骨形成及び骨硬化促進用組成物
本発明は、骨形成及び骨硬化促進用組成物に関するものである。詳細には、トリポリリン酸塩（ｔｒｉｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）と水溶性キトサンの混合物に骨形成及び骨硬化促進物質を添加した骨形成及び骨硬化促進用組成物に関するものである。本発明の組成物は、骨形成及び骨硬化を初期に促進させることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、骨形成及び骨硬化促進用組成物に関するものである。詳細には、トリポリリン酸塩（ｔｒｉｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）と水溶性キトサンの混合物に骨形成及び骨硬化促進物質を添加した骨形成及び骨硬化促進用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
最近、自動車事故または疾患等により骨欠損が生じる場合がよくあり、それにしたがって骨欠損部分を補完する必要性が高まっている。骨欠損部分を補完するには、骨移植をしたりするが、最近では骨充填剤が多く利用されている。さらに、最近では身長を伸ばしたり矮小した顎を矯正したりするために骨伸延手術が多く行われていて、それにより骨充填剤の要求がさらに大きくなっている。
【０００３】
骨伸延手術というのは、ストレッチング（ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ）により骨の長さ方向の成長を誘導するもので「引き延ばす物理的な力は組織学的な発生を刺激する（Ｔｅｎｓｉｏｎ ｆｏｒｃｅｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｈｉｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）」という原理に基づくもので初めは足骨の伸長のために考案されたが、最近では顎骨伸長手術に多く採り入れられている。顎骨伸長手術というのは、最近発展した頭蓋顎顔面外科部分中の一つで骨伸長（骨伸延）装置を後退した顎骨部位や中顔容貌後退部位に装着することにより広範囲な切骨を行わずに顔の骨を漸次的に動かして顔の比率を改善させる施術である。
【０００４】
骨伸延手術は、イリザロブ（Ｉｌｉｚａｒｏｖ ＧＡ，Ｊ．Ｄｉｓ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｉｎｓｔ．，１９８８年、第４８（１）巻、１頁；Ｉｌｉｚａｒｏｖ ＧＡ，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏ．，１９８９年、第２３９巻、２６３頁；Ｉｌｉｚａｒｏｖ ＧＡ，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏ．，１９８９年、第２３８巻、２４９頁）が骨伸延手術に対する生体力学的（ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ）因子を糾明した以後に、長骨（ｌｏｎｇ ｂｏｎｅ）の骨欠損矯正に成功的に利用されてきた。成功的な骨伸延手術を行なうためには、骨伸延部の血液循環を保存して皮質骨の折骨部位両側に外固定器を安定に固定して骨の長さ延長を漸次的に施行して骨硬化を促進させるようにしなければならない（Ｗｈｉｔｅ ＳＨ，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎ Ｓｕｒｇｅｒｙ，１９９０年、第７２−Ｂ巻、３５０頁；Ｗｈｉｔｅ ＳＨ，Ｏｒｔｈｏｐ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ．Ａｍｅｒ．，１９９１年、第２２巻、５６９頁；Ｆｉｓｈｇｒｕｎｄ Ｊ．，Ｐａｌｅｙ Ｄ．，Ｓｕｌｔｅｒ Ｄ．，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．，１９９４年、第３０１巻、３１頁）。
【０００５】
骨硬化期間は、顔面骨または長骨のような伸延する骨の部位、血行化状態、患者の年齢により変わり得る。骨伸延後の骨硬化期間は、頭蓋顔面骨では小児が３週〜５週、成人が６週〜１２週所要され、長骨では年齢に関係なく３ヵ月〜６ヵ月程度所要される。したがって、頭蓋顔面骨で骨伸延手術を施行する場合、その治療期間は、潜在期、骨伸延期、骨硬化期を含めて総２ヵ月乃至４ヵ月が所要される。このように長い骨硬化期間によりピンによる感染のような合併症の可能性を高めることもあり、日常生活への復帰を遅延させる問題点が提起されてきた。
【０００６】
治療期間を短縮させるための骨伸延後の研究報告においてカールス（Ｃｈａｒｌｓ）とセイラー（Ｓａｉｌｅｒ）は、一日に１ｍｍ伸延することが２乃至３ｍｍ伸延することよりさらに強い生化学的、生理学的特性を示すと報告した（Ｃａｒｌｓ ＆ Ｓａｉｌｅｒ，Ｊ．Ｃｒａｎｉｏｍａｘｉｌｌｏｆａｃ Ｓｕｒｇ．，１９９４年、第９４巻、１５２頁）。また、イリザロブ（Ｉｌｉｚａｒｏｖ）は、一日に０．５ｍｍ伸延することは未成熟骨硬化を起こし、一日に２ｍｍ伸延することは伸延した組織に好ましくない変化を惹起するため、一日に１ｍｍ伸延することが最も良い結果を得ると報告した（Ｉｌｉｚａｒｏｖ，Ｊ．Ｄｉｓ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｉｎｓｔ．，１９８８年、第４８（１）巻、１頁；Ｉｌｉｚａｒｏｖ，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏ．，１９８９年、第２３９巻、２６３頁）。併せて、連続的に伸延することが組織損傷を最も少なくし、最も多い毛細血管新生と骨形成を惹起すると知られている。したがって、骨伸延期間と骨硬化期間を短縮させることが可能なら長い骨硬化期間による合併症の可能性を防ぐことができ、全体的な治療期間を短縮して患者を早期に日常生活に復帰させられるものと期待される。それで、骨伸延期間と骨硬化期間を短縮するために、骨形成を促進して骨硬化を促進させる充填剤を使用している。
【０００７】
一方、自家骨移植、処置された同種骨移植や異種骨移植及び骨移植代替物（ｂｏｎｅ ｇｒａｆｔ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ）は、骨形成を刺激するものと知られている。自家骨移植は、骨空洞（ｂｏｎｅ ｃａｖｉｔｙ）や骨欠損を埋めて感染、腫瘍、手術による空隙（ｖｏｉｄ）と損傷をなくしたり関節癒合や不癒合骨折を治癒したりするのに利用される。移植された自家骨が吸収され再血行化がなされると骨前駆細胞（ｏｓｔｅｏｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）が骨形成細胞（ｂｏｎｙ ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ｃｅｌｌ）に分化され前記骨形成細胞の活動が新しい骨再生と骨欠損部治癒を起こす。しかし、自家骨は採取できる量が制限されていて供与部位に対する二次手術が追加され罹患率（ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ）が高いという短所を持っている。したがって、伸延された部位で骨再生を誘導するために骨形態発生タンパク質（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）や他の骨移植代置物等が使用されている。この中で骨形態発生タンパク質が最も強力な骨誘導物質と考えられているが非常に高価で求めにくい短所のため臨床的に使用するには多くの限界があるのが実情である。
【０００８】
以上のことを鑑みて、本発明者らは、非常に経済的で生体適合する骨形成及び骨硬化促進用組成物を見つけ出す努力を重ねた結果、トリポリリン酸塩と水溶性キトサンの混合物に骨形成及び骨硬化促進物質を添加して製造される組成物を製造して、前記組成物が早期骨硬化を促進して骨硬化期間を減らすことにより骨生成の治療期間を短縮できることを確認して本発明を完成した。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明は、骨形成及び骨硬化促進用組成物に関するものである。詳細には、トリポリリン酸塩（ｔｒｉｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）と水溶性キトサンの混合物に骨形成及び骨硬化促進物質を添加した骨形成及び骨硬化促進用組成物に関するものである。本発明の骨形成及び骨硬化促進用組成物は新生骨形成と骨硬化を早期に促進させる。
【００１０】
発明の詳細な説明
前記目的を達成するために、本発明は、トリポリリン酸塩と水溶性キトサンの混合物に骨形成及び骨硬化促進物質を添加した骨形成及び骨硬化促進用組成物を提供する。
【００１１】
また、本発明は、前記組成物を骨形成及び骨硬化を早期に促進させるのに使用する用途を提供する。
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、トリポリリン酸塩と水溶性キトサンの混合物に骨形成及び骨硬化促進物質を添加した骨形成及び骨硬化促進用組成物を提供する。
【００１３】
本発明の骨形成及び骨硬化促進用組成物は、トリポリリン酸塩と水溶性キトサンの混合物に骨形成及び骨硬化促進物質を添加して製造する。前記で骨形成及び骨硬化促進物質の例として、βｉｇ−ｈ３、骨形態発生タンパク質、ＴＧＦ−β、ＦＧＦ、ＩＧＦ−１、ＰＤＧＦ等を挙げているが、必ずしもそれに限定されるものではない。本発明では、好ましい実施態様として骨形成及び骨硬化促進物質にβｉｇ−ｈ３及び骨形態発生タンパク質としてＢＭＰ−４を使用した場合を例示した。
【００１４】
キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）は、海の甲殻類の外骨格構成物質であるキチン（ｃｈｉｔｉｎ）の脱アセチル化（ｄｅａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）により得られる多糖類（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）である（Ｋｉｎｄ，Ｇ．Ｍ．，Ｂｉｎｄ，Ｓ．Ｄ．，Ｓｔａｒｅｎ，Ｅ．Ｄ．，Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ，Ａ．Ｊ．ａｎｄ Ｅｃｏｎｏｍｏｕ，Ｓ．Ｇ．，Ｃｕｒｒ．Ｓｕｒｇ．，１９９０年、第４７巻、３７頁；Ｈａｕｓｃｈｋｓ，Ｐ．Ｖ．，Ｂｏｎｅ，１９９０年、第１巻、１０３頁，Ｌｏｎｄｏｎ ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｎ．Ｓ．，Ｐａｒａｌｋａｒ，Ｖ．ａｎｄ Ｒｅｄｄｉ，Ａ．Ｈ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８２年、第８９巻、１１７４０頁；Ｍａｌｅｔｔｅ，Ｗ．Ｇ．，Ｑｕｉｇｌｅｙ，Ｈ．Ｊ．ａｎｄ Ａｄｉｃｋｅｓ，Ｅ．Ｄ．，Ｎａｔｕｒｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８６年、４３５頁：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）。ムザレリー（Ｍｕｚａｒｅｌｌｉ）等は、骨欠損部位にキトサンを使用した結果正常骨形成を促進する役割があることを発見した（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ，Ｒ．Ａ．，Ｍａｔｔｉｏｌｉ−Ｂｅｌｍｏｎｔｅ，Ｍ．，Ｔｉｅｔｓ，Ｃ．，Ｂｉａｇｉｎｉ，Ｒ．，Ｆｅｉｏｌｉ，Ｇ．，Ｂｒｕｎｅｌｌｉ，Ｍ．Ａ．，Ｆｉｎｉ，Ｍ．，Ｇｉａｒｄｉｎｏ，Ｒ．，Ｉｌａｒｉ，Ｐ．ａｎｄ Ｂｉａｇｉｎｉ，Ｇ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１９９４年、第１５巻、１０７５頁）、クロッケボルド（Ｋｌｏｋｋｅｖｏｌｄ）等は、キトサンが骨形成細胞の分化を促進させて骨形成を容易にすると報告した（Ｋｌｏｋｋｅｖｏｌｄ，Ｐ．Ｒ．，Ｖａｎｄｅｍａｒｋ，Ｌ．，Ｋｅｎｎｅｙ，Ｅ．Ｂ．ａｎｄ Ｂｅｒｎａｒｄ，Ｇ．Ｗ．，Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．，１９９６年、第６７巻、１１７０頁）。
