酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼ
【課題】酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼ（アスコルビン酸ペルオキシダーゼ）およびその製造方法ならびにアスコルビン酸パーオキシダーゼに酸化耐性を付与する方法の提供。
【解決手段】未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列において、少なくとも特定の配列の２５位に相当する位置のアミノ酸がシステインからシステイン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する、酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼおよびその製造方法、ならびに未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列において、少なくとも特定の配列の２５位に相当する位置のアミノ酸をシステインからシステイン以外のアミノ酸に置換する工程を包含するアスコルビン酸パーオキシダーゼに酸化耐性を付与する方法からなる。
【解決手段】未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列において、少なくとも特定の配列の２５位に相当する位置のアミノ酸がシステインからシステイン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する、酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼおよびその製造方法、ならびに未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列において、少なくとも特定の配列の２５位に相当する位置のアミノ酸をシステインからシステイン以外のアミノ酸に置換する工程を包含するアスコルビン酸パーオキシダーゼに酸化耐性を付与する方法からなる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼおよびその製造方法ならびにアスコルビン酸パーオキシダーゼに酸化耐性を付与する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アスコルビン酸パーオキシダーゼ（「アスコルビン酸ペルオキシダーゼ」とも呼ばれる；以下、「ＡＰＸ」と略記する場合がある）は、藻類から高等植物に至る真核光合成生物において見出される、Ｉ型ヘムパーオキシダーゼ遺伝子ファミリーのメンバーである。ＡＰＸはアスコルビン酸を電子供与体として過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を水（Ｈ２Ｏ）に還元する。詳細には、ＡＰＸが１分子の過酸化水素と反応すると、ヘムの第二鉄（ＦｅＩＩＩ）原子はオキシフェリル（ＦｅＩＶ＝Ｏ）に酸化され、ポルフィリンはカチオンラジカル中間体（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｉと称する）となる。この中間体はその後２分子のアスコルビン酸との２段階の反応により基底状態の鉄（ＦｅＩＩＩ）となり、副産物として２分子のモノデヒドロアスコルビン酸ラジカルが生じる。
【０００３】
高等植物のＡＰＸには複数のアイソフォームが存在する。このうち、葉緑体局在型ＡＰＸは過酸化水素に感受性であり、一方、細胞質局在型ＡＰＸは過酸化水素に耐性である。高等植物の葉緑体には２つのＡＰＸアイソフォームがあり、一方はストロマに局在しており、他方はチラコイド膜のストロマ側に結合している。これらはいずれも過酸化水素に対して非常に感受性であり、還元剤であるアスコルビン酸が欠乏すると過剰の過酸化水素によって数分のうちに失活する（非特許文献１）。本発明者らが紅藻ガルディエリア・パーチタ（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｐａｒｔｉｔａ）から得たＡＰＸ（ＡＰＸＢ）は、Ｎ末端側ドメインでは高等植物の葉緑体ＡＰＸとの配列類似性を有するが（非特許文献２）、高等植物の細胞質ゾルやマイクロボディに局在するＡＰＸアイソフォームと同様に比較的過酸化水素に耐性である（非特許文献３）。
【０００４】
植物は移動することができないため、常に高温・低温・乾燥等のストレスにさらされており、極端な環境条件下では、植物は生育阻害、枯死等の障害を受ける。そして、これら障害の原因の一つは、植物体内で発生する活性酸素であることが知られている。この活性酸素の除去を目的とし、ＡＰＸを利用して過酸化水素を消去し、植物にストレス耐性を与える試みがなされている（特許文献１−２、非特許文献４−８）。しかし、上記のようにＡＰＸは失活しやすく、期待されるようなストレス耐性植物は得られていない。
【０００５】
上記したＡＰＸの反応において、還元剤としてのアスコルビン酸が存在せず、カチオンラジカル中間体が還元されなければ、ラジカルはアポタンパク質のアミノ酸残基に転移する。ＡＰＸの失活はこのような過酸化水素による反応中間体の攻撃に起因すると考えられている。従って、ＡＰＸにおけるタンパク質内ラジカル転移に関する情報は、過酸化水素が媒介する失活のメカニズムおよびＡＰＸアイソフォームの過酸化水素に対する感受性の差異を理解するために必要である。
【０００６】
例えば、タンパク質中のシステイン残基のチオール基は生体内で酸化されることが知られており（非特許文献９−１０）、ＡＰＸの失活と個々のアミノ酸残基との関係についてより詳細に調べる必要がある。しかし、ＡＰＸのアスコルビン酸結合部位を調べるためにＡＰＸ中のシステイン残基に変異を導入したとの報告はあるものの（非特許文献１１）、ＡＰＸにおけるタンパク質内ラジカル転移に関与するアミノ酸残基についての知見は少なかった。
【０００７】
本発明者らは、触媒部位の遠位空洞（distal cavity）に面するトリプトファン残基が葉緑体ＡＰＸ中のラジカル部位であることを、ＡＰＸが過剰の過酸化水素で失活する際にトリプトファン残基がヘムに架橋されるという知見に基づいて、見出している（特許文献３）。しかし、ＡＰＸにおいてその他のラジカル部位は十分には調べられておらず、近位のトリプトファンと思われる残基が過酸化水素での処理によってヒドロキシル化されるという知見に基づいて、マメの細胞質ゾルＡＰＸのラジカル部位が近位のトリプトファン残基であると提唱する報告があるのみである（非特許文献１２）。
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−００９６９２号公報
【特許文献２】特開２００４−１０５１３６号公報
【特許文献３】特開２００６−２９６２０９号公報
【非特許文献１】Asada, K., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 50:601-639 (1999)
【非特許文献２】Kitajima, S. et al., Biosic. Biotechnol. Biochem., 66:2367-2375 (2002)
【非特許文献３】Kitajima, S. et al., FEBS J., 273, 2704-2710 (2006)
【非特許文献４】Kornyeyev, D. et al., Physiol. Plant, 113:323-331(2001)
【非特許文献５】Payton, P. et al., J. Exp. Bot., 52:2345-2354 (2001)
【非特許文献６】Yabuta, Y. et al., Plant J., 32:915-925 (2002)
【非特許文献７】Murgia, I. et al., Plant J., 38:940-953 (2004)
【非特許文献８】Badawi, G.H. et al., Physiol. Plant, 121:231-238 (2004)
【非特許文献９】Ghezzi, P., Biochem. Soc. Trans., 33:1378-1381 (2005)
【非特許文献１０】Spickett, C.M. et al., Biochim. Biopys. Acta, 1764:1823-1841 (2006)
【非特許文献１１】Mandelman, D. et al., Biochemistry, 37:17610-17617 (1998)
【非特許文献１２】Hiner, A.N. et al., Eur. J. Biochem., 268:3091-3098 (2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、新規な酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼおよびその製造方法ならびにアスコルビン酸パーオキシダーゼに酸化耐性を付与する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は以下に関する：
［１］未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列において、少なくとも配列番号１の２５位に相当する位置のアミノ酸がシステインからシステイン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する、酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼ；
［２］未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼがガルディエリア・パーチタ（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｐａｒｔｉｔａ）またはタバコに由来する、［１］の酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼ；
［３］配列番号３、１１、１４および１５からなる群より選択されるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有する、［１］または［２］の酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼ；
［４］システイン以外のアミノ酸がセリンである、［１］〜［３］のいずれかの酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼ；
［５］ラジカル捕捉剤の存在下で酸化耐性を示す、［１］〜「４」のいずれかの酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼ；
［６］さらに、配列番号１の３４位に相当する位置のアミノ酸のトリプトファンからトリプトファン以外のアミノ酸への置換および／または配列番号１の１２１位に相当する位置のアミノ酸のシステインからシステイン以外のアミノ酸への置換を有する、［１］〜［５］のいずれかの酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼ；
［７］酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼを生産する細胞を培養する工程を包含する、酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼの製造方法であって、酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼが、未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列において、少なくとも配列番号１の２５位に相当する位置のアミノ酸がシステインからシステイン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する、方法；
［８］未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼがガルディエリア・パーチタ（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｐａｒｔｉｔａ）またはタバコに由来する、［７］の方法；
［９］酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼが、配列番号３、１１、１４および１５からなる群より選択されるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有する、［７］または［８］の方法；
［１０］システイン以外のアミノ酸がセリンである、［７］〜［９］のいずれかの方法；
［１１］酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼがラジカル捕捉剤の存在下で酸化耐性を示す、［７］〜［１０］のいずれかの方法；
［１２］酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼが、さらに、配列番号１の３４位に相当する位置のアミノ酸のトリプトファンからトリプトファン以外のアミノ酸への置換および／または配列番号１の１２１位に相当する位置のアミノ酸のシステインからシステイン以外のアミノ酸への置換を有する、［７］〜［１１］のいずれかの方法。
［１３］未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列において、少なくとも配列番号１の２５位に相当する位置のアミノ酸をシステインからシステイン以外のアミノ酸に置換する工程を包含する、アスコルビン酸パーオキシダーゼに酸化耐性を付与する方法；
［１４］未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼがガルディエリア・パーチタ（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｐａｒｔｉｔａ）またはタバコに由来する、［１３］の方法；
［１５］酸化耐性を付与されたアスコルビン酸パーオキシダーゼが、配列番号３、１１、１４および１５からなる群より選択されるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有する、［１３］または［１４］の方法；
［１６］システイン以外のアミノ酸がセリンである、［１３］〜［１５］のいずれかの方法；
［１７］ラジカル捕捉剤の存在下での酸化耐性が付与される、［１３］〜［１６］のいずれかの方法。
［１８］配列番号１の３４位に相当する位置のアミノ酸をトリプトファンからトリプトファン以外のアミノ酸に置換する工程および／または配列番号１の１２１位に相当する位置のアミノ酸をシステインからシステイン以外のアミノ酸に置換する工程をさらに包含する、［１３］〜［１７］のいずれかの方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、新規な酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼおよびその製造方法ならびにアスコルビン酸パーオキシダーゼに酸化耐性を付与する方法が提供される。本発明のアスコルビン酸パーオキシダーゼは酸化耐性を示し、ストレス耐性植物の作製に加えて、研究用試薬、化粧品（特表２００４−５２９８６６号公報参照）、医薬品（特表２００２−５２３３７８号公報、特表平１０−５０４３０４号公報、国際公開第２００４／０６６９８８号パンフレット参照）など従来のアスコルビン酸パーオキシダーゼが利用可能な全ての目的のために有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼを提供する。本発明の酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼは、未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列において、少なくとも配列番号１の２５位に相当する位置のアミノ酸がシステインからシステイン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する。本発明の酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼは、さらに配列番号１の３４位に相当する位置のアミノ酸のトリプトファンからトリプトファン以外のアミノ酸への置換および／または配列番号１の１２１位に相当する位置のアミノ酸のシステインからシステイン以外のアミノ酸への置換を有していてもよい。
【００１３】
「アスコルビン酸パーオキシダーゼ」は、アスコルビン酸を還元剤として、過酸化水素を還元する酵素である。アスコルビン酸パーオキシダーゼ活性は公知の任意の方法によって測定することができる。例えば、Ｎａｋａｎｏらの方法（Nakano, Y. et al., Plant Cell Physiol., 22, 867-880 (1981)）に従い、過酸化水素によるアスコルビン酸の減少を吸光度の減少として測定することにより決定することができる。
【００１４】
本明細書において、「未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼ」は、配列番号１の２５位に相当する位置のアミノ酸としてシステインを有し、アスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有するタンパク質をいう。未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼは、天然のアスコルビン酸パーオキシダーゼと同一のアミノ酸配列からなってもよく、あるいは天然のアスコルビン酸パーオキシダーゼとは異なるアミノ酸配列を有していてもよい。
【００１５】
未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼは、任意の生物に由来し得る。例えば、本発明者らによって単離されたガルディエリア・パーチタ（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｐａｒｔｉｔａ）由来のアスコルビン酸パーオキシダーゼを使用することができる。当該酵素のアミノ酸配列を配列番号１に示す。タバコ由来のアスコルビン酸パーオキシダーゼも好適に使用することができる。当該酵素のアミノ酸配列を配列番号９に示す。
【００１６】
本明細書において、「酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼ」は、未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列において、少なくとも配列番号１の２５位に相当する位置のアミノ酸がシステインからシステイン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有し、アスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有するタンパク質であって、酸化に対する耐性が未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼに比較して向上したタンパク質をいう。酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼが未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼと同様の酵素活性を保持していることは、例えば、Ｋｍおよびｋｃａｔの値、吸収スペクトルなどを調べることによって確認することができる。
【００１７】
