超高純度ガラクトオリゴ糖を製造する方法
本発明は、より低純度のＧＯＳから出発し、サッカロミセス・セレビシエ及びストレプトコッカス・サーモフィルスを用いる微生物精製を順次行って超高純度（≧９５％）のガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を調製する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、ＧＯＳ含量が少ない、ラクトース由来シロップから出発して、高純度（≧９５％）のガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を調製する分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）は、少なくとも二糖、三糖、四糖、五糖、及び六糖の混合物からなる。ＧＯＳにおいて、グルコースは、還元末端が遊離の糖であり、鎖内の他の糖は、ラクトースから出発するグリコシル転移（ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）反応で使用される酵素に応じて、互いに、及びグルコースと多様な方法で連結されるガラクトースである。
【０００３】
現在、ＧＯＳへの関心が、着実に高まっている。なぜなら、最近の研究によって、これらのオリゴ糖のプレバイオティクスとしての効率が実証されてきているからである。この意味では、ＧＯＳは、胃腸の細菌叢の成長を刺激する、非う蝕性で難消化性の低カロリーオリゴ糖の混合物である。
【０００４】
ＧＯＳのさらなる利点は、その抗付着活性である。つまり、これらのオリゴ糖は、胃腸の上皮細胞を通常攻撃する病原菌の結合部位の模倣体として作用して、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）などの腸内病原菌によって引き起こされる感染を直接阻害することができる。
【０００５】
市販のＧＯＳは、様々な天然の微生物（例えば、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、ペニシリウム・エクスパンサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｅｘｐａｎｓｕｍ）、及びバシルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ））又は改変された微生物から単離されたβ−ガラクトシダーゼ（ラクターゼ）のグリコシル転移活性を使用することによって、ラクトースから合成される。ＧＯＳの構造は、酵素源に応じて変わる。天然酵素から製造されるＧＯＳの収率は、一般に２０〜４５％であり、組換え型又は改変型酵素を用いることによって増大させることができる。最も広く市販されているＧＯＳの形態は、約５０〜６０重量％の濃度のＧＯＳを含有し、かなりの量のグルコース（ＧＯＳ形成反応の副生成物）及び未反応のラクトース（出発材料）も含有する。このことによって、糖尿病又はラクトース不耐症を患う人々が、ＧＯＳを使用できなくなる。
【０００６】
高純度のＧＯＳ、すなわち、すべての消化性糖質（ラクトース、グルコース、ガラクトース）が存在しないＧＯＳを得るための方法は、文献で知られている。そうした方法は、クロマトグラフィー、酵素的酸化、又は微生物発酵による、ＧＯＳ中のグルコース及びラクトースの除去を必要とする。しかし、前述の方法は、大規模に適用することができない（クロマトグラフィーの場合）、又は欠点を示す。
【０００７】
Ｓｈｏａｆ，Ｋ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７４（１２）６９２０〜６９２８、２００６では、単糖及び二糖が含まれないＧＯＳを含有する混合物が、研究所において、分取ＴＬＣによって（このため、数ミリグラムの量で）作製された。
【０００８】
Ｓｐｌｅｃｈｔｎａ，Ｂ．ら、Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９（６）４３４〜４４０、２００１は、残留ラクトースを、真菌のセロビオース脱水素酵素で選択酸化させてラクトビオン酸にすることによって、除去することについて記載している。この酵素は、容易に入手できず、ラクトースの酸化を、触媒濃度で存在する２，６−ジクロロ−インドフェノールの還元と共役させることによって働く。この酸化型酸化還元メディエーターは、分子酸素の水への真菌ラッカーゼ触媒還元によって絶え間なく再生される。ラクトビオン酸を除去するために、イオン交換クロマトグラフィーが使用された。
【０００９】
Ｃｈｅｎｇ，Ｃ．−Ｃ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２８ ７９３〜７９７、２００６は、クルイべロミセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）を用いる発酵による、残留ラクトースの除去について記載している。この方法は、収率が良好であり、グルコース、ガラクトース、ラクトースを含んでいない高純度の生成物をもたらすが、ラクトースだけでなく、Ｋ．マルキシアヌスによる処理前にＧＯＳ混合物中に存在する他のすべての二糖も、この微生物によって消費される。
【００１０】
Ｌｉ，Ｚ．ら、Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００８、４３（８）、８９６〜８９９は、アルギン酸カルシウム上で固定化された、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又はクルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）を用いる発酵による、消化性糖質の除去について記載している。結果は、Ｋ．ラクチスを使用した場合、良好であるが、Ｓ．セレビシエを使用した場合、不十分である。
【００１１】
クルイベロミセス・マルキシアヌス又はクルイベロミセス・ラクチスを使用する欠点は、両方とも、一般の人々にとって公的に入手可能であるが、食品産業で一般的に採用されておらず、したがって、すぐに使用できる形で低コストで商業的に入手可能ではないことである。
【００１２】
高純度のＧＯＳを製造するための代替法であって、工業規模でも適用可能であり、すべての消化性糖質（ラクトース、グルコース、ガラクトース）が存在しないか、少量で存在し、また、容易に広く入手できる微生物を利用する代替法の明らかな必要性が存在する。
【００１３】
定義及び略語：
ＧＯＳ＝ガラクトオリゴ糖
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、より低純度のＧＯＳ混合物から出発して、消化性糖質であるラクトース、グルコース、及びガラクトースの全割合が５％以下である、純度９５％以上のＧＯＳを調製するための方法であって、前記方法が、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）を用いる１つの発酵ステップと、サッカロミセス・セレビシエを用いる少なくとも１つの発酵ステップとを含み、前記純度が、ＧＯＳ及び前記消化性糖質を識別し、定量化できる任意の分析法によって算出される、方法によって、前述の問題を克服する。
【００１５】
該方法は、前記消化性糖質が、微生物精製によって選択的に除去されることを可能にする。
【００１６】
有利なことに、前記方法によって、消化性糖質であるラクトース、グルコース、及びガラクトースの含量が少ないＧＯＳ混合物を得ることが可能になり、その方法では、グリコシル転移において形成されるすべての二糖が、微生物によって除去されることはない。
【００１７】
有利なことに、Ｓ．サーモフィルスを用いる発酵ステップは、ＨＰＬＣ保持時間がラクトースの保持時間に非常に近い、他の二糖を維持しつつ、ラクトースの選択的除去を可能にすることが判明している。ラクトースのピーク直後のＨＰＬＣのピークによって同定できる、該オリゴ糖のこの特徴的維持により、該方法によって得られる生成物は、当技術分野で公知の他の生成物とは違ったものになる。
【００１８】
前述の方法は、食品産業で広く採用されている、コストの低い市販の微生物を使用する。該微生物は、予備発酵混合物を調製することによって微生物を活性化させる必要なく、直接、凍結乾燥形態（購入された際の形態）で使用することができる。
【００１９】
