重症細菌感染を処置するためのＴＦＰＩの使用
重症細菌感染を発症するリスクのある患者、または重症細菌感染と診断された患者を予防的または治療的に処置する方法であって、この疾患の罹患患者または発症リスクのある患者に、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）またはＴＦＰＩアナログを投与することを含む。方法は、有害な副作用を回避するため、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの低用量での連続静脈内注入の使用を含む。いくつかの実施形態では、重症細菌感染は、肺炎、菌血症、深部組織感染、皮膚感染、軟部組織感染、歯周炎、腹膜炎、外科感染、または髄膜炎の原因となる。さらなる実施形態では、肺炎は、市中肺炎または院内肺炎であり、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに起因しうる。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
重症細菌感染は、生命にかかわる種を含む、さまざまな合併症につながりうる。重症細菌感染を治療する、および／または重症細菌感染による死亡リスクを低下させる有効な方法が、当技術分野では引き続き必要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
発明の要旨
本発明の１つの実施形態は、重症細菌感染を発症するリスクのある患者、または重症細菌感染と診断された患者を治療する方法であり、この方法は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを、それを必要とする患者に投与することを含む。いくつかの実施形態では、重症細菌感染は、肺炎、菌血症、深部組織感染、皮膚感染、軟部組織感染、歯周炎、腹膜炎、外科感染、または髄膜炎の原因となる。さらなる実施形態では、肺炎は、市中肺炎（ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−ａｃｑｕｉｒｅｄ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または院内肺炎であり、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに起因しうる。
【０００３】
別の実施形態は、重症細菌感染による死亡リスクを低下させる方法であり、この方法は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを含む医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む。いくつかの実施形態では、重症細菌感染は、肺炎、菌血症、深部組織感染、皮膚感染、軟部組織感染、歯周炎、腹膜炎、外科感染、または髄膜炎の原因となる。さらなる実施形態では、肺炎は、市中肺炎または院内肺炎であり、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに起因しうる。
【０００４】
他の実施形態は、前記患者が以下の基準：血中ＩＬ−６レベルが３，２００ｐｇ／ｍｌ未満；国際標準比（ＩＮＲ）が２．５未満；急性生理スコア（ＡＰＳ）が２６未満；Ａｃｕｔｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ａｎｄ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（ＡＰＡＣＨＥ ＩＩ）スコアが３８未満；およびＭＯＤＳスコアが１８を超える、のいずれかを満たす、上記実施形態のいずれかを含む。
【０００５】
他の実施形態は、前記ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、グリコシル化されていない、上記実施形態のいずれかを含む。他の実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約１２％未満が、修飾された種であり、修飾された種には、逆相クロマトグラフィーで検出される、酸化ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子；カチオン交換クロマトグラフィーで検出される、カルバミル化ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子；Ｐｒｏｍｅｇａ ＩＳＯＱＵＡＮＴ（登録商標）キットで検出される、脱アミド化ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子；アミノ酸分析で決定される、システイン付加物を含むＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子；サイズ除外クロマトグラフィーで検出される、凝集したＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子；および非変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で検出される、誤って折り畳まれたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子、の１つまたは複数を含む、上記実施形態を含む。
【０００６】
他の実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約９％未満が酸化されている、上記実施形態を含む。
【０００７】
他の実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約３％未満がカルバミル化されている、上記実施形態を含む。
【０００８】
他の実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約９％未満が脱アミド化されている、上記実施形態を含む。
【０００９】
他の実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約２％未満がシステイン付加物を含む、上記実施形態を含む。
【００１０】
他の実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約３％未満が凝集されている、上記実施形態を含む。
【００１１】
他の実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約３％未満が誤って折り畳まれている、上記実施形態を含む。
【００１２】
他の実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを含む凍結乾燥組成物から調製される、上記実施形態を含む。他の実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、アルギニンを含む製剤として投与される、上記実施形態を含む。他の実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、クエン酸を含む製剤として投与される、上記実施形態を含む。
【００１３】
他の実施形態は、医薬組成物が、０．０１から１．０ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを含む、上記実施形態を含む。他の実施形態は、医薬組成物が、１５０〜４５０ｍＭのＬ−アルギニンを含む、上記実施形態を含む。他の実施形態は、医薬組成物が、０．１〜５０ｍＭのＬ−メチオニンを含む、上記実施形態を含む。他の実施形態は、医薬組成物が、５〜５０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液を含む、上記実施形態を含む他の実施形態は、医薬組成物が、５．０〜６．０のｐＨを有する、上記実施形態を含む。
【００１４】
他の実施形態は、方法が、０．１５±１５％ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、３００±１５％ｍＭのＬ−アルギニン、５±１５％ｍＭのＬ−メチオニン、および２０±１５％ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５±１５％）を含む医薬組成物の使用を含む、上記実施形態を含む。
【００１５】
他の実施形態は、方法が、０．１５±１０％ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、３００±１０％ｍＭのＬ−アルギニン、５±１０％ｍＭのＬ−メチオニン、および２０±１０％ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５±１０％）を含む医薬組成物の使用を含む、上記実施形態を含む。
【００１６】
他の実施形態は、方法が、０．１５±５％ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、３００±５％ｍＭのＬ−アルギニン、５±５％ｍＭのＬ−メチオニン、および２０±５％ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５±５％）を含む医薬組成物の使用を含む、上記実施形態を含む。
【００１７】
他の実施形態は、方法が、０．４５±１５％ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、３００±１５％ｍＭのＬ−アルギニン、５±１５％ｍＭのＬ−メチオニン、および２０±１５％ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５±１５％）を含む医薬組成物の使用を含む、上記実施形態を含む。
【００１８】
他の実施形態は、方法が、０．４５±１０％ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、３００±１０％ｍＭのＬ−アルギニン、５±１０％ｍＭのＬ−メチオニン、および２０±１０％ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５±１０％）を含む医薬組成物の使用を含む、上記実施形態を含む。
【００１９】
他の実施形態は、方法が、０．４５±５％ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、３００±５％ｍＭのＬ−アルギニン、５±５％ｍＭのＬ−メチオニン、および２０±５％ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５±５％）を含む医薬組成物の使用を含む、上記実施形態を含む。
【００２０】
他の実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、参照ａｌａ−ＴＦＰＩを約０．６６ｍｇ／ｋｇ／時間未満の投与速度で投与するのに等しい投与速度で連続静脈内注入により投与される、上記実施形態を含む。
【００２１】
他の実施形態は、投与速度が、参照ａｌａ−ＴＦＰＩを投与速度約０．０００２５から約０．１ｍｇ／ｋｇ／時間で投与するのに等しく、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、少なくとも約７２時間投与される、上記実施形態を含む。他の実施形態は、投与速度が、参照ａｌａ−ＴＦＰＩを投与速度約０．０１０から約０．１ｍｇ／ｋｇ／時間で投与するのに等しい、上記実施形態を含む。他の実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、少なくとも約９６時間投与される、上記実施形態を含む。
【００２２】
他の実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、参照ａｌａ−ＴＦＰＩを合計用量約０．０２４から約４．８ｍｇ／ｋｇで投与するのに等しい合計用量を提供する連続静脈内注入により投与される、上記実施形態を含む。他の実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、参照ａｌａ−ＴＦＰＩを投与速度約０．０２から約１ｍｇ／ｋｇ／時間で投与するのに等しい投与速度で連続静脈内注入により投与される、上記実施形態を含む。他の実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、参照ａｌａ−ＴＦＰＩを日用量約０．００６ｍｇ／ｋｇから約１．２ｍｇ／ｋｇで投与するのに等しい日用量を提供する連続静脈内注入により投与される、上記実施形態を含む。
【００２３】
他の実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、１０〜２００時間、１０〜１５０時間、または２４〜９６時間の間、注入により投与される、上記実施形態を含む。
【００２４】
他の実施形態は、患者が、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ投与前の少なくとも８時間はヘパリン治療を受けていない、上記実施形態を含む。
【００２５】
他の実施形態は、活性化タンパク質Ｃで患者を治療することをさらに含む、上記実施形態を含む。
【００２６】
他の実施形態は、ＴＦＰＩアナログが、ａｌａ−ＴＦＰＩである、上記実施形態を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
詳細な説明
ＴＦＰＩは、抗炎症活性を有すると考えられる強力な抗凝固剤である。ＥＰ０６４３５８５を参照のこと。ＴＦＰＩは、例えば、腫瘍に関連した血管新生を阻害するのに使用することができる。ＥＰ０９１４８３０を参照のこと。本発明者らは、ＴＦＰＩが、先天性免疫系を制御する炎症性サイトカインの制御を介した抗菌活性も有することを見出した。本発明者らは、ＴＦＰＩは、重症細菌感染の結果、分解されると思われること、感染の進行中にＴＦＰＩが減少することが、この系を損なうことも見出した。したがって、ＴＦＰＩは、感染との闘いにおいて重要な役割を果たす一方、内因性ＴＦＰＩは、重症感染の間に変化し、ＴＦＰＩの治療機能を減少させる。
【００２８】
いくつかの要因は、敗血症患者群における死亡率を予測する。これらには、Ａｃｕｔｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ａｎｄ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（ＡＰＡＣＨＥ ＩＩ）スコアリングシステム（Ｋｎａｕｓら、Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１９８５年；１３：８１８〜２９頁）、急性生理スコア（ａｃｕｔｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｓｃｏｒｅ）（ＡＰＳ）、国際標準比（ＩＮＲ）（Ｒ．Ｓ．Ｒｉｌｅｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．１４：１０１〜１１４頁、２０００年）、および血漿ＩＬ−６濃度が含まれる。市中肺炎（ＣＡＰ）を伴う患者集団では、本発明者らは以前に、ＴＦＰＩが死亡率を減少させるうえで有効であることを観察した。相対リスク減少率は、（１００×絶対リスク減少率）／プラセボ死亡率で決定される。ＡＰＡＣＨＥ ＩＩスコア（図２０）、急性生理スコア、ＩＮＲ、（図２２）または血漿ＩＬ−６レベル、（図２１）を用いて、ＣＡＰ患者を重症度別に分類した場合、本発明者らは、ＴＦＰＩ治療からの恩恵には、プラセボ死亡率が最も低い患者が含まれることを見出した。例えば、ＡＰＡＣＨＥ ＩＩスコアで分類したＣＡＰサブセットでは、ＡＰＡＣＨＥ ＩＩスコア１６で５％の死亡リスクの減少があった。これは３２％の相対リスク減少率を意味する。図２０は、平均ＡＰＡＣＨＥ ＩＩスコアが３６以下の患者で死亡リスクが減少することを示している。ベースラインのＴＦＰＩ血清濃度は、死亡率および有効性の双方を予測するものであった。
【００２９】
ＩＮＲレベルが１．２未満である下位試験の患者は、高ＩＮＲの一次試験（全体で１８％ｖｓ．３４％）の患者より死亡リスクが低く、ａｌａ−ＴＦＰＩは、ＩＮＲレベルが１．２未満である下位試験において有効であった（図２５）。ＩＮＲレベルが平均２．１未満の患者のＣＡＰサブセットは、ａｌａ−ＴＦＰＩの効果が得られた（図２１）。これは、ヘパリン治療をせずａｌａ−ＴＦＰＩで治療した患者についても当てはまる。
【００３０】
図２０は、全体および市中肺炎（ＣＡＰ）プラセボ群におけるＡＰＡＣＨＥ ＩＩと死亡率との予測相関を示している（図２０）。ＡＰＡＣＨＥ ＩＩの四分位にＣＡＰコホートを当てはめた場合、本発明者らは、全てのＡＰＡＣＨＥ ＩＩ四分位で有効性が認められることに気づいた。同様に、ＡＰＳ、ＩＮＲおよびＩＬ−６は全て、死亡率との間に正の相関が認められた。これらのパラメータで測定した場合、全てのケースでａｌａ−ＴＦＰＩは、リスクが最も低い群の生存を改善した（図２１、２２、２３）。ＴＦＰＩは、血液からの細菌培養が陽性である患者において有効である（図２４）。この場合もＴＦＰＩは、患者をＡＰＡＣＨＥスコアで分けた場合の下位４分の３で幅広く有効であった。
【００３１】
故に、外因性ＴＦＰＩによる治療は、重症細菌感染を発症するリスクのある患者、または重症細菌感染と診断された患者に対し治療的有用性があり、こうした感染による死亡リスクを減少させるのに有用である。重症細菌感染は、一般に緊急医療、特に入院を必要とする感染である。いくつかの細菌感染は、一般に、抗感染治療および支持医療または積極的な医学的介入を必要とする。一般的な重症細菌感染には、肺炎（院内肺炎ならびに市中肺炎を含む）、菌血症、深部組織感染、皮膚感染、軟部組織感染、歯周炎、腹膜炎、外科感染、および髄膜炎が含まれるが、これらに限定されない。
【００３２】
本発明により治療されうる患者は、以下の基準の１つまたは複数を満たす：（ａ）血中ＩＬ−６レベルが３，２００ｐｇ／ｍｌ未満（例えば、ＩＬ−６レベルが３，０００、２，５００、２，０００、１，５００、１，０００、５００、２５０、１００または１０）；（ｂ）国際標準比（ＩＮＲ）が２．５未満（例えば、ＩＮＲが２．４、２．３、２．２、２．１、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、または１．１）；（ｃ）急性生理スコア（ＡＰＳ）が２６未満（例えば、ＡＰＳスコアが２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、もしくは１６、または１６〜１９の間、または２０〜２３の間）；（ｄ）Ａｃｕｔｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ａｎｄ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（ＡＰＡＣＨＥ ＩＩ）スコアが３８未満（例えば、ＡＰＡＣＨＥ ＩＩスコアが３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、または１６）；および（ｅ）多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）スコアが１８を超える（例えば、ＭＯＤＳスコアが１９、２０、２１、２２、２３、もしくは２４、または２０〜２１の間、または２２〜２３の間）。
【００３３】
１つの実施形態では、患者は、血中ＩＬ−６レベルが３，２００ｐｇ／ｍｌ未満である。別の実施形態では、患者は、国際標準比（ＩＮＲ）が２．５未満である。さらに別の実施形態では、患者は、急性生理スコア（ＡＰＳ）が２６未満である。さらに別の実施形態では、患者は、Ａｃｕｔｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ａｎｄ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（ＡＰＡＣＨＥ ＩＩ）スコアが３８未満である。さらに別の実施形態では、患者は、ＭＯＤＳスコアが１８を超えている。
ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログ
ＴＦＰＩは、まず、天然由来の抗凝固剤として単離された。タンパク質は、いくつかの主要なドメイン（図１）：Ｋｕｎｉｔｚ型（Ｋ１、Ｋ２およびＫ３）、Ｎ末端ドメイン、およびＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）の３つのセリンプロテアーゼインヒビタードメインを有する。Ｋ１ドメインは、凝固因子ＶＩＩａ−組織因子（ＴＦ）複合体を阻害する。Ｋ２ドメインは、因子Ｘａを阻害する。これまで、セリンプロテアーゼは、Ｋ３との関連が認められていなかったが、近年の実験は、ＴＦＰＩが細胞表面のＧＰＩアンカー型受容体と結合するうえで、Ｋ３が機能することを示唆している。Ｐｉｒｏ ＆ Ｂｒｏｎｚｅ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００４年１２月７日；１１０（２３）：３５６７〜７２頁。ＣＴＤは、細胞結合、ヘパリン結合、およびＸａ至適阻害にも関与している。
【００３４】
ＴＦＰＩは、天然には、血液および他の組織中の複数の細胞型で産生される。ほとんどのＴＦＰＩは、血管内皮細胞でつくられると考えられている。ＴＦＰＩの一部は、血液中に見出される。この血漿ＴＦＰＩのほとんどは、他の血漿タンパク質とのジスルフィド交換、またはＣＴＤを除去する切断により、共有結合的に修飾される。ＴＦＰＩのこれらの形態は、生化学的アッセイでの活性が低く、細胞を効率よく結合させない。これは、血漿ＴＦＰＩが不活性であることを示唆する。これと一致するように、複数の試験が、血漿ＴＦＰＩの半減期はきわめて短いこと、血漿ＴＦＰＩは肝臓で効率よく除去されることを明らかにした。
【００３５】
ＴＦＰＩのさまざまな細胞関連型は、インビトロで最大活性を有する完全長の単量体タンパク質である。内皮細胞には、ヘパリンによる治療で除去されうるわずかなＴＦＰＩの小画分がある。別のプールは、表層側の下の小胞に存在すると思われ、細胞がトロンビンにより刺激された場合に放出される。細胞表面ＴＦＰＩの大半は、他の系のシグナル伝達に関連した細胞小器官であるカベオラで見出される。Ｌｕｐｕら、ＪＢＣ Ｐａｐｅｒｓ ｉｎ Ｐｒｅｓｓ、２００５年４月６日、Ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ Ｍ５０３３３３２００として発表。カベオラのＴＦＰＩは、内皮細胞のＴＦに関与するＴＦＰＩであると思われる。内皮細胞が細菌に曝露されると、内皮細胞はこの表面全体にＴＦを誘導する。ＴＦは、Ｘａを生じるＶＩＩａと結合する。ＴＦ：ＶＩＩａは、急速にカベオラへ移動し、ここでＴＦＰＩと結合する。通常の内皮細胞では、ＴＦＰＩが過剰となり、ＴＦ発現内皮細胞は、病的レベルの凝固酵素を誘導しないようにする。興味深いことに、ＴＦはカベオラへ移行すると安定する。このことは、ＴＦには、ＴＦＰＩにより中和された後に果たす役割があることを示唆する。
【００３６】
本明細書で使用される「ＴＦＰＩ」とは、配列番号１に示された２７６アミノ酸残基配列および分子量約３８，０００ダルトンを有する、成熟した血清糖タンパク質を言う。米国特許第５，１０６，８３３号を参照のこと。ＴＦＰＩ ｃＤＮＡのクローニングは、Ｗｕｎら、米国特許第４，９６６，８５２号に記載されている。本発明で使用されるＴＦＰＩは、グリコシル化されていないまたはグリコシル化されたものであってよい。
【００３７】
「ＴＦＰＩアナログ」は、修飾がＴＦＰＩ生物学的活性を破壊しない限り、１つまたは複数のアミノ酸の付加もしくは置換（一般に性質が保存され、好ましくは非Ｋｕｎｉｔｚドメインまたはタンパク質のＣ末端部分で保存される）、１つまたは複数のアミノ酸欠失（例えば、ＴＦＰＩフラグメント）、または１つまたは複数の化学的部分の、１つまたは複数のアミノ酸への付加により修飾されたＴＦＰＩ誘導体である。好ましくは、ＴＦＰＩアナログは、３つのＫｕｎｉｔｚドメイン全てを含む。ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログは、グリコシル化型または非グリコシル化型のいずれかでありうる。
【００３８】
好ましいＴＦＰＩアナログは、アミノ酸配列が配列番号２に示された、Ｎ−Ｌ−アラニル−ＴＦＰＩ（ａｌａ−ＴＦＰＩ）である。ａｌａ−ＴＦＰＩは、国際薬品名「チファコギン」（ｔｉｆａｃｏｇｉｎ）としても知られている。ａｌａ−ＴＦＰＩのアミノ末端アラニン残基は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現を改善し、切断しなければアミノ末端メチオニン残基となるものを切断させるＴＦＰＩ配列へ、遺伝子操作された。米国特許第５，２１２，０９１号を参照のこと。ＴＦＰＩの他のアナログは、米国特許第５，１０６，８３３号に記載されている。ＴＦＰＩアナログは、以下に記載された生物学的活性アッセイにより判定される、ＴＦＰＩ活性のいくつかの指標を保有している。ＴＦＰＩおよびアナログの好ましい生物学的活性アッセイは、プロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイである（以下参照）。
【００３９】
ＴＦＰＩアナログは、性質が保存されるアミノ酸置換、すなわち、これらの側鎖に関連するアミノ酸ファミリー内で生じる置換を有することができる。具体的には、アミノ酸は、一般に以下の４つのファミリーに分類される：（１）酸性−−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性−−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；ならびに（４）非荷電性極性−−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、およびチロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、芳香族アミノ酸として分類される場合もある。例えば、ロイシンのイソロイシンもしくはバリンによる単一置換、アスパラギン酸のグルタミン酸による単一置換、スレオニンのセリンによる単一置換、または１つのアミノ酸の構造的に関連した１つのアミノ酸による同様の保存的置換は、生物学的活性に対し重大な影響を与えないことは、当然予測可能である。例えば、分子の所望の機能がインタクトなままである限り、目的とするポリペプチドには、約１〜１５までの保存的または非保存的アミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５）が含まれてよい。好ましいＴＦＰＩ形態には、Ｋｕｎｉｔｚ１、Ｋｕｎｉｔｚ２、Ｋｕｎｉｔｚ３ドメインが、天然ヒトＴＦＰＩ Ｋｕｎｉｔｚドメインとまさに一致する、より好ましくは、各Ｋｕｎｉｔｚドメインが、天然ヒトＴＦＰＩ Ｋｕｎｉｔｚドメインの各々とまさに一致するＴＦＰＩアナログが含まれる。
