軟骨再生促進剤
【課題】軟骨の再生を効率的に促進でき、かつ安全性の高い、優れた軟骨再生促進剤、並びに、前記軟骨再生促進剤を利用した医薬及び食品を提供すること。
【解決手段】ヒドロキシチロソール及びヒドロキシチロソール前駆体の少なくともいずれかを含有することを特徴とする軟骨再生促進剤、並びに、前記軟骨再生促進剤を含有する医薬及び食品である。
【解決手段】ヒドロキシチロソール及びヒドロキシチロソール前駆体の少なくともいずれかを含有することを特徴とする軟骨再生促進剤、並びに、前記軟骨再生促進剤を含有する医薬及び食品である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節軟骨の再生を促進する軟骨再生促進剤、並びに、前記軟骨再生促進剤を利用した医薬及び食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節内の骨の両端を覆い、骨と骨との間の衝撃を吸収するクッションの役割を担う軟骨は、通常、日々の磨耗と再生を繰り返しながら健全性を保っている。
しかしながら、例えば、疾患や外傷等により、軟骨は大きく損傷を受ける場合がある。また、加齢に伴う軟骨の磨り減りや弾力性の低下によっても、軟骨は損傷を受け易い状態となる。このような損傷に対して軟骨の再生が追いつかない状態となると、軟骨の機能は損なわれ、関節内の骨と骨との間の衝撃を吸収することができなくなり、関節内に炎症、痛みが発生する。
【０００３】
このような軟骨の損傷に対する治療又は予防方法に関しては、従来から広く研究開発が行われており、例えば、軟骨の構成成分又はその前駆体を含む組成物を、経口や静注で体内に投与することにより、体内での軟骨の生合成を促す方法などが開発されてきた。
より具体的には、例えば、関節軟骨の水分を保ち、弾力を与える成分であるプロテオグリカン等の生成を促す、グルコサミンとコンドロイチン硫酸塩とを、それぞれ単独で、又は併用して使用することにより、軟骨損傷に対する治療効果が得られたことが報告されている（例えば、特許文献１参照）。また、グルコサミンと骨髄エキスとを併用することにより、グルコサミンの軟骨再生促進作用がより増強したことなども報告されている（例えば、特許文献２参照）。
【０００４】
しかしながら、例えば、前記したような様々な原因から、軟骨損傷を患う患者は多く、したがって、軟骨の再生を効率的に促進でき、かつ安全性の高い、新たな軟骨再生促進剤の開発が、未だ望まれているのが現状である。
【０００５】
【特許文献１】特許第２９７１５７９号公報
【特許文献２】特開２００１−３２２９３８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、軟骨の再生を効率的に促進でき、かつ安全性の高い、優れた軟骨再生促進剤、並びに、前記軟骨再生促進剤を利用した医薬及び食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、オリーブ（モクセイ科オリーブ属オリーブ：Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）等から得ることのできる成分であるヒドロキシチロソールが、優れた軟骨再生促進作用を有するという知見である。
【０００８】
前記ヒドロキシチロソール（Ｈｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ：２−（３，４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｅｔｈａｎｏｌ）は、後述する構造式（１）で表される化合物であり、従来から、メラニン生成抑制作用や過酸化脂質生成抑制作用を有しており、皮膚外用剤や浴用剤等として使用できることなどが知られていた（例えば、特開２００４−２６８３６号公報参照）。また、前記ヒドロキシチロソールとオレウロペインとを含有した処置剤を用い、リウマチ様関節炎等の炎症状態を処置する方法なども提案されている（例えば、特表２００５−５１７０３３号公報参照）。
【０００９】
しかしながら、前記ヒドロキシチロソールが優れた軟骨再生促進作用を有することは従来全く知られておらず、本発明者らの新たな知見である。
【００１０】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ ヒドロキシチロソール及びヒドロキシチロソール前駆体の少なくともいずれかを含有することを特徴とする軟骨再生促進剤である。
＜２＞ ヒドロキシチロソール及びヒドロキシチロソール前駆体の少なくともいずれかがオリーブ由来である前記＜１＞に記載の軟骨再生促進剤である。
＜３＞ ヒドロキシチロソール前駆体がオレウロペインである前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の軟骨再生促進剤である。
＜４＞ ヒドロキシチロソール及びヒドロキシチロソール前駆体の少なくともいずれかを１０質量％以上含有する前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の軟骨再生促進剤である。
＜５＞ オリーブ抽出物を含有する前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の軟骨再生促進剤である。
＜６＞ ヒドロキシチロソール及びヒドロキシチロソール前駆体の少なくともいずれかと、アミノ糖とを組み合わせてなる前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の軟骨再生促進剤である。
＜７＞ アミノ糖がグルコサミン塩酸塩である前記＜６＞に記載の軟骨再生促進剤である。
＜８＞ ヒドロキシチロソール及びヒドロキシチロソール前駆体の少なくともいずれかと、アミノ糖との配合剤である前記＜６＞から＜７＞のいずれかに記載の軟骨再生促進剤である。
＜９＞ ヒドロキシチロソール及びヒドロキシチロソール前駆体の少なくともいずれかを含有する薬剤と、アミノ糖を含有する薬剤とを含むキットである前記＜６＞から＜７＞のいずれかに記載の軟骨再生促進剤である。
＜１０＞ 前記＜１＞から＜９＞のいずれかに記載の軟骨再生促進剤を含有することを特徴とする医薬である。
＜１１＞ 前記＜１＞から＜９＞のいずれかに記載の軟骨再生促進剤を含有することを特徴とする食品である。
【００１１】
＜１２＞ ヒドロキシチロソール及びヒドロキシチロソール前駆体の少なくともいずれかを含有することを特徴とするグルコサミノグリカン産生促進剤である。
＜１３＞ ヒドロキシチロソール及びヒドロキシチロソール前駆体の少なくともいずれかがオリーブ由来である前記＜１２＞に記載のグルコサミノグリカン産生促進剤である。
＜１４＞ ヒドロキシチロソール前駆体がオレウロペインである前記＜１２＞から＜１３＞のいずれかに記載のグルコサミノグリカン産生促進剤である。
＜１５＞ ヒドロキシチロソール及びヒドロキシチロソール前駆体の少なくともいずれかを１０質量％以上含有する前記＜１２＞から＜１４＞のいずれかに記載のグルコサミノグリカン産生促進剤である。
＜１６＞ オリーブ抽出物を含有する前記＜１２＞から＜１５＞のいずれかに記載のグルコサミノグリカン産生促進剤である。
＜１７＞ ヒドロキシチロソール及びヒドロキシチロソール前駆体の少なくともいずれかと、アミノ糖とを組み合わせてなる前記＜１２＞から＜１６＞のいずれかに記載のグルコサミノグリカン産生促進剤である。
＜１８＞ アミノ糖がグルコサミン塩酸塩である前記＜１７＞に記載のグルコサミノグリカン産生促進剤である。
＜１９＞ ヒドロキシチロソール及びヒドロキシチロソール前駆体の少なくともいずれかと、アミノ糖との配合剤である前記＜１７＞から＜１８＞のいずれかに記載のグルコサミノグリカン産生促進剤である。
＜２０＞ ヒドロキシチロソール及びヒドロキシチロソール前駆体の少なくともいずれかを含有する薬剤と、アミノ糖を含有する薬剤とを含むキットである前記＜１７＞から＜１８＞のいずれかに記載のグルコサミノグリカン産生促進剤である。
＜２１＞ 前記＜１２＞から＜２０＞のいずれかに記載のグルコサミノグリカン産生促進剤を含有することを特徴とする医薬である。
＜２２＞ 前記＜１２＞から＜２０＞のいずれかに記載のグルコサミノグリカン産生促進剤を含有することを特徴とする食品である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によると、従来における諸問題を解決することができ、軟骨の再生を効率的に促進でき、かつ安全性の高い、優れた軟骨再生促進剤、並びに、前記軟骨再生促進剤を利用した医薬及び食品を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（軟骨再生促進剤）
本発明の軟骨再生促進剤は、ヒドロキシチロソール及びヒドロキシチロソール前駆体の少なくともいずれか（ヒドロキシチロソール及び／又はヒドロキシチロソール前駆体）を含有してなり、必要に応じて更にその他の成分を含有してなる。
【００１４】
＜ヒドロキシチロソール、ヒドロキシチロソール前駆体＞
−ヒドロキシチロソール−
前記ヒドロキシチロソール（Ｈｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ：２−（３，４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｅｔｈａｎｏｌ）は、後述する構造式（１）で表される化合物である。
【００１５】
【化１】
【００１６】
前記ヒドロキシチロソールは、その入手方法に特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学的に合成されたものを使用してもよいし、天然物由来のものを使用してもよい。
前記ヒドロキシチロソールとして天然物由来のものを使用する場合、その由来としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、中でも、植物由来であることが好ましく、オリーブ（モクセイ科オリーブ属オリーブ：Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）由来であることがより好ましい。
【００１７】
前記ヒドロキシチロソールは、例えば、前記オリーブの植物体から抽出することにより得ることができ、前記植物体としては、例えば、葉、茎、実などが挙げられる。
前記オリーブの植物体からの前記ヒドロキシチロソールの抽出方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、メタノール、エタノール、アセトン等の水溶性有機溶媒又は含水有機溶媒を用いて抽出することができる。
【００１８】
−ヒドロキシチロソール前駆体−
また、前記ヒドロキシチロソール前駆体とは、生体内の代謝反応によってヒドロキシチロソールへと変換される、ヒドロキシチロソールの前段階の物質をいう。
したがって、前記ヒドロキシチロソール前駆体の具体例としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、オレウロペイン（Ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ）などが好適に挙げられる。前記オレウロペインは、例えばヒトやラット等の哺乳動物が経口摂取した場合、体内で加水分解され、ヒドロキシチロソールに変換されることが知られている（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，７８５（２００３）４７−５６、及び、Ｊ．Ｎｕｔｒ．１３２：４０９−４１７，２００２参照）。したがって、前記ヒドロキシチロソール前駆体は、体内でヒドロキシチロソールへと代謝されることにより、前記ヒドロキシチロソールと同様の軟骨再生促進効果を奏することが可能である。
【００１９】
前記オレウロペインの入手方法としても、前記ヒドロキシチロソール同様、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学的に合成されたものを使用してもよいし、天然物由来のものを使用してもよい。
前記オレウロペインとして天然物由来のものを使用する場合、その由来としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、中でも、植物由来であることが好ましく、オリーブ（モクセイ科オリーブ属オリーブ：Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）由来であることがより好ましい。
【００２０】
前記オレウロペインは、例えば、前記オリーブの植物体から抽出することにより得ることができ、前記植物体としては、例えば、葉、茎、実などが挙げられる。
前記オリーブの植物体からの前記オレウロペインの抽出方法としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、特開２００２−１２８６７８号公報、特開２００３−３３５６９３号公報などに記載の抽出方法を参照して抽出することができる。
【００２１】
なお、前記ヒドロキシチロソール、及び、前記ヒドロキシチロソール前駆体は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００２２】