前述の方法は、工業規模、すなわち、何ｋｇもの規模で容易に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】Ｂ．サーキュランスのラクターゼにより触媒されるグリコシル転移によってラクトースから得られた、実施例１の純度４０％のＧＯＳ出発サンプルのＨＰＬＣトレースを示す図である。
【図２】本発明に従って、サッカロミセス・セレビシエを用いて脱グルコース化（ｄｅｇｌｕｃｏｓａｔｉｏｎ）した後の、実施例１のＧＯＳサンプルのＨＰＬＣトレースを示す図である。
【図３】本発明に従って、ストレプトコッカス・サーモフィルスを用いて脱ラクトース化（ｄｅｌａｃｔｏｓａｔｉｏｎ）した後の、実施例１のＧＯＳサンプルのＨＰＬＣトレースを示す図である。
【図４Ａ】本発明に従って、サッカロミセス・セレビシエを用いて、図３に対応するサンプルを脱ガラクトース化（ｄｅｇａｌａｃｔｏｓａｔｉｏｎ）した後の、実施例１のＧＯＳサンプルのＨＰＬＣトレースを示す図である（Ａ：少なくとも２０時間の発酵後、Ｂ：少なくとも４０時間の発酵後）。
【図４Ｂ】本発明に従って、サッカロミセス・セレビシエを用いて、図３に対応するサンプルを脱ガラクトース化（ｄｅｇａｌａｃｔｏｓａｔｉｏｎ）した後の、実施例１のＧＯＳサンプルのＨＰＬＣトレースを示す図である（Ａ：少なくとも２０時間の発酵後、Ｂ：少なくとも４０時間の発酵後）。
【図５】本発明の方法に従って完了時に得られた、実施例１の純度９５％以上のＧＯＳサンプルのＨＰＬＣトレースを示す図である。
【図６】実施例２の出発ＧＯＳサンプル、すなわち、ＧＴＣ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、Ｇｏｌｄｅｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ、ＵＳＡから購入したプリムン（Ｐｕｒｉｍｕｎｅ）（商標）（ＧＯ−Ｐ９０）のＨＰＬＣトレースを示す図である。
【図７】本発明の方法に従って完了時に得られた、実施例２の純度９５％以上のＧＯＳサンプルのＨＰＬＣトレースを示す図である。
【図８】クルべロミセス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）・マルキシアヌスを用いた発酵後に得られた、実施例４のＧＯＳサンプルのＨＰＬＣトレースを示す図である。
【発明の詳細な説明】
【００２１】
本発明の方法では、純度９５％未満の任意のＧＯＳ混合物を、出発材料として使用することができ、不純物が、消化性糖質であるラクトース、グルコース、及びガラクトースから本質的になる、純度４０％以上のＧＯＳ混合物を使用することが、最も好都合である。
【００２２】
本発明の目的のために、ＧＯＳ混合物の純度を評価するために、好ましくは、ＧＯＳ、ラクトース、ガラクトース、及びグルコースを識別し、定量化できる任意のＨＰＬＣ法を使用する。
【００２３】
用語「純度」は、前記ＧＯＳ及び消化性糖質のピークに対応する、ＨＰＬＣによる面積パーセントを意味する。
【００２４】
４０〜６０％の（又はより高い）純度のＧＯＳ混合物は、商業的に入手可能である（例えば、オリゴメイト（Ｏｌｉｇｏｍａｔｅ）５５、ビビナル（Ｖｉｖｉｎａｌ）ＧＯＳ、プリムン、カップオリゴ（Ｃｕｐ ｏｌｉｇｏ）Ｐ）、又はバシルス・サーキュランスから単離されたラクターゼなどの、その目的で知られる適切なラクターゼにより触媒されるグリコシル転移によって、ラクトースから調製することができる。特に、本発明の方法は、４０〜６０％ＧＯＳ混合物から出発すると好都合である。
【００２５】
好ましくは、本発明の方法は、Ｓ．サーモフィルスを用いる前記発酵ステップの次に、Ｓ．セレビシエを用いる発酵ステップが続くような方法である。Ｓ．サーモフィルスは、ラクトースを加水分解してから、生成されたグルコースを消費し、ガラクトースを蓄積する。ガラクトースは、次いで、Ｓ．セレビシエによって排除される。Ｓ．サーモフィルスを用いる発酵ステップによって、ラクトース含量を、所望のレベル、好ましくはＨＰＬＣ面積パーセントで５％未満、より好ましくは３％未満に減少させることができる。
【００２６】
出発ＧＯＳ混合物が、ＨＰＬＣ面積パーセントで５％未満のグルコース含量を有する場合、前記方法は、Ｓ．サーモフィルスを用いる発酵ステップに続き、Ｓ．セレビシエを用いる発酵ステップを含む。Ｓ．サーモフィルスは、ラクトースを加水分解してから、最初に存在した少量のグルコース、及びＳ．サーモフィルスがガラクトースの蓄積の間に生成するグルコースを消費する。次いでガラクトースは、その後、Ｓ．セレビシエによって排除される。
【００２７】
したがって、例えば（実施例２を参照）、ＨＰＬＣ面積パーセントで２％の量でグルコースが存在する、約８０％程度の純度の市販のＧＯＳ混合物から出発することによって、ラクトース含量を、Ｓ．サーモフィルスを用いる直接発酵によって、所望のレベル、すなわち、ＧＯＳの面積パーセントの合計に対して、面積パーセントで５％未満に減少させることができる。
【００２８】
出発ＧＯＳ混合物が、ＨＰＬＣ面積パーセントで５％以上のグルコース含量を有する場合、Ｓ．サーモフィルスを用いる発酵ステップの前に、Ｓ．セレビシエを用いる発酵ステップが行われる。したがって、この場合、該方法は、以下の３つのステップ、すなわち、
（ａ）サッカロミセス・セレビシエを用いる発酵ステップと、
（ｂ）ストレプトコッカス・サーモフィルスを用いる発酵ステップと、
（ｃ）サッカロミセス・セレビシエを用いる発酵ステップと、
を含む。
【００２９】
したがって、例えば（実施例１を参照されたい）、Ｂ．サーキュランスを用いたグリコシル転移によって得られた、約４０％の純度を有するＧＯＳ混合物（図１を参照されたい）から出発すると、Ｓ．セレビシエを用いる発酵（ａ）は、出発ＧＯＳ混合物中に存在するグルコースが、ほぼ完全に除去されることを可能にする（図２を参照されたい）。
【００３０】
発酵（ｂ）は、ラクトースが、３％未満のＨＰＬＣ面積パーセントに低下することを可能にする（図３を参照されたい）。
【００３１】
約２０％の純度でグルコースが存在する、純度４０〜６０％のＧＯＳ混合物で出発すると、Ｓ．サーモフィルスを用いる発酵（ｂ）の前に、発酵（ａ）などの脱グルコース化ステップが行われた場合、ラクトースを、３面積％を下回るまで低下させることができるのに対して、Ｓ．サーモフィルスを用いる直接発酵は、Ｓ．セレビシエを用いる脱グルコース化ステップ（ａ）を最初に実施することなく行われた場合、４０時間を超えて延長されても、ラクトースが、所望のレベルに低下することを可能にしないことが分かる。
【００３２】
Ｓ．セレビシエを用いる発酵（ｃ）は、Ｓ．サーモフィルスを用いた発酵後に形成された残留ガラクトースが、ほぼ完全に除去されることを可能にする（図４を参照されたい）。
【００３３】
該方法の最後において、得られたＧＯＳ混合物は、９５％以上の純度を有し、この混合物中に、グルコース及びガラクトースは、非存在ではないにしても、ごくわずかな量で存在し、その量は、ラクトースと合わせても、合計５％以下である（図５を参照されたい）。
【００３４】
Ｓ．セレビシエを用いる発酵は、好ましくは、出発ＧＯＳの乾燥重量１ｋｇあたり４０〜１５ｇの脱水されたＳ．セレビシエを用いてｐＨ６．５±０．５、温度３５±５℃で少なくとも１２時間行われる。ステップ（Ｃ）は、４０時間を超える時間でも行うことでき、そのような場合、Ｓ．サーモフィルスを用いた発酵（ｂ）後に形成された乳酸の実質的な除去が、実際に実現される（図４Ｂを参照されたい）。
【００３５】
Ｓ．サーモフィルスを用いる発酵は、好ましくは、塩基の添加によりｐＨを６．０〜６．５に維持して、出発ＧＯＳの乾燥重量１ｋｇあたり１〜０．４ｇの脱水されたＳ．サーモフィルスを用いて温度４０±５℃で少なくとも１５時間行われる。
【００３６】
本発明の方法によれば、発酵ステップの後、該混合物は、好ましくは、セラミック限外濾過、ナノ濾過、炭素を用いる脱色、及びイオン交換樹脂での脱イオンによるさらなる処理にかけられる。
【００３７】
本発明の方法によれば、発酵ステップ（ｂ）及び（ｃ）の前に、低温殺菌が、好ましくは７５±５℃で少なくとも５分間行われる。
【００３８】
実際、前述の方法の最後に得られた生成物は、特徴的なＧＯＳプロファイルを示す。つまり、ＨＰＬＣトレース（図２と図３、及び図６と図７の比較）から明らかであるように、Ｓ．サーモフィルスを用いた発酵ステップの間、ラクトースが、主に除去され、また、二糖の領域においては、ラクトースの保持時間（約１２．９分）の直後の、約１３．６分の保持時間を有する成分（実施例でＧＯＳ６と表す）が残ることも認識できる。ラクトースの除去に伴って、ラクトースの保持時間の直前の、約１２．４分の保持時間を有する成分（実施例でＧＯＳ５と表す）が消失することが認識できる。ＧＯＳプロファイルのこの維持は、特徴的であり、クロマトグラフ分離によって、又はクルイべロミセス属の微生物を用いた精製（実施例４を参照し、図１と図８を比較されたい）の後に得られたＧＯＳ混合物（これらの方法は、ＧＯＳ混合物中に存在するすべての二糖を無差別に除去する）などの、現状技術で公知の他のＧＯＳ混合物と区別可能である。
