酵素阻害剤およびプロテインキナーゼの同定方法
本発明は、キナーゼを阻害する化合物を同定する方法を提供する。さらに、プロテインキナーゼをプロファイルする方法も提供される。さらに、キナーゼ阻害剤の作用様式を決定する方法も提供される。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
プロテインキナーゼは、真核生物における最も大きい蛋白質スーパーファミリーの１つを代表する。ヒト属の機能的分類に基づくと、ヒトゲノム中にコード化されるプロテインキナーゼの数は、概算で５００を越えるが、１０００未満であり、それは、ヒトの全遺伝子の約３％を構成する（Venter, et al., Science, 291:1304-1351(2001)）。プロテインキナーゼは、シグナル変換経路および多くの細胞調節過程、例えば、細胞分裂および分化、発達、腫瘍形成、細胞生存およびアポトーシスにおいて重要な役割を果たす。さらに、多くのプロテインキナーゼをコードしている遺伝子は、疫学的関連遺伝子の多くの上流または下流に位置し、それらを治療的介入の標的として強調している。したがって、プロテインキナーゼが、多くの疾患の新規な治療剤の同定および開発のための魅力的な標的として明らかであることは、驚くべきことではない。
【０００２】
配列アラインメント研究は、ほとんどのプロテインキナーゼが約２７０個のアミノ酸からなる共通のコアを有することを明らかにした（(Hank, S.K., and Hunter, T., The Protein Kinase Facts Book, Ed G. Kardie and S. Hanks, Academic Press, NY. (1995)）。キナーゼの結晶構造を比較する研究は、全てのキナーゼのコア構造が共通の折り畳み構造をとることを示した（Hanks and Hunter, 1995）。最も注目すべきは、ＡＴＰ結合に関与するＮ末端ドメイン中の領域および蛋白質基質認識に関与するＣ末端ドメイン中の領域が、その活性形態における結晶構造によって明らかにされるように、ほとんどのキナーゼにおいて類似の配座をとることである。ＡＴＰ結合部位は、Ｎ末端ローブおよびＣ末端ローブの中間面に位置する。
【０００３】
構造研究は、これまでに研究された小型分子キナーゼ阻害剤のほとんどがＭｇ−ＡＴＰ複合体結合ポケットに結合することを示した（Garcia-Echeverria et al., Med. Res. Rev., 20:28-57 (2000)）。結果として、化学的鋳型を調節し、微調整することによって、強力かつ選択的なＡＴＰ部位に向けられたプロテインキナーゼ阻害剤の合成に向けて、相当な進歩がなされた（Garcia-Echeverria et al., 2000）。これらの研究は共に、ＡＴＰ結合の溝（binding cleft）が強力で特異的な阻害剤の開発のための理想的な標的ではないという許容された考えに異議を唱えた。
【０００４】
ｐ−フルオロスルホニルベンゾイル５’−アデノシン（ＦＳＢＡ）は、種々のプロテインキナーゼにおけるヌクレオチド結合部位の共有結合修飾に効果的であるＡＴＰ−アフィニティー試薬である（Kamps, et al., Nature 310:589-592 (1984); Scoggins, et al., Biochemistry 35:9197-9203 (1996); Young, et al., J. Biol. Chem. 272: 12116-12121 (1997); Fox, et al., FEBS Letts. 461:323-328 (1999)）。構造的に、ＦＳＢＡは、ＡＴＰの３個のホスフェートの代わりにフルオロスルホニルベンゾイル基が存在することを除き、ＡＴＰに類似している。ＦＳＢＡは、多くのプロテインキナーゼを選択的に標識し、特徴付けるために使用された。プロテインキナーゼの一群において行われたペプチド・マス・フィンガープリンティング研究は、ＦＳＢＡがＡＴＰ結合部位において見出される決定的な保存されたリジンの側鎖に不可逆的に結合することを示した（Kamps, et al., 1984; Zoller et al., J. Biol. Chem. 256:10837-10842 (1981)）。１４Ｃ−標識ＦＳＢＡ（Fox, et al., 1999; Buhrow, et al., . Biol. Chem. 258:7824-7827 (1983)）およびＦＳＢＡ−特異的抗体（Parker, FEBS Letts. 334:347-350 (1993); T'Jampens, et al., FEBS Letts. 516:20-26 (2002)）は、細胞ライゼート由来のプロテインキナーゼを同定し、特徴付けるために使用されたが、これらの試薬は、その制限のために、阻害剤スクリーニングには有効に使用されていない（T'Jampens, et al., 2002）。
【０００５】
液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）技術は、天然および組み換え発現された蛋白質の共有結合修飾をモニターするのに価値を有している（Feng, et al., Anal. Chem. 73:5691-5697（2001））。これらの技術は、また、薬物代謝および薬物動態学研究においてルーチンに使用されてきた（Feng, et al., 2001）が、スクリーニングツールとしてのその使用は、幅広く研究されていない。
【０００６】
したがって、キナーゼを阻害する化合物を同定する方法が大いに必要とされている。さらに、プロテインキナーゼをプロファイルする方法もまた、大いに必要とされている。
【０００７】
発明の概要
本発明の一の具体例は、ＡＴＰ結合部位を有する酵素の組成物、該酵素のＡＴＰ結合部位に結合可能な被検体、および試験化合物を接触させ、次いで、該試験化合物が該被検体の該酵素のＡＴＰ結合部位への結合を阻害するかどうかを検出することを特徴とする、ＡＴＰ結合部位を有する酵素を阻害する化合物を同定する方法を提供することにある。
【０００８】
本発明のさらなる具体例は、ＡＴＰ結合部位を有するキナーゼを含む組成物、および該キナーゼのＡＴＰ結合部位に結合する被検体を接触させ；該被検体のＡＴＰ結合部位への結合を検出し；該キナーゼを含む組成物、該被検体および試験化合物を接触させ、次いで、該試験化合物が該被検体の該ＡＴＰ結合部位への結合を阻害するかどうかを検出する工程を含む、ＡＴＰ結合部位を有するキナーゼを阻害する化合物を同定する方法を提供する。
【０００９】
本発明の別の具体例において、ＡＴＰ結合部位を有するキナーゼを含む組成物、および試験化合物を接触させ；該キナーゼを含む該組成物および該試験化合物と被検体を接触させ；次いで、該試験化合物が該被検体の該キナーゼのＡＴＰ結合部位への結合を阻害するかどうかを検出する工程を含む、ＡＴＰ結合部位を有するキナーゼを阻害する試験化合物を同定する方法が提供される。
【００１０】
また、本発明において、キナーゼに対する試験化合物の結合の検出が液体クロマトグラフィー／質量分析の使用からなる方法が提供される。
本発明の別の具体例において、ＡＴＰ結合部位を有するプロテインキナーゼを含む組成物と、該キナーゼに結合可能な被検体を接触させ、次いで、被検体が該キナーゼに結合するかどうかを検出する工程を含む、ＡＴＰ結合部位を有するプロテインキナーゼを同定する方法が提供される。
別の具体例において、ビオチン−ＦＳＢＡが提供される。
【００１１】
また、本発明において、（ａ）第１のＡＴＰ結合部位を有する第１の酵素を含む組成物、該酵素の第１のＡＴＰ結合部位に結合可能な被検体、および試験化合物を接触させ、ここに、被検体の試験化合物に対する濃度比率が少なくとも１：１であり、次いで、（ｂ）該試験化合物が該被検体の該第１のＡＴＰ結合部位への結合を阻害するかどうかを検出し、ここに、該第１のＡＴＰ結合部位に結合している被検体の減少が該試験化合物による拮抗的阻害を示す工程を含む、第１のＡＴＰ結合部位を有する第１の酵素を阻害する試験化合物の作用様式を同定する方法が提供される。本発明の別の態様において、（ａ）第２のＡＴＰ結合部位を有する第２の酵素を含む組成物、該第２の酵素の第２のＡＴＰ結合部位に結合可能な被検体、および試験化合物を接触させ；（ｂ）該試験化合物が該被検体の該第２のＡＴＰ結合部位への結合を阻害するかどうかを検出し；次いで（ｃ）該試験化合物が該酵素の選択的阻害剤であるかどうかを決定することを特徴とする、試験化合物の作用様式を同定する方法が提供される。各方法において使用される被検体は、同一または異なっていてもよい。また、本発明により、化合物の作用様式を同定する方法が提供され、ここに、被検体の第１の酵素への結合を減少させるが、被検体の第２の酵素への結合を減少させない試験化合物は、第１の酵素の選択的阻害剤である。
【００１２】
発明の詳細な記載
用語
本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド」なる語は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合によって互いに結合した２以上のアミノ酸を含むいずれかのペプチドまたは蛋白質をいう。「ポリペプチド」なる語は、一般にペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーと称される短鎖、および一般に蛋白質と称される長鎖の両方をいう。ポリペプチドは、２０種類の遺伝子コード化アミノ酸以外のアミノ酸を含んでいてもよい。「ポリペプチド」は、プロセッシングおよび他の翻訳後修飾などの天然過程によって修飾されたものだけでなく、化学的修飾技術によって修飾されたものも包含する。かかる修飾は、基本的な教本およびより詳細な研究論文、ならびに豊富な研究文献においてよく記載されており、それらは当業者によく知られている。同じ型の修飾が所定のポリペプチド中のいくつかの部位に同じ程度または種々の程度で存在しうることは明らかであろう。また、所定のポリペプチドは、多くの型の修飾を含みうる。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノまたはカルボキシル末端を包含するポリペプチドのどこにでも起こることができる。修飾は、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム基の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白質分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化、セレノイル化（selenoylation）、硫酸化、アミノ酸の蛋白質へのトランスファーＲＮＡ媒介性付加、例えば、アルギニル化、およびユビキチン化を包含する。例えば、PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993) and Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pgs. 1-12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990) および Rattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62 (1992) を参照のこと。ポリペプチドは、分枝していてもよく、または分枝を有するか、または有さずに環化していてもよい。環化、分枝および分枝した環状ポリペプチドは、翻訳後の天然過程に由来していてもよく、また、完全に合成法によって作製されてもよい。
【００１３】
本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」なる語は、一般に、修飾されていないＲＮＡまたはＤＮＡあるいは修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡであってもよいいずれかのポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをいう。「ポリヌクレオチド」なる語は、限定するものではないが、１本鎖および２本鎖ＤＮＡ、１本鎖および２本鎖領域または１本鎖、２本鎖および３本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、１本鎖および２本鎖ＲＮＡ、ならびに１本鎖および２本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、１本鎖またはより典型的には、２本鎖、または３本鎖領域、または１本鎖および２本鎖領域の混合物であってもよいＤＮＡおよびＲＮＡからなるハイブリッド分子を包含する。さらに、本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」なる語は、ＲＮＡまたはＤＮＡあるいはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む３本鎖領域をいう。かかる領域における鎖は、同じ分子から由来してもよく、または異なる分子から由来してもよい。該領域は、１以上の該分子の全てを含んでいてもよいが、典型的には、該分子のいくつかの領域だけを含む。３重らせん領域の分子の１つは、しばしば、オリゴヌクレオチドである。本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」なる語は、また、１以上の修飾された塩基を含む上記のＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。かくして、安定性または他の理由で修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書中で意図されるとおりの「ポリヌクレオチド」である。さらに、異常な塩基、例えば、イノシン、または修飾された塩基、例えば、トリチル化塩基（２つだけ例を挙げるが）を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書中で使用される用語のとおりのポリヌクレオチドである。多種多様な修飾が、当業者に既知の多くの有用な目的を提供するＤＮＡおよびＲＮＡになされることは、明らかであろう。本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」なる語は、かかる化学的に、酵素的に、または代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチド、ならびに例えば、単純および複雑な細胞を包含するウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的な形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、しばしば、オリゴヌクレオチドと称される短いポリヌクレオチドを包含する。
【００１４】
本明細書中で使用される場合、「キナーゼ」なる語は、リン酸化またはリン酸基を別の分子に付加することのできるいずれかのポリペプチドをいう。他の分子は、限定するものではないが、別のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはコファクターであってもよい。キナーゼは、触媒作用可能な酵素であってもよい。
