骨髄細胞の分化
【構成】 骨髄細胞は、試験管内で膵臓ホルモン産生細胞へ分化し、生体内で膵臓を再集合するのを誘導する。これらのインスリン産生細胞を用いて、損傷した膵臓を再生させ、哺乳類内の高血糖を改善させることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連特許）
本出願は、２００２年１０月１８日に出願された米国仮特許出願第６０／４１９，４３４号及び２００３年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６０／４７９，０６６号の利益を主張する。
【０００２】
（連邦政府委託研究に関する宣言）
本発明は、国立衛生研究所 (National Institutes of Health) により付与された助成番号ＤＫ６００１５及びＤＫ５８６１４の下、合衆国政府の支援によってなされた。合衆国政府は、本発明における特定の権利を有する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、概して発生生物学と薬学の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、試験管内及び生体内で、骨髄細胞（ＢＭ）から内分泌ホルモン産生細胞を産生するための方法及び損傷した膵臓を修復するための方法に関する。
【０００４】
（発明の背景）
糖尿病は、米国において罹患及び死亡の主要な原因のうちの1つである。米国におけるこの疾病を治療するための費用は、毎年約９８０億ドルであると推測される。糖尿病の最も一般的な二つの形式は、１型及び２型糖尿病と称される。２型の検体が正常又はほぼ正常のレベルのインシュリンを有するのに対して、１型の検体はほとんど又は全くインシュリンを有しないという点で、１型及び２型糖尿病が識別される。従って、１型糖尿病は、しばしばインシュリン依存型糖尿病と称される。
【０００５】
１型糖尿病は、インシュリンを生産する膵臓ベータ(つまり、膵島)細胞を破壊する自己免疫反応によって特徴づけられる。成人の膵島細胞の増殖能は制限される。膵島細胞置換は、１型及びインシュリン要求２型糖尿病の治療における1つのアプローチを示す。しかし、この治療の可能性は、利用可能なドナー細胞の限定によって制限される。利用可能なドナー組織の不足に加えて、移植組織の免疫系を介した拒絶は移植治療の広範囲の実施にとっての別の主要な妨げとなっている。成人の膵臓における膵島細胞新生の誘導は、糖尿病の治療のための重要な治療法になるだろう。
【発明の開示】
【０００６】
（要約）
本発明は、試験管内における内分泌ホルモン産生細胞への骨髄細胞の分化を誘導するための方法の開発及び骨髄細胞を用いた損傷した膵臓を修復するための方法に関する。これらの開発は、１型糖尿病を治療する方法として、移植の実際の実施と同様に、損傷した膵臓の再生を促進する。なぜならば、（１）内分泌ホルモン産生細胞へ分化した骨髄細胞は、インシュリン産生細胞の源を提供し、（２）自家移植のためのそのような細胞の使用は、移植細胞の拒絶に結びつく免疫系を介した反応を回避するからである。
【０００７】
従って、本発明は、哺乳類（例えば、齧歯動物又はラット)の骨髄細胞が、内分泌ホルモン産生細胞へ分化する方法を特徴とする。この方法は、まずＤＭＳＯを含む低濃度のグルコース（例えば、５．５ｍＭ）培地において骨髄を培養するステップと、次に適当な条件下で、内分泌ホルモン産生細胞への前記細胞の分化を促進するための十分な時間、血清を含む高濃度のグルコース（例えば、２５ｍＭ）培地中で骨髄細胞を培養するステップとを含む。前記細胞によって生産された内分泌ホルモンは、インシュリン、グルカゴン、ソマトスタチンあるいは膵臓ポリペプチドなどの膵臓の内分泌ホルモンになり得る。また、前記方法によって作られた細胞は、本発明の範囲内である。
【０００８】
別の側面では、本発明は、損傷した又は病気の膵臓を再生する／修復するための方法を特徴とする。本発明の方法は、損傷した又は病気の膵臓において、検体（例えば、ラットなどの哺乳動物）へ、少なくとも１個の骨髄細胞を投与するステップを含む。損傷した膵臓は、正常の数の膵島細胞（ベータ細胞）を欠いている糖尿病の膵臓となり、その検体は、糖尿病によって引き起こされた高血糖を備えた検体となる。少なくとも1個の骨髄細胞の投与は、検体におけるインシュリン値を増加させることにより、検体の高血糖を下げる。
【０００９】
本発明の別の側面は、哺乳動物中の高血糖を下げるのに十分な内分泌ホルモン産生細胞の用量を動物に投与することにより、糖尿病を有する哺乳動物において高血糖を改善させる方法である。ホルモン産生細胞は、以下のステップを含む方法に従って作られる：まず、ＤＭＳＯを含んでいる低グルコース培地中で骨髄細胞を培養し、その後、適当な条件下で、内分泌ホルモン産生細胞への前記細胞の分化を促進するための十分な時間、血清を含む高グルコース培地中で骨髄細胞を培養する。
【００１０】
他に定義しなければ、ここで用いる全ての技術用語は、本発明の属する分野の通常の知識を有するものによって理解されるものと同様な意味を有する。
【００１１】
ここで用いる語句「検体」とは、ヒト又はヒトではない動物を意味し、犬、猫、馬、牛、豚、羊、ヤギ、鶏、霊長類、ラット及びマウス等の哺乳動物を含むが、これらに限定されない。
【００１２】
ここで用いる語句「分化」とは、ある細胞の型が別のものに変化することを言う。分化は、例えば、膵臓の内分泌細胞状の表現型を有する細胞への骨髄細胞の変化を含み得る。
【００１３】
語句「骨髄細胞」及び「ＢＭ」とは、胎児から成体までの発生のあらゆる段階で動物の骨髄で見つかるあらゆる細胞を意味する。これは、動物の発生のあらゆる段階で骨髄に存在する骨髄幹細胞を含み得る。
【００１４】
ここで説明することと類似又は同等の方法と物質は、本発明の実施や試験で使用可能であるが、適した方法と物質は以下で説明される。すべての出版物、特許出願、特許、及びここで言及された参考文献は、引用して完全に援用される。抵触の場合は、定義を含む本明細書が法的に規制するであろう。さらに、以下に論じた特定の実施形態は、一実施例であって、これに制限されるものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（詳細な発明）
本発明は、試験管内で骨髄細胞を膵臓細胞へ分化させること、生体内で膵臓を再集合させること、及び生体内で高血糖を下げることを含む方法に関する。本発明では、最初、ＤＭＳＯを含む低グルコース含有培地中で骨髄細胞を培養し、その後、高グルコース含有培地中で前記細胞を培養することによって、骨髄細胞を内分泌ホルモン産生細胞（例えば、インシュリンを分泌する細胞）へ分化させる。この方法は、インシュリン、グルカゴン、ソマトスタチン及び膵臓ポリペプチドを含む膵臓ホルモンを生産することが可能な細胞への骨髄細胞の分化をもたらす。このようにして作られた膵臓の内分泌ホルモン産生細胞を、損傷した膵臓を再生させるための再生可能な細胞源として用いることできる。従って、本発明はまた、(例えば、１型糖尿病を有する患者を治療するため)損傷した膵臓を再生するために用いることができる自己由来のインシュリンを産生する膵島様細胞を生産するための方法を提供する。
【００１６】
以下に記述された好適な実施例は、これらの細胞及び方法の適用を説明する。それにもかかわらず、これらの実施例の記述から、本発明の他の側面を作成し、及び／又は実施することができる。
【００１７】
（試験管内での骨髄細胞の分離、培養及び分化転換）
本発明は、２つのステップの培養過程によって、内分泌ホルモン産生細胞へ分化させることができる骨髄細胞の発見に基づく。第１のステップにおいて、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を含む無血清・低グルコース培地中で骨髄細胞を培養する。第２のステップにおいて、培養した骨髄細胞を血清を含む高グルコース培地中でさらに培養する。
【００１８】
本発明で用いられる骨髄細胞を、従来の技法に従って分離することができる。例えば、以下の実施例の欄で述べているように、屠殺された齧歯動物から取り出され、殺菌された骨（例えば、大腿及び頚骨）から骨髄細胞を得る。いったん骨髄を皮膚と筋肉から取り除き殺菌すると、骨の端を切ることにより、骨髄細胞が露出する。針を挿入し、骨幹を介して適当な培地（例えば、抗生物質溶液が添加されたイスコフ培地）を送り込むことによって、この骨髄細胞を排出する。その後、骨髄細胞をフィルター（例えば、ナイロンメッシュ）に通し、細胞懸濁液を混入する可能性のあるいくつかの骨片を取り除く。この分離された細胞を適当な培地（例えば、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む低グルコース培地）で培養し、接着細胞を取り除き、分離された非接着性骨髄細胞の固体群をもたらす結果となる。
【００１９】
方法の第１のステップは、ＤＭＳＯを含む無血清・低グルコース培地中で、分離した骨髄細胞を培養することを含む。このステップは、内分泌ホルモン産生（例えば、インシュリン分泌）細胞へさらに分化するための前記細胞を準備する。一般的に、約３日間（例えば、１〜５日間）低グルコース培地中で細胞を培養する。以下で述べる本実験では、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を培地として用いたが、本方法の実施に適したあらゆる基本培地を用いてもよい。ＤＭＥＭに加えた基本培地の例として、ＲＰＭＩ、基本培地イーグル（ＢＭＥ）、ハム（Ｈａｍ’ｓ）、最小必須培地イーグル（ＭＥＭ）及びイスコフ改変ＤＭＥＭが挙げられる。
【００２０】
低グルコース中において分離された骨髄細胞を培養することは、内分泌ホルモン産生細胞へのさらなる分化のための骨髄細胞の準備や調整を達成するために重要である。以下の実施例では、低グルコース培地は、５．５ｍＭグルコース及び１％のＤＭＳＯを含む。これらは本発明の実施のため適切な濃度であるが、他のグルコース及びＤＭＳＯ濃度（例えば、約４、４．５、５、６、６．５、又は７ｍＭグルコース及び約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０％のＤＭＳＯ）はまた、細胞を準備するのにおそらく十分であろう。将来用いられる本発明の方法の特定の変化において採用される条件下で異なるグルコースレベルを試験することにより、本発明の方法の第１の培養ステップの実施のための異なるグルコース及びＤＭＳＯの濃度の適合性を、実験的に決定することができる。
【００２１】
方法の第２のステップは、血清を含む高グルコース培地中において、前記骨髄細胞をさらに培養することを含む。このステップは、内分泌ホルモン産生細胞への骨髄細胞の分化を引き起こす。典型的には、細胞が内分泌ホルモンを産生し始める前に、細胞が約７日間（例えば、４〜９日間）高グルコース培地中で細胞を培養する。前記低グルコース培地と同様に、高グルコース培地中で使用される基本培地は、ＤＭＥＭ又はその他の適当な培地であってもよい。内分泌ホルモン産生細胞への骨髄細胞の分化を達成するために適した任意のグルコース濃度を使用してもよい。以下の実施例では、高グルコース培地には２５ｍＭグルコースを含有させた。これは述べられる特定の方法の実施のために適当な濃度であるが、他の高グルコース濃度（例えば、約２０〜３０ｍＭ）でも内分泌ホルモン生産を引き起こしうるであろう。将来用いられる本発明の方法の特定の変化において採用される条件下で異なるグルコースレベルを試験することにより、本発明の方法の第２の培養ステップの実施のための異なるグルコース及びＤＭＳＯの濃度の適合性を、実験的に決定することができる。
【００２２】
