遺伝子メチル化の検出
【課題】高次真核生物ではCpGジヌクレオチドにおいて、DNAは、グアノシンに対して5'に位置するシトシンでのみメチル化される。この修飾は、遺伝子発現に対する重要な調節作用を有する。正常な非メチル化CpG島の異常メチル化は、特定の腫瘍サプレッサー遺伝子または特定のヒト癌の改善に関連するその他の遺伝子の転写不活性化に関連している。良性前立腺過形成と前立腺癌を区別するメチル化特異的PCR(MSP)プライマーおよびプローブのデザイニングは、複雑である。新規のプライマーおよびプローブの組み合わせによって、さらに頑健で、一貫したアッセイを得ることができる。
【解決手段】各種遺伝子のメチル化状態を検出するための方法、キットおよび組成物は、前立腺癌などの増殖性疾患と疑われる疾患を含む各種診断応用で有用である。
【解決手段】各種遺伝子のメチル化状態を検出するための方法、キットおよび組成物は、前立腺癌などの増殖性疾患と疑われる疾患を含む各種診断応用で有用である。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
〔発明の背景〕
本発明は、癌などの細胞増殖疾患の診断および予後判定アッセイなどの用途におけるメチル化遺伝子の疑問(interrogation)に関する。関連遺伝子は、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GSTPI)遺伝子またはその一部を含む。
【０００２】
高次真核生物ではCpGジヌクレオチドにおいて、DNAは、グアノシンに対して5'に位置するシトシンでのみメチル化される。この修飾は、特に、遺伝子プロモーター領域に位置する富CpG部分（CpG rich areas）(CpG島)を含むと、遺伝子発現に対して重要な調節作用を有する。正常な非メチル化CpG島の異常メチル化は、不死化および形質転換細胞に多発する事象であり、特定の腫瘍サプレッサー遺伝子または特定のヒト癌の改善に関連するその他の遺伝子の転写不活性化に関連付けられている。
【０００３】
グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)は、化学反応求電子剤をグルタチオンに共役させることによって、求電子発癌物質の不活性化を含めて、細胞内解毒反応を触媒する(C.B.Pickettら、「アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー（Annu. Rev. Blocbern.）」58巻:ｐ．743, 1989年; B. Colesら、「ＣＲＣクリティカル・レビュー・オブ・バイオケミカル・アンド・モレキュラー・バイオロジー（CRC Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol.）」25巻: ｐ．47, 1990年; T.H. Rushmoreら、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）」268巻: ｐ．11475, 1993年)。異なる遺伝子座で異なる遺伝子数個によってコード化されるヒトGSTは、アルファ、ミュー、パイおよびシータと称する4科に分類される(B. Mannervikら、「バイオケミカル・ジャーナル（Biochem. J.）」282巻:ｐ．305, 1992年)。前立腺癌および肝臓癌などの多くのヒトの癌は、それらの発生源組織に比較して、GSTP1発現の減少を呈する。
【０００４】
前立腺癌の場合、特に良性前立腺過形成と前立腺癌を区別するメチル化特異的PCR(MSP)プライマーおよびプローブのデザイニングは、複雑であると判明している。公表されている最良のプライマー/プローブセットは、典型的には、アッセイを調整し、100％特異性にすると、約75％までの感度を示し、アッセイを調整し、100％高感度にすると、60％未満の特異性を示す。新規のプライマーおよびプローブの組み合わせによって、さらに頑健で、一貫したアッセイを得ることができる。本発明は、こうした要求を満たす。
【０００５】
〔発明の概要〕
本発明のある態様では、対象者の前立腺組織または他のサンプル中の細胞増殖性疾患を検出する方法は、特定の遺伝子の過剰メチル化領域の増幅および検出に有用な試薬との細胞成分の接触を含む。
【０００６】
本発明の別の態様では、少なくとも1個の当該過剰メチル化遺伝子は、1個以上の他の遺伝子と併用してアッセイすることができるGSTP1である。
【０００７】
本発明の別の態様では、メチル化標的配列を有すると考えられる核酸サンプルを生体サンプルから入手し、当該核酸サンプルを、標的の一部を初回刺激(prime)できる試薬で処理し、当該核酸標的を増幅し、増幅されたサンプルのメチル化度を既知の正常サンプルのメチル化度と比較する。本発明のなおも別の態様では、増幅されたメチル化配列との比較のために、メチル化されている可能性が低い配列を増幅、検出する。
【０００８】
なおも別の態様では、本発明は、細胞増殖性疾患の検出法を提供する。これは、メチル化状態が細胞増殖性疾患を示す遺伝子を増幅することによって実施される。本検出法は、非メチル化シトシンを修飾する物質との核酸含有標本または体液の接触、当該標本中の核酸の、修飾メチル化核酸と非メチル化核酸(modified methylated and nonmethylated nucleic acid)を識別するオリゴヌクレオチドプライマーまたはプライミング配列による増幅、および、増幅中に生じた増幅産物の有無によるメチル化核酸の検出を含むことができる。
【０００９】
本発明の方法は、サンプルのメチル化比の決定を包含する。メチル化比は、罹病状態で過剰メチル化されたマーカー(または、マーカーのある領域)のメチル化レベルの、同一条件下で過剰メチル化されていないマーカーのメチル化レベルに対する(または、同一条件下で過剰メチル化されていない同一マーカーのある領域に対する)比率である。罹病状態で過剰メチル化されているマーカーのメチル化の、過剰メチル化されていない別のマーカーとの比較によってメチル化比を決定する場合、第2のマーカーを参照マーカーと称することができる。
【００１０】
本発明の別の態様では、メチル化比は、定量的リアルタイムPCRによって決定される。
【００１１】
本発明の別の態様では、診断および/または予後判定アッセイ用レポーター分子を提供する。
【００１２】
別の実施態様では、本発明は、メチル化核酸の検出に有用なキットを提供する。キットは、1個以上の容器を含み、非メチル化シトシンを修飾する試薬を含有する第1容器、および、CpG含有核酸の増幅を初回刺激(prime)する試薬で、修飾メチル化核酸と非修飾メチル化核酸を識別する試薬を含有する第2容器である。
【００１３】
本発明のなおも別の態様では、本発明の方法またはその実施用キットによって検出される核酸配列は、プロモーターまたはプロモーターの一部を含む。
【００１４】
本発明のなおも別の態様では、特定の遺伝子のメチル化部分の検出に使用する方法およびキットは、別の核酸の存在をアッセイする段階および/または成分も含む。意図的にメチル化された遺伝子が処理(例、増幅)の影響を受ける程度を、他の核酸のそれと比較し、マーカーのメチル化範囲を決定する。
【００１５】
〔発明の詳細な説明〕
特定の遺伝子の過剰メチル化は、前立腺発癌性と相関する。当該遺伝子または当該遺伝子の一部を含む核酸配列は、本明細書ではマーカーと呼ばれる。マーカーは、次の遺伝子または当該遺伝子の一部を含む核酸を含む。即ち、GSTP1 (配列ID. No. 54)、RARB2 (配列ID. No. 57)、RASSF1A (配列ID. No. 64)、TIMP3 (配列ID. No. 58)、APC (プロモーター= 配列ID No. 59、遺伝子= 配列ID.No. 60)、ベータ-アクチン (配列ID. No.55 および56)、PTGS2 (プロモーター= 配列ID. No.61、遺伝子= 配列ID. No. 62)および14-3-3 シグマ(配列ID. No.63)である。
【００１６】
前記過剰メチル化を検出するアッセイは、MSPおよび制限エンドヌクレアーゼ分析などの技術を含む。プロモーター領域は、当該過剰メチル化分析の検出のための特に注目に値する標的である。GSTP1のプロモーター領域の配列分析は、ヌクレオチドの72％近くがCGであり、約10％がCpGジヌクレオチドであることを示す。
【００１７】
本発明は、対象者の組織または他の生体サンプル中のマーカーの特定領域のメチル化状態を決定する方法で、増殖性疾患に関連するDNAを増幅、検出する方法を提供する。マーカーによってコード化されたタンパクレベルの減少(即ち、転写減少)は、プロモーターなどの特定領域の過剰メチル化の結果であることがしばしばあるので、当該領域が過剰メチル化されているかどうかを決定するのが望ましい。GSTP1遺伝子の場合は、これが最も確実に見られる。過剰メチル化領域は、正常組織に比較して、罹病組織のサンプルの方が統計的に有意に高い程度までメチル化される領域である。
【００１８】
本発明の目的上、特定のマーカー領域に特異的な核酸プローブまたはレポーターを使って、体液または組織中のマーカー遺伝子のメチル化領域の存在を検出する。PCRなどの技術によるDNA増幅には、当該マーカー配列の特定部分に基づいたオリゴヌクレオチドプライマーが特に有用である。検出可能な量の関連ポリヌクレオチドを含有する標本なら、どれでも使用できる。本発明の好ましい標本は、泌尿生殖器由来組織、特に前立腺組織である。好ましくは、サンプルは、上皮細胞を含有する。
【００１９】
本発明のプライマー/プローブまたはレポーター試薬を数種類使用して、マーカー遺伝子の発現抑制配列(expression control sequences)のメチル化を検出する。これらは、核酸配列の転写、ある場合は、翻訳を調節する核酸配列である。よって、発現抑制配列は、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、開始コドン(即ち、ATG)、イントロンスプライシングシグナル、mRNAの適正な翻訳を可能にするためのその遺伝子の正確なリーディングフレームの維持、および停止コドンに関与する配列を含むことができる。
【００２０】
GSTP1プロモーターは、有用なマーカーに典型的な発現抑制配列である。それは、遺伝子の転写に指示し、グルタチオン-S-トランスフェラーゼタンパクを産生できるポリヌクレオチド配列である。プロモーター領域は、構造遺伝子の上流、または5'に位置する。細胞型特異的、組織特異的な外部シグナルまたは作用物質に対して調節可能な、または、外部シグナルまたは作用物質によって誘導可能なプロモーター依存性遺伝子発現を提供するのに十分なエレメントを含むことができる。当該エレメントは、ポリヌクレオチド配列の5'または3'領域に位置することができる。
【００２１】
本発明のある方法は、マーカーを含有する標的細胞の、核酸に結合する試薬との接触を含む。標的細胞成分は、DNAまたはRNAなどの核酸である。試薬は、PCRまたはMSPプライマーなどのプローブおよびプライマー、あるいは、標的配列を増幅および検出するように構成された他の分子を含むことができる。例えば、試薬は、スコーピオン試薬またはスコーピオンレポーターと呼ばれるものなど、それ自体のレポーター部分に組み合わされた、または、結合されたプライミング配列を含むことができ、Whitcombeらへの米国特許第6,326,145号および第6,270,967号に記述されている(参照することによって、そのまま本明細書に組み入れられている)。「プライマー」および「プライミング配列」という用語は、同一ではないが、本明細書では、核酸配列の増幅を初回刺激する分子または分子の一部を示す際に使用することができる。
【００２２】
メチル化パターンを検出する、ある高感度な方法は、メチル化感受性酵素とポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の使用の組み合わせに関する。DNAを当該酵素で消化した後、DNA開裂がメチル化で防止される場合のみ、制限部位に隣接するプライマーから、PCRを増幅させる。本発明のPCRプライマーをデザインする典型的な標的領域は、GSTP1の転写開始部位からM24485(Genbank)のゲノム位置番号に従った-71〜+59bpあたりにある領域に隣接するプライマーを含む。
【００２３】
本発明の方法は、非メチル化シトシンを修飾する作用物質との核酸含有標本の接触、CpG特異的オリゴヌクレオチドプライマーによる当該標本中のCpG含有核酸の増幅、およびメチル化核酸の検出も含むことができる。好ましい修飾は、非メチル化シトシンの別のヌクレオチドへの変換で、これが、非メチル化シトシンをメチル化シトシンから識別することになる。好ましくは、作用物質は、非メチル化シトシンを修飾してウラシルとし、亜硫酸水素ナトリウムであるが、非メチル化シトシンを修飾するが、メチル化シトシンは修飾しない他の作用物質も使用できる。亜硫酸水素ナトリウム(NaHSO3)修飾は、最も好ましく、シトシンの5,6-二重結合と容易に反応するが、メチル化シトシンとは反応しにくい。シトシンは、亜硫酸イオンと反応し、脱アミノ化に感受性を示すスルフォン化シトシン反応中間体を形成し、スルフォン化ウラシルを生じる。スルフォン酸基は、アルカリ条件下で取り除くことができ、ウラシルを形成できる。ウラシルは、Taqポリメラーゼによってチミンとして認識され、そのため、PCR時、生じた産物は、5-メチルシトシンが開始テンプレートに起こる位置にのみシトシンを含有する。スコーピオンレポーターおよび試薬、および他の検出系は、このように処理された非修飾種から修飾種を同様に識別する。
【００２４】