本明細書中で使用される場合、「ビオチン−」または「ビオチン化された」なる語は、ビオチン基が結合しているいずれかの分子をいう。ビオチン基は、共有結合していてもよい。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、「プロテアーゼアッセイ」なる語は、ポリペプチドのプロテアーゼ活性が測定されるアッセイをいう。プロテアーゼ活性は、限定するものではないが、ポリペプチドをペプチドフラグメントに切断することのできる酵素を包含しうる。
本明細書中で使用される場合、「キナーゼアッセイ」なる語は、キナーゼの活性が測定されるアッセイをいう。キナーゼ活性は、限定するものではないが、キナーゼによる基質のリン酸化の速度または量を包含しうる。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、「拮抗阻害剤」なる語は、天然基質と同じ結合部位に対して競合することによって、基質に結合される酵素の割合を減少させることによって、酵素触媒作用速度を減少させるいずれかの化合物をいう。例えば、拮抗阻害剤は、酵素の活性部位に結合することによって、酵素の天然基質と競合しうる。
本明細書中で使用される場合、「非拮抗阻害剤」なる語は、酵素に結合する基質に影響をもたらさない化合物をいう。基質および阻害剤は可逆的、無作為かつ独立的に、酵素上の異なる部位に結合する。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、「非拮抗阻害剤」なる語は、遊離の酵素に結合しないが、酵素−基質複合体に可逆的に結合し、それにより、不活性な酵素−基質−阻害剤複合体を生じる化合物をいう。
【００１８】
近年、フルオロホスホネート／フルオロホスフェート（ＦＰ）誘導体は、セリンヒドロラーゼをプロファイリングするのに使用された（(Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:14694-14699(1999); Kidd et al., Biochemistry 40, 4005-4015 (2001)）。ＦＰ阻害剤は、活性依存的に多くのセリンヒドロラーゼに対して反応性を示す。ＦＳＢＡは、活性部位へ結合することによって、キナーゼの一団と反応し、その標識化は、キナーゼのコンホメーション／活性状態に依存的であるようである。したがって、ＦＳＢＡは、キナーゼのＡＴＰ拮抗阻害剤を選択するために、ＡＢＰとして使用された。
【００１９】
ＦＳＢＡの放射性形態（市販されている）は、キナーゼ・プロファイリング研究に使用できるが、フルオログラフィーによるその検出は、数日ないし数週間を必要とする。さらに、放射性材料の取扱および処分もまた、それをスクリーニング研究の魅力のない試薬としている。キナーゼのＦＳＢＡ修飾は、ＬＣ／ＭＳに対して安定であると予想される共有結合であるので、ＬＣ／ＭＳは、オートラジオグラフィーの別法として、本発明の一部として使用された。
【００２０】
ＦＳＢＡはプロテインキナーゼのＡＴＰ結合ポケットにおいて共有結合するので、ＬＣ／ＭＳは、ＡＴＰ拮抗プロテインキナーゼ阻害剤のスクリーニングにおいて有用性を有する。本発明は、精製した組み換えキナーゼおよびＦＳＢＡを活性に基づくプローブ（activity-baased probe: ＡＢＰ）として用いると、ＬＣ／ＭＳが、プロテインキナーゼのＡＴＰ拮抗阻害剤をスクリーンするための一般的な迅速かつ再現性のある手段を提供することを明らかにする。
【００２１】
本発明において、オートラジオグラフィーおよびＬＣ／ＭＳ技術は、ＦＳＢＡをプロテインキナーゼの活性に基づくプローブとして評価するために使用される。本明細書中に提供される研究は、活性に基づくプローブとしてのＦＳＢＡの有用性およびＡＴＰ拮抗プロテインキナーゼ阻害剤の選択のためのスクリーニングツールとしてのＬＣ／ＭＳの有用性を明らかにする。評価に数日ないし数週間かかるフルオログラフィーと比べると、ＬＣ／ＭＳは、阻害剤スクリーニングの迅速な検出（例えば、数分以内）を可能にする。さらに、新たな一体化した１０−ポンプで８チャンネルのパラレルＬＣ／ＭＳ（Feng et al., 2001）の出現で、該方法は、ハイスループットモードにおいても使用される可能性を有する。
【００２２】
ビオチンは、可視マーカーと共に使用してもよい。可視シグナルを提供することのできる分子に結合したアビジンまたはストレプトアビジンを用いてビオチンを検出できることは、当該分野で理解されている。典型的には、アビジンまたはストレプトアビジン結合型西洋ワサビペルオキシダーゼをウェスタンブロットにおいて使用して、ビオチン化抗体を検出する。本発明の一部として、ビオチンをＦＳＢＡに共有結合させ、次いで、それをマーカーに結合したアビジンまたはストレプトアビジンによって検出してもよい。本明細書中で使用される場合、「ウェスタンブロット」なる語は、固体支持体に結合したポリペプチドを検出する方法を包含し、ここに、該ポリペプチドを、ビオチン基を有する分子と接触させる。該ビオチン基は、抗体またはＦＳＢＡに結合していてもよい。次いで、ビオチンは、可視シグナルを提供することのできる分子に結合したアビジンまたはストレプトアビジンを用いて可視化される。
【００２３】
かくして、本発明の１の具体例は、ＡＴＰ結合部位を有する酵素の組成物、該酵素のＡＴＰ結合部位に結合可能な被検体、および試験化合物を接触させ、次いで、該試験化合物が、該被検体の該ＡＴＰ結合部位への結合を阻害するかどうかを検出することを特徴とする、ＡＴＰ結合部位を有する酵素を阻害する化合物を同定する方法を提供することにある。本発明の一の態様において、該酵素はキナーゼである。本発明の別の態様において、試験化合物は、被検体の拮抗阻害剤である。本発明のまた別の態様において、被検体は、ｐ−フルオロスルホニルベンゾイル５’−アデノシン（ＦＳＢＡ）である。本発明のまた別の態様において、該酵素は、ＡＴＰ結合部位において保存されたリジンを含む。本発明のまた別の態様において、被検体は、保存されたリジンに結合する。試験化合物が被検体の酵素への結合を阻害するかどうかの検出は、質量分析、プロテアーゼアッセイまたはキナーゼアッセイによって行うことができる。
【００２４】
本発明の別の具体例において、ＡＴＰ結合部位を有するキナーゼを含む組成物、および該キナーゼのＡＴＰ結合部位に結合する被検体を接触させ；被検体のＡＴＰ結合部位への結合を検出し；該キナーゼを含む組成物、該被検体および試験化合物を接触させ、次いで、試験化合物が該被検体の該ＡＴＰ結合部位への結合を阻害するかどうかを検出する工程を含む、ＡＴＰ結合部位を有するキナーゼを阻害する化合物の同定方法が提供される。本発明の別の態様において、該酵素は、ＡＴＰ結合部位において保存されたリジンを有する。本発明のまた別の態様において、被検体は保存されたリジンに結合する。本発明の別の態様において、被検体のＡＴＰ結合部位への結合は、質量分析、プロテアーゼアッセイまたはキナーゼアッセイによって行うことができる。本発明の別の態様において、試験化合物は被検体の拮抗阻害剤である。被検体は、ｐ−フルオロスルホニルベンゾイル５’−アデノシン（ＦＳＢＡ）であってもよい。
【００２５】
本発明の別の具体例において、ＡＴＰ結合部位を有するキナーゼを含む組成物および試験化合物を接触させ；該キナーゼを含む組成物および該試験化合物と被検体を接触させ；次いで、試験化合物が該被検体の該キナーゼのＡＴＰ結合部位への結合を阻害するかどうかを検出する工程を含む、ＡＴＰ結合部位を有するキナーゼを阻害する試験化合物を同定する方法が提供される。本発明の別の態様において、該酵素は、ＡＴＰ結合部位において保存されたリジンを有する。本発明の別の態様において、被検体は保存されたリジンに結合する。試験化合物が被検体のキナーゼのＡＴＰ結合部位への結合を阻害するかどうかの検出は、質量分析、プロテアーゼアッセイまたはキナーゼアッセイを用いて行うことができる。本発明のまた別の態様において、試験化合物は、被検体の拮抗阻害剤である。被検体は、ｐ−フルオロスルホニルベンゾイル５’−アデノシン（ＦＳＢＡ）であってもよい。
【００２６】
また別の具体例において、ＡＴＰ結合部位を有するプロテインキナーゼを含む組成物と、該キナーゼに結合可能な被検体を接触させ、次いで、被検体が該キナーゼに結合するかどうかを検出する工程を含む、ＡＴＰ結合部位を有するプロテインキナーゼを同定する方法が提供される。別の態様において、被検体は、ｐ−フルオロスルホニルベンゾイル５’−アデノシン（ＦＳＢＡ）である。別の態様において、プロテインキナーゼをキナーゼ阻害剤と接触させる。別の態様において、ウェスタンブロットを用いてＦＳＢＡ結合を検出する。別の態様において、ＬＣ／ＭＳを用いてＦＳＢＡ結合を検出する。
【００２７】
別の具体例において、ビオチン−ＦＳＢＡが提供される。別の態様において、式Ｉ：
【化１】
［式中、
Ｒ１およびＲ２は独立して、Ｈまたは式ＩＩ：
【化２】
で示されるビオチンである］
で示される化合物が提供される。
【００２８】
ビオチン化されたＦＳＢＡは、溶液中で有用な遊離化合物として製造されてもよく、または固体支持体もしくは樹脂に結合していてもよい。別の具体例において、式Ｉの化合物の製法が提供される。
【００２９】
また、本発明において、（ａ）第１のＡＴＰ結合部位を有する第１の酵素を含む組成物、該酵素の第１のＡＴＰ結合部位に結合可能な被検体、および試験化合物を接触させ、ここに、被検体の試験化合物に対する濃度比率は、少なくとも１：１であり、次いで（ｂ）該試験化合物が該被検体の該第１のＡＴＰ結合部位への結合を阻害するかどうかを検出し、ここに、第１のＡＴＰ結合部位に結合する被検体の減少が、該試験化合物による拮抗阻害を示す工程を含む、第１のＡＴＰ結合部位を有する第１の酵素を阻害する試験化合物の作用様式を同定する方法が提供される。本発明の別の態様において、（ａ）第２のＡＴＰ結合部位を有する第２の酵素を含む組成物、第２の酵素の第２のＡＴＰ結合部位に結合可能な被検体、および該試験化合物を接触させ；（ｂ）該試験化合物が該被検体の該第２のＡＴＰ結合部位への結合を阻害するかどうかを検出し；ついで（ｃ）該試験化合物が該酵素の選択的阻害剤であるかどうかを決定することを含む、試験化合物の作用様式を同定する方法が提供される。各方法において使用される被検体は、同じであっても、異なっていてもよい。また、本発明によって、被検体の第１の酵素への結合を減少させるが、被検体の第２の酵素への結合を減少させない試験化合物が第１の酵素の選択的阻害剤である、化合物の作用様式を同定する方法が提供される。
【００３０】
下記の実施例は、本発明の種々の態様を説明するものである。これらの実施例は、添付の請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００３１】
精製プロテインキナーゼを下記の実施例において使用した。別記しないかぎり、蛋白質および化学物質は、Sigmaから入手した。１４Ｃ−標識化ＦＳＢＡは、Perkin Elmer Life Sciencesから入手した。１４Ｃ−ＦＳＢＡ標識したプロテインキナーゼ上のオートラジオグラフィーは、記載のとおりに行った（Buhrow et al., 1983; Fox et al., 1997）。乾燥させたゲルを−８０℃で２〜４週間、フィルムに曝露した。精製蛋白質およびＦＳＢＡ−修飾したプロテインキナーゼのＭＳ分析は、記載のとおりに行った（Feng, et al., 2001）。
【００３２】
ＦＳＢＡ標識の場合、別記しないかぎり、精製蛋白質（約０．２〜約０．５ｍｇ／ｍＬ）を１０μＭ ＦＳＢＡ（２．５％ＤＭＳＯ中）と共に室温でインキュベートした。時間依存性修飾研究の場合、以前の記載のとおりに、１０μｌアリコートを指定時間で取り出し、５０μｌの０．１％ＴＦＡと混合し、ＬＣ／ＭＳに注入した（Feng et al., 2001）。ＡＴＰ保護実験の場合、精製キナーゼを１０μＭ ＦＳＢＡならびに種々の量のＡＴＰおよびＭｇＣｌ２と共に、室温で１〜２時間共にインキュベートした。スタウロスポリン（staurosporine）保護実験の場合、精製プロテインキナーゼを１０μＭ ＦＳＢＡおよび種々の量のスタウロスポリン（０．１μＭ−１０μＭ）と共に、室温で１〜２時間共にインキュベートした。
【００３３】
オートラジオグラフィーおよびＬＣ／ＭＳを用いて、プロテインキナーゼのための活性に基づくプローブとしてＦＳＢＡを評価した。本明細書に記載の研究は、活性に基づくプローブとしてのＦＳＢＡの有用性を明らかにし、ＡＴＰ拮抗プロテインキナーゼ阻害剤の選択のためのスクリーニングツールとして、ＬＣ／ＭＳを使用できることを明らかにする。
【００３４】
実施例１：オートラジオグラフィーによって検出されるＦＳＢＡのアフィニティー標識
ＡＴＰ類似体であるＦＳＢＡは、ＡＴＰポケットへの結合によって、ほとんどのプロテインキナーゼを共有結合標識するアフィニティー標識である。最初のＦＳＢＡ標識研究の場合、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−β Ｉ型受容体（アクチビン受容体様キナーゼ、ＡＬＫ５；Laping et al., Mol. Pharmacol. 62:58-64 (2002)）の組み換え発現され、精製されたキナーゼドメインを用いた。ＴＧＦ−βは、ＡＬＫ５を介して作用して、種々のメディエーターを活性化する。ＴＧＦ−βは、細胞外マトリックス合成のための強力な刺激であるので、ＡＬＫ５活性の阻害は、線維障害において有益であるかもしれない（Kanzler, et al., Am. J. Physiol. 39:G1059-G1068 (1999); Laping, et al. 2002）。
【００３５】
１４Ｃ−標識したＦＳＢＡは、ＡＬＫ５の精製調製物（(Laping et al., 2002）と共に、室温で１時間インキュベートした。試料は、１４Ｃ−ＦＳＢＡの添加前に、９５℃に加熱するか、または氷上で１０分間維持した。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、オートラジオグラフィーで処理するか、またはクーマシーブルー（Coomassie blue）で染色した。オートラジオグラフィーの結果は、ＦＳＢＡは非加熱ＡＬＫ５およびＣＤＫ２を標識したが、熱変性したＡＬＫ５を標識しなかったことを示した。冷却拮抗実験において、冷ＦＳＢＡは１４Ｃ−ＦＳＢＡのＡＬＫ５キナーゼへの結合と拮抗した。非加熱試料および加熱試料のクーマシーブルー染色パターンによると、ＦＳＢＡは、ＡＬＫ５の天然様コンホメーションにのみ結合する。同様の結果が、他のキナーゼのパネルについて得られた。
【００３６】
より初期の研究は、ＡＴＰが多くのキナーゼのＦＳＢＡ修飾と拮抗することを示している（Kamps et al., 1984; Fox et al., 1999; T'Jampens et al., 2002）。これらの研究をＡＬＫ５にまで拡大するために、精製ＡＬＫ５を１時間、〜２０μＭ１４Ｃ−ＦＳＢＡおよび１ｍＭまたは１０ｍＭ ＡＴＰと共にインキュベートした。オートラジオグラフィーおよびゲルのクーマシーブルー染色は、標識のほとんどが１ｍＭ ＡＴＰによって阻害され、１０ｍＭ ＡＴＰが１４Ｃ−ＦＳＢＡを阻害したので、オートラジオグラフは１４Ｃ−ＦＳＢＡ結合を検出しなかったことを示した。これらの結果は、ＦＳＢＡおよびＡＴＰがＡＬＫ５における同じ結合ポケットについて拮抗することを示す。熱変性およびＡＴＰ保護の結果は共に、ＦＳＢＡがキナーゼ・プロファイリング研究のための活性に基づくプローブである可能性を有することを示した。
【００３７】
実施例２：ＦＳＢＡによるアフィニティー標識後に行う代替技術としてのＬＣ／ＭＳ
