誘導可能な局所接着キナーゼ細胞アッセイ
本発明の細胞に基づくアッセイは、ＦＡＫの生物学とあわせて誘導可能な遺伝子発現システムを活かして、ＦＡＫ発現および位置３９７でのチロシン残基（Ｙ３９７）におけるＦＡＫリン酸化を外因的に制御する。本発明の細胞に基づくアッセイは、柔軟性があり、そしてＹ３９７におけるＦＡＫリン酸化、全
ＦＡＫリン酸化の測定が可能であり、変異ＦＡＫタンパク質の同定が可能であり、そしてタンパク質およびホスホチロシンの組み合わせを測定することが可能である。
ＦＡＫリン酸化の測定が可能であり、変異ＦＡＫタンパク質の同定が可能であり、そしてタンパク質およびホスホチロシンの組み合わせを測定することが可能である。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
本発明は、増殖因子応答および細胞遊走に関わるシグナルタンパク質をコードし、そしてまた疾患に関係する、局所接着キナーゼ（ＦＡＫ）遺伝子の発現を誘導するための方法および組成物に関する。本発明はＦＡＫ阻害剤の同定にも向けられる。
【０００２】
ＦＡＫは、細胞質性の、非受容体チロシンキナーゼである。ＦＡＫは、種々の刺激の群（例えば、インテグリン、サイトカイン、ケモカイン、および増殖因子）からのシグナリングを伝達して、細胞増殖、遊走、形態、および細胞生存を含む様々な細胞の経路および過程を制御する。ほとんどの種類の組織において発現することに加えて、ＦＡＫはほとんどのヒトの癌、特に高度に浸潤性の転移、において高いレベルで見られる。優性阻害のＦＡＫ関連非キナーゼ（ＦＲＮＫ）のヒト癌細胞における発現は、細胞の丸い形態、局所プラークの不可逆的喪失、およびそれに続く細胞死という結果となることが示されている。さらに、ＦＲＮＫの制御された発現は、ＦＡＫの減少したチロシンリン酸化を生じ、これはＦＡＫリン酸化の阻害はヒトの癌の治療のための療法的指標を生じるかもしれないことを示唆している。
【０００３】
ＦＡＫ活性化に導く正確な機構はよく分かっていないが、Ｙ３９７（位置３９７におけるチロシン残基）におけるリン酸化を生ずるＦＡＫ酵素活性は、インテグリンシグナル伝達において重要なステップであると信じられている（Ｇｕａｎ，ＪＬ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ２９： １０８５−９６，１９９７）。膜貫通インテグリン受容体は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質を細胞のアクチン細胞骨格と連結し、そして核が細胞形態、組織構築、および付着誘導遺伝子発現を調節するのに重要である。インテグリン受容体とＦＡＫの局所接着の部位への共局在は、残基Ｙ３９７でのＦＡＫリン酸化を導き、Ｓｒｃ−ファミリーチロシンキナーゼのためのＳＨ２ドッキング部位を作り出すと信じられている。ホスホチロシンＦＡＫＹ３９７へのＳｒｃ結合は、Ｙ５７６、Ｙ５７７、Ｙ８６１、およびＹ９２５を含む種々の下流チロシン残基でのＦＡＫの優先的なリン酸化へと導く。ＦＡＫチロシン残基（Ｙ５７６／Ｙ５７７）のリン酸化は、増加したＦＡＫキナーゼ活性ならびに細胞骨格の再構築、細胞増殖、細胞生存、および細胞遊走を調節するシグナル伝達へと導く。
【０００４】
インテグリンシグナリングカスケードにかかわるキナーゼおよび基質の多様性のために、特定のキナーゼについて特異的なアッセイを設計することが好ましい。本発明の目的は、ＦＡＫの生化学的機構を追跡するＦＡＫ薬剤発見経路を設計しそして開発することにある。いくらかの外因性刺激がＦＡＫリン酸化を導くことができる、例えば（１）ＥＣＭリガンドに結合しているインテグリン（例えば、フィブロネクチンへのインテグリンβ１）；（２）サイトカインまたはケモカイン刺激（例えば、エンドセリン１／２、ボンベシン、またはＰＭＡ）；（３）チロシンキナーゼ受容体の増殖因子刺激（例えば、ＰＤＧＦＢＢ）；そして（４）インテグリン抗体架橋（例えば、抗−β１）。反対に、ＦＡＫ不活性化を導く最も実行可能な外因性対照は、細胞−細胞間および細胞−ＥＣＭ間の接触の剥離である（例えば、細胞懸濁液）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明のまとめ
本発明は、局所接着キナーゼ（ＦＡＫ）の細胞活性（cell-active）阻害剤を同定する方法であって：
（ａ）ＦＡＫをコードする遺伝子の発現を誘導するために誘導剤を哺乳動物細胞に加え、ここで当該哺乳動物細胞は当該遺伝子で安定にトランスフェクトされ、そして当該遺伝子は当該誘導剤の存在下で発現する；
（ｂ）試験化合物を加え；
（ｃ）ＦＡＫ捕捉剤を用いて発現したＦＡＫを捕捉し；そして、
（ｄ）当該ＦＡＫのリン酸化を検出する；
ことを含んでなる、前記方法に関する。
【０００６】
本発明の一態様は、試験化合物の細胞毒性を測定する方法であって、哺乳動物細胞をＦＡＫをコードする遺伝子で安定にトランスフェクトし、ここで当該遺伝子は誘導剤の存在下で発現する；誘導剤を加えてＦＡＫをコードする当該遺伝子の発現を誘導し；試験化合物を加え；当該細胞に細胞毒性指示薬を加え；そして、当該試験化合物の細胞毒性を検出する、ことを含んでなる前記方法を提供する。特定の態様において、試験化合物の細胞毒性は細胞毒性指示薬の比色の転換によって測定され、ここで転換した細胞毒性指示薬の量は生細胞の数に比例する。
【０００７】
本発明の一態様は、組換え核酸分子で安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞を提供し、ここで当該組換え核酸分子は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群から選択され、そしてここで、当該配列の発現は誘導剤の存在を必要とする。
【０００８】
本発明の一態様は、配列番号１、２、３および４からなる群から選択される配列を含んでなるタンパク質をコードする組換え核酸分子で安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞を提供し、ここで当該タンパク質の発現は誘導剤の存在を必要とする。
【０００９】
詳細な説明
本発明は、ＦＡＫについての誘導可能な細胞に基づくアッセイを対象とする。細胞に基づくアッセイはＦＡＫの生物学、そしてＦＡＫ発現および位置３９７のチロシン残基（Ｙ３９７）におけるＦＡＫリン酸化を外因的に制御するための誘導可能な遺伝子発現システム、を活用する。通常のホスホチロシン系よりもむしろ、ＦＡＫＹ３９７リン酸化特異的な細胞に基づくアッセイを用いることにより、擬陽性阻害剤の同定を防ぐ。本発明の細胞に基づくアッセイは、柔軟性があり、そしてＹ３９７におけるＦＡＫリン酸化、ＦＡＫリン酸化全体の測定、変異ＦＡＫタンパク質の同定、およびタンパク質とホスホチロシンの組み合わせの測定、をすることができる。
【００１０】
本発明の細胞に基づく誘導可能なＦＡＫアッセイは、異所性の基底レベルＦＡＫ発現についての厳格な制御、および外因性の刺激剤を介したＦＡＫ遺伝子発現の迅速な抑制解除を提供する点において有利である。細胞に基づくアッセイは、最終的な読み出しが、ホスホチロシンＦＡＫＹ３９７、ＦＡＫホスホチロシン全体のプロファイル、ＦＡＫまたは変異タンパク質、またはタンパク質とホスホチロシンのいくつかの組み合わせ、について測定されたＦＡＫ生物学と機構的に等価であるように柔軟性がある。さらに、本発明はいくらかのＦＡＫ阻害剤を同定するのに首尾よく用いられた。本明細書に置いて、用語「厳格な制御」は、外因性の刺激剤の存在下で起こる、ＦＡＫ遺伝子の制御された発現を意味する。言い換えると、本発明は、適切な誘導剤の存在下でＦＡＫの発現が誘導される、ＦＡＫについての誘導可能な遺伝子発現システムを提供する。本発明はＦＡＫの誘導可能な発現のための方法、ここでＦＡＫ遺伝子の調節された発現は細胞生存度に不利に影響しない、を提供する。
【００１１】
本発明の一態様は、ＦＡＫ阻害剤のスクリーニングのための細胞に基づくアッセイに向けられる。細胞に基づくアッセイはＦＡＫの生物学、そしてＦＡＫ発現および位置３９７のチロシン残基（Ｙ３９７）におけるＦＡＫリン酸化を外因的に制御するための誘導可能な遺伝子発現システムを活用する。細胞に基づくアッセイは、ＦＡＫ生物学と機構的に等価であり、そしてＦＡＫリン酸化における変化を測定する。通常のホスホチロシン系よりもむしろ、ＦＡＫＹ３９７リン酸化特異的な細胞に基づくアッセイを用いることにより、擬陽性阻害剤の同定を防ぐ。本発明の細胞に基づくアッセイは、柔軟性があり、そしてＦＡＫリン酸化、ＦＡＫリン酸化の全体の測定、変異ＦＡＫタンパク質の同定、およびタンパク質とホスホチロシンの組み合わせの測定、をすることができる。
【００１２】
本発明の一態様は、ＦＡＫの細胞活性阻害剤を同定する方法であって、ＦＡＫをコードする遺伝子で哺乳動物細胞を安定にトランスフェクトし、ここで当該遺伝子は誘導剤の存在下で発現する；誘導剤を加えてＦＡＫをコードする当該遺伝子の発現を誘導し；試験化合物を加え；ＦＡＫ捕捉剤を用いて発現したＦＡＫを捕捉し；捕捉したＦＡＫを抗ホスホチロシン抗体に曝露し；そして、当該ＦＡＫのリン酸化を検出する；ことを含んでなる、前記方法を提供する。いくつかの態様において、ＦＡＫのリン酸化の度合いを、捕捉されたＦＡＫへの抗ホスホチロシン抗体の結合により決定する、ここで捕捉されたＦＡＫへ抗ホスホチロシン抗体が結合した量は、当該ＦＡＫのリン酸化の量に比例する。
【００１３】
本発明の特定の態様において、ＦＡＫの細胞活性阻害剤を同定するための方法は、哺乳動物細胞を第一の固相上に被覆する、所望による工程を含んでなる。第一の固相は、好ましくは第一のマイクロタイタープレートのウェルである。本発明の他の態様において、第一の固相上に被覆された細胞は、発現したＦＡＫの捕捉の前に、溶解バッファーで溶解する。溶解バッファーは所望により可溶化界面活性剤を含んでなる。特定の態様において、ＦＡＫ捕捉剤は第二の固相、好ましくは第二のマイクロタイタープレートのウェル、上に被覆する。
【００１４】
特定の態様において、試験化合物はＹ３９７におけるＦＡＫのリン酸化を阻害する。
本発明の一態様は、試験化合物の細胞毒性を測定するための方法であって、ＦＡＫをコードする遺伝子で哺乳動物細胞を安定にトランスフェクトし、ここで当該遺伝子は誘導剤の存在下で発現する；誘導剤を加えてＦＡＫをコードする当該遺伝子の発現を誘導し；試験化合物を加え；当該細胞に細胞毒性指示薬を加え；そして該試験化合物の細胞毒性を検出する；ことを含んでなる、前記方法を提供する。特定の態様において、試験化合物の細胞毒性は細胞毒性指示薬の比色の転換によって測定され、ここで転換した細胞毒性指示薬の量は生細胞の数に比例する。
【００１５】
本発明の特定の態様において、試験化合物の細胞毒性を測定する方法は、哺乳動物細胞を固相上に被覆する所望による工程を含んでなる。固相は、好ましくは第一のマイクロタイタープレートのウェルである。
【００１６】
本発明の一態様は、局所接着キナーゼ（ＦＡＫ）の細胞活性阻害剤を同定する方法であって、細胞が第一の固相に接着するように哺乳動物細胞の均一な集団を第一の固相に被覆し、ここで当該細胞はＦＡＫをコードする遺伝子で安定にトランスフェクトされ、そしてここで当該遺伝子は誘導剤の存在下で発現する；誘導剤を加えてＦＡＫをコードする当該遺伝子の発現を誘導し；試験化合物を加え；接着細胞を可溶化して細胞溶解物を遊離させ；ＦＡＫ捕捉剤が第二の固相に接着するように、ＦＡＫ捕捉剤で第二の固相を被覆し；ＦＡＫ捕捉剤がＦＡＫを捕捉するように、細胞溶解物を接着したＦＡＫ捕捉剤に曝露し；捕捉したＦＡＫを抗ホスホチロシン抗体に曝露し；捕捉したＦＡＫへの抗ホスホチロシン抗体の結合を測定する、ここで捕捉したＦＡＫへの抗ホスホチロシン抗体の結合量は、当該ＦＡＫのリン酸化の量に比例する；ことを含んでなる、前記方法を提供する。
【００１７】
本発明の別の態様は、組換え核酸分子で安定にトランスフェクトとされた哺乳動物細胞であって、ここで、当該組換え核酸分子は配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群より選択され、そしてここで、当該配列の発現は誘導剤の存在を必要とする、前記哺乳動物細胞を提供する。
【００１８】
本発明の一態様は、配列番号１、２、３および４からなる群より選択される配列を含んでなるタンパク質をコードする組換え核酸分子で安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞、そしてここで当該タンパク質の発現は誘導剤の存在を必要とする、を提供する。
【００１９】
ＦＡＫは、タンパク質−チロシンキナーゼ２、ＰＴＫ２、としても知られている。いずれの活性なＦＡＫ変異体をも上記アッセイに使用することができる。不活性型の変異体もまた、種々の対照の目的のためのアッセイに用いることができる。上記に記載のアッセイに使用できる追加のＦＡＫの変異体は、１０５２アミノ酸のＩ５３０１２の野生型（ＷＴ）ヒトＦＡＫ（配列番号１）；Ａｎｄｒｅ，Ｅ．およびＢｅｃｋｅｒ−Ａｎｄｒｅ，Ｍ．，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｆｏｒｍ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｋｉｎａｓｅ ｉｎ ｂｒａｉｎ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． １９０：１４０−１４７，１９９３（ＡＡＡ３５８１９の８７９アミノ酸変異体、ＰＣ１２２６の５５４アミノ酸変異体、およびＰＣ１２２７の４３１アミノ酸変異体を記載）に記載されるようなＦＡＫのスプライスバリアント；ＸＰ ０５０３３７のＦＡＫの５７０触媒ドメイン；ヒトＦＡＫに対して１０２３／１０５２アミノ酸同一性（９７％）のＮＰ ０３２００８．１のマウスＦＡＫ；ヒトＦＡＫのアミノ酸１−９０３に対して８７８／９０４アミノ酸同一性（９７％）のマウスＦＡＫカルボキシル切断バリアント；ヒトＦＡＫに対して１０２０／１０５５アミノ酸同一性（９６％）のＮＰ ０３７２１３．１のラットＦＡＫ；ヒトＦＡＫに対して１０１７／１０５５アミノ酸同一性（９６％）のＪＣ５４９４のＦＡＫ変異体；ヒトＦＡＫに対して９８８／１０５４アミノ酸同一性（９３％）のＱ００９４４のトリＦＡＫ；ヒトＦＡＫに対して９６５／１０２９アミノ酸同一性（９３％）のＡ４５３８８のトリＦＡＫ変異体；ＦＡＫ Ｙ３９７Ｆ（配列番号２）、Ｋ４５４Ｒ（配列番号３）、ＦＲＮＫ（イニシエーターＭＥＴに先行されるＦＡＫ残基６９４−１０５２を有するアミノ末端切断体）（配列番号４）を含む合成ＦＡＫ変異体、およびＦＡＫ Ｙ３９７Ｄ、Ｙ３９７Ｅ、Ｙ５７７Ｄ、Ｙ５７７Ｅ、Ｙ８６１Ｄ、Ｙ８６１Ｅ、Ｙ９２５Ｄ、Ｙ９２５Ｅを含む種々のリン酸化模倣体、ならびにそれらの組み合わせ；Ｃｈａｎ Ｐら、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）；２６９（３２）：２０５６７−７４に記載されるＣＤ２−ＦＡＫ融合体（構成的な、ＣＤ２との活性ＦＡＫ融合体）、を含む。
【００２０】