本明細書において「配列番号１の２５位に相当する位置のアミノ酸」とは、配列番号１に示す紅藻ガルディエリア・パーチタ由来アスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列と、対象となるアスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列とを比較した場合に、配列番号１の２５位のシステインに相当する対象配列中の位置に存在するアミノ酸をいう。あるいは、この位置のアミノ酸は、ヘムのプロピオン酸側鎖の近位に存在するシステイン残基としても同定することができる。同様に、「配列番号１の３４位に相当する位置のアミノ酸」および「配列番号１の１２１位に相当する位置のアミノ酸」とは、配列番号１に示す紅藻ガルディエリア・パーチタ由来アスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列と、対象となるアスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列とを比較した場合に、それぞれ配列番号１の３４位のトリプトファンおよび１２１位のシステインに相当する対象配列中の位置に存在するアミノ酸をいう。
【００１８】
アミノ酸配列の比較は公知の配列解析用プログラムまたはアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ）を使用して行うことができる。いくつかの公知のアスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列を比較したアラインメントの結果の一例を表１に示す。表中、「Ｐｅａ＿Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ＿Ｐ４８５３４」はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ４８５３４に登録されたエンドウの細胞質局在型アスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列を示し、「Ｃｏｔｔｏｎ＿Ｍｉｃｒｏｂｏｄｙ＿ＡＡＢ５２９５４」はＧｅｎＢａｎｋプロテインＩＤ番号ＡＡＢ５２９５４に登録されたワタのマイクロボディ局在型アスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列を示し、「Ｇａｌｄｉｅｒｉａ＿Ｃｙｔｏｓｏｌｉｄ＿ＡＢ０３７５３７」はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０３７５３７に登録された紅藻ガルディエリア・パーチタのアスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列（すなわち、配列番号１のアミノ酸配列）を示し、「Ｔｏｂａｃｃｏ＿Ｓｔｒｏｍａｌ＿ＢＡＡ７８５５３」はＧｅｎＢａｎｋプロテインＩＤ番号ＢＡＡ７８５５３に登録されたタバコの葉緑体ストロマ局在型アスコルビン酸パーオキシダーゼの全長アミノ酸配列（トランジットペプチドを含む）を示す。
【００１９】
【表１−１】
【００２０】
【表１−２】
【００２１】
配列番号１の２５位に相当する位置は、表１−１中第３段の１５番目に当たる（「Ｃ２５」で示す）。表に示した全ての配列において同じ位置にシステイン残基（Ｃ）が見られる（完全一致を示す記号「＊」が表示されている）ことから明らかなように、この位置のシステイン残基は各種アスコルビン酸パーオキシダーゼの間で高度に保存されている。なお、この位置は、エンドウの細胞質局在型、ワタのマイクロボディ局在型、タバコの葉緑体ストロマ局在型アスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列のそれぞれ３２位、３０位、１１５位に相当する。従って、当業者は、対象となるアスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列において、配列番号１の２５位に相当する位置のアミノ酸を容易に同定することができる。同様に、配列番号１の３４位に相当する位置（表中「Ｗ３４」で示す）、配列番号１の１２１位に相当する位置（表中「Ｃ１２１」で示す）も容易に同定される。例えば、配列番号９に示すタバコ由来のアスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列の２６位、３５位、１２６位がそれぞれ配列番号１の２５位、３４位、１２１位に相当する。
【００２２】
酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼは、例えば、配列番号３のアミノ酸配列からなる。ここで配列番号３のアミノ酸配列は、配列番号１の２５位のアミノ酸がシステインからセリンに置換されたものである。あるいは、酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼは、アスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有する限り、配列番号３のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなってもよい。また、例えば、酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼとして、配列番号１１、１４および１５から選択されるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有するタンパク質を使用することができる。なお、配列番号１１〜１５のアミノ酸配列は、配列番号９のアミノ酸配列において以下の置換を有するものである：配列番号１１：２６位のシステインからセリン；配列番号１２：３５位のトリプトファンからフェニルアラニン；配列番号１３：１２６位のシステインからアラニン；配列番号１４：２６位のシステインからセリンおよび１２６位のシステインからアラニン；配列番号１５：２６位のシステインからセリン、３５位のトリプトファンからフェニルアラニンおよび１２６位のシステインからアラニン。
【００２３】
配列番号１の２５位に相当する位置に配置されるシステイン以外のアミノ酸としては、置換した後にアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性が保持されるのであれば、システイン以外の任意の天然アミノ酸を使用することができる。例えば、システインと分子構造が類似するセリンを使用することにより、置換によるタンパク質の立体構造の変化を少なくすることができる。アラニンも配列番号１の２５位に相当する位置に配置されるシステイン以外のアミノ酸として好適に使用することができる。同様に、当業者は配列番号１の３４位に相当する位置に配置されるトリプトファン以外のアミノ酸を適切に選択することができ、例えばフェニルアラニンを使用することができる。
【００２４】
本発明のアスコルビン酸パーオキシダーゼは、配列番号１の２５位に相当する位置に加えて、他の置換されたアミノ酸残基を有してもよい。他の置換の例としては、配列番号１の３４位に相当する位置のトリプトファンの別のアミノ酸への置換、配列番号１の１２１位に相当する位置のシステイン残基の別のアミノ酸残基への置換が挙げられる。
【００２５】
１つの実施態様において、本発明のアスコルビン酸パーオキシダーゼはラジカル捕捉剤の存在下で酸化耐性を示す。ラジカル捕捉剤（ラジカル捕獲剤ともいう）は、反応中に生ずるラジカルを捕らえるために用いられる化合物である。本発明には任意のラジカル捕捉剤を使用することができる。例えば、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシル（ＴＥＭＰＯ）を使用することができる。ＴＥＭＰＯはアミノ酸ラジカルに結合して安定な生成物を形成することが知られている。なお、ＴＥＭＰＯはチオール（−ＳＨ）ラジカルと連鎖的に反応しＴＥＭＰＯ付加物だけでなく、チオール基の酸化物であるスルフィン酸（−ＳＯ２Ｈ）、スルホン酸（−ＳＯ３Ｈ）も生じることが報告されており、この不可逆的酸化反応はＴＥＭＰＯの官能基であるニトロキシド・ラジカルの作用によるものであることが示唆されているBorisenko, G.G. et al., J. Am. Chem. Soc., 126:9221-9232 (2004)）。従って、一般にラジカル捕捉剤と称されていない化合物であっても、ＴＥＭＰＯと同様にニトロキシド・ラジカルを有してシステインラジカルの不可逆的酸化反応を引き起し得るものはラジカル捕捉剤に含まれる。
【００２６】
酸化に対する耐性は、例えば、以下のようにして確認することができる。すなわち、嫌気５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０に置換したアスコルビン酸パーオキシダーゼ含有酵素液１．０ｍＬに、ラジカル捕捉剤を終濃度０．２または０ｍＭ添加し、続いて過酸化水素を５モルまたは０モル当量となるように添加する。一定時間ごとに一部をとりだして速やかに反応液（０．５ｍＭアスコルビン酸、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．０１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）に混合し、失活反応を停止させて各時間の活性測定をおこなう。ここで、反応液１．０ｍＬに対して終濃度１００μＭの過酸化水素を添加したときの過酸化水素依存的アスコルビン酸の酸化を２５℃で測定して活性を決定する。なお、本明細書において「モル当量」なる用語は、アスコルビン酸パーオキシダーゼに対する過酸化水素のモル数での比率を表す。上記条件下、ラジカル捕捉剤としてのＴＥＭＰＯの存在下で１０分間反応させた場合、本発明のアスコルビン酸パーオキシダーゼは、例えば、６０〜１００％、好ましくは８０〜１００％、より好ましくは９０〜１００％の残存活性を示す。
【００２７】
本発明は、上記酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼを生産する細胞を培養する工程を包含する、酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼの製造方法を提供する。
【００２８】
酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼを生産する細胞としては、例えば、酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼをコードする核酸を含む組換えＤＮＡで形質転換された宿主細胞を使用することができる。従って、本発明によれば、本発明のアスコルビン酸パーオキシダーゼをコードする核酸、当該核酸を含む組換えＤＮＡ、当該組換えＤＮＡを含む形質転換体も提供される。
【００２９】
酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼをコードする核酸としては、例えば、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸が挙げられる。そのような核酸の例としては、配列番号４のヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられる。なお、配列番号４の配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０３７５３７に登録された紅藻ガルディエリア・パーチタのアスコルビン酸パーオキシダーゼのヌクレオチド配列のコード領域に当たる１９８位から９４１位（配列番号２）のうち、配列番号１の２５位に相当する位置のシステインのコドン（ＴＧＴ）（配列番号２の７３〜７５位）をセリンのコドン（ＴＣＴ）（配列番号４の７３〜７５位）に変化させたものである。あるいは、当該核酸は、配列番号４のヌクレオチド配列からなる核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸であってもよい。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件としては、J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されるような条件が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液（Denhardt's solution）、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中６８℃でプローブとハイブリダイズさせた後、洗浄条件を２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中室温から０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中６８℃まで変化させる条件が挙げられる。配列番号１１、１４および１５から選択されるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸も同様に使用することができる。
【００３０】
宿主細胞としては、細菌などの原核細胞、糸状菌、酵母などの真核微生物細胞、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであれば任意の細胞を選択することができる。当該組換えＤＮＡには、酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼをコードする核酸に加えて、転写、翻訳、形質転換体の選択などに必要な任意の核酸配列を含めてもよい。上記細胞の培養は、使用する細胞に適切な条件で行われる。また、上記組換えＤＮＡを導入した細胞を用いて動物個体（トランスジェニック動物）を作製することもできる。例えば、酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼを乳汁中に生産するトランスジェニック動物を作製することができる。このような組換え体は公知の方法に従って作製することができる。
【００３１】
あるいは、上記組換えＤＮＡを導入した細胞を用いて植物個体（トランスジェニック植物）を作製することもできる。このような植物個体はアスコルビン酸パーオキシダーゼの製造以外に、耐ストレス作物として有用である。組換えＤＮＡを導入する植物としては、任意の植物を使用することができる。そのような植物には単子葉植物（イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシなど）および双子葉植物（ワタ、トマト、タバコなど）のいずれもが含まれる。このような植物個体の作製方法は当該分野において公知であり、例えば、特許文献１−２、非特許文献４−８に記載されている。このような植物は酸化毒ストレスに対する耐性を有し、砂漠緑化、ＣＯ２削減、農業における作物生産などに有用である。
【００３２】
本発明は、未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列において、少なくとも配列番号１の２５位に相当する位置のアミノ酸をシステインからシステイン以外のアミノ酸に置換する工程を包含する、アスコルビン酸パーオキシダーゼに酸化耐性を付与する方法を提供する。本発明の方法によりアスコルビン酸パーオキシダーゼに酸化耐性が付与されることは上記で説明したとおりである。
【００３３】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３４】
ＴＥＭＰＯ存在下で過酸化水素処理したＡＰＸＢの質量分析
ガルディエリア・パーチタ（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｐａｒｔｉｔａ）由来アスコルビン酸パーオキシダーゼ、ＡＰＸＢを５モル当量の過酸化水素とともに嫌気化した５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０中でインキュベートすると重合体が形成されたが、０．２ｍＭのラジカル捕捉剤２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシル（ＴＥＭＰＯ）の存在下ではこのような重合体は形成されなかった。このことは、重合がタンパク質表面でのラジカル形成に起因するものであり、ＴＥＭＰＯがラジカル部位を捕捉したことを示す。そこで、ラジカル部位を同定するために、未処理およびＴＥＭＰＯ存在下で過酸化水素処理したＡＰＸＢのトリプシン消化物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよびＭＳ／ＭＳにより解析した。ＡＰＸＢ酵素液の調製は下記の実施例３に記載のように行った。
【００３５】
精製ＡＰＸＢを、ＮＡＰ５ゲル濾過カラム２本を用いて、窒素ガスにより嫌気化した５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０にバッファー置換し、１．０ｍＬの酵素液を得た。嫌気条件に保ったまま、紫外可視分光光度計ＵＶ−１７００ ＰｈａｒｍａＳｐｅｃでＳｏｒｅｔピークを測定して酵素濃度を決定した。ＡＰＸＢのこの条件でのモル吸光係数は、１０２ｍＭ−１・ｃｍ−１である。なお、下記ＡＰＸＢ変異体ＡＰＸＢＣ２５Ｓのモル吸光係数は、９３ｍＭ−１・ｃｍ−１である。ヘム濃度はＰｙｒｉｄｉｎｅ ｈｅｍｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎ法により（非特許文献２）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（モル吸光係数１００ｍＭ−１・ｃｍ−１、ナカライテスク）を標準品として決定した。
【００３６】
嫌気５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０に置換したＡＰＸＢ酵素液１．０ｍＬに、終濃度０．２または０ｍＭのラジカル捕捉剤ＴＥＭＰＯ（和光純薬）を添加し、続いて過酸化水素を５モルまたは０モル当量となるように添加した。一定時間後にＮＡＰ１０ゲル濾過カラムに供して嫌気５０ｍＭ重炭酸アンモニウムバッファー、ｐＨ８．０で溶出することにより未反応のＴＥＭＰＯまたはグルタチオンと過酸化水素を除去して酵素液０．５ｍＬを得た。酵素液は１００μｌずつサンプルチューブに分注し、液体窒素で凍らせて−８０℃で保存した。
【００３７】
これらの酵素液１００μｌに、３３μｌの８Ｍ尿素を混合し、１μｌのトリプシン（Sequencing Grade Modified Trypsin、Frozen、Promega）を加えて一晩消化した。トリプシンで消化したＡＰＸをＺｉｐＴｉｐ（登録商標）Ｃ１８（Millipore）に供し、測定サンプル用溶媒（７５％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ）を用いて説明書に従って溶出した。マトリックスとしてα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ、Bruker Daltonics）を、標準試料としてｐｅｐｔｉｄｅ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｓｔａｎｄａｒｄ ＩＩ（Bruker Daltonics）を用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（VoyagerDE STR、Applied biosystems）およびＭＳ／ＭＳ（ultraflex TOF/TOF、Bruker Daltonics）でＡＰＸＢトリプシン消化物の質量分析をおこなった。測定方法は装置の説明書に従った。解析にはＭａｓｃｏｔ Ｓｅａｒｃｈ（http://www.matrixscience.com/search_form_select.html）を用いた。
【００３８】
ＴＥＭＯ存在下で過酸化水素処理したＡＰＸＢのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの結果を図１および表２に示す。
【００３９】
【表２】
【００４０】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの結果より、未処理のＡＰＸＢで確認できたアミノ酸配列１９から３１番（ＬＦＥＱＴＰＣＭＰＩＭＶＲ、分子量計算値：１５６３．７６１１）に相当する質量１５６５ｍ／ｚのピークが、ＴＥＭＰＯと過酸化水素で処理することで顕著に減少し、これに伴い、いくつかのピークが出現していることが明らかとなった。