【００４０】
好ましくは、ＴＦＰＩアナログは、配列番号１に示されたＴＦＰＩと少なくとも９５％以上同一であるアミノ酸配列を有する。より好ましくは、分子は、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。
【００４１】
ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログの生物学的活性は、プロトロンビンアッセイで決定されうる。適切なプロトロンビンアッセイは、米国特許第５，８８８，９６８号およびＷＯ９６／４０７８４に記載されている。簡単には、プロトロンビン時間は、血液凝固測定装置（例えば、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ製のＣｏａｇ−Ａ−Ｍａｔｅ ＭＴＸ ＩＩ）を用いて決定されうる。適切なアッセイ緩衝液は、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含有する、ｐＨ７．５に調整された、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓである。必要とされるさらなる試薬は、正常ヒト血漿（例えば、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａによる「Ｖｅｒｉｆｙ １」）、トロンボプラスチン試薬（例えば、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａによる「Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ Ｅｘｃｅｌ」）、およびＴＦＰＩ標準液（例えば、アッセイ緩衝液１ｍｌあたり、１００％純粋ａｌａ−ＴＦＰＩ（またはこの等価物）２０μｇ）である。標準曲線は、ＴＦＰＩ標準溶液の一連の（例えば、１から５μｇ／ｍｌの範囲の最終濃度への）希釈物の凝固時間を分析して得られる。
【００４２】
凝固時間を決定するため、試料またはＴＦＰＩ標準物質が、まずアッセイ緩衝液で希釈される。次いで、正常ヒト血漿が添加される。凝固反応は、トロンボプラスチン試薬の添加により開始される。次いで、機器が凝固時間を記録する。直線のＴＦＰＩ標準曲線は、凝固時間の対数ｖｓ．ＴＦＰＩ濃度の対数のプロットから得られる。標準曲線は、１００％純粋な標準物質と同等なＴＦＰＩ濃度と一致するように、ＴＦＰＩ標準の純度を基に調整される。例えば、標準物質が、生化学的に９７％純粋な（すなわち、ＴＦＰＩの生物学的活性を伴わない分子種を３重量％含有する）ａｌａ−ＴＦＰＩ製剤である場合、標準物質の各希釈物濃度に０．９７を乗じてＴＦＰＩの実際の濃度が得られる。故に、９７％純粋な製剤１ｍｌあたりの実際の重量に対して１．０μｇ／ｍｌであるＴＦＰＩ標準物質は、１．０×０．９７、すなわち０．９７μｇ／ｍｌの濃度と等しくなり、この濃度で処理される。
ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログの入手
本発明の方法において使用されるＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログは、細胞もしくは組織から単離および精製、化学的に合成、または原核生物細胞もしくは真核生物細胞のいずれかにおいて組換え生成することができる。
【００４３】
ＴＦＰＩは、いくつかの方法により単離されうる。例えば、ＴＦＰＩを分泌する細胞には、老化内皮細胞、約３〜４日間ＴＮＦで処理された幼若内皮細胞、肝細胞、および肝細胞癌細胞が含まれる。ＴＦＰＩは、Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、１９９０年、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５、１６７８６〜９３頁、Ｎｏｖｏｔｎｙら、１９８９年、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４、１８８３２〜３７頁、Ｎｏｖｏｔｎｙら、１９９１年、Ｂｌｏｏｄ ７８、３９４〜４００頁、Ｗｕｎら、１９９０年、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５、１６０９６〜１０１頁、およびＢｒｏｚｅら、１９８７年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４、１８８６〜９０頁のクロマトグラフィー法を含む、従来の方法により精製されうる。ＴＦＰＩは、血流中に現れ、血液から精製されうる。Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、１９９０年を参照のこと。
【００４４】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ変異体は、固相法を用いる直接ペプチド合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５、２１４９〜２１５４頁、１９６３年；Ｒｏｂｅｒｇｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９、２０２〜２０４頁、１９９５年）など、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ変異体のアミノ酸配列を合成するための化学的方法により生成されうる。タンパク質合成は、手動法または自動化により実施されうる。自動化合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）により実現されうる。場合により、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ変異体のフラグメントは、完全長の分子を生成するための化学的方法により別個に合成、結合されうる。
【００４５】
ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログは、米国特許第４，９６６，８５２号に示されているように組換え的に生成されうる。例えば、所望されるタンパク質のためのｃＤＮＡは、原核生物または真核生物における発現のためプラスミドに組込まれうる。米国特許第４，８４７，２０１号は、特定のＤＮＡ配列による微生物の形質転換、およびこれらの発現について詳細を提供している。微生物を用いたタンパク質の発現について詳細を提供する、当業者に公知の他の参考文献が多数存在する。Ｍａｎｉａｔａｓら、１９８２年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓなど、これらの多くは、米国特許第４，８４７，２０１号に引用されている。
【００４６】
微生物を形質転換し、これらを使用してＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログを発現するための、さまざまな方法が利用可能である。以下は、可能なアプローチの単なる例である。ＴＦＰＩ ＤＮＡ配列は、単離され、適切な制御配列に結合されなければならない。ＴＦＰＩ ＤＮＡ配列は、米国特許第４，９６６，８５２号に示されており、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍなどの企業から市販されているｐＵＮＣ１３またはｐＢＲ３８２２といったプラスミドに組込まれうる。ＴＦＰＩ ＤＮＡはベクターにひとたび挿入されると、適切な宿主の中にクローン化されうる。ＤＮＡは、Ｍｕｌｌｉｓに対する米国特許第４，６８３，２０２号およびＭｕｌｌｉｓらに対する米国特許第４，６８３，１９５号に示されているものなどの方法により増幅されうる。ＴＦＰＩ ｃＤＮＡは、肝細胞癌細胞（ＨｅｐＧ２およびＳＫＨｅｐなど）のような細胞を誘導してＴＦＰＩ ｍＲＮＡを作製し、次いでｍＲＮＡを同定および単離し、これを逆転写してＴＦＰＩに対するｃＤＮＡを得ることで得られうる。発現ベクターが、Ｅ．ｃｏｌｉなどの宿主の中に形質転換された後、この細菌は発酵され、タンパク質が発現されうる。細菌は、好ましい原核微生物であり、Ｅ．ｃｏｌｉは、特に好ましい。本発明で有用な好ましい微生物は、Ｂｕｄａｐｅｓｔ条約の規定の下、１９８４年２月１４日にＡＴＣＣに寄託された、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２、ＭＭ２９４株（アクセッション番号３９６０７）である。
【００４７】
当然のことながら、多細胞生物由来の真核生物宿主細胞培養物においてポリペプチドをコードする遺伝子を発現することも可能である。例えば、Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ、１９７３年、ＣｒｕｚおよびＰａｔｔｅｒｓｏｎ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。有用な哺乳類細胞系には、マウス骨髄腫Ｎ５１、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ，Ｃ１２７、Ｈｅｐ Ｇ２、およびＳＫ Ｈｅｐが含まれる。ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログは、バキュロウイルス感染昆虫細胞においても発現されうる（上記に対する参照として、米国特許第４，８４７，２０１号も参照のこと）。Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、１９９０年、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６５：１６７８６〜１６７９３頁も参照のこと。真核生物細胞に対する発現ベクターには、通常、哺乳類細胞に適合するプロモーターおよび制御配列（例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来の、一般に使用される初期プロモーターおよび後期プロモーター（Ｆｉｅｒｓら、１９７８年、Ｎａｔｕｒｅ、２７３：１１３頁）など）、または他のウイルスプロモーター（ポリオーマ、アデノウイルス２、ウシパピローマウイルス、またはトリ肉腫ウイルス由来のものなど）、または免疫グロブリンプロモーターおよび熱ショックプロモーターが含まれる。
【００４８】
哺乳類細胞宿主系の形質転換の一般的側面は、Ａｘｅｌ、米国特許第４，３９９，２１６号により記載されている。今では、「エンハンサー」領域が、発現を最適化するうえで重要であるようにも思われる。これらは、一般に、プロモーター領域の上流に見出される配列である。複製起点は、必要な場合、ウイルス源から得られうる。しかし、染色体への組み込みは、真核生物におけるＤＮＡ複製の共通の機構である。植物細胞も今では宿主として利用可能であり、ノパリンシンターゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列など（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ，Ａら、１９８２年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．、１：５６１頁）などの、植物細胞と適合する制御配列が入手可能である。植物細胞の形質転換のための方法およびベクターは、ＷＯ８５／０４８９９に開示されている。
【００４９】
哺乳類細胞で発現されるＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログの精製に使用されうる方法には、ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＭｏｎｏＱ、ＭｏｎｏＳ、および逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーの連続適用が含まれる。Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、上記参照；Ｎｏｖｏｔｎｙら、１９８９年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１８８３２〜１８８３７頁；Ｎｏｖｏｔｎｙら、１９９１年、Ｂｌｏｏｄ、７８：３９４〜４００頁；Ｗｕｎら、１９９０年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１６０９６〜１６１０１頁；Ｂｒｏｚｅら、１９８７年、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、８４：１８８６〜１８９０頁；米国特許第５，１０６，８３３号；および米国特許第５，４６６，７８３号を参照のこと。これらの参考文献は、哺乳類により産生されたＴＦＰＩを精製するさまざまな方法を記載している。
【００５０】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子を調製する好ましい方法は、ＷＯ０５／０１９２６５に開示されている。この方法は、製剤の約１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、または０．５％未満が、「修飾された種」からなる、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子製剤を生成する。「修飾された種」には、以下の１つまたは複数が含まれる：逆相クロマトグラフィーにより検出される、酸化ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子；カチオン交換クロマトグラフィーで検出される、カルバミル化ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子；Ｐｒｏｍｅｇａ ＩＳＯＱＵＡＮＴ（登録商標）キットで検出される、脱アミド化ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子；アミノ酸分析で決定される、システイン付加物を含むＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子；サイズ除外クロマトグラフィーで検出される、凝集したＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子；および非変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で検出される、誤って折り畳まれたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子。ＷＯ０５／０１９２６５に開示された方法を用いて、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約９％未満が酸化され、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約３％未満がカルバミル化され、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約９％未満が脱アミド化され、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約２％未満がシステイン付加物を含み、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約３％未満が凝集され、およびＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約３％未満が誤って折り畳まれる、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子製剤は生成されうる。
【００５１】
ＴＦＰＩはまた、マウスＣ１２７細胞（Ｄａｙら、Ｂｌｏｏｄ ７６、１５３８〜４５頁、１９９０年）、ベビーハムスター腎細胞（Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、１９９０年）、チャイニーズハムスター卵巣細胞、およびヒトＳＫ肝癌細胞など、哺乳類細胞宿主を用いて組換えグリコシル化タンパク質として発現されうる。Ｃ１２７ ＴＦＰＩは、動物試験で使用され、ウサギにおける組織因子誘導性血管内凝固の阻害（Ｄａｙら（上記参照））、イヌにおける血栓溶解後の動脈再閉塞の予防（Ｈａｓｋｅｌら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８４：８２１〜８２７頁（１９９１年））、およびヒヒにおけるＥ．ｃｏｌｉ敗血症モデルでの死亡率減少（Ｃｒｅａｓｅｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２８５０頁（１９９３年））において有効であることが示された。ａｌａ−ＴＦＰＩは、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞により、組換え非グリコシル化タンパク質として発現されうる。Ｅ．ｃｏｌｉで産生される組換えタンパク質のインビトロでの再折り畳みにより、高活性なａｌａ−ＴＦＰＩを産生する方法が記載されている。ＷＯ９６／４０７８４を参照のこと。
【００５２】
ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログはまた、細菌または酵母において産生され、続いて精製されうる。一般に、米国特許第５，２１２，０９１号；第６，０６３，７６４号；および第６，１０３，５００号またはＷＯ９６／４０７８４に示された手順が使用されうる。ａｌａ−ＴＦＰＩおよび他のＴＦＰＩアナログは、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ９６／４０７８４およびＧｕｓｔａｆｓｏｎら、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｐｕｒ．５：２３３頁（１９９４年）に従って、精製され、可溶化され、再折り畳みされうる。例えば、ＷＯ９６／４０７８４の実施例９に従って調製される場合、成熟した、適切に折り畳まれた、生物学的に活性なａｌａ−ＴＦＰＩとして、総タンパク質の約８５重量％から９０重量％を含有し、この約１０％から１５％が、１つまたは複数の酸化メチオニン残基を有するａｌａ−ＴＦＰＩ製剤が得られうる。これらの酸化型は、プロトロンビンアッセイにより決定される、非誘導化ａｌａ−ＴＦＰＩの生物学的活性と同等の生物学的活性を有し、本明細書に開示された本発明において活性であることが予測される。残留物質は、二量体化型、凝集化型、およびアセチル化型を含め、ａｌａ−ＴＦＰＩのさまざまな修飾型を含む。
【００５３】
ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログは、かなりの数のシステイン残基を有することができ、米国特許第４，９２９，７００号に示された手順は、ＴＦＰＩ再折り畳みに関する。ＴＦＰＩおよびアナログは、上述されたものなど、さまざまなクロマトグラフィー法により緩衝溶液から精製されうる。所望の場合、米国特許第４，９２９，７００号に示された方法が使用されうる。ヒトへの投与に適した精製度および活性レベルをもたらすＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログを精製する、いずれかの方法が使用されうる。
治療方法および組成物
ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログは、重症細菌感染を発症するリスクのある患者、もしくは重症細菌感染と診断された患者を治療する、または１人の患者もしくは１つの患者群における重症細菌感染からの死亡リスクを減少させるのに有用である。
【００５４】
重症細菌感染には、例えば、米国胸部学会により示されたガイドラインに従って定義された「重症肺炎」が含まれる。具体的には、重症肺炎は、肺炎の診断および、ａ）２つの主要な基準のうち１つ、ｂ）３つの小基準のうち２つ、またはｃ）英国胸部学会の４つの基準のうち２つ（Ｔｈｏｒａｘ ２００１年；５６［補遺ＩＶ］：１〜６４頁）のいずれかの存在を必要とする。主要な基準は、１）機械換気の必要性および２）敗血症性ショックまたは＞４時間の昇圧の必要性である。小基準は、１）収縮期血圧≦９０ｍｍＨｇ、２）多葉性肺炎、および３）低酸素血症基準（ＰａＯ２／ＦｉＯ２）＜２５０である。英国胸部学会の基準は、１）呼吸数≧３０回／分、２）拡張期血圧≦６０ｍｍＨｇ、３）血中尿素窒素（ＢＵＮ）＞７．０ｍＭ（＞１９．６ｍｇ／ｄＬ）、および４）錯乱である。当技術分野において理解されるように、低酸素血症基準（ＰａＯ２／ＦｉＯ２）とは、吸入酸素画分に対する動脈酸素の分圧を言い、ガス交換の障害のレベルを示す。
【００５５】
重症肺炎患者は、当技術分野で公知のいずれかの手段により実証可能な感染を有する。これらの方法には、例えば、ＧＲＡＭ染色、培養、組織化学染色、免疫化学アッセイ、または核酸アッセイによる、血液または他の通常滅菌した体液もしくは組織の培養物中の病原体の検出が含まれるが、これらに限定されない。実証可能な感染はまた、全身性抗感染療法の根拠となる肺炎の診断、およびいずれかの感染の臨床症状（呼吸数≧３０回／分またはＰａＣＯ２／ＦｉＯ２＜２５０、血圧の低下、および体温の上昇を含むが、これらに限定されない）と一致する胸部Ｘ線写真によっても照明されうる。
ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログの製剤
ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログの製剤は、好ましくは静脈内注入により投与される。基本的に連続静脈内注入が好ましい。この投与を実現するための方法は、当技術分野の当業者に公知である。注入は、中心系または末梢系を介して実施されうる。投与速度の大きな変動は避けられるべきであるが、本発明の投与速度からの短期的な偏差は、許容されうる。ただし、その結果得られる、投与されたＴＦＰＩの血漿レベルは、本発明の好ましい実施形態による一定の投与速度での連続注入から予測されるレベルの２０％以内とする。
【００５６】
患者へ投与する前に、製剤化剤は、ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログに添加されうる。液体製剤が好ましい。ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログは、さまざまな製剤化剤を用いて、さまざまな濃度で、ならびにＴＦＰＩタンパク質の投与経路、溶解度、および安定性に適合する生理学的に適切な任意のｐＨで調製されうる。静脈内注入のための好ましい製剤には、最大約０．６ｍｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩ、最大３００ｍＭの塩酸アルギニン、およびｐＨ５．０〜６．０のクエン酸ナトリウム緩衝液が含まれる。アルギニン、ＮａＣｌ、スクロース、およびマンニトールなどの特定の溶質は、ａｌａ−ＴＦＰＩを可溶化、および／または安定化するのに役立つ。ＷＯ９６／４０７８４を参照のこと。
【００５７】
薬学的製剤には、例えば、０．０１から１．０ｍｇ／ｍｌ、０．０１から０．８ｍｇ／ｍｌ、０．０１から０．５ｍｇ／ｍｌ、０．０１から０．３ｍｇ／ｍｌ、０．０１から０．２ｍｇ／ｍｌ、または０．０１から０．１ｍｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩ；１５０〜４５０ｍＭ、１５０〜４００ｍＭ、１５０〜３５０ｍＭ、または１５０〜３００ｍＭのＬ−アルギニン；０．１〜５０ｍＭ、０．１〜４０ｍＭ、０．１〜３０ｍＭ、０．１〜２５ｍＭ、０．１〜１５ｍＭ、０．１〜１０ｍＭ、または０．１〜５ｍＭのＬ−メチオニン；５〜５０ｍＭ、５〜４５ｍＭ、５〜４０ｍＭ、５〜３５ｍＭ、５〜３０ｍＭ、５〜２５ｍＭ、または５〜２０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液が含まれうる。製剤のｐＨは、５．０〜６、５．０〜５．８、５．０〜５．７、５．０〜５．６、または５．０〜５．５の範囲でありうる。好ましい薬学的製剤には、３００ｍＭ（±１５、１０、または５％）のＬ−アルギニン、５ｍＭ（±１５、１０、または５％）のＬ−メチオニン、２０ｍＭ（±１５、１０、または５％）のクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５（±１５、１０、または５％）、オスモル濃度５６０＋／−１１０ｍＯｓｍ／ｋｇ（±１５、１０、または５％））中の、０．１５ｍｇ／ｍｌ（±１５、１０、または５％）または０．４５ｍｇ／ｍｌ（±１５、１０、または５％）の組換えａｌａ−ＴＦＰＩが含まれる。
【００５８】
静脈内注入のための特に好ましい製剤は、約０．１５ｍｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩ、３００ｍＭの塩酸アルギニン、および２０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を含有する。ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログはまた、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび２０ｍＭのリン酸ナトリウムまたは別の緩衝液（ｐＨ５．５〜７．２）中で、場合によっては０．００５％または０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）と共に、最大約０．１５ｍｇ／ｍｌの濃度でも調製されうる。他の製剤は、１５０ｍＭのＮａＣｌ、８％（ｗ／ｖ）スクロース、または４．５％（ｗ／ｖ）マンニトールのいずれかを含有する、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）中に、最大約０．５ｍｇ／ｍｌＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを含有する。ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログはまた、高塩を用いて、最大数ｍｇ／ｍｌのより高い濃度でも調製されうる。例えば、１つの製剤は、５００ｍＭのＮａＣｌおよび２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中に、最大約６．７ｍｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩを含有する。