本明細書において、用語「誘導剤」は、少なくとも６倍のシグナル対ノイズ比を生じる、剤、化合物、または化学物質である。誘導剤の例は、非限定的に、ミフェプリストン（Mifepristone）（Ｒｕ４８６）ならびに、Ｏｒｇ３１８０６およびＯｒｇ３１３７６のようなその他のアンチプロゲスチン類を含む。Ｏ’Ｍａｌｌｅｙら、Ｃｅｌｌ，６９，７０３−７１３（１９９２）を参照されたい。本明細書において、捕捉剤は、ヒスチジン残基、ストレプトアビジンまたはその他の同等のアフィニティータグ、でタグ付けされたＦＡＫを含む、いずれかの型の局所接着キナーゼを捕捉可能な、剤、化合物または化学物質である。捕捉剤は、非限定的に、ホスホチロシンＦＡＫＹ３９７特異的抗体、一般のホスホチロシン抗体、抗ＦＡＫ抗体、抗ヒスチジンタグ抗体、およびストレプトアビジン修飾ＦＡＫの捕捉を容易にするビオチンを含有する分子、が含まれる。本発明の特定の態様において、捕捉剤は、ヤギ抗ウサギ抗体およびホスホチロシンＦＡＫＹ３９７特異的抗体の組み合わせを非限定的に含む、１またはそれより多くの抗体の組合せを含む。
【００２１】
本明細書において、用語「抗ホスホチロシン抗体」は、非限定的に、ホスホチロシンＦＡＫＹ３９７特異的抗体ならびに一般のホスホチロシン抗体を含み、後者は、非限定的にＦＡＫの位置３９７のチロシン残基を含む、いずれのリン酸化チロシン残基をも認識することが可能である。
【００２２】
本明細書において、細胞毒性指示薬は、細胞生存度を評価するのに用いる剤、化学物質または化合物である。細胞毒性指示薬の例は、非限定的に、この種の解析に特に有用なテトラゾリウム塩（例えば、ＭＴＴ、ＸＴＴ、ＷＳＴ−１）を含む。
【００２３】
ＭＴＴは、黄色のテトラゾリウム塩であり、代謝活性のある細胞によって紫色のホルマザン結晶に切断される。可溶化されたホルマザン生成物は、ＥＬＩＳＡリーダーまたはその他の分光光度的な装置を用いて、分光光度的に定量化される。生存数は、吸光度によりモニターされる、形成した紫色のホルマザン結晶の量に直接関連する。
【００２４】
本発明の一態様は、矛盾のない厳格な遺伝子発現調節を提供する能力を有する、誘導可能なＦＡＫ遺伝子発現系を用いて行う。本発明の一態様において、導入遺伝子、例えばＦＡＫ、の調節された発現のための系を含んでなる、誘導可能なＦＡＫ遺伝子発現システムを提供する。ＦＡＫ発現は、誘導剤の非存在下では「オフ」であり、しかし、その存在下では「オン」になる。当該システムは二つの遺伝子からなる：ひとつは調節タンパク質をコードし、そして他方は誘導可能な目的の導入遺伝子をコードする。調節タンパク質の発現は、構成的プロモーターによって駆動する。誘導可能なＦＡＫ導入遺伝子は、調節タンパク質を結合可能な結合部位の多数コピーを連結した最小プロモーターからなるプロモーターを有する。
【００２５】
本発明の一態様において、調節タンパク質は、酵母ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン、切断されたヒトプロゲステロン受容体リガンド結合ドメイン、およびＮＦ−κＢからのヒトｐ６５活性化ドメイン、からなる転写因子であり、導入遺伝子の基底発現について厳格な調節を容易にする。調節タンパク質をコードするプラスミドは、正のフィードバックループを確立してリガンド処理の際の迅速な応答を容易にする、ＧＡＬ４プロモーターを含有する。調節タンパク質の外因性の制御は、小分子リガンドを用いて行う。調節タンパク質の導入遺伝子のプロモーターへの種特異的結合により、そして、調節タンパク質のリガンド依存性高次構造的活性化を通して、厳格な調節を行う。
【００２６】
よって、特定の態様において、本発明は以下の利点がある：
・生存細胞クローンを生じる、誘導されていないときの遺伝子発現の厳格な抑制を可能にする、誘導可能な系を用いた細胞におけるＦＡＫの誘導。
・リン酸化ＦＡＫの検出をＦＡＫキナーゼ活性の阻害剤を同定するのに用いてもよい。リン酸化ＦＡＫを検出するいくつかの方法は、ＦＡＫ阻害剤の同定のための、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に基づくアッセイ、およびＥＬＩＳＡに基づくアッセイを含む。他の適切な検出システムもまた、用いてよい。
・アッセイはＦＡＫタンパク質全体、リン酸化ＦＡＫタンパク質の全体、または定められたチロシン（例えばチロシン３９７）でリン酸化されたＦＡＫタンパク質、の検出を可能にする。
・トランスフェクトした細胞が腫瘍原性であり、そしてミフェプリストンを動物に与えることによりＦＡＫをｉｎ ｖｉｖｏで誘導することができるので、細胞に基づくアッセイをＦＡＫ阻害剤のｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングに用いてもよい。当該系のｉｎ ｖｉｖｏでの有用性は証明されている。
【００２７】
比較例
比較例１
アッセイシグナルおよびノイズを改善することを期待して、種々の細胞背景において安定に異所的に発現したＦＡＫまたはＦＡＫ変異体を生じる試みを行った。しかしながら、これらの成果は、ほとんどの細胞がＦＡＫタンパク質レベルの変化に感受性を示し、そして細胞に基づくアッセイを開発するための生存クローンを形成しなかったため、不成功に終わることが証明された。ＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞またはＡ２０５８ヒト転移性黒色腫細胞のような、低度から中程度のレベルの内因性のＦＡＫを発現する細胞は、ＦＡＫの発現を内因性レベルについて２倍を超えては許容しなかった。結果的に、これらのクローンは、上述の理由と同様の理由により、アッセイに開発に不十分であることが証明された：刺激および再現性の悪さ、高いバックグラウンドノイズ、そして薬剤の発見に貢献しない。したがって、天然のＦＡＫを含有する細胞における非誘導性のＦＡＫの発現は、ＦＡＫ発現の誘導を研究するのに適していないことがわかった。
【００２８】
比較例２
中程度のおよび高スループットスクリーニング（ＥＬＩＳＡ系）、そしてＦＡＫの生化学的機構を追跡することの両方に貢献する、ＦＡＫの細胞に基づくアッセイを開発するために、ＦＡＫ生物学を活用するためのいくつかのアプローチをとった。例えば、フィブロネクチン、もしくはコラーゲン、またはマトリゲルのようなその他のＥＣＭ、のような細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質上に細胞をプレーティングすることにより、ＦＡＫの接着細胞刺激を模倣することを試みたが、このアプローチは、ＦＡＫの悪い刺激という結果になり不十分であることが証明され、そして完全に細胞の型に依存した。さらに、ＥＣＭマトリゲルに誘導される細胞の付着は、ｐＹ５４ＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−複合化ホスホチロシン抗体）により測定したところＦＡＫリン酸化の刺激がないという結果になり、そして二次抗マウスＨＲＰ（２ｏＭＨＲＰ）単独で用いた対照の検出は、マトリゲル上で刺激された細胞に由来する溶解物でインキュベートしたウェルにおいて非特異的なアッセイシグナルの増加という結果になった。ｐＹ５４ＨＲＰおよび２ＯＭＨＲＰの組み合わせを用いた場合のシグナルとノイズの比（Ｓ／Ｎ）は、１．０から１．７の範囲であり、一方でｐＹ５４（非複合化ホスホチロシン抗体）および２ＯＭＨＲＰの組み合わせでは、１．０から２．４のＳ／Ｎ比を生じた。このことは、アッセイシグナルの非特異的増加は、細胞溶解物中のいくつかのマトリゲル混入物に対する交差反応性（cross-reactivity）によるものであることが示唆され、そして確認された。よって、適切なＦＡＫの細胞に基づくアッセイの開発についての上記のアプローチは実行可能ではない。
【００２９】
結果はまた、ＥＣＭマトリゲルまたはフィブロネクチンのいずれかへの細胞付着における、中程度のそして次善の２から３倍のシグナル対ノイズのＦＡＫリン酸化の刺激を示した。細胞数、細胞−ＥＣＭ付着時間、検出抗体および捕捉抗体の種類、ならびにエンドセリン−１およびホルボール １２−ミリステート １３−アセテート（ＰＭＡ）を用いたコンビナトリアル刺激を変えることによる、これらのアッセイ条件のさらなる至適化は、これらの誘導可能ではないＦＡＫ刺激方法は、アッセイの開発について不十分であり、再現性がなく、そして実現可能ではないことを示した。
【００３０】
比較例３
インテグリンクラスタリングがＦＡＫリン酸化を導くので、β１インテグリンに特異的な抗体を用いてインテグリン受容体を架橋する抗体の実現可能性について試験した。しかしながら、これらの成果はまた、ＦＡＫ刺激の間接的方法は高い変動性と再現性のなさを導くため、失敗であることがわかった。例えば、インテグリンβ１架橋は、最適な刺激には、時間がかかりそして管理するのが困難な温度感受性の工程が必要であったため、中程度のスループットスクリーニングにおいても煩雑すぎることがわかった。さらに、ポリスチレンプレート上の細胞をより低いバックグラウンドノイズに維持することは、悪いＥＣＭ接触のために細胞生存度が低下するという結果になり、それによってこれらの誘導可能ではない発現系はアッセイの開発ついて実行可能ではなかった。
【００３１】
比較例４
ＦＡＫの細胞に基づくアッセイの開発を進めるために、種々の細胞背景において、野生型または変異ＦＡＫタンパク質を発現する安定なクローンを産生する試みを行った。構成的に活性なタンパク質（ＣＤ２・ＦＡＫ）、膜結合性のチロシンをつぶした（tyrosine-dead）タンパク質（ＣＤ２・ＦＡＫＹ３９７Ｆ）、鍵となる下流チロシン残基を欠く細胞質性ＦＡＫ変異体（例えば、ＦＡＫＹ８６１Ｆ、ＦＡＫＹ９２５Ｆ、およびＦＡＫＹ８６１Ｆ／Ｙ９２５Ｆ）のいずれかをコードするＦＡＫ ｃＤＮＡ転写物を宿したクローンを産生した。これらの生物学的ツールは、上述した点を扱うため、そして薬剤の発見に貢献する丈夫で再現性のある細胞に基づくアッセイの開発を必要とするために、ＦＡＫ生物学の知識に基づいて戦略的に設計した。
【００３２】
ベクター構築物またはＬａｃＺタンパク質のいずれかを発現する生存対照細胞は得られたものの、ＦＡＫＷＴを過剰発現する安定なクローンを産生する試みは失敗であった。ＦＡＫ変異体構築物のトランスフェクションは、Ｙ３９７におけるＦＡＫリン酸化およびキナーゼ活性を保存してＦＡＫの下流リン酸化を遮断する（ＦＡＫＹ８６１Ｆ、ＦＡＫＹ９２５Ｆ、およびＦＡＫＹ８６１Ｆ／Ｙ９２５Ｆ）、またはインテグリンレセプターの要求性を回避する（ＣＤ２・ＦＡＫＷＴおよびＣＤ２・ＦＡＫＹ３９７Ｆ）ことのいずれかのように設計されたが、これらもまた失敗であることがわかった。ヒト転移性黒色腫Ａ２０５８のような、内因性ＦＡＫを低度から中程度のレベルで発現する細胞において、生存クローンが同定された。しかし、Ａ２０５８・ＦＡＫＷＴクローンは、約２倍のＦＡＫレベルの増加のみを示し、これはＦＡＫの細胞に基づくアッセイの開発には不十分であった。
【００３３】
外因性刺激、基底ＦＡＫリン酸化についての対照、および異所的に発現するＦＡＫクローンの試みについての研究に加えて、ＦＡＫＷＴおよびチロシンをつぶしたＦＡＫＹ３９７Ｆ ｃＤＮＡに、Ｔｅｔ−Ｏｎ／Ｔｅｔ−Ｏｆｆ誘導可能な系を用いてテトラサイクリン制御を受けさせた。しかしながら、ＦＡＫＷＴまたはＦＡＫＹ３９７Ｆ形質転換体は検出されなかった。生存クローンが同定できなかったので、ＦＡＫＷＴまたはＦＡＫＹ３９７Ｆ Ｔｅｔ−形質転換体における「漏出度（leakiness）」、すなわち基底発現の不十分な調節、のレベルは決定できなかった。Ｔｅｔ−ＯｎＴＭ／Ｔｅｔ−ＯｆｆＴＭ系は、標的タンパク質発現について変化する対照を示し、そしてそれによってＦＡＫのような致死遺伝子の調節には適していないことを示した。
【実施例】
【００３４】
実施例
野生型ＦＡＫＷＴ（配列番号５）、チロシンをつぶした（tyrosine-dead）ＦＡＫＹ３９７Ｆ（配列番号６）、キナーゼ活性のない（kinase-dead）ＦＡＫＫ４５４Ｒ（配列番号７）および優性阻害のＦＡＫ関連非キナーゼ（ＦＲＮＫ）（配列番号８）を、ＢａｍＨＩ−ＡｐａＩまたはＫｐｎＩ−ＡｐａＩ挿入物のいずれかとしてＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈＴＭ ｐＧｅｎｅＶ５／Ｈｉｓ Ａ−ベクター骨格にクローニングした。本明細書において、用語「ＦＡＫをコードする遺伝子」は非限定的に、配列番号１〜４を含む。これらの構築物は、ヒトＦＡＫについてＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｌ１３６１６（Ｗｈｉｔｎｅｙ，Ｇ．Ｓ．ら、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２（９），８２３−８３０（１９９３）を参照）として公開された配列に基づき、そしてそれぞれの構築物は配列を確認し、そして公開された配列に対して整列した。ＤＮＡ構築物は、従来技術に対して独特で区別できるように、特異的５’および３’制限部位を含むように操作した。加えて、特定の構築物の３’末端はＶ５およびヒスチジンタグのようなタグ付けされたエピトープを含むように操作した。
【００３５】
ＮＩＨスイスマウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ−９２）、ヒト類表皮癌Ａ４３１（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ１５５５）、およびヒトグリア芽細胞腫星細胞腫Ｕ８７ＭＧ（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＴＢ−１４）を含む、いくつかの細胞株をトランスフェクションのために選択した。それぞれの細胞株は、それらの適用をＦＡＫの過剰発現について好ましくする独特の特徴を示す。例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は種特異的ＦＡＫ過剰発現およびトランスフェクトの容易性を提供し、Ａ４３１細胞は中程度のレベルの内因性ＦＡＫを発現し、そしてＦＡＫの天然の環境をより代表する腫瘍背景を提供し、そして、Ｕ８７ＭＧ細胞は推定ＦＡＫ天然受容体ＰＴＥＮ（腫瘍サプレッサーホスファターゼ）を欠損する。ストラタジーンのＧｅｎｅＪａｍｍｅｒＴＭ トランスフェクションリガンドを用いて、Ａ４３１細胞にｐＳｗｉｔｃｈ調節ベクターを、ｐＧｅｎｅＶｅｃｔｏｒＶ５Ｈｉｓ、またはｐＧｅｎｅＦＡＫＷＴＶ５Ｈｉｓ、またはｐＧｅｎｅＦＡＫ変異体（ｐＧｅｎｅＦＡＫＫ４５４ＲＶ５Ｈｉｓ、そしてｐＧｅｎｅＦＡＫＹ３９７ＦＶ５Ｈｉｓ）のいずれかとともに同時トランスフェクトした。同様に、ＮＩＨ３Ｔ３およびＵ８７ＭＧ細胞を、ｐＳｗｉｃｈ調節タンパク質および目的の特定のｐＧｅｎｅ構築物を同時発現するように形質転換した。ハイグロマイシンおよびゼオシン耐性クローンを選択し、ウエスタンおよびＲＴ−ＰＣＲ解析によるスクリーニングのために培養して拡張した。Ａ４３１：ＦＡＫＷＴＶ５Ｈｉｓ、Ａ４３１：ＦＡＫＹ３９７ＦＶ５Ｈｉｓ、Ａ４３１：ＦＡＫＫ４５４ＲＶ５Ｈｉｓ、Ａ４３１：Ｖｅｃｔｏｒ、ＮＩＨ３Ｔ３：ＦＡＫＷＴＶ５Ｈｉｓ、ＮＩＨ３Ｔ３：ＦＡＫＹ３９７ＦＶ５Ｈｉｓ、ＮＩＨ３Ｔ３：Ｖｅｃｔｏｒ、Ｕ８７ＭＧ：ＦＡＫＷＴＶ５Ｈｉｓ、およびＵ８７ＭＧ：ＦＡＫＹ３９７ＦＶ５Ｈｉｓを含むいくつかの誘導可能クローンを首尾よく単離し、選択し、確認しそして確証した。
【００３６】