【００４１】
さらに、図１の１５９７ｍ／ｚのピークについてＭＳ／ＭＳ解析を行ったところ、２５位のシステイン残基（Ｃｙｓ−２５）の質量増加が３２ｍ／ｚであり、Ｃｙｓ−２５に酸素２原子（原子量１６）が結合したことが確認できた（−ＳＯ２Ｈ）。図１の１７３６ｍ／ｚのピークについてＭＳ／ＭＳ解析を行ったところ、Ｃｙｓ−２５の質量増加が１７１ｍ／ｚであり、Ｃｙｓ−２５に１分子のＴＥＭＰＯ（分子量１５６．３）と１原子の酸素が結合したことが確認できた（−ＳＯ−ＴＥＭＰＯ）。
【００４２】
ＴＥＭＰＯはチオール（−ＳＨ）ラジカルと連鎖的に反応しＴＥＭＰＯ付加物だけでなく、チオール基の酸化物であるスルフィン酸（−ＳＯ２Ｈ）、スルホン酸（−ＳＯ３Ｈ）も生じることが報告されており（Borisenko, G.G. et al., J. Am. Chem. Soc., 126:9221-9232 (2004)）、今回の結果と一致していた。以上より、Ｃｙｓ−２５がラジカル化部位であることが明らかとなった。以下の実施例では主にＣｙｓ−２５について記載するが、１２１位のシステイン残基（Ｃｙｓ−１２１）もラジカル化部位であることが示唆されており、このシステイン残基とＡＰＸの失活との関係については実施例６において記載する。
【００４３】
また、トリプシン消化せずにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで分析すると、ＡＰＸＢはＴＥＭＰＯ存在下で過酸化水素処理した場合に、未処理の場合と比較して約５０Ｄａの質量増加がみられる（図２）。この結果から、実際にはシステイン残基にＴＥＭＰＯ付加物はほとんど存在せず、その大半がシステイン残基の酸化物であるスルフィン酸（−ＳＯ２Ｈ）あるいはスルホン酸（−ＳＯ３Ｈ）であることが示された。
【実施例２】
【００４４】
ＡＰＸＢのラジカル化に与えるグルタチオンの影響
２−１．グルタチオン存在下で過酸化水素処理したＡＰＸＢのＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＴＥＭＰＯは植物など生体内には存在しないが、システイン残基のチオール基の酸化はインビボにおいても生じ得る（非特許文献９−１０）。しかし生体内ではラジカル化したシステイン残基へグルタチオンが結合することによってこのような酸化が防止される可能性も考えられる。以下で、ＡＰＸＢのラジカル化に与えるグルタチオンの影響を検討した。
【００４５】
嫌気５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０に置換したＡＰＸＢ酵素液０．３ｍＬに、グルタチオンを終濃度０、０．１、０．２、０．５、１．０、２．０ｍＭとなるように、続いて過酸化水素を５モルまたは０モル当量となるようにマイクロシリンジで注入した。グルタチオンと過酸化水素を添加した酵素液を、一定時間後にＮＡＰ１０（Pharmacia）ゲル濾過カラムに供して嫌気５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０で溶出することにより未反応のグルタチオンと過酸化水素を除去して酵素液０．５ｍＬを得た。得た酵素液は１００μｌずつサンプルチューブに分注し、液体窒素で凍らせて−８０℃で保存した。
【００４６】
グルタチオンと過酸化水素を除去した酵素液１００μｌに、当量の２倍濃度ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー（２−メルカプトエタノールを含まない）を加えて混合し、５０μｌずつサンプルチューブに分注し、液体窒素で凍らせて−８０℃で保存した。２−メルカプトエタノールは終濃度５％となるように泳動直前に添加した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは１２．５％ポリアクリルアミドゲルを用いて行い、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色により染色した。
【００４７】
結果を図３に示す。図３において、各レーンは、左から以下を表す：マーカー（NEB BroadRangeP7702）；未処理ＡＰＸＢ；ＡＰＸＢ＋５モル当量Ｈ２Ｏ２；ＡＰＸＢ＋５モル当量Ｈ２Ｏ２＋０．１ｍＭグルタチオン；ＡＰＸＢ＋５モル当量Ｈ２Ｏ２＋０．２ｍＭグルタチオン；ＡＰＸＢ＋５モル当量Ｈ２Ｏ２＋０．５ｍＭグルタチオン；ＡＰＸＢ＋５モル当量Ｈ２Ｏ２＋１．０ｍＭグルタチオン；ＡＰＸＢ＋５モル当量Ｈ２Ｏ２＋２．０ｍＭグルタチオン。未処理のＡＰＸＢについては２８ｋＤａ付近に単一のバンドが確認できるのに対して、過酸化水素を添加した場合では２８、６０、１２０ｋＤａ付近にＡＰＸＢのモノマーおよび重合体と思われる複数のバンドが確認された。一方、グルタチオン存在下で過酸化水素処理した場合ではグルタチオン濃度の増加にしたがってそれらのバンドが薄くなり、２．０ｍＭのグルタチオンの存在下で過酸化水素処理した場合では、ＡＰＸＢのモノマーに対応する２８ｋＤａ以外のバンドはほとんど確認できなかった。すなわち、グルタチオンがＡＰＸＢタンパク質表面のラジカル化したシステイン残基に結合し、過酸化水素によるタンパク質同士の重合を防止することが示唆された。
【００４８】
２−２．グルタチオン存在下で過酸化水素処理したＡＰＸＢの質量分析
グルタチオンがラジカル化部位であるシステイン残基に結合しているかを明らかにするために、グルタチオン存在下で過酸化水素処理したＡＰＸＢのトリプシン消化物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよびＭＳ／ＭＳにより解析した。実験は、ＴＥＭＰＯの代わりに２．０ｍＭまたは０ｍＭのグルタチオン（和光純薬）を使用した以外、実施例１と同様に実施した。結果を図４に示す。
【００４９】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの結果より、未処理のＡＰＸＢで確認できたアミノ酸配列１９から３１番に相当する質量１５６５ｍ／ｚのピークが、グルタチオンと過酸化水素で処理することで顕著に減少し、これに伴い、このペプチド断片にグルタチオン１分子（分子量３０７．３３）分が結合し、水素２原子（原子量１．０１）が脱離したと考えられるピークが出現していることが明らかとなった（−Ｓ−Ｓ−Ｇ）。
【００５０】
さらに、図４の１８７０ｍ／ｚのピークについてＭＳ／ＭＳ解析を行ったところ、Ｃｙｓ−２５にグルタチオンが結合し、水素２原子が脱離したことが確認できた。これより、ＡＰＸＢは過酸化水素との反応により、タンパク質表面のシステイン残基がラジカル化し、グルタチオンと結合することが示された。
【００５１】
なお、過酸化処理したＡＰＸＢの残存活性を下記実施例５と同様に測定したところ、残存活性は未処理時の５０％程度であったが、グルタチオン存在下で過酸化水素処理した場合のＡＰＸの残存活性は未処理時の８０％であり、Ｃｙｓ−２５にグルタチオンが結合することによるＡＰＸＢの触媒活性の低下はないことが示された。
【００５２】
植物の細胞には２．０ｍＭから５．０ｍＭのグルタチオンが存在するといわれている。上記の結果を考慮すれば、通常は、生体内においてもタンパク質同士の重合およびシステイン残基の不可逆的な酸化がＡＰＸとグルタチオンとの結合により防止されている可能性がある。しかし、細胞が深刻な酸化ストレスに曝されると還元型グルタチオンの濃度が低下するとされている。このような場合には、ＡＰＸのシステイン残基がグルタチオンにより保護されずに酸化され、その結果、ＡＰＸＢの触媒活性が失われる可能性がある。従って、植物細胞の状態によっては実施例１において示された過酸化水素およびＴＥＭＰＯによるのと同様の２５位のシステイン残基（Ｃｙｓ−２５）の酸化が生体内においても生じ得ることが示唆された。
【実施例３】
【００５３】
ＡＰＸＢおよびＡＰＸＢＣ２５Ｓの構築、発現および精製
実施例１においてＴＥＭＰＯ存在下で過酸化水素と反応させることにより、ＡＰＸＢの２５位のシステイン残基がラジカル化し、さらに酸化されることが明らかとなった。また実施例２において、このシステイン残基にグルタチオンが結合し、過酸化水素によるＡＰＸＢの重合が防止されることが示唆された。そこで、システイン残基の酸化がＡＰＸＢの触媒活性に与える影響を検証するために、当該システイン残基を欠損する変異型ＡＰＸＢを作製した。
【００５４】
３−１．ｐＥＴＡＰＸＢＣ２５Ｓの構築
紅藻ガルディエリア・パーチタの細胞質局在型ＡＰＸ（ＡＰＸＢ）の２５位のシステイン残基（Ｃｙｓ−２５）をセリン（Ｓｅｒ）に置換したＡＰＸ（ＡＰＸＢＣ２５Ｓと命名する）を発現する大腸菌用発現ベクターｐＥＴ１６ｂＡＰＸＢＣ２５Ｓを以下のようにして作製した。
【００５５】
５’末端側断片の増幅のために、プライマーＡＰＸＢ２９Ｒ（５’−ＡＧＧＡＧＴＣＴＧＴＴＣＡＡＡＴＡＧＣＴＴＴＡＣ−３’）（配列番号５）を設計し、の５’末端をＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（東洋紡績）を用いリン酸化した。プロトコールはカタログＴＯＹＯＢＯ ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ＦＯＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ（２００４／２００５）中の使用説明書に従った。
【００５６】
３’末端側断片の増幅と変異導入のために、プライマーＡＰＸＢ３０（５’−ＴＣＴＡＴＧＣＣＴＡＴＴＡＴＧＧＴＧＣＧＡＣＴＡＧＣ−３’）（配列番号６）を設計した。このプライマーはＣｙｓ−２５に対応する塩基（ＴＧＴ）のうち、１塩基を置換してＳｅｒに対応する塩基（ＴＣＴ）としたものである。
【００５７】
全長ＡＰＸＢ遺伝子を含むプラスミドｐＥＴ１６ｂＡＰＸＢ（非特許文献２）を鋳型として、５’末端側断片にはプライマーＴ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’）（配列番号７）とリン酸化したプライマーＡＰＸＢ２９Ｒを、３’末端側断片にはプライマーＡＰＸＢ３０とプライマー Ｔ７ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（５’−ＡＣＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＴＡＡＣＴＡＧＣ−３’）（配列番号８）を用いて、一段階目のＰＣＲ反応をおこなった。ＤＮＡポリメラーゼにはＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Strategene）を用いた。反応条件および反応液組成は酵素の推奨プロトコールに従い、サーマルサイクラーとしてＭｉｎｉ Ｃｙｃｌｅｒ（MJ Research）を用いた。
【００５８】
ＰＣＲにより得られた５’末端側断片と３’末端側断片とを精製し、ライゲーションした。ライゲーションは、説明書に従い、Ｔａｋａｒａ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いておこなった。ただし、キットのＩ液を加える前にＤＮＡ溶液を４２℃で３０秒間加熱した。ＰＣＲ産物の精製は特に断りのない限り、説明書に従ってＷｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍを用いておこなった。
【００５９】
ライゲーション産物を鋳型として、プライマーＴ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒとプライマーＴ７ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを用いて二段階目のＰＣＲをおこなった。このＰＣＲ産物を精製し、制限酵素ＮｃｏＩ（東洋紡績）およびＸｈｏＩ（タカラバイオ）で消化して、再び精製した。また、ｐＥＴ１６−ｂベクター（Novagen）もＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで消化し、精製した。
【００６０】
ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで消化したＰＣＲ産物をｐＥＴ１６−ｂのＮｃｏＩ／ＸｈｏＩサイトに挿入した。得られたｐＥＴ１６ｂＡＰＸＢＣ２５Ｓを用いて大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ株を形質転換した。
【００６１】
ＬＢプレートのコロニーから楊枝で取った大腸菌を鋳型として、プライマーＴ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒとプライマーＴ７ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを用いてコロニーＰＣＲをおこなった。ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルで電気泳動し、約１０００ｂｐの目的のＰＣＲ産物を与えるコロニーを検出し、そのＰＣＲ産物を精製した。ＤＮＡポリメラーゼにはＴａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（NEB）を用い、バッファーにはＥｘ Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｂｕｆｆｅｒを用いた。反応条件および反応液組成は酵素の推奨プロトコールに従い、サーマルサイクラーとしてＭｉｎｉ Ｃｙｃｌｅｒを用いた。
【００６２】
精製したＰＣＲ産物を鋳型として、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖｅｒ．３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Applied Biosystems）を用い、説明書に従ってシーケンス反応液を調整した。サンプルインジェクションバッファーＴＳＲ（Template Suppression Reagent,Applied Biosystems）を用いて調整したサンプルを、ＤＮＡシーケンサーであるＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に供して配列を解析した。
【００６３】
３−２．ＡＰＸＢおよびＡＰＸＢＣ２５Ｓの精製
ＡＰＸＢおよびＡＰＸＢＣ２５Ｓを非特許文献３に記載の方法で精製した。詳細には、コンピタントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ：ＢＬ２１（ＤＥ３）株）へのｐＥＴ１６ｂＡＰＸＢ（野生型ＡＰＸＢをコードする）およびｐＥＴ１６ｂＡＰＸＢＣ２５Ｓ（Ｃｙｓ−２５をＳｅｒに置換したＡＰＸＢをコードする）の導入を常法に従って行った。ｐＥＴ１６ｂＡＰＸＢまたはｐＥＴ１６ｂＡＰＸＢＣ２５Ｓを保持する大腸菌を、終濃度５０ｍｇ／Ｌのアンピシリン含むＬＢ培地１Ｌで、振とう培養装置ＩＣ−４３（Simadzu）を用いて１２０ｒｐｍ、３７℃下振とう培養した。培養は、培地の濁度を紫外可視分光光度計ＵＶ−１７００ ＰｈａｒｍａＳｐｅｃ（Shimadzu）で測定した。ＯＤ６００＝０．６となるまで約１２時間培養し、最終濃度０．５ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、和光純薬）と同時に再び終濃度５０ｍｇ／Ｌのアンピシリンを添加した。Ｏ．Ｄ．６００＝１．０を上回るまでさらに５時間培養を続け、集菌した。液体培地を遠心分離（２８００×ｇ、４℃、２０分）して集菌し、バッファーＡ（５０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭアスコルビン酸）で菌体を洗浄後、液体窒素で凍らせて−８０℃で保存した。
【００６４】
保存しておいたＬＢ培地４Ｌ分の大腸菌を、４０ｍＬのバッファーＡに懸濁し、超音波破砕機ＶＰ−１５Ｓ、標準ホーンＨＮＮ−０２００（Taitec）により菌体を破砕した。破砕は出力４、サイクル２０％、５分の条件で２回繰り返し、その後出力５、サイクル２０％、５分の条件で２回繰り返した。この破砕物を遠心分離（１３，０００×ｇ、４℃、３０分）し、その上清に対して硫安沈殿分画をおこなった。方法は「タンパク質実験ノート」（岡田雅人・宮崎香 (1999) Bradford法と硫安分画：無敵のバイオテクニカルシリーズ 改訂 タンパク質実験ノート 上 抽出と分離精製 (羊土社) , pp33-34 , 72-74）に従い、４０％飽和硫安において沈殿せず、８０％飽和硫安において沈殿する画分を、４０％飽和硫安を含むバッファーＢ（１０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭアスコルビン酸）に懸濁した。
【００６５】
硫安沈殿により得られたサンプルをフィルター濾過（ＤＩＳＭＩＣ−２５ＣＳ ０．４５μｍ、Advantec）し、疎水カラム ＨｉＬｏａｄ １６／１０ｍｍ Ｐｈｅｎｙｌｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Pharmacia）に供した。すべてのクロマトグラフィーはＢｉｏＬｏｇｉｃ Ｄｕｏ Ｆｌｏｗ（Bio-Rad）をクロマトグラフィーシステムに用い、４℃で行なった。バッファーＢ＋４０％飽和硫安を用いて４０分間かけて非吸着タンパク質をカラムから溶出し、その後１００分間かけて４０％から０％に硫安の濃度勾配を形成し、溶出した。流速は１．０ｍＬ／分で、フラクション分取量は１．５ｍＬ／チューブとした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＡＰＸを含むフラクションを選択した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは１２．５％ポリアクリルアミドゲルを用いて、常法に従いおこなった。
【００６６】
疎水クロマトグラフィーにより分取したフラクションを、限外濾過Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ ＹＭ−１０（Millipore）により５ｍＬに濃縮し、ゲル濾過カラム Ｈｉｌｏａｄ １６／６０ｍｍ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（Pharmacia）に供した。０．１５Ｍ塩化カリウムを含むバッファーＢで溶出した。流速０．５ｍＬ／分で、フラクション分取量は２．０ｍＬ／チューブとした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＡＰＸＢを含むフラクションを選択した。
【００６７】
ＡＰＸＢおよびＡＰＸＢＣ２５Ｓは、回収したＡＰＸＢ酵素液のＳｏｒｅｔピークが約４になるよう０．１５Ｍ塩化カリウムを含むバッファーＢで希釈し、２００μｌずつサンプルチューブに分注し、液体窒素で凍らせて−８０℃で保存した。精製したＡＰＸＢおよびＡＰＸＢＣ２５Ｓのタンパク質定量は常法により行なった。
【００６８】
以上の操作により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを与える精製標品を得た。
【実施例４】
【００６９】
ＡＰＸＢＣ２５ＳのＫｍ、ｋｃａｔと吸収スペクトル
作製した変異型ＡＰＸＢの変異による触媒活性および構造への影響を非特許文献３に記載の方法に従って得られた酵素化学的パラメーターおよび吸収スペクトルにより検証した。
【００７０】
４−１．ＡＰＸＢＣ２５ＳのＫｍおよびｋｃａｔ
