質量分析法による核酸分子の配列決定
本発明は、以下の工程：ａ）少なくとも１つの修飾を有する核酸分子の複数の分子を提供する工程；ｂ）複数の修飾核酸分子をランダムに切断し、それにより修飾核酸分子断片と非修飾核酸分子断片とを提供する工程；ｃ）修飾核酸分子断片を非修飾核酸分子断片から分離する工程；ｄ）修飾核酸分子断片をその長さ、質量および／または電荷によって分離または分別し、そのような分離または分別によって、修飾核酸断片のパターンが生成される工程；ならびにｅ）任意で修飾核酸断片のパターンを可視化する工程を含む、核酸分子のヌクレオチド配列を決定するための方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
ａ）少なくとも１つの修飾を有する前記核酸分子の複数の分子を提供する工程；
ｂ）複数の修飾核酸分子をランダムに切断し、それにより修飾核酸分子断片と非修飾核酸分子断片とを提供する工程；
ｃ）前記修飾核酸分子断片を前記非修飾核酸分子断片から分離する工程；
ｄ）前記修飾核酸分子断片をその長さ、質量および／または電荷によって分離または分別し、そのような分離または分別によって、修飾核酸断片のパターンが生成される工程；ならびに
ｅ）任意で前記修飾核酸断片のパターンを可視化する工程
を含む、核酸分子のヌクレオチド配列を決定するための方法。
【請求項２】
前記方法が、
ｆ）前記修飾核酸断片のパターンから前記核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
複数の分子の個々の核酸分子が、そのヌクレオチド配列が決定される核酸分子の５’末端に、３’末端にまたはヌクレオチド配列内に少なくとも１つの修飾を有する、請求項１〜２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記切断が、化学的切断、酵素的切断、熱による切断および／または二価カチオンの使用による切断によって行なわれる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記切断が、化学的切断、好ましくはヌクレオチド非特異的切断である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記切断が限定的切断である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記切断が、限定的なランダム切断、好ましくは限定的で化学的なランダム切断である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
切断する工程が、断片、好ましくは修飾断片の混合物を提供し、そのような断片の混合物が、前記核酸分子の全てのあり得るヌクレオチド配列断片を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記混合物が、そのヌクレオチド配列が決定される修飾された全長形態の前記核酸分子を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記修飾核酸分子断片が、修飾と相互作用パートナーとの相互作用によって非修飾核酸分子断片から分離され、そのような相互作用パートナーが支持体に連結される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記支持体が固体支持体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記非修飾核酸分子断片が、好ましくは洗浄によって、前記相互作用パートナーと相互作用する前記修飾核酸分子断片から除去される、請求項１０〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記修飾核酸分子断片が、好ましくは前記相互作用パートナーからの前記修飾の放出によるか、前記支持体からの前記相互作用パートナーからの放出によるか、あるいは前記核酸分子断片から前記修飾またはその一部もしくは部分を切断することによって、前記支持体から放出される、請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記修飾核酸分子断片が、質量識別、サイズ識別、および／または疎水性識別、電荷識別、イオン識別、水素結合識別、あるいは液相によって仲介される抽出による分離によって、前記非修飾核酸分子から分離され、好ましくは前記非標識核酸分子断片が除去される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記修飾核酸断片のパターンが修飾核酸断片のラダーを含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記修飾核酸断片のパターンが質量分析法によって生成され、好ましくは前記核酸分子の核酸配列が推定される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記修飾核酸断片のパターンが生成され、個々の断片の質量が質量分析法によって決定され、好ましくは前記核酸分子の核酸配列が推定される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸分子のヌクレオチド配列が未知である、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記修飾核酸断片のパターンから前記核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程が、以下の工程：
ｆａ）最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量および／またはヌクレオチド配列を決定する工程；
ｆｂ）前記最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量と１ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量を決定する工程；
ｆｃ）前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量と前記最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量の質量差を決定する工程；
ｆｄ）前記質量差を個別のヌクレオチド種に帰属させ、前記個別のヌクレオチド種を前記最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の配列に付加することにより前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の配列を生成させる工程
を含む、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
工程ｆｂ）〜ｆｄ）が反復され、各々の反復で、１の加数によりｘが増加し、１回目の反復で、ｘが２となり、工程ｆｂ）において、修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の質量と１ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの質量が決定され、工程ｆｃ）において、前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの質量と前記修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の質量の質量差が決定され、かつ工程ｆｄ）において、前記質量差が個別のヌクレオチド種に帰属させられ、前記個別のヌクレオチド種を前記修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の配列に付加することにより前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの配列が生成される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
工程ｆｂ）〜ｆｄ）のｍ回目の反復で、ｘが次の通り、すなわち、ｘ＝ｍ＋１となる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸分子のヌクレオチド配列が既知であり、好ましくは前記方法が、前記核酸分子のヌクレオチド配列を確認するためのものである、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記修飾核酸断片のパターンから前記核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程が、以下の工程：
ｆａ）最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量と１ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量を決定する工程；
ｆｂ）前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量と前記最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量の質量差を決定する工程；
ｆｃ）前記質量差を個別のヌクレオチド種に帰属させ、前記個別のヌクレオチド種を前記最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の配列に付加することにより前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の配列を生成させる工程
を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
工程ｆａ）〜ｆｃ）が反復され、各々の反復で、１の加数によりｘが増加し、１回目の反復で、ｘが２となり、工程ｆａ）において、前記修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の質量と１ヌクレオチドだけ異なる前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの質量が決定され、工程ｆｂ）において、前記前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの質量と前記修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の質量の質量差が決定され、かつ工程ｆｃ）において、前記質量差が個別のヌクレオチド種に帰属させられ、前記個別のヌクレオチド種を前記修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の配列に付加することにより前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの配列が生成される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
工程ｆａ）〜ｆｃ）のｍ回目の反復で、ｘが次の通り、すなわち、ｘ＝ｍ＋１となる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量および／またはヌクレオチド配列が既知である、請求項２２〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記修飾核酸断片のパターンから前記核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程が、以下の工程：
ｆａ）最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量と１ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量を決定する工程；
ｆｂ）前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量を、そのヌクレオチド配列が既知である核酸分子の核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の計算質量に帰属させ、前記個別のヌクレオチド種を前記最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の配列に付加することにより前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の配列を生成させる工程
