雑穀類を用いる液体麹の製造法
【課題】発酵飲食品の製造に用いられる液体麹、特に焼酎醸造に使用できるグルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼの活性が高い液体麹を提供する。
【解決手段】発酵飲食品製造に用いられる液体麹の製造方法であって、培養原料として雑穀類であるアマランサス及び／又はキヌアを含む液体培地で麹菌を培養することを特徴とする液体麹の製造方法。これによって、グルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼが同時にバランスよく高生成されて、焼酎等の発酵飲食品の製造に必要な酵素活性を有する液体麹を製造することができる。
【解決手段】発酵飲食品製造に用いられる液体麹の製造方法であって、培養原料として雑穀類であるアマランサス及び／又はキヌアを含む液体培地で麹菌を培養することを特徴とする液体麹の製造方法。これによって、グルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼが同時にバランスよく高生成されて、焼酎等の発酵飲食品の製造に必要な酵素活性を有する液体麹を製造することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の雑穀類を使用する、発酵飲食品の製造に用いられる液体麹、特に焼酎醸造に必要な酵素活性を有する液体麹の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酒類等の製造に用いられる麹は、蒸煮等の処理後の原料に糸状菌の胞子を接種して培養する固体麹と、水に原料及びその他の栄養源を添加して液体培地を調製し、これに麹菌の胞子又は前培養した菌糸等を接種して培養する液体麹がある。
【０００３】
従来の酒類又は発酵飲食品、例えば、日本酒、焼酎、しょうゆ、みそ、みりん等の製造では、固体培養法により製麹された、いわゆる固体麹が広く利用されている。この固体培養法は、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリーゼ（Aspergillus oryzae）、又は、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）等の麹菌の胞子を、蒸煮した穀類等の固体原料へ散布し、その表面で麹菌を増殖させる培養方法である。
【０００４】
例えば、焼酎の製造では、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）やアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）等の固体麹が広く用いられている。しかしながら、固体培養法は、原料や麹菌が不均一に分散する培養系であるため、温度や水分含量、各種栄養成分といった因子を均一にすることが困難であり、その培養制御は大変煩雑である。また、開放状態で製麹されることも多く、この場合は、雑菌による汚染といった品質管理面での注意も要する。そのため、大規模製造には不向きな方法ともいえる。
【０００５】
これに対して、液体培養法は、培養制御や品質管理が容易であり、効率的な生産に適した培養形態であるが、例えば、焼酎醸造に必要な酵素活性が十分に得られない等で、麹菌を液体培養して得られる培養物を、実際に焼酎麹として用いた例は少ない。ここで、液体培養法で得られる培養物とは、液体培養法で得られる培養物そのもの（以下、液体麹ともいう）の他、培養液、菌体、それらの濃縮物又はそれらの乾燥物であってもよい。
【０００６】
液体培養法で得られる培養物が焼酎等の発酵飲食品の製造に利用されない大きな理由として、液体培養では麹菌のアミラーゼ、セルラーゼ等の酵素生産挙動が固体培養と大きく異なるばかりか、全般的に生産性が低下することが知られている（非特許文献１参照）。
【０００７】
通常、焼酎をはじめとする酒類の製造では、並行複発酵によりアルコールが生成される。従って、麹菌へのグルコース供給に影響を与える麹菌の糖質分解関連酵素、特にグルコアミラーゼや耐酸性α−アミラーゼは、アルコール発酵における鍵酵素である。しかしながら、液体培養法で得られる培養物において、グルコアミラーゼの活性は著しく低く、生産挙動も固体培養とは大きく異なることが知られている（非特許文献２参照）。
【０００８】
麹菌のグルコアミラーゼ活性を向上させる方法として、菌糸の生育にストレスを与えながら麹菌を培養する方法（特許文献１参照）や焙炒した穀類を麹菌培養液に添加する方法（特許文献２参照）が報告されている。特許文献１に開示の方法は、多孔性膜上又は空隙を有する包括固定化剤中で培養してグルコアミラーゼをコードする新規遺伝子ｇｌａＢを発現させて同酵素活性を高めるもので、厳密な制御又は特殊な培養装置が必要であり、実用的ではない。また、特許文献２に開示の方法は、原料の少なくとも一部に焙炒した穀類を用いた液体培地で麹菌を培養するもので、穀類を焙炒するという、新たな製造工程が加わることになる。
【０００９】
そこで、本発明者らは、麹菌にとって難分解性の糖質を含有する液体培地を用いた麹菌の培養方法に関する発明を提案した（特許文献３参照）。この発明によれば、麹菌の液体培養において、酒類又は発酵飲食品の製造に使用可能な、グルコアミラーゼ等の糖質分解関連酵素の活性が高い麹菌培養物を、簡便、且つ安価に培養することができる。
【００１０】
一方、耐酸性α−アミラーゼについては、最近、分子生物学的な解析が詳細に行なわれ始めている（非特許文献３参照）。それによれば、白麹菌は非耐酸性α−アミラーゼと耐酸性α−アミラーゼという性質の異なる２種類のアミラーゼ遺伝子を有しているが、その発現様式は大きく異なっており、液体培養においては、非耐酸性α−アミラーゼは十分に生産されるものの、焼酎醸造の鍵酵素である耐酸性α−アミラーゼはほとんど生産されないことが報告されている。
【００１１】
焼酎製造では、焼酎もろみの腐造防止のために低ｐＨ環境下で醸造する。しかし、非耐酸性α−アミラーゼは、低ｐＨ条件では速やかに失活してしまうため、焼酎醸造の糖質分解にはほとんど貢献しない。そのため、焼酎醸造の糖質分解に寄与していると考えられる耐酸性α−アミラーゼを、麹菌の液体培養で大量に生成させることが、焼酎製造のために不可欠である。
【００１２】