本発明のこの態様のＦＡＫ誘導可能アッセイは、Ｙ３９７でのＦＡＫリン酸化を測定した。Ａ４３１：ＦＡＫＷＴＶ５Ｈｉｓ（約１．０ｘ１０４から１．０ｘ１０７細胞）をＵ底９６ウェルプレート上に播種し、そして３７℃、５％ＣＯ２で、４から６時間付着させた後、０．１ｎＭ ミフェプリストンの存在下で一晩培養した。続いて、Ａ４３１：ＦＡＫＷＴＶ５Ｈｉｓ誘導細胞を、処理しないままにするかまたは阻害化合物で３７℃、５％ＣＯ２で３０分間処理し、そしてＲＩＰＡ溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１％ ＮＰ−４０、０．２５％デオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ ＮａＦ、および５０ｍｌ溶液あたりＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤１つ）中で溶解した。およそ４５μｇの全タンパク質（１００μｌ）を、リン酸化ＦＡＫタンパク質の捕捉およびそれに続く検出のために、０．３５μｇ／ウェルの抗ＦＡＫリン特異的Ｙ３９７抗体で被覆したヤギ抗ウサギプレートへ移した（図３参照）。
【００３７】
ＮＩＨ３Ｔ３：ＦＡＫＷＴＶ５ＨｉｓクローンおよびＮＩＨ３Ｔ３：ＦＡＫＹ３９７ＦＶ５Ｈｉｓクローンを、Ｔ２５フラスコに播種しておよそ８０％集密度になるようにし、そして処理しないままにするかまたは０．１ｎＭ ミフェプリストンで３７℃、５％ＣＯ２で１６時間刺激した。細胞溶解物を調製し、全ＦＡＫタンパク質を抗ＦＡＫ（ＵＢＩＴＭ、レイクプラシッド、ニューヨーク）モノクローナル抗体を用いて免疫枯渇（immunodepleted）した。次いで、ＦＡＫ免疫複合体をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、抗ＦＡＫ（Ａ１７）ポリクローナル抗体で免疫ブロッティングした。表１は、オートラジオグラフィーのフィルムの自由裁量による「バンド光（band light）」ユニットにより測定したデンシトメトリーによる定量および、刺激していない細胞と比較したＦＡＫタンパク質レベルの変化の倍数を示す。
【００３８】
【表１】
【００３９】
ＦＡＫＷＴ誘導可能クローンは、ミフェプリストン刺激に対して非常によく応答したことを観察した。
上記の条件は容易に９６ウェルＥＬＩＳＡ形式に移すことができたた。表２は、ＦＡＫＷＴまたはＦＡＫＹ３９７Ｆタンパク質を発現するように誘導したＮＩＨ３Ｔ３クローンを示す。ＦＡＫＷＴまたはＦＡＫＹ３９７Ｆタンパク質は、ミフェプリストンにより誘導された全ＦＡＫタンパク質またはホスホチロシンＦＡＫＹ３９７のいずれかを測定するために捕捉した。
【００４０】
【表２】
【００４１】
ＮＩＨ３Ｔ３クローンが丈夫なホスホチロシンＦＡＫＹ３９７およびＦＡＫタンパク質を、それぞれ、〜７および〜６のシグナル対ノイズ比で生じたことを観察した。ＮＩＨ３Ｔ３チロシンをつぶしたクローンおよびベクターＮＩＨ３Ｔ３形質転換体の両方についてホスホＦＡＫＹ３９７についてのアッセイ特異性を確認した。
【００４２】
表３は、至適条件下でアッセイされたＡ４３１：ＦＡＫクローンを示す。
【００４３】
【表３】
【００４４】
至適条件下で、Ａ４３１：ＦＡＫクローンは丈夫なホスホチロシンＦＡＫＹ３９７およびＦＡＫタンパク質を、それぞれ〜１７および〜１１のシグナル対ノイズ比で生じた。Ａ４３１チロシンをつぶしたクローンおよびベクターＡ４３１形質転換体の両方についてホスホＦＡＫＹ３９７についてのアッセイ特異性を確認した。ホスホチロシンＹ３９７およびＦＡＫタンパク質の誘導は、例えば、ミフェプリストンのインキュベーション時間、ミフェプリストン濃度、細胞密度、および抗体濃度といった、アッセイ条件を変えることにより制御可能であった。
【００４５】
Ａ４３１およびその他の細胞背景についてのＦＡＫ活性化の機構を研究した。Ａ４３１：ＦＡＫＷＴ細胞は処理しないままにおくか、またはミフェプリストンで刺激した。第一に、ＦＡＫタンパク質およびホスホチロシンＹ３９７レベルについての時間依存的減少を示すために、流出（washout）実験を行った（すなわち、ミフェプリストンで一晩（１６時間）刺激した細胞を、続いて、ミフェプリストンの不在下で時間を追って新鮮な増殖培地中で培養した）。第二に、ミフェプリストンで刺激したＡ４３１：ＦＡＫＷＴ細胞を剥がし、そして新鮮な増殖培地に１５分間懸濁し、その後、細胞培養処理ペトリ皿上で４、２４、４８および７２時間、再プレーティングした。表４、実験Ａは、オートラジオグラフィーのフィルムの自由裁量による「バンド光」ユニットにより測定したデンシトメトリーによる定量および、刺激していない対照と比較したＦＡＫリン酸化の変化の倍数を示す。
【００４６】
【表４】
【００４７】
実験Ｂにおいては、処理していない細胞に対して中程度の４倍の誘導が観察された。しかしながら、刺激した細胞を１５分間、新鮮な増殖培地に懸濁し、続いてプラスチックへ４時間付着させると、ホスホＦＡＫＹ３９７の減少を導いた。さらに、懸濁したミフェプリストンで誘導した細胞を２４時間、再付着させると、ホスホチロシンＦＡＫＹ３９７の再活性化という結果になり、これはＦＡＫ活性化の機構が損なわれていないことを示唆する。ＦＡＫタンパク質レベルの時間依存的な減少と矛盾せず、ホスホチロシンＦＡＫＹ３９７は７２時間で刺激していない対照レベルに減少した。
【００４８】
細胞懸濁液はＦＡＫリン酸化の不活性化へと導く。ＦＡＫの再活性化は懸濁した細胞を細胞付着させるために再プレーティングすることによって達成することができる。表４はＦＡＫ活性化のメカニズムが上述した調節システムのもとで無傷であることを示している。言い換えると、ミフェプリストンによる外因性刺激は、機構的に等価なＦＡＫの活性化へと導く。
【００４９】
本発明のＦＡＫ誘導可能な細胞に基づくアッセイは、ＰＰ１およびスタウロスポリンを含む、いくつかのＦＡＫ阻害剤の同定においてうまく用いられた。加えて、該アッセイはＦＡＫを発現している細胞における特定の化合物の細胞毒性を決定するのに用いた。これらの実験において、試験化合物を、ＦＡＫ誘導または非誘導対照細胞へと接触するように置いた。表５は、増加していく濃度のＦＡＫ阻害剤での処理におけるＯＤ４５０ユニットでの、ＦＡＫリン酸化における変化を示す。表６は、オートラジオグラフィーフィルムの任意の「バンド光」ユニットで測定したデンシトメトリーによる定量、および増加していく濃度のＦＡＫ阻害剤の存在下におけるＦＡＫリン酸化の倍変化を示す。よって、本発明のアッセイはＦＡＫ薬物探索プログラムにおいて有利に使用することができる。
【００５０】
ＦＡＫ誘導可能な細胞に基づくアッセイは、ＦＡＫ阻害剤をスクリーニングするのに図３に記載されるように用いた。ＦＡＫ阻害剤の１０μＭ曲線は、表５に示すように１／２ｌｏｇ希釈で実施した。％阻害を決定し、そして５０％における阻害濃度（ＩＣ５０）を計算した。Ａ４３１：ＦＡＫＷＴ細胞をＴ２５フラスコに〜８０％集密度で播種し、そして処理しないままにおくか、または０．１ｎＭミフェプリストンで一晩刺激した。続いて、刺激した細胞を表５と同じＦＡＫ阻害剤で、同じ１０μＭ曲線の１／２ｌｏｇ濃度で、３０分間、３７℃、５％ＣＯ２で処理した。次いで、細胞溶解物を調製し、そして全タンパク質濃度をプロテインアッセイによって決定した。全タンパク質の等価な量をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、そしてホスホチロシンＦＡＫＹ９３７特異的抗体、通常のホスホチロシンｐＹ２０抗体、および抗ＦＡＫ（Ａ１７）抗体を用いてウエスタン分析にかけた。
【００５１】
【表５】
【００５２】
ＦＡＫ阻害剤についての計算された５０％の阻害濃度は〜０．９３μＭであった。
表６は、オートラジオグラフィーフィルムの自由裁量による「バンド光」ユニットで測定したデンシトメトリーによる定量、および増加していく濃度のＦＡＫ阻害剤の存在下におけるＦＡＫリン酸化の倍変化を示す。これらの実験はさらに本発明のアッセイのＦＡＫ薬剤探索プログラムにおける有用性を示す。
【００５３】
【表６】
【００５４】
タンパク質装填（loading）についての対照として、実験ＡにおけるＦＡＫタンパク質の量が等価であり、そしてＦＡＫ阻害剤とのインキュベーションはＦＡＫ発現にはいかなる効果をも及ぼさなかった。実験Ｂにおいて、表５で報告したＩＣ５０と矛盾せず、抗ＦＡＫｐＹ３９７ブロットは０．３７から１．１μＭの範囲の推定ＩＣ５０値を示し、ここで５０％濃度は１．１μＭに近かった。実験Ｃに見られるように、ＦＡＫ生物学に類似しそして矛盾せず、抗ｐＹ２０イムノブロットにより測定した全ＦＡＫリン酸化は、阻害剤により１．１から３．３μＭの推定ＩＣ５０の範囲で阻害され、ここで５０％阻害濃度は３．３μＭにより近かった。
【００５５】
ＦＡＫリン酸化の外因性対照
ＦＡＫのＥＣＭ刺激は、商業的に入手可能なフィブロネクチン（ＦＮ）９６ウェルプレートまたは社内で調製したＦＮ９６ウェルプレート上に２．０ｘ１０５細胞／ウェルでプレーティングすることにより行った。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で、１５、３０、６０または９０分間付着させるようにして、インテグリン会合（engagement）および続くＦＡＫリン酸化を誘導した。細胞溶解物をＲＩＰＡ溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１％ ＮＰ−４０、０．２５％ デオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ Ｎａ３Ｖｏ４、１ｍＭ ＮａＦ、および、５０ｍｌ溶液につきＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤ペレットを１つ）中で調製し、そして抗ＦＡＫで被覆した９６ウェルプレートに移して全ＦＡＫタンパク質を捕捉した。ホスホチロシンＦＡＫタンパク質を通常のホスホチロシン抗体Ｐｙ５４を用いて測定した。同様に、細胞を商業的に入手可能なマトリゲル被覆プレートまたは社内で調製したマトリゲルプレート上で刺激した。ウエスタン解析のために、細胞を商業的に入手可能なＥＣＭ被覆フラスコまたは社内で調製したＥＣＭ被覆フラスコに、上記に示した時間付着させるようにした。細胞溶解物をＲＩＰＡ溶解バッファー中で調製し、そして全およびホスホチロシンＦＡＫタンパク質を、破壊する（pull-down）か、または抗ＦＡＫ抗体または抗ホスホチロシン抗体を用いて免疫検出した。
【００５６】
細胞（例えば、Ａ２０５８ヒト転移性黒色腫）を９６ウェルプレートまたはＴ２５／Ｔ７５フラスコ上、増殖培地（ＤＭＥＭ １０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｇｌｕ）中に播種し、そして、３７℃、５％ＣＯ２でおよそ５時間、組織培養処理したプラスチックへ接着させるようにした。続いて、それらは０．１％ ＦＢＳ ＤＭＥＭ飢餓性培地中で一晩、３７℃、５％ＣＯ２で飢えさせ、続いて（１００μＭまでの）エンドセリンＩ、（１００ｎＭまでの）ボンベシン、または（８００ｎＭまでの）ＰＭＡでの処理によって刺激した。サイトカインへの曝露は、３７℃、５％ＣＯ２で、１０分から６０分までの長さで変化させた。全ＦＡＫタンパク質はＥＬＩＳＡフォーマットで捕捉するか、または抗ＦＡＫ特異的抗体を用いて免疫沈降した。ホスホチロシンＦＡＫタンパク質は次いで、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンフォーマットのいずれかにおいて、通常の抗ホスホチロシン抗体で検出した。
【００５７】
飢えさせた細胞（例えば、Ａ２０５８）を、４℃で３０分間予備冷却し、そして、変化させた濃度（２００μｇ／ｍｌのストック濃度の１：１００、１：３３０、１：１０００、１：３，３００、または１：１０，０００）のβ１−インテグリン抗体とともにインキュベーションした（４℃、３０分間）。β１−インテグリンのクラスタリングを、ヤギ抗マウス二次抗体の１：５００希釈物で４℃で３０分間誘導した。次いで、全細胞溶解物を溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ バナジン酸ナトリウム、１％ ＮＰ４０、プロテアーゼ阻害剤）中で調製し、そして全ＦＡＫタンパク質を抗ＦＡＫ抗体を用いて免疫沈降した。ホスホチロシンＦＡＫタンパク質は、抗ホスホチロシン抗体Ｐｙ５４を用いて測定した。
【００５８】
ＦＡＫＷＴおよびＦＡＫ変異体のクローニング（非誘導性およびＴｅｔ−ＯｎＴＭ／Ｔｅｔ−ＯｆｆＴＭシステム）
完全長ＦＡＫＷＴ ｃＤＮＡは、Ｔ細胞ｃＤＮＡライブラリーから、ＲＴ−ＰＣＲにおいて、プライマー ＦＡＤ５’Ｂａｍ：ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＴＧＣＴＴＡＣＣＴＴＧＡＣ（配列番号９）およびＦＡＫ３’Ｂａｍ：ＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＴＣＡＣＴＣＡＧＴＧＴＧＧＴＣＴＣＧＴＣＴＧＣＣＣＡ（配列番号１０）を用いてクローニングし、そして寄託番号Ｌ１３６１６に対して配列を確認した。ＦＡＫＷＴテンプレートの部位特異的変異誘発は、ストラタジーンＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ部位特異的変異誘発キットを用いて行った。クロンテックのあらかじめ作製されたＨｅＬａまたはＨＥＫ２９３ ｔｅｔ−Ｏｎ／ｔｅｔ−Ｏｆｆ細胞株へのエレクトロポレーションのためのプラスミドを産生するために、完全長ＦＡＫＷＴ、チロシンをつぶした変異体（ＦＡＫＹ３９７Ｆ）、およびキナーゼ活性のない変異体（ＦＡＫＫ４５４Ｒ）のｃＤＮＡをｐＴＲＥ：ＦＬＡＧベクターのＢａｍＨＩサイトへとサブクローニングした。以下のコンストラクト： ｐＴＲＥ：ＦＬＡＧベクター、ｐＴＲＥ：ＦＡＫＷＴＦＬＡＧ、およびｐＴＲＥ：ＦＡＫＹ３９７ＦＦＬＡＧを産生し、そしてＨｅＬａ Ｔｅｔ−Ｏｆｆ、ＨｅＬａ Ｔｅｔ−Ｏｎ、または２９３ Ｔｅｔ−Ｏｎへとエレクトロポレーションした。Ｇ４１８耐性クローンを選択し、ＤＭＥＭ＋１００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８増殖培地中で拡張した。
【００５９】
ＦＡＫＷＴおよびＦＡＫ変異体のクローニング（ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈＴＭシステム）
完全長の局所接着キナーゼ（ＦＡＫＷＴ）ｃＤＮＡをＴ細胞ｃＤＮＡライブラリーから、ＲＴ−ＰＣＲにおいて上記のプライマーを用いてクローニングし、そして寄託番号Ｌ１３６１６に対して配列を確認した。ＦＡＫＷＴテンプレートの部位特異的変異誘発は、ストラタジーンＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ部位特異的変異誘発キットを用いて行った。完全長ＦＡＫＷＴ、チロシンをつぶした変異体（ＦＡＫＹ３９７Ｆ）、およびキナーゼ活性のない変異体（ＦＡＫＫ４５４Ｒ）のｃＤＮＡをｐＧｅｎｅＶ５／Ｈｉｓ−ＡプラスミドのＢａｍＨＩ−ＡｐａＩサイトへとサブクローニングした。優性阻害のＦＡＫ関連非キナーゼ（ＦＲＮＫ）ｃＤＮＡをｐＧｅｎｅＶ５／Ｈｉｓ−Ａベクターのカセット中にＫｐｎＩ−ＡｐａＩ挿入物としてサブクローニングした。これらのプラスミドはＤＮＡ配列解析および制限消化解析によって確認した。続いて、これらのコンストラクトを、ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈＴＭタンパク質をコードするｐＳｗｉｔｃｈコンストラクトとともに、ＮＩＨ３Ｔ３、Ａ４３１、またはＵ８７ＭＧ細胞へと、ストラタジーンのＧｅｎｅＪａｍｍｅｒＴＭトランスフェクション試薬を用いて同時トランスフェクションした。トランスフェクタントを増殖させ、そしてＤＭＥＭ増殖倍地（１０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｇｌｕ）中で選択し、７５０μｇ／ｍｌのゼオシンおよび５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシン抗生物質でスパイクした。ハイグロマイシンおよびゼオシン耐性クローンを選択し、そして、ウエスタンおよびＲＴ−ＰＣＲフォーマットの両方でスクリーニングするために培養中で拡張した。