ＡＰＸＢＣ２５Ｓの精製標品をバッファー（５０ ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０、０．５ｍＭアスコルビン酸、０．０１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）で１／１００希釈し、終濃度０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．３、０．４、０．５ｍＭのアスコルビン酸を含む反応液（５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０）に混合し、活性測定をおこなった。１．０ｍＬ反応液に終濃度１００μＭの過酸化水素を添加したときの過酸化水素依存的アスコルビン酸の酸化を測定した（Nakano, Y. et al., Plant Cell Physiol., 22:867-880 (1981)）。測定は２５℃でおこない、２９０ｎｍの吸収（モル吸光係数２．８ｍＭ−１ｃｍ−１）の減少を紫外可視分光光度計ＵＶ−１７００ ＰｈａｒｍａＳｐｅｃで観測することでおこなった。各アスコルビン酸濃度におけるＡＰＸＢＣ２５Ｓの活性よりアスコルビン酸に対するＫｍとｋｃａｔを決定した。
【００７１】
次に、ＡＰＸＢＣ２５Ｓの精製標品をバッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０、０．５ｍＭアスコルビン酸、０．０１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）で１／１００希釈し、それを反応液（５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０、０．５ｍＭアスコルビン酸）に混合し、活性測定をおこなった。１．０ｍＬの反応液に対し終濃度１０、２０、３０、４０、６０、８０、１００μＭの過酸化水素を添加したときの過酸化水素依存的アスコルビン酸の酸化を測定した。各過酸化水素濃度におけるＡＰＸＢＣ２５Ｓの活性より過酸化水素に対するＫｍを決定した。対照として野生型ＡＰＸＢを使用した。結果を表３に示す。
【００７２】
【表３】
【００７３】
過酸化水素に対するＡＰＸＢＣ２５ＳのＫｍはＡＰＸＢの値と比較して同程度となった。また、アスコルビン酸に対するＡＰＸＢＣ２５ＳのＫｍはＡＰＸＢの値と比較して４ないし５倍程度であり、ｋｃａｔは７０％以上であった。この結果より、アスコルビン酸に対する親和性は下がったものの、Ｃｙｓ−２５のＳｅｒへの置換が触媒活性にほとんど影響がないことが示された。
【００７４】
４−２．ＡＰＸＢＣ２５Ｓの吸収スペクトル
窒素ガスにより嫌気化した５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０にバッファー置換した。バッファー置換したＡＰＸについて、未処理の場合、０．５ｍＭシアン化カリウムを添加した場合、少量のジチオナイトを添加した場合、それぞれのスペクトルを測定した。測定には紫外可視分光光度計ＵＶ−１７００ ＰｈａｒｍａＳｐｅｃを用いて２５℃でおこなった。
【００７５】
その結果、未処理、およびシアン化カリウムあるいはジチオナイトを添加した変異型ＡＰＸの吸収スペクトルは、ＡＰＸＢのそれらと極めて類似しており、ＣｙｓのＳｅｒへの置換が触媒部位の構造にほとんど影響がないことが示された。これより、これらの変異型ＡＰＸＢを以下の実験に用いることが可能であると判断した。
【実施例５】
【００７６】
ＴＥＭＰＯ存在下でのＡＰＸＢおよびＡＰＸＢＣ２５Ｓの残存活性
ＴＥＭＰＯ存在下での過酸化水素との反応によりシステイン残基が酸化されることで、ＡＰＸＢの触媒活性はどのような影響を受けるか検証するために、ＡＰＸＢおよびＡＰＸＢＣ２５Ｓの残存活性を測定した。
【００７７】
嫌気５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０に置換した酵素液１．０ｍＬに、ラジカル捕捉剤である終濃度０．２または０ｍＭのＴＥＭＰＯを添加し、続いて過酸化水素を５モルまたは０モル当量となるように添加した。一定時間ごとに一部をとりだして速やかに反応液（０．５ｍＭアスコルビン酸、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．０１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）に混合し、失活反応を停止させて各時間の活性測定をおこなった。反応液１．０ｍＬに対して終濃度１００μＭの過酸化水素を添加したときの過酸化水素依存的アスコルビン酸の酸化を２５℃で測定して活性を決定した。
【００７８】
結果を図５に示す。図５中、Ａは野生型ＡＰＸＢを過酸化水素のみで処理した場合、Ｂは変異体ＡＰＸＢＣ２５Ｓを過酸化水素のみで処理した場合、ＣはＡＰＸＢをＴＥＭＰＯの存在下で過酸化水素処理した場合、ＤはＡＰＸＢＣ２５ＳをＴＥＭＰＯの存在下で過酸化水素処理した場合を示す。また、□は過酸化水素を含まない対照を示し、◆は過酸化水素を含む場合を示す。
【００７９】
ＴＥＭＰＯ非存在下で過酸化水素処理した場合の残存活性は、ＡＰＸＢおよびＡＰＸＢＣ２５Ｓいずれも未処理時の５０％程度であった。しかし、ＴＥＭＰＯ存在下で過酸化水素処理した場合の残存活性は、ＡＰＸＢはほぼ完全に活性を失ったのに対して、ＡＰＸＢＣ２５Ｓでは残存活性は１０％程度しか低下しなかった。これより、ＴＥＭＰＯと過酸化水素に依存的に２５位のシステイン残基の酸化が促進されたことにより、ＡＰＸＢでは顕著な触媒活性の低下がおこったことが示された。ＡＰＸＢ変異体でＴＥＭＰＯ非存在下よりも存在下のほうが過酸化水素による失活が起こりにくかった理由は、ＴＥＭＰＯがアスコルビン酸の代わりに触媒部位のヘムを還元したためであると推定された。
【実施例６】
【００８０】
本実施例においては、特許文献３に記載されるタバコＡＰＸを基に、配列番号１の２５位に相当する位置のシステインに加えて、配列番号１の３４位に相当する位置のトリプトファン、配列番号１の１２１位に相当する位置のシステインを別のアミノ酸に置換した２重変異体、３重変異体を作製し、これらの変異の酸化耐性に対する効果を検討した。タバコＡＰＸのアミノ酸配列を配列番号９に、それをコードする核酸のヌクレオチド配列を配列番号１０に示す。配列番号１の２５位は配列番号９の２６位に、３４位は３５位に、１２１位は１２６位にそれぞれ相当する。
【００８１】
実施例３および特許文献３に記載の方法と同様の方法により、配列番号９のアミノ酸配列を有する野生型のタバコＡＰＸ（ｔｓＡＰＸ）、配列番号９の２６位のシステインをセリンに置換したｔｓＡＰＸＣ２６Ｓ（配列番号１１）、配列番号９の３５位のトリプトファンをフェニルアラニンに置換したｔｓＡＰＸＷ３５Ｆ（配列番号１２）、配列番号９の１２６位のシステインをアラニンに置換したｔｓＡＰＸＣ１２６Ａ（配列番号１３）、配列番号９の２６位のシステインをセリンに、１２６位のセリンをアラニンにそれぞれ置換したｔｓＡＰＸＣ２６ＳＣ１２６Ａ（２重変異体）（配列番号１４）、配列番号９の２６位のシステインをセリンに、３５位のトリプトファンをフェニルアラニンに、１２６位のセリンをアラニンにそれぞれ置換したｔｓＡＰＸＣ２６ＳＷ３５ＦＣ１２６Ａ（３重変異体）（配列番号１５）を得た。
【００８２】
それぞれの精製酵素標品について吸光係数（εｓｏｒｅｔ）を測定し、実施例４に記載の方法と同様の方法によりアスコルビン酸および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）に対する定常状態キネティックパラメータ（Ｋｍ、ｋｃａｔ）を測定した。アスコルビン酸に対するＫｍ値の決定には種々の濃度のアスコルビン酸（０〜０．５ｍＭ）および固定濃度のＨ２Ｏ２（０．１ｍＭ）を使用し、Ｈ２Ｏ２に対するＫｍ値の決定には種々の濃度のＨ２Ｏ２（０〜０．１ｍＭ）および固定濃度のアスコルビン酸（０．５ｍＭ）を使用した。結果を表４−１および４−２に示す
【００８３】
【表４−１】
【００８４】
【表４−２】
【００８５】
この結果より、各変異体ＡＰＸが野生型ＡＰＸに比べて遜色ない酵素学的性能を有することが示された。
【００８６】
次に、実施例５に記載の方法と同様の方法により、それぞれの酵素標品をＴＥＭＰＯの存在下または非存在下で過酸化水素で処理し、残存活性を測定した。０．２ｍＭ ＴＥＭＰＯ存在下で５モル当量の過酸化水素で処理した結果を図６に、ＴＥＭＰＯ非存在下で２０モル当量の過酸化水素で処理した結果を図７に示す。
【００８７】
ＴＥＭＰＯは過酸化水素によるシステイン残基の酸化損傷を促進する。図６に示すように、ＴＥＭＰＯ存在下で過酸化水素処理すると、２つのシステイン残基をそれぞれ他の残基に変異させた２重変異の場合（ｔｓＡＰＸＣ２６ＳＣ１２６Ａ）、野生型（ｔｓＡＰＸ）よりも高い酸化耐性が示された。またこの２重変異は各システイン残基の単独変異の場合（ｔｓＡＰＸＣ２６Ｓ、ｔｓＡＰＸＣ１２６Ａ）よりも効果的であった。さらに３５位のトリプトファンに変異導入した３重変異の場合（ｔｓＡＰＸＣ２６ＳＷ３５ＦＣ１２６Ａ）、最も高い酸化耐性が示された。
【００８８】
過酸化水素単独で処理すると、ヘムと３５位のトリプトファンの架橋、アポタンパク質間の重合など複合的な酸化損傷が引き起こされる。図７に示すように、過酸化水素単独で処理すると、２つのシステイン残基の単独変異（ｔｓＡＰＸＣ２６Ｓ、ｔｓＡＰＸＣ１２６Ａ）、２重変異（ｔｓＡＰＸＣ２６ＳＣ１２６Ａ）のいずれの場合も野生型（ｔｓＡＰＸ）と同等の酸化耐性しか示さなかった。一方、３５位のトリプトファンにおける変異を導入した場合（ｔｓＡＰＸＷ３５Ｆ）、野生型よりも高い酸化耐性が示され、３重変異の場合（ｔｓＡＰＸＣ２６ＳＷ３５ＦＣ１２６Ａ）さらに高い酸化耐性が示された。
【００８９】
以上の結果より、配列番号１の２５位に相当する位置のシステインの置換と、配列番号１の３４位に相当する位置のトリプトファンの置換、配列番号１の１２１位に相当する位置のシステインの置換を併用することにより酸化耐性がさらに向上することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明により、新規な酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼおよびその製造方法ならびにアスコルビン酸パーオキシダーゼに酸化耐性を付与する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】ＴＥＭＰＯ存在下で過酸化水素処理したＡＰＸＢトリプシン消化物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの結果を示す図である。
【図２】ＴＥＭＰＯ存在下で過酸化水素処理したＡＰＸＢのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの結果を示す図である。
【図３】グルタチオン存在下で過酸化水素処理したＡＰＸＢのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す図である。
【図４】グルタチオン存在下で過酸化水素処理したＡＰＸＢトリプシン消化物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの結果を示す図である。
【図５】ＴＥＭＰＯ存在下での過酸化水素処理によるＡＰＸＢおよびＡＰＸＢＣ２５Ｓの触媒活性への影響を示す図である。
【図６】ＴＥＭＰＯ存在下での過酸化水素処理による各種ＡＰＸの触媒活性への影響を示す図である。
【図７】ＴＥＭＰＯ非存在下での過酸化水素処理による各種ＡＰＸの触媒活性への影響を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００９２】
SEQ ID NO:3: Cys at position 25 of ascorbate peroxidase from G. partita is replaced by Ser
SEQ ID NO:4: g at position 74 of ascorbate peroxidase-encoding sequence from G. partita is replaced by c
SEQ ID NO:5: A primer APXB29R
SEQ ID NO:6: A primer APXB30
SEQ ID NO:7: A primer T7 promoter
SEQ ID NO:8: A primer T7 terminator
SEQ ID NO:11: Cys at position 26 of ascorbate peroxidase from tobacco is replaced by Ser
SEQ ID NO:12: Trp at position 35 of ascorbate peroxidase from tobacco is replaced by Phe
SEQ ID NO:13: Cys at position 126 of ascorbate peroxidase from tobacco is replaced by Ala
SEQ ID NO:14: Cys at position 26 of ascorbate peroxidase from tobacco is replaced by Ser; Cys at position 126 of ascorbate peroxidase from tobacco is replaced by Ala
SEQ ID NO:15: Cys at position 26 of ascorbate peroxidase from tobacco is replaced by Ser; Trp at position 35 of ascorbate peroxidase from tobacco is replaced by Phe; Cys at position 126 of ascorbate peroxidase from tobacco is replaced by Ala
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼおよびその製造方法ならびにアスコルビン酸パーオキシダーゼに酸化耐性を付与する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アスコルビン酸パーオキシダーゼ（「アスコルビン酸ペルオキシダーゼ」とも呼ばれる；以下、「ＡＰＸ」と略記する場合がある）は、藻類から高等植物に至る真核光合成生物において見出される、Ｉ型ヘムパーオキシダーゼ遺伝子ファミリーのメンバーである。ＡＰＸはアスコルビン酸を電子供与体として過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を水（Ｈ２Ｏ）に還元する。詳細には、ＡＰＸが１分子の過酸化水素と反応すると、ヘムの第二鉄（ＦｅＩＩＩ）原子はオキシフェリル（ＦｅＩＶ＝Ｏ）に酸化され、ポルフィリンはカチオンラジカル中間体（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｉと称する）となる。この中間体はその後２分子のアスコルビン酸との２段階の反応により基底状態の鉄（ＦｅＩＩＩ）となり、副産物として２分子のモノデヒドロアスコルビン酸ラジカルが生じる。
【０００３】
高等植物のＡＰＸには複数のアイソフォームが存在する。このうち、葉緑体局在型ＡＰＸは過酸化水素に感受性であり、一方、細胞質局在型ＡＰＸは過酸化水素に耐性である。高等植物の葉緑体には２つのＡＰＸアイソフォームがあり、一方はストロマに局在しており、他方はチラコイド膜のストロマ側に結合している。これらはいずれも過酸化水素に対して非常に感受性であり、還元剤であるアスコルビン酸が欠乏すると過剰の過酸化水素によって数分のうちに失活する（非特許文献１）。本発明者らが紅藻ガルディエリア・パーチタ（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｐａｒｔｉｔａ）から得たＡＰＸ（ＡＰＸＢ）は、Ｎ末端側ドメインでは高等植物の葉緑体ＡＰＸとの配列類似性を有するが（非特許文献２）、高等植物の細胞質ゾルやマイクロボディに局在するＡＰＸアイソフォームと同様に比較的過酸化水素に耐性である（非特許文献３）。
【０００４】
植物は移動することができないため、常に高温・低温・乾燥等のストレスにさらされており、極端な環境条件下では、植物は生育阻害、枯死等の障害を受ける。そして、これら障害の原因の一つは、植物体内で発生する活性酸素であることが知られている。この活性酸素の除去を目的とし、ＡＰＸを利用して過酸化水素を消去し、植物にストレス耐性を与える試みがなされている（特許文献１−２、非特許文献４−８）。しかし、上記のようにＡＰＸは失活しやすく、期待されるようなストレス耐性植物は得られていない。
【０００５】
上記したＡＰＸの反応において、還元剤としてのアスコルビン酸が存在せず、カチオンラジカル中間体が還元されなければ、ラジカルはアポタンパク質のアミノ酸残基に転移する。ＡＰＸの失活はこのような過酸化水素による反応中間体の攻撃に起因すると考えられている。従って、ＡＰＸにおけるタンパク質内ラジカル転移に関する情報は、過酸化水素が媒介する失活のメカニズムおよびＡＰＸアイソフォームの過酸化水素に対する感受性の差異を理解するために必要である。
【０００６】
例えば、タンパク質中のシステイン残基のチオール基は生体内で酸化されることが知られており（非特許文献９−１０）、ＡＰＸの失活と個々のアミノ酸残基との関係についてより詳細に調べる必要がある。しかし、ＡＰＸのアスコルビン酸結合部位を調べるためにＡＰＸ中のシステイン残基に変異を導入したとの報告はあるものの（非特許文献１１）、ＡＰＸにおけるタンパク質内ラジカル転移に関与するアミノ酸残基についての知見は少なかった。
【０００７】
本発明者らは、触媒部位の遠位空洞（distal cavity）に面するトリプトファン残基が葉緑体ＡＰＸ中のラジカル部位であることを、ＡＰＸが過剰の過酸化水素で失活する際にトリプトファン残基がヘムに架橋されるという知見に基づいて、見出している（特許文献３）。しかし、ＡＰＸにおいてその他のラジカル部位は十分には調べられておらず、近位のトリプトファンと思われる残基が過酸化水素での処理によってヒドロキシル化されるという知見に基づいて、マメの細胞質ゾルＡＰＸのラジカル部位が近位のトリプトファン残基であると提唱する報告があるのみである（非特許文献１２）。
【０００８】
【特許文献１】特開２００３−００９６９２号公報
【特許文献２】特開２００４−１０５１３６号公報
【特許文献３】特開２００６−２９６２０９号公報
【非特許文献１】Asada, K., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 50:601-639 (1999)
【非特許文献２】Kitajima, S. et al., Biosic. Biotechnol. Biochem., 66:2367-2375 (2002)
【非特許文献３】Kitajima, S. et al., FEBS J., 273, 2704-2710 (2006)
【非特許文献４】Kornyeyev, D. et al., Physiol. Plant, 113:323-331(2001)
【非特許文献５】Payton, P. et al., J. Exp. Bot., 52:2345-2354 (2001)
【非特許文献６】Yabuta, Y. et al., Plant J., 32:915-925 (2002)
【非特許文献７】Murgia, I. et al., Plant J., 38:940-953 (2004)
【非特許文献８】Badawi, G.H. et al., Physiol. Plant, 121:231-238 (2004)
【非特許文献９】Ghezzi, P., Biochem. Soc. Trans., 33:1378-1381 (2005)
【非特許文献１０】Spickett, C.M. et al., Biochim. Biopys. Acta, 1764:1823-1841 (2006)
【非特許文献１１】Mandelman, D. et al., Biochemistry, 37:17610-17617 (1998)
【非特許文献１２】Hiner, A.N. et al., Eur. J. Biochem., 268:3091-3098 (2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、新規な酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼおよびその製造方法ならびにアスコルビン酸パーオキシダーゼに酸化耐性を付与する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は以下に関する：
