難培養性細菌の培養方法
【課題】本発明は、従来in vitroでの培養ができなかったＨ．ハイルマニー菌の培養物を提供することを課題とし、また、Ｈ．ハイルマニー菌の培養方法を提供することを課題とする。さらには、Ｈ．ハイルマニー菌培養用培地及びＨ．ハイルマニー菌の検査方法を提供することを課題とする。
【解決手段】Ｈ．ハイルマニー感染動物の胃のホモジェナイズし、ヘリコバクターピロリ選択サプリメント含むｐＨ２．２ ＨＣｌ-ＫＣｌ緩衝液で処理する。また基礎培地にヘリコバクターピロリ選択サプリメント及びカタラーゼ含む栄養培地を用いることにより、in vitroの系においてＨ．ハイルマニー菌を培養可能となる。また、前記栄養培地で培養して得られたコロニーを採取して、再度当該栄養培地で培養する工程を少なくとも２回繰り返すことにより、他の微生物を含まないＨ．ハイルマニー菌培養物が得られる。
【解決手段】Ｈ．ハイルマニー感染動物の胃のホモジェナイズし、ヘリコバクターピロリ選択サプリメント含むｐＨ２．２ ＨＣｌ-ＫＣｌ緩衝液で処理する。また基礎培地にヘリコバクターピロリ選択サプリメント及びカタラーゼ含む栄養培地を用いることにより、in vitroの系においてＨ．ハイルマニー菌を培養可能となる。また、前記栄養培地で培養して得られたコロニーを採取して、再度当該栄養培地で培養する工程を少なくとも２回繰り返すことにより、他の微生物を含まないＨ．ハイルマニー菌培養物が得られる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、難培養性細菌のうち特にヘリコバクター・ハイルマニー（Helicobacter heilmannii、以下単に「Ｈ．ハイルマニー」ともいう。）菌の培養方法に関し、さらにはＨ．ハイルマニー菌培養物、Ｈ．ハイルマニー菌の培養に用いる栄養培地、及びＨ．ハイルマニー菌の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胃炎、胃潰瘍患者の胃生検材料からヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ピロリ）が高率に検出されることが1983年に報告され（Warren JR, Mashall BJ, Lancet, 1273-1275 (1983)）、それ以来、胃炎、胃又は十二指腸潰瘍の発症にヘリコバクター属細菌が関わっていることが次第に明らかとなってきた。ヒトのＨ．ピロリ感染症は、慢性胃炎や潰瘍の他、リンパ腫、腺腫などの発生にも関与している。Ｈ．ハイルマニー菌はヒトをはじめ多くの哺乳動物の胃内に生息が確認されており、Ｈ．ピロリ菌と同様に胃炎、胃潰瘍、胃癌、リンパ腫などを引き起こすことが報告されており（非特許文献１）、胃ＭＡＬＴ型リンパ腫の原因菌である可能性が示唆されている（非特許文献２）。Ｈ．ハイルマニー菌は、グラム陰性螺旋型桿菌であり、５〜７巻の螺旋を有する。両極に、10〜20本の鞭毛を有し、運動性があり、ウレアーゼ活性を有する。Ｈ．ピロリ菌感染者の0.66％、Ｈ．ハイルマニー菌感染者の1.47％にリンパ腫が発生することが報告されている。
【０００３】
しかしながら、Ｈ．ハイルマニー菌は、in vitroでの培養方法は確立されておらず、in vivoで菌の継代が行なわれているのみである（非特許文献３）。また、Ｈ．ハイルマニー菌の分離培養について試みたものの、発育が認められなかったという報告もある（非特許文献４）。
【０００４】
自然界に存在し、生きているが培養困難な状態の微生物について、例えばコレラ菌、赤痢菌、大腸菌等は平板培養法でのコロニー形成菌数が顕著に減少することをColwell等は指摘している（Microbial. Ecol. 8313-323 (1982)）。これに対して蛍光染色法による全菌数は変化しないこと、及びコロニー形成菌数よりもはるかに多数の菌がタンパク質合成能力を有していることが確認されている（Can. J. Microbiol., 25, 415-420 (1979)）。このような微生物の生理状態をColwell等はVBNC（Viable But Not Culturable）と称している。VBNCをカタラーゼを含む栄養培地で培養し、培養した微生物を分離することを特徴とする微生物の取得方法について、開示があり（特許文献１）、この実施例ではVBNC状のE. coli K-12を用いている。細菌は、エネルギー代謝を行い、宿主細胞の生体防衛システムによりこの過程で過酸化水素を細胞内で発生させることが知られている。細胞内において発生した過酸化水素は、さらに有毒なスーパーオキシドやヒドロキシラジカルを発生させる。Ｈ．ピロリのような病原性細菌では、特に過酸化水素やヒドロキシラジカルにさらされるといわれている（非特許文献５）。カタラーゼにより、細菌の過酸化水素による直接的及び間接的酸化ダメージが回避されることが報告されている（非特許文献６、７）。
【０００５】
しかしながら、特許文献１が公開された2004年3月25日よりも後に、Ｈ．ハイルマニー菌は、in vitroでの培養は困難であることが各種報告されている。例えば、ブタの胃に感染させたＨ．ハイルマニー菌を取得したものを材料としたもの（非特許文献８）、マウスの胃に感染させたＨ．ハイルマニー菌を取得したものを材料としたもの（非特許文献９）、販売カタログに掲載されるマウスの胃で継代されたＨ．ハイルマニー菌（非特許文献１０）などが挙げられる。このように、Ｈ．ハイルマニー菌については、in vitroでの培養方法が提供されている状況とはいえず、そのために本菌の病原性並びに遺伝子等の解析について詳細な検討が非常に困難であり、研究の進展に妨げとなっていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2004-89106号公報（2004年3月25日公開）
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】J Clin Microbiol, 42:2144-51 (2004)
【非特許文献２】Gastroenterology 118:821-28 (2000)
【非特許文献３】J Clin Microbiol Infect Dis, 15:95-96 (1996)
【非特許文献４】第37回関東甲信越地区医学検査学会2000.10.14-15、「Helicobacter heilmanniiの分離培養への試み」
【非特許文献５】Microbiology, 149: 665-672 (2003)
【非特許文献６】Arch. Microbiol., 172: 63-67 (1999)
【非特許文献７】Arch. Microbiol., 173: 307-310 (2000)
【非特許文献８】Braz J Medical Biol Res, 39:253-261 (2006)
【非特許文献９】Infect Immun. 2007 Mar;75(3):1214-22. Epub 2006 Dec 28.