【００６０】
Ａ４３１・ＦＡＫクローンのスクリーニング
Ａ４３１・ＦＡＫＷＴおよびＡ４３１・ＦＡＫＹ３９７Ｆクローンを、Ｔ２５フラスコに、８０％集密度近くで播種し、そして、処理しないままにするか、または、０．１ｎＭミフェプリストンリガンドで一晩（〜１６時間）処理した。次いで、Ａ４３１トランスフェクタントは、ＲＩＰＡ溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．４、１％ ＮＰ−４０、０．２５％ デオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ ＮａＦ、および５０ｍｌ溶液あたりＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤ペレット１つ）中で溶解し、そして細胞溶解物を総タンパク質濃度についてアッセイした。等価な総タンパク質濃度を、標準のウエスタンブロッティング技術を用いて、ＦＡＫ、またはＦＡＫ変異体、タンパク質およびホスホチロシンＦＡＫＹ３９７についてのウエスタン解析免疫ブロッティングにかけた。陽性を示し、そして内因性ＦＡＫレベルに対して少なくとも３倍の誘導を示したクローンを、最適化およびＦＡＫの細胞に基づくアッセイの開発のために選択した。
【００６１】
クローンは、ＲＴ−ＰＣＲによってもスクリーニングし、そして検証した。細胞質性ｍＲＮＡ転写物を、ランダムヘキサマーを用いたｃＤＮＡ合成のために、Ａ４３１・ＦＡＫ野生型および変異体クローンから単離し、そして精製した。続いて、ポリメラーゼ連鎖反応を、Ｎ末端、内部ＦＡＫ配列およびＦＡＫのＣ末端に特異的なプライマーを用いて、Ａ４３１・ＦＡＫトランスフェクタントに由来するｃＤＮＡライブラリー上で行った。ｃＤＮＡライブラリーの質のためであるとともにトランスフェクションの内部対照として、抗生物質転写物のゼオシンまたはハイグロマイシンおよびＧＡＰＤＨに特異的なプライマーもまた、これらの遺伝子を増幅するのに用いた。
【００６２】
ＦＡＫ誘導可能な細胞に基づくシステムの至適化
Ａ４３１・ｐＧｅｎｅＶｅｃｔｏｒ、Ａ４３１・ＦＡＫＷＴ、Ａ４３１・ＦＡＫＫ４５４Ｒ、およびＡ４３１・ＦＡＫＹ３９７ＦクローンをＴ２５フラスコに８０％集密度近くで播種し、そして処理しないままにしておくか、または０．１、１０、または１００ｎＭのミフェプリストンリガンドで一晩（〜１６時間）処理した。ついで、Ａ４３１トランスフェクタントを、ＲＩＰＡ溶解バッファー（上述）中で溶解し、そして細胞溶解物を総タンパク質濃度についてアッセイした。等価な総タンパク質濃度を、標準のウエスタンブロッティング技術を用いて、ＦＡＫ、またはＦＡＫ変異体、タンパク質およびホスホチロシンＦＡＫＹ３９７についてのウエスタン解析免疫ブロッティングにかけた。ウエスタンフォーマットにおけるミフェプリストン濃度の至適化がＥＬＩＳＡシステムにも転じる（translate）ことを決定するために、ミフェプリストン濃度およびインキュベーション時間をＥＬＩＳＡフォーマットについても至適化した。
【００６３】
Ａ４３１・ｐＧｅｎｅＶｅｃｔｏｒ、Ａ４３１・ＦＡＫＷＴ、およびＡ４３１・ＦＡＫＹ３９７Ｆクローンを９６ウェルＵ底プレート中に、１．２ｘ１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種した。細胞を、ミフェプリストンリガンドでのＦＡＫ誘導の前に、３７℃、５％ＣＯ２で、６から８時間おいた。続いて、Ａ４３１クローンを処理しないままにおくか、または０．１、１０、１００または１１０ｎＭのミフェプリストンで〜０．５、１．０、２．０、４．０または２４．０時間、３７℃、５％ＣＯ２で処理した。次いで、細胞をＲＩＰＡ溶解バッファー中で溶解し、そして、１００μｌの細胞溶解物（総タンパク質４５μｇ）を９６ウェルプレートに移した。続いて、ＦＡＫまたはＦＡＫ変異体タンパク質およびホスホチロシンＦＡＫＹ３９７は、それぞれＦＡＫ特異的抗体またはホスホチロシンＦＡＫＹ３９７抗体で被覆したヤギ抗マウスまたはヤギ抗ウサギプレート上に捕捉した。ＦＡＫまたはＦＡＫ変異体タンパク質を捕捉するために、例えば、１００μｌの細胞溶解物（総タンパク質４５μｇ）とともにインキュベーションする前に、ヤギ抗マウスプレートを０．５μｇ／ｍｌの抗ＦＡＫ（ＵＢＩ）モノクローナル抗体で被覆した。次いで、捕捉したＦＡＫまたはＦＡＫ変異体タンパク質の検出は、抗ＦＡＫ（Ａ１７）ポリクローナル抗体によって測定した。同様に、ホスホチロシンＦＡＫＹ３９７タンパク質の捕捉は、ヤギ抗ウサギプレートを３．５μｇ／ｍｌの抗ＦＡＫｐ［Ｙ３９７］ポリクローナル抗体で被覆し、続いて抗ＦＡＫ（ＵＢＩ）モノクローナル抗体を用いた検出によって行った。
【００６４】
パラメータは、利用する特定の高スループットスクリーニングシステムについて至適化することができ、これには９６ウェルプレートの種類（例えば、抗ウサギ、プロテインＡ、またはプロテインＧ）、捕捉抗体濃度、検出抗体濃度、二次セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抗体濃度、細胞密度、ブロッキングバッファー（例えば、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキングＴＢＳ、３％ＢＳＡブロッキング）、および化合物処理時間、を評価することを含む。
【００６５】
残基Ｙ３９７でリン酸化されている精製ＧＳＴ・ＦＡＫタンパク質を用いて、捕捉抗体濃度の至適化を、９６ウェル抗ウサギプレートを増加していく濃度の抗ＦＡＫｐ［Ｙ３９７］リン特異的（phosphospecific）抗体で被覆することによって最初に決定した。捕捉されたリン特異的ＧＳＴ・ＦＡＫＹ３９７ 対 抗ＦＡＫｐ［Ｙ３９７］抗体濃度のプロットを、至適捕捉抗体濃度を決定するために作製した。この予備的抗ＦＡＫｐ［Ｙ３９７］捕捉濃度を用いて、その他のパラメータ（検出および二次抗体濃度、細胞密度、ブロッキングバッファー）を至適化し、そして高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）を設定した。これらのパラメータのほとんどは、９６ウェルマトリクスを確立することにより、またはいくつかの順列間のシグナル対ノイズ比の変化を交差比較（cross-comparing）することにより、同時に至適化されまたは評価される。例えば、３．５μｇ／ｍｌの抗ＦＡＫｐ［Ｙ３９７］捕捉抗体で被覆した９６ウェル抗ウサギプレート上で、増加していく濃度の検出および二次ＨＲＰ抗体を、これらの抗体の濃度を至適化するために、９６ウェルマトリックスに設置して捕捉されたホスホチロシンＦＡＫＹ３９７タンパク質を検出する。この実験は、システムを至適化するために、プロテインＡプレート上で繰り返してもよく、および／またはブロッキングバッファーまたはその他のパラメータを変えることによって、順列の数の間のシグナル対ノイズ値を交差比較すしてもよい。
【００６６】
ＦＡＫの細胞に基づくアッセイの評価
Ａ４３１・ＦＡＫＷＴ細胞をＴ２５フラスコに８０％集密度近くで播種し、そして、処理しないままにしておくか、または０．１ｎＭのミフェプリストンリガンドで一晩（〜１６時間）処理した。Ａ４３１・ＦＡＫＷＴ非誘導または誘導細胞を１０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、そして１５ｍｌの増殖培地（ＤＭＥＭ １０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｇｌｕ、７５０μｇ／ｍｌゼオシン、５０μｇ／ｍｌハイグロマイシン）中、３７℃、５％ＣＯ２で３０、６０、９０、または１２０分間、懸濁した。続いて細胞をＲＩＰＡ溶解バッファー（上述）中で溶解し、そして細胞溶解物を総タンパク質濃度についてアッセイした。等価な総タンパク質濃度を、標準的なウエスタンブロッティング技術を用いてＦＡＫまたはホスホチロシンＦＡＫＹ３９７タンパク質についてのウエスタン解析免疫ブロッティングにかけた。
【００６７】
Ａ４３１・ＦＡＫＷＴおよびＡ４３１・ＦＡＫＹ３９７Ｆクローンを、Ｔ２５フラスコに８０％集密度近くで播種し、そして、処理しないままにしておくか、または０．１ｎＭミフェプリストンリガンドで一晩（〜１６時間）処理した。続いて、Ａ４３１・ＦＡＫＷＴ細胞を、増加していく濃度の、ＦＡＫ誘導可能な細胞に基づくアッセイを用いて同定されたＦＡＫ阻害剤（１０μＭ開始濃度の２分の１ ｌｏｇ（half-log）希釈）で処理した。次いで、細胞溶解物をＲＩＰＡ溶解バッファー中で調製し、そして総タンパク質濃度についてアッセイした。等価な総タンパク質濃度を、標準的なウエスタンブロッティング技術を用いて、ＦＡＫ、通常のホスホチロシンＦＡＫ、またはホスホチロシンＦＡＫＹ３９７タンパク質についてのウエスタン解析免疫ブロッティングにかけた。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ複合化ホスホチロシン抗体（ｐＹ５４ＨＲＰ）を用いるリン酸化ＦＡＫの検出を示す模式図である。
【図２】図２は、非複合化ホスホチロシン抗体（ｐＹ５４）に続いて二次マウスセイヨウワサビペルオキシダーゼ抗体を用いる、リン酸化ＦＡＫの検出を示す模式図である。
【図３】図３は、本発明のＦＡＫ誘導可能な細胞に基づくアッセイを示す模式図である。
【配列表】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
本発明は、増殖因子応答および細胞遊走に関わるシグナルタンパク質をコードし、そしてまた疾患に関係する、局所接着キナーゼ（ＦＡＫ）遺伝子の発現を誘導するための方法および組成物に関する。本発明はＦＡＫ阻害剤の同定にも向けられる。
【０００２】
ＦＡＫは、細胞質性の、非受容体チロシンキナーゼである。ＦＡＫは、種々の刺激の群（例えば、インテグリン、サイトカイン、ケモカイン、および増殖因子）からのシグナリングを伝達して、細胞増殖、遊走、形態、および細胞生存を含む様々な細胞の経路および過程を制御する。ほとんどの種類の組織において発現することに加えて、ＦＡＫはほとんどのヒトの癌、特に高度に浸潤性の転移、において高いレベルで見られる。優性阻害のＦＡＫ関連非キナーゼ（ＦＲＮＫ）のヒト癌細胞における発現は、細胞の丸い形態、局所プラークの不可逆的喪失、およびそれに続く細胞死という結果となることが示されている。さらに、ＦＲＮＫの制御された発現は、ＦＡＫの減少したチロシンリン酸化を生じ、これはＦＡＫリン酸化の阻害はヒトの癌の治療のための療法的指標を生じるかもしれないことを示唆している。
【０００３】
ＦＡＫ活性化に導く正確な機構はよく分かっていないが、Ｙ３９７（位置３９７におけるチロシン残基）におけるリン酸化を生ずるＦＡＫ酵素活性は、インテグリンシグナル伝達において重要なステップであると信じられている（Ｇｕａｎ，ＪＬ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ２９： １０８５−９６，１９９７）。膜貫通インテグリン受容体は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質を細胞のアクチン細胞骨格と連結し、そして核が細胞形態、組織構築、および付着誘導遺伝子発現を調節するのに重要である。インテグリン受容体とＦＡＫの局所接着の部位への共局在は、残基Ｙ３９７でのＦＡＫリン酸化を導き、Ｓｒｃ−ファミリーチロシンキナーゼのためのＳＨ２ドッキング部位を作り出すと信じられている。ホスホチロシンＦＡＫＹ３９７へのＳｒｃ結合は、Ｙ５７６、Ｙ５７７、Ｙ８６１、およびＹ９２５を含む種々の下流チロシン残基でのＦＡＫの優先的なリン酸化へと導く。ＦＡＫチロシン残基（Ｙ５７６／Ｙ５７７）のリン酸化は、増加したＦＡＫキナーゼ活性ならびに細胞骨格の再構築、細胞増殖、細胞生存、および細胞遊走を調節するシグナル伝達へと導く。
【０００４】
インテグリンシグナリングカスケードにかかわるキナーゼおよび基質の多様性のために、特定のキナーゼについて特異的なアッセイを設計することが好ましい。本発明の目的は、ＦＡＫの生化学的機構を追跡するＦＡＫ薬剤発見経路を設計しそして開発することにある。いくらかの外因性刺激がＦＡＫリン酸化を導くことができる、例えば（１）ＥＣＭリガンドに結合しているインテグリン（例えば、フィブロネクチンへのインテグリンβ１）；（２）サイトカインまたはケモカイン刺激（例えば、エンドセリン１／２、ボンベシン、またはＰＭＡ）；（３）チロシンキナーゼ受容体の増殖因子刺激（例えば、ＰＤＧＦＢＢ）；そして（４）インテグリン抗体架橋（例えば、抗−β１）。反対に、ＦＡＫ不活性化を導く最も実行可能な外因性対照は、細胞−細胞間および細胞−ＥＣＭ間の接触の剥離である（例えば、細胞懸濁液）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明のまとめ
本発明は、局所接着キナーゼ（ＦＡＫ）の細胞活性（cell-active）阻害剤を同定する方法であって：
（ａ）ＦＡＫをコードする遺伝子の発現を誘導するために誘導剤を哺乳動物細胞に加え、ここで当該哺乳動物細胞は当該遺伝子で安定にトランスフェクトされ、そして当該遺伝子は当該誘導剤の存在下で発現する；
（ｂ）試験化合物を加え；
（ｃ）ＦＡＫ捕捉剤を用いて発現したＦＡＫを捕捉し；そして、
（ｄ）当該ＦＡＫのリン酸化を検出する；
ことを含んでなる、前記方法に関する。
【０００６】
本発明の一態様は、試験化合物の細胞毒性を測定する方法であって、哺乳動物細胞をＦＡＫをコードする遺伝子で安定にトランスフェクトし、ここで当該遺伝子は誘導剤の存在下で発現する；誘導剤を加えてＦＡＫをコードする当該遺伝子の発現を誘導し；試験化合物を加え；当該細胞に細胞毒性指示薬を加え；そして、当該試験化合物の細胞毒性を検出する、ことを含んでなる前記方法を提供する。特定の態様において、試験化合物の細胞毒性は細胞毒性指示薬の比色の転換によって測定され、ここで転換した細胞毒性指示薬の量は生細胞の数に比例する。
【０００７】
本発明の一態様は、組換え核酸分子で安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞を提供し、ここで当該組換え核酸分子は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群から選択され、そしてここで、当該配列の発現は誘導剤の存在を必要とする。
【０００８】
本発明の一態様は、配列番号１、２、３および４からなる群から選択される配列を含んでなるタンパク質をコードする組換え核酸分子で安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞を提供し、ここで当該タンパク質の発現は誘導剤の存在を必要とする。