ＬＣ／ＭＳによってキナーゼのＦＳＢＡ修飾を評価するために、時間依存的反応を行った。精製ＡＬＫ５をＦＳＢＡと共に室温でインキュベートし、所定の時間間隔で取り出した試料のアリコートをＬＣ／ＭＳに付した。デコンボリューション（deconvoluted）質量スペクトルプロファイルは、ＡＬＫ５のＦＳＢＡでの時間依存的共有結合修飾を示した。精製ＡＬＫ５は、ＡＬＫ５蛋白質のバキュロウイルス発現性非リン酸化形態に期待される分子量３４，９７４Ｄａを有する単一の優勢な親ピークを与えた（Laping, et al., 2002）。ＦＳＢＡの存在下でのインキュベーションは、時間依存的に、分子量の３５，４０５Ｄａへのシフトを引き起こした。６０分までに、親ピークは、４３３Ｄａの質量増加を伴う新しいピークに変わった。同様に、ＡＬＫ４およびＣＤＫ２（２つの他の組み換え発現され、精製されたキナーゼ）の共有結合修飾もまた、約１時間で完了した。該修飾は、ＦＳＢＡ−処理したＡＬＫ４およびＣＤＫ２蛋白質の分子量の増加（４３３Ｄａ）によって明らかにされた。
【００３８】
同条件下で、ＦＳＢＡは、トリプシンおよびＢＳＡ（ＡＴＰ結合部位を含有しないキナーゼ）を修飾しなかった。このことは、これらの研究下で試験されたＡＴＰ−要求性キナーゼに対するＦＳＢＡの選択的活性を示す。試験された各々のキナーゼの非修飾形態とＦＳＢＡ−修飾形態における差異は、フッ素原子の除去によって、共有結合したスルホニルベンゾイルアデノシン基の存在を明らかにする。これらの結果は、Fox et al. (1999)によって報告されたようなＦＳＢＡによるＰ３８γのアフィニティー標識に類似する。彼らのＬＣ／ＭＳ研究に基づくと、Ｐ３８γの非リン酸化形態とリン酸化形態のどちらも、ＦＳＢＡ−処理蛋白質の４３３Ｄａという質量増加によって示されるように、ＦＳＢＡによって修飾された。
【００３９】
実施例３：ＡＴＰは、ＬＣ／ＭＳによって測定した場合、ＦＳＢＡ修飾と拮抗する
オートラジオグラフィー研究は、ＡＴＰがＡＬＫ５キナーゼのＦＳＢＡ修飾と拮抗することを示した。ＬＣ／ＭＳによるＡＴＰ保護効果にしたがうために、およびＡＬＫ５結果を他のキナーゼにまで拡大するために、精製ＡＬＫ５、ＡＬＫ４およびＣＤＫ２キナーゼを表１に示すように、ＦＳＢＡおよび種々の量のＡＴＰ（０．１μＭ−１ｍＭ）の存在下で共にインキュベートした。
【００４０】
【表１】
【００４１】
ＡＴＰは、ＡＬＫ５およびＡＬＫ４の両方のＦＳＢＡによる共有結合修飾を濃度依存的に防ぎ、該共有結合修飾のほとんどが０．５ｍＭ ＡＴＰの存在下で阻害された。同様に、ＡＴＰは、ＣＤＫ２のＦＳＢＡによる標識を濃度依存的に防いだが、ＦＳＢＡ結合を阻害するのに５ｍＭのＡＴＰが必要であった。同様の結果が、１４Ｃ−ＦＳＢＡを用いるオートラジオグラフィーによって得られた。これらの結果は、ＡＴＰのＡＬＫ５およびＡＬＫ４に対するアフィニティーがＣＤＫ２に対するそれよりも有意に高いことを示唆する。これらの結果は、また、ＦＳＢＡ修飾と組み合わせたＬＣ／ＭＳがキナーゼのＡＴＰ結合ポケットに結合する能力について化合物を評価するための迅速な方法を提供することを示唆する。
【００４２】
実施例４：スタウロスポリンはＦＳＢＡ標識と拮抗する
ＡＴＰ拮抗性小型プロテインキナーゼ阻害剤（ＡＴＰ結合ポケットをも含む）は、ＦＳＢＡによるキナーゼの共有結合修飾を妨げることがわかった。微生物性アルカロイドであるスタウロスポリンは、強力であるが、非特異的なプロテインキナーゼ阻害剤である（Rueegg et al., Trends Pharmacol. Sci. 10:218 (1989); Garcia-Echeverria et al., 2000）。それは、ＣＤＫ２（DeBondt, et al., Nature 363:595-602 (1993)；Lawrie, et al., Nature Structural Biology 4:796-801 (1997)；Zhao, et al., J. Biol. Chem. 277:46609-46615（2002））およびＡＬＫ５（N. Laping, 発表されていない結果）を包含する多くのキナーゼ（Jacobson, et al., J. Cell Biol. 133:1041-1051 (1996); Schnier, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1041-1051（1996））を、ナノモル濃度範囲のＩＣ５０値で阻害する。スタウロスポリンと複合体形成したＣＤＫ２およびＣｈｋ１キナーゼの結晶構造が報告されている（Lawrie, et al., 1997; Zhao, et al., 2002）。どちらの構造においても、スタウロスポリンは、ＡＴＰ結合溝において、舟形配座のテトラヒドロピラン環を用いて結合することが示された。
【００４３】
スタウロスポリンの保護効果を評価するために、精製ＡＬＫ５、ＡＬＫ４、ＣＤＫ２をＦＳＢＡおよび増加量のスタウロスポリンと共にインキュベートした。試料は、ＬＣ／ＭＳによって分析した。ＦＳＢＡおよびスタウロスポリンの存在下で試験した各キナーゼのＬＣ／ＭＳプロファイルは、スタウロスポリンがＦＳＢＡ標識を濃度依存的に阻害したことを明らかにした。表２に示すように、試験した全ての酵素に対するＦＳＢＡの結合は、本質的に、１０μＭスタウロスポリンの添加によって阻害された。
【００４４】
【表２】
【００４５】
実施例５：ビオチン化ＦＳＢＡ（ビオチン−ＦＳＢＡ）
ＣＨＫ４／ＦＳＢＡ複合体の結晶構造およびScoggins, et al. (1996)の発表された研究に基づいて、ＦＳＢＡは、そのリボース基のＲ２およびＲ３位でビオチン基を支持することがわかった。式Ｉ：
【化３】
［式中、
Ｒ２およびＲ３は独立して、Ｈまたは式ＩＩ：
【化４】
で示されるビオチンである］
で示される化合物が合成された。
【００４６】
３’および２’ヒドロキシ基の両方でビオチン化された化合物は、ＨＰＬＣを用いて、１つのビオチン基を含むＦＳＢＡから分離された。３’および２’ビオチン化ＦＳＢＡは、さらに、ＨＰＬＣを用いて、互いに分離された。各々の単一にビオチン化されたＦＳＢＡは、約６８０Ｄａの分子量を有する。
ビオチン化ＦＳＢＡは、溶液中で有用な遊離化合物として製造されてもよく、または固体支持体もしくは樹脂に結合していてもよい。
【００４７】
実施例６：ビオチン−ＦＳＢＡの合成
（＋）−ビオチン（０．０７０ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）を乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、１ｍＬ）中に加熱して溶解した。冷却時、ジ−イソプロピルカルボジイミド（２５μＬ、０．１６ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で１時間静置した。次いで、部分的にゲル化した溶液を５’−（４−フルオロスルホニルベンゾイル）アデノシン．１ＤＭＦ（ＦＳＢＡ、０．０５６３ｇ、０．１ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（１７．４μＬ、０．１ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（８００μＬ）中氷冷溶液に加えた。５分後、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（０．０１２２ｇ）の乾燥ＤＭＦ（２００μＬ）中溶液を加え、混合物を室温にゆっくりと温めた。反応物を分析的ＨＰＬＣ（Spherisorb S5 ODS2, ４５分にわたって４０％〜６０％Ｂ Ａ＝０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／水，Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％アセトニトリル／１０％水）に付した。反応の間に生じる異性体比は、一晩攪拌後、平衡に達する時間と共に変化した。
【００４８】
反応混合物を蒸発乾固し、最少容量の酢酸／水／アセトニトリル（容量で１０／４０／５０）中に再溶解し、次いで、分取ＨＰＬＣ（Hypersil 5u BDS C8, ２５０ｘ２１．２ｍｍ，２５％〜５０％Ｂ ８０分にわたる）によって精製した。２’（最初に溶出される）および３’異性体（１）を含有するフラクションをプールし、次いで、凍結乾燥した（各々、１０．２ｍｇおよび９．８ｍｇ回収された）。
【００４９】
実施例７：ビオチン−ＦＳＢＡの合成
（＋）−ビオチン（０．０３２ｇ、０．１４３ｍｍｏｌ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（０．０５４ｇ、０．１４３ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール・Ｈ２Ｏ（０．０２２ｇ、０．１４３ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（０．０１７５ｇ、０．１４３ｍｍｏｌ）および５’−（４−フルオロスルホニルベンゾイル）アデノシン（ＦＳＢＡ、０．０５６３ｇ、０．１ｍｍｏｌ）を乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．５ｍＬ）中に溶解し、氷浴で冷却した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．０７５ｍＬ、０．４３ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温に加温後、一晩攪拌した。反応物を分析的ＨＰＬＣ（Spherisorb S5 ODS2, ４５分にわたる４０％〜６０％Ｂ Ａ＝０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／水，Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％アセトニトリル／１０％水）に付した。反応の間に生じた異性体比は、一晩攪拌後、平衡に達する時間と共に変化した。
【００５０】
反応混合物を蒸発乾固し、最少容量の酢酸／水／アセトニトリル（容量で１０／４０／５０）中に再溶解し、次いで、分取ＨＰＬＣ（Hypersil 5u BDS C8, ２５０ｘ２１．２ｍｍ，８０分にわたって２５％〜５０％Ｂ）によって精製した。２’（最初に溶出される）および３’異性体（１）を含有するフラクションをプールし、次いで、凍結乾燥した（各々、１０．２ｍｇおよび９．８ｍｇ回収された）。
【００５１】
実施例８：ビオチン−ＦＳＢＡとＡＬＫ５の結合
精製ＡＬＫ５（１０μｇ）を室温で、２μＭ、１０μＭおよび２０μＭの３’ビオチン−ＦＳＢＡと共に、別々の容器中でインキュベートした。各溶液の内容物をＬＣ／ＭＳに付した。デコンボリューション質量スペクトルプロファイルは、ＡＬＫ５の３’ビオチン−ＦＳＢＡでの濃度依存的な共有結合修飾を示した。精製ＡＬＫ５は、ＡＬＫ５蛋白質のバキュロウイルス発現型非リン酸化形態に予想される３４，９７１Ｄａの分子量を有する単一の優勢ピークを与えた（Laping et al., 2002）。３’ビオチン−ＦＳＢＡの存在下でのインキュベーションは、濃度依存的に、３５，６３１Ｄａへの分子量のシフトをもたらした。１０μｇ ＡＬＫ５を２０μＭ ３’ビオチン−ＦＳＢＡと共にインキュベートしたとき、該親ピークは、約６６０Ｄａの増加質量を有する新規なピークに変化した。同様の結果が、ＣＤＫ２を３’ビオチン−ＦＳＢＡと共にインキュベートした場合に観察された。
【００５２】
これらの結果は、ビオチン化ＦＳＢＡが非ビオチン化ＦＳＢＡと同じくらい効果的にプロテインキナーゼを修飾することを示す。同様に、これらの結果は、ＬＣ／ＭＳを用いてキナーゼとビオチン−ＦＳＢＡの結合を検出しうることを示す。
【００５３】
実施例９：ＡＴＰはビオチン−ＦＳＢＡ修飾と拮抗する
ＡＬＫ５を、ビオチン−ＦＳＢＡ（２０μＭ）と共に、またはビオチン−ＦＳＢＡを用いないでインキュベートした。ビオチン−ＦＳＢＡを含有するＡＬＫ５のアリコートをまた、下記の濃度：０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１．０ｍＭおよび１０ｍＭのＡＴＰと共にインキュベートした。さらに、ＡＬＫ５およびビオチン−ＦＳＢＡのアリコートを下記の濃度：０．１μＭ、１．０μＭ、５．０μＭ、１０．０μＭおよび１００．０μＭのスタウロスポリンと共にインキュベートした。
【００５４】
ウェスタンブロットのための試料を下記のように調製した。各試料のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、エレクトロブロッティングによってＰＶＤＦ膜上に転移させた。転移後、膜を１％Ｔｗｅｅｎを含有するＴｒｉｓ−緩衝化セーライン（ＴＢＳ）（ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）および３％（ｗｔ／ｖｏｌ）無脂肪ドライミルク中、室温で１時間ブロックした。次いで、ブロットを、３％無脂肪ドライミルクを含有するＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中におけるアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体（Bio-Rad, １：１０００希釈）で、室温で１時間処理した。ブロットをＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し（各洗浄は５−１０分）、次いで、Supersignal West Pico 化学ルミネセンス基質（Pierce）で１分間処理した。AlphaImager 2000 (Alpha Innotech) を用いることによって、ブロットを曝露し、顕出した。
【００５５】
クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットは、ＡＴＰおよびスタウロスポリンの両方がＡＬＫ５結合について、ビオチン−ＦＳＢＡと競合したことを示した。精製ＡＬＫ５は、ビオチン−ＦＳＢＡの存在下で、ＡＬＫ５単独の場合と比べてＳＤＳ−ゲル上でシフトし、それにより、より高い分子量を示した。ＡＴＰ（＞１．０ｍＭ）またはスタウロスポリン（＞５．０μＭ）の存在下、ビオチン−ＦＳＢＡ／ＡＬＫ５バンドは、ウェスタンブロットによって測定した場合、もはや目に見えなかった。
【００５６】
実施例１０：ＡＬＫ５阻害剤は、ビオチン−ＦＳＢＡのＡＬＫ５への結合を阻害する
精製ＡＬＫ５（５μｇ）、ＣＤＫ２（１０μｇ）およびＢＳＡ（５μｇ）を各々、ビオチン−ＦＳＢＡ（４０μＭ）と共に、室温で約２時間、別々の容器中でインキュベートした。試料をビオチンＦＳＢＡ単独と共に、および２０μＭの既知のＡＬＫ５阻害剤（ＳＢ４３１５４２）と共にインキュベートした。ＳＢ４３１５４２は、ＡＬＫ５阻害剤として、Gareth, et al., Mol Pharmacol (2002) 62: 65-7 and Laping, et al., Mol Pharmacol (2002) 62: 58-64中に記載されている。次いで、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびクーマシーブルー染色に付し、実施例９に記載のように、ウェスタンブロットを行った。
【００５７】