を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
工程ｆａ）〜ｆｂ）が反復され、各々の反復で、１の加数によりｘが増加し、１回目の反復で、ｘが２となり、工程ｆａ）において、前記修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の質量と１ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの質量が決定され、かつ工程ｆｂ）において、前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量を、そのヌクレオチド配列が既知である核酸分子の核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の計算質量に帰属させられ、前記個別のヌクレオチド種を前記修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の配列に付加することにより断片ｎ＋ｘの修飾核酸分子配列が生成される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
工程ｆａ）〜ｆｃ）のｍ回目の反復で、ｘが次の通り、すなわち、ｘ＝ｍ＋１となる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記修飾が核酸分子断片の５’末端に存在し、かつ前記最小の修飾核酸分子断片が全長核酸分子の末端５’ヌクレオチドを含むか、または前記修飾が核酸分子断片の３’末端に存在し、かつ前記最小の修飾核酸分子断片が全長核酸分子の末端３’ヌクレオチドを含む、請求項１９〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記修飾が１つの部分を含む一成分修飾である、請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記部分が、前記修飾核酸分子断片を前記非修飾核酸分子から分離するときに使用される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記部分が、パターンの生成において前記修飾核酸分子断片を分離または分別するときに使用される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記修飾が、少なくとも第１の部分と第２の部分を含む多成分修飾であり、任意で前記少なくとも第１の部分と第２の部分がリンカーで連結されている、請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記第１の部分が、修飾核酸分子断片を非修飾核酸分子から分離するときに使用され、前記第２の部分が、パターンの生成において前記修飾核酸分子断片を分離または分別するときに使用される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記修飾核酸分子断片を前記非修飾核酸分子から分離するときに使用される部分が、相互作用パートナーに対するリガンドを含み、そのような相互作用パートナーが支持体上に存在し、好ましくはそのような支持体に連結され、前記リガンドと前記相互作用パートナーの相互作用が前記支持体上への前記修飾核酸分子断片の固定を仲介する、請求項３１〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記固定が、化学的固定、親和性固定、磁気固定を含む群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記固定が親和性固定である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記支持体上への前記核酸分子および前記核酸分子断片の固定を仲介する相互作用が、ビオチン−アビジン相互作用、ビオチン−ニュートロアビジン相互作用、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用、抗原−抗体相互作用、前記核酸分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、またはその組合せからなる、２つのオリゴヌクレオチドの相互作用、カルモジュリンとカルモジュリン結合ペプチドの相互作用、アルブミンとシバクロンブルーの相互作用、金属キレーター剤と金属キレート化支持体の相互作用を含む群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記修飾核酸分子断片を前記非修飾核酸分子から分離するときに使用される部分が、ビオチン、オリゴヌクレオチド、カルモジュリン結合ペプチド、アルブミンおよび金属キレーター剤を含む群から選択される、請求項３１〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記修飾核酸分子断片が、濾過、透析、クロマトグラフィー、磁場、遠心分離および沈殿を含む群から選択される手段によって、前記非修飾核酸分子から分離される、請求項１〜４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
クロマトグラフィーがサイズ排除クロマトグラフィーであり、前記修飾核酸断片が、そのサイズによるかまたは前記修飾によってそれに与えられる修飾断片のサイズの増加によって、前記非修飾核酸分子から分離される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記パターンの生成において前記修飾核酸分子断片を分離または分別するときに使用される部分が、質量タグまたは親油性タグから選択される、請求項３１〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記修飾核酸分子断片が、好ましくは濾過および透析およびクロマトグラフィーおよび質量分析法を含む群から選択される質量またはサイズ識別のための方法によって分離または分別され、好ましくはそのような方法がＭＳ、ＬＣＭＳまたはＥＳＩ ＭＳである、請求項１〜４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記修飾核酸分子断片が、好ましくはＲＰ−ＨＰＬＣである疎水性相互作用に基づく方法によって分離または分別される、請求項１〜４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
前記リンカーが疎水性リンカーである、請求項３４〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記リンカーが切断可能なリンカーである、請求項３４〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記リンカーが、選択的に切断可能なリンカーであり、より好ましくは、前記選択的に切断可能なリンカーが、酵素的に切断可能、化学的に切断可能、光切断可能または熱切断可能なものである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記核酸分子が、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子およびヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子、ＰＮＡ、ＬＮＡならびにそれらの組合せ、好ましくは、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子およびデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの両方を含有する核酸分子の群から選択される、請求項１〜４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
前記核酸分子が、アプタマー、シュピーゲルマー、リボザイム、シュピーゲルザイム、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子およびデコイ分子からなる群、好ましくはシュピーゲルマーから選択される、請求項１〜４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
前記核酸分子がＲＮＡ分子および／またはヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子である、請求項１〜５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
前記切断が、アルカリ加水分解、アミン、またはポリアミンによってなされる前記ＲＮＡ分子および／または前記ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子の化学的切断である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記切断が、ヌクレアーゼ、好ましくはリボヌクレアーゼ、および／または核酸ベースの酵素、好ましくは核酸ベースの酵素の使用によってなされる前記ＲＮＡ分子および／または前記ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子の酵素的切断である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記切断が、前記ＲＮＡ分子および／または前記ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子の熱による切断である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記切断が、二価カチオンの使用による前記ＲＮＡ分子および／または前記ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子の切断である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
前記核酸がＤＮＡ分子および／またはヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子である、請求項１〜５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
前記切断が、酸加水分解の使用によってなされる前記ＤＮＡ分子および／または前記ヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子の化学的切断である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記切断が、ヌクレアーゼ、好ましくはデオキシリボヌクレアーゼ、および／または核酸ベースの酵素、好ましくは核酸ベースの酵素の使用によってなされる前記ＤＮＡ分子および／または前記ヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子の酵素的切断である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
質量分析法が、直接質量分析法、ＬＣ−ＭＳおよびＭＳ／ＭＳを含む群から選択される、請求項１６〜５８のいずれかに記載の方法。
【請求項６０】
核酸分子の特異的なマスフィンガープリントが決定される、請求項１〜５９のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】
前記特異的なマスフィンガープリントが、核酸分子の同定および／または品質管理に使用される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記核酸分子または前記核酸分子の複数の分子の前記少なくとも１つの修飾が、工程ａ）またはｂ）の前に、前記核酸分子の５’末端または３’末端に付加される、請求項１〜６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
前記核酸分子または前記核酸分子の複数の分子が非核酸部分を含む、請求項１〜６２のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