【０００９】
詳細な説明
本発明は、ＦＡＫについての誘導可能な細胞に基づくアッセイを対象とする。細胞に基づくアッセイはＦＡＫの生物学、そしてＦＡＫ発現および位置３９７のチロシン残基（Ｙ３９７）におけるＦＡＫリン酸化を外因的に制御するための誘導可能な遺伝子発現システム、を活用する。通常のホスホチロシン系よりもむしろ、ＦＡＫＹ３９７リン酸化特異的な細胞に基づくアッセイを用いることにより、擬陽性阻害剤の同定を防ぐ。本発明の細胞に基づくアッセイは、柔軟性があり、そしてＹ３９７におけるＦＡＫリン酸化、ＦＡＫリン酸化全体の測定、変異ＦＡＫタンパク質の同定、およびタンパク質とホスホチロシンの組み合わせの測定、をすることができる。
【００１０】
本発明の細胞に基づく誘導可能なＦＡＫアッセイは、異所性の基底レベルＦＡＫ発現についての厳格な制御、および外因性の刺激剤を介したＦＡＫ遺伝子発現の迅速な抑制解除を提供する点において有利である。細胞に基づくアッセイは、最終的な読み出しが、ホスホチロシンＦＡＫＹ３９７、ＦＡＫホスホチロシン全体のプロファイル、ＦＡＫまたは変異タンパク質、またはタンパク質とホスホチロシンのいくつかの組み合わせ、について測定されたＦＡＫ生物学と機構的に等価であるように柔軟性がある。さらに、本発明はいくらかのＦＡＫ阻害剤を同定するのに首尾よく用いられた。本明細書に置いて、用語「厳格な制御」は、外因性の刺激剤の存在下で起こる、ＦＡＫ遺伝子の制御された発現を意味する。言い換えると、本発明は、適切な誘導剤の存在下でＦＡＫの発現が誘導される、ＦＡＫについての誘導可能な遺伝子発現システムを提供する。本発明はＦＡＫの誘導可能な発現のための方法、ここでＦＡＫ遺伝子の調節された発現は細胞生存度に不利に影響しない、を提供する。
【００１１】
本発明の一態様は、ＦＡＫ阻害剤のスクリーニングのための細胞に基づくアッセイに向けられる。細胞に基づくアッセイはＦＡＫの生物学、そしてＦＡＫ発現および位置３９７のチロシン残基（Ｙ３９７）におけるＦＡＫリン酸化を外因的に制御するための誘導可能な遺伝子発現システムを活用する。細胞に基づくアッセイは、ＦＡＫ生物学と機構的に等価であり、そしてＦＡＫリン酸化における変化を測定する。通常のホスホチロシン系よりもむしろ、ＦＡＫＹ３９７リン酸化特異的な細胞に基づくアッセイを用いることにより、擬陽性阻害剤の同定を防ぐ。本発明の細胞に基づくアッセイは、柔軟性があり、そしてＦＡＫリン酸化、ＦＡＫリン酸化の全体の測定、変異ＦＡＫタンパク質の同定、およびタンパク質とホスホチロシンの組み合わせの測定、をすることができる。
【００１２】
本発明の一態様は、ＦＡＫの細胞活性阻害剤を同定する方法であって、ＦＡＫをコードする遺伝子で哺乳動物細胞を安定にトランスフェクトし、ここで当該遺伝子は誘導剤の存在下で発現する；誘導剤を加えてＦＡＫをコードする当該遺伝子の発現を誘導し；試験化合物を加え；ＦＡＫ捕捉剤を用いて発現したＦＡＫを捕捉し；捕捉したＦＡＫを抗ホスホチロシン抗体に曝露し；そして、当該ＦＡＫのリン酸化を検出する；ことを含んでなる、前記方法を提供する。いくつかの態様において、ＦＡＫのリン酸化の度合いを、捕捉されたＦＡＫへの抗ホスホチロシン抗体の結合により決定する、ここで捕捉されたＦＡＫへ抗ホスホチロシン抗体が結合した量は、当該ＦＡＫのリン酸化の量に比例する。
【００１３】
本発明の特定の態様において、ＦＡＫの細胞活性阻害剤を同定するための方法は、哺乳動物細胞を第一の固相上に被覆する、所望による工程を含んでなる。第一の固相は、好ましくは第一のマイクロタイタープレートのウェルである。本発明の他の態様において、第一の固相上に被覆された細胞は、発現したＦＡＫの捕捉の前に、溶解バッファーで溶解する。溶解バッファーは所望により可溶化界面活性剤を含んでなる。特定の態様において、ＦＡＫ捕捉剤は第二の固相、好ましくは第二のマイクロタイタープレートのウェル、上に被覆する。
【００１４】
特定の態様において、試験化合物はＹ３９７におけるＦＡＫのリン酸化を阻害する。
本発明の一態様は、試験化合物の細胞毒性を測定するための方法であって、ＦＡＫをコードする遺伝子で哺乳動物細胞を安定にトランスフェクトし、ここで当該遺伝子は誘導剤の存在下で発現する；誘導剤を加えてＦＡＫをコードする当該遺伝子の発現を誘導し；試験化合物を加え；当該細胞に細胞毒性指示薬を加え；そして該試験化合物の細胞毒性を検出する；ことを含んでなる、前記方法を提供する。特定の態様において、試験化合物の細胞毒性は細胞毒性指示薬の比色の転換によって測定され、ここで転換した細胞毒性指示薬の量は生細胞の数に比例する。
【００１５】
本発明の特定の態様において、試験化合物の細胞毒性を測定する方法は、哺乳動物細胞を固相上に被覆する所望による工程を含んでなる。固相は、好ましくは第一のマイクロタイタープレートのウェルである。
【００１６】
本発明の一態様は、局所接着キナーゼ（ＦＡＫ）の細胞活性阻害剤を同定する方法であって、細胞が第一の固相に接着するように哺乳動物細胞の均一な集団を第一の固相に被覆し、ここで当該細胞はＦＡＫをコードする遺伝子で安定にトランスフェクトされ、そしてここで当該遺伝子は誘導剤の存在下で発現する；誘導剤を加えてＦＡＫをコードする当該遺伝子の発現を誘導し；試験化合物を加え；接着細胞を可溶化して細胞溶解物を遊離させ；ＦＡＫ捕捉剤が第二の固相に接着するように、ＦＡＫ捕捉剤で第二の固相を被覆し；ＦＡＫ捕捉剤がＦＡＫを捕捉するように、細胞溶解物を接着したＦＡＫ捕捉剤に曝露し；捕捉したＦＡＫを抗ホスホチロシン抗体に曝露し；捕捉したＦＡＫへの抗ホスホチロシン抗体の結合を測定する、ここで捕捉したＦＡＫへの抗ホスホチロシン抗体の結合量は、当該ＦＡＫのリン酸化の量に比例する；ことを含んでなる、前記方法を提供する。
【００１７】
本発明の別の態様は、組換え核酸分子で安定にトランスフェクトとされた哺乳動物細胞であって、ここで、当該組換え核酸分子は配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群より選択され、そしてここで、当該配列の発現は誘導剤の存在を必要とする、前記哺乳動物細胞を提供する。
【００１８】
本発明の一態様は、配列番号１、２、３および４からなる群より選択される配列を含んでなるタンパク質をコードする組換え核酸分子で安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞、そしてここで当該タンパク質の発現は誘導剤の存在を必要とする、を提供する。
【００１９】
ＦＡＫは、タンパク質−チロシンキナーゼ２、ＰＴＫ２、としても知られている。いずれの活性なＦＡＫ変異体をも上記アッセイに使用することができる。不活性型の変異体もまた、種々の対照の目的のためのアッセイに用いることができる。上記に記載のアッセイに使用できる追加のＦＡＫの変異体は、１０５２アミノ酸のＩ５３０１２の野生型（ＷＴ）ヒトＦＡＫ（配列番号１）；Ａｎｄｒｅ，Ｅ．およびＢｅｃｋｅｒ−Ａｎｄｒｅ，Ｍ．，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｆｏｒｍ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｋｉｎａｓｅ ｉｎ ｂｒａｉｎ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． １９０：１４０−１４７，１９９３（ＡＡＡ３５８１９の８７９アミノ酸変異体、ＰＣ１２２６の５５４アミノ酸変異体、およびＰＣ１２２７の４３１アミノ酸変異体を記載）に記載されるようなＦＡＫのスプライスバリアント；ＸＰ ０５０３３７のＦＡＫの５７０触媒ドメイン；ヒトＦＡＫに対して１０２３／１０５２アミノ酸同一性（９７％）のＮＰ ０３２００８．１のマウスＦＡＫ；ヒトＦＡＫのアミノ酸１−９０３に対して８７８／９０４アミノ酸同一性（９７％）のマウスＦＡＫカルボキシル切断バリアント；ヒトＦＡＫに対して１０２０／１０５５アミノ酸同一性（９６％）のＮＰ ０３７２１３．１のラットＦＡＫ；ヒトＦＡＫに対して１０１７／１０５５アミノ酸同一性（９６％）のＪＣ５４９４のＦＡＫ変異体；ヒトＦＡＫに対して９８８／１０５４アミノ酸同一性（９３％）のＱ００９４４のトリＦＡＫ；ヒトＦＡＫに対して９６５／１０２９アミノ酸同一性（９３％）のＡ４５３８８のトリＦＡＫ変異体；ＦＡＫ Ｙ３９７Ｆ（配列番号２）、Ｋ４５４Ｒ（配列番号３）、ＦＲＮＫ（イニシエーターＭＥＴに先行されるＦＡＫ残基６９４−１０５２を有するアミノ末端切断体）（配列番号４）を含む合成ＦＡＫ変異体、およびＦＡＫ Ｙ３９７Ｄ、Ｙ３９７Ｅ、Ｙ５７７Ｄ、Ｙ５７７Ｅ、Ｙ８６１Ｄ、Ｙ８６１Ｅ、Ｙ９２５Ｄ、Ｙ９２５Ｅを含む種々のリン酸化模倣体、ならびにそれらの組み合わせ；Ｃｈａｎ Ｐら、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）；２６９（３２）：２０５６７−７４に記載されるＣＤ２−ＦＡＫ融合体（構成的な、ＣＤ２との活性ＦＡＫ融合体）、を含む。
【００２０】
本明細書において、用語「誘導剤」は、少なくとも６倍のシグナル対ノイズ比を生じる、剤、化合物、または化学物質である。誘導剤の例は、非限定的に、ミフェプリストン（Mifepristone）（Ｒｕ４８６）ならびに、Ｏｒｇ３１８０６およびＯｒｇ３１３７６のようなその他のアンチプロゲスチン類を含む。Ｏ’Ｍａｌｌｅｙら、Ｃｅｌｌ，６９，７０３−７１３（１９９２）を参照されたい。本明細書において、捕捉剤は、ヒスチジン残基、ストレプトアビジンまたはその他の同等のアフィニティータグ、でタグ付けされたＦＡＫを含む、いずれかの型の局所接着キナーゼを捕捉可能な、剤、化合物または化学物質である。捕捉剤は、非限定的に、ホスホチロシンＦＡＫＹ３９７特異的抗体、一般のホスホチロシン抗体、抗ＦＡＫ抗体、抗ヒスチジンタグ抗体、およびストレプトアビジン修飾ＦＡＫの捕捉を容易にするビオチンを含有する分子、が含まれる。本発明の特定の態様において、捕捉剤は、ヤギ抗ウサギ抗体およびホスホチロシンＦＡＫＹ３９７特異的抗体の組み合わせを非限定的に含む、１またはそれより多くの抗体の組合せを含む。
【００２１】
本明細書において、用語「抗ホスホチロシン抗体」は、非限定的に、ホスホチロシンＦＡＫＹ３９７特異的抗体ならびに一般のホスホチロシン抗体を含み、後者は、非限定的にＦＡＫの位置３９７のチロシン残基を含む、いずれのリン酸化チロシン残基をも認識することが可能である。
【００２２】
本明細書において、細胞毒性指示薬は、細胞生存度を評価するのに用いる剤、化学物質または化合物である。細胞毒性指示薬の例は、非限定的に、この種の解析に特に有用なテトラゾリウム塩（例えば、ＭＴＴ、ＸＴＴ、ＷＳＴ−１）を含む。
【００２３】
ＭＴＴは、黄色のテトラゾリウム塩であり、代謝活性のある細胞によって紫色のホルマザン結晶に切断される。可溶化されたホルマザン生成物は、ＥＬＩＳＡリーダーまたはその他の分光光度的な装置を用いて、分光光度的に定量化される。生存数は、吸光度によりモニターされる、形成した紫色のホルマザン結晶の量に直接関連する。
【００２４】
本発明の一態様は、矛盾のない厳格な遺伝子発現調節を提供する能力を有する、誘導可能なＦＡＫ遺伝子発現系を用いて行う。本発明の一態様において、導入遺伝子、例えばＦＡＫ、の調節された発現のための系を含んでなる、誘導可能なＦＡＫ遺伝子発現システムを提供する。ＦＡＫ発現は、誘導剤の非存在下では「オフ」であり、しかし、その存在下では「オン」になる。当該システムは二つの遺伝子からなる：ひとつは調節タンパク質をコードし、そして他方は誘導可能な目的の導入遺伝子をコードする。調節タンパク質の発現は、構成的プロモーターによって駆動する。誘導可能なＦＡＫ導入遺伝子は、調節タンパク質を結合可能な結合部位の多数コピーを連結した最小プロモーターからなるプロモーターを有する。
【００２５】
本発明の一態様において、調節タンパク質は、酵母ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン、切断されたヒトプロゲステロン受容体リガンド結合ドメイン、およびＮＦ−κＢからのヒトｐ６５活性化ドメイン、からなる転写因子であり、導入遺伝子の基底発現について厳格な調節を容易にする。調節タンパク質をコードするプラスミドは、正のフィードバックループを確立してリガンド処理の際の迅速な応答を容易にする、ＧＡＬ４プロモーターを含有する。調節タンパク質の外因性の制御は、小分子リガンドを用いて行う。調節タンパク質の導入遺伝子のプロモーターへの種特異的結合により、そして、調節タンパク質のリガンド依存性高次構造的活性化を通して、厳格な調節を行う。
【００２６】
よって、特定の態様において、本発明は以下の利点がある：
・生存細胞クローンを生じる、誘導されていないときの遺伝子発現の厳格な抑制を可能にする、誘導可能な系を用いた細胞におけるＦＡＫの誘導。
・リン酸化ＦＡＫの検出をＦＡＫキナーゼ活性の阻害剤を同定するのに用いてもよい。リン酸化ＦＡＫを検出するいくつかの方法は、ＦＡＫ阻害剤の同定のための、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に基づくアッセイ、およびＥＬＩＳＡに基づくアッセイを含む。他の適切な検出システムもまた、用いてよい。
・アッセイはＦＡＫタンパク質全体、リン酸化ＦＡＫタンパク質の全体、または定められたチロシン（例えばチロシン３９７）でリン酸化されたＦＡＫタンパク質、の検出を可能にする。
・トランスフェクトした細胞が腫瘍原性であり、そしてミフェプリストンを動物に与えることによりＦＡＫをｉｎ ｖｉｖｏで誘導することができるので、細胞に基づくアッセイをＦＡＫ阻害剤のｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングに用いてもよい。当該系のｉｎ ｖｉｖｏでの有用性は証明されている。
【００２７】
比較例
比較例１
アッセイシグナルおよびノイズを改善することを期待して、種々の細胞背景において安定に異所的に発現したＦＡＫまたはＦＡＫ変異体を生じる試みを行った。しかしながら、これらの成果は、ほとんどの細胞がＦＡＫタンパク質レベルの変化に感受性を示し、そして細胞に基づくアッセイを開発するための生存クローンを形成しなかったため、不成功に終わることが証明された。ＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞またはＡ２０５８ヒト転移性黒色腫細胞のような、低度から中程度のレベルの内因性のＦＡＫを発現する細胞は、ＦＡＫの発現を内因性レベルについて２倍を超えては許容しなかった。結果的に、これらのクローンは、上述の理由と同様の理由により、アッセイに開発に不十分であることが証明された：刺激および再現性の悪さ、高いバックグラウンドノイズ、そして薬剤の発見に貢献しない。したがって、天然のＦＡＫを含有する細胞における非誘導性のＦＡＫの発現は、ＦＡＫ発現の誘導を研究するのに適していないことがわかった。
【００２８】
比較例２