［１］未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列において、少なくとも配列番号１の２５位に相当する位置のアミノ酸がシステインからシステイン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する、酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼ；
［２］未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼがガルディエリア・パーチタ（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｐａｒｔｉｔａ）またはタバコに由来する、［１］の酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼ；
［３］配列番号３、１１、１４および１５からなる群より選択されるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有する、［１］または［２］の酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼ；
［４］システイン以外のアミノ酸がセリンである、［１］〜［３］のいずれかの酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼ；
［５］ラジカル捕捉剤の存在下で酸化耐性を示す、［１］〜「４」のいずれかの酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼ；
［６］さらに、配列番号１の３４位に相当する位置のアミノ酸のトリプトファンからトリプトファン以外のアミノ酸への置換および／または配列番号１の１２１位に相当する位置のアミノ酸のシステインからシステイン以外のアミノ酸への置換を有する、［１］〜［５］のいずれかの酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼ；
［７］酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼを生産する細胞を培養する工程を包含する、酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼの製造方法であって、酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼが、未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列において、少なくとも配列番号１の２５位に相当する位置のアミノ酸がシステインからシステイン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する、方法；
［８］未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼがガルディエリア・パーチタ（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｐａｒｔｉｔａ）またはタバコに由来する、［７］の方法；
［９］酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼが、配列番号３、１１、１４および１５からなる群より選択されるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有する、［７］または［８］の方法；
［１０］システイン以外のアミノ酸がセリンである、［７］〜［９］のいずれかの方法；
［１１］酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼがラジカル捕捉剤の存在下で酸化耐性を示す、［７］〜［１０］のいずれかの方法；
［１２］酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼが、さらに、配列番号１の３４位に相当する位置のアミノ酸のトリプトファンからトリプトファン以外のアミノ酸への置換および／または配列番号１の１２１位に相当する位置のアミノ酸のシステインからシステイン以外のアミノ酸への置換を有する、［７］〜［１１］のいずれかの方法。
［１３］未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列において、少なくとも配列番号１の２５位に相当する位置のアミノ酸をシステインからシステイン以外のアミノ酸に置換する工程を包含する、アスコルビン酸パーオキシダーゼに酸化耐性を付与する方法；
［１４］未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼがガルディエリア・パーチタ（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｐａｒｔｉｔａ）またはタバコに由来する、［１３］の方法；
［１５］酸化耐性を付与されたアスコルビン酸パーオキシダーゼが、配列番号３、１１、１４および１５からなる群より選択されるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有する、［１３］または［１４］の方法；
［１６］システイン以外のアミノ酸がセリンである、［１３］〜［１５］のいずれかの方法；
［１７］ラジカル捕捉剤の存在下での酸化耐性が付与される、［１３］〜［１６］のいずれかの方法。
［１８］配列番号１の３４位に相当する位置のアミノ酸をトリプトファンからトリプトファン以外のアミノ酸に置換する工程および／または配列番号１の１２１位に相当する位置のアミノ酸をシステインからシステイン以外のアミノ酸に置換する工程をさらに包含する、［１３］〜［１７］のいずれかの方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、新規な酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼおよびその製造方法ならびにアスコルビン酸パーオキシダーゼに酸化耐性を付与する方法が提供される。本発明のアスコルビン酸パーオキシダーゼは酸化耐性を示し、ストレス耐性植物の作製に加えて、研究用試薬、化粧品（特表２００４−５２９８６６号公報参照）、医薬品（特表２００２−５２３３７８号公報、特表平１０−５０４３０４号公報、国際公開第２００４／０６６９８８号パンフレット参照）など従来のアスコルビン酸パーオキシダーゼが利用可能な全ての目的のために有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼを提供する。本発明の酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼは、未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列において、少なくとも配列番号１の２５位に相当する位置のアミノ酸がシステインからシステイン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する。本発明の酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼは、さらに配列番号１の３４位に相当する位置のアミノ酸のトリプトファンからトリプトファン以外のアミノ酸への置換および／または配列番号１の１２１位に相当する位置のアミノ酸のシステインからシステイン以外のアミノ酸への置換を有していてもよい。
【００１３】
「アスコルビン酸パーオキシダーゼ」は、アスコルビン酸を還元剤として、過酸化水素を還元する酵素である。アスコルビン酸パーオキシダーゼ活性は公知の任意の方法によって測定することができる。例えば、Ｎａｋａｎｏらの方法（Nakano, Y. et al., Plant Cell Physiol., 22, 867-880 (1981)）に従い、過酸化水素によるアスコルビン酸の減少を吸光度の減少として測定することにより決定することができる。
【００１４】
本明細書において、「未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼ」は、配列番号１の２５位に相当する位置のアミノ酸としてシステインを有し、アスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有するタンパク質をいう。未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼは、天然のアスコルビン酸パーオキシダーゼと同一のアミノ酸配列からなってもよく、あるいは天然のアスコルビン酸パーオキシダーゼとは異なるアミノ酸配列を有していてもよい。
【００１５】
未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼは、任意の生物に由来し得る。例えば、本発明者らによって単離されたガルディエリア・パーチタ（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｐａｒｔｉｔａ）由来のアスコルビン酸パーオキシダーゼを使用することができる。当該酵素のアミノ酸配列を配列番号１に示す。タバコ由来のアスコルビン酸パーオキシダーゼも好適に使用することができる。当該酵素のアミノ酸配列を配列番号９に示す。
【００１６】
本明細書において、「酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼ」は、未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列において、少なくとも配列番号１の２５位に相当する位置のアミノ酸がシステインからシステイン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有し、アスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有するタンパク質であって、酸化に対する耐性が未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼに比較して向上したタンパク質をいう。酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼが未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼと同様の酵素活性を保持していることは、例えば、Ｋｍおよびｋｃａｔの値、吸収スペクトルなどを調べることによって確認することができる。
【００１７】
本明細書において「配列番号１の２５位に相当する位置のアミノ酸」とは、配列番号１に示す紅藻ガルディエリア・パーチタ由来アスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列と、対象となるアスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列とを比較した場合に、配列番号１の２５位のシステインに相当する対象配列中の位置に存在するアミノ酸をいう。あるいは、この位置のアミノ酸は、ヘムのプロピオン酸側鎖の近位に存在するシステイン残基としても同定することができる。同様に、「配列番号１の３４位に相当する位置のアミノ酸」および「配列番号１の１２１位に相当する位置のアミノ酸」とは、配列番号１に示す紅藻ガルディエリア・パーチタ由来アスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列と、対象となるアスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列とを比較した場合に、それぞれ配列番号１の３４位のトリプトファンおよび１２１位のシステインに相当する対象配列中の位置に存在するアミノ酸をいう。
【００１８】
アミノ酸配列の比較は公知の配列解析用プログラムまたはアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ）を使用して行うことができる。いくつかの公知のアスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列を比較したアラインメントの結果の一例を表１に示す。表中、「Ｐｅａ＿Ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ＿Ｐ４８５３４」はＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ４８５３４に登録されたエンドウの細胞質局在型アスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列を示し、「Ｃｏｔｔｏｎ＿Ｍｉｃｒｏｂｏｄｙ＿ＡＡＢ５２９５４」はＧｅｎＢａｎｋプロテインＩＤ番号ＡＡＢ５２９５４に登録されたワタのマイクロボディ局在型アスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列を示し、「Ｇａｌｄｉｅｒｉａ＿Ｃｙｔｏｓｏｌｉｄ＿ＡＢ０３７５３７」はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０３７５３７に登録された紅藻ガルディエリア・パーチタのアスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列（すなわち、配列番号１のアミノ酸配列）を示し、「Ｔｏｂａｃｃｏ＿Ｓｔｒｏｍａｌ＿ＢＡＡ７８５５３」はＧｅｎＢａｎｋプロテインＩＤ番号ＢＡＡ７８５５３に登録されたタバコの葉緑体ストロマ局在型アスコルビン酸パーオキシダーゼの全長アミノ酸配列（トランジットペプチドを含む）を示す。
【００１９】
【表１−１】
【００２０】
【表１−２】
【００２１】
配列番号１の２５位に相当する位置は、表１−１中第３段の１５番目に当たる（「Ｃ２５」で示す）。表に示した全ての配列において同じ位置にシステイン残基（Ｃ）が見られる（完全一致を示す記号「＊」が表示されている）ことから明らかなように、この位置のシステイン残基は各種アスコルビン酸パーオキシダーゼの間で高度に保存されている。なお、この位置は、エンドウの細胞質局在型、ワタのマイクロボディ局在型、タバコの葉緑体ストロマ局在型アスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列のそれぞれ３２位、３０位、１１５位に相当する。従って、当業者は、対象となるアスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列において、配列番号１の２５位に相当する位置のアミノ酸を容易に同定することができる。同様に、配列番号１の３４位に相当する位置（表中「Ｗ３４」で示す）、配列番号１の１２１位に相当する位置（表中「Ｃ１２１」で示す）も容易に同定される。例えば、配列番号９に示すタバコ由来のアスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列の２６位、３５位、１２６位がそれぞれ配列番号１の２５位、３４位、１２１位に相当する。
【００２２】
酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼは、例えば、配列番号３のアミノ酸配列からなる。ここで配列番号３のアミノ酸配列は、配列番号１の２５位のアミノ酸がシステインからセリンに置換されたものである。あるいは、酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼは、アスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有する限り、配列番号３のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなってもよい。また、例えば、酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼとして、配列番号１１、１４および１５から選択されるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有するタンパク質を使用することができる。なお、配列番号１１〜１５のアミノ酸配列は、配列番号９のアミノ酸配列において以下の置換を有するものである：配列番号１１：２６位のシステインからセリン；配列番号１２：３５位のトリプトファンからフェニルアラニン；配列番号１３：１２６位のシステインからアラニン；配列番号１４：２６位のシステインからセリンおよび１２６位のシステインからアラニン；配列番号１５：２６位のシステインからセリン、３５位のトリプトファンからフェニルアラニンおよび１２６位のシステインからアラニン。
【００２３】
配列番号１の２５位に相当する位置に配置されるシステイン以外のアミノ酸としては、置換した後にアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性が保持されるのであれば、システイン以外の任意の天然アミノ酸を使用することができる。例えば、システインと分子構造が類似するセリンを使用することにより、置換によるタンパク質の立体構造の変化を少なくすることができる。アラニンも配列番号１の２５位に相当する位置に配置されるシステイン以外のアミノ酸として好適に使用することができる。同様に、当業者は配列番号１の３４位に相当する位置に配置されるトリプトファン以外のアミノ酸を適切に選択することができ、例えばフェニルアラニンを使用することができる。
【００２４】
本発明のアスコルビン酸パーオキシダーゼは、配列番号１の２５位に相当する位置に加えて、他の置換されたアミノ酸残基を有してもよい。他の置換の例としては、配列番号１の３４位に相当する位置のトリプトファンの別のアミノ酸への置換、配列番号１の１２１位に相当する位置のシステイン残基の別のアミノ酸残基への置換が挙げられる。
【００２５】
１つの実施態様において、本発明のアスコルビン酸パーオキシダーゼはラジカル捕捉剤の存在下で酸化耐性を示す。ラジカル捕捉剤（ラジカル捕獲剤ともいう）は、反応中に生ずるラジカルを捕らえるために用いられる化合物である。本発明には任意のラジカル捕捉剤を使用することができる。例えば、２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシル（ＴＥＭＰＯ）を使用することができる。ＴＥＭＰＯはアミノ酸ラジカルに結合して安定な生成物を形成することが知られている。なお、ＴＥＭＰＯはチオール（−ＳＨ）ラジカルと連鎖的に反応しＴＥＭＰＯ付加物だけでなく、チオール基の酸化物であるスルフィン酸（−ＳＯ２Ｈ）、スルホン酸（−ＳＯ３Ｈ）も生じることが報告されており、この不可逆的酸化反応はＴＥＭＰＯの官能基であるニトロキシド・ラジカルの作用によるものであることが示唆されているBorisenko, G.G. et al., J. Am. Chem. Soc., 126:9221-9232 (2004)）。従って、一般にラジカル捕捉剤と称されていない化合物であっても、ＴＥＭＰＯと同様にニトロキシド・ラジカルを有してシステインラジカルの不可逆的酸化反応を引き起し得るものはラジカル捕捉剤に含まれる。
【００２６】