過去には、麹菌の液体培養における耐酸性α−アミラーゼの生産挙動を詳細に検討した報告があるものの、その方法はペプトンやクエン酸緩衝液を含む合成培地を用いているし、培養時間が１００時間以上かかるなど、実際の焼酎醸造に適用できるような液体麹の製造方法であるとは言い難い（非特許文献４参照）。
【特許文献１】特開平１１−２２５７４６号公報
【特許文献２】特開２００１−３２１１５４号公報
【特許文献３】特開２００３−２６５１６５号公報
【非特許文献１】Iwashita K. et al: Biosci. Biotechnol. Biochem.，62，1938-1946（1998）、山根雄一ら: 日本醸造協会誌.，99，84-92(2004)
【非特許文献２】Hata Y. et al: J. Ferment. Bioeng.，84,532-537(1997)、Hata Y. et al: Gene.，207，127-134(1998)、Ishida H. et al: J. Ferment. Bioeng.，86，301-307(1998)、Ishida H. et al: Curr Genet.，37，373-379(2000)
【非特許文献３】Nagamine K. et al: Biosci. Biotechnol. Biochem.，67，2194-2202（2003）
【非特許文献４】Sudo S. et al: J. Ferment. Bioeng.，76,105-110(1993)、Sudo S. et al: J. Ferment. Bioeng.，77，483-489(1994)、須藤茂俊ら: 日本醸造協会誌.，89，768-774(1994)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、特許文献３の方法ではグルコアミラーゼの活性が高い麹菌培養物は、難分解性糖質を加えて調製された液体培地で麹菌を培養するもので、穀類等の培養原料で調製された普通の液体培地から培養されるものでない。
【００１４】
また、麹菌を液体培地で培養してグルコアミラーゼ活性が高い麹菌培養物を得る技術は開示されているが、アルコール発酵におけるもう一つの鍵酵素である耐酸性α−アミラーゼの活性が高い液体麹を、液体培地で麹菌を培養して得るという技術が開示されたものはない。この耐酸性α−アミラーゼは、液体培養では生成されない酵素であると一般的に言われており、これまでに耐酸性α−アミラーゼの活性が高い液体麹は開発されていない。
【００１５】
本発明の目的は、発酵飲食品の製造に用いられる液体麹、特に焼酎醸造のアルコール発酵における鍵酵素となるグルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼの活性が高い液体麹を特殊な糖質等を加えたり、焙炒処理された原料を使用するといった特別の液体培地でなく、原料として特定の雑穀類を使用した液体培地で麹菌を培養して液体麹を製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、発酵飲食品の製造に用いられる液体麹を製造するにあたり、培養原料としてアマランサス及び／又はキヌアを含有する液体培地で麹菌を培養することで、グルコアミラーゼ活性、及び耐酸性α−アミラーゼ活性が増強された液体麹が製造されることを見出した。更に、この酵素活性が増強された液体麹は、焼酎醸造に適していることを見出して、本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち、本発明は以下に示すものを提供する。
【００１８】
（１） 発酵飲食品製造に用いられる液体麹の製造方法であって、培養原料としてアマランサス及び／又はキヌアを含む液体培地で麹菌を培養することを特徴とする液体麹の製造方法。
【００１９】
（２） 前記玄米を含む液体培地で培養される麹菌培養物中に、少なくともグルコアミラーゼと、耐酸性α−アミラーゼとを同時に生成、蓄積させる（１）に記載の液体麹の製造方法。
【００２０】
（３） （１）または（２）に記載の液体麹の製造方法で得られるグルコアミラーゼ活性と、耐酸性α−アミラーゼ活性とを有する発酵飲食品製造用の液体麹のセット。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、アマランサス及び／又はキヌアを含む液体培地で麹菌を培養することで、焼酎醸造に必要な酵素活性を有する液体麹、すなわち、グルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼの両酵素が同時に高生産された液体麹を得ることができる。液体培養は固体培養に比べ厳密な培養コントロールが可能であるため、品質が安定した液体麹を安価に製造することができる。
【００２２】
また、本発明により製造した液体麹を用いると、従来の固体麹を用いた焼酎もろみと同程度の発酵性が得られ、製造された焼酎は固体麹を用いて製造された焼酎と同程度の品質を有し、官能的にも遜色ない焼酎を製造することができる。
【００２３】
また、本発明に係る液体麹を用いて焼酎を製造する場合に、固体麹を使用する従来の焼酎製造とは異なり、全工程を液相のままで行なうことが可能なので、従来に比べ効率的、かつ安定的な焼酎製造システムを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明について具体的に説明する。
【００２５】
本発明における液体麹の製造方法は、原料として特定の雑穀類であるアマランサス及び／又はキヌアを添加して調製された液体培地で麹菌の培養を行ない、グルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼの酵素活性を増強した液体麹を製造する工程を包含するものである。
【００２６】
本発明において、原料として用いるアマランサスは、ヒユ科ヒユ属植物の総称で、穀類のなかでは蛋白質含量が高く、アミノ酸の一つであるリジンの含量は大豆に匹敵する。また、精白米に比べてもカルシウム、鉄分、繊維質を多く含む高栄養価穀物であり、原産国は、中南米諸国、インド、ヒマラヤ、ネパールの特定地域である。一方、キヌアは、アガサ科の一年草であり、主にペルー南部やボリビア西部のアンデス山脈などの高地で栽培されており、ミネラル、ビタミン、蛋白質、食物繊維を豊富に含んでいる。