【００１５】
ＴＧＦ−βは、軟骨細胞と造骨細胞の増殖と分化を刺激するだけではなく、βｉｇ−ｈ３は試験管内で様々な骨間質（ｂｏｎｅ ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ）タンパク質の生産を増加させて造骨細胞で膠原質（ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解を減少させることが知られている（Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ Ａ．Ｂ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：１９９０年、３頁；Ｃｅｎｔｒｅｌｌａ，Ｍ．，ＭｃＣａｒｔｈｙ，Ｔ．Ｌ．ａｎｄ Ｃａｎａｌｉｓ，Ｅ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎ．Ｓｕｒｇ．，１９９１年、第７３（Ａｍ）巻、１４１８頁；Ｍｕｓｔｏｅ，Ｔ．Ａ．，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｇ．Ｆ．，Ｔｈｏｍａｓｏｎ，Ａ．，Ｇｒａｍａｔｅｓ，Ｐ．，Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ．ａｎｄ Ｄｅｕｅｌ，Ｔ．Ｆ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７年、第２３７巻、１３３３頁；Ｎｏｄａ，Ｍ．ａｎｄ Ｃａｍｉｌｌｉｅｒｅ，Ｊ．Ｊ．，Ｅｎｄｏｃｌｉｎｏｌ．，１９８９年、第１２４巻、２９９１頁；Ｊｏｙｃｅ，Ｍ．Ｅ．，Ｊｉｎｇｕｓｋｉ，Ｓ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａ．Ｂ．，Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ．ａｎｄ Ｂｏｌａｎｄｅｒ，Ｍ．Ｅ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１９８９年、第４巻、２２５頁；Ｈｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．，Ｃａｎａｌｉｓ，Ｅ．ａｎｄ Ｃｅｎｔｒｅｌｌａ，Ｍ．，Ｅｎｄｏｃｌｉｎｏｌ．，１９９０年、第１２６巻、４２１頁；Ｂｅｃｋ，Ｌ．Ｓ．，Ａｍｍａｎｎ，Ａ．Ｊ．，Ａｕｆｄｅｍｏｒｔｅ，Ｔ．Ｂ．，ＤｅＧｕｚｍａｎ，Ｌ．，Ｘｕ，Ｙ．，Ｌｅｅ，Ｗ．Ｐ．，ＭｃＦａｔｒｉｄｇｅ，Ｌ．Ａ．ａｎｄ Ｃｈｅｎ，Ｔ．Ｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１９９１年、第６巻、９６１頁）。成長因子中でＴＧＦ−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ β）は、骨再生と発達に重要な調節因子として台頭してきている。ＴＧＦ−β１は、強力な骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）の化学走化性因子（ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ）で、軟骨内骨化（ｅｎｄｏｃｈｏｎｄｒａｌ ｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）過程で造骨細胞の前駆細胞に分裂効果を有している。βｉｇ−ｈ３は、ＴＧＦ−βにより発現が誘導される細胞付着タンパク質としてインテクリンと作用して細胞の付着及び拡散機能（Ｊｕｎｇ−Ｅｕｎ Ｋｉｍ，Ｓｏｎｇ−Ｊａ Ｋｉｍ，Ｂｙｕｎｇ−Ｈｅｏｎ Ｌｅｅ，Ｒａｎｇ−Ｗｏｏｎ Ｐａｒｋ，Ｋｉ−Ｓａｎ Ｋｉｍ ａｎｄ Ｉｎ−Ｓａｎ Ｋｉｍ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０００年、第２７５巻、３０９０７−３０９１５頁）を有していて、創傷治癒効果があると知られている。また、骨形成の初期工程で重要な役割をするものとして知られている（Ｄｉｅｕｄｏｎｎｅ，Ｓ．Ｃ．，Ｋｅｒｒ，Ｊ．Ｍ．，Ｘｕ，Ｔ．，Ｓｏｍｍｅｒ Ｂ．，ＤｅＲｕｂｅｉｓ，Ａ．Ｒ．，Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖ，Ｓ．Ａ．，Ｋｉｍ，Ｉ−Ｓ．，Ｒｏｂｅｙ，Ｐ．Ｇ．，ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ Ｍ．Ｆ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９９年、第７６巻、２３１−２４３頁）。
【００１６】
骨形態発生タンパク質（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ；以下「ＢＭＰ」と略称する）は、骨形成物質としてウリスト（Ｕｒｉｓｔ）により最初に発見されて以来、該骨形態発生タンパク質は多機能性細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｅｌｌ）が軟骨細胞と骨形成細胞に分化されることを促進させ、骨再生において重要な役割をすることが報告された（Ｕｒｉｓｔ，Ｍ．Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９６５年、第１５０巻、８９３頁；Ｕｒｉｓｔ，Ｍ．Ｒ．ａｎｄ Ｓｔｒａｔｅｓ，Ｂ．Ｓ．，Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．，１９７１年、第５０巻、１３９２頁；Ｗｏｚｎｅｙ，Ｊ．Ｍ．，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｈｅｉｎｅｒｍａｎｎ １ｓｔ Ｅｄ．Ｌｏｎｄｏｎ：１９９４年、３９７−４１１頁；Ｗｏｚｎｅｙ，Ｊ．Ｍ．，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，１９９２年、第３２巻、１６０頁；Ｗｏｚｎｅｙ，Ｊ．Ｍ．，Ｒｏｓｅｎ，Ｖ．ａｎｄ Ｃｅｌｅｓｔｅ，Ａ．Ｊ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８年、第２４２巻、１５２８頁；Ｏｎｏ，Ｉ．，Ｔａｔａｓｈｉｔａ，Ｔ．，Ｔａｋｉｔａ，Ｈ．ａｎｄ Ｋｕｂｏｋｉ，Ｙ．，Ｊ．Ｃｒａｎｉｏｆａｃ．Ｓｕｒｇ．，１９９６年、第７巻、４１８頁）。現在まで確認されたヒト骨形態発生タンパク質は１３種で、特にヒト骨形態発生タンパク質−４（ＢＭＰ−４）は、骨再生に卓越した効果があると報告された（Ｂｏｙｎｅ，Ｐ．Ｊ．，Ｂｏｎｅ，１９９６年、第１９巻、８３ｓ頁；Ｚｅｇｚｕｌａ，Ｈ．Ｄ．，Ｂｕｃｋ，Ｄ．Ｃ．，Ｂｒｅｋｋｅ，Ｊ．，Ｗｏｚｎｅｙ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｏ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎ．Ｓｕｒｇ．，１９９７年、第７９巻、１７７８頁；Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ ＡＢ（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：１９９０年、３頁）。
【００１７】
本発明の組成物においてトリポリリン酸塩は、水溶性キトサンと混合される時、瞬く間に固まってしまうので、水溶性キトサン単独または骨形成及び骨硬化促進物質のβｉｇ−ｈ３または骨形態発生タンパク質を含有した水溶性キトサンを添加する時、図２のような二重注射器（ｄｕａｌ ｓｙｒｉｎｇｅ）を使用し、同一な部位に同時に注射して注射した部位で二種の物質が出会い即時に固まるようにして、注射した物質が他の部位に移動することを防止することが好ましい。
【００１８】
本発明のトリポリリン酸塩と水溶性キトサンの混合物に骨形成及び骨硬化促進物質としてβｉｇ−ｈ３または骨形態発生タンパク質を添加した骨形成及び骨硬化促進用組成物においてトリポリリン酸塩と水溶性キトサンの比率は２０：８０乃至８０：２０重量％であることが好ましく、５０：５０の同量であることがさらに好ましい。前記で骨形成及び骨硬化促進物質として添加されるβｉｇ−ｈ３は、組成物全体に対して１００μｇ／ｍｌ乃至１μｇ／ｍｌ添加されることが好ましく、３００μｇ／ｍｌ乃至６００μｇ／ｍｌ添加されることがさらに好ましい。また、骨形態発生タンパク質の場合には、組成物全体に対して５０ｎｇ／ｍｌ乃至５００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加されることが好ましく、１００ｎｇ／ｍｌ乃至３００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加されることがさらに好ましい。
【００１９】
また、本発明は、前記組成物を骨形成及び骨硬化を早期に促進させるのに使用する用途を提供する。
【００２０】
本発明者らは、前記組成物を骨形成及び骨硬化を促進させるのに使用できるかどうかを確認するために、犬の下顎で骨伸延手術時に本発明のトリポリリン酸塩に水溶性キトサン、βｉｇ−ｈ３を含有した水溶性キトサンまたは、骨形態発生タンパク質を含有した水溶性キトサンを添加した組成物が骨形成及び骨硬化に及ぼす影響を確認した。
【００２１】
その結果、骨伸延が終了後４週と７週目に採取した骨標本において、対照群では伸延された部位が堅くなっていたが骨を折り曲げた時、多少流動性があった。トリポリリン酸塩にＢＭＰ−４を含有した水溶性キトサンを添加したＢＭＰ−４群、βｉｇ−ｈ３を含有した水溶性キトサンを添加したβｉｇ−ｈ３群及び水溶性キトサンだけを添加したキトサン群では、４週目の骨伸延された部位が７週目の対照群骨標本よりさらに少し堅固で７週目には新生骨の形成によってとても堅固だった。
【００２２】
また、骨伸延が終了後４週と７週に実施した放射線検査で、対照群では伸延された下顎骨片間に広い放射線透過区域（ｒａｄｉｏｌｕｃｅｎｔ ｚｏｎｅ）をおいて両側下顎骨片に接して放射線非透過区域（ｒａｄｉｏｄｅｎｓｅ ｚｏｎｅ）がほとんどなく、４週と７週の間に明確な差がなかった。ＢＭＰ−４群、βｉｇ−ｈ３群及びキトサン群では、各群に該当する骨成長物質が注入された下顎骨伸延部位で、時間の経過により進行される石灰化（ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が観察できた。骨成長物質を注入した後４週目の放射線所見で、伸延された骨片間の放射線透過区域が両側骨片間に伸びて入った放射線非透過区域でほとんど連結された。７週目には放射線非透過区域の上下厚みは、４週目の厚みより二倍以上になった。特に、ＢＭＰ−４群で他の群と比べて放射線非透過陰影（ｒａｄｉｏｄｅｎｓｅ ｓｈａｄｏｗ）の密度が濃く、その厚みが厚くなったことが分かった（図４乃至図７参照）。
【００２３】
また、骨鉱質密度を測定した結果、骨鉱質密度はすべての群で対照群より高く測定された。その中でもＢＭＰ−４群で最も高く現れ、βｉｇ−ｈ３群、キトサン群、対照群の順だった。７週目でもＢＭＰ−４群で他の群に比べて飛び抜けて高く現れ、βｉｇ−ｈ３群、キトサン群、対照群の順だった。骨鉱質密度は、放射線像に現れた下顎骨骨片間の伸延された部位での放射線非透過程度、即ち、明るさ程度を反映するもので高く測定されるほど新生骨形成が多いことを意味する（図８参照）。
【００２４】