前記軟骨再生促進剤中の、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体の含有量は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記軟骨再生促進剤１００質量％に対して、１０質量％以上が好ましく、１５質量％以上がより好ましく、２０質量％以上が特に好ましい。また、前記含有量の上限としては、特に制限はなく、前記含有量が高い程、より強い軟骨再生効果が期待できる。また、前記軟骨再生促進剤は、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体そのものであってもよい。
【００２３】
＜アミノ糖との併用＞
また、前記軟骨再生促進剤は、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体と、アミノ糖とを組み合わせて（併用して）なるものであってもよい。
前記軟骨再生促進剤が、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体と、前記アミノ糖とを組み合わせてなるものであると、軟骨細胞におけるグルコサミノグリカン（中でも、ヒアルロン酸）の産生促進作用を高めることができる点で、有利である。軟骨細胞におけるグルコサミノグリカンの産生促進作用が高まることにより、更なる軟骨再生の促進が期待される。
【００２４】
−アミノ糖−
前記アミノ糖としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、グルコサミン（Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ：２−ａｍｉｎｏ−２−ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ）、マンノサミン（Ｍａｎｎｏｓａｍｉｎｅ：２−ａｍｉｎｏ−２−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ）、ガラクトサミン（Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ：２−ａｍｉｎｏ−２−ｄｅｏｘｙｇａｌａｃｔｏｓｅ）、フコサミン（Ｆｕｃｏｓａｍｉｎｅ：２−ａｍｉｎｏ−２，６−ｄｉｄｅｏｘｙｇａｌａｃｔｏｓｅ）、キノボサミン（Ｑｕｉｎｏｖｏｓａｍｉｎｅ：２−ａｍｉｎｏ−２，６−ｄｉｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ）、ラムノサミン（Ｒｈａｍｎｏｓａｍｉｎｅ：２−ａｍｉｎｏ−２，６−ｄｉｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ）、これらの薬理学的に許容され得る塩などが挙げられる。また、これらのアミノ糖におけるアミノ基がアセチル化された化合物、及び前記化合物の薬理学的に許容され得る塩も、それぞれ前記アミノ糖の範囲内に含まれる。また、前記薬理学的に許容され得る塩としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩酸塩、硫酸塩等の無機塩、クエン酸塩、グルコン酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩等の有機酸塩などが挙げられる。これらの中でも、塩酸塩が、特に好ましい。
中でも、前記アミノ糖としては、グルコサミン、ガラクトサミン、及びこれらの薬理学的に許容され得る塩が好ましく、グルコサミン塩酸塩がより好ましい。
【００２５】
前記アミノ糖は、その入手方法に特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学的に合成されたものを使用してもよいし、カニ・エビ等の甲殻から得られる天然物由来のものを使用してもよい。
【００２６】
なお、前記アミノ糖は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００２７】
前記軟骨再生促進剤が、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体と、前記アミノ糖とを組み合わせてなるものである場合、前記軟骨再生促進剤中の、前記アミノ糖の含有量は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記軟骨再生促進剤１００質量％に対して、１０〜９０質量％が好ましく、１５〜８５質量％がより好ましく、２０〜８０質量％が特に好ましい。
【００２８】
−含有量比−
前記軟骨再生促進剤が、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体と、前記アミノ糖とを組み合わせてなるものである場合、前記軟骨再生促進剤中の、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体と、前記アミノ糖との含有量比としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、質量比で、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体：前記アミノ糖＝２０：１〜１：１００が好ましく、１：１０〜１：７０がより好ましい。
【００２９】
−配合剤、キット−
なお、前記軟骨再生促進剤が、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体と、前記アミノ糖とを組み合わせてなる場合、前記軟骨再生促進剤としては、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体と、前記アミノ糖とが混合された配合剤の状態であってもよいし、また、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体を含有する薬剤と、前記アミノ糖を含有する薬剤とを含む（前記２種の成分が混合されていない）、キットの状態であってもよい。
【００３０】
（医薬）
本発明の医薬は、前記した本発明の軟骨再生促進剤を少なくとも含有してなり、必要に応じて更にその他の成分を含有してなる。
【００３１】
前記医薬中の、前記軟骨再生促進剤の含有量としては、特に制限はなく、例えば、後述する前記医薬の剤型や、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができる。また、前記医薬は、前記軟骨再生促進剤そのものであってもよい。
【００３２】
−その他の成分−
前記その他の成分としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、後述するような医薬用の添加剤などが挙げられる。また、前記医薬中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３３】
上記医薬としては、前記軟骨再生促進剤をそのまま、又は適当な添加剤を混和し、製剤化したものを使用する。
上記添加剤としては、一般に医薬に使用される、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、矯味矯臭剤、乳化剤、界面活性剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤、安定化剤、吸収促進剤等を挙げることができ、所望により、これらを適宜組み合わせて使用することもできる。
上記賦形剤としては、例えば乳糖、白糖、ブドウ糖、コーンスターチ、マンニトール、ソルビトール、デンプン、α化デンプン、デキストリン、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウム、ケイ酸カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、リン酸水素カルシウム等を挙げることができる。
上記結合剤としては、例えばポリビニルアルコール、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等を挙げることができる。
上記滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、フマル酸ステアリルナトリウム、タルク、ポリエチレングリコール、コロイドシリカ等を挙げることができる。
上記崩壊剤としては、例えば結晶セルロース、寒天、ゼラチン、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム等を挙げることができる。
上記着色剤としては、例えば三二酸化鉄、黄色三二酸化鉄、カルミン、カラメル、β−カロチン、酸化チタン、タルク、リン酸リボフラビンナトリウム、黄色アルミニウムレーキ等、医薬品に添加することが許可されているものを挙げることができる。
上記矯味矯臭剤としては、例えばココア末、ハッカ脳、芳香散、ハッカ油、メントール、竜脳、桂皮末等を挙げることができる。
上記乳化剤又は界面活性剤としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、モノステアリン酸グリセリン、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル等を挙げることができる。
上記溶解補助剤としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、安息香酸ベンジル、エタノール、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド等を挙げることができる。
上記懸濁化剤としては、前記界面活性剤のほか、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子を挙げることができる。
上記等張化剤としては、例えばブドウ糖、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール等を挙げることができる。
上記緩衝剤としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液を挙げることができる。
上記防腐剤としては、例えばメチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等を挙げることができる。
上記抗酸化剤としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロール等を挙げることができる。
上記安定化剤としては、アスコルビン酸、エデト酸ナトリウム、エリソルビン酸、トコフェロール等を挙げることができる。
上記吸収促進剤としては、ミリスチン酸イソプロピル、トコフェロール、カルシフェロール等を挙げることができる。
【００３４】
また、上記製剤としては、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤のような経口剤；坐剤、軟膏剤、眼軟膏剤、テープ剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤のような外用剤又は注射剤を挙げることができる。
上記経口剤は、上記添加剤を適宜組み合わせて製剤化する。なお、必要に応じてこれらの表面をコーティングしてもよい。
上記外用剤は、上記添加剤のうち、特に賦形剤、結合剤、矯味矯臭剤、乳化剤、界面活性剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、防腐剤、抗酸化剤、安定化剤又は吸収促進剤を適宜組み合わせて製剤化する。
上記注射剤は、上記添加剤のうち、特に乳化剤、界面活性剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤、安定化剤又は吸収促進剤を適宜組み合わせて製剤化する。
【００３５】
なお、前記軟骨再生促進剤が、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体と、前記アミノ糖とを組み合わせてなる場合、前記医薬としては、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体と、前記アミノ糖とを同時に含んでなるものであってもよいし、また、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体を含有する薬剤と、前記アミノ糖を含有する薬剤との、組合せからなるものであってもよい。
【００３６】
前記医薬は、前記した本発明の軟骨再生促進剤を少なくとも含むので、軟骨の再生を促進する効果に優れる。したがって、前記医薬は、軟骨損傷の治療又は予防用途に特に好適である。
【００３７】
（食品）
本発明の食品は、前記した本発明の軟骨再生促進剤を少なくとも含有してなり、必要に応じて更にその他の成分を含有してなる。
【００３８】
前記食品中の、前記軟骨再生促進剤の含有量としては、特に制限はなく、例えば、後述する前記食品の種類や、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができる。また、前記食品は、前記軟骨再生促進剤そのものであってもよい。
【００３９】
−その他の成分−
前記その他の成分としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、各種食品原料などが挙げられる。前記食品原料としても、特に制限はなく、例えば、後述する前記食品の種類等に応じて適宜選択することができる。また、前記食品中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４０】
−食品の種類−