原料のアマランサスとキヌアは、単独で用いてもよく、あるいは組み合わせて用いてもよい。これらは、細砕や粉砕などの前処理をすることなく、水と混合して液体培地を調製する。
原料の配合割合は、麹菌の培養中にグルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼが選択的に生成、蓄積される程度のものに調製される。例えば、アマランサスの場合は、１.５％（ｗ／ｖｏｌ）から１５％（ｗ／ｖｏｌ）、好ましくは２％（ｗ／ｖｏｌ）から１０
％（ｗ／ｖｏｌ）、より好ましくは２％（ｗ／ｖｏｌ）から８％（ｗ／ｖｏｌ）を添加した液体培地に調製される。一方、キヌアの場合は、１.５％（ｗ／ｖｏｌ）から７％（ｗ／ｖｏｌ）、好ましくは２％（ｗ／ｖｏｌ）から６％（ｗ／ｖｏｌ）、より好ましくは２％（ｗ／ｖｏｌ）から４％（ｗ／ｖｏｌ）を添加した液体培地に調製される。なお、使用する原料の種類や使用する麹菌株によって、最適な配合使用量は異なるので、適宜選択すればよい。
【００２７】
適量の上記原料を添加した液体培地で麹菌を培養すると、グルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼの両酵素がバランスよく高生産され、焼酎醸造に使用するのに十分な酵素活性を有する液体麹が得られる。
原料である雑穀類の使用量が上限値を超えると、培養液の粘性が高くなり、麹菌を好気培養するために必要な酸素や空気の供給が不十分となり、培養物中の酸素濃度が低下して、培養が進み難くなるので、好ましくない。一方、該原料の使用量が下限値に満たないと、目的とする酵素が高生産されない。
【００２８】
原料に含まれるでん粉は、培養前に予め糊化しておいてもよい。でん粉の糊化方法については特に限定はなく、蒸きょう法、焙炒法等常法に従って行なえばよい。尚、後述する液体培地の殺菌工程において、高温高圧滅菌等によりでん粉の糊化温度以上に加熱する場合は、この処理によりでん粉の糊化も同時に行なわれる。
【００２９】
液体培地には、上記の原料の他に栄養源として有機物、無機塩等を適宜添加するのが好ましい。これら添加物は、麹菌の培養に一般に使用されているものであれば特に限定はないが、有機物としては米糠、小麦麩、コーンスティープリカー、大豆粕、脱脂大豆等を、無機塩としてはアンモニウム塩、硝酸塩、カリウム塩、酸性リン酸塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の水溶性の化合物を挙げることができ、２種類以上の有機物及び／又は無機塩を同時に使用してもよい。
これらの添加量は、麹菌の増殖を促進する程度であれば特に限定はないが、有機物としては０．１〜５％（ｗ／ｖｏｌ）程度、無機塩としては０．１〜１％（ｗ／ｖｏｌ）程度添加するのが好ましい。このようにして得られた麹菌の液体培地は、必要に応じて滅菌処理を行なってもよく、処理方法には特に限定はない。例としては、高温高圧滅菌法を挙げることができ、１２１℃で１５分間行なえばよい。
【００３０】
滅菌した液体培地を培養温度まで冷却後、麹菌を液体培地に接種する。本発明で用いる麹菌は、糖質分解酵素生産能を有する麹菌、好ましくはグルコアミラーゼ生産能、耐酸性α−アミラーゼ生産能を有する麹菌であり、例えば、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）等に代表される白麹菌、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）やアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）等に代表される黒麹菌、アスペルギルス・オリーゼ（Aspergillus oryzae）やアスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）等に代表される黄麹菌等が挙げられる。また、培地に接種する麹菌の形態は任意であり、胞子又は菌糸を用いることができる。
【００３１】
これらの麹菌は一種類の菌株による培養、又は同種若しくは異種の二種類以上の菌株による混合培養のどちらでも用いることができる。これらは胞子又は前培養により得られる菌糸のどちらの形態のものを用いても問題はないが、菌糸を用いる方が対数増殖期に要する時間が短くなるので好ましい。麹菌の液体培地への接種量には特に制限はないが、液体培地１ｍｌ当り、胞子であれば１×１０４〜１×１０６個程度、菌糸であれば前培養液を０．１〜１０％程度接種することが好ましい。
【００３２】
麹菌の培養温度は、生育に影響を及ぼさない限りであれば特に限定はないが、好ましくは２５〜４５℃、より好ましくは３０〜４０℃で行なうのがよい。培養温度が低いと、麹菌の増殖が遅くなるため雑菌による汚染が起きやすくなる。培養時間は２４〜７２時間が好ましい。培養装置は液体培養を行なうことができるものであればよいが、麹菌は好気培養を行なう必要があるので、酸素や空気を培地中に供給できる好気的条件下で行なう必要がある。また、培養中は培地中の原料、酸素、及び麹菌が装置内に均一に分布するように撹拌をするのが好ましい。撹拌条件や通気量については、培養環境を好気的に保つことができる条件であればいかなる条件でもよく、培養装置、培地の粘度等により適宜選択すればよい。
【００３３】
上記の培養法で培養することにより、グルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼの両酵素がバランスよく高生産され、焼酎醸造に使用するのに十分な酵素活性を有する液体麹が得られる。尚、上記の培養法で得られる液体麹は、培養物そのものの他に、培養物を遠心分離等することにより得られる培養液、麹菌体、それらの濃縮物又はそれらの乾燥物等としてもよい。
【００３４】
本発明の製造方法で得られた液体麹は、酒類又は発酵飲食品の製造に用いることができる。例えば、清酒を製造する場合には、酒母や各もろみ仕込み段階において、焼酎を製造する場合には、もろみ仕込み段階において、しょうゆを製造する場合には、盛り込みの段階において、味噌を製造する場合には、仕込み段階において、みりんを製造する場合は、仕込み段階において、液体麹を固体麹の代わりに用いることができる。
【００３５】