前記非核酸部分が、工程ａ）またはｂ）の前に、前記核酸分子または前記核酸分子の複数の分子から除去される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
第１の工程において、前記非核酸部分が、前記核酸分子または前記核酸分子の複数の分子から除去され、第２の工程において、前記核酸分子または前記核酸分子の複数の分子の修飾が、工程ａ）またはｂ）の前に、５’末端、３’末端または前記核酸分子もしくは前記核酸分子の複数の分子のヌクレオチド配列内のヌクレオチドに付加される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
以下の工程：
ａ）少なくとも１つの修飾を有する核酸分子の複数の分子を提供する工程；
ｂ）複数の修飾核酸分子をランダムに切断し、それにより修飾核酸分子断片を提供する工程；
ｃ）前記修飾核酸分子断片をその長さ、質量および／または電荷によって分離または分別し、そのような分離または分別が修飾核酸断片のパターンを生成させる、工程；ならびに
ｄ）任意で前記修飾核酸断片のパターンを可視化する工程
を含む、核酸分子のヌクレオチド配列を決定するための方法。
【請求項６７】
工程ｂ）またはｃ）の後に得られる反応混合物が、該少なくとも１つの修飾を有さない１以上の核酸分子またはその断片を含有する、請求項６６のいずれかに記載の方法。
【請求項６８】
前記修飾核酸断片のパターンの可視化が、前記少なくとも１つの修飾を利用し、好ましくは前記修飾が、該修飾を有する核酸分子と該修飾を有さない核酸分子の識別を可能にする、請求項６６および６７の１つに記載の方法。
【請求項６９】
前記修飾が、質量タグ、核酸分子の親油性部分よりも顕著に大きい所与の波長でのＵＶ吸光度を有する部分、規定の分子質量を有するポリマー、放射性標識およびイオン移動度の変化を与える部分を含む群から選択される、請求項６６〜６８のいずれかに記載の方法。
【請求項７０】
前記核酸分子よりも顕著に大きい所与の波長でのＵＶ吸光度を有する部分が、発色団、色素および蛍光標識を含む群から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記方法が、
ｅ）前記修飾核酸断片のパターンから前記核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程
をさらに含む、請求項６６〜７０のいずれかに記載の方法。
【請求項７２】
複数の分子の個々の核酸分子が、そのヌクレオチド配列が決定される核酸分子の５’末端に、３’末端にまたはヌクレオチド配列内に少なくとも１つの修飾を有する、請求項６６〜７１のいずれかに記載の方法。
【請求項７３】
前記切断が、化学的切断、酵素的切断、熱による切断および／または二価カチオンの使用による切断によって行なわれる、請求項６６〜７２のいずれかに記載の方法。
【請求項７４】
前記切断が、化学的切断、好ましくはヌクレオチド非特異的切断である、請求項６６〜７３のいずれかに記載の方法。
【請求項７５】
前記切断が限定的切断である、請求項６６〜７４のいずれかに記載の方法。
【請求項７６】
前記切断が、限定的なランダム切断、好ましくは限定的で化学的なランダム切断である、請求項６６〜７５のいずれかに記載の方法。
【請求項７７】
切断する工程が、断片、好ましくは修飾断片の混合物を提供し、断片のそのような混合物が前記核酸分子の全てのあり得るヌクレオチド配列断片を含む、請求項６６〜７６のいずれかに記載の方法。
【請求項７８】
前記混合物が、そのヌクレオチド配列が決定される修飾された全長形態の前記核酸分子を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記修飾核酸断片のパターンが修飾核酸断片のラダーを含む、請求項６６〜７８のいずれかに記載の方法。
【請求項８０】
前記修飾核酸断片のパターンが質量分析法、好ましくはＬＣ−ＭＳによって生成され、かつ好ましくは前記核酸分子の核酸配列が推定される、請求項６６〜７９のいずれかに記載の方法。
【請求項８１】
前記修飾核酸断片のパターンが生成され、個々の断片の質量が質量分析法によって決定され、かつ好ましくは、前記核酸分子の核酸配列が推定される、請求項６６〜７９のいずれかに記載の方法。
【請求項８２】
前記核酸分子のヌクレオチド配列が未知である、請求項６６〜８１のいずれかに記載の方法。
【請求項８３】
前記修飾核酸断片のパターンから前記核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程が、以下の工程：
ｆａ）最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量および／またはヌクレオチド配列を決定する工程；
ｆｂ）前記最小の修飾核酸分子断片ｎ＋１、ｘ＝０の質量と１ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量を決定する工程；
ｆｃ）前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量と前記最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量の質量差を決定する工程；
ｆｄ）前記質量差を個別のヌクレオチド種に帰属させ、前記個別のヌクレオチド種を前記最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の配列に付加することにより修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の配列を生成させる工程
を含む、請求項６６〜８２のいずれかに記載の方法。
【請求項８４】
工程ｆｂ）〜ｆｄ）が反復され、各々の反復で、１の加数によりｘが増加し、１回目の反復で、ｘが２となり、工程ｆｂ）において、前記修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の質量と１ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの質量が決定され、工程ｆｃ）において、前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの質量と前記修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の質量の質量差が決定され、工程ｄ）において、前記質量差が個別のヌクレオチド種に帰属させられ、前記個別のヌクレオチド種を前記修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の配列に付加することにより前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの配列が生成される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
工程ｆｂ）〜ｆｄ）のｍ回目の反復で、ｘが次の通り、すなわち、ｘ＝ｍ＋１となる、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記核酸分子のヌクレオチド配列が既知であり、好ましくは、前記方法が前記核酸分子のヌクレオチド配列を確認するためのものである、請求項６６〜８１のいずれかに記載の方法。
【請求項８７】
前記修飾核酸断片のパターンから前記核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程が、以下の工程：
ｆａ）最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量と１ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量を決定する工程；
ｆｂ）前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量と前記最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量の質量差を決定する工程；
ｆｃ）前記質量差を個別のヌクレオチド種に帰属させ、前記個別のヌクレオチド種を前記最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の配列に付加することにより修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の配列を生成させる工程
を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
工程ｆａ）〜ｆｃ）が反復され、各々の反復で、１の加数によりｘが増加し、１回目の反復で、ｘが２となり、工程ｆａ）において、修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の質量と１ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの質量が決定され、工程ｆｂ）において、前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの質量と前記修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の質量の質量差が決定され、工程ｆｃ）において、質量差が個別のヌクレオチド種に帰属させられ、前記個別のヌクレオチド種を前記修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の配列に付加することにより断片ｎ＋ｘの配列が生成される、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
工程ｆａ）〜ｆｂ）のｍ回目の反復で、ｘが次の通り、すなわち、ｘ＝ｍ＋１となる、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量および／またはヌクレオチド配列が既知である、請求項８６〜８９のいずれかに記載の方法。
【請求項９１】
前記修飾核酸断片のパターンから前記核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程が、以下の工程：
ｆａ）最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量と１ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量を決定する工程；
ｆｂ）前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量を、そのヌクレオチド配列が既知である核酸分子の前記核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の計算質量に帰属させ、個別のヌクレオチド種を前記最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の配列に付加することにより修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の配列を生成させる工程
を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項９２】
工程ｆａ）〜ｆｂ）が反復され、各々の反復で、１の加数によりｘが増加し、１回目の反復で、ｘが２となり、工程ｆａ）において、前記修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の質量と１ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの質量が決定され、工程ｆｂ）において、前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量が、そのヌクレオチド配列が既知である核酸分子の核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の計算質量に帰属させられ、前記個別のヌクレオチド種を前記修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の配列に付加することにより断片ｎ＋ｘの修飾核酸分子配列が生成される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