前記食品の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ゼリー、キャンディー、チョコレート、ビスケット等の菓子類；緑茶、紅茶、コーヒー、清涼飲料等の嗜好飲料；原料乳、ヨーグルト、アイスクリーム等の乳製品；野菜飲料、果実飲料、ジャム類等の野菜・果実加工品；ハム、ソーセージ、魚肉ソーセージ、かまぼこ等の食肉・魚肉加工品；スープ等の液体食品；パン類、麺類等の穀物加工品；などが挙げられる。これらの食品の製造方法としては、特に制限はなく、例えば、通常の各種食品の製造方法に応じて、適宜製造することができる。
また、前記食品は、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤等の経口固形剤や、内服液剤、シロップ剤等の経口液剤として製造されたものであってもよい。前記経口固形剤、経口液剤の製造方法は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記した医薬の経口固形剤、経口液剤の製造方法にならい、製造することができる。
【００４１】
なお、前記軟骨再生促進剤が、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体と、前記アミノ糖とを組み合わせてなる場合、前記食品としては、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体と、前記アミノ糖とを同時に含んでなるものであってもよいし、また、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体を含有する食品と、前記アミノ糖を含有する食品との、組合せからなるものであってもよい。
【００４２】
前記食品は、前記した本発明の軟骨再生促進剤を少なくとも含むので、軟骨の再生を促進する効果に優れる。したがって、前記食品は、軟骨損傷の治療、改善、予防目的で摂取される、健康食品、機能性食品（例えば、栄養補助食品（サプリメント））として特に有用である。
【００４３】
［使用］
前記軟骨再生促進剤、前記医薬、及び前記食品は、例えば、軟骨に損傷を有する患者等への適用に好適であり、これらの患者に投与することにより使用することができる。
前記軟骨再生促進剤、前記医薬、及び前記食品の投与対象動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、ハムスター、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、サルなどが挙げられる。
また、前記軟骨再生促進剤、前記医薬、及び前記食品の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、経口投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、関節腔内への注入などが挙げられる。
また、前記軟骨再生促進剤、前記医薬、及び前記食品の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、成人への１日の投与あたり、有効成分である前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体の量として、０．１〜５００ｍｇ／ｋｇ体重が好ましく、１〜２００ｍｇ／ｋｇ体重がより好ましい。
また、前記軟骨再生促進剤、前記医薬、及び前記食品の投与時期としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、軟骨が損傷を受ける前に、予防的に投与されてもよいし、軟骨が損傷を受けた後に、治療的に投与されてもよい。
【００４４】
［効果］
前記軟骨再生促進剤、前記医薬、及び前記食品は、軟骨の再生を促進する効果に優れるので、例えば、軟骨損傷を患う患者に投与することにより、前記患者の軟骨再生を効果的に促進することができる。
また、前記軟骨再生促進剤、前記医薬、及び前記食品は、その有効成分がオリーブ等の天然物から得ることのできる前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体であることから、安全性の高い点でも、有利である。
【００４５】
（グルコサミノグリカン産生促進剤）
また、前記軟骨再生促進剤は、軟骨細胞におけるグルコサミノグリカン産生を促進させることによって、軟骨の再生を促進させていることが考えられる。したがって、本発明は、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体を含有する、グルコサミノグリカン産生促進剤にも関する。また、本発明は、前記グルコサミノグリカン産生促進剤を含有する、医薬及び食品にも関する。
【００４６】
ここで、前記グルコサミノグリカン（Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）とは、軟骨の構成成分の１種であり、その具体例としては、例えば、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ケラタン硫酸（Ｋｅｒａｔａｎ ｓｕｌｆａｔｅ）、コンドロイチン（Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ）、コンドロイチン硫酸（Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ）、デルマタン硫酸（Ｄｅｒｍａｔａｎ Ｓｕｌｆａｔｅ）、ヘパリン(Ｈｅｐａｒｉｎ)、ヘパラン硫酸（Ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ）などが挙げられる。また、前記コンドロイチン硫酸としては、その構造の型に特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｄ、コンドロイチン硫酸Ｅ、コンドロイチン硫酸Ｋなどが挙げられる。
【００４７】
中でも、前記グルコサミノグリカン産生促進剤は、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体と、前記アミノ糖とを組み合わせてなることが好ましく、この場合、軟骨細胞におけるグルコサミノグリカン（中でも、ヒアルロン酸）の産生促進作用を高めることができる点で、有利である。
【００４８】
なお、前記グルコサミノグリカン産生促進剤、並びにそれを含有する医薬及び食品における、各成分、各成分の含有量、製造方法、使用方法等の詳細は、前記した本発明の軟骨再生促進剤、並びに前記軟骨再生促進剤を含有する医薬及び食品における詳細と同様である。
【実施例】
【００４９】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００５０】
（製造例１：ヒドロキシチロソールの製造）
本発明に係るヒドロキシチロソールを以下の方法で製造した。
オリーブ葉１００ｇを、含水８０％エタノール５００ｍＬ、液温５０℃で３時間、３回抽出し、減圧下で２００ｍＬまで濃縮後、ろ過した。得られたろ液に塩酸を加え、ｐＨ２．０に調整後、液温５０℃で２４時間、酸分解を行い、冷却後、水酸化ナトリウムを加えて中和した。
次いで、スチレンジビニルベンゼン重合樹脂（三菱化成工業株式会社製、ダイヤイオンＨＰ２０）１５０ｍＬに流速１．２５ｍＬ／ｍｉｎで通液し、さらに水４５０ｍＬを流速２．５ｍＬ／ｍｉｎで洗浄した。溶出は、含水２０％エタノール４５０ｍＬを流速２．５ｍＬ／ｍｉｎで流し、ヒドロキシチロソールを含む溶液を得た。
この溶液を減圧下で一定量まで濃縮し、濃縮液中にヒドロキシチロソールを４５％含む抽出固形物を２．８６ｇ得た。
次いで、デキストリンを添加してヒドロキシチロソール含量２０％に調製した。この調製液を凍結乾燥し、固形物６．４３ｇ（ヒドロキシチロソール２０質量％含有品）を得た。
【００５１】
（実施例１：ヒドロキシチロソールの軟骨再生促進作用の検討（１））
前記製造例１で得られたヒドロキシチロソールの軟骨再生促進作用を、実験的に作製したウサギの関節軟骨障害モデルを用いて検討した。
【００５２】
＜方法＞
（１）馴化飼育
雌雄各６例のウサギ（ニュージーランドホワイト、導入時１６週齢、体重２．００〜２．５５ｋｇ）を、１例／ケージ、温度２３〜２５℃、相対湿度５０〜６０％、明暗各１２時間の照明サイクル、換気回数１２回／時間の条件下で、１週間、馴化飼育した。この間、動物には市販の飼料及び殺菌水道水を自由摂取させた。
その後、各群雌雄各３例ずつとなるように、無作為に各２群に群分けを行った。その一方を対照群、残りをヒドロキシチロソール投与群（以下、ＨＴ群）とした。
馴化期間終了後、全例のウサギについて、後述の方法によって関節軟骨障害モデルを作製した。
【００５３】
（２）関節軟骨障害モデルの作製
Ｍｉｎａｍｉらの方法を参考に、ウサギの関節軟骨障害モデルを作製した（Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．３，（２００３）５９６−６０３、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ．４８，（２００２）３６９−３７８、及び、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ．５４，（２００３）２５１−２６２参照）。まず、各動物にペントバルビタールナトリウム（４０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与し、麻酔を行った。次に、動物の左後肢膝関節部を剃毛し、０．５％グルコン酸クロルヘキシジン水溶液及び７０％エタノール水溶液で消毒した。その後、膝関節部外側の皮膚を、大腿骨中央部付近から脛骨粗面方向に切開し、関節包を露出させ、関節包を切開した。さらに、膝蓋骨を内側方向にずらして、膝関節部分を完全に露出させた。ハンドドリルを使用して、大腿骨関節部の内側滑車稜に１つ、滑車溝に２つ、直径２ｍｍ、深さ４ｍｍの穴を形成させた。切開部分を滅菌した生理食塩液で洗浄し、関節包を合成吸収糸で、皮下織・皮膚を同時にナイロン糸で、それぞれ縫合した。その後、１週間、皮膚縫合部をポビドンヨードで、１日１回、消毒し、また、１０ｍｇ／ｋｇの塩酸オキシテトラサイクリンを、１日２回、皮下投与した。
【００５４】
（３）実験飼育
関節軟骨に障害を形成した後、ＨＴ群に対しては、前記製造例１で得られたヒドロキシチロソール２０質量％含有品を水道水に溶解し、１日当たり５００ｍｇ／ｋｇ（ヒドロキシチロソールとして１００ｍｇ／ｋｇ）、給水瓶を使用して、２１日間混水投与した。薬物を全量摂取したことを確認した後、殺菌水道水に切り替えた。対照群に対しては、殺菌水道水を自由摂取させた。
【００５５】
―一般状態の観察―
実験飼育期間中、各ウサギの下痢、食欲、毛艶の様子を観察した。また、１週間ごとに体重を測定した。
【００５６】
―関節部の肉眼所見―
実験飼育終了後、全ての動物にペントバルビタールナトリウム（８０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与し、過麻酔で安楽死させた。その後、膝関節部を切開し、肉眼で関節部の状態を観察し、軟骨の傷の治癒の程度を以下の基準で評価した。
［評価基準］
− ：治癒の程度が５０％未満
＋ ：治癒の程度が５０〜６０％
＋＋ ：治癒の程度が６０〜８０％
＋＋＋：治癒の程度が８０〜１００％
更に、上記の評価を数字に割り当て、（−）を０点、（＋）を１点、（＋＋）を２点、（＋＋＋）を３点として関節軟骨の治癒の程度を数値化し、対照群とＨＴ群との間で、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定を行った。
【００５７】
―筋重量の測定―
各動物について、左右の外側広筋及び大腿二頭筋をそれぞれ採取し、重量を測定した。軟骨障害を作製した側の筋重量について、反対側の筋重量との比を算出し、対照群とＨＴ群との間で、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を行った。
【００５８】
―病理組織学的検査―
各動物について大腿骨を採取し、１０％中性緩衝ホルマリン液で固定した。その後、膝関節軟骨の障害形成部、正常部、及び成長帯（骨端線）部分から、それぞれ厚さ５ｍｍの標本を切り出し、５％の蟻酸中で２４時間振盪して脱灰した。さらに、５％硫酸ナトリウム水溶液で２４時間中和し、流水で１０時間洗浄した。常法に従いパラフィンに包埋し、ミクロトームを使用して、厚さ５μｍに薄切した。その後、各標本に対して、ヘマトキシリン・エオジン染色を施して、病理組織学的検査に供した。
【００５９】
―画像解析―
上記と同様に、サフラニンＯ染色、アルシアンブルー染色を施した標本を作製し、画像解析に供した。標本の２００倍拡大像を、デジタルカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＤＰ７０、オリンパス製）を使用して、コンピュータに取り込んだ。その後、無作為に２カ所（画素数２０，０００ピクセル）を抽出し、所定の色に染色された部位（サフラニンＯ染色部位：プロテオグリカンに相当、アルシアンブルー染色部位：グルコサミノグリカンに相当）の密度を計測した。計測値について、対照群とＨＴ群との間で、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を行った。
【００６０】
＜結果＞
―一般状態―
ＨＴ群、対照群ともに、一般状態（下痢、食欲、毛艶の様子等）に顕著な変化は見られなかった。また、試験期間中の体重変化において、ＨＴ群と対照群との間に有意差は見られなかった（データ示さず）。