標本中のCpG含有核酸の増幅に本発明で使用するプライマーは、修飾(亜硫酸塩による)後に、具体的には、未処理DNA、メチル化DNAと非メチル化DNAを識別する。メチル化特異的PCR (MSPCR)では、非メチル化DNA用プライマーまたはプライミング配列は、好ましくは3'CGペア中にTを有し、メチル化DNAに保持されるCとそれを識別し、補完物(compliment)が、アンチセンスプライマー用にデザインされる。非メチル化DNA用MSPプライマーまたはプライミング配列は、通常、その配列に比較的少数のCまたはGを含有する。それは、Cがセンスプライマー中に存在しなくなり、Gがアンチセンスプライマーに存在しなくなる(Cは修飾されてU（ウラシル)になり、これが増幅産物中でT(チミジン)として増幅される)からである。
【００２５】
本発明のプライマーは、多形遺伝子座の多数の核酸への特異的重合開始を提供するために十分な長さと適切な配列のオリゴヌクレオチドである。本発明のプライマーによって増幅される配列は、本発明のプローブまたはレポーターに曝露されると、メチル化状態とそれによる診断情報を示す。それらは、先行技術のものよりも高感度で、特異的である。
【００２６】
本発明のプライマーは、最も好ましくは、多形遺伝子座鎖に実質的に相補的なプライマー伸長産物の合成を開始できるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド8個以上である。合成につながる環境条件は、ヌクレオシドトリフォスフェートおよび重合用剤、例えばDNAポリメラーゼ、の存在および適切な温度とpHを含む。プライマーまたはプライミング配列のプライミング部分は、好ましくは増幅で最大効率を挙げる一本鎖であるが、二本鎖であることができる。二本鎖の場合には、伸長産物の調製に使用する前に、プライマーを、最初に、処理して当該二本鎖を分離する。プライマーは、重合誘導剤の存在下で伸長産物の合成を開始（prime）するのに十分な長さがなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、緩衝液、ヌクレオチド組成などの要因に依存することになる。オリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくは周知のデザイン指針または規則に従って、約12〜20個のヌクレオチドを含有するのが最も好ましいが、含有するヌクレオチドはそれより多くても少なくてもよい。
【００２７】
本発明のプライマーは、増幅対象ゲノム遺伝子座の各鎖に実質的に相補的であるようにデザインされ、上記のように、適切なGまたはCヌクレオチドを含む。これは、重合用剤の実施を可能にする条件下でプライマーはそれぞれの鎖とハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならないことを意味する。言い換えれば、プライマーは、ゲノム遺伝子座をハイブリダイズし、ゲノム遺伝子座の増幅を可能にするのに十分な、5'および3'フランキング配列との相補性を有する必要がある。
【００２８】
本発明のプライマーは、増幅プロセスに用いられる。即ち、関与する反応段階数に比べて、さらに多くの標的遺伝子座量を産生する反応(好ましくは、酵素的連鎖反応)である。最も好ましい実施態様では、当該反応は、指数的に増加した標的遺伝子座量を生じる。これらなどの反応は、PCR反応を含む。典型的には、あるプライマーは、遺伝子座のマイナス鎖に相補的であり、別のプライマーは、プラス鎖に相補的である。変性核酸へのプライマーのアニーリングとそれに続く酵素、DNAポリメラーゼI(Klenow)の大型断片およびヌクレオチドなど、による伸長は、標的遺伝子座配列を含有する＋鎖と−鎖を新たに合成する。当該連鎖反応の産物は、用いられた特異的プライマー末端に対応する末端を有する離散核酸二重らせんである。
【００２９】
本発明のプライマーは、自動化法を含む普通のフォスフォトリエステル（phosphotriester）およびフォスフォジエステル（phosphodiester）法など、どの適切な方法によっても調製できる。当該自動化の、ある実施態様では、開始材としてジエチルフォスフォアミダイト（diethylphosphoramidites）が使用され、これは、Beaucageら (Tetrahedron Letters, 22: 1859-1862, 1981年)が記述するとおりに合成できる。修飾固相支持体上でのオリゴヌクレオチドの合成法は、米国特許第4,458,066に記述されている。
【００３０】
標的遺伝子座(例、CpG)を含有する特定核酸配列を含有する、あるいは、含有すると考えられる、という条件付きで、開始核酸または核酸群として、精製済み、未精製の形態の、どの核酸標本でも利用できる。よって、前記プロセスは、例えば、DNAまたはメッセンジャーRNAを含むRNAを用いることができる。DNAまたはRNAは、一本鎖であることも、二本鎖であることもできる。テンプレートとしてRNAを使用しなければならない場合、テンプレートをDNAに逆転写するのに最適な酵素および/または条件を用いる。さらに、それぞれの一方の鎖を含有するDNA-RNAハイブリッドを利用できる。核酸混合物も使用でき、あるいは、同一または異なるプライマーを使った本明細書の先の増幅反応で産生される核酸も利用できる。増幅対象の特定核酸配列、即ち標的遺伝子座は、大型分子の一部分であることができ、あるいは、特定配列が核酸全体を構成するように、初めに離散分子として存在することができる。
【００３１】
メチル化CpGの検出に使用される核酸含有標本は、組織(特に、前立腺組織およびリンパ組織)、血液、リンパ、尿および射精などの任意の発生源から得ることができ、Maniatisら(「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」コールド・スプリング・ハーバー研究所出版会、ニューヨーク pp280, 281, 1982年)によって述べられているようなものなど、各種技術によって抽出することができる。
【００３２】
抽出されたサンプルが不純である場合、当該サンプルの細胞、体液、組織または動物細胞膜を開き、核酸鎖を露出および/または分離するのに有効な試薬量で、増幅する前に、処理することができる。この、当該核酸鎖を露出および分離する溶解および核酸変性段階が、増幅をはるかに容易に起こさせる。
【００３３】
サンプルの標的核酸配列が2本鎖を含有する場合、テンプレートとして使用できる前に、当該核酸鎖を分離することが必要である。鎖分離は、個別の段階として、もしくは、プライマー伸長産物の合成と同時に行うことができる。この鎖分離は、物理的、化学的または酵素的手段を含む各種の適切な変性条件を使って達成できる。核酸鎖の、ある物理的分離法は、変性するまでの核酸の加熱を含む。典型的熱変性は、10分間までの約80〜105℃の範囲の温度を含む。核酸鎖の分離は、ヘリカーゼとして知られる酵素クラスの酵素、または、ヘリカーゼ活性を有し、リボATPの存在下でDNAを変性させることが知られている酵素RecAによっても誘導できる。ヘリカーゼを使った核酸の鎖分離に適した反応条件は、Kuhn Hoffmann-Berling(「ＣＳＨ‐クオンティテイティブ・バイオロジー（CSH-Quantitative Biology）」43巻:ｐ．63, 1978年)によって記述されている。RecA使用技術は、C. Radding(「アニュアル・レビュー・オブ・ジェネティクス（Ann. Rev. Genetics）」16:405-437, 1982)で再検討されている。これらの技術の改良もまた、現在、周知である。
【００３４】
核酸または核酸群の相補鎖を分離する場合、核酸が元々二本鎖であったか、一本鎖であったかにかかわらず、分離された鎖は、別の核酸鎖の合成にテンプレートとして容易に使用できる。この合成は、プライマーのテンプレートへのハイブリダイゼーションを起こす条件下で実施される。一般に合成は、緩衝水溶液中、好ましくはpH 7〜9、最も好ましくは約8で起こる。過剰モル(ゲノム核酸に対して、通常約108：1、プライマー：テンプレート)の2個のオリゴヌクレオチドプライマーを、好ましくは、分離テンプレート鎖含有緩衝液に添加する。相補鎖量は、本発明のプロセスを診断応用に使用する場合、明らかでない可能性があるので、必ずしも相補鎖量に対するプライマー量を確実に測定できるわけではない。しかし、実際問題として、添加されるプライマー量は、一般に、複合的長鎖核酸鎖の混合物に増幅対象の配列が含有される場合、相補鎖（テンプレート)量を上回る過剰モルになる。当該プロセスの効率を向上させるには、大過剰モルが好ましい。
【００３５】
デオキシリボヌクレオシド三リン酸 dATP、dCTP、dGTP、およびdTTPは、適切な量で個別に、もしくは、プライマーとともに、合成混合物に添加し、生じた溶液を約90〜100℃に、10分間まで、好ましくは1〜4分間加熱する。この加熱期間後、当該溶液を、プライマーハイブリダイゼーションに好ましい室温まで冷却できる。冷却された混合物にプライマー伸長反応を引き起こす適当な物質を添加し(重合用剤)、技術上周知の条件下で反応させる。重合用剤は、熱安定性であれば、他の試薬と合わせて添加することもできる。この合成(即ち、増幅)反応は、重合用剤がもはや機能しなくなる温度までの室温で行うことができる。
【００３６】
重合用剤は、プライマー伸長産物の合成を達成するように機能するいずれかの化合物または系、好ましくは酵素であることができる。この目的に適した酵素は、例えばE.coliDNAポリメラーゼ１、E.coliDNAポリメラーゼIのKlenow断片、T4 DNAポリメラーゼ、他の利用可能なDNAポリメラーゼ、ポリメラーゼミューテイン（polymerase muteins）、逆転写酵素、および、熱安定酵素(例、十分な上昇温に供し、変性を引き起こした後にプライマー伸長を行う酵素)を含めた他の酵素を含む。好ましい重合用剤は、Taqポリメラーゼである。適切な酵素は、各遺伝子座の核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物を形成するのに適した方法でヌクレオチドの配合を促進する。一般に、当該合成は、各プライマーの3'末端で開始され、テンプレート鎖に沿って5'方向に進み、合成が終了するまで、異なる長さの分子を生じる。しかし、上記のものと同じプロセスを使って、5'末端で合成を開始し、他の方向に進行させる重合用剤が可能である。
【００３７】
最も好ましくは、増幅法は、PCRによる。本発明のプライマーを使ってPCRにより増幅されたメチル化および非メチル化遺伝子座が、代替手段によって、同様に増幅される限り、この代替手段も用いることができる。
【００３８】
増幅された産物は、好ましくは、Mullisらへの米国特許第4,683,195号に記述される産物に特異的なプローブまたはレポーターでメチル化体または非メチル化体として同定される。当該特許は、参照することによってそのまま本明細書に組み入れられている。ポリヌクレオチド検出用プローブおよびレポーターの分野の進歩は、当業者に周知である。任意に、核酸のメチル化パターンを、制限酵素の消化およびサザンブロット分析などの他の技術によって確認できる。5'CpGメチル化の検出に使用できるメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼの例は、SmaI、SacII、EagI、MspI、HpaII、BstUI およびBssHIIを含む。
【００３９】
本発明の最も好ましい方法は、メチル化比の確定を含む。これは、達成されたマーカーの増幅メチル化種の量と増幅参照マーカーまたは増幅非メチル化マーカー領域の量の比を確定することによって実施できる。これは、定量的リアルタイムPCRを使用すると、最も適切に実施される。既定の、または、所定のカットオフまたは閾値を上回る比は、過剰メチル化され、癌(GSTP1の場合は前立腺癌)などの増殖性疾患を有することを示す、と見なされる。カットオフは、既知法に従って確定され、当該方法は、罹病状態が既知のサンプルおよび正常状態が既知のサンプルの少なくとも2セットのサンプル、について実施される。本発明の参照マーカーは、内部対照としても使用できる。当該参照マーカーは、好ましくは、Bアクチンなどのサンプル細胞中に構成的に発現される遺伝子である。
【００４０】
本発明の方法およびキットは、多重化用の段階および試薬を含むことができる。即ち、1個以上のマーカーを一度にアッセイできる。
【００４１】
マーカーに結合する遺伝子の転写レベルの減少は、ポリヌクレオチド配列および/または発現抑制配列(例、プロモーター配列)の特定のエレメントの過剰メチル化の結果であるので、それらの配列に適合するように調製されたプライマーを準備した。従って、本発明は、マーカーの発現抑制またはプロモーター領域内の特定部分のメチル化を検出することによって細胞増殖性疾患を検出または診断する方法を提供する。これらの部分のメチル化の検出に有用なプローブは、当該診断または予後判定法に有用である。マーカーの検出に好ましい分子を以下に示す。マーカー遺伝子の略名を、用いる検出系のタイプとともに括弧内に示す。アンチセンスは、結合されるペアの他方のプライミング配列と関連してそのように指定したプライマーの配向を示すにすぎない。それは、必ずしもゲノムDNAに対するアンチセンスではない。
配列ID. NO. 1 (GSTP1スコーピオン):
CCCCGAACGTCGACCGCTCGGGG-BHQ-HEG-CGATTTCGGGGATTTTAGGGCGT
配列ID. NO. 2 (GSTP1スコーピオンアンチセンスプライマー):
AAAATCCCGCGAACTCCCGCC
配列ID. NO. 3 (GSTP1スコーピオン):
CCCGAACGTCGACCGCTTTCGGG-BHQ-HEG-CGATTTCGGGGATTTTAGGGCGT
配列ID. NO. 4 (GSTP1 スコーピオンアンチセンスプライマー):
AAAATCCCGCGAACTCCCGCC
配列ID. NO. 5 (GSTP1スコーピオン):
CGGCGGGAGTTCGCGGGCGCCG-BHQ-HEG-ACTAAATCACGACGCCGACCGC
配列ID. NO. 6 (GSTP1 スコーピオンアンチセンスプライマー):
CGGTTAGTTGCGCGGCGATTTC
配列ID. NO. 7 (GSTP1スコーピオン):
