遺伝子発現調節エレメントのハイスループットでの特徴付けのための機能性アレイ
本発明は、生物のゲノム、特にヒトゲノム中の遺伝子発現調節エレメントの大規模な構造および機能の特徴づけのための組成物、キット、アセンブリ、ライブラリー、アレイ、および高処理方法を提供する。本発明の１つの態様では、各発現構築物が、レポーター配列の発現が核酸セグメントの転写調節下にあるように発現ベクター中のレポーター配列に作動可能に連結された核酸セグメント、ライブラリー中で変動し、多様度が少なくとも５０である核酸セグメントを含む、発現構築物のアレイを提供する。核酸セグメントは、転写プロモーターなどの遺伝子発現調節エレメントの巨大なライブラリーであり得る。本発明は、個別化医療、薬理ゲノミクス、および多形性と表現型形質との相関関係などに広範で多様に適用することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
発現構築物のライブラリーであって、該ライブラリーの各メンバーがゲノム由来の異なる核酸セグメントを含み、該セグメントが発現ベクター中の異種レポーター配列に作動可能に連結された転写調節配列を含み、その結果、該レポーター配列の発現が該転写調節配列の転写制御下にあり、
（ａ）該ライブラリーは、少なくとも５０の異なる核酸セグメントという多様度を有し、
（ｂ）各核酸セグメントは、該ゲノム中でｃＤＮＡとして発現される配列に天然では連結しており、
（ｃ）該ライブラリー中の核酸セグメントの平均長が少なくとも６００ヌクレオチドである、発現構築物のライブラリー。
【請求項２】
前記ライブラリー中の核酸セグメントの平均長が、７００ヌクレオチドと１２００ヌクレオチドとの間である、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項３】
前記ライブラリー中の核酸セグメントの平均長が、８００ヌクレオチドと１１００ヌクレオチドとの間である、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項４】
前記ライブラリー中の核酸セグメントの少なくとも９０％が、７００ヌクレオチドと１３００ヌクレオチドとの間の長さを有する、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項５】
各核酸セグメントが、転写開始部位の上流に少なくとも５００ヌクレオチド含む、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項６】
前記核酸セグメントのうちの５％以下が、ｃＤＮＡアラインメント人工産物に天然に結合されている、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項７】
前記ライブラリーが、ゲノム中の各転写調節配列の転写調節下で遺伝子を天然に示すための指標がついている、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項８】
前記レポーター配列が、同一のレポーター分子をコードする、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項９】
前記レポーター配列が、発光レポーター分子、蛍光レポーター分子、または比色分子をコードする、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項１０】
各レポーター配列が、可視シグナルをレポートする所定の独特のヌクレオチドバーコードおよび／またはレポーターを含む、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項１１】
前記ゲノムが哺乳動物ゲノムである、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項１２】
前記ゲノムがヒトゲノムである、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項１３】
前記ゲノムがマウスゲノムである、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項１４】
前記核酸セグメントの多様度が少なくとも１００である、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項１５】
前記核酸セグメントの多様度が少なくとも５００である、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項１６】
前記発現構築物がプラスミドまたはウイルス構築物である、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項１７】
前記核酸セグメントが、配列番号１〜４５０９６、もしくはそのフラグメント、またはそれらに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の相同性を有する配列を有する核酸からなる群から選択されるＤＮＡセグメントのうちの少なくとも２つを含む、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項１８】
単離された核酸分子のライブラリーであって、該ライブラリーの各メンバーは、ゲノム由来の異なる所定の核酸セグメントを含み、該セグメントが転写調節配列を含み、
（ａ）該ライブラリーは、少なくとも５０の異なる核酸セグメントという多様度を有し、
（ｂ）各核酸セグメントは、該ゲノム中でｃＤＮＡとして発現される配列に天然では連結しており、
（ｃ）該ライブラリー中の核酸セグメントの平均長が少なくとも６００ヌクレオチドである、ライブラリー。
【請求項１９】
組換え核酸分子のライブラリーであって、該ライブラリーの各メンバーは、異種核酸分子に連結したゲノム由来の異なる所定の核酸セグメントを含み、該セグメントが転写調節配列を含み、
（ａ）該ライブラリーは、少なくとも５０の異なる核酸セグメントという多様度を有し、
（ｂ）各核酸セグメントは、該ゲノム中でｃＤＮＡとして発現される配列に天然では連結しており、
（ｃ）該ライブラリー中の核酸セグメントの平均長が少なくとも６００ヌクレオチドである、組換え核酸分子のライブラリー。
【請求項２０】
前記核酸分子が、前記セグメントの５’側に隣接する制限部位と３’側に隣接する制限部位との対を含む、請求項１９に記載のライブラリー。