高グルコース培地中に血清を含ませることは、内分泌性ホルモンを生産するように細胞を促進させるのに重要である。以下に述べる実施例では、１０％のＦＢＳを用いた。他の血清濃度（例えば、１〜２０％）及び他のタイプの血清（例えば、仔ウシ血清、新生児ウシ血清、成体ウシ血清だけでなく、他の哺乳動物の成体、新生児又は胎児からの血清）は、高グルコース培地中で使用するのに適しているであろう。ここで述べられる方法に従って所定の試験をすることによって、あらゆる特定の割合及びあらゆる特定のタイプの血清の適正を決定してもよい。
【００２３】
（膵臓の内分泌ホルモン及びｍＲＮＡの検出）
骨髄細胞が内分泌ホルモン産生細胞へうまく分化するかどうかを決定するため、１以上の膵臓内分泌ホルモン（例えば、インシュリン（又はプロインシュリン及びプレプロインシュリン等のインシュリンの前駆体）、グルカゴン、膵臓ポリペプチド及びソマトスタチンだけでなく、ホルモンｍＲＮＡ）の発現によって細胞を調べることができる。任意の既知の技術によってホルモン発現を分析してもよい。例えば、抗ホルモン（例えば、抗インシュリン）抗体を用いた免疫沈降及びウェスタンブロッティングのような抗体に基づいた測定法を用いてもよい。生体外で生成されたインシュリンを産生する膵島細胞の機能性を評価するために、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、グルコース刺激に基づくインシュリン放出を測定してもよい。
【００２４】
細胞におけるホルモンのｍＲＮＡ発現を分析するため、ノーザンブロッティング及びＲＴ−ＰＣＲ技法を含む多くの測定法を用いてもよい。例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、サンプル中のインシュリン、グルカゴン、ソマトスタチン及び膵臓ポリペプチドｍＲＮＡを検出するため、当技術分野で知られている多くの任意の手法を用いて、膵臓及び骨髄細胞から全ＲＮＡを最初に分離する。いったん精製すれば、ＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲに供され、ｃＤＮＡを生産する。次いで、適当なプライマーを用いて結果として生じるＰＣＲ産物を増幅し、電気泳動で分離する。その後、多くのシークエンシング・キットのうち任意のもの（例えば、AmpliTaqサイクル・シークエンシング・キット、Perkin-Elmer Setus（Branchburg NJ））を用いて、精製されたＰＣＲ産物を配列決定した。
【００２５】
（損傷した膵臓の再生及びホルモン欠乏の改善）
本発明は、検体における損傷した膵臓を修復するための方法も含む。そのような1つの方法は、損傷した膵臓を有する検体（例えば、未損傷の膵臓より少ない膵島細胞を有する検体）を準備するステップと、少なくとも一つの骨髄細胞を検体（例えば、糖尿病によって生じる高血糖を有する齧歯動物又はヒト等の哺乳動物）へ投入するステップを含む。投与される（例えば、移植される）骨髄細胞を、齧歯動物又はヒト等の哺乳動物から分離してもよい。本発明に関連する方法は、骨髄細胞を単に分離するのではなく、上記のように内分泌ホルモン産生細胞へ分化した骨髄の移植を利用する。これらの方法の好ましい変形例では、免疫系を媒介とした拒絶を回避するために、処置される検体から又は組織適合性のドナーから骨髄細胞を分離する。任意の適当な手法によって、分離した骨髄細胞又は内分泌ホルモン産生細胞を検体へ投与してもよい。適切な細胞移植プロトコルの例を以下に述べる。また、ドナー幹細胞の分離及びその分離した細胞の移植のための手法は当技術分野で知られている。例えば、Sandhu et al., Am. J. Pathol. 159: 1323-1334, 2001、Ianus et al., J. Clin. Invest. 111: 843-850, 2003、Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 8078-8083, 2002、Lumelsky et al., Science 292: 1389-1394, 2001及びSoria et al., Diabetes 49: 157-162, 2000を参照。
【００２６】
宿主動物において、損傷した膵臓を再生するためのドナー由来の骨髄又はホルモン産生細胞の能力を試験するため、宿主動物に存在しないマーカーを有するドナー細胞を宿主動物に移植して、キメラ動物を作成することができる。この異種のマーカーの表現に基づいて、ドナー細胞の存在を検出することができる。そのような方法を使用すると、ドナー細胞に由来する膵臓におけるホルモン産生細胞（例えば、ベータ・インシュリン産生細胞）の割合を評価できる。以下に述べる実施例では、細胞マーカーＤＰＰＩＶを遺伝子導入したドナー及び宿主である齧歯動物を用いて、損傷した膵臓を再生する骨髄細胞の能力を試験した。しかし、あらゆる適当なマーカーを用いてもよい。
【００２７】
処置される動物（つまり、骨髄又は内分泌ホルモン産生細胞を移植した動物）の器官の再生と、コントロールである動物（つまり、骨髄又は内分泌ホルモン産生細胞を移植していない動物）のそれとを（例えば、肉眼的又は組織学的検査によって）単純に比較することによって、ドナー由来の骨髄又はホルモン産生細胞の、宿主動物における損傷した膵臓を再生する能力を調べるための別の方法を実施することができる。
【００２８】
（検体における膵臓疾患の治療）
本発明の特定用途は、膵臓疾患から生じる内分泌ホルモンの欠乏の治療に関する。膵臓疾患を有する検体へ骨髄又はホルモン産生細胞を移植した後、移植した細胞によって分泌されるホルモンを全身に放出して、ホルモンの欠乏を減少させ、又は改善させる。例えば、これらの細胞によるインシュリンの分泌は、糖尿病の検体の高血糖を下げる又は改善することができる。従来の臨床の測定法を利用して、特定のプロトコルの有効性を評価できる。例えば、致死的に放射線を当てられた動物へドナー細胞を移植し、膵臓細胞の再生を測定し、高グルコース負荷に対する動物のインシュリン分泌反応、循環するグルコース・レベルを標準化する能力及びグルコース・ホメオスタシスを維持する能力を決定する。
【００２９】
（細胞の投与）
上記の細胞は、任意の適当な形状で、哺乳動物（例えば、ラット、ヒト）を含む動物に投与（移植）してもよい。例えば、内分泌ホルモン産生細胞を、薬学的に許容されるキャリアー中あるいは生理食塩水又は緩衝塩溶液等の希釈液中で形成してもよい。投与方法と手段及び標準的な薬学的基準に基づいて、適当なキャリアー及び希釈液を選択してもよい。Remington's Phamacetuical Science（当分野における一般的な教科書）及びＵＳＰ／ＮＦで、薬学的な製造と同様に模範的な薬学的に許容可能なキャリアー及び希釈剤の記述を見つけることができる。
【００３０】
従来の任意の手法によって、本発明の細胞を動物に投与してもよい。例えば、内部又は外部の標的部位への注入あるいは外科的送達によって、あるいは血管によって到達できる部位へカテーテルによって、標的部位（例えば、膵臓又は肝臓）に細胞を直接投与してもよい。単一のボーラス、複数の注入又は静脈内連続注入によって、細胞を投与してもよい。
【００３１】
（有効投与量）
好ましくは上記の細胞を哺乳動物に有効量投与する。すなわち、その有効量は治療される検体において望まれる結果（例えば、膵臓細胞を再生する又は検体の高血糖を改善させ糖尿病を治療する）を生産できる量である。医学及び獣医学の技術においてよく知られているように、任意の１固体の動物への投与量は、検体の大きさ、体表面面積、年齢、投与される特定の混合物、投与の時間と方法、通常の健康等を含む多くの要因に依存する。動物検体の大きさに依存して、約１〜１０００ＩＰＣの間のクラスターを、又は約１〜１×１０8の間の内分泌ホルモン産生細胞を動物検体へ投与してもよい。
【００３２】
（実施例）
本発明は、以下の特定の実施例によって、本発明をさらに説明する。実施例は本発明を説明するために用い、任意の方法で発明の範囲又は内容を制限するものとは解釈することができない。
【実施例１】
【００３３】
（骨髄細胞の入手と培養）
ラットの大腿及び頚骨から骨髄細胞を収集した。１０％ＦＢＳを補ったＤＭＥＭ、低グルコース（５．５ｍＭ）（ＧＩＢＣＯ社製 カタログ番号１１８８５−０８４）において骨髄細胞を培養した。６０分間のインキュベーションの後、非接着細胞を収集し、無血清ＤＭＥＭ培地で洗浄した。１％ＤＭＳＯ存在下で３日間、１×１０5／ｃｍ2の細胞密度で、無血清ＤＭＥＭ培地中において細胞を再接種した。そして、高濃度グルコース（２５ｍＭ、高グルコース、ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ社製、カタログ番号１１９９５−０６５）中において１０％のＦＢＳを含む培地で、７日間細胞を培養した。Michalopoulos and Piot, Exp. Cell Res. 94: 70-78 (1975)で述べられた方法によってラットの尾の腱から抽出された、０．３％の１型コラーゲンで覆われた、スライドカバーガラス（２２×２２ｍｍ）上のプラスチックの６ウェルプレートに細胞を播種した。
【００３４】
高グルコース条件下で、７日目に、小さい球状のクラスターが形成し始めた。１０日目の後、球状の細胞クラスターの数と大きさは著しく増加し、強固に組織化された細胞の塊を形成した。単一の領域で多数のクラスターを見ることができた。より高い倍率では、クラスターは、端と構造を形成したようであった。Bonner-Weir et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97: 7999-8004, 2000；Zulewski et al., Diabetes. 50: 521-533, 2001；Ramiya et al., Nat. Med. 6:278-282, 2000；Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99: 8078-8083, 2002で述べられているように、３次元の細胞増殖は形態学的に膵島様クラスターに似ていた。培地中におけるグルコースのレベルは、１０日目の終わりまでに形成されるクラスターの数に重大な影響をもたらした。高グルコース培養条件では、２２×２２ｍｍのカバーガラス毎に１５７．５±３２．９クラスター（ｎ＝８ウェル／３の独立した実験）という平均クラスター値を示した。一方、低グルコース条件では、カバーガラス毎に１７．３±１１．３クラスター（ｎ＝８ウェル／３の独立した実験）を示した。従って、低グルコース条件下におけるクラスターの大きさは、高グルコース条件のそれと比較して顕著に小さかった。
【００３５】
別の培養方法では、3日間１％のＤＭＳＯの存在下、骨髄細胞を培養し、７日間１０％のＦＢＳを補填した、４．５ｇ／Ｌのグルコースを含むＤＭＥＭへ変えた。その後、胎児血清から干渉がなく、インシュリン分泌の検出を可能にするため、培地を無血清培地へ変えた。無血清培地には、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び５．５ｍＭグルコースを補填した。無血清培地において５時間３７℃で骨髄細胞をインキュベートして、無血清培地で２回洗浄した。その後、培地を、高グルコース（例えば、２５ｍＭ）を含む培地と変更し、細胞を２時間３７℃でインキュベートした。培養馴化培地を収集し、−７０℃で凍結させた。
【実施例２】
【００３６】
（生体内におけるドナー細胞の移植測定法）
Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ研究所(Wilmington、MA)から、ドナーであるＤＰＰＩＶ+Ｆ−３４４ラットを購入した。同系交配の正常なオスのＦ−３４４ラットからの骨髄細胞を、致死量の放射線を与えたＤＰＰＩＶ−のオスのＦ−３４４ラットへ移植した。その全量は、137セシウム源からの約８００ｒａｄ（４００ｒａｄの２回）であった。ネンブタール過剰服用（ｌ００ｍｇ／ｋｇ）によって屠殺された正常なオスのＦ−３４４ラットから取り除いた大腿と頚骨から得られた骨髄細胞を得て、７０％エタノール中に浸して殺菌した。骨を皮膚と筋肉から取り除き洗浄した後、骨の端を切ることにより骨髄細胞を露出し、針を挿入し、骨幹を介して抗生物質溶液が添加されたイスコフ培地を送り込むことによって、骨髄細胞を排出させた。骨髄細胞をナイロンメッシュへ通して、細胞懸濁液を混入する可能性のある骨片を取り除いた。約６０×１０6のオスの骨髄細胞を後部静脈注入によって移植した。キメラ系の構築のため３０日間を費やした。キメラ系の構築は、後部静脈出血から得られた血液細胞からのＤＰＰＩＶの免疫組織化学測定法及びＰＣＲ測定法によって評価された。ＤＰＰＩＶを発現する動物だけを、膵臓外傷プロトコル( Field et al., Pro. Soc. Exp. Bio. & Med. 186: 183-187, 1987)で飼育した。6週間の銅の欠乏食の後、動物を再び普通食で飼育した。銅の消耗及び回復期間中の指定された時に組織を得た。麻酔による管理に続いて、２、４、６、８及び１０週でラットから全膵臓をサンプリングした。組織試料の免疫組織化学測定法からの結果について以下の実施例３で述べる。
【実施例３】
【００３７】
（細胞の免疫組織化学）
免疫組織化学法を用いて、移植レシピエント動物における膵臓組織からサンプリングした細胞中のＤＰＰＩＶ、膵臓ポリペプチド、ソマトスタチン、グルカゴン及びインシュリンの発現を評価した。アセトン・エタノール（１：９９、ｖｏｌ／ｖｏｌ）中で５分間−２０℃で固定し、９５％のエタノールで４℃５分間洗浄した後、ＤＰＰＩＶ基質と凍結切片とインキュベーションすることを含む、Lojdoら(Sb Lek. 81: 200-7, 1979)によって述べられた細胞化学の方法を用いてＤＰＰＩＶ活性を検出した。スライドを室温で空気乾燥させた。基質溶液は、１５０μｌのジメチルホルムアミド中の２．５ｍｇのｇｌｙ−ｐｒｏ−４−メトキシ−ベータ−ナフチルアミド（ＧＰＭＮ）と、５ｍｌのＴＭＳ緩衝液（０．１Ｍのトリス マレアトール（ｍａｌｅａｔｏｌ）、０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５）中の５ｍｇのＦａｓｔ Ｂｌｕｅ ＢＢ塩との調整溶液である。２つの溶液は使用の直前に混合し、フィルターに通した。スライドを基質溶液中で１０〜２０分間３７℃でインキュベートした。スライドをＴＭＳ緩衝液で２回洗浄し、２分間０．１ＭＣｕＳＯ4中でインキュベートした。スライドをＴＭＳ緩衝液で再度洗浄して、ヘマトキシリンですぐに対比染色した。さらに、凍結切片をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド上で１５分間室温で固定し、ＰＢＳ中の５％スキムミルク（ブロッキング仲介物）で１時間処理した。
【００３８】
ＤＰＰＩＶ−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）及びインシュリン−テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）をマーカーとして用いて、移植及び銅の欠乏食後の膵臓組織の免疫蛍光染色を実施した。未処理のＤＰＰＩＶ＋ラットの肝臓及び膵臓をコントロールとして調べた。未処理のＤＰＰＩＶ欠乏膵臓からのインシュリン細胞は、ＤＰＰＩＶ＋ではなかった。未処理のＤＰＰＩＶ欠乏膵臓又は未処理のＤＰＰＩＶ欠乏肝臓の両方ともにＤＰＰＩＶによる染色がなかった。しかし、ベータ細胞はインシュリンに対して陽性染色を示した。致死量の放射線をオスのラットに当てた後、オスの動物からの骨髄移植で救われた。そして、移植されたオスのラットを、6週間の銅の欠乏食のプロトコルで飼育した後、普通食に戻した。移植及び銅の欠乏食のプロトコル（６週間）の後、膵臓におけるインシュリン及びＤＰＰＩＶの免疫組織化学的局在を分析した。ＤＰＰＩＶ−ＦＩＴＣ及びインシュリン−Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄという２つのマーカーを使用した。（Ａ）インシュリン抗体との膵臓の免疫蛍光染色、（Ｂ）ＤＰＰＩＶ抗体との膵臓の免疫蛍光染色、（Ｃ）インシュリンを共発現する細胞におけるＤＰＰＩＶ発現の合成イメージングからなる。図１は、骨髄を移植した動物の膵臓におけるＤＰＰＩＶ細胞の発現を示す。ＤＰＰＩＶ発現細胞を膵臓組織で２、４、６、８及び１０週間で測定した。骨髄移植されたＤＰＰＩＶが欠乏したオスの各々において、６０切片を凍結膵臓から切り取り、染色し、ＤＰＰＩＶ陽性細胞の全数を計測した。白いバーは全ＤＰＰＩＶ発現細胞を示すのに対して、黒いバーはランゲルハンス島中のＤＰＰＩＶ発現細胞を示す。ＤＰＰＩＶ陽性であるランゲルハンス島細胞／全細胞の割合を数字で示す。
【００３９】
また、免疫組織化学の手法を用いて、試験管内で培養した骨髄細胞におけるインシュリンの発現を評価した。生体内で膵臓系へ分化した骨髄細胞におけるインシュリンの免疫組織化学的局在を分析した。１０日後、（ａ）コントロールの骨髄細胞及び（ｂ）１％ＤＭＳＯ中で培養した骨髄細胞の、インシュリンとの免疫組織化学的局在及び核染色を実施した。コントロールの骨髄細胞と異なり、１％ＤＭＳＯ中で培養された細胞は球状のクラスターを形成し、インシュリンに関して陽性に染色された。
【実施例４】
【００４０】
（膵臓遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ及びノーザンブロット分析）
骨髄細胞培養物が内分泌ホルモン産生細胞へ分化したかどうかを決定するため、ＲＴ−ＰＣＲを用いて内分泌細胞ホルモンの遺伝子発現を測定した。インシュリン、グルカゴン、ソマトスタチン及び膵臓ポリペプチドのｍＲＮＡを検出するため、骨髄細胞を１％ＤＭＳＯ／ＤＭＥＭ低グルコース（５．５ｍＭ）培地で（３日）処理し、１０％ＦＢＳを有するＤＭＥＭ高グルコース（７日及び１０日）で処理し、又は骨髄細胞を培養しないで、成体ラットの膵臓からＲＮｅａｓｙキット（Ｑｕｉａｇｅｎ社製、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて全ＲＮＡを分離した。前述のように、ＲＴ−ＰＣＲを行った (Oh et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 279: 500-504, 2000)。２μｇのＲＮＡをｃＤＮＡ合成のために用いた。得られるＲＴ産物を以下の条件下で増殖させた：９４℃で４分間後、９４℃で１分間、６０℃で１分間及び７２℃で２分間の３０サイクル、そして７２℃で４分間の最後のサイクル。
【００４１】
インシュリンＩプライマーは５０７ｂｐ産物を生成した。インシュリンＩＩプライマーは５０９ｂｐ産物を生成した。グルカゴンプライマーは６５０ｂｐ産物又は２６９ｂｐ産物を生成した。ソマトスタチンプライマーは４５６ｂｐ産物又は３０１ｂｐ産物を生成した。膵臓ポリペプチドプライマーは５８７ｂｐ産物を生成した。グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プライマーは５８０ｂｐ産物を生成した。増幅された産物は１．５％のアガロースゲル中で電気泳動を実施し、エチジウムブロマイドで染色した。ＡｍｐｌｉＴａｑサイクルシークエンシングキット(Perkin-Elmer Setus社製, Branchburg, NJ)を用いて、生成したＰＣＲ産物を直接配列決定した。
【００４２】
分化した幹細胞は、インシュリン、グルカゴン、ソマトスタチン及び膵臓ポリペプチドを発現した。これらの結果は、系統が限定されない形で、主要な成体骨髄幹細胞を分化させることができることを示した。新たに分離した骨髄細胞においては、内分泌性膵臓のｍＲＮＡは検出されなかった。ＲＴ−ＰＣＲにより、１％ＤＭＳＯで処理された骨髄細胞培養物において、これらの遺伝子のいくつかが発現することがわかった。インシュリンＩ、インシュリンＩＩ、グルカゴン、ソマトスタチン及び膵臓ポリペプチドｍＲＮＡを培養の最初の3日間で検知した。また、７日間及び１０日間１０％ＦＢＳを有する高グルコースＤＭＥＭでさらに培養すると、これらのｍＲＮＡが発現することがわかった。配列決定によってＰＣＲ産物をさらに分析し、遺伝子バンクで比較してデータを確認した。
【００４３】
別のＲＴ−ＰＣＲ実験で、ＲＴ−ＰＣＲを実施し、前述のようにＲＴ−ＰＣＲを実施した(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:8078-8083, 2002)。Yangらによって述べられたラット膵臓分泌遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:8078-8083, 2002)を用いた。ＲＴ−ＰＣＲのデータにより、骨髄由来細胞の分化の初期において転写因子、ＰＤＸ−１、ＮＫＸ２．２及びＮＫＸ６．１が発現すること、細胞が成熟するにつれて、これらの転写因子が下方制御されることがわかった。グルカゴン、インシュリン、ソマトスタチン及び膵臓ポリペプチドの生産の原因遺伝子のような成熟した内分泌性遺伝子が、後の分化過程で発現された。遺伝的確認のため、精製したＰＣＲ産物を直接配列決定した。ＤＭＳＯで促進された骨髄由来細胞は、成熟膵臓細胞と関連した遺伝子をいくつか発現した。これらの結果は、骨髄由来細胞は、膵臓へさらに分化できる膵臓前駆細胞を含むことを示唆している。
【００４４】
インシュリンのｍＲＮＡが分化した骨髄由来細胞に存在するか否かを確かめるため、高グルコースで培養された骨髄由来細胞からのＲＮＡを用いて、ノーザンブロット解析を実施した。ＩＮＳ−１細胞からのＲＮＡをポジティブコントロール(Hohmeier et al., Diabetes 49: 423-30, 2000)、正常肝臓からのＲＮＡをネガティブコントール、培養されていない全骨髄細胞を比較として用いた。高グルコースで培養した骨髄由来細胞はインシュリンｍＲＮＡの発現を示したが、培養しなかった全骨髄細胞は示さなかった。
【実施例５】
【００４５】
（免疫沈降（ウエスタンブロット及びＥＬＩＳＡ）によるインシュリンの含量と分泌の測定）
実施例４で述べられたインシュリン、膵臓ポリペプチド及びＧＡＰＤＨのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、インシュリン、グルカゴン、ソマトスタチン及び膵臓ポリペプチドｍＲＮＡの検出を実施した。１％ＤＭＳＯの存在下で、骨髄細胞を３日間培養し、１０％ＦＢＳを有する４．５ｇ／ＬグルコースのＤＭＥＭに７日間交換した。その後、胎児血清からの阻害なしにインシュリン分泌を検出できるようにするため、培地を無血清培地へ変更した。この無血清培地を０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び５．５ｍＭグルコースで補填した。無血清培地で５時間３７℃で骨髄細胞をインキュベートし、無血清培地で２度洗浄した。そして、培地を高グルコース（２５ｍＭ）を含む培地に２時間交換し、３７℃で細胞をインキュベートした。培養馴化培地を収集し、−７０℃で凍結させた。そして、溶解緩衝液でインシュリンを抽出し、Yangらにより述べられたウサギポリクローナル抗インシュリン抗体(Santa Cruz社製, Santa Cruz, CA)を用いた免疫沈降及びウェスタンブロッティング（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:8078-8083, 2002）によって、インシュリンを検出した。免疫沈降の後、１８％ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって沈降物を分析し、ナイロンメンブレンに転写し、抗インシュリン抗体でブロットした。コントロールのサンプルは正常のウサギ血清及び０．５％ＢＳＡを含む培養培地から構成した。化学発光によってインシュリンを視覚化した。