CGGGAGTTCGCGGGTCCCG-BHQ-HEG-ACTAAATCACGACGCCGACCGC
配列ID. NO. 8 (GSTP1 スコーピオンアンチセンスプライマー):
CGGTTAGTTGCGCGGCGATTTC
配列ID. NO. 9 (GSTP1スコーピオン):
GTGGTTGATGTTTGGGGTATCAACCAC-BHQ-HEG_AATCCCACAAACTCCCACCAACC
配列ID. NO. 10 (GSTP1 スコーピオンアンチセンスプライマー):
GTGGTGATTTTGGGGATTTTAGGGTGT
配列ID. NO. 11 (GSTP1 スコーピオン):
ACCCCAGTGGTTGATGTTTGGGGT-BHQ-HEG-AATCCCACAAACTCCCACCAACC
配列ID. NO. 12 (GSTP1 スコーピオンアンチセンスプライマー):
GTGGTGATTTTGGGGATTTTAGGGTGT
配列ID. NO. 13 (GSTP1スコーピオン):
CCCCACAGGTTGGTGGGAGTTTGTGGGG-BHQ-HEG-CCCAATACTAAATCACAACACCAACCAC
配列ID. NO. 14 (GSTP1 スコーピオンアンチセンスプライマー):
TGGTTAGTTGTGTGGTGATTTTGGGGA
配列ID. NO. 15 (GSTP1スコーピオン):
CCCCGAACGTCGACCGCTCGGGG-BHQ-HEG- CGATTTCGGGGATTTTAGGGCGT
配列ID. NO. 16 (GSTP1 スコーピオンアンチセンスプライマー):
AAAATCCCGCGAACTCCCGCC
配列ID. NO. 17 (GSTP1スコーピオン):
CGCACGCCGAACGTCGACCGCAAACGTGCG-BHQ-HEG-CGATTTCGGGGATTTTAGGGCGT
配列ID. NO. 18 (GSTP1スコーピオンアンチセンスプライマー):
AAAATCCCGCGAACTCCCGCC
配列ID. NO. 19 (GSTP1スコーピオン):
CGCACGGCGAACTCCCGCCGACGTGCG BHQ-HEG-
TGTAGCGGTCGTCGGGGTTG
配列ID. NO. 20 (GSTP1 スコーピオンアンチセンスプライマー):
GCCCCAATACTAAATCACGACG
配列ID. NO. 21 (GSTP1スコーピオン):
CCGACGCACAAAAAAACACCCTAAAATCCGTCGG-BHQ-HEG-GGTTAGTTGTGTGGTGATTTT
配列ID. NO. 22 (GSTP1 スコーピオンアンチセンスプライマー):
CACAACACCAACCACTCTTC
配列ID. NO. 23 (GSTP1 TAQMAN プライマー):
CGTGATTTAGTATTGGGGCGGAGCGGGGC
配列ID. NO. 24 (GSTP1 TAQMAN プライマー):
ATCCCCGAAAAACGAACCGCGCGTA
配列ID. NO. 25 (GSTP1 TAQMAN プローブ):
TCGGAGGTCGCGAGGTTTTCGTTGGA
配列ID. NO. 26 (RARB2スコーピオン):
GCCGCCGTCGAGAACGCGAGCGGGCGGC-BHQ-HEG-TACCCCGACGATACCCAAAC
配列ID. NO. 27 (RARB2 スコーピオンアンチセンスプライマー):
GGGATTAGAATTTTTTATGCGAGTTGT
配列ID. NO. 28 (RARB2スコーピオン):
CGGCAGGATTGGGATGTCGAGCTGCCG-BHQ-HEG-TACCCCGACGATACCCAAAC
配列ID. NO. 29 (RARB2 スコーピオンアンチセンスプライマー):
GGGATTAGAATTTTTTATGCGAGTTGT
配列ID. NO. 30 (RASSF1Aスコーピオン):
GCCGCGGTTTCGTTCGGTTCGCGGC-BHQ-HEG-CCCGTACTTCGCTAACTTTAAACG
配列ID. NO. 31 (RASSF1A スコーピオンアンチセンスプライマー):
GCGTTGAAGTCGGGGTTC
配列ID. NO. 32 (TIMP3スコーピオン):
GCGGCGAGTTCGGGTTGTAGCGCCGC-BHQ-HEG-CGCCTCTCCAAAATTACCGTAC
配列ID. NO. 33 (TIMP3 スコーピオンアンチセンスプライマー):
GCGTCGGAGGTTAAGGTTGTT
配列ID. NO. 34 (APCスコーピオン):
GCCGGCGGGTTTTCGACGGGCCGGC-BHQ-HEG-CGAACCAAAACGCTCCCCA
配列ID. NO. 35 (APC スコーピオンアンチセンスプライマー):
GTCGGTTACGTGCGTTTATATTTAG
配列ID. NO. 36 (アクチンスコーピオン):
GCGCCCAACCGCACAAGGGCGC-BHQ-HEG-GGGTATATTTTCGAGGGGTACG
配列ID. NO. 37 (アクチン スコーピオンアンチセンスプライマー):
CGACCCGCACTCCGCAAT
配列ID. NO. 38(アクチンスコーピオン):
CCGCGCATCACCACCCCACACGCGCGG-BHQ-HEG-GGAGTATATAGGTTGGGGAAGTTTG
配列ID. NO. 39 (アクチン スコーピオンアンチセンスプライマー):
AACACACAATAACAAACACAAATTCAC
配列ID. NO. 40 (アクチンスコーピオン):
CCCGGCTAAACCCACCATCCAGCCGGG-BHQ-HEG-GGGAGGGTAGTTTAGTTGTGGTT
配列ID. NO. 41 (アクチン スコーピオンアンチセンスプライマー):
CAAAACAAAAAAACTAAATCTACACAACC
配列ID. NO. 42 (アクチンスコーピオン):
CCGCGGAACATTCAACTCAACCGCGG-BHQ-HEG-GGAGGAGGAAGGTAGGTTTTT
配列ID. NO. 43 (アクチン スコーピオンアンチセンスプライマー):
ACATACAACAATCAATAACATAAAACCAC
配列ID. NO. 44 (PTGS2/COX2スコーピオン):
CACGCCGCCGTATCTAGGCGTG-BHQ-HEG-GTTTGTTTCGACGTGATTTTTTCGA
配列ID. NO. 45 (PTGS2/COX2アンチセンスプライマー):
GCAAAAAATCCCCTCTCCCGC
配列ID. NO. 46 (PTGS2/COX2スコーピオン):
GCCGCGCACAAATTTCCGCGGC-BHQ-HEG-GAATTGGTTTTCGGAAGCGTTCG
配列ID. NO. 47 (PTGS2/COX2アンチセンスプライマー):
CCCGAATTCCACCGCC
配列ID. NO. 48 (PTGS2/COX2スコーピオン):
GGCGGAACGCACAAATTTCCGCC-BHQ-HEG-GAATTGGTTTTCGGAAGCGTTCG
配列ID. NO. 49 (PTGS2/COX2アンチセンスプライマー):
CCCGAATTCCACCGCC
配列ID. NO. 50 (PTGS2/COX2スコーピオン):
TGCCGCCGCCGTATCTAATGGCGGCA-BHQ-HEG-GTTTGTTTCGACGTGATTTTTTCGA
配列ID. NO. 51 (PTGS2/COX2アンチセンスプライマー):
GCAAAAAATCCCCTCTCCCGC
配列ID. NO. 52 (14-3-3スコーピオン):
CGGCCTTCGCTCTTCGCAAAAGGCCG-BHQ-HEG-GGTAGTTTTTATGAAAGGCGTCGTG
配列ID. NO. 53 (14-3-3アンチセンスプライマー):
CTAACCGCCCACCACGTT
BHQ=ブラック・ホール・クエンチャー（Black Hole Quencher）(バイオサーチ・テクノロジーズ社（BioSearch Technologies）カリフォルニア州サンフランシスコ)
HEG=ヘキサエチレングリコール
【００４２】
本発明のキットは、全てが、少なくとも1個の本発明のプライマーまたはプローブ、もしくは、検出分子(例、スコーピオンレポーター)を含有するという条件付きで、各種の成分で構成されることができる。ある実施態様では、キットは、過剰メチル化マーカー部分の増幅および検出用試薬を含む。任意に、キットは、サンプルから核酸を抽出するためのサンプル調製試薬および/または調製用品(例、試験管)を含む。
【００４３】
好ましいキットでは、1-試験管MSP（one-tube MSP）に必要な試薬が含まれ、その試薬は、対応するPCRプライマーセット、熱安定DNAポリメラーゼ（Taqポリメラーゼなど)、および適切な検出試薬(加水分解プローブまたは分子ビーコン)などである。任意の好ましいキットでは、検出試薬は、スコーピオンレポーターまたは試薬である。二本鎖DNAに特異的な、臭化エチジウムなど、の単独のダイプライマーまたは蛍光染料も使用できる。当該プライマーは、好ましくは、高濃度を生じる量である。キット中に追加材料を含むことができ、その追加材料は、適切な反応用試験管またはバイアル、バリア組成物、任意にマグネシウムを含む典型的にはワックスビーズ、dNTPなどの必要な緩衝液および試薬、対照核酸および/または任意の追加緩衝液、化合物、補因子、イオン成分、タンパクおよび酵素、ポリマーなどであり、MSP反応で使用可能である。任意に、キットは、核酸抽出試薬および材料を含む。
【００４４】
〔実施例１〕
比較
文献中のプライマーおよびプローブに基づいて、加水分解プローブアッセイをデザインし、臨床的限局性疾患を有する患者の前立腺癌検出の定量的アッセイに向けた。このアッセイは、腫瘍性前立腺組織と非腫瘍性前立腺組織の識別に使用するコアCpGプロモーター領域を含む。
【００４５】
このデザインの検査を受けたプライマーおよび二重標識加水分解プローブ配列は、次のとおりであった：
フォワードプライマー GSTP1；(-192)MU17 AGTTGCGCGGCGATTTC (配列ID. No. 65)
リバースプライマー GSTP1；(-74)ML22 GCCCCAATACTAAATCACGACG (配列ID. No. 20)
プローブ(5'FAM/3'TAMRA)GSTP1；(-152)MP23 CGGTCGACGTTCGGGGTGTAGCG (配列ID. No. 66)
【００４６】
GSTP1メチル化レベルを、良性前立腺過形成(BPH)のサンプル12個、臨床的限局性前立腺腺癌(腫瘍)のサンプル12個、および正常サンプル2個について分析した。データは、検出されたGSTP1の総コピーで表し、図1に示す。本アッセイは、良性サンプルが示した最高コピー数に対してカットオフを設定すると、前立腺腺癌の検出感度75％を示すことが分かった。良性前立腺過形成および臨床的限局性前立腺腺癌を示す前立腺組織のGSTP1メチル化レベルの中等度分布は、別のマーカーで補完せずに、臨床関連性のないアッセイであることを示唆している。
【００４７】
〔実施例２〕
本発明に従った加水分解プローブアッセイ
MSPプライマーおよびプローブをデザインし、GSTP1アッセイの感度および特異性をさらに向上させ、実施例1と同じサンプルセットについて検査した。このデザインは、CpG島のさらに下流に位置し、コアプロモーターおよびエキソン1の一部を包含した。この実施例で検査したプライマーおよび二重標識加水分解プローブ配列は、次のとおりである：
フォワードプライマー：(-71)MU29 CGTGATTTAGTATTGGGGCGGAGCGGGGC (配列ID. No. 23)
リバースプライマー：(+59)ML25 ATCCCCGAAAAACGAACCGCGCGTA (配列ID. No. 24)
プローブ(5'FAM/3'TAMRA)GSTP1：(-23)MP26 TCGGAGGTCGCGAGGTTTTCGTTGGA (配列ID. No. 25)
【００４８】
データは、検出されたGSTP1の総コピーで表し、図2に示す。本アッセイは、良性サンプルが示す最高コピー数に対してカットオフを設定すると、前立腺腺癌の検出感度100％および特異性100％を示すことが分かった。
【００４９】
GSTP1の1.5 kb CpG島は、プロモーターからエキソン3に及び、全体を通して広範囲にメチル化されることが認められている。2個の転写結合部位AP1およびSp1は、エキソン1のすぐ上流に位置しており、SP1内でCpG含量が高いために、この実施例で使用するプローブおよびプライマーデザインの中心(focus)であった。これは、クロマチン縮合と遺伝子サイレンシングを誘導するためには、転写因子とAP1およびSp1部位に結合するメチル-CpG結合タンパクの間の競合によって、アッセイデザインの良好な領域であると判明した。
【００５０】
〔実施例３〕
スコーピオンMSP
以下のマーカーおよび参照マーカー用としてスコーピオン試薬をデザインした：
配列ID. No. 19, 20 (GSTP1)
配列ID. No. 38, 39 (アクチン)
配列ID. No. 28, 29 (RARB2)
配列ID. No. 30, 31 (RASSF1A)
配列ID. No. 32, 33 (TIMP3)
配列ID. No. 34, 35 (APC)
配列ID. No. 50, 51 (PTGS2)
配列ID. No. 52, 53 (14-3-3 シグマ)
【００５１】
