関節リウマチの診断方法
【課題】関節リウマチの診断方法を提供すること。
【解決手段】哺乳動物から採取した関節滑液、血液及び脳脊髄液等の試料中に存在するジペプチジルペプチダーゼ活性を測定することを特徴とする。ペプチジルペプチダーゼに特異的な蛍光合成基質及びアミノペプチダーゼ阻害剤であるベスタチンに、ペプチジルペプチダーゼ阻害剤であるタイノルフィンの存在あるいは非存在下において、試料を反応させ、反応後の反応液の蛍光強度を測定する。
【解決手段】哺乳動物から採取した関節滑液、血液及び脳脊髄液等の試料中に存在するジペプチジルペプチダーゼ活性を測定することを特徴とする。ペプチジルペプチダーゼに特異的な蛍光合成基質及びアミノペプチダーゼ阻害剤であるベスタチンに、ペプチジルペプチダーゼ阻害剤であるタイノルフィンの存在あるいは非存在下において、試料を反応させ、反応後の反応液の蛍光強度を測定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節リウマチの診断方法に関する。より詳しくは、本発明は、被験者の試料中の発現タンパク質であるジペプチジルペプチダーゼやスパイノルフィンを解析することにより関節リウマチを診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（以下、ＲＡと略記する。）は慢性的な多関節の滑膜性炎症及び軟骨と骨組織の進行性破壊を特徴とする疾患である。軟骨組織のプロテオグリカンとコラーゲンを分解する多数のタンパク質分解酵素（例えばマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、カテプシン、ペプチダーゼ等）の濃度上昇がそのような組織において見られることが知られている（非特許文献１、２参照）。さらに、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、種々のサトカイン及び酵素阻害因子もまたＲＡの病因に重要な役割を果たすことが知られている（非特許文献３，４参照）。これらのタンパク質は膝、関節部と複雑に関与しながら、慢性的炎症から関節の破壊に至るまで病状を憎悪化する。ＲＡ患者の薬物治療には、非ステロイド系の抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、抗リウマチ薬剤（ＤＭＡＲＤ）及び生物学的薬剤（抗ＴＮＦレセプター及びＩＬ−１拮抗剤）等が用いられている（非特許文献５−７参照）。しかしながら、懸命の治療にもかかわらず、多くのＲＡ患者の病状は回復せず痛みを感じ続け、骨破壊を受け続ける。ＲＡの痛みは、慢性的且つ侵害性であると考えられており、末梢部位（膝や関節）にある種々の侵害受容器を刺激し、脊髄を通じて大脳へと変換され知覚されるシグナルである。
【０００３】
ＲＡは上記したように重篤にいたる疾患でありながら、現在のＲＡの診断方法は、アメリカリウマチ学会（ＡＣＲ）の「ＡＣＲ改訂診断基準」に基づくものである。該診断基準は、１）１時間以上続く朝のこわばり（主に手指）；２）３箇所以上の関節腫れ；３）手の関節（手関節、中手指節関節、近位指節間接）の腫れ；４）対称性の関節（左右同じ関節）の腫れ；５）手のエックス線写真の異常所見；６）皮下結節、及び７）血液検査でリウマチ反応が陽性、である。このうち、４項目以上満たせばＲＡと診断される。前記血液検査は、血清中のリウマチ因子（ＲＦ）が主として測定される。ＲＦは、ＲＡ患者の血清中に高頻度で出現するＩｇＧのＦｃ部分に対する自己抗体である。健常人のＲＦはＩｇＧ以外の種々のタンパクにも反応するｐｏｌｙａｃｔｉｖｅな抗体であるが、ＲＡ患者由来のＲＦはｐｏｌｙａｃｔｉｖｅなもの以外にＩｇＧＦｃのみに反応するｍｏｎｏａｃｔｉｖｅなものが存在する。このｍｏｎｏａｃｔｉｖｅなＲＦは、ｐｏｌｙａｃｔｉｖｅなものに比べ、ＩｇＧＦｃに対する反応が約１００倍高い。このため、該ＲＦをＲＡ患者の判定の指標として測定するものである。しかし、ＲＡ患者でも常にＲＦが検出されない血清反応陰性ＲＡも存在し、また健常人でも陽性反応（２％程度）を呈しうることが知られている。
このため、ＲＡ患者の尿を、液体クロマトグラフィーを用いてＲＡ特有成分のクロマトピークの存在を以ってＲＡであると判定する方法（特許文献１参照）、糖タンパク質から糖鎖を切り出し、該糖鎖を標識した後精製して糖鎖分析用試料を調整し、調製した試料をＯＤＳ−シリカカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで分析し、試料の糖鎖組成を求めることにより、糖鎖組成変化に基づきＲＡを診断する方法（特許文献２参照）等が提案されている。
しかし、これらの方法も健常人と比べて高いピークが認められるというものであったり、分析用試料の調製が煩雑であったりで、満足すべきものではなかった。
【特許文献１】特開平７−７２１３３号公報
【特許文献２】特開平８−２２８７９５号公報
【非特許文献１】ランデュー・アール（Ｌａｎｄｅｗｅ Ｒ）他７名、アースリティス・アンド・リューマチズム（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ）、２００４年、第５０巻、ｐ．１３９０−１３９９
【非特許文献２】チェトベリコフ・アイ（Ｔｃｈｅｔｖｅｒｉｋｏｖ Ｉ）他７名、アナルズ・オブ・ザ・リウマチック・ディズィーズ（Ａｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ）、２００３年、第６２巻、ｐ．１０９４−１０９９
【非特許文献３】クロス・エー（Ｃｒｏｓｓ Ａ）他３名、アースリティス・アンド・リューマチズム（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ）、２００４年、第５０巻、ｐ．１４３０−１４３６
【非特許文献４】リープ・ティー（Ｒａａｐ Ｔ）他５名、ザ・ジャーナル・オブ・リウマトロジー（Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ）、２０００年、第２７巻、ｐ．２５５８−２５６５
【非特許文献５】クリミーク・ピー・エー（Ｋｌｉｍｉｕｋ ＰＡ）他３名、ザ・ジャーナル・オブ・リウマトロジー（Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ）、２００４年、第３１巻、ｐ．２３８−２４２
【非特許文献６】ドーガドス・エム（Ｄｏｕｇａｄｏｓ Ｍ）他６名、ザ・ジャーナル・オブ・リウマトロジー（Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ）、２００３年、第３０巻、ｐ．２５７２−２５７９
【非特許文献７】デー・エー（Ｄｅ Ａ）他７名、ザ・ジャーナル・オブ・リウマトロジー（Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ）、２００２年、第２９巻、ｐ．４６−５１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ＲＡの診断方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ＲＡの痛みは、慢性的且つ侵害性であると考えられており、末梢部位（膝や関節）にある種々の侵害受容器を刺激し、脊髄を通じて大脳へと変換され知覚されるシグナルである。
抗炎症性及び抗侵害性の活性化の役割を果たす、ウシ脊髄由来の内因性ペプチドであるスパイノルフィン（ＬＶＶＹＰＷＴ；配列表：配列番号１）と呼ばれる神経ペプチドが単離された。スパイノルフィンは動物モデルでブラジキニン（ＢＫ）誘発侵害受容性疼痛反応を抑制すること、また、スパイノルフィンは多形核好中球（ＰＭＮｓ）の種々の機能、例えばケモタキシス（走化性）、Ｏ２−生成やエクソサイトーシス等を抑制することが知られている。
【０００６】
本発明者らは、炎症と痛みのコントロールにおけるスパイノルフィンが果たす役割を解明するために、慢性的痛みと炎症症状を有するＲＡ患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）中のスパイノルフィンと代謝酵素の活性の変化に焦点を当て種々研究を重ねたところ、ＲＡ患者ではＣＳＦ中のスパイノルフィン量、スパイノルフィンプロセシング酵素、ジペプチジルペプチダーゼの活性化に変化が見られることを知見した。
更に本発明者らは、ジペプチジルペプチダーゼ活性とスパイノルフィンの炎症と侵害受容性疼痛反応メカニズムにおける役割を調べるために、ＲＡ患者と変形性関節炎（以下、ＯＡと略記する。）患者の関節から採取した滑液を用いジペプチジルペプチダーゼ活性とスパイノルフィン量を比較した。その結果、ＲＡ患者では、ジペプチジルペプチダーゼ活性が増加し、かつスパイノルフィン量が減少すること、及びジペプチジルペプチダーゼ活性の増加とスパイノルフィン量の減少に相関関係を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
〔１〕 哺乳動物から採取した試料のジペプチジルペプチダーゼ活性を測定することを特徴とする関節リウマチの診断方法、
［２］ 試料が関節滑液、血液及び脳脊髄液から選択される少なくとも１種であることを特徴とする前記［１］に記載の診断方法、
［３］ さらに哺乳動物から採取した試料中に存在するスパイノルフィンの量を測定することを特徴とする前記［１］又は［２］に記載の診断方法、
［４］ 測定された試料中のスパイノルフィン濃度５ｎｇ／ｍＬ以下が、関節リウマチ疾患推定スパイノルフィン量であることを特徴とする前記［３］に記載の診断方法、
［５］ ジペプチジルペプチダーゼに特異的な蛍光基質及びアミノペプチダーゼ阻害剤に、ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤の存在あるいは非存在下において、試料を反応させ、反応後の反応液の蛍光強度を測定することを特徴とする、前記［１］に記載の診断のためのジペプチジルペプチダーゼ活性の測定方法、
［６］ 蛍光基質がＡｒｇ−Ａｒｇ基を有する蛍光合成基質であることを特徴とする前記［５］に記載の測定方法、
［７］ 蛍光合成基質がＡｒｇ−Ａｒｇ−４−メチルクマリル−７−アミドであることを特徴とする前記［６］に記載の測定方法、
［８］ 反応によって生成した７−アミノ−４−メチルクマリンの蛍光強度を測定することを特徴とする前記［７］に記載の測定方法、
［９］ アミノペプチダーゼ阻害剤が、ベスタチンであることを特徴とする前記［５］〜［８］のいずれかに記載の測定方法、
［１０］ ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤がタイノルフィンであることを特徴とする前記［５］〜［９］いずれかに記載の測定方法、
［１１］ ジペプチジルペプチダーゼに特異的な蛍光基質、アミノペプチダーゼ阻害剤及びジペプチジルペプチダーゼ阻害剤を含む関節リウマチ診断キット、
［１２］ 蛍光基質が、Ａｒｇ−Ａｒｇ基を有する蛍光合成基質であることを特徴とする前記［１１］に記載のキット、及び
［１３］ 合成基質がＡｒｇ−Ａｒｇ−４−メチルクマリル−７−アミドであることを特徴とする前記［１２］に記載のキット、
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明に従えば、ＲＡ患者では、試料、特に関節から採取された滑液中のジペプチジルペプチダーゼ活性がＯＡ患者のそれと比較して特異的に高い。このことは、試料中のジペプチジルペプチダーゼ活性がＲＡ診断の指標となり得ることを示すものである。従って、試料中のジペプチジルペプチダーゼ活性を測定し、ＲＡの診断推定を行なうことは、ＲＡの新しい診断方法として使用できる。