【００５９】
ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログのための製剤化剤のさらなる例には、油、ポリマー、ビタミン、炭水化物、アミノ酸、塩、緩衝剤、アルブミン、界面活性剤、または充填剤が含まれる。好ましくは、炭水化物には、単糖類、二糖類、もしくは多糖類、または水溶性グルカンなどの糖類または糖アルコールが含まれる。糖類またはグルカンには、フルクトース、デキストロース、ラクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、アルファおよびベータシクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、ならびにカルボキシメチルセルロース、またはこれらの混合物が含まれる。スクロースが最も好ましい。糖アルコールは、−ＯＨ基を有するＣ４からＣ８の炭化水素として定義され、ガラクチトール、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、グリセロール、およびアラビトールが含まれる。マンニトールが最も好ましい。上述のこれらの糖または糖アルコールは、個別にまたは組み合わせて用いられうる。糖または糖アルコールが、水性製剤中で可溶である限り、使用される量に定められた限度はない。好ましくは、糖または糖アルコール濃度は、１．０ｗ／ｖ％と７．０ｗ／ｖ％との間であり、より好ましくは、２．０と６．０ｗ／ｖ％との間である。
【００６０】
好ましくは、アミノ酸には、左旋性（Ｌ）型のカルニチン、アルギニン、およびベタインが含まれるが、他のアミノ酸も加えられうる。凍結乾燥前または再構成後の溶液におけるｐＨ変化を最小化するため、組成物中に緩衝液を使用することもまた好ましい。ほとんどのいずれの生理緩衝液も用いられうるが、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、およびグルタミン酸緩衝液、またはこれらの混合物が好ましい。好ましくは、緩衝液の濃度は、０．０１から０．３モルである。製剤に添加されうる界面活性剤は、ＥＰ２７０，７９９およびＥＰ２６８，１１０に示されている。
【００６１】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの液体の医薬組成物は、調製された後、分解を防止し無菌性を保存するため、凍結乾燥されうる。液体組成物を凍結乾燥する方法は、当業者に公知である。使用する直前に、組成物は、付加成分を含みうる滅菌希釈剤（例えば、リンゲル液、蒸留水、または無菌生理食塩水）で再構成されうる。再構成されると、組成物は、好ましくは、連続静脈内注入により被験体に投与される。
ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログの投与量
ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログは、重症肺炎を含む重症細菌感染を治療および予防するのに治療的に有効な濃度で投与される。このような投与はまた、他の急性または慢性炎症、および一般に、サイトカインが組織因子発現をアップレギュレートする疾患についても有効である。この目的を達成するため、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログは、好ましくは静脈内投与される。この投与を実現する方法は、当業者に公知である。一般に、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログは、１ｍｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇとの間、より好ましくは、２ｍｇ／ｋｇと１５ｍｇ／ｋｇとの間、最も好ましくは、２と１０ｍｇ／ｋｇとの間の投与量で与えられる。
【００６２】
上記の投与量は、一般に、単回投与または分割投与において宿主に投与される合計日用量が、例えば、１日あたり約２から約１５ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約４から約１０ｍｇ／ｋｇの量でありうるように、少なくとも約１日、および通常は数日間にわたって投与される。投与単位組成物は、日用量を構成するような量またはこの約数を含有しうる。低い日用量（例えば、１μｇ／ｋｇから２ｍｇ／ｋｇ）は、予防目的または他の目的に有用でありうる。単回投与形態を作製するため、キャリア物質と併用されうる活性成分の量は、治療される患者および投与の特定様式により異なるであろう。
【００６３】
投与レジメンは、患者のタイプ、年齢、体重、性別、食事および病状、疾患の重症度、投与経路、薬理学的検討（活性、有効性、薬物動態プロフィールおよび毒性プロフィールなど）、薬物送達系が利用されるか否か、ならびにこの化合物が複合薬の一部として投与されるか否かを含む、さまざまな要因により選択される。故に、実際に使用される投与レジメンは、広く異なる可能性があり、したがって、上述された好ましい投与レジメンから逸脱する可能性がある。好ましくは、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの投与は、約０．６６ｍｇ／ｋｇ／時間のａｌａ−ＴＦＰＩの投与速度に等しい投与速度を超えるべきではない。投与速度に加えて、ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログの注入期間は、患者各々の臨床的重症度に依存するであろうが、適切な期間の決定は、通常の臨床医には十分に公知である。注入は、例えば、１０〜２００時間、１０〜１５０時間、２４〜１２０時間、３６〜１００時間または２４〜９６時間の間、実施されうる。１つまたは複数の治療コース、典型的には２つが、治療担当医師の判断により、実施されうる。
ＴＦＰＩ投与量の投与
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、少なくとも約０．０００２５ｍｇ／ｋｇ／時間（０．００４１７μｇ／ｋｇ／分）および約０．５０ｍｇ／ｋｇ／時間（８．３３μｇ／ｋｇ／分）未満の投与速度でａｌａ−ＴＦＰＩを投与するのに等しい投与速度で投与される場合、重症細菌感染の治療有効性は保持され、出血などの有害な副作用は、最小限に抑えられる。有効性および安全性を併せて向上させるには、投与速度は、好ましくは、少なくとも約０．０１０ｍｇ／ｋｇ／時間（０．１６７μｇ／ｋｇ／分）および約０．１ｍｇ／ｋｇ／時間（１．６７μｇ／ｋｇ／分）未満でのａｌａ−ＴＦＰＩの投与速度に等しく、または少なくとも約０．０２０ｍｇ／ｋｇ／時間および約０．０８０ｍｇ／ｋｇ／時間未満でのａｌａ−ＴＦＰＩの投与速度に等しく、最も好ましくは、約０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間（０．４１７μｇ／ｋｇ／分）から約０．０７５ｍｇ／ｋｇ／時間（１．２５１μｇ／ｋｇ／分）のａｌａ−ＴＦＰＩの投与速度に等しい。投与経路は、一般に、静脈内投与であり、連続静脈内注入が好ましい。注入は、少なくとも約７２、９６、１００、１２０、または２４０時間にわたって投与されうる。好ましくは、連続注入は、３から８日間、より好ましくは３から６日間、最も好ましくは約４日間にわたって投与される。
【００６４】
「連続注入による」投与することは、注入が、所定の持続期間のほとんどを実質的な中断なしに、ほぼ所定の速度で維持されることを意味する。あるいは、間欠的静脈内注入が使用されうる。間欠的注入が使用される場合、上述された連続注入のための投与速度に等しい時間平均投与速度が、使用されるべきである。さらに、間欠的注入プログラムは、連続注入により得られる最大濃度を、多くとも約２０％上回る最大血清濃度をもたらさなければならない。患者における有害反応、特に出血を含む副作用を回避するため、投与速度は、約０．１ｍｇ／ｋｇ／時間でのａｌａ−ＴＦＰＩの連続静脈内注入に等しい投与速度未満であるべきである。
【００６５】
投与速度および合計用量を含む、本明細書に記載された全ての用量は、タンパク質濃度およびプロトロンビンアッセイによる生物学的活性の判定における誤差のため、実際には最大１０％の差異が生じる。故に、本明細書に記載された用量より最大１０％高い、または最大１０％低い実際に投与される任意の用量は、記載された用量に等しいとみなされる。この理由のために、全ての用量は、「約」特定の用量として記載されている。例えば、「約０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間」と記載された用量は、０．０２２５から０．０２７５ｍｇ／ｋｇ／時間の範囲にある任意の実用量に等しいとみなされる。
【００６６】
好ましい投与レジメンには、３００ｍＭのＬ−アルギニン、５ｍＭのＬ−メチオニン、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５、オスモル濃度５６０＋／−１１０ｍＯｓｍ／ｋｇ）中の、０．１５ｍｇ／ｍｌまたは０．４５ｍｇ／ｍｌの組換えａｌａ−ＴＦＰＩが各１００ｍｌという、２つの静脈内投与が含まれる。
【００６７】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログのボーラス注入または短時間の高速の注入速度も、低用量のＴＦＰＩ投与が続く場合、本発明を実施するうえで使用されうる。例えば、ボーラス注入または高速の注入速度は、患者の血液循環における投与されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの平衡時間を減少させるのに使用されうる。こうすることで、最終定常状態のＴＦＰＩ血漿レベルはより迅速に達成され、ＴＦＰＩ受容体はより迅速に飽和されうる。ａｌａ−ＴＦＰＩを約０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間で２時間ヒトへ投与することは、ＴＦＰＩ（加えてａｌａ−ＴＦＰＩ）の血漿レベルを約８０ｎｇ／ｍｌから約１２５ｎｇ／ｍｌに増加させる、すなわち約５０％増加させる。注入速度が上昇される、またはボーラス注入が使用される場合、同じレベルがより迅速に達成されるであろう。定常状態が得られるまで注入が続けられる場合、より高速の注入速度は、より高いレベルをもたらすであろう。重症細菌感染に罹患した患者では、約０．０５０ｍｇ／ｋｇ／時間でのａｌａ−ＴＦＰＩの投与に対する定常状態レベルは、約３００ｎｇ／ｍｌであり、約０．３３ｍｇ／ｋｇ／時間または約０．６６ｍｇ／ｋｇ／時間でのａｌａ−ＴＦＰＩの投与に対しては、少なくとも約２μｇ／ｍｌであることが見出された。
【００６８】
単回連続注入量または分割注入量で宿主に投与される合計日用量は、例えば、少なくとも約０．００６ｍｇ／ｋｇ／日から約１．２ｍｇ／ｋｇ／日未満のａｌａ−ＴＦＰＩの投与に等しい、より通常は、約０．２４ｍｇ／ｋｇ／日から約１．２ｍｇ／ｋｇ／日未満のａｌａ−ＴＦＰＩの投与に等しい、好ましくは約０．６ｍｇ／ｋｇ／日のａｌａ−ＴＦＰＩに等しい量であってよい。この範囲内のより低い量は、予防目的または他の目的に有用でありうる。本発明の投与プロトコルは、患者に投与される合計用量としても表されうる。合計用量は、注入速度と合計注入時間との数学的な積である。例えば、ａｌａ−ＴＦＰＩに対する好ましい投与速度（約０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間）および好ましい注入時間（９６時間）では、合計用量は、体重１ｋｇあたり約２．４ｍｇのａｌａ−ＴＦＰＩである。本発明により投与されるＴＦＰＩの合計用量は、少なくとも約０．７５μｇ／ｋｇおよび約４．８ｍｇ／ｋｇ未満のａｌａ−ＴＦＰＩに等しい。好ましくは、合計用量は、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇおよび約４．８ｍｇ／ｋｇ未満のａｌａ−ＴＦＰＩに等しい。より好ましくは、合計用量は、約２．４ｍｇ／ｋｇのａｌａ−ＴＦＰＩに等しい。
【００６９】
ｍｇ／ｋｇ／時間ベースの投与速度および合計日用量を含む、上述の投与レジメンは、「参照ａｌａ−ＴＦＰＩの投与に等しい」投与量として表される。これは、「参照ａｌａ−ＴＦＰＩ」の投与量に対する正規化により定量的に決定されることを意味する。参照ａｌａ−ＴＦＰＩは、成熟した、１００％純粋な（タンパク質ベースで）、適切に折り畳まれた、生物学的に活性な、非グリコシル化ａｌａ−ＴＦＰＩとして定義される。ａｌａ−ＴＦＰＩは、アミノ酸配列が配列番号２に示されたＴＦＰＩアナログである。成熟した、完全長のＴＦＰＩおよびこのアナログを含め、ＴＦＰＩの他の形態もまた、本発明において使用されうる。ａｌａ−ＴＦＰＩ以外のＴＦＰＩ形態、および１００％未満の純度であるａｌａ−ＴＦＰＩまたは別のＴＦＰＩアナログの製剤により、本発明を実施するのに適切な用量範囲を決定するため、参照ａｌａ−ＴＦＰＩについて本明細書に記載された用量範囲は、ＴＦＰＩの特定形態の内因的な生物学的活性を基に調整することができ、さらに製剤の生化学的純度を基に調整することができる。
【００７０】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの内因的な生物学的活性とは、プロトロンビンアッセイにより定義される、成熟した、１００％純粋な、適切に折り畳まれたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの特定の活性を言う。故に、同等の投与量は、（参照ａｌａ−ＴＦＰＩ投与量）／（（相対的内因性活性）×（生化学的純度））として算出される。ここで、相対的内因性活性とは、（アナログの内因活性）／（参照ａｌａ−ＴＦＰＩの内因性活性）を言う。例えば、特定のＴＦＰＩアナログが、参照ａｌａ−ＴＦＰＩの８０％の内因性生物学的活性を有する場合、特定のＴＦＰＩアナログに対する同等の投与量は、参照ａｌａ−ＴＦＰＩの用量値を０．８で除して得られる。さらに、患者に投与される製剤が、例えば、９０％しか生化学的に純粋でない（すなわち、ＴＦＰＩの生物学的活性を欠く、１０％の分子種を含む）場合、ａｌａ−ＴＦＰＩに対する参照用量値のさらなる補正は、この用量値を０．９で除して行われる。故に、ａｌａ−ＴＦＰＩの内因性活性の８０％を有し、生化学的に９０％純粋な仮のＴＦＰＩアナログが投与された場合、参照ａｌａ−ＴＦＰＩを０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間で投与するのに等しい投与速度は、０．０３４７ｍｇ／ｋｇ／時間（すなわち、０．０２５／（０．８×０．９））となる。
【００７１】
同等の投与量はまた、内因性活性または生化学的純度のいずれも知ることなく、相対的な生物学的活性を測定して決定されることもできる。相対的な生物学的活性は、プロトロンビン時間アッセイを用いて、特定のＴＦＰＩアナログとＴＦＰＩ生物学的活性標準との比較により決定されうる。例えば、ＷＯ９６／４０７８４の実施例９の方法により生成されたａｌａ−ＴＦＰＩ（約８５％生物学的に活性なＴＦＰＩ分子種を含有する）は、ＴＦＰＩ生物学的活性標準として使用されうる。ＷＯ９６／４０７８４の実施例９の方法により生成されたａｌａ−ＴＦＰＩは、プロトロンビンアッセイでは参照ａｌａ−ＴＦＰＩの約８５％の活性を有する。プロトロンビン時間標準曲線をプロットする際、凝固時間の対数は、ＴＦＰＩ濃度の対数に対してプロットされる。ＴＦＰＩ生物学的活性標準が、参照ａｌａ−ＴＦＰＩの活性の８５％を保有する場合、プロットされた活性が１００％純粋な参照ａｌａ−ＴＦＰＩの活性に等しくなるように、ＴＦＰＩ生物学的活性標準の濃度を、プロット前に０．８５で乗じれば、参照ａｌａ−ＴＦＰＩの標準曲線に等しい標準曲線が作成されうる。特定のＴＦＰＩアナログの凝固時間が、標準曲線と比較される場合、参照ａｌａ−ＴＦＰＩの同等の濃度は、この曲線から読み取られうる。
【００７２】
あるいは、標準曲線の直線部分の傾斜が直線回帰分析により得られる場合、この傾斜は、参照ａｌａ−ＴＦＰＩと比較したＴＦＰＩ生物学的活性標準の活性を基に補正されうる。特定のＴＦＰＩアナログの相対的生物学的活性は、故に、アナログ活性に対する参照ａｌａ−ＴＦＰＩ活性の比に等しい。例えば、特定のアナログが、１．００μｇの参照ａｌａ−ＴＦＰＩと同じプロトロンビン時間活性を生じるために１．４３μｇを必要とする場合、このアナログの相対的な生物学的活性は、１．００／１．４３、すなわち０．７である。このアナログでは、参照ａｌａ−ＴＦＰＩ投与量に等しい投与量は、参照ａｌａ−ＴＦＰＩ投与量をこのアナログの相対的な生物学的活性で除して得られる。例えば、参照ａｌａ−ＴＦＰＩの０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間の投与量は、このアナログの０．０３５７ｍｇ／ｋｇ／時間（すなわち、０．０２５／０．７）に等しくなる。
【００７３】
いくつかの実施形態では、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログは、過去にヘパリン治療を受けていた患者に投与される。この場合、患者は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ投与前の少なくとも８時間はヘパリンを投与されていないことが好ましい。非分画ヘパリンによる治療は、より長い「洗い出し」（ウォッシュアウト）期間（例えば、２０、２１、２２、２３、または２４時間）を必要としうる。低分子量のヘパリンで治療された患者に対する典型的なウォッシュアウト期間は、９、１０、１１、または１２時間である。
【００７４】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログは、単独の活性抗凝固薬剤として投与されうるが、これらの分子はまた、重症肺炎を治療するための併用療法を実現するため、１つまたは複数のさらなる治療剤と併用して使用されることもできる。このようなさらなる治療剤には、例えば、抗エンドトキシン、モノクローナル抗体（例えば、エンドトキシン結合Ｍａｂ）、および抗ＴＮＦマウスＭａｂのような抗ＴＮＦ生成物などの抗体が含まれる。ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログはまた、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト、殺菌性／透過性亢進（ＢＰＩ）タンパク質、免疫賦活剤、ＰＡＦアンタゴニストなどの抗炎症活性を有する化合物、および細胞接着ブロッカー（例えば、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａインヒビターなどの抗血小板剤）と併用されることもできる。
【００７５】
ＡＰＡＣＨＥＩＩスコアが３８未満であるが２５を超える（例えば、２５と３７の間、すなわち、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、または３７）患者は、さらに活性化タンパク質Ｃ（例えば、ＸＩＧＲＩＳ（登録商標））で治療されうる。活性化タンパク質Ｃは典型的には、合計９６時間、２４μｇ／ｋｇ／時間の注入速度で投与される。この投与レジメンの調整は、個々の患者の臨床所見により熟練した医師により調整されうる。
【００７６】
併用投与される場合、治療剤は、同時または異なる時間に与えられる別個の組成物として製剤されうる。好ましくは、さらなる治療剤は、同時（すなわち、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの投与期間の間）、またはＴＦＰＩもしくはＴＦＰＩアナログの投与期間の２４時間以内（すなわち、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの投与期間の開始前２４時間以内、またはＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの投与期間の開始後２４時間以内）のいずれかに与えられる。さらなる治療剤はまた、単独の組成物としてＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログと共に与えられることもできる。
【００７７】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログはまた、重症細菌感染、特に肺炎を治療するのに効果がある他の薬剤と併用して与えられることもできる。例えば、以下は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログと併用して投与されうる：基礎疾患である細菌感染を治療しうる抗生剤、細菌の細胞壁成分に対するモノクローナル抗体、重症肺炎の経路に関与するサイトカインと複合しうる受容体；ならびに一般的には、サイトカインと相互作用しうる、または重症肺炎および／もしくはこの症状を減弱する補体タンパク質を含む、他の活性化されたもしくは増幅された生理学的経路と相互作用しうる任意の薬剤またはタンパク質。
【００７８】
有用な抗生剤には、一般的な分類のもの：ベータ−ラクタム環（ペニシリン）、グリコシド結合におけるアミノ糖（アミノグリコシド）、大環状ラクトン環（マクロライド）、ナフタセンカルボキサニド（ｎａｐｔｈａｃｅｎｅｃａｒｂｏｘａｎｉｄｅ）の多環式誘導体（テトラサイクリン）、ジクロロ酢酸のニトロベンゼン誘導体、ペプチド（バシトラシン、グラミシジン、およびポリミキシン）、共役二重結合系大環状物（ポリエン）、スルファニルアミド由来のサルファ剤（スルホンアミド）、５−ニトロ−２−フラニル基（ニトロフラン）、キノロンカルボン酸（ナリジクス酸）、および他多数、が含まれる。他の抗生剤、および上記の特定の抗生剤のより多くのバージョンは、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第３版、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｙｍｅｒ（編）、第２巻、７８２〜１０３６頁（１９７８年）および第３巻、１〜７８頁、Ｚｉｎｓｓｅｒ、ＭｉｃｒｏＢｉｏｌｏｇｙ、第１７版、Ｗ．Ｊｏｌｄｉｋら（編）２３５〜２７７頁（１９８０年）、またはＤｏｒｌａｎｄ’ｓ Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ、第２７版、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８８年）に見出されうる。
【００７９】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログと併用されうる他の薬剤には、Ｅ５５３１（リピッドＡアナログ、Ａｓａｉら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２２：４３２頁（１９９９年）を参照のこと）などのエンドトキシンアンタゴニスト、抗凝固活性を有するＴＦアナログ（例えば、Ｋｅｌｌｅｙら、Ｂｌｏｏｄ ８９：３２１９頁（１９９７年）およびＬｅｅ ＆ Ｋｅｌｌｅｙ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：４１４９頁（１９９８年）を参照こと）、ＩＬ−６またはＭ−ＣＳＦに対するこれらのモノクローナル抗体（１９８９年１２月１５日に出願された、米国特許出願シリアル番号０７／４５１，２１８を参照のこと）などのサイトカインに対するモノクローナル抗体、およびＴＮＦに対するモノクローナル抗体（Ｃｅｒａｍｉら、米国特許第４，６０３，１０６号を参照のこと）、ＴＮＦプロホルモンが産生された細胞から成熟ＴＮＦプロホルモンを切断するタンパク質インヒビター（１９８９年８月１６日に出願された、米国特許出願シリアル番号０７／３９５，２５３を参照のこと）、ＩＬ−１アンタゴニスト（１９９０年５月１日に出願された、米国特許出願シリアル番号０７／５１７，２７６を参照のこと）、インヒビン（米国特許第５，９４２，２２０号を参照のこと）などのＩＬ−６サイトカイン発現インヒビター、およびＩＬ−１などのさまざまなサイトカインの受容体ベースのインヒビターが含まれる。補体に対する抗体、または補体のタンパク質インヒビター（ＣＲ１、ＤＡＦ、およびＭＣＰなど）も使用されうる。
【００８０】
この開示に引用されている全ての特許、特許出願、および参考文献は、これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８１】
本発明は、これより、特に有利な実施形態を示す以下の実施例を参照して説明される。しかし、これらの実施形態は例であり、本発明を限定するものとして決して解釈してはならない。
【実施例】
【００８２】
（実施例１）
材料
ＴＦＰＩのＫｕｎｉｔｚドメイン１（４９０４）またはＫｕｎｉｔｚドメイン２（４９０３）に対するモノクローナル抗体は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｉｎｃ．（グリニッチ、ＣＴ）から購入した。本発明者らは、さらなるモノクローナル抗体を作製した（Ｋｕｎｉｔｚドメイン１に対して２Ｈ８、およびＣ末端に対して１７）。対照マウスＩｇＧ１は、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ Ｉｎｃ．から購入した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（サンディエゴ、ＣＡ）から購入し、ＥＢＭ−２培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）で３７℃で培養した。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のリポ多糖類（ＬＰＳ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｌ−２６５４）から購入した。