【００４６】
免疫沈降及びウェスタンブロット解析により、分化した骨髄由来細胞（ＢＭＤ）、又はインシュリン産生細胞（ＩＰＣ）クラスターが、グルコース負荷試験の間、検出できる量のインシュリンを合成し、蓄積することがわかった。グルコース負荷試験の間、ＩＰＣクラスターの細胞溶解物はインシュリンの前駆体形を含むが、培地は活性のある二本鎖状のインシュリンを含むことが示された。培地へのインシュリン分泌量を決定するため、１−２−３超感受性ラットインシュリンＥＬＩＳＡキット(ALPCO社製 Diagnostics)を用いて、条件培地上でＥＬＩＳＡを実施した。ＢＭＤとＩＰＣクラスター（実験毎に約９０）を２５ｍＭグルコースで２時間調べた。Ｈ９−２（８３クラスター）及びＨ８−２（９４クラスター）の両方とも培地へのインシュリンの分泌を示した（各々１７７．８ｎｇ／ｍＬ及び１９６．０ｎｇ／ｍＬ）。低グルコース条件及び培地のみにさらされたＩＰＣクラスターは、測定においてインシュリンに反応を示さなかった。この結果は、グルコース負荷試験にさらされると、骨髄由来細胞が活性インシュリンを生産する内分泌様細胞へ分化できることを示す上で有用である。
【実施例６】
【００４７】
（ＢＭＤクラスター及びＩＰＣの超微細構造分析）
ＢＭＤクラスターの免疫蛍光分析を実施した。Ohら(Biochem. Biophys. Res.Commun. 279: 500-504, 2000)による細胞化学の方法を用いて、免疫活性を検出した。ラット尾部コラーゲン（ＲＴＣ）で無菌の顕微鏡カバーグラスを覆い、６ウェル組織培養プレートに置いた。培養約１０日目で球状のコロニーが形成されるまで分化した骨髄由来細胞を成長させた。クラスターを慎重に選択し、−７０℃で最適切断化合物（ＯＣＴ）中で凍結させ、６μｍの切片をＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔＰｌｕｓスライド上へ置いた。凍結切片を４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ溶液で室温で１５分間固定させた。その後、ＴＢＳ−Ｃａ（Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、５０ｍＭ ＣａＣｌ2.Ｈ2、１ｍＭのＮａＣｌ）ブロッキング溶媒中の５％スキムミルクでスライドを１時間処理した。そして、マウス抗ラットＤＰＰＩＶ(BD Pharmingen社製, San Diego, CA)、ウサギ抗ラットインシュリン(Santa Cruz Biotechnology社製, Santa Cruz, CA)、ウサギ抗ラット膵臓ポリペプチド(Dako社製, Cambridge, MA)、ヤギ抗ラットソマトスタチン(Santa Cruz Biotechnology社製, Santa Cruz, CA)、ヤギ抗ラットグルカゴン(Santa Cruz Biotechnology社製, Santa Cruz, CA)又は抗ラットCペプチド(Linco Research社製, St. Charles, MO)等の一次抗体と組織を４℃で一晩中、反応させた。なお、この一次抗体はブロッキング溶液を用いて１：１００に希釈されたものである。ＰＢＳで組織を洗浄後、テキサスーレッド結合抗ヤギ／ウサギＩｇＧ抗体、ＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ抗体（ブロッキング溶液を用いて１：１００に希釈、Vecter Labs, Burlingame, CA）といった二次抗体と、及び核染色のためのＤＡＰＩ(Vecter Labs, Burlingame, CA)と、組織を４℃で３時間インキュベートした。その後、蛍光顕微鏡下で組織を観察した。
【００４８】
培養をしていない骨髄由来細胞はインシュリンを発現しなかった。しかし、骨髄由来細胞クラスターは、一般的にはランゲルハンス島の細胞中で発現される、インシュリン、ソマトスタチン及び膵臓ポリペプチドの細胞質タンパク質を発現した。骨髄由来細胞クラスターの全細胞集団の約８０％は、インシュリン陽性細胞に相当する。骨髄由来クラスターの免疫組織化学により、観察されたインシュリン陽性の細胞の数は、ソマトスタチン又は膵臓ポリペプチドのいずれかを発現する細胞の数より相当多いことがわかった。
【００４９】
Ｃペプチドの発現を評価し、原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）でのハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を通してインシュリンのｍＲＮＡを調べるため、低温保持装置の切片（６μｍの厚さ）を４％パラホルムアルデヒド中で１５分間固定した。８０℃で５分間変性させた後、ラットインシュリン・ジゴキシゲニンで標識されたＤＮＡプローブ(Roche社製, Basel, Switzerland)を５２℃で切片へ適用した。その後、切片をカバースライド上に置き、ゴム糊で密封し、水和したスライドボックス中で一晩中５２℃でインキュベートした。あらかじめ熱した２×ＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．０）中で６５℃でカバーガラスを取り除いた。５分間（室温）であらかじめ熱した５×ＳＳＣ緩衝液中の５０％ホルムアルデヒドで切片を２回洗浄し、６５℃で５分間あらかじめ熱した０．１×ＳＳＣ緩衝液で２回洗浄した。ＮＢＴとＢＣＩＰ（Roche社製, Basel, Switzerland）を含む１００ｍＭトリス緩衝液（１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＭｇＣｌ2、ｐＨ９．５）中で室温で発色させた。切片を核ファストレッド（Vecter Labs, Burlingame, CA）と対比染色した後、Ｃｙｔｏｓｅａｌ(Richard-Allan Scientific社製, Kalamazoo, MI)中でマウントした。
【００５０】
クラスターの間でＣペプチド染色に陽性である細胞を確認した。高倍率顕微鏡写真により、報告されているベータ細胞染色と同様である明瞭なパターンの陽性染色が明らかになった。ＩＮＳ−１細胞及び膵臓組織と比較した時、同様の染色パターン及び発現レベルを観察した。Ｃペプチド染色に加えて、インシュリンｍＲＮＡ発現に関するＩＰＣの凍結切片上のＩＳＨを行った。ジゴキシゲニンで標識したインシュリン１オリゴヌクレオチドプローブを用いて、骨髄由来細胞クラスターの細胞質中のインシュリンｍＲＮＡを染色検出で観察した。そして、対比染色として核ファストレッドで青の陽性のシグナルを与えた。陽性の青色のシグナルは核周囲で観察され、細胞の細胞質の全体にわたって発せられた。この結果は、骨髄由来細胞はランゲルハンス島内で見出された細胞へ分化する潜在能力を有すことを示す。
【実施例７】
【００５１】
（インシュリン産生細胞（ＩＰＣ）移植及び生理学的試験）
ＳＴＺ誘導糖尿病ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスモデルを用いて、骨髄由来細胞の膵島様細胞クラスターが高血糖を改善する能力を生体内で調べた。低用量のＳＴＺを用いて、多数の処置を通して、ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスを糖尿病状態へ化学的に誘導した。糖尿病状態へ誘導した後、２日毎に標準血糖測定器（Ｏｎｅ ｔｏｕｃｈ Ｐｒｏｆｉｌｅ、糖尿病追跡システム、Johnson & Johnson Com., Milpitas, CA）を用いて血糖値を決定した。
【００５２】
５日間一日に一度４０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシン（ＳＴＺ）の腹膜腔内注射を利用して、１０週齢のオスＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスにおいて糖尿病を引き起こした。各注射のため、０．１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐH４．５）に溶解することによってＳＴＺを準備する。安定した高血糖（標準血糖測定器を用いて決定されるような血糖値３００〜６００ｍｇ／ｄＬ）は、最後のＳＴＺ注射の５〜６日後に明らかになった。マウスは１５０の厳選されたＩＰＣを（全身麻酔の下で）移植されるか、又はマウスは右の腎臓被膜下領域中に食塩水の偽の移植を受けた。約１５０のＢＭＤＩＰＣクラスターを９個体の糖尿病マウスの腎臓被膜下領域へ移植した。
【００５３】
移植を受けたマウスは、２〜３日以内に標準化された血糖値を示し始めた。移植約１７日後、移植片を取り除くため、９個体のマウスのうちの６個体が腎臓摘出術を受けた。図２で示されるように、移植後、２日毎に血糖値をモニターし、再び腎臓摘出術を受けた。移植を受けていない又は培養していない骨髄細胞を移植した動物は高血糖のままであり、ＳＴＺ処置後１５日以上生存しなかった。これは、ＳＴＺが膵臓のベータ細胞を破壊し、糖尿病でマウスを死なせてしまうという順序を示唆している。移植を受けた動物は、移植の２日以内にグルコースのレベルをほとんど正常まで下げることができた。移植クラスターがグルコースレベルの正常化の原因であるかどうかを決定するため、ＩＰＣを移植したマウスは２つのグループに分けられた。１つのグループは移植片を維持した。一方、もう１つの移植されたマウスのグループは腎臓摘出術を行い、移植された細胞を戻し、正常血糖の回復を試験した。１７日後、移植片を置いた腎臓を取り出し、さらに試験をするためＯＣＴ中で凍結させた。移植片を除かれたマウスは高血糖になり、その後すぐに死んだ。移植したＩＰＣクラスターを維持した動物は、研究の残りの期間、ほとんど正常のグルコースレベルを維持することができ、１個体の動物はＳＴＺ処置後の９０日まで生存した。これは、クラスターが完全に膵臓の機能をする内分泌細胞へ成熟する可能性を有することを示唆している。移植を受けない又は非培養の骨髄細胞を受けたコントロールである動物は、持続性の高血糖を示し、その後、最終的に死んだ。
【００５４】
従来の実施例３と６で述べたように、従来のヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色、免疫組織化学ならびにインシュリン及びインシュリンｍＲＮＡに関するＩＳＨによって、移植された細胞を受けて、取り除かれた腎臓をさらに調べた。Ｈ＆Ｅ染色に見られるように、移植された細胞は生存可能で、クラスターの形成を維持したが、それら自身を腎臓へ組み入れなかった。Ｈ＆Ｅ染色により、細胞が、外観において、成人の膵臓で見られる成熟した膵島構造に典型的な立方形になったことが明らかになった。免疫組織化学とＩＳＨによって、腎臓被膜の下でインシュリン陽性細胞を観察した。インシュリンｍＲＮＡの発現を検出するために、ジゴキシゲニン標識ＤＮＡプローブを用いた。移植された細胞は、インシュリンｍＲＮＡの発現に対し陽性であった。ネガティブコントロールである移植されていない肝臓組織をＩＳＨのために用いた。このネガティブコントロールは、切片の全体にわたって陽性のシグナルを示さなかった。この結果は、骨髄由来細胞クラスターが、生体内でインシュリンを分泌する能力を保持し、糖尿病のマウスにおける高血糖値に反応して機能したことを裏付ける。
【実施例８】
【００５５】