中程度のおよび高スループットスクリーニング（ＥＬＩＳＡ系）、そしてＦＡＫの生化学的機構を追跡することの両方に貢献する、ＦＡＫの細胞に基づくアッセイを開発するために、ＦＡＫ生物学を活用するためのいくつかのアプローチをとった。例えば、フィブロネクチン、もしくはコラーゲン、またはマトリゲルのようなその他のＥＣＭ、のような細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質上に細胞をプレーティングすることにより、ＦＡＫの接着細胞刺激を模倣することを試みたが、このアプローチは、ＦＡＫの悪い刺激という結果になり不十分であることが証明され、そして完全に細胞の型に依存した。さらに、ＥＣＭマトリゲルに誘導される細胞の付着は、ｐＹ５４ＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−複合化ホスホチロシン抗体）により測定したところＦＡＫリン酸化の刺激がないという結果になり、そして二次抗マウスＨＲＰ（２ｏＭＨＲＰ）単独で用いた対照の検出は、マトリゲル上で刺激された細胞に由来する溶解物でインキュベートしたウェルにおいて非特異的なアッセイシグナルの増加という結果になった。ｐＹ５４ＨＲＰおよび２ＯＭＨＲＰの組み合わせを用いた場合のシグナルとノイズの比（Ｓ／Ｎ）は、１．０から１．７の範囲であり、一方でｐＹ５４（非複合化ホスホチロシン抗体）および２ＯＭＨＲＰの組み合わせでは、１．０から２．４のＳ／Ｎ比を生じた。このことは、アッセイシグナルの非特異的増加は、細胞溶解物中のいくつかのマトリゲル混入物に対する交差反応性（cross-reactivity）によるものであることが示唆され、そして確認された。よって、適切なＦＡＫの細胞に基づくアッセイの開発についての上記のアプローチは実行可能ではない。
【００２９】
結果はまた、ＥＣＭマトリゲルまたはフィブロネクチンのいずれかへの細胞付着における、中程度のそして次善の２から３倍のシグナル対ノイズのＦＡＫリン酸化の刺激を示した。細胞数、細胞−ＥＣＭ付着時間、検出抗体および捕捉抗体の種類、ならびにエンドセリン−１およびホルボール １２−ミリステート １３−アセテート（ＰＭＡ）を用いたコンビナトリアル刺激を変えることによる、これらのアッセイ条件のさらなる至適化は、これらの誘導可能ではないＦＡＫ刺激方法は、アッセイの開発について不十分であり、再現性がなく、そして実現可能ではないことを示した。
【００３０】
比較例３
インテグリンクラスタリングがＦＡＫリン酸化を導くので、β１インテグリンに特異的な抗体を用いてインテグリン受容体を架橋する抗体の実現可能性について試験した。しかしながら、これらの成果はまた、ＦＡＫ刺激の間接的方法は高い変動性と再現性のなさを導くため、失敗であることがわかった。例えば、インテグリンβ１架橋は、最適な刺激には、時間がかかりそして管理するのが困難な温度感受性の工程が必要であったため、中程度のスループットスクリーニングにおいても煩雑すぎることがわかった。さらに、ポリスチレンプレート上の細胞をより低いバックグラウンドノイズに維持することは、悪いＥＣＭ接触のために細胞生存度が低下するという結果になり、それによってこれらの誘導可能ではない発現系はアッセイの開発ついて実行可能ではなかった。
【００３１】
比較例４
ＦＡＫの細胞に基づくアッセイの開発を進めるために、種々の細胞背景において、野生型または変異ＦＡＫタンパク質を発現する安定なクローンを産生する試みを行った。構成的に活性なタンパク質（ＣＤ２・ＦＡＫ）、膜結合性のチロシンをつぶした（tyrosine-dead）タンパク質（ＣＤ２・ＦＡＫＹ３９７Ｆ）、鍵となる下流チロシン残基を欠く細胞質性ＦＡＫ変異体（例えば、ＦＡＫＹ８６１Ｆ、ＦＡＫＹ９２５Ｆ、およびＦＡＫＹ８６１Ｆ／Ｙ９２５Ｆ）のいずれかをコードするＦＡＫ ｃＤＮＡ転写物を宿したクローンを産生した。これらの生物学的ツールは、上述した点を扱うため、そして薬剤の発見に貢献する丈夫で再現性のある細胞に基づくアッセイの開発を必要とするために、ＦＡＫ生物学の知識に基づいて戦略的に設計した。
【００３２】
ベクター構築物またはＬａｃＺタンパク質のいずれかを発現する生存対照細胞は得られたものの、ＦＡＫＷＴを過剰発現する安定なクローンを産生する試みは失敗であった。ＦＡＫ変異体構築物のトランスフェクションは、Ｙ３９７におけるＦＡＫリン酸化およびキナーゼ活性を保存してＦＡＫの下流リン酸化を遮断する（ＦＡＫＹ８６１Ｆ、ＦＡＫＹ９２５Ｆ、およびＦＡＫＹ８６１Ｆ／Ｙ９２５Ｆ）、またはインテグリンレセプターの要求性を回避する（ＣＤ２・ＦＡＫＷＴおよびＣＤ２・ＦＡＫＹ３９７Ｆ）ことのいずれかのように設計されたが、これらもまた失敗であることがわかった。ヒト転移性黒色腫Ａ２０５８のような、内因性ＦＡＫを低度から中程度のレベルで発現する細胞において、生存クローンが同定された。しかし、Ａ２０５８・ＦＡＫＷＴクローンは、約２倍のＦＡＫレベルの増加のみを示し、これはＦＡＫの細胞に基づくアッセイの開発には不十分であった。
【００３３】
外因性刺激、基底ＦＡＫリン酸化についての対照、および異所的に発現するＦＡＫクローンの試みについての研究に加えて、ＦＡＫＷＴおよびチロシンをつぶしたＦＡＫＹ３９７Ｆ ｃＤＮＡに、Ｔｅｔ−Ｏｎ／Ｔｅｔ−Ｏｆｆ誘導可能な系を用いてテトラサイクリン制御を受けさせた。しかしながら、ＦＡＫＷＴまたはＦＡＫＹ３９７Ｆ形質転換体は検出されなかった。生存クローンが同定できなかったので、ＦＡＫＷＴまたはＦＡＫＹ３９７Ｆ Ｔｅｔ−形質転換体における「漏出度（leakiness）」、すなわち基底発現の不十分な調節、のレベルは決定できなかった。Ｔｅｔ−ＯｎＴＭ／Ｔｅｔ−ＯｆｆＴＭ系は、標的タンパク質発現について変化する対照を示し、そしてそれによってＦＡＫのような致死遺伝子の調節には適していないことを示した。
【実施例】
【００３４】
実施例
野生型ＦＡＫＷＴ（配列番号５）、チロシンをつぶした（tyrosine-dead）ＦＡＫＹ３９７Ｆ（配列番号６）、キナーゼ活性のない（kinase-dead）ＦＡＫＫ４５４Ｒ（配列番号７）および優性阻害のＦＡＫ関連非キナーゼ（ＦＲＮＫ）（配列番号８）を、ＢａｍＨＩ−ＡｐａＩまたはＫｐｎＩ−ＡｐａＩ挿入物のいずれかとしてＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈＴＭ ｐＧｅｎｅＶ５／Ｈｉｓ Ａ−ベクター骨格にクローニングした。本明細書において、用語「ＦＡＫをコードする遺伝子」は非限定的に、配列番号１〜４を含む。これらの構築物は、ヒトＦＡＫについてＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｌ１３６１６（Ｗｈｉｔｎｅｙ，Ｇ．Ｓ．ら、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２（９），８２３−８３０（１９９３）を参照）として公開された配列に基づき、そしてそれぞれの構築物は配列を確認し、そして公開された配列に対して整列した。ＤＮＡ構築物は、従来技術に対して独特で区別できるように、特異的５’および３’制限部位を含むように操作した。加えて、特定の構築物の３’末端はＶ５およびヒスチジンタグのようなタグ付けされたエピトープを含むように操作した。
【００３５】
ＮＩＨスイスマウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ−９２）、ヒト類表皮癌Ａ４３１（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ１５５５）、およびヒトグリア芽細胞腫星細胞腫Ｕ８７ＭＧ（ＡＴＣＣ寄託番号ＨＴＢ−１４）を含む、いくつかの細胞株をトランスフェクションのために選択した。それぞれの細胞株は、それらの適用をＦＡＫの過剰発現について好ましくする独特の特徴を示す。例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は種特異的ＦＡＫ過剰発現およびトランスフェクトの容易性を提供し、Ａ４３１細胞は中程度のレベルの内因性ＦＡＫを発現し、そしてＦＡＫの天然の環境をより代表する腫瘍背景を提供し、そして、Ｕ８７ＭＧ細胞は推定ＦＡＫ天然受容体ＰＴＥＮ（腫瘍サプレッサーホスファターゼ）を欠損する。ストラタジーンのＧｅｎｅＪａｍｍｅｒＴＭ トランスフェクションリガンドを用いて、Ａ４３１細胞にｐＳｗｉｔｃｈ調節ベクターを、ｐＧｅｎｅＶｅｃｔｏｒＶ５Ｈｉｓ、またはｐＧｅｎｅＦＡＫＷＴＶ５Ｈｉｓ、またはｐＧｅｎｅＦＡＫ変異体（ｐＧｅｎｅＦＡＫＫ４５４ＲＶ５Ｈｉｓ、そしてｐＧｅｎｅＦＡＫＹ３９７ＦＶ５Ｈｉｓ）のいずれかとともに同時トランスフェクトした。同様に、ＮＩＨ３Ｔ３およびＵ８７ＭＧ細胞を、ｐＳｗｉｃｈ調節タンパク質および目的の特定のｐＧｅｎｅ構築物を同時発現するように形質転換した。ハイグロマイシンおよびゼオシン耐性クローンを選択し、ウエスタンおよびＲＴ−ＰＣＲ解析によるスクリーニングのために培養して拡張した。Ａ４３１：ＦＡＫＷＴＶ５Ｈｉｓ、Ａ４３１：ＦＡＫＹ３９７ＦＶ５Ｈｉｓ、Ａ４３１：ＦＡＫＫ４５４ＲＶ５Ｈｉｓ、Ａ４３１：Ｖｅｃｔｏｒ、ＮＩＨ３Ｔ３：ＦＡＫＷＴＶ５Ｈｉｓ、ＮＩＨ３Ｔ３：ＦＡＫＹ３９７ＦＶ５Ｈｉｓ、ＮＩＨ３Ｔ３：Ｖｅｃｔｏｒ、Ｕ８７ＭＧ：ＦＡＫＷＴＶ５Ｈｉｓ、およびＵ８７ＭＧ：ＦＡＫＹ３９７ＦＶ５Ｈｉｓを含むいくつかの誘導可能クローンを首尾よく単離し、選択し、確認しそして確証した。
【００３６】
本発明のこの態様のＦＡＫ誘導可能アッセイは、Ｙ３９７でのＦＡＫリン酸化を測定した。Ａ４３１：ＦＡＫＷＴＶ５Ｈｉｓ（約１．０ｘ１０４から１．０ｘ１０７細胞）をＵ底９６ウェルプレート上に播種し、そして３７℃、５％ＣＯ２で、４から６時間付着させた後、０．１ｎＭ ミフェプリストンの存在下で一晩培養した。続いて、Ａ４３１：ＦＡＫＷＴＶ５Ｈｉｓ誘導細胞を、処理しないままにするかまたは阻害化合物で３７℃、５％ＣＯ２で３０分間処理し、そしてＲＩＰＡ溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１％ ＮＰ−４０、０．２５％デオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ ＮａＦ、および５０ｍｌ溶液あたりＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤１つ）中で溶解した。およそ４５μｇの全タンパク質（１００μｌ）を、リン酸化ＦＡＫタンパク質の捕捉およびそれに続く検出のために、０．３５μｇ／ウェルの抗ＦＡＫリン特異的Ｙ３９７抗体で被覆したヤギ抗ウサギプレートへ移した（図３参照）。
【００３７】
ＮＩＨ３Ｔ３：ＦＡＫＷＴＶ５ＨｉｓクローンおよびＮＩＨ３Ｔ３：ＦＡＫＹ３９７ＦＶ５Ｈｉｓクローンを、Ｔ２５フラスコに播種しておよそ８０％集密度になるようにし、そして処理しないままにするかまたは０．１ｎＭ ミフェプリストンで３７℃、５％ＣＯ２で１６時間刺激した。細胞溶解物を調製し、全ＦＡＫタンパク質を抗ＦＡＫ（ＵＢＩＴＭ、レイクプラシッド、ニューヨーク）モノクローナル抗体を用いて免疫枯渇（immunodepleted）した。次いで、ＦＡＫ免疫複合体をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、抗ＦＡＫ（Ａ１７）ポリクローナル抗体で免疫ブロッティングした。表１は、オートラジオグラフィーのフィルムの自由裁量による「バンド光（band light）」ユニットにより測定したデンシトメトリーによる定量および、刺激していない細胞と比較したＦＡＫタンパク質レベルの変化の倍数を示す。
【００３８】
【表１】
【００３９】
ＦＡＫＷＴ誘導可能クローンは、ミフェプリストン刺激に対して非常によく応答したことを観察した。
上記の条件は容易に９６ウェルＥＬＩＳＡ形式に移すことができたた。表２は、ＦＡＫＷＴまたはＦＡＫＹ３９７Ｆタンパク質を発現するように誘導したＮＩＨ３Ｔ３クローンを示す。ＦＡＫＷＴまたはＦＡＫＹ３９７Ｆタンパク質は、ミフェプリストンにより誘導された全ＦＡＫタンパク質またはホスホチロシンＦＡＫＹ３９７のいずれかを測定するために捕捉した。
【００４０】
【表２】
【００４１】
ＮＩＨ３Ｔ３クローンが丈夫なホスホチロシンＦＡＫＹ３９７およびＦＡＫタンパク質を、それぞれ、〜７および〜６のシグナル対ノイズ比で生じたことを観察した。ＮＩＨ３Ｔ３チロシンをつぶしたクローンおよびベクターＮＩＨ３Ｔ３形質転換体の両方についてホスホＦＡＫＹ３９７についてのアッセイ特異性を確認した。
【００４２】
表３は、至適条件下でアッセイされたＡ４３１：ＦＡＫクローンを示す。
【００４３】
【表３】
【００４４】
至適条件下で、Ａ４３１：ＦＡＫクローンは丈夫なホスホチロシンＦＡＫＹ３９７およびＦＡＫタンパク質を、それぞれ〜１７および〜１１のシグナル対ノイズ比で生じた。Ａ４３１チロシンをつぶしたクローンおよびベクターＡ４３１形質転換体の両方についてホスホＦＡＫＹ３９７についてのアッセイ特異性を確認した。ホスホチロシンＹ３９７およびＦＡＫタンパク質の誘導は、例えば、ミフェプリストンのインキュベーション時間、ミフェプリストン濃度、細胞密度、および抗体濃度といった、アッセイ条件を変えることにより制御可能であった。
【００４５】
Ａ４３１およびその他の細胞背景についてのＦＡＫ活性化の機構を研究した。Ａ４３１：ＦＡＫＷＴ細胞は処理しないままにおくか、またはミフェプリストンで刺激した。第一に、ＦＡＫタンパク質およびホスホチロシンＹ３９７レベルについての時間依存的減少を示すために、流出（washout）実験を行った（すなわち、ミフェプリストンで一晩（１６時間）刺激した細胞を、続いて、ミフェプリストンの不在下で時間を追って新鮮な増殖培地中で培養した）。第二に、ミフェプリストンで刺激したＡ４３１：ＦＡＫＷＴ細胞を剥がし、そして新鮮な増殖培地に１５分間懸濁し、その後、細胞培養処理ペトリ皿上で４、２４、４８および７２時間、再プレーティングした。表４、実験Ａは、オートラジオグラフィーのフィルムの自由裁量による「バンド光」ユニットにより測定したデンシトメトリーによる定量および、刺激していない対照と比較したＦＡＫリン酸化の変化の倍数を示す。
【００４６】
【表４】
【００４７】
実験Ｂにおいては、処理していない細胞に対して中程度の４倍の誘導が観察された。しかしながら、刺激した細胞を１５分間、新鮮な増殖培地に懸濁し、続いてプラスチックへ４時間付着させると、ホスホＦＡＫＹ３９７の減少を導いた。さらに、懸濁したミフェプリストンで誘導した細胞を２４時間、再付着させると、ホスホチロシンＦＡＫＹ３９７の再活性化という結果になり、これはＦＡＫ活性化の機構が損なわれていないことを示唆する。ＦＡＫタンパク質レベルの時間依存的な減少と矛盾せず、ホスホチロシンＦＡＫＹ３９７は７２時間で刺激していない対照レベルに減少した。
【００４８】
細胞懸濁液はＦＡＫリン酸化の不活性化へと導く。ＦＡＫの再活性化は懸濁した細胞を細胞付着させるために再プレーティングすることによって達成することができる。表４はＦＡＫ活性化のメカニズムが上述した調節システムのもとで無傷であることを示している。言い換えると、ミフェプリストンによる外因性刺激は、機構的に等価なＦＡＫの活性化へと導く。
【００４９】
本発明のＦＡＫ誘導可能な細胞に基づくアッセイは、ＰＰ１およびスタウロスポリンを含む、いくつかのＦＡＫ阻害剤の同定においてうまく用いられた。加えて、該アッセイはＦＡＫを発現している細胞における特定の化合物の細胞毒性を決定するのに用いた。これらの実験において、試験化合物を、ＦＡＫ誘導または非誘導対照細胞へと接触するように置いた。表５は、増加していく濃度のＦＡＫ阻害剤での処理におけるＯＤ４５０ユニットでの、ＦＡＫリン酸化における変化を示す。表６は、オートラジオグラフィーフィルムの任意の「バンド光」ユニットで測定したデンシトメトリーによる定量、および増加していく濃度のＦＡＫ阻害剤の存在下におけるＦＡＫリン酸化の倍変化を示す。よって、本発明のアッセイはＦＡＫ薬物探索プログラムにおいて有利に使用することができる。