工程ｆａ）〜ｆｃ）のｍ回目の反復で、ｘが次の通り、すなわち、ｘ＝ｍ＋１となる、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記修飾が前記核酸分子断片の５’末端に存在し、かつ前記最小の修飾核酸分子断片が全長核酸分子の末端５’ヌクレオチドを含むか、または前記修飾が前記核酸分子断片の３’末端に存在し、かつ前記最小の修飾核酸分子断片が全長核酸分子の末端３’ヌクレオチドを含む、請求項８３〜９３のいずれかに記載の方法。
【請求項９５】
前記修飾が、パターンの生成において前記修飾核酸分子断片を分離または分別するときに使用される、請求項６６〜９４のいずれかに記載の方法。
【請求項９６】
前記修飾が、その波長吸光度が前記核酸分子のヌクレオ塩基の波長吸光度とは異なる蛍光標識である、請求項６６〜９５のいずれかに記載の方法。
【請求項９７】
前記核酸分子が、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびそれらの組合せ、好ましくはＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子およびデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの両方を含有する核酸分子の群から選択される、請求項６６〜９６のいずれかに記載の方法。
【請求項９８】
前記核酸分子が、アプタマー、シュピーゲルマー、リボザイム、シュピーゲルザイム、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子およびデコイ分子からなる群、好ましくはシュピーゲルマーから選択される、請求項６６〜９７のいずれかに記載の方法。
【請求項９９】
前記核酸分子がＲＮＡ分子および／またはヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子である、請求項６６〜９８のいずれかに記載の方法。
【請求項１００】
前記切断が、前記ＲＮＡ分子および／または前記ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子の化学的切断であり、かつそのような切断がアルカリ加水分解によってなされる、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記切断が、ヌクレアーゼ、好ましくはリボヌクレアーゼ、および／または核酸ベースの酵素、好ましくは核酸ベースの酵素の使用によってなされる前記ＲＮＡ分子および／または前記ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子の酵素的切断である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
前記切断が、前記ＲＮＡ分子および／または前記ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子の熱による切断である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０３】
前記切断が、二価カチオンの使用による前記ＲＮＡ分子および／または前記ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子の切断、あるいは熱および切断剤による切断の組合せである、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０４】
前記核酸がＤＮＡ分子および／またはヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子である、請求項６６〜９８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０５】
前記切断が、酸加水分解の使用によってなされる前記ＤＮＡ分子および／または前記ヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子の化学的切断である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記切断が、ヌクレアーゼ、好ましくはデオキシリボヌクレアーゼ、および／または核酸ベースの酵素、好ましくは核酸ベースの酵素の使用によってなされる前記ＤＮＡ分子および／または前記ヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子の酵素的切断である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０７】
核酸分子の特異的なマスフィンガープリントが決定される、請求項６６〜１０６のいずれかに記載の方法。
【請求項１０８】
前記特異的なマスフィンガープリントが、核酸分子の同定および／または品質管理に使用される、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記核酸分子または前記核酸分子の複数の分子の前記少なくとも１つの修飾が、工程ａ）またはｂ）の前に、前記核酸分子の５’末端または３’末端に付加される、請求項６６〜１０８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１０】
前記核酸分子または前記核酸分子の複数の分子が非核酸部分を含む、請求項６６〜１０９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１１】
前記非核酸部分が、工程ａ）またはｂ）の前に、前記核酸分子または前記核酸分子の複数の分子から除去される、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
第１の工程において、前記非核酸部分が、前記核酸分子または前記核酸分子の複数の分子から除去され、第２の工程において、前記核酸分子または前記核酸分子の複数の分子の修飾が、工程ａ）またはｂ）の前に、前記核酸分子もしくは前記核酸分子の複数の分子の５’末端、３’末端またはヌクレオチド配列内のヌクレオチドに付加される、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
以下の工程：
ａ）核酸分子の複数の分子を提供する工程；
ｂ）前記核酸分子の複数の分子をヌクレオ塩基選択的処置に供し、前記核酸分子を形成する１個または数個のヌクレオ塩基種を選択的に修飾し、そのようなヌクレオ塩基選択的処置の後で、前記核酸分子の選択的に処置可能なヌクレオ塩基のいくつかを修飾し、前記核酸分子の選択的に処置可能なヌクレオチドまたはヌクレオ塩基のいくつかを非修飾のままにする工程；
ｃ）修飾ヌクレオ塩基の３’で選択的に核酸リン酸骨格を化学的に切断し、前記修飾ヌクレオ塩基の全てではない前記核酸リン酸骨格を切断する工程；
ｄ）核酸分子断片をＬＣ−ＭＳおよび／またはＬＣ−ＭＳ−ＭＳにより分析する工程；ならびに
ｅ）インタクトの末端を有する核酸分子断片をサイズが増加する順に同定し、それから核酸分子の配列を生成させ、ここで、好ましくは、前記核酸分子断片が同じインタクトの末端、より好ましくは同じインタクトの３’末端を有する、工程
を含む、核酸分子のヌクレオチド配列を決定する方法。
【請求項１１４】
前記核酸分子が、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子およびヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子、ＰＮＡ、ＬＮＡ、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの両方を含む核酸分子、ならびにそれらの組合せ、好ましくはＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子およびヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子の群から選択される、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記核酸分子が、アプタマー、シュピーゲルマー、リボザイム、シュピーゲルザイム、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子およびデコイ分子からなる群、好ましくはシュピーゲルマーから選択される、請求項１１３〜１１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１１６】
前記核酸分子が、ＲＮＡ分子および／またはヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子である、請求項１１３〜１１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１１７】
前記選択的に処置可能なヌクレオ塩基が、グアノシン、アデノシン、シチジン、チミジンおよびウラシルを含む群から選択される、請求項１１３〜１１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１１８】
ヌクレオ塩基Ｕが、ヒドラジンと酢酸とアニリンの組合せで選択的に処置され、５’リン酸付加３’断片とアニリン修飾リボース５’断片が生じる、請求項１１３〜１１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１１９】
前記５’リン酸付加３’断片とインタクトの核酸分子が、請求項１１３に記載の工程ｄ）においてアニリン修飾リボース５’断片よりも効率的にイオン化される、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記５’リン酸付加３’断片が、請求項１１３に記載の工程ｄ）においてアニリン修飾リボース５’断片よりも効率的にイオン化される、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
前記５’リン酸付加３’断片が、請求項１１３に記載の工程ｅ）において使用される、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記核酸分子が２５個よりも多いヌクレオチドまたはヌクレオ塩基を含む、請求項１〜１２１のいずれかに記載の方法。
【請求項１２３】
前記核酸分子が３５個よりも多いヌクレオチドまたはヌクレオ塩基を含む、請求項１〜１２２のいずれかに記載の方法。
【請求項１２４】
前記核酸分子が、２６個〜５０個のヌクレオ塩基、または３６個〜５０個のヌクレオ塩基、好ましくは２６個〜４５個のヌクレオ塩基または３６個〜４５個のヌクレオ塩基を含む、請求項１〜１２３のいずれかに記載の方法。
【請求項１２５】
前記核酸分子の複数の分子の核酸分子の凝集が軽減される、請求項１〜１２４のいずれかに記載の方法。
【請求項１２６】
前記凝集が、工程ａ）〜ｅ）のいずれか、好ましくは工程ａ）およびｂ）のいずれかへのカオトロピック溶液の添加によって軽減される、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１】
以下の工程：
ａ）少なくとも１つの修飾を有する前記核酸分子の複数の分子を提供する工程；
ｂ）複数の修飾核酸分子をランダムに切断し、それにより修飾核酸分子断片と非修飾核酸分子断片とを提供する工程；
ｃ）前記修飾核酸分子断片を前記非修飾核酸分子断片から分離する工程；
ｄ）前記修飾核酸分子断片をその長さ、質量および／または電荷によって分離または分別し、そのような分離または分別によって、修飾核酸断片のパターンが生成される工程；ならびに
ｅ）任意で前記修飾核酸断片のパターンを可視化する工程
を含む、核酸分子のヌクレオチド配列を決定するための方法。
【請求項２】
前記方法が、
ｆ）前記修飾核酸断片のパターンから前記核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