【非特許文献１０】ATCC(R)catalog, 49286TM, 2008 ATCC. All Rights Reserved.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、従来in vitroでの培養ができなかったＨ．ハイルマニー菌の培養物を提供することを課題とし、また、Ｈ．ハイルマニー菌の培養方法を提供することを課題とする。さらには、Ｈ．ハイルマニー菌培養用培地及びＨ．ハイルマニー菌の検査方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、基礎培地に少なくともカタラーゼ含む栄養培地を用いることによりＨ．ハイルマニー菌をin vitroの系において培養可能となることを見出した。また、前記栄養培地で培養して得られたコロニーを採取して、再度当該栄養培地で培養することにより、他の微生物を含まないＨ．ハイルマニー菌培養物を得ることに成功し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．Ｈ．ハイルマニー菌のみからなり、他の微生物を含まないＨ．ハイルマニー菌培養物。
２．培養物が、動物組織を含まない前項１に記載のＨ．ハイルマニー菌培養物。
３．培養物が、in vitroの系で培養されたものである前項１又は２に記載のＨ．ハイルマニー菌培養物。
４．基礎培地に少なくともカタラーゼ含む、Ｈ．ハイルマニー菌の培養用栄養培地。
５．基礎培地が、トリプチケースソイ寒天培地である前項４に記載の栄養培地。
６．さらに、乳酸トリメトプリムを含む前項４又は５に記載の栄養培地。
７．以下の組成物を含む前項４〜６のいずれか１に記載の栄養培地：
トリプチケースソイ寒天培地；
ヒツジ血液（５〜１５w/v％）；
乳酸トリメトプリム（２〜１０ｍｇ／ｍｌ）；
カタラーゼ（５０〜１０００Ｕ／ｍｌ）。
８．前項４〜７のいずれか１に記載の栄養培地を用いて培養する、Ｈ．ハイルマニー菌の培養方法。
９．以下の工程を含む、前項８に記載の培養方法：
１）ヒト又は動物より採取したＨ．ハイルマニー菌を、前項４〜７のいずれか１に記載の栄養培地を用いて培養する工程；
２）上記１）の工程で得られたコロニーの一部を採取し、採取したコロニーを前項４〜７のいずれか１に記載の栄養培地を用いて再度培養する工程。
１０．上記２）の工程の後に得られたコロニーの一部を採取し、採取したコロニーを前項４〜７のいずれか１に記載の栄養培地を用いて再度培養する工程を少なくとも２回繰り返し、Ｈ．ハイルマニー菌を純化する工程を含む前項９に記載の培養方法。
１１．培養されたＨ．ハイルマニー菌培養物が、Ｈ．ハイルマニー菌のみからなり、他の微生物を含まないことを確認する工程を含む、前項８〜１０のいずれか１に記載の培養方法。
１２．前項８〜１１のいずれか１に記載の培養方法により培養されたＨ．ハイルマニー菌培養物。
１３．前項８〜１１のいずれか１に記載の培養方法を用いるＨ．ハイルマニー菌の分離方法。
１４．前項８〜１１のいずれか１に記載の培養方法を用いるＨ．ハイルマニー菌の検査方法。
１５．前項１〜３および前項１１のいずれか１に記載のＨ．ハイルマニー菌培養物を検出することを特徴とするＨ．ハイルマニー菌の検査方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の培養方法により、従来in vitroでの培養ができなかったＨ．ハイルマニー菌を培養することができた。本発明の培養方法により得られたＨ．ハイルマニー菌培養物を使用することで、本菌の病原性並びに遺伝子等の解析など、従来未解明であった研究を進めることができる。また、本発明の培養方法を用いることで、胃の生検検体よりＨ．ハイルマニー菌の存在の有無を確認することによるＨ．ハイルマニー菌の検査を行うことができる。さらに、精製菌体のタンパク質を用いて、特異的抗体を検出することで、血清、尿から、その感染診断を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Ｈ．ハイルマニー菌の培養方法の概略を示す図である。
【図２】本発明の培養物からの細菌の１６ＳｒＲＮＡの遺伝子配列を検出する方法の概略を示す図である。
【図３】豚胃粘膜の肉眼所見及び組織所見を示す写真図である。（実験例１−１）
【図４】豚胃粘膜から精製されたＤＮＡをテンプレートとして、Ｈ．ハイルマニー１６Ｓプライマー用いたＰＣＲによりＨ．ハイルマニー菌１６ＳｒＲＮＡ増幅産物の存在を示す写真図である。（実験例１−１）
【図５】本発明の栄養培地で培養された培養物の写真図である（実験例１−２）。左が単離培養前、右が培養を繰り返し純化したＨ．ハイルマニー菌を示す。
【図６】本発明の栄養培地で純化培養された培養物（コロニー）からＤＮＡを精製し、Ｈ．ハイルマニー菌ウレアーゼＡプライマーならびにウレアーゼＢプライマーを用いてウレアーゼＡならびにウレアーゼＢ遺伝子の増幅産物の存在を示す図である。（実験例１−３）
【図７】本発明の栄養培地で培養された培養物のウレアーゼＡ遺伝子配列を示す図である。（実験例１−３）
【図８】本発明の栄養培地で培養された培養物のウレアーゼＢ遺伝子配列を示す図である。（実験例１−３）
【図９】マウス胃粘膜から本発明の栄養培地で培養された培養物の写真図（Ａ）である（実験例２）。純化精製された培養物より得られたＤＮＡをテンプレートとして、Ｈ．ハイルマニー１６Ｓプライマー用いたＰＣＲによりＨ．ハイルマニー菌１６ＳｒＲＮＡ増幅産物の存在を示す写真図である。（実験例２−１）
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、従来in vitroでの培養ができなかったＨ．ハイルマニー菌の培養方法、前記培養方法により得られるＨ．ハイルマニー菌培養物、Ｈ．ハイルマニー菌の培養に用いる栄養培地、さらにはＨ．ハイルマニー菌の検査方法に関する。
【００１４】
まずはじめに、Ｈ．ハイルマニー菌の培養方法の概略を、図１に従い説明する。図１は、具体的な例を示すものであって、本発明はこれに限定されるものではない。Ｈ．ハイルマニー菌は生体検体から採取することができ、例えばＨ．ハイルマニー菌の感染動物の胃組織から採取することができる。当該感染動物は、Ｈ．ハイルマニー菌が感染可能な動物であればよく、特に限定されない。Ｈ．ハイルマニー菌は、例えばマウス、カニクイザル、ブタ、イヌ、ヒト等から採取することができる。例えば、実験動物からは当該実験動物の胃を摘出したものを生体検体とし、ヒトの場合は胃組織を生検採取により採取したものを生体検体とし、採取することができる。あるいは、in vivoの系でストックされている市販のＨ．ハイルマニー菌を用いることもできる。
【００１５】
生体検体などからＨ．ハイルマニー菌を単離するための最初の選択培地として、本発明のＨ．ハイルマニー菌培養用の栄養培地を使用することができる。具体的には、Ｈ．ハイルマニー菌が感染しているか、又は感染が疑われる動物あるいはヒトから採取した生体検体を高酸緩衝液でホモジェナイズしたものを、本発明のＨ．ハイルマニー菌培養用の栄養培地に直接接種して培養することができる。
【００１６】
ここで、本発明のＨ．ハイルマニー菌培養用の栄養培地には、基礎培地に少なくともカタラーゼを含むことを特徴とする。基礎培地として、トリプチケースソイ寒天培地を用いる。さらに、当該栄養培地には、ヒツジ血液や乳酸トリメトプリムを含むことができる。
【００１７】
好適な栄養培地は、トリプチケースソイ寒天培地；ヒツジ血液（５〜１５w/v％、より好適には約５w/v％）；乳酸トリメトプリム（２〜１０ｍｇ／ｌ、より好適には約２ｍｇ／ｌ）；カタラーゼ（５０〜１０００Ｕ／ｍｌ、好適には１００〜２００Ｕ／ｍｌ、より好適には約１００ｍｇ／ｌ）を含むことができる。さらに、バンコマイシン、セフスロジン及びアンホテリシンＢなどを含むことができる。
【００１８】
Ｈ．ハイルマニー菌は、当該栄養培地に接種し、３７±０．５℃で１〜１０日間、好ましくは約５日間、微好気性培養、例えば５％ＣＯ２存在下で培養することができる。培養の際に、湿度を高くすることでＨ．ハイルマニー菌の発育を向上させることができる。例えば、湿度は９５％以上とすることができる。
【００１９】
さらに以下の工程を含む培養方法により培養することができる。
１）ヒト又は動物より採取したＨ．ハイルマニー菌を、当該栄養培地を用いて培養する工程。
２）上記１）の工程で得られた培養物（コロニー）の一部を採取し、採取したコロニーを当該栄養培地を用いて再度培養する工程。
【００２０】
本発明の培養方法では、上記２）の工程の後に得られたコロニーの一部を採取し、採取したコロニーを当該栄養培地を用いて再度培養する工程を少なくとも２回、好ましくは３回以上繰り返し、Ｈ．ハイルマニー菌を純化する工程を含む。上記採取したコロニーを当該栄養培地を用いて培養する工程を繰り返すことにより、Ｈ．ハイルマニー菌を純化することができる。上記のように培養して得られた培養物（コロニー）の一部を、当該栄養培地に塗抹し、継代培養することができる。本発明の培養方法では、さらに、前記の培養方法により培養されたＨ．ハイルマニー菌培養物がＨ．ハイルマニー菌のみからなり、他の微生物を含まないことを確認する工程を含んでいてもよい。