酸化に対する耐性は、例えば、以下のようにして確認することができる。すなわち、嫌気５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０に置換したアスコルビン酸パーオキシダーゼ含有酵素液１．０ｍＬに、ラジカル捕捉剤を終濃度０．２または０ｍＭ添加し、続いて過酸化水素を５モルまたは０モル当量となるように添加する。一定時間ごとに一部をとりだして速やかに反応液（０．５ｍＭアスコルビン酸、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．０１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）に混合し、失活反応を停止させて各時間の活性測定をおこなう。ここで、反応液１．０ｍＬに対して終濃度１００μＭの過酸化水素を添加したときの過酸化水素依存的アスコルビン酸の酸化を２５℃で測定して活性を決定する。なお、本明細書において「モル当量」なる用語は、アスコルビン酸パーオキシダーゼに対する過酸化水素のモル数での比率を表す。上記条件下、ラジカル捕捉剤としてのＴＥＭＰＯの存在下で１０分間反応させた場合、本発明のアスコルビン酸パーオキシダーゼは、例えば、６０〜１００％、好ましくは８０〜１００％、より好ましくは９０〜１００％の残存活性を示す。
【００２７】
本発明は、上記酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼを生産する細胞を培養する工程を包含する、酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼの製造方法を提供する。
【００２８】
酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼを生産する細胞としては、例えば、酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼをコードする核酸を含む組換えＤＮＡで形質転換された宿主細胞を使用することができる。従って、本発明によれば、本発明のアスコルビン酸パーオキシダーゼをコードする核酸、当該核酸を含む組換えＤＮＡ、当該組換えＤＮＡを含む形質転換体も提供される。
【００２９】
酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼをコードする核酸としては、例えば、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸が挙げられる。そのような核酸の例としては、配列番号４のヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられる。なお、配列番号４の配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０３７５３７に登録された紅藻ガルディエリア・パーチタのアスコルビン酸パーオキシダーゼのヌクレオチド配列のコード領域に当たる１９８位から９４１位（配列番号２）のうち、配列番号１の２５位に相当する位置のシステインのコドン（ＴＧＴ）（配列番号２の７３〜７５位）をセリンのコドン（ＴＣＴ）（配列番号４の７３〜７５位）に変化させたものである。あるいは、当該核酸は、配列番号４のヌクレオチド配列からなる核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸であってもよい。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件としては、J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されるような条件が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液（Denhardt's solution）、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中６８℃でプローブとハイブリダイズさせた後、洗浄条件を２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中室温から０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中６８℃まで変化させる条件が挙げられる。配列番号１１、１４および１５から選択されるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸も同様に使用することができる。
【００３０】
宿主細胞としては、細菌などの原核細胞、糸状菌、酵母などの真核微生物細胞、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであれば任意の細胞を選択することができる。当該組換えＤＮＡには、酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼをコードする核酸に加えて、転写、翻訳、形質転換体の選択などに必要な任意の核酸配列を含めてもよい。上記細胞の培養は、使用する細胞に適切な条件で行われる。また、上記組換えＤＮＡを導入した細胞を用いて動物個体（トランスジェニック動物）を作製することもできる。例えば、酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼを乳汁中に生産するトランスジェニック動物を作製することができる。このような組換え体は公知の方法に従って作製することができる。
【００３１】
あるいは、上記組換えＤＮＡを導入した細胞を用いて植物個体（トランスジェニック植物）を作製することもできる。このような植物個体はアスコルビン酸パーオキシダーゼの製造以外に、耐ストレス作物として有用である。組換えＤＮＡを導入する植物としては、任意の植物を使用することができる。そのような植物には単子葉植物（イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシなど）および双子葉植物（ワタ、トマト、タバコなど）のいずれもが含まれる。このような植物個体の作製方法は当該分野において公知であり、例えば、特許文献１−２、非特許文献４−８に記載されている。このような植物は酸化毒ストレスに対する耐性を有し、砂漠緑化、ＣＯ２削減、農業における作物生産などに有用である。
【００３２】
本発明は、未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列において、少なくとも配列番号１の２５位に相当する位置のアミノ酸をシステインからシステイン以外のアミノ酸に置換する工程を包含する、アスコルビン酸パーオキシダーゼに酸化耐性を付与する方法を提供する。本発明の方法によりアスコルビン酸パーオキシダーゼに酸化耐性が付与されることは上記で説明したとおりである。
【００３３】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３４】
ＴＥＭＰＯ存在下で過酸化水素処理したＡＰＸＢの質量分析
ガルディエリア・パーチタ（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｐａｒｔｉｔａ）由来アスコルビン酸パーオキシダーゼ、ＡＰＸＢを５モル当量の過酸化水素とともに嫌気化した５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０中でインキュベートすると重合体が形成されたが、０．２ｍＭのラジカル捕捉剤２，２，６，６−テトラメチル−１−ピペリジニルオキシル（ＴＥＭＰＯ）の存在下ではこのような重合体は形成されなかった。このことは、重合がタンパク質表面でのラジカル形成に起因するものであり、ＴＥＭＰＯがラジカル部位を捕捉したことを示す。そこで、ラジカル部位を同定するために、未処理およびＴＥＭＰＯ存在下で過酸化水素処理したＡＰＸＢのトリプシン消化物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよびＭＳ／ＭＳにより解析した。ＡＰＸＢ酵素液の調製は下記の実施例３に記載のように行った。
【００３５】
精製ＡＰＸＢを、ＮＡＰ５ゲル濾過カラム２本を用いて、窒素ガスにより嫌気化した５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０にバッファー置換し、１．０ｍＬの酵素液を得た。嫌気条件に保ったまま、紫外可視分光光度計ＵＶ−１７００ ＰｈａｒｍａＳｐｅｃでＳｏｒｅｔピークを測定して酵素濃度を決定した。ＡＰＸＢのこの条件でのモル吸光係数は、１０２ｍＭ−１・ｃｍ−１である。なお、下記ＡＰＸＢ変異体ＡＰＸＢＣ２５Ｓのモル吸光係数は、９３ｍＭ−１・ｃｍ−１である。ヘム濃度はＰｙｒｉｄｉｎｅ ｈｅｍｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎ法により（非特許文献２）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（モル吸光係数１００ｍＭ−１・ｃｍ−１、ナカライテスク）を標準品として決定した。
【００３６】
嫌気５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０に置換したＡＰＸＢ酵素液１．０ｍＬに、終濃度０．２または０ｍＭのラジカル捕捉剤ＴＥＭＰＯ（和光純薬）を添加し、続いて過酸化水素を５モルまたは０モル当量となるように添加した。一定時間後にＮＡＰ１０ゲル濾過カラムに供して嫌気５０ｍＭ重炭酸アンモニウムバッファー、ｐＨ８．０で溶出することにより未反応のＴＥＭＰＯまたはグルタチオンと過酸化水素を除去して酵素液０．５ｍＬを得た。酵素液は１００μｌずつサンプルチューブに分注し、液体窒素で凍らせて−８０℃で保存した。
【００３７】
これらの酵素液１００μｌに、３３μｌの８Ｍ尿素を混合し、１μｌのトリプシン（Sequencing Grade Modified Trypsin、Frozen、Promega）を加えて一晩消化した。トリプシンで消化したＡＰＸをＺｉｐＴｉｐ（登録商標）Ｃ１８（Millipore）に供し、測定サンプル用溶媒（７５％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ）を用いて説明書に従って溶出した。マトリックスとしてα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ、Bruker Daltonics）を、標準試料としてｐｅｐｔｉｄｅ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｓｔａｎｄａｒｄ ＩＩ（Bruker Daltonics）を用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（VoyagerDE STR、Applied biosystems）およびＭＳ／ＭＳ（ultraflex TOF/TOF、Bruker Daltonics）でＡＰＸＢトリプシン消化物の質量分析をおこなった。測定方法は装置の説明書に従った。解析にはＭａｓｃｏｔ Ｓｅａｒｃｈ（http://www.matrixscience.com/search_form_select.html）を用いた。
【００３８】
ＴＥＭＯ存在下で過酸化水素処理したＡＰＸＢのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの結果を図１および表２に示す。
【００３９】
【表２】
【００４０】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの結果より、未処理のＡＰＸＢで確認できたアミノ酸配列１９から３１番（ＬＦＥＱＴＰＣＭＰＩＭＶＲ、分子量計算値：１５６３．７６１１）に相当する質量１５６５ｍ／ｚのピークが、ＴＥＭＰＯと過酸化水素で処理することで顕著に減少し、これに伴い、いくつかのピークが出現していることが明らかとなった。
【００４１】
さらに、図１の１５９７ｍ／ｚのピークについてＭＳ／ＭＳ解析を行ったところ、２５位のシステイン残基（Ｃｙｓ−２５）の質量増加が３２ｍ／ｚであり、Ｃｙｓ−２５に酸素２原子（原子量１６）が結合したことが確認できた（−ＳＯ２Ｈ）。図１の１７３６ｍ／ｚのピークについてＭＳ／ＭＳ解析を行ったところ、Ｃｙｓ−２５の質量増加が１７１ｍ／ｚであり、Ｃｙｓ−２５に１分子のＴＥＭＰＯ（分子量１５６．３）と１原子の酸素が結合したことが確認できた（−ＳＯ−ＴＥＭＰＯ）。
【００４２】
ＴＥＭＰＯはチオール（−ＳＨ）ラジカルと連鎖的に反応しＴＥＭＰＯ付加物だけでなく、チオール基の酸化物であるスルフィン酸（−ＳＯ２Ｈ）、スルホン酸（−ＳＯ３Ｈ）も生じることが報告されており（Borisenko, G.G. et al., J. Am. Chem. Soc., 126:9221-9232 (2004)）、今回の結果と一致していた。以上より、Ｃｙｓ−２５がラジカル化部位であることが明らかとなった。以下の実施例では主にＣｙｓ−２５について記載するが、１２１位のシステイン残基（Ｃｙｓ−１２１）もラジカル化部位であることが示唆されており、このシステイン残基とＡＰＸの失活との関係については実施例６において記載する。
【００４３】
また、トリプシン消化せずにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで分析すると、ＡＰＸＢはＴＥＭＰＯ存在下で過酸化水素処理した場合に、未処理の場合と比較して約５０Ｄａの質量増加がみられる（図２）。この結果から、実際にはシステイン残基にＴＥＭＰＯ付加物はほとんど存在せず、その大半がシステイン残基の酸化物であるスルフィン酸（−ＳＯ２Ｈ）あるいはスルホン酸（−ＳＯ３Ｈ）であることが示された。
【実施例２】
【００４４】
ＡＰＸＢのラジカル化に与えるグルタチオンの影響
２−１．グルタチオン存在下で過酸化水素処理したＡＰＸＢのＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＴＥＭＰＯは植物など生体内には存在しないが、システイン残基のチオール基の酸化はインビボにおいても生じ得る（非特許文献９−１０）。しかし生体内ではラジカル化したシステイン残基へグルタチオンが結合することによってこのような酸化が防止される可能性も考えられる。以下で、ＡＰＸＢのラジカル化に与えるグルタチオンの影響を検討した。
【００４５】
嫌気５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０に置換したＡＰＸＢ酵素液０．３ｍＬに、グルタチオンを終濃度０、０．１、０．２、０．５、１．０、２．０ｍＭとなるように、続いて過酸化水素を５モルまたは０モル当量となるようにマイクロシリンジで注入した。グルタチオンと過酸化水素を添加した酵素液を、一定時間後にＮＡＰ１０（Pharmacia）ゲル濾過カラムに供して嫌気５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０で溶出することにより未反応のグルタチオンと過酸化水素を除去して酵素液０．５ｍＬを得た。得た酵素液は１００μｌずつサンプルチューブに分注し、液体窒素で凍らせて−８０℃で保存した。
【００４６】
グルタチオンと過酸化水素を除去した酵素液１００μｌに、当量の２倍濃度ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー（２−メルカプトエタノールを含まない）を加えて混合し、５０μｌずつサンプルチューブに分注し、液体窒素で凍らせて−８０℃で保存した。２−メルカプトエタノールは終濃度５％となるように泳動直前に添加した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは１２．５％ポリアクリルアミドゲルを用いて行い、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色により染色した。
【００４７】
結果を図３に示す。図３において、各レーンは、左から以下を表す：マーカー（NEB BroadRangeP7702）；未処理ＡＰＸＢ；ＡＰＸＢ＋５モル当量Ｈ２Ｏ２；ＡＰＸＢ＋５モル当量Ｈ２Ｏ２＋０．１ｍＭグルタチオン；ＡＰＸＢ＋５モル当量Ｈ２Ｏ２＋０．２ｍＭグルタチオン；ＡＰＸＢ＋５モル当量Ｈ２Ｏ２＋０．５ｍＭグルタチオン；ＡＰＸＢ＋５モル当量Ｈ２Ｏ２＋１．０ｍＭグルタチオン；ＡＰＸＢ＋５モル当量Ｈ２Ｏ２＋２．０ｍＭグルタチオン。未処理のＡＰＸＢについては２８ｋＤａ付近に単一のバンドが確認できるのに対して、過酸化水素を添加した場合では２８、６０、１２０ｋＤａ付近にＡＰＸＢのモノマーおよび重合体と思われる複数のバンドが確認された。一方、グルタチオン存在下で過酸化水素処理した場合ではグルタチオン濃度の増加にしたがってそれらのバンドが薄くなり、２．０ｍＭのグルタチオンの存在下で過酸化水素処理した場合では、ＡＰＸＢのモノマーに対応する２８ｋＤａ以外のバンドはほとんど確認できなかった。すなわち、グルタチオンがＡＰＸＢタンパク質表面のラジカル化したシステイン残基に結合し、過酸化水素によるタンパク質同士の重合を防止することが示唆された。
【００４８】
２−２．グルタチオン存在下で過酸化水素処理したＡＰＸＢの質量分析
グルタチオンがラジカル化部位であるシステイン残基に結合しているかを明らかにするために、グルタチオン存在下で過酸化水素処理したＡＰＸＢのトリプシン消化物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよびＭＳ／ＭＳにより解析した。実験は、ＴＥＭＰＯの代わりに２．０ｍＭまたは０ｍＭのグルタチオン（和光純薬）を使用した以外、実施例１と同様に実施した。結果を図４に示す。
【００４９】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの結果より、未処理のＡＰＸＢで確認できたアミノ酸配列１９から３１番に相当する質量１５６５ｍ／ｚのピークが、グルタチオンと過酸化水素で処理することで顕著に減少し、これに伴い、このペプチド断片にグルタチオン１分子（分子量３０７．３３）分が結合し、水素２原子（原子量１．０１）が脱離したと考えられるピークが出現していることが明らかとなった（−Ｓ−Ｓ−Ｇ）。
【００５０】
さらに、図４の１８７０ｍ／ｚのピークについてＭＳ／ＭＳ解析を行ったところ、Ｃｙｓ−２５にグルタチオンが結合し、水素２原子が脱離したことが確認できた。これより、ＡＰＸＢは過酸化水素との反応により、タンパク質表面のシステイン残基がラジカル化し、グルタチオンと結合することが示された。
【００５１】
なお、過酸化処理したＡＰＸＢの残存活性を下記実施例５と同様に測定したところ、残存活性は未処理時の５０％程度であったが、グルタチオン存在下で過酸化水素処理した場合のＡＰＸの残存活性は未処理時の８０％であり、Ｃｙｓ−２５にグルタチオンが結合することによるＡＰＸＢの触媒活性の低下はないことが示された。
【００５２】
植物の細胞には２．０ｍＭから５．０ｍＭのグルタチオンが存在するといわれている。上記の結果を考慮すれば、通常は、生体内においてもタンパク質同士の重合およびシステイン残基の不可逆的な酸化がＡＰＸとグルタチオンとの結合により防止されている可能性がある。しかし、細胞が深刻な酸化ストレスに曝されると還元型グルタチオンの濃度が低下するとされている。このような場合には、ＡＰＸのシステイン残基がグルタチオンにより保護されずに酸化され、その結果、ＡＰＸＢの触媒活性が失われる可能性がある。従って、植物細胞の状態によっては実施例１において示された過酸化水素およびＴＥＭＰＯによるのと同様の２５位のシステイン残基（Ｃｙｓ−２５）の酸化が生体内においても生じ得ることが示唆された。
【実施例３】
【００５３】
ＡＰＸＢおよびＡＰＸＢＣ２５Ｓの構築、発現および精製
実施例１においてＴＥＭＰＯ存在下で過酸化水素と反応させることにより、ＡＰＸＢの２５位のシステイン残基がラジカル化し、さらに酸化されることが明らかとなった。また実施例２において、このシステイン残基にグルタチオンが結合し、過酸化水素によるＡＰＸＢの重合が防止されることが示唆された。そこで、システイン残基の酸化がＡＰＸＢの触媒活性に与える影響を検証するために、当該システイン残基を欠損する変異型ＡＰＸＢを作製した。
【００５４】
３−１．ｐＥＴＡＰＸＢＣ２５Ｓの構築
紅藻ガルディエリア・パーチタの細胞質局在型ＡＰＸ（ＡＰＸＢ）の２５位のシステイン残基（Ｃｙｓ−２５）をセリン（Ｓｅｒ）に置換したＡＰＸ（ＡＰＸＢＣ２５Ｓと命名する）を発現する大腸菌用発現ベクターｐＥＴ１６ｂＡＰＸＢＣ２５Ｓを以下のようにして作製した。
【００５５】