【００６１】
―関節部の肉眼所見―
軟骨障害を作製した直後の膝関節の様子を、図１の（ａ）に示した。矢印は上から順に、滑車溝近位の穴、滑車溝遠位の穴、内側滑車稜の穴を示す。
図１の（ｂ）には、実験期間終了後の対照群の膝関節を示した。対照群では軟骨障害は完全には治癒しなかった。図１の（ｃ）には、実験期間終了後のＨＴ群の膝関節を示した。ヒドロシキシチロソールの投与により、軟骨の再生が促進された。
【００６２】
下記表１は、手術から３週間後の軟骨障害部の治癒の様子を各個体で肉眼観察した結果をまとめた表である。なお、−〜＋＋＋の評価基準は前述の通りである。
【００６３】
【表１】
【００６４】
上記の結果を数値化して比較したところ、ＨＴ群は対照群と比べて、有意に軟骨治癒が促進されていた（ｐ＜０．０５）。
また、各群の数値化データの平均値は、対照群が４．８３であったのに対して、ＨＴ群では７．１７であった（図２）。
【００６５】
―筋重量―
算出した外側広筋と大腿二頭筋の重量比を表２に、対照群とＨＴ群との比較を図３に示した。
【００６６】
【表２】
【００６７】
対照群では、外側広筋と大腿二頭筋の筋重量の顕著な減少が観察された。一方、ＨＴ群では、外側広筋の筋重量はわずかに減少したが、大腿二頭筋の筋重量の減少はほとんど見られなかった。
【００６８】
―病理組織学的検査―
対照群及びＨＴ群の病理組織像を図４に示した。
図４の（ａ）〜（ｂ）は障害形成部位のヘマトキシリン・エオジン染色像を、（ｃ）〜（ｄ）はサフラニンＯ染色像を、（ｅ）〜（ｆ）はアルシアンブルー染色像を示す。なお、図４の左列（ａ）、（ｃ）、（ｅ）は対照群を、右列（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）はＨＴ群をそれぞれ示す。
対照群では、障害形成部位に、マクロファージ及び破骨細胞の浸潤、毛細血管、繊維芽細胞の増殖が認められたが、軟骨細胞の新生はわずかであった。
一方、ＨＴ群では、結合組織はわずかであり、成熟した軟骨細胞が広範囲で認められた。また、破骨細胞及び毛細血管の増殖像が見られなかったことから、軟骨組織の再生は、ほぼ終了しているものと推測された。
【００６９】
―画像解析―
対照群及びＨＴ群の画像解析結果を図５〜６に示した。図５はサフラニンＯ染色の画像解析結果、図６はアルシアンブルー染色の画像解析結果である。
軟骨の障害形成部位では、対照群と比較してＨＴ群では、サフラニンＯ染色で染色された部位の密度が有意に増加していた。したがって、ＨＴ群ではプロテオグリカンの生成が促進されたことが明らかになった。一方、軟骨の正常部位及び成長帯では、対照群とＨＴ群の間に差は認められなかった（図５）。
【００７０】
（実施例２：ヒドロキシチロソールの軟骨再生促進作用の検討（２））
実施例１と同様の方法で、ヒドロキシチロソール（１日当たり１００ｍｇ／ｋｇ、ＨＴ群）、及び、比較対照としてのグルコサミン塩酸塩（１日当たり８００ｍｇ／ｋｇ、以下、ＧＡＨ群）の軟骨再生促進作用を検討した。なお、対照群は実施例１と同様に設定した。
【００７１】
＜結果＞
―一般状態の観察―
対照群、ＨＴ群及びＧＡＨ群のいずれにおいても、一般状態に変化はみられなかった。また、体重の推移もＨＴ群及びＧＡＨ群ともに、対照群とほぼ同様であった。
【００７２】
―関節部の肉眼所見―
軟骨障害を作製した直後の膝関節の様子を、図７の（ａ）に示した。
図７の（ｂ）には、実験期間終了後の対照群の膝関節を示した。対照群では軟骨障害は完全には治癒しなかった。図７の（ｃ）及び（ｄ）には、それぞれ、実験期間終了後のＨＴ群及びＧＡＨ群の膝関節を示した。ヒドロシキシチロソール又はグルコサミン塩酸塩の投与により、軟骨の再生が促進された。
下記表３は、実施例１と同様に、手術から３週間後の軟骨障害部の治癒の様子を各個体で肉眼観察した結果をまとめた表である。
【００７３】
【表３】
【００７４】
上記の結果を数値化して比較したところ、対照群と比べて、ＨＴ群（ｐ＜０．０１）、ＧＡＨ群（ｐ＜０．０５）ともに有意に軟骨治癒が促進されていた。
また、各群の数値化データの平均値は、対照群が５．３３であったのに対して、ＨＴ群では８．１７、ＧＡＨ群では７．１７であり、ＨＴ群の方がＧＡＨ群よりも、軟骨再生が促進されていた（図８）。
【００７５】
―筋重量―
算出した外側広筋と大腿二頭筋の重量比を表４に、対照群、ＨＴ群及びＧＡＨ群の比較を図９に示した。
【００７６】
【表４】
【００７７】
対照群及びＧＡＨ群では、特に大腿二頭筋の筋重量の顕著な減少が観察され、また、外側広筋についてもやや筋重量の減少が見られたのに対し、ＨＴ群では、外側広筋、大腿二頭筋ともに筋重量の減少はほとんど見られなかった。
【００７８】
―病理組織学的検査―
対照群、ＨＴ群及びＧＡＨ群の病理組織像を図１０に示した。
図１０の（ａ）〜（ｃ）はヘマトキシリン・エオジン染色像を、（ｄ）〜（ｆ）はサフラニンＯ染色像を示す。なお、図１０の（ａ）、（ｄ）は対照群を、（ｂ）、（ｅ）はＧＡＨ群を、（ｃ）、（ｆ）はＨＴ群をそれぞれ示す。
対照群では、障害形成部位に、マクロファージ及び破骨細胞の浸潤、毛細血管、繊維芽細胞の増殖が認められたが、軟骨細胞の新生はわずかであった。
一方、ＨＴ群では、結合組織はわずかであり、成熟した軟骨細胞が広範囲で認められた。また、破骨細胞及び毛細血管の増殖像が見られなかったことから、軟骨組織の再生は、ほぼ終了しているものと推測された。
ＧＡＨ群では、ＨＴ群とほぼ同様の所見が認められた。
【００７９】
―画像解析―
対照群、ＨＴ群及びＧＡＨ群の画像解析結果を図１１〜１２に示した。図１１はサフラニンＯ染色の画像解析結果、図１２はアルシアンブルー染色の画像解析結果である。
対照群と比較してＨＴ群及びＧＡＨ群では、軟骨の障害形成部位のサフラニンＯ染色で染色された部位の密度が有意に増加していた。したがって、ＨＴ群及びＧＡＨ群ではプロテオグリカンの生成が促進されたことが明らかになった。また、ＧＡＨ群よりもＨＴ群の方が、プロテオグリカンの生成はより促進されていた。一方、軟骨の正常部位及び成長帯では、対照群とＨＴ群、ＧＡＨ群の間に差は認められなかった（図１１）。
【００８０】
以上の実施例１〜２の結果から、本発明の軟骨再生促進剤は、軟骨障害の治癒（軟骨再生）を促進する作用を有することが示された。また、本発明の軟骨再生促進剤による一般状態への有害な作用が観察されなかったことから、本発明の軟骨再生促進剤の安全性も確認された。
【００８１】
（実施例３：ヒドロキシチロソール及びグルコサミン塩酸塩の併用効果）
ヒドロキシチロソール及びグルコサミン塩酸塩の、軟骨細胞におけるグルコサミノグリカン産生促進作用及びヒアルロン酸産生促進作用を評価した。
【００８２】
ウサギ軟骨細胞（ウサギ関節軟骨初代培養細胞、Ｆ−８、セルガレージ社）を、リン酸緩衝生理食塩液で洗浄した後、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液で細胞を単離させた。
単離させた軟骨細胞を、１０％ ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、１００μＭ アスコルビン酸−２−リン酸エステル三ナトリウム（ＳＩＧＭＡ社）、及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＤＭＥＭ培地で、３７℃、５％ＣＯ２、湿潤条件下で維持培養した。
コラーゲンでコートした２４穴ウェルプレートに、１ウェル当たり２．５×１０５個（１ｍｌ／ウェル）の上記軟骨細胞を播種し、７日間培養後、培地を吸引除去した。
その後、上記培養軟骨細胞に、最終濃度１００ｎｇ／ｍｌのヒドロキシチロソール（ＣＡＹＭＡＮ社、純度９８％、以下ＨＴ群）、最終濃度４μｇ／ｍｌのグルコサミン塩酸塩（東京健食有限会社、純度９９％、以下ＧＡＨ群）、又は、上記ヒドロキシチロソール及び上記グルコサミン塩酸塩の両者（以下、ＨＴ＋ＧＡＨ群）を混合溶解した上記培地２ｍｌ／ウェルを添加し、さらに１２日間培養を行った。
なお、対照群として、薬物を添加しないで細胞を培養した群を設定した。
【００８３】
−生残細胞数の測定、及び各産生量の測定−
１２日間培養後の各群について、ＷＳＴ法で生残細胞数の測定を行った。
また、対照群に対する各実験群のグルコサミノグリカン、ヒアルロン酸の産生量の割合は、下記の式によって算出した。
式：（（各実験群産生量／各実験群細胞数）×１００）／（対照群産生量／対照群細胞数）
【００８４】
１）グルコサミノグリカン産生量の測定
上記の培養細胞について、測定用キット（酸性ムコ多糖定量キット、セルガレージ社）を使用して、グルコサミノグリカンの産生量を測定した。
その結果、ＨＴ群、ＧＡＨ群におけるグルコサミノグリカンの産生量は、対照群と比較して、それぞれ１１９．８％、１４７．０％であった。また、ＨＴ＋ＧＡＨ群における産生量は、対照群と比較して１７３．４％であり、ヒドロキシチロソールとグルコサミン塩酸塩を併用すると相乗効果が現れることが明らかになった（図１３）。
【００８５】
２）ヒアルロン酸産生量の測定
各群の培養細胞の上清を採取し、測定用キット（ヒアルロン酸定量キット、生化学工業社）を使用して、ヒアルロン酸の産生量を測定した。
その結果、ＨＴ群、ＧＡＨ群におけるヒアルロン酸の産生量は、対照群と比較して、それぞれ８２．９％、１２７．４％であった。また、ＨＴ＋ＧＡＨ群における産生量は、対照群と比較して２４５．２％であり、ヒドロキシチロソールとグルコサミン塩酸塩を併用すると相乗効果が現れることが明らかになった（図１４）。
【００８６】
以上の実施例３の結果から、本発明の軟骨再生促進剤は、軟骨細胞におけるグルコサミノグリカン産生を促進する作用を有することが示され、特にヒドロキシチロソール及びグルコサミン塩酸塩の両者を併用する態様において、その作用（中でも、ヒアルロン酸産生促進作用）が相乗的に高まることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明の軟骨再生促進剤、医薬、及び食品は、例えば、軟骨損傷を患う患者への適用に、特に好適である。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】図１は、ウサギの膝関節軟骨障害に対する、ヒドロキシチロソールの軟骨再生促進作用を示した図である。
【図２】図２は、ウサギの膝関節軟骨障害に対する、ヒドロキシチロソールの軟骨再生促進作用を示したグラフである。
【図３】図３は、ウサギの膝関節軟骨障害に対する、ヒドロキシチロソールの筋重量における作用を示したグラフである。
【図４】図４は、ウサギの膝関節軟骨障害に対する、ヒドロキシチロソールの軟骨再生促進作用を組織学的に示した組織染色像である（×２００）。
【図５】図５は、ウサギの膝関節軟骨障害に対する、ヒドロキシチロソールのプロテオグリカン生成における作用を示したグラフである。
【図６】図６は、ウサギの膝関節軟骨障害に対する、ヒドロキシチロソールのグルコサミノグリカン生成における作用を示したグラフである。
【図７】図７は、ウサギの膝関節軟骨障害に対する、ヒドロキシチロソール、及びグルコサミン塩酸塩（比較対照）の軟骨再生促進作用を示した図である。
【図８】図８は、ウサギの膝関節軟骨障害に対する、ヒドロキシチロソール、及びグルコサミン塩酸塩（比較対照）の軟骨再生促進作用を示したグラフである。
【図９】図９は、ウサギの膝関節軟骨障害に対する、ヒドロキシチロソール、及びグルコサミン塩酸塩（比較対照）の筋重量における作用を示したグラフである。
【図１０】図１０は、ウサギの膝関節軟骨障害に対する、ヒドロキシチロソール、及びグルコサミン塩酸塩（比較対照）の軟骨再生促進作用を組織学的に示した組織染色像である（×２００）。
【図１１】図１１は、ウサギの膝関節軟骨障害に対する、ヒドロキシチロソール、及びグルコサミン塩酸塩（比較対照）のプロテオグリカン生成における作用を示したグラフである。
【図１２】図１２は、ウサギの膝関節軟骨障害に対する、ヒドロキシチロソール、及びグルコサミン塩酸塩（比較対照）のグルコサミノグリカン生成における作用を示したグラフである。
【図１３】図１３は、ウサギの軟骨細胞における、ヒドロキシチロソール及びグルコサミン塩酸塩（併用）のグルコサミノグリカン産生促進作用を示したグラフである。
【図１４】図１４は、ウサギの軟骨細胞における、ヒドロキシチロソール及びグルコサミン塩酸塩（併用）のヒアルロン酸産生促進作用を示したグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節軟骨の再生を促進する軟骨再生促進剤、並びに、前記軟骨再生促進剤を利用した医薬及び食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節内の骨の両端を覆い、骨と骨との間の衝撃を吸収するクッションの役割を担う軟骨は、通常、日々の磨耗と再生を繰り返しながら健全性を保っている。
しかしながら、例えば、疾患や外傷等により、軟骨は大きく損傷を受ける場合がある。また、加齢に伴う軟骨の磨り減りや弾力性の低下によっても、軟骨は損傷を受け易い状態となる。このような損傷に対して軟骨の再生が追いつかない状態となると、軟骨の機能は損なわれ、関節内の骨と骨との間の衝撃を吸収することができなくなり、関節内に炎症、痛みが発生する。
【０００３】
このような軟骨の損傷に対する治療又は予防方法に関しては、従来から広く研究開発が行われており、例えば、軟骨の構成成分又はその前駆体を含む組成物を、経口や静注で体内に投与することにより、体内での軟骨の生合成を促す方法などが開発されてきた。