【００２１】
上記のように培養して分離された培養物は、Ｈ．ハイルマニー菌のみからなり、他の微生物を含まないことを特徴とする。本発明は、上記得られたＨ．ハイルマニー菌培養物にも及ぶ。Ｈ．ハイルマニー菌は、従来は純粋培養ができず、例えば実験動物やヒト等の胃内、即ちin vivoでしか生存できなかったため、胃からの分離物にはＨ．ハイルマニー菌のほか、他の微生物や動物細胞が混入していた。しかし、本発明の培養方法により初めて純粋培養が可能となり、他の微生物や動物細胞が混入していないＨ．ハイルマニー菌のみを含む培養物を分離することができる。これにより、Ｈ．ハイルマニー菌の微生物学的研究、さらに全遺伝子解析が可能となる。他の微生物の例として、例えば動物の胃内で生存可能な他の細菌、例えばＨ．ピロリ、大腸菌（Escherichia coli）、乳酸菌（Lactobacillus属菌）、 バチルス（Bacillus）属菌等が挙げられる。
【００２２】
また、凍結保存は、本発明の栄養培地で培養した培養物、即ちＨ．ハイルマニー菌を、ブルセラ培地（２０％グリセロール及び１０％馬血清を含む）に懸濁し、−８０℃にて凍結保存することができる。
【００２３】
本発明のＨ．ハイルマニー菌の培養方法は、生体検体から採取したＨ．ハイルマニー菌の培養方法や、継代後に培養した菌の培養方法にも及ぶ。上記の培養方法によりＨ．ハイルマニー菌培養物を分離することができる。本発明は、Ｈ．ハイルマニー菌の分離方法にも及ぶ。
【００２４】
上記において、得られた培養物に他の微生物が含まれないことを確認するための方法として、得られた培養物の全ゲノム解析や１６ＳリボソームＲＮＡ（１６ＳｒＲＮＡ）遺伝子の塩基配列解析等を挙げることができる。１６ＳｒＲＮＡの塩基配列は、培養物からＤＮＡを抽出し、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子ユニバーサルプライマーを用いて増幅、大腸菌にトランスフォーメーション後、得られたそれぞれのコロニーからプラスミドを精製し、挿入塩基配列を解読することにより解析することができる。Ｈ．ハイルマニー菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子は、GenBank Accession No.AF506794に登録される塩基配列、若しくは当該塩基配列のうち、１〜複数個のヌクレオチドが置換し、欠失し、又は付加又は導入される配列のオリゴヌクレオチドからなる。当該配列により、Ｈ．ハイルマニー菌を同定することができる。上記配列は、例えば１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に対するユニバーサルプライマー又はＨ．ハイルマニー菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子特異的プライマーを用いて増幅した遺伝子産物について、塩基配列を確認し、上述のＨ．ハイルマニー菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子との配列を比較することにより、Ｈ．ハイルマニー菌を確認することができる（図２参照）。増幅した遺伝子産物と上述の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子との配列のホモロジーが、少なくとも９５％以上、好ましくは９８．５％以上、より好ましくは９９％以上の場合に、Ｈ．ハイルマニー菌を同定することができる。
【００２５】
さらには、本発明は上述の培養方法を用いることを特徴とするＨ．ハイルマニー菌の検査方法にも及ぶ。具体的には上記の培養方法により培養して得られたＨ．ハイルマニー菌培養物を検出することを特徴とする。例えば、Ｈ．ハイルマニー菌の感染の可能性が疑われる場合に、胃の生検検体を採取し、本発明の栄養培地を用いて培養し、培養物が得られるか否か、あるいは得られた培養物の解析、例えば培養物から抽出した遺伝子をＨ．ハイルマニー１６ＳプライマーをもちいたＰＣＲ法で増幅されるかどうかを解析することにより、Ｈ．ハイルマニー菌の存在を確認することができる。さらに、分離された培養物から抽出した遺伝子を１６ＳｒＲＮＡ遺伝子ユニバーサルプライマーをもちいて増幅し、大腸菌にトランスフォーメーションすることでその配列を解析することで、Ｈ．ハイルマニー菌以外の菌が存在していないかを確認することができる。さらに、精製菌体のタンパク質を用いてEnzyme-Linked Immunosorbent Assay（ELISA）システムを構築することで、感染が疑われるヒトを含む動物などの血清、尿から、その感染診断を行うことができる。
【実施例】
【００２６】
本発明の理解を深めるために、以下の実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではないことは明らかである。
【００２７】
（実施例１）豚胃粘膜からのＨ．ハイルマニー菌の単離培養
Ｈ．ハイルマニー菌の培養は、図１に示す手順にて行なった。具体的には、実験例１−２に記載の方法により行なった。
【００２８】
（実験例１−１）豚胃粘膜におけるＨ．ハイルマニー菌の存在確認
１）方法
豚の胃組織を採取し、胃粘膜の組織所見をＨ＆Ｅ染色にて観察したところ、胃粘膜に著明なリンパ濾胞が認められる豚胃粘膜組織が存在した。豚胃粘膜の肉眼所見及び組織所見を図３に示した。当該豚の胃粘膜にＨ．ハイルマニー菌が感染しているかどうかをＨ．ハイルマニー１６Ｓプライマーを用いたＰＣＲ法で確認した。具体的には、豚の胃粘膜を、溶解緩衝液（Lysis buffer：10 mM Tris-HCl, 1% SDS, 240μg/ml Proteinase K）、フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコール、エタノールを用いてＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡについて、以下に示すＨ．ハイルマニー１６Ｓプライマーを用いてＰＣＲ(polymerase chain reaction)の手法によりＤＮＡを増幅させた。陽性コントロールは、in vivoの系でストックされている市販のＨ．ハイルマニー菌より抽出したＤＮＡにＰＣＲ増幅産物とした。
【００２９】
Ｈ．ハイルマニー１６Ｓプライマー
ａ）フォワードプライマー： TTGGGAGGCTTTGTCTTTCCA（配列番号１）
ｂ）リバースプライマー： GATTAGCTCTGCCTCGCGGCT（配列番号２）
【００３０】
２）結果
ＰＣＲ増幅産物は、陽性コントロールと同じ位置にバンドを認め、実験例１で使用した豚胃粘膜には、Ｈ．ハイルマニー菌が含まれていることが確認された（図４）。
【００３１】
（実験例１−２）マウス感染胃粘膜からのＨ．ハイルマニー菌の培養
１）方法
実験例１−１の豚の胃粘膜を、リン酸緩衝液中でホモジェナイズしたものをマウスに経口投与した。１ヶ月間、マウスを通常通り飼育した後、屠殺し、胃粘膜を採取した。マウスの胃粘膜を、ヘリコバクターピロリ選択サプリメントを含むｐＨ２．２ ＨＣｌ-ＫＣｌ緩衝液でホモジェナイズし、１〜２時間、３７℃でインキュベートしたものを、以下のＨ．ハイルマニー菌の培養用栄養培地（本発明の栄養培地）に塗抹し、５％ＣＯ２、湿度９５％以上において３７±０．５℃、３〜４日間培養した。
【００３２】
Ｈ．ハイルマニー菌培養用栄養培地組成
・基本培地
５w/v％ヒツジ血液加トリプチケースソイＩＩ寒天培地（ベクトンディッキンソン製）
・添加物
ウシ肝臓由来カタラーゼ（Ｗａｋｏ製）１００Ｕ/ ｍｌ
・抗生物質
ヘリコバクターピロリ選択サプリメント（DENT:SR147）（関東化学製）
上記サプリメントには、バンコマイシン：１０ｍｇ／ｌ、乳酸トリメトプリム：５ｍｇ／ｌ、セフスロジン：５ｍｇ／ｌ、アンホテリシンＢ：５ｍｇ／ｌを含む。
【００３３】
２）結果
上記栄養培地で培養した結果、培養物が得られた（図５左）。培養を２度繰り返し、コロニーを純化した（図５右）。
【００３４】
（実験例１−３）Ｈ．ハイルマニー菌ウレアーゼ遺伝子の解析
本実験例では、実験例１−２で培養し、分離された培養物のウレアーゼＡならびにウレアーゼＢ遺伝子を解析した。
【００３５】
１）実験方法
分離された培養物について、実験例１−１と同手法によりＤＮＡを抽出し、Ｈ．ハイルマニーウレアーゼＡならびにウレアーゼＢプライマー用いてＰＣＲを行い、増幅産物を得た。ＰＣＲ増幅産物を１％アガロースゲルで電気泳動した。さらにそれぞれの遺伝子の塩基配列を決定した。
Ｈ．ハイルマニーウレアーゼＡプライマー
ａ）フォワードプライマー： ACTTGTTACCATCCACACTC（配列番号３）
ｂ）リバースプライマー： CGCAGTTAATGGTGCCAA （配列番号４）
Ｈ．ハイルマニーウレアーゼＢプライマー
ａ）フォワードプライマー： GGCGATAAAGTCAGACTAGG（配列番号５）
ｂ）リバースプライマー： GCGAATCCTAGAGTCAGCAA（配列番号６）
【００３６】
２）結果