【請求項２１】
前記核酸分子が、増幅に使用することができるＰＣＲプライマーに相補的なセグメントの５’末端に隣接する制限部位と３’末端に隣接する制限部位との対を含む、請求項１９に記載のライブラリー。
【請求項２２】
細胞のライブラリーであって、該細胞のライブラリー中の各細胞が発現構築物のライブラリーの異なるメンバーを含み、該発現構築物のライブラリーの各メンバーがゲノム由来の異なる核酸セグメントを含み、該セグメントが発現ベクター中の異種レポーター配列に作動可能に連結された転写調節配列を含み、その結果、該レポーター配列の発現が転写調節配列の転写制御下にあり、
（ａ）該ライブラリーは、少なくとも５０の異なる核酸セグメントという多様度を有し、
（ｂ）各核酸セグメントは、該ゲノム中でｃＤＮＡとして発現される配列に天然では連結しており、
（ｃ）該ライブラリー中の核酸セグメントの平均長が少なくとも６００ヌクレオチドである、細胞のライブラリー。
【請求項２３】
前記細胞がヒト細胞である、請求項２２に記載のライブラリー。
【請求項２４】
前記細胞が非ヒト細胞である、請求項２２に記載のライブラリー。
【請求項２５】
細胞内に発現構築物のライブラリーを含む細胞のコレクションであって、該発現構築物のライブラリーの各メンバーがゲノム由来の異なる核酸セグメントを含み、該セグメントが発現ベクター中の異なる異種レポーター配列に作動可能に連結された転写調節配列を含み、その結果、該レポーター配列の発現が転写調節配列の転写調節下にある、細胞のコレクション。
【請求項２６】
前記異なる発現構築物を含む細胞が同定可能なバイアルまたはウェル中に存在する、請求項２５に記載の細胞のコレクション。
【請求項２７】
（ａ）前記ライブラリーは、少なくとも５０の異なる核酸セグメントという多様度を有し、
（ｂ）各核酸セグメントは、該ゲノム中でｃＤＮＡとして発現される配列に天然では連結しており、
（ｃ）該ライブラリー中の核酸セグメントの平均長が少なくとも６００ヌクレオチドである、請求項２５に記載の細胞のコレクション。
【請求項２８】
複数のウェルを含む少なくとも１つのプレートを含むデバイスであって、各ウェルが発現構築物のライブラリーの異なるメンバーを含み、各発現構築物がゲノム由来の異なる核酸セグメントを含み、該セグメントが発現ベクター中の異種レポーター配列に作動可能に連結された転写調節配列を含み、その結果、該レポーター配列の発現が該転写調節配列の転写制御下にあり、各メンバーがウェル中の既知の位置を有する、デバイス。
【請求項２９】
（ａ）前記ライブラリーは、少なくとも５０の異なる核酸セグメントという多様度を有し、
（ｂ）各核酸セグメントは、該ゲノム中でｃＤＮＡとして発現される配列に天然では連結しており、
（ｃ）前記ライブラリー中の核酸セグメントの平均長が少なくとも６００ヌクレオチドである、請求項２８に記載のデバイス。
【請求項３０】
前記構築物が、乾燥核酸の形態であるかまたは溶けている、請求項２８に記載のデバイス。
【請求項３１】
前記構築物が、トランスフェクションマトリックスの組み合わせの状態にある、請求項３０に記載のデバイス。
【請求項３２】
９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、または１５３６ウェルプレートを含む、請求項２８に記載のデバイス。
【請求項３３】
前記遺伝子発現調節エレメントが、配列番号１〜４５０９６、もしくはそのフラグメント、またはそれらに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の相同性を有する配列を有する核酸からなる群から選択されるＤＮＡセグメントのうちの少なくとも２つを含む、請求項２８に記載のデバイス。
【請求項３４】
複数のウェルを含む少なくとも１つのプレートを含むデバイスであって、各ウェルが細胞のライブラリーの異なるメンバーを含み、細胞のライブラリー中の各細胞が発現構築物のライブラリーの異なるメンバーを含み、各発現構築物がゲノム由来の異なる核酸セグメントを含み、該セグメントが発現ベクター中の異種レポーター配列に作動可能に連結された転写調節配列を含み、その結果、該レポーター配列の発現が転写調節配列の転写制御下にあり、前記細胞のライブラリーの各メンバーがウェル中の既知の位置を有する、デバイス。
【請求項３５】
（ａ）前記発現構築物のライブラリーは、少なくとも５０の異なる核酸セグメントという多様度を有し、
（ｂ）各核酸セグメントは、該ゲノム中でｃＤＮＡとして発現される配列に天然では連結しており、
（ｃ）該ライブラリー中の核酸セグメントの平均長が少なくとも６００ヌクレオチドである、請求項３４に記載のデバイス。
【請求項３６】
標的遺伝子発現調節エレメントの生物機能を特徴づけるためのキットであって、
（ａ）複数のウェルを含む少なくとも１つのプレートを含むデバイスであって、各ウェルが発現構築物のライブラリーの異なるメンバーを含み、各発現構築物がゲノム由来の異なる核酸セグメントを含み、該セグメントが発現ベクター中の異種レポーター配列に作動可能に連結された転写調節配列を含み、その結果、該レポーター配列の発現が転写調節配列の転写制御下にあり、各メンバーがウェル中の既知の位置を有する、デバイス、および
（ｂ）レポーターアッセイ基質
を含む、キット。
【請求項３７】
標的遺伝子発現調節エレメントの生物機能を特徴づけるための説明書をさらに含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
表面および前記表面にそれぞれ異なる既知の位置に固定された核酸分子を含む固体基板を含むデバイスであって、各分子が転写調節配列を含むゲノムセグメント由来の少なくとも１０ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、該デバイスが少なくとも５０の異なるゲノムセグメント由来の転写調節配列を含む、デバイス。
【請求項３９】
各核酸セグメントは、該ゲノム中でｃＤＮＡとして発現される配列に天然では連結している、請求項３８に記載のデバイス。
【請求項４０】
前記遺伝子発現調節エレメントが、配列番号１〜４５０９６またはそのフラグメントからなる群から選択されるＤＮＡセグメントのうちの少なくとも２つを含む、請求項３８に記載のデバイス。
【請求項４１】
前記分子が６０ヌクレオチド以下の長さである、請求項３８に記載のデバイス。
【請求項４２】