また、ＲＡ患者では、試料、特に関節から採取された滑液中のスパイノルフィン量が５ｎｇ／ｍＬと低値である。このことは、試料中のスパイノルフィン量がＲＡ診断の指標となり得ることを示すものである。
従って、上記ジペプチジルペプチダーゼ活性の測定に加え、スパイノルフィン量を測定することにより、ＲＡの診断推定を行なうことは、ＲＡ診断の精度を高めることができ、ＲＡの新しい診断方法として使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下に本発明のＲＡの診断方法について説明する。
本発明において使用することのできる試料としては、哺乳動物であれば特に制限はなく、例えばヒト、ラット、マウス、イヌ、ウシ、ネコ、ウサギ、モルモット等の脳脊髄液、関節滑液、血液、血漿、血清、唾液又は尿等の生体試料並びに動物における各種の臓器や組織等を挙げることができるが、関節滑液、血液又は脳脊髄液が好ましい。
【００１０】
試料におけるジペプチジルペプチダーゼ活性の測定は、ジペプチジルペプチダーゼに特異的な蛍光基質及びアミノペプチダーゼ阻害剤を含む反応液に、ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤の存在あるいは非存在下において試料を反応させ、反応後の反応液の蛍光強度を測定することにより行なうことができる。
【００１１】
まず、反応液を作製する。ジペプチジルペプチダーゼ活性の好適なｐＨ、好ましくはｐＨ約７〜９の緩衝液に、蛍光基質とアミノペプチダーゼ阻害剤を加えることによって作製される反応液と、前記緩衝液と蛍光基質とアミノペプチダーゼ阻害剤以外にさらにジペプチジルペプチダーゼ阻害剤を加えた反応液とを作製する。
【００１２】
前記緩衝液としては、例えばトリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液等が挙げられる。
【００１３】
蛍光基質としては、Ａｒｇ−Ａｒｇ基を有する合成基質、例えばＡｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＡＭＣ等が挙げられる。なお、前記ＭＣＡは４−メチルクマリル−７−アミドを、Ｂｏｃはｔ−ブトキシカルボニル基を、Ｓｕｃはサクシニル基を、ＡＭＣは７−アミノ−４−メチルクマリンを示す。以下、ＭＣＡ、Ｂｏｃ、ＡＭＣにおいて同義である。
【００１４】
蛍光基質の量は、試料中のジペプチジルペプチダーゼと反応するのに充分な量を加えることが好ましく、通常約０．２〜５μＭ程度が好ましい。
【００１５】
アミノペプチダーゼ阻害剤としては、ベスタチン、ロイヒスチン等を好ましく挙げることができる。アミノペプチダーゼ阻害剤を加えるのは、上記基質にアミノペプチダーゼが作用するのを阻害し、ジペプチジルペプチダーゼと基質との基質特異性を高めるためである。これにより、試料中のアミノペプチダーゼの酵素活性を失活し得る。従って、アミノペプチダーゼ阻害剤の量は、試料中のアミノペプチダーゼ活性を抑制するのに充分な量を加えることが好ましく、通常約５０〜２５０μｇ／ｍＬ程度が好ましい。
【００１６】
なお、前記蛍光合成基質は、アミノペプチダーゼ阻害剤と共に、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃付近で、約１〜３０分間プレインキュベートするのが好ましい。
【００１７】
ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤としては、使用するジペプチジルペプチダーゼを特異的に阻害するものを選択するのが好ましく、例えばタイノルフィン等が挙げられる。ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤は、試料中のジペプチジルペプチダーゼ活性を抑制するのに充分な量を加えることが好ましく、通常約５０〜２００μｇ／ｍＬ程度が好ましい。
【００１８】
試料と上記反応液との反応は、約２０〜４０℃、好ましくは、約３７℃付近で、通常約１０〜６０分、好ましくは約２０〜４０分間インキュベートするのが好ましい。該インキュベートにより、前記蛍光基質は、酵素（ジペプチジルペプチダーゼ）によって、例えば蛍光基質としてＡｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡを用いた場合、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）を反応液中に遊離させる。この反応は以下；
Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ →Ａｒｇ−Ａｒｇ ＋ ＡＭＣ
によって示すことができる。
次いで、上記反応液に反応停止液、例えば酢酸、酢酸ナトリウム等を加え反応を停止するのが好ましい。
反応停止後、遊離された反応生成物の蛍光強度を測定する。蛍光強度の測定波長は反応生成物により異なり、例えば反応生成物が上記ＡＭＣの場合、励起波長：３６０ｎｍ、蛍光波長：４４０ｎｍにて測定され得る。
【００１９】
そして、試料中のジペプチジルペプチダーゼ活性は、以下の式；
活性＝（ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤非存在での基質分解活性）−（ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤存在下での基質分解活性）
で説明される。
活性は、試料中に含まれる総タンパク質の量からタンパク質１ｍｇ当たりの活性、すなわちｐｍｏｌ／インキュベーション時間（分）／ｍｇタンパクの単位で表すことができる。
試料中の総タンパク質の量は、公知のタンパク質測定法、例えばブラッドフォード法（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＵＳＡ，Ｐｉｅｒｃｅ社）等により測定できる。
上記基質分解活性は、ＡＭＣの濃度と蛍光値の関係より、標準曲線を描き、その標準曲線より算出することで、試料中のタンパク質１ｍｇに対する値に換算できる。
【００２０】
上記方法に基づく測定により得られるジペプチジルペプチダーゼ活性は、その測定条件（反応温度、反応時間等）などにより異なるが、得られる該活性値を基にＲＡの診断をし得る。例えば被験者の関節から採取した滑液を試料として、例えば３０μｇ／ｍＬのベスタチンを含有する５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）１ｍＬからなる反応混合物中で、滑液（１００μＬ）を１μＭのＡｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡと共に、タイノルフィンの存在又は非存在下で、３７度で３０分インキュベーションし、インキュベーション後の溶液の蛍光（励起波長：３６０ｎｍ，蛍光波長：４４０ｎｍ）を測定し、ジペプチジルペプチダーゼ活性が、約２０ｐｍｏｌ／３０ｍｉｎ／ｍｇタンパク質以上、好ましくは約３０〜２００ｐｍｏｌ／３０ｍｉｎ／ｍｇタンパク質の場合にＲＡと診断推定し得る。
【００２１】
上記ジペプチジルペプチダーゼ活性の測定により、測定され得るジペプチジルペプチダーゼとしては、例えばエンケファリン分解酵素のジペプチジルペプチダーゼＩＩＩ（ＤＰＰＩＩＩ）、リソソームシステインプロテアーゼのジペプチジルペプチダーゼＩ（ＤＰＰＩ）、ジペプチジルペプチダーゼＩＩ（ＤＰＰＩＩ）、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）等が挙げられるが、これらに限定されない。ジペプチジルペプチダーゼがいずれであるにしても、上記方法により、測定されるジペプチジルペプチダーゼ活性が高ければ、ＲＡと診断推定し得る。
【００２２】
また、本発明は上記ジペプチジルペプチダーゼ活性の測定に加え、さらに試料中に存在するスパイノルフィン量を測定することによるＲＡの診断方法も提供する。
【００２３】
試料中に存在するスパイノルフィン量の測定は、次の（Ａ）〜（Ｅ）工程を含む；
（Ａ）生体から採取した試料をトリクロロ酢酸と混合して得られる溶液相を逆相カラムクロマトグラフィーに付し、溶媒でスパイノルフィンを溶出する工程；
（Ｂ）前記（Ａ）工程で溶出したスパイノルフィンを、担体に固相化したスパイノルフィン及びスパイノルフィン抗体と接触させる工程；
（Ｃ）担体に固相化されたスパイノルフィンと結合しなかったスパイノルフィン抗体を除去する工程；
（Ｄ）上記（Ｃ）工程の担体に固相化されたスパイノルフィンと結合したスパイノルフィン抗体に、特異的に結合する標識二次抗体を接触させ、担体に固相化したスパイノルフィンに結合したスパイノルフィン抗体と標識二次抗体とを結合する工程；及び
（Ｅ）スパイノルフィン抗体と結合している標識二次抗体の標識量を測定する工程。
【００２４】
上記（Ａ）工程は、生体から採取した試料をトリクロロ酢酸と混合して得られる溶液相を逆相カラムクロマトグラフィーに付し、溶媒でスパイノルフィンを溶出する。
トリクロロ酢酸の濃度は、測定する生体試料によっても異なるが、約５〜２０質量％トリクロロ酢酸水溶液として用いるのが好ましい。トリクロロ酢酸の量は生体試料中のタンパク質を沈殿させるに充分な量がよく、生体試料溶液の１容積に対し、前記トリクロロ酢酸水溶液を約０．５〜２容積比加えるのが好ましい。溶液相の分離手段はろ過、遠心分離等公知の方法を用い得る。
【００２５】
上記逆相カラムクロマトグラフィーのカラムとしては、例えばＯＤＳカラム等が好ましく挙げられる。ＯＤＳカラムクロマトグラフィーとは、シリカゲル担体にオクタデシルシリル基（ＯＤＳ基，Ｃ１８基）を化学結合した充填剤が詰められているカラムである。ＯＤＳカラムとしては、例えばＯＤＳ−Ａ ６０−６０／３０（ＹＭＣ社製）、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ（ジーエルサイエンス株式会社製）、Ｌ−ｃｏｌｕｍｎ ＯＤＳ （財団法人化学物質評価研究機構製）、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ ＵＧ−５（野村化学株式会社製）、ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＭＧＩＩ（株式会社資生堂製）、ＺＯＲＢＡＸ ＸＤＢ−Ｃ１８（横河アナリティカルシステムズ株式会社製）、Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８（ウォーターズ社製）、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ Ｃ１８（Ｍ．ナーゲル社製）等を挙げることができる。
【００２６】
上記スパイノルフィンの溶出に用いられる溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、プロパノール等の炭素数１〜５のアルコールもしくはアセトニトリル、又はこれらの２種以上を混合した溶媒等或いは前記溶媒と水との混合溶媒等が挙げられる。
【００２７】
次いで、（Ｂ）工程において、前記（Ａ）工程で溶出したスパイノルフィンを、担体に固相化したスパイノルフィン及びスパイノルフィン抗体と接触させる。
ここで、スパイノルフィンを固相化する担体としては、マイクロタイタープレートや試験管、ポリマービーズ等が挙げられるが、スパイノルフィンがオリゴペプチドであることから、前記担体表面にアミノ基、カルボキシル基等の活性な官能基を持たせたものや疎水性ポリマーのコートスライド〔例えばＩｍｍｕｎｏ Ｐｌａｔｅ，ＭａｘｉＳｏｒｐ（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製）〕等を施したものが好ましい。担体へのスパイノルフィンの固相化は、前記担体の表面とスパイノルフィンを共有結合で結合させることが好ましい。前記結合はスパイノルフィンを緩衝液、例えばリン酸緩衝液又はトリス塩酸生理食塩水等に溶解し、前記担体と接触させ、少なくとも約３０分以上、好ましくは約３０〜１２０分、温度約０〜５０℃、好ましくは室温で、インキュベートするのが好ましい。スパイノルフィンを固相化した担体はブロッキング剤でブロッキングされることが好ましい。ブロッキング剤としては、例えばスキムミルク、Ｂｌｏｃｋ ＡｃｅＴＭ等が挙げられる。