組織学的検査の結果、対照群では４週目に骨伸延された部位全般が繊維化組織で満たされていて、下顎骨の断面に接して骨膜反応による新生骨形成が始まったが、全般的には新生骨形成の所見はなかった（図９Ａ参照）。７週目組織所見で伸延された部位の端の部分に新生骨及び軟骨形成所見が見られ、所々に血管と神経組織等が観察された（図９Ｂ及び図９Ｃ参照）。
【００２５】
ＢＭＰ−４群では、４週目に伸延された骨片の端の部分と中央部で類骨（ｏｓｔｅｏｉｄ）を形成する造骨細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）の増殖が部分的に観察されたが、伸延された部位の多くの部分は繊維化組織で満たされていた（図１０Ａ及び図１０Ｃ参照）。７週目には、伸延された部位に部分的に石灰化がなされた不規則な模様の交織骨肉柱（ｗｏｖｅｎ ｂｏｎｅ ｔｒａｂｅｃｕｌａｅ）と多様な大きさの血管等が内在した広い新生骨部位とその中心に上下に位置した狭い繊維帯（ｆｉｂｒｏｕｓ ｉｎｔｅｒｚｏｎｅ）が観察された。伸延された部位全般にわたって形成された新生骨は正常皮質骨に近かった（図１０Ｂ及び図１０Ｄ参照）。
【００２６】
βｉｇ−ｈ３群では、４週目の組織所見では類骨を形成する造骨細胞が伸延された部位の中央部に部分的に観察された（図１１Ａ参照）。７週目には、多くの活動的な造骨細胞が伸延された部位の端の部分から中央部まで部分的に新生骨を形成した。その量は、ＢＭＰ−４群より少なく、伸延された部位中央部上下に位置した繊維帯はＢＭＰ−４群より広かった（図１１Ｂ及び図１１Ｃ参照）。
【００２７】
キトサン群では、４週目の組織所見では伸延された部位の大部分が繊維化組織で満たされていた（図１２Ａ参照）。７週目には新生骨と共に多くの造骨細胞が伸延された部位の端の部分で観察され、伸延された部位の中央部まで部分的に新生骨を形成した（図１２Ｂ及び図１２Ｃ参照）。伸延された部位での新生骨量は、βｉｇ−ｈ３群やＢＭＰ−４群より少なく、繊維帯はβｉｇ−ｈ３群より広かった。
【００２８】
結論的に、本発明のトリポリリン酸塩に水溶性キトサン、βｉｇ−ｈ３を含有した水溶性キトサン、またはＢＭＰ−４を含有した水溶性キトサンを添加した組成物は、新生骨形成と骨硬化を早期に促進させて骨硬化期間を短縮させるので、非常に経済的で生体適合した骨形成及び骨硬化促進用組成物として有用に使用できる。
【００２９】
実施例
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
但し、下記の実施例は本発明を例示するだけのものであり、本発明の内容が下記の実施例の内容によって限定されるものではない。
【００３０】
実施例１：組成物の製造
本発明者らは、トリポリリン酸塩に骨形成及び骨硬化促進物質を添加した骨形成及び骨硬化促進用組成物を製造した。詳細には、５％のトリポリリン酸塩０．５ｍｌに５％キトサン０．５ｍｌを添加した組成物を製造して、それを「キトサン群」と命名した。
【００３１】
実施例２：組成物の製造
本発明者らは、前記実施例１と同一な方法で５％のトリポリリン酸塩０．５ｍｌに４５０μｇ／ｍｌ濃度のβｉｇ−ｈ３を含有した水溶性キトサン０．５ｍｌを添加した組成物を製造して、それを「βｉｇ−ｈ３群」と命名した。
【００３２】
実施例３：組成物の製造
本発明者らは、前記実施例１と同一な方法で５％のトリポリリン酸塩０．５ｍｌに２００ｎｇ／ｍｌ濃度のＢＭＰ−４を含有した水溶性キトサン０．５ｍｌを添加した組成物を製造して、それを「ＢＭＰ−４群」と命名した。
【００３３】
実験例１：本発明の組成物が骨形成及び骨硬化に及ぼす影響の測定
本発明者らは、前記実施例１乃至実施例３で製造した本発明の骨形成及び骨硬化促進用組成物が新生骨形成と骨硬化を早期に促進させるかどうか確認するために、犬の下顎骨に骨伸延手術を施行した後、本発明の骨形成及び骨硬化促進用組成物を注射して変化を観察した。
【００３４】
詳細には、生後５〜８ヵ月の１６匹の犬を実験動物に使用した。対照群、キトサン群、βｉｇ−ｈ３群及びＢＭＰ−４群に分類して各群毎に４匹ずつ実験に使用した。
【００３５】
実験用の犬は、全身麻酔後気管内挿管で呼吸を維持した。手術部位は削毛した後、基本的な消毒と塗布を実施した。下顎骨の下端部に沿って３〜４ｃｍの皮膚切開を加えた後、咬筋（ｍａｓｓｅｔｅｒ ｍｕｓｃｌｅ）を持ち上げて下顎骨の外側面を露出させた。電気ノコギリで下顎骨体部に垂直に切骨手術を施行して下顎骨を完全切断した。外固定装置に固定するピンは、切骨された部位から左右に１ｃｍの地点の骨片に各々固定した。ピンを下顎骨骨片にドリルで固定時、生理食塩水で洗浄しながら固定してピン固定部位の骨が焦げないようにした。ここで、ピンは下顎骨をやっと貫通する程度打ち込みしっかりと固定した。２匹の犬のピンを固定した後、骨延長器具（Ｍｏｌｉｎａ Ｄｉｓｔｒａｃｔｏｒｓ，Ｗｅｌｌｓ Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）に装着した（図１）。
【００３６】
５−０ビクリル（ｖｉｃｒｙｌ）と５−０ナイロン（ｎｙｌｏｎ）縫合糸で切開部位を幾重にも縫合して実験動物を麻酔から回復させた。手術後、７日間ペニシリン抗生剤（１００，０００μ／ｋｇ）を１２時間毎に筋肉注射し、痛みを緩和するために鎮痛剤を４〜６時間間隔で経口投与した。手術直後から２日目までは軟質食餌（ｓｏｆｔ ｄｉｅｔ）を与え、３日目から一般食餌（ｒｅｇｕｌａｒ ｄｉｅｔ）に替えた。手術後５日目から一日に２ｍｍずつ、総１０ｍｍになるように５日間伸延した。
【００３７】
各群は、骨伸延が終わる日に各群別に伸延された部位に凝固剤として０．５ｍｌの５％トリポリリン酸塩（ｔｒｉｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＴＰＰ）と同量の５％水溶性キトサン、ＢＭＰ−４（２００ｎｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ．）を含有した５％水溶性キトサン、βｉｇ−ｈ３（４５０ μｇ／ｍｌ）を含有した５％水溶性キトサンを各々同量を二重注射器（ｄｕａｌ ｓｙｒｉｎｇｅ）（図２）を使用して同一部位に同時に注射して伸延された部位内で二種物質が出会って即時に固まり注射した物質が他の部位に移動することを防止すると同時に骨形成時に骨台になるようにした。対照群には、５％トリポリリン酸塩だけを１ｍｌ注射した。
【００３８】
本発明の骨形成及び骨硬化促進用組成物の注入が終わった後、骨硬化と骨再生のために骨伸延装置を７週間維持した。各群毎に２匹ずつ全体８匹を骨伸延が終わった後４週目、残りの８匹は７週目にペントバルビタール（ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ）を過用量（４０〜５０ｍｇ／ｋｇ）注射して犠牲にした。（図３）。
【００３９】
＜１−１＞肉眼観察
前記の実験を実施した後、肉眼で変化を観察した結果、すべての犬は麻酔及び手術から回復し、骨伸延装置はよく維持され装置周囲に明白な感染の症状はなかった。骨伸延が終わった後４週と７週目に採取した骨標本において、対照群では伸延された部位が堅かったが骨を折り曲げた時多少流動性があった。ＢＭＰ−４群、βｉｇ−ｈ３群及びキトサン群では、４週目の骨伸延された部位が７週目の対照群の骨標本よりもう少し堅固で、７週目には新生骨の形成によりとても堅固だった。
【００４０】
＜１−２＞放射線検査
前記で骨伸延が施行された各群の実験動物に毎週放射線検査を実施し、４週と７週目に得られた放射線写真を基礎にして骨生成及び骨硬化程度を観察した。
【００４１】
その結果、示されたように、骨伸延が終わった後４週と７週に実施した放射線検査において、対照群では伸延された下顎骨片間に広い放射線透過区域をおき、両側下顎骨片に接した放射線非透過区域がほとんどなく、４週と７週の間には明白な差がなかった。ＢＭＰ−４群、βｉｇ−ｈ３群及びキトサン群では、各群に該当した骨成長物質が注入された下顎骨伸延部位で時間の経過により進行される石灰化（ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が観察できた。骨成長物質を注入した後４週目の放射線所見で伸延された骨片間の放射線透過区域が両側骨片間に伸びて入り放射線非透過区域にほとんど連結され、７週目には放射線非透過区域の上下厚みは、４週目の厚みより二倍以上になった。特に、ＢＭＰ−４群で他の群に比べて放射線非透過陰影（ｒａｄｉｏｄｅｎｓｅ ｓｈａｄｏｗ）の密度が濃くその厚みが厚かった。
【００４２】
＜１−３＞骨鉱質密度（ｂｏｎｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）の測定
前記実施例＜１−２＞の７週目から得られた放射線写真（図４Ｂ、図５Ｂ、図６Ｂ及び図７Ｂ参照）を基礎にして放射線写真像から骨形成が進行するほど放射線非透過区域（ｒａｄｉｏｄｅｎｓｅ ｚｏｎｅ）が広く現れることを利用し、コンピュータープログラムで骨鉱質密度（ｂｏｎｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）を測定した。
【００４３】
その結果、４週目に骨鉱質密度はすべての群で対照群より高く測定された。その中でもＢＭＰ−４群で最も高く現れ、βｉｇ−ｈ３群、キトサン群、対照群の順だった（図８Ａ）。７週目にもＢＭＰ−４群で他の群に比べて飛び抜けて高く現れ、β−ｉｇｈ３群、キトサン群、対照群の順だった（図８Ｂ）。骨鉱質密度は、放射線像に現れた下顎骨骨片間に伸延された部位での放射線非透過程度、即ち、明るさ程度を反映するものであるため高く測定されるほど新生骨形成が多いということを意味するので、本発明の骨形成及び骨硬化促進用組成物を添加した群で対照群より新生骨形成がさらに早く起きていることが分かった。
【００４４】
＜１−４＞組織学的検査
前記で骨伸延手術が終わった実験動物の組織学的検査のために電気ノコを使用して伸延された下顎骨部位とその周囲の正常骨組織を含んで骨標本を採取した。採取された骨片を１０％中性ホルマリンに１週間固定した後、２日間１０％硝酸と１０％クエン酸ナトリウムに脱灰（ｄｅｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）した後、通常の方法にしたがって脱水及びパラフィン固定を経て４〜６μｍの標本を製作した。前記標本をヘマトキシリン−エオジン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−ｅｏｓｉｎ）で染色して光学顕微鏡で組織学的観察をした。
【００４５】
その結果、対照群では４週目に骨伸延された部位全般に繊維化組織で満たされていて下顎骨の断面に接して骨膜反応による新生骨形成が始まったが、全般的には新生骨形成の所見はなかった（図９Ａ）。７週目組織所見で伸延された部位の端の部分に新生骨及び軟骨形成所見が見られ、所々に血管と神経組織等が観察された（図９Ｂ及び図９Ｃ）。
【００４６】
ＢＭＰ−４群では、４週目に伸延された骨片の端の部分と中央部で類骨（ｏｓｔｅｏｉｄ）を形成する造骨細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）の増殖が部分的に観察されたが、伸延された部位の多くの部分は繊維化組織で満たされていた（図１０Ａ及び図１０Ｃ）。７週目には伸延された部位に部分的に石灰化が起きた不規則な模様の交織骨肉柱（ｗｏｖｅｎ ｂｏｎｅ ｔｒａｂｅｃｕｌａｅ）と多様な大きさの血管が内在した広い新生骨部位とその中心上下に位置している狭い繊維帯（ｆｉｂｒｏｕｓ ｉｎｔｅｒｚｏｎｅ）が観察された。伸延された部位全般にわたって形成された新生骨は、正常皮質骨に近かった（図１０Ｂ及び図１０Ｄ）。
【００４７】
βｉｇ−ｈ３群では、４週目の組織所見には類骨を形成する造骨細胞が伸延された部位の中央部に部分的に観察された（図１１Ａ）。７週目には多くの活動的な造骨細胞が伸延された部位の端の部分から中央部まで部分的に新生骨を形成し、その量はＢＭＰ−４群より少なく、伸延された部位中央部で上下に位置した繊維帯はＢＭＰ−４群より広かった（図１１Ｂ及び図１１Ｃ）。
【００４８】