（ＩＰＣクラスターの超微細構造分析）
超微細構造レベルでＩＰＣクラスターを調べた。これらの細胞の超微細構造の性質を特徴付けるため、１０日目のＩＰＣの電子顕微鏡観察を行った。ＩＰＣ球状体を固定し（０．１Ｍカコジル酸緩衝液中の０．１％グルタルアルデヒド／２％ホルムアルデヒド）、０．１Ｍのカコジル酸緩衝液に移し、埋め込んだ。超薄切片を、１０％のＨ2０2で処置し、０．９％のＮａＣｌで洗浄し、３％のＢＳＡでブロッキングをし、０．５％のＢＳＡ（ウサギ抗ラット・インシュリン、Santa Cruz社製）で補填したＰＢＳ中の一次抗体と一晩中インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、ヤギ血清で再ブロッキングした。金標識二次抗体（１５ｎｍの金の粒子、ヤギ抗ウサギ、Amersham Pharmacia)で一次抗体の結合の視覚化を行い、その後、電子顕微鏡のために切片の対比染色をした。
【００５６】
分化細胞は、粗面小胞体、ゴルジ複合体、少数の大きな液胞及び密顆粒を含有する分泌小胞を含む分泌細胞に典型的な構造を示した。分泌顆粒は、分化細胞の細胞質内に濃厚に密集した。成熟したベータ細胞の別の特性として報告されている、細胞膜に沿った微絨毛を見ることができた。骨髄由来のＩＰＣクラスター中で見られる多くの顆粒は青白く、結晶類似の特性を有していた。免疫金電子顕微鏡は、骨髄由来のＩＰＣクラスターの小分泌小胞内の顆粒にインシュリンが格納されていることを示した。金標識により、細胞の頂極で、綿状の低密度物質及び高電子密度核を有するいくつかの顆粒で満たされた、異なるサイズのかすかな球状の構造が検出された。核の中で又は細胞の他の場所で非特異性の標識化を観察しなかった。成体ベータ細胞で典型的に見られる超微細構造の特性がこれらのＩＰＣクラスターで見つかるという事実は、これらの細胞は培地中でインシュリンを産出できるベータ細胞状へ確かに分化していたことを示している。
【００５７】
（他の実施形態）
本発明の詳細な説明とともに本発明は記述されている一方、前述の説明は説明することを意図しており、本発明の範囲を限定することを意図していないのを理解するべきである。本発明の範囲は添付された特許請求の範囲の範囲によって定義される。他の側面、利点及び変更は次に述べる特許請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１は、膵臓におけるＤＰＰＩＶ細胞の発現を示すグラフである。ＤＰＰＩＶ発現細胞は、膵臓組織において、２，４，６，８，及び１０週目に数えた。白いバーは全ＤＰＰＩＶ発現細胞を示し、黒いバーはランゲルハンス島におけるＤＰＰＩＶ発現細胞を示す。ＤＰＰＩＶ陽性であるランゲルハンス島細胞／全細胞の割合として数を示す。
【図２】図２は、化学的に誘導された糖尿病マウスに移植後のＩＰＣ血糖値の経時変化を示すグラフである。グラフには、コントロールであるＳＴＺ処置マウス（非移植細胞；ｎ＝１０）、又は非培養骨髄細胞（骨髄細胞のみ；ｎ＝３）、及びインシュリン産生クラスターを誘導した約１５０のＢＭが移植されたマウス（ｎ＝９）を示す。
【技術分野】
【０００１】
（関連特許）
本出願は、２００２年１０月１８日に出願された米国仮特許出願第６０／４１９，４３４号及び２００３年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６０／４７９，０６６号の利益を主張する。
【０００２】
（連邦政府委託研究に関する宣言）
本発明は、国立衛生研究所 (National Institutes of Health) により付与された助成番号ＤＫ６００１５及びＤＫ５８６１４の下、合衆国政府の支援によってなされた。合衆国政府は、本発明における特定の権利を有する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、概して発生生物学と薬学の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、試験管内及び生体内で、骨髄細胞（ＢＭ）から内分泌ホルモン産生細胞を産生するための方法及び損傷した膵臓を修復するための方法に関する。
【０００４】
（発明の背景）
糖尿病は、米国において罹患及び死亡の主要な原因のうちの1つである。米国におけるこの疾病を治療するための費用は、毎年約９８０億ドルであると推測される。糖尿病の最も一般的な二つの形式は、１型及び２型糖尿病と称される。２型の検体が正常又はほぼ正常のレベルのインシュリンを有するのに対して、１型の検体はほとんど又は全くインシュリンを有しないという点で、１型及び２型糖尿病が識別される。従って、１型糖尿病は、しばしばインシュリン依存型糖尿病と称される。
【０００５】
１型糖尿病は、インシュリンを生産する膵臓ベータ(つまり、膵島)細胞を破壊する自己免疫反応によって特徴づけられる。成人の膵島細胞の増殖能は制限される。膵島細胞置換は、１型及びインシュリン要求２型糖尿病の治療における1つのアプローチを示す。しかし、この治療の可能性は、利用可能なドナー細胞の限定によって制限される。利用可能なドナー組織の不足に加えて、移植組織の免疫系を介した拒絶は移植治療の広範囲の実施にとっての別の主要な妨げとなっている。成人の膵臓における膵島細胞新生の誘導は、糖尿病の治療のための重要な治療法になるだろう。
【発明の開示】
【０００６】
（要約）
本発明は、試験管内における内分泌ホルモン産生細胞への骨髄細胞の分化を誘導するための方法の開発及び骨髄細胞を用いた損傷した膵臓を修復するための方法に関する。これらの開発は、１型糖尿病を治療する方法として、移植の実際の実施と同様に、損傷した膵臓の再生を促進する。なぜならば、（１）内分泌ホルモン産生細胞へ分化した骨髄細胞は、インシュリン産生細胞の源を提供し、（２）自家移植のためのそのような細胞の使用は、移植細胞の拒絶に結びつく免疫系を介した反応を回避するからである。
【０００７】
従って、本発明は、哺乳類（例えば、齧歯動物又はラット)の骨髄細胞が、内分泌ホルモン産生細胞へ分化する方法を特徴とする。この方法は、まずＤＭＳＯを含む低濃度のグルコース（例えば、５．５ｍＭ）培地において骨髄を培養するステップと、次に適当な条件下で、内分泌ホルモン産生細胞への前記細胞の分化を促進するための十分な時間、血清を含む高濃度のグルコース（例えば、２５ｍＭ）培地中で骨髄細胞を培養するステップとを含む。前記細胞によって生産された内分泌ホルモンは、インシュリン、グルカゴン、ソマトスタチンあるいは膵臓ポリペプチドなどの膵臓の内分泌ホルモンになり得る。また、前記方法によって作られた細胞は、本発明の範囲内である。
【０００８】
別の側面では、本発明は、損傷した又は病気の膵臓を再生する／修復するための方法を特徴とする。本発明の方法は、損傷した又は病気の膵臓において、検体（例えば、ラットなどの哺乳動物）へ、少なくとも１個の骨髄細胞を投与するステップを含む。損傷した膵臓は、正常の数の膵島細胞（ベータ細胞）を欠いている糖尿病の膵臓となり、その検体は、糖尿病によって引き起こされた高血糖を備えた検体となる。少なくとも1個の骨髄細胞の投与は、検体におけるインシュリン値を増加させることにより、検体の高血糖を下げる。
【０００９】
本発明の別の側面は、哺乳動物中の高血糖を下げるのに十分な内分泌ホルモン産生細胞の用量を動物に投与することにより、糖尿病を有する哺乳動物において高血糖を改善させる方法である。ホルモン産生細胞は、以下のステップを含む方法に従って作られる：まず、ＤＭＳＯを含んでいる低グルコース培地中で骨髄細胞を培養し、その後、適当な条件下で、内分泌ホルモン産生細胞への前記細胞の分化を促進するための十分な時間、血清を含む高グルコース培地中で骨髄細胞を培養する。
【００１０】
他に定義しなければ、ここで用いる全ての技術用語は、本発明の属する分野の通常の知識を有するものによって理解されるものと同様な意味を有する。
【００１１】
ここで用いる語句「検体」とは、ヒト又はヒトではない動物を意味し、犬、猫、馬、牛、豚、羊、ヤギ、鶏、霊長類、ラット及びマウス等の哺乳動物を含むが、これらに限定されない。
【００１２】
ここで用いる語句「分化」とは、ある細胞の型が別のものに変化することを言う。分化は、例えば、膵臓の内分泌細胞状の表現型を有する細胞への骨髄細胞の変化を含み得る。
【００１３】
語句「骨髄細胞」及び「ＢＭ」とは、胎児から成体までの発生のあらゆる段階で動物の骨髄で見つかるあらゆる細胞を意味する。これは、動物の発生のあらゆる段階で骨髄に存在する骨髄幹細胞を含み得る。
【００１４】
ここで説明することと類似又は同等の方法と物質は、本発明の実施や試験で使用可能であるが、適した方法と物質は以下で説明される。すべての出版物、特許出願、特許、及びここで言及された参考文献は、引用して完全に援用される。抵触の場合は、定義を含む本明細書が法的に規制するであろう。さらに、以下に論じた特定の実施形態は、一実施例であって、これに制限されるものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（詳細な発明）
本発明は、試験管内で骨髄細胞を膵臓細胞へ分化させること、生体内で膵臓を再集合させること、及び生体内で高血糖を下げることを含む方法に関する。本発明では、最初、ＤＭＳＯを含む低グルコース含有培地中で骨髄細胞を培養し、その後、高グルコース含有培地中で前記細胞を培養することによって、骨髄細胞を内分泌ホルモン産生細胞（例えば、インシュリンを分泌する細胞）へ分化させる。この方法は、インシュリン、グルカゴン、ソマトスタチン及び膵臓ポリペプチドを含む膵臓ホルモンを生産することが可能な細胞への骨髄細胞の分化をもたらす。このようにして作られた膵臓の内分泌ホルモン産生細胞を、損傷した膵臓を再生させるための再生可能な細胞源として用いることできる。従って、本発明はまた、(例えば、１型糖尿病を有する患者を治療するため)損傷した膵臓を再生するために用いることができる自己由来のインシュリンを産生する膵島様細胞を生産するための方法を提供する。
【００１６】
以下に記述された好適な実施例は、これらの細胞及び方法の適用を説明する。それにもかかわらず、これらの実施例の記述から、本発明の他の側面を作成し、及び／又は実施することができる。
【００１７】
（試験管内での骨髄細胞の分離、培養及び分化転換）
本発明は、２つのステップの培養過程によって、内分泌ホルモン産生細胞へ分化させることができる骨髄細胞の発見に基づく。第１のステップにおいて、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を含む無血清・低グルコース培地中で骨髄細胞を培養する。第２のステップにおいて、培養した骨髄細胞を血清を含む高グルコース培地中でさらに培養する。
【００１８】
本発明で用いられる骨髄細胞を、従来の技法に従って分離することができる。例えば、以下の実施例の欄で述べているように、屠殺された齧歯動物から取り出され、殺菌された骨（例えば、大腿及び頚骨）から骨髄細胞を得る。いったん骨髄を皮膚と筋肉から取り除き殺菌すると、骨の端を切ることにより、骨髄細胞が露出する。針を挿入し、骨幹を介して適当な培地（例えば、抗生物質溶液が添加されたイスコフ培地）を送り込むことによって、この骨髄細胞を排出する。その後、骨髄細胞をフィルター（例えば、ナイロンメッシュ）に通し、細胞懸濁液を混入する可能性のあるいくつかの骨片を取り除く。この分離された細胞を適当な培地（例えば、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む低グルコース培地）で培養し、接着細胞を取り除き、分離された非接着性骨髄細胞の固体群をもたらす結果となる。
【００１９】