なお、スパイノルフィンは、公知の方法、例えば特開２０００−９５７９４号公報記載の方法により製造することができる。
【００２８】
本発明で使用するスパイノルフィン抗体としては、スパイノルフィンに特異的に結合する抗体であれば、いずれの抗体も好ましく用いることができる。スパイノルフィン抗体は、スパイノルフィンを抗原として用いて、動物、例えばウサギ、ラット等を感作し、常法により分離・精製して容易に作製することができる。なお、スパイノルフィンは７アミノ酸から構成されるペプチドであり、通常、免疫原性を示すには短すぎるので、キャリアタンパク質を用いて免疫原性を増強させるためコンジュゲーションを行うのが好ましい。コンジュゲーションのためのキャリアタンパク質としては、例えばＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、ウシ血清アルブミン又はオバルブミン等が挙げられる。コンジュゲーションの方法としては、例えばスパイノルフィンのＣ末端のカルボキシル基をカルボジイミド（例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド等）により活性化しキャリアプロテインの一級アミンと反応させるＥＤＣ法、又はＭＢＳ（マレイミドベンゾイルオキシコハク酸イミド）型架橋剤を用い蛋白のアミノ基とペプチド（スアピノルフィン）のＳＨ基を結合するＭＢＳ法等が挙げられる。
上記により作製された抗体としては、ポリクロナール抗体或いはモノクロナール抗体のいずれも使用することができる。
【００２９】
上記で得られるスパイノルフィン抗体は、スパイノルフィンに特異的であることが好ましく、スパイノルフィン類似化合物、例えばＶＶＹＰＷＴ（配列表：配列番号２），ＶＹＰＷＴ（配列表：配列番号３），ヘモルフィン−４（ＹＰＷＴ；配列表：配列番号４），ＰＷＴ，ＬＶＶＹＰＷ（配列表：配列番号５），タイノルフィン（ＶＶＹＰＷ；配列表：配列番号６），ＶＹＰＷ（配列表：配列番号７），ＹＰＷ，ＬＶＶＹＰ（配列表：配列番号８），ＶＶＹＰ（配列表：配列番号９）及びＶＹＰ等と交叉反応を行なわないことが好ましい。
【００３０】
（Ｂ）工程について、前記（Ａ）工程で溶出したスパイノルフィンの、担体に固相化したスパイノルフィン及びスパイノルフィン抗体との接触は、上記スパイノルフィンウサギ抗体及び前記（Ａ）工程で溶出したスパイノルフィンを緩衝液（例えばトリス緩衝液生理食塩、リン酸緩衝液等）に溶解又は必要により希釈した溶液を、スパイノルフィンが固相化された担体に接触させることにより行なうのが好ましい。該接触は、通常約０〜室温で、静置又はゆっくり揺らしながら約３０分〜２時間、好ましくは約３０分〜１時間程度行なわれるのが好ましい。前記反応の期間に、担体に固相化されたスパイノルフィンと前記（Ａ）工程で溶出したスパイノルフィンがスパイノルフィン抗体と競合し、担体に固相化されたスパイノルフィンとスパイノルフィン抗体が結合し得る。
【００３１】
次いで（Ｃ）工程において、担体に固相化されたスパイノルフィンと結合しなかったスパイノルフィン抗体を除去する。
上記の除去は、例えば担体を傾け担体と接触している溶液を捨てるか、ピペットで吸引除去するのが好ましい。担体は、さらに、上記緩衝液等で、少なくとも３回、好ましくは約３〜６回程度洗浄するのが好ましい。
【００３２】
次いで、（Ｄ）工程では、上記（Ｃ）工程の担体に固相化されたスパイノルフィンと結合したスパイノルフィン抗体に、特異的に結合する標識二次抗体を接触させ、担体に固相化したスパイノルフィンに結合したスパイノルフィン抗体と標識二次抗体とを結合させる。
標識二次抗体としては、標識酵素又は蛍光色素で標識された抗ウサギＩｇＧヤギＩｇＧ抗体、ヤギ抗マウス抗体等が挙げられる。標識酵素としては、例えばペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、酸性ホスファターゼ、アルカリ性ホスファターゼ等が挙げられるが、ペルオキシダーゼが好ましく、西洋ワサビペルオキシダーゼがとりわけ好ましい。標識蛍光色素としては、例えばＭＦＰ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、ローダミン、フルオレセイン、Ｃｙ２又はＣｙ３等が挙げられる。
【００３３】
担体に固相化されたスパイノルフィンと結合したスパイノルフィン抗体と標識二次抗体との結合は、通常約０〜室温で、静置又はゆっくり揺らしながら約３０分〜２時間、好ましくは約３０分〜１時間程度反応させることによって行なわれるのが好ましい。
【００３４】
（Ｅ）工程は、上記（Ｄ）工程においてスパイノルフィン抗体と結合した標識二次抗体の標識量を測定する。
固相化抗原（スパイノルフィン）に結合したスパイノルフィン抗体と結合した標識二次抗体の標識量の測定は、例えば酵素で標識された二次抗体の場合であれば、標識酵素と基質との発色反応を利用して、その発色の色調に応じた波長の吸光度を測定することにより実施できる。標識酵素と基質との発色反応は、基質溶液を酵素標識二次抗体と接触させることにより行なうことができる。基質としては使用する標識酵素により異なるが、例えば標識酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼの場合、例えばｏーフェニレンジアミンや３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン等が基質として好ましく使用し得る。吸光度の測定は、発色後約１０〜６０分以内に測定することが好ましい。
蛍光標識の場合は、蛍光強度を蛍光光度計で測定すればよい。
なお、担体がマイクロプレートのような場合には、酵素標識の場合は吸光度を連続自動測定ができるオートリーダーやマイクロプレートリーダーを、蛍光標識の場合は、蛍光マイクロリーダー等を用いるのが好ましい。
【００３５】
上記スパイノルフィンの測定方法により、定量的に測定できるスパイノルフィンの濃度範囲は、好ましくは約１０−１０〜１０−７ｇ／ｍＬである。このため、スパイノルフィンが高濃度に存在する試料の場合は、上記した緩衝液等で適宜希釈するのがよい。
試料のジペプチジルペプチダーゼ活性とスパイノルフィン量には、
本発明の測定方法を用いることにより、例えば被験者の関節から採取される滑液中のスパイノルフィン量を測定し、スパイノルフィン量が約５ｎｇ／ｍＬ以下である場合に、被験者がリウマチであると推定できる。
【００３６】
次に、上記ジペプチジルペプチダーゼ活性とスパイノルフィン量は、以下の統計学的分析を行ない得る。例えばＲＡ患者とＯＡ患者の各滑液のジペプチジルペプチダーゼ活性とスパイノルフィン濃度を、例えばＭａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ ｔｅｓｔにより比較できる。比較の結果、危険率５％以下の場合に有意差があるとし得る。本発明に従えば、例えばジペプチジルペプチダーゼ活性を縦軸に、スパイノルフィン量を横軸にプロットニングすると、負の相関関係が得られる。このことから、ジペプチジルペプチダーゼ活性及びスパイノルフィン量の両特性値から診断推定することにより、より確率の高いＲＡの診断推定ができる。具体的には、例えば被験者の関節の滑液を試料として用いた場合、滑液中のジペプチジルペプチダーゼ活性が約２０ｐｍｏｌ／３０ｍｉｎ／ｍｇタンパク質以上、好ましくは約３０〜２００ｐｍｏｌ／３０ｍｉｎ／ｍｇタンパク質であって、かつスパイノルフィン量が５ｎｇ／ｍＬ以下であるとき、ＲＡである確率が非常に高い。
【００３７】
本発明のＲＡ診断キットにおいて、ジペプチジルペプチダーゼに特異的な蛍光基質としては、例えばＡｒｇ−Ａｒｇ基を有する蛍光合成基質、例えばＡｒｇ−Ａｒｇ−４−メチルクマリル−７−アミド又はＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−４−ＭＣＡ等が挙げられる。
アミノペプチダーゼ阻害剤としては、ベスタチン、ロイヒスチン等が挙げられる。
ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤としては、タイノルフィン等が挙げられる。
【００３８】
本発明のＲＡ診断キットによれば、簡易に短時間で精確に試料提供者をＲＡであるかどうかの診断ができる。
また、本発明において、上記ＲＡ診断キットに加え、スパイノルフィン抗体、コーティング用抗原（スパイノルフィン）、マイクロタイタープレート、標識二次抗体およびその他の試薬類を含む試料中のスパイノルフィン濃度の測定キットを使用することもできる。
【００３９】
スパイノルフィン濃度の測定キットにおいて、スパイノルフィン抗体としては、例えばスパイノルフィンウサギ抗体等が挙げられる。コーティング用抗原としては、スパイノルフィンを緩衝液に溶解したもの等が挙げられる。マイクロタイタープレートとしては、マイクロタイタープレートの表面にアミノ基、カルボキシル基等の活性な官能基を持たせたものや疎水性ポリマーのコートスライドしたものが好ましい。また、コーティング用抗原とマイクロタイタープレートの代わりに、マイクロタイタープレートに抗原としてスパイノルフィンを固相化したものをスパイノルフィン抗体及び標識二次抗体と共に、これらを含むキットを使用してもよい。標識二次抗体としては、上記した酵素標識二次抗体又は蛍光標識二次抗体が好ましい。また、その他の試薬類としては、例えば、酵素標識二次抗体がキットに含まれる場合、上記基質等が挙げられ、さらにプレートの洗浄液〔海面活性剤（例えばポリソルベート ２０等）などが添加された緩衝液等〕や緩衝液（例えばリン酸緩衝液、トリス緩衝液生理食塩水）等が挙げられる。
【００４０】
上記スパイノルフィン濃度の測定キットによれば、簡易に短時間で精確に試料中のスパイノルフィンの濃度を測定できる。
【００４１】
以下に実施例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４２】
試薬：
スパイノルフィンとタイノルフィンはＡｍｅｒｉｋａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡから入手した。
Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ及びべスタチンはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡから購入した。ＨＲＰ−Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）はＺｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｔｏｎ Ｃｏｕｒｔ，ＣＡ，ＵＳＡから購入した。ＯＤＳカラムとしてはＯＤＳ−Ａ ６０−６０／３０（ＹＭＣ社，京都、日本）を使用した。全ての他の試薬は特級品を使用した。
【００４３】
試料の採取：
関節の滑液をＯＡ患者４０人とＲＡ患者３９人から集めた。滑液のサンプルを患者のひざ関節から吸引し、プラスチック容器に入れ、４℃で１０分間１５００×ｇで遠心し、上清を分析時まで−２０℃で保存した。ＯＡとＲＡの診断はアメリカリウマチ学会（ＡＣＲ）の「ＡＣＲ改訂診断基準」に基づいて行なった。