前記各ゲノムセグメントが複数の分子を含むセットにより表され、該セット中の各分子がゲノムセグメント由来の異なるヌクレオチド配列を含む、請求項３８に記載のデバイス。
【請求項４３】
（ａ）請求項３４に記載のデバイス、
（ｂ）該デバイスの各ウェル中で発現されたレポーター配列由来のシグナルを検出するように適合された読み取り装置、
を含むシステム。
【請求項４４】
前記デバイスが、所定のシグナルレベルを提供する複数のコントロール構築物を含み、前記システムが、（ｃ）（ｉ）該コントロール構築物由来のシグナルに基づいてプレートの全ウェル由来のシグナルを規準化するアルゴリズムを実行するコードを含むソフトウェアをさらに含む、請求項４３に記載のシステム。
【請求項４５】
請求項４４に記載のアルゴリズムを実行するコードを含むソフトウェア。
【請求項４６】
（ａ）複数のウェルを含む少なくとも１つのプレートを含むデバイスを提供する工程であって、各ウェルが細胞のライブラリーの異なるメンバーを含み、該細胞のライブラリー中の各細胞が発現構築物のライブラリーの異なるメンバーを含み、各発現構築物がゲノム由来の異なる核酸セグメントを含み、前記セグメントが発現ベクター中の異種レポーター配列に作動可能に連結された転写調節配列を含み、その結果、該レポーター配列の発現が該転写調節配列の転写制御下にあり、該細胞のライブラリーの各メンバーがウェル中の既知の位置を有する、提供する工程、
（ｂ）該細胞を培養する工程、および
（ｃ）各ウェル中のレポーター配列の発現レベルを測定する工程
を含む、方法。
【請求項４７】
（ｉ）前記ライブラリーは、少なくとも５０の異なる核酸セグメントという多様度を有し、
（ｉｉ）各核酸セグメントは、該ゲノム中でｃＤＮＡとして発現される配列に天然では連結しており、
（ｉｉｉ）前記ライブラリー中の核酸セグメントの平均長が少なくとも６００ヌクレオチドである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記デバイスを提供する工程が、
（ｉ）複数のウェルを含む少なくとも１つのプレートを含むデバイスを提供する工程であって、各ウェルが発現構築物のライブラリーの異なるメンバーを含み、該発現構築物のライブラリーの各メンバーがウェル中の既知の位置を有する、工程、
（ｉｉ）該ウェルの各々に細胞を送達する工程、
（ｉｉｉ）該発現構築物で該細胞をトランスフェクションする工程を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
（ｄ）各ウェル中で前記細胞を撹乱する工程、
（ｅ）各ウェル中の前記レポーター配列の発現レベルを測定する工程、および
（ｆ）任意のウェル中の発現レベルが該細胞と試験化合物との接触後に変化したかどうかを決定する工程
をさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
前記撹乱する工程が、各ウェル中の前記細胞を試験化合物と接触させる工程、該細胞を異なる環境条件に曝露する工程、変異の誘導などによって持続的または一過性に該細胞を遺伝子改変する工程、例えばｃＤＮＡでのトランスフェクションによって転写産物を過剰発現させる工程、またはｓｉＲＮＡによって転写産物の発現を減少させる工程を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記レポーター配列がレポーター分子をコードし、前記レポーター配列の発現の測定が該レポーター分子の発現の測定を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項５２】
（ａ）第１のデバイスおよび第２のデバイスを提供する工程であって、各デバイスが複数のウェルを含む少なくとも１つのプレートを含み、前記各ウェルが細胞のライブラリーの異なるメンバーを含み、該細胞のライブラリー中の各細胞が発現構築物のライブラリーの異なるメンバーを含み、各発現構築物がゲノム由来の異なる核酸セグメントを含み、該セグメントが発現ベクター中の異種レポーター配列に作動可能に連結された転写調節配列を含み、その結果、該レポーター配列の発現が該転写調節配列の転写制御下にあり、該細胞のライブラリーの各メンバーがウェル中の既知の位置に存在し、前記第１のデバイスおよび第２のデバイスが同じタイプの細胞を含み、前記発現構築物のライブラリーが該第１のデバイスおよび該第２のデバイスで同一である、工程、
（ｂ）該第１のデバイスおよび該第２のデバイスの細胞を異なる培養条件下で培養する工程、
（ｃ）各ウェル中の該レポーター配列の発現レベルを測定する工程、および
（ｄ）該レポーター配列の発現レベルを前記第１の細胞型と第２の細胞型との間で各転写調節配列と比較する工程
を含む、方法。
【請求項５３】
前記異なる培養条件が、前記第１のデバイスの細胞の培養物中に存在しない化合物の存在下で前記第２のデバイスの細胞を培養する工程を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
（ａ）第１のデバイスおよび第２のデバイスを提供する工程であって、各デバイスが複数のウェルを含む少なくとも１つのプレートを含み、各ウェルが細胞のライブラリーの異なるメンバーを含み、該細胞のライブラリー中の各細胞が発現構築物のライブラリーの異なるメンバーを含み、各発現構築物がゲノム由来の異なる核酸セグメントを含み、該セグメントが発現ベクター中の異種レポーター配列に作動可能に連結された転写調節配列を含み、その結果、該レポーター配列の発現が該転写調節配列の転写制御下にあり、該細胞のライブラリーの各メンバーがウェル中の既知の位置を有し、該第１のデバイスが第１の型の細胞を含み、第２のデバイスが第２の型の細胞を含み、該発現構築物のライブラリーが該第１のデバイスおよび該第２のデバイスで同一である、提供する工程、
（ｂ）該第１のデバイスおよび該第２のデバイスの細胞を培養する工程、
（ｃ）各ウェル中の該レポーター配列の発現レベルを測定する工程、および
（ｄ）該レポーター配列の発現レベルを該第１の細胞型と該第２の細胞型との間で各転写調節配列と比較する工程
を含む、方法。
【請求項５５】
（ｉ）前記ライブラリーは、少なくとも５０の異なる核酸セグメントという多様度を有し、
（ｉｉ）各核酸セグメントは、該ゲノム中でｃＤＮＡとして発現される配列に天然では連結しており、