【００８３】
以下の実施例では、外因性ＴＦＰＩは全て、ａｌａ−ＴＦＰＩである。
【００８４】
（実施例２）
全血アッセイ
血液は、抗凝固剤の非存在下、血小板活性化を最小限に抑える条件下で、健康なドナーから採取した。ドナー選択は、アスピリンまたは他の抗凝血剤、コレステロール降下剤、抗炎症剤、抗ヒスタミン剤、および抗生剤の使用を除外した。１０ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ、およびａｌａ−ＴＦＰＩを含むまたは含まないさまざまな濃度のｍＡｂを含有する試薬混合物は、９６ウェルディッシュ中で前形成されていた。血液を、採血１０分以内に、総量２００μｌの１０％ＦＢＳを含むまたは含まないＲＰＭＩ−１６４０培地に、１：１０の比まで添加した。希釈血液試料を、細胞培養インキュベータで１６から２０時間、３７℃にてインキュベートし、細胞上清のアリコートは、ＩＬ−６ ＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を用いて炎症性サイトカインの分泌について分析した。他のサイトカインの放出は、ＬＩＮＣＯＰＬＥＸ（登録商標）サイトカインキット（ＬＩＮＣＯ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて測定した。
【００８５】
（実施例３）
全血＋ＨＵＶＥＣアッセイ
ＨＵＶＥＣ細胞を、実験１日前に１０ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳを含むＥＢＭ−２培地に５０００〜７０００細胞／９６ウェルで播種した。実験１日目、この培地を除去し、１０％ＦＢＳを含むまたは含まないＲＰＭＩ−１６４０培地に、１０ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ、およびａｌａ−ＴＦＰＩを含むまたは含まないさまざまな濃度のｍＡｂを含有する、前形成された試薬混合物と交換した。次いで、血液を、１：１０の比で添加した。全血アッセイは、上述のように実施した。
【００８６】
（実施例４）
患者のベースラインＴＦＰＩは死亡率と相関する
複数の原因の重症敗血症を、ａｌａ−ＴＦＰＩで治療するための大規模第ＩＩＩ相臨床試験において、本発明者らは、明らかにａｌａ−ＴＦＰＩ治療の効果が得られる患者の大規模なサブセットを見出した。特に、本発明者らは、ＣＡＰ患者は治療成績が良好であることに気づいた。この試験で行われた分析のうち、本発明者らは、ＴＦＰＩのベースラインの血漿濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。図２に示されたように、患者のベースラインＴＦＰＩは、死亡率を相関していた。これは、患者全体またはＣＡＰサブセットのいずれにも当てはまることであった。この結果は、敗血症が悪化するにつれ、ＴＦＰＩが不活性化され、血液細胞から放出されることを示唆する。外因性ａｌａ−ＴＦＰＩは、感染中の内因性ＴＦＰＩの欠失に取って代わるものである。
【００８７】
（実施例５）
全血敗血症モデルにおけるＴＦＰＩ代謝回転およびＴＦＰＩ分解誘導のシミュレーション
本発明者らは、血清を正常な血液に添加して、敗血症血液モデルを作成した。これは、急速な凝固をもたらし、多くのサイトカインのリポ多糖類（ＬＰＳ）依存性分泌を誘導して、敗血症患者由来の血液で観察されるものと同様の状況を創出するものである。
【００８８】
ａｌａ−ＴＦＰＩが全血に添加された場合、ａｌａ−ＴＦＰＩは、Ｃ末端でインタクトなままであった。しかし、本発明者らの敗血症モデルでは、Ｃ末端ドメインを、添加されたａｌａ−ＴＦＰＩから切断した。この結果は、図３に示されている。このデータは、凝固を活性化し、血液中の炎症性サイトカインを誘導する状況は、ＴＦＰＩのＣ末端ドメインの除去をもたらすことを示している。正常血漿ＴＦＰＩの最大９５％は、Ｃ末端の欠失を有する。Ｃ末端を切断されたＴＦＰＩは、血液アッセイにおいて活性がほとんど見られない。
【００８９】
（実施例６）
添加されたａｌａ−ＴＦＰＩの、さまざまな内因性ＴＦＰＩレベルを有する患者の生存に与える影響
添加されたａｌａ−ＴＦＰＩは、ベースラインＴＦＰＩが異常な患者において効果があると思われる（図４）。ＣＡＰ患者が、ベースラインのＴＦＰＩレベル別にサブセットに分類された場合、本発明者らは、ａｌａ−ＴＦＰＩが、正常なベースラインＴＦＰＩより下の患者、およびベースラインＴＦＰＩの高い患者において効果があることを見出した。添加されたａｌａ−ＴＦＰＩが、ベースラインＴＦＰＩの高い患者を改善したという事実は、血漿ＴＦＰＩは不活性であり、ａｌａ−ＴＦＰＩ剤が、十分に活性型であることを示すデータと一致する。
【００９０】
（実施例７）
本発明者らは、健康なドナー由来の希釈された全血におけるＴＦＰＩ活性を調べた。本発明者らは、いくつかの活性は、ＴＦＰＩが、炎症性サイトカインを介して抗菌活性を制御するシグナル伝達複合体の一部であることと一致すると考えている。正常血液中の炎症性サイトカインレベルは、きわめて低く、外因性ａｌａ−ＴＦＰＩが添加された場合も低いままであった（図５）。予測された通り、ＬＰＳの正常血液への添加は、ＩＬ−６、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αを含む炎症性サイトカインレベルを上昇させた。この反応は、血漿ＴＦＰＩ濃度に感受性であり、機能的ＴＦＰＩのいずれの欠失も、この反応を低下させるであろう。
【００９１】
意外にも、ＬＰＳもまた、添加されたａｌａ−ＴＦＰＩが、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、およびＴＮＦ−αを誘導するように、ＴＦＰＩに対し血液を感作した（図６、７Ａ）。ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの増加は全て、少量の抗ＴＦＰＩにより覆された（図７Ｂ）。このサイトカインのスペクトルは、マクロファージの活性化と関連して、これらの抗菌活性を増加させる。
【００９２】
細胞免疫学における現在の理解では、細胞性免疫は、ＴＨ１細胞により媒介される。ＴＨ１細胞の活性化は、関連するＴ細胞の抗原認識およびクローン性増殖という、１週間を要するプロセスを必要とする。ａｌａ−ＴＦＰＩによる誘導が数時間後に生じたが、これは、活性化のこの形態が、適応免疫系が十分に関与する前に、感染の臨床初期段階において重要な役割を果たしうることを示唆するものである。
【００９３】
これらの結果は、ＴＦＰＩは、凝固カスケードにおけるプロテアーゼインヒビターではなく、シグナル伝達カスケードにおけるリガンドとして機能しているように思われることを示す。
【００９４】
（実施例８）
最近の文献は、ＴＦＰＩとこの受容体との相互作用に不可欠なドメインとして、Ｋｕｎｉｔｚドメイン３（Ｋ３）を挙げているが、Ｋ３は、凝固阻害に関しては重要でないと思われる。Ｐｉｒｏ＆Ｂｒｏｚｅ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００４年１２月７日；１１０（２３）：３５６７〜７２頁。全血アッセイにより、本発明者らは、ＴＦＰＩがサイトカインを誘導するのに必要とされるＴＦＰＩドメインをマッピングした。この結果は、図８に示されている。本発明者らは、Ｃ末端ドメインおよびＫ３の双方を欠く欠失変異体が不活性であるのに対し、Ｃ末端が欠失したＴＦＰＩは、依然として活性を有することを見出した。これらのデータは、Ｋ３を介して受容体に固定されるＴＦＰＩの、提案されたシグナル伝達活性と一致する。
【００９５】
（実施例９）
上述の通り、ＬＰＳ含有血液への血清の添加は、サイトカインのスペクトル（これらには、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０が含まれるが、ＩＦＮ−γは含まれない）を誘導する。この回収物は、活性化されたマクロファージの産生量と一致する。外因的に添加された３から１０ｎＭのａｌａ−ＴＦＰＩは、血清に誘導されたこれらのサイトカインを阻害することができる（図７および９）。
【００９６】
（実施例１０）
ＴＦＰＩは因子Ｘａにより誘発されたＩＬ−６産生を阻害する
ＩＬ−６産生に対するＴＦＰＩの阻害活性は、Ｘａ産生を阻害するＴＦＰＩの能力を介すると思われる。図１０は、さまざまなインヒビター（インヒビターＤＥＧＲ−ＶＩＩａ、ＤＥＧＲ−ＩＸａ、およびＤＥＧＲ−Ｘａは、ＶＩＩａｉ、ＩＸａｉおよびＸａｉと記載される）の存在下、ＬＰＳおよび血清に誘発されたＩＬ−６を測定する全血アッセイの結果を示している。本発明者らが、いくつかのインヒビターを試験したとき、本発明者らは、部位不活性化ＶＩＩａが活性を持たないことを見出した。このことは、サイトカインが、組織因子（ＴＦ）媒介性の凝固活性化により誘発されたことを示している。本発明者らの予測に反して、部位不活性化ＩＸａは、ＴＦＰＩと同じくらい強力であった。このことは、サイトカイン分泌が、内因性凝固カスケードを介して誘発される因子Ｘａの形成に関与したことを示している。文献によれば、Ｘａは、トロンビンを生成するＸａの能力を介してサイトカインを誘導するはずである。これに反し、本発明者らは、部位不活性化Ｘａが作用を持たないことを見出した。
【００９７】
これらの結果は、サイトカインは、Ｘａにより直接誘発されうること、この反応型におけるＴＦＰＩは、Ｘａ産生を阻害するＴＦＰＩの能力を介して効力発揮することを示している。
【００９８】
（実施例１１）
ＴＦＰＩおよびＡＰＣ（活性化タンパク質Ｃ）は、各々がトロンビン産生を制限するため、凝固に対するきわめて類似の作用を有する（図１１）。しかし、サイトカイン誘導が、因子Ｘａに誘発される場合、これらの薬剤は、ＩＬ−６誘導に対する異なる作用を有するはずである。ＡＰＣは、因子ＶＩＩＩａの破壊によりＸａ産生を阻害するが、ＴＦによるＸａ産生に対しては作用を持たない。本発明者らの敗血症血液モデルでは、本発明者らは、この反応に少量のＴＦを添加した際、まさしくこの結果を観察した（図１２）。ＩＸａが、ＩＬ−６を誘発する反応では、本発明者らは、両方のタンパク質が、ＩＬ−６レベルに反映されるように、血清による炎症を阻害しうることを見出している。予測通り、ＡＰＣは、内因性経路により誘導されるＩＬ−６産生を阻害した。しかし、ＴＦの存在下では、ＴＦＰＩのみがＩＬ−６産生を阻害しうるであろう。
【００９９】
（実施例１２）
血液細胞は、この表面にＴＦＰＩを有することが知られている。このＴＦＰＩの活性を定量するため、本発明者らは、この機能を抗ＴＦＰＩ抗体で阻害し、サイトカインを測定した（図１３）。添加されたａｌａ−ＴＦＰＩで見られた阻害とは明らかに反対に、抗ＴＦＰＩはＩＬ−６分泌も阻害した。これらのデータは、ａｌａ−ＴＦＰＩを正常血液およびＬＰＳに添加した結果と類似する。これらのデータから、本発明者らは、ＴＦＰＩは、シグナル伝達複合体の一部であると結論づけた。
【０１００】
ＴＦ：ＶＩＩａ：Ｘａ複合体のカベオラ（ここで、複合体はＴＦＰＩと結合する）への移動モデルは、図１４に示されている。この複合体は、複合体の形成をＸａに依存する。この機構にとらわれたくはないが、本発明者らは、複合体の機能は、サイトカイン分泌を活性化し、細菌排除機構を高めることであると考える。複合体の形成はＸａに依存するため、過剰なＴＦＰＩは、抗体を中和化するのと同様に、複合体の形成を防止するであろう。
【０１０１】
このモデルに従い、プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）誘導性サイトカインの制御は、ＰＡＲ−１がアゴニストペプチドにより活性化された場合でも、因子Ｘａに依存することを見出した（図１５）。ＰＡＲ−１活性化をブロックする抗体が、ＩＬ−６分泌を阻害したことから（図１６）、ＰＡＲ−１は、本発明者らの敗血症血液モデルでは、ＩＬ−６分泌を誘導するシグナル伝達系の一部であるように思われる。ＰＡＲ−１アゴニストのさらなる添加は、ＩＬ−６分泌を増加させた。これらの活性の双方は、ＰＡＲが、炎症性サイトカイン産生に関与していることに関する文献データと一致する。ＰＡＲ活性化は、凝固カスケードの下流であるため、ＰＡＲアゴニストは、この系では優位のはずである。その代わりに本発明者らは、ＴＦＰＩは、サイトカインを制御するＸａ依存性ＴＦＰＩ複合体の本発明者らのモデルと整合して、ＰＡＲアゴニストより優位になりうることに気づく。
【０１０２】
（実施例１３）
カベオラにおけるＴＦＰＩの主要な貯蔵庫は、内皮細胞において見られる。これらの細胞は、これらの細胞の、表面ＴＦの迅速な誘導を介して血液感染の見張り役を果たすことが提案されている。上述の通り、本発明者らは、血液が、ＩＬ−６の適度なバースト放出により、ＬＰＳに反応することを見出した（図１７）。同様に、内皮細胞は、少量のサイトカインでＬＰＳに反応する。本発明者らは、血液および内皮細胞を組み合わせることが、ＬＰＳに対する相乗的反応につながることを見出した。本発明者らは、相乗的反応が、ＩＬ−６およびＩＬ−８に限定されることを見出した。これは、内皮細胞の警報システムとしての役割と一致する。
【０１０３】
今一度、この反応におけるＴＦＰＩの役割を調べるため、本発明者らは、中和化抗ＴＦＰＩ抗体を添加した（図１８）。本発明者らは、高濃度の抗ＴＦＰＩが、ＩＬ−６産生を阻害することを見出した。この阻害がＴＦＰＩによるものであることを確かめるため、本発明者らは、抗ＴＦＰＩを低濃度のａｌａ−ＴＦＰＩでプレインキュベートし、１０ｎＭのａｌａ−ＴＦＰＩが、部分的に６００ｎＭの抗ＴＦＰＩの作用を減弱させることを見出した（図１９）。
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
重症細菌感染は、生命にかかわる種を含む、さまざまな合併症につながりうる。重症細菌感染を治療する、および／または重症細菌感染による死亡リスクを低下させる有効な方法が、当技術分野では引き続き必要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
発明の要旨
本発明の１つの実施形態は、重症細菌感染を発症するリスクのある患者、または重症細菌感染と診断された患者を治療する方法であり、この方法は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを、それを必要とする患者に投与することを含む。いくつかの実施形態では、重症細菌感染は、肺炎、菌血症、深部組織感染、皮膚感染、軟部組織感染、歯周炎、腹膜炎、外科感染、または髄膜炎の原因となる。さらなる実施形態では、肺炎は、市中肺炎（ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−ａｃｑｕｉｒｅｄ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）または院内肺炎であり、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに起因しうる。
【０００３】
別の実施形態は、重症細菌感染による死亡リスクを低下させる方法であり、この方法は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを含む医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む。いくつかの実施形態では、重症細菌感染は、肺炎、菌血症、深部組織感染、皮膚感染、軟部組織感染、歯周炎、腹膜炎、外科感染、または髄膜炎の原因となる。さらなる実施形態では、肺炎は、市中肺炎または院内肺炎であり、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに起因しうる。
【０００４】
他の実施形態は、前記患者が以下の基準：血中ＩＬ−６レベルが３，２００ｐｇ／ｍｌ未満；国際標準比（ＩＮＲ）が２．５未満；急性生理スコア（ＡＰＳ）が２６未満；Ａｃｕｔｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ａｎｄ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（ＡＰＡＣＨＥ ＩＩ）スコアが３８未満；およびＭＯＤＳスコアが１８を超える、のいずれかを満たす、上記実施形態のいずれかを含む。
【０００５】
他の実施形態は、前記ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、グリコシル化されていない、上記実施形態のいずれかを含む。他の実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約１２％未満が、修飾された種であり、修飾された種には、逆相クロマトグラフィーで検出される、酸化ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子；カチオン交換クロマトグラフィーで検出される、カルバミル化ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子；Ｐｒｏｍｅｇａ ＩＳＯＱＵＡＮＴ（登録商標）キットで検出される、脱アミド化ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子；アミノ酸分析で決定される、システイン付加物を含むＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子；サイズ除外クロマトグラフィーで検出される、凝集したＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子；および非変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で検出される、誤って折り畳まれたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子、の１つまたは複数を含む、上記実施形態を含む。
【０００６】
他の実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約９％未満が酸化されている、上記実施形態を含む。
【０００７】
他の実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約３％未満がカルバミル化されている、上記実施形態を含む。
【０００８】
他の実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約９％未満が脱アミド化されている、上記実施形態を含む。
【０００９】
他の実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約２％未満がシステイン付加物を含む、上記実施形態を含む。
【００１０】
他の実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約３％未満が凝集されている、上記実施形態を含む。
【００１１】
他の実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約３％未満が誤って折り畳まれている、上記実施形態を含む。
【００１２】
他の実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを含む凍結乾燥組成物から調製される、上記実施形態を含む。他の実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、アルギニンを含む製剤として投与される、上記実施形態を含む。他の実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、クエン酸を含む製剤として投与される、上記実施形態を含む。
【００１３】
他の実施形態は、医薬組成物が、０．０１から１．０ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを含む、上記実施形態を含む。他の実施形態は、医薬組成物が、１５０〜４５０ｍＭのＬ−アルギニンを含む、上記実施形態を含む。他の実施形態は、医薬組成物が、０．１〜５０ｍＭのＬ−メチオニンを含む、上記実施形態を含む。他の実施形態は、医薬組成物が、５〜５０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液を含む、上記実施形態を含む他の実施形態は、医薬組成物が、５．０〜６．０のｐＨを有する、上記実施形態を含む。
【００１４】
他の実施形態は、方法が、０．１５±１５％ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、３００±１５％ｍＭのＬ−アルギニン、５±１５％ｍＭのＬ−メチオニン、および２０±１５％ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５±１５％）を含む医薬組成物の使用を含む、上記実施形態を含む。
【００１５】
他の実施形態は、方法が、０．１５±１０％ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、３００±１０％ｍＭのＬ−アルギニン、５±１０％ｍＭのＬ−メチオニン、および２０±１０％ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５±１０％）を含む医薬組成物の使用を含む、上記実施形態を含む。
【００１６】
他の実施形態は、方法が、０．１５±５％ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、３００±５％ｍＭのＬ−アルギニン、５±５％ｍＭのＬ−メチオニン、および２０±５％ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５±５％）を含む医薬組成物の使用を含む、上記実施形態を含む。
【００１７】
他の実施形態は、方法が、０．４５±１５％ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、３００±１５％ｍＭのＬ−アルギニン、５±１５％ｍＭのＬ−メチオニン、および２０±１５％ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５±１５％）を含む医薬組成物の使用を含む、上記実施形態を含む。
【００１８】
他の実施形態は、方法が、０．４５±１０％ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、３００±１０％ｍＭのＬ−アルギニン、５±１０％ｍＭのＬ−メチオニン、および２０±１０％ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５±１０％）を含む医薬組成物の使用を含む、上記実施形態を含む。
【００１９】
他の実施形態は、方法が、０．４５±５％ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、３００±５％ｍＭのＬ−アルギニン、５±５％ｍＭのＬ−メチオニン、および２０±５％ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５±５％）を含む医薬組成物の使用を含む、上記実施形態を含む。
【００２０】
他の実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、参照ａｌａ−ＴＦＰＩを約０．６６ｍｇ／ｋｇ／時間未満の投与速度で投与するのに等しい投与速度で連続静脈内注入により投与される、上記実施形態を含む。
【００２１】
他の実施形態は、投与速度が、参照ａｌａ−ＴＦＰＩを投与速度約０．０００２５から約０．１ｍｇ／ｋｇ／時間で投与するのに等しく、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、少なくとも約７２時間投与される、上記実施形態を含む。他の実施形態は、投与速度が、参照ａｌａ−ＴＦＰＩを投与速度約０．０１０から約０．１ｍｇ／ｋｇ／時間で投与するのに等しい、上記実施形態を含む。他の実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、少なくとも約９６時間投与される、上記実施形態を含む。
【００２２】
他の実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、参照ａｌａ−ＴＦＰＩを合計用量約０．０２４から約４．８ｍｇ／ｋｇで投与するのに等しい合計用量を提供する連続静脈内注入により投与される、上記実施形態を含む。他の実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、参照ａｌａ−ＴＦＰＩを投与速度約０．０２から約１ｍｇ／ｋｇ／時間で投与するのに等しい投与速度で連続静脈内注入により投与される、上記実施形態を含む。他の実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、参照ａｌａ−ＴＦＰＩを日用量約０．００６ｍｇ／ｋｇから約１．２ｍｇ／ｋｇで投与するのに等しい日用量を提供する連続静脈内注入により投与される、上記実施形態を含む。
【００２３】
他の実施形態は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、１０〜２００時間、１０〜１５０時間、または２４〜９６時間の間、注入により投与される、上記実施形態を含む。
【００２４】
他の実施形態は、患者が、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ投与前の少なくとも８時間はヘパリン治療を受けていない、上記実施形態を含む。
【００２５】
他の実施形態は、活性化タンパク質Ｃで患者を治療することをさらに含む、上記実施形態を含む。
【００２６】
他の実施形態は、ＴＦＰＩアナログが、ａｌａ−ＴＦＰＩである、上記実施形態を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
詳細な説明