【００３９】
したがって、本発明はまた、該方法から得られるＧＯＳ混合物、すなわち、ラクトース以外のガラクト二糖が１％以上の量で存在し、消化性糖質であるラクトース、グルコース、及びガラクトースの全割合が５％以下である、純度９５％以上のＧＯＳ混合物に関する。
【００４０】
該方法によって得られる前述の生成物は、医薬組成物、乳児用調合乳、及び食品組成物の調製を含めた既知の目的のために用いることができ、これらは、本発明のさらなる態様である。
【００４１】
本発明は、以下の実施例に照らすとよりよく理解できる。
【実施例】
【００４２】
ＨＰＬＣ法：
これは、外部標準との比較を使用するＨＰＬＣ法である。ＨＰＬＣ測定器を、アイソクラティックポンプ、オートサンプラー、カラム温度調節用のペルティエ（Ｐｅｌｔｉｅｒ）オーブン、屈折率検出器、及び類似のプレカラムを備えたＴｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃのカラムであるＩＣＥ−ＳＥＰ ＩＣＥ−ＩＯＮ３００（製品コード、ＩＣＥ−９９−９８５０）と共に使用する。以下の操作条件下で分析を行った。
カラム温度：４０℃
注入量：２０μｌ
移動相：Ｈ２ＳＯ４ ０．０１５Ｎ
流速：０．４ｍｌ／分
分析時間３６分
積分器：Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒのトータルクロム（Ｔｏｔａｌｃｈｒｏｍ）ワークステーション
【００４３】
上に示した条件下で、各生成物の保持時間は、ラクトースについて約１２．５分、グルコースについて１５．０分、ガラクトースについて１６．２分、乳酸について２１．３分、及びグリセリンについて２２．２分であった（外部標準に対して）。
【００４４】
サンプル溶液における、ＧＯＳ生成物の６つのピークを、
ＧＯＳ１：約９．３分にピーク
ＧＯＳ２：約９．７分にピーク
ＧＯＳ３：約１０．３分にピーク
ＧＯＳ４：約１１．３分にピーク
ＧＯＳ５：約１２．４分にピーク
ＧＯＳ６：約１３．６分にピーク
として識別し、同定した。
【００４５】
ＨＰＬＣ表示において、用語ＧＯＳ１〜６は、ＧＯＳ中に存在する糖類単位の数に関係なく、ＧＯＳに起因するピークを単に意味するだけである。
【００４６】
積分システムは、次式によって、含量を自動的に算出した。
％＝Ａｓ×ＣＳＴＤ×Ｖ×１００／ＡＳＴＤ×Ｗｓ
式中、
ＡＣ＝サンプル溶液におけるピーク面積
ＣＳＴＤ＝標準溶液における糖濃度の割合（％）
Ｗｓ＝グラム単位でのサンプル重量
ＡＳＴＤ＝標準溶液における糖ピーク面積
【００４７】
プロセスのモニタリングの間、各ＧＯＳピークの含量は、ピーク自体の標準物質に対して算出しなかったが、ラクトースの応答係数を使用することによって、又は面積／総面積で表されるラクトースの純度を評価することによって算出した。
【００４８】
直前に述べた分析法を使用して、他のガラクトオリゴ糖との重複があれば、ラクトースの測定値を無効とした。
【００４９】
前述の分析法を使用した、市販サンプルにおけるラクトースの測定値と、証明書に示された値との間で見つかる、顕著な不一致について留意することが重要である。
【００５０】
例えば、Ｆｒｉｅｓｌａｎｄ Ｆｏｏｄｓ Ｄｏｍｏによって供給された、ビビナル（登録商標）ＧＯＳ６０、バッチ番号６２９７７７０のサンプルは、証明済みラクトース含量が、乾物ベースで１７．５％であったが、本発明者らの分析研究所で実施したＨＰＬＣにより、そのラクトース含量は３３．２％であった。
【００５１】
ラクトースを算定した際の類似した評価値が、プリムン（商標）のサンプル、バッチ番号２００８１２１７で見出された。そのサンプルにおいては、ＧＯＳの証明済み総純度が９０．４％であったのに対して、本発明者らの分析研究所（付属）で実施したＨＰＬＣにより、前記純度は８３．０％であり、ラクトースの純度が面積パーセントで１３．６％であった。
【００５２】
したがって、ラクトースの測定値は、本発明者らの分析法によって過大に算定され、結果として、最終生成物に存在するラクトース濃度の過大の評価値となった。
【００５３】
説明において曖昧な点が生じないように、以下に提示する実施例において、及び図面欄においては、市販品についての値と同様に、前述のＨＰＬＣ法を用いて得られた純度値のみを示す。
【００５４】
実施例１（ラクトースから出発する調製例）：
８０ｋｇのラクトース一水和物（０．２２ｋｍｏｌ）を、１２０ｌの水に懸濁させ、ラクトースが完全に溶解するまで、穏やかな攪拌下で７０℃に加熱した。
この溶液を、５０℃で温度調節し、そのｐＨを、２７ｍｌの７５％リン酸で５．５〜５．０に調整した。
２６６ｇのバシルス・サーキュランス由来のラクターゼを添加した（１５００Ｕ／ｇ）。
反応をＨＰＬＣによってモニタリングし、２２時間後、ＧＯＳの形成、並びにグルコース及びガラクトースの出現が検出され、結果的に、ラクトースの面積パーセント純度が４０％未満に低下した。
２００ｋｇの４０％粗ＧＯＳ溶液を得た。その溶液のＨＰＬＣトレースを図１に示し、また、下に表形式で提示する。
【００５５】
【表１】
【００５６】
ステップ１（Ｓ．セレビシエを用いる脱グルコシル化）：
前述の出発混合物を、２５０ｍｌの７５％リン酸でｐＨ３．０に酸性化させた。このｐＨ条件下で、周囲温度での保存が可能であった。
４６ｋｇの４０％粗ＧＯＳ溶液（バッチ番号０１４４９ＩＮ９）を、１４０ｌの水で希釈し、３７℃で温度調節した。溶液のｐＨを、６００ｍｌの２４％アンモニアでｐＨ２．８〜ｐＨ７．０に調整した後、２００ｇの凍結乾燥されたビール酵母を添加した。ＨＰＬＣによってモニタリングした脱グルコシル化ステップは、２４時間の激しい攪拌後に完了した。
混合物を、７０℃で約５分間低温殺菌してから、４０℃で温度調節した。
図２は、下には表形式で提示した、低温殺菌後の混合物のＨＰＬＣトレースを示す。
【００５７】
【表２】
【００５８】
ステップ２（Ｓ．サーモフィルスを用いる脱ラクトース化）：
２．５ｇ／ｌの酵母エキスを、（ステップ１からもたらされた）上述の混合物に添加し、ｐＨを、４００ｍｌの１５％水酸化ナトリウムでｐＨ５．２〜ｐＨ６．６に調整した。混合物に５ｇのストレプトコッカス・サーモフィルスを接種した。ｐＨスタットにより１５％水酸化ナトリウムを添加することによって、ｐＨ６．４〜６．５で発酵を進行させた。ＨＰＬＣによってモニタリングした反応は、２６時間後に終了に達し、その時の混合物中のラクトース含量は、３面積％未満であった。
混合物を、７０℃で約５分間低温殺菌してから、３７℃で温度調節した。
図３は、下には表形式で提示した、低温殺菌後の混合物のＨＰＬＣトレースを示す。
【００５９】
【表３】
【００６０】
ステップ３（Ｓ．セレビシエを用いる脱ガラクトース化）：
２００ｇの凍結乾燥されたビール酵母を、ステップ２からもたらされた混合物に添加した。２０時間の激しい攪拌後、ＨＰＬＣによってモニタリングした脱ガラクトース化ステップは完了した。
ｐＨ３．０に達するまで、５ｌの５０％硫酸を添加することによって、反応を止めた。
図４は、下には表形式で提示した、脱ガラクトース化後の混合物のＨＰＬＣトレースを示す。
【００６１】
【表４】
【００６２】
限外濾過により細胞を除去することによって、混合物を澄ませた。
次いで、低分子量の発酵副生成物（乳酸、グリセリンなど）を、ナノ濾過によって除去した。
次いで、溶液を炭素で脱色し、直列に配置された一組のイオン交換樹脂、すなわち、強カチオンのもの（アンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）Ｃ−２００ Ｈ＋形、３ｌ）と弱アニオンのもの（ＩＲＡ−９６ 遊離塩基形、３ｌ）で塩分を除いた。
次いで、脱塩した溶液をマイクロ濾過し、７５°ブリックスという検糖計濃度が得られるまで、真空中で濃縮した。
純度９５％以上の９ｋｇのＧＯＳ混合物を得た。該方法の最後に得られたＧＯＳ混合物のＨＰＬＣトレースを、図５に示し、下には表形式で提示する。
【００６３】
【表５】
【００６４】
表にされたデータ、及び添付した様々なステップのクロマトグラムから、ステップ２（Ｓ．サーモフィルスを用いる発酵）の間に、ＧＯＳ５のピークが消失する一方で、ＧＯＳ６のピークがほぼ変わらないまま残ることが分かる。