５’末端側断片の増幅のために、プライマーＡＰＸＢ２９Ｒ（５’−ＡＧＧＡＧＴＣＴＧＴＴＣＡＡＡＴＡＧＣＴＴＴＡＣ−３’）（配列番号５）を設計し、の５’末端をＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（東洋紡績）を用いリン酸化した。プロトコールはカタログＴＯＹＯＢＯ ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ＦＯＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ（２００４／２００５）中の使用説明書に従った。
【００５６】
３’末端側断片の増幅と変異導入のために、プライマーＡＰＸＢ３０（５’−ＴＣＴＡＴＧＣＣＴＡＴＴＡＴＧＧＴＧＣＧＡＣＴＡＧＣ−３’）（配列番号６）を設計した。このプライマーはＣｙｓ−２５に対応する塩基（ＴＧＴ）のうち、１塩基を置換してＳｅｒに対応する塩基（ＴＣＴ）としたものである。
【００５７】
全長ＡＰＸＢ遺伝子を含むプラスミドｐＥＴ１６ｂＡＰＸＢ（非特許文献２）を鋳型として、５’末端側断片にはプライマーＴ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’）（配列番号７）とリン酸化したプライマーＡＰＸＢ２９Ｒを、３’末端側断片にはプライマーＡＰＸＢ３０とプライマー Ｔ７ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（５’−ＡＣＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＴＡＡＣＴＡＧＣ−３’）（配列番号８）を用いて、一段階目のＰＣＲ反応をおこなった。ＤＮＡポリメラーゼにはＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Strategene）を用いた。反応条件および反応液組成は酵素の推奨プロトコールに従い、サーマルサイクラーとしてＭｉｎｉ Ｃｙｃｌｅｒ（MJ Research）を用いた。
【００５８】
ＰＣＲにより得られた５’末端側断片と３’末端側断片とを精製し、ライゲーションした。ライゲーションは、説明書に従い、Ｔａｋａｒａ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２（タカラバイオ）を用いておこなった。ただし、キットのＩ液を加える前にＤＮＡ溶液を４２℃で３０秒間加熱した。ＰＣＲ産物の精製は特に断りのない限り、説明書に従ってＷｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍを用いておこなった。
【００５９】
ライゲーション産物を鋳型として、プライマーＴ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒとプライマーＴ７ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを用いて二段階目のＰＣＲをおこなった。このＰＣＲ産物を精製し、制限酵素ＮｃｏＩ（東洋紡績）およびＸｈｏＩ（タカラバイオ）で消化して、再び精製した。また、ｐＥＴ１６−ｂベクター（Novagen）もＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで消化し、精製した。
【００６０】
ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで消化したＰＣＲ産物をｐＥＴ１６−ｂのＮｃｏＩ／ＸｈｏＩサイトに挿入した。得られたｐＥＴ１６ｂＡＰＸＢＣ２５Ｓを用いて大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ株を形質転換した。
【００６１】
ＬＢプレートのコロニーから楊枝で取った大腸菌を鋳型として、プライマーＴ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒとプライマーＴ７ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを用いてコロニーＰＣＲをおこなった。ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルで電気泳動し、約１０００ｂｐの目的のＰＣＲ産物を与えるコロニーを検出し、そのＰＣＲ産物を精製した。ＤＮＡポリメラーゼにはＴａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（NEB）を用い、バッファーにはＥｘ Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｂｕｆｆｅｒを用いた。反応条件および反応液組成は酵素の推奨プロトコールに従い、サーマルサイクラーとしてＭｉｎｉ Ｃｙｃｌｅｒを用いた。
【００６２】
精製したＰＣＲ産物を鋳型として、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖｅｒ．３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Applied Biosystems）を用い、説明書に従ってシーケンス反応液を調整した。サンプルインジェクションバッファーＴＳＲ（Template Suppression Reagent,Applied Biosystems）を用いて調整したサンプルを、ＤＮＡシーケンサーであるＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に供して配列を解析した。
【００６３】
３−２．ＡＰＸＢおよびＡＰＸＢＣ２５Ｓの精製
ＡＰＸＢおよびＡＰＸＢＣ２５Ｓを非特許文献３に記載の方法で精製した。詳細には、コンピタントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ：ＢＬ２１（ＤＥ３）株）へのｐＥＴ１６ｂＡＰＸＢ（野生型ＡＰＸＢをコードする）およびｐＥＴ１６ｂＡＰＸＢＣ２５Ｓ（Ｃｙｓ−２５をＳｅｒに置換したＡＰＸＢをコードする）の導入を常法に従って行った。ｐＥＴ１６ｂＡＰＸＢまたはｐＥＴ１６ｂＡＰＸＢＣ２５Ｓを保持する大腸菌を、終濃度５０ｍｇ／Ｌのアンピシリン含むＬＢ培地１Ｌで、振とう培養装置ＩＣ−４３（Simadzu）を用いて１２０ｒｐｍ、３７℃下振とう培養した。培養は、培地の濁度を紫外可視分光光度計ＵＶ−１７００ ＰｈａｒｍａＳｐｅｃ（Shimadzu）で測定した。ＯＤ６００＝０．６となるまで約１２時間培養し、最終濃度０．５ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、和光純薬）と同時に再び終濃度５０ｍｇ／Ｌのアンピシリンを添加した。Ｏ．Ｄ．６００＝１．０を上回るまでさらに５時間培養を続け、集菌した。液体培地を遠心分離（２８００×ｇ、４℃、２０分）して集菌し、バッファーＡ（５０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭアスコルビン酸）で菌体を洗浄後、液体窒素で凍らせて−８０℃で保存した。
【００６４】
保存しておいたＬＢ培地４Ｌ分の大腸菌を、４０ｍＬのバッファーＡに懸濁し、超音波破砕機ＶＰ−１５Ｓ、標準ホーンＨＮＮ−０２００（Taitec）により菌体を破砕した。破砕は出力４、サイクル２０％、５分の条件で２回繰り返し、その後出力５、サイクル２０％、５分の条件で２回繰り返した。この破砕物を遠心分離（１３，０００×ｇ、４℃、３０分）し、その上清に対して硫安沈殿分画をおこなった。方法は「タンパク質実験ノート」（岡田雅人・宮崎香 (1999) Bradford法と硫安分画：無敵のバイオテクニカルシリーズ 改訂 タンパク質実験ノート 上 抽出と分離精製 (羊土社) , pp33-34 , 72-74）に従い、４０％飽和硫安において沈殿せず、８０％飽和硫安において沈殿する画分を、４０％飽和硫安を含むバッファーＢ（１０ｍＭリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭアスコルビン酸）に懸濁した。
【００６５】
硫安沈殿により得られたサンプルをフィルター濾過（ＤＩＳＭＩＣ−２５ＣＳ ０．４５μｍ、Advantec）し、疎水カラム ＨｉＬｏａｄ １６／１０ｍｍ Ｐｈｅｎｙｌｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Pharmacia）に供した。すべてのクロマトグラフィーはＢｉｏＬｏｇｉｃ Ｄｕｏ Ｆｌｏｗ（Bio-Rad）をクロマトグラフィーシステムに用い、４℃で行なった。バッファーＢ＋４０％飽和硫安を用いて４０分間かけて非吸着タンパク質をカラムから溶出し、その後１００分間かけて４０％から０％に硫安の濃度勾配を形成し、溶出した。流速は１．０ｍＬ／分で、フラクション分取量は１．５ｍＬ／チューブとした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＡＰＸを含むフラクションを選択した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは１２．５％ポリアクリルアミドゲルを用いて、常法に従いおこなった。
【００６６】
疎水クロマトグラフィーにより分取したフラクションを、限外濾過Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ ＹＭ−１０（Millipore）により５ｍＬに濃縮し、ゲル濾過カラム Ｈｉｌｏａｄ １６／６０ｍｍ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（Pharmacia）に供した。０．１５Ｍ塩化カリウムを含むバッファーＢで溶出した。流速０．５ｍＬ／分で、フラクション分取量は２．０ｍＬ／チューブとした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＡＰＸＢを含むフラクションを選択した。
【００６７】
ＡＰＸＢおよびＡＰＸＢＣ２５Ｓは、回収したＡＰＸＢ酵素液のＳｏｒｅｔピークが約４になるよう０．１５Ｍ塩化カリウムを含むバッファーＢで希釈し、２００μｌずつサンプルチューブに分注し、液体窒素で凍らせて−８０℃で保存した。精製したＡＰＸＢおよびＡＰＸＢＣ２５Ｓのタンパク質定量は常法により行なった。
【００６８】
以上の操作により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを与える精製標品を得た。
【実施例４】
【００６９】
ＡＰＸＢＣ２５ＳのＫｍ、ｋｃａｔと吸収スペクトル
作製した変異型ＡＰＸＢの変異による触媒活性および構造への影響を非特許文献３に記載の方法に従って得られた酵素化学的パラメーターおよび吸収スペクトルにより検証した。
【００７０】
４−１．ＡＰＸＢＣ２５ＳのＫｍおよびｋｃａｔ
ＡＰＸＢＣ２５Ｓの精製標品をバッファー（５０ ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０、０．５ｍＭアスコルビン酸、０．０１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）で１／１００希釈し、終濃度０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．３、０．４、０．５ｍＭのアスコルビン酸を含む反応液（５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０）に混合し、活性測定をおこなった。１．０ｍＬ反応液に終濃度１００μＭの過酸化水素を添加したときの過酸化水素依存的アスコルビン酸の酸化を測定した（Nakano, Y. et al., Plant Cell Physiol., 22:867-880 (1981)）。測定は２５℃でおこない、２９０ｎｍの吸収（モル吸光係数２．８ｍＭ−１ｃｍ−１）の減少を紫外可視分光光度計ＵＶ−１７００ ＰｈａｒｍａＳｐｅｃで観測することでおこなった。各アスコルビン酸濃度におけるＡＰＸＢＣ２５Ｓの活性よりアスコルビン酸に対するＫｍとｋｃａｔを決定した。
【００７１】
次に、ＡＰＸＢＣ２５Ｓの精製標品をバッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０、０．５ｍＭアスコルビン酸、０．０１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）で１／１００希釈し、それを反応液（５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０、０．５ｍＭアスコルビン酸）に混合し、活性測定をおこなった。１．０ｍＬの反応液に対し終濃度１０、２０、３０、４０、６０、８０、１００μＭの過酸化水素を添加したときの過酸化水素依存的アスコルビン酸の酸化を測定した。各過酸化水素濃度におけるＡＰＸＢＣ２５Ｓの活性より過酸化水素に対するＫｍを決定した。対照として野生型ＡＰＸＢを使用した。結果を表３に示す。
【００７２】
【表３】
【００７３】
過酸化水素に対するＡＰＸＢＣ２５ＳのＫｍはＡＰＸＢの値と比較して同程度となった。また、アスコルビン酸に対するＡＰＸＢＣ２５ＳのＫｍはＡＰＸＢの値と比較して４ないし５倍程度であり、ｋｃａｔは７０％以上であった。この結果より、アスコルビン酸に対する親和性は下がったものの、Ｃｙｓ−２５のＳｅｒへの置換が触媒活性にほとんど影響がないことが示された。
【００７４】
４−２．ＡＰＸＢＣ２５Ｓの吸収スペクトル
窒素ガスにより嫌気化した５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０にバッファー置換した。バッファー置換したＡＰＸについて、未処理の場合、０．５ｍＭシアン化カリウムを添加した場合、少量のジチオナイトを添加した場合、それぞれのスペクトルを測定した。測定には紫外可視分光光度計ＵＶ−１７００ ＰｈａｒｍａＳｐｅｃを用いて２５℃でおこなった。
【００７５】
その結果、未処理、およびシアン化カリウムあるいはジチオナイトを添加した変異型ＡＰＸの吸収スペクトルは、ＡＰＸＢのそれらと極めて類似しており、ＣｙｓのＳｅｒへの置換が触媒部位の構造にほとんど影響がないことが示された。これより、これらの変異型ＡＰＸＢを以下の実験に用いることが可能であると判断した。
【実施例５】
【００７６】
ＴＥＭＰＯ存在下でのＡＰＸＢおよびＡＰＸＢＣ２５Ｓの残存活性
ＴＥＭＰＯ存在下での過酸化水素との反応によりシステイン残基が酸化されることで、ＡＰＸＢの触媒活性はどのような影響を受けるか検証するために、ＡＰＸＢおよびＡＰＸＢＣ２５Ｓの残存活性を測定した。
【００７７】
嫌気５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．０に置換した酵素液１．０ｍＬに、ラジカル捕捉剤である終濃度０．２または０ｍＭのＴＥＭＰＯを添加し、続いて過酸化水素を５モルまたは０モル当量となるように添加した。一定時間ごとに一部をとりだして速やかに反応液（０．５ｍＭアスコルビン酸、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．０１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）に混合し、失活反応を停止させて各時間の活性測定をおこなった。反応液１．０ｍＬに対して終濃度１００μＭの過酸化水素を添加したときの過酸化水素依存的アスコルビン酸の酸化を２５℃で測定して活性を決定した。
【００７８】
結果を図５に示す。図５中、Ａは野生型ＡＰＸＢを過酸化水素のみで処理した場合、Ｂは変異体ＡＰＸＢＣ２５Ｓを過酸化水素のみで処理した場合、ＣはＡＰＸＢをＴＥＭＰＯの存在下で過酸化水素処理した場合、ＤはＡＰＸＢＣ２５ＳをＴＥＭＰＯの存在下で過酸化水素処理した場合を示す。また、□は過酸化水素を含まない対照を示し、◆は過酸化水素を含む場合を示す。
【００７９】
ＴＥＭＰＯ非存在下で過酸化水素処理した場合の残存活性は、ＡＰＸＢおよびＡＰＸＢＣ２５Ｓいずれも未処理時の５０％程度であった。しかし、ＴＥＭＰＯ存在下で過酸化水素処理した場合の残存活性は、ＡＰＸＢはほぼ完全に活性を失ったのに対して、ＡＰＸＢＣ２５Ｓでは残存活性は１０％程度しか低下しなかった。これより、ＴＥＭＰＯと過酸化水素に依存的に２５位のシステイン残基の酸化が促進されたことにより、ＡＰＸＢでは顕著な触媒活性の低下がおこったことが示された。ＡＰＸＢ変異体でＴＥＭＰＯ非存在下よりも存在下のほうが過酸化水素による失活が起こりにくかった理由は、ＴＥＭＰＯがアスコルビン酸の代わりに触媒部位のヘムを還元したためであると推定された。
【実施例６】
【００８０】
本実施例においては、特許文献３に記載されるタバコＡＰＸを基に、配列番号１の２５位に相当する位置のシステインに加えて、配列番号１の３４位に相当する位置のトリプトファン、配列番号１の１２１位に相当する位置のシステインを別のアミノ酸に置換した２重変異体、３重変異体を作製し、これらの変異の酸化耐性に対する効果を検討した。タバコＡＰＸのアミノ酸配列を配列番号９に、それをコードする核酸のヌクレオチド配列を配列番号１０に示す。配列番号１の２５位は配列番号９の２６位に、３４位は３５位に、１２１位は１２６位にそれぞれ相当する。
【００８１】
実施例３および特許文献３に記載の方法と同様の方法により、配列番号９のアミノ酸配列を有する野生型のタバコＡＰＸ（ｔｓＡＰＸ）、配列番号９の２６位のシステインをセリンに置換したｔｓＡＰＸＣ２６Ｓ（配列番号１１）、配列番号９の３５位のトリプトファンをフェニルアラニンに置換したｔｓＡＰＸＷ３５Ｆ（配列番号１２）、配列番号９の１２６位のシステインをアラニンに置換したｔｓＡＰＸＣ１２６Ａ（配列番号１３）、配列番号９の２６位のシステインをセリンに、１２６位のセリンをアラニンにそれぞれ置換したｔｓＡＰＸＣ２６ＳＣ１２６Ａ（２重変異体）（配列番号１４）、配列番号９の２６位のシステインをセリンに、３５位のトリプトファンをフェニルアラニンに、１２６位のセリンをアラニンにそれぞれ置換したｔｓＡＰＸＣ２６ＳＷ３５ＦＣ１２６Ａ（３重変異体）（配列番号１５）を得た。
【００８２】
それぞれの精製酵素標品について吸光係数（εｓｏｒｅｔ）を測定し、実施例４に記載の方法と同様の方法によりアスコルビン酸および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）に対する定常状態キネティックパラメータ（Ｋｍ、ｋｃａｔ）を測定した。アスコルビン酸に対するＫｍ値の決定には種々の濃度のアスコルビン酸（０〜０．５ｍＭ）および固定濃度のＨ２Ｏ２（０．１ｍＭ）を使用し、Ｈ２Ｏ２に対するＫｍ値の決定には種々の濃度のＨ２Ｏ２（０〜０．１ｍＭ）および固定濃度のアスコルビン酸（０．５ｍＭ）を使用した。結果を表４−１および４−２に示す
【００８３】
【表４−１】
【００８４】
【表４−２】
【００８５】
この結果より、各変異体ＡＰＸが野生型ＡＰＸに比べて遜色ない酵素学的性能を有することが示された。
【００８６】
次に、実施例５に記載の方法と同様の方法により、それぞれの酵素標品をＴＥＭＰＯの存在下または非存在下で過酸化水素で処理し、残存活性を測定した。０．２ｍＭ ＴＥＭＰＯ存在下で５モル当量の過酸化水素で処理した結果を図６に、ＴＥＭＰＯ非存在下で２０モル当量の過酸化水素で処理した結果を図７に示す。
【００８７】
ＴＥＭＰＯは過酸化水素によるシステイン残基の酸化損傷を促進する。図６に示すように、ＴＥＭＰＯ存在下で過酸化水素処理すると、２つのシステイン残基をそれぞれ他の残基に変異させた２重変異の場合（ｔｓＡＰＸＣ２６ＳＣ１２６Ａ）、野生型（ｔｓＡＰＸ）よりも高い酸化耐性が示された。またこの２重変異は各システイン残基の単独変異の場合（ｔｓＡＰＸＣ２６Ｓ、ｔｓＡＰＸＣ１２６Ａ）よりも効果的であった。さらに３５位のトリプトファンに変異導入した３重変異の場合（ｔｓＡＰＸＣ２６ＳＷ３５ＦＣ１２６Ａ）、最も高い酸化耐性が示された。
【００８８】
過酸化水素単独で処理すると、ヘムと３５位のトリプトファンの架橋、アポタンパク質間の重合など複合的な酸化損傷が引き起こされる。図７に示すように、過酸化水素単独で処理すると、２つのシステイン残基の単独変異（ｔｓＡＰＸＣ２６Ｓ、ｔｓＡＰＸＣ１２６Ａ）、２重変異（ｔｓＡＰＸＣ２６ＳＣ１２６Ａ）のいずれの場合も野生型（ｔｓＡＰＸ）と同等の酸化耐性しか示さなかった。一方、３５位のトリプトファンにおける変異を導入した場合（ｔｓＡＰＸＷ３５Ｆ）、野生型よりも高い酸化耐性が示され、３重変異の場合（ｔｓＡＰＸＣ２６ＳＷ３５ＦＣ１２６Ａ）さらに高い酸化耐性が示された。