（ｉｉｉ）該ライブラリー中の核酸セグメントの平均長が少なくとも６００ヌクレオチドである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記デバイスを提供する工程が、
（ｉ）デバイスを提供する工程であって、各デバイスが、複数のウェルを含む少なくとも１つのプレートを含み、各ウェルが発現構築物のライブラリーの異なるメンバーを含み、該発現構築物のライブラリーの各メンバーがウェル中の既知の位置を有する、工程、
（ｉｉ）該ウェルの各々に細胞を送達す工程、
（ｉｉｉ）該発現構築物で該細胞をトランスフェクションするかまたは感染させる工程を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
請求項４６に記載の方法によって測定された構築物由来の発現レベルを評価するための方法であって、
（ａ）コントロールレポーター構築物セットを含む細胞セットを提供する工程であって、各コントロールレポーター構築物が前記異種レポーター配列に作動可能に連結されたランダムゲノムフラグメントを含む、提供する工程、
（ｂ）各細胞中の該レポーター配列の発現レベルを測定する工程、
（ｃ）該コントロール構築物間の発現レベルの平均値または平均を決定する工程、
（ｄ）各試験構築物の発現レベルについて、平均値または平均からの統計的距離を決定する工程、および
（ｅ）偏差が統計的に有意であるかどうかを決定する工程
を含む、方法。
【請求項５８】
前記偏差が標準偏差である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ランダムゲノムフラグメントが、実験フラグメントと同一サイズの分布のゲノムから選択されるランダムフラグメントである、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記ランダムゲノムフラグメントが、タンパク質コード遺伝子の中間エキソン由来のランダムフラグメントであり、該中間エキソンがタンパク質をコードし、その長さが少なくとも実験フラグメントのサイズであり、且つ前記ゲノム中の既知の転写開始部位から少なくとも５，０００塩基または１０，０００塩基である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
活性および有意性を、以下の式：Ｚスコアプロモーター活性＝（未加工のプロモーター活性−ランダムコントロールの平均値）／ランダムコントロールの標準偏差によってＺスコアとして計算する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
請求項５７に記載の平均値および偏差を決定するアルゴリズムを実行するコードを含むソフトウェア。
【請求項６３】
Ｚスコア変換プロモーター活性データを、ＤＮＡメチル化実験由来のＺスコア変換機能データ、転写因子結合データ、ヒストン修飾データ、ＤＮアーゼ高感受性データ、ヌクレオソーム置換データ、または遺伝子発現データと統合する分析ソフトウェア。
【請求項６４】
核酸配列中のメチル化パターンを決定するための方法であって、
（ａ）第１の標識核酸セグメントセットを、
（ｉ）供給源由来の配列を含む核酸分子を得ること、および
（ｉｉ）単離核酸分子を第１の標識で標識することにより、標識により、前記第１の標識核酸セグメントセットが作製されること、
によって作製する工程；
（ｂ）第２の標識核酸セグメントセットを、
（ｉ）該供給源由来のヌクレオチド配列を有する核酸分子を得ること、
（ｉｉ）該核酸分子を、異なる認識配列を有する少なくとも３つのメチル感受性制限酵素と接触させ、該酵素が非メチル化認識配列において核酸分子を切断するが、メチル化認識部位では切断されず、それにより、核酸フラグメントが得られること、
（ｉｉｉ）混合物から少なくとも１００ヌクレオチドの核酸フラグメントを単離すること、および
（ｉｖ）該フラグメントを第２の異なる標識で標識することにより、標識により、前記第２の核酸セグメントセットが作製されること、
によって作製する工程；
（ｃ）該第１の標識セグメントおよび該第２の標識セグメントを、前記ヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の核酸プローブとハイブリッド形成する工程、および
（ｄ）該第１の標識セグメントおよび該第２の標識セグメントによって識別的に標識されたヌクレオチド配列の領域を決定する工程であって、該識別的に標識された領域が該ヌクレオチド配列の非メチル化領域である、決定する工程
を含む、方法。
【請求項６５】
前記核酸分子が転写調節配列を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記核酸分子を少なくとも６つの異なるメチル感受性酵素と接触させる工程を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記第１の標識が第１の色を生じ、前記第２の標識が第２の異なる色を生じる、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記セグメントを、前記核酸分子のヌクレオチド配列をタイル状に配置する複数のプローブとハイブリッド形成する工程を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
前記方法を２回目に第２の供給源由来の核酸を使用して行う工程をさらに含み、前記第１の供給源および前記第２の供給源が、健康な組織および罹患組織であるか、または２つの異なるタイプの罹患組織である、請求項６４に記載の方法。
【請求項７０】
ビジネス方法であって、
（ａ）請求項１、請求項１８、請求項１９、請求項２２、請求項２５、請求項２８、請求項３４、請求項３７、請求項４２、請求項４４、請求項４５、請求項５１、請求項５３、請求項５６、請求項６１、請求項６３、および請求項６３のいずれか１項に記載の組成物、デバイス、または方法を商業化する工程
を含む、方法。
【請求項１】
発現構築物のライブラリーであって、該ライブラリーの各メンバーがゲノム由来の異なる核酸セグメントを含み、該セグメントが発現ベクター中の異種レポーター配列に作動可能に連結された転写調節配列を含み、その結果、該レポーター配列の発現が該転写調節配列の転写制御下にあり、
（ａ）該ライブラリーは、少なくとも５０の異なる核酸セグメントという多様度を有し、
（ｂ）各核酸セグメントは、該ゲノム中でｃＤＮＡとして発現される配列に天然では連結しており、