オリゴ6プライマーデザインソフトウェア(モレキュラー・バイオロジー・インサイツ（Molecular Biology Insights）米国コロラド州カスケード)およびビジュアルOMP(ＤＮＡソフトウェア・インコーポレーション（DNA Software, Inc.）米国ミシガン州アナーバーウェストワシントンストリート1201/2)を使って、二次構造および不適切な二量化について、デザインを検査した。DNA mfoldプログラム(http://bioinfo.math.rpi.edu/~mfold/dna/forml.cgi)およびビジュアルOMP(ＤＮＡソフトウェア・インコーポレーション（DNA Software, Inc.）米国ミシガン州アナーバーウェストワシントンストリート1201/2)を使って、スコーピオンフォールディングおよびアンプリコンプロービングをモデルにした。標準フォスフォアミダイト化学(スカンジナビアン・ジーン・シンセシスＡＢ（Scandinavian Gene Synthesis AB）スウェーデンショーピング（Koping）)およびバイオサーチ・テクノロジーズ（Biosearch Technologies）(米国カリフォルニア州ナヴァト)を使って、スコーピオンおよびプライマーを、自動DNA合成器で合成した。
【００５２】
〔実施例３〕
スコーピオン試薬の検討
実施例2で述べた試薬を、各種ヒトDNAサンプルについて検査した。これらのサンプルは、市販のメチル化(グアニンに先行する全シトシンが5位でメチル化されている)および非メチル化ヒトゲノムDNA(ケミコン社（Chemicon）米国カリフォルニア州テメキュラ)をそれぞれ陽性テンプレートおよび陰性テンプレートとして含んだ。GSTP1メチル化の陽性および陰性対照としてのヒトの乳癌細胞系MCF-7および結腸直腸癌細胞系HCT116からのゲノムDNAも使用した(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）米国バージニア州マナッサス)。
【００５３】
ゲノムDNAは、市販の亜硫酸水素ナトリウム変換試薬キット(ザイモ・リサーチ（Zymo Research）米国カリフォルニア州オレンジ)を使って修飾した。この処理は、非メチル化DNA中の全シトシンをウラシルに変換したが、メチル化DNAでは、グアニンに先行しないシトシンだけが、ウラシルに変換された。グアニンに先行する全シトシン(CpGジヌクレオチド中)は、シトシンのままであった。
【００５４】
以下の成分を含有する25μL反応液中で、亜硫酸水素ナトリウム修飾ゲノムDNA(100〜150 ng)を増幅した：67mM トリスpH 8.8、16.6mM (NH4)2SO4、6.7mM MgCl2、 10mMベータメルカプトエタノール；1.25mM 各dATP、dCTP、dGTP、dTTP、1 U Hot start Taq DNA ポリメラーゼ、250 nMスコーピオンプローブ、250 nMリバースまたはフォワードプライマー(スコーピオンデザインに応じて)、625 nM の受動参照染料、 ROX (ABI7900操作専用)。
【００５５】
次に、ABI 7900HT配列検出装置および/またはCepheid SmartCycler(登録商標)PCR器具で、定量的リアルタイムPCRアッセイによって、サンプルを検査した。
【００５６】
使用したPCR条件は次のとおりであった：
ABI 7900操作の場合：
950Cで5分間；次に、950Cで30秒間を40サイクル, 590Cで30秒間および720Cで30秒間；最終伸長720Cで5分間。光学データをサイクルごとに590Cで収集した。
Cepheid smart cycler操作の場合：
950Cで60秒間；次に、950Cで30秒間を40サイクル、590Cで30秒間、最終伸長720Cで5分間。光学データをサイクルごとに590Cで収集した。
【００５７】
スコーピオン試薬は、GSTP1試薬の場合、PCR効率91.2％、アクチン試薬の場合95.2％を示した。平均Ct値は、次のとおりであった：
GSTP1 28
B アクチン 30
APC 29
TIMP3 30
RASSF1A 29
RARB2 29
PTGS2 33
14-3-3 S 32
【００５８】
〔実施例４〕
分子ビーコンとの比較
実施例1に記述される遺伝子の一部に沿ったGSTP1過剰メチル化の検出用に分子ビーコンを得た。実施例2に述べられたとおりのサンプルに関するPCR反応にビーコンを適用した。それぞれの場合、メチル化比が得られるように、Bアクチンを同時増幅した。GSTP1およびB-アクチンスコーピオンプローブ−プライマーセットは、ともに、メチル化GSTP1 DNAおよび非メチル化BアクチンDNAの検出の性能の向上を示した。デザインしたスコーピオンセットのCt閾値は、分子ビーコンプローブの場合よりも1.5 Ct以上の向上を示した(平均Ctは、ビーコン28.82対スコーピオンレポーター27.30)。結果は、次のとおりである。
万能メチル化DNA、ng 500 250 100 50 10 5
スコーピオン (GSTP1/Bアクチンコピー数比) 272 310 285 296 339 288
分子ビーコン(GSTP1/Bアクチンコピー数比) 759 735 758 767 797 814
【００５９】
〔実施例５〕
メチル化比カットオフ値
次に、既知の臨床病態の患者からの前立腺組織サンプルを、実施例2に述べたとおりに、PCRに供した。メチル化比を計算し、以下に示す。以下の手順を使って、データを分析した。アルゴリズムを使用する前に、次の前提条件に従った。
アクチン：両複製物でCT値＜40、 (リアルタイムPCR装置が規定したとおり）
「メチル化」GSTP1結果：両複製物でCT値＜40、 (リアルタイムPCR装置によって既定されたとおり）
両標準曲線の傾き−4以上(PCR効率＞80％)
R2：0.99、標準曲線上の4点の関連データ点
陽性アッセイ対照は、陽性結果を生じなければならない。
通常含まれる非テンプレート対照(標準曲線)は、陰性でなければならない。
前提条件が満たされれば、標準曲線に基づいて、遺伝子(GSTP1およびアクチン)毎にコピー数を計算し、以下の式を使って、サンプル毎(陽性対照を含む)に比を計算した：(GSTP1コピー数/β-アクチンコピー数)*1000。次に、高特異性および高感度を生じる比を使ってカットオフ値を確定した。GSTP1でカットオフ値は10で、ホルマリン固定パラフィン封埋前立腺組織142個に対して感度87％および特異性100％を提供した。得られた比を使って、以下の基準を用いて特定サンプルのメチル化状態を決定した。
【表１】
【００６０】
当業者は、カットオフ値が、好ましくは、当業者の使用目的(例、スクリーニング、治療モニタリング、不明瞭な診断の反射的検査)に適したものに感度および特異性の値を設定するように、カットオフ値を調整できることを認識するところとなる。
【００６１】
〔実施例６〕
組み合わせマーカー(机上)
以下の組み合わせ用のスコーピオン試薬を、実施例１に述べるとおりに調製する：GSTP1 マーカーとRARβ2、GSTP1とAPC、GSTP1とPTGS2。病態既知(即ち、正常、良性過形成、前立腺癌)の前立腺組織サンプル50例の繰り返し操作を使って、実施例2に従って多重PCRとして、マーカーを組み合わせて操作する。予想結果を以下に示す。
【表２】
【００６２】
〔実施の態様〕
（１） 増殖性疾患の存在の診断、あるいは、増殖性疾患の経過の予測を行う方法において、
配列ID.No.1〜35および44〜53から成る群から選択される試薬を使用して、生体サンプル中のマーカーのメチル化状態を決定する工程、
を含む、方法。
（２） 実施態様1に記載の方法において、
参照マーカーの存在を測定する工程、
をさらに含む、方法。
（３） 実施態様2に記載の方法において、
前記参照マーカーがBアクチンから成る群から選択される、
方法。
（４） 実施態様2に記載の方法において、
複数のマーカーの組み合わせが使用される、
方法。
（５） 実施態様4に記載の方法において、
前記マーカーの組み合わせが、GSTP1に対するマーカー、および、APC、TIMP、RASSF1A、RARB2、PTGS2または14-3-3に対するマーカーを含む、
方法。
（６） 実施態様4に記載の方法において、
前記マーカー用の試薬が、配列ID.No.1〜35および44〜53から成る群の1員を含む、
方法。
（７） 実施態様1に記載の方法において、
前記サンプルが前立腺組織である、
方法。
（８） 実施態様1に記載の方法において、
前記サンプルが、尿、血清、血漿または循環細胞である、
方法。
（９） 組成物において、
配列ID.No.1〜43から成る群の1員、
を含む、組成物。
（１０） 組成物において、
実施態様10の組成物1個以上の混合物、
を含む、組成物。
（１１） 実施態様1に従ってアッセイを実施するキットにおいて、
核酸増幅試薬および核酸検出試薬、
を含む、キット。
（１２） 実施態様11に記載のキットにおいて、
前記増幅試薬および前記検出試薬が、配列ID.No.1〜43から成る群から選択される、
キット。
（１３） 実施態様12に記載のキットにおいて、
前記増幅試薬および前記検出試薬が、配列ID.No.36〜43から成る群から選択される試薬と共に、配列ID.No.1〜25から選択される、
キット。
（１４） 実施態様11に記載のキットにおいて、
説明書、
をさらに含む、キット。
（１５） 実施態様11に記載のキットにおいて、
前記試薬が、GSTP1およびAPC、TIMP、RASSF1a、RARB2、PTGS2または14-3-3から成る群から選択される遺伝子の過剰メチル化を検出する、
キット。
（１６） 実施態様11に記載のキットにおいて、
構成的発現遺伝子を増幅し、その存在を検出する試薬をさらに含む、
キット。
（１７） 実施態様11に記載のキットにおいて、
構成的発現遺伝子群を増幅し、その構成的発現遺伝子群の存在を検出する試薬、
をさらに含む、キット。
（１８） 実施態様1に記載の方法において、
メチル化比を確定する工程と、
前記メチル化比がカットオフ値を超えるか否かを決定する工程と、
をさらに含む、方法。
（１９） 実施態様1に記載の方法において、
治療モニタリングでの使用のための、方法。
（２０） 実施態様1に記載の方法において、
スクリーニングでの使用のための、方法。
（２１） 実施態様1に記載の方法において、
実施態様1とは異なる方法を使って得られた癌アッセイの不明瞭または不確かな結果を解決する場合に使用するための、方法。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図1は、先行技術のプローブおよびプライマーを使ったMSPCRアッセイの結果のグラフである。
【図２】図2は、本発明に従った加水分解プローブおよびプライマーを使ったMSPCRアッセイの結果のグラフである。
【開示の内容】
【０００１】
〔発明の背景〕
本発明は、癌などの細胞増殖疾患の診断および予後判定アッセイなどの用途におけるメチル化遺伝子の疑問(interrogation)に関する。関連遺伝子は、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GSTPI)遺伝子またはその一部を含む。
【０００２】
高次真核生物ではCpGジヌクレオチドにおいて、DNAは、グアノシンに対して5'に位置するシトシンでのみメチル化される。この修飾は、特に、遺伝子プロモーター領域に位置する富CpG部分（CpG rich areas）(CpG島)を含むと、遺伝子発現に対して重要な調節作用を有する。正常な非メチル化CpG島の異常メチル化は、不死化および形質転換細胞に多発する事象であり、特定の腫瘍サプレッサー遺伝子または特定のヒト癌の改善に関連するその他の遺伝子の転写不活性化に関連付けられている。
【０００３】
グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)は、化学反応求電子剤をグルタチオンに共役させることによって、求電子発癌物質の不活性化を含めて、細胞内解毒反応を触媒する(C.B.Pickettら、「アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー（Annu. Rev. Blocbern.）」58巻:ｐ．743, 1989年; B. Colesら、「ＣＲＣクリティカル・レビュー・オブ・バイオケミカル・アンド・モレキュラー・バイオロジー（CRC Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol.）」25巻: ｐ．47, 1990年; T.H. Rushmoreら、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）」268巻: ｐ．11475, 1993年)。異なる遺伝子座で異なる遺伝子数個によってコード化されるヒトGSTは、アルファ、ミュー、パイおよびシータと称する4科に分類される(B. Mannervikら、「バイオケミカル・ジャーナル（Biochem. J.）」282巻:ｐ．305, 1992年)。前立腺癌および肝臓癌などの多くのヒトの癌は、それらの発生源組織に比較して、GSTP1発現の減少を呈する。
【０００４】
前立腺癌の場合、特に良性前立腺過形成と前立腺癌を区別するメチル化特異的PCR(MSP)プライマーおよびプローブのデザイニングは、複雑であると判明している。公表されている最良のプライマー/プローブセットは、典型的には、アッセイを調整し、100％特異性にすると、約75％までの感度を示し、アッセイを調整し、100％高感度にすると、60％未満の特異性を示す。新規のプライマーおよびプローブの組み合わせによって、さらに頑健で、一貫したアッセイを得ることができる。本発明は、こうした要求を満たす。
【０００５】
〔発明の概要〕
本発明のある態様では、対象者の前立腺組織または他のサンプル中の細胞増殖性疾患を検出する方法は、特定の遺伝子の過剰メチル化領域の増幅および検出に有用な試薬との細胞成分の接触を含む。
【０００６】
本発明の別の態様では、少なくとも1個の当該過剰メチル化遺伝子は、1個以上の他の遺伝子と併用してアッセイすることができるGSTP1である。
【０００７】
本発明の別の態様では、メチル化標的配列を有すると考えられる核酸サンプルを生体サンプルから入手し、当該核酸サンプルを、標的の一部を初回刺激(prime)できる試薬で処理し、当該核酸標的を増幅し、増幅されたサンプルのメチル化度を既知の正常サンプルのメチル化度と比較する。本発明のなおも別の態様では、増幅されたメチル化配列との比較のために、メチル化されている可能性が低い配列を増幅、検出する。