方法の第１のステップは、ＤＭＳＯを含む無血清・低グルコース培地中で、分離した骨髄細胞を培養することを含む。このステップは、内分泌ホルモン産生（例えば、インシュリン分泌）細胞へさらに分化するための前記細胞を準備する。一般的に、約３日間（例えば、１〜５日間）低グルコース培地中で細胞を培養する。以下で述べる本実験では、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を培地として用いたが、本方法の実施に適したあらゆる基本培地を用いてもよい。ＤＭＥＭに加えた基本培地の例として、ＲＰＭＩ、基本培地イーグル（ＢＭＥ）、ハム（Ｈａｍ’ｓ）、最小必須培地イーグル（ＭＥＭ）及びイスコフ改変ＤＭＥＭが挙げられる。
【００２０】
低グルコース中において分離された骨髄細胞を培養することは、内分泌ホルモン産生細胞へのさらなる分化のための骨髄細胞の準備や調整を達成するために重要である。以下の実施例では、低グルコース培地は、５．５ｍＭグルコース及び１％のＤＭＳＯを含む。これらは本発明の実施のため適切な濃度であるが、他のグルコース及びＤＭＳＯ濃度（例えば、約４、４．５、５、６、６．５、又は７ｍＭグルコース及び約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０％のＤＭＳＯ）はまた、細胞を準備するのにおそらく十分であろう。将来用いられる本発明の方法の特定の変化において採用される条件下で異なるグルコースレベルを試験することにより、本発明の方法の第１の培養ステップの実施のための異なるグルコース及びＤＭＳＯの濃度の適合性を、実験的に決定することができる。
【００２１】
方法の第２のステップは、血清を含む高グルコース培地中において、前記骨髄細胞をさらに培養することを含む。このステップは、内分泌ホルモン産生細胞への骨髄細胞の分化を引き起こす。典型的には、細胞が内分泌ホルモンを産生し始める前に、細胞が約７日間（例えば、４〜９日間）高グルコース培地中で細胞を培養する。前記低グルコース培地と同様に、高グルコース培地中で使用される基本培地は、ＤＭＥＭ又はその他の適当な培地であってもよい。内分泌ホルモン産生細胞への骨髄細胞の分化を達成するために適した任意のグルコース濃度を使用してもよい。以下の実施例では、高グルコース培地には２５ｍＭグルコースを含有させた。これは述べられる特定の方法の実施のために適当な濃度であるが、他の高グルコース濃度（例えば、約２０〜３０ｍＭ）でも内分泌ホルモン生産を引き起こしうるであろう。将来用いられる本発明の方法の特定の変化において採用される条件下で異なるグルコースレベルを試験することにより、本発明の方法の第２の培養ステップの実施のための異なるグルコース及びＤＭＳＯの濃度の適合性を、実験的に決定することができる。
【００２２】
高グルコース培地中に血清を含ませることは、内分泌性ホルモンを生産するように細胞を促進させるのに重要である。以下に述べる実施例では、１０％のＦＢＳを用いた。他の血清濃度（例えば、１〜２０％）及び他のタイプの血清（例えば、仔ウシ血清、新生児ウシ血清、成体ウシ血清だけでなく、他の哺乳動物の成体、新生児又は胎児からの血清）は、高グルコース培地中で使用するのに適しているであろう。ここで述べられる方法に従って所定の試験をすることによって、あらゆる特定の割合及びあらゆる特定のタイプの血清の適正を決定してもよい。
【００２３】
（膵臓の内分泌ホルモン及びｍＲＮＡの検出）
骨髄細胞が内分泌ホルモン産生細胞へうまく分化するかどうかを決定するため、１以上の膵臓内分泌ホルモン（例えば、インシュリン（又はプロインシュリン及びプレプロインシュリン等のインシュリンの前駆体）、グルカゴン、膵臓ポリペプチド及びソマトスタチンだけでなく、ホルモンｍＲＮＡ）の発現によって細胞を調べることができる。任意の既知の技術によってホルモン発現を分析してもよい。例えば、抗ホルモン（例えば、抗インシュリン）抗体を用いた免疫沈降及びウェスタンブロッティングのような抗体に基づいた測定法を用いてもよい。生体外で生成されたインシュリンを産生する膵島細胞の機能性を評価するために、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、グルコース刺激に基づくインシュリン放出を測定してもよい。
【００２４】
細胞におけるホルモンのｍＲＮＡ発現を分析するため、ノーザンブロッティング及びＲＴ−ＰＣＲ技法を含む多くの測定法を用いてもよい。例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、サンプル中のインシュリン、グルカゴン、ソマトスタチン及び膵臓ポリペプチドｍＲＮＡを検出するため、当技術分野で知られている多くの任意の手法を用いて、膵臓及び骨髄細胞から全ＲＮＡを最初に分離する。いったん精製すれば、ＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲに供され、ｃＤＮＡを生産する。次いで、適当なプライマーを用いて結果として生じるＰＣＲ産物を増幅し、電気泳動で分離する。その後、多くのシークエンシング・キットのうち任意のもの（例えば、AmpliTaqサイクル・シークエンシング・キット、Perkin-Elmer Setus（Branchburg NJ））を用いて、精製されたＰＣＲ産物を配列決定した。
【００２５】
（損傷した膵臓の再生及びホルモン欠乏の改善）
本発明は、検体における損傷した膵臓を修復するための方法も含む。そのような1つの方法は、損傷した膵臓を有する検体（例えば、未損傷の膵臓より少ない膵島細胞を有する検体）を準備するステップと、少なくとも一つの骨髄細胞を検体（例えば、糖尿病によって生じる高血糖を有する齧歯動物又はヒト等の哺乳動物）へ投入するステップを含む。投与される（例えば、移植される）骨髄細胞を、齧歯動物又はヒト等の哺乳動物から分離してもよい。本発明に関連する方法は、骨髄細胞を単に分離するのではなく、上記のように内分泌ホルモン産生細胞へ分化した骨髄の移植を利用する。これらの方法の好ましい変形例では、免疫系を媒介とした拒絶を回避するために、処置される検体から又は組織適合性のドナーから骨髄細胞を分離する。任意の適当な手法によって、分離した骨髄細胞又は内分泌ホルモン産生細胞を検体へ投与してもよい。適切な細胞移植プロトコルの例を以下に述べる。また、ドナー幹細胞の分離及びその分離した細胞の移植のための手法は当技術分野で知られている。例えば、Sandhu et al., Am. J. Pathol. 159: 1323-1334, 2001、Ianus et al., J. Clin. Invest. 111: 843-850, 2003、Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 8078-8083, 2002、Lumelsky et al., Science 292: 1389-1394, 2001及びSoria et al., Diabetes 49: 157-162, 2000を参照。
【００２６】
宿主動物において、損傷した膵臓を再生するためのドナー由来の骨髄又はホルモン産生細胞の能力を試験するため、宿主動物に存在しないマーカーを有するドナー細胞を宿主動物に移植して、キメラ動物を作成することができる。この異種のマーカーの表現に基づいて、ドナー細胞の存在を検出することができる。そのような方法を使用すると、ドナー細胞に由来する膵臓におけるホルモン産生細胞（例えば、ベータ・インシュリン産生細胞）の割合を評価できる。以下に述べる実施例では、細胞マーカーＤＰＰＩＶを遺伝子導入したドナー及び宿主である齧歯動物を用いて、損傷した膵臓を再生する骨髄細胞の能力を試験した。しかし、あらゆる適当なマーカーを用いてもよい。
【００２７】
処置される動物（つまり、骨髄又は内分泌ホルモン産生細胞を移植した動物）の器官の再生と、コントロールである動物（つまり、骨髄又は内分泌ホルモン産生細胞を移植していない動物）のそれとを（例えば、肉眼的又は組織学的検査によって）単純に比較することによって、ドナー由来の骨髄又はホルモン産生細胞の、宿主動物における損傷した膵臓を再生する能力を調べるための別の方法を実施することができる。
【００２８】
（検体における膵臓疾患の治療）
本発明の特定用途は、膵臓疾患から生じる内分泌ホルモンの欠乏の治療に関する。膵臓疾患を有する検体へ骨髄又はホルモン産生細胞を移植した後、移植した細胞によって分泌されるホルモンを全身に放出して、ホルモンの欠乏を減少させ、又は改善させる。例えば、これらの細胞によるインシュリンの分泌は、糖尿病の検体の高血糖を下げる又は改善することができる。従来の臨床の測定法を利用して、特定のプロトコルの有効性を評価できる。例えば、致死的に放射線を当てられた動物へドナー細胞を移植し、膵臓細胞の再生を測定し、高グルコース負荷に対する動物のインシュリン分泌反応、循環するグルコース・レベルを標準化する能力及びグルコース・ホメオスタシスを維持する能力を決定する。
【００２９】
（細胞の投与）
上記の細胞は、任意の適当な形状で、哺乳動物（例えば、ラット、ヒト）を含む動物に投与（移植）してもよい。例えば、内分泌ホルモン産生細胞を、薬学的に許容されるキャリアー中あるいは生理食塩水又は緩衝塩溶液等の希釈液中で形成してもよい。投与方法と手段及び標準的な薬学的基準に基づいて、適当なキャリアー及び希釈液を選択してもよい。Remington's Phamacetuical Science（当分野における一般的な教科書）及びＵＳＰ／ＮＦで、薬学的な製造と同様に模範的な薬学的に許容可能なキャリアー及び希釈剤の記述を見つけることができる。
【００３０】
従来の任意の手法によって、本発明の細胞を動物に投与してもよい。例えば、内部又は外部の標的部位への注入あるいは外科的送達によって、あるいは血管によって到達できる部位へカテーテルによって、標的部位（例えば、膵臓又は肝臓）に細胞を直接投与してもよい。単一のボーラス、複数の注入又は静脈内連続注入によって、細胞を投与してもよい。
【００３１】
（有効投与量）
好ましくは上記の細胞を哺乳動物に有効量投与する。すなわち、その有効量は治療される検体において望まれる結果（例えば、膵臓細胞を再生する又は検体の高血糖を改善させ糖尿病を治療する）を生産できる量である。医学及び獣医学の技術においてよく知られているように、任意の１固体の動物への投与量は、検体の大きさ、体表面面積、年齢、投与される特定の混合物、投与の時間と方法、通常の健康等を含む多くの要因に依存する。動物検体の大きさに依存して、約１〜１０００ＩＰＣの間のクラスターを、又は約１〜１×１０8の間の内分泌ホルモン産生細胞を動物検体へ投与してもよい。
【００３２】
（実施例）
本発明は、以下の特定の実施例によって、本発明をさらに説明する。実施例は本発明を説明するために用い、任意の方法で発明の範囲又は内容を制限するものとは解釈することができない。
【実施例１】
【００３３】
（骨髄細胞の入手と培養）
ラットの大腿及び頚骨から骨髄細胞を収集した。１０％ＦＢＳを補ったＤＭＥＭ、低グルコース（５．５ｍＭ）（ＧＩＢＣＯ社製 カタログ番号１１８８５−０８４）において骨髄細胞を培養した。６０分間のインキュベーションの後、非接着細胞を収集し、無血清ＤＭＥＭ培地で洗浄した。１％ＤＭＳＯ存在下で３日間、１×１０5／ｃｍ2の細胞密度で、無血清ＤＭＥＭ培地中において細胞を再接種した。そして、高濃度グルコース（２５ｍＭ、高グルコース、ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ社製、カタログ番号１１９９５−０６５）中において１０％のＦＢＳを含む培地で、７日間細胞を培養した。Michalopoulos and Piot, Exp. Cell Res. 94: 70-78 (1975)で述べられた方法によってラットの尾の腱から抽出された、０．３％の１型コラーゲンで覆われた、スライドカバーガラス（２２×２２ｍｍ）上のプラスチックの６ウェルプレートに細胞を播種した。