表１は、実施例１の様々なステップの結果の概要を示す。
【００６５】
【表６】
【００６６】
表中、
％濃度＝重量／重量％単位での濃度
％純度＝ＨＰＬＣピークにより定められた面積パーセント
相対％＝ＧＯＳの純度／ＧＯＳ、ラクトース、グルコース及びガラクトースの純度の合計
【００６７】
実施例２（８３％（９０％で市販）のＧＯＳから出発する調製例）：
２００ｇのプリムンＧＯＳ（ＧＯ−Ｐ９０）、バッチ番号２００８１２１７を、１８００ｍｌの水に可溶化した。図６は、そのクロマトグラムを示し、また、溶液のＨＰＬＣを、下に表形式で提示する。
【００６８】
【表７】
【００６９】
存在しているグルコースは、面積パーセントが５％未満であるので、直接、乳酸菌培養による発酵から、手順を続行した。
５ｇ／ｌの酵母エキスを添加し、ｐＨを、０．３ｍｌの１５％水酸化ナトリウムでｐＨ４．９〜ｐＨ６．４に調整した。７５ｍｇのストレプトコッカス・サーモフィルスを接種した後、ｐＨスタットにより１５％水酸化ナトリウムを添加することによって、ｐＨ６．３〜６．５で発酵を進行させた。ＨＰＬＣによってモニタリングした反応は、１５時間後に終了に達し、その時の混合物中のラクトース含量は、ＧＯＳの面積パーセントの合計に対して、面積パーセントで５％未満であった。
【００７０】
【表８】
【００７１】
得られた結果の概要を表２に示す。
【００７２】
【表９】
【００７３】
略語：
％濃度＝重量／重量％単位での濃度
％純度＝ＨＰＬＣピークにより定められた面積パーセント
相対％＝ＧＯＳの純度／ＧＯＳ、ラクトース、グルコース及びガラクトースの純度の合計
【００７４】
この段階で実験を止めたが、実施例１で既に説明した方式で、その後に混合物を脱ガラクトース化し、精製することができたことは明らかであった。
【００７５】
ストレプトコッカス・サーモフィルスを用いる直接発酵のため、Ｓ．セレビシエを用いる脱グルコース化をしなかった（今回の場合は不必要であった）ことは、ＧＯＳ対ラクトースの所望の面積比をもたらした。さらに、その後に続くＳ．セレビシエを用いる発酵が、ガラクトースを除去できたことを考えると、表２で報告した面積パーセント値を基にして、ラクトースのみに対して９５．６％というＧＯＳ純度を、理論的に算出することができる。
【００７６】
実施例３（４３％（６０％で市販）のＧＯＳから出発する調製例）：
４２７ｇのビビナルＧＯＳ６０、バッチ番号６２９７７７０を、１６００ｍｌの水に可溶化した。溶液のＨＰＬＣデータを、下に表形式で示す。
【００７７】
【表１０】
【００７８】
最初に、Ｓ．セレビシエを用いる脱グルコース化ステップ、それに続くＳ．サーモフィルスを用いる発酵について、実施例１とまさしく同じように、手順を行った。Ｓ．サーモフィルスを用いる発酵ステップ（実施例１でのステップ２）の最後に、ＨＰＬＣが得られた。実施例１の結果に完全に匹敵している結果を下表にまとめる。
【００７９】
【表１１】
【００８０】
Ｓ．サーモフィルスを用いる発酵の間に、ＧＯＳ５のピークが消失する一方で、ＧＯＳ６のピークがほぼ変わらないまま残ることが、この実施例でも分かる。
【００８１】
実施例２と同じように、この段階でこの実験を止めて、実施例１で既に説明した方式で混合物を脱ガラクトース化し、精製した。
【００８２】
さらに、Ｓ．セレビシエを用いる第２の発酵で、ガラクトースを除去できたことを考えると、本実施例の第２のＨＰＬＣの表で報告した面積パーセント値を基にして、ラクトースのみに対して９５．２％というＧＯＳ純度を、理論的に算出することができる。
【００８３】
実施例４（Ｋ．マルキシアヌスを用いる、４０％のＧＯＳから出発する調製例（Ｃｈｅｎｇ，Ｃ．−Ｃ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２８ ７９３〜７９７、２００６））：
菌株であるＫ．マルキシアヌスＡＴＣＣ５６４９７を、オートクレーブ滅菌した酵母用ＹＰＤ寒天培地を含有するプレート上で培養し、３０℃のインキュベーター内に４８時間置いた。
予備発酵混合物を調製するために、１００ｍｌのＹＰＤ液体培地を調製し、オートクレーブ滅菌し、次いで、事前に調製したプレートから取り出したコロニーを接種した。微生物を、３０℃の温度で振盪機内で増殖させ、２００ｒｐｍで２４時間振盪した。
実施例１と同じ出発溶液、すなわち、１．４１ｌの水で希釈した４６０ｇの４０％粗ＧＯＳ溶液（バッチ番号０１４４９ＩＮ９）で、試験を行った。
溶液のｐＨを、１５％水酸化ナトリウムでｐＨ２．８〜ｐＨ５．４に調整した後、溶液を３０℃で温度調節した。
全部の予備発酵混合物を接種のために使用した。ｐＨスタットにより１５％水酸化ナトリウムを添加することによって、ｐＨ５．２〜５．４で発酵を進行させた。混合物のサンプル抽出を、４８時間後に行ったが、下に提示する、表にされたＨＰＬＣデータ（図８も参照されたい）から分かるように、反応が完了に達したことが示されている。
【００８４】
【表１２】
【００８５】
反応は有効に、ラクトースのほぼ完全な消失をもたらしたが、ガラクト−オリゴ糖に起因するピークが、二糖の全領域（１２．２分〜１３．２分の間）に存在しないことに、添付したクロマトグラム（図８）から留意されたい。
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、ＧＯＳ含量が少ない、ラクトース由来シロップから出発して、高純度（≧９５％）のガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を調製する分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）は、少なくとも二糖、三糖、四糖、五糖、及び六糖の混合物からなる。ＧＯＳにおいて、グルコースは、還元末端が遊離の糖であり、鎖内の他の糖は、ラクトースから出発するグリコシル転移（ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）反応で使用される酵素に応じて、互いに、及びグルコースと多様な方法で連結されるガラクトースである。
【０００３】
現在、ＧＯＳへの関心が、着実に高まっている。なぜなら、最近の研究によって、これらのオリゴ糖のプレバイオティクスとしての効率が実証されてきているからである。この意味では、ＧＯＳは、胃腸の細菌叢の成長を刺激する、非う蝕性で難消化性の低カロリーオリゴ糖の混合物である。
【０００４】
ＧＯＳのさらなる利点は、その抗付着活性である。つまり、これらのオリゴ糖は、胃腸の上皮細胞を通常攻撃する病原菌の結合部位の模倣体として作用して、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）などの腸内病原菌によって引き起こされる感染を直接阻害することができる。
【０００５】
市販のＧＯＳは、様々な天然の微生物（例えば、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、ペニシリウム・エクスパンサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｅｘｐａｎｓｕｍ）、及びバシルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ））又は改変された微生物から単離されたβ−ガラクトシダーゼ（ラクターゼ）のグリコシル転移活性を使用することによって、ラクトースから合成される。ＧＯＳの構造は、酵素源に応じて変わる。天然酵素から製造されるＧＯＳの収率は、一般に２０〜４５％であり、組換え型又は改変型酵素を用いることによって増大させることができる。最も広く市販されているＧＯＳの形態は、約５０〜６０重量％の濃度のＧＯＳを含有し、かなりの量のグルコース（ＧＯＳ形成反応の副生成物）及び未反応のラクトース（出発材料）も含有する。このことによって、糖尿病又はラクトース不耐症を患う人々が、ＧＯＳを使用できなくなる。
【０００６】
高純度のＧＯＳ、すなわち、すべての消化性糖質（ラクトース、グルコース、ガラクトース）が存在しないＧＯＳを得るための方法は、文献で知られている。そうした方法は、クロマトグラフィー、酵素的酸化、又は微生物発酵による、ＧＯＳ中のグルコース及びラクトースの除去を必要とする。しかし、前述の方法は、大規模に適用することができない（クロマトグラフィーの場合）、又は欠点を示す。
【０００７】
Ｓｈｏａｆ，Ｋ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７４（１２）６９２０〜６９２８、２００６では、単糖及び二糖が含まれないＧＯＳを含有する混合物が、研究所において、分取ＴＬＣによって（このため、数ミリグラムの量で）作製された。