ＴＦＰＩは、抗炎症活性を有すると考えられる強力な抗凝固剤である。ＥＰ０６４３５８５を参照のこと。ＴＦＰＩは、例えば、腫瘍に関連した血管新生を阻害するのに使用することができる。ＥＰ０９１４８３０を参照のこと。本発明者らは、ＴＦＰＩが、先天性免疫系を制御する炎症性サイトカインの制御を介した抗菌活性も有することを見出した。本発明者らは、ＴＦＰＩは、重症細菌感染の結果、分解されると思われること、感染の進行中にＴＦＰＩが減少することが、この系を損なうことも見出した。したがって、ＴＦＰＩは、感染との闘いにおいて重要な役割を果たす一方、内因性ＴＦＰＩは、重症感染の間に変化し、ＴＦＰＩの治療機能を減少させる。
【００２８】
いくつかの要因は、敗血症患者群における死亡率を予測する。これらには、Ａｃｕｔｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ａｎｄ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（ＡＰＡＣＨＥ ＩＩ）スコアリングシステム（Ｋｎａｕｓら、Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１９８５年；１３：８１８〜２９頁）、急性生理スコア（ａｃｕｔｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｓｃｏｒｅ）（ＡＰＳ）、国際標準比（ＩＮＲ）（Ｒ．Ｓ．Ｒｉｌｅｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．１４：１０１〜１１４頁、２０００年）、および血漿ＩＬ−６濃度が含まれる。市中肺炎（ＣＡＰ）を伴う患者集団では、本発明者らは以前に、ＴＦＰＩが死亡率を減少させるうえで有効であることを観察した。相対リスク減少率は、（１００×絶対リスク減少率）／プラセボ死亡率で決定される。ＡＰＡＣＨＥ ＩＩスコア（図２０）、急性生理スコア、ＩＮＲ、（図２２）または血漿ＩＬ−６レベル、（図２１）を用いて、ＣＡＰ患者を重症度別に分類した場合、本発明者らは、ＴＦＰＩ治療からの恩恵には、プラセボ死亡率が最も低い患者が含まれることを見出した。例えば、ＡＰＡＣＨＥ ＩＩスコアで分類したＣＡＰサブセットでは、ＡＰＡＣＨＥ ＩＩスコア１６で５％の死亡リスクの減少があった。これは３２％の相対リスク減少率を意味する。図２０は、平均ＡＰＡＣＨＥ ＩＩスコアが３６以下の患者で死亡リスクが減少することを示している。ベースラインのＴＦＰＩ血清濃度は、死亡率および有効性の双方を予測するものであった。
【００２９】
ＩＮＲレベルが１．２未満である下位試験の患者は、高ＩＮＲの一次試験（全体で１８％ｖｓ．３４％）の患者より死亡リスクが低く、ａｌａ−ＴＦＰＩは、ＩＮＲレベルが１．２未満である下位試験において有効であった（図２５）。ＩＮＲレベルが平均２．１未満の患者のＣＡＰサブセットは、ａｌａ−ＴＦＰＩの効果が得られた（図２１）。これは、ヘパリン治療をせずａｌａ−ＴＦＰＩで治療した患者についても当てはまる。
【００３０】
図２０は、全体および市中肺炎（ＣＡＰ）プラセボ群におけるＡＰＡＣＨＥ ＩＩと死亡率との予測相関を示している（図２０）。ＡＰＡＣＨＥ ＩＩの四分位にＣＡＰコホートを当てはめた場合、本発明者らは、全てのＡＰＡＣＨＥ ＩＩ四分位で有効性が認められることに気づいた。同様に、ＡＰＳ、ＩＮＲおよびＩＬ−６は全て、死亡率との間に正の相関が認められた。これらのパラメータで測定した場合、全てのケースでａｌａ−ＴＦＰＩは、リスクが最も低い群の生存を改善した（図２１、２２、２３）。ＴＦＰＩは、血液からの細菌培養が陽性である患者において有効である（図２４）。この場合もＴＦＰＩは、患者をＡＰＡＣＨＥスコアで分けた場合の下位４分の３で幅広く有効であった。
【００３１】
故に、外因性ＴＦＰＩによる治療は、重症細菌感染を発症するリスクのある患者、または重症細菌感染と診断された患者に対し治療的有用性があり、こうした感染による死亡リスクを減少させるのに有用である。重症細菌感染は、一般に緊急医療、特に入院を必要とする感染である。いくつかの細菌感染は、一般に、抗感染治療および支持医療または積極的な医学的介入を必要とする。一般的な重症細菌感染には、肺炎（院内肺炎ならびに市中肺炎を含む）、菌血症、深部組織感染、皮膚感染、軟部組織感染、歯周炎、腹膜炎、外科感染、および髄膜炎が含まれるが、これらに限定されない。
【００３２】
本発明により治療されうる患者は、以下の基準の１つまたは複数を満たす：（ａ）血中ＩＬ−６レベルが３，２００ｐｇ／ｍｌ未満（例えば、ＩＬ−６レベルが３，０００、２，５００、２，０００、１，５００、１，０００、５００、２５０、１００または１０）；（ｂ）国際標準比（ＩＮＲ）が２．５未満（例えば、ＩＮＲが２．４、２．３、２．２、２．１、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、または１．１）；（ｃ）急性生理スコア（ＡＰＳ）が２６未満（例えば、ＡＰＳスコアが２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、もしくは１６、または１６〜１９の間、または２０〜２３の間）；（ｄ）Ａｃｕｔｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ａｎｄ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（ＡＰＡＣＨＥ ＩＩ）スコアが３８未満（例えば、ＡＰＡＣＨＥ ＩＩスコアが３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、または１６）；および（ｅ）多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）スコアが１８を超える（例えば、ＭＯＤＳスコアが１９、２０、２１、２２、２３、もしくは２４、または２０〜２１の間、または２２〜２３の間）。
【００３３】
１つの実施形態では、患者は、血中ＩＬ−６レベルが３，２００ｐｇ／ｍｌ未満である。別の実施形態では、患者は、国際標準比（ＩＮＲ）が２．５未満である。さらに別の実施形態では、患者は、急性生理スコア（ＡＰＳ）が２６未満である。さらに別の実施形態では、患者は、Ａｃｕｔｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ａｎｄ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（ＡＰＡＣＨＥ ＩＩ）スコアが３８未満である。さらに別の実施形態では、患者は、ＭＯＤＳスコアが１８を超えている。
ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログ
ＴＦＰＩは、まず、天然由来の抗凝固剤として単離された。タンパク質は、いくつかの主要なドメイン（図１）：Ｋｕｎｉｔｚ型（Ｋ１、Ｋ２およびＫ３）、Ｎ末端ドメイン、およびＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）の３つのセリンプロテアーゼインヒビタードメインを有する。Ｋ１ドメインは、凝固因子ＶＩＩａ−組織因子（ＴＦ）複合体を阻害する。Ｋ２ドメインは、因子Ｘａを阻害する。これまで、セリンプロテアーゼは、Ｋ３との関連が認められていなかったが、近年の実験は、ＴＦＰＩが細胞表面のＧＰＩアンカー型受容体と結合するうえで、Ｋ３が機能することを示唆している。Ｐｉｒｏ ＆ Ｂｒｏｎｚｅ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００４年１２月７日；１１０（２３）：３５６７〜７２頁。ＣＴＤは、細胞結合、ヘパリン結合、およびＸａ至適阻害にも関与している。
【００３４】
ＴＦＰＩは、天然には、血液および他の組織中の複数の細胞型で産生される。ほとんどのＴＦＰＩは、血管内皮細胞でつくられると考えられている。ＴＦＰＩの一部は、血液中に見出される。この血漿ＴＦＰＩのほとんどは、他の血漿タンパク質とのジスルフィド交換、またはＣＴＤを除去する切断により、共有結合的に修飾される。ＴＦＰＩのこれらの形態は、生化学的アッセイでの活性が低く、細胞を効率よく結合させない。これは、血漿ＴＦＰＩが不活性であることを示唆する。これと一致するように、複数の試験が、血漿ＴＦＰＩの半減期はきわめて短いこと、血漿ＴＦＰＩは肝臓で効率よく除去されることを明らかにした。
【００３５】
ＴＦＰＩのさまざまな細胞関連型は、インビトロで最大活性を有する完全長の単量体タンパク質である。内皮細胞には、ヘパリンによる治療で除去されうるわずかなＴＦＰＩの小画分がある。別のプールは、表層側の下の小胞に存在すると思われ、細胞がトロンビンにより刺激された場合に放出される。細胞表面ＴＦＰＩの大半は、他の系のシグナル伝達に関連した細胞小器官であるカベオラで見出される。Ｌｕｐｕら、ＪＢＣ Ｐａｐｅｒｓ ｉｎ Ｐｒｅｓｓ、２００５年４月６日、Ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ Ｍ５０３３３３２００として発表。カベオラのＴＦＰＩは、内皮細胞のＴＦに関与するＴＦＰＩであると思われる。内皮細胞が細菌に曝露されると、内皮細胞はこの表面全体にＴＦを誘導する。ＴＦは、Ｘａを生じるＶＩＩａと結合する。ＴＦ：ＶＩＩａは、急速にカベオラへ移動し、ここでＴＦＰＩと結合する。通常の内皮細胞では、ＴＦＰＩが過剰となり、ＴＦ発現内皮細胞は、病的レベルの凝固酵素を誘導しないようにする。興味深いことに、ＴＦはカベオラへ移行すると安定する。このことは、ＴＦには、ＴＦＰＩにより中和された後に果たす役割があることを示唆する。
【００３６】
本明細書で使用される「ＴＦＰＩ」とは、配列番号１に示された２７６アミノ酸残基配列および分子量約３８，０００ダルトンを有する、成熟した血清糖タンパク質を言う。米国特許第５，１０６，８３３号を参照のこと。ＴＦＰＩ ｃＤＮＡのクローニングは、Ｗｕｎら、米国特許第４，９６６，８５２号に記載されている。本発明で使用されるＴＦＰＩは、グリコシル化されていないまたはグリコシル化されたものであってよい。
【００３７】
「ＴＦＰＩアナログ」は、修飾がＴＦＰＩ生物学的活性を破壊しない限り、１つまたは複数のアミノ酸の付加もしくは置換（一般に性質が保存され、好ましくは非Ｋｕｎｉｔｚドメインまたはタンパク質のＣ末端部分で保存される）、１つまたは複数のアミノ酸欠失（例えば、ＴＦＰＩフラグメント）、または１つまたは複数の化学的部分の、１つまたは複数のアミノ酸への付加により修飾されたＴＦＰＩ誘導体である。好ましくは、ＴＦＰＩアナログは、３つのＫｕｎｉｔｚドメイン全てを含む。ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログは、グリコシル化型または非グリコシル化型のいずれかでありうる。
【００３８】
好ましいＴＦＰＩアナログは、アミノ酸配列が配列番号２に示された、Ｎ−Ｌ−アラニル−ＴＦＰＩ（ａｌａ−ＴＦＰＩ）である。ａｌａ−ＴＦＰＩは、国際薬品名「チファコギン」（ｔｉｆａｃｏｇｉｎ）としても知られている。ａｌａ−ＴＦＰＩのアミノ末端アラニン残基は、Ｅ．ｃｏｌｉ発現を改善し、切断しなければアミノ末端メチオニン残基となるものを切断させるＴＦＰＩ配列へ、遺伝子操作された。米国特許第５，２１２，０９１号を参照のこと。ＴＦＰＩの他のアナログは、米国特許第５，１０６，８３３号に記載されている。ＴＦＰＩアナログは、以下に記載された生物学的活性アッセイにより判定される、ＴＦＰＩ活性のいくつかの指標を保有している。ＴＦＰＩおよびアナログの好ましい生物学的活性アッセイは、プロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイである（以下参照）。
【００３９】
ＴＦＰＩアナログは、性質が保存されるアミノ酸置換、すなわち、これらの側鎖に関連するアミノ酸ファミリー内で生じる置換を有することができる。具体的には、アミノ酸は、一般に以下の４つのファミリーに分類される：（１）酸性−−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性−−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；ならびに（４）非荷電性極性−−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、およびチロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、芳香族アミノ酸として分類される場合もある。例えば、ロイシンのイソロイシンもしくはバリンによる単一置換、アスパラギン酸のグルタミン酸による単一置換、スレオニンのセリンによる単一置換、または１つのアミノ酸の構造的に関連した１つのアミノ酸による同様の保存的置換は、生物学的活性に対し重大な影響を与えないことは、当然予測可能である。例えば、分子の所望の機能がインタクトなままである限り、目的とするポリペプチドには、約１〜１５までの保存的または非保存的アミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５）が含まれてよい。好ましいＴＦＰＩ形態には、Ｋｕｎｉｔｚ１、Ｋｕｎｉｔｚ２、Ｋｕｎｉｔｚ３ドメインが、天然ヒトＴＦＰＩ Ｋｕｎｉｔｚドメインとまさに一致する、より好ましくは、各Ｋｕｎｉｔｚドメインが、天然ヒトＴＦＰＩ Ｋｕｎｉｔｚドメインの各々とまさに一致するＴＦＰＩアナログが含まれる。
【００４０】
好ましくは、ＴＦＰＩアナログは、配列番号１に示されたＴＦＰＩと少なくとも９５％以上同一であるアミノ酸配列を有する。より好ましくは、分子は、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。
【００４１】
ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログの生物学的活性は、プロトロンビンアッセイで決定されうる。適切なプロトロンビンアッセイは、米国特許第５，８８８，９６８号およびＷＯ９６／４０７８４に記載されている。簡単には、プロトロンビン時間は、血液凝固測定装置（例えば、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ製のＣｏａｇ−Ａ−Ｍａｔｅ ＭＴＸ ＩＩ）を用いて決定されうる。適切なアッセイ緩衝液は、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含有する、ｐＨ７．５に調整された、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓである。必要とされるさらなる試薬は、正常ヒト血漿（例えば、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａによる「Ｖｅｒｉｆｙ １」）、トロンボプラスチン試薬（例えば、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａによる「Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ Ｅｘｃｅｌ」）、およびＴＦＰＩ標準液（例えば、アッセイ緩衝液１ｍｌあたり、１００％純粋ａｌａ−ＴＦＰＩ（またはこの等価物）２０μｇ）である。標準曲線は、ＴＦＰＩ標準溶液の一連の（例えば、１から５μｇ／ｍｌの範囲の最終濃度への）希釈物の凝固時間を分析して得られる。
【００４２】
凝固時間を決定するため、試料またはＴＦＰＩ標準物質が、まずアッセイ緩衝液で希釈される。次いで、正常ヒト血漿が添加される。凝固反応は、トロンボプラスチン試薬の添加により開始される。次いで、機器が凝固時間を記録する。直線のＴＦＰＩ標準曲線は、凝固時間の対数ｖｓ．ＴＦＰＩ濃度の対数のプロットから得られる。標準曲線は、１００％純粋な標準物質と同等なＴＦＰＩ濃度と一致するように、ＴＦＰＩ標準の純度を基に調整される。例えば、標準物質が、生化学的に９７％純粋な（すなわち、ＴＦＰＩの生物学的活性を伴わない分子種を３重量％含有する）ａｌａ−ＴＦＰＩ製剤である場合、標準物質の各希釈物濃度に０．９７を乗じてＴＦＰＩの実際の濃度が得られる。故に、９７％純粋な製剤１ｍｌあたりの実際の重量に対して１．０μｇ／ｍｌであるＴＦＰＩ標準物質は、１．０×０．９７、すなわち０．９７μｇ／ｍｌの濃度と等しくなり、この濃度で処理される。
ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログの入手
本発明の方法において使用されるＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログは、細胞もしくは組織から単離および精製、化学的に合成、または原核生物細胞もしくは真核生物細胞のいずれかにおいて組換え生成することができる。
【００４３】
ＴＦＰＩは、いくつかの方法により単離されうる。例えば、ＴＦＰＩを分泌する細胞には、老化内皮細胞、約３〜４日間ＴＮＦで処理された幼若内皮細胞、肝細胞、および肝細胞癌細胞が含まれる。ＴＦＰＩは、Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、１９９０年、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５、１６７８６〜９３頁、Ｎｏｖｏｔｎｙら、１９８９年、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４、１８８３２〜３７頁、Ｎｏｖｏｔｎｙら、１９９１年、Ｂｌｏｏｄ ７８、３９４〜４００頁、Ｗｕｎら、１９９０年、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５、１６０９６〜１０１頁、およびＢｒｏｚｅら、１９８７年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４、１８８６〜９０頁のクロマトグラフィー法を含む、従来の方法により精製されうる。ＴＦＰＩは、血流中に現れ、血液から精製されうる。Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、１９９０年を参照のこと。
【００４４】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ変異体は、固相法を用いる直接ペプチド合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５、２１４９〜２１５４頁、１９６３年；Ｒｏｂｅｒｇｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９、２０２〜２０４頁、１９９５年）など、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ変異体のアミノ酸配列を合成するための化学的方法により生成されうる。タンパク質合成は、手動法または自動化により実施されうる。自動化合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）により実現されうる。場合により、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩ変異体のフラグメントは、完全長の分子を生成するための化学的方法により別個に合成、結合されうる。
【００４５】
ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログは、米国特許第４，９６６，８５２号に示されているように組換え的に生成されうる。例えば、所望されるタンパク質のためのｃＤＮＡは、原核生物または真核生物における発現のためプラスミドに組込まれうる。米国特許第４，８４７，２０１号は、特定のＤＮＡ配列による微生物の形質転換、およびこれらの発現について詳細を提供している。微生物を用いたタンパク質の発現について詳細を提供する、当業者に公知の他の参考文献が多数存在する。Ｍａｎｉａｔａｓら、１９８２年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓなど、これらの多くは、米国特許第４，８４７，２０１号に引用されている。
【００４６】
微生物を形質転換し、これらを使用してＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログを発現するための、さまざまな方法が利用可能である。以下は、可能なアプローチの単なる例である。ＴＦＰＩ ＤＮＡ配列は、単離され、適切な制御配列に結合されなければならない。ＴＦＰＩ ＤＮＡ配列は、米国特許第４，９６６，８５２号に示されており、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍなどの企業から市販されているｐＵＮＣ１３またはｐＢＲ３８２２といったプラスミドに組込まれうる。ＴＦＰＩ ＤＮＡはベクターにひとたび挿入されると、適切な宿主の中にクローン化されうる。ＤＮＡは、Ｍｕｌｌｉｓに対する米国特許第４，６８３，２０２号およびＭｕｌｌｉｓらに対する米国特許第４，６８３，１９５号に示されているものなどの方法により増幅されうる。ＴＦＰＩ ｃＤＮＡは、肝細胞癌細胞（ＨｅｐＧ２およびＳＫＨｅｐなど）のような細胞を誘導してＴＦＰＩ ｍＲＮＡを作製し、次いでｍＲＮＡを同定および単離し、これを逆転写してＴＦＰＩに対するｃＤＮＡを得ることで得られうる。発現ベクターが、Ｅ．ｃｏｌｉなどの宿主の中に形質転換された後、この細菌は発酵され、タンパク質が発現されうる。細菌は、好ましい原核微生物であり、Ｅ．ｃｏｌｉは、特に好ましい。本発明で有用な好ましい微生物は、Ｂｕｄａｐｅｓｔ条約の規定の下、１９８４年２月１４日にＡＴＣＣに寄託された、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２、ＭＭ２９４株（アクセッション番号３９６０７）である。
【００４７】
当然のことながら、多細胞生物由来の真核生物宿主細胞培養物においてポリペプチドをコードする遺伝子を発現することも可能である。例えば、Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ、１９７３年、ＣｒｕｚおよびＰａｔｔｅｒｓｏｎ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照のこと。有用な哺乳類細胞系には、マウス骨髄腫Ｎ５１、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ，Ｃ１２７、Ｈｅｐ Ｇ２、およびＳＫ Ｈｅｐが含まれる。ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログは、バキュロウイルス感染昆虫細胞においても発現されうる（上記に対する参照として、米国特許第４，８４７，２０１号も参照のこと）。Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、１９９０年、Ｊ．ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６５：１６７８６〜１６７９３頁も参照のこと。真核生物細胞に対する発現ベクターには、通常、哺乳類細胞に適合するプロモーターおよび制御配列（例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来の、一般に使用される初期プロモーターおよび後期プロモーター（Ｆｉｅｒｓら、１９７８年、Ｎａｔｕｒｅ、２７３：１１３頁）など）、または他のウイルスプロモーター（ポリオーマ、アデノウイルス２、ウシパピローマウイルス、またはトリ肉腫ウイルス由来のものなど）、または免疫グロブリンプロモーターおよび熱ショックプロモーターが含まれる。
【００４８】
哺乳類細胞宿主系の形質転換の一般的側面は、Ａｘｅｌ、米国特許第４，３９９，２１６号により記載されている。今では、「エンハンサー」領域が、発現を最適化するうえで重要であるようにも思われる。これらは、一般に、プロモーター領域の上流に見出される配列である。複製起点は、必要な場合、ウイルス源から得られうる。しかし、染色体への組み込みは、真核生物におけるＤＮＡ複製の共通の機構である。植物細胞も今では宿主として利用可能であり、ノパリンシンターゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列など（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ，Ａら、１９８２年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．、１：５６１頁）などの、植物細胞と適合する制御配列が入手可能である。植物細胞の形質転換のための方法およびベクターは、ＷＯ８５／０４８９９に開示されている。
【００４９】
哺乳類細胞で発現されるＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログの精製に使用されうる方法には、ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＭｏｎｏＱ、ＭｏｎｏＳ、および逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーの連続適用が含まれる。Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、上記参照；Ｎｏｖｏｔｎｙら、１９８９年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１８８３２〜１８８３７頁；Ｎｏｖｏｔｎｙら、１９９１年、Ｂｌｏｏｄ、７８：３９４〜４００頁；Ｗｕｎら、１９９０年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１６０９６〜１６１０１頁；Ｂｒｏｚｅら、１９８７年、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、８４：１８８６〜１８９０頁；米国特許第５，１０６，８３３号；および米国特許第５，４６６，７８３号を参照のこと。これらの参考文献は、哺乳類により産生されたＴＦＰＩを精製するさまざまな方法を記載している。