【００５０】
ＦＡＫ誘導可能な細胞に基づくアッセイは、ＦＡＫ阻害剤をスクリーニングするのに図３に記載されるように用いた。ＦＡＫ阻害剤の１０μＭ曲線は、表５に示すように１／２ｌｏｇ希釈で実施した。％阻害を決定し、そして５０％における阻害濃度（ＩＣ５０）を計算した。Ａ４３１：ＦＡＫＷＴ細胞をＴ２５フラスコに〜８０％集密度で播種し、そして処理しないままにおくか、または０．１ｎＭミフェプリストンで一晩刺激した。続いて、刺激した細胞を表５と同じＦＡＫ阻害剤で、同じ１０μＭ曲線の１／２ｌｏｇ濃度で、３０分間、３７℃、５％ＣＯ２で処理した。次いで、細胞溶解物を調製し、そして全タンパク質濃度をプロテインアッセイによって決定した。全タンパク質の等価な量をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、そしてホスホチロシンＦＡＫＹ９３７特異的抗体、通常のホスホチロシンｐＹ２０抗体、および抗ＦＡＫ（Ａ１７）抗体を用いてウエスタン分析にかけた。
【００５１】
【表５】
【００５２】
ＦＡＫ阻害剤についての計算された５０％の阻害濃度は〜０．９３μＭであった。
表６は、オートラジオグラフィーフィルムの自由裁量による「バンド光」ユニットで測定したデンシトメトリーによる定量、および増加していく濃度のＦＡＫ阻害剤の存在下におけるＦＡＫリン酸化の倍変化を示す。これらの実験はさらに本発明のアッセイのＦＡＫ薬剤探索プログラムにおける有用性を示す。
【００５３】
【表６】
【００５４】
タンパク質装填（loading）についての対照として、実験ＡにおけるＦＡＫタンパク質の量が等価であり、そしてＦＡＫ阻害剤とのインキュベーションはＦＡＫ発現にはいかなる効果をも及ぼさなかった。実験Ｂにおいて、表５で報告したＩＣ５０と矛盾せず、抗ＦＡＫｐＹ３９７ブロットは０．３７から１．１μＭの範囲の推定ＩＣ５０値を示し、ここで５０％濃度は１．１μＭに近かった。実験Ｃに見られるように、ＦＡＫ生物学に類似しそして矛盾せず、抗ｐＹ２０イムノブロットにより測定した全ＦＡＫリン酸化は、阻害剤により１．１から３．３μＭの推定ＩＣ５０の範囲で阻害され、ここで５０％阻害濃度は３．３μＭにより近かった。
【００５５】
ＦＡＫリン酸化の外因性対照
ＦＡＫのＥＣＭ刺激は、商業的に入手可能なフィブロネクチン（ＦＮ）９６ウェルプレートまたは社内で調製したＦＮ９６ウェルプレート上に２．０ｘ１０５細胞／ウェルでプレーティングすることにより行った。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で、１５、３０、６０または９０分間付着させるようにして、インテグリン会合（engagement）および続くＦＡＫリン酸化を誘導した。細胞溶解物をＲＩＰＡ溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１％ ＮＰ−４０、０．２５％ デオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ Ｎａ３Ｖｏ４、１ｍＭ ＮａＦ、および、５０ｍｌ溶液につきＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤ペレットを１つ）中で調製し、そして抗ＦＡＫで被覆した９６ウェルプレートに移して全ＦＡＫタンパク質を捕捉した。ホスホチロシンＦＡＫタンパク質を通常のホスホチロシン抗体Ｐｙ５４を用いて測定した。同様に、細胞を商業的に入手可能なマトリゲル被覆プレートまたは社内で調製したマトリゲルプレート上で刺激した。ウエスタン解析のために、細胞を商業的に入手可能なＥＣＭ被覆フラスコまたは社内で調製したＥＣＭ被覆フラスコに、上記に示した時間付着させるようにした。細胞溶解物をＲＩＰＡ溶解バッファー中で調製し、そして全およびホスホチロシンＦＡＫタンパク質を、破壊する（pull-down）か、または抗ＦＡＫ抗体または抗ホスホチロシン抗体を用いて免疫検出した。
【００５６】
細胞（例えば、Ａ２０５８ヒト転移性黒色腫）を９６ウェルプレートまたはＴ２５／Ｔ７５フラスコ上、増殖培地（ＤＭＥＭ １０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｇｌｕ）中に播種し、そして、３７℃、５％ＣＯ２でおよそ５時間、組織培養処理したプラスチックへ接着させるようにした。続いて、それらは０．１％ ＦＢＳ ＤＭＥＭ飢餓性培地中で一晩、３７℃、５％ＣＯ２で飢えさせ、続いて（１００μＭまでの）エンドセリンＩ、（１００ｎＭまでの）ボンベシン、または（８００ｎＭまでの）ＰＭＡでの処理によって刺激した。サイトカインへの曝露は、３７℃、５％ＣＯ２で、１０分から６０分までの長さで変化させた。全ＦＡＫタンパク質はＥＬＩＳＡフォーマットで捕捉するか、または抗ＦＡＫ特異的抗体を用いて免疫沈降した。ホスホチロシンＦＡＫタンパク質は次いで、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンフォーマットのいずれかにおいて、通常の抗ホスホチロシン抗体で検出した。
【００５７】
飢えさせた細胞（例えば、Ａ２０５８）を、４℃で３０分間予備冷却し、そして、変化させた濃度（２００μｇ／ｍｌのストック濃度の１：１００、１：３３０、１：１０００、１：３，３００、または１：１０，０００）のβ１−インテグリン抗体とともにインキュベーションした（４℃、３０分間）。β１−インテグリンのクラスタリングを、ヤギ抗マウス二次抗体の１：５００希釈物で４℃で３０分間誘導した。次いで、全細胞溶解物を溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ バナジン酸ナトリウム、１％ ＮＰ４０、プロテアーゼ阻害剤）中で調製し、そして全ＦＡＫタンパク質を抗ＦＡＫ抗体を用いて免疫沈降した。ホスホチロシンＦＡＫタンパク質は、抗ホスホチロシン抗体Ｐｙ５４を用いて測定した。
【００５８】
ＦＡＫＷＴおよびＦＡＫ変異体のクローニング（非誘導性およびＴｅｔ−ＯｎＴＭ／Ｔｅｔ−ＯｆｆＴＭシステム）
完全長ＦＡＫＷＴ ｃＤＮＡは、Ｔ細胞ｃＤＮＡライブラリーから、ＲＴ−ＰＣＲにおいて、プライマー ＦＡＤ５’Ｂａｍ：ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＴＧＣＴＴＡＣＣＴＴＧＡＣ（配列番号９）およびＦＡＫ３’Ｂａｍ：ＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＴＣＡＣＴＣＡＧＴＧＴＧＧＴＣＴＣＧＴＣＴＧＣＣＣＡ（配列番号１０）を用いてクローニングし、そして寄託番号Ｌ１３６１６に対して配列を確認した。ＦＡＫＷＴテンプレートの部位特異的変異誘発は、ストラタジーンＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ部位特異的変異誘発キットを用いて行った。クロンテックのあらかじめ作製されたＨｅＬａまたはＨＥＫ２９３ ｔｅｔ−Ｏｎ／ｔｅｔ−Ｏｆｆ細胞株へのエレクトロポレーションのためのプラスミドを産生するために、完全長ＦＡＫＷＴ、チロシンをつぶした変異体（ＦＡＫＹ３９７Ｆ）、およびキナーゼ活性のない変異体（ＦＡＫＫ４５４Ｒ）のｃＤＮＡをｐＴＲＥ：ＦＬＡＧベクターのＢａｍＨＩサイトへとサブクローニングした。以下のコンストラクト： ｐＴＲＥ：ＦＬＡＧベクター、ｐＴＲＥ：ＦＡＫＷＴＦＬＡＧ、およびｐＴＲＥ：ＦＡＫＹ３９７ＦＦＬＡＧを産生し、そしてＨｅＬａ Ｔｅｔ−Ｏｆｆ、ＨｅＬａ Ｔｅｔ−Ｏｎ、または２９３ Ｔｅｔ−Ｏｎへとエレクトロポレーションした。Ｇ４１８耐性クローンを選択し、ＤＭＥＭ＋１００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８増殖培地中で拡張した。
【００５９】
ＦＡＫＷＴおよびＦＡＫ変異体のクローニング（ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈＴＭシステム）
完全長の局所接着キナーゼ（ＦＡＫＷＴ）ｃＤＮＡをＴ細胞ｃＤＮＡライブラリーから、ＲＴ−ＰＣＲにおいて上記のプライマーを用いてクローニングし、そして寄託番号Ｌ１３６１６に対して配列を確認した。ＦＡＫＷＴテンプレートの部位特異的変異誘発は、ストラタジーンＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ部位特異的変異誘発キットを用いて行った。完全長ＦＡＫＷＴ、チロシンをつぶした変異体（ＦＡＫＹ３９７Ｆ）、およびキナーゼ活性のない変異体（ＦＡＫＫ４５４Ｒ）のｃＤＮＡをｐＧｅｎｅＶ５／Ｈｉｓ−ＡプラスミドのＢａｍＨＩ−ＡｐａＩサイトへとサブクローニングした。優性阻害のＦＡＫ関連非キナーゼ（ＦＲＮＫ）ｃＤＮＡをｐＧｅｎｅＶ５／Ｈｉｓ−Ａベクターのカセット中にＫｐｎＩ−ＡｐａＩ挿入物としてサブクローニングした。これらのプラスミドはＤＮＡ配列解析および制限消化解析によって確認した。続いて、これらのコンストラクトを、ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈＴＭタンパク質をコードするｐＳｗｉｔｃｈコンストラクトとともに、ＮＩＨ３Ｔ３、Ａ４３１、またはＵ８７ＭＧ細胞へと、ストラタジーンのＧｅｎｅＪａｍｍｅｒＴＭトランスフェクション試薬を用いて同時トランスフェクションした。トランスフェクタントを増殖させ、そしてＤＭＥＭ増殖倍地（１０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｇｌｕ）中で選択し、７５０μｇ／ｍｌのゼオシンおよび５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシン抗生物質でスパイクした。ハイグロマイシンおよびゼオシン耐性クローンを選択し、そして、ウエスタンおよびＲＴ−ＰＣＲフォーマットの両方でスクリーニングするために培養中で拡張した。
【００６０】
Ａ４３１・ＦＡＫクローンのスクリーニング
Ａ４３１・ＦＡＫＷＴおよびＡ４３１・ＦＡＫＹ３９７Ｆクローンを、Ｔ２５フラスコに、８０％集密度近くで播種し、そして、処理しないままにするか、または、０．１ｎＭミフェプリストンリガンドで一晩（〜１６時間）処理した。次いで、Ａ４３１トランスフェクタントは、ＲＩＰＡ溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．４、１％ ＮＰ−４０、０．２５％ デオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ ＮａＦ、および５０ｍｌ溶液あたりＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ ＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤ペレット１つ）中で溶解し、そして細胞溶解物を総タンパク質濃度についてアッセイした。等価な総タンパク質濃度を、標準のウエスタンブロッティング技術を用いて、ＦＡＫ、またはＦＡＫ変異体、タンパク質およびホスホチロシンＦＡＫＹ３９７についてのウエスタン解析免疫ブロッティングにかけた。陽性を示し、そして内因性ＦＡＫレベルに対して少なくとも３倍の誘導を示したクローンを、最適化およびＦＡＫの細胞に基づくアッセイの開発のために選択した。
【００６１】
クローンは、ＲＴ−ＰＣＲによってもスクリーニングし、そして検証した。細胞質性ｍＲＮＡ転写物を、ランダムヘキサマーを用いたｃＤＮＡ合成のために、Ａ４３１・ＦＡＫ野生型および変異体クローンから単離し、そして精製した。続いて、ポリメラーゼ連鎖反応を、Ｎ末端、内部ＦＡＫ配列およびＦＡＫのＣ末端に特異的なプライマーを用いて、Ａ４３１・ＦＡＫトランスフェクタントに由来するｃＤＮＡライブラリー上で行った。ｃＤＮＡライブラリーの質のためであるとともにトランスフェクションの内部対照として、抗生物質転写物のゼオシンまたはハイグロマイシンおよびＧＡＰＤＨに特異的なプライマーもまた、これらの遺伝子を増幅するのに用いた。
【００６２】
ＦＡＫ誘導可能な細胞に基づくシステムの至適化
Ａ４３１・ｐＧｅｎｅＶｅｃｔｏｒ、Ａ４３１・ＦＡＫＷＴ、Ａ４３１・ＦＡＫＫ４５４Ｒ、およびＡ４３１・ＦＡＫＹ３９７ＦクローンをＴ２５フラスコに８０％集密度近くで播種し、そして処理しないままにしておくか、または０．１、１０、または１００ｎＭのミフェプリストンリガンドで一晩（〜１６時間）処理した。ついで、Ａ４３１トランスフェクタントを、ＲＩＰＡ溶解バッファー（上述）中で溶解し、そして細胞溶解物を総タンパク質濃度についてアッセイした。等価な総タンパク質濃度を、標準のウエスタンブロッティング技術を用いて、ＦＡＫ、またはＦＡＫ変異体、タンパク質およびホスホチロシンＦＡＫＹ３９７についてのウエスタン解析免疫ブロッティングにかけた。ウエスタンフォーマットにおけるミフェプリストン濃度の至適化がＥＬＩＳＡシステムにも転じる（translate）ことを決定するために、ミフェプリストン濃度およびインキュベーション時間をＥＬＩＳＡフォーマットについても至適化した。
【００６３】
Ａ４３１・ｐＧｅｎｅＶｅｃｔｏｒ、Ａ４３１・ＦＡＫＷＴ、およびＡ４３１・ＦＡＫＹ３９７Ｆクローンを９６ウェルＵ底プレート中に、１．２ｘ１０６細胞／ｍｌの細胞密度で播種した。細胞を、ミフェプリストンリガンドでのＦＡＫ誘導の前に、３７℃、５％ＣＯ２で、６から８時間おいた。続いて、Ａ４３１クローンを処理しないままにおくか、または０．１、１０、１００または１１０ｎＭのミフェプリストンで〜０．５、１．０、２．０、４．０または２４．０時間、３７℃、５％ＣＯ２で処理した。次いで、細胞をＲＩＰＡ溶解バッファー中で溶解し、そして、１００μｌの細胞溶解物（総タンパク質４５μｇ）を９６ウェルプレートに移した。続いて、ＦＡＫまたはＦＡＫ変異体タンパク質およびホスホチロシンＦＡＫＹ３９７は、それぞれＦＡＫ特異的抗体またはホスホチロシンＦＡＫＹ３９７抗体で被覆したヤギ抗マウスまたはヤギ抗ウサギプレート上に捕捉した。ＦＡＫまたはＦＡＫ変異体タンパク質を捕捉するために、例えば、１００μｌの細胞溶解物（総タンパク質４５μｇ）とともにインキュベーションする前に、ヤギ抗マウスプレートを０．５μｇ／ｍｌの抗ＦＡＫ（ＵＢＩ）モノクローナル抗体で被覆した。次いで、捕捉したＦＡＫまたはＦＡＫ変異体タンパク質の検出は、抗ＦＡＫ（Ａ１７）ポリクローナル抗体によって測定した。同様に、ホスホチロシンＦＡＫＹ３９７タンパク質の捕捉は、ヤギ抗ウサギプレートを３．５μｇ／ｍｌの抗ＦＡＫｐ［Ｙ３９７］ポリクローナル抗体で被覆し、続いて抗ＦＡＫ（ＵＢＩ）モノクローナル抗体を用いた検出によって行った。
【００６４】
パラメータは、利用する特定の高スループットスクリーニングシステムについて至適化することができ、これには９６ウェルプレートの種類（例えば、抗ウサギ、プロテインＡ、またはプロテインＧ）、捕捉抗体濃度、検出抗体濃度、二次セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抗体濃度、細胞密度、ブロッキングバッファー（例えば、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋブロッキングＴＢＳ、３％ＢＳＡブロッキング）、および化合物処理時間、を評価することを含む。