複数の分子の個々の核酸分子が、そのヌクレオチド配列が決定される核酸分子の５’末端に、３’末端にまたはヌクレオチド配列内に少なくとも１つの修飾を有する、請求項１〜２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記切断が、化学的切断、酵素的切断、熱による切断および／または二価カチオンの使用による切断によって行なわれる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記切断が、化学的切断、好ましくはヌクレオチド非特異的切断である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記切断が限定的切断である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記切断が、限定的なランダム切断、好ましくは限定的で化学的なランダム切断である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
切断する工程が、断片、好ましくは修飾断片の混合物を提供し、そのような断片の混合物が、前記核酸分子の全てのあり得るヌクレオチド配列断片を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記混合物が、そのヌクレオチド配列が決定される修飾された全長形態の前記核酸分子を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記修飾核酸分子断片が、修飾と相互作用パートナーとの相互作用によって非修飾核酸分子断片から分離され、そのような相互作用パートナーが支持体に連結される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記支持体が固体支持体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記非修飾核酸分子断片が、好ましくは洗浄によって、前記相互作用パートナーと相互作用する前記修飾核酸分子断片から除去される、請求項１０〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記修飾核酸分子断片が、好ましくは前記相互作用パートナーからの前記修飾の放出によるか、前記支持体からの前記相互作用パートナーからの放出によるか、あるいは前記核酸分子断片から前記修飾またはその一部もしくは部分を切断することによって、前記支持体から放出される、請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記修飾核酸分子断片が、質量識別、サイズ識別、および／または疎水性識別、電荷識別、イオン識別、水素結合識別、あるいは液相によって仲介される抽出による分離によって、前記非修飾核酸分子から分離され、好ましくは前記非標識核酸分子断片が除去される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記修飾核酸断片のパターンが修飾核酸断片のラダーを含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記修飾核酸断片のパターンが質量分析法によって生成され、好ましくは前記核酸分子の核酸配列が推定される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記修飾核酸断片のパターンが生成され、個々の断片の質量が質量分析法によって決定され、好ましくは前記核酸分子の核酸配列が推定される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸分子のヌクレオチド配列が未知である、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記修飾核酸断片のパターンから前記核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程が、以下の工程：
ｆａ）最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量および／またはヌクレオチド配列を決定する工程；
ｆｂ）前記最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量と１ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量を決定する工程；
ｆｃ）前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量と前記最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量の質量差を決定する工程；
ｆｄ）前記質量差を個別のヌクレオチド種に帰属させ、前記個別のヌクレオチド種を前記最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の配列に付加することにより前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の配列を生成させる工程
を含む、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
工程ｆｂ）〜ｆｄ）が反復され、各々の反復で、１の加数によりｘが増加し、１回目の反復で、ｘが２となり、工程ｆｂ）において、修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の質量と１ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの質量が決定され、工程ｆｃ）において、前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの質量と前記修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の質量の質量差が決定され、かつ工程ｆｄ）において、前記質量差が個別のヌクレオチド種に帰属させられ、前記個別のヌクレオチド種を前記修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の配列に付加することにより前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの配列が生成される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
工程ｆｂ）〜ｆｄ）のｍ回目の反復で、ｘが次の通り、すなわち、ｘ＝ｍ＋１となる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸分子のヌクレオチド配列が既知であり、好ましくは前記方法が、前記核酸分子のヌクレオチド配列を確認するためのものである、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記修飾核酸断片のパターンから前記核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程が、以下の工程：
ｆａ）最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量と１ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量を決定する工程；
ｆｂ）前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量と前記最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量の質量差を決定する工程；
ｆｃ）前記質量差を個別のヌクレオチド種に帰属させ、前記個別のヌクレオチド種を前記最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の配列に付加することにより前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の配列を生成させる工程
を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
工程ｆａ）〜ｆｃ）が反復され、各々の反復で、１の加数によりｘが増加し、１回目の反復で、ｘが２となり、工程ｆａ）において、前記修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の質量と１ヌクレオチドだけ異なる前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの質量が決定され、工程ｆｂ）において、前記前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの質量と前記修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の質量の質量差が決定され、かつ工程ｆｃ）において、前記質量差が個別のヌクレオチド種に帰属させられ、前記個別のヌクレオチド種を前記修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の配列に付加することにより前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの配列が生成される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
工程ｆａ）〜ｆｃ）のｍ回目の反復で、ｘが次の通り、すなわち、ｘ＝ｍ＋１となる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量および／またはヌクレオチド配列が既知である、請求項２２〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記修飾核酸断片のパターンから前記核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程が、以下の工程：
ｆａ）最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量と１ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量を決定する工程；
ｆｂ）前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量を、そのヌクレオチド配列が既知である核酸分子の核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の計算質量に帰属させ、前記個別のヌクレオチド種を前記最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の配列に付加することにより前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の配列を生成させる工程
を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
工程ｆａ）〜ｆｂ）が反復され、各々の反復で、１の加数によりｘが増加し、１回目の反復で、ｘが２となり、工程ｆａ）において、前記修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の質量と１ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの質量が決定され、かつ工程ｆｂ）において、前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量を、そのヌクレオチド配列が既知である核酸分子の核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の計算質量に帰属させられ、前記個別のヌクレオチド種を前記修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の配列に付加することにより断片ｎ＋ｘの修飾核酸分子配列が生成される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