ビオチン−ＦＳＢＡは、ＡＬＫ５阻害剤を用いる、または用いないＣＤＫ２の試料中で酵素に結合することがウェスタンブロットによって検出された。ウェスタンブロットは、ＢＳＡの試料についてバンドを示さず、このことは、ビオチン−ＦＳＢＡがＢＳＡに結合しなかったことを示した。ＡＬＫ５およびビオチン−ＦＳＢＡを含有する試料は、ウェスタンブロットによって検出されたが、阻害剤を含有するＡＬＫ５試料についてバンドは検出されず、このことは、ビオチン−ＦＳＢＡがＡＬＫ５阻害剤の存在下でＡＬＫ５に結合しなかったことを示した。
【００５８】
実施例１１：ビオチン−ＦＳＢＡを用いて複合体プロテオームからキナーゼをプロファイリングする
Ｔｒｉｔｏｎ抽出したＨｅＬａ細胞を溶解および透析してＡＴＰおよびＡＤＰを除去した。細胞ライゼートは、アビジンビーズを用いて事前に清浄化した。細胞抽出物をスタウロスポリン（５００μＭ）と共に、またはスタウロスポリンを用いないで、室温で２時間インキュベートした。次いで、ライゼート試料をビオチン−ＦＳＢＡと共にさらに４時間インキュベートした。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに付し、クーマシーブルーで染色した。また、ウェスタンブロットを実施例９の記載のとおりに行った。クーマシー染色ゲルは、試料間でゲルバンドの差異をほとんど示さなかった。ウェスタンブロット分析は、スタウロスポリンが存在した試料において、選択されたバンドについてバンド強度の顕著な減少を示した。このことは、スタウロスポリンがビオチン−ＦＳＢＡと、細胞ライゼート中のある特定の蛋白質について競合することを示す。
【００５９】
実施例１２：ビオチン−ＦＳＢＡおよび選択的阻害剤を用いて複合体プロテオームからキナーゼをプロファイリングする
ＨｅＬａ細胞を実施例９に記載のように、溶解し、事前に清浄化した。細胞ライゼート（８０μｇ）を別々の容器中、キナーゼ阻害剤を用いないで、または５００μＭスタウロスポリンと共に、またはＲｈｏ結合型プロテインキナーゼ／ＲＯＣＫ（以下、「ＲＯＣＫ」という）の２つの選択的阻害剤のうち１つと共に、室温で２時間インキュベートした。ビオチン−ＦＳＢＡを各容器に加え（２０μＭ）、室温でさらに４時間インキュベートした。各混合物のアリコートを実施例９に記載のように、ウェスタンブロットにより分析した。ＲＯＣＫおよびＲＯＣＫの選択的阻害剤は、Uehata, et al., Nature (1997) 389:990-994に記載されている。
スタウロスポリンと共に、または２つのＲＯＣＫ阻害剤のうち１つと共にインキュベートした細胞抽出物は、阻害剤を用いないでインキュベートした細胞抽出物と比べて、選択的バンドにおける強度の減少を示した。これにより、キナーゼ阻害剤の存在下で、ビオチン−ＦＳＢＡの選択的蛋白質への結合の減少が示された。該バンド強度の減少は、細胞ライゼートを用いて、可能性のあるキナーゼをさらに同定するのに使用できるかもしれない。
【００６０】
実施例１３：ＲＯＣＫ１阻害剤はビオチン−ＦＳＢＡのＲＯＣＫへの結合を阻害するが、ＡＬＫ５への結合を阻害しない
約１０μｇのヒトＲＯＣＫ１（ｈＲＯＣＫ１）（４８ｋＤａ）またはＡＬＫ５（３４ｋＤａ）を別々に、１０μＭ ＦＳＢＡと共に、２つの既知ｈＲＯＣＫ１阻害剤（ＳＢ−７４２５４８およびＹ−２７６３２）を用いて、または用いないで、室温で３時間、共にインキュベートした。０．１％ＴＦＡで反応を止めた。ＬＣ／ＭＳにより、試料を分析した。試験した各阻害剤のＬＣ／ＭＳプロファイルにより、ｈＲＯＣＫ１阻害剤は、ＲＯＣＫ１のＦＳＢＡ標識を阻害したが、ＡＬＫ５のＦＳＢＡ標識を阻害しなかったことが明らかになった。化合物ＳＢ−７４２５４８および類似化合物は、ＷＯ０３／０８０６１０（出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）に記載されている。Ｙ−２７６３２は、Uehata, et al., Nature (1997) 389:990-994において、ＲＯＣＫ１の選択的阻害剤として記載されている。
【００６１】
実施例１４：ＲＯＣＫ阻害剤の作用様式
約１０μｇのヒトＲＯＣＫ１（ｈＲＯＣＫ１）（４８ｋＤａ）を１０μＭ ＦＳＢＡと共に、Ｙ−２７６３２を用いて（ＦＳＢＡに対し１：１の比率またはＦＳＢＡに対して１：５の濃度比で）、または用いないで、室温で３時間共にインキュベートした。０．１％ＴＦＡで反応を止めた。ＬＣ／ＭＳにより、試料を分析した。ＬＣ／ＭＳプロファイルは、１：１比のＹ−２７６３２がｈＲＯＣＫ１を阻害することを明らかにした。かくして、該阻害剤は、ｈＲＯＣＫ１の拮抗阻害剤として作用する。
【００６２】
実施例１５：ＡＬＫ５に対するＲＯＣＫ阻害剤の評価
精製ＡＬＫ５（５μｇ）をＦＳＢＡ（４０μＭ）と共に、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２）を用いて、または用いないで、約２時間インキュベートした。０．１％ＴＦＡで反応を止めた。ＬＣ／ＭＳにより、試料を分析した。ＦＳＢＡの存在下で試験されたＬＣ／ＭＳプロファイルは、Ｙ−２７６３２がＡＬＫ５に対するＦＳＢＡ結合に対し、影響を及ぼさなかったことを明らかにした。
【００６３】
上記の記載は、どのように本発明を実施し、使用するかを十分に開示する。しかしながら、本発明は、上記の特定の具体例に限定されるものではなく、添付の請求の範囲の範囲内での全てのその修飾およびその等価物を包含する。当業者は、ルーチンな実験により、本発明の範囲から逸脱することなく、種々の変更および修飾がなされることを理解するであろう。本明細書中に引用される定期刊行物、特許および他の特許出願に対する種々の言及は、出典明示により、あたかも完全に示されているかの如く本明細書の一部とされる。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
プロテインキナーゼは、真核生物における最も大きい蛋白質スーパーファミリーの１つを代表する。ヒト属の機能的分類に基づくと、ヒトゲノム中にコード化されるプロテインキナーゼの数は、概算で５００を越えるが、１０００未満であり、それは、ヒトの全遺伝子の約３％を構成する（Venter, et al., Science, 291:1304-1351(2001)）。プロテインキナーゼは、シグナル変換経路および多くの細胞調節過程、例えば、細胞分裂および分化、発達、腫瘍形成、細胞生存およびアポトーシスにおいて重要な役割を果たす。さらに、多くのプロテインキナーゼをコードしている遺伝子は、疫学的関連遺伝子の多くの上流または下流に位置し、それらを治療的介入の標的として強調している。したがって、プロテインキナーゼが、多くの疾患の新規な治療剤の同定および開発のための魅力的な標的として明らかであることは、驚くべきことではない。
【０００２】
配列アラインメント研究は、ほとんどのプロテインキナーゼが約２７０個のアミノ酸からなる共通のコアを有することを明らかにした（(Hank, S.K., and Hunter, T., The Protein Kinase Facts Book, Ed G. Kardie and S. Hanks, Academic Press, NY. (1995)）。キナーゼの結晶構造を比較する研究は、全てのキナーゼのコア構造が共通の折り畳み構造をとることを示した（Hanks and Hunter, 1995）。最も注目すべきは、ＡＴＰ結合に関与するＮ末端ドメイン中の領域および蛋白質基質認識に関与するＣ末端ドメイン中の領域が、その活性形態における結晶構造によって明らかにされるように、ほとんどのキナーゼにおいて類似の配座をとることである。ＡＴＰ結合部位は、Ｎ末端ローブおよびＣ末端ローブの中間面に位置する。
【０００３】
構造研究は、これまでに研究された小型分子キナーゼ阻害剤のほとんどがＭｇ−ＡＴＰ複合体結合ポケットに結合することを示した（Garcia-Echeverria et al., Med. Res. Rev., 20:28-57 (2000)）。結果として、化学的鋳型を調節し、微調整することによって、強力かつ選択的なＡＴＰ部位に向けられたプロテインキナーゼ阻害剤の合成に向けて、相当な進歩がなされた（Garcia-Echeverria et al., 2000）。これらの研究は共に、ＡＴＰ結合の溝（binding cleft）が強力で特異的な阻害剤の開発のための理想的な標的ではないという許容された考えに異議を唱えた。
【０００４】
ｐ−フルオロスルホニルベンゾイル５’−アデノシン（ＦＳＢＡ）は、種々のプロテインキナーゼにおけるヌクレオチド結合部位の共有結合修飾に効果的であるＡＴＰ−アフィニティー試薬である（Kamps, et al., Nature 310:589-592 (1984); Scoggins, et al., Biochemistry 35:9197-9203 (1996); Young, et al., J. Biol. Chem. 272: 12116-12121 (1997); Fox, et al., FEBS Letts. 461:323-328 (1999)）。構造的に、ＦＳＢＡは、ＡＴＰの３個のホスフェートの代わりにフルオロスルホニルベンゾイル基が存在することを除き、ＡＴＰに類似している。ＦＳＢＡは、多くのプロテインキナーゼを選択的に標識し、特徴付けるために使用された。プロテインキナーゼの一群において行われたペプチド・マス・フィンガープリンティング研究は、ＦＳＢＡがＡＴＰ結合部位において見出される決定的な保存されたリジンの側鎖に不可逆的に結合することを示した（Kamps, et al., 1984; Zoller et al., J. Biol. Chem. 256:10837-10842 (1981)）。１４Ｃ−標識ＦＳＢＡ（Fox, et al., 1999; Buhrow, et al., . Biol. Chem. 258:7824-7827 (1983)）およびＦＳＢＡ−特異的抗体（Parker, FEBS Letts. 334:347-350 (1993); T'Jampens, et al., FEBS Letts. 516:20-26 (2002)）は、細胞ライゼート由来のプロテインキナーゼを同定し、特徴付けるために使用されたが、これらの試薬は、その制限のために、阻害剤スクリーニングには有効に使用されていない（T'Jampens, et al., 2002）。
【０００５】
液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）技術は、天然および組み換え発現された蛋白質の共有結合修飾をモニターするのに価値を有している（Feng, et al., Anal. Chem. 73:5691-5697（2001））。これらの技術は、また、薬物代謝および薬物動態学研究においてルーチンに使用されてきた（Feng, et al., 2001）が、スクリーニングツールとしてのその使用は、幅広く研究されていない。
【０００６】
したがって、キナーゼを阻害する化合物を同定する方法が大いに必要とされている。さらに、プロテインキナーゼをプロファイルする方法もまた、大いに必要とされている。
【０００７】
発明の概要
本発明の一の具体例は、ＡＴＰ結合部位を有する酵素の組成物、該酵素のＡＴＰ結合部位に結合可能な被検体、および試験化合物を接触させ、次いで、該試験化合物が該被検体の該酵素のＡＴＰ結合部位への結合を阻害するかどうかを検出することを特徴とする、ＡＴＰ結合部位を有する酵素を阻害する化合物を同定する方法を提供することにある。
【０００８】
本発明のさらなる具体例は、ＡＴＰ結合部位を有するキナーゼを含む組成物、および該キナーゼのＡＴＰ結合部位に結合する被検体を接触させ；該被検体のＡＴＰ結合部位への結合を検出し；該キナーゼを含む組成物、該被検体および試験化合物を接触させ、次いで、該試験化合物が該被検体の該ＡＴＰ結合部位への結合を阻害するかどうかを検出する工程を含む、ＡＴＰ結合部位を有するキナーゼを阻害する化合物を同定する方法を提供する。
【０００９】
本発明の別の具体例において、ＡＴＰ結合部位を有するキナーゼを含む組成物、および試験化合物を接触させ；該キナーゼを含む該組成物および該試験化合物と被検体を接触させ；次いで、該試験化合物が該被検体の該キナーゼのＡＴＰ結合部位への結合を阻害するかどうかを検出する工程を含む、ＡＴＰ結合部位を有するキナーゼを阻害する試験化合物を同定する方法が提供される。
【００１０】
また、本発明において、キナーゼに対する試験化合物の結合の検出が液体クロマトグラフィー／質量分析の使用からなる方法が提供される。
本発明の別の具体例において、ＡＴＰ結合部位を有するプロテインキナーゼを含む組成物と、該キナーゼに結合可能な被検体を接触させ、次いで、被検体が該キナーゼに結合するかどうかを検出する工程を含む、ＡＴＰ結合部位を有するプロテインキナーゼを同定する方法が提供される。
別の具体例において、ビオチン−ＦＳＢＡが提供される。
【００１１】
また、本発明において、（ａ）第１のＡＴＰ結合部位を有する第１の酵素を含む組成物、該酵素の第１のＡＴＰ結合部位に結合可能な被検体、および試験化合物を接触させ、ここに、被検体の試験化合物に対する濃度比率が少なくとも１：１であり、次いで、（ｂ）該試験化合物が該被検体の該第１のＡＴＰ結合部位への結合を阻害するかどうかを検出し、ここに、該第１のＡＴＰ結合部位に結合している被検体の減少が該試験化合物による拮抗的阻害を示す工程を含む、第１のＡＴＰ結合部位を有する第１の酵素を阻害する試験化合物の作用様式を同定する方法が提供される。本発明の別の態様において、（ａ）第２のＡＴＰ結合部位を有する第２の酵素を含む組成物、該第２の酵素の第２のＡＴＰ結合部位に結合可能な被検体、および試験化合物を接触させ；（ｂ）該試験化合物が該被検体の該第２のＡＴＰ結合部位への結合を阻害するかどうかを検出し；次いで（ｃ）該試験化合物が該酵素の選択的阻害剤であるかどうかを決定することを特徴とする、試験化合物の作用様式を同定する方法が提供される。各方法において使用される被検体は、同一または異なっていてもよい。また、本発明により、化合物の作用様式を同定する方法が提供され、ここに、被検体の第１の酵素への結合を減少させるが、被検体の第２の酵素への結合を減少させない試験化合物は、第１の酵素の選択的阻害剤である。
【００１２】
発明の詳細な記載
用語
本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド」なる語は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合によって互いに結合した２以上のアミノ酸を含むいずれかのペプチドまたは蛋白質をいう。「ポリペプチド」なる語は、一般にペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーと称される短鎖、および一般に蛋白質と称される長鎖の両方をいう。ポリペプチドは、２０種類の遺伝子コード化アミノ酸以外のアミノ酸を含んでいてもよい。「ポリペプチド」は、プロセッシングおよび他の翻訳後修飾などの天然過程によって修飾されたものだけでなく、化学的修飾技術によって修飾されたものも包含する。かかる修飾は、基本的な教本およびより詳細な研究論文、ならびに豊富な研究文献においてよく記載されており、それらは当業者によく知られている。同じ型の修飾が所定のポリペプチド中のいくつかの部位に同じ程度または種々の程度で存在しうることは明らかであろう。また、所定のポリペプチドは、多くの型の修飾を含みうる。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノまたはカルボキシル末端を包含するポリペプチドのどこにでも起こることができる。修飾は、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム基の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白質分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化、セレノイル化（selenoylation）、硫酸化、アミノ酸の蛋白質へのトランスファーＲＮＡ媒介性付加、例えば、アルギニル化、およびユビキチン化を包含する。例えば、PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993) and Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pgs. 1-12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990) および Rattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62 (1992) を参照のこと。ポリペプチドは、分枝していてもよく、または分枝を有するか、または有さずに環化していてもよい。環化、分枝および分枝した環状ポリペプチドは、翻訳後の天然過程に由来していてもよく、また、完全に合成法によって作製されてもよい。