キトサン群では、４週目の組織所見では伸延された部位の大部分が繊維化組織で満たされていた（図１２Ａ）。７週目には新生骨と共に多くの造骨細胞が伸延された部位の端の部分で観察され、伸延された部位の中央部まで部分的に新生骨を形成した。伸延された部位での新生骨量は、βｉｇ−ｈ３群やＢＭＰ−４群より少なく、繊維帯はβｉｇ−ｈ３群よりも広かった（図１２Ｂ及び図１２Ｃ）。
【００４９】
前記の結果から、本発明の骨形成及び骨硬化促進用組成物を添加したＢＭＰ−４群、βｉｇ−ｈ３群及びキトサン群では、骨伸延された部位に新生骨が４週目に一部生成され、７週目には相当に多くの量が生成された。新生骨の量は、ＢＭＰ−４群で最も多く、その次はβｉｇ−ｈ３群、キトサン群の順だった。すべての群で７週目に伸延された部位の中央に繊維帯が観察された。ＢＭＰ−４群で繊維帯の幅が最も狭く、βｉｇ−ｈ３群、キトサン群の順で幅が広く、対照群では伸延された部位の大部分を占めた。７週目にも繊維帯が残っているということは、新生骨の形成が進行中であることを示している。
【００５０】
産業上の利用可能性
前記で詳しく見てきたように、本発明のトリポリリン酸塩と水溶性キトサンの混合物に骨形成及び骨硬化促進物質を添加した組成物は、新生骨形成を誘導して正常骨構造を提供して好ましくない結合組織の成長を防ぎ、骨治癒時の防御膜の役割を行なうだけではなく、治癒過程で骨に代置されるため、生体に適合して血管成長と骨形成細胞の成長を早期に誘導するので骨形成及び骨硬化促進用組成物として有用に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明のキトサン、βｉｇ−ｈ３、ヒト骨形態発生タンパク質（ＢＭＰ−４）を使用した骨伸延手術を施行するために犬の左側顎部分に垂直切骨手術が行われたことを示した図である。
【図２】本発明の水溶性キトサン、βｉｇ−ｈ３を含有した水溶性キトサン、ヒト骨形態発生タンパク質（ＢＭＰ−４）を含有した水溶性キトサンと５％トリポリリン酸塩を入れた二重注射器を示した図で、Ａ：０．５ｃｃの骨成長物質である水溶性キトサン単独、βｉｇ−ｈ３を含有した水溶性キトサン、またはＢＭＰ−４を含有した水溶性キトサン。Ｂ：０．５ｃｃの５％トリポリリン酸塩。
【図３】骨伸延をしてから７週間が経過後、犬を殺す直前の状態を示した図である。
【図４Ａ】本発明でトリポリリン酸塩だけ注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延した対照群で骨伸延手術後４週が経過した後の骨硬化程度を放射線検査で測定した図である。
【図４Ｂ】本発明でトリポリリン酸塩だけ注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延した対照群で骨伸延手術後７週が経過した後、骨硬化程度を放射線検査で測定した図である。
【図５Ａ】本発明のキトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）とトリポリリン酸塩を注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延したキトサン群で骨伸延手術後４週が経過した後、骨硬化程度を放射線検査で測定した図である。
【図５Ｂ】本発明のキトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）とトリポリリン酸塩を注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延したキトサン群で骨伸延手術後７週が経過した後、骨硬化程度を放射線検査で測定した図である。
【図６Ａ】本発明のβｉｇ−ｈ３を含有した水溶性キトサンとトリポリリン酸塩を注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延したβｉｇ−ｈ３群で骨伸延手術後４週が経過した後、骨硬化程度を放射線検査で測定した図である。
【図６Ｂ】本発明のβｉｇ−ｈ３を含有した水溶性キトサンとトリポリリン酸塩を注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延したβｉｇ−ｈ３群で骨伸延手術後７週が経過した後、骨硬化程度を放射線検査で測定した図である。
【図７Ａ】本発明のＢＭＰ−４を含有した水溶性キトサンとトリポリリン酸塩を注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延したＢＭＰ−４群で骨伸延手術後４週が経過した後、骨硬化程度を放射線検査で測定した図である。
【図７Ｂ】本発明のＢＭＰ−４を含有した水溶性キトサンとトリポリリン酸塩を注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延したＢＭＰ−４群で骨伸延手術後７週が経過した後、骨硬化程度を放射線検査で測定した図である。
【図８Ａ】本発明のキトサン、βｉｇ−ｈ３を含有した水溶性キトサン、ＢＭＰ−４を含有した水溶性キトサンを注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延した各群で骨伸延手術後４週が経過した後、骨の鉱質濃度（ｍｉｎｅｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）を示したグラフである。
【図８Ｂ】本発明のキトサン、βｉｇ−ｈ３を含有した水溶性キトサン、ＢＭＰ−４を含有した水溶性キトサンを注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延した各群で骨伸延手術後７週が経過した後、骨の鉱質濃度（ｍｉｎｅｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）を示したグラフである。
【図９Ａ】本発明でトリポリリン酸塩だけ注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延した対照群の骨伸延手術４週後の組織学的な断面を示した図である。矢印：最初切断部位。
【図９Ｂ】本発明でトリポリリン酸塩だけ注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延した対照群の骨伸延手術７週後の組織学的な断面を示した図である。矢印：最初切断部位。
【図９Ｃ】本発明でトリポリリン酸塩だけ注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延した対照群の骨伸延手術部位の端部分で新しい骨が形成されていることをヘマトキシリン＆エオジン染色で確認した図である。Ａ：繊維化組織。Ｂ：造骨細胞。
【図１０Ａ】本発明のＢＭＰ−４を含有した水溶性キトサンとトリポリリン酸塩を注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延したＢＭＰ−４群の骨伸延手術４週後の組織学的な断面を示した図である。矢印：最初切断部位。
【図１０Ｂ】本発明のＢＭＰ−４を含有した水溶性キトサンとトリポリリン酸塩を注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延したＢＭＰ−４群の骨伸延手術７週後の組織学的な断面を示した図である。矢印：最初切断部位。
【図１０Ｃ】図１０Ａの組織学的な断面をヘマトキシリン＆エオジンで染色して、伸延された部位の中央が造骨細胞と繊維化組織で満たされていることを確認した図である。
【図１０Ｄ】図１０Ｂの組織学的な断面をヘマトキシリン＆エオジンで染色して、伸延された部位の中央が造骨細胞と繊維化組織で満たされていることを確認した図である。
【図１１Ａ】本発明のβｉｇ−ｈ３を含有した水溶性キトサンとトリポリリン酸塩を注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延したβｉｇ−ｈ３群で骨伸延手術４週後の組織学的な断面を示した図である。矢印：最初切断部位。
【図１１Ｂ】本発明のβｉｇ−ｈ３を含有した水溶性キトサンとトリポリリン酸塩が注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延したβｉｇ−ｈ３群で骨伸延手術７週後の組織学的な断面を示した図である。矢印：最初切断部位。
【図１１Ｃ】図１１Ｂの組織学的な断面をヘマトキシリン＆エオジンで染色して、伸延された部位全般にわたって新生骨が形成されていることを確認した図である。
【図１２Ａ】本発明のキトサンとトリポリリン酸塩を注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延したキトサン群で骨伸延手術４週後の組織学的な断面を示した図である。矢印：最初切断部位。
【図１２Ｂ】本発明のキトサンとトリポリリン酸塩を注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延したキトサン群で骨伸延手術７週後の組織学的な断面を示した図である。矢印：最初切断部位。
【図１２Ｃ】図１２Ａの組織学的な断面をヘマトキシリン＆エオジンで染色して、伸延された部位全般にわたって新生骨が形成されていることを確認した図である。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、骨形成及び骨硬化促進用組成物に関するものである。詳細には、トリポリリン酸塩（ｔｒｉｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）と水溶性キトサンの混合物に骨形成及び骨硬化促進物質を添加した骨形成及び骨硬化促進用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
最近、自動車事故または疾患等により骨欠損が生じる場合がよくあり、それにしたがって骨欠損部分を補完する必要性が高まっている。骨欠損部分を補完するには、骨移植をしたりするが、最近では骨充填剤が多く利用されている。さらに、最近では身長を伸ばしたり矮小した顎を矯正したりするために骨伸延手術が多く行われていて、それにより骨充填剤の要求がさらに大きくなっている。
【０００３】
骨伸延手術というのは、ストレッチング（ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ）により骨の長さ方向の成長を誘導するもので「引き延ばす物理的な力は組織学的な発生を刺激する（Ｔｅｎｓｉｏｎ ｆｏｒｃｅｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｈｉｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）」という原理に基づくもので初めは足骨の伸長のために考案されたが、最近では顎骨伸長手術に多く採り入れられている。顎骨伸長手術というのは、最近発展した頭蓋顎顔面外科部分中の一つで骨伸長（骨伸延）装置を後退した顎骨部位や中顔容貌後退部位に装着することにより広範囲な切骨を行わずに顔の骨を漸次的に動かして顔の比率を改善させる施術である。
【０００４】
骨伸延手術は、イリザロブ（Ｉｌｉｚａｒｏｖ ＧＡ，Ｊ．Ｄｉｓ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｉｎｓｔ．，１９８８年、第４８（１）巻、１頁；Ｉｌｉｚａｒｏｖ ＧＡ，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏ．，１９８９年、第２３９巻、２６３頁；Ｉｌｉｚａｒｏｖ ＧＡ，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏ．，１９８９年、第２３８巻、２４９頁）が骨伸延手術に対する生体力学的（ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ）因子を糾明した以後に、長骨（ｌｏｎｇ ｂｏｎｅ）の骨欠損矯正に成功的に利用されてきた。成功的な骨伸延手術を行なうためには、骨伸延部の血液循環を保存して皮質骨の折骨部位両側に外固定器を安定に固定して骨の長さ延長を漸次的に施行して骨硬化を促進させるようにしなければならない（Ｗｈｉｔｅ ＳＨ，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎ Ｓｕｒｇｅｒｙ，１９９０年、第７２−Ｂ巻、３５０頁；Ｗｈｉｔｅ ＳＨ，Ｏｒｔｈｏｐ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ．Ａｍｅｒ．，１９９１年、第２２巻、５６９頁；Ｆｉｓｈｇｒｕｎｄ Ｊ．，Ｐａｌｅｙ Ｄ．，Ｓｕｌｔｅｒ Ｄ．，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．，１９９４年、第３０１巻、３１頁）。