【０００８】
Ｓｐｌｅｃｈｔｎａ，Ｂ．ら、Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９（６）４３４〜４４０、２００１は、残留ラクトースを、真菌のセロビオース脱水素酵素で選択酸化させてラクトビオン酸にすることによって、除去することについて記載している。この酵素は、容易に入手できず、ラクトースの酸化を、触媒濃度で存在する２，６−ジクロロ−インドフェノールの還元と共役させることによって働く。この酸化型酸化還元メディエーターは、分子酸素の水への真菌ラッカーゼ触媒還元によって絶え間なく再生される。ラクトビオン酸を除去するために、イオン交換クロマトグラフィーが使用された。
【０００９】
Ｃｈｅｎｇ，Ｃ．−Ｃ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２８ ７９３〜７９７、２００６は、クルイべロミセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）を用いる発酵による、残留ラクトースの除去について記載している。この方法は、収率が良好であり、グルコース、ガラクトース、ラクトースを含んでいない高純度の生成物をもたらすが、ラクトースだけでなく、Ｋ．マルキシアヌスによる処理前にＧＯＳ混合物中に存在する他のすべての二糖も、この微生物によって消費される。
【００１０】
Ｌｉ，Ｚ．ら、Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００８、４３（８）、８９６〜８９９は、アルギン酸カルシウム上で固定化された、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又はクルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）を用いる発酵による、消化性糖質の除去について記載している。結果は、Ｋ．ラクチスを使用した場合、良好であるが、Ｓ．セレビシエを使用した場合、不十分である。
【００１１】
クルイベロミセス・マルキシアヌス又はクルイベロミセス・ラクチスを使用する欠点は、両方とも、一般の人々にとって公的に入手可能であるが、食品産業で一般的に採用されておらず、したがって、すぐに使用できる形で低コストで商業的に入手可能ではないことである。
【００１２】
高純度のＧＯＳを製造するための代替法であって、工業規模でも適用可能であり、すべての消化性糖質（ラクトース、グルコース、ガラクトース）が存在しないか、少量で存在し、また、容易に広く入手できる微生物を利用する代替法の明らかな必要性が存在する。
【００１３】
定義及び略語：
ＧＯＳ＝ガラクトオリゴ糖
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、より低純度のＧＯＳ混合物から出発して、消化性糖質であるラクトース、グルコース、及びガラクトースの全割合が５％以下である、純度９５％以上のＧＯＳを調製するための方法であって、前記方法が、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）を用いる１つの発酵ステップと、サッカロミセス・セレビシエを用いる少なくとも１つの発酵ステップとを含み、前記純度が、ＧＯＳ及び前記消化性糖質を識別し、定量化できる任意の分析法によって算出される、方法によって、前述の問題を克服する。
【００１５】
該方法は、前記消化性糖質が、微生物精製によって選択的に除去されることを可能にする。
【００１６】
有利なことに、前記方法によって、消化性糖質であるラクトース、グルコース、及びガラクトースの含量が少ないＧＯＳ混合物を得ることが可能になり、その方法では、グリコシル転移において形成されるすべての二糖が、微生物によって除去されることはない。
【００１７】
有利なことに、Ｓ．サーモフィルスを用いる発酵ステップは、ＨＰＬＣ保持時間がラクトースの保持時間に非常に近い、他の二糖を維持しつつ、ラクトースの選択的除去を可能にすることが判明している。ラクトースのピーク直後のＨＰＬＣのピークによって同定できる、該オリゴ糖のこの特徴的維持により、該方法によって得られる生成物は、当技術分野で公知の他の生成物とは違ったものになる。
【００１８】
前述の方法は、食品産業で広く採用されている、コストの低い市販の微生物を使用する。該微生物は、予備発酵混合物を調製することによって微生物を活性化させる必要なく、直接、凍結乾燥形態（購入された際の形態）で使用することができる。
【００１９】
前述の方法は、工業規模、すなわち、何ｋｇもの規模で容易に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】Ｂ．サーキュランスのラクターゼにより触媒されるグリコシル転移によってラクトースから得られた、実施例１の純度４０％のＧＯＳ出発サンプルのＨＰＬＣトレースを示す図である。
【図２】本発明に従って、サッカロミセス・セレビシエを用いて脱グルコース化（ｄｅｇｌｕｃｏｓａｔｉｏｎ）した後の、実施例１のＧＯＳサンプルのＨＰＬＣトレースを示す図である。
【図３】本発明に従って、ストレプトコッカス・サーモフィルスを用いて脱ラクトース化（ｄｅｌａｃｔｏｓａｔｉｏｎ）した後の、実施例１のＧＯＳサンプルのＨＰＬＣトレースを示す図である。
【図４Ａ】本発明に従って、サッカロミセス・セレビシエを用いて、図３に対応するサンプルを脱ガラクトース化（ｄｅｇａｌａｃｔｏｓａｔｉｏｎ）した後の、実施例１のＧＯＳサンプルのＨＰＬＣトレースを示す図である（Ａ：少なくとも２０時間の発酵後、Ｂ：少なくとも４０時間の発酵後）。
【図４Ｂ】本発明に従って、サッカロミセス・セレビシエを用いて、図３に対応するサンプルを脱ガラクトース化（ｄｅｇａｌａｃｔｏｓａｔｉｏｎ）した後の、実施例１のＧＯＳサンプルのＨＰＬＣトレースを示す図である（Ａ：少なくとも２０時間の発酵後、Ｂ：少なくとも４０時間の発酵後）。
【図５】本発明の方法に従って完了時に得られた、実施例１の純度９５％以上のＧＯＳサンプルのＨＰＬＣトレースを示す図である。
【図６】実施例２の出発ＧＯＳサンプル、すなわち、ＧＴＣ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、Ｇｏｌｄｅｎ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ、ＵＳＡから購入したプリムン（Ｐｕｒｉｍｕｎｅ）（商標）（ＧＯ−Ｐ９０）のＨＰＬＣトレースを示す図である。
【図７】本発明の方法に従って完了時に得られた、実施例２の純度９５％以上のＧＯＳサンプルのＨＰＬＣトレースを示す図である。
【図８】クルべロミセス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）・マルキシアヌスを用いた発酵後に得られた、実施例４のＧＯＳサンプルのＨＰＬＣトレースを示す図である。
【発明の詳細な説明】
【００２１】
本発明の方法では、純度９５％未満の任意のＧＯＳ混合物を、出発材料として使用することができ、不純物が、消化性糖質であるラクトース、グルコース、及びガラクトースから本質的になる、純度４０％以上のＧＯＳ混合物を使用することが、最も好都合である。
【００２２】
本発明の目的のために、ＧＯＳ混合物の純度を評価するために、好ましくは、ＧＯＳ、ラクトース、ガラクトース、及びグルコースを識別し、定量化できる任意のＨＰＬＣ法を使用する。
【００２３】
用語「純度」は、前記ＧＯＳ及び消化性糖質のピークに対応する、ＨＰＬＣによる面積パーセントを意味する。
【００２４】
４０〜６０％の（又はより高い）純度のＧＯＳ混合物は、商業的に入手可能である（例えば、オリゴメイト（Ｏｌｉｇｏｍａｔｅ）５５、ビビナル（Ｖｉｖｉｎａｌ）ＧＯＳ、プリムン、カップオリゴ（Ｃｕｐ ｏｌｉｇｏ）Ｐ）、又はバシルス・サーキュランスから単離されたラクターゼなどの、その目的で知られる適切なラクターゼにより触媒されるグリコシル転移によって、ラクトースから調製することができる。特に、本発明の方法は、４０〜６０％ＧＯＳ混合物から出発すると好都合である。
【００２５】
好ましくは、本発明の方法は、Ｓ．サーモフィルスを用いる前記発酵ステップの次に、Ｓ．セレビシエを用いる発酵ステップが続くような方法である。Ｓ．サーモフィルスは、ラクトースを加水分解してから、生成されたグルコースを消費し、ガラクトースを蓄積する。ガラクトースは、次いで、Ｓ．セレビシエによって排除される。Ｓ．サーモフィルスを用いる発酵ステップによって、ラクトース含量を、所望のレベル、好ましくはＨＰＬＣ面積パーセントで５％未満、より好ましくは３％未満に減少させることができる。