本発明の栄養培地で分離した培養物（４コロニー）のすべてにおいて、陽性コントロールと同じサイズのバンドが確認された。これにより、栄養培地から分離した培養物は、Ｈ．ハイルマニー菌ウレアーゼ遺伝子をもっていることが示唆された。図６から８において、陽性コントロールは、in vivoの系でストックされている市販のＨ．ハイルマニー菌より抽出したＤＮＡである。分離された培養物、ウレアーゼＡ（図７）ならびにウレアーゼＢ遺伝子（図８）の塩基配列は、Ｈ．ハイルマニー菌の配列と９８．５％以上一致した。
【００３７】
（実験例１−４）Ｈ．ハイルマニー菌以外の菌が培養物に含まれていないことの確認実験
（１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の解析による他の細菌が混在していないことの確認）
本実験例では、実験例１−２で培養し、分離された培養物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を解析した。
【００３８】
１）実験方法
本発明の栄養培地で分離した培養物より、溶解緩衝液（Lysis buffer：10 mM Tris-HCl, 1% SDS, 240μg/ml Proteinase K）、フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコール、エタノールを用いてＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡについて、以下に示す１６ＳｒＲＮＡ遺伝子ユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲ(polymerase chain reaction)の手法によりＤＮＡを増幅させ、ＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ産物をＴＡベクターにつないで大腸菌(E. coli)に導入（トランスフォーメーション）した。選択培地で前記大腸菌を培養し、ベクターが導入された大腸菌を選択した。異なる１０個のコロニーをピックアップして培養後、プラスミドを抽出し、前記プラスミドの挿入配列遺伝子の塩基配列を解析した。
【００３９】
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子ユニバーサルプライマー
ａ）フォワードプライマー：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG （配列番号７）
ｂ）リバースプライマー： GACGGGCGGTGWGTRCA （配列番号８）
【００４０】
２）結果
培養物（１０コロニー）より抽出したＤＮＡすべてで、データベース（GenBank Accession No.AF506794）のＨ．ハイルマニー菌の配列と９８．５％以上一致した。これにより、本発明の栄養培地で分離した菌は、Ｈ．ハイルマニー菌、又はその近縁種であり、他の細菌が混ざっていないことが確認された。
【００４１】
（実施例２）マウス感染胃粘膜よりＨ．ハイルマニー菌の培養
Ｈ．ハイルマニー菌（49286TM、ＡＴＣＣ(R)）を感染させたマウス胃粘膜を、リン酸緩衝液中でホモジェナイズしたものをマウスに経口投与した。１ヶ月間、マウスを通常通り飼育した後、屠殺し、胃粘膜を採取した。マウスの胃粘膜を、ヘリコバクターピロリ選択サプリメントを含むｐＨ２．２ ＨＣｌ-ＫＣｌ緩衝液でホモジェナイズし、１〜２時間、３７℃でインキュベートしたものを、以下のＨ．ハイルマニー菌の培養用栄養培地（本発明の栄養培地）に塗抹し、５％ＣＯ２、湿度９５％以上において３７±０．５℃、３〜４日間培養した。この培養物を用い更に２回培養し、コロニーを純化した。
【００４２】
Ｈ．ハイルマニー菌培養用栄養培地組成
・基本培地
５w/v％ヒツジ血液加トリプチケースソイＩＩ寒天培地（ベクトンディッキンソン製）
・添加物
ウシ肝臓由来カタラーゼ（Ｗａｋｏ製）１００Ｕ／ｍｌ
・抗生物質
ヘリコバクターピロリ選択サプリメント（DENT:SR147）（関東化学製）
上記サプリメントには、バンコマイシン：１０ｍｇ／ｌ、乳酸トリメトプリム：５ｍｇ／ｌ、セフスロジン：５ｍｇ／ｌ、アンホテリシンＢ：５ｍｇ／ｌを含む。
【００４３】
（実験例２−１）培養物の確認
１）方法
得られた培養物から、上述の方法でＤＮＡを精製し、Ｈ．ハイルマニー１６Ｓプライマーを用いてＰＣＲの手法によりＤＮＡを増幅させた。陽性コントロールは、in vivoの系でストックされている市販のＨ．ハイルマニー菌より抽出したＤＮＡにＰＣＲ増幅産物とした。
【００４４】
２）結果
上記栄養培地で培養した結果、培養物が得られた（図９Ａ）。また、培養物から得られたＰＣＲ増幅産物は、陽性コントロールと同じ位置にバンドを認め、培養物はＨ．ハイルマニー菌が含まれていることが確認された（図９Ｂ）。
【００４５】
（実験例２−２）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の解析による他の細菌が混在していないことの確認
本実験例では、実施例２で培養し、分離された培養物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を解析した。
【００４６】
１）実験方法
本発明の栄養培地で分離した培養物より、溶解緩衝液（Lysis buffer：10 mM Tris-HCl, 1% SDS, 240μg/ml Proteinase K）、フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコール、エタノールを用いてＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡについて、以下に示す１６ＳｒＲＮＡ遺伝子ユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲ(polymerase chain reaction)の手法によりＤＮＡを増幅させ、ＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ産物をＴＡベクターにつないで大腸菌(E. coli)に導入（トランスフォーメーション）した。選択培地で前記大腸菌を培養し、ベクターが導入された大腸菌を選択した。異なる１０個のコロニーをピックアップして培養後、プラスミドを抽出し、前記プラスミドの挿入配列遺伝子の塩基配列を解析した。
【００４７】
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子ユニバーサルプライマー
ａ）フォワードプライマー：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG （配列番号７）
ｂ）リバースプライマー： GACGGGCGGTGWGTRCA （配列番号８）
【００４８】
２）結果
培養物（１０コロニー）より抽出したＤＮＡすべてで、データベース（GenBank Accession No.AF506794）のＨ．ハイルマニー菌の配列と９８．５％以上一致した。これにより、本発明の栄養培地で分離した菌は、Ｈ．ハイルマニー菌、又はその近縁種であり、他の細菌が混ざっていないことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
以上詳述したように、本発明の培養方法により、従来in vitroでの培養ができなかったＨ．ハイルマニー菌を培養することができた。本発明の培養方法を用いることで、胃の生検検体について、Ｈ．ハイルマニー菌の存在の有無を確認することによりＨ．ハイルマニー菌の検査を行うことができる。また、本発明の栄養培地で培養された培養物を使用することで、本菌の病原性並びに遺伝子等の解析など、従来未解明であった研究を進めることができ、非常に有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、難培養性細菌のうち特にヘリコバクター・ハイルマニー（Helicobacter heilmannii、以下単に「Ｈ．ハイルマニー」ともいう。）菌の培養方法に関し、さらにはＨ．ハイルマニー菌培養物、Ｈ．ハイルマニー菌の培養に用いる栄養培地、及びＨ．ハイルマニー菌の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胃炎、胃潰瘍患者の胃生検材料からヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ピロリ）が高率に検出されることが1983年に報告され（Warren JR, Mashall BJ, Lancet, 1273-1275 (1983)）、それ以来、胃炎、胃又は十二指腸潰瘍の発症にヘリコバクター属細菌が関わっていることが次第に明らかとなってきた。ヒトのＨ．ピロリ感染症は、慢性胃炎や潰瘍の他、リンパ腫、腺腫などの発生にも関与している。Ｈ．ハイルマニー菌はヒトをはじめ多くの哺乳動物の胃内に生息が確認されており、Ｈ．ピロリ菌と同様に胃炎、胃潰瘍、胃癌、リンパ腫などを引き起こすことが報告されており（非特許文献１）、胃ＭＡＬＴ型リンパ腫の原因菌である可能性が示唆されている（非特許文献２）。Ｈ．ハイルマニー菌は、グラム陰性螺旋型桿菌であり、５〜７巻の螺旋を有する。両極に、10〜20本の鞭毛を有し、運動性があり、ウレアーゼ活性を有する。Ｈ．ピロリ菌感染者の0.66％、Ｈ．ハイルマニー菌感染者の1.47％にリンパ腫が発生することが報告されている。