【０００５】
骨硬化期間は、顔面骨または長骨のような伸延する骨の部位、血行化状態、患者の年齢により変わり得る。骨伸延後の骨硬化期間は、頭蓋顔面骨では小児が３週〜５週、成人が６週〜１２週所要され、長骨では年齢に関係なく３ヵ月〜６ヵ月程度所要される。したがって、頭蓋顔面骨で骨伸延手術を施行する場合、その治療期間は、潜在期、骨伸延期、骨硬化期を含めて総２ヵ月乃至４ヵ月が所要される。このように長い骨硬化期間によりピンによる感染のような合併症の可能性を高めることもあり、日常生活への復帰を遅延させる問題点が提起されてきた。
【０００６】
治療期間を短縮させるための骨伸延後の研究報告においてカールス（Ｃｈａｒｌｓ）とセイラー（Ｓａｉｌｅｒ）は、一日に１ｍｍ伸延することが２乃至３ｍｍ伸延することよりさらに強い生化学的、生理学的特性を示すと報告した（Ｃａｒｌｓ ＆ Ｓａｉｌｅｒ，Ｊ．Ｃｒａｎｉｏｍａｘｉｌｌｏｆａｃ Ｓｕｒｇ．，１９９４年、第９４巻、１５２頁）。また、イリザロブ（Ｉｌｉｚａｒｏｖ）は、一日に０．５ｍｍ伸延することは未成熟骨硬化を起こし、一日に２ｍｍ伸延することは伸延した組織に好ましくない変化を惹起するため、一日に１ｍｍ伸延することが最も良い結果を得ると報告した（Ｉｌｉｚａｒｏｖ，Ｊ．Ｄｉｓ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｉｎｓｔ．，１９８８年、第４８（１）巻、１頁；Ｉｌｉｚａｒｏｖ，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏ．，１９８９年、第２３９巻、２６３頁）。併せて、連続的に伸延することが組織損傷を最も少なくし、最も多い毛細血管新生と骨形成を惹起すると知られている。したがって、骨伸延期間と骨硬化期間を短縮させることが可能なら長い骨硬化期間による合併症の可能性を防ぐことができ、全体的な治療期間を短縮して患者を早期に日常生活に復帰させられるものと期待される。それで、骨伸延期間と骨硬化期間を短縮するために、骨形成を促進して骨硬化を促進させる充填剤を使用している。
【０００７】
一方、自家骨移植、処置された同種骨移植や異種骨移植及び骨移植代替物（ｂｏｎｅ ｇｒａｆｔ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ）は、骨形成を刺激するものと知られている。自家骨移植は、骨空洞（ｂｏｎｅ ｃａｖｉｔｙ）や骨欠損を埋めて感染、腫瘍、手術による空隙（ｖｏｉｄ）と損傷をなくしたり関節癒合や不癒合骨折を治癒したりするのに利用される。移植された自家骨が吸収され再血行化がなされると骨前駆細胞（ｏｓｔｅｏｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）が骨形成細胞（ｂｏｎｙ ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ｃｅｌｌ）に分化され前記骨形成細胞の活動が新しい骨再生と骨欠損部治癒を起こす。しかし、自家骨は採取できる量が制限されていて供与部位に対する二次手術が追加され罹患率（ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ）が高いという短所を持っている。したがって、伸延された部位で骨再生を誘導するために骨形態発生タンパク質（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）や他の骨移植代置物等が使用されている。この中で骨形態発生タンパク質が最も強力な骨誘導物質と考えられているが非常に高価で求めにくい短所のため臨床的に使用するには多くの限界があるのが実情である。
【０００８】
以上のことを鑑みて、本発明者らは、非常に経済的で生体適合する骨形成及び骨硬化促進用組成物を見つけ出す努力を重ねた結果、トリポリリン酸塩と水溶性キトサンの混合物に骨形成及び骨硬化促進物質を添加して製造される組成物を製造して、前記組成物が早期骨硬化を促進して骨硬化期間を減らすことにより骨生成の治療期間を短縮できることを確認して本発明を完成した。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明は、骨形成及び骨硬化促進用組成物に関するものである。詳細には、トリポリリン酸塩（ｔｒｉｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）と水溶性キトサンの混合物に骨形成及び骨硬化促進物質を添加した骨形成及び骨硬化促進用組成物に関するものである。本発明の骨形成及び骨硬化促進用組成物は新生骨形成と骨硬化を早期に促進させる。
【００１０】
発明の詳細な説明
前記目的を達成するために、本発明は、トリポリリン酸塩と水溶性キトサンの混合物に骨形成及び骨硬化促進物質を添加した骨形成及び骨硬化促進用組成物を提供する。
【００１１】
また、本発明は、前記組成物を骨形成及び骨硬化を早期に促進させるのに使用する用途を提供する。
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、トリポリリン酸塩と水溶性キトサンの混合物に骨形成及び骨硬化促進物質を添加した骨形成及び骨硬化促進用組成物を提供する。
【００１３】
本発明の骨形成及び骨硬化促進用組成物は、トリポリリン酸塩と水溶性キトサンの混合物に骨形成及び骨硬化促進物質を添加して製造する。前記で骨形成及び骨硬化促進物質の例として、βｉｇ−ｈ３、骨形態発生タンパク質、ＴＧＦ−β、ＦＧＦ、ＩＧＦ−１、ＰＤＧＦ等を挙げているが、必ずしもそれに限定されるものではない。本発明では、好ましい実施態様として骨形成及び骨硬化促進物質にβｉｇ−ｈ３及び骨形態発生タンパク質としてＢＭＰ−４を使用した場合を例示した。
【００１４】
キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）は、海の甲殻類の外骨格構成物質であるキチン（ｃｈｉｔｉｎ）の脱アセチル化（ｄｅａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）により得られる多糖類（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）である（Ｋｉｎｄ，Ｇ．Ｍ．，Ｂｉｎｄ，Ｓ．Ｄ．，Ｓｔａｒｅｎ，Ｅ．Ｄ．，Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ，Ａ．Ｊ．ａｎｄ Ｅｃｏｎｏｍｏｕ，Ｓ．Ｇ．，Ｃｕｒｒ．Ｓｕｒｇ．，１９９０年、第４７巻、３７頁；Ｈａｕｓｃｈｋｓ，Ｐ．Ｖ．，Ｂｏｎｅ，１９９０年、第１巻、１０３頁，Ｌｏｎｄｏｎ ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｎ．Ｓ．，Ｐａｒａｌｋａｒ，Ｖ．ａｎｄ Ｒｅｄｄｉ，Ａ．Ｈ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８２年、第８９巻、１１７４０頁；Ｍａｌｅｔｔｅ，Ｗ．Ｇ．，Ｑｕｉｇｌｅｙ，Ｈ．Ｊ．ａｎｄ Ａｄｉｃｋｅｓ，Ｅ．Ｄ．，Ｎａｔｕｒｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８６年、４３５頁：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）。ムザレリー（Ｍｕｚａｒｅｌｌｉ）等は、骨欠損部位にキトサンを使用した結果正常骨形成を促進する役割があることを発見した（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ，Ｒ．Ａ．，Ｍａｔｔｉｏｌｉ−Ｂｅｌｍｏｎｔｅ，Ｍ．，Ｔｉｅｔｓ，Ｃ．，Ｂｉａｇｉｎｉ，Ｒ．，Ｆｅｉｏｌｉ，Ｇ．，Ｂｒｕｎｅｌｌｉ，Ｍ．Ａ．，Ｆｉｎｉ，Ｍ．，Ｇｉａｒｄｉｎｏ，Ｒ．，Ｉｌａｒｉ，Ｐ．ａｎｄ Ｂｉａｇｉｎｉ，Ｇ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１９９４年、第１５巻、１０７５頁）、クロッケボルド（Ｋｌｏｋｋｅｖｏｌｄ）等は、キトサンが骨形成細胞の分化を促進させて骨形成を容易にすると報告した（Ｋｌｏｋｋｅｖｏｌｄ，Ｐ．Ｒ．，Ｖａｎｄｅｍａｒｋ，Ｌ．，Ｋｅｎｎｅｙ，Ｅ．Ｂ．ａｎｄ Ｂｅｒｎａｒｄ，Ｇ．Ｗ．，Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．，１９９６年、第６７巻、１１７０頁）。
【００１５】
ＴＧＦ−βは、軟骨細胞と造骨細胞の増殖と分化を刺激するだけではなく、βｉｇ−ｈ３は試験管内で様々な骨間質（ｂｏｎｅ ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ）タンパク質の生産を増加させて造骨細胞で膠原質（ｃｏｌｌａｇｅｎ）の分解を減少させることが知られている（Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ Ａ．Ｂ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：１９９０年、３頁；Ｃｅｎｔｒｅｌｌａ，Ｍ．，ＭｃＣａｒｔｈｙ，Ｔ．Ｌ．ａｎｄ Ｃａｎａｌｉｓ，Ｅ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎ．Ｓｕｒｇ．，１９９１年、第７３（Ａｍ）巻、１４１８頁；Ｍｕｓｔｏｅ，Ｔ．Ａ．，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｇ．Ｆ．，Ｔｈｏｍａｓｏｎ，Ａ．，Ｇｒａｍａｔｅｓ，Ｐ．，Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ．ａｎｄ Ｄｅｕｅｌ，Ｔ．Ｆ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７年、第２３７巻、１３３３頁；Ｎｏｄａ，Ｍ．ａｎｄ Ｃａｍｉｌｌｉｅｒｅ，Ｊ．Ｊ．，Ｅｎｄｏｃｌｉｎｏｌ．，１９８９年、第１２４巻、２９９１頁；Ｊｏｙｃｅ，Ｍ．Ｅ．，Ｊｉｎｇｕｓｋｉ，Ｓ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａ．Ｂ．，Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ．ａｎｄ Ｂｏｌａｎｄｅｒ，Ｍ．Ｅ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１９８９年、第４巻、２２５頁；Ｈｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．，Ｃａｎａｌｉｓ，Ｅ．ａｎｄ Ｃｅｎｔｒｅｌｌａ，Ｍ．，Ｅｎｄｏｃｌｉｎｏｌ．，１９９０年、第１２６巻、４２１頁；Ｂｅｃｋ，Ｌ．Ｓ．，Ａｍｍａｎｎ，Ａ．Ｊ．，Ａｕｆｄｅｍｏｒｔｅ，Ｔ．Ｂ．，ＤｅＧｕｚｍａｎ，Ｌ．，Ｘｕ，Ｙ．，Ｌｅｅ，Ｗ．Ｐ．，ＭｃＦａｔｒｉｄｇｅ，Ｌ．Ａ．ａｎｄ Ｃｈｅｎ，Ｔ．Ｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１９９１年、第６巻、９６１頁）。成長因子中でＴＧＦ−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ β）は、骨再生と発達に重要な調節因子として台頭してきている。ＴＧＦ−β１は、強力な骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）の化学走化性因子（ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ）で、軟骨内骨化（ｅｎｄｏｃｈｏｎｄｒａｌ ｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）過程で造骨細胞の前駆細胞に分裂効果を有している。βｉｇ−ｈ３は、ＴＧＦ−βにより発現が誘導される細胞付着タンパク質としてインテクリンと作用して細胞の付着及び拡散機能（Ｊｕｎｇ−Ｅｕｎ Ｋｉｍ，Ｓｏｎｇ−Ｊａ Ｋｉｍ，Ｂｙｕｎｇ−Ｈｅｏｎ Ｌｅｅ，Ｒａｎｇ−Ｗｏｏｎ Ｐａｒｋ，Ｋｉ−Ｓａｎ Ｋｉｍ ａｎｄ Ｉｎ−Ｓａｎ Ｋｉｍ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０００年、第２７５巻、３０９０７−３０９１５頁）を有していて、創傷治癒効果があると知られている。また、骨形成の初期工程で重要な役割をするものとして知られている（Ｄｉｅｕｄｏｎｎｅ，Ｓ．Ｃ．，Ｋｅｒｒ，Ｊ．Ｍ．，Ｘｕ，Ｔ．，Ｓｏｍｍｅｒ Ｂ．，ＤｅＲｕｂｅｉｓ，Ａ．Ｒ．，Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖ，Ｓ．Ａ．，Ｋｉｍ，Ｉ−Ｓ．，Ｒｏｂｅｙ，Ｐ．Ｇ．，ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ Ｍ．Ｆ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９９年、第７６巻、２３１−２４３頁）。