（ｃ）該ライブラリー中の核酸セグメントの平均長が少なくとも６００ヌクレオチドである、発現構築物のライブラリー。
【請求項２】
前記ライブラリー中の核酸セグメントの平均長が、７００ヌクレオチドと１２００ヌクレオチドとの間である、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項３】
前記ライブラリー中の核酸セグメントの平均長が、８００ヌクレオチドと１１００ヌクレオチドとの間である、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項４】
前記ライブラリー中の核酸セグメントの少なくとも９０％が、７００ヌクレオチドと１３００ヌクレオチドとの間の長さを有する、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項５】
各核酸セグメントが、転写開始部位の上流に少なくとも５００ヌクレオチド含む、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項６】
前記核酸セグメントのうちの５％以下が、ｃＤＮＡアラインメント人工産物に天然に結合されている、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項７】
前記ライブラリーが、ゲノム中の各転写調節配列の転写調節下で遺伝子を天然に示すための指標がついている、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項８】
前記レポーター配列が、同一のレポーター分子をコードする、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項９】
前記レポーター配列が、発光レポーター分子、蛍光レポーター分子、または比色分子をコードする、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項１０】
各レポーター配列が、可視シグナルをレポートする所定の独特のヌクレオチドバーコードおよび／またはレポーターを含む、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項１１】
前記ゲノムが哺乳動物ゲノムである、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項１２】
前記ゲノムがヒトゲノムである、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項１３】
前記ゲノムがマウスゲノムである、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項１４】
前記核酸セグメントの多様度が少なくとも１００である、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項１５】
前記核酸セグメントの多様度が少なくとも５００である、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項１６】
前記発現構築物がプラスミドまたはウイルス構築物である、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項１７】
前記核酸セグメントが、配列番号１〜４５０９６、もしくはそのフラグメント、またはそれらに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の相同性を有する配列を有する核酸からなる群から選択されるＤＮＡセグメントのうちの少なくとも２つを含む、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項１８】
単離された核酸分子のライブラリーであって、該ライブラリーの各メンバーは、ゲノム由来の異なる所定の核酸セグメントを含み、該セグメントが転写調節配列を含み、
（ａ）該ライブラリーは、少なくとも５０の異なる核酸セグメントという多様度を有し、
（ｂ）各核酸セグメントは、該ゲノム中でｃＤＮＡとして発現される配列に天然では連結しており、
（ｃ）該ライブラリー中の核酸セグメントの平均長が少なくとも６００ヌクレオチドである、ライブラリー。
【請求項１９】
組換え核酸分子のライブラリーであって、該ライブラリーの各メンバーは、異種核酸分子に連結したゲノム由来の異なる所定の核酸セグメントを含み、該セグメントが転写調節配列を含み、
（ａ）該ライブラリーは、少なくとも５０の異なる核酸セグメントという多様度を有し、
（ｂ）各核酸セグメントは、該ゲノム中でｃＤＮＡとして発現される配列に天然では連結しており、
（ｃ）該ライブラリー中の核酸セグメントの平均長が少なくとも６００ヌクレオチドである、組換え核酸分子のライブラリー。
【請求項２０】
前記核酸分子が、前記セグメントの５’側に隣接する制限部位と３’側に隣接する制限部位との対を含む、請求項１９に記載のライブラリー。
【請求項２１】
前記核酸分子が、増幅に使用することができるＰＣＲプライマーに相補的なセグメントの５’末端に隣接する制限部位と３’末端に隣接する制限部位との対を含む、請求項１９に記載のライブラリー。
【請求項２２】
細胞のライブラリーであって、該細胞のライブラリー中の各細胞が発現構築物のライブラリーの異なるメンバーを含み、該発現構築物のライブラリーの各メンバーがゲノム由来の異なる核酸セグメントを含み、該セグメントが発現ベクター中の異種レポーター配列に作動可能に連結された転写調節配列を含み、その結果、該レポーター配列の発現が転写調節配列の転写制御下にあり、
（ａ）該ライブラリーは、少なくとも５０の異なる核酸セグメントという多様度を有し、
（ｂ）各核酸セグメントは、該ゲノム中でｃＤＮＡとして発現される配列に天然では連結しており、
（ｃ）該ライブラリー中の核酸セグメントの平均長が少なくとも６００ヌクレオチドである、細胞のライブラリー。
【請求項２３】
前記細胞がヒト細胞である、請求項２２に記載のライブラリー。
【請求項２４】
前記細胞が非ヒト細胞である、請求項２２に記載のライブラリー。
【請求項２５】
細胞内に発現構築物のライブラリーを含む細胞のコレクションであって、該発現構築物のライブラリーの各メンバーがゲノム由来の異なる核酸セグメントを含み、該セグメントが発現ベクター中の異なる異種レポーター配列に作動可能に連結された転写調節配列を含み、その結果、該レポーター配列の発現が転写調節配列の転写調節下にある、細胞のコレクション。