【０００３】
しかしながら、Ｈ．ハイルマニー菌は、in vitroでの培養方法は確立されておらず、in vivoで菌の継代が行なわれているのみである（非特許文献３）。また、Ｈ．ハイルマニー菌の分離培養について試みたものの、発育が認められなかったという報告もある（非特許文献４）。
【０００４】
自然界に存在し、生きているが培養困難な状態の微生物について、例えばコレラ菌、赤痢菌、大腸菌等は平板培養法でのコロニー形成菌数が顕著に減少することをColwell等は指摘している（Microbial. Ecol. 8313-323 (1982)）。これに対して蛍光染色法による全菌数は変化しないこと、及びコロニー形成菌数よりもはるかに多数の菌がタンパク質合成能力を有していることが確認されている（Can. J. Microbiol., 25, 415-420 (1979)）。このような微生物の生理状態をColwell等はVBNC（Viable But Not Culturable）と称している。VBNCをカタラーゼを含む栄養培地で培養し、培養した微生物を分離することを特徴とする微生物の取得方法について、開示があり（特許文献１）、この実施例ではVBNC状のE. coli K-12を用いている。細菌は、エネルギー代謝を行い、宿主細胞の生体防衛システムによりこの過程で過酸化水素を細胞内で発生させることが知られている。細胞内において発生した過酸化水素は、さらに有毒なスーパーオキシドやヒドロキシラジカルを発生させる。Ｈ．ピロリのような病原性細菌では、特に過酸化水素やヒドロキシラジカルにさらされるといわれている（非特許文献５）。カタラーゼにより、細菌の過酸化水素による直接的及び間接的酸化ダメージが回避されることが報告されている（非特許文献６、７）。
【０００５】
しかしながら、特許文献１が公開された2004年3月25日よりも後に、Ｈ．ハイルマニー菌は、in vitroでの培養は困難であることが各種報告されている。例えば、ブタの胃に感染させたＨ．ハイルマニー菌を取得したものを材料としたもの（非特許文献８）、マウスの胃に感染させたＨ．ハイルマニー菌を取得したものを材料としたもの（非特許文献９）、販売カタログに掲載されるマウスの胃で継代されたＨ．ハイルマニー菌（非特許文献１０）などが挙げられる。このように、Ｈ．ハイルマニー菌については、in vitroでの培養方法が提供されている状況とはいえず、そのために本菌の病原性並びに遺伝子等の解析について詳細な検討が非常に困難であり、研究の進展に妨げとなっていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2004-89106号公報（2004年3月25日公開）
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】J Clin Microbiol, 42:2144-51 (2004)
【非特許文献２】Gastroenterology 118:821-28 (2000)
【非特許文献３】J Clin Microbiol Infect Dis, 15:95-96 (1996)
【非特許文献４】第37回関東甲信越地区医学検査学会2000.10.14-15、「Helicobacter heilmanniiの分離培養への試み」
【非特許文献５】Microbiology, 149: 665-672 (2003)
【非特許文献６】Arch. Microbiol., 172: 63-67 (1999)
【非特許文献７】Arch. Microbiol., 173: 307-310 (2000)
【非特許文献８】Braz J Medical Biol Res, 39:253-261 (2006)
【非特許文献９】Infect Immun. 2007 Mar;75(3):1214-22. Epub 2006 Dec 28.
【非特許文献１０】ATCC(R)catalog, 49286TM, 2008 ATCC. All Rights Reserved.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、従来in vitroでの培養ができなかったＨ．ハイルマニー菌の培養物を提供することを課題とし、また、Ｈ．ハイルマニー菌の培養方法を提供することを課題とする。さらには、Ｈ．ハイルマニー菌培養用培地及びＨ．ハイルマニー菌の検査方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、基礎培地に少なくともカタラーゼ含む栄養培地を用いることによりＨ．ハイルマニー菌をin vitroの系において培養可能となることを見出した。また、前記栄養培地で培養して得られたコロニーを採取して、再度当該栄養培地で培養することにより、他の微生物を含まないＨ．ハイルマニー菌培養物を得ることに成功し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．Ｈ．ハイルマニー菌のみからなり、他の微生物を含まないＨ．ハイルマニー菌培養物。
２．培養物が、動物組織を含まない前項１に記載のＨ．ハイルマニー菌培養物。
３．培養物が、in vitroの系で培養されたものである前項１又は２に記載のＨ．ハイルマニー菌培養物。
４．基礎培地に少なくともカタラーゼ含む、Ｈ．ハイルマニー菌の培養用栄養培地。
５．基礎培地が、トリプチケースソイ寒天培地である前項４に記載の栄養培地。
６．さらに、乳酸トリメトプリムを含む前項４又は５に記載の栄養培地。
７．以下の組成物を含む前項４〜６のいずれか１に記載の栄養培地：
トリプチケースソイ寒天培地；
ヒツジ血液（５〜１５w/v％）；
乳酸トリメトプリム（２〜１０ｍｇ／ｍｌ）；
カタラーゼ（５０〜１０００Ｕ／ｍｌ）。
８．前項４〜７のいずれか１に記載の栄養培地を用いて培養する、Ｈ．ハイルマニー菌の培養方法。
９．以下の工程を含む、前項８に記載の培養方法：
１）ヒト又は動物より採取したＨ．ハイルマニー菌を、前項４〜７のいずれか１に記載の栄養培地を用いて培養する工程；
２）上記１）の工程で得られたコロニーの一部を採取し、採取したコロニーを前項４〜７のいずれか１に記載の栄養培地を用いて再度培養する工程。
１０．上記２）の工程の後に得られたコロニーの一部を採取し、採取したコロニーを前項４〜７のいずれか１に記載の栄養培地を用いて再度培養する工程を少なくとも２回繰り返し、Ｈ．ハイルマニー菌を純化する工程を含む前項９に記載の培養方法。
１１．培養されたＨ．ハイルマニー菌培養物が、Ｈ．ハイルマニー菌のみからなり、他の微生物を含まないことを確認する工程を含む、前項８〜１０のいずれか１に記載の培養方法。
１２．前項８〜１１のいずれか１に記載の培養方法により培養されたＨ．ハイルマニー菌培養物。
１３．前項８〜１１のいずれか１に記載の培養方法を用いるＨ．ハイルマニー菌の分離方法。
１４．前項８〜１１のいずれか１に記載の培養方法を用いるＨ．ハイルマニー菌の検査方法。
１５．前項１〜３および前項１１のいずれか１に記載のＨ．ハイルマニー菌培養物を検出することを特徴とするＨ．ハイルマニー菌の検査方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の培養方法により、従来in vitroでの培養ができなかったＨ．ハイルマニー菌を培養することができた。本発明の培養方法により得られたＨ．ハイルマニー菌培養物を使用することで、本菌の病原性並びに遺伝子等の解析など、従来未解明であった研究を進めることができる。また、本発明の培養方法を用いることで、胃の生検検体よりＨ．ハイルマニー菌の存在の有無を確認することによるＨ．ハイルマニー菌の検査を行うことができる。さらに、精製菌体のタンパク質を用いて、特異的抗体を検出することで、血清、尿から、その感染診断を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Ｈ．ハイルマニー菌の培養方法の概略を示す図である。
【図２】本発明の培養物からの細菌の１６ＳｒＲＮＡの遺伝子配列を検出する方法の概略を示す図である。
【図３】豚胃粘膜の肉眼所見及び組織所見を示す写真図である。（実験例１−１）
【図４】豚胃粘膜から精製されたＤＮＡをテンプレートとして、Ｈ．ハイルマニー１６Ｓプライマー用いたＰＣＲによりＨ．ハイルマニー菌１６ＳｒＲＮＡ増幅産物の存在を示す写真図である。（実験例１−１）
【図５】本発明の栄養培地で培養された培養物の写真図である（実験例１−２）。左が単離培養前、右が培養を繰り返し純化したＨ．ハイルマニー菌を示す。
【図６】本発明の栄養培地で純化培養された培養物（コロニー）からＤＮＡを精製し、Ｈ．ハイルマニー菌ウレアーゼＡプライマーならびにウレアーゼＢプライマーを用いてウレアーゼＡならびにウレアーゼＢ遺伝子の増幅産物の存在を示す図である。（実験例１−３）