【０００８】
なおも別の態様では、本発明は、細胞増殖性疾患の検出法を提供する。これは、メチル化状態が細胞増殖性疾患を示す遺伝子を増幅することによって実施される。本検出法は、非メチル化シトシンを修飾する物質との核酸含有標本または体液の接触、当該標本中の核酸の、修飾メチル化核酸と非メチル化核酸(modified methylated and nonmethylated nucleic acid)を識別するオリゴヌクレオチドプライマーまたはプライミング配列による増幅、および、増幅中に生じた増幅産物の有無によるメチル化核酸の検出を含むことができる。
【０００９】
本発明の方法は、サンプルのメチル化比の決定を包含する。メチル化比は、罹病状態で過剰メチル化されたマーカー(または、マーカーのある領域)のメチル化レベルの、同一条件下で過剰メチル化されていないマーカーのメチル化レベルに対する(または、同一条件下で過剰メチル化されていない同一マーカーのある領域に対する)比率である。罹病状態で過剰メチル化されているマーカーのメチル化の、過剰メチル化されていない別のマーカーとの比較によってメチル化比を決定する場合、第2のマーカーを参照マーカーと称することができる。
【００１０】
本発明の別の態様では、メチル化比は、定量的リアルタイムPCRによって決定される。
【００１１】
本発明の別の態様では、診断および/または予後判定アッセイ用レポーター分子を提供する。
【００１２】
別の実施態様では、本発明は、メチル化核酸の検出に有用なキットを提供する。キットは、1個以上の容器を含み、非メチル化シトシンを修飾する試薬を含有する第1容器、および、CpG含有核酸の増幅を初回刺激(prime)する試薬で、修飾メチル化核酸と非修飾メチル化核酸を識別する試薬を含有する第2容器である。
【００１３】
本発明のなおも別の態様では、本発明の方法またはその実施用キットによって検出される核酸配列は、プロモーターまたはプロモーターの一部を含む。
【００１４】
本発明のなおも別の態様では、特定の遺伝子のメチル化部分の検出に使用する方法およびキットは、別の核酸の存在をアッセイする段階および/または成分も含む。意図的にメチル化された遺伝子が処理(例、増幅)の影響を受ける程度を、他の核酸のそれと比較し、マーカーのメチル化範囲を決定する。
【００１５】
〔発明の詳細な説明〕
特定の遺伝子の過剰メチル化は、前立腺発癌性と相関する。当該遺伝子または当該遺伝子の一部を含む核酸配列は、本明細書ではマーカーと呼ばれる。マーカーは、次の遺伝子または当該遺伝子の一部を含む核酸を含む。即ち、GSTP1 (配列ID. No. 54)、RARB2 (配列ID. No. 57)、RASSF1A (配列ID. No. 64)、TIMP3 (配列ID. No. 58)、APC (プロモーター= 配列ID No. 59、遺伝子= 配列ID.No. 60)、ベータ-アクチン (配列ID. No.55 および56)、PTGS2 (プロモーター= 配列ID. No.61、遺伝子= 配列ID. No. 62)および14-3-3 シグマ(配列ID. No.63)である。
【００１６】
前記過剰メチル化を検出するアッセイは、MSPおよび制限エンドヌクレアーゼ分析などの技術を含む。プロモーター領域は、当該過剰メチル化分析の検出のための特に注目に値する標的である。GSTP1のプロモーター領域の配列分析は、ヌクレオチドの72％近くがCGであり、約10％がCpGジヌクレオチドであることを示す。
【００１７】
本発明は、対象者の組織または他の生体サンプル中のマーカーの特定領域のメチル化状態を決定する方法で、増殖性疾患に関連するDNAを増幅、検出する方法を提供する。マーカーによってコード化されたタンパクレベルの減少(即ち、転写減少)は、プロモーターなどの特定領域の過剰メチル化の結果であることがしばしばあるので、当該領域が過剰メチル化されているかどうかを決定するのが望ましい。GSTP1遺伝子の場合は、これが最も確実に見られる。過剰メチル化領域は、正常組織に比較して、罹病組織のサンプルの方が統計的に有意に高い程度までメチル化される領域である。
【００１８】
本発明の目的上、特定のマーカー領域に特異的な核酸プローブまたはレポーターを使って、体液または組織中のマーカー遺伝子のメチル化領域の存在を検出する。PCRなどの技術によるDNA増幅には、当該マーカー配列の特定部分に基づいたオリゴヌクレオチドプライマーが特に有用である。検出可能な量の関連ポリヌクレオチドを含有する標本なら、どれでも使用できる。本発明の好ましい標本は、泌尿生殖器由来組織、特に前立腺組織である。好ましくは、サンプルは、上皮細胞を含有する。
【００１９】
本発明のプライマー/プローブまたはレポーター試薬を数種類使用して、マーカー遺伝子の発現抑制配列(expression control sequences)のメチル化を検出する。これらは、核酸配列の転写、ある場合は、翻訳を調節する核酸配列である。よって、発現抑制配列は、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、開始コドン(即ち、ATG)、イントロンスプライシングシグナル、mRNAの適正な翻訳を可能にするためのその遺伝子の正確なリーディングフレームの維持、および停止コドンに関与する配列を含むことができる。
【００２０】
GSTP1プロモーターは、有用なマーカーに典型的な発現抑制配列である。それは、遺伝子の転写に指示し、グルタチオン-S-トランスフェラーゼタンパクを産生できるポリヌクレオチド配列である。プロモーター領域は、構造遺伝子の上流、または5'に位置する。細胞型特異的、組織特異的な外部シグナルまたは作用物質に対して調節可能な、または、外部シグナルまたは作用物質によって誘導可能なプロモーター依存性遺伝子発現を提供するのに十分なエレメントを含むことができる。当該エレメントは、ポリヌクレオチド配列の5'または3'領域に位置することができる。
【００２１】
本発明のある方法は、マーカーを含有する標的細胞の、核酸に結合する試薬との接触を含む。標的細胞成分は、DNAまたはRNAなどの核酸である。試薬は、PCRまたはMSPプライマーなどのプローブおよびプライマー、あるいは、標的配列を増幅および検出するように構成された他の分子を含むことができる。例えば、試薬は、スコーピオン試薬またはスコーピオンレポーターと呼ばれるものなど、それ自体のレポーター部分に組み合わされた、または、結合されたプライミング配列を含むことができ、Whitcombeらへの米国特許第6,326,145号および第6,270,967号に記述されている(参照することによって、そのまま本明細書に組み入れられている)。「プライマー」および「プライミング配列」という用語は、同一ではないが、本明細書では、核酸配列の増幅を初回刺激する分子または分子の一部を示す際に使用することができる。
【００２２】
メチル化パターンを検出する、ある高感度な方法は、メチル化感受性酵素とポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の使用の組み合わせに関する。DNAを当該酵素で消化した後、DNA開裂がメチル化で防止される場合のみ、制限部位に隣接するプライマーから、PCRを増幅させる。本発明のPCRプライマーをデザインする典型的な標的領域は、GSTP1の転写開始部位からM24485(Genbank)のゲノム位置番号に従った-71〜+59bpあたりにある領域に隣接するプライマーを含む。
【００２３】
本発明の方法は、非メチル化シトシンを修飾する作用物質との核酸含有標本の接触、CpG特異的オリゴヌクレオチドプライマーによる当該標本中のCpG含有核酸の増幅、およびメチル化核酸の検出も含むことができる。好ましい修飾は、非メチル化シトシンの別のヌクレオチドへの変換で、これが、非メチル化シトシンをメチル化シトシンから識別することになる。好ましくは、作用物質は、非メチル化シトシンを修飾してウラシルとし、亜硫酸水素ナトリウムであるが、非メチル化シトシンを修飾するが、メチル化シトシンは修飾しない他の作用物質も使用できる。亜硫酸水素ナトリウム(NaHSO3)修飾は、最も好ましく、シトシンの5,6-二重結合と容易に反応するが、メチル化シトシンとは反応しにくい。シトシンは、亜硫酸イオンと反応し、脱アミノ化に感受性を示すスルフォン化シトシン反応中間体を形成し、スルフォン化ウラシルを生じる。スルフォン酸基は、アルカリ条件下で取り除くことができ、ウラシルを形成できる。ウラシルは、Taqポリメラーゼによってチミンとして認識され、そのため、PCR時、生じた産物は、5-メチルシトシンが開始テンプレートに起こる位置にのみシトシンを含有する。スコーピオンレポーターおよび試薬、および他の検出系は、このように処理された非修飾種から修飾種を同様に識別する。
【００２４】
標本中のCpG含有核酸の増幅に本発明で使用するプライマーは、修飾(亜硫酸塩による)後に、具体的には、未処理DNA、メチル化DNAと非メチル化DNAを識別する。メチル化特異的PCR (MSPCR)では、非メチル化DNA用プライマーまたはプライミング配列は、好ましくは3'CGペア中にTを有し、メチル化DNAに保持されるCとそれを識別し、補完物(compliment)が、アンチセンスプライマー用にデザインされる。非メチル化DNA用MSPプライマーまたはプライミング配列は、通常、その配列に比較的少数のCまたはGを含有する。それは、Cがセンスプライマー中に存在しなくなり、Gがアンチセンスプライマーに存在しなくなる(Cは修飾されてU（ウラシル)になり、これが増幅産物中でT(チミジン)として増幅される)からである。
【００２５】
本発明のプライマーは、多形遺伝子座の多数の核酸への特異的重合開始を提供するために十分な長さと適切な配列のオリゴヌクレオチドである。本発明のプライマーによって増幅される配列は、本発明のプローブまたはレポーターに曝露されると、メチル化状態とそれによる診断情報を示す。それらは、先行技術のものよりも高感度で、特異的である。
【００２６】
本発明のプライマーは、最も好ましくは、多形遺伝子座鎖に実質的に相補的なプライマー伸長産物の合成を開始できるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド8個以上である。合成につながる環境条件は、ヌクレオシドトリフォスフェートおよび重合用剤、例えばDNAポリメラーゼ、の存在および適切な温度とpHを含む。プライマーまたはプライミング配列のプライミング部分は、好ましくは増幅で最大効率を挙げる一本鎖であるが、二本鎖であることができる。二本鎖の場合には、伸長産物の調製に使用する前に、プライマーを、最初に、処理して当該二本鎖を分離する。プライマーは、重合誘導剤の存在下で伸長産物の合成を開始（prime）するのに十分な長さがなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、緩衝液、ヌクレオチド組成などの要因に依存することになる。オリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくは周知のデザイン指針または規則に従って、約12〜20個のヌクレオチドを含有するのが最も好ましいが、含有するヌクレオチドはそれより多くても少なくてもよい。
【００２７】
本発明のプライマーは、増幅対象ゲノム遺伝子座の各鎖に実質的に相補的であるようにデザインされ、上記のように、適切なGまたはCヌクレオチドを含む。これは、重合用剤の実施を可能にする条件下でプライマーはそれぞれの鎖とハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならないことを意味する。言い換えれば、プライマーは、ゲノム遺伝子座をハイブリダイズし、ゲノム遺伝子座の増幅を可能にするのに十分な、5'および3'フランキング配列との相補性を有する必要がある。
【００２８】
本発明のプライマーは、増幅プロセスに用いられる。即ち、関与する反応段階数に比べて、さらに多くの標的遺伝子座量を産生する反応(好ましくは、酵素的連鎖反応)である。最も好ましい実施態様では、当該反応は、指数的に増加した標的遺伝子座量を生じる。これらなどの反応は、PCR反応を含む。典型的には、あるプライマーは、遺伝子座のマイナス鎖に相補的であり、別のプライマーは、プラス鎖に相補的である。変性核酸へのプライマーのアニーリングとそれに続く酵素、DNAポリメラーゼI(Klenow)の大型断片およびヌクレオチドなど、による伸長は、標的遺伝子座配列を含有する＋鎖と−鎖を新たに合成する。当該連鎖反応の産物は、用いられた特異的プライマー末端に対応する末端を有する離散核酸二重らせんである。
【００２９】
本発明のプライマーは、自動化法を含む普通のフォスフォトリエステル（phosphotriester）およびフォスフォジエステル（phosphodiester）法など、どの適切な方法によっても調製できる。当該自動化の、ある実施態様では、開始材としてジエチルフォスフォアミダイト（diethylphosphoramidites）が使用され、これは、Beaucageら (Tetrahedron Letters, 22: 1859-1862, 1981年)が記述するとおりに合成できる。修飾固相支持体上でのオリゴヌクレオチドの合成法は、米国特許第4,458,066に記述されている。
【００３０】
標的遺伝子座(例、CpG)を含有する特定核酸配列を含有する、あるいは、含有すると考えられる、という条件付きで、開始核酸または核酸群として、精製済み、未精製の形態の、どの核酸標本でも利用できる。よって、前記プロセスは、例えば、DNAまたはメッセンジャーRNAを含むRNAを用いることができる。DNAまたはRNAは、一本鎖であることも、二本鎖であることもできる。テンプレートとしてRNAを使用しなければならない場合、テンプレートをDNAに逆転写するのに最適な酵素および/または条件を用いる。さらに、それぞれの一方の鎖を含有するDNA-RNAハイブリッドを利用できる。核酸混合物も使用でき、あるいは、同一または異なるプライマーを使った本明細書の先の増幅反応で産生される核酸も利用できる。増幅対象の特定核酸配列、即ち標的遺伝子座は、大型分子の一部分であることができ、あるいは、特定配列が核酸全体を構成するように、初めに離散分子として存在することができる。