【請求項２６】
前記異なる発現構築物を含む細胞が同定可能なバイアルまたはウェル中に存在する、請求項２５に記載の細胞のコレクション。
【請求項２７】
（ａ）前記ライブラリーは、少なくとも５０の異なる核酸セグメントという多様度を有し、
（ｂ）各核酸セグメントは、該ゲノム中でｃＤＮＡとして発現される配列に天然では連結しており、
（ｃ）該ライブラリー中の核酸セグメントの平均長が少なくとも６００ヌクレオチドである、請求項２５に記載の細胞のコレクション。
【請求項２８】
複数のウェルを含む少なくとも１つのプレートを含むデバイスであって、各ウェルが発現構築物のライブラリーの異なるメンバーを含み、各発現構築物がゲノム由来の異なる核酸セグメントを含み、該セグメントが発現ベクター中の異種レポーター配列に作動可能に連結された転写調節配列を含み、その結果、該レポーター配列の発現が該転写調節配列の転写制御下にあり、各メンバーがウェル中の既知の位置を有する、デバイス。
【請求項２９】
（ａ）前記ライブラリーは、少なくとも５０の異なる核酸セグメントという多様度を有し、
（ｂ）各核酸セグメントは、該ゲノム中でｃＤＮＡとして発現される配列に天然では連結しており、
（ｃ）前記ライブラリー中の核酸セグメントの平均長が少なくとも６００ヌクレオチドである、請求項２８に記載のデバイス。
【請求項３０】
前記構築物が、乾燥核酸の形態であるかまたは溶けている、請求項２８に記載のデバイス。
【請求項３１】
前記構築物が、トランスフェクションマトリックスの組み合わせの状態にある、請求項３０に記載のデバイス。
【請求項３２】
９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、または１５３６ウェルプレートを含む、請求項２８に記載のデバイス。
【請求項３３】
前記遺伝子発現調節エレメントが、配列番号１〜４５０９６、もしくはそのフラグメント、またはそれらに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９８％の相同性を有する配列を有する核酸からなる群から選択されるＤＮＡセグメントのうちの少なくとも２つを含む、請求項２８に記載のデバイス。
【請求項３４】
複数のウェルを含む少なくとも１つのプレートを含むデバイスであって、各ウェルが細胞のライブラリーの異なるメンバーを含み、細胞のライブラリー中の各細胞が発現構築物のライブラリーの異なるメンバーを含み、各発現構築物がゲノム由来の異なる核酸セグメントを含み、該セグメントが発現ベクター中の異種レポーター配列に作動可能に連結された転写調節配列を含み、その結果、該レポーター配列の発現が転写調節配列の転写制御下にあり、前記細胞のライブラリーの各メンバーがウェル中の既知の位置を有する、デバイス。
【請求項３５】
（ａ）前記発現構築物のライブラリーは、少なくとも５０の異なる核酸セグメントという多様度を有し、
（ｂ）各核酸セグメントは、該ゲノム中でｃＤＮＡとして発現される配列に天然では連結しており、
（ｃ）該ライブラリー中の核酸セグメントの平均長が少なくとも６００ヌクレオチドである、請求項３４に記載のデバイス。
【請求項３６】
標的遺伝子発現調節エレメントの生物機能を特徴づけるためのキットであって、
（ａ）複数のウェルを含む少なくとも１つのプレートを含むデバイスであって、各ウェルが発現構築物のライブラリーの異なるメンバーを含み、各発現構築物がゲノム由来の異なる核酸セグメントを含み、該セグメントが発現ベクター中の異種レポーター配列に作動可能に連結された転写調節配列を含み、その結果、該レポーター配列の発現が転写調節配列の転写制御下にあり、各メンバーがウェル中の既知の位置を有する、デバイス、および
（ｂ）レポーターアッセイ基質
を含む、キット。
【請求項３７】
標的遺伝子発現調節エレメントの生物機能を特徴づけるための説明書をさらに含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
表面および前記表面にそれぞれ異なる既知の位置に固定された核酸分子を含む固体基板を含むデバイスであって、各分子が転写調節配列を含むゲノムセグメント由来の少なくとも１０ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、該デバイスが少なくとも５０の異なるゲノムセグメント由来の転写調節配列を含む、デバイス。
【請求項３９】
各核酸セグメントは、該ゲノム中でｃＤＮＡとして発現される配列に天然では連結している、請求項３８に記載のデバイス。
【請求項４０】
前記遺伝子発現調節エレメントが、配列番号１〜４５０９６またはそのフラグメントからなる群から選択されるＤＮＡセグメントのうちの少なくとも２つを含む、請求項３８に記載のデバイス。
【請求項４１】
前記分子が６０ヌクレオチド以下の長さである、請求項３８に記載のデバイス。
【請求項４２】
前記各ゲノムセグメントが複数の分子を含むセットにより表され、該セット中の各分子がゲノムセグメント由来の異なるヌクレオチド配列を含む、請求項３８に記載のデバイス。
【請求項４３】
（ａ）請求項３４に記載のデバイス、
（ｂ）該デバイスの各ウェル中で発現されたレポーター配列由来のシグナルを検出するように適合された読み取り装置、
を含むシステム。
【請求項４４】
前記デバイスが、所定のシグナルレベルを提供する複数のコントロール構築物を含み、前記システムが、（ｃ）（ｉ）該コントロール構築物由来のシグナルに基づいてプレートの全ウェル由来のシグナルを規準化するアルゴリズムを実行するコードを含むソフトウェアをさらに含む、請求項４３に記載のシステム。
【請求項４５】
請求項４４に記載のアルゴリズムを実行するコードを含むソフトウェア。
【請求項４６】
（ａ）複数のウェルを含む少なくとも１つのプレートを含むデバイスを提供する工程であって、各ウェルが細胞のライブラリーの異なるメンバーを含み、該細胞のライブラリー中の各細胞が発現構築物のライブラリーの異なるメンバーを含み、各発現構築物がゲノム由来の異なる核酸セグメントを含み、前記セグメントが発現ベクター中の異種レポーター配列に作動可能に連結された転写調節配列を含み、その結果、該レポーター配列の発現が該転写調節配列の転写制御下にあり、該細胞のライブラリーの各メンバーがウェル中の既知の位置を有する、提供する工程、
（ｂ）該細胞を培養する工程、および