【図７】本発明の栄養培地で培養された培養物のウレアーゼＡ遺伝子配列を示す図である。（実験例１−３）
【図８】本発明の栄養培地で培養された培養物のウレアーゼＢ遺伝子配列を示す図である。（実験例１−３）
【図９】マウス胃粘膜から本発明の栄養培地で培養された培養物の写真図（Ａ）である（実験例２）。純化精製された培養物より得られたＤＮＡをテンプレートとして、Ｈ．ハイルマニー１６Ｓプライマー用いたＰＣＲによりＨ．ハイルマニー菌１６ＳｒＲＮＡ増幅産物の存在を示す写真図である。（実験例２−１）
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、従来in vitroでの培養ができなかったＨ．ハイルマニー菌の培養方法、前記培養方法により得られるＨ．ハイルマニー菌培養物、Ｈ．ハイルマニー菌の培養に用いる栄養培地、さらにはＨ．ハイルマニー菌の検査方法に関する。
【００１４】
まずはじめに、Ｈ．ハイルマニー菌の培養方法の概略を、図１に従い説明する。図１は、具体的な例を示すものであって、本発明はこれに限定されるものではない。Ｈ．ハイルマニー菌は生体検体から採取することができ、例えばＨ．ハイルマニー菌の感染動物の胃組織から採取することができる。当該感染動物は、Ｈ．ハイルマニー菌が感染可能な動物であればよく、特に限定されない。Ｈ．ハイルマニー菌は、例えばマウス、カニクイザル、ブタ、イヌ、ヒト等から採取することができる。例えば、実験動物からは当該実験動物の胃を摘出したものを生体検体とし、ヒトの場合は胃組織を生検採取により採取したものを生体検体とし、採取することができる。あるいは、in vivoの系でストックされている市販のＨ．ハイルマニー菌を用いることもできる。
【００１５】
生体検体などからＨ．ハイルマニー菌を単離するための最初の選択培地として、本発明のＨ．ハイルマニー菌培養用の栄養培地を使用することができる。具体的には、Ｈ．ハイルマニー菌が感染しているか、又は感染が疑われる動物あるいはヒトから採取した生体検体を高酸緩衝液でホモジェナイズしたものを、本発明のＨ．ハイルマニー菌培養用の栄養培地に直接接種して培養することができる。
【００１６】
ここで、本発明のＨ．ハイルマニー菌培養用の栄養培地には、基礎培地に少なくともカタラーゼを含むことを特徴とする。基礎培地として、トリプチケースソイ寒天培地を用いる。さらに、当該栄養培地には、ヒツジ血液や乳酸トリメトプリムを含むことができる。
【００１７】
好適な栄養培地は、トリプチケースソイ寒天培地；ヒツジ血液（５〜１５w/v％、より好適には約５w/v％）；乳酸トリメトプリム（２〜１０ｍｇ／ｌ、より好適には約２ｍｇ／ｌ）；カタラーゼ（５０〜１０００Ｕ／ｍｌ、好適には１００〜２００Ｕ／ｍｌ、より好適には約１００ｍｇ／ｌ）を含むことができる。さらに、バンコマイシン、セフスロジン及びアンホテリシンＢなどを含むことができる。
【００１８】
Ｈ．ハイルマニー菌は、当該栄養培地に接種し、３７±０．５℃で１〜１０日間、好ましくは約５日間、微好気性培養、例えば５％ＣＯ２存在下で培養することができる。培養の際に、湿度を高くすることでＨ．ハイルマニー菌の発育を向上させることができる。例えば、湿度は９５％以上とすることができる。
【００１９】
さらに以下の工程を含む培養方法により培養することができる。
１）ヒト又は動物より採取したＨ．ハイルマニー菌を、当該栄養培地を用いて培養する工程。
２）上記１）の工程で得られた培養物（コロニー）の一部を採取し、採取したコロニーを当該栄養培地を用いて再度培養する工程。
【００２０】
本発明の培養方法では、上記２）の工程の後に得られたコロニーの一部を採取し、採取したコロニーを当該栄養培地を用いて再度培養する工程を少なくとも２回、好ましくは３回以上繰り返し、Ｈ．ハイルマニー菌を純化する工程を含む。上記採取したコロニーを当該栄養培地を用いて培養する工程を繰り返すことにより、Ｈ．ハイルマニー菌を純化することができる。上記のように培養して得られた培養物（コロニー）の一部を、当該栄養培地に塗抹し、継代培養することができる。本発明の培養方法では、さらに、前記の培養方法により培養されたＨ．ハイルマニー菌培養物がＨ．ハイルマニー菌のみからなり、他の微生物を含まないことを確認する工程を含んでいてもよい。
【００２１】
上記のように培養して分離された培養物は、Ｈ．ハイルマニー菌のみからなり、他の微生物を含まないことを特徴とする。本発明は、上記得られたＨ．ハイルマニー菌培養物にも及ぶ。Ｈ．ハイルマニー菌は、従来は純粋培養ができず、例えば実験動物やヒト等の胃内、即ちin vivoでしか生存できなかったため、胃からの分離物にはＨ．ハイルマニー菌のほか、他の微生物や動物細胞が混入していた。しかし、本発明の培養方法により初めて純粋培養が可能となり、他の微生物や動物細胞が混入していないＨ．ハイルマニー菌のみを含む培養物を分離することができる。これにより、Ｈ．ハイルマニー菌の微生物学的研究、さらに全遺伝子解析が可能となる。他の微生物の例として、例えば動物の胃内で生存可能な他の細菌、例えばＨ．ピロリ、大腸菌（Escherichia coli）、乳酸菌（Lactobacillus属菌）、 バチルス（Bacillus）属菌等が挙げられる。
【００２２】
また、凍結保存は、本発明の栄養培地で培養した培養物、即ちＨ．ハイルマニー菌を、ブルセラ培地（２０％グリセロール及び１０％馬血清を含む）に懸濁し、−８０℃にて凍結保存することができる。
【００２３】
本発明のＨ．ハイルマニー菌の培養方法は、生体検体から採取したＨ．ハイルマニー菌の培養方法や、継代後に培養した菌の培養方法にも及ぶ。上記の培養方法によりＨ．ハイルマニー菌培養物を分離することができる。本発明は、Ｈ．ハイルマニー菌の分離方法にも及ぶ。
【００２４】
上記において、得られた培養物に他の微生物が含まれないことを確認するための方法として、得られた培養物の全ゲノム解析や１６ＳリボソームＲＮＡ（１６ＳｒＲＮＡ）遺伝子の塩基配列解析等を挙げることができる。１６ＳｒＲＮＡの塩基配列は、培養物からＤＮＡを抽出し、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子ユニバーサルプライマーを用いて増幅、大腸菌にトランスフォーメーション後、得られたそれぞれのコロニーからプラスミドを精製し、挿入塩基配列を解読することにより解析することができる。Ｈ．ハイルマニー菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子は、GenBank Accession No.AF506794に登録される塩基配列、若しくは当該塩基配列のうち、１〜複数個のヌクレオチドが置換し、欠失し、又は付加又は導入される配列のオリゴヌクレオチドからなる。当該配列により、Ｈ．ハイルマニー菌を同定することができる。上記配列は、例えば１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に対するユニバーサルプライマー又はＨ．ハイルマニー菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子特異的プライマーを用いて増幅した遺伝子産物について、塩基配列を確認し、上述のＨ．ハイルマニー菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子との配列を比較することにより、Ｈ．ハイルマニー菌を確認することができる（図２参照）。増幅した遺伝子産物と上述の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子との配列のホモロジーが、少なくとも９５％以上、好ましくは９８．５％以上、より好ましくは９９％以上の場合に、Ｈ．ハイルマニー菌を同定することができる。
【００２５】
さらには、本発明は上述の培養方法を用いることを特徴とするＨ．ハイルマニー菌の検査方法にも及ぶ。具体的には上記の培養方法により培養して得られたＨ．ハイルマニー菌培養物を検出することを特徴とする。例えば、Ｈ．ハイルマニー菌の感染の可能性が疑われる場合に、胃の生検検体を採取し、本発明の栄養培地を用いて培養し、培養物が得られるか否か、あるいは得られた培養物の解析、例えば培養物から抽出した遺伝子をＨ．ハイルマニー１６ＳプライマーをもちいたＰＣＲ法で増幅されるかどうかを解析することにより、Ｈ．ハイルマニー菌の存在を確認することができる。さらに、分離された培養物から抽出した遺伝子を１６ＳｒＲＮＡ遺伝子ユニバーサルプライマーをもちいて増幅し、大腸菌にトランスフォーメーションすることでその配列を解析することで、Ｈ．ハイルマニー菌以外の菌が存在していないかを確認することができる。さらに、精製菌体のタンパク質を用いてEnzyme-Linked Immunosorbent Assay（ELISA）システムを構築することで、感染が疑われるヒトを含む動物などの血清、尿から、その感染診断を行うことができる。
【実施例】
【００２６】
本発明の理解を深めるために、以下の実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではないことは明らかである。