より具体的には、例えば、関節軟骨の水分を保ち、弾力を与える成分であるプロテオグリカン等の生成を促す、グルコサミンとコンドロイチン硫酸塩とを、それぞれ単独で、又は併用して使用することにより、軟骨損傷に対する治療効果が得られたことが報告されている（例えば、特許文献１参照）。また、グルコサミンと骨髄エキスとを併用することにより、グルコサミンの軟骨再生促進作用がより増強したことなども報告されている（例えば、特許文献２参照）。
【０００４】
しかしながら、例えば、前記したような様々な原因から、軟骨損傷を患う患者は多く、したがって、軟骨の再生を効率的に促進でき、かつ安全性の高い、新たな軟骨再生促進剤の開発が、未だ望まれているのが現状である。
【０００５】
【特許文献１】特許第２９７１５７９号公報
【特許文献２】特開２００１−３２２９３８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、軟骨の再生を効率的に促進でき、かつ安全性の高い、優れた軟骨再生促進剤、並びに、前記軟骨再生促進剤を利用した医薬及び食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、オリーブ（モクセイ科オリーブ属オリーブ：Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）等から得ることのできる成分であるヒドロキシチロソールが、優れた軟骨再生促進作用を有するという知見である。
【０００８】
前記ヒドロキシチロソール（Ｈｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ：２−（３，４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｅｔｈａｎｏｌ）は、後述する構造式（１）で表される化合物であり、従来から、メラニン生成抑制作用や過酸化脂質生成抑制作用を有しており、皮膚外用剤や浴用剤等として使用できることなどが知られていた（例えば、特開２００４−２６８３６号公報参照）。また、前記ヒドロキシチロソールとオレウロペインとを含有した処置剤を用い、リウマチ様関節炎等の炎症状態を処置する方法なども提案されている（例えば、特表２００５−５１７０３３号公報参照）。
【０００９】
しかしながら、前記ヒドロキシチロソールが優れた軟骨再生促進作用を有することは従来全く知られておらず、本発明者らの新たな知見である。
【００１０】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ ヒドロキシチロソール及びヒドロキシチロソール前駆体の少なくともいずれかを含有することを特徴とする軟骨再生促進剤である。
＜２＞ ヒドロキシチロソール及びヒドロキシチロソール前駆体の少なくともいずれかがオリーブ由来である前記＜１＞に記載の軟骨再生促進剤である。
＜３＞ ヒドロキシチロソール前駆体がオレウロペインである前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の軟骨再生促進剤である。
＜４＞ ヒドロキシチロソール及びヒドロキシチロソール前駆体の少なくともいずれかを１０質量％以上含有する前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の軟骨再生促進剤である。
＜５＞ オリーブ抽出物を含有する前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の軟骨再生促進剤である。
＜６＞ ヒドロキシチロソール及びヒドロキシチロソール前駆体の少なくともいずれかと、アミノ糖とを組み合わせてなる前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の軟骨再生促進剤である。
＜７＞ アミノ糖がグルコサミン塩酸塩である前記＜６＞に記載の軟骨再生促進剤である。
＜８＞ ヒドロキシチロソール及びヒドロキシチロソール前駆体の少なくともいずれかと、アミノ糖との配合剤である前記＜６＞から＜７＞のいずれかに記載の軟骨再生促進剤である。
＜９＞ ヒドロキシチロソール及びヒドロキシチロソール前駆体の少なくともいずれかを含有する薬剤と、アミノ糖を含有する薬剤とを含むキットである前記＜６＞から＜７＞のいずれかに記載の軟骨再生促進剤である。
＜１０＞ 前記＜１＞から＜９＞のいずれかに記載の軟骨再生促進剤を含有することを特徴とする医薬である。
＜１１＞ 前記＜１＞から＜９＞のいずれかに記載の軟骨再生促進剤を含有することを特徴とする食品である。
【００１１】
＜１２＞ ヒドロキシチロソール及びヒドロキシチロソール前駆体の少なくともいずれかを含有することを特徴とするグルコサミノグリカン産生促進剤である。
＜１３＞ ヒドロキシチロソール及びヒドロキシチロソール前駆体の少なくともいずれかがオリーブ由来である前記＜１２＞に記載のグルコサミノグリカン産生促進剤である。
＜１４＞ ヒドロキシチロソール前駆体がオレウロペインである前記＜１２＞から＜１３＞のいずれかに記載のグルコサミノグリカン産生促進剤である。
＜１５＞ ヒドロキシチロソール及びヒドロキシチロソール前駆体の少なくともいずれかを１０質量％以上含有する前記＜１２＞から＜１４＞のいずれかに記載のグルコサミノグリカン産生促進剤である。
＜１６＞ オリーブ抽出物を含有する前記＜１２＞から＜１５＞のいずれかに記載のグルコサミノグリカン産生促進剤である。
＜１７＞ ヒドロキシチロソール及びヒドロキシチロソール前駆体の少なくともいずれかと、アミノ糖とを組み合わせてなる前記＜１２＞から＜１６＞のいずれかに記載のグルコサミノグリカン産生促進剤である。
＜１８＞ アミノ糖がグルコサミン塩酸塩である前記＜１７＞に記載のグルコサミノグリカン産生促進剤である。
＜１９＞ ヒドロキシチロソール及びヒドロキシチロソール前駆体の少なくともいずれかと、アミノ糖との配合剤である前記＜１７＞から＜１８＞のいずれかに記載のグルコサミノグリカン産生促進剤である。
＜２０＞ ヒドロキシチロソール及びヒドロキシチロソール前駆体の少なくともいずれかを含有する薬剤と、アミノ糖を含有する薬剤とを含むキットである前記＜１７＞から＜１８＞のいずれかに記載のグルコサミノグリカン産生促進剤である。
＜２１＞ 前記＜１２＞から＜２０＞のいずれかに記載のグルコサミノグリカン産生促進剤を含有することを特徴とする医薬である。
＜２２＞ 前記＜１２＞から＜２０＞のいずれかに記載のグルコサミノグリカン産生促進剤を含有することを特徴とする食品である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によると、従来における諸問題を解決することができ、軟骨の再生を効率的に促進でき、かつ安全性の高い、優れた軟骨再生促進剤、並びに、前記軟骨再生促進剤を利用した医薬及び食品を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（軟骨再生促進剤）
本発明の軟骨再生促進剤は、ヒドロキシチロソール及びヒドロキシチロソール前駆体の少なくともいずれか（ヒドロキシチロソール及び／又はヒドロキシチロソール前駆体）を含有してなり、必要に応じて更にその他の成分を含有してなる。
【００１４】
＜ヒドロキシチロソール、ヒドロキシチロソール前駆体＞
−ヒドロキシチロソール−
前記ヒドロキシチロソール（Ｈｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ：２−（３，４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｅｔｈａｎｏｌ）は、後述する構造式（１）で表される化合物である。
【００１５】
【化１】
【００１６】
前記ヒドロキシチロソールは、その入手方法に特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学的に合成されたものを使用してもよいし、天然物由来のものを使用してもよい。
前記ヒドロキシチロソールとして天然物由来のものを使用する場合、その由来としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、中でも、植物由来であることが好ましく、オリーブ（モクセイ科オリーブ属オリーブ：Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）由来であることがより好ましい。
【００１７】
前記ヒドロキシチロソールは、例えば、前記オリーブの植物体から抽出することにより得ることができ、前記植物体としては、例えば、葉、茎、実などが挙げられる。
前記オリーブの植物体からの前記ヒドロキシチロソールの抽出方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、メタノール、エタノール、アセトン等の水溶性有機溶媒又は含水有機溶媒を用いて抽出することができる。
【００１８】
−ヒドロキシチロソール前駆体−
また、前記ヒドロキシチロソール前駆体とは、生体内の代謝反応によってヒドロキシチロソールへと変換される、ヒドロキシチロソールの前段階の物質をいう。
したがって、前記ヒドロキシチロソール前駆体の具体例としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、オレウロペイン（Ｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ）などが好適に挙げられる。前記オレウロペインは、例えばヒトやラット等の哺乳動物が経口摂取した場合、体内で加水分解され、ヒドロキシチロソールに変換されることが知られている（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，７８５（２００３）４７−５６、及び、Ｊ．Ｎｕｔｒ．１３２：４０９−４１７，２００２参照）。したがって、前記ヒドロキシチロソール前駆体は、体内でヒドロキシチロソールへと代謝されることにより、前記ヒドロキシチロソールと同様の軟骨再生促進効果を奏することが可能である。
【００１９】
前記オレウロペインの入手方法としても、前記ヒドロキシチロソール同様、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学的に合成されたものを使用してもよいし、天然物由来のものを使用してもよい。
前記オレウロペインとして天然物由来のものを使用する場合、その由来としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、中でも、植物由来であることが好ましく、オリーブ（モクセイ科オリーブ属オリーブ：Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）由来であることがより好ましい。
【００２０】
前記オレウロペインは、例えば、前記オリーブの植物体から抽出することにより得ることができ、前記植物体としては、例えば、葉、茎、実などが挙げられる。
前記オリーブの植物体からの前記オレウロペインの抽出方法としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、特開２００２−１２８６７８号公報、特開２００３−３３５６９３号公報などに記載の抽出方法を参照して抽出することができる。
【００２１】
なお、前記ヒドロキシチロソール、及び、前記ヒドロキシチロソール前駆体は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００２２】
前記軟骨再生促進剤中の、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体の含有量は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記軟骨再生促進剤１００質量％に対して、１０質量％以上が好ましく、１５質量％以上がより好ましく、２０質量％以上が特に好ましい。また、前記含有量の上限としては、特に制限はなく、前記含有量が高い程、より強い軟骨再生効果が期待できる。また、前記軟骨再生促進剤は、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体そのものであってもよい。
【００２３】
＜アミノ糖との併用＞
また、前記軟骨再生促進剤は、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体と、アミノ糖とを組み合わせて（併用して）なるものであってもよい。
前記軟骨再生促進剤が、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体と、前記アミノ糖とを組み合わせてなるものであると、軟骨細胞におけるグルコサミノグリカン（中でも、ヒアルロン酸）の産生促進作用を高めることができる点で、有利である。軟骨細胞におけるグルコサミノグリカンの産生促進作用が高まることにより、更なる軟骨再生の促進が期待される。
【００２４】
−アミノ糖−