また、上記した液体麹或いは培養物から得られる培養液又はそれらの濃縮物等を用いて酒類又は発酵飲食品を製造する場合には、全工程を液相で行なうことができる。全工程を液相で行なう酒類の製造方法としては、例えば、焼酎を製造する場合、とうもろこし、麦、米、いも、さとうきび等を掛け原料に用い、該原料を約８０℃の高温で耐熱性酵素剤を使用して溶かして液化した後、これに上記した液体麹、及び酵母を添加することでアルコール発酵させたもろみを、常圧蒸留法又は減圧蒸留法等により蒸留して製造する方法が挙げられる。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施例によってより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３７】
＜実施例１＞[アマランサス液体麹の製造]
1.前培養方法； ９０％精白米８ｇと水１００ｍｌを５００ｍｌバッフル付三角フラスコに張り込み、１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、この前培養培地に白麹菌（Aspergillus kawachii IFO4308）を１×１０6個／ｍｌになるように植菌し、３７℃、２４時間、１００ｒｐｍで振盪培養した。
【００３８】
2.本培養方法； アマランサス１〜８ｇと硝酸カリウム０．２ｇ、リン酸２水素カリウム０．３ｇと水１００ｍｌを５００ｍｌバッフル付三角フラスコに張り込み、１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌した。この本培養培地へ前培養液１ｍｌを植菌し、３７℃、４８時間、１００ｒｐｍで振盪培養した。培養後の培養上清中のグルコアミラーゼ活性（GA）と耐酸性α―アミラーゼ活性（ASAA）について測定した。GA活性の測定は、糖化力分別定量キット（キッコーマン製）を用いて行ない、ASAA活性の測定は、＜非特許文献４＞に記載の方法を若干改良し、培養物を酸処理することで非耐熱性α−アミラーゼ活性を失活させた後、α−アミラーゼ活性測定キット（キッコーマン製）を用いて行なった。より具体的には、培養液１ｍｌに９ｍｌの１００ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ３）を添加し、３７℃で１時間酸処理を行なった後に、α−アミラーゼ活性測定キット（キッコーマン製）を用いて測定した。
【００３９】
3.結果； 表１に示した通りである。これまでの検討で焼酎醸造に必要な酵素活性の目標値はグルコアミラーゼ１００Ｕ／ｍｌ、耐酸性α−アミラーゼは１０Ｕ／ｍｌである。表から明らかなように、アマランサス使用量２％以上で、GA、ASAA両酵素の活性は、いずれも目標値をクリアし、アマランサスが液体麹原料として有効であることが示された。
【００４０】
【表１】
【００４１】
＜実施例２＞[キヌア液体麹の製造]
1.前養方法； ９０％精白米８ｇと水１００ｍｌを５００ｍｌバッフル付三角フラスコに張り込み、１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、この前培養培地に白麹菌（Aspergillus kawachii IFO4308）を１×１０6個／ｍｌになるように植菌し、３７℃、２４時間、１００ｒｐｍで振盪培養した。
【００４２】
2.本培養方法； キヌア１〜８ｇと硝酸カリウム０．２ｇ、リン酸２水素カリウム０．３ｇと水１００ｍｌを５００ｍｌバッフル付三角フラスコに張り込み、１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌した。この本培養培地へ前培養液１ｍｌを植菌し、３７℃、４８時間、１００ｒｐｍで振盪培養した。培養後の培養上清中のグルコアミラーゼ活性（GA）と耐酸性α―アミラーゼ活性（ASAA）について、実施例１と同様の方法で測定した。
【００４３】
3.結果； 表１に示した通りである。これまでの検討で焼酎醸造に必要な酵素活性の目標値はグルコアミラーゼ１００Ｕ／ｍｌ、耐酸性α−アミラーゼは１０Ｕ／ｍｌである。表から明らかなように、 下表の通り。これまでの検討で焼酎醸造に必要な酵素活性の目標値はグルコアミラーゼ１００Ｕ／ｍｌ、耐酸性α−アミラーゼは１０Ｕ／ｍｌである。キヌア使用量２〜４％でバランスよく両酵素を生産し、キヌアが液体麹原料として有効であることが示された。
【００４４】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明により、雑穀類であるアマランサス及び／又はキヌアを培養原料として用い、品質が安定した液体麹を効率よく、かつ安価に製造する方法が提供される。しかも、この液体麹は、発酵飲食品の製造に好適である上に、グルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼの両酵素がバランスよく高生産されるので、焼酎等の酒類の製造に適している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の雑穀類を使用する、発酵飲食品の製造に用いられる液体麹、特に焼酎醸造に必要な酵素活性を有する液体麹の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酒類等の製造に用いられる麹は、蒸煮等の処理後の原料に糸状菌の胞子を接種して培養する固体麹と、水に原料及びその他の栄養源を添加して液体培地を調製し、これに麹菌の胞子又は前培養した菌糸等を接種して培養する液体麹がある。
【０００３】
従来の酒類又は発酵飲食品、例えば、日本酒、焼酎、しょうゆ、みそ、みりん等の製造では、固体培養法により製麹された、いわゆる固体麹が広く利用されている。この固体培養法は、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリーゼ（Aspergillus oryzae）、又は、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）等の麹菌の胞子を、蒸煮した穀類等の固体原料へ散布し、その表面で麹菌を増殖させる培養方法である。
【０００４】