【００８９】
以上の結果より、配列番号１の２５位に相当する位置のシステインの置換と、配列番号１の３４位に相当する位置のトリプトファンの置換、配列番号１の１２１位に相当する位置のシステインの置換を併用することにより酸化耐性がさらに向上することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明により、新規な酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼおよびその製造方法ならびにアスコルビン酸パーオキシダーゼに酸化耐性を付与する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】ＴＥＭＰＯ存在下で過酸化水素処理したＡＰＸＢトリプシン消化物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの結果を示す図である。
【図２】ＴＥＭＰＯ存在下で過酸化水素処理したＡＰＸＢのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの結果を示す図である。
【図３】グルタチオン存在下で過酸化水素処理したＡＰＸＢのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す図である。
【図４】グルタチオン存在下で過酸化水素処理したＡＰＸＢトリプシン消化物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの結果を示す図である。
【図５】ＴＥＭＰＯ存在下での過酸化水素処理によるＡＰＸＢおよびＡＰＸＢＣ２５Ｓの触媒活性への影響を示す図である。
【図６】ＴＥＭＰＯ存在下での過酸化水素処理による各種ＡＰＸの触媒活性への影響を示す図である。
【図７】ＴＥＭＰＯ非存在下での過酸化水素処理による各種ＡＰＸの触媒活性への影響を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００９２】
SEQ ID NO:3: Cys at position 25 of ascorbate peroxidase from G. partita is replaced by Ser
SEQ ID NO:4: g at position 74 of ascorbate peroxidase-encoding sequence from G. partita is replaced by c
SEQ ID NO:5: A primer APXB29R
SEQ ID NO:6: A primer APXB30
SEQ ID NO:7: A primer T7 promoter
SEQ ID NO:8: A primer T7 terminator
SEQ ID NO:11: Cys at position 26 of ascorbate peroxidase from tobacco is replaced by Ser
SEQ ID NO:12: Trp at position 35 of ascorbate peroxidase from tobacco is replaced by Phe
SEQ ID NO:13: Cys at position 126 of ascorbate peroxidase from tobacco is replaced by Ala
SEQ ID NO:14: Cys at position 26 of ascorbate peroxidase from tobacco is replaced by Ser; Cys at position 126 of ascorbate peroxidase from tobacco is replaced by Ala
SEQ ID NO:15: Cys at position 26 of ascorbate peroxidase from tobacco is replaced by Ser; Trp at position 35 of ascorbate peroxidase from tobacco is replaced by Phe; Cys at position 126 of ascorbate peroxidase from tobacco is replaced by Ala
【特許請求の範囲】
【請求項１】
未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列において、少なくとも配列番号１の２５位に相当する位置のアミノ酸がシステインからシステイン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する、酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼ。
【請求項２】
未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼがガルディエリア・パーチタ（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｐａｒｔｉｔａ）またはタバコに由来する、請求項１記載の酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼ。
【請求項３】
配列番号３、１１、１４および１５からなる群より選択されるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有する、請求項１または２記載の酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼ。
【請求項４】
システイン以外のアミノ酸がセリンである、請求項１〜３のいずれか１項記載の酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼ。
【請求項５】
ラジカル捕捉剤の存在下で酸化耐性を示す、請求項１〜４のいずれか１項記載の酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼ。
【請求項６】
さらに、配列番号１の３４位に相当する位置のアミノ酸のトリプトファンからトリプトファン以外のアミノ酸への置換および／または配列番号１の１２１位に相当する位置のアミノ酸のシステインからシステイン以外のアミノ酸への置換を有する、請求項１〜５のいずれか１項記載の酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼ。
【請求項７】
酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼを生産する細胞を培養する工程を包含する、酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼの製造方法であって、酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼが、未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列において、少なくとも配列番号１の２５位に相当する位置のアミノ酸がシステインからシステイン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する、方法。
【請求項８】
未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼがガルディエリア・パーチタ（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｐａｒｔｉｔａ）またはタバコに由来する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼが、配列番号３、１１、１４および１５からなる群より選択されるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有する、請求項７または８記載の方法。
【請求項１０】
システイン以外のアミノ酸がセリンである、請求項７〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼがラジカル捕捉剤の存在下で酸化耐性を示す、請求項７〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼが、さらに、配列番号１の３４位に相当する位置のアミノ酸のトリプトファンからトリプトファン以外のアミノ酸への置換および／または配列番号１の１２１位に相当する位置のアミノ酸のシステインからシステイン以外のアミノ酸への置換を有する、請求項７〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列において、少なくとも配列番号１の２５位に相当する位置のアミノ酸をシステインからシステイン以外のアミノ酸に置換する工程を包含する、アスコルビン酸パーオキシダーゼに酸化耐性を付与する方法。
【請求項１４】
未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼがガルディエリア・パーチタ（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｐａｒｔｉｔａ）またはタバコに由来する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
酸化耐性を付与されたアスコルビン酸パーオキシダーゼが、配列番号３、１１、１４および１５からなる群より選択されるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有する、請求項１３または１４記載の方法。
【請求項１６】
システイン以外のアミノ酸がセリンである、請求項１３〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
ラジカル捕捉剤の存在下での酸化耐性が付与される、請求項１３〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
配列番号１の３４位に相当する位置のアミノ酸をトリプトファンからトリプトファン以外のアミノ酸に置換する工程および／または配列番号１の１２１位に相当する位置のアミノ酸をシステインからシステイン以外のアミノ酸に置換する工程をさらに包含する、請求項１３〜１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１】
未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列において、少なくとも配列番号１の２５位に相当する位置のアミノ酸がシステインからシステイン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する、酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼ。
【請求項２】
未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼがガルディエリア・パーチタ（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｐａｒｔｉｔａ）またはタバコに由来する、請求項１記載の酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼ。
【請求項３】
配列番号３、１１、１４および１５からなる群より選択されるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有する、請求項１または２記載の酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼ。
【請求項４】
システイン以外のアミノ酸がセリンである、請求項１〜３のいずれか１項記載の酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼ。
【請求項５】
ラジカル捕捉剤の存在下で酸化耐性を示す、請求項１〜４のいずれか１項記載の酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼ。
【請求項６】
さらに、配列番号１の３４位に相当する位置のアミノ酸のトリプトファンからトリプトファン以外のアミノ酸への置換および／または配列番号１の１２１位に相当する位置のアミノ酸のシステインからシステイン以外のアミノ酸への置換を有する、請求項１〜５のいずれか１項記載の酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼ。
【請求項７】
酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼを生産する細胞を培養する工程を包含する、酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼの製造方法であって、酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼが、未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列において、少なくとも配列番号１の２５位に相当する位置のアミノ酸がシステインからシステイン以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する、方法。
【請求項８】
未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼがガルディエリア・パーチタ（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｐａｒｔｉｔａ）またはタバコに由来する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼが、配列番号３、１１、１４および１５からなる群より選択されるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有する、請求項７または８記載の方法。
【請求項１０】
システイン以外のアミノ酸がセリンである、請求項７〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼがラジカル捕捉剤の存在下で酸化耐性を示す、請求項７〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
酸化耐性アスコルビン酸パーオキシダーゼが、さらに、配列番号１の３４位に相当する位置のアミノ酸のトリプトファンからトリプトファン以外のアミノ酸への置換および／または配列番号１の１２１位に相当する位置のアミノ酸のシステインからシステイン以外のアミノ酸への置換を有する、請求項７〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼのアミノ酸配列において、少なくとも配列番号１の２５位に相当する位置のアミノ酸をシステインからシステイン以外のアミノ酸に置換する工程を包含する、アスコルビン酸パーオキシダーゼに酸化耐性を付与する方法。
【請求項１４】
未改変アスコルビン酸パーオキシダーゼがガルディエリア・パーチタ（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｐａｒｔｉｔａ）またはタバコに由来する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
酸化耐性を付与されたアスコルビン酸パーオキシダーゼが、配列番号３、１１、１４および１５からなる群より選択されるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスコルビン酸パーオキシダーゼ活性を有する、請求項１３または１４記載の方法。
【請求項１６】
システイン以外のアミノ酸がセリンである、請求項１３〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
ラジカル捕捉剤の存在下での酸化耐性が付与される、請求項１３〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
配列番号１の３４位に相当する位置のアミノ酸をトリプトファンからトリプトファン以外のアミノ酸に置換する工程および／または配列番号１の１２１位に相当する位置のアミノ酸をシステインからシステイン以外のアミノ酸に置換する工程をさらに包含する、請求項１３〜１７のいずれか１項記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００８−２５３２４８（Ｐ２００８−２５３２４８Ａ）
【公開日】平成２０年１０月２３日（２００８．１０．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−９４５５（Ｐ２００８−９４５５）
【出願日】平成２０年１月１８日（２００８．１．１８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００６年９月３０日 日本農芸化学会 関西支部主催の「日本農芸化学会２００６年度（平成１８年度）関西支部大会」に文書をもって発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年２月１９日 国立大学法人 京都工芸繊維大学主催の「平成１８年度 京都工芸繊維大学 繊維学部 応用生物学科」に文書をもって発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００７年２月２１日 国立大学法人 京都工芸繊維大学主催の「平成１８年度 京都工芸繊維大学大学院 工芸科学研究科 応用生物学専攻 修士論文公聴会」に文書をもって発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００７年３月５日 社団法人 日本農芸化学会発行の「日本農芸化学会２００７年度（平成１９年度）大会講演要旨集」に発表
【出願人】（５０４２５５６８５）国立大学法人京都工芸繊維大学 (203)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月２３日（２００８．１０．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月１８日（２００８．１．１８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００６年９月３０日 日本農芸化学会 関西支部主催の「日本農芸化学会２００６年度（平成１８年度）関西支部大会」に文書をもって発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年２月１９日 国立大学法人 京都工芸繊維大学主催の「平成１８年度 京都工芸繊維大学 繊維学部 応用生物学科」に文書をもって発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００７年２月２１日 国立大学法人 京都工芸繊維大学主催の「平成１８年度 京都工芸繊維大学大学院 工芸科学研究科 応用生物学専攻 修士論文公聴会」に文書をもって発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００７年３月５日 社団法人 日本農芸化学会発行の「日本農芸化学会２００７年度（平成１９年度）大会講演要旨集」に発表
【出願人】（５０４２５５６８５）国立大学法人京都工芸繊維大学 (203)
【Ｆターム（参考）】
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