【００２６】
出発ＧＯＳ混合物が、ＨＰＬＣ面積パーセントで５％未満のグルコース含量を有する場合、前記方法は、Ｓ．サーモフィルスを用いる発酵ステップに続き、Ｓ．セレビシエを用いる発酵ステップを含む。Ｓ．サーモフィルスは、ラクトースを加水分解してから、最初に存在した少量のグルコース、及びＳ．サーモフィルスがガラクトースの蓄積の間に生成するグルコースを消費する。次いでガラクトースは、その後、Ｓ．セレビシエによって排除される。
【００２７】
したがって、例えば（実施例２を参照）、ＨＰＬＣ面積パーセントで２％の量でグルコースが存在する、約８０％程度の純度の市販のＧＯＳ混合物から出発することによって、ラクトース含量を、Ｓ．サーモフィルスを用いる直接発酵によって、所望のレベル、すなわち、ＧＯＳの面積パーセントの合計に対して、面積パーセントで５％未満に減少させることができる。
【００２８】
出発ＧＯＳ混合物が、ＨＰＬＣ面積パーセントで５％以上のグルコース含量を有する場合、Ｓ．サーモフィルスを用いる発酵ステップの前に、Ｓ．セレビシエを用いる発酵ステップが行われる。したがって、この場合、該方法は、以下の３つのステップ、すなわち、
（ａ）サッカロミセス・セレビシエを用いる発酵ステップと、
（ｂ）ストレプトコッカス・サーモフィルスを用いる発酵ステップと、
（ｃ）サッカロミセス・セレビシエを用いる発酵ステップと、
を含む。
【００２９】
したがって、例えば（実施例１を参照されたい）、Ｂ．サーキュランスを用いたグリコシル転移によって得られた、約４０％の純度を有するＧＯＳ混合物（図１を参照されたい）から出発すると、Ｓ．セレビシエを用いる発酵（ａ）は、出発ＧＯＳ混合物中に存在するグルコースが、ほぼ完全に除去されることを可能にする（図２を参照されたい）。
【００３０】
発酵（ｂ）は、ラクトースが、３％未満のＨＰＬＣ面積パーセントに低下することを可能にする（図３を参照されたい）。
【００３１】
約２０％の純度でグルコースが存在する、純度４０〜６０％のＧＯＳ混合物で出発すると、Ｓ．サーモフィルスを用いる発酵（ｂ）の前に、発酵（ａ）などの脱グルコース化ステップが行われた場合、ラクトースを、３面積％を下回るまで低下させることができるのに対して、Ｓ．サーモフィルスを用いる直接発酵は、Ｓ．セレビシエを用いる脱グルコース化ステップ（ａ）を最初に実施することなく行われた場合、４０時間を超えて延長されても、ラクトースが、所望のレベルに低下することを可能にしないことが分かる。
【００３２】
Ｓ．セレビシエを用いる発酵（ｃ）は、Ｓ．サーモフィルスを用いた発酵後に形成された残留ガラクトースが、ほぼ完全に除去されることを可能にする（図４を参照されたい）。
【００３３】
該方法の最後において、得られたＧＯＳ混合物は、９５％以上の純度を有し、この混合物中に、グルコース及びガラクトースは、非存在ではないにしても、ごくわずかな量で存在し、その量は、ラクトースと合わせても、合計５％以下である（図５を参照されたい）。
【００３４】
Ｓ．セレビシエを用いる発酵は、好ましくは、出発ＧＯＳの乾燥重量１ｋｇあたり４０〜１５ｇの脱水されたＳ．セレビシエを用いてｐＨ６．５±０．５、温度３５±５℃で少なくとも１２時間行われる。ステップ（Ｃ）は、４０時間を超える時間でも行うことでき、そのような場合、Ｓ．サーモフィルスを用いた発酵（ｂ）後に形成された乳酸の実質的な除去が、実際に実現される（図４Ｂを参照されたい）。
【００３５】
Ｓ．サーモフィルスを用いる発酵は、好ましくは、塩基の添加によりｐＨを６．０〜６．５に維持して、出発ＧＯＳの乾燥重量１ｋｇあたり１〜０．４ｇの脱水されたＳ．サーモフィルスを用いて温度４０±５℃で少なくとも１５時間行われる。
【００３６】
本発明の方法によれば、発酵ステップの後、該混合物は、好ましくは、セラミック限外濾過、ナノ濾過、炭素を用いる脱色、及びイオン交換樹脂での脱イオンによるさらなる処理にかけられる。
【００３７】
本発明の方法によれば、発酵ステップ（ｂ）及び（ｃ）の前に、低温殺菌が、好ましくは７５±５℃で少なくとも５分間行われる。
【００３８】
実際、前述の方法の最後に得られた生成物は、特徴的なＧＯＳプロファイルを示す。つまり、ＨＰＬＣトレース（図２と図３、及び図６と図７の比較）から明らかであるように、Ｓ．サーモフィルスを用いた発酵ステップの間、ラクトースが、主に除去され、また、二糖の領域においては、ラクトースの保持時間（約１２．９分）の直後の、約１３．６分の保持時間を有する成分（実施例でＧＯＳ６と表す）が残ることも認識できる。ラクトースの除去に伴って、ラクトースの保持時間の直前の、約１２．４分の保持時間を有する成分（実施例でＧＯＳ５と表す）が消失することが認識できる。ＧＯＳプロファイルのこの維持は、特徴的であり、クロマトグラフ分離によって、又はクルイべロミセス属の微生物を用いた精製（実施例４を参照し、図１と図８を比較されたい）の後に得られたＧＯＳ混合物（これらの方法は、ＧＯＳ混合物中に存在するすべての二糖を無差別に除去する）などの、現状技術で公知の他のＧＯＳ混合物と区別可能である。
【００３９】
したがって、本発明はまた、該方法から得られるＧＯＳ混合物、すなわち、ラクトース以外のガラクト二糖が１％以上の量で存在し、消化性糖質であるラクトース、グルコース、及びガラクトースの全割合が５％以下である、純度９５％以上のＧＯＳ混合物に関する。
【００４０】
該方法によって得られる前述の生成物は、医薬組成物、乳児用調合乳、及び食品組成物の調製を含めた既知の目的のために用いることができ、これらは、本発明のさらなる態様である。
【００４１】
本発明は、以下の実施例に照らすとよりよく理解できる。
【実施例】
【００４２】
ＨＰＬＣ法：
これは、外部標準との比較を使用するＨＰＬＣ法である。ＨＰＬＣ測定器を、アイソクラティックポンプ、オートサンプラー、カラム温度調節用のペルティエ（Ｐｅｌｔｉｅｒ）オーブン、屈折率検出器、及び類似のプレカラムを備えたＴｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃのカラムであるＩＣＥ−ＳＥＰ ＩＣＥ−ＩＯＮ３００（製品コード、ＩＣＥ−９９−９８５０）と共に使用する。以下の操作条件下で分析を行った。
カラム温度：４０℃
注入量：２０μｌ
移動相：Ｈ２ＳＯ４ ０．０１５Ｎ
流速：０．４ｍｌ／分
分析時間３６分
積分器：Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒのトータルクロム（Ｔｏｔａｌｃｈｒｏｍ）ワークステーション
【００４３】
上に示した条件下で、各生成物の保持時間は、ラクトースについて約１２．５分、グルコースについて１５．０分、ガラクトースについて１６．２分、乳酸について２１．３分、及びグリセリンについて２２．２分であった（外部標準に対して）。
【００４４】
サンプル溶液における、ＧＯＳ生成物の６つのピークを、
ＧＯＳ１：約９．３分にピーク
ＧＯＳ２：約９．７分にピーク
ＧＯＳ３：約１０．３分にピーク
ＧＯＳ４：約１１．３分にピーク
ＧＯＳ５：約１２．４分にピーク
ＧＯＳ６：約１３．６分にピーク
として識別し、同定した。
【００４５】
ＨＰＬＣ表示において、用語ＧＯＳ１〜６は、ＧＯＳ中に存在する糖類単位の数に関係なく、ＧＯＳに起因するピークを単に意味するだけである。
【００４６】
積分システムは、次式によって、含量を自動的に算出した。
％＝Ａｓ×ＣＳＴＤ×Ｖ×１００／ＡＳＴＤ×Ｗｓ
式中、
ＡＣ＝サンプル溶液におけるピーク面積
ＣＳＴＤ＝標準溶液における糖濃度の割合（％）
Ｗｓ＝グラム単位でのサンプル重量
ＡＳＴＤ＝標準溶液における糖ピーク面積
【００４７】
プロセスのモニタリングの間、各ＧＯＳピークの含量は、ピーク自体の標準物質に対して算出しなかったが、ラクトースの応答係数を使用することによって、又は面積／総面積で表されるラクトースの純度を評価することによって算出した。
【００４８】
直前に述べた分析法を使用して、他のガラクトオリゴ糖との重複があれば、ラクトースの測定値を無効とした。
【００４９】
前述の分析法を使用した、市販サンプルにおけるラクトースの測定値と、証明書に示された値との間で見つかる、顕著な不一致について留意することが重要である。
【００５０】
例えば、Ｆｒｉｅｓｌａｎｄ Ｆｏｏｄｓ Ｄｏｍｏによって供給された、ビビナル（登録商標）ＧＯＳ６０、バッチ番号６２９７７７０のサンプルは、証明済みラクトース含量が、乾物ベースで１７．５％であったが、本発明者らの分析研究所で実施したＨＰＬＣにより、そのラクトース含量は３３．２％であった。