例えば、焼酎の製造では、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）やアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）等の固体麹が広く用いられている。しかしながら、固体培養法は、原料や麹菌が不均一に分散する培養系であるため、温度や水分含量、各種栄養成分といった因子を均一にすることが困難であり、その培養制御は大変煩雑である。また、開放状態で製麹されることも多く、この場合は、雑菌による汚染といった品質管理面での注意も要する。そのため、大規模製造には不向きな方法ともいえる。
【０００５】
これに対して、液体培養法は、培養制御や品質管理が容易であり、効率的な生産に適した培養形態であるが、例えば、焼酎醸造に必要な酵素活性が十分に得られない等で、麹菌を液体培養して得られる培養物を、実際に焼酎麹として用いた例は少ない。ここで、液体培養法で得られる培養物とは、液体培養法で得られる培養物そのもの（以下、液体麹ともいう）の他、培養液、菌体、それらの濃縮物又はそれらの乾燥物であってもよい。
【０００６】
液体培養法で得られる培養物が焼酎等の発酵飲食品の製造に利用されない大きな理由として、液体培養では麹菌のアミラーゼ、セルラーゼ等の酵素生産挙動が固体培養と大きく異なるばかりか、全般的に生産性が低下することが知られている（非特許文献１参照）。
【０００７】
通常、焼酎をはじめとする酒類の製造では、並行複発酵によりアルコールが生成される。従って、麹菌へのグルコース供給に影響を与える麹菌の糖質分解関連酵素、特にグルコアミラーゼや耐酸性α−アミラーゼは、アルコール発酵における鍵酵素である。しかしながら、液体培養法で得られる培養物において、グルコアミラーゼの活性は著しく低く、生産挙動も固体培養とは大きく異なることが知られている（非特許文献２参照）。
【０００８】
麹菌のグルコアミラーゼ活性を向上させる方法として、菌糸の生育にストレスを与えながら麹菌を培養する方法（特許文献１参照）や焙炒した穀類を麹菌培養液に添加する方法（特許文献２参照）が報告されている。特許文献１に開示の方法は、多孔性膜上又は空隙を有する包括固定化剤中で培養してグルコアミラーゼをコードする新規遺伝子ｇｌａＢを発現させて同酵素活性を高めるもので、厳密な制御又は特殊な培養装置が必要であり、実用的ではない。また、特許文献２に開示の方法は、原料の少なくとも一部に焙炒した穀類を用いた液体培地で麹菌を培養するもので、穀類を焙炒するという、新たな製造工程が加わることになる。
【０００９】
そこで、本発明者らは、麹菌にとって難分解性の糖質を含有する液体培地を用いた麹菌の培養方法に関する発明を提案した（特許文献３参照）。この発明によれば、麹菌の液体培養において、酒類又は発酵飲食品の製造に使用可能な、グルコアミラーゼ等の糖質分解関連酵素の活性が高い麹菌培養物を、簡便、且つ安価に培養することができる。
【００１０】
一方、耐酸性α−アミラーゼについては、最近、分子生物学的な解析が詳細に行なわれ始めている（非特許文献３参照）。それによれば、白麹菌は非耐酸性α−アミラーゼと耐酸性α−アミラーゼという性質の異なる２種類のアミラーゼ遺伝子を有しているが、その発現様式は大きく異なっており、液体培養においては、非耐酸性α−アミラーゼは十分に生産されるものの、焼酎醸造の鍵酵素である耐酸性α−アミラーゼはほとんど生産されないことが報告されている。
【００１１】
焼酎製造では、焼酎もろみの腐造防止のために低ｐＨ環境下で醸造する。しかし、非耐酸性α−アミラーゼは、低ｐＨ条件では速やかに失活してしまうため、焼酎醸造の糖質分解にはほとんど貢献しない。そのため、焼酎醸造の糖質分解に寄与していると考えられる耐酸性α−アミラーゼを、麹菌の液体培養で大量に生成させることが、焼酎製造のために不可欠である。
【００１２】
過去には、麹菌の液体培養における耐酸性α−アミラーゼの生産挙動を詳細に検討した報告があるものの、その方法はペプトンやクエン酸緩衝液を含む合成培地を用いているし、培養時間が１００時間以上かかるなど、実際の焼酎醸造に適用できるような液体麹の製造方法であるとは言い難い（非特許文献４参照）。
【特許文献１】特開平１１−２２５７４６号公報
【特許文献２】特開２００１−３２１１５４号公報
【特許文献３】特開２００３−２６５１６５号公報
【非特許文献１】Iwashita K. et al: Biosci. Biotechnol. Biochem.，62，1938-1946（1998）、山根雄一ら: 日本醸造協会誌.，99，84-92(2004)
【非特許文献２】Hata Y. et al: J. Ferment. Bioeng.，84,532-537(1997)、Hata Y. et al: Gene.，207，127-134(1998)、Ishida H. et al: J. Ferment. Bioeng.，86，301-307(1998)、Ishida H. et al: Curr Genet.，37，373-379(2000)
【非特許文献３】Nagamine K. et al: Biosci. Biotechnol. Biochem.，67，2194-2202（2003）
【非特許文献４】Sudo S. et al: J. Ferment. Bioeng.，76,105-110(1993)、Sudo S. et al: J. Ferment. Bioeng.，77，483-489(1994)、須藤茂俊ら: 日本醸造協会誌.，89，768-774(1994)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、特許文献３の方法ではグルコアミラーゼの活性が高い麹菌培養物は、難分解性糖質を加えて調製された液体培地で麹菌を培養するもので、穀類等の培養原料で調製された普通の液体培地から培養されるものでない。
【００１４】
また、麹菌を液体培地で培養してグルコアミラーゼ活性が高い麹菌培養物を得る技術は開示されているが、アルコール発酵におけるもう一つの鍵酵素である耐酸性α−アミラーゼの活性が高い液体麹を、液体培地で麹菌を培養して得るという技術が開示されたものはない。この耐酸性α−アミラーゼは、液体培養では生成されない酵素であると一般的に言われており、これまでに耐酸性α−アミラーゼの活性が高い液体麹は開発されていない。
【００１５】