【００３１】
メチル化CpGの検出に使用される核酸含有標本は、組織(特に、前立腺組織およびリンパ組織)、血液、リンパ、尿および射精などの任意の発生源から得ることができ、Maniatisら(「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」コールド・スプリング・ハーバー研究所出版会、ニューヨーク pp280, 281, 1982年)によって述べられているようなものなど、各種技術によって抽出することができる。
【００３２】
抽出されたサンプルが不純である場合、当該サンプルの細胞、体液、組織または動物細胞膜を開き、核酸鎖を露出および/または分離するのに有効な試薬量で、増幅する前に、処理することができる。この、当該核酸鎖を露出および分離する溶解および核酸変性段階が、増幅をはるかに容易に起こさせる。
【００３３】
サンプルの標的核酸配列が2本鎖を含有する場合、テンプレートとして使用できる前に、当該核酸鎖を分離することが必要である。鎖分離は、個別の段階として、もしくは、プライマー伸長産物の合成と同時に行うことができる。この鎖分離は、物理的、化学的または酵素的手段を含む各種の適切な変性条件を使って達成できる。核酸鎖の、ある物理的分離法は、変性するまでの核酸の加熱を含む。典型的熱変性は、10分間までの約80〜105℃の範囲の温度を含む。核酸鎖の分離は、ヘリカーゼとして知られる酵素クラスの酵素、または、ヘリカーゼ活性を有し、リボATPの存在下でDNAを変性させることが知られている酵素RecAによっても誘導できる。ヘリカーゼを使った核酸の鎖分離に適した反応条件は、Kuhn Hoffmann-Berling(「ＣＳＨ‐クオンティテイティブ・バイオロジー（CSH-Quantitative Biology）」43巻:ｐ．63, 1978年)によって記述されている。RecA使用技術は、C. Radding(「アニュアル・レビュー・オブ・ジェネティクス（Ann. Rev. Genetics）」16:405-437, 1982)で再検討されている。これらの技術の改良もまた、現在、周知である。
【００３４】
核酸または核酸群の相補鎖を分離する場合、核酸が元々二本鎖であったか、一本鎖であったかにかかわらず、分離された鎖は、別の核酸鎖の合成にテンプレートとして容易に使用できる。この合成は、プライマーのテンプレートへのハイブリダイゼーションを起こす条件下で実施される。一般に合成は、緩衝水溶液中、好ましくはpH 7〜9、最も好ましくは約8で起こる。過剰モル(ゲノム核酸に対して、通常約108：1、プライマー：テンプレート)の2個のオリゴヌクレオチドプライマーを、好ましくは、分離テンプレート鎖含有緩衝液に添加する。相補鎖量は、本発明のプロセスを診断応用に使用する場合、明らかでない可能性があるので、必ずしも相補鎖量に対するプライマー量を確実に測定できるわけではない。しかし、実際問題として、添加されるプライマー量は、一般に、複合的長鎖核酸鎖の混合物に増幅対象の配列が含有される場合、相補鎖（テンプレート)量を上回る過剰モルになる。当該プロセスの効率を向上させるには、大過剰モルが好ましい。
【００３５】
デオキシリボヌクレオシド三リン酸 dATP、dCTP、dGTP、およびdTTPは、適切な量で個別に、もしくは、プライマーとともに、合成混合物に添加し、生じた溶液を約90〜100℃に、10分間まで、好ましくは1〜4分間加熱する。この加熱期間後、当該溶液を、プライマーハイブリダイゼーションに好ましい室温まで冷却できる。冷却された混合物にプライマー伸長反応を引き起こす適当な物質を添加し(重合用剤)、技術上周知の条件下で反応させる。重合用剤は、熱安定性であれば、他の試薬と合わせて添加することもできる。この合成(即ち、増幅)反応は、重合用剤がもはや機能しなくなる温度までの室温で行うことができる。
【００３６】
重合用剤は、プライマー伸長産物の合成を達成するように機能するいずれかの化合物または系、好ましくは酵素であることができる。この目的に適した酵素は、例えばE.coliDNAポリメラーゼ１、E.coliDNAポリメラーゼIのKlenow断片、T4 DNAポリメラーゼ、他の利用可能なDNAポリメラーゼ、ポリメラーゼミューテイン（polymerase muteins）、逆転写酵素、および、熱安定酵素(例、十分な上昇温に供し、変性を引き起こした後にプライマー伸長を行う酵素)を含めた他の酵素を含む。好ましい重合用剤は、Taqポリメラーゼである。適切な酵素は、各遺伝子座の核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物を形成するのに適した方法でヌクレオチドの配合を促進する。一般に、当該合成は、各プライマーの3'末端で開始され、テンプレート鎖に沿って5'方向に進み、合成が終了するまで、異なる長さの分子を生じる。しかし、上記のものと同じプロセスを使って、5'末端で合成を開始し、他の方向に進行させる重合用剤が可能である。
【００３７】
最も好ましくは、増幅法は、PCRによる。本発明のプライマーを使ってPCRにより増幅されたメチル化および非メチル化遺伝子座が、代替手段によって、同様に増幅される限り、この代替手段も用いることができる。
【００３８】
増幅された産物は、好ましくは、Mullisらへの米国特許第4,683,195号に記述される産物に特異的なプローブまたはレポーターでメチル化体または非メチル化体として同定される。当該特許は、参照することによってそのまま本明細書に組み入れられている。ポリヌクレオチド検出用プローブおよびレポーターの分野の進歩は、当業者に周知である。任意に、核酸のメチル化パターンを、制限酵素の消化およびサザンブロット分析などの他の技術によって確認できる。5'CpGメチル化の検出に使用できるメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼの例は、SmaI、SacII、EagI、MspI、HpaII、BstUI およびBssHIIを含む。
【００３９】
本発明の最も好ましい方法は、メチル化比の確定を含む。これは、達成されたマーカーの増幅メチル化種の量と増幅参照マーカーまたは増幅非メチル化マーカー領域の量の比を確定することによって実施できる。これは、定量的リアルタイムPCRを使用すると、最も適切に実施される。既定の、または、所定のカットオフまたは閾値を上回る比は、過剰メチル化され、癌(GSTP1の場合は前立腺癌)などの増殖性疾患を有することを示す、と見なされる。カットオフは、既知法に従って確定され、当該方法は、罹病状態が既知のサンプルおよび正常状態が既知のサンプルの少なくとも2セットのサンプル、について実施される。本発明の参照マーカーは、内部対照としても使用できる。当該参照マーカーは、好ましくは、Bアクチンなどのサンプル細胞中に構成的に発現される遺伝子である。
【００４０】
本発明の方法およびキットは、多重化用の段階および試薬を含むことができる。即ち、1個以上のマーカーを一度にアッセイできる。
【００４１】
マーカーに結合する遺伝子の転写レベルの減少は、ポリヌクレオチド配列および/または発現抑制配列(例、プロモーター配列)の特定のエレメントの過剰メチル化の結果であるので、それらの配列に適合するように調製されたプライマーを準備した。従って、本発明は、マーカーの発現抑制またはプロモーター領域内の特定部分のメチル化を検出することによって細胞増殖性疾患を検出または診断する方法を提供する。これらの部分のメチル化の検出に有用なプローブは、当該診断または予後判定法に有用である。マーカーの検出に好ましい分子を以下に示す。マーカー遺伝子の略名を、用いる検出系のタイプとともに括弧内に示す。アンチセンスは、結合されるペアの他方のプライミング配列と関連してそのように指定したプライマーの配向を示すにすぎない。それは、必ずしもゲノムDNAに対するアンチセンスではない。
配列ID. NO. 1 (GSTP1スコーピオン):
CCCCGAACGTCGACCGCTCGGGG-BHQ-HEG-CGATTTCGGGGATTTTAGGGCGT
配列ID. NO. 2 (GSTP1スコーピオンアンチセンスプライマー):
AAAATCCCGCGAACTCCCGCC
配列ID. NO. 3 (GSTP1スコーピオン):
CCCGAACGTCGACCGCTTTCGGG-BHQ-HEG-CGATTTCGGGGATTTTAGGGCGT
配列ID. NO. 4 (GSTP1 スコーピオンアンチセンスプライマー):
AAAATCCCGCGAACTCCCGCC
配列ID. NO. 5 (GSTP1スコーピオン):
CGGCGGGAGTTCGCGGGCGCCG-BHQ-HEG-ACTAAATCACGACGCCGACCGC
配列ID. NO. 6 (GSTP1 スコーピオンアンチセンスプライマー):
CGGTTAGTTGCGCGGCGATTTC
配列ID. NO. 7 (GSTP1スコーピオン):
CGGGAGTTCGCGGGTCCCG-BHQ-HEG-ACTAAATCACGACGCCGACCGC
配列ID. NO. 8 (GSTP1 スコーピオンアンチセンスプライマー):
CGGTTAGTTGCGCGGCGATTTC
配列ID. NO. 9 (GSTP1スコーピオン):
GTGGTTGATGTTTGGGGTATCAACCAC-BHQ-HEG_AATCCCACAAACTCCCACCAACC
配列ID. NO. 10 (GSTP1 スコーピオンアンチセンスプライマー):
GTGGTGATTTTGGGGATTTTAGGGTGT
配列ID. NO. 11 (GSTP1 スコーピオン):
ACCCCAGTGGTTGATGTTTGGGGT-BHQ-HEG-AATCCCACAAACTCCCACCAACC
配列ID. NO. 12 (GSTP1 スコーピオンアンチセンスプライマー):
GTGGTGATTTTGGGGATTTTAGGGTGT
配列ID. NO. 13 (GSTP1スコーピオン):
CCCCACAGGTTGGTGGGAGTTTGTGGGG-BHQ-HEG-CCCAATACTAAATCACAACACCAACCAC
配列ID. NO. 14 (GSTP1 スコーピオンアンチセンスプライマー):
TGGTTAGTTGTGTGGTGATTTTGGGGA
配列ID. NO. 15 (GSTP1スコーピオン):
CCCCGAACGTCGACCGCTCGGGG-BHQ-HEG- CGATTTCGGGGATTTTAGGGCGT
配列ID. NO. 16 (GSTP1 スコーピオンアンチセンスプライマー):
AAAATCCCGCGAACTCCCGCC
配列ID. NO. 17 (GSTP1スコーピオン):
CGCACGCCGAACGTCGACCGCAAACGTGCG-BHQ-HEG-CGATTTCGGGGATTTTAGGGCGT
配列ID. NO. 18 (GSTP1スコーピオンアンチセンスプライマー):
AAAATCCCGCGAACTCCCGCC
配列ID. NO. 19 (GSTP1スコーピオン):
CGCACGGCGAACTCCCGCCGACGTGCG BHQ-HEG-
TGTAGCGGTCGTCGGGGTTG
配列ID. NO. 20 (GSTP1 スコーピオンアンチセンスプライマー):
GCCCCAATACTAAATCACGACG
配列ID. NO. 21 (GSTP1スコーピオン):
CCGACGCACAAAAAAACACCCTAAAATCCGTCGG-BHQ-HEG-GGTTAGTTGTGTGGTGATTTT
配列ID. NO. 22 (GSTP1 スコーピオンアンチセンスプライマー):
CACAACACCAACCACTCTTC
配列ID. NO. 23 (GSTP1 TAQMAN プライマー):
CGTGATTTAGTATTGGGGCGGAGCGGGGC
配列ID. NO. 24 (GSTP1 TAQMAN プライマー):
ATCCCCGAAAAACGAACCGCGCGTA
配列ID. NO. 25 (GSTP1 TAQMAN プローブ):
TCGGAGGTCGCGAGGTTTTCGTTGGA
配列ID. NO. 26 (RARB2スコーピオン):
GCCGCCGTCGAGAACGCGAGCGGGCGGC-BHQ-HEG-TACCCCGACGATACCCAAAC
配列ID. NO. 27 (RARB2 スコーピオンアンチセンスプライマー):
GGGATTAGAATTTTTTATGCGAGTTGT
配列ID. NO. 28 (RARB2スコーピオン):
CGGCAGGATTGGGATGTCGAGCTGCCG-BHQ-HEG-TACCCCGACGATACCCAAAC
配列ID. NO. 29 (RARB2 スコーピオンアンチセンスプライマー):
GGGATTAGAATTTTTTATGCGAGTTGT
配列ID. NO. 30 (RASSF1Aスコーピオン):
GCCGCGGTTTCGTTCGGTTCGCGGC-BHQ-HEG-CCCGTACTTCGCTAACTTTAAACG
配列ID. NO. 31 (RASSF1A スコーピオンアンチセンスプライマー):
GCGTTGAAGTCGGGGTTC
配列ID. NO. 32 (TIMP3スコーピオン):
GCGGCGAGTTCGGGTTGTAGCGCCGC-BHQ-HEG-CGCCTCTCCAAAATTACCGTAC
配列ID. NO. 33 (TIMP3 スコーピオンアンチセンスプライマー):
GCGTCGGAGGTTAAGGTTGTT
配列ID. NO. 34 (APCスコーピオン):
GCCGGCGGGTTTTCGACGGGCCGGC-BHQ-HEG-CGAACCAAAACGCTCCCCA
配列ID. NO. 35 (APC スコーピオンアンチセンスプライマー):