【００１３】
本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」なる語は、一般に、修飾されていないＲＮＡまたはＤＮＡあるいは修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡであってもよいいずれかのポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをいう。「ポリヌクレオチド」なる語は、限定するものではないが、１本鎖および２本鎖ＤＮＡ、１本鎖および２本鎖領域または１本鎖、２本鎖および３本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、１本鎖および２本鎖ＲＮＡ、ならびに１本鎖および２本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、１本鎖またはより典型的には、２本鎖、または３本鎖領域、または１本鎖および２本鎖領域の混合物であってもよいＤＮＡおよびＲＮＡからなるハイブリッド分子を包含する。さらに、本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」なる語は、ＲＮＡまたはＤＮＡあるいはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む３本鎖領域をいう。かかる領域における鎖は、同じ分子から由来してもよく、または異なる分子から由来してもよい。該領域は、１以上の該分子の全てを含んでいてもよいが、典型的には、該分子のいくつかの領域だけを含む。３重らせん領域の分子の１つは、しばしば、オリゴヌクレオチドである。本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」なる語は、また、１以上の修飾された塩基を含む上記のＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。かくして、安定性または他の理由で修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書中で意図されるとおりの「ポリヌクレオチド」である。さらに、異常な塩基、例えば、イノシン、または修飾された塩基、例えば、トリチル化塩基（２つだけ例を挙げるが）を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書中で使用される用語のとおりのポリヌクレオチドである。多種多様な修飾が、当業者に既知の多くの有用な目的を提供するＤＮＡおよびＲＮＡになされることは、明らかであろう。本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」なる語は、かかる化学的に、酵素的に、または代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチド、ならびに例えば、単純および複雑な細胞を包含するウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的な形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、しばしば、オリゴヌクレオチドと称される短いポリヌクレオチドを包含する。
【００１４】
本明細書中で使用される場合、「キナーゼ」なる語は、リン酸化またはリン酸基を別の分子に付加することのできるいずれかのポリペプチドをいう。他の分子は、限定するものではないが、別のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはコファクターであってもよい。キナーゼは、触媒作用可能な酵素であってもよい。
本明細書中で使用される場合、「ビオチン−」または「ビオチン化された」なる語は、ビオチン基が結合しているいずれかの分子をいう。ビオチン基は、共有結合していてもよい。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、「プロテアーゼアッセイ」なる語は、ポリペプチドのプロテアーゼ活性が測定されるアッセイをいう。プロテアーゼ活性は、限定するものではないが、ポリペプチドをペプチドフラグメントに切断することのできる酵素を包含しうる。
本明細書中で使用される場合、「キナーゼアッセイ」なる語は、キナーゼの活性が測定されるアッセイをいう。キナーゼ活性は、限定するものではないが、キナーゼによる基質のリン酸化の速度または量を包含しうる。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、「拮抗阻害剤」なる語は、天然基質と同じ結合部位に対して競合することによって、基質に結合される酵素の割合を減少させることによって、酵素触媒作用速度を減少させるいずれかの化合物をいう。例えば、拮抗阻害剤は、酵素の活性部位に結合することによって、酵素の天然基質と競合しうる。
本明細書中で使用される場合、「非拮抗阻害剤」なる語は、酵素に結合する基質に影響をもたらさない化合物をいう。基質および阻害剤は可逆的、無作為かつ独立的に、酵素上の異なる部位に結合する。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、「非拮抗阻害剤」なる語は、遊離の酵素に結合しないが、酵素−基質複合体に可逆的に結合し、それにより、不活性な酵素−基質−阻害剤複合体を生じる化合物をいう。
【００１８】
近年、フルオロホスホネート／フルオロホスフェート（ＦＰ）誘導体は、セリンヒドロラーゼをプロファイリングするのに使用された（(Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:14694-14699(1999); Kidd et al., Biochemistry 40, 4005-4015 (2001)）。ＦＰ阻害剤は、活性依存的に多くのセリンヒドロラーゼに対して反応性を示す。ＦＳＢＡは、活性部位へ結合することによって、キナーゼの一団と反応し、その標識化は、キナーゼのコンホメーション／活性状態に依存的であるようである。したがって、ＦＳＢＡは、キナーゼのＡＴＰ拮抗阻害剤を選択するために、ＡＢＰとして使用された。
【００１９】
ＦＳＢＡの放射性形態（市販されている）は、キナーゼ・プロファイリング研究に使用できるが、フルオログラフィーによるその検出は、数日ないし数週間を必要とする。さらに、放射性材料の取扱および処分もまた、それをスクリーニング研究の魅力のない試薬としている。キナーゼのＦＳＢＡ修飾は、ＬＣ／ＭＳに対して安定であると予想される共有結合であるので、ＬＣ／ＭＳは、オートラジオグラフィーの別法として、本発明の一部として使用された。
【００２０】
ＦＳＢＡはプロテインキナーゼのＡＴＰ結合ポケットにおいて共有結合するので、ＬＣ／ＭＳは、ＡＴＰ拮抗プロテインキナーゼ阻害剤のスクリーニングにおいて有用性を有する。本発明は、精製した組み換えキナーゼおよびＦＳＢＡを活性に基づくプローブ（activity-baased probe: ＡＢＰ）として用いると、ＬＣ／ＭＳが、プロテインキナーゼのＡＴＰ拮抗阻害剤をスクリーンするための一般的な迅速かつ再現性のある手段を提供することを明らかにする。
【００２１】
本発明において、オートラジオグラフィーおよびＬＣ／ＭＳ技術は、ＦＳＢＡをプロテインキナーゼの活性に基づくプローブとして評価するために使用される。本明細書中に提供される研究は、活性に基づくプローブとしてのＦＳＢＡの有用性およびＡＴＰ拮抗プロテインキナーゼ阻害剤の選択のためのスクリーニングツールとしてのＬＣ／ＭＳの有用性を明らかにする。評価に数日ないし数週間かかるフルオログラフィーと比べると、ＬＣ／ＭＳは、阻害剤スクリーニングの迅速な検出（例えば、数分以内）を可能にする。さらに、新たな一体化した１０−ポンプで８チャンネルのパラレルＬＣ／ＭＳ（Feng et al., 2001）の出現で、該方法は、ハイスループットモードにおいても使用される可能性を有する。
【００２２】
ビオチンは、可視マーカーと共に使用してもよい。可視シグナルを提供することのできる分子に結合したアビジンまたはストレプトアビジンを用いてビオチンを検出できることは、当該分野で理解されている。典型的には、アビジンまたはストレプトアビジン結合型西洋ワサビペルオキシダーゼをウェスタンブロットにおいて使用して、ビオチン化抗体を検出する。本発明の一部として、ビオチンをＦＳＢＡに共有結合させ、次いで、それをマーカーに結合したアビジンまたはストレプトアビジンによって検出してもよい。本明細書中で使用される場合、「ウェスタンブロット」なる語は、固体支持体に結合したポリペプチドを検出する方法を包含し、ここに、該ポリペプチドを、ビオチン基を有する分子と接触させる。該ビオチン基は、抗体またはＦＳＢＡに結合していてもよい。次いで、ビオチンは、可視シグナルを提供することのできる分子に結合したアビジンまたはストレプトアビジンを用いて可視化される。
【００２３】
かくして、本発明の１の具体例は、ＡＴＰ結合部位を有する酵素の組成物、該酵素のＡＴＰ結合部位に結合可能な被検体、および試験化合物を接触させ、次いで、該試験化合物が、該被検体の該ＡＴＰ結合部位への結合を阻害するかどうかを検出することを特徴とする、ＡＴＰ結合部位を有する酵素を阻害する化合物を同定する方法を提供することにある。本発明の一の態様において、該酵素はキナーゼである。本発明の別の態様において、試験化合物は、被検体の拮抗阻害剤である。本発明のまた別の態様において、被検体は、ｐ−フルオロスルホニルベンゾイル５’−アデノシン（ＦＳＢＡ）である。本発明のまた別の態様において、該酵素は、ＡＴＰ結合部位において保存されたリジンを含む。本発明のまた別の態様において、被検体は、保存されたリジンに結合する。試験化合物が被検体の酵素への結合を阻害するかどうかの検出は、質量分析、プロテアーゼアッセイまたはキナーゼアッセイによって行うことができる。
【００２４】
本発明の別の具体例において、ＡＴＰ結合部位を有するキナーゼを含む組成物、および該キナーゼのＡＴＰ結合部位に結合する被検体を接触させ；被検体のＡＴＰ結合部位への結合を検出し；該キナーゼを含む組成物、該被検体および試験化合物を接触させ、次いで、試験化合物が該被検体の該ＡＴＰ結合部位への結合を阻害するかどうかを検出する工程を含む、ＡＴＰ結合部位を有するキナーゼを阻害する化合物の同定方法が提供される。本発明の別の態様において、該酵素は、ＡＴＰ結合部位において保存されたリジンを有する。本発明のまた別の態様において、被検体は保存されたリジンに結合する。本発明の別の態様において、被検体のＡＴＰ結合部位への結合は、質量分析、プロテアーゼアッセイまたはキナーゼアッセイによって行うことができる。本発明の別の態様において、試験化合物は被検体の拮抗阻害剤である。被検体は、ｐ−フルオロスルホニルベンゾイル５’−アデノシン（ＦＳＢＡ）であってもよい。
【００２５】
本発明の別の具体例において、ＡＴＰ結合部位を有するキナーゼを含む組成物および試験化合物を接触させ；該キナーゼを含む組成物および該試験化合物と被検体を接触させ；次いで、試験化合物が該被検体の該キナーゼのＡＴＰ結合部位への結合を阻害するかどうかを検出する工程を含む、ＡＴＰ結合部位を有するキナーゼを阻害する試験化合物を同定する方法が提供される。本発明の別の態様において、該酵素は、ＡＴＰ結合部位において保存されたリジンを有する。本発明の別の態様において、被検体は保存されたリジンに結合する。試験化合物が被検体のキナーゼのＡＴＰ結合部位への結合を阻害するかどうかの検出は、質量分析、プロテアーゼアッセイまたはキナーゼアッセイを用いて行うことができる。本発明のまた別の態様において、試験化合物は、被検体の拮抗阻害剤である。被検体は、ｐ−フルオロスルホニルベンゾイル５’−アデノシン（ＦＳＢＡ）であってもよい。
【００２６】
また別の具体例において、ＡＴＰ結合部位を有するプロテインキナーゼを含む組成物と、該キナーゼに結合可能な被検体を接触させ、次いで、被検体が該キナーゼに結合するかどうかを検出する工程を含む、ＡＴＰ結合部位を有するプロテインキナーゼを同定する方法が提供される。別の態様において、被検体は、ｐ−フルオロスルホニルベンゾイル５’−アデノシン（ＦＳＢＡ）である。別の態様において、プロテインキナーゼをキナーゼ阻害剤と接触させる。別の態様において、ウェスタンブロットを用いてＦＳＢＡ結合を検出する。別の態様において、ＬＣ／ＭＳを用いてＦＳＢＡ結合を検出する。
【００２７】
別の具体例において、ビオチン−ＦＳＢＡが提供される。別の態様において、式Ｉ：
【化１】
［式中、
Ｒ１およびＲ２は独立して、Ｈまたは式ＩＩ：
【化２】
で示されるビオチンである］
で示される化合物が提供される。
【００２８】
ビオチン化されたＦＳＢＡは、溶液中で有用な遊離化合物として製造されてもよく、または固体支持体もしくは樹脂に結合していてもよい。別の具体例において、式Ｉの化合物の製法が提供される。
【００２９】
また、本発明において、（ａ）第１のＡＴＰ結合部位を有する第１の酵素を含む組成物、該酵素の第１のＡＴＰ結合部位に結合可能な被検体、および試験化合物を接触させ、ここに、被検体の試験化合物に対する濃度比率は、少なくとも１：１であり、次いで（ｂ）該試験化合物が該被検体の該第１のＡＴＰ結合部位への結合を阻害するかどうかを検出し、ここに、第１のＡＴＰ結合部位に結合する被検体の減少が、該試験化合物による拮抗阻害を示す工程を含む、第１のＡＴＰ結合部位を有する第１の酵素を阻害する試験化合物の作用様式を同定する方法が提供される。本発明の別の態様において、（ａ）第２のＡＴＰ結合部位を有する第２の酵素を含む組成物、第２の酵素の第２のＡＴＰ結合部位に結合可能な被検体、および該試験化合物を接触させ；（ｂ）該試験化合物が該被検体の該第２のＡＴＰ結合部位への結合を阻害するかどうかを検出し；ついで（ｃ）該試験化合物が該酵素の選択的阻害剤であるかどうかを決定することを含む、試験化合物の作用様式を同定する方法が提供される。各方法において使用される被検体は、同じであっても、異なっていてもよい。また、本発明によって、被検体の第１の酵素への結合を減少させるが、被検体の第２の酵素への結合を減少させない試験化合物が第１の酵素の選択的阻害剤である、化合物の作用様式を同定する方法が提供される。