本発明の目的は、発酵飲食品の製造に用いられる液体麹、特に焼酎醸造のアルコール発酵における鍵酵素となるグルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼの活性が高い液体麹を特殊な糖質等を加えたり、焙炒処理された原料を使用するといった特別の液体培地でなく、原料として特定の雑穀類を使用した液体培地で麹菌を培養して液体麹を製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、発酵飲食品の製造に用いられる液体麹を製造するにあたり、培養原料としてアマランサス及び／又はキヌアを含有する液体培地で麹菌を培養することで、グルコアミラーゼ活性、及び耐酸性α−アミラーゼ活性が増強された液体麹が製造されることを見出した。更に、この酵素活性が増強された液体麹は、焼酎醸造に適していることを見出して、本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち、本発明は以下に示すものを提供する。
【００１８】
（１） 発酵飲食品製造に用いられる液体麹の製造方法であって、培養原料としてアマランサス及び／又はキヌアを含む液体培地で麹菌を培養することを特徴とする液体麹の製造方法。
【００１９】
（２） 前記玄米を含む液体培地で培養される麹菌培養物中に、少なくともグルコアミラーゼと、耐酸性α−アミラーゼとを同時に生成、蓄積させる（１）に記載の液体麹の製造方法。
【００２０】
（３） （１）または（２）に記載の液体麹の製造方法で得られるグルコアミラーゼ活性と、耐酸性α−アミラーゼ活性とを有する発酵飲食品製造用の液体麹のセット。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、アマランサス及び／又はキヌアを含む液体培地で麹菌を培養することで、焼酎醸造に必要な酵素活性を有する液体麹、すなわち、グルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼの両酵素が同時に高生産された液体麹を得ることができる。液体培養は固体培養に比べ厳密な培養コントロールが可能であるため、品質が安定した液体麹を安価に製造することができる。
【００２２】
また、本発明により製造した液体麹を用いると、従来の固体麹を用いた焼酎もろみと同程度の発酵性が得られ、製造された焼酎は固体麹を用いて製造された焼酎と同程度の品質を有し、官能的にも遜色ない焼酎を製造することができる。
【００２３】
また、本発明に係る液体麹を用いて焼酎を製造する場合に、固体麹を使用する従来の焼酎製造とは異なり、全工程を液相のままで行なうことが可能なので、従来に比べ効率的、かつ安定的な焼酎製造システムを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明について具体的に説明する。
【００２５】
本発明における液体麹の製造方法は、原料として特定の雑穀類であるアマランサス及び／又はキヌアを添加して調製された液体培地で麹菌の培養を行ない、グルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼの酵素活性を増強した液体麹を製造する工程を包含するものである。
【００２６】
本発明において、原料として用いるアマランサスは、ヒユ科ヒユ属植物の総称で、穀類のなかでは蛋白質含量が高く、アミノ酸の一つであるリジンの含量は大豆に匹敵する。また、精白米に比べてもカルシウム、鉄分、繊維質を多く含む高栄養価穀物であり、原産国は、中南米諸国、インド、ヒマラヤ、ネパールの特定地域である。一方、キヌアは、アガサ科の一年草であり、主にペルー南部やボリビア西部のアンデス山脈などの高地で栽培されており、ミネラル、ビタミン、蛋白質、食物繊維を豊富に含んでいる。
原料のアマランサスとキヌアは、単独で用いてもよく、あるいは組み合わせて用いてもよい。これらは、細砕や粉砕などの前処理をすることなく、水と混合して液体培地を調製する。
原料の配合割合は、麹菌の培養中にグルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼが選択的に生成、蓄積される程度のものに調製される。例えば、アマランサスの場合は、１.５％（ｗ／ｖｏｌ）から１５％（ｗ／ｖｏｌ）、好ましくは２％（ｗ／ｖｏｌ）から１０
％（ｗ／ｖｏｌ）、より好ましくは２％（ｗ／ｖｏｌ）から８％（ｗ／ｖｏｌ）を添加した液体培地に調製される。一方、キヌアの場合は、１.５％（ｗ／ｖｏｌ）から７％（ｗ／ｖｏｌ）、好ましくは２％（ｗ／ｖｏｌ）から６％（ｗ／ｖｏｌ）、より好ましくは２％（ｗ／ｖｏｌ）から４％（ｗ／ｖｏｌ）を添加した液体培地に調製される。なお、使用する原料の種類や使用する麹菌株によって、最適な配合使用量は異なるので、適宜選択すればよい。
【００２７】
適量の上記原料を添加した液体培地で麹菌を培養すると、グルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼの両酵素がバランスよく高生産され、焼酎醸造に使用するのに十分な酵素活性を有する液体麹が得られる。
原料である雑穀類の使用量が上限値を超えると、培養液の粘性が高くなり、麹菌を好気培養するために必要な酸素や空気の供給が不十分となり、培養物中の酸素濃度が低下して、培養が進み難くなるので、好ましくない。一方、該原料の使用量が下限値に満たないと、目的とする酵素が高生産されない。
【００２８】
原料に含まれるでん粉は、培養前に予め糊化しておいてもよい。でん粉の糊化方法については特に限定はなく、蒸きょう法、焙炒法等常法に従って行なえばよい。尚、後述する液体培地の殺菌工程において、高温高圧滅菌等によりでん粉の糊化温度以上に加熱する場合は、この処理によりでん粉の糊化も同時に行なわれる。
【００２９】
液体培地には、上記の原料の他に栄養源として有機物、無機塩等を適宜添加するのが好ましい。これら添加物は、麹菌の培養に一般に使用されているものであれば特に限定はないが、有機物としては米糠、小麦麩、コーンスティープリカー、大豆粕、脱脂大豆等を、無機塩としてはアンモニウム塩、硝酸塩、カリウム塩、酸性リン酸塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の水溶性の化合物を挙げることができ、２種類以上の有機物及び／又は無機塩を同時に使用してもよい。