【００５０】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子を調製する好ましい方法は、ＷＯ０５／０１９２６５に開示されている。この方法は、製剤の約１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、または０．５％未満が、「修飾された種」からなる、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子製剤を生成する。「修飾された種」には、以下の１つまたは複数が含まれる：逆相クロマトグラフィーにより検出される、酸化ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子；カチオン交換クロマトグラフィーで検出される、カルバミル化ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子；Ｐｒｏｍｅｇａ ＩＳＯＱＵＡＮＴ（登録商標）キットで検出される、脱アミド化ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子；アミノ酸分析で決定される、システイン付加物を含むＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子；サイズ除外クロマトグラフィーで検出される、凝集したＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子；および非変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で検出される、誤って折り畳まれたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子。ＷＯ０５／０１９２６５に開示された方法を用いて、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約９％未満が酸化され、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約３％未満がカルバミル化され、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約９％未満が脱アミド化され、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約２％未満がシステイン付加物を含み、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約３％未満が凝集され、およびＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約３％未満が誤って折り畳まれる、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子製剤は生成されうる。
【００５１】
ＴＦＰＩはまた、マウスＣ１２７細胞（Ｄａｙら、Ｂｌｏｏｄ ７６、１５３８〜４５頁、１９９０年）、ベビーハムスター腎細胞（Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、１９９０年）、チャイニーズハムスター卵巣細胞、およびヒトＳＫ肝癌細胞など、哺乳類細胞宿主を用いて組換えグリコシル化タンパク質として発現されうる。Ｃ１２７ ＴＦＰＩは、動物試験で使用され、ウサギにおける組織因子誘導性血管内凝固の阻害（Ｄａｙら（上記参照））、イヌにおける血栓溶解後の動脈再閉塞の予防（Ｈａｓｋｅｌら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８４：８２１〜８２７頁（１９９１年））、およびヒヒにおけるＥ．ｃｏｌｉ敗血症モデルでの死亡率減少（Ｃｒｅａｓｅｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２８５０頁（１９９３年））において有効であることが示された。ａｌａ−ＴＦＰＩは、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞により、組換え非グリコシル化タンパク質として発現されうる。Ｅ．ｃｏｌｉで産生される組換えタンパク質のインビトロでの再折り畳みにより、高活性なａｌａ−ＴＦＰＩを産生する方法が記載されている。ＷＯ９６／４０７８４を参照のこと。
【００５２】
ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログはまた、細菌または酵母において産生され、続いて精製されうる。一般に、米国特許第５，２１２，０９１号；第６，０６３，７６４号；および第６，１０３，５００号またはＷＯ９６／４０７８４に示された手順が使用されうる。ａｌａ−ＴＦＰＩおよび他のＴＦＰＩアナログは、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ９６／４０７８４およびＧｕｓｔａｆｓｏｎら、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｐｕｒ．５：２３３頁（１９９４年）に従って、精製され、可溶化され、再折り畳みされうる。例えば、ＷＯ９６／４０７８４の実施例９に従って調製される場合、成熟した、適切に折り畳まれた、生物学的に活性なａｌａ−ＴＦＰＩとして、総タンパク質の約８５重量％から９０重量％を含有し、この約１０％から１５％が、１つまたは複数の酸化メチオニン残基を有するａｌａ−ＴＦＰＩ製剤が得られうる。これらの酸化型は、プロトロンビンアッセイにより決定される、非誘導化ａｌａ−ＴＦＰＩの生物学的活性と同等の生物学的活性を有し、本明細書に開示された本発明において活性であることが予測される。残留物質は、二量体化型、凝集化型、およびアセチル化型を含め、ａｌａ−ＴＦＰＩのさまざまな修飾型を含む。
【００５３】
ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログは、かなりの数のシステイン残基を有することができ、米国特許第４，９２９，７００号に示された手順は、ＴＦＰＩ再折り畳みに関する。ＴＦＰＩおよびアナログは、上述されたものなど、さまざまなクロマトグラフィー法により緩衝溶液から精製されうる。所望の場合、米国特許第４，９２９，７００号に示された方法が使用されうる。ヒトへの投与に適した精製度および活性レベルをもたらすＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログを精製する、いずれかの方法が使用されうる。
治療方法および組成物
ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログは、重症細菌感染を発症するリスクのある患者、もしくは重症細菌感染と診断された患者を治療する、または１人の患者もしくは１つの患者群における重症細菌感染からの死亡リスクを減少させるのに有用である。
【００５４】
重症細菌感染には、例えば、米国胸部学会により示されたガイドラインに従って定義された「重症肺炎」が含まれる。具体的には、重症肺炎は、肺炎の診断および、ａ）２つの主要な基準のうち１つ、ｂ）３つの小基準のうち２つ、またはｃ）英国胸部学会の４つの基準のうち２つ（Ｔｈｏｒａｘ ２００１年；５６［補遺ＩＶ］：１〜６４頁）のいずれかの存在を必要とする。主要な基準は、１）機械換気の必要性および２）敗血症性ショックまたは＞４時間の昇圧の必要性である。小基準は、１）収縮期血圧≦９０ｍｍＨｇ、２）多葉性肺炎、および３）低酸素血症基準（ＰａＯ２／ＦｉＯ２）＜２５０である。英国胸部学会の基準は、１）呼吸数≧３０回／分、２）拡張期血圧≦６０ｍｍＨｇ、３）血中尿素窒素（ＢＵＮ）＞７．０ｍＭ（＞１９．６ｍｇ／ｄＬ）、および４）錯乱である。当技術分野において理解されるように、低酸素血症基準（ＰａＯ２／ＦｉＯ２）とは、吸入酸素画分に対する動脈酸素の分圧を言い、ガス交換の障害のレベルを示す。
【００５５】
重症肺炎患者は、当技術分野で公知のいずれかの手段により実証可能な感染を有する。これらの方法には、例えば、ＧＲＡＭ染色、培養、組織化学染色、免疫化学アッセイ、または核酸アッセイによる、血液または他の通常滅菌した体液もしくは組織の培養物中の病原体の検出が含まれるが、これらに限定されない。実証可能な感染はまた、全身性抗感染療法の根拠となる肺炎の診断、およびいずれかの感染の臨床症状（呼吸数≧３０回／分またはＰａＣＯ２／ＦｉＯ２＜２５０、血圧の低下、および体温の上昇を含むが、これらに限定されない）と一致する胸部Ｘ線写真によっても照明されうる。
ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログの製剤
ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログの製剤は、好ましくは静脈内注入により投与される。基本的に連続静脈内注入が好ましい。この投与を実現するための方法は、当技術分野の当業者に公知である。注入は、中心系または末梢系を介して実施されうる。投与速度の大きな変動は避けられるべきであるが、本発明の投与速度からの短期的な偏差は、許容されうる。ただし、その結果得られる、投与されたＴＦＰＩの血漿レベルは、本発明の好ましい実施形態による一定の投与速度での連続注入から予測されるレベルの２０％以内とする。
【００５６】
患者へ投与する前に、製剤化剤は、ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログに添加されうる。液体製剤が好ましい。ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログは、さまざまな製剤化剤を用いて、さまざまな濃度で、ならびにＴＦＰＩタンパク質の投与経路、溶解度、および安定性に適合する生理学的に適切な任意のｐＨで調製されうる。静脈内注入のための好ましい製剤には、最大約０．６ｍｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩ、最大３００ｍＭの塩酸アルギニン、およびｐＨ５．０〜６．０のクエン酸ナトリウム緩衝液が含まれる。アルギニン、ＮａＣｌ、スクロース、およびマンニトールなどの特定の溶質は、ａｌａ−ＴＦＰＩを可溶化、および／または安定化するのに役立つ。ＷＯ９６／４０７８４を参照のこと。
【００５７】
薬学的製剤には、例えば、０．０１から１．０ｍｇ／ｍｌ、０．０１から０．８ｍｇ／ｍｌ、０．０１から０．５ｍｇ／ｍｌ、０．０１から０．３ｍｇ／ｍｌ、０．０１から０．２ｍｇ／ｍｌ、または０．０１から０．１ｍｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩ；１５０〜４５０ｍＭ、１５０〜４００ｍＭ、１５０〜３５０ｍＭ、または１５０〜３００ｍＭのＬ−アルギニン；０．１〜５０ｍＭ、０．１〜４０ｍＭ、０．１〜３０ｍＭ、０．１〜２５ｍＭ、０．１〜１５ｍＭ、０．１〜１０ｍＭ、または０．１〜５ｍＭのＬ−メチオニン；５〜５０ｍＭ、５〜４５ｍＭ、５〜４０ｍＭ、５〜３５ｍＭ、５〜３０ｍＭ、５〜２５ｍＭ、または５〜２０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液が含まれうる。製剤のｐＨは、５．０〜６、５．０〜５．８、５．０〜５．７、５．０〜５．６、または５．０〜５．５の範囲でありうる。好ましい薬学的製剤には、３００ｍＭ（±１５、１０、または５％）のＬ−アルギニン、５ｍＭ（±１５、１０、または５％）のＬ−メチオニン、２０ｍＭ（±１５、１０、または５％）のクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５（±１５、１０、または５％）、オスモル濃度５６０＋／−１１０ｍＯｓｍ／ｋｇ（±１５、１０、または５％））中の、０．１５ｍｇ／ｍｌ（±１５、１０、または５％）または０．４５ｍｇ／ｍｌ（±１５、１０、または５％）の組換えａｌａ−ＴＦＰＩが含まれる。
【００５８】
静脈内注入のための特に好ましい製剤は、約０．１５ｍｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩ、３００ｍＭの塩酸アルギニン、および２０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を含有する。ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログはまた、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび２０ｍＭのリン酸ナトリウムまたは別の緩衝液（ｐＨ５．５〜７．２）中で、場合によっては０．００５％または０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）と共に、最大約０．１５ｍｇ／ｍｌの濃度でも調製されうる。他の製剤は、１５０ｍＭのＮａＣｌ、８％（ｗ／ｖ）スクロース、または４．５％（ｗ／ｖ）マンニトールのいずれかを含有する、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）中に、最大約０．５ｍｇ／ｍｌＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを含有する。ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログはまた、高塩を用いて、最大数ｍｇ／ｍｌのより高い濃度でも調製されうる。例えば、１つの製剤は、５００ｍＭのＮａＣｌおよび２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中に、最大約６．７ｍｇ／ｍｌのａｌａ−ＴＦＰＩを含有する。
【００５９】
ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログのための製剤化剤のさらなる例には、油、ポリマー、ビタミン、炭水化物、アミノ酸、塩、緩衝剤、アルブミン、界面活性剤、または充填剤が含まれる。好ましくは、炭水化物には、単糖類、二糖類、もしくは多糖類、または水溶性グルカンなどの糖類または糖アルコールが含まれる。糖類またはグルカンには、フルクトース、デキストロース、ラクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、アルファおよびベータシクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、ならびにカルボキシメチルセルロース、またはこれらの混合物が含まれる。スクロースが最も好ましい。糖アルコールは、−ＯＨ基を有するＣ４からＣ８の炭化水素として定義され、ガラクチトール、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、グリセロール、およびアラビトールが含まれる。マンニトールが最も好ましい。上述のこれらの糖または糖アルコールは、個別にまたは組み合わせて用いられうる。糖または糖アルコールが、水性製剤中で可溶である限り、使用される量に定められた限度はない。好ましくは、糖または糖アルコール濃度は、１．０ｗ／ｖ％と７．０ｗ／ｖ％との間であり、より好ましくは、２．０と６．０ｗ／ｖ％との間である。
【００６０】
好ましくは、アミノ酸には、左旋性（Ｌ）型のカルニチン、アルギニン、およびベタインが含まれるが、他のアミノ酸も加えられうる。凍結乾燥前または再構成後の溶液におけるｐＨ変化を最小化するため、組成物中に緩衝液を使用することもまた好ましい。ほとんどのいずれの生理緩衝液も用いられうるが、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、およびグルタミン酸緩衝液、またはこれらの混合物が好ましい。好ましくは、緩衝液の濃度は、０．０１から０．３モルである。製剤に添加されうる界面活性剤は、ＥＰ２７０，７９９およびＥＰ２６８，１１０に示されている。
【００６１】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの液体の医薬組成物は、調製された後、分解を防止し無菌性を保存するため、凍結乾燥されうる。液体組成物を凍結乾燥する方法は、当業者に公知である。使用する直前に、組成物は、付加成分を含みうる滅菌希釈剤（例えば、リンゲル液、蒸留水、または無菌生理食塩水）で再構成されうる。再構成されると、組成物は、好ましくは、連続静脈内注入により被験体に投与される。
ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログの投与量
ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログは、重症肺炎を含む重症細菌感染を治療および予防するのに治療的に有効な濃度で投与される。このような投与はまた、他の急性または慢性炎症、および一般に、サイトカインが組織因子発現をアップレギュレートする疾患についても有効である。この目的を達成するため、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログは、好ましくは静脈内投与される。この投与を実現する方法は、当業者に公知である。一般に、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログは、１ｍｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇとの間、より好ましくは、２ｍｇ／ｋｇと１５ｍｇ／ｋｇとの間、最も好ましくは、２と１０ｍｇ／ｋｇとの間の投与量で与えられる。
【００６２】
上記の投与量は、一般に、単回投与または分割投与において宿主に投与される合計日用量が、例えば、１日あたり約２から約１５ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約４から約１０ｍｇ／ｋｇの量でありうるように、少なくとも約１日、および通常は数日間にわたって投与される。投与単位組成物は、日用量を構成するような量またはこの約数を含有しうる。低い日用量（例えば、１μｇ／ｋｇから２ｍｇ／ｋｇ）は、予防目的または他の目的に有用でありうる。単回投与形態を作製するため、キャリア物質と併用されうる活性成分の量は、治療される患者および投与の特定様式により異なるであろう。
【００６３】
投与レジメンは、患者のタイプ、年齢、体重、性別、食事および病状、疾患の重症度、投与経路、薬理学的検討（活性、有効性、薬物動態プロフィールおよび毒性プロフィールなど）、薬物送達系が利用されるか否か、ならびにこの化合物が複合薬の一部として投与されるか否かを含む、さまざまな要因により選択される。故に、実際に使用される投与レジメンは、広く異なる可能性があり、したがって、上述された好ましい投与レジメンから逸脱する可能性がある。好ましくは、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの投与は、約０．６６ｍｇ／ｋｇ／時間のａｌａ−ＴＦＰＩの投与速度に等しい投与速度を超えるべきではない。投与速度に加えて、ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログの注入期間は、患者各々の臨床的重症度に依存するであろうが、適切な期間の決定は、通常の臨床医には十分に公知である。注入は、例えば、１０〜２００時間、１０〜１５０時間、２４〜１２０時間、３６〜１００時間または２４〜９６時間の間、実施されうる。１つまたは複数の治療コース、典型的には２つが、治療担当医師の判断により、実施されうる。
ＴＦＰＩ投与量の投与
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、少なくとも約０．０００２５ｍｇ／ｋｇ／時間（０．００４１７μｇ／ｋｇ／分）および約０．５０ｍｇ／ｋｇ／時間（８．３３μｇ／ｋｇ／分）未満の投与速度でａｌａ−ＴＦＰＩを投与するのに等しい投与速度で投与される場合、重症細菌感染の治療有効性は保持され、出血などの有害な副作用は、最小限に抑えられる。有効性および安全性を併せて向上させるには、投与速度は、好ましくは、少なくとも約０．０１０ｍｇ／ｋｇ／時間（０．１６７μｇ／ｋｇ／分）および約０．１ｍｇ／ｋｇ／時間（１．６７μｇ／ｋｇ／分）未満でのａｌａ−ＴＦＰＩの投与速度に等しく、または少なくとも約０．０２０ｍｇ／ｋｇ／時間および約０．０８０ｍｇ／ｋｇ／時間未満でのａｌａ−ＴＦＰＩの投与速度に等しく、最も好ましくは、約０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間（０．４１７μｇ／ｋｇ／分）から約０．０７５ｍｇ／ｋｇ／時間（１．２５１μｇ／ｋｇ／分）のａｌａ−ＴＦＰＩの投与速度に等しい。投与経路は、一般に、静脈内投与であり、連続静脈内注入が好ましい。注入は、少なくとも約７２、９６、１００、１２０、または２４０時間にわたって投与されうる。好ましくは、連続注入は、３から８日間、より好ましくは３から６日間、最も好ましくは約４日間にわたって投与される。
【００６４】
「連続注入による」投与することは、注入が、所定の持続期間のほとんどを実質的な中断なしに、ほぼ所定の速度で維持されることを意味する。あるいは、間欠的静脈内注入が使用されうる。間欠的注入が使用される場合、上述された連続注入のための投与速度に等しい時間平均投与速度が、使用されるべきである。さらに、間欠的注入プログラムは、連続注入により得られる最大濃度を、多くとも約２０％上回る最大血清濃度をもたらさなければならない。患者における有害反応、特に出血を含む副作用を回避するため、投与速度は、約０．１ｍｇ／ｋｇ／時間でのａｌａ−ＴＦＰＩの連続静脈内注入に等しい投与速度未満であるべきである。
【００６５】
投与速度および合計用量を含む、本明細書に記載された全ての用量は、タンパク質濃度およびプロトロンビンアッセイによる生物学的活性の判定における誤差のため、実際には最大１０％の差異が生じる。故に、本明細書に記載された用量より最大１０％高い、または最大１０％低い実際に投与される任意の用量は、記載された用量に等しいとみなされる。この理由のために、全ての用量は、「約」特定の用量として記載されている。例えば、「約０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間」と記載された用量は、０．０２２５から０．０２７５ｍｇ／ｋｇ／時間の範囲にある任意の実用量に等しいとみなされる。
【００６６】
好ましい投与レジメンには、３００ｍＭのＬ−アルギニン、５ｍＭのＬ−メチオニン、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５、オスモル濃度５６０＋／−１１０ｍＯｓｍ／ｋｇ）中の、０．１５ｍｇ／ｍｌまたは０．４５ｍｇ／ｍｌの組換えａｌａ−ＴＦＰＩが各１００ｍｌという、２つの静脈内投与が含まれる。
【００６７】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログのボーラス注入または短時間の高速の注入速度も、低用量のＴＦＰＩ投与が続く場合、本発明を実施するうえで使用されうる。例えば、ボーラス注入または高速の注入速度は、患者の血液循環における投与されたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの平衡時間を減少させるのに使用されうる。こうすることで、最終定常状態のＴＦＰＩ血漿レベルはより迅速に達成され、ＴＦＰＩ受容体はより迅速に飽和されうる。ａｌａ−ＴＦＰＩを約０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間で２時間ヒトへ投与することは、ＴＦＰＩ（加えてａｌａ−ＴＦＰＩ）の血漿レベルを約８０ｎｇ／ｍｌから約１２５ｎｇ／ｍｌに増加させる、すなわち約５０％増加させる。注入速度が上昇される、またはボーラス注入が使用される場合、同じレベルがより迅速に達成されるであろう。定常状態が得られるまで注入が続けられる場合、より高速の注入速度は、より高いレベルをもたらすであろう。重症細菌感染に罹患した患者では、約０．０５０ｍｇ／ｋｇ／時間でのａｌａ−ＴＦＰＩの投与に対する定常状態レベルは、約３００ｎｇ／ｍｌであり、約０．３３ｍｇ／ｋｇ／時間または約０．６６ｍｇ／ｋｇ／時間でのａｌａ−ＴＦＰＩの投与に対しては、少なくとも約２μｇ／ｍｌであることが見出された。
【００６８】
単回連続注入量または分割注入量で宿主に投与される合計日用量は、例えば、少なくとも約０．００６ｍｇ／ｋｇ／日から約１．２ｍｇ／ｋｇ／日未満のａｌａ−ＴＦＰＩの投与に等しい、より通常は、約０．２４ｍｇ／ｋｇ／日から約１．２ｍｇ／ｋｇ／日未満のａｌａ−ＴＦＰＩの投与に等しい、好ましくは約０．６ｍｇ／ｋｇ／日のａｌａ−ＴＦＰＩに等しい量であってよい。この範囲内のより低い量は、予防目的または他の目的に有用でありうる。本発明の投与プロトコルは、患者に投与される合計用量としても表されうる。合計用量は、注入速度と合計注入時間との数学的な積である。例えば、ａｌａ−ＴＦＰＩに対する好ましい投与速度（約０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間）および好ましい注入時間（９６時間）では、合計用量は、体重１ｋｇあたり約２．４ｍｇのａｌａ−ＴＦＰＩである。本発明により投与されるＴＦＰＩの合計用量は、少なくとも約０．７５μｇ／ｋｇおよび約４．８ｍｇ／ｋｇ未満のａｌａ−ＴＦＰＩに等しい。好ましくは、合計用量は、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇおよび約４．８ｍｇ／ｋｇ未満のａｌａ−ＴＦＰＩに等しい。より好ましくは、合計用量は、約２．４ｍｇ／ｋｇのａｌａ−ＴＦＰＩに等しい。
【００６９】
ｍｇ／ｋｇ／時間ベースの投与速度および合計日用量を含む、上述の投与レジメンは、「参照ａｌａ−ＴＦＰＩの投与に等しい」投与量として表される。これは、「参照ａｌａ−ＴＦＰＩ」の投与量に対する正規化により定量的に決定されることを意味する。参照ａｌａ−ＴＦＰＩは、成熟した、１００％純粋な（タンパク質ベースで）、適切に折り畳まれた、生物学的に活性な、非グリコシル化ａｌａ−ＴＦＰＩとして定義される。ａｌａ−ＴＦＰＩは、アミノ酸配列が配列番号２に示されたＴＦＰＩアナログである。成熟した、完全長のＴＦＰＩおよびこのアナログを含め、ＴＦＰＩの他の形態もまた、本発明において使用されうる。ａｌａ−ＴＦＰＩ以外のＴＦＰＩ形態、および１００％未満の純度であるａｌａ−ＴＦＰＩまたは別のＴＦＰＩアナログの製剤により、本発明を実施するのに適切な用量範囲を決定するため、参照ａｌａ−ＴＦＰＩについて本明細書に記載された用量範囲は、ＴＦＰＩの特定形態の内因的な生物学的活性を基に調整することができ、さらに製剤の生化学的純度を基に調整することができる。