【００３０】
下記の実施例は、本発明の種々の態様を説明するものである。これらの実施例は、添付の請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００３１】
精製プロテインキナーゼを下記の実施例において使用した。別記しないかぎり、蛋白質および化学物質は、Sigmaから入手した。１４Ｃ−標識化ＦＳＢＡは、Perkin Elmer Life Sciencesから入手した。１４Ｃ−ＦＳＢＡ標識したプロテインキナーゼ上のオートラジオグラフィーは、記載のとおりに行った（Buhrow et al., 1983; Fox et al., 1997）。乾燥させたゲルを−８０℃で２〜４週間、フィルムに曝露した。精製蛋白質およびＦＳＢＡ−修飾したプロテインキナーゼのＭＳ分析は、記載のとおりに行った（Feng, et al., 2001）。
【００３２】
ＦＳＢＡ標識の場合、別記しないかぎり、精製蛋白質（約０．２〜約０．５ｍｇ／ｍＬ）を１０μＭ ＦＳＢＡ（２．５％ＤＭＳＯ中）と共に室温でインキュベートした。時間依存性修飾研究の場合、以前の記載のとおりに、１０μｌアリコートを指定時間で取り出し、５０μｌの０．１％ＴＦＡと混合し、ＬＣ／ＭＳに注入した（Feng et al., 2001）。ＡＴＰ保護実験の場合、精製キナーゼを１０μＭ ＦＳＢＡならびに種々の量のＡＴＰおよびＭｇＣｌ２と共に、室温で１〜２時間共にインキュベートした。スタウロスポリン（staurosporine）保護実験の場合、精製プロテインキナーゼを１０μＭ ＦＳＢＡおよび種々の量のスタウロスポリン（０．１μＭ−１０μＭ）と共に、室温で１〜２時間共にインキュベートした。
【００３３】
オートラジオグラフィーおよびＬＣ／ＭＳを用いて、プロテインキナーゼのための活性に基づくプローブとしてＦＳＢＡを評価した。本明細書に記載の研究は、活性に基づくプローブとしてのＦＳＢＡの有用性を明らかにし、ＡＴＰ拮抗プロテインキナーゼ阻害剤の選択のためのスクリーニングツールとして、ＬＣ／ＭＳを使用できることを明らかにする。
【００３４】
実施例１：オートラジオグラフィーによって検出されるＦＳＢＡのアフィニティー標識
ＡＴＰ類似体であるＦＳＢＡは、ＡＴＰポケットへの結合によって、ほとんどのプロテインキナーゼを共有結合標識するアフィニティー標識である。最初のＦＳＢＡ標識研究の場合、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−β Ｉ型受容体（アクチビン受容体様キナーゼ、ＡＬＫ５；Laping et al., Mol. Pharmacol. 62:58-64 (2002)）の組み換え発現され、精製されたキナーゼドメインを用いた。ＴＧＦ−βは、ＡＬＫ５を介して作用して、種々のメディエーターを活性化する。ＴＧＦ−βは、細胞外マトリックス合成のための強力な刺激であるので、ＡＬＫ５活性の阻害は、線維障害において有益であるかもしれない（Kanzler, et al., Am. J. Physiol. 39:G1059-G1068 (1999); Laping, et al. 2002）。
【００３５】
１４Ｃ−標識したＦＳＢＡは、ＡＬＫ５の精製調製物（(Laping et al., 2002）と共に、室温で１時間インキュベートした。試料は、１４Ｃ−ＦＳＢＡの添加前に、９５℃に加熱するか、または氷上で１０分間維持した。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、オートラジオグラフィーで処理するか、またはクーマシーブルー（Coomassie blue）で染色した。オートラジオグラフィーの結果は、ＦＳＢＡは非加熱ＡＬＫ５およびＣＤＫ２を標識したが、熱変性したＡＬＫ５を標識しなかったことを示した。冷却拮抗実験において、冷ＦＳＢＡは１４Ｃ−ＦＳＢＡのＡＬＫ５キナーゼへの結合と拮抗した。非加熱試料および加熱試料のクーマシーブルー染色パターンによると、ＦＳＢＡは、ＡＬＫ５の天然様コンホメーションにのみ結合する。同様の結果が、他のキナーゼのパネルについて得られた。
【００３６】
より初期の研究は、ＡＴＰが多くのキナーゼのＦＳＢＡ修飾と拮抗することを示している（Kamps et al., 1984; Fox et al., 1999; T'Jampens et al., 2002）。これらの研究をＡＬＫ５にまで拡大するために、精製ＡＬＫ５を１時間、〜２０μＭ１４Ｃ−ＦＳＢＡおよび１ｍＭまたは１０ｍＭ ＡＴＰと共にインキュベートした。オートラジオグラフィーおよびゲルのクーマシーブルー染色は、標識のほとんどが１ｍＭ ＡＴＰによって阻害され、１０ｍＭ ＡＴＰが１４Ｃ−ＦＳＢＡを阻害したので、オートラジオグラフは１４Ｃ−ＦＳＢＡ結合を検出しなかったことを示した。これらの結果は、ＦＳＢＡおよびＡＴＰがＡＬＫ５における同じ結合ポケットについて拮抗することを示す。熱変性およびＡＴＰ保護の結果は共に、ＦＳＢＡがキナーゼ・プロファイリング研究のための活性に基づくプローブである可能性を有することを示した。
【００３７】
実施例２：ＦＳＢＡによるアフィニティー標識後に行う代替技術としてのＬＣ／ＭＳ
ＬＣ／ＭＳによってキナーゼのＦＳＢＡ修飾を評価するために、時間依存的反応を行った。精製ＡＬＫ５をＦＳＢＡと共に室温でインキュベートし、所定の時間間隔で取り出した試料のアリコートをＬＣ／ＭＳに付した。デコンボリューション（deconvoluted）質量スペクトルプロファイルは、ＡＬＫ５のＦＳＢＡでの時間依存的共有結合修飾を示した。精製ＡＬＫ５は、ＡＬＫ５蛋白質のバキュロウイルス発現性非リン酸化形態に期待される分子量３４，９７４Ｄａを有する単一の優勢な親ピークを与えた（Laping, et al., 2002）。ＦＳＢＡの存在下でのインキュベーションは、時間依存的に、分子量の３５，４０５Ｄａへのシフトを引き起こした。６０分までに、親ピークは、４３３Ｄａの質量増加を伴う新しいピークに変わった。同様に、ＡＬＫ４およびＣＤＫ２（２つの他の組み換え発現され、精製されたキナーゼ）の共有結合修飾もまた、約１時間で完了した。該修飾は、ＦＳＢＡ−処理したＡＬＫ４およびＣＤＫ２蛋白質の分子量の増加（４３３Ｄａ）によって明らかにされた。
【００３８】
同条件下で、ＦＳＢＡは、トリプシンおよびＢＳＡ（ＡＴＰ結合部位を含有しないキナーゼ）を修飾しなかった。このことは、これらの研究下で試験されたＡＴＰ−要求性キナーゼに対するＦＳＢＡの選択的活性を示す。試験された各々のキナーゼの非修飾形態とＦＳＢＡ−修飾形態における差異は、フッ素原子の除去によって、共有結合したスルホニルベンゾイルアデノシン基の存在を明らかにする。これらの結果は、Fox et al. (1999)によって報告されたようなＦＳＢＡによるＰ３８γのアフィニティー標識に類似する。彼らのＬＣ／ＭＳ研究に基づくと、Ｐ３８γの非リン酸化形態とリン酸化形態のどちらも、ＦＳＢＡ−処理蛋白質の４３３Ｄａという質量増加によって示されるように、ＦＳＢＡによって修飾された。
【００３９】
実施例３：ＡＴＰは、ＬＣ／ＭＳによって測定した場合、ＦＳＢＡ修飾と拮抗する
オートラジオグラフィー研究は、ＡＴＰがＡＬＫ５キナーゼのＦＳＢＡ修飾と拮抗することを示した。ＬＣ／ＭＳによるＡＴＰ保護効果にしたがうために、およびＡＬＫ５結果を他のキナーゼにまで拡大するために、精製ＡＬＫ５、ＡＬＫ４およびＣＤＫ２キナーゼを表１に示すように、ＦＳＢＡおよび種々の量のＡＴＰ（０．１μＭ−１ｍＭ）の存在下で共にインキュベートした。
【００４０】
【表１】
【００４１】
ＡＴＰは、ＡＬＫ５およびＡＬＫ４の両方のＦＳＢＡによる共有結合修飾を濃度依存的に防ぎ、該共有結合修飾のほとんどが０．５ｍＭ ＡＴＰの存在下で阻害された。同様に、ＡＴＰは、ＣＤＫ２のＦＳＢＡによる標識を濃度依存的に防いだが、ＦＳＢＡ結合を阻害するのに５ｍＭのＡＴＰが必要であった。同様の結果が、１４Ｃ−ＦＳＢＡを用いるオートラジオグラフィーによって得られた。これらの結果は、ＡＴＰのＡＬＫ５およびＡＬＫ４に対するアフィニティーがＣＤＫ２に対するそれよりも有意に高いことを示唆する。これらの結果は、また、ＦＳＢＡ修飾と組み合わせたＬＣ／ＭＳがキナーゼのＡＴＰ結合ポケットに結合する能力について化合物を評価するための迅速な方法を提供することを示唆する。
【００４２】
実施例４：スタウロスポリンはＦＳＢＡ標識と拮抗する
ＡＴＰ拮抗性小型プロテインキナーゼ阻害剤（ＡＴＰ結合ポケットをも含む）は、ＦＳＢＡによるキナーゼの共有結合修飾を妨げることがわかった。微生物性アルカロイドであるスタウロスポリンは、強力であるが、非特異的なプロテインキナーゼ阻害剤である（Rueegg et al., Trends Pharmacol. Sci. 10:218 (1989); Garcia-Echeverria et al., 2000）。それは、ＣＤＫ２（DeBondt, et al., Nature 363:595-602 (1993)；Lawrie, et al., Nature Structural Biology 4:796-801 (1997)；Zhao, et al., J. Biol. Chem. 277:46609-46615（2002））およびＡＬＫ５（N. Laping, 発表されていない結果）を包含する多くのキナーゼ（Jacobson, et al., J. Cell Biol. 133:1041-1051 (1996); Schnier, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1041-1051（1996））を、ナノモル濃度範囲のＩＣ５０値で阻害する。スタウロスポリンと複合体形成したＣＤＫ２およびＣｈｋ１キナーゼの結晶構造が報告されている（Lawrie, et al., 1997; Zhao, et al., 2002）。どちらの構造においても、スタウロスポリンは、ＡＴＰ結合溝において、舟形配座のテトラヒドロピラン環を用いて結合することが示された。
【００４３】
スタウロスポリンの保護効果を評価するために、精製ＡＬＫ５、ＡＬＫ４、ＣＤＫ２をＦＳＢＡおよび増加量のスタウロスポリンと共にインキュベートした。試料は、ＬＣ／ＭＳによって分析した。ＦＳＢＡおよびスタウロスポリンの存在下で試験した各キナーゼのＬＣ／ＭＳプロファイルは、スタウロスポリンがＦＳＢＡ標識を濃度依存的に阻害したことを明らかにした。表２に示すように、試験した全ての酵素に対するＦＳＢＡの結合は、本質的に、１０μＭスタウロスポリンの添加によって阻害された。
【００４４】
【表２】
【００４５】
実施例５：ビオチン化ＦＳＢＡ（ビオチン−ＦＳＢＡ）
ＣＨＫ４／ＦＳＢＡ複合体の結晶構造およびScoggins, et al. (1996)の発表された研究に基づいて、ＦＳＢＡは、そのリボース基のＲ２およびＲ３位でビオチン基を支持することがわかった。式Ｉ：
【化３】
［式中、
Ｒ２およびＲ３は独立して、Ｈまたは式ＩＩ：
【化４】
で示されるビオチンである］
で示される化合物が合成された。
【００４６】
３’および２’ヒドロキシ基の両方でビオチン化された化合物は、ＨＰＬＣを用いて、１つのビオチン基を含むＦＳＢＡから分離された。３’および２’ビオチン化ＦＳＢＡは、さらに、ＨＰＬＣを用いて、互いに分離された。各々の単一にビオチン化されたＦＳＢＡは、約６８０Ｄａの分子量を有する。
ビオチン化ＦＳＢＡは、溶液中で有用な遊離化合物として製造されてもよく、または固体支持体もしくは樹脂に結合していてもよい。
【００４７】
実施例６：ビオチン−ＦＳＢＡの合成
（＋）−ビオチン（０．０７０ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）を乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、１ｍＬ）中に加熱して溶解した。冷却時、ジ−イソプロピルカルボジイミド（２５μＬ、０．１６ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で１時間静置した。次いで、部分的にゲル化した溶液を５’−（４−フルオロスルホニルベンゾイル）アデノシン．１ＤＭＦ（ＦＳＢＡ、０．０５６３ｇ、０．１ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（１７．４μＬ、０．１ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（８００μＬ）中氷冷溶液に加えた。５分後、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（０．０１２２ｇ）の乾燥ＤＭＦ（２００μＬ）中溶液を加え、混合物を室温にゆっくりと温めた。反応物を分析的ＨＰＬＣ（Spherisorb S5 ODS2, ４５分にわたって４０％〜６０％Ｂ Ａ＝０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／水，Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％アセトニトリル／１０％水）に付した。反応の間に生じる異性体比は、一晩攪拌後、平衡に達する時間と共に変化した。
【００４８】
反応混合物を蒸発乾固し、最少容量の酢酸／水／アセトニトリル（容量で１０／４０／５０）中に再溶解し、次いで、分取ＨＰＬＣ（Hypersil 5u BDS C8, ２５０ｘ２１．２ｍｍ，２５％〜５０％Ｂ ８０分にわたる）によって精製した。２’（最初に溶出される）および３’異性体（１）を含有するフラクションをプールし、次いで、凍結乾燥した（各々、１０．２ｍｇおよび９．８ｍｇ回収された）。
【００４９】
実施例７：ビオチン−ＦＳＢＡの合成
（＋）−ビオチン（０．０３２ｇ、０．１４３ｍｍｏｌ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（０．０５４ｇ、０．１４３ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール・Ｈ２Ｏ（０．０２２ｇ、０．１４３ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（０．０１７５ｇ、０．１４３ｍｍｏｌ）および５’−（４−フルオロスルホニルベンゾイル）アデノシン（ＦＳＢＡ、０．０５６３ｇ、０．１ｍｍｏｌ）を乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．５ｍＬ）中に溶解し、氷浴で冷却した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．０７５ｍＬ、０．４３ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温に加温後、一晩攪拌した。反応物を分析的ＨＰＬＣ（Spherisorb S5 ODS2, ４５分にわたる４０％〜６０％Ｂ Ａ＝０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／水，Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％アセトニトリル／１０％水）に付した。反応の間に生じた異性体比は、一晩攪拌後、平衡に達する時間と共に変化した。
【００５０】
反応混合物を蒸発乾固し、最少容量の酢酸／水／アセトニトリル（容量で１０／４０／５０）中に再溶解し、次いで、分取ＨＰＬＣ（Hypersil 5u BDS C8, ２５０ｘ２１．２ｍｍ，８０分にわたって２５％〜５０％Ｂ）によって精製した。２’（最初に溶出される）および３’異性体（１）を含有するフラクションをプールし、次いで、凍結乾燥した（各々、１０．２ｍｇおよび９．８ｍｇ回収された）。