工程ｆａ）〜ｆｃ）のｍ回目の反復で、ｘが次の通り、すなわち、ｘ＝ｍ＋１となる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記修飾が核酸分子断片の５’末端に存在し、かつ前記最小の修飾核酸分子断片が全長核酸分子の末端５’ヌクレオチドを含むか、または前記修飾が核酸分子断片の３’末端に存在し、かつ前記最小の修飾核酸分子断片が全長核酸分子の末端３’ヌクレオチドを含む、請求項１９〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記修飾が１つの部分を含む一成分修飾である、請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記部分が、前記修飾核酸分子断片を前記非修飾核酸分子から分離するときに使用される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記部分が、パターンの生成において前記修飾核酸分子断片を分離または分別するときに使用される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記修飾が、少なくとも第１の部分と第２の部分を含む多成分修飾であり、任意で前記少なくとも第１の部分と第２の部分がリンカーで連結されている、請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記第１の部分が、修飾核酸分子断片を非修飾核酸分子から分離するときに使用され、前記第２の部分が、パターンの生成において前記修飾核酸分子断片を分離または分別するときに使用される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記修飾核酸分子断片を前記非修飾核酸分子から分離するときに使用される部分が、相互作用パートナーに対するリガンドを含み、そのような相互作用パートナーが支持体上に存在し、好ましくはそのような支持体に連結され、前記リガンドと前記相互作用パートナーの相互作用が前記支持体上への前記修飾核酸分子断片の固定を仲介する、請求項３１〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記固定が、化学的固定、親和性固定、磁気固定を含む群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記固定が親和性固定である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記支持体上への前記核酸分子および前記核酸分子断片の固定を仲介する相互作用が、ビオチン−アビジン相互作用、ビオチン−ニュートロアビジン相互作用、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用、抗原−抗体相互作用、前記核酸分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、またはその組合せからなる、２つのオリゴヌクレオチドの相互作用、カルモジュリンとカルモジュリン結合ペプチドの相互作用、アルブミンとシバクロンブルーの相互作用、金属キレーター剤と金属キレート化支持体の相互作用を含む群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記修飾核酸分子断片を前記非修飾核酸分子から分離するときに使用される部分が、ビオチン、オリゴヌクレオチド、カルモジュリン結合ペプチド、アルブミンおよび金属キレーター剤を含む群から選択される、請求項３１〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記修飾核酸分子断片が、濾過、透析、クロマトグラフィー、磁場、遠心分離および沈殿を含む群から選択される手段によって、前記非修飾核酸分子から分離される、請求項１〜４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
クロマトグラフィーがサイズ排除クロマトグラフィーであり、前記修飾核酸断片が、そのサイズによるかまたは前記修飾によってそれに与えられる修飾断片のサイズの増加によって、前記非修飾核酸分子から分離される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記パターンの生成において前記修飾核酸分子断片を分離または分別するときに使用される部分が、質量タグまたは親油性タグから選択される、請求項３１〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記修飾核酸分子断片が、好ましくは濾過および透析およびクロマトグラフィーおよび質量分析法を含む群から選択される質量またはサイズ識別のための方法によって分離または分別され、好ましくはそのような方法がＭＳ、ＬＣＭＳまたはＥＳＩ ＭＳである、請求項１〜４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記修飾核酸分子断片が、好ましくはＲＰ−ＨＰＬＣである疎水性相互作用に基づく方法によって分離または分別される、請求項１〜４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
前記リンカーが疎水性リンカーである、請求項３４〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記リンカーが切断可能なリンカーである、請求項３４〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記リンカーが、選択的に切断可能なリンカーであり、より好ましくは、前記選択的に切断可能なリンカーが、酵素的に切断可能、化学的に切断可能、光切断可能または熱切断可能なものである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記核酸分子が、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子およびヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子、ＰＮＡ、ＬＮＡならびにそれらの組合せ、好ましくは、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子およびデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの両方を含有する核酸分子の群から選択される、請求項１〜４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
前記核酸分子が、アプタマー、シュピーゲルマー、リボザイム、シュピーゲルザイム、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子およびデコイ分子からなる群、好ましくはシュピーゲルマーから選択される、請求項１〜４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
前記核酸分子がＲＮＡ分子および／またはヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子である、請求項１〜５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
前記切断が、アルカリ加水分解、アミン、またはポリアミンによってなされる前記ＲＮＡ分子および／または前記ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子の化学的切断である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記切断が、ヌクレアーゼ、好ましくはリボヌクレアーゼ、および／または核酸ベースの酵素、好ましくは核酸ベースの酵素の使用によってなされる前記ＲＮＡ分子および／または前記ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子の酵素的切断である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記切断が、前記ＲＮＡ分子および／または前記ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子の熱による切断である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記切断が、二価カチオンの使用による前記ＲＮＡ分子および／または前記ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子の切断である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
前記核酸がＤＮＡ分子および／またはヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子である、請求項１〜５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
前記切断が、酸加水分解の使用によってなされる前記ＤＮＡ分子および／または前記ヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子の化学的切断である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記切断が、ヌクレアーゼ、好ましくはデオキシリボヌクレアーゼ、および／または核酸ベースの酵素、好ましくは核酸ベースの酵素の使用によってなされる前記ＤＮＡ分子および／または前記ヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子の酵素的切断である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
質量分析法が、直接質量分析法、ＬＣ−ＭＳおよびＭＳ／ＭＳを含む群から選択される、請求項１６〜５８のいずれかに記載の方法。
【請求項６０】
核酸分子の特異的なマスフィンガープリントが決定される、請求項１〜５９のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】
前記特異的なマスフィンガープリントが、核酸分子の同定および／または品質管理に使用される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記核酸分子または前記核酸分子の複数の分子の前記少なくとも１つの修飾が、工程ａ）またはｂ）の前に、前記核酸分子の５’末端または３’末端に付加される、請求項１〜６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
前記核酸分子または前記核酸分子の複数の分子が非核酸部分を含む、請求項１〜６２のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
前記非核酸部分が、工程ａ）またはｂ）の前に、前記核酸分子または前記核酸分子の複数の分子から除去される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
第１の工程において、前記非核酸部分が、前記核酸分子または前記核酸分子の複数の分子から除去され、第２の工程において、前記核酸分子または前記核酸分子の複数の分子の修飾が、工程ａ）またはｂ）の前に、５’末端、３’末端または前記核酸分子もしくは前記核酸分子の複数の分子のヌクレオチド配列内のヌクレオチドに付加される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
以下の工程：
ａ）少なくとも１つの修飾を有する核酸分子の複数の分子を提供する工程；
ｂ）複数の修飾核酸分子をランダムに切断し、それにより修飾核酸分子断片を提供する工程；
ｃ）前記修飾核酸分子断片をその長さ、質量および／または電荷によって分離または分別し、そのような分離または分別が修飾核酸断片のパターンを生成させる、工程；ならびに
ｄ）任意で前記修飾核酸断片のパターンを可視化する工程
を含む、核酸分子のヌクレオチド配列を決定するための方法。
【請求項６７】
工程ｂ）またはｃ）の後に得られる反応混合物が、該少なくとも１つの修飾を有さない１以上の核酸分子またはその断片を含有する、請求項６６のいずれかに記載の方法。
【請求項６８】
前記修飾核酸断片のパターンの可視化が、前記少なくとも１つの修飾を利用し、好ましくは前記修飾が、該修飾を有する核酸分子と該修飾を有さない核酸分子の識別を可能にする、請求項６６および６７の１つに記載の方法。
【請求項６９】