【００７０】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの内因的な生物学的活性とは、プロトロンビンアッセイにより定義される、成熟した、１００％純粋な、適切に折り畳まれたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの特定の活性を言う。故に、同等の投与量は、（参照ａｌａ−ＴＦＰＩ投与量）／（（相対的内因性活性）×（生化学的純度））として算出される。ここで、相対的内因性活性とは、（アナログの内因活性）／（参照ａｌａ−ＴＦＰＩの内因性活性）を言う。例えば、特定のＴＦＰＩアナログが、参照ａｌａ−ＴＦＰＩの８０％の内因性生物学的活性を有する場合、特定のＴＦＰＩアナログに対する同等の投与量は、参照ａｌａ−ＴＦＰＩの用量値を０．８で除して得られる。さらに、患者に投与される製剤が、例えば、９０％しか生化学的に純粋でない（すなわち、ＴＦＰＩの生物学的活性を欠く、１０％の分子種を含む）場合、ａｌａ−ＴＦＰＩに対する参照用量値のさらなる補正は、この用量値を０．９で除して行われる。故に、ａｌａ−ＴＦＰＩの内因性活性の８０％を有し、生化学的に９０％純粋な仮のＴＦＰＩアナログが投与された場合、参照ａｌａ−ＴＦＰＩを０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間で投与するのに等しい投与速度は、０．０３４７ｍｇ／ｋｇ／時間（すなわち、０．０２５／（０．８×０．９））となる。
【００７１】
同等の投与量はまた、内因性活性または生化学的純度のいずれも知ることなく、相対的な生物学的活性を測定して決定されることもできる。相対的な生物学的活性は、プロトロンビン時間アッセイを用いて、特定のＴＦＰＩアナログとＴＦＰＩ生物学的活性標準との比較により決定されうる。例えば、ＷＯ９６／４０７８４の実施例９の方法により生成されたａｌａ−ＴＦＰＩ（約８５％生物学的に活性なＴＦＰＩ分子種を含有する）は、ＴＦＰＩ生物学的活性標準として使用されうる。ＷＯ９６／４０７８４の実施例９の方法により生成されたａｌａ−ＴＦＰＩは、プロトロンビンアッセイでは参照ａｌａ−ＴＦＰＩの約８５％の活性を有する。プロトロンビン時間標準曲線をプロットする際、凝固時間の対数は、ＴＦＰＩ濃度の対数に対してプロットされる。ＴＦＰＩ生物学的活性標準が、参照ａｌａ−ＴＦＰＩの活性の８５％を保有する場合、プロットされた活性が１００％純粋な参照ａｌａ−ＴＦＰＩの活性に等しくなるように、ＴＦＰＩ生物学的活性標準の濃度を、プロット前に０．８５で乗じれば、参照ａｌａ−ＴＦＰＩの標準曲線に等しい標準曲線が作成されうる。特定のＴＦＰＩアナログの凝固時間が、標準曲線と比較される場合、参照ａｌａ−ＴＦＰＩの同等の濃度は、この曲線から読み取られうる。
【００７２】
あるいは、標準曲線の直線部分の傾斜が直線回帰分析により得られる場合、この傾斜は、参照ａｌａ−ＴＦＰＩと比較したＴＦＰＩ生物学的活性標準の活性を基に補正されうる。特定のＴＦＰＩアナログの相対的生物学的活性は、故に、アナログ活性に対する参照ａｌａ−ＴＦＰＩ活性の比に等しい。例えば、特定のアナログが、１．００μｇの参照ａｌａ−ＴＦＰＩと同じプロトロンビン時間活性を生じるために１．４３μｇを必要とする場合、このアナログの相対的な生物学的活性は、１．００／１．４３、すなわち０．７である。このアナログでは、参照ａｌａ−ＴＦＰＩ投与量に等しい投与量は、参照ａｌａ−ＴＦＰＩ投与量をこのアナログの相対的な生物学的活性で除して得られる。例えば、参照ａｌａ−ＴＦＰＩの０．０２５ｍｇ／ｋｇ／時間の投与量は、このアナログの０．０３５７ｍｇ／ｋｇ／時間（すなわち、０．０２５／０．７）に等しくなる。
【００７３】
いくつかの実施形態では、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログは、過去にヘパリン治療を受けていた患者に投与される。この場合、患者は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ投与前の少なくとも８時間はヘパリンを投与されていないことが好ましい。非分画ヘパリンによる治療は、より長い「洗い出し」（ウォッシュアウト）期間（例えば、２０、２１、２２、２３、または２４時間）を必要としうる。低分子量のヘパリンで治療された患者に対する典型的なウォッシュアウト期間は、９、１０、１１、または１２時間である。
【００７４】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログは、単独の活性抗凝固薬剤として投与されうるが、これらの分子はまた、重症肺炎を治療するための併用療法を実現するため、１つまたは複数のさらなる治療剤と併用して使用されることもできる。このようなさらなる治療剤には、例えば、抗エンドトキシン、モノクローナル抗体（例えば、エンドトキシン結合Ｍａｂ）、および抗ＴＮＦマウスＭａｂのような抗ＴＮＦ生成物などの抗体が含まれる。ＴＦＰＩおよびＴＦＰＩアナログはまた、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト、殺菌性／透過性亢進（ＢＰＩ）タンパク質、免疫賦活剤、ＰＡＦアンタゴニストなどの抗炎症活性を有する化合物、および細胞接着ブロッカー（例えば、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａインヒビターなどの抗血小板剤）と併用されることもできる。
【００７５】
ＡＰＡＣＨＥＩＩスコアが３８未満であるが２５を超える（例えば、２５と３７の間、すなわち、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、または３７）患者は、さらに活性化タンパク質Ｃ（例えば、ＸＩＧＲＩＳ（登録商標））で治療されうる。活性化タンパク質Ｃは典型的には、合計９６時間、２４μｇ／ｋｇ／時間の注入速度で投与される。この投与レジメンの調整は、個々の患者の臨床所見により熟練した医師により調整されうる。
【００７６】
併用投与される場合、治療剤は、同時または異なる時間に与えられる別個の組成物として製剤されうる。好ましくは、さらなる治療剤は、同時（すなわち、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの投与期間の間）、またはＴＦＰＩもしくはＴＦＰＩアナログの投与期間の２４時間以内（すなわち、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの投与期間の開始前２４時間以内、またはＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの投与期間の開始後２４時間以内）のいずれかに与えられる。さらなる治療剤はまた、単独の組成物としてＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログと共に与えられることもできる。
【００７７】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログはまた、重症細菌感染、特に肺炎を治療するのに効果がある他の薬剤と併用して与えられることもできる。例えば、以下は、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログと併用して投与されうる：基礎疾患である細菌感染を治療しうる抗生剤、細菌の細胞壁成分に対するモノクローナル抗体、重症肺炎の経路に関与するサイトカインと複合しうる受容体；ならびに一般的には、サイトカインと相互作用しうる、または重症肺炎および／もしくはこの症状を減弱する補体タンパク質を含む、他の活性化されたもしくは増幅された生理学的経路と相互作用しうる任意の薬剤またはタンパク質。
【００７８】
有用な抗生剤には、一般的な分類のもの：ベータ−ラクタム環（ペニシリン）、グリコシド結合におけるアミノ糖（アミノグリコシド）、大環状ラクトン環（マクロライド）、ナフタセンカルボキサニド（ｎａｐｔｈａｃｅｎｅｃａｒｂｏｘａｎｉｄｅ）の多環式誘導体（テトラサイクリン）、ジクロロ酢酸のニトロベンゼン誘導体、ペプチド（バシトラシン、グラミシジン、およびポリミキシン）、共役二重結合系大環状物（ポリエン）、スルファニルアミド由来のサルファ剤（スルホンアミド）、５−ニトロ−２−フラニル基（ニトロフラン）、キノロンカルボン酸（ナリジクス酸）、および他多数、が含まれる。他の抗生剤、および上記の特定の抗生剤のより多くのバージョンは、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第３版、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｙｍｅｒ（編）、第２巻、７８２〜１０３６頁（１９７８年）および第３巻、１〜７８頁、Ｚｉｎｓｓｅｒ、ＭｉｃｒｏＢｉｏｌｏｇｙ、第１７版、Ｗ．Ｊｏｌｄｉｋら（編）２３５〜２７７頁（１９８０年）、またはＤｏｒｌａｎｄ’ｓ Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ、第２７版、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８８年）に見出されうる。
【００７９】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログと併用されうる他の薬剤には、Ｅ５５３１（リピッドＡアナログ、Ａｓａｉら、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２２：４３２頁（１９９９年）を参照のこと）などのエンドトキシンアンタゴニスト、抗凝固活性を有するＴＦアナログ（例えば、Ｋｅｌｌｅｙら、Ｂｌｏｏｄ ８９：３２１９頁（１９９７年）およびＬｅｅ ＆ Ｋｅｌｌｅｙ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：４１４９頁（１９９８年）を参照こと）、ＩＬ−６またはＭ−ＣＳＦに対するこれらのモノクローナル抗体（１９８９年１２月１５日に出願された、米国特許出願シリアル番号０７／４５１，２１８を参照のこと）などのサイトカインに対するモノクローナル抗体、およびＴＮＦに対するモノクローナル抗体（Ｃｅｒａｍｉら、米国特許第４，６０３，１０６号を参照のこと）、ＴＮＦプロホルモンが産生された細胞から成熟ＴＮＦプロホルモンを切断するタンパク質インヒビター（１９８９年８月１６日に出願された、米国特許出願シリアル番号０７／３９５，２５３を参照のこと）、ＩＬ−１アンタゴニスト（１９９０年５月１日に出願された、米国特許出願シリアル番号０７／５１７，２７６を参照のこと）、インヒビン（米国特許第５，９４２，２２０号を参照のこと）などのＩＬ−６サイトカイン発現インヒビター、およびＩＬ−１などのさまざまなサイトカインの受容体ベースのインヒビターが含まれる。補体に対する抗体、または補体のタンパク質インヒビター（ＣＲ１、ＤＡＦ、およびＭＣＰなど）も使用されうる。
【００８０】
この開示に引用されている全ての特許、特許出願、および参考文献は、これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８１】
本発明は、これより、特に有利な実施形態を示す以下の実施例を参照して説明される。しかし、これらの実施形態は例であり、本発明を限定するものとして決して解釈してはならない。
【実施例】
【００８２】
（実施例１）
材料
ＴＦＰＩのＫｕｎｉｔｚドメイン１（４９０４）またはＫｕｎｉｔｚドメイン２（４９０３）に対するモノクローナル抗体は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｉｎｃ．（グリニッチ、ＣＴ）から購入した。本発明者らは、さらなるモノクローナル抗体を作製した（Ｋｕｎｉｔｚドメイン１に対して２Ｈ８、およびＣ末端に対して１７）。対照マウスＩｇＧ１は、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ Ｉｎｃ．から購入した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（サンディエゴ、ＣＡ）から購入し、ＥＢＭ−２培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）で３７℃で培養した。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のリポ多糖類（ＬＰＳ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｌ−２６５４）から購入した。
【００８３】
以下の実施例では、外因性ＴＦＰＩは全て、ａｌａ−ＴＦＰＩである。
【００８４】
（実施例２）
全血アッセイ
血液は、抗凝固剤の非存在下、血小板活性化を最小限に抑える条件下で、健康なドナーから採取した。ドナー選択は、アスピリンまたは他の抗凝血剤、コレステロール降下剤、抗炎症剤、抗ヒスタミン剤、および抗生剤の使用を除外した。１０ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ、およびａｌａ−ＴＦＰＩを含むまたは含まないさまざまな濃度のｍＡｂを含有する試薬混合物は、９６ウェルディッシュ中で前形成されていた。血液を、採血１０分以内に、総量２００μｌの１０％ＦＢＳを含むまたは含まないＲＰＭＩ−１６４０培地に、１：１０の比まで添加した。希釈血液試料を、細胞培養インキュベータで１６から２０時間、３７℃にてインキュベートし、細胞上清のアリコートは、ＩＬ−６ ＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を用いて炎症性サイトカインの分泌について分析した。他のサイトカインの放出は、ＬＩＮＣＯＰＬＥＸ（登録商標）サイトカインキット（ＬＩＮＣＯ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて測定した。
【００８５】
（実施例３）
全血＋ＨＵＶＥＣアッセイ
ＨＵＶＥＣ細胞を、実験１日前に１０ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳを含むＥＢＭ−２培地に５０００〜７０００細胞／９６ウェルで播種した。実験１日目、この培地を除去し、１０％ＦＢＳを含むまたは含まないＲＰＭＩ−１６４０培地に、１０ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ、およびａｌａ−ＴＦＰＩを含むまたは含まないさまざまな濃度のｍＡｂを含有する、前形成された試薬混合物と交換した。次いで、血液を、１：１０の比で添加した。全血アッセイは、上述のように実施した。
【００８６】
（実施例４）
患者のベースラインＴＦＰＩは死亡率と相関する
複数の原因の重症敗血症を、ａｌａ−ＴＦＰＩで治療するための大規模第ＩＩＩ相臨床試験において、本発明者らは、明らかにａｌａ−ＴＦＰＩ治療の効果が得られる患者の大規模なサブセットを見出した。特に、本発明者らは、ＣＡＰ患者は治療成績が良好であることに気づいた。この試験で行われた分析のうち、本発明者らは、ＴＦＰＩのベースラインの血漿濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。図２に示されたように、患者のベースラインＴＦＰＩは、死亡率を相関していた。これは、患者全体またはＣＡＰサブセットのいずれにも当てはまることであった。この結果は、敗血症が悪化するにつれ、ＴＦＰＩが不活性化され、血液細胞から放出されることを示唆する。外因性ａｌａ−ＴＦＰＩは、感染中の内因性ＴＦＰＩの欠失に取って代わるものである。
【００８７】
（実施例５）
全血敗血症モデルにおけるＴＦＰＩ代謝回転およびＴＦＰＩ分解誘導のシミュレーション
本発明者らは、血清を正常な血液に添加して、敗血症血液モデルを作成した。これは、急速な凝固をもたらし、多くのサイトカインのリポ多糖類（ＬＰＳ）依存性分泌を誘導して、敗血症患者由来の血液で観察されるものと同様の状況を創出するものである。
【００８８】
ａｌａ−ＴＦＰＩが全血に添加された場合、ａｌａ−ＴＦＰＩは、Ｃ末端でインタクトなままであった。しかし、本発明者らの敗血症モデルでは、Ｃ末端ドメインを、添加されたａｌａ−ＴＦＰＩから切断した。この結果は、図３に示されている。このデータは、凝固を活性化し、血液中の炎症性サイトカインを誘導する状況は、ＴＦＰＩのＣ末端ドメインの除去をもたらすことを示している。正常血漿ＴＦＰＩの最大９５％は、Ｃ末端の欠失を有する。Ｃ末端を切断されたＴＦＰＩは、血液アッセイにおいて活性がほとんど見られない。
【００８９】
（実施例６）
添加されたａｌａ−ＴＦＰＩの、さまざまな内因性ＴＦＰＩレベルを有する患者の生存に与える影響
添加されたａｌａ−ＴＦＰＩは、ベースラインＴＦＰＩが異常な患者において効果があると思われる（図４）。ＣＡＰ患者が、ベースラインのＴＦＰＩレベル別にサブセットに分類された場合、本発明者らは、ａｌａ−ＴＦＰＩが、正常なベースラインＴＦＰＩより下の患者、およびベースラインＴＦＰＩの高い患者において効果があることを見出した。添加されたａｌａ−ＴＦＰＩが、ベースラインＴＦＰＩの高い患者を改善したという事実は、血漿ＴＦＰＩは不活性であり、ａｌａ−ＴＦＰＩ剤が、十分に活性型であることを示すデータと一致する。
【００９０】
（実施例７）
本発明者らは、健康なドナー由来の希釈された全血におけるＴＦＰＩ活性を調べた。本発明者らは、いくつかの活性は、ＴＦＰＩが、炎症性サイトカインを介して抗菌活性を制御するシグナル伝達複合体の一部であることと一致すると考えている。正常血液中の炎症性サイトカインレベルは、きわめて低く、外因性ａｌａ−ＴＦＰＩが添加された場合も低いままであった（図５）。予測された通り、ＬＰＳの正常血液への添加は、ＩＬ−６、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αを含む炎症性サイトカインレベルを上昇させた。この反応は、血漿ＴＦＰＩ濃度に感受性であり、機能的ＴＦＰＩのいずれの欠失も、この反応を低下させるであろう。
【００９１】
意外にも、ＬＰＳもまた、添加されたａｌａ−ＴＦＰＩが、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、およびＴＮＦ−αを誘導するように、ＴＦＰＩに対し血液を感作した（図６、７Ａ）。ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの増加は全て、少量の抗ＴＦＰＩにより覆された（図７Ｂ）。このサイトカインのスペクトルは、マクロファージの活性化と関連して、これらの抗菌活性を増加させる。
【００９２】
細胞免疫学における現在の理解では、細胞性免疫は、ＴＨ１細胞により媒介される。ＴＨ１細胞の活性化は、関連するＴ細胞の抗原認識およびクローン性増殖という、１週間を要するプロセスを必要とする。ａｌａ−ＴＦＰＩによる誘導が数時間後に生じたが、これは、活性化のこの形態が、適応免疫系が十分に関与する前に、感染の臨床初期段階において重要な役割を果たしうることを示唆するものである。
【００９３】
これらの結果は、ＴＦＰＩは、凝固カスケードにおけるプロテアーゼインヒビターではなく、シグナル伝達カスケードにおけるリガンドとして機能しているように思われることを示す。
【００９４】
（実施例８）
最近の文献は、ＴＦＰＩとこの受容体との相互作用に不可欠なドメインとして、Ｋｕｎｉｔｚドメイン３（Ｋ３）を挙げているが、Ｋ３は、凝固阻害に関しては重要でないと思われる。Ｐｉｒｏ＆Ｂｒｏｚｅ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００４年１２月７日；１１０（２３）：３５６７〜７２頁。全血アッセイにより、本発明者らは、ＴＦＰＩがサイトカインを誘導するのに必要とされるＴＦＰＩドメインをマッピングした。この結果は、図８に示されている。本発明者らは、Ｃ末端ドメインおよびＫ３の双方を欠く欠失変異体が不活性であるのに対し、Ｃ末端が欠失したＴＦＰＩは、依然として活性を有することを見出した。これらのデータは、Ｋ３を介して受容体に固定されるＴＦＰＩの、提案されたシグナル伝達活性と一致する。
【００９５】
（実施例９）
上述の通り、ＬＰＳ含有血液への血清の添加は、サイトカインのスペクトル（これらには、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０が含まれるが、ＩＦＮ−γは含まれない）を誘導する。この回収物は、活性化されたマクロファージの産生量と一致する。外因的に添加された３から１０ｎＭのａｌａ−ＴＦＰＩは、血清に誘導されたこれらのサイトカインを阻害することができる（図７および９）。
【００９６】
（実施例１０）
ＴＦＰＩは因子Ｘａにより誘発されたＩＬ−６産生を阻害する
ＩＬ−６産生に対するＴＦＰＩの阻害活性は、Ｘａ産生を阻害するＴＦＰＩの能力を介すると思われる。図１０は、さまざまなインヒビター（インヒビターＤＥＧＲ−ＶＩＩａ、ＤＥＧＲ−ＩＸａ、およびＤＥＧＲ−Ｘａは、ＶＩＩａｉ、ＩＸａｉおよびＸａｉと記載される）の存在下、ＬＰＳおよび血清に誘発されたＩＬ−６を測定する全血アッセイの結果を示している。本発明者らが、いくつかのインヒビターを試験したとき、本発明者らは、部位不活性化ＶＩＩａが活性を持たないことを見出した。このことは、サイトカインが、組織因子（ＴＦ）媒介性の凝固活性化により誘発されたことを示している。本発明者らの予測に反して、部位不活性化ＩＸａは、ＴＦＰＩと同じくらい強力であった。このことは、サイトカイン分泌が、内因性凝固カスケードを介して誘発される因子Ｘａの形成に関与したことを示している。文献によれば、Ｘａは、トロンビンを生成するＸａの能力を介してサイトカインを誘導するはずである。これに反し、本発明者らは、部位不活性化Ｘａが作用を持たないことを見出した。
【００９７】
これらの結果は、サイトカインは、Ｘａにより直接誘発されうること、この反応型におけるＴＦＰＩは、Ｘａ産生を阻害するＴＦＰＩの能力を介して効力発揮することを示している。
【００９８】
（実施例１１）
ＴＦＰＩおよびＡＰＣ（活性化タンパク質Ｃ）は、各々がトロンビン産生を制限するため、凝固に対するきわめて類似の作用を有する（図１１）。しかし、サイトカイン誘導が、因子Ｘａに誘発される場合、これらの薬剤は、ＩＬ−６誘導に対する異なる作用を有するはずである。ＡＰＣは、因子ＶＩＩＩａの破壊によりＸａ産生を阻害するが、ＴＦによるＸａ産生に対しては作用を持たない。本発明者らの敗血症血液モデルでは、本発明者らは、この反応に少量のＴＦを添加した際、まさしくこの結果を観察した（図１２）。ＩＸａが、ＩＬ−６を誘発する反応では、本発明者らは、両方のタンパク質が、ＩＬ−６レベルに反映されるように、血清による炎症を阻害しうることを見出している。予測通り、ＡＰＣは、内因性経路により誘導されるＩＬ−６産生を阻害した。しかし、ＴＦの存在下では、ＴＦＰＩのみがＩＬ−６産生を阻害しうるであろう。
【００９９】
（実施例１２）
血液細胞は、この表面にＴＦＰＩを有することが知られている。このＴＦＰＩの活性を定量するため、本発明者らは、この機能を抗ＴＦＰＩ抗体で阻害し、サイトカインを測定した（図１３）。添加されたａｌａ−ＴＦＰＩで見られた阻害とは明らかに反対に、抗ＴＦＰＩはＩＬ−６分泌も阻害した。これらのデータは、ａｌａ−ＴＦＰＩを正常血液およびＬＰＳに添加した結果と類似する。これらのデータから、本発明者らは、ＴＦＰＩは、シグナル伝達複合体の一部であると結論づけた。
【０１００】
ＴＦ：ＶＩＩａ：Ｘａ複合体のカベオラ（ここで、複合体はＴＦＰＩと結合する）への移動モデルは、図１４に示されている。この複合体は、複合体の形成をＸａに依存する。この機構にとらわれたくはないが、本発明者らは、複合体の機能は、サイトカイン分泌を活性化し、細菌排除機構を高めることであると考える。複合体の形成はＸａに依存するため、過剰なＴＦＰＩは、抗体を中和化するのと同様に、複合体の形成を防止するであろう。
【０１０１】
このモデルに従い、プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）誘導性サイトカインの制御は、ＰＡＲ−１がアゴニストペプチドにより活性化された場合でも、因子Ｘａに依存することを見出した（図１５）。ＰＡＲ−１活性化をブロックする抗体が、ＩＬ−６分泌を阻害したことから（図１６）、ＰＡＲ−１は、本発明者らの敗血症血液モデルでは、ＩＬ−６分泌を誘導するシグナル伝達系の一部であるように思われる。ＰＡＲ−１アゴニストのさらなる添加は、ＩＬ−６分泌を増加させた。これらの活性の双方は、ＰＡＲが、炎症性サイトカイン産生に関与していることに関する文献データと一致する。ＰＡＲ活性化は、凝固カスケードの下流であるため、ＰＡＲアゴニストは、この系では優位のはずである。その代わりに本発明者らは、ＴＦＰＩは、サイトカインを制御するＸａ依存性ＴＦＰＩ複合体の本発明者らのモデルと整合して、ＰＡＲアゴニストより優位になりうることに気づく。
【０１０２】
（実施例１３）
カベオラにおけるＴＦＰＩの主要な貯蔵庫は、内皮細胞において見られる。これらの細胞は、これらの細胞の、表面ＴＦの迅速な誘導を介して血液感染の見張り役を果たすことが提案されている。上述の通り、本発明者らは、血液が、ＩＬ−６の適度なバースト放出により、ＬＰＳに反応することを見出した（図１７）。同様に、内皮細胞は、少量のサイトカインでＬＰＳに反応する。本発明者らは、血液および内皮細胞を組み合わせることが、ＬＰＳに対する相乗的反応につながることを見出した。本発明者らは、相乗的反応が、ＩＬ−６およびＩＬ−８に限定されることを見出した。これは、内皮細胞の警報システムとしての役割と一致する。
【０１０３】
今一度、この反応におけるＴＦＰＩの役割を調べるため、本発明者らは、中和化抗ＴＦＰＩ抗体を添加した（図１８）。本発明者らは、高濃度の抗ＴＦＰＩが、ＩＬ−６産生を阻害することを見出した。この阻害がＴＦＰＩによるものであることを確かめるため、本発明者らは、抗ＴＦＰＩを低濃度のａｌａ−ＴＦＰＩでプレインキュベートし、１０ｎＭのａｌａ−ＴＦＰＩが、部分的に６００ｎＭの抗ＴＦＰＩの作用を減弱させることを見出した（図１９）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重症細菌感染を発症するリスクのある患者、または重症細菌感染と診断された患者を治療する方法であって、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを、それを必要とし、以下の基準：