（ｃ）各ウェル中のレポーター配列の発現レベルを測定する工程
を含む、方法。
【請求項４７】
（ｉ）前記ライブラリーは、少なくとも５０の異なる核酸セグメントという多様度を有し、
（ｉｉ）各核酸セグメントは、該ゲノム中でｃＤＮＡとして発現される配列に天然では連結しており、
（ｉｉｉ）前記ライブラリー中の核酸セグメントの平均長が少なくとも６００ヌクレオチドである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記デバイスを提供する工程が、
（ｉ）複数のウェルを含む少なくとも１つのプレートを含むデバイスを提供する工程であって、各ウェルが発現構築物のライブラリーの異なるメンバーを含み、該発現構築物のライブラリーの各メンバーがウェル中の既知の位置を有する、工程、
（ｉｉ）該ウェルの各々に細胞を送達する工程、
（ｉｉｉ）該発現構築物で該細胞をトランスフェクションする工程を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
（ｄ）各ウェル中で前記細胞を撹乱する工程、
（ｅ）各ウェル中の前記レポーター配列の発現レベルを測定する工程、および
（ｆ）任意のウェル中の発現レベルが該細胞と試験化合物との接触後に変化したかどうかを決定する工程
をさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
前記撹乱する工程が、各ウェル中の前記細胞を試験化合物と接触させる工程、該細胞を異なる環境条件に曝露する工程、変異の誘導などによって持続的または一過性に該細胞を遺伝子改変する工程、例えばｃＤＮＡでのトランスフェクションによって転写産物を過剰発現させる工程、またはｓｉＲＮＡによって転写産物の発現を減少させる工程を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記レポーター配列がレポーター分子をコードし、前記レポーター配列の発現の測定が該レポーター分子の発現の測定を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項５２】
（ａ）第１のデバイスおよび第２のデバイスを提供する工程であって、各デバイスが複数のウェルを含む少なくとも１つのプレートを含み、前記各ウェルが細胞のライブラリーの異なるメンバーを含み、該細胞のライブラリー中の各細胞が発現構築物のライブラリーの異なるメンバーを含み、各発現構築物がゲノム由来の異なる核酸セグメントを含み、該セグメントが発現ベクター中の異種レポーター配列に作動可能に連結された転写調節配列を含み、その結果、該レポーター配列の発現が該転写調節配列の転写制御下にあり、該細胞のライブラリーの各メンバーがウェル中の既知の位置に存在し、前記第１のデバイスおよび第２のデバイスが同じタイプの細胞を含み、前記発現構築物のライブラリーが該第１のデバイスおよび該第２のデバイスで同一である、工程、
（ｂ）該第１のデバイスおよび該第２のデバイスの細胞を異なる培養条件下で培養する工程、
（ｃ）各ウェル中の該レポーター配列の発現レベルを測定する工程、および
（ｄ）該レポーター配列の発現レベルを前記第１の細胞型と第２の細胞型との間で各転写調節配列と比較する工程
を含む、方法。
【請求項５３】
前記異なる培養条件が、前記第１のデバイスの細胞の培養物中に存在しない化合物の存在下で前記第２のデバイスの細胞を培養する工程を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
（ａ）第１のデバイスおよび第２のデバイスを提供する工程であって、各デバイスが複数のウェルを含む少なくとも１つのプレートを含み、各ウェルが細胞のライブラリーの異なるメンバーを含み、該細胞のライブラリー中の各細胞が発現構築物のライブラリーの異なるメンバーを含み、各発現構築物がゲノム由来の異なる核酸セグメントを含み、該セグメントが発現ベクター中の異種レポーター配列に作動可能に連結された転写調節配列を含み、その結果、該レポーター配列の発現が該転写調節配列の転写制御下にあり、該細胞のライブラリーの各メンバーがウェル中の既知の位置を有し、該第１のデバイスが第１の型の細胞を含み、第２のデバイスが第２の型の細胞を含み、該発現構築物のライブラリーが該第１のデバイスおよび該第２のデバイスで同一である、提供する工程、
（ｂ）該第１のデバイスおよび該第２のデバイスの細胞を培養する工程、
（ｃ）各ウェル中の該レポーター配列の発現レベルを測定する工程、および
（ｄ）該レポーター配列の発現レベルを該第１の細胞型と該第２の細胞型との間で各転写調節配列と比較する工程
を含む、方法。
【請求項５５】
（ｉ）前記ライブラリーは、少なくとも５０の異なる核酸セグメントという多様度を有し、
（ｉｉ）各核酸セグメントは、該ゲノム中でｃＤＮＡとして発現される配列に天然では連結しており、
（ｉｉｉ）該ライブラリー中の核酸セグメントの平均長が少なくとも６００ヌクレオチドである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記デバイスを提供する工程が、
（ｉ）デバイスを提供する工程であって、各デバイスが、複数のウェルを含む少なくとも１つのプレートを含み、各ウェルが発現構築物のライブラリーの異なるメンバーを含み、該発現構築物のライブラリーの各メンバーがウェル中の既知の位置を有する、工程、
（ｉｉ）該ウェルの各々に細胞を送達す工程、
（ｉｉｉ）該発現構築物で該細胞をトランスフェクションするかまたは感染させる工程を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
請求項４６に記載の方法によって測定された構築物由来の発現レベルを評価するための方法であって、
（ａ）コントロールレポーター構築物セットを含む細胞セットを提供する工程であって、各コントロールレポーター構築物が前記異種レポーター配列に作動可能に連結されたランダムゲノムフラグメントを含む、提供する工程、
（ｂ）各細胞中の該レポーター配列の発現レベルを測定する工程、
（ｃ）該コントロール構築物間の発現レベルの平均値または平均を決定する工程、
（ｄ）各試験構築物の発現レベルについて、平均値または平均からの統計的距離を決定する工程、および
（ｅ）偏差が統計的に有意であるかどうかを決定する工程
を含む、方法。
【請求項５８】