GTCGGTTACGTGCGTTTATATTTAG
配列ID. NO. 36 (アクチンスコーピオン):
GCGCCCAACCGCACAAGGGCGC-BHQ-HEG-GGGTATATTTTCGAGGGGTACG
配列ID. NO. 37 (アクチン スコーピオンアンチセンスプライマー):
CGACCCGCACTCCGCAAT
配列ID. NO. 38(アクチンスコーピオン):
CCGCGCATCACCACCCCACACGCGCGG-BHQ-HEG-GGAGTATATAGGTTGGGGAAGTTTG
配列ID. NO. 39 (アクチン スコーピオンアンチセンスプライマー):
AACACACAATAACAAACACAAATTCAC
配列ID. NO. 40 (アクチンスコーピオン):
CCCGGCTAAACCCACCATCCAGCCGGG-BHQ-HEG-GGGAGGGTAGTTTAGTTGTGGTT
配列ID. NO. 41 (アクチン スコーピオンアンチセンスプライマー):
CAAAACAAAAAAACTAAATCTACACAACC
配列ID. NO. 42 (アクチンスコーピオン):
CCGCGGAACATTCAACTCAACCGCGG-BHQ-HEG-GGAGGAGGAAGGTAGGTTTTT
配列ID. NO. 43 (アクチン スコーピオンアンチセンスプライマー):
ACATACAACAATCAATAACATAAAACCAC
配列ID. NO. 44 (PTGS2/COX2スコーピオン):
CACGCCGCCGTATCTAGGCGTG-BHQ-HEG-GTTTGTTTCGACGTGATTTTTTCGA
配列ID. NO. 45 (PTGS2/COX2アンチセンスプライマー):
GCAAAAAATCCCCTCTCCCGC
配列ID. NO. 46 (PTGS2/COX2スコーピオン):
GCCGCGCACAAATTTCCGCGGC-BHQ-HEG-GAATTGGTTTTCGGAAGCGTTCG
配列ID. NO. 47 (PTGS2/COX2アンチセンスプライマー):
CCCGAATTCCACCGCC
配列ID. NO. 48 (PTGS2/COX2スコーピオン):
GGCGGAACGCACAAATTTCCGCC-BHQ-HEG-GAATTGGTTTTCGGAAGCGTTCG
配列ID. NO. 49 (PTGS2/COX2アンチセンスプライマー):
CCCGAATTCCACCGCC
配列ID. NO. 50 (PTGS2/COX2スコーピオン):
TGCCGCCGCCGTATCTAATGGCGGCA-BHQ-HEG-GTTTGTTTCGACGTGATTTTTTCGA
配列ID. NO. 51 (PTGS2/COX2アンチセンスプライマー):
GCAAAAAATCCCCTCTCCCGC
配列ID. NO. 52 (14-3-3スコーピオン):
CGGCCTTCGCTCTTCGCAAAAGGCCG-BHQ-HEG-GGTAGTTTTTATGAAAGGCGTCGTG
配列ID. NO. 53 (14-3-3アンチセンスプライマー):
CTAACCGCCCACCACGTT
BHQ=ブラック・ホール・クエンチャー（Black Hole Quencher）(バイオサーチ・テクノロジーズ社（BioSearch Technologies）カリフォルニア州サンフランシスコ)
HEG=ヘキサエチレングリコール
【００４２】
本発明のキットは、全てが、少なくとも1個の本発明のプライマーまたはプローブ、もしくは、検出分子(例、スコーピオンレポーター)を含有するという条件付きで、各種の成分で構成されることができる。ある実施態様では、キットは、過剰メチル化マーカー部分の増幅および検出用試薬を含む。任意に、キットは、サンプルから核酸を抽出するためのサンプル調製試薬および/または調製用品(例、試験管)を含む。
【００４３】
好ましいキットでは、1-試験管MSP（one-tube MSP）に必要な試薬が含まれ、その試薬は、対応するPCRプライマーセット、熱安定DNAポリメラーゼ（Taqポリメラーゼなど)、および適切な検出試薬(加水分解プローブまたは分子ビーコン)などである。任意の好ましいキットでは、検出試薬は、スコーピオンレポーターまたは試薬である。二本鎖DNAに特異的な、臭化エチジウムなど、の単独のダイプライマーまたは蛍光染料も使用できる。当該プライマーは、好ましくは、高濃度を生じる量である。キット中に追加材料を含むことができ、その追加材料は、適切な反応用試験管またはバイアル、バリア組成物、任意にマグネシウムを含む典型的にはワックスビーズ、dNTPなどの必要な緩衝液および試薬、対照核酸および/または任意の追加緩衝液、化合物、補因子、イオン成分、タンパクおよび酵素、ポリマーなどであり、MSP反応で使用可能である。任意に、キットは、核酸抽出試薬および材料を含む。
【００４４】
〔実施例１〕
比較
文献中のプライマーおよびプローブに基づいて、加水分解プローブアッセイをデザインし、臨床的限局性疾患を有する患者の前立腺癌検出の定量的アッセイに向けた。このアッセイは、腫瘍性前立腺組織と非腫瘍性前立腺組織の識別に使用するコアCpGプロモーター領域を含む。
【００４５】
このデザインの検査を受けたプライマーおよび二重標識加水分解プローブ配列は、次のとおりであった：
フォワードプライマー GSTP1；(-192)MU17 AGTTGCGCGGCGATTTC (配列ID. No. 65)
リバースプライマー GSTP1；(-74)ML22 GCCCCAATACTAAATCACGACG (配列ID. No. 20)
プローブ(5'FAM/3'TAMRA)GSTP1；(-152)MP23 CGGTCGACGTTCGGGGTGTAGCG (配列ID. No. 66)
【００４６】
GSTP1メチル化レベルを、良性前立腺過形成(BPH)のサンプル12個、臨床的限局性前立腺腺癌(腫瘍)のサンプル12個、および正常サンプル2個について分析した。データは、検出されたGSTP1の総コピーで表し、図1に示す。本アッセイは、良性サンプルが示した最高コピー数に対してカットオフを設定すると、前立腺腺癌の検出感度75％を示すことが分かった。良性前立腺過形成および臨床的限局性前立腺腺癌を示す前立腺組織のGSTP1メチル化レベルの中等度分布は、別のマーカーで補完せずに、臨床関連性のないアッセイであることを示唆している。
【００４７】
〔実施例２〕
本発明に従った加水分解プローブアッセイ
MSPプライマーおよびプローブをデザインし、GSTP1アッセイの感度および特異性をさらに向上させ、実施例1と同じサンプルセットについて検査した。このデザインは、CpG島のさらに下流に位置し、コアプロモーターおよびエキソン1の一部を包含した。この実施例で検査したプライマーおよび二重標識加水分解プローブ配列は、次のとおりである：
フォワードプライマー：(-71)MU29 CGTGATTTAGTATTGGGGCGGAGCGGGGC (配列ID. No. 23)
リバースプライマー：(+59)ML25 ATCCCCGAAAAACGAACCGCGCGTA (配列ID. No. 24)
プローブ(5'FAM/3'TAMRA)GSTP1：(-23)MP26 TCGGAGGTCGCGAGGTTTTCGTTGGA (配列ID. No. 25)
【００４８】
データは、検出されたGSTP1の総コピーで表し、図2に示す。本アッセイは、良性サンプルが示す最高コピー数に対してカットオフを設定すると、前立腺腺癌の検出感度100％および特異性100％を示すことが分かった。
【００４９】
GSTP1の1.5 kb CpG島は、プロモーターからエキソン3に及び、全体を通して広範囲にメチル化されることが認められている。2個の転写結合部位AP1およびSp1は、エキソン1のすぐ上流に位置しており、SP1内でCpG含量が高いために、この実施例で使用するプローブおよびプライマーデザインの中心(focus)であった。これは、クロマチン縮合と遺伝子サイレンシングを誘導するためには、転写因子とAP1およびSp1部位に結合するメチル-CpG結合タンパクの間の競合によって、アッセイデザインの良好な領域であると判明した。
【００５０】
〔実施例３〕
スコーピオンMSP
以下のマーカーおよび参照マーカー用としてスコーピオン試薬をデザインした：
配列ID. No. 19, 20 (GSTP1)
配列ID. No. 38, 39 (アクチン)
配列ID. No. 28, 29 (RARB2)
配列ID. No. 30, 31 (RASSF1A)
配列ID. No. 32, 33 (TIMP3)
配列ID. No. 34, 35 (APC)
配列ID. No. 50, 51 (PTGS2)
配列ID. No. 52, 53 (14-3-3 シグマ)
【００５１】
オリゴ6プライマーデザインソフトウェア(モレキュラー・バイオロジー・インサイツ（Molecular Biology Insights）米国コロラド州カスケード)およびビジュアルOMP(ＤＮＡソフトウェア・インコーポレーション（DNA Software, Inc.）米国ミシガン州アナーバーウェストワシントンストリート1201/2)を使って、二次構造および不適切な二量化について、デザインを検査した。DNA mfoldプログラム(http://bioinfo.math.rpi.edu/~mfold/dna/forml.cgi)およびビジュアルOMP(ＤＮＡソフトウェア・インコーポレーション（DNA Software, Inc.）米国ミシガン州アナーバーウェストワシントンストリート1201/2)を使って、スコーピオンフォールディングおよびアンプリコンプロービングをモデルにした。標準フォスフォアミダイト化学(スカンジナビアン・ジーン・シンセシスＡＢ（Scandinavian Gene Synthesis AB）スウェーデンショーピング（Koping）)およびバイオサーチ・テクノロジーズ（Biosearch Technologies）(米国カリフォルニア州ナヴァト)を使って、スコーピオンおよびプライマーを、自動DNA合成器で合成した。
【００５２】
〔実施例３〕
スコーピオン試薬の検討
実施例2で述べた試薬を、各種ヒトDNAサンプルについて検査した。これらのサンプルは、市販のメチル化(グアニンに先行する全シトシンが5位でメチル化されている)および非メチル化ヒトゲノムDNA(ケミコン社（Chemicon）米国カリフォルニア州テメキュラ)をそれぞれ陽性テンプレートおよび陰性テンプレートとして含んだ。GSTP1メチル化の陽性および陰性対照としてのヒトの乳癌細胞系MCF-7および結腸直腸癌細胞系HCT116からのゲノムDNAも使用した(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）米国バージニア州マナッサス)。
【００５３】
ゲノムDNAは、市販の亜硫酸水素ナトリウム変換試薬キット(ザイモ・リサーチ（Zymo Research）米国カリフォルニア州オレンジ)を使って修飾した。この処理は、非メチル化DNA中の全シトシンをウラシルに変換したが、メチル化DNAでは、グアニンに先行しないシトシンだけが、ウラシルに変換された。グアニンに先行する全シトシン(CpGジヌクレオチド中)は、シトシンのままであった。
【００５４】
以下の成分を含有する25μL反応液中で、亜硫酸水素ナトリウム修飾ゲノムDNA(100〜150 ng)を増幅した：67mM トリスpH 8.8、16.6mM (NH4)2SO4、6.7mM MgCl2、 10mMベータメルカプトエタノール；1.25mM 各dATP、dCTP、dGTP、dTTP、1 U Hot start Taq DNA ポリメラーゼ、250 nMスコーピオンプローブ、250 nMリバースまたはフォワードプライマー(スコーピオンデザインに応じて)、625 nM の受動参照染料、 ROX (ABI7900操作専用)。
【００５５】
次に、ABI 7900HT配列検出装置および/またはCepheid SmartCycler(登録商標)PCR器具で、定量的リアルタイムPCRアッセイによって、サンプルを検査した。
【００５６】
使用したPCR条件は次のとおりであった：
ABI 7900操作の場合：
950Cで5分間；次に、950Cで30秒間を40サイクル, 590Cで30秒間および720Cで30秒間；最終伸長720Cで5分間。光学データをサイクルごとに590Cで収集した。
Cepheid smart cycler操作の場合：
950Cで60秒間；次に、950Cで30秒間を40サイクル、590Cで30秒間、最終伸長720Cで5分間。光学データをサイクルごとに590Cで収集した。
【００５７】
スコーピオン試薬は、GSTP1試薬の場合、PCR効率91.2％、アクチン試薬の場合95.2％を示した。平均Ct値は、次のとおりであった：
GSTP1 28
B アクチン 30
APC 29
TIMP3 30
RASSF1A 29
RARB2 29
PTGS2 33
14-3-3 S 32
【００５８】
〔実施例４〕
分子ビーコンとの比較
実施例1に記述される遺伝子の一部に沿ったGSTP1過剰メチル化の検出用に分子ビーコンを得た。実施例2に述べられたとおりのサンプルに関するPCR反応にビーコンを適用した。それぞれの場合、メチル化比が得られるように、Bアクチンを同時増幅した。GSTP1およびB-アクチンスコーピオンプローブ−プライマーセットは、ともに、メチル化GSTP1 DNAおよび非メチル化BアクチンDNAの検出の性能の向上を示した。デザインしたスコーピオンセットのCt閾値は、分子ビーコンプローブの場合よりも1.5 Ct以上の向上を示した(平均Ctは、ビーコン28.82対スコーピオンレポーター27.30)。結果は、次のとおりである。
万能メチル化DNA、ng 500 250 100 50 10 5
スコーピオン (GSTP1/Bアクチンコピー数比) 272 310 285 296 339 288
分子ビーコン(GSTP1/Bアクチンコピー数比) 759 735 758 767 797 814
【００５９】