【００５１】
ラクトースを算定した際の類似した評価値が、プリムン（商標）のサンプル、バッチ番号２００８１２１７で見出された。そのサンプルにおいては、ＧＯＳの証明済み総純度が９０．４％であったのに対して、本発明者らの分析研究所（付属）で実施したＨＰＬＣにより、前記純度は８３．０％であり、ラクトースの純度が面積パーセントで１３．６％であった。
【００５２】
したがって、ラクトースの測定値は、本発明者らの分析法によって過大に算定され、結果として、最終生成物に存在するラクトース濃度の過大の評価値となった。
【００５３】
説明において曖昧な点が生じないように、以下に提示する実施例において、及び図面欄においては、市販品についての値と同様に、前述のＨＰＬＣ法を用いて得られた純度値のみを示す。
【００５４】
実施例１（ラクトースから出発する調製例）：
８０ｋｇのラクトース一水和物（０．２２ｋｍｏｌ）を、１２０ｌの水に懸濁させ、ラクトースが完全に溶解するまで、穏やかな攪拌下で７０℃に加熱した。
この溶液を、５０℃で温度調節し、そのｐＨを、２７ｍｌの７５％リン酸で５．５〜５．０に調整した。
２６６ｇのバシルス・サーキュランス由来のラクターゼを添加した（１５００Ｕ／ｇ）。
反応をＨＰＬＣによってモニタリングし、２２時間後、ＧＯＳの形成、並びにグルコース及びガラクトースの出現が検出され、結果的に、ラクトースの面積パーセント純度が４０％未満に低下した。
２００ｋｇの４０％粗ＧＯＳ溶液を得た。その溶液のＨＰＬＣトレースを図１に示し、また、下に表形式で提示する。
【００５５】
【表１】
【００５６】
ステップ１（Ｓ．セレビシエを用いる脱グルコシル化）：
前述の出発混合物を、２５０ｍｌの７５％リン酸でｐＨ３．０に酸性化させた。このｐＨ条件下で、周囲温度での保存が可能であった。
４６ｋｇの４０％粗ＧＯＳ溶液（バッチ番号０１４４９ＩＮ９）を、１４０ｌの水で希釈し、３７℃で温度調節した。溶液のｐＨを、６００ｍｌの２４％アンモニアでｐＨ２．８〜ｐＨ７．０に調整した後、２００ｇの凍結乾燥されたビール酵母を添加した。ＨＰＬＣによってモニタリングした脱グルコシル化ステップは、２４時間の激しい攪拌後に完了した。
混合物を、７０℃で約５分間低温殺菌してから、４０℃で温度調節した。
図２は、下には表形式で提示した、低温殺菌後の混合物のＨＰＬＣトレースを示す。
【００５７】
【表２】
【００５８】
ステップ２（Ｓ．サーモフィルスを用いる脱ラクトース化）：
２．５ｇ／ｌの酵母エキスを、（ステップ１からもたらされた）上述の混合物に添加し、ｐＨを、４００ｍｌの１５％水酸化ナトリウムでｐＨ５．２〜ｐＨ６．６に調整した。混合物に５ｇのストレプトコッカス・サーモフィルスを接種した。ｐＨスタットにより１５％水酸化ナトリウムを添加することによって、ｐＨ６．４〜６．５で発酵を進行させた。ＨＰＬＣによってモニタリングした反応は、２６時間後に終了に達し、その時の混合物中のラクトース含量は、３面積％未満であった。
混合物を、７０℃で約５分間低温殺菌してから、３７℃で温度調節した。
図３は、下には表形式で提示した、低温殺菌後の混合物のＨＰＬＣトレースを示す。
【００５９】
【表３】
【００６０】
ステップ３（Ｓ．セレビシエを用いる脱ガラクトース化）：
２００ｇの凍結乾燥されたビール酵母を、ステップ２からもたらされた混合物に添加した。２０時間の激しい攪拌後、ＨＰＬＣによってモニタリングした脱ガラクトース化ステップは完了した。
ｐＨ３．０に達するまで、５ｌの５０％硫酸を添加することによって、反応を止めた。
図４は、下には表形式で提示した、脱ガラクトース化後の混合物のＨＰＬＣトレースを示す。
【００６１】
【表４】
【００６２】
限外濾過により細胞を除去することによって、混合物を澄ませた。
次いで、低分子量の発酵副生成物（乳酸、グリセリンなど）を、ナノ濾過によって除去した。
次いで、溶液を炭素で脱色し、直列に配置された一組のイオン交換樹脂、すなわち、強カチオンのもの（アンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）Ｃ−２００ Ｈ＋形、３ｌ）と弱アニオンのもの（ＩＲＡ−９６ 遊離塩基形、３ｌ）で塩分を除いた。
次いで、脱塩した溶液をマイクロ濾過し、７５°ブリックスという検糖計濃度が得られるまで、真空中で濃縮した。
純度９５％以上の９ｋｇのＧＯＳ混合物を得た。該方法の最後に得られたＧＯＳ混合物のＨＰＬＣトレースを、図５に示し、下には表形式で提示する。
【００６３】
【表５】
【００６４】
表にされたデータ、及び添付した様々なステップのクロマトグラムから、ステップ２（Ｓ．サーモフィルスを用いる発酵）の間に、ＧＯＳ５のピークが消失する一方で、ＧＯＳ６のピークがほぼ変わらないまま残ることが分かる。
表１は、実施例１の様々なステップの結果の概要を示す。
【００６５】
【表６】
【００６６】
表中、
％濃度＝重量／重量％単位での濃度
％純度＝ＨＰＬＣピークにより定められた面積パーセント
相対％＝ＧＯＳの純度／ＧＯＳ、ラクトース、グルコース及びガラクトースの純度の合計
【００６７】
実施例２（８３％（９０％で市販）のＧＯＳから出発する調製例）：
２００ｇのプリムンＧＯＳ（ＧＯ−Ｐ９０）、バッチ番号２００８１２１７を、１８００ｍｌの水に可溶化した。図６は、そのクロマトグラムを示し、また、溶液のＨＰＬＣを、下に表形式で提示する。
【００６８】
【表７】
【００６９】
存在しているグルコースは、面積パーセントが５％未満であるので、直接、乳酸菌培養による発酵から、手順を続行した。
５ｇ／ｌの酵母エキスを添加し、ｐＨを、０．３ｍｌの１５％水酸化ナトリウムでｐＨ４．９〜ｐＨ６．４に調整した。７５ｍｇのストレプトコッカス・サーモフィルスを接種した後、ｐＨスタットにより１５％水酸化ナトリウムを添加することによって、ｐＨ６．３〜６．５で発酵を進行させた。ＨＰＬＣによってモニタリングした反応は、１５時間後に終了に達し、その時の混合物中のラクトース含量は、ＧＯＳの面積パーセントの合計に対して、面積パーセントで５％未満であった。
【００７０】
【表８】
【００７１】
得られた結果の概要を表２に示す。
【００７２】
【表９】
【００７３】
略語：
％濃度＝重量／重量％単位での濃度
％純度＝ＨＰＬＣピークにより定められた面積パーセント
相対％＝ＧＯＳの純度／ＧＯＳ、ラクトース、グルコース及びガラクトースの純度の合計
【００７４】
この段階で実験を止めたが、実施例１で既に説明した方式で、その後に混合物を脱ガラクトース化し、精製することができたことは明らかであった。
【００７５】
ストレプトコッカス・サーモフィルスを用いる直接発酵のため、Ｓ．セレビシエを用いる脱グルコース化をしなかった（今回の場合は不必要であった）ことは、ＧＯＳ対ラクトースの所望の面積比をもたらした。さらに、その後に続くＳ．セレビシエを用いる発酵が、ガラクトースを除去できたことを考えると、表２で報告した面積パーセント値を基にして、ラクトースのみに対して９５．６％というＧＯＳ純度を、理論的に算出することができる。
【００７６】
実施例３（４３％（６０％で市販）のＧＯＳから出発する調製例）：
４２７ｇのビビナルＧＯＳ６０、バッチ番号６２９７７７０を、１６００ｍｌの水に可溶化した。溶液のＨＰＬＣデータを、下に表形式で示す。
【００７７】
【表１０】
【００７８】
最初に、Ｓ．セレビシエを用いる脱グルコース化ステップ、それに続くＳ．サーモフィルスを用いる発酵について、実施例１とまさしく同じように、手順を行った。Ｓ．サーモフィルスを用いる発酵ステップ（実施例１でのステップ２）の最後に、ＨＰＬＣが得られた。実施例１の結果に完全に匹敵している結果を下表にまとめる。
【００７９】
【表１１】
【００８０】
Ｓ．サーモフィルスを用いる発酵の間に、ＧＯＳ５のピークが消失する一方で、ＧＯＳ６のピークがほぼ変わらないまま残ることが、この実施例でも分かる。
【００８１】
実施例２と同じように、この段階でこの実験を止めて、実施例１で既に説明した方式で混合物を脱ガラクトース化し、精製した。
【００８２】
さらに、Ｓ．セレビシエを用いる第２の発酵で、ガラクトースを除去できたことを考えると、本実施例の第２のＨＰＬＣの表で報告した面積パーセント値を基にして、ラクトースのみに対して９５．２％というＧＯＳ純度を、理論的に算出することができる。
【００８３】
実施例４（Ｋ．マルキシアヌスを用いる、４０％のＧＯＳから出発する調製例（Ｃｈｅｎｇ，Ｃ．−Ｃ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２８ ７９３〜７９７、２００６））：