前記アミノ糖としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、グルコサミン（Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ：２−ａｍｉｎｏ−２−ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ）、マンノサミン（Ｍａｎｎｏｓａｍｉｎｅ：２−ａｍｉｎｏ−２−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ）、ガラクトサミン（Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ：２−ａｍｉｎｏ−２−ｄｅｏｘｙｇａｌａｃｔｏｓｅ）、フコサミン（Ｆｕｃｏｓａｍｉｎｅ：２−ａｍｉｎｏ−２，６−ｄｉｄｅｏｘｙｇａｌａｃｔｏｓｅ）、キノボサミン（Ｑｕｉｎｏｖｏｓａｍｉｎｅ：２−ａｍｉｎｏ−２，６−ｄｉｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ）、ラムノサミン（Ｒｈａｍｎｏｓａｍｉｎｅ：２−ａｍｉｎｏ−２，６−ｄｉｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ）、これらの薬理学的に許容され得る塩などが挙げられる。また、これらのアミノ糖におけるアミノ基がアセチル化された化合物、及び前記化合物の薬理学的に許容され得る塩も、それぞれ前記アミノ糖の範囲内に含まれる。また、前記薬理学的に許容され得る塩としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩酸塩、硫酸塩等の無機塩、クエン酸塩、グルコン酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩等の有機酸塩などが挙げられる。これらの中でも、塩酸塩が、特に好ましい。
中でも、前記アミノ糖としては、グルコサミン、ガラクトサミン、及びこれらの薬理学的に許容され得る塩が好ましく、グルコサミン塩酸塩がより好ましい。
【００２５】
前記アミノ糖は、その入手方法に特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学的に合成されたものを使用してもよいし、カニ・エビ等の甲殻から得られる天然物由来のものを使用してもよい。
【００２６】
なお、前記アミノ糖は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００２７】
前記軟骨再生促進剤が、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体と、前記アミノ糖とを組み合わせてなるものである場合、前記軟骨再生促進剤中の、前記アミノ糖の含有量は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記軟骨再生促進剤１００質量％に対して、１０〜９０質量％が好ましく、１５〜８５質量％がより好ましく、２０〜８０質量％が特に好ましい。
【００２８】
−含有量比−
前記軟骨再生促進剤が、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体と、前記アミノ糖とを組み合わせてなるものである場合、前記軟骨再生促進剤中の、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体と、前記アミノ糖との含有量比としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、質量比で、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体：前記アミノ糖＝２０：１〜１：１００が好ましく、１：１０〜１：７０がより好ましい。
【００２９】
−配合剤、キット−
なお、前記軟骨再生促進剤が、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体と、前記アミノ糖とを組み合わせてなる場合、前記軟骨再生促進剤としては、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体と、前記アミノ糖とが混合された配合剤の状態であってもよいし、また、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体を含有する薬剤と、前記アミノ糖を含有する薬剤とを含む（前記２種の成分が混合されていない）、キットの状態であってもよい。
【００３０】
（医薬）
本発明の医薬は、前記した本発明の軟骨再生促進剤を少なくとも含有してなり、必要に応じて更にその他の成分を含有してなる。
【００３１】
前記医薬中の、前記軟骨再生促進剤の含有量としては、特に制限はなく、例えば、後述する前記医薬の剤型や、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができる。また、前記医薬は、前記軟骨再生促進剤そのものであってもよい。
【００３２】
−その他の成分−
前記その他の成分としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、後述するような医薬用の添加剤などが挙げられる。また、前記医薬中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３３】
上記医薬としては、前記軟骨再生促進剤をそのまま、又は適当な添加剤を混和し、製剤化したものを使用する。
上記添加剤としては、一般に医薬に使用される、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、矯味矯臭剤、乳化剤、界面活性剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤、安定化剤、吸収促進剤等を挙げることができ、所望により、これらを適宜組み合わせて使用することもできる。
上記賦形剤としては、例えば乳糖、白糖、ブドウ糖、コーンスターチ、マンニトール、ソルビトール、デンプン、α化デンプン、デキストリン、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウム、ケイ酸カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、リン酸水素カルシウム等を挙げることができる。
上記結合剤としては、例えばポリビニルアルコール、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、マクロゴール等を挙げることができる。
上記滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、フマル酸ステアリルナトリウム、タルク、ポリエチレングリコール、コロイドシリカ等を挙げることができる。
上記崩壊剤としては、例えば結晶セルロース、寒天、ゼラチン、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム等を挙げることができる。
上記着色剤としては、例えば三二酸化鉄、黄色三二酸化鉄、カルミン、カラメル、β−カロチン、酸化チタン、タルク、リン酸リボフラビンナトリウム、黄色アルミニウムレーキ等、医薬品に添加することが許可されているものを挙げることができる。
上記矯味矯臭剤としては、例えばココア末、ハッカ脳、芳香散、ハッカ油、メントール、竜脳、桂皮末等を挙げることができる。
上記乳化剤又は界面活性剤としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、モノステアリン酸グリセリン、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル等を挙げることができる。
上記溶解補助剤としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、安息香酸ベンジル、エタノール、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド等を挙げることができる。
上記懸濁化剤としては、前記界面活性剤のほか、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子を挙げることができる。
上記等張化剤としては、例えばブドウ糖、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール等を挙げることができる。
上記緩衝剤としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液を挙げることができる。
上記防腐剤としては、例えばメチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等を挙げることができる。
上記抗酸化剤としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロール等を挙げることができる。
上記安定化剤としては、アスコルビン酸、エデト酸ナトリウム、エリソルビン酸、トコフェロール等を挙げることができる。
上記吸収促進剤としては、ミリスチン酸イソプロピル、トコフェロール、カルシフェロール等を挙げることができる。
【００３４】
また、上記製剤としては、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤のような経口剤；坐剤、軟膏剤、眼軟膏剤、テープ剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤のような外用剤又は注射剤を挙げることができる。
上記経口剤は、上記添加剤を適宜組み合わせて製剤化する。なお、必要に応じてこれらの表面をコーティングしてもよい。
上記外用剤は、上記添加剤のうち、特に賦形剤、結合剤、矯味矯臭剤、乳化剤、界面活性剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、防腐剤、抗酸化剤、安定化剤又は吸収促進剤を適宜組み合わせて製剤化する。
上記注射剤は、上記添加剤のうち、特に乳化剤、界面活性剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤、安定化剤又は吸収促進剤を適宜組み合わせて製剤化する。
【００３５】
なお、前記軟骨再生促進剤が、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体と、前記アミノ糖とを組み合わせてなる場合、前記医薬としては、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体と、前記アミノ糖とを同時に含んでなるものであってもよいし、また、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体を含有する薬剤と、前記アミノ糖を含有する薬剤との、組合せからなるものであってもよい。
【００３６】
前記医薬は、前記した本発明の軟骨再生促進剤を少なくとも含むので、軟骨の再生を促進する効果に優れる。したがって、前記医薬は、軟骨損傷の治療又は予防用途に特に好適である。
【００３７】
（食品）
本発明の食品は、前記した本発明の軟骨再生促進剤を少なくとも含有してなり、必要に応じて更にその他の成分を含有してなる。
【００３８】
前記食品中の、前記軟骨再生促進剤の含有量としては、特に制限はなく、例えば、後述する前記食品の種類や、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができる。また、前記食品は、前記軟骨再生促進剤そのものであってもよい。
【００３９】
−その他の成分−
前記その他の成分としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、各種食品原料などが挙げられる。前記食品原料としても、特に制限はなく、例えば、後述する前記食品の種類等に応じて適宜選択することができる。また、前記食品中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４０】
−食品の種類−
前記食品の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ゼリー、キャンディー、チョコレート、ビスケット等の菓子類；緑茶、紅茶、コーヒー、清涼飲料等の嗜好飲料；原料乳、ヨーグルト、アイスクリーム等の乳製品；野菜飲料、果実飲料、ジャム類等の野菜・果実加工品；ハム、ソーセージ、魚肉ソーセージ、かまぼこ等の食肉・魚肉加工品；スープ等の液体食品；パン類、麺類等の穀物加工品；などが挙げられる。これらの食品の製造方法としては、特に制限はなく、例えば、通常の各種食品の製造方法に応じて、適宜製造することができる。
また、前記食品は、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤等の経口固形剤や、内服液剤、シロップ剤等の経口液剤として製造されたものであってもよい。前記経口固形剤、経口液剤の製造方法は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記した医薬の経口固形剤、経口液剤の製造方法にならい、製造することができる。
【００４１】
なお、前記軟骨再生促進剤が、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体と、前記アミノ糖とを組み合わせてなる場合、前記食品としては、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体と、前記アミノ糖とを同時に含んでなるものであってもよいし、また、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体を含有する食品と、前記アミノ糖を含有する食品との、組合せからなるものであってもよい。
【００４２】