ＯＡ患者の年齢は７４−８８歳（男性１１人、女性２９人）であった。平均罹患期間は６年（範囲：０．１−２０年）。ＲＡ患者の年齢は４４−７４歳（男性６人、女性３２人）であった。その平均罹患期間は１４．５年〔範囲：１−３６年、少関節破壊型（ＬＥＳ）３人，多関節破壊型（ＭＥＳ）２９人，ムチランス型（ＭＵＤ）６人〕であった。ＲＡの全ての患者は数種の医薬を服用していた。医薬は抗炎症薬、金、メトトレキサート、スルファサラジン、コルチコステロイド、ブシラミン及びＤ−ペニシラミンであった。滑液の吸引前に高濃度のコルチコステロイドや関節内ステロイドを処置されたものはいなかった。なお、患者からの同意は委員会で検討され、各患者から個々のインフォームドコンセプトを得た。
滑液中のタンパク質含有量をブラッドフォード法（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＵＳＡ，Ｐｉｅｒｃｅ社）により測定した。
【００４４】
統計的処理：
ＲＡ患者とＯＡ患者の滑液のジペプチジルペプチダーゼ活性とスパイノルフィン濃度はＭａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ ｔｅｓｔを用い、危険率５％以下を有意差有とした。
【実施例１】
【００４５】
ジペプチジルペプチダーゼ活性
ジペプチジルペプチダーゼ活性は特異的蛍光合成基質のＡｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡの加水分解により測定した。まず、３０μｇ／ｍＬのベスタチン及び１μＭのＡｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡを含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）１ｍＬを、３７度で３０分、プレインキュベーションした。プレインキュベーション後、前記緩衝液に、滑液（１００μＬ）を加え混合し、ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤１００μｇ／ｍＬの存在又は非存在下で、３７度で３０分、インキュベーションした。５０％（ｖ／ｖ）酢酸を加え反応を停止した。４℃で１０分間放置後、ジペプチジルペプチダーゼ活性として放出したＡＭＣの蛍光強度を、分光蛍光光度計Ｆ−２０００（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｃｏ．Ｌｔｄ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍで測定した。
ジペプチジルペプチダーゼ活性は以下の式により算出した。
活性＝（ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤非存在での基質分解活性）−（ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤存在下での基質分解活性）
ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤としては、タイノルフィン使用した。
なお、上記基質分解活性は、ＡＭＣの濃度と蛍光値の関係より標準曲線を描き、その標準曲線より算出することで、試料中のタンパク質１ｍｇに対する値に換算した。
【００４６】
結果：
ＲＡ患者とＯＡ患者の滑液のジペプチジルペプチダーゼ活性はそれぞれ４６．１±１９．６（ｎ＝２９）と１０．６±６．２（ｎ＝３３）ｐｍｏｌ／３０ｍｉｎ／ｍｇタンパクであった（図１）。
ＲＡ患者のジペプチジルペプチダーゼ活性はＯＡ患者に比較して約５倍高かった（ｐ＜０．００１）。
なお、ＲＡのジペプチジルペプチダーゼ活性と病気の重症度、罹患期間、Ｃ−反応型タンパクや血液沈降速度のような血清検査値との間に相関関係はなかった。
【実施例２】
【００４７】
スパイノルフィンの測定
滑液サンプル２ｍＬを等量の１０質量％トリクロロ酢酸と混合し、混合物を４℃で１時間静置した。
１５００×ｇで２０分間遠心分離し、その上清をＯＤＳカラムに付した。前記カラムを１０容積倍の水で洗浄し、８０％（ｖ／ｖ）メタノール水溶液でスパイノルフィンを溶出した。溶媒を蒸発後、溶出物をトリス緩衝液生理食塩（ＴＢＳ）０．５ｍＬに溶解し、試料とした。
９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｌａｔｅ，ＭａｘｉＳｏｒｐ Ｓｕｒｆａｃｅ，Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｄｅｎｍａｒｋ；以下、単にプレートともいう。）に、５０ｎｇスパイノルフィン／１００μＬ ＴＢＳを入れ、室温で１時間反応させ、プレートにスパイノルフィンを固相化した。スパイノルフィンを固相化したプレートを５回、０．１質量％ツウィーン ２０を含む１０ｍＭのＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）で洗浄した。次いでスパイノルフィンを固相化したプレートを室温で１時間、１０質量％スキムミルクと０．１質量％アジ化ナトリウムを含むＴＢＳ−Ｔでブロックした。プレートからスキムミルクを洗浄除去後、プレートにスパイノルフィンウサギ抗体を５μｇ／ウェルを添加し、試料の希釈溶液１００μＬを添加し、競合反応に付した。プレートをゆっくり揺らしながら１時間反応させた。プレートをそれから５回洗浄し、１００μＬの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−標識Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（１０００倍希釈）をプレートに添加し、室温で１時間反応させた。反応後、プレートは５回洗浄し、それから２．２μＭのｏ−フェニレンジアミンと０．０１４％（ｖ／ｖ）過酸化水素水を含むクエン酸緩衝液（０．１Ｍ，、ｐＨ５）１００μＬをプレートに添加した。プレートを２０分間静置後、オートリーダー（Ｋｏｒｏｎａ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｉｂａｒａｇｉ，日本）を用いて４０５ｎｍでプレートのウェル中の溶液の吸光度を測定した。試料中のスパイノルフィンの濃度を標準曲線の％Ｂ／Ｂｏ（吸光度比；吸光度をＢｌａｎｋ０の吸光度で割った値）から算出した。
【００４８】
結果
ＲＡ患者の滑液中のスパイノルフィン量は４．２±３．４ｎｇ／ｍＬ（ｎ＝２０）で、ＯＡ患者のそれは１０．１±７．１ｎｇ／ｍＬ（ｎ＝２３）であった（図２）。ＲＡ患者のスパイノルフィン量はＯＡ患者のそれより有意に低かった（Ｐ＜０．０１）。
【００４９】
２０サンプル中、ジペプチジルペプチダーゼ活性とスパイノルフィン量の両方を測ることができた滑液中の両者に負の相関関係が観察された（ｒ＝−０．５１）。
【００５０】
〔参考例〕
スパイノルフィンウサギ抗体の産生
スパイノルフィン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｉｎｃ．，Ｓuｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡから入手した。）をＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）を用いてＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）と結合させ、ＫＬＨ結合スパイノルフィンを得た。２羽のウサギ（ニュージーランドホワイト）の背中にＫＬＨ結合スパイノルフィンを皮下注射した。２週間間隔でＫＬＨ結合スパイノルフィンを８回免疫した。最後の免疫後、ウサギ心臓から採血し、採取した全血液から血清を分離し、スパイノルフィンウサギ抗体とした。抗体の力価は、２００ｎｇ／ウェルの固体抗原に、１００μＬ／ウェルの希釈血清を反応させ、洗浄後二次抗体を添加し、最終的に基質添加後の発色を測定した。希釈血清は、１０００倍希釈により開始し、３倍ずつ希釈し、最大８１０００倍まで希釈して用いた。
【００５１】
スパイノルフィン類似化合物［ＶＶＹＰＷＴ（配列表：配列番号２），ＶＹＰＷＴ（配列表：配列番号３）ヘモルフィン−４（ＹＰＷＴ；配列表：配列番号４），ＰＷＴ，ＬＶＶＹＰＷ（配列表：配列番号５），タイノルフィン（ＶＶＹＰＷ；配列表：配列番号６），ＶＹＰＷ（配列表：配列番号７），ＹＰＷ，ＬＶＶＹＰ（配列表：配列番号８），ＶＶＹＰ（配列表：配列番号９）及びＶＹＰ］の有する抗スパイノルフィンの交叉反応は、スパイノルフィンの０．１％より低かく、交叉反応は認められなかった。なお、類似化合物は特開２０００−９５７９４号公報に記載の方法に準じて合成した。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明は、ＲＡの新しい診断方法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、ＯＡ患者とＲＡ患者から採取した滑液中のジペプチジルペプチダーゼ活性を示す図である。
【図２】図２は、ＯＡ患者とＲＡ患者から採取した滑液中のスパイノルフィン量を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節リウマチの診断方法に関する。より詳しくは、本発明は、被験者の試料中の発現タンパク質であるジペプチジルペプチダーゼやスパイノルフィンを解析することにより関節リウマチを診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（以下、ＲＡと略記する。）は慢性的な多関節の滑膜性炎症及び軟骨と骨組織の進行性破壊を特徴とする疾患である。軟骨組織のプロテオグリカンとコラーゲンを分解する多数のタンパク質分解酵素（例えばマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、カテプシン、ペプチダーゼ等）の濃度上昇がそのような組織において見られることが知られている（非特許文献１、２参照）。さらに、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、種々のサトカイン及び酵素阻害因子もまたＲＡの病因に重要な役割を果たすことが知られている（非特許文献３，４参照）。これらのタンパク質は膝、関節部と複雑に関与しながら、慢性的炎症から関節の破壊に至るまで病状を憎悪化する。ＲＡ患者の薬物治療には、非ステロイド系の抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、抗リウマチ薬剤（ＤＭＡＲＤ）及び生物学的薬剤（抗ＴＮＦレセプター及びＩＬ−１拮抗剤）等が用いられている（非特許文献５−７参照）。しかしながら、懸命の治療にもかかわらず、多くのＲＡ患者の病状は回復せず痛みを感じ続け、骨破壊を受け続ける。ＲＡの痛みは、慢性的且つ侵害性であると考えられており、末梢部位（膝や関節）にある種々の侵害受容器を刺激し、脊髄を通じて大脳へと変換され知覚されるシグナルである。
【０００３】
ＲＡは上記したように重篤にいたる疾患でありながら、現在のＲＡの診断方法は、アメリカリウマチ学会（ＡＣＲ）の「ＡＣＲ改訂診断基準」に基づくものである。該診断基準は、１）１時間以上続く朝のこわばり（主に手指）；２）３箇所以上の関節腫れ；３）手の関節（手関節、中手指節関節、近位指節間接）の腫れ；４）対称性の関節（左右同じ関節）の腫れ；５）手のエックス線写真の異常所見；６）皮下結節、及び７）血液検査でリウマチ反応が陽性、である。このうち、４項目以上満たせばＲＡと診断される。前記血液検査は、血清中のリウマチ因子（ＲＦ）が主として測定される。ＲＦは、ＲＡ患者の血清中に高頻度で出現するＩｇＧのＦｃ部分に対する自己抗体である。健常人のＲＦはＩｇＧ以外の種々のタンパクにも反応するｐｏｌｙａｃｔｉｖｅな抗体であるが、ＲＡ患者由来のＲＦはｐｏｌｙａｃｔｉｖｅなもの以外にＩｇＧＦｃのみに反応するｍｏｎｏａｃｔｉｖｅなものが存在する。このｍｏｎｏａｃｔｉｖｅなＲＦは、ｐｏｌｙａｃｔｉｖｅなものに比べ、ＩｇＧＦｃに対する反応が約１００倍高い。このため、該ＲＦをＲＡ患者の判定の指標として測定するものである。しかし、ＲＡ患者でも常にＲＦが検出されない血清反応陰性ＲＡも存在し、また健常人でも陽性反応（２％程度）を呈しうることが知られている。