菌株であるＫ．マルキシアヌスＡＴＣＣ５６４９７を、オートクレーブ滅菌した酵母用ＹＰＤ寒天培地を含有するプレート上で培養し、３０℃のインキュベーター内に４８時間置いた。
予備発酵混合物を調製するために、１００ｍｌのＹＰＤ液体培地を調製し、オートクレーブ滅菌し、次いで、事前に調製したプレートから取り出したコロニーを接種した。微生物を、３０℃の温度で振盪機内で増殖させ、２００ｒｐｍで２４時間振盪した。
実施例１と同じ出発溶液、すなわち、１．４１ｌの水で希釈した４６０ｇの４０％粗ＧＯＳ溶液（バッチ番号０１４４９ＩＮ９）で、試験を行った。
溶液のｐＨを、１５％水酸化ナトリウムでｐＨ２．８〜ｐＨ５．４に調整した後、溶液を３０℃で温度調節した。
全部の予備発酵混合物を接種のために使用した。ｐＨスタットにより１５％水酸化ナトリウムを添加することによって、ｐＨ５．２〜５．４で発酵を進行させた。混合物のサンプル抽出を、４８時間後に行ったが、下に提示する、表にされたＨＰＬＣデータ（図８も参照されたい）から分かるように、反応が完了に達したことが示されている。
【００８４】
【表１２】
【００８５】
反応は有効に、ラクトースのほぼ完全な消失をもたらしたが、ガラクト−オリゴ糖に起因するピークが、二糖の全領域（１２．２分〜１３．２分の間）に存在しないことに、添付したクロマトグラム（図８）から留意されたい。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
消化性糖質であるラクトース、グルコース及びガラクトースの全割合が５％以下である、純度９５％以上のＧＯＳ混合物を、より低純度のＧＯＳ混合物から出発して調製するための方法であって、前記方法は、ストレプトコッカス・サーモフィルスを用いる１つの発酵ステップと、サッカロミセス・セレビシエを用いる少なくとも１つの発酵ステップと、を含み、前記純度は、ＧＯＳ及び前記消化性糖質を識別・定量化できる任意の分析法によって算出される、方法。
【請求項２】
Ｓ．サーモフィルスを用いる前記発酵ステップの後に、Ｓ．セレビシエを用いる発酵ステップが行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
出発ＧＯＳ混合物のグルコース含量がＨＰＬＣ面積パーセントで５％以下である場合、Ｓ．サーモフィルスを用いる発酵ステップの後に、Ｓ．セレビシエを用いる発酵ステップが行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
出発ＧＯＳ混合物のグルコース含量がＨＰＬＣ面積パーセントで５％を超える場合、Ｓ．サーモフィルスを用いる発酵ステップの前に、Ｓ．セレビシエを用いる発酵ステップが行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
Ｓ．セレビシエを用いる発酵ステップは、出発ＧＯＳの乾燥重量１ｋｇあたり４０〜１５ｇの脱水されたＳ．セレビシエを用いてｐＨ６．５±０．５、温度３５±℃で少なくとも１２時間行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
Ｓ．サーモフィルスを用いる発酵ステップは、好ましくは、塩基の添加によりｐＨを６．０〜６．５に維持して、出発ＧＯＳの乾燥重量１ｋｇあたり１〜０．４ｇの脱水されたＳ．サーモフィルスを用いて温度４０±５℃で少なくとも１５時間行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
発酵ステップの後、前記混合物は、セラミック限外濾過、ナノ濾過、炭素を用いる脱色、及びイオン交換樹脂での脱イオンによるさらなる処理にかけられる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ラクトース以外のガラクト二糖が１％以上の量で存在し、消化性糖質であるラクトース、グルコース及びガラクトースの全割合が５％以下である、純度９５％以上のＧＯＳ混合物。
【請求項９】
請求項８に記載のＧＯＳ混合物を含む医薬又は食品組成物。
【請求項１】
消化性糖質であるラクトース、グルコース及びガラクトースの全割合が５％以下である、純度９５％以上のＧＯＳ混合物を、より低純度のＧＯＳ混合物から出発して調製するための方法であって、前記方法は、ストレプトコッカス・サーモフィルスを用いる１つの発酵ステップと、サッカロミセス・セレビシエを用いる少なくとも１つの発酵ステップと、を含み、前記純度は、ＧＯＳ及び前記消化性糖質を識別・定量化できる任意の分析法によって算出される、方法。
【請求項２】
Ｓ．サーモフィルスを用いる前記発酵ステップの後に、Ｓ．セレビシエを用いる発酵ステップが行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
出発ＧＯＳ混合物のグルコース含量がＨＰＬＣ面積パーセントで５％以下である場合、Ｓ．サーモフィルスを用いる発酵ステップの後に、Ｓ．セレビシエを用いる発酵ステップが行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
出発ＧＯＳ混合物のグルコース含量がＨＰＬＣ面積パーセントで５％を超える場合、Ｓ．サーモフィルスを用いる発酵ステップの前に、Ｓ．セレビシエを用いる発酵ステップが行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
Ｓ．セレビシエを用いる発酵ステップは、出発ＧＯＳの乾燥重量１ｋｇあたり４０〜１５ｇの脱水されたＳ．セレビシエを用いてｐＨ６．５±０．５、温度３５±℃で少なくとも１２時間行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
Ｓ．サーモフィルスを用いる発酵ステップは、好ましくは、塩基の添加によりｐＨを６．０〜６．５に維持して、出発ＧＯＳの乾燥重量１ｋｇあたり１〜０．４ｇの脱水されたＳ．サーモフィルスを用いて温度４０±５℃で少なくとも１５時間行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
発酵ステップの後、前記混合物は、セラミック限外濾過、ナノ濾過、炭素を用いる脱色、及びイオン交換樹脂での脱イオンによるさらなる処理にかけられる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ラクトース以外のガラクト二糖が１％以上の量で存在し、消化性糖質であるラクトース、グルコース及びガラクトースの全割合が５％以下である、純度９５％以上のＧＯＳ混合物。
【請求項９】
請求項８に記載のＧＯＳ混合物を含む医薬又は食品組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１３−５０１５０４（Ｐ２０１３−５０１５０４Ａ）
【公表日】平成２５年１月１７日（２０１３．１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２３４２５（Ｐ２０１２−５２３４２５）
【出願日】平成２２年８月６日（２０１０．８．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０５３５６７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１６００８
【国際公開日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【出願人】（５０２３５０７９９）イナルコ ソシエタ ペル アチオニ (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年１月１７日（２０１３．１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月６日（２０１０．８．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０５３５６７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１６００８
【国際公開日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【出願人】（５０２３５０７９９）イナルコ ソシエタ ペル アチオニ (6)
【Ｆターム（参考）】
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