（ａ）血中ＩＬ−６レベルが３，２００ｐｇ／ｍｌ未満；
（ｂ）国際標準比（ＩＮＲ）が２．５未満；
（ｃ）急性生理スコア（ＡＰＳ）が２６未満；
（ｄ）Ａｃｕｔｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ａｎｄ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（ＡＰＡＣＨＥ ＩＩ）スコアが３８未満；および
（ｅ）ＭＯＤＳスコアが１８を超える
の１つまたは複数を満たす患者に投与することを含む方法。
【請求項２】
重症細菌感染による死亡リスクを低下させる方法であって、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを含む医薬組成物を、それを必要とし、以下の基準：
（ａ）血中ＩＬ−６レベルが３，２００ｐｇ／ｍｌ未満；
（ｂ）国際標準比（ＩＮＲ）が２．５未満；
（ｃ）急性生理スコア（ＡＰＳ）が２６未満；
（ｄ）Ａｃｕｔｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ａｎｄ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（ＡＰＡＣＨＥ ＩＩ）スコアが３８未満；および
（ｅ）ＭＯＤＳスコアが１８を超える
の１つまたは複数を満たす患者に投与することを含む方法。
【請求項３】
重症細菌感染が、肺炎、菌血症、深部組織感染、皮膚感染、軟部組織感染、歯周炎、腹膜炎、外科感染、または髄膜炎の原因となる、請求項１または請求項２の方法。
【請求項４】
重症細菌感染が、肺炎の原因となり、肺炎は、市中肺炎または院内肺炎である、請求項３の方法。
【請求項５】
肺炎が、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに起因する、請求項４の方法。
【請求項６】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、グリコシル化されていない、請求項１から６のいずれかの方法。
【請求項７】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約１２％未満が、修飾された種であり、修飾された種は、
（ｉ）逆相クロマトグラフィーで検出される、酸化ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子；
（ｉｉ）カチオン交換クロマトグラフィーで検出される、カルバミル化ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子；
（ｉｉｉ）Ｐｒｏｍｅｇａ ＩＳＯＱＵＡＮＴ（登録商標）キットで検出される、脱アミド化ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子；
（ｉｖ）アミノ酸分析で決定される、システイン付加物を含むＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子；
（ｖ）サイズ除外クロマトグラフィーで検出される、凝集したＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子；および
（ｖｉ）非変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で検出される、誤って折り畳まれたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子
の１つまたは複数を含む、請求項１から６のいずれかの方法。
【請求項８】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約９％未満が酸化される、請求項７の方法。
【請求項９】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約３％未満がカルバミル化される、請求項７の方法。
【請求項１０】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約９％未満が脱アミド化される、請求項７の方法。
【請求項１１】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約２％未満がシステイン付加物を含む、請求項７の方法。
【請求項１２】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約３％未満が凝集される、請求項７の方法。
【請求項１３】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約３％未満が誤って折り畳まれる、請求項７の方法。
【請求項１４】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを含む凍結乾燥組成物から調製される、請求項１から１３のいずれかの方法。
【請求項１５】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、アルギニンを含む製剤として投与される、請求項１から１３のいずれかの方法。
【請求項１６】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、クエン酸を含む製剤として投与される、請求項１から１３のいずれかの方法。
【請求項１７】
医薬組成物が、０．０１から１．０ｍｇ／ｍｌ、０．０１から０．８ｍｇ／ｍｌ、０．０１から０．５ｍｇ／ｍｌ、０．０１から０．３ｍｇ／ｍｌ、０．０１から０．２ｍｇ／ｍｌ、または０．０１から０．１ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを含む、請求項１から１６のいずれかの方法。
【請求項１８】
医薬組成物が、１５０〜４５０ｍＭ、１５０〜４００ｍＭ、１５０〜３５０ｍＭ、または１５０〜３００ｍＭのＬ−アルギニンを含む、請求項１から１６のいずれかの方法。
【請求項１９】
医薬組成物が、０．１〜５０ｍＭ、０．１〜４０ｍＭ、０．１〜３０ｍＭ、０．１〜２５ｍＭ、０．１〜１５ｍＭ、０．１〜１０ｍＭ、または０．１〜５ｍＭのＬ−メチオニンを含む、請求項１から１６のいずれかの方法。
【請求項２０】
医薬組成物が、５〜５０ｍＭ、５〜４５ｍＭ、５〜４０ｍＭ、５〜３５ｍＭ、５〜３０ｍＭ、５〜２５ｍＭ、または５〜２０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液を含む、請求項１から１６のいずれかの方法。
【請求項２１】
医薬組成物が、５．０〜６、５．０〜５．８、５．０〜５．７、５．０〜５．６、または５．０〜５．５のｐＨを有する、請求項１から２０のいずれかの方法。
【請求項２２】
医薬組成物が、０．１５±１５％ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、３００±１５％ｍＭのＬ−アルギニン、５±１５％ｍＭのＬ−メチオニン、および２０±１５％ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５±１５％）を含む、請求項１から２１のいずれかの方法。
【請求項２３】
医薬組成物が、０．１５±１０％ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、３００±１０％ｍＭのＬ−アルギニン、５±１０％ｍＭのＬ−メチオニン、および２０±１０％ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５±１０％）を含む、請求項１から２１のいずれかの方法。
【請求項２４】
医薬組成物が、０．１５±５％ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、３００±５％ｍＭのＬ−アルギニン、５±５％ｍＭのＬ−メチオニン、および２０±５％ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５±５％）を含む、請求項１から２１のいずれかの方法。
【請求項２５】
医薬組成物が、０．４５±１５％ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、３００±１５％ｍＭのＬ−アルギニン、５±１５％ｍＭのＬ−メチオニン、および２０±１５％ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５±１５％）を含む、請求項１から２１のいずれかの方法。
【請求項２６】
医薬組成物が、０．４５±１０％ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、３００±１０％ｍＭのＬ−アルギニン、５±１０％ｍＭのＬ−メチオニン、および２０±１０％ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５±１０％）を含む、請求項１から２１のいずれかの方法。
【請求項２７】
医薬組成物が、０．４５±５％ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、３００±５％ｍＭのＬ−アルギニン、５±５％ｍＭのＬ−メチオニン、および２０±５％ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５±５％）を含む、請求項１から２１のいずれかの方法。
【請求項２８】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、参照ａｌａ−ＴＦＰＩを約０．６６ｍｇ／ｋｇ／時間未満の投与速度で投与するのに等しい投与速度で連続静脈内注入により投与される、請求項１から２７のいずれかの方法。
【請求項２９】
投与速度が、参照ａｌａ−ＴＦＰＩを投与速度約０．０００２５から約０．１ｍｇ／ｋｇ／時間で投与するのに等しく、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、少なくとも約７２時間投与される、請求項１から２７のいずれかの方法。
【請求項３０】
投与速度が、参照ａｌａ−ＴＦＰＩを投与速度約０．０１０から約０．１ｍｇ／ｋｇ／時間で投与するのに等しい、請求項１から２７のいずれかの方法。
【請求項３１】
投与速度が、参照ａｌａ−ＴＦＰＩを投与速度約０．０２から約０．１ｍｇ／ｋｇ／時間で投与するのに等しい、請求項１から２７のいずれかの方法。
【請求項３２】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、少なくとも約９６時間投与される、請求項１から２７のいずれかの方法。
【請求項３３】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、参照ａｌａ−ＴＦＰＩを合計用量約０．０２４から約４．８ｍｇ／ｋｇで投与するのに等しい合計用量を提供する連続静脈内注入により投与される、請求項１から２７のいずれかの方法。
【請求項３４】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、参照ａｌａ−ＴＦＰＩを投与速度約０．０２から約１ｍｇ／ｋｇ／時間で投与するのに等しい投与速度で連続静脈内注入により投与される、請求項１から２７のいずれかの方法。
【請求項３５】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、参照ａｌａ−ＴＦＰＩを日用量約０．００６ｍｇ／ｋｇから約１．２ｍｇ／ｋｇで投与するのに等しい日用量を提供する連続静脈内注入により投与される、請求項１から２７のいずれかの方法。
【請求項３６】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、１０〜２００時間、１０〜１５０時間、または２４〜９６時間の間、注入により投与される、請求項１から３５のいずれかの方法。
【請求項３７】
患者が、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ投与前の少なくとも８時間はヘパリン治療を受けていない、請求項１から３６のいずれかの方法。
【請求項３８】
活性化タンパク質Ｃで患者を治療することをさらに含む、請求項１から３７のいずれかの方法。
【請求項３９】
ＴＦＰＩアナログが、ａｌａ−ＴＦＰＩである、請求項１から３８のいずれかの方法。
【請求項１】
重症細菌感染を発症するリスクのある患者、または重症細菌感染と診断された患者を治療する方法であって、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを、それを必要とし、以下の基準：
（ａ）血中ＩＬ−６レベルが３，２００ｐｇ／ｍｌ未満；
（ｂ）国際標準比（ＩＮＲ）が２．５未満；
（ｃ）急性生理スコア（ＡＰＳ）が２６未満；
（ｄ）Ａｃｕｔｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ａｎｄ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（ＡＰＡＣＨＥ ＩＩ）スコアが３８未満；および
（ｅ）ＭＯＤＳスコアが１８を超える
の１つまたは複数を満たす患者に投与することを含む方法。
【請求項２】
重症細菌感染による死亡リスクを低下させる方法であって、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを含む医薬組成物を、それを必要とし、以下の基準：
（ａ）血中ＩＬ−６レベルが３，２００ｐｇ／ｍｌ未満；
（ｂ）国際標準比（ＩＮＲ）が２．５未満；
（ｃ）急性生理スコア（ＡＰＳ）が２６未満；
（ｄ）Ａｃｕｔｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ａｎｄ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（ＡＰＡＣＨＥ ＩＩ）スコアが３８未満；および
（ｅ）ＭＯＤＳスコアが１８を超える
の１つまたは複数を満たす患者に投与することを含む方法。
【請求項３】
重症細菌感染が、肺炎、菌血症、深部組織感染、皮膚感染、軟部組織感染、歯周炎、腹膜炎、外科感染、または髄膜炎の原因となる、請求項１または請求項２の方法。
【請求項４】
重症細菌感染が、肺炎の原因となり、肺炎は、市中肺炎または院内肺炎である、請求項３の方法。
【請求項５】
肺炎が、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに起因する、請求項４の方法。
【請求項６】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、グリコシル化されていない、請求項１から６のいずれかの方法。
【請求項７】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約１２％未満が、修飾された種であり、修飾された種は、
（ｉ）逆相クロマトグラフィーで検出される、酸化ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子；
（ｉｉ）カチオン交換クロマトグラフィーで検出される、カルバミル化ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子；
（ｉｉｉ）Ｐｒｏｍｅｇａ ＩＳＯＱＵＡＮＴ（登録商標）キットで検出される、脱アミド化ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子；
（ｉｖ）アミノ酸分析で決定される、システイン付加物を含むＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子；
（ｖ）サイズ除外クロマトグラフィーで検出される、凝集したＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子；および
（ｖｉ）非変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で検出される、誤って折り畳まれたＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子
の１つまたは複数を含む、請求項１から６のいずれかの方法。
【請求項８】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約９％未満が酸化される、請求項７の方法。
【請求項９】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約３％未満がカルバミル化される、請求項７の方法。
【請求項１０】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約９％未満が脱アミド化される、請求項７の方法。
【請求項１１】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約２％未満がシステイン付加物を含む、請求項７の方法。
【請求項１２】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約３％未満が凝集される、請求項７の方法。
【請求項１３】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログの分子の約３％未満が誤って折り畳まれる、請求項７の方法。
【請求項１４】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを含む凍結乾燥組成物から調製される、請求項１から１３のいずれかの方法。
【請求項１５】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、アルギニンを含む製剤として投与される、請求項１から１３のいずれかの方法。
【請求項１６】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、クエン酸を含む製剤として投与される、請求項１から１３のいずれかの方法。
【請求項１７】
医薬組成物が、０．０１から１．０ｍｇ／ｍｌ、０．０１から０．８ｍｇ／ｍｌ、０．０１から０．５ｍｇ／ｍｌ、０．０１から０．３ｍｇ／ｍｌ、０．０１から０．２ｍｇ／ｍｌ、または０．０１から０．１ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログを含む、請求項１から１６のいずれかの方法。
【請求項１８】
医薬組成物が、１５０〜４５０ｍＭ、１５０〜４００ｍＭ、１５０〜３５０ｍＭ、または１５０〜３００ｍＭのＬ−アルギニンを含む、請求項１から１６のいずれかの方法。
【請求項１９】
医薬組成物が、０．１〜５０ｍＭ、０．１〜４０ｍＭ、０．１〜３０ｍＭ、０．１〜２５ｍＭ、０．１〜１５ｍＭ、０．１〜１０ｍＭ、または０．１〜５ｍＭのＬ−メチオニンを含む、請求項１から１６のいずれかの方法。
【請求項２０】
医薬組成物が、５〜５０ｍＭ、５〜４５ｍＭ、５〜４０ｍＭ、５〜３５ｍＭ、５〜３０ｍＭ、５〜２５ｍＭ、または５〜２０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液を含む、請求項１から１６のいずれかの方法。
【請求項２１】
医薬組成物が、５．０〜６、５．０〜５．８、５．０〜５．７、５．０〜５．６、または５．０〜５．５のｐＨを有する、請求項１から２０のいずれかの方法。
【請求項２２】
医薬組成物が、０．１５±１５％ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、３００±１５％ｍＭのＬ−アルギニン、５±１５％ｍＭのＬ−メチオニン、および２０±１５％ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５±１５％）を含む、請求項１から２１のいずれかの方法。
【請求項２３】
医薬組成物が、０．１５±１０％ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、３００±１０％ｍＭのＬ−アルギニン、５±１０％ｍＭのＬ−メチオニン、および２０±１０％ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５±１０％）を含む、請求項１から２１のいずれかの方法。
【請求項２４】
医薬組成物が、０．１５±５％ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、３００±５％ｍＭのＬ−アルギニン、５±５％ｍＭのＬ−メチオニン、および２０±５％ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５±５％）を含む、請求項１から２１のいずれかの方法。
【請求項２５】
医薬組成物が、０．４５±１５％ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、３００±１５％ｍＭのＬ−アルギニン、５±１５％ｍＭのＬ−メチオニン、および２０±１５％ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５±１５％）を含む、請求項１から２１のいずれかの方法。
【請求項２６】
医薬組成物が、０．４５±１０％ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、３００±１０％ｍＭのＬ−アルギニン、５±１０％ｍＭのＬ−メチオニン、および２０±１０％ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５±１０％）を含む、請求項１から２１のいずれかの方法。
【請求項２７】
医薬組成物が、０．４５±５％ｍｇ／ｍｌのＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ、３００±５％ｍＭのＬ−アルギニン、５±５％ｍＭのＬ−メチオニン、および２０±５％ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５±５％）を含む、請求項１から２１のいずれかの方法。
【請求項２８】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、参照ａｌａ−ＴＦＰＩを約０．６６ｍｇ／ｋｇ／時間未満の投与速度で投与するのに等しい投与速度で連続静脈内注入により投与される、請求項１から２７のいずれかの方法。
【請求項２９】
投与速度が、参照ａｌａ−ＴＦＰＩを投与速度約０．０００２５から約０．１ｍｇ／ｋｇ／時間で投与するのに等しく、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、少なくとも約７２時間投与される、請求項１から２７のいずれかの方法。
【請求項３０】
投与速度が、参照ａｌａ−ＴＦＰＩを投与速度約０．０１０から約０．１ｍｇ／ｋｇ／時間で投与するのに等しい、請求項１から２７のいずれかの方法。
【請求項３１】
投与速度が、参照ａｌａ−ＴＦＰＩを投与速度約０．０２から約０．１ｍｇ／ｋｇ／時間で投与するのに等しい、請求項１から２７のいずれかの方法。
【請求項３２】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、少なくとも約９６時間投与される、請求項１から２７のいずれかの方法。
【請求項３３】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、参照ａｌａ−ＴＦＰＩを合計用量約０．０２４から約４．８ｍｇ／ｋｇで投与するのに等しい合計用量を提供する連続静脈内注入により投与される、請求項１から２７のいずれかの方法。
【請求項３４】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、参照ａｌａ−ＴＦＰＩを投与速度約０．０２から約１ｍｇ／ｋｇ／時間で投与するのに等しい投与速度で連続静脈内注入により投与される、請求項１から２７のいずれかの方法。
【請求項３５】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、参照ａｌａ−ＴＦＰＩを日用量約０．００６ｍｇ／ｋｇから約１．２ｍｇ／ｋｇで投与するのに等しい日用量を提供する連続静脈内注入により投与される、請求項１から２７のいずれかの方法。
【請求項３６】
ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログが、１０〜２００時間、１０〜１５０時間、または２４〜９６時間の間、注入により投与される、請求項１から３５のいずれかの方法。
【請求項３７】
患者が、ＴＦＰＩまたはＴＦＰＩアナログ投与前の少なくとも８時間はヘパリン治療を受けていない、請求項１から３６のいずれかの方法。
【請求項３８】
活性化タンパク質Ｃで患者を治療することをさらに含む、請求項１から３７のいずれかの方法。
【請求項３９】
ＴＦＰＩアナログが、ａｌａ−ＴＦＰＩである、請求項１から３８のいずれかの方法。
【公表番号】特表２００８−５４０４６０（Ｐ２００８−５４０４６０Ａ）
【公表日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５１０３３０（Ｐ２００８−５１０３３０）
【出願日】平成１８年５月８日（２００６．５．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１７９５６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１２２１３９
【国際公開日】平成１８年１１月１６日（２００６．１１．１６）
【出願人】（５０７３６５０９７）ノバルティス アーゲー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年５月８日（２００６．５．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１７９５６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１２２１３９
【国際公開日】平成１８年１１月１６日（２００６．１１．１６）
【出願人】（５０７３６５０９７）ノバルティス アーゲー (1)
【Ｆターム（参考）】
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