【００３４】
高グルコース条件下で、７日目に、小さい球状のクラスターが形成し始めた。１０日目の後、球状の細胞クラスターの数と大きさは著しく増加し、強固に組織化された細胞の塊を形成した。単一の領域で多数のクラスターを見ることができた。より高い倍率では、クラスターは、端と構造を形成したようであった。Bonner-Weir et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97: 7999-8004, 2000；Zulewski et al., Diabetes. 50: 521-533, 2001；Ramiya et al., Nat. Med. 6:278-282, 2000；Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99: 8078-8083, 2002で述べられているように、３次元の細胞増殖は形態学的に膵島様クラスターに似ていた。培地中におけるグルコースのレベルは、１０日目の終わりまでに形成されるクラスターの数に重大な影響をもたらした。高グルコース培養条件では、２２×２２ｍｍのカバーガラス毎に１５７．５±３２．９クラスター（ｎ＝８ウェル／３の独立した実験）という平均クラスター値を示した。一方、低グルコース条件では、カバーガラス毎に１７．３±１１．３クラスター（ｎ＝８ウェル／３の独立した実験）を示した。従って、低グルコース条件下におけるクラスターの大きさは、高グルコース条件のそれと比較して顕著に小さかった。
【００３５】
別の培養方法では、3日間１％のＤＭＳＯの存在下、骨髄細胞を培養し、７日間１０％のＦＢＳを補填した、４．５ｇ／Ｌのグルコースを含むＤＭＥＭへ変えた。その後、胎児血清から干渉がなく、インシュリン分泌の検出を可能にするため、培地を無血清培地へ変えた。無血清培地には、０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び５．５ｍＭグルコースを補填した。無血清培地において５時間３７℃で骨髄細胞をインキュベートして、無血清培地で２回洗浄した。その後、培地を、高グルコース（例えば、２５ｍＭ）を含む培地と変更し、細胞を２時間３７℃でインキュベートした。培養馴化培地を収集し、−７０℃で凍結させた。
【実施例２】
【００３６】
（生体内におけるドナー細胞の移植測定法）
Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ研究所(Wilmington、MA)から、ドナーであるＤＰＰＩＶ+Ｆ−３４４ラットを購入した。同系交配の正常なオスのＦ−３４４ラットからの骨髄細胞を、致死量の放射線を与えたＤＰＰＩＶ−のオスのＦ−３４４ラットへ移植した。その全量は、137セシウム源からの約８００ｒａｄ（４００ｒａｄの２回）であった。ネンブタール過剰服用（ｌ００ｍｇ／ｋｇ）によって屠殺された正常なオスのＦ−３４４ラットから取り除いた大腿と頚骨から得られた骨髄細胞を得て、７０％エタノール中に浸して殺菌した。骨を皮膚と筋肉から取り除き洗浄した後、骨の端を切ることにより骨髄細胞を露出し、針を挿入し、骨幹を介して抗生物質溶液が添加されたイスコフ培地を送り込むことによって、骨髄細胞を排出させた。骨髄細胞をナイロンメッシュへ通して、細胞懸濁液を混入する可能性のある骨片を取り除いた。約６０×１０6のオスの骨髄細胞を後部静脈注入によって移植した。キメラ系の構築のため３０日間を費やした。キメラ系の構築は、後部静脈出血から得られた血液細胞からのＤＰＰＩＶの免疫組織化学測定法及びＰＣＲ測定法によって評価された。ＤＰＰＩＶを発現する動物だけを、膵臓外傷プロトコル( Field et al., Pro. Soc. Exp. Bio. & Med. 186: 183-187, 1987)で飼育した。6週間の銅の欠乏食の後、動物を再び普通食で飼育した。銅の消耗及び回復期間中の指定された時に組織を得た。麻酔による管理に続いて、２、４、６、８及び１０週でラットから全膵臓をサンプリングした。組織試料の免疫組織化学測定法からの結果について以下の実施例３で述べる。
【実施例３】
【００３７】
（細胞の免疫組織化学）
免疫組織化学法を用いて、移植レシピエント動物における膵臓組織からサンプリングした細胞中のＤＰＰＩＶ、膵臓ポリペプチド、ソマトスタチン、グルカゴン及びインシュリンの発現を評価した。アセトン・エタノール（１：９９、ｖｏｌ／ｖｏｌ）中で５分間−２０℃で固定し、９５％のエタノールで４℃５分間洗浄した後、ＤＰＰＩＶ基質と凍結切片とインキュベーションすることを含む、Lojdoら(Sb Lek. 81: 200-7, 1979)によって述べられた細胞化学の方法を用いてＤＰＰＩＶ活性を検出した。スライドを室温で空気乾燥させた。基質溶液は、１５０μｌのジメチルホルムアミド中の２．５ｍｇのｇｌｙ−ｐｒｏ−４−メトキシ−ベータ−ナフチルアミド（ＧＰＭＮ）と、５ｍｌのＴＭＳ緩衝液（０．１Ｍのトリス マレアトール（ｍａｌｅａｔｏｌ）、０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５）中の５ｍｇのＦａｓｔ Ｂｌｕｅ ＢＢ塩との調整溶液である。２つの溶液は使用の直前に混合し、フィルターに通した。スライドを基質溶液中で１０〜２０分間３７℃でインキュベートした。スライドをＴＭＳ緩衝液で２回洗浄し、２分間０．１ＭＣｕＳＯ4中でインキュベートした。スライドをＴＭＳ緩衝液で再度洗浄して、ヘマトキシリンですぐに対比染色した。さらに、凍結切片をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド上で１５分間室温で固定し、ＰＢＳ中の５％スキムミルク（ブロッキング仲介物）で１時間処理した。
【００３８】
ＤＰＰＩＶ−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）及びインシュリン−テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）をマーカーとして用いて、移植及び銅の欠乏食後の膵臓組織の免疫蛍光染色を実施した。未処理のＤＰＰＩＶ＋ラットの肝臓及び膵臓をコントロールとして調べた。未処理のＤＰＰＩＶ欠乏膵臓からのインシュリン細胞は、ＤＰＰＩＶ＋ではなかった。未処理のＤＰＰＩＶ欠乏膵臓又は未処理のＤＰＰＩＶ欠乏肝臓の両方ともにＤＰＰＩＶによる染色がなかった。しかし、ベータ細胞はインシュリンに対して陽性染色を示した。致死量の放射線をオスのラットに当てた後、オスの動物からの骨髄移植で救われた。そして、移植されたオスのラットを、6週間の銅の欠乏食のプロトコルで飼育した後、普通食に戻した。移植及び銅の欠乏食のプロトコル（６週間）の後、膵臓におけるインシュリン及びＤＰＰＩＶの免疫組織化学的局在を分析した。ＤＰＰＩＶ−ＦＩＴＣ及びインシュリン−Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄという２つのマーカーを使用した。（Ａ）インシュリン抗体との膵臓の免疫蛍光染色、（Ｂ）ＤＰＰＩＶ抗体との膵臓の免疫蛍光染色、（Ｃ）インシュリンを共発現する細胞におけるＤＰＰＩＶ発現の合成イメージングからなる。図１は、骨髄を移植した動物の膵臓におけるＤＰＰＩＶ細胞の発現を示す。ＤＰＰＩＶ発現細胞を膵臓組織で２、４、６、８及び１０週間で測定した。骨髄移植されたＤＰＰＩＶが欠乏したオスの各々において、６０切片を凍結膵臓から切り取り、染色し、ＤＰＰＩＶ陽性細胞の全数を計測した。白いバーは全ＤＰＰＩＶ発現細胞を示すのに対して、黒いバーはランゲルハンス島中のＤＰＰＩＶ発現細胞を示す。ＤＰＰＩＶ陽性であるランゲルハンス島細胞／全細胞の割合を数字で示す。
【００３９】
また、免疫組織化学の手法を用いて、試験管内で培養した骨髄細胞におけるインシュリンの発現を評価した。生体内で膵臓系へ分化した骨髄細胞におけるインシュリンの免疫組織化学的局在を分析した。１０日後、（ａ）コントロールの骨髄細胞及び（ｂ）１％ＤＭＳＯ中で培養した骨髄細胞の、インシュリンとの免疫組織化学的局在及び核染色を実施した。コントロールの骨髄細胞と異なり、１％ＤＭＳＯ中で培養された細胞は球状のクラスターを形成し、インシュリンに関して陽性に染色された。
【実施例４】
【００４０】
（膵臓遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ及びノーザンブロット分析）
骨髄細胞培養物が内分泌ホルモン産生細胞へ分化したかどうかを決定するため、ＲＴ−ＰＣＲを用いて内分泌細胞ホルモンの遺伝子発現を測定した。インシュリン、グルカゴン、ソマトスタチン及び膵臓ポリペプチドのｍＲＮＡを検出するため、骨髄細胞を１％ＤＭＳＯ／ＤＭＥＭ低グルコース（５．５ｍＭ）培地で（３日）処理し、１０％ＦＢＳを有するＤＭＥＭ高グルコース（７日及び１０日）で処理し、又は骨髄細胞を培養しないで、成体ラットの膵臓からＲＮｅａｓｙキット（Ｑｕｉａｇｅｎ社製、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて全ＲＮＡを分離した。前述のように、ＲＴ−ＰＣＲを行った (Oh et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 279: 500-504, 2000)。２μｇのＲＮＡをｃＤＮＡ合成のために用いた。得られるＲＴ産物を以下の条件下で増殖させた：９４℃で４分間後、９４℃で１分間、６０℃で１分間及び７２℃で２分間の３０サイクル、そして７２℃で４分間の最後のサイクル。
【００４１】
インシュリンＩプライマーは５０７ｂｐ産物を生成した。インシュリンＩＩプライマーは５０９ｂｐ産物を生成した。グルカゴンプライマーは６５０ｂｐ産物又は２６９ｂｐ産物を生成した。ソマトスタチンプライマーは４５６ｂｐ産物又は３０１ｂｐ産物を生成した。膵臓ポリペプチドプライマーは５８７ｂｐ産物を生成した。グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プライマーは５８０ｂｐ産物を生成した。増幅された産物は１．５％のアガロースゲル中で電気泳動を実施し、エチジウムブロマイドで染色した。ＡｍｐｌｉＴａｑサイクルシークエンシングキット(Perkin-Elmer Setus社製, Branchburg, NJ)を用いて、生成したＰＣＲ産物を直接配列決定した。
【００４２】
分化した幹細胞は、インシュリン、グルカゴン、ソマトスタチン及び膵臓ポリペプチドを発現した。これらの結果は、系統が限定されない形で、主要な成体骨髄幹細胞を分化させることができることを示した。新たに分離した骨髄細胞においては、内分泌性膵臓のｍＲＮＡは検出されなかった。ＲＴ−ＰＣＲにより、１％ＤＭＳＯで処理された骨髄細胞培養物において、これらの遺伝子のいくつかが発現することがわかった。インシュリンＩ、インシュリンＩＩ、グルカゴン、ソマトスタチン及び膵臓ポリペプチドｍＲＮＡを培養の最初の3日間で検知した。また、７日間及び１０日間１０％ＦＢＳを有する高グルコースＤＭＥＭでさらに培養すると、これらのｍＲＮＡが発現することがわかった。配列決定によってＰＣＲ産物をさらに分析し、遺伝子バンクで比較してデータを確認した。
【００４３】