【００２７】
（実施例１）豚胃粘膜からのＨ．ハイルマニー菌の単離培養
Ｈ．ハイルマニー菌の培養は、図１に示す手順にて行なった。具体的には、実験例１−２に記載の方法により行なった。
【００２８】
（実験例１−１）豚胃粘膜におけるＨ．ハイルマニー菌の存在確認
１）方法
豚の胃組織を採取し、胃粘膜の組織所見をＨ＆Ｅ染色にて観察したところ、胃粘膜に著明なリンパ濾胞が認められる豚胃粘膜組織が存在した。豚胃粘膜の肉眼所見及び組織所見を図３に示した。当該豚の胃粘膜にＨ．ハイルマニー菌が感染しているかどうかをＨ．ハイルマニー１６Ｓプライマーを用いたＰＣＲ法で確認した。具体的には、豚の胃粘膜を、溶解緩衝液（Lysis buffer：10 mM Tris-HCl, 1% SDS, 240μg/ml Proteinase K）、フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコール、エタノールを用いてＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡについて、以下に示すＨ．ハイルマニー１６Ｓプライマーを用いてＰＣＲ(polymerase chain reaction)の手法によりＤＮＡを増幅させた。陽性コントロールは、in vivoの系でストックされている市販のＨ．ハイルマニー菌より抽出したＤＮＡにＰＣＲ増幅産物とした。
【００２９】
Ｈ．ハイルマニー１６Ｓプライマー
ａ）フォワードプライマー： TTGGGAGGCTTTGTCTTTCCA（配列番号１）
ｂ）リバースプライマー： GATTAGCTCTGCCTCGCGGCT（配列番号２）
【００３０】
２）結果
ＰＣＲ増幅産物は、陽性コントロールと同じ位置にバンドを認め、実験例１で使用した豚胃粘膜には、Ｈ．ハイルマニー菌が含まれていることが確認された（図４）。
【００３１】
（実験例１−２）マウス感染胃粘膜からのＨ．ハイルマニー菌の培養
１）方法
実験例１−１の豚の胃粘膜を、リン酸緩衝液中でホモジェナイズしたものをマウスに経口投与した。１ヶ月間、マウスを通常通り飼育した後、屠殺し、胃粘膜を採取した。マウスの胃粘膜を、ヘリコバクターピロリ選択サプリメントを含むｐＨ２．２ ＨＣｌ-ＫＣｌ緩衝液でホモジェナイズし、１〜２時間、３７℃でインキュベートしたものを、以下のＨ．ハイルマニー菌の培養用栄養培地（本発明の栄養培地）に塗抹し、５％ＣＯ２、湿度９５％以上において３７±０．５℃、３〜４日間培養した。
【００３２】
Ｈ．ハイルマニー菌培養用栄養培地組成
・基本培地
５w/v％ヒツジ血液加トリプチケースソイＩＩ寒天培地（ベクトンディッキンソン製）
・添加物
ウシ肝臓由来カタラーゼ（Ｗａｋｏ製）１００Ｕ/ ｍｌ
・抗生物質
ヘリコバクターピロリ選択サプリメント（DENT:SR147）（関東化学製）
上記サプリメントには、バンコマイシン：１０ｍｇ／ｌ、乳酸トリメトプリム：５ｍｇ／ｌ、セフスロジン：５ｍｇ／ｌ、アンホテリシンＢ：５ｍｇ／ｌを含む。
【００３３】
２）結果
上記栄養培地で培養した結果、培養物が得られた（図５左）。培養を２度繰り返し、コロニーを純化した（図５右）。
【００３４】
（実験例１−３）Ｈ．ハイルマニー菌ウレアーゼ遺伝子の解析
本実験例では、実験例１−２で培養し、分離された培養物のウレアーゼＡならびにウレアーゼＢ遺伝子を解析した。
【００３５】
１）実験方法
分離された培養物について、実験例１−１と同手法によりＤＮＡを抽出し、Ｈ．ハイルマニーウレアーゼＡならびにウレアーゼＢプライマー用いてＰＣＲを行い、増幅産物を得た。ＰＣＲ増幅産物を１％アガロースゲルで電気泳動した。さらにそれぞれの遺伝子の塩基配列を決定した。
Ｈ．ハイルマニーウレアーゼＡプライマー
ａ）フォワードプライマー： ACTTGTTACCATCCACACTC（配列番号３）
ｂ）リバースプライマー： CGCAGTTAATGGTGCCAA （配列番号４）
Ｈ．ハイルマニーウレアーゼＢプライマー
ａ）フォワードプライマー： GGCGATAAAGTCAGACTAGG（配列番号５）
ｂ）リバースプライマー： GCGAATCCTAGAGTCAGCAA（配列番号６）
【００３６】
２）結果
本発明の栄養培地で分離した培養物（４コロニー）のすべてにおいて、陽性コントロールと同じサイズのバンドが確認された。これにより、栄養培地から分離した培養物は、Ｈ．ハイルマニー菌ウレアーゼ遺伝子をもっていることが示唆された。図６から８において、陽性コントロールは、in vivoの系でストックされている市販のＨ．ハイルマニー菌より抽出したＤＮＡである。分離された培養物、ウレアーゼＡ（図７）ならびにウレアーゼＢ遺伝子（図８）の塩基配列は、Ｈ．ハイルマニー菌の配列と９８．５％以上一致した。
【００３７】
（実験例１−４）Ｈ．ハイルマニー菌以外の菌が培養物に含まれていないことの確認実験
（１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の解析による他の細菌が混在していないことの確認）
本実験例では、実験例１−２で培養し、分離された培養物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を解析した。
【００３８】
１）実験方法
本発明の栄養培地で分離した培養物より、溶解緩衝液（Lysis buffer：10 mM Tris-HCl, 1% SDS, 240μg/ml Proteinase K）、フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコール、エタノールを用いてＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡについて、以下に示す１６ＳｒＲＮＡ遺伝子ユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲ(polymerase chain reaction)の手法によりＤＮＡを増幅させ、ＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ産物をＴＡベクターにつないで大腸菌(E. coli)に導入（トランスフォーメーション）した。選択培地で前記大腸菌を培養し、ベクターが導入された大腸菌を選択した。異なる１０個のコロニーをピックアップして培養後、プラスミドを抽出し、前記プラスミドの挿入配列遺伝子の塩基配列を解析した。
【００３９】
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子ユニバーサルプライマー
ａ）フォワードプライマー：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG （配列番号７）
ｂ）リバースプライマー： GACGGGCGGTGWGTRCA （配列番号８）
【００４０】
２）結果
培養物（１０コロニー）より抽出したＤＮＡすべてで、データベース（GenBank Accession No.AF506794）のＨ．ハイルマニー菌の配列と９８．５％以上一致した。これにより、本発明の栄養培地で分離した菌は、Ｈ．ハイルマニー菌、又はその近縁種であり、他の細菌が混ざっていないことが確認された。
【００４１】
（実施例２）マウス感染胃粘膜よりＨ．ハイルマニー菌の培養
Ｈ．ハイルマニー菌（49286TM、ＡＴＣＣ(R)）を感染させたマウス胃粘膜を、リン酸緩衝液中でホモジェナイズしたものをマウスに経口投与した。１ヶ月間、マウスを通常通り飼育した後、屠殺し、胃粘膜を採取した。マウスの胃粘膜を、ヘリコバクターピロリ選択サプリメントを含むｐＨ２．２ ＨＣｌ-ＫＣｌ緩衝液でホモジェナイズし、１〜２時間、３７℃でインキュベートしたものを、以下のＨ．ハイルマニー菌の培養用栄養培地（本発明の栄養培地）に塗抹し、５％ＣＯ２、湿度９５％以上において３７±０．５℃、３〜４日間培養した。この培養物を用い更に２回培養し、コロニーを純化した。
【００４２】
Ｈ．ハイルマニー菌培養用栄養培地組成
・基本培地
５w/v％ヒツジ血液加トリプチケースソイＩＩ寒天培地（ベクトンディッキンソン製）
・添加物
ウシ肝臓由来カタラーゼ（Ｗａｋｏ製）１００Ｕ／ｍｌ
・抗生物質
ヘリコバクターピロリ選択サプリメント（DENT:SR147）（関東化学製）
上記サプリメントには、バンコマイシン：１０ｍｇ／ｌ、乳酸トリメトプリム：５ｍｇ／ｌ、セフスロジン：５ｍｇ／ｌ、アンホテリシンＢ：５ｍｇ／ｌを含む。
【００４３】
（実験例２−１）培養物の確認
１）方法
得られた培養物から、上述の方法でＤＮＡを精製し、Ｈ．ハイルマニー１６Ｓプライマーを用いてＰＣＲの手法によりＤＮＡを増幅させた。陽性コントロールは、in vivoの系でストックされている市販のＨ．ハイルマニー菌より抽出したＤＮＡにＰＣＲ増幅産物とした。
【００４４】
２）結果
上記栄養培地で培養した結果、培養物が得られた（図９Ａ）。また、培養物から得られたＰＣＲ増幅産物は、陽性コントロールと同じ位置にバンドを認め、培養物はＨ．ハイルマニー菌が含まれていることが確認された（図９Ｂ）。
【００４５】