前記食品は、前記した本発明の軟骨再生促進剤を少なくとも含むので、軟骨の再生を促進する効果に優れる。したがって、前記食品は、軟骨損傷の治療、改善、予防目的で摂取される、健康食品、機能性食品（例えば、栄養補助食品（サプリメント））として特に有用である。
【００４３】
［使用］
前記軟骨再生促進剤、前記医薬、及び前記食品は、例えば、軟骨に損傷を有する患者等への適用に好適であり、これらの患者に投与することにより使用することができる。
前記軟骨再生促進剤、前記医薬、及び前記食品の投与対象動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、ハムスター、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、サルなどが挙げられる。
また、前記軟骨再生促進剤、前記医薬、及び前記食品の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、経口投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、関節腔内への注入などが挙げられる。
また、前記軟骨再生促進剤、前記医薬、及び前記食品の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、成人への１日の投与あたり、有効成分である前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体の量として、０．１〜５００ｍｇ／ｋｇ体重が好ましく、１〜２００ｍｇ／ｋｇ体重がより好ましい。
また、前記軟骨再生促進剤、前記医薬、及び前記食品の投与時期としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、軟骨が損傷を受ける前に、予防的に投与されてもよいし、軟骨が損傷を受けた後に、治療的に投与されてもよい。
【００４４】
［効果］
前記軟骨再生促進剤、前記医薬、及び前記食品は、軟骨の再生を促進する効果に優れるので、例えば、軟骨損傷を患う患者に投与することにより、前記患者の軟骨再生を効果的に促進することができる。
また、前記軟骨再生促進剤、前記医薬、及び前記食品は、その有効成分がオリーブ等の天然物から得ることのできる前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体であることから、安全性の高い点でも、有利である。
【００４５】
（グルコサミノグリカン産生促進剤）
また、前記軟骨再生促進剤は、軟骨細胞におけるグルコサミノグリカン産生を促進させることによって、軟骨の再生を促進させていることが考えられる。したがって、本発明は、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体を含有する、グルコサミノグリカン産生促進剤にも関する。また、本発明は、前記グルコサミノグリカン産生促進剤を含有する、医薬及び食品にも関する。
【００４６】
ここで、前記グルコサミノグリカン（Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）とは、軟骨の構成成分の１種であり、その具体例としては、例えば、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ケラタン硫酸（Ｋｅｒａｔａｎ ｓｕｌｆａｔｅ）、コンドロイチン（Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ）、コンドロイチン硫酸（Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ）、デルマタン硫酸（Ｄｅｒｍａｔａｎ Ｓｕｌｆａｔｅ）、ヘパリン(Ｈｅｐａｒｉｎ)、ヘパラン硫酸（Ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ）などが挙げられる。また、前記コンドロイチン硫酸としては、その構造の型に特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｄ、コンドロイチン硫酸Ｅ、コンドロイチン硫酸Ｋなどが挙げられる。
【００４７】
中でも、前記グルコサミノグリカン産生促進剤は、前記ヒドロキシチロソール及び／又は前記ヒドロキシチロソール前駆体と、前記アミノ糖とを組み合わせてなることが好ましく、この場合、軟骨細胞におけるグルコサミノグリカン（中でも、ヒアルロン酸）の産生促進作用を高めることができる点で、有利である。
【００４８】
なお、前記グルコサミノグリカン産生促進剤、並びにそれを含有する医薬及び食品における、各成分、各成分の含有量、製造方法、使用方法等の詳細は、前記した本発明の軟骨再生促進剤、並びに前記軟骨再生促進剤を含有する医薬及び食品における詳細と同様である。
【実施例】
【００４９】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００５０】
（製造例１：ヒドロキシチロソールの製造）
本発明に係るヒドロキシチロソールを以下の方法で製造した。
オリーブ葉１００ｇを、含水８０％エタノール５００ｍＬ、液温５０℃で３時間、３回抽出し、減圧下で２００ｍＬまで濃縮後、ろ過した。得られたろ液に塩酸を加え、ｐＨ２．０に調整後、液温５０℃で２４時間、酸分解を行い、冷却後、水酸化ナトリウムを加えて中和した。
次いで、スチレンジビニルベンゼン重合樹脂（三菱化成工業株式会社製、ダイヤイオンＨＰ２０）１５０ｍＬに流速１．２５ｍＬ／ｍｉｎで通液し、さらに水４５０ｍＬを流速２．５ｍＬ／ｍｉｎで洗浄した。溶出は、含水２０％エタノール４５０ｍＬを流速２．５ｍＬ／ｍｉｎで流し、ヒドロキシチロソールを含む溶液を得た。
この溶液を減圧下で一定量まで濃縮し、濃縮液中にヒドロキシチロソールを４５％含む抽出固形物を２．８６ｇ得た。
次いで、デキストリンを添加してヒドロキシチロソール含量２０％に調製した。この調製液を凍結乾燥し、固形物６．４３ｇ（ヒドロキシチロソール２０質量％含有品）を得た。
【００５１】
（実施例１：ヒドロキシチロソールの軟骨再生促進作用の検討（１））
前記製造例１で得られたヒドロキシチロソールの軟骨再生促進作用を、実験的に作製したウサギの関節軟骨障害モデルを用いて検討した。
【００５２】
＜方法＞
（１）馴化飼育
雌雄各６例のウサギ（ニュージーランドホワイト、導入時１６週齢、体重２．００〜２．５５ｋｇ）を、１例／ケージ、温度２３〜２５℃、相対湿度５０〜６０％、明暗各１２時間の照明サイクル、換気回数１２回／時間の条件下で、１週間、馴化飼育した。この間、動物には市販の飼料及び殺菌水道水を自由摂取させた。
その後、各群雌雄各３例ずつとなるように、無作為に各２群に群分けを行った。その一方を対照群、残りをヒドロキシチロソール投与群（以下、ＨＴ群）とした。
馴化期間終了後、全例のウサギについて、後述の方法によって関節軟骨障害モデルを作製した。
【００５３】
（２）関節軟骨障害モデルの作製
Ｍｉｎａｍｉらの方法を参考に、ウサギの関節軟骨障害モデルを作製した（Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．３，（２００３）５９６−６０３、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ．４８，（２００２）３６９−３７８、及び、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ．５４，（２００３）２５１−２６２参照）。まず、各動物にペントバルビタールナトリウム（４０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与し、麻酔を行った。次に、動物の左後肢膝関節部を剃毛し、０．５％グルコン酸クロルヘキシジン水溶液及び７０％エタノール水溶液で消毒した。その後、膝関節部外側の皮膚を、大腿骨中央部付近から脛骨粗面方向に切開し、関節包を露出させ、関節包を切開した。さらに、膝蓋骨を内側方向にずらして、膝関節部分を完全に露出させた。ハンドドリルを使用して、大腿骨関節部の内側滑車稜に１つ、滑車溝に２つ、直径２ｍｍ、深さ４ｍｍの穴を形成させた。切開部分を滅菌した生理食塩液で洗浄し、関節包を合成吸収糸で、皮下織・皮膚を同時にナイロン糸で、それぞれ縫合した。その後、１週間、皮膚縫合部をポビドンヨードで、１日１回、消毒し、また、１０ｍｇ／ｋｇの塩酸オキシテトラサイクリンを、１日２回、皮下投与した。
【００５４】
（３）実験飼育
関節軟骨に障害を形成した後、ＨＴ群に対しては、前記製造例１で得られたヒドロキシチロソール２０質量％含有品を水道水に溶解し、１日当たり５００ｍｇ／ｋｇ（ヒドロキシチロソールとして１００ｍｇ／ｋｇ）、給水瓶を使用して、２１日間混水投与した。薬物を全量摂取したことを確認した後、殺菌水道水に切り替えた。対照群に対しては、殺菌水道水を自由摂取させた。
【００５５】
―一般状態の観察―
実験飼育期間中、各ウサギの下痢、食欲、毛艶の様子を観察した。また、１週間ごとに体重を測定した。
【００５６】
―関節部の肉眼所見―
実験飼育終了後、全ての動物にペントバルビタールナトリウム（８０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与し、過麻酔で安楽死させた。その後、膝関節部を切開し、肉眼で関節部の状態を観察し、軟骨の傷の治癒の程度を以下の基準で評価した。
［評価基準］
− ：治癒の程度が５０％未満
＋ ：治癒の程度が５０〜６０％
＋＋ ：治癒の程度が６０〜８０％
＋＋＋：治癒の程度が８０〜１００％
更に、上記の評価を数字に割り当て、（−）を０点、（＋）を１点、（＋＋）を２点、（＋＋＋）を３点として関節軟骨の治癒の程度を数値化し、対照群とＨＴ群との間で、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定を行った。
【００５７】
―筋重量の測定―
各動物について、左右の外側広筋及び大腿二頭筋をそれぞれ採取し、重量を測定した。軟骨障害を作製した側の筋重量について、反対側の筋重量との比を算出し、対照群とＨＴ群との間で、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を行った。
【００５８】
―病理組織学的検査―
各動物について大腿骨を採取し、１０％中性緩衝ホルマリン液で固定した。その後、膝関節軟骨の障害形成部、正常部、及び成長帯（骨端線）部分から、それぞれ厚さ５ｍｍの標本を切り出し、５％の蟻酸中で２４時間振盪して脱灰した。さらに、５％硫酸ナトリウム水溶液で２４時間中和し、流水で１０時間洗浄した。常法に従いパラフィンに包埋し、ミクロトームを使用して、厚さ５μｍに薄切した。その後、各標本に対して、ヘマトキシリン・エオジン染色を施して、病理組織学的検査に供した。
【００５９】
―画像解析―
上記と同様に、サフラニンＯ染色、アルシアンブルー染色を施した標本を作製し、画像解析に供した。標本の２００倍拡大像を、デジタルカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＤＰ７０、オリンパス製）を使用して、コンピュータに取り込んだ。その後、無作為に２カ所（画素数２０，０００ピクセル）を抽出し、所定の色に染色された部位（サフラニンＯ染色部位：プロテオグリカンに相当、アルシアンブルー染色部位：グルコサミノグリカンに相当）の密度を計測した。計測値について、対照群とＨＴ群との間で、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を行った。
【００６０】
＜結果＞
―一般状態―
ＨＴ群、対照群ともに、一般状態（下痢、食欲、毛艶の様子等）に顕著な変化は見られなかった。また、試験期間中の体重変化において、ＨＴ群と対照群との間に有意差は見られなかった（データ示さず）。
【００６１】
―関節部の肉眼所見―
軟骨障害を作製した直後の膝関節の様子を、図１の（ａ）に示した。矢印は上から順に、滑車溝近位の穴、滑車溝遠位の穴、内側滑車稜の穴を示す。
図１の（ｂ）には、実験期間終了後の対照群の膝関節を示した。対照群では軟骨障害は完全には治癒しなかった。図１の（ｃ）には、実験期間終了後のＨＴ群の膝関節を示した。ヒドロシキシチロソールの投与により、軟骨の再生が促進された。
【００６２】
下記表１は、手術から３週間後の軟骨障害部の治癒の様子を各個体で肉眼観察した結果をまとめた表である。なお、−〜＋＋＋の評価基準は前述の通りである。
【００６３】
【表１】
【００６４】
上記の結果を数値化して比較したところ、ＨＴ群は対照群と比べて、有意に軟骨治癒が促進されていた（ｐ＜０．０５）。
また、各群の数値化データの平均値は、対照群が４．８３であったのに対して、ＨＴ群では７．１７であった（図２）。
【００６５】
―筋重量―
算出した外側広筋と大腿二頭筋の重量比を表２に、対照群とＨＴ群との比較を図３に示した。
【００６６】
【表２】
【００６７】
対照群では、外側広筋と大腿二頭筋の筋重量の顕著な減少が観察された。一方、ＨＴ群では、外側広筋の筋重量はわずかに減少したが、大腿二頭筋の筋重量の減少はほとんど見られなかった。
【００６８】
―病理組織学的検査―
対照群及びＨＴ群の病理組織像を図４に示した。
図４の（ａ）〜（ｂ）は障害形成部位のヘマトキシリン・エオジン染色像を、（ｃ）〜（ｄ）はサフラニンＯ染色像を、（ｅ）〜（ｆ）はアルシアンブルー染色像を示す。なお、図４の左列（ａ）、（ｃ）、（ｅ）は対照群を、右列（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）はＨＴ群をそれぞれ示す。