【００５１】
実施例８：ビオチン−ＦＳＢＡとＡＬＫ５の結合
精製ＡＬＫ５（１０μｇ）を室温で、２μＭ、１０μＭおよび２０μＭの３’ビオチン−ＦＳＢＡと共に、別々の容器中でインキュベートした。各溶液の内容物をＬＣ／ＭＳに付した。デコンボリューション質量スペクトルプロファイルは、ＡＬＫ５の３’ビオチン−ＦＳＢＡでの濃度依存的な共有結合修飾を示した。精製ＡＬＫ５は、ＡＬＫ５蛋白質のバキュロウイルス発現型非リン酸化形態に予想される３４，９７１Ｄａの分子量を有する単一の優勢ピークを与えた（Laping et al., 2002）。３’ビオチン−ＦＳＢＡの存在下でのインキュベーションは、濃度依存的に、３５，６３１Ｄａへの分子量のシフトをもたらした。１０μｇ ＡＬＫ５を２０μＭ ３’ビオチン−ＦＳＢＡと共にインキュベートしたとき、該親ピークは、約６６０Ｄａの増加質量を有する新規なピークに変化した。同様の結果が、ＣＤＫ２を３’ビオチン−ＦＳＢＡと共にインキュベートした場合に観察された。
【００５２】
これらの結果は、ビオチン化ＦＳＢＡが非ビオチン化ＦＳＢＡと同じくらい効果的にプロテインキナーゼを修飾することを示す。同様に、これらの結果は、ＬＣ／ＭＳを用いてキナーゼとビオチン−ＦＳＢＡの結合を検出しうることを示す。
【００５３】
実施例９：ＡＴＰはビオチン−ＦＳＢＡ修飾と拮抗する
ＡＬＫ５を、ビオチン−ＦＳＢＡ（２０μＭ）と共に、またはビオチン−ＦＳＢＡを用いないでインキュベートした。ビオチン−ＦＳＢＡを含有するＡＬＫ５のアリコートをまた、下記の濃度：０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１．０ｍＭおよび１０ｍＭのＡＴＰと共にインキュベートした。さらに、ＡＬＫ５およびビオチン−ＦＳＢＡのアリコートを下記の濃度：０．１μＭ、１．０μＭ、５．０μＭ、１０．０μＭおよび１００．０μＭのスタウロスポリンと共にインキュベートした。
【００５４】
ウェスタンブロットのための試料を下記のように調製した。各試料のアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、エレクトロブロッティングによってＰＶＤＦ膜上に転移させた。転移後、膜を１％Ｔｗｅｅｎを含有するＴｒｉｓ−緩衝化セーライン（ＴＢＳ）（ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）および３％（ｗｔ／ｖｏｌ）無脂肪ドライミルク中、室温で１時間ブロックした。次いで、ブロットを、３％無脂肪ドライミルクを含有するＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中におけるアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体（Bio-Rad, １：１０００希釈）で、室温で１時間処理した。ブロットをＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し（各洗浄は５−１０分）、次いで、Supersignal West Pico 化学ルミネセンス基質（Pierce）で１分間処理した。AlphaImager 2000 (Alpha Innotech) を用いることによって、ブロットを曝露し、顕出した。
【００５５】
クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットは、ＡＴＰおよびスタウロスポリンの両方がＡＬＫ５結合について、ビオチン−ＦＳＢＡと競合したことを示した。精製ＡＬＫ５は、ビオチン−ＦＳＢＡの存在下で、ＡＬＫ５単独の場合と比べてＳＤＳ−ゲル上でシフトし、それにより、より高い分子量を示した。ＡＴＰ（＞１．０ｍＭ）またはスタウロスポリン（＞５．０μＭ）の存在下、ビオチン−ＦＳＢＡ／ＡＬＫ５バンドは、ウェスタンブロットによって測定した場合、もはや目に見えなかった。
【００５６】
実施例１０：ＡＬＫ５阻害剤は、ビオチン−ＦＳＢＡのＡＬＫ５への結合を阻害する
精製ＡＬＫ５（５μｇ）、ＣＤＫ２（１０μｇ）およびＢＳＡ（５μｇ）を各々、ビオチン−ＦＳＢＡ（４０μＭ）と共に、室温で約２時間、別々の容器中でインキュベートした。試料をビオチンＦＳＢＡ単独と共に、および２０μＭの既知のＡＬＫ５阻害剤（ＳＢ４３１５４２）と共にインキュベートした。ＳＢ４３１５４２は、ＡＬＫ５阻害剤として、Gareth, et al., Mol Pharmacol (2002) 62: 65-7 and Laping, et al., Mol Pharmacol (2002) 62: 58-64中に記載されている。次いで、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびクーマシーブルー染色に付し、実施例９に記載のように、ウェスタンブロットを行った。
【００５７】
ビオチン−ＦＳＢＡは、ＡＬＫ５阻害剤を用いる、または用いないＣＤＫ２の試料中で酵素に結合することがウェスタンブロットによって検出された。ウェスタンブロットは、ＢＳＡの試料についてバンドを示さず、このことは、ビオチン−ＦＳＢＡがＢＳＡに結合しなかったことを示した。ＡＬＫ５およびビオチン−ＦＳＢＡを含有する試料は、ウェスタンブロットによって検出されたが、阻害剤を含有するＡＬＫ５試料についてバンドは検出されず、このことは、ビオチン−ＦＳＢＡがＡＬＫ５阻害剤の存在下でＡＬＫ５に結合しなかったことを示した。
【００５８】
実施例１１：ビオチン−ＦＳＢＡを用いて複合体プロテオームからキナーゼをプロファイリングする
Ｔｒｉｔｏｎ抽出したＨｅＬａ細胞を溶解および透析してＡＴＰおよびＡＤＰを除去した。細胞ライゼートは、アビジンビーズを用いて事前に清浄化した。細胞抽出物をスタウロスポリン（５００μＭ）と共に、またはスタウロスポリンを用いないで、室温で２時間インキュベートした。次いで、ライゼート試料をビオチン−ＦＳＢＡと共にさらに４時間インキュベートした。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに付し、クーマシーブルーで染色した。また、ウェスタンブロットを実施例９の記載のとおりに行った。クーマシー染色ゲルは、試料間でゲルバンドの差異をほとんど示さなかった。ウェスタンブロット分析は、スタウロスポリンが存在した試料において、選択されたバンドについてバンド強度の顕著な減少を示した。このことは、スタウロスポリンがビオチン−ＦＳＢＡと、細胞ライゼート中のある特定の蛋白質について競合することを示す。
【００５９】
実施例１２：ビオチン−ＦＳＢＡおよび選択的阻害剤を用いて複合体プロテオームからキナーゼをプロファイリングする
ＨｅＬａ細胞を実施例９に記載のように、溶解し、事前に清浄化した。細胞ライゼート（８０μｇ）を別々の容器中、キナーゼ阻害剤を用いないで、または５００μＭスタウロスポリンと共に、またはＲｈｏ結合型プロテインキナーゼ／ＲＯＣＫ（以下、「ＲＯＣＫ」という）の２つの選択的阻害剤のうち１つと共に、室温で２時間インキュベートした。ビオチン−ＦＳＢＡを各容器に加え（２０μＭ）、室温でさらに４時間インキュベートした。各混合物のアリコートを実施例９に記載のように、ウェスタンブロットにより分析した。ＲＯＣＫおよびＲＯＣＫの選択的阻害剤は、Uehata, et al., Nature (1997) 389:990-994に記載されている。
スタウロスポリンと共に、または２つのＲＯＣＫ阻害剤のうち１つと共にインキュベートした細胞抽出物は、阻害剤を用いないでインキュベートした細胞抽出物と比べて、選択的バンドにおける強度の減少を示した。これにより、キナーゼ阻害剤の存在下で、ビオチン−ＦＳＢＡの選択的蛋白質への結合の減少が示された。該バンド強度の減少は、細胞ライゼートを用いて、可能性のあるキナーゼをさらに同定するのに使用できるかもしれない。
【００６０】
実施例１３：ＲＯＣＫ１阻害剤はビオチン−ＦＳＢＡのＲＯＣＫへの結合を阻害するが、ＡＬＫ５への結合を阻害しない
約１０μｇのヒトＲＯＣＫ１（ｈＲＯＣＫ１）（４８ｋＤａ）またはＡＬＫ５（３４ｋＤａ）を別々に、１０μＭ ＦＳＢＡと共に、２つの既知ｈＲＯＣＫ１阻害剤（ＳＢ−７４２５４８およびＹ−２７６３２）を用いて、または用いないで、室温で３時間、共にインキュベートした。０．１％ＴＦＡで反応を止めた。ＬＣ／ＭＳにより、試料を分析した。試験した各阻害剤のＬＣ／ＭＳプロファイルにより、ｈＲＯＣＫ１阻害剤は、ＲＯＣＫ１のＦＳＢＡ標識を阻害したが、ＡＬＫ５のＦＳＢＡ標識を阻害しなかったことが明らかになった。化合物ＳＢ−７４２５４８および類似化合物は、ＷＯ０３／０８０６１０（出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）に記載されている。Ｙ−２７６３２は、Uehata, et al., Nature (1997) 389:990-994において、ＲＯＣＫ１の選択的阻害剤として記載されている。
【００６１】
実施例１４：ＲＯＣＫ阻害剤の作用様式
約１０μｇのヒトＲＯＣＫ１（ｈＲＯＣＫ１）（４８ｋＤａ）を１０μＭ ＦＳＢＡと共に、Ｙ−２７６３２を用いて（ＦＳＢＡに対し１：１の比率またはＦＳＢＡに対して１：５の濃度比で）、または用いないで、室温で３時間共にインキュベートした。０．１％ＴＦＡで反応を止めた。ＬＣ／ＭＳにより、試料を分析した。ＬＣ／ＭＳプロファイルは、１：１比のＹ−２７６３２がｈＲＯＣＫ１を阻害することを明らかにした。かくして、該阻害剤は、ｈＲＯＣＫ１の拮抗阻害剤として作用する。
【００６２】
実施例１５：ＡＬＫ５に対するＲＯＣＫ阻害剤の評価
精製ＡＬＫ５（５μｇ）をＦＳＢＡ（４０μＭ）と共に、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２）を用いて、または用いないで、約２時間インキュベートした。０．１％ＴＦＡで反応を止めた。ＬＣ／ＭＳにより、試料を分析した。ＦＳＢＡの存在下で試験されたＬＣ／ＭＳプロファイルは、Ｙ−２７６３２がＡＬＫ５に対するＦＳＢＡ結合に対し、影響を及ぼさなかったことを明らかにした。
【００６３】
上記の記載は、どのように本発明を実施し、使用するかを十分に開示する。しかしながら、本発明は、上記の特定の具体例に限定されるものではなく、添付の請求の範囲の範囲内での全てのその修飾およびその等価物を包含する。当業者は、ルーチンな実験により、本発明の範囲から逸脱することなく、種々の変更および修飾がなされることを理解するであろう。本明細書中に引用される定期刊行物、特許および他の特許出願に対する種々の言及は、出典明示により、あたかも完全に示されているかの如く本明細書の一部とされる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＡＴＰ結合部位を有する酵素を含む組成物、該酵素のＡＴＰ結合部位に結合可能な被検体、および試験化合物を接触させ、次いで
（ｂ）該試験化合物が該被検体の該ＡＴＰ結合部位への結合を阻害するかどうかを検出する工程を含む、ＡＴＰ結合部位を有する酵素を阻害する化合物を同定する方法。
【請求項２】
酵素がキナーゼである請求項１記載の方法。
【請求項３】
試験化合物が被検体の拮抗阻害剤である請求項１記載の方法。
【請求項４】
被検体がｐ−フルオロスルホニルベンゾイル５’−アデノシン（ＦＳＢＡ）である請求項１記載の方法。
【請求項５】
ＦＳＢＡがビオチン化されている請求項４記載の方法。
【請求項６】
酵素がＡＴＰ結合部位において保存されたリジンを含む請求項１記載の方法。
【請求項７】
さらに、保存されたリジンへの被検体の結合を含む請求項６記載の方法。
【請求項８】
検出工程が質量分析を用いることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
検出工程がプロテアーゼアッセイを用いることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
検出工程がキナーゼアッセイを用いることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】
検出工程がウェスタンブロットを用いることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）キナーゼを含む組成物および該キナーゼのＡＴＰ結合部位に結合する被検体を接触させ、
（ｂ）該被検体の該ＡＴＰ結合部位への結合を検出し、
（ｃ）該キナーゼを含む組成物、該被検体、および試験化合物を接触させ、次いで、
（ｄ）該試験化合物が工程（ｃ）で、該被検体の該ＡＴＰ結合部位への結合を阻害するかどうかを検出する工程を含む、ＡＴＰ結合部位を有するキナーゼを阻害する化合物を同定する方法。
【請求項１３】
キナーゼがＡＴＰ結合部位において保存されたリジンを含む請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
さらに、保存されたリジンへの被検体の結合を含む請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
検出工程が質量分析を用いることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
検出工程がプロテアーゼアッセイを用いることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
検出工程がキナーゼアッセイを用いることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
検出工程がウェスタンブロットを用いることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１９】
試験化合物が被検体の拮抗阻害剤である請求項１２記載の方法。
【請求項２０】
被検体がｐ−フルオロスルホニルベンゾイル５’−アデノシン（ＦＳＢＡ）である請求項１２記載の方法。
【請求項２１】
ＦＳＢＡがビオチン化されている請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）ＡＴＰ結合部位を有するキナーゼを含む組成物および試験化合物を接触させ、
（ｂ）該キナーゼを含む組成物および該試験化合物を被検体と接触させ、次いで、
（ｃ）該試験化合物が、工程（ｂ）において、該被検体の該ＡＴＰ結合部位への結合を阻害するかどうかを検出する工程を含む、ＡＴＰ結合部位を有するキナーゼを阻害する試験化合物を同定する方法。
【請求項２３】
キナーゼがＡＴＰ結合部位において保存されたリジンを含む請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
さらに、保存されたリジンへの被検体の結合を含む請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
検出工程が質量分析を用いることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
検出工程がプロテアーゼアッセイを用いることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
検出工程がキナーゼアッセイを用いることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２８】
試験化合物が被検体の拮抗阻害剤である請求項２２記載の方法。