（実験例２−２）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の解析による他の細菌が混在していないことの確認
本実験例では、実施例２で培養し、分離された培養物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を解析した。
【００４６】
１）実験方法
本発明の栄養培地で分離した培養物より、溶解緩衝液（Lysis buffer：10 mM Tris-HCl, 1% SDS, 240μg/ml Proteinase K）、フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコール、エタノールを用いてＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡについて、以下に示す１６ＳｒＲＮＡ遺伝子ユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲ(polymerase chain reaction)の手法によりＤＮＡを増幅させ、ＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ産物をＴＡベクターにつないで大腸菌(E. coli)に導入（トランスフォーメーション）した。選択培地で前記大腸菌を培養し、ベクターが導入された大腸菌を選択した。異なる１０個のコロニーをピックアップして培養後、プラスミドを抽出し、前記プラスミドの挿入配列遺伝子の塩基配列を解析した。
【００４７】
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子ユニバーサルプライマー
ａ）フォワードプライマー：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG （配列番号７）
ｂ）リバースプライマー： GACGGGCGGTGWGTRCA （配列番号８）
【００４８】
２）結果
培養物（１０コロニー）より抽出したＤＮＡすべてで、データベース（GenBank Accession No.AF506794）のＨ．ハイルマニー菌の配列と９８．５％以上一致した。これにより、本発明の栄養培地で分離した菌は、Ｈ．ハイルマニー菌、又はその近縁種であり、他の細菌が混ざっていないことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
以上詳述したように、本発明の培養方法により、従来in vitroでの培養ができなかったＨ．ハイルマニー菌を培養することができた。本発明の培養方法を用いることで、胃の生検検体について、Ｈ．ハイルマニー菌の存在の有無を確認することによりＨ．ハイルマニー菌の検査を行うことができる。また、本発明の栄養培地で培養された培養物を使用することで、本菌の病原性並びに遺伝子等の解析など、従来未解明であった研究を進めることができ、非常に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘリコバクター・ハイルマニー（Ｈ．ハイルマニー）菌のみからなり、他の微生物を含まないＨ．ハイルマニー菌培養物。
【請求項２】
培養物が、動物組織を含まない請求項１に記載のＨ．ハイルマニー菌培養物。
【請求項３】
培養物が、in vitroの系で培養されたものである請求項１又は２に記載のＨ．ハイルマニー菌培養物。
【請求項４】
基礎培地に少なくともカタラーゼ含む、Ｈ．ハイルマニー菌の培養用栄養培地。
【請求項５】
基礎培地が、トリプチケースソイ寒天培地である請求項４に記載の栄養培地。
【請求項６】
さらに、乳酸トリメトプリムを含む請求項４又は５に記載の栄養培地。
【請求項７】
以下の組成物を含む請求項４〜６のいずれか１に記載の栄養培地：
トリプチケースソイ寒天培地；
ヒツジ血液（５〜１５w/v％）；
乳酸トリメトプリム（２〜１０ｍｇ／ｍｌ）；
カタラーゼ（５０〜１０００Ｕ／ｍｌ）。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれか１に記載の栄養培地を用いて培養する、Ｈ．ハイルマニー菌の培養方法。
【請求項９】
以下の工程を含む、請求項８に記載の培養方法：
１）ヒト又は動物より採取したＨ．ハイルマニー菌を、請求項４〜７のいずれか１に記載の栄養培地を用いて培養する工程；
２）上記１）の工程で得られたコロニーの一部を採取し、採取したコロニーを請求項４〜７のいずれか１に記載の栄養培地を用いて再度培養する工程。
【請求項１０】
上記２）の工程の後に得られたコロニーの一部を採取し、採取したコロニーを請求項４〜７のいずれか１に記載の栄養培地を用いて再度培養する工程を少なくとも２回繰り返し、Ｈ．ハイルマニー菌を純化する工程を含む請求項９に記載の培養方法。
【請求項１１】
培養されたＨ．ハイルマニー菌培養物が、Ｈ．ハイルマニー菌のみからなり、他の微生物を含まないことを確認する工程を含む、請求項８〜１０のいずれか１に記載の培養方法。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか１に記載の培養方法により培養されたＨ．ハイルマニー菌培養物。
【請求項１３】
請求項８〜１１のいずれか１に記載の培養方法を用いるＨ．ハイルマニー菌の分離方法。
【請求項１４】
請求項８〜１１のいずれか１に記載の培養方法を用いるＨ．ハイルマニー菌の検査方法。
【請求項１５】
請求項１〜３および請求項１１のいずれか１に記載のＨ．ハイルマニー菌培養物を検出することを特徴とするＨ．ハイルマニー菌の検査方法。
【請求項１】
ヘリコバクター・ハイルマニー（Ｈ．ハイルマニー）菌のみからなり、他の微生物を含まないＨ．ハイルマニー菌培養物。
【請求項２】
培養物が、動物組織を含まない請求項１に記載のＨ．ハイルマニー菌培養物。
【請求項３】
培養物が、in vitroの系で培養されたものである請求項１又は２に記載のＨ．ハイルマニー菌培養物。
【請求項４】
基礎培地に少なくともカタラーゼ含む、Ｈ．ハイルマニー菌の培養用栄養培地。
【請求項５】
基礎培地が、トリプチケースソイ寒天培地である請求項４に記載の栄養培地。
【請求項６】
さらに、乳酸トリメトプリムを含む請求項４又は５に記載の栄養培地。
【請求項７】
以下の組成物を含む請求項４〜６のいずれか１に記載の栄養培地：
トリプチケースソイ寒天培地；
ヒツジ血液（５〜１５w/v％）；
乳酸トリメトプリム（２〜１０ｍｇ／ｍｌ）；
カタラーゼ（５０〜１０００Ｕ／ｍｌ）。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれか１に記載の栄養培地を用いて培養する、Ｈ．ハイルマニー菌の培養方法。
【請求項９】
以下の工程を含む、請求項８に記載の培養方法：
１）ヒト又は動物より採取したＨ．ハイルマニー菌を、請求項４〜７のいずれか１に記載の栄養培地を用いて培養する工程；
２）上記１）の工程で得られたコロニーの一部を採取し、採取したコロニーを請求項４〜７のいずれか１に記載の栄養培地を用いて再度培養する工程。
【請求項１０】
上記２）の工程の後に得られたコロニーの一部を採取し、採取したコロニーを請求項４〜７のいずれか１に記載の栄養培地を用いて再度培養する工程を少なくとも２回繰り返し、Ｈ．ハイルマニー菌を純化する工程を含む請求項９に記載の培養方法。
【請求項１１】
培養されたＨ．ハイルマニー菌培養物が、Ｈ．ハイルマニー菌のみからなり、他の微生物を含まないことを確認する工程を含む、請求項８〜１０のいずれか１に記載の培養方法。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか１に記載の培養方法により培養されたＨ．ハイルマニー菌培養物。
【請求項１３】
請求項８〜１１のいずれか１に記載の培養方法を用いるＨ．ハイルマニー菌の分離方法。
【請求項１４】
請求項８〜１１のいずれか１に記載の培養方法を用いるＨ．ハイルマニー菌の検査方法。
【請求項１５】
請求項１〜３および請求項１１のいずれか１に記載のＨ．ハイルマニー菌培養物を検出することを特徴とするＨ．ハイルマニー菌の検査方法。
【図７】
【図８】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図９】
【図８】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図９】
【公開番号】特開２０１１−１５６６４（Ｐ２０１１−１５６６４Ａ）
【公開日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１６４２５８（Ｐ２００９−１６４２５８）
【出願日】平成２１年７月１０日（２００９．７．１０）
【出願人】（５０４１５０４５０）国立大学法人神戸大学 (421)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月１０日（２００９．７．１０）
【出願人】（５０４１５０４５０）国立大学法人神戸大学 (421)
【Ｆターム（参考）】
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