対照群では、障害形成部位に、マクロファージ及び破骨細胞の浸潤、毛細血管、繊維芽細胞の増殖が認められたが、軟骨細胞の新生はわずかであった。
一方、ＨＴ群では、結合組織はわずかであり、成熟した軟骨細胞が広範囲で認められた。また、破骨細胞及び毛細血管の増殖像が見られなかったことから、軟骨組織の再生は、ほぼ終了しているものと推測された。
【００６９】
―画像解析―
対照群及びＨＴ群の画像解析結果を図５〜６に示した。図５はサフラニンＯ染色の画像解析結果、図６はアルシアンブルー染色の画像解析結果である。
軟骨の障害形成部位では、対照群と比較してＨＴ群では、サフラニンＯ染色で染色された部位の密度が有意に増加していた。したがって、ＨＴ群ではプロテオグリカンの生成が促進されたことが明らかになった。一方、軟骨の正常部位及び成長帯では、対照群とＨＴ群の間に差は認められなかった（図５）。
【００７０】
（実施例２：ヒドロキシチロソールの軟骨再生促進作用の検討（２））
実施例１と同様の方法で、ヒドロキシチロソール（１日当たり１００ｍｇ／ｋｇ、ＨＴ群）、及び、比較対照としてのグルコサミン塩酸塩（１日当たり８００ｍｇ／ｋｇ、以下、ＧＡＨ群）の軟骨再生促進作用を検討した。なお、対照群は実施例１と同様に設定した。
【００７１】
＜結果＞
―一般状態の観察―
対照群、ＨＴ群及びＧＡＨ群のいずれにおいても、一般状態に変化はみられなかった。また、体重の推移もＨＴ群及びＧＡＨ群ともに、対照群とほぼ同様であった。
【００７２】
―関節部の肉眼所見―
軟骨障害を作製した直後の膝関節の様子を、図７の（ａ）に示した。
図７の（ｂ）には、実験期間終了後の対照群の膝関節を示した。対照群では軟骨障害は完全には治癒しなかった。図７の（ｃ）及び（ｄ）には、それぞれ、実験期間終了後のＨＴ群及びＧＡＨ群の膝関節を示した。ヒドロシキシチロソール又はグルコサミン塩酸塩の投与により、軟骨の再生が促進された。
下記表３は、実施例１と同様に、手術から３週間後の軟骨障害部の治癒の様子を各個体で肉眼観察した結果をまとめた表である。
【００７３】
【表３】
【００７４】
上記の結果を数値化して比較したところ、対照群と比べて、ＨＴ群（ｐ＜０．０１）、ＧＡＨ群（ｐ＜０．０５）ともに有意に軟骨治癒が促進されていた。
また、各群の数値化データの平均値は、対照群が５．３３であったのに対して、ＨＴ群では８．１７、ＧＡＨ群では７．１７であり、ＨＴ群の方がＧＡＨ群よりも、軟骨再生が促進されていた（図８）。
【００７５】
―筋重量―
算出した外側広筋と大腿二頭筋の重量比を表４に、対照群、ＨＴ群及びＧＡＨ群の比較を図９に示した。
【００７６】
【表４】
【００７７】
対照群及びＧＡＨ群では、特に大腿二頭筋の筋重量の顕著な減少が観察され、また、外側広筋についてもやや筋重量の減少が見られたのに対し、ＨＴ群では、外側広筋、大腿二頭筋ともに筋重量の減少はほとんど見られなかった。
【００７８】
―病理組織学的検査―
対照群、ＨＴ群及びＧＡＨ群の病理組織像を図１０に示した。
図１０の（ａ）〜（ｃ）はヘマトキシリン・エオジン染色像を、（ｄ）〜（ｆ）はサフラニンＯ染色像を示す。なお、図１０の（ａ）、（ｄ）は対照群を、（ｂ）、（ｅ）はＧＡＨ群を、（ｃ）、（ｆ）はＨＴ群をそれぞれ示す。
対照群では、障害形成部位に、マクロファージ及び破骨細胞の浸潤、毛細血管、繊維芽細胞の増殖が認められたが、軟骨細胞の新生はわずかであった。
一方、ＨＴ群では、結合組織はわずかであり、成熟した軟骨細胞が広範囲で認められた。また、破骨細胞及び毛細血管の増殖像が見られなかったことから、軟骨組織の再生は、ほぼ終了しているものと推測された。
ＧＡＨ群では、ＨＴ群とほぼ同様の所見が認められた。
【００７９】
―画像解析―
対照群、ＨＴ群及びＧＡＨ群の画像解析結果を図１１〜１２に示した。図１１はサフラニンＯ染色の画像解析結果、図１２はアルシアンブルー染色の画像解析結果である。
対照群と比較してＨＴ群及びＧＡＨ群では、軟骨の障害形成部位のサフラニンＯ染色で染色された部位の密度が有意に増加していた。したがって、ＨＴ群及びＧＡＨ群ではプロテオグリカンの生成が促進されたことが明らかになった。また、ＧＡＨ群よりもＨＴ群の方が、プロテオグリカンの生成はより促進されていた。一方、軟骨の正常部位及び成長帯では、対照群とＨＴ群、ＧＡＨ群の間に差は認められなかった（図１１）。
【００８０】
以上の実施例１〜２の結果から、本発明の軟骨再生促進剤は、軟骨障害の治癒（軟骨再生）を促進する作用を有することが示された。また、本発明の軟骨再生促進剤による一般状態への有害な作用が観察されなかったことから、本発明の軟骨再生促進剤の安全性も確認された。
【００８１】
（実施例３：ヒドロキシチロソール及びグルコサミン塩酸塩の併用効果）
ヒドロキシチロソール及びグルコサミン塩酸塩の、軟骨細胞におけるグルコサミノグリカン産生促進作用及びヒアルロン酸産生促進作用を評価した。
【００８２】
ウサギ軟骨細胞（ウサギ関節軟骨初代培養細胞、Ｆ−８、セルガレージ社）を、リン酸緩衝生理食塩液で洗浄した後、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液で細胞を単離させた。
単離させた軟骨細胞を、１０％ ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、１００μＭ アスコルビン酸−２−リン酸エステル三ナトリウム（ＳＩＧＭＡ社）、及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＤＭＥＭ培地で、３７℃、５％ＣＯ２、湿潤条件下で維持培養した。
コラーゲンでコートした２４穴ウェルプレートに、１ウェル当たり２．５×１０５個（１ｍｌ／ウェル）の上記軟骨細胞を播種し、７日間培養後、培地を吸引除去した。
その後、上記培養軟骨細胞に、最終濃度１００ｎｇ／ｍｌのヒドロキシチロソール（ＣＡＹＭＡＮ社、純度９８％、以下ＨＴ群）、最終濃度４μｇ／ｍｌのグルコサミン塩酸塩（東京健食有限会社、純度９９％、以下ＧＡＨ群）、又は、上記ヒドロキシチロソール及び上記グルコサミン塩酸塩の両者（以下、ＨＴ＋ＧＡＨ群）を混合溶解した上記培地２ｍｌ／ウェルを添加し、さらに１２日間培養を行った。
なお、対照群として、薬物を添加しないで細胞を培養した群を設定した。
【００８３】
−生残細胞数の測定、及び各産生量の測定−
１２日間培養後の各群について、ＷＳＴ法で生残細胞数の測定を行った。
また、対照群に対する各実験群のグルコサミノグリカン、ヒアルロン酸の産生量の割合は、下記の式によって算出した。
式：（（各実験群産生量／各実験群細胞数）×１００）／（対照群産生量／対照群細胞数）
【００８４】
１）グルコサミノグリカン産生量の測定
上記の培養細胞について、測定用キット（酸性ムコ多糖定量キット、セルガレージ社）を使用して、グルコサミノグリカンの産生量を測定した。
その結果、ＨＴ群、ＧＡＨ群におけるグルコサミノグリカンの産生量は、対照群と比較して、それぞれ１１９．８％、１４７．０％であった。また、ＨＴ＋ＧＡＨ群における産生量は、対照群と比較して１７３．４％であり、ヒドロキシチロソールとグルコサミン塩酸塩を併用すると相乗効果が現れることが明らかになった（図１３）。
【００８５】
２）ヒアルロン酸産生量の測定
各群の培養細胞の上清を採取し、測定用キット（ヒアルロン酸定量キット、生化学工業社）を使用して、ヒアルロン酸の産生量を測定した。
その結果、ＨＴ群、ＧＡＨ群におけるヒアルロン酸の産生量は、対照群と比較して、それぞれ８２．９％、１２７．４％であった。また、ＨＴ＋ＧＡＨ群における産生量は、対照群と比較して２４５．２％であり、ヒドロキシチロソールとグルコサミン塩酸塩を併用すると相乗効果が現れることが明らかになった（図１４）。
【００８６】
以上の実施例３の結果から、本発明の軟骨再生促進剤は、軟骨細胞におけるグルコサミノグリカン産生を促進する作用を有することが示され、特にヒドロキシチロソール及びグルコサミン塩酸塩の両者を併用する態様において、その作用（中でも、ヒアルロン酸産生促進作用）が相乗的に高まることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明の軟骨再生促進剤、医薬、及び食品は、例えば、軟骨損傷を患う患者への適用に、特に好適である。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】図１は、ウサギの膝関節軟骨障害に対する、ヒドロキシチロソールの軟骨再生促進作用を示した図である。
【図２】図２は、ウサギの膝関節軟骨障害に対する、ヒドロキシチロソールの軟骨再生促進作用を示したグラフである。
【図３】図３は、ウサギの膝関節軟骨障害に対する、ヒドロキシチロソールの筋重量における作用を示したグラフである。
【図４】図４は、ウサギの膝関節軟骨障害に対する、ヒドロキシチロソールの軟骨再生促進作用を組織学的に示した組織染色像である（×２００）。
【図５】図５は、ウサギの膝関節軟骨障害に対する、ヒドロキシチロソールのプロテオグリカン生成における作用を示したグラフである。
【図６】図６は、ウサギの膝関節軟骨障害に対する、ヒドロキシチロソールのグルコサミノグリカン生成における作用を示したグラフである。
【図７】図７は、ウサギの膝関節軟骨障害に対する、ヒドロキシチロソール、及びグルコサミン塩酸塩（比較対照）の軟骨再生促進作用を示した図である。
【図８】図８は、ウサギの膝関節軟骨障害に対する、ヒドロキシチロソール、及びグルコサミン塩酸塩（比較対照）の軟骨再生促進作用を示したグラフである。
【図９】図９は、ウサギの膝関節軟骨障害に対する、ヒドロキシチロソール、及びグルコサミン塩酸塩（比較対照）の筋重量における作用を示したグラフである。
【図１０】図１０は、ウサギの膝関節軟骨障害に対する、ヒドロキシチロソール、及びグルコサミン塩酸塩（比較対照）の軟骨再生促進作用を組織学的に示した組織染色像である（×２００）。
【図１１】図１１は、ウサギの膝関節軟骨障害に対する、ヒドロキシチロソール、及びグルコサミン塩酸塩（比較対照）のプロテオグリカン生成における作用を示したグラフである。
【図１２】図１２は、ウサギの膝関節軟骨障害に対する、ヒドロキシチロソール、及びグルコサミン塩酸塩（比較対照）のグルコサミノグリカン生成における作用を示したグラフである。
【図１３】図１３は、ウサギの軟骨細胞における、ヒドロキシチロソール及びグルコサミン塩酸塩（併用）のグルコサミノグリカン産生促進作用を示したグラフである。
【図１４】図１４は、ウサギの軟骨細胞における、ヒドロキシチロソール及びグルコサミン塩酸塩（併用）のヒアルロン酸産生促進作用を示したグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドロキシチロソール及びヒドロキシチロソール前駆体の少なくともいずれかを含有することを特徴とする軟骨再生促進剤。
【請求項２】
ヒドロキシチロソール及びヒドロキシチロソール前駆体の少なくともいずれかがオリーブ由来である請求項１に記載の軟骨再生促進剤。
【請求項３】
ヒドロキシチロソール前駆体がオレウロペインである請求項１から２のいずれかに記載の軟骨再生促進剤。
【請求項４】
ヒドロキシチロソール及びヒドロキシチロソール前駆体の少なくともいずれかと、アミノ糖とを組み合わせてなる請求項１から３のいずれかに記載の軟骨再生促進剤。
【請求項５】
アミノ糖がグルコサミン塩酸塩である請求項４に記載の軟骨再生促進剤。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の軟骨再生促進剤を含有することを特徴とする医薬。
【請求項７】
請求項１から５のいずれかに記載の軟骨再生促進剤を含有することを特徴とする食品。
【請求項１】
ヒドロキシチロソール及びヒドロキシチロソール前駆体の少なくともいずれかを含有することを特徴とする軟骨再生促進剤。
【請求項２】
ヒドロキシチロソール及びヒドロキシチロソール前駆体の少なくともいずれかがオリーブ由来である請求項１に記載の軟骨再生促進剤。
【請求項３】
ヒドロキシチロソール前駆体がオレウロペインである請求項１から２のいずれかに記載の軟骨再生促進剤。
【請求項４】
ヒドロキシチロソール及びヒドロキシチロソール前駆体の少なくともいずれかと、アミノ糖とを組み合わせてなる請求項１から３のいずれかに記載の軟骨再生促進剤。
【請求項５】
アミノ糖がグルコサミン塩酸塩である請求項４に記載の軟骨再生促進剤。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の軟骨再生促進剤を含有することを特徴とする医薬。
【請求項７】
請求項１から５のいずれかに記載の軟骨再生促進剤を含有することを特徴とする食品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２００８−１３３２５４（Ｐ２００８−１３３２５４Ａ）
【公開日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−８６３５７（Ｐ２００７−８６３５７）
【出願日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【出願人】（５０５０８０５８５）エーザイフード・ケミカル株式会社 (10)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【出願人】（５０５０８０５８５）エーザイフード・ケミカル株式会社 (10)
【Ｆターム（参考）】
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