これらの添加量は、麹菌の増殖を促進する程度であれば特に限定はないが、有機物としては０．１〜５％（ｗ／ｖｏｌ）程度、無機塩としては０．１〜１％（ｗ／ｖｏｌ）程度添加するのが好ましい。このようにして得られた麹菌の液体培地は、必要に応じて滅菌処理を行なってもよく、処理方法には特に限定はない。例としては、高温高圧滅菌法を挙げることができ、１２１℃で１５分間行なえばよい。
【００３０】
滅菌した液体培地を培養温度まで冷却後、麹菌を液体培地に接種する。本発明で用いる麹菌は、糖質分解酵素生産能を有する麹菌、好ましくはグルコアミラーゼ生産能、耐酸性α−アミラーゼ生産能を有する麹菌であり、例えば、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）等に代表される白麹菌、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）やアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）等に代表される黒麹菌、アスペルギルス・オリーゼ（Aspergillus oryzae）やアスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）等に代表される黄麹菌等が挙げられる。また、培地に接種する麹菌の形態は任意であり、胞子又は菌糸を用いることができる。
【００３１】
これらの麹菌は一種類の菌株による培養、又は同種若しくは異種の二種類以上の菌株による混合培養のどちらでも用いることができる。これらは胞子又は前培養により得られる菌糸のどちらの形態のものを用いても問題はないが、菌糸を用いる方が対数増殖期に要する時間が短くなるので好ましい。麹菌の液体培地への接種量には特に制限はないが、液体培地１ｍｌ当り、胞子であれば１×１０４〜１×１０６個程度、菌糸であれば前培養液を０．１〜１０％程度接種することが好ましい。
【００３２】
麹菌の培養温度は、生育に影響を及ぼさない限りであれば特に限定はないが、好ましくは２５〜４５℃、より好ましくは３０〜４０℃で行なうのがよい。培養温度が低いと、麹菌の増殖が遅くなるため雑菌による汚染が起きやすくなる。培養時間は２４〜７２時間が好ましい。培養装置は液体培養を行なうことができるものであればよいが、麹菌は好気培養を行なう必要があるので、酸素や空気を培地中に供給できる好気的条件下で行なう必要がある。また、培養中は培地中の原料、酸素、及び麹菌が装置内に均一に分布するように撹拌をするのが好ましい。撹拌条件や通気量については、培養環境を好気的に保つことができる条件であればいかなる条件でもよく、培養装置、培地の粘度等により適宜選択すればよい。
【００３３】
上記の培養法で培養することにより、グルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼの両酵素がバランスよく高生産され、焼酎醸造に使用するのに十分な酵素活性を有する液体麹が得られる。尚、上記の培養法で得られる液体麹は、培養物そのものの他に、培養物を遠心分離等することにより得られる培養液、麹菌体、それらの濃縮物又はそれらの乾燥物等としてもよい。
【００３４】
本発明の製造方法で得られた液体麹は、酒類又は発酵飲食品の製造に用いることができる。例えば、清酒を製造する場合には、酒母や各もろみ仕込み段階において、焼酎を製造する場合には、もろみ仕込み段階において、しょうゆを製造する場合には、盛り込みの段階において、味噌を製造する場合には、仕込み段階において、みりんを製造する場合は、仕込み段階において、液体麹を固体麹の代わりに用いることができる。
【００３５】
また、上記した液体麹或いは培養物から得られる培養液又はそれらの濃縮物等を用いて酒類又は発酵飲食品を製造する場合には、全工程を液相で行なうことができる。全工程を液相で行なう酒類の製造方法としては、例えば、焼酎を製造する場合、とうもろこし、麦、米、いも、さとうきび等を掛け原料に用い、該原料を約８０℃の高温で耐熱性酵素剤を使用して溶かして液化した後、これに上記した液体麹、及び酵母を添加することでアルコール発酵させたもろみを、常圧蒸留法又は減圧蒸留法等により蒸留して製造する方法が挙げられる。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施例によってより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３７】
＜実施例１＞[アマランサス液体麹の製造]
1.前培養方法； ９０％精白米８ｇと水１００ｍｌを５００ｍｌバッフル付三角フラスコに張り込み、１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、この前培養培地に白麹菌（Aspergillus kawachii IFO4308）を１×１０6個／ｍｌになるように植菌し、３７℃、２４時間、１００ｒｐｍで振盪培養した。
【００３８】
2.本培養方法； アマランサス１〜８ｇと硝酸カリウム０．２ｇ、リン酸２水素カリウム０．３ｇと水１００ｍｌを５００ｍｌバッフル付三角フラスコに張り込み、１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌した。この本培養培地へ前培養液１ｍｌを植菌し、３７℃、４８時間、１００ｒｐｍで振盪培養した。培養後の培養上清中のグルコアミラーゼ活性（GA）と耐酸性α―アミラーゼ活性（ASAA）について測定した。GA活性の測定は、糖化力分別定量キット（キッコーマン製）を用いて行ない、ASAA活性の測定は、＜非特許文献４＞に記載の方法を若干改良し、培養物を酸処理することで非耐熱性α−アミラーゼ活性を失活させた後、α−アミラーゼ活性測定キット（キッコーマン製）を用いて行なった。より具体的には、培養液１ｍｌに９ｍｌの１００ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ３）を添加し、３７℃で１時間酸処理を行なった後に、α−アミラーゼ活性測定キット（キッコーマン製）を用いて測定した。
【００３９】
3.結果； 表１に示した通りである。これまでの検討で焼酎醸造に必要な酵素活性の目標値はグルコアミラーゼ１００Ｕ／ｍｌ、耐酸性α−アミラーゼは１０Ｕ／ｍｌである。表から明らかなように、アマランサス使用量２％以上で、GA、ASAA両酵素の活性は、いずれも目標値をクリアし、アマランサスが液体麹原料として有効であることが示された。