前記修飾が、質量タグ、核酸分子の親油性部分よりも顕著に大きい所与の波長でのＵＶ吸光度を有する部分、規定の分子質量を有するポリマー、放射性標識およびイオン移動度の変化を与える部分を含む群から選択される、請求項６６〜６８のいずれかに記載の方法。
【請求項７０】
前記核酸分子よりも顕著に大きい所与の波長でのＵＶ吸光度を有する部分が、発色団、色素および蛍光標識を含む群から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記方法が、
ｅ）前記修飾核酸断片のパターンから前記核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程
をさらに含む、請求項６６〜７０のいずれかに記載の方法。
【請求項７２】
複数の分子の個々の核酸分子が、そのヌクレオチド配列が決定される核酸分子の５’末端に、３’末端にまたはヌクレオチド配列内に少なくとも１つの修飾を有する、請求項６６〜７１のいずれかに記載の方法。
【請求項７３】
前記切断が、化学的切断、酵素的切断、熱による切断および／または二価カチオンの使用による切断によって行なわれる、請求項６６〜７２のいずれかに記載の方法。
【請求項７４】
前記切断が、化学的切断、好ましくはヌクレオチド非特異的切断である、請求項６６〜７３のいずれかに記載の方法。
【請求項７５】
前記切断が限定的切断である、請求項６６〜７４のいずれかに記載の方法。
【請求項７６】
前記切断が、限定的なランダム切断、好ましくは限定的で化学的なランダム切断である、請求項６６〜７５のいずれかに記載の方法。
【請求項７７】
切断する工程が、断片、好ましくは修飾断片の混合物を提供し、断片のそのような混合物が前記核酸分子の全てのあり得るヌクレオチド配列断片を含む、請求項６６〜７６のいずれかに記載の方法。
【請求項７８】
前記混合物が、そのヌクレオチド配列が決定される修飾された全長形態の前記核酸分子を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記修飾核酸断片のパターンが修飾核酸断片のラダーを含む、請求項６６〜７８のいずれかに記載の方法。
【請求項８０】
前記修飾核酸断片のパターンが質量分析法、好ましくはＬＣ−ＭＳによって生成され、かつ好ましくは前記核酸分子の核酸配列が推定される、請求項６６〜７９のいずれかに記載の方法。
【請求項８１】
前記修飾核酸断片のパターンが生成され、個々の断片の質量が質量分析法によって決定され、かつ好ましくは、前記核酸分子の核酸配列が推定される、請求項６６〜７９のいずれかに記載の方法。
【請求項８２】
前記核酸分子のヌクレオチド配列が未知である、請求項６６〜８１のいずれかに記載の方法。
【請求項８３】
前記修飾核酸断片のパターンから前記核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程が、以下の工程：
ｆａ）最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量および／またはヌクレオチド配列を決定する工程；
ｆｂ）前記最小の修飾核酸分子断片ｎ＋１、ｘ＝０の質量と１ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量を決定する工程；
ｆｃ）前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量と前記最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量の質量差を決定する工程；
ｆｄ）前記質量差を個別のヌクレオチド種に帰属させ、前記個別のヌクレオチド種を前記最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の配列に付加することにより修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の配列を生成させる工程
を含む、請求項６６〜８２のいずれかに記載の方法。
【請求項８４】
工程ｆｂ）〜ｆｄ）が反復され、各々の反復で、１の加数によりｘが増加し、１回目の反復で、ｘが２となり、工程ｆｂ）において、前記修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の質量と１ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの質量が決定され、工程ｆｃ）において、前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの質量と前記修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の質量の質量差が決定され、工程ｄ）において、前記質量差が個別のヌクレオチド種に帰属させられ、前記個別のヌクレオチド種を前記修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の配列に付加することにより前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの配列が生成される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
工程ｆｂ）〜ｆｄ）のｍ回目の反復で、ｘが次の通り、すなわち、ｘ＝ｍ＋１となる、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記核酸分子のヌクレオチド配列が既知であり、好ましくは、前記方法が前記核酸分子のヌクレオチド配列を確認するためのものである、請求項６６〜８１のいずれかに記載の方法。
【請求項８７】
前記修飾核酸断片のパターンから前記核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程が、以下の工程：
ｆａ）最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量と１ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量を決定する工程；
ｆｂ）前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量と前記最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量の質量差を決定する工程；
ｆｃ）前記質量差を個別のヌクレオチド種に帰属させ、前記個別のヌクレオチド種を前記最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の配列に付加することにより修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の配列を生成させる工程
を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
工程ｆａ）〜ｆｃ）が反復され、各々の反復で、１の加数によりｘが増加し、１回目の反復で、ｘが２となり、工程ｆａ）において、修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の質量と１ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの質量が決定され、工程ｆｂ）において、前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの質量と前記修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の質量の質量差が決定され、工程ｆｃ）において、質量差が個別のヌクレオチド種に帰属させられ、前記個別のヌクレオチド種を前記修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の配列に付加することにより断片ｎ＋ｘの配列が生成される、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
工程ｆａ）〜ｆｂ）のｍ回目の反復で、ｘが次の通り、すなわち、ｘ＝ｍ＋１となる、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量および／またはヌクレオチド配列が既知である、請求項８６〜８９のいずれかに記載の方法。
【請求項９１】
前記修飾核酸断片のパターンから前記核酸分子のヌクレオチド配列を推定する工程が、以下の工程：
ｆａ）最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の質量と１ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量を決定する工程；
ｆｂ）前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量を、そのヌクレオチド配列が既知である核酸分子の前記核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の計算質量に帰属させ、個別のヌクレオチド種を前記最小の修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝０の配列に付加することにより修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の配列を生成させる工程
を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項９２】
工程ｆａ）〜ｆｂ）が反復され、各々の反復で、１の加数によりｘが増加し、１回目の反復で、ｘが２となり、工程ｆａ）において、前記修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の質量と１ヌクレオチドだけ異なる修飾核酸分子断片ｎ＋ｘの質量が決定され、工程ｆｂ）において、前記修飾核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の質量が、そのヌクレオチド配列が既知である核酸分子の核酸分子断片ｎ＋ｘ、ｘ＝１の計算質量に帰属させられ、前記個別のヌクレオチド種を前記修飾核酸分子断片ｎ＋（ｘ−１）の配列に付加することにより断片ｎ＋ｘの修飾核酸分子配列が生成される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
工程ｆａ）〜ｆｃ）のｍ回目の反復で、ｘが次の通り、すなわち、ｘ＝ｍ＋１となる、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記修飾が前記核酸分子断片の５’末端に存在し、かつ前記最小の修飾核酸分子断片が全長核酸分子の末端５’ヌクレオチドを含むか、または前記修飾が前記核酸分子断片の３’末端に存在し、かつ前記最小の修飾核酸分子断片が全長核酸分子の末端３’ヌクレオチドを含む、請求項８３〜９３のいずれかに記載の方法。
【請求項９５】
前記修飾が、パターンの生成において前記修飾核酸分子断片を分離または分別するときに使用される、請求項６６〜９４のいずれかに記載の方法。
【請求項９６】
前記修飾が、その波長吸光度が前記核酸分子のヌクレオ塩基の波長吸光度とは異なる蛍光標識である、請求項６６〜９５のいずれかに記載の方法。
【請求項９７】
前記核酸分子が、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびそれらの組合せ、好ましくはＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子およびデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの両方を含有する核酸分子の群から選択される、請求項６６〜９６のいずれかに記載の方法。
【請求項９８】
前記核酸分子が、アプタマー、シュピーゲルマー、リボザイム、シュピーゲルザイム、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子およびデコイ分子からなる群、好ましくはシュピーゲルマーから選択される、請求項６６〜９７のいずれかに記載の方法。
【請求項９９】
前記核酸分子がＲＮＡ分子および／またはヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子である、請求項６６〜９８のいずれかに記載の方法。
【請求項１００】