前記偏差が標準偏差である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ランダムゲノムフラグメントが、実験フラグメントと同一サイズの分布のゲノムから選択されるランダムフラグメントである、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記ランダムゲノムフラグメントが、タンパク質コード遺伝子の中間エキソン由来のランダムフラグメントであり、該中間エキソンがタンパク質をコードし、その長さが少なくとも実験フラグメントのサイズであり、且つ前記ゲノム中の既知の転写開始部位から少なくとも５，０００塩基または１０，０００塩基である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
活性および有意性を、以下の式：Ｚスコアプロモーター活性＝（未加工のプロモーター活性−ランダムコントロールの平均値）／ランダムコントロールの標準偏差によってＺスコアとして計算する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
請求項５７に記載の平均値および偏差を決定するアルゴリズムを実行するコードを含むソフトウェア。
【請求項６３】
Ｚスコア変換プロモーター活性データを、ＤＮＡメチル化実験由来のＺスコア変換機能データ、転写因子結合データ、ヒストン修飾データ、ＤＮアーゼ高感受性データ、ヌクレオソーム置換データ、または遺伝子発現データと統合する分析ソフトウェア。
【請求項６４】
核酸配列中のメチル化パターンを決定するための方法であって、
（ａ）第１の標識核酸セグメントセットを、
（ｉ）供給源由来の配列を含む核酸分子を得ること、および
（ｉｉ）単離核酸分子を第１の標識で標識することにより、標識により、前記第１の標識核酸セグメントセットが作製されること、
によって作製する工程；
（ｂ）第２の標識核酸セグメントセットを、
（ｉ）該供給源由来のヌクレオチド配列を有する核酸分子を得ること、
（ｉｉ）該核酸分子を、異なる認識配列を有する少なくとも３つのメチル感受性制限酵素と接触させ、該酵素が非メチル化認識配列において核酸分子を切断するが、メチル化認識部位では切断されず、それにより、核酸フラグメントが得られること、
（ｉｉｉ）混合物から少なくとも１００ヌクレオチドの核酸フラグメントを単離すること、および
（ｉｖ）該フラグメントを第２の異なる標識で標識することにより、標識により、前記第２の核酸セグメントセットが作製されること、
によって作製する工程；
（ｃ）該第１の標識セグメントおよび該第２の標識セグメントを、前記ヌクレオチド配列を含む１つまたは複数の核酸プローブとハイブリッド形成する工程、および
（ｄ）該第１の標識セグメントおよび該第２の標識セグメントによって識別的に標識されたヌクレオチド配列の領域を決定する工程であって、該識別的に標識された領域が該ヌクレオチド配列の非メチル化領域である、決定する工程
を含む、方法。
【請求項６５】
前記核酸分子が転写調節配列を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記核酸分子を少なくとも６つの異なるメチル感受性酵素と接触させる工程を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記第１の標識が第１の色を生じ、前記第２の標識が第２の異なる色を生じる、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記セグメントを、前記核酸分子のヌクレオチド配列をタイル状に配置する複数のプローブとハイブリッド形成する工程を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
前記方法を２回目に第２の供給源由来の核酸を使用して行う工程をさらに含み、前記第１の供給源および前記第２の供給源が、健康な組織および罹患組織であるか、または２つの異なるタイプの罹患組織である、請求項６４に記載の方法。
【請求項７０】
ビジネス方法であって、
（ａ）請求項１、請求項１８、請求項１９、請求項２２、請求項２５、請求項２８、請求項３４、請求項３７、請求項４２、請求項４４、請求項４５、請求項５１、請求項５３、請求項５６、請求項６１、請求項６３、および請求項６３のいずれか１項に記載の組成物、デバイス、または方法を商業化する工程
を含む、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公表番号】特表２００９−５１９７１０（Ｐ２００９−５１９７１０Ａ）
【公表日】平成２１年５月２１日（２００９．５．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４５６７７（Ｐ２００８−５４５６７７）
【出願日】平成１８年１２月８日（２００６．１２．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４６９２０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７８５９９
【国際公開日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【出願人】（５０１２４３０３０）ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー (17)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年５月２１日（２００９．５．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月８日（２００６．１２．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４６９２０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７８５９９
【国際公開日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【出願人】（５０１２４３０３０）ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー (17)
【Ｆターム（参考）】
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