【００４０】
【表１】
【００４１】
＜実施例２＞[キヌア液体麹の製造]
1.前養方法； ９０％精白米８ｇと水１００ｍｌを５００ｍｌバッフル付三角フラスコに張り込み、１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、この前培養培地に白麹菌（Aspergillus kawachii IFO4308）を１×１０6個／ｍｌになるように植菌し、３７℃、２４時間、１００ｒｐｍで振盪培養した。
【００４２】
2.本培養方法； キヌア１〜８ｇと硝酸カリウム０．２ｇ、リン酸２水素カリウム０．３ｇと水１００ｍｌを５００ｍｌバッフル付三角フラスコに張り込み、１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌した。この本培養培地へ前培養液１ｍｌを植菌し、３７℃、４８時間、１００ｒｐｍで振盪培養した。培養後の培養上清中のグルコアミラーゼ活性（GA）と耐酸性α―アミラーゼ活性（ASAA）について、実施例１と同様の方法で測定した。
【００４３】
3.結果； 表１に示した通りである。これまでの検討で焼酎醸造に必要な酵素活性の目標値はグルコアミラーゼ１００Ｕ／ｍｌ、耐酸性α−アミラーゼは１０Ｕ／ｍｌである。表から明らかなように、 下表の通り。これまでの検討で焼酎醸造に必要な酵素活性の目標値はグルコアミラーゼ１００Ｕ／ｍｌ、耐酸性α−アミラーゼは１０Ｕ／ｍｌである。キヌア使用量２〜４％でバランスよく両酵素を生産し、キヌアが液体麹原料として有効であることが示された。
【００４４】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明により、雑穀類であるアマランサス及び／又はキヌアを培養原料として用い、品質が安定した液体麹を効率よく、かつ安価に製造する方法が提供される。しかも、この液体麹は、発酵飲食品の製造に好適である上に、グルコアミラーゼ、及び耐酸性α−アミラーゼの両酵素がバランスよく高生産されるので、焼酎等の酒類の製造に適している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵飲食品製造に用いられる液体麹の製造方法であって、培養原料としてアマランサス及び／又はキヌアを含む液体培地で麹菌を培養することを特徴とする液体麹の製造方法。
【請求項２】
前記アマランサス及び／又はキヌアを含む液体培地で培養される麹菌培養物中に、少なくともグルコアミラーゼと、耐酸性α−アミラーゼとを同時に生成、蓄積させる請求項１に記載の液体麹の製造方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の液体麹の製造方法で得られるグルコアミラーゼ活性と、耐酸性α−アミラーゼ活性とを有する発酵飲食品製造用の液体麹のセット。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵飲食品製造に用いられる液体麹の製造方法であって、培養原料として細砕や粉砕などの前処理をしないアマランサス１．５〜１５％（ｗ／ｖｏｌ）及び／又はキヌア１．５〜７％（ｗ／ｖｏｌ）を含む液体培地で白麹菌及び／又は黒麹菌を培養することを特徴とする液体麹の製造方法。
【請求項２】
前記アマランサス及び／又はキヌアを含む液体培地で培養される麹菌培養物中に、少なくともグルコアミラーゼと、耐酸性α−アミラーゼとを同時に生成、蓄積させる請求項１に記載の液体麹の製造方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の液体麹の製造方法で得られるグルコアミラーゼと、耐酸性α−アミラーゼとを有する発酵飲食品製造用の液体麹のセット。
【請求項１】
発酵飲食品製造に用いられる液体麹の製造方法であって、培養原料としてアマランサス及び／又はキヌアを含む液体培地で麹菌を培養することを特徴とする液体麹の製造方法。
【請求項２】
前記アマランサス及び／又はキヌアを含む液体培地で培養される麹菌培養物中に、少なくともグルコアミラーゼと、耐酸性α−アミラーゼとを同時に生成、蓄積させる請求項１に記載の液体麹の製造方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の液体麹の製造方法で得られるグルコアミラーゼ活性と、耐酸性α−アミラーゼ活性とを有する発酵飲食品製造用の液体麹のセット。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵飲食品製造に用いられる液体麹の製造方法であって、培養原料として細砕や粉砕などの前処理をしないアマランサス１．５〜１５％（ｗ／ｖｏｌ）及び／又はキヌア１．５〜７％（ｗ／ｖｏｌ）を含む液体培地で白麹菌及び／又は黒麹菌を培養することを特徴とする液体麹の製造方法。
【請求項２】
前記アマランサス及び／又はキヌアを含む液体培地で培養される麹菌培養物中に、少なくともグルコアミラーゼと、耐酸性α−アミラーゼとを同時に生成、蓄積させる請求項１に記載の液体麹の製造方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の液体麹の製造方法で得られるグルコアミラーゼと、耐酸性α−アミラーゼとを有する発酵飲食品製造用の液体麹のセット。
【公開番号】特開２００６−１８０７８９（Ｐ２００６−１８０７８９Ａ）
【公開日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３７８４５３（Ｐ２００４−３７８４５３）
【出願日】平成１６年１２月２８日（２００４．１２．２８）
【特許番号】特許第３７１８６８１号（Ｐ３７１８６８１）
【特許公報発行日】平成１７年１１月２４日（２００５．１１．２４）
【出願人】（０００００００５５）アサヒビール株式会社 (535)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月２８日（２００４．１２．２８）
【特許番号】特許第３７１８６８１号（Ｐ３７１８６８１）
【特許公報発行日】平成１７年１１月２４日（２００５．１１．２４）
【出願人】（０００００００５５）アサヒビール株式会社 (535)
【Ｆターム（参考）】
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