前記切断が、前記ＲＮＡ分子および／または前記ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子の化学的切断であり、かつそのような切断がアルカリ加水分解によってなされる、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記切断が、ヌクレアーゼ、好ましくはリボヌクレアーゼ、および／または核酸ベースの酵素、好ましくは核酸ベースの酵素の使用によってなされる前記ＲＮＡ分子および／または前記ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子の酵素的切断である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
前記切断が、前記ＲＮＡ分子および／または前記ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子の熱による切断である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０３】
前記切断が、二価カチオンの使用による前記ＲＮＡ分子および／または前記ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子の切断、あるいは熱および切断剤による切断の組合せである、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０４】
前記核酸がＤＮＡ分子および／またはヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子である、請求項６６〜９８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０５】
前記切断が、酸加水分解の使用によってなされる前記ＤＮＡ分子および／または前記ヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子の化学的切断である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記切断が、ヌクレアーゼ、好ましくはデオキシリボヌクレアーゼ、および／または核酸ベースの酵素、好ましくは核酸ベースの酵素の使用によってなされる前記ＤＮＡ分子および／または前記ヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子の酵素的切断である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０７】
核酸分子の特異的なマスフィンガープリントが決定される、請求項６６〜１０６のいずれかに記載の方法。
【請求項１０８】
前記特異的なマスフィンガープリントが、核酸分子の同定および／または品質管理に使用される、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記核酸分子または前記核酸分子の複数の分子の前記少なくとも１つの修飾が、工程ａ）またはｂ）の前に、前記核酸分子の５’末端または３’末端に付加される、請求項６６〜１０８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１０】
前記核酸分子または前記核酸分子の複数の分子が非核酸部分を含む、請求項６６〜１０９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１１】
前記非核酸部分が、工程ａ）またはｂ）の前に、前記核酸分子または前記核酸分子の複数の分子から除去される、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
第１の工程において、前記非核酸部分が、前記核酸分子または前記核酸分子の複数の分子から除去され、第２の工程において、前記核酸分子または前記核酸分子の複数の分子の修飾が、工程ａ）またはｂ）の前に、前記核酸分子もしくは前記核酸分子の複数の分子の５’末端、３’末端またはヌクレオチド配列内のヌクレオチドに付加される、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
以下の工程：
ａ）核酸分子の複数の分子を提供する工程；
ｂ）前記核酸分子の複数の分子をヌクレオ塩基選択的処置に供し、前記核酸分子を形成する１個または数個のヌクレオ塩基種を選択的に修飾し、そのようなヌクレオ塩基選択的処置の後で、前記核酸分子の選択的に処置可能なヌクレオ塩基のいくつかを修飾し、前記核酸分子の選択的に処置可能なヌクレオチドまたはヌクレオ塩基のいくつかを非修飾のままにする工程；
ｃ）修飾ヌクレオ塩基の３’で選択的に核酸リン酸骨格を化学的に切断し、前記修飾ヌクレオ塩基の全てではない前記核酸リン酸骨格を切断する工程；
ｄ）核酸分子断片をＬＣ−ＭＳおよび／またはＬＣ−ＭＳ−ＭＳにより分析する工程；ならびに
ｅ）インタクトの末端を有する核酸分子断片をサイズが増加する順に同定し、それから核酸分子の配列を生成させ、ここで、好ましくは、前記核酸分子断片が同じインタクトの末端、より好ましくは同じインタクトの３’末端を有する、工程
を含む、核酸分子のヌクレオチド配列を決定する方法。
【請求項１１４】
前記核酸分子が、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子およびヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子、ＰＮＡ、ＬＮＡ、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの両方を含む核酸分子、ならびにそれらの組合せ、好ましくはＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子、ヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子およびヌクレオチド修飾ＤＮＡ分子の群から選択される、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記核酸分子が、アプタマー、シュピーゲルマー、リボザイム、シュピーゲルザイム、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子およびデコイ分子からなる群、好ましくはシュピーゲルマーから選択される、請求項１１３〜１１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１１６】
前記核酸分子が、ＲＮＡ分子および／またはヌクレオチド修飾ＲＮＡ分子である、請求項１１３〜１１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１１７】
前記選択的に処置可能なヌクレオ塩基が、グアノシン、アデノシン、シチジン、チミジンおよびウラシルを含む群から選択される、請求項１１３〜１１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１１８】
ヌクレオ塩基Ｕが、ヒドラジンと酢酸とアニリンの組合せで選択的に処置され、５’リン酸付加３’断片とアニリン修飾リボース５’断片が生じる、請求項１１３〜１１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１１９】
前記５’リン酸付加３’断片とインタクトの核酸分子が、請求項１１３に記載の工程ｄ）においてアニリン修飾リボース５’断片よりも効率的にイオン化される、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記５’リン酸付加３’断片が、請求項１１３に記載の工程ｄ）においてアニリン修飾リボース５’断片よりも効率的にイオン化される、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
前記５’リン酸付加３’断片が、請求項１１３に記載の工程ｅ）において使用される、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記核酸分子が２５個よりも多いヌクレオチドまたはヌクレオ塩基を含む、請求項１〜１２１のいずれかに記載の方法。
【請求項１２３】
前記核酸分子が３５個よりも多いヌクレオチドまたはヌクレオ塩基を含む、請求項１〜１２２のいずれかに記載の方法。
【請求項１２４】
前記核酸分子が、２６個〜５０個のヌクレオ塩基、または３６個〜５０個のヌクレオ塩基、好ましくは２６個〜４５個のヌクレオ塩基または３６個〜４５個のヌクレオ塩基を含む、請求項１〜１２３のいずれかに記載の方法。
【請求項１２５】
前記核酸分子の複数の分子の核酸分子の凝集が軽減される、請求項１〜１２４のいずれかに記載の方法。
【請求項１２６】
前記凝集が、工程ａ）〜ｅ）のいずれか、好ましくは工程ａ）およびｂ）のいずれかへのカオトロピック溶液の添加によって軽減される、請求項１２５に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１３Ｅ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１８Ｃ】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図１９Ｃ】
【図２０】
【図２１】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２２Ｃ】
【図２３Ａ】
【図２３Ｂ】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８Ａ】
【図２８Ｂ】
【図２８Ｃ】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３Ａ】
【図３３Ｂ】
【図３３Ｃ】
【図３４Ａ】
【図３４Ｂ】
【図３５】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１３Ｅ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１８Ｃ】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図１９Ｃ】
【図２０】
【図２１】
【図２２Ａ】
【図２２Ｂ】
【図２２Ｃ】
【図２３Ａ】
【図２３Ｂ】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８Ａ】
【図２８Ｂ】
【図２８Ｃ】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３Ａ】
【図３３Ｂ】
【図３３Ｃ】
【図３４Ａ】
【図３４Ｂ】
【図３５】
【公表番号】特表２０１２−５０６７０９（Ｐ２０１２−５０６７０９Ａ）
【公表日】平成２４年３月２２日（２０１２．３．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３３６０９（Ｐ２０１１−５３３６０９）
【出願日】平成２１年１０月２９日（２００９．１０．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００７７５４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４９１５６
【国際公開日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【出願人】（５１１０８５２７５）ノクソン ファーマ エージー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年３月２２日（２０１２．３．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月２９日（２００９．１０．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００７７５４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４９１５６
【国際公開日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【出願人】（５１１０８５２７５）ノクソン ファーマ エージー (1)
【Ｆターム（参考）】
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