このため、ＲＡ患者の尿を、液体クロマトグラフィーを用いてＲＡ特有成分のクロマトピークの存在を以ってＲＡであると判定する方法（特許文献１参照）、糖タンパク質から糖鎖を切り出し、該糖鎖を標識した後精製して糖鎖分析用試料を調整し、調製した試料をＯＤＳ−シリカカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで分析し、試料の糖鎖組成を求めることにより、糖鎖組成変化に基づきＲＡを診断する方法（特許文献２参照）等が提案されている。
しかし、これらの方法も健常人と比べて高いピークが認められるというものであったり、分析用試料の調製が煩雑であったりで、満足すべきものではなかった。
【特許文献１】特開平７−７２１３３号公報
【特許文献２】特開平８−２２８７９５号公報
【非特許文献１】ランデュー・アール（Ｌａｎｄｅｗｅ Ｒ）他７名、アースリティス・アンド・リューマチズム（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ）、２００４年、第５０巻、ｐ．１３９０−１３９９
【非特許文献２】チェトベリコフ・アイ（Ｔｃｈｅｔｖｅｒｉｋｏｖ Ｉ）他７名、アナルズ・オブ・ザ・リウマチック・ディズィーズ（Ａｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ）、２００３年、第６２巻、ｐ．１０９４−１０９９
【非特許文献３】クロス・エー（Ｃｒｏｓｓ Ａ）他３名、アースリティス・アンド・リューマチズム（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ）、２００４年、第５０巻、ｐ．１４３０−１４３６
【非特許文献４】リープ・ティー（Ｒａａｐ Ｔ）他５名、ザ・ジャーナル・オブ・リウマトロジー（Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ）、２０００年、第２７巻、ｐ．２５５８−２５６５
【非特許文献５】クリミーク・ピー・エー（Ｋｌｉｍｉｕｋ ＰＡ）他３名、ザ・ジャーナル・オブ・リウマトロジー（Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ）、２００４年、第３１巻、ｐ．２３８−２４２
【非特許文献６】ドーガドス・エム（Ｄｏｕｇａｄｏｓ Ｍ）他６名、ザ・ジャーナル・オブ・リウマトロジー（Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ）、２００３年、第３０巻、ｐ．２５７２−２５７９
【非特許文献７】デー・エー（Ｄｅ Ａ）他７名、ザ・ジャーナル・オブ・リウマトロジー（Ｊ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ）、２００２年、第２９巻、ｐ．４６−５１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ＲＡの診断方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ＲＡの痛みは、慢性的且つ侵害性であると考えられており、末梢部位（膝や関節）にある種々の侵害受容器を刺激し、脊髄を通じて大脳へと変換され知覚されるシグナルである。
抗炎症性及び抗侵害性の活性化の役割を果たす、ウシ脊髄由来の内因性ペプチドであるスパイノルフィン（ＬＶＶＹＰＷＴ；配列表：配列番号１）と呼ばれる神経ペプチドが単離された。スパイノルフィンは動物モデルでブラジキニン（ＢＫ）誘発侵害受容性疼痛反応を抑制すること、また、スパイノルフィンは多形核好中球（ＰＭＮｓ）の種々の機能、例えばケモタキシス（走化性）、Ｏ２−生成やエクソサイトーシス等を抑制することが知られている。
【０００６】
本発明者らは、炎症と痛みのコントロールにおけるスパイノルフィンが果たす役割を解明するために、慢性的痛みと炎症症状を有するＲＡ患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）中のスパイノルフィンと代謝酵素の活性の変化に焦点を当て種々研究を重ねたところ、ＲＡ患者ではＣＳＦ中のスパイノルフィン量、スパイノルフィンプロセシング酵素、ジペプチジルペプチダーゼの活性化に変化が見られることを知見した。
更に本発明者らは、ジペプチジルペプチダーゼ活性とスパイノルフィンの炎症と侵害受容性疼痛反応メカニズムにおける役割を調べるために、ＲＡ患者と変形性関節炎（以下、ＯＡと略記する。）患者の関節から採取した滑液を用いジペプチジルペプチダーゼ活性とスパイノルフィン量を比較した。その結果、ＲＡ患者では、ジペプチジルペプチダーゼ活性が増加し、かつスパイノルフィン量が減少すること、及びジペプチジルペプチダーゼ活性の増加とスパイノルフィン量の減少に相関関係を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
〔１〕 哺乳動物から採取した試料のジペプチジルペプチダーゼ活性を測定することを特徴とする関節リウマチの診断方法、
［２］ 試料が関節滑液、血液及び脳脊髄液から選択される少なくとも１種であることを特徴とする前記［１］に記載の診断方法、
［３］ さらに哺乳動物から採取した試料中に存在するスパイノルフィンの量を測定することを特徴とする前記［１］又は［２］に記載の診断方法、
［４］ 測定された試料中のスパイノルフィン濃度５ｎｇ／ｍＬ以下が、関節リウマチ疾患推定スパイノルフィン量であることを特徴とする前記［３］に記載の診断方法、
［５］ ジペプチジルペプチダーゼに特異的な蛍光基質及びアミノペプチダーゼ阻害剤に、ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤の存在あるいは非存在下において、試料を反応させ、反応後の反応液の蛍光強度を測定することを特徴とする、前記［１］に記載の診断のためのジペプチジルペプチダーゼ活性の測定方法、
［６］ 蛍光基質がＡｒｇ−Ａｒｇ基を有する蛍光合成基質であることを特徴とする前記［５］に記載の測定方法、
［７］ 蛍光合成基質がＡｒｇ−Ａｒｇ−４−メチルクマリル−７−アミドであることを特徴とする前記［６］に記載の測定方法、
［８］ 反応によって生成した７−アミノ−４−メチルクマリンの蛍光強度を測定することを特徴とする前記［７］に記載の測定方法、
［９］ アミノペプチダーゼ阻害剤が、ベスタチンであることを特徴とする前記［５］〜［８］のいずれかに記載の測定方法、
［１０］ ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤がタイノルフィンであることを特徴とする前記［５］〜［９］いずれかに記載の測定方法、
［１１］ ジペプチジルペプチダーゼに特異的な蛍光基質、アミノペプチダーゼ阻害剤及びジペプチジルペプチダーゼ阻害剤を含む関節リウマチ診断キット、
［１２］ 蛍光基質が、Ａｒｇ−Ａｒｇ基を有する蛍光合成基質であることを特徴とする前記［１１］に記載のキット、及び
［１３］ 合成基質がＡｒｇ−Ａｒｇ−４−メチルクマリル−７−アミドであることを特徴とする前記［１２］に記載のキット、
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明に従えば、ＲＡ患者では、試料、特に関節から採取された滑液中のジペプチジルペプチダーゼ活性がＯＡ患者のそれと比較して特異的に高い。このことは、試料中のジペプチジルペプチダーゼ活性がＲＡ診断の指標となり得ることを示すものである。従って、試料中のジペプチジルペプチダーゼ活性を測定し、ＲＡの診断推定を行なうことは、ＲＡの新しい診断方法として使用できる。
また、ＲＡ患者では、試料、特に関節から採取された滑液中のスパイノルフィン量が５ｎｇ／ｍＬと低値である。このことは、試料中のスパイノルフィン量がＲＡ診断の指標となり得ることを示すものである。
従って、上記ジペプチジルペプチダーゼ活性の測定に加え、スパイノルフィン量を測定することにより、ＲＡの診断推定を行なうことは、ＲＡ診断の精度を高めることができ、ＲＡの新しい診断方法として使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下に本発明のＲＡの診断方法について説明する。
本発明において使用することのできる試料としては、哺乳動物であれば特に制限はなく、例えばヒト、ラット、マウス、イヌ、ウシ、ネコ、ウサギ、モルモット等の脳脊髄液、関節滑液、血液、血漿、血清、唾液又は尿等の生体試料並びに動物における各種の臓器や組織等を挙げることができるが、関節滑液、血液又は脳脊髄液が好ましい。
【００１０】
試料におけるジペプチジルペプチダーゼ活性の測定は、ジペプチジルペプチダーゼに特異的な蛍光基質及びアミノペプチダーゼ阻害剤を含む反応液に、ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤の存在あるいは非存在下において試料を反応させ、反応後の反応液の蛍光強度を測定することにより行なうことができる。
【００１１】
まず、反応液を作製する。ジペプチジルペプチダーゼ活性の好適なｐＨ、好ましくはｐＨ約７〜９の緩衝液に、蛍光基質とアミノペプチダーゼ阻害剤を加えることによって作製される反応液と、前記緩衝液と蛍光基質とアミノペプチダーゼ阻害剤以外にさらにジペプチジルペプチダーゼ阻害剤を加えた反応液とを作製する。
【００１２】
前記緩衝液としては、例えばトリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液等が挙げられる。
【００１３】
蛍光基質としては、Ａｒｇ−Ａｒｇ基を有する合成基質、例えばＡｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＡＭＣ等が挙げられる。なお、前記ＭＣＡは４−メチルクマリル−７−アミドを、Ｂｏｃはｔ−ブトキシカルボニル基を、Ｓｕｃはサクシニル基を、ＡＭＣは７−アミノ−４−メチルクマリンを示す。以下、ＭＣＡ、Ｂｏｃ、ＡＭＣにおいて同義である。
【００１４】
蛍光基質の量は、試料中のジペプチジルペプチダーゼと反応するのに充分な量を加えることが好ましく、通常約０．２〜５μＭ程度が好ましい。
【００１５】
アミノペプチダーゼ阻害剤としては、ベスタチン、ロイヒスチン等を好ましく挙げることができる。アミノペプチダーゼ阻害剤を加えるのは、上記基質にアミノペプチダーゼが作用するのを阻害し、ジペプチジルペプチダーゼと基質との基質特異性を高めるためである。これにより、試料中のアミノペプチダーゼの酵素活性を失活し得る。従って、アミノペプチダーゼ阻害剤の量は、試料中のアミノペプチダーゼ活性を抑制するのに充分な量を加えることが好ましく、通常約５０〜２５０μｇ／ｍＬ程度が好ましい。
【００１６】
なお、前記蛍光合成基質は、アミノペプチダーゼ阻害剤と共に、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃付近で、約１〜３０分間プレインキュベートするのが好ましい。
【００１７】
ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤としては、使用するジペプチジルペプチダーゼを特異的に阻害するものを選択するのが好ましく、例えばタイノルフィン等が挙げられる。ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤は、試料中のジペプチジルペプチダーゼ活性を抑制するのに充分な量を加えることが好ましく、通常約５０〜２００μｇ／ｍＬ程度が好ましい。
【００１８】
試料と上記反応液との反応は、約２０〜４０℃、好ましくは、約３７℃付近で、通常約１０〜６０分、好ましくは約２０〜４０分間インキュベートするのが好ましい。該インキュベートにより、前記蛍光基質は、酵素（ジペプチジルペプチダーゼ）によって、例えば蛍光基質としてＡｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡを用いた場合、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）を反応液中に遊離させる。この反応は以下；
Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ →Ａｒｇ−Ａｒｇ ＋ ＡＭＣ
によって示すことができる。
次いで、上記反応液に反応停止液、例えば酢酸、酢酸ナトリウム等を加え反応を停止するのが好ましい。
反応停止後、遊離された反応生成物の蛍光強度を測定する。蛍光強度の測定波長は反応生成物により異なり、例えば反応生成物が上記ＡＭＣの場合、励起波長：３６０ｎｍ、蛍光波長：４４０ｎｍにて測定され得る。
【００１９】
そして、試料中のジペプチジルペプチダーゼ活性は、以下の式；
活性＝（ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤非存在での基質分解活性）−（ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤存在下での基質分解活性）
で説明される。
活性は、試料中に含まれる総タンパク質の量からタンパク質１ｍｇ当たりの活性、すなわちｐｍｏｌ／インキュベーション時間（分）／ｍｇタンパクの単位で表すことができる。
試料中の総タンパク質の量は、公知のタンパク質測定法、例えばブラッドフォード法（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＵＳＡ，Ｐｉｅｒｃｅ社）等により測定できる。
上記基質分解活性は、ＡＭＣの濃度と蛍光値の関係より、標準曲線を描き、その標準曲線より算出することで、試料中のタンパク質１ｍｇに対する値に換算できる。
【００２０】
上記方法に基づく測定により得られるジペプチジルペプチダーゼ活性は、その測定条件（反応温度、反応時間等）などにより異なるが、得られる該活性値を基にＲＡの診断をし得る。例えば被験者の関節から採取した滑液を試料として、例えば３０μｇ／ｍＬのベスタチンを含有する５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）１ｍＬからなる反応混合物中で、滑液（１００μＬ）を１μＭのＡｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡと共に、タイノルフィンの存在又は非存在下で、３７度で３０分インキュベーションし、インキュベーション後の溶液の蛍光（励起波長：３６０ｎｍ，蛍光波長：４４０ｎｍ）を測定し、ジペプチジルペプチダーゼ活性が、約２０ｐｍｏｌ／３０ｍｉｎ／ｍｇタンパク質以上、好ましくは約３０〜２００ｐｍｏｌ／３０ｍｉｎ／ｍｇタンパク質の場合にＲＡと診断推定し得る。
【００２１】
上記ジペプチジルペプチダーゼ活性の測定により、測定され得るジペプチジルペプチダーゼとしては、例えばエンケファリン分解酵素のジペプチジルペプチダーゼＩＩＩ（ＤＰＰＩＩＩ）、リソソームシステインプロテアーゼのジペプチジルペプチダーゼＩ（ＤＰＰＩ）、ジペプチジルペプチダーゼＩＩ（ＤＰＰＩＩ）、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）等が挙げられるが、これらに限定されない。ジペプチジルペプチダーゼがいずれであるにしても、上記方法により、測定されるジペプチジルペプチダーゼ活性が高ければ、ＲＡと診断推定し得る。
【００２２】
また、本発明は上記ジペプチジルペプチダーゼ活性の測定に加え、さらに試料中に存在するスパイノルフィン量を測定することによるＲＡの診断方法も提供する。
【００２３】
試料中に存在するスパイノルフィン量の測定は、次の（Ａ）〜（Ｅ）工程を含む；
（Ａ）生体から採取した試料をトリクロロ酢酸と混合して得られる溶液相を逆相カラムクロマトグラフィーに付し、溶媒でスパイノルフィンを溶出する工程；
（Ｂ）前記（Ａ）工程で溶出したスパイノルフィンを、担体に固相化したスパイノルフィン及びスパイノルフィン抗体と接触させる工程；
（Ｃ）担体に固相化されたスパイノルフィンと結合しなかったスパイノルフィン抗体を除去する工程；
（Ｄ）上記（Ｃ）工程の担体に固相化されたスパイノルフィンと結合したスパイノルフィン抗体に、特異的に結合する標識二次抗体を接触させ、担体に固相化したスパイノルフィンに結合したスパイノルフィン抗体と標識二次抗体とを結合する工程；及び
（Ｅ）スパイノルフィン抗体と結合している標識二次抗体の標識量を測定する工程。
【００２４】
上記（Ａ）工程は、生体から採取した試料をトリクロロ酢酸と混合して得られる溶液相を逆相カラムクロマトグラフィーに付し、溶媒でスパイノルフィンを溶出する。
トリクロロ酢酸の濃度は、測定する生体試料によっても異なるが、約５〜２０質量％トリクロロ酢酸水溶液として用いるのが好ましい。トリクロロ酢酸の量は生体試料中のタンパク質を沈殿させるに充分な量がよく、生体試料溶液の１容積に対し、前記トリクロロ酢酸水溶液を約０．５〜２容積比加えるのが好ましい。溶液相の分離手段はろ過、遠心分離等公知の方法を用い得る。
【００２５】
上記逆相カラムクロマトグラフィーのカラムとしては、例えばＯＤＳカラム等が好ましく挙げられる。ＯＤＳカラムクロマトグラフィーとは、シリカゲル担体にオクタデシルシリル基（ＯＤＳ基，Ｃ１８基）を化学結合した充填剤が詰められているカラムである。ＯＤＳカラムとしては、例えばＯＤＳ−Ａ ６０−６０／３０（ＹＭＣ社製）、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ（ジーエルサイエンス株式会社製）、Ｌ−ｃｏｌｕｍｎ ＯＤＳ （財団法人化学物質評価研究機構製）、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ ＵＧ−５（野村化学株式会社製）、ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８ ＭＧＩＩ（株式会社資生堂製）、ＺＯＲＢＡＸ ＸＤＢ−Ｃ１８（横河アナリティカルシステムズ株式会社製）、Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８（ウォーターズ社製）、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ Ｃ１８（Ｍ．ナーゲル社製）等を挙げることができる。
【００２６】
上記スパイノルフィンの溶出に用いられる溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、プロパノール等の炭素数１〜５のアルコールもしくはアセトニトリル、又はこれらの２種以上を混合した溶媒等或いは前記溶媒と水との混合溶媒等が挙げられる。
【００２７】
次いで、（Ｂ）工程において、前記（Ａ）工程で溶出したスパイノルフィンを、担体に固相化したスパイノルフィン及びスパイノルフィン抗体と接触させる。
ここで、スパイノルフィンを固相化する担体としては、マイクロタイタープレートや試験管、ポリマービーズ等が挙げられるが、スパイノルフィンがオリゴペプチドであることから、前記担体表面にアミノ基、カルボキシル基等の活性な官能基を持たせたものや疎水性ポリマーのコートスライド〔例えばＩｍｍｕｎｏ Ｐｌａｔｅ，ＭａｘｉＳｏｒｐ（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製）〕等を施したものが好ましい。担体へのスパイノルフィンの固相化は、前記担体の表面とスパイノルフィンを共有結合で結合させることが好ましい。前記結合はスパイノルフィンを緩衝液、例えばリン酸緩衝液又はトリス塩酸生理食塩水等に溶解し、前記担体と接触させ、少なくとも約３０分以上、好ましくは約３０〜１２０分、温度約０〜５０℃、好ましくは室温で、インキュベートするのが好ましい。スパイノルフィンを固相化した担体はブロッキング剤でブロッキングされることが好ましい。ブロッキング剤としては、例えばスキムミルク、Ｂｌｏｃｋ ＡｃｅＴＭ等が挙げられる。
なお、スパイノルフィンは、公知の方法、例えば特開２０００−９５７９４号公報記載の方法により製造することができる。
【００２８】
本発明で使用するスパイノルフィン抗体としては、スパイノルフィンに特異的に結合する抗体であれば、いずれの抗体も好ましく用いることができる。スパイノルフィン抗体は、スパイノルフィンを抗原として用いて、動物、例えばウサギ、ラット等を感作し、常法により分離・精製して容易に作製することができる。なお、スパイノルフィンは７アミノ酸から構成されるペプチドであり、通常、免疫原性を示すには短すぎるので、キャリアタンパク質を用いて免疫原性を増強させるためコンジュゲーションを行うのが好ましい。コンジュゲーションのためのキャリアタンパク質としては、例えばＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、ウシ血清アルブミン又はオバルブミン等が挙げられる。コンジュゲーションの方法としては、例えばスパイノルフィンのＣ末端のカルボキシル基をカルボジイミド（例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド等）により活性化しキャリアプロテインの一級アミンと反応させるＥＤＣ法、又はＭＢＳ（マレイミドベンゾイルオキシコハク酸イミド）型架橋剤を用い蛋白のアミノ基とペプチド（スアピノルフィン）のＳＨ基を結合するＭＢＳ法等が挙げられる。
上記により作製された抗体としては、ポリクロナール抗体或いはモノクロナール抗体のいずれも使用することができる。
【００２９】
上記で得られるスパイノルフィン抗体は、スパイノルフィンに特異的であることが好ましく、スパイノルフィン類似化合物、例えばＶＶＹＰＷＴ（配列表：配列番号２），ＶＹＰＷＴ（配列表：配列番号３），ヘモルフィン−４（ＹＰＷＴ；配列表：配列番号４），ＰＷＴ，ＬＶＶＹＰＷ（配列表：配列番号５），タイノルフィン（ＶＶＹＰＷ；配列表：配列番号６），ＶＹＰＷ（配列表：配列番号７），ＹＰＷ，ＬＶＶＹＰ（配列表：配列番号８），ＶＶＹＰ（配列表：配列番号９）及びＶＹＰ等と交叉反応を行なわないことが好ましい。
【００３０】
（Ｂ）工程について、前記（Ａ）工程で溶出したスパイノルフィンの、担体に固相化したスパイノルフィン及びスパイノルフィン抗体との接触は、上記スパイノルフィンウサギ抗体及び前記（Ａ）工程で溶出したスパイノルフィンを緩衝液（例えばトリス緩衝液生理食塩、リン酸緩衝液等）に溶解又は必要により希釈した溶液を、スパイノルフィンが固相化された担体に接触させることにより行なうのが好ましい。該接触は、通常約０〜室温で、静置又はゆっくり揺らしながら約３０分〜２時間、好ましくは約３０分〜１時間程度行なわれるのが好ましい。前記反応の期間に、担体に固相化されたスパイノルフィンと前記（Ａ）工程で溶出したスパイノルフィンがスパイノルフィン抗体と競合し、担体に固相化されたスパイノルフィンとスパイノルフィン抗体が結合し得る。
【００３１】
次いで（Ｃ）工程において、担体に固相化されたスパイノルフィンと結合しなかったスパイノルフィン抗体を除去する。