【００６５】
残基Ｙ３９７でリン酸化されている精製ＧＳＴ・ＦＡＫタンパク質を用いて、捕捉抗体濃度の至適化を、９６ウェル抗ウサギプレートを増加していく濃度の抗ＦＡＫｐ［Ｙ３９７］リン特異的（phosphospecific）抗体で被覆することによって最初に決定した。捕捉されたリン特異的ＧＳＴ・ＦＡＫＹ３９７ 対 抗ＦＡＫｐ［Ｙ３９７］抗体濃度のプロットを、至適捕捉抗体濃度を決定するために作製した。この予備的抗ＦＡＫｐ［Ｙ３９７］捕捉濃度を用いて、その他のパラメータ（検出および二次抗体濃度、細胞密度、ブロッキングバッファー）を至適化し、そして高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）を設定した。これらのパラメータのほとんどは、９６ウェルマトリクスを確立することにより、またはいくつかの順列間のシグナル対ノイズ比の変化を交差比較（cross-comparing）することにより、同時に至適化されまたは評価される。例えば、３．５μｇ／ｍｌの抗ＦＡＫｐ［Ｙ３９７］捕捉抗体で被覆した９６ウェル抗ウサギプレート上で、増加していく濃度の検出および二次ＨＲＰ抗体を、これらの抗体の濃度を至適化するために、９６ウェルマトリックスに設置して捕捉されたホスホチロシンＦＡＫＹ３９７タンパク質を検出する。この実験は、システムを至適化するために、プロテインＡプレート上で繰り返してもよく、および／またはブロッキングバッファーまたはその他のパラメータを変えることによって、順列の数の間のシグナル対ノイズ値を交差比較すしてもよい。
【００６６】
ＦＡＫの細胞に基づくアッセイの評価
Ａ４３１・ＦＡＫＷＴ細胞をＴ２５フラスコに８０％集密度近くで播種し、そして、処理しないままにしておくか、または０．１ｎＭのミフェプリストンリガンドで一晩（〜１６時間）処理した。Ａ４３１・ＦＡＫＷＴ非誘導または誘導細胞を１０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、そして１５ｍｌの増殖培地（ＤＭＥＭ １０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｇｌｕ、７５０μｇ／ｍｌゼオシン、５０μｇ／ｍｌハイグロマイシン）中、３７℃、５％ＣＯ２で３０、６０、９０、または１２０分間、懸濁した。続いて細胞をＲＩＰＡ溶解バッファー（上述）中で溶解し、そして細胞溶解物を総タンパク質濃度についてアッセイした。等価な総タンパク質濃度を、標準的なウエスタンブロッティング技術を用いてＦＡＫまたはホスホチロシンＦＡＫＹ３９７タンパク質についてのウエスタン解析免疫ブロッティングにかけた。
【００６７】
Ａ４３１・ＦＡＫＷＴおよびＡ４３１・ＦＡＫＹ３９７Ｆクローンを、Ｔ２５フラスコに８０％集密度近くで播種し、そして、処理しないままにしておくか、または０．１ｎＭミフェプリストンリガンドで一晩（〜１６時間）処理した。続いて、Ａ４３１・ＦＡＫＷＴ細胞を、増加していく濃度の、ＦＡＫ誘導可能な細胞に基づくアッセイを用いて同定されたＦＡＫ阻害剤（１０μＭ開始濃度の２分の１ ｌｏｇ（half-log）希釈）で処理した。次いで、細胞溶解物をＲＩＰＡ溶解バッファー中で調製し、そして総タンパク質濃度についてアッセイした。等価な総タンパク質濃度を、標準的なウエスタンブロッティング技術を用いて、ＦＡＫ、通常のホスホチロシンＦＡＫ、またはホスホチロシンＦＡＫＹ３９７タンパク質についてのウエスタン解析免疫ブロッティングにかけた。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ複合化ホスホチロシン抗体（ｐＹ５４ＨＲＰ）を用いるリン酸化ＦＡＫの検出を示す模式図である。
【図２】図２は、非複合化ホスホチロシン抗体（ｐＹ５４）に続いて二次マウスセイヨウワサビペルオキシダーゼ抗体を用いる、リン酸化ＦＡＫの検出を示す模式図である。
【図３】図３は、本発明のＦＡＫ誘導可能な細胞に基づくアッセイを示す模式図である。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
局所接着キナーゼ（ＦＡＫ）の細胞活性（cell-active）阻害剤を同定するための方法であって：
（ａ）ＦＡＫをコードする遺伝子の発現を誘導するために誘導剤を哺乳動物細胞に加え、ここで当該哺乳動物細胞は当該遺伝子で安定にトランスフェクトされ、そして当該遺伝子は当該誘導剤の存在下で発現する；
（ｂ）試験化合物を加え；
（ｃ）ＦＡＫ捕捉剤を用いて発現したＦＡＫを捕捉し；そして、
（ｄ）当該ＦＡＫのリン酸化を検出する；
ことを含んでなる、前記方法。
【請求項２】
哺乳動物細胞が第一の固相上に被覆され、そしてＦＡＫのリン酸化が、リン酸化されたＦＡＫを抗ホスホチロシン抗体に曝露しそして当該抗体の存在を検出することにより検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＦＡＫ捕捉剤が一またはそれより多くの種類の抗体を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
一またはそれより多くの種類の抗体が、抗ホスホチロシン抗体を含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
リン酸化が、捕捉されたＦＡＫへの抗ホスホチロシン抗体の結合に比例する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
細胞が第一の固相へ自然に接着し、そして細胞が、発現したＦＡＫを捕捉する前に溶解バッファーで溶解される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
誘導剤が、ＦＡＫをコードする遺伝子の発現についてのアゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
試験化合物が、ＦＡＫのキナーゼ依存性リン酸化を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
試験化合物の細胞毒性を測定する方法であって：
（ａ）哺乳動物細胞をＦＡＫをコードする遺伝子で安定にトランスフェクトし、ここで当該遺伝子は誘導剤の存在下で発現する；
（ｂ）ＦＡＫをコードする当該遺伝子の発現を誘導するために誘導剤を加え；
（ｃ）試験化合物を加え；
（ｄ）当該細胞に細胞毒性指示薬を加え；そして、
（ｅ）当該試験化合物の細胞毒性を検出する；
ことを含んでなる、前記方法。
【請求項１０】
配列番号１、２、３および４からなる群より選択される配列を含んでなるタンパク質をコードし、そして当該タンパク質の発現には誘導剤の存在を必要とする、組換え核酸分子で安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞。
【請求項１１】
ＦＡＫタンパク質を誘導的に発現する組換え核酸で安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞。
【請求項１２】
核酸が、ヒトＦＡＫスプライス変異体、ヒトＦＡＫの触媒ドメイン、マウスＦＡＫ、ラットＦＡＫ、およびニワトリＦＡＫからなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項１１に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１３】
配列番号５、６、７および８からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含んでなり、そして当該ポリヌクレオチドの発現には誘導剤の存在を必要とする、組換え核酸分子で安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞。
【請求項１４】
局所接着キナーゼ（ＦＡＫ）の細胞活性阻害剤を同定する方法であって、以下の工程：
（ａ）細胞が第一の固相に接着するように第一の固相を哺乳動物細胞の同質の集団で被覆し、ここで当該細胞はＦＡＫをコードする遺伝子で安定にトランスフェクトされ、そしてここで当該遺伝子は誘導剤の存在下で発現する；
（ｂ）ＦＡＫをコードする当該遺伝子の発現を誘導するために誘導剤を添加し；
（ｃ）試験化合物を添加し；
（ｄ）細胞溶解物を遊離させるために接着細胞を可溶化し；
（ｅ）ＦＡＫ捕捉剤が第二の固相に接着するように、第二の固相をＦＡＫ捕捉剤で被覆し；
（ｆ）ＦＡＫ捕捉剤がＦＡＫを捕捉するように、接着したＦＡＫ捕捉剤に細胞溶解物を曝露し；
（ｇ）捕捉されたＦＡＫを抗ホスホチロシン抗体に曝露し；そして、
（ｈ）捕捉されたＦＡＫへの抗ホスホチロシン抗体の結合を測定する、ここで、捕捉されたＦＡＫへ結合した抗ホスホチロシン抗体の量は、当該ＦＡＫのリン酸化の量と比例する；
ことを含む、前記方法。
【請求項１】
局所接着キナーゼ（ＦＡＫ）の細胞活性（cell-active）阻害剤を同定するための方法であって：
（ａ）ＦＡＫをコードする遺伝子の発現を誘導するために誘導剤を哺乳動物細胞に加え、ここで当該哺乳動物細胞は当該遺伝子で安定にトランスフェクトされ、そして当該遺伝子は当該誘導剤の存在下で発現する；
（ｂ）試験化合物を加え；
（ｃ）ＦＡＫ捕捉剤を用いて発現したＦＡＫを捕捉し；そして、
（ｄ）当該ＦＡＫのリン酸化を検出する；
ことを含んでなる、前記方法。
【請求項２】
哺乳動物細胞が第一の固相上に被覆され、そしてＦＡＫのリン酸化が、リン酸化されたＦＡＫを抗ホスホチロシン抗体に曝露しそして当該抗体の存在を検出することにより検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＦＡＫ捕捉剤が一またはそれより多くの種類の抗体を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
一またはそれより多くの種類の抗体が、抗ホスホチロシン抗体を含んでなる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
リン酸化が、捕捉されたＦＡＫへの抗ホスホチロシン抗体の結合に比例する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
細胞が第一の固相へ自然に接着し、そして細胞が、発現したＦＡＫを捕捉する前に溶解バッファーで溶解される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
誘導剤が、ＦＡＫをコードする遺伝子の発現についてのアゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
試験化合物が、ＦＡＫのキナーゼ依存性リン酸化を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
試験化合物の細胞毒性を測定する方法であって：
（ａ）哺乳動物細胞をＦＡＫをコードする遺伝子で安定にトランスフェクトし、ここで当該遺伝子は誘導剤の存在下で発現する；
（ｂ）ＦＡＫをコードする当該遺伝子の発現を誘導するために誘導剤を加え；
（ｃ）試験化合物を加え；
（ｄ）当該細胞に細胞毒性指示薬を加え；そして、
（ｅ）当該試験化合物の細胞毒性を検出する；
ことを含んでなる、前記方法。
【請求項１０】
配列番号１、２、３および４からなる群より選択される配列を含んでなるタンパク質をコードし、そして当該タンパク質の発現には誘導剤の存在を必要とする、組換え核酸分子で安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞。
【請求項１１】
ＦＡＫタンパク質を誘導的に発現する組換え核酸で安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞。
【請求項１２】
核酸が、ヒトＦＡＫスプライス変異体、ヒトＦＡＫの触媒ドメイン、マウスＦＡＫ、ラットＦＡＫ、およびニワトリＦＡＫからなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項１１に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１３】
配列番号５、６、７および８からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含んでなり、そして当該ポリヌクレオチドの発現には誘導剤の存在を必要とする、組換え核酸分子で安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞。
【請求項１４】
局所接着キナーゼ（ＦＡＫ）の細胞活性阻害剤を同定する方法であって、以下の工程：
（ａ）細胞が第一の固相に接着するように第一の固相を哺乳動物細胞の同質の集団で被覆し、ここで当該細胞はＦＡＫをコードする遺伝子で安定にトランスフェクトされ、そしてここで当該遺伝子は誘導剤の存在下で発現する；
（ｂ）ＦＡＫをコードする当該遺伝子の発現を誘導するために誘導剤を添加し；
（ｃ）試験化合物を添加し；
（ｄ）細胞溶解物を遊離させるために接着細胞を可溶化し；
（ｅ）ＦＡＫ捕捉剤が第二の固相に接着するように、第二の固相をＦＡＫ捕捉剤で被覆し；
（ｆ）ＦＡＫ捕捉剤がＦＡＫを捕捉するように、接着したＦＡＫ捕捉剤に細胞溶解物を曝露し；
（ｇ）捕捉されたＦＡＫを抗ホスホチロシン抗体に曝露し；そして、
（ｈ）捕捉されたＦＡＫへの抗ホスホチロシン抗体の結合を測定する、ここで、捕捉されたＦＡＫへ結合した抗ホスホチロシン抗体の量は、当該ＦＡＫのリン酸化の量と比例する；
ことを含む、前記方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００６−５０００２２（Ｐ２００６−５０００２２Ａ）
【公表日】平成１８年１月５日（２００６．１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５３７４１３（Ｐ２００４−５３７４１３）
【出願日】平成１５年９月８日（２００３．９．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００３／００３９６８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２７０１８
【国際公開日】平成１６年４月１日（２００４．４．１）
【出願人】（３９７０６７１５２）ファイザー・プロダクツ・インク (504)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１月５日（２００６．１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年９月８日（２００３．９．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００３／００３９６８
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２７０１８
【国際公開日】平成１６年４月１日（２００４．４．１）
【出願人】（３９７０６７１５２）ファイザー・プロダクツ・インク (504)
【Ｆターム（参考）】
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