【００１６】
骨形態発生タンパク質（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ；以下「ＢＭＰ」と略称する）は、骨形成物質としてウリスト（Ｕｒｉｓｔ）により最初に発見されて以来、該骨形態発生タンパク質は多機能性細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｅｌｌ）が軟骨細胞と骨形成細胞に分化されることを促進させ、骨再生において重要な役割をすることが報告された（Ｕｒｉｓｔ，Ｍ．Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９６５年、第１５０巻、８９３頁；Ｕｒｉｓｔ，Ｍ．Ｒ．ａｎｄ Ｓｔｒａｔｅｓ，Ｂ．Ｓ．，Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．，１９７１年、第５０巻、１３９２頁；Ｗｏｚｎｅｙ，Ｊ．Ｍ．，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｈｅｉｎｅｒｍａｎｎ １ｓｔ Ｅｄ．Ｌｏｎｄｏｎ：１９９４年、３９７−４１１頁；Ｗｏｚｎｅｙ，Ｊ．Ｍ．，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，１９９２年、第３２巻、１６０頁；Ｗｏｚｎｅｙ，Ｊ．Ｍ．，Ｒｏｓｅｎ，Ｖ．ａｎｄ Ｃｅｌｅｓｔｅ，Ａ．Ｊ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８年、第２４２巻、１５２８頁；Ｏｎｏ，Ｉ．，Ｔａｔａｓｈｉｔａ，Ｔ．，Ｔａｋｉｔａ，Ｈ．ａｎｄ Ｋｕｂｏｋｉ，Ｙ．，Ｊ．Ｃｒａｎｉｏｆａｃ．Ｓｕｒｇ．，１９９６年、第７巻、４１８頁）。現在まで確認されたヒト骨形態発生タンパク質は１３種で、特にヒト骨形態発生タンパク質−４（ＢＭＰ−４）は、骨再生に卓越した効果があると報告された（Ｂｏｙｎｅ，Ｐ．Ｊ．，Ｂｏｎｅ，１９９６年、第１９巻、８３ｓ頁；Ｚｅｇｚｕｌａ，Ｈ．Ｄ．，Ｂｕｃｋ，Ｄ．Ｃ．，Ｂｒｅｋｋｅ，Ｊ．，Ｗｏｚｎｅｙ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｏ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎ．Ｓｕｒｇ．，１９９７年、第７９巻、１７７８頁；Ｓｐｏｒｎ，Ｍ．Ｂ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ ＡＢ（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：１９９０年、３頁）。
【００１７】
本発明の組成物においてトリポリリン酸塩は、水溶性キトサンと混合される時、瞬く間に固まってしまうので、水溶性キトサン単独または骨形成及び骨硬化促進物質のβｉｇ−ｈ３または骨形態発生タンパク質を含有した水溶性キトサンを添加する時、図２のような二重注射器（ｄｕａｌ ｓｙｒｉｎｇｅ）を使用し、同一な部位に同時に注射して注射した部位で二種の物質が出会い即時に固まるようにして、注射した物質が他の部位に移動することを防止することが好ましい。
【００１８】
本発明のトリポリリン酸塩と水溶性キトサンの混合物に骨形成及び骨硬化促進物質としてβｉｇ−ｈ３または骨形態発生タンパク質を添加した骨形成及び骨硬化促進用組成物においてトリポリリン酸塩と水溶性キトサンの比率は２０：８０乃至８０：２０重量％であることが好ましく、５０：５０の同量であることがさらに好ましい。前記で骨形成及び骨硬化促進物質として添加されるβｉｇ−ｈ３は、組成物全体に対して１００μｇ／ｍｌ乃至１μｇ／ｍｌ添加されることが好ましく、３００μｇ／ｍｌ乃至６００μｇ／ｍｌ添加されることがさらに好ましい。また、骨形態発生タンパク質の場合には、組成物全体に対して５０ｎｇ／ｍｌ乃至５００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加されることが好ましく、１００ｎｇ／ｍｌ乃至３００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加されることがさらに好ましい。
【００１９】
また、本発明は、前記組成物を骨形成及び骨硬化を早期に促進させるのに使用する用途を提供する。
【００２０】
本発明者らは、前記組成物を骨形成及び骨硬化を促進させるのに使用できるかどうかを確認するために、犬の下顎で骨伸延手術時に本発明のトリポリリン酸塩に水溶性キトサン、βｉｇ−ｈ３を含有した水溶性キトサンまたは、骨形態発生タンパク質を含有した水溶性キトサンを添加した組成物が骨形成及び骨硬化に及ぼす影響を確認した。
【００２１】
その結果、骨伸延が終了後４週と７週目に採取した骨標本において、対照群では伸延された部位が堅くなっていたが骨を折り曲げた時、多少流動性があった。トリポリリン酸塩にＢＭＰ−４を含有した水溶性キトサンを添加したＢＭＰ−４群、βｉｇ−ｈ３を含有した水溶性キトサンを添加したβｉｇ−ｈ３群及び水溶性キトサンだけを添加したキトサン群では、４週目の骨伸延された部位が７週目の対照群骨標本よりさらに少し堅固で７週目には新生骨の形成によってとても堅固だった。
【００２２】
また、骨伸延が終了後４週と７週に実施した放射線検査で、対照群では伸延された下顎骨片間に広い放射線透過区域（ｒａｄｉｏｌｕｃｅｎｔ ｚｏｎｅ）をおいて両側下顎骨片に接して放射線非透過区域（ｒａｄｉｏｄｅｎｓｅ ｚｏｎｅ）がほとんどなく、４週と７週の間に明確な差がなかった。ＢＭＰ−４群、βｉｇ−ｈ３群及びキトサン群では、各群に該当する骨成長物質が注入された下顎骨伸延部位で、時間の経過により進行される石灰化（ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が観察できた。骨成長物質を注入した後４週目の放射線所見で、伸延された骨片間の放射線透過区域が両側骨片間に伸びて入った放射線非透過区域でほとんど連結された。７週目には放射線非透過区域の上下厚みは、４週目の厚みより二倍以上になった。特に、ＢＭＰ−４群で他の群と比べて放射線非透過陰影（ｒａｄｉｏｄｅｎｓｅ ｓｈａｄｏｗ）の密度が濃く、その厚みが厚くなったことが分かった（図４乃至図７参照）。
【００２３】
また、骨鉱質密度を測定した結果、骨鉱質密度はすべての群で対照群より高く測定された。その中でもＢＭＰ−４群で最も高く現れ、βｉｇ−ｈ３群、キトサン群、対照群の順だった。７週目でもＢＭＰ−４群で他の群に比べて飛び抜けて高く現れ、βｉｇ−ｈ３群、キトサン群、対照群の順だった。骨鉱質密度は、放射線像に現れた下顎骨骨片間の伸延された部位での放射線非透過程度、即ち、明るさ程度を反映するもので高く測定されるほど新生骨形成が多いことを意味する（図８参照）。
【００２４】
組織学的検査の結果、対照群では４週目に骨伸延された部位全般が繊維化組織で満たされていて、下顎骨の断面に接して骨膜反応による新生骨形成が始まったが、全般的には新生骨形成の所見はなかった（図９Ａ参照）。７週目組織所見で伸延された部位の端の部分に新生骨及び軟骨形成所見が見られ、所々に血管と神経組織等が観察された（図９Ｂ及び図９Ｃ参照）。
【００２５】
ＢＭＰ−４群では、４週目に伸延された骨片の端の部分と中央部で類骨（ｏｓｔｅｏｉｄ）を形成する造骨細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）の増殖が部分的に観察されたが、伸延された部位の多くの部分は繊維化組織で満たされていた（図１０Ａ及び図１０Ｃ参照）。７週目には、伸延された部位に部分的に石灰化がなされた不規則な模様の交織骨肉柱（ｗｏｖｅｎ ｂｏｎｅ ｔｒａｂｅｃｕｌａｅ）と多様な大きさの血管等が内在した広い新生骨部位とその中心に上下に位置した狭い繊維帯（ｆｉｂｒｏｕｓ ｉｎｔｅｒｚｏｎｅ）が観察された。伸延された部位全般にわたって形成された新生骨は正常皮質骨に近かった（図１０Ｂ及び図１０Ｄ参照）。
【００２６】
βｉｇ−ｈ３群では、４週目の組織所見では類骨を形成する造骨細胞が伸延された部位の中央部に部分的に観察された（図１１Ａ参照）。７週目には、多くの活動的な造骨細胞が伸延された部位の端の部分から中央部まで部分的に新生骨を形成した。その量は、ＢＭＰ−４群より少なく、伸延された部位中央部上下に位置した繊維帯はＢＭＰ−４群より広かった（図１１Ｂ及び図１１Ｃ参照）。
【００２７】
キトサン群では、４週目の組織所見では伸延された部位の大部分が繊維化組織で満たされていた（図１２Ａ参照）。７週目には新生骨と共に多くの造骨細胞が伸延された部位の端の部分で観察され、伸延された部位の中央部まで部分的に新生骨を形成した（図１２Ｂ及び図１２Ｃ参照）。伸延された部位での新生骨量は、βｉｇ−ｈ３群やＢＭＰ−４群より少なく、繊維帯はβｉｇ−ｈ３群より広かった。
【００２８】
結論的に、本発明のトリポリリン酸塩に水溶性キトサン、βｉｇ−ｈ３を含有した水溶性キトサン、またはＢＭＰ−４を含有した水溶性キトサンを添加した組成物は、新生骨形成と骨硬化を早期に促進させて骨硬化期間を短縮させるので、非常に経済的で生体適合した骨形成及び骨硬化促進用組成物として有用に使用できる。
【００２９】
実施例
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
但し、下記の実施例は本発明を例示するだけのものであり、本発明の内容が下記の実施例の内容によって限定されるものではない。
【００３０】
実施例１：組成物の製造
本発明者らは、トリポリリン酸塩に骨形成及び骨硬化促進物質を添加した骨形成及び骨硬化促進用組成物を製造した。詳細には、５％のトリポリリン酸塩０．５ｍｌに５％キトサン０．５ｍｌを添加した組成物を製造して、それを「キトサン群」と命名した。
【００３１】
実施例２：組成物の製造
本発明者らは、前記実施例１と同一な方法で５％のトリポリリン酸塩０．５ｍｌに４５０μｇ／ｍｌ濃度のβｉｇ−ｈ３を含有した水溶性キトサン０．５ｍｌを添加した組成物を製造して、それを「βｉｇ−ｈ３群」と命名した。
【００３２】
実施例３：組成物の製造
本発明者らは、前記実施例１と同一な方法で５％のトリポリリン酸塩０．５ｍｌに２００ｎｇ／ｍｌ濃度のＢＭＰ−４を含有した水溶性キトサン０．５ｍｌを添加した組成物を製造して、それを「ＢＭＰ−４群」と命名した。