上記の除去は、例えば担体を傾け担体と接触している溶液を捨てるか、ピペットで吸引除去するのが好ましい。担体は、さらに、上記緩衝液等で、少なくとも３回、好ましくは約３〜６回程度洗浄するのが好ましい。
【００３２】
次いで、（Ｄ）工程では、上記（Ｃ）工程の担体に固相化されたスパイノルフィンと結合したスパイノルフィン抗体に、特異的に結合する標識二次抗体を接触させ、担体に固相化したスパイノルフィンに結合したスパイノルフィン抗体と標識二次抗体とを結合させる。
標識二次抗体としては、標識酵素又は蛍光色素で標識された抗ウサギＩｇＧヤギＩｇＧ抗体、ヤギ抗マウス抗体等が挙げられる。標識酵素としては、例えばペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、酸性ホスファターゼ、アルカリ性ホスファターゼ等が挙げられるが、ペルオキシダーゼが好ましく、西洋ワサビペルオキシダーゼがとりわけ好ましい。標識蛍光色素としては、例えばＭＦＰ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、ローダミン、フルオレセイン、Ｃｙ２又はＣｙ３等が挙げられる。
【００３３】
担体に固相化されたスパイノルフィンと結合したスパイノルフィン抗体と標識二次抗体との結合は、通常約０〜室温で、静置又はゆっくり揺らしながら約３０分〜２時間、好ましくは約３０分〜１時間程度反応させることによって行なわれるのが好ましい。
【００３４】
（Ｅ）工程は、上記（Ｄ）工程においてスパイノルフィン抗体と結合した標識二次抗体の標識量を測定する。
固相化抗原（スパイノルフィン）に結合したスパイノルフィン抗体と結合した標識二次抗体の標識量の測定は、例えば酵素で標識された二次抗体の場合であれば、標識酵素と基質との発色反応を利用して、その発色の色調に応じた波長の吸光度を測定することにより実施できる。標識酵素と基質との発色反応は、基質溶液を酵素標識二次抗体と接触させることにより行なうことができる。基質としては使用する標識酵素により異なるが、例えば標識酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼの場合、例えばｏーフェニレンジアミンや３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン等が基質として好ましく使用し得る。吸光度の測定は、発色後約１０〜６０分以内に測定することが好ましい。
蛍光標識の場合は、蛍光強度を蛍光光度計で測定すればよい。
なお、担体がマイクロプレートのような場合には、酵素標識の場合は吸光度を連続自動測定ができるオートリーダーやマイクロプレートリーダーを、蛍光標識の場合は、蛍光マイクロリーダー等を用いるのが好ましい。
【００３５】
上記スパイノルフィンの測定方法により、定量的に測定できるスパイノルフィンの濃度範囲は、好ましくは約１０−１０〜１０−７ｇ／ｍＬである。このため、スパイノルフィンが高濃度に存在する試料の場合は、上記した緩衝液等で適宜希釈するのがよい。
試料のジペプチジルペプチダーゼ活性とスパイノルフィン量には、
本発明の測定方法を用いることにより、例えば被験者の関節から採取される滑液中のスパイノルフィン量を測定し、スパイノルフィン量が約５ｎｇ／ｍＬ以下である場合に、被験者がリウマチであると推定できる。
【００３６】
次に、上記ジペプチジルペプチダーゼ活性とスパイノルフィン量は、以下の統計学的分析を行ない得る。例えばＲＡ患者とＯＡ患者の各滑液のジペプチジルペプチダーゼ活性とスパイノルフィン濃度を、例えばＭａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ ｔｅｓｔにより比較できる。比較の結果、危険率５％以下の場合に有意差があるとし得る。本発明に従えば、例えばジペプチジルペプチダーゼ活性を縦軸に、スパイノルフィン量を横軸にプロットニングすると、負の相関関係が得られる。このことから、ジペプチジルペプチダーゼ活性及びスパイノルフィン量の両特性値から診断推定することにより、より確率の高いＲＡの診断推定ができる。具体的には、例えば被験者の関節の滑液を試料として用いた場合、滑液中のジペプチジルペプチダーゼ活性が約２０ｐｍｏｌ／３０ｍｉｎ／ｍｇタンパク質以上、好ましくは約３０〜２００ｐｍｏｌ／３０ｍｉｎ／ｍｇタンパク質であって、かつスパイノルフィン量が５ｎｇ／ｍＬ以下であるとき、ＲＡである確率が非常に高い。
【００３７】
本発明のＲＡ診断キットにおいて、ジペプチジルペプチダーゼに特異的な蛍光基質としては、例えばＡｒｇ−Ａｒｇ基を有する蛍光合成基質、例えばＡｒｇ−Ａｒｇ−４−メチルクマリル−７−アミド又はＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−４−ＭＣＡ等が挙げられる。
アミノペプチダーゼ阻害剤としては、ベスタチン、ロイヒスチン等が挙げられる。
ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤としては、タイノルフィン等が挙げられる。
【００３８】
本発明のＲＡ診断キットによれば、簡易に短時間で精確に試料提供者をＲＡであるかどうかの診断ができる。
また、本発明において、上記ＲＡ診断キットに加え、スパイノルフィン抗体、コーティング用抗原（スパイノルフィン）、マイクロタイタープレート、標識二次抗体およびその他の試薬類を含む試料中のスパイノルフィン濃度の測定キットを使用することもできる。
【００３９】
スパイノルフィン濃度の測定キットにおいて、スパイノルフィン抗体としては、例えばスパイノルフィンウサギ抗体等が挙げられる。コーティング用抗原としては、スパイノルフィンを緩衝液に溶解したもの等が挙げられる。マイクロタイタープレートとしては、マイクロタイタープレートの表面にアミノ基、カルボキシル基等の活性な官能基を持たせたものや疎水性ポリマーのコートスライドしたものが好ましい。また、コーティング用抗原とマイクロタイタープレートの代わりに、マイクロタイタープレートに抗原としてスパイノルフィンを固相化したものをスパイノルフィン抗体及び標識二次抗体と共に、これらを含むキットを使用してもよい。標識二次抗体としては、上記した酵素標識二次抗体又は蛍光標識二次抗体が好ましい。また、その他の試薬類としては、例えば、酵素標識二次抗体がキットに含まれる場合、上記基質等が挙げられ、さらにプレートの洗浄液〔海面活性剤（例えばポリソルベート ２０等）などが添加された緩衝液等〕や緩衝液（例えばリン酸緩衝液、トリス緩衝液生理食塩水）等が挙げられる。
【００４０】
上記スパイノルフィン濃度の測定キットによれば、簡易に短時間で精確に試料中のスパイノルフィンの濃度を測定できる。
【００４１】
以下に実施例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４２】
試薬：
スパイノルフィンとタイノルフィンはＡｍｅｒｉｋａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡから入手した。
Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡ及びべスタチンはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡから購入した。ＨＲＰ−Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）はＺｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｔｏｎ Ｃｏｕｒｔ，ＣＡ，ＵＳＡから購入した。ＯＤＳカラムとしてはＯＤＳ−Ａ ６０−６０／３０（ＹＭＣ社，京都、日本）を使用した。全ての他の試薬は特級品を使用した。
【００４３】
試料の採取：
関節の滑液をＯＡ患者４０人とＲＡ患者３９人から集めた。滑液のサンプルを患者のひざ関節から吸引し、プラスチック容器に入れ、４℃で１０分間１５００×ｇで遠心し、上清を分析時まで−２０℃で保存した。ＯＡとＲＡの診断はアメリカリウマチ学会（ＡＣＲ）の「ＡＣＲ改訂診断基準」に基づいて行なった。
ＯＡ患者の年齢は７４−８８歳（男性１１人、女性２９人）であった。平均罹患期間は６年（範囲：０．１−２０年）。ＲＡ患者の年齢は４４−７４歳（男性６人、女性３２人）であった。その平均罹患期間は１４．５年〔範囲：１−３６年、少関節破壊型（ＬＥＳ）３人，多関節破壊型（ＭＥＳ）２９人，ムチランス型（ＭＵＤ）６人〕であった。ＲＡの全ての患者は数種の医薬を服用していた。医薬は抗炎症薬、金、メトトレキサート、スルファサラジン、コルチコステロイド、ブシラミン及びＤ−ペニシラミンであった。滑液の吸引前に高濃度のコルチコステロイドや関節内ステロイドを処置されたものはいなかった。なお、患者からの同意は委員会で検討され、各患者から個々のインフォームドコンセプトを得た。
滑液中のタンパク質含有量をブラッドフォード法（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＵＳＡ，Ｐｉｅｒｃｅ社）により測定した。
【００４４】
統計的処理：
ＲＡ患者とＯＡ患者の滑液のジペプチジルペプチダーゼ活性とスパイノルフィン濃度はＭａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ ｔｅｓｔを用い、危険率５％以下を有意差有とした。
【実施例１】
【００４５】
ジペプチジルペプチダーゼ活性
ジペプチジルペプチダーゼ活性は特異的蛍光合成基質のＡｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡの加水分解により測定した。まず、３０μｇ／ｍＬのベスタチン及び１μＭのＡｒｇ−Ａｒｇ−ＭＣＡを含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）１ｍＬを、３７度で３０分、プレインキュベーションした。プレインキュベーション後、前記緩衝液に、滑液（１００μＬ）を加え混合し、ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤１００μｇ／ｍＬの存在又は非存在下で、３７度で３０分、インキュベーションした。５０％（ｖ／ｖ）酢酸を加え反応を停止した。４℃で１０分間放置後、ジペプチジルペプチダーゼ活性として放出したＡＭＣの蛍光強度を、分光蛍光光度計Ｆ−２０００（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｃｏ．Ｌｔｄ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍで測定した。
ジペプチジルペプチダーゼ活性は以下の式により算出した。
活性＝（ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤非存在での基質分解活性）−（ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤存在下での基質分解活性）
ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤としては、タイノルフィン使用した。
なお、上記基質分解活性は、ＡＭＣの濃度と蛍光値の関係より標準曲線を描き、その標準曲線より算出することで、試料中のタンパク質１ｍｇに対する値に換算した。
【００４６】
結果：
ＲＡ患者とＯＡ患者の滑液のジペプチジルペプチダーゼ活性はそれぞれ４６．１±１９．６（ｎ＝２９）と１０．６±６．２（ｎ＝３３）ｐｍｏｌ／３０ｍｉｎ／ｍｇタンパクであった（図１）。
ＲＡ患者のジペプチジルペプチダーゼ活性はＯＡ患者に比較して約５倍高かった（ｐ＜０．００１）。