【請求項２９】
被検体がｐ−フルオロスルホニルベンゾイル５’−アデノシン（ＦＳＢＡ）である請求項２２記載の方法。
【請求項３０】
ＦＳＢＡがビオチン化されている請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
（ａ）ＡＴＰ結合部位を有するプロテインキナーゼを含む組成物と、該キナーゼに結合可能な被検体を接触させ、次いで、
（ｂ）被検体が該キナーゼに結合するかどうかを検出する工程を含む、ＡＴＰ結合部位を有するプロテインキナーゼを同定する方法。
【請求項３２】
被検体がｐ−フルオロスルホニルベンゾイル５’−アデノシン（ＦＳＢＡ）である請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
ＦＳＢＡがビオチン化されている請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
さらに、プロテインキナーゼとキナーゼ阻害剤と接触させることを含む請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
検出工程がウェスタンブロットを用いることを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項３６】
検出工程がＬＣ／ＭＳを用いることを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項３７】
式Ｉ：
【化１】
［式中、
Ｒ１およびＲ２は独立して、Ｈまたは式ＩＩ：
【化２】
で示されるビオチンである］
で示される化合物。
【請求項３８】
ａ）（＋）−ビオチン、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェートを乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中に溶解し、加熱し；
ｂ）工程ａ）の溶液を冷却し；
ｃ）ジ−イソプロピルカルボジイミドを工程ｂ）の溶液に加え；次いで、
ｄ）工程ｃ）の溶液を、５’−（４−フルオロスルホニルベンゾイル）アデノシン１ＤＭＦおよびジイソプロピルエチルアミンの氷冷した溶液に加え；次いで
ｅ）乾燥ＤＭＦ中におけるＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンを工程ｄ）の溶液に加え、ゆっくりと加温する工程を含む、式Ｉの化合物の製法。
【請求項３９】
ａ）（＋）−ビオチン、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール・Ｈ２Ｏ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンおよび５’−（４−フルオロスルホニルベンゾイル）アデノシンを乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中に溶解し；
ｂ）工程ａ）の溶液を冷却し；
ｃ）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを工程ｂ）の溶液に加え；次いで、
ｄ）工程ｃ）の溶液を室温まで温め、攪拌する工程を含む、式Ｉの化合物の製法。
【請求項４０】
（ａ）第１のＡＴＰ結合部位を有する第１の酵素を含む組成物、該酵素の第１のＡＴＰ結合部位に結合可能な被検体、および試験化合物を接触させ、ここに、被検体の試験化合物に対する濃度比率は少なくとも１：１であり；次いで
（ｂ）該試験化合物が該被検体の該第１のＡＴＰ結合部位への結合を阻害するかどうかを検出し、ここに、第１のＡＴＰ結合部位に結合している被検体の減少が該試験化合物による拮抗的阻害を示す工程を含む、第１のＡＴＰ結合部位を有する第１の酵素を阻害する試験化合物の作用様式を同定する方法。
【請求項４１】
さらに、
（ａ）第２のＡＴＰ結合部位を有する第２の酵素を含む組成物、該第２の酵素の第２のＡＴＰ結合部位に結合可能な被検体、および該試験化合物を接触させ；
（ｂ）該試験化合物が該被検体の該第２のＡＴＰ結合部位への結合を阻害するかどうかを検出し；次いで
（ｃ）該試験化合物が該酵素の選択的阻害剤であるかどうかを決定する工程を含む、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
被検体の第１の酵素への結合を減少させるが、被検体の第２の酵素への結合を減少させない試験化合物が第１の酵素の選択的阻害剤である請求項４１記載の方法。
【請求項１】
（ａ）ＡＴＰ結合部位を有する酵素を含む組成物、該酵素のＡＴＰ結合部位に結合可能な被検体、および試験化合物を接触させ、次いで
（ｂ）該試験化合物が該被検体の該ＡＴＰ結合部位への結合を阻害するかどうかを検出する工程を含む、ＡＴＰ結合部位を有する酵素を阻害する化合物を同定する方法。
【請求項２】
酵素がキナーゼである請求項１記載の方法。
【請求項３】
試験化合物が被検体の拮抗阻害剤である請求項１記載の方法。
【請求項４】
被検体がｐ−フルオロスルホニルベンゾイル５’−アデノシン（ＦＳＢＡ）である請求項１記載の方法。
【請求項５】
ＦＳＢＡがビオチン化されている請求項４記載の方法。
【請求項６】
酵素がＡＴＰ結合部位において保存されたリジンを含む請求項１記載の方法。
【請求項７】
さらに、保存されたリジンへの被検体の結合を含む請求項６記載の方法。
【請求項８】
検出工程が質量分析を用いることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
検出工程がプロテアーゼアッセイを用いることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
検出工程がキナーゼアッセイを用いることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】
検出工程がウェスタンブロットを用いることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）キナーゼを含む組成物および該キナーゼのＡＴＰ結合部位に結合する被検体を接触させ、
（ｂ）該被検体の該ＡＴＰ結合部位への結合を検出し、
（ｃ）該キナーゼを含む組成物、該被検体、および試験化合物を接触させ、次いで、
（ｄ）該試験化合物が工程（ｃ）で、該被検体の該ＡＴＰ結合部位への結合を阻害するかどうかを検出する工程を含む、ＡＴＰ結合部位を有するキナーゼを阻害する化合物を同定する方法。
【請求項１３】
キナーゼがＡＴＰ結合部位において保存されたリジンを含む請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
さらに、保存されたリジンへの被検体の結合を含む請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
検出工程が質量分析を用いることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
検出工程がプロテアーゼアッセイを用いることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
検出工程がキナーゼアッセイを用いることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
検出工程がウェスタンブロットを用いることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１９】
試験化合物が被検体の拮抗阻害剤である請求項１２記載の方法。
【請求項２０】
被検体がｐ−フルオロスルホニルベンゾイル５’−アデノシン（ＦＳＢＡ）である請求項１２記載の方法。
【請求項２１】
ＦＳＢＡがビオチン化されている請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）ＡＴＰ結合部位を有するキナーゼを含む組成物および試験化合物を接触させ、
（ｂ）該キナーゼを含む組成物および該試験化合物を被検体と接触させ、次いで、
（ｃ）該試験化合物が、工程（ｂ）において、該被検体の該ＡＴＰ結合部位への結合を阻害するかどうかを検出する工程を含む、ＡＴＰ結合部位を有するキナーゼを阻害する試験化合物を同定する方法。
【請求項２３】
キナーゼがＡＴＰ結合部位において保存されたリジンを含む請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
さらに、保存されたリジンへの被検体の結合を含む請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
検出工程が質量分析を用いることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
検出工程がプロテアーゼアッセイを用いることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
検出工程がキナーゼアッセイを用いることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２８】
試験化合物が被検体の拮抗阻害剤である請求項２２記載の方法。
【請求項２９】
被検体がｐ−フルオロスルホニルベンゾイル５’−アデノシン（ＦＳＢＡ）である請求項２２記載の方法。
【請求項３０】
ＦＳＢＡがビオチン化されている請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
（ａ）ＡＴＰ結合部位を有するプロテインキナーゼを含む組成物と、該キナーゼに結合可能な被検体を接触させ、次いで、
（ｂ）被検体が該キナーゼに結合するかどうかを検出する工程を含む、ＡＴＰ結合部位を有するプロテインキナーゼを同定する方法。
【請求項３２】
被検体がｐ−フルオロスルホニルベンゾイル５’−アデノシン（ＦＳＢＡ）である請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
ＦＳＢＡがビオチン化されている請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
さらに、プロテインキナーゼとキナーゼ阻害剤と接触させることを含む請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
検出工程がウェスタンブロットを用いることを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項３６】
検出工程がＬＣ／ＭＳを用いることを特徴とする請求項３１記載の方法。
【請求項３７】
式Ｉ：
【化１】
［式中、
Ｒ１およびＲ２は独立して、Ｈまたは式ＩＩ：
【化２】
で示されるビオチンである］
で示される化合物。
【請求項３８】
ａ）（＋）−ビオチン、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェートを乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中に溶解し、加熱し；
ｂ）工程ａ）の溶液を冷却し；
ｃ）ジ−イソプロピルカルボジイミドを工程ｂ）の溶液に加え；次いで、
ｄ）工程ｃ）の溶液を、５’−（４−フルオロスルホニルベンゾイル）アデノシン１ＤＭＦおよびジイソプロピルエチルアミンの氷冷した溶液に加え；次いで
ｅ）乾燥ＤＭＦ中におけるＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンを工程ｄ）の溶液に加え、ゆっくりと加温する工程を含む、式Ｉの化合物の製法。
【請求項３９】
ａ）（＋）−ビオチン、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール・Ｈ２Ｏ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンおよび５’−（４−フルオロスルホニルベンゾイル）アデノシンを乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中に溶解し；
ｂ）工程ａ）の溶液を冷却し；
ｃ）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを工程ｂ）の溶液に加え；次いで、
ｄ）工程ｃ）の溶液を室温まで温め、攪拌する工程を含む、式Ｉの化合物の製法。
【請求項４０】
（ａ）第１のＡＴＰ結合部位を有する第１の酵素を含む組成物、該酵素の第１のＡＴＰ結合部位に結合可能な被検体、および試験化合物を接触させ、ここに、被検体の試験化合物に対する濃度比率は少なくとも１：１であり；次いで
（ｂ）該試験化合物が該被検体の該第１のＡＴＰ結合部位への結合を阻害するかどうかを検出し、ここに、第１のＡＴＰ結合部位に結合している被検体の減少が該試験化合物による拮抗的阻害を示す工程を含む、第１のＡＴＰ結合部位を有する第１の酵素を阻害する試験化合物の作用様式を同定する方法。
【請求項４１】
さらに、
（ａ）第２のＡＴＰ結合部位を有する第２の酵素を含む組成物、該第２の酵素の第２のＡＴＰ結合部位に結合可能な被検体、および該試験化合物を接触させ；
（ｂ）該試験化合物が該被検体の該第２のＡＴＰ結合部位への結合を阻害するかどうかを検出し；次いで
（ｃ）該試験化合物が該酵素の選択的阻害剤であるかどうかを決定する工程を含む、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
被検体の第１の酵素への結合を減少させるが、被検体の第２の酵素への結合を減少させない試験化合物が第１の酵素の選択的阻害剤である請求項４１記載の方法。
【公表番号】特表２００６−５２０６００（Ｐ２００６−５２０６００Ａ）
【公表日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０７２４４（Ｐ２００６−５０７２４４）
【出願日】平成１６年３月１７日（２００４．３．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００８０４３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８３１７５
【国際公開日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【出願人】（５９１００２９５７）スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション (341)
【氏名又は名称原語表記】ＳＭＩＴＨＫＬＩＮＥ ＢＥＥＣＨＡＭ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年３月１７日（２００４．３．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００８０４３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８３１７５
【国際公開日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【出願人】（５９１００２９５７）スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション (341)
【氏名又は名称原語表記】ＳＭＩＴＨＫＬＩＮＥ ＢＥＥＣＨＡＭ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]