【００３３】
実験例１：本発明の組成物が骨形成及び骨硬化に及ぼす影響の測定
本発明者らは、前記実施例１乃至実施例３で製造した本発明の骨形成及び骨硬化促進用組成物が新生骨形成と骨硬化を早期に促進させるかどうか確認するために、犬の下顎骨に骨伸延手術を施行した後、本発明の骨形成及び骨硬化促進用組成物を注射して変化を観察した。
【００３４】
詳細には、生後５〜８ヵ月の１６匹の犬を実験動物に使用した。対照群、キトサン群、βｉｇ−ｈ３群及びＢＭＰ−４群に分類して各群毎に４匹ずつ実験に使用した。
【００３５】
実験用の犬は、全身麻酔後気管内挿管で呼吸を維持した。手術部位は削毛した後、基本的な消毒と塗布を実施した。下顎骨の下端部に沿って３〜４ｃｍの皮膚切開を加えた後、咬筋（ｍａｓｓｅｔｅｒ ｍｕｓｃｌｅ）を持ち上げて下顎骨の外側面を露出させた。電気ノコギリで下顎骨体部に垂直に切骨手術を施行して下顎骨を完全切断した。外固定装置に固定するピンは、切骨された部位から左右に１ｃｍの地点の骨片に各々固定した。ピンを下顎骨骨片にドリルで固定時、生理食塩水で洗浄しながら固定してピン固定部位の骨が焦げないようにした。ここで、ピンは下顎骨をやっと貫通する程度打ち込みしっかりと固定した。２匹の犬のピンを固定した後、骨延長器具（Ｍｏｌｉｎａ Ｄｉｓｔｒａｃｔｏｒｓ，Ｗｅｌｌｓ Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）に装着した（図１）。
【００３６】
５−０ビクリル（ｖｉｃｒｙｌ）と５−０ナイロン（ｎｙｌｏｎ）縫合糸で切開部位を幾重にも縫合して実験動物を麻酔から回復させた。手術後、７日間ペニシリン抗生剤（１００，０００μ／ｋｇ）を１２時間毎に筋肉注射し、痛みを緩和するために鎮痛剤を４〜６時間間隔で経口投与した。手術直後から２日目までは軟質食餌（ｓｏｆｔ ｄｉｅｔ）を与え、３日目から一般食餌（ｒｅｇｕｌａｒ ｄｉｅｔ）に替えた。手術後５日目から一日に２ｍｍずつ、総１０ｍｍになるように５日間伸延した。
【００３７】
各群は、骨伸延が終わる日に各群別に伸延された部位に凝固剤として０．５ｍｌの５％トリポリリン酸塩（ｔｒｉｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＴＰＰ）と同量の５％水溶性キトサン、ＢＭＰ−４（２００ｎｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ．）を含有した５％水溶性キトサン、βｉｇ−ｈ３（４５０ μｇ／ｍｌ）を含有した５％水溶性キトサンを各々同量を二重注射器（ｄｕａｌ ｓｙｒｉｎｇｅ）（図２）を使用して同一部位に同時に注射して伸延された部位内で二種物質が出会って即時に固まり注射した物質が他の部位に移動することを防止すると同時に骨形成時に骨台になるようにした。対照群には、５％トリポリリン酸塩だけを１ｍｌ注射した。
【００３８】
本発明の骨形成及び骨硬化促進用組成物の注入が終わった後、骨硬化と骨再生のために骨伸延装置を７週間維持した。各群毎に２匹ずつ全体８匹を骨伸延が終わった後４週目、残りの８匹は７週目にペントバルビタール（ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ）を過用量（４０〜５０ｍｇ／ｋｇ）注射して犠牲にした。（図３）。
【００３９】
＜１−１＞肉眼観察
前記の実験を実施した後、肉眼で変化を観察した結果、すべての犬は麻酔及び手術から回復し、骨伸延装置はよく維持され装置周囲に明白な感染の症状はなかった。骨伸延が終わった後４週と７週目に採取した骨標本において、対照群では伸延された部位が堅かったが骨を折り曲げた時多少流動性があった。ＢＭＰ−４群、βｉｇ−ｈ３群及びキトサン群では、４週目の骨伸延された部位が７週目の対照群の骨標本よりもう少し堅固で、７週目には新生骨の形成によりとても堅固だった。
【００４０】
＜１−２＞放射線検査
前記で骨伸延が施行された各群の実験動物に毎週放射線検査を実施し、４週と７週目に得られた放射線写真を基礎にして骨生成及び骨硬化程度を観察した。
【００４１】
その結果、示されたように、骨伸延が終わった後４週と７週に実施した放射線検査において、対照群では伸延された下顎骨片間に広い放射線透過区域をおき、両側下顎骨片に接した放射線非透過区域がほとんどなく、４週と７週の間には明白な差がなかった。ＢＭＰ−４群、βｉｇ−ｈ３群及びキトサン群では、各群に該当した骨成長物質が注入された下顎骨伸延部位で時間の経過により進行される石灰化（ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が観察できた。骨成長物質を注入した後４週目の放射線所見で伸延された骨片間の放射線透過区域が両側骨片間に伸びて入り放射線非透過区域にほとんど連結され、７週目には放射線非透過区域の上下厚みは、４週目の厚みより二倍以上になった。特に、ＢＭＰ−４群で他の群に比べて放射線非透過陰影（ｒａｄｉｏｄｅｎｓｅ ｓｈａｄｏｗ）の密度が濃くその厚みが厚かった。
【００４２】
＜１−３＞骨鉱質密度（ｂｏｎｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）の測定
前記実施例＜１−２＞の７週目から得られた放射線写真（図４Ｂ、図５Ｂ、図６Ｂ及び図７Ｂ参照）を基礎にして放射線写真像から骨形成が進行するほど放射線非透過区域（ｒａｄｉｏｄｅｎｓｅ ｚｏｎｅ）が広く現れることを利用し、コンピュータープログラムで骨鉱質密度（ｂｏｎｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）を測定した。
【００４３】
その結果、４週目に骨鉱質密度はすべての群で対照群より高く測定された。その中でもＢＭＰ−４群で最も高く現れ、βｉｇ−ｈ３群、キトサン群、対照群の順だった（図８Ａ）。７週目にもＢＭＰ−４群で他の群に比べて飛び抜けて高く現れ、β−ｉｇｈ３群、キトサン群、対照群の順だった（図８Ｂ）。骨鉱質密度は、放射線像に現れた下顎骨骨片間に伸延された部位での放射線非透過程度、即ち、明るさ程度を反映するものであるため高く測定されるほど新生骨形成が多いということを意味するので、本発明の骨形成及び骨硬化促進用組成物を添加した群で対照群より新生骨形成がさらに早く起きていることが分かった。
【００４４】
＜１−４＞組織学的検査
前記で骨伸延手術が終わった実験動物の組織学的検査のために電気ノコを使用して伸延された下顎骨部位とその周囲の正常骨組織を含んで骨標本を採取した。採取された骨片を１０％中性ホルマリンに１週間固定した後、２日間１０％硝酸と１０％クエン酸ナトリウムに脱灰（ｄｅｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）した後、通常の方法にしたがって脱水及びパラフィン固定を経て４〜６μｍの標本を製作した。前記標本をヘマトキシリン−エオジン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−ｅｏｓｉｎ）で染色して光学顕微鏡で組織学的観察をした。
【００４５】
その結果、対照群では４週目に骨伸延された部位全般に繊維化組織で満たされていて下顎骨の断面に接して骨膜反応による新生骨形成が始まったが、全般的には新生骨形成の所見はなかった（図９Ａ）。７週目組織所見で伸延された部位の端の部分に新生骨及び軟骨形成所見が見られ、所々に血管と神経組織等が観察された（図９Ｂ及び図９Ｃ）。
【００４６】
ＢＭＰ−４群では、４週目に伸延された骨片の端の部分と中央部で類骨（ｏｓｔｅｏｉｄ）を形成する造骨細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）の増殖が部分的に観察されたが、伸延された部位の多くの部分は繊維化組織で満たされていた（図１０Ａ及び図１０Ｃ）。７週目には伸延された部位に部分的に石灰化が起きた不規則な模様の交織骨肉柱（ｗｏｖｅｎ ｂｏｎｅ ｔｒａｂｅｃｕｌａｅ）と多様な大きさの血管が内在した広い新生骨部位とその中心上下に位置している狭い繊維帯（ｆｉｂｒｏｕｓ ｉｎｔｅｒｚｏｎｅ）が観察された。伸延された部位全般にわたって形成された新生骨は、正常皮質骨に近かった（図１０Ｂ及び図１０Ｄ）。
【００４７】
βｉｇ−ｈ３群では、４週目の組織所見には類骨を形成する造骨細胞が伸延された部位の中央部に部分的に観察された（図１１Ａ）。７週目には多くの活動的な造骨細胞が伸延された部位の端の部分から中央部まで部分的に新生骨を形成し、その量はＢＭＰ−４群より少なく、伸延された部位中央部で上下に位置した繊維帯はＢＭＰ−４群より広かった（図１１Ｂ及び図１１Ｃ）。
【００４８】
キトサン群では、４週目の組織所見では伸延された部位の大部分が繊維化組織で満たされていた（図１２Ａ）。７週目には新生骨と共に多くの造骨細胞が伸延された部位の端の部分で観察され、伸延された部位の中央部まで部分的に新生骨を形成した。伸延された部位での新生骨量は、βｉｇ−ｈ３群やＢＭＰ−４群より少なく、繊維帯はβｉｇ−ｈ３群よりも広かった（図１２Ｂ及び図１２Ｃ）。
【００４９】
前記の結果から、本発明の骨形成及び骨硬化促進用組成物を添加したＢＭＰ−４群、βｉｇ−ｈ３群及びキトサン群では、骨伸延された部位に新生骨が４週目に一部生成され、７週目には相当に多くの量が生成された。新生骨の量は、ＢＭＰ−４群で最も多く、その次はβｉｇ−ｈ３群、キトサン群の順だった。すべての群で７週目に伸延された部位の中央に繊維帯が観察された。ＢＭＰ−４群で繊維帯の幅が最も狭く、βｉｇ−ｈ３群、キトサン群の順で幅が広く、対照群では伸延された部位の大部分を占めた。７週目にも繊維帯が残っているということは、新生骨の形成が進行中であることを示している。
【００５０】
産業上の利用可能性
前記で詳しく見てきたように、本発明のトリポリリン酸塩と水溶性キトサンの混合物に骨形成及び骨硬化促進物質を添加した組成物は、新生骨形成を誘導して正常骨構造を提供して好ましくない結合組織の成長を防ぎ、骨治癒時の防御膜の役割を行なうだけではなく、治癒過程で骨に代置されるため、生体に適合して血管成長と骨形成細胞の成長を早期に誘導するので骨形成及び骨硬化促進用組成物として有用に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明のキトサン、βｉｇ−ｈ３、ヒト骨形態発生タンパク質（ＢＭＰ−４）を使用した骨伸延手術を施行するために犬の左側顎部分に垂直切骨手術が行われたことを示した図である。
【図２】本発明の水溶性キトサン、βｉｇ−ｈ３を含有した水溶性キトサン、ヒト骨形態発生タンパク質（ＢＭＰ−４）を含有した水溶性キトサンと５％トリポリリン酸塩を入れた二重注射器を示した図で、Ａ：０．５ｃｃの骨成長物質である水溶性キトサン単独、βｉｇ−ｈ３を含有した水溶性キトサン、またはＢＭＰ−４を含有した水溶性キトサン。Ｂ：０．５ｃｃの５％トリポリリン酸塩。
【図３】骨伸延をしてから７週間が経過後、犬を殺す直前の状態を示した図である。
【図４Ａ】本発明でトリポリリン酸塩だけ注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延した対照群で骨伸延手術後４週が経過した後の骨硬化程度を放射線検査で測定した図である。
【図４Ｂ】本発明でトリポリリン酸塩だけ注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延した対照群で骨伸延手術後７週が経過した後、骨硬化程度を放射線検査で測定した図である。
【図５Ａ】本発明のキトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）とトリポリリン酸塩を注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延したキトサン群で骨伸延手術後４週が経過した後、骨硬化程度を放射線検査で測定した図である。
【図５Ｂ】本発明のキトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）とトリポリリン酸塩を注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延したキトサン群で骨伸延手術後７週が経過した後、骨硬化程度を放射線検査で測定した図である。