なお、ＲＡのジペプチジルペプチダーゼ活性と病気の重症度、罹患期間、Ｃ−反応型タンパクや血液沈降速度のような血清検査値との間に相関関係はなかった。
【実施例２】
【００４７】
スパイノルフィンの測定
滑液サンプル２ｍＬを等量の１０質量％トリクロロ酢酸と混合し、混合物を４℃で１時間静置した。
１５００×ｇで２０分間遠心分離し、その上清をＯＤＳカラムに付した。前記カラムを１０容積倍の水で洗浄し、８０％（ｖ／ｖ）メタノール水溶液でスパイノルフィンを溶出した。溶媒を蒸発後、溶出物をトリス緩衝液生理食塩（ＴＢＳ）０．５ｍＬに溶解し、試料とした。
９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｌａｔｅ，ＭａｘｉＳｏｒｐ Ｓｕｒｆａｃｅ，Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｄｅｎｍａｒｋ；以下、単にプレートともいう。）に、５０ｎｇスパイノルフィン／１００μＬ ＴＢＳを入れ、室温で１時間反応させ、プレートにスパイノルフィンを固相化した。スパイノルフィンを固相化したプレートを５回、０．１質量％ツウィーン ２０を含む１０ｍＭのＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）で洗浄した。次いでスパイノルフィンを固相化したプレートを室温で１時間、１０質量％スキムミルクと０．１質量％アジ化ナトリウムを含むＴＢＳ−Ｔでブロックした。プレートからスキムミルクを洗浄除去後、プレートにスパイノルフィンウサギ抗体を５μｇ／ウェルを添加し、試料の希釈溶液１００μＬを添加し、競合反応に付した。プレートをゆっくり揺らしながら１時間反応させた。プレートをそれから５回洗浄し、１００μＬの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−標識Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（１０００倍希釈）をプレートに添加し、室温で１時間反応させた。反応後、プレートは５回洗浄し、それから２．２μＭのｏ−フェニレンジアミンと０．０１４％（ｖ／ｖ）過酸化水素水を含むクエン酸緩衝液（０．１Ｍ，、ｐＨ５）１００μＬをプレートに添加した。プレートを２０分間静置後、オートリーダー（Ｋｏｒｏｎａ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｉｂａｒａｇｉ，日本）を用いて４０５ｎｍでプレートのウェル中の溶液の吸光度を測定した。試料中のスパイノルフィンの濃度を標準曲線の％Ｂ／Ｂｏ（吸光度比；吸光度をＢｌａｎｋ０の吸光度で割った値）から算出した。
【００４８】
結果
ＲＡ患者の滑液中のスパイノルフィン量は４．２±３．４ｎｇ／ｍＬ（ｎ＝２０）で、ＯＡ患者のそれは１０．１±７．１ｎｇ／ｍＬ（ｎ＝２３）であった（図２）。ＲＡ患者のスパイノルフィン量はＯＡ患者のそれより有意に低かった（Ｐ＜０．０１）。
【００４９】
２０サンプル中、ジペプチジルペプチダーゼ活性とスパイノルフィン量の両方を測ることができた滑液中の両者に負の相関関係が観察された（ｒ＝−０．５１）。
【００５０】
〔参考例〕
スパイノルフィンウサギ抗体の産生
スパイノルフィン（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｉｎｃ．，Ｓuｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡから入手した。）をＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）を用いてＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）と結合させ、ＫＬＨ結合スパイノルフィンを得た。２羽のウサギ（ニュージーランドホワイト）の背中にＫＬＨ結合スパイノルフィンを皮下注射した。２週間間隔でＫＬＨ結合スパイノルフィンを８回免疫した。最後の免疫後、ウサギ心臓から採血し、採取した全血液から血清を分離し、スパイノルフィンウサギ抗体とした。抗体の力価は、２００ｎｇ／ウェルの固体抗原に、１００μＬ／ウェルの希釈血清を反応させ、洗浄後二次抗体を添加し、最終的に基質添加後の発色を測定した。希釈血清は、１０００倍希釈により開始し、３倍ずつ希釈し、最大８１０００倍まで希釈して用いた。
【００５１】
スパイノルフィン類似化合物［ＶＶＹＰＷＴ（配列表：配列番号２），ＶＹＰＷＴ（配列表：配列番号３）ヘモルフィン−４（ＹＰＷＴ；配列表：配列番号４），ＰＷＴ，ＬＶＶＹＰＷ（配列表：配列番号５），タイノルフィン（ＶＶＹＰＷ；配列表：配列番号６），ＶＹＰＷ（配列表：配列番号７），ＹＰＷ，ＬＶＶＹＰ（配列表：配列番号８），ＶＶＹＰ（配列表：配列番号９）及びＶＹＰ］の有する抗スパイノルフィンの交叉反応は、スパイノルフィンの０．１％より低かく、交叉反応は認められなかった。なお、類似化合物は特開２０００−９５７９４号公報に記載の方法に準じて合成した。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明は、ＲＡの新しい診断方法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、ＯＡ患者とＲＡ患者から採取した滑液中のジペプチジルペプチダーゼ活性を示す図である。
【図２】図２は、ＯＡ患者とＲＡ患者から採取した滑液中のスパイノルフィン量を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物から採取した試料のジペプチジルペプチダーゼ活性を測定することを特徴とする関節リウマチの診断方法。
【請求項２】
試料が関節滑液、血液及び脳脊髄液から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項１に記載の診断方法。
【請求項３】
さらに哺乳動物から採取した試料中に存在するスパイノルフィンの量を測定することを特徴とする請求項１又は２に記載の診断方法。
【請求項４】
測定された試料中のスパイノルフィン濃度５ｎｇ／ｍＬ以下が、関節リウマチ疾患推定スパイノルフィン量であることを特徴とする請求項３記載の診断方法。
【請求項５】
ジペプチジルペプチダーゼに特異的な蛍光基質及びアミノペプチダーゼ阻害剤に、ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤の存在あるいは非存在下において、試料を反応させ、反応後の反応液の蛍光強度を測定することを特徴とする、請求項１記載の診断のためのジペプチジルペプチダーゼ活性の測定方法。
【請求項６】
蛍光基質がＡｒｇ−Ａｒｇ基を有する蛍光合成基質であることを特徴とする請求項５に記載の測定方法。
【請求項７】
蛍光合成基質がＡｒｇ−Ａｒｇ−４−メチルクマリル−７−アミドであることを特徴とする請求項６に記載の測定方法。
【請求項８】
反応によって生成した７−アミノ−４−メチルクマリンの蛍光強度を測定することを特徴とする請求項７に記載の測定方法。
【請求項９】
アミノペプチダーゼ阻害剤が、ベスタチンであることを特徴とする請求項５〜８のいずれかに記載の測定方法。
【請求項１０】
ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤がタイノルフィンであることを特徴とする請求項５〜９のいずれかに記載の測定方法。
【請求項１１】
ジペプチジルペプチダーゼに特異的な蛍光基質、アミノペプチダーゼ阻害剤及びジペプチジルペプチダーゼ阻害剤を含む関節リウマチ診断キット。
【請求項１２】
蛍光基質が、Ａｒｇ−Ａｒｇ基を有する蛍光合成基質であることを特徴とする請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
合成基質がＡｒｇ−Ａｒｇ−４−メチルクマリル−７−アミドであることを特徴とする請求項１２に記載のキット。
【請求項１】
哺乳動物から採取した試料のジペプチジルペプチダーゼ活性を測定することを特徴とする関節リウマチの診断方法。
【請求項２】
試料が関節滑液、血液及び脳脊髄液から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項１に記載の診断方法。
【請求項３】
さらに哺乳動物から採取した試料中に存在するスパイノルフィンの量を測定することを特徴とする請求項１又は２に記載の診断方法。
【請求項４】
測定された試料中のスパイノルフィン濃度５ｎｇ／ｍＬ以下が、関節リウマチ疾患推定スパイノルフィン量であることを特徴とする請求項３記載の診断方法。
【請求項５】
ジペプチジルペプチダーゼに特異的な蛍光基質及びアミノペプチダーゼ阻害剤に、ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤の存在あるいは非存在下において、試料を反応させ、反応後の反応液の蛍光強度を測定することを特徴とする、請求項１記載の診断のためのジペプチジルペプチダーゼ活性の測定方法。
【請求項６】
蛍光基質がＡｒｇ−Ａｒｇ基を有する蛍光合成基質であることを特徴とする請求項５に記載の測定方法。
【請求項７】
蛍光合成基質がＡｒｇ−Ａｒｇ−４−メチルクマリル−７−アミドであることを特徴とする請求項６に記載の測定方法。
【請求項８】
反応によって生成した７−アミノ−４−メチルクマリンの蛍光強度を測定することを特徴とする請求項７に記載の測定方法。
【請求項９】
アミノペプチダーゼ阻害剤が、ベスタチンであることを特徴とする請求項５〜８のいずれかに記載の測定方法。
【請求項１０】
ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤がタイノルフィンであることを特徴とする請求項５〜９のいずれかに記載の測定方法。
【請求項１１】
ジペプチジルペプチダーゼに特異的な蛍光基質、アミノペプチダーゼ阻害剤及びジペプチジルペプチダーゼ阻害剤を含む関節リウマチ診断キット。
【請求項１２】
蛍光基質が、Ａｒｇ−Ａｒｇ基を有する蛍光合成基質であることを特徴とする請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
合成基質がＡｒｇ−Ａｒｇ−４−メチルクマリル−７−アミドであることを特徴とする請求項１２に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００６−２３０３１８（Ｐ２００６−２３０３１８Ａ）
【公開日】平成１８年９月７日（２００６．９．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５２００７（Ｐ２００５−５２００７）
【出願日】平成１７年２月２５日（２００５．２．２５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１６年８月２５日 社団法人日本生化学会発行の「生化学 第７６巻 第８号」に発表
【出願人】（３９３０２８０３６）丸石製薬株式会社 (20)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年９月７日（２００６．９．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月２５日（２００５．２．２５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１６年８月２５日 社団法人日本生化学会発行の「生化学 第７６巻 第８号」に発表
【出願人】（３９３０２８０３６）丸石製薬株式会社 (20)
【Ｆターム（参考）】
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