〔実施例５〕
メチル化比カットオフ値
次に、既知の臨床病態の患者からの前立腺組織サンプルを、実施例2に述べたとおりに、PCRに供した。メチル化比を計算し、以下に示す。以下の手順を使って、データを分析した。アルゴリズムを使用する前に、次の前提条件に従った。
アクチン：両複製物でCT値＜40、 (リアルタイムPCR装置が規定したとおり）
「メチル化」GSTP1結果：両複製物でCT値＜40、 (リアルタイムPCR装置によって既定されたとおり）
両標準曲線の傾き−4以上(PCR効率＞80％)
R2：0.99、標準曲線上の4点の関連データ点
陽性アッセイ対照は、陽性結果を生じなければならない。
通常含まれる非テンプレート対照(標準曲線)は、陰性でなければならない。
前提条件が満たされれば、標準曲線に基づいて、遺伝子(GSTP1およびアクチン)毎にコピー数を計算し、以下の式を使って、サンプル毎(陽性対照を含む)に比を計算した：(GSTP1コピー数/β-アクチンコピー数)*1000。次に、高特異性および高感度を生じる比を使ってカットオフ値を確定した。GSTP1でカットオフ値は10で、ホルマリン固定パラフィン封埋前立腺組織142個に対して感度87％および特異性100％を提供した。得られた比を使って、以下の基準を用いて特定サンプルのメチル化状態を決定した。
【表１】
【００６０】
当業者は、カットオフ値が、好ましくは、当業者の使用目的(例、スクリーニング、治療モニタリング、不明瞭な診断の反射的検査)に適したものに感度および特異性の値を設定するように、カットオフ値を調整できることを認識するところとなる。
【００６１】
〔実施例６〕
組み合わせマーカー(机上)
以下の組み合わせ用のスコーピオン試薬を、実施例１に述べるとおりに調製する：GSTP1 マーカーとRARβ2、GSTP1とAPC、GSTP1とPTGS2。病態既知(即ち、正常、良性過形成、前立腺癌)の前立腺組織サンプル50例の繰り返し操作を使って、実施例2に従って多重PCRとして、マーカーを組み合わせて操作する。予想結果を以下に示す。
【表２】
【００６２】
〔実施の態様〕
（１） 増殖性疾患の存在の診断、あるいは、増殖性疾患の経過の予測を行う方法において、
配列ID.No.1〜35および44〜53から成る群から選択される試薬を使用して、生体サンプル中のマーカーのメチル化状態を決定する工程、
を含む、方法。
（２） 実施態様1に記載の方法において、
参照マーカーの存在を測定する工程、
をさらに含む、方法。
（３） 実施態様2に記載の方法において、
前記参照マーカーがBアクチンから成る群から選択される、
方法。
（４） 実施態様2に記載の方法において、
複数のマーカーの組み合わせが使用される、
方法。
（５） 実施態様4に記載の方法において、
前記マーカーの組み合わせが、GSTP1に対するマーカー、および、APC、TIMP、RASSF1A、RARB2、PTGS2または14-3-3に対するマーカーを含む、
方法。
（６） 実施態様4に記載の方法において、
前記マーカー用の試薬が、配列ID.No.1〜35および44〜53から成る群の1員を含む、
方法。
（７） 実施態様1に記載の方法において、
前記サンプルが前立腺組織である、
方法。
（８） 実施態様1に記載の方法において、
前記サンプルが、尿、血清、血漿または循環細胞である、
方法。
（９） 組成物において、
配列ID.No.1〜43から成る群の1員、
を含む、組成物。
（１０） 組成物において、
実施態様10の組成物1個以上の混合物、
を含む、組成物。
（１１） 実施態様1に従ってアッセイを実施するキットにおいて、
核酸増幅試薬および核酸検出試薬、
を含む、キット。
（１２） 実施態様11に記載のキットにおいて、
前記増幅試薬および前記検出試薬が、配列ID.No.1〜43から成る群から選択される、
キット。
（１３） 実施態様12に記載のキットにおいて、
前記増幅試薬および前記検出試薬が、配列ID.No.36〜43から成る群から選択される試薬と共に、配列ID.No.1〜25から選択される、
キット。
（１４） 実施態様11に記載のキットにおいて、
説明書、
をさらに含む、キット。
（１５） 実施態様11に記載のキットにおいて、
前記試薬が、GSTP1およびAPC、TIMP、RASSF1a、RARB2、PTGS2または14-3-3から成る群から選択される遺伝子の過剰メチル化を検出する、
キット。
（１６） 実施態様11に記載のキットにおいて、
構成的発現遺伝子を増幅し、その存在を検出する試薬をさらに含む、
キット。
（１７） 実施態様11に記載のキットにおいて、
構成的発現遺伝子群を増幅し、その構成的発現遺伝子群の存在を検出する試薬、
をさらに含む、キット。
（１８） 実施態様1に記載の方法において、
メチル化比を確定する工程と、
前記メチル化比がカットオフ値を超えるか否かを決定する工程と、
をさらに含む、方法。
（１９） 実施態様1に記載の方法において、
治療モニタリングでの使用のための、方法。
（２０） 実施態様1に記載の方法において、
スクリーニングでの使用のための、方法。
（２１） 実施態様1に記載の方法において、
実施態様1とは異なる方法を使って得られた癌アッセイの不明瞭または不確かな結果を解決する場合に使用するための、方法。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図1は、先行技術のプローブおよびプライマーを使ったMSPCRアッセイの結果のグラフである。
【図２】図2は、本発明に従った加水分解プローブおよびプライマーを使ったMSPCRアッセイの結果のグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
増殖性疾患の存在の診断、あるいは、増殖性疾患の経過の予測を行う方法において、
配列ID.No.1〜35および44〜53から成る群から選択される試薬を使用して、生体サンプル中のマーカーのメチル化状態を決定する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
請求項1に記載の方法において、
参照マーカーの存在を測定する工程、
をさらに含む、方法。
【請求項３】
請求項2に記載の方法において、
前記参照マーカーがBアクチンから成る群から選択される、
方法。
【請求項４】
請求項2に記載の方法において、
複数のマーカーの組み合わせが使用される、
方法。
【請求項５】
請求項4に記載の方法において、
前記マーカーの組み合わせが、GSTP1に対するマーカー、および、APC、TIMP、RASSF1A、RARB2、PTGS2または14-3-3に対するマーカーを含む、
方法。
【請求項６】
請求項4に記載の方法において、
前記マーカー用の試薬が、配列ID.No.1〜35および44〜53から成る群の1員を含む、
方法。
【請求項７】
請求項1に記載の方法において、
前記サンプルが前立腺組織である、
方法。
【請求項８】
請求項1に記載の方法において、
前記サンプルが、尿、血清、血漿または循環細胞である、
方法。
【請求項９】
組成物において、
配列ID.No.1〜43から成る群の1員、
を含む、組成物。
【請求項１０】
組成物において、
請求項10の組成物1個以上の混合物、
を含む、組成物。
【請求項１１】
請求項1に従ってアッセイを実施するキットにおいて、
核酸増幅試薬および核酸検出試薬、
を含む、キット。
【請求項１２】
請求項11に記載のキットにおいて、
前記増幅試薬および前記検出試薬が、配列ID.No.1〜43から成る群から選択される、
キット。
【請求項１３】
請求項12に記載のキットにおいて、
前記増幅試薬および前記検出試薬が、配列ID.No.36〜43から成る群から選択される試薬と共に、配列ID.No.1〜25から選択される、
キット。
【請求項１４】
請求項11に記載のキットにおいて、
説明書、
をさらに含む、キット。
【請求項１５】
請求項11に記載のキットにおいて、
前記試薬が、GSTP1およびAPC、TIMP、RASSF1a、RARB2、PTGS2または14-3-3から成る群から選択される遺伝子の過剰メチル化を検出する、
キット。
【請求項１６】
請求項11に記載のキットにおいて、
構成的発現遺伝子を増幅し、その存在を検出する試薬をさらに含む、
キット。
【請求項１７】
請求項11に記載のキットにおいて、
構成的発現遺伝子群を増幅し、その構成的発現遺伝子群の存在を検出する試薬、
をさらに含む、キット。
【請求項１８】
請求項1に記載の方法において、
メチル化比を確定する工程と、
前記メチル化比がカットオフ値を超えるか否かを決定する工程と、
をさらに含む、方法。
【請求項１９】
請求項1に記載の方法において、
治療モニタリングでの使用のための、方法。
【請求項２０】
請求項1に記載の方法において、
スクリーニングでの使用のための、方法。
【請求項２１】
請求項1に記載の方法において、
請求項1とは異なる方法を使って得られた癌アッセイの不明瞭または不確かな結果を解決する場合に使用するための、方法。
【請求項１】
増殖性疾患の存在の診断、あるいは、増殖性疾患の経過の予測を行う方法において、
配列ID.No.1〜35および44〜53から成る群から選択される試薬を使用して、生体サンプル中のマーカーのメチル化状態を決定する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
請求項1に記載の方法において、
参照マーカーの存在を測定する工程、
をさらに含む、方法。
【請求項３】
請求項2に記載の方法において、
前記参照マーカーがBアクチンから成る群から選択される、
方法。
【請求項４】
請求項2に記載の方法において、
複数のマーカーの組み合わせが使用される、
方法。
【請求項５】
請求項4に記載の方法において、
前記マーカーの組み合わせが、GSTP1に対するマーカー、および、APC、TIMP、RASSF1A、RARB2、PTGS2または14-3-3に対するマーカーを含む、
方法。
【請求項６】
請求項4に記載の方法において、
前記マーカー用の試薬が、配列ID.No.1〜35および44〜53から成る群の1員を含む、
方法。
【請求項７】
請求項1に記載の方法において、
前記サンプルが前立腺組織である、
方法。
【請求項８】
請求項1に記載の方法において、
前記サンプルが、尿、血清、血漿または循環細胞である、
方法。
【請求項９】
組成物において、
配列ID.No.1〜43から成る群の1員、
を含む、組成物。
【請求項１０】
組成物において、
請求項10の組成物1個以上の混合物、
を含む、組成物。
【請求項１１】
請求項1に従ってアッセイを実施するキットにおいて、
核酸増幅試薬および核酸検出試薬、
を含む、キット。
【請求項１２】
請求項11に記載のキットにおいて、
前記増幅試薬および前記検出試薬が、配列ID.No.1〜43から成る群から選択される、
キット。
【請求項１３】
請求項12に記載のキットにおいて、
前記増幅試薬および前記検出試薬が、配列ID.No.36〜43から成る群から選択される試薬と共に、配列ID.No.1〜25から選択される、
キット。
【請求項１４】
請求項11に記載のキットにおいて、
説明書、
をさらに含む、キット。
【請求項１５】
請求項11に記載のキットにおいて、
前記試薬が、GSTP1およびAPC、TIMP、RASSF1a、RARB2、PTGS2または14-3-3から成る群から選択される遺伝子の過剰メチル化を検出する、
キット。
【請求項１６】
請求項11に記載のキットにおいて、
構成的発現遺伝子を増幅し、その存在を検出する試薬をさらに含む、
キット。
【請求項１７】
請求項11に記載のキットにおいて、
構成的発現遺伝子群を増幅し、その構成的発現遺伝子群の存在を検出する試薬、
をさらに含む、キット。
【請求項１８】
請求項1に記載の方法において、
メチル化比を確定する工程と、
前記メチル化比がカットオフ値を超えるか否かを決定する工程と、
をさらに含む、方法。
【請求項１９】
請求項1に記載の方法において、
治療モニタリングでの使用のための、方法。
【請求項２０】
請求項1に記載の方法において、
スクリーニングでの使用のための、方法。
【請求項２１】
請求項1に記載の方法において、
請求項1とは異なる方法を使って得られた癌アッセイの不明瞭または不確かな結果を解決する場合に使用するための、方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００７−７５１１４（Ｐ２００７−７５１１４Ａ）
【公開日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００６−２４９６６３（Ｐ２００６−２４９６６３）
【出願日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【出願人】（５０５０６０３４７）ベリデックス・エルエルシー (43)
【氏名又は名称原語表記】Ｖｅｒｉｄｅｘ，ＬＬＣ
【住所又は居所原語表記】３３ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｒｉｖｅ，Ｗａｒｒｅｎ，ＮＪ ０７０５９，Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２４９６６３（Ｐ２００６−２４９６６３）
【出願日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【出願人】（５０５０６０３４７）ベリデックス・エルエルシー (43)
【氏名又は名称原語表記】Ｖｅｒｉｄｅｘ，ＬＬＣ
【住所又は居所原語表記】３３ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｒｉｖｅ，Ｗａｒｒｅｎ，ＮＪ ０７０５９，Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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