【図６Ａ】本発明のβｉｇ−ｈ３を含有した水溶性キトサンとトリポリリン酸塩を注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延したβｉｇ−ｈ３群で骨伸延手術後４週が経過した後、骨硬化程度を放射線検査で測定した図である。
【図６Ｂ】本発明のβｉｇ−ｈ３を含有した水溶性キトサンとトリポリリン酸塩を注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延したβｉｇ−ｈ３群で骨伸延手術後７週が経過した後、骨硬化程度を放射線検査で測定した図である。
【図７Ａ】本発明のＢＭＰ−４を含有した水溶性キトサンとトリポリリン酸塩を注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延したＢＭＰ−４群で骨伸延手術後４週が経過した後、骨硬化程度を放射線検査で測定した図である。
【図７Ｂ】本発明のＢＭＰ−４を含有した水溶性キトサンとトリポリリン酸塩を注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延したＢＭＰ−４群で骨伸延手術後７週が経過した後、骨硬化程度を放射線検査で測定した図である。
【図８Ａ】本発明のキトサン、βｉｇ−ｈ３を含有した水溶性キトサン、ＢＭＰ−４を含有した水溶性キトサンを注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延した各群で骨伸延手術後４週が経過した後、骨の鉱質濃度（ｍｉｎｅｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）を示したグラフである。
【図８Ｂ】本発明のキトサン、βｉｇ−ｈ３を含有した水溶性キトサン、ＢＭＰ−４を含有した水溶性キトサンを注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延した各群で骨伸延手術後７週が経過した後、骨の鉱質濃度（ｍｉｎｅｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）を示したグラフである。
【図９Ａ】本発明でトリポリリン酸塩だけ注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延した対照群の骨伸延手術４週後の組織学的な断面を示した図である。矢印：最初切断部位。
【図９Ｂ】本発明でトリポリリン酸塩だけ注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延した対照群の骨伸延手術７週後の組織学的な断面を示した図である。矢印：最初切断部位。
【図９Ｃ】本発明でトリポリリン酸塩だけ注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延した対照群の骨伸延手術部位の端部分で新しい骨が形成されていることをヘマトキシリン＆エオジン染色で確認した図である。Ａ：繊維化組織。Ｂ：造骨細胞。
【図１０Ａ】本発明のＢＭＰ−４を含有した水溶性キトサンとトリポリリン酸塩を注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延したＢＭＰ−４群の骨伸延手術４週後の組織学的な断面を示した図である。矢印：最初切断部位。
【図１０Ｂ】本発明のＢＭＰ−４を含有した水溶性キトサンとトリポリリン酸塩を注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延したＢＭＰ−４群の骨伸延手術７週後の組織学的な断面を示した図である。矢印：最初切断部位。
【図１０Ｃ】図１０Ａの組織学的な断面をヘマトキシリン＆エオジンで染色して、伸延された部位の中央が造骨細胞と繊維化組織で満たされていることを確認した図である。
【図１０Ｄ】図１０Ｂの組織学的な断面をヘマトキシリン＆エオジンで染色して、伸延された部位の中央が造骨細胞と繊維化組織で満たされていることを確認した図である。
【図１１Ａ】本発明のβｉｇ−ｈ３を含有した水溶性キトサンとトリポリリン酸塩を注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延したβｉｇ−ｈ３群で骨伸延手術４週後の組織学的な断面を示した図である。矢印：最初切断部位。
【図１１Ｂ】本発明のβｉｇ−ｈ３を含有した水溶性キトサンとトリポリリン酸塩が注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延したβｉｇ−ｈ３群で骨伸延手術７週後の組織学的な断面を示した図である。矢印：最初切断部位。
【図１１Ｃ】図１１Ｂの組織学的な断面をヘマトキシリン＆エオジンで染色して、伸延された部位全般にわたって新生骨が形成されていることを確認した図である。
【図１２Ａ】本発明のキトサンとトリポリリン酸塩を注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延したキトサン群で骨伸延手術４週後の組織学的な断面を示した図である。矢印：最初切断部位。
【図１２Ｂ】本発明のキトサンとトリポリリン酸塩を注射して一日に２．０ｍｍずつ５日間伸延したキトサン群で骨伸延手術７週後の組織学的な断面を示した図である。矢印：最初切断部位。
【図１２Ｃ】図１２Ａの組織学的な断面をヘマトキシリン＆エオジンで染色して、伸延された部位全般にわたって新生骨が形成されていることを確認した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリポリリン酸塩塩（ｔｒｉｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）と水溶性キトサンを含有した骨形成及び骨硬化促進用組成物。
【請求項２】
前記組成物が、骨形成及び骨硬化促進物質をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の骨形成及び骨硬化促進用組成物。
【請求項３】
骨形成及び骨硬化促進物質が、βｉｇ−ｈ３、骨形態発生タンパク質、ＴＧＦ−β、ＦＧＦ、ＩＧＦ−１及びＰＤＧＦからなる群から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の骨形成及び骨硬化促進用組成物。
【請求項４】
トリポリリン酸塩と水溶性キトサンの比率が、２０：８０乃至８０：２０重量％であることを特徴とする、請求項１に記載の骨形成及び骨硬化促進用組成物。
【請求項５】
トリポリリン酸塩と水溶性キトサンの比率が、５０：５０重量％であることを特徴とする、請求項４に記載の骨形成及び骨硬化促進用組成物。
【請求項６】
βｉｇ−ｈ３が、組成物全体に対して１００μｇ／ｍｌ乃至１μｇ／ｍｌの濃度で添加されることを特徴とする、請求項３に記載の骨形成及び骨硬化促進用組成物。
【請求項７】
骨形態発生タンパク質が、組成物全体に対して５０ｎｇ／ｍｌ乃至５００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加されることを特徴とする、請求項３に記載の骨形成及び骨硬化促進用組成物。
【請求項８】
βｉｇ−ｈ３が、組成物全体に対して３００μｇ／ｍｌ乃至６００μｇ／ｍｌの濃度で添加されることを特徴とする、請求項６に記載の骨形成及び骨硬化促進用組成物。
【請求項９】
骨形態発生タンパク質が、組成物全体に対して１００ｎｇ／ｍｌ乃至３００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加されることを特徴とする、請求項７に記載の骨形成及び骨硬化促進用組成物。
【請求項１０】
骨形態発生タンパク質が、ＢＭＰ−４であることを特徴とする、請求項４に記載の骨形成及び骨硬化促進用組成物。
【請求項１】
トリポリリン酸塩塩（ｔｒｉｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）と水溶性キトサンを含有した骨形成及び骨硬化促進用組成物。
【請求項２】
前記組成物が、骨形成及び骨硬化促進物質をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の骨形成及び骨硬化促進用組成物。
【請求項３】
骨形成及び骨硬化促進物質が、βｉｇ−ｈ３、骨形態発生タンパク質、ＴＧＦ−β、ＦＧＦ、ＩＧＦ−１及びＰＤＧＦからなる群から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の骨形成及び骨硬化促進用組成物。
【請求項４】
トリポリリン酸塩と水溶性キトサンの比率が、２０：８０乃至８０：２０重量％であることを特徴とする、請求項１に記載の骨形成及び骨硬化促進用組成物。
【請求項５】
トリポリリン酸塩と水溶性キトサンの比率が、５０：５０重量％であることを特徴とする、請求項４に記載の骨形成及び骨硬化促進用組成物。
【請求項６】
βｉｇ−ｈ３が、組成物全体に対して１００μｇ／ｍｌ乃至１μｇ／ｍｌの濃度で添加されることを特徴とする、請求項３に記載の骨形成及び骨硬化促進用組成物。
【請求項７】
骨形態発生タンパク質が、組成物全体に対して５０ｎｇ／ｍｌ乃至５００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加されることを特徴とする、請求項３に記載の骨形成及び骨硬化促進用組成物。
【請求項８】
βｉｇ−ｈ３が、組成物全体に対して３００μｇ／ｍｌ乃至６００μｇ／ｍｌの濃度で添加されることを特徴とする、請求項６に記載の骨形成及び骨硬化促進用組成物。
【請求項９】
骨形態発生タンパク質が、組成物全体に対して１００ｎｇ／ｍｌ乃至３００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加されることを特徴とする、請求項７に記載の骨形成及び骨硬化促進用組成物。
【請求項１０】
骨形態発生タンパク質が、ＢＭＰ−４であることを特徴とする、請求項４に記載の骨形成及び骨硬化促進用組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【公表番号】特表２００６−５０３６１４（Ｐ２００６−５０３６１４Ａ）
【公表日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５３９５９８（Ｐ２００４−５３９５９８）
【出願日】平成１４年９月３０日（２００２．９．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００２／００１８３７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２８５７８
【国際公開日】平成１６年４月８日（２００４．４．８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り
【出願人】（５０２４１１１５９）リージェン バイオテック インコーポレーテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１４年９月３０日（２００２．９．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００２／００１８３７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２８５７８
【国際公開日】平成１６年４月８日（２００４．４．８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り
【出願人】（５０２４１１１５９）リージェン バイオテック インコーポレーテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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