別のＲＴ−ＰＣＲ実験で、ＲＴ−ＰＣＲを実施し、前述のようにＲＴ−ＰＣＲを実施した(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:8078-8083, 2002)。Yangらによって述べられたラット膵臓分泌遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:8078-8083, 2002)を用いた。ＲＴ−ＰＣＲのデータにより、骨髄由来細胞の分化の初期において転写因子、ＰＤＸ−１、ＮＫＸ２．２及びＮＫＸ６．１が発現すること、細胞が成熟するにつれて、これらの転写因子が下方制御されることがわかった。グルカゴン、インシュリン、ソマトスタチン及び膵臓ポリペプチドの生産の原因遺伝子のような成熟した内分泌性遺伝子が、後の分化過程で発現された。遺伝的確認のため、精製したＰＣＲ産物を直接配列決定した。ＤＭＳＯで促進された骨髄由来細胞は、成熟膵臓細胞と関連した遺伝子をいくつか発現した。これらの結果は、骨髄由来細胞は、膵臓へさらに分化できる膵臓前駆細胞を含むことを示唆している。
【００４４】
インシュリンのｍＲＮＡが分化した骨髄由来細胞に存在するか否かを確かめるため、高グルコースで培養された骨髄由来細胞からのＲＮＡを用いて、ノーザンブロット解析を実施した。ＩＮＳ−１細胞からのＲＮＡをポジティブコントロール(Hohmeier et al., Diabetes 49: 423-30, 2000)、正常肝臓からのＲＮＡをネガティブコントール、培養されていない全骨髄細胞を比較として用いた。高グルコースで培養した骨髄由来細胞はインシュリンｍＲＮＡの発現を示したが、培養しなかった全骨髄細胞は示さなかった。
【実施例５】
【００４５】
（免疫沈降（ウエスタンブロット及びＥＬＩＳＡ）によるインシュリンの含量と分泌の測定）
実施例４で述べられたインシュリン、膵臓ポリペプチド及びＧＡＰＤＨのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、インシュリン、グルカゴン、ソマトスタチン及び膵臓ポリペプチドｍＲＮＡの検出を実施した。１％ＤＭＳＯの存在下で、骨髄細胞を３日間培養し、１０％ＦＢＳを有する４．５ｇ／ＬグルコースのＤＭＥＭに７日間交換した。その後、胎児血清からの阻害なしにインシュリン分泌を検出できるようにするため、培地を無血清培地へ変更した。この無血清培地を０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び５．５ｍＭグルコースで補填した。無血清培地で５時間３７℃で骨髄細胞をインキュベートし、無血清培地で２度洗浄した。そして、培地を高グルコース（２５ｍＭ）を含む培地に２時間交換し、３７℃で細胞をインキュベートした。培養馴化培地を収集し、−７０℃で凍結させた。そして、溶解緩衝液でインシュリンを抽出し、Yangらにより述べられたウサギポリクローナル抗インシュリン抗体(Santa Cruz社製, Santa Cruz, CA)を用いた免疫沈降及びウェスタンブロッティング（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:8078-8083, 2002）によって、インシュリンを検出した。免疫沈降の後、１８％ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって沈降物を分析し、ナイロンメンブレンに転写し、抗インシュリン抗体でブロットした。コントロールのサンプルは正常のウサギ血清及び０．５％ＢＳＡを含む培養培地から構成した。化学発光によってインシュリンを視覚化した。
【００４６】
免疫沈降及びウェスタンブロット解析により、分化した骨髄由来細胞（ＢＭＤ）、又はインシュリン産生細胞（ＩＰＣ）クラスターが、グルコース負荷試験の間、検出できる量のインシュリンを合成し、蓄積することがわかった。グルコース負荷試験の間、ＩＰＣクラスターの細胞溶解物はインシュリンの前駆体形を含むが、培地は活性のある二本鎖状のインシュリンを含むことが示された。培地へのインシュリン分泌量を決定するため、１−２−３超感受性ラットインシュリンＥＬＩＳＡキット(ALPCO社製 Diagnostics)を用いて、条件培地上でＥＬＩＳＡを実施した。ＢＭＤとＩＰＣクラスター（実験毎に約９０）を２５ｍＭグルコースで２時間調べた。Ｈ９−２（８３クラスター）及びＨ８−２（９４クラスター）の両方とも培地へのインシュリンの分泌を示した（各々１７７．８ｎｇ／ｍＬ及び１９６．０ｎｇ／ｍＬ）。低グルコース条件及び培地のみにさらされたＩＰＣクラスターは、測定においてインシュリンに反応を示さなかった。この結果は、グルコース負荷試験にさらされると、骨髄由来細胞が活性インシュリンを生産する内分泌様細胞へ分化できることを示す上で有用である。
【実施例６】
【００４７】
（ＢＭＤクラスター及びＩＰＣの超微細構造分析）
ＢＭＤクラスターの免疫蛍光分析を実施した。Ohら(Biochem. Biophys. Res.Commun. 279: 500-504, 2000)による細胞化学の方法を用いて、免疫活性を検出した。ラット尾部コラーゲン（ＲＴＣ）で無菌の顕微鏡カバーグラスを覆い、６ウェル組織培養プレートに置いた。培養約１０日目で球状のコロニーが形成されるまで分化した骨髄由来細胞を成長させた。クラスターを慎重に選択し、−７０℃で最適切断化合物（ＯＣＴ）中で凍結させ、６μｍの切片をＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔＰｌｕｓスライド上へ置いた。凍結切片を４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ溶液で室温で１５分間固定させた。その後、ＴＢＳ−Ｃａ（Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、５０ｍＭ ＣａＣｌ2.Ｈ2、１ｍＭのＮａＣｌ）ブロッキング溶媒中の５％スキムミルクでスライドを１時間処理した。そして、マウス抗ラットＤＰＰＩＶ(BD Pharmingen社製, San Diego, CA)、ウサギ抗ラットインシュリン(Santa Cruz Biotechnology社製, Santa Cruz, CA)、ウサギ抗ラット膵臓ポリペプチド(Dako社製, Cambridge, MA)、ヤギ抗ラットソマトスタチン(Santa Cruz Biotechnology社製, Santa Cruz, CA)、ヤギ抗ラットグルカゴン(Santa Cruz Biotechnology社製, Santa Cruz, CA)又は抗ラットCペプチド(Linco Research社製, St. Charles, MO)等の一次抗体と組織を４℃で一晩中、反応させた。なお、この一次抗体はブロッキング溶液を用いて１：１００に希釈されたものである。ＰＢＳで組織を洗浄後、テキサスーレッド結合抗ヤギ／ウサギＩｇＧ抗体、ＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ抗体（ブロッキング溶液を用いて１：１００に希釈、Vecter Labs, Burlingame, CA）といった二次抗体と、及び核染色のためのＤＡＰＩ(Vecter Labs, Burlingame, CA)と、組織を４℃で３時間インキュベートした。その後、蛍光顕微鏡下で組織を観察した。
【００４８】
培養をしていない骨髄由来細胞はインシュリンを発現しなかった。しかし、骨髄由来細胞クラスターは、一般的にはランゲルハンス島の細胞中で発現される、インシュリン、ソマトスタチン及び膵臓ポリペプチドの細胞質タンパク質を発現した。骨髄由来細胞クラスターの全細胞集団の約８０％は、インシュリン陽性細胞に相当する。骨髄由来クラスターの免疫組織化学により、観察されたインシュリン陽性の細胞の数は、ソマトスタチン又は膵臓ポリペプチドのいずれかを発現する細胞の数より相当多いことがわかった。
【００４９】
Ｃペプチドの発現を評価し、原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）でのハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を通してインシュリンのｍＲＮＡを調べるため、低温保持装置の切片（６μｍの厚さ）を４％パラホルムアルデヒド中で１５分間固定した。８０℃で５分間変性させた後、ラットインシュリン・ジゴキシゲニンで標識されたＤＮＡプローブ(Roche社製, Basel, Switzerland)を５２℃で切片へ適用した。その後、切片をカバースライド上に置き、ゴム糊で密封し、水和したスライドボックス中で一晩中５２℃でインキュベートした。あらかじめ熱した２×ＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．０）中で６５℃でカバーガラスを取り除いた。５分間（室温）であらかじめ熱した５×ＳＳＣ緩衝液中の５０％ホルムアルデヒドで切片を２回洗浄し、６５℃で５分間あらかじめ熱した０．１×ＳＳＣ緩衝液で２回洗浄した。ＮＢＴとＢＣＩＰ（Roche社製, Basel, Switzerland）を含む１００ｍＭトリス緩衝液（１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＭｇＣｌ2、ｐＨ９．５）中で室温で発色させた。切片を核ファストレッド（Vecter Labs, Burlingame, CA）と対比染色した後、Ｃｙｔｏｓｅａｌ(Richard-Allan Scientific社製, Kalamazoo, MI)中でマウントした。
【００５０】
クラスターの間でＣペプチド染色に陽性である細胞を確認した。高倍率顕微鏡写真により、報告されているベータ細胞染色と同様である明瞭なパターンの陽性染色が明らかになった。ＩＮＳ−１細胞及び膵臓組織と比較した時、同様の染色パターン及び発現レベルを観察した。Ｃペプチド染色に加えて、インシュリンｍＲＮＡ発現に関するＩＰＣの凍結切片上のＩＳＨを行った。ジゴキシゲニンで標識したインシュリン１オリゴヌクレオチドプローブを用いて、骨髄由来細胞クラスターの細胞質中のインシュリンｍＲＮＡを染色検出で観察した。そして、対比染色として核ファストレッドで青の陽性のシグナルを与えた。陽性の青色のシグナルは核周囲で観察され、細胞の細胞質の全体にわたって発せられた。この結果は、骨髄由来細胞はランゲルハンス島内で見出された細胞へ分化する潜在能力を有すことを示す。
【実施例７】
【００５１】
（インシュリン産生細胞（ＩＰＣ）移植及び生理学的試験）
ＳＴＺ誘導糖尿病ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスモデルを用いて、骨髄由来細胞の膵島様細胞クラスターが高血糖を改善する能力を生体内で調べた。低用量のＳＴＺを用いて、多数の処置を通して、ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスを糖尿病状態へ化学的に誘導した。糖尿病状態へ誘導した後、２日毎に標準血糖測定器（Ｏｎｅ ｔｏｕｃｈ Ｐｒｏｆｉｌｅ、糖尿病追跡システム、Johnson & Johnson Com., Milpitas, CA）を用いて血糖値を決定した。
【００５２】
５日間一日に一度４０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシン（ＳＴＺ）の腹膜腔内注射を利用して、１０週齢のオスＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスにおいて糖尿病を引き起こした。各注射のため、０．１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐH４．５）に溶解することによってＳＴＺを準備する。安定した高血糖（標準血糖測定器を用いて決定されるような血糖値３００〜６００ｍｇ／ｄＬ）は、最後のＳＴＺ注射の５〜６日後に明らかになった。マウスは１５０の厳選されたＩＰＣを（全身麻酔の下で）移植されるか、又はマウスは右の腎臓被膜下領域中に食塩水の偽の移植を受けた。約１５０のＢＭＤＩＰＣクラスターを９個体の糖尿病マウスの腎臓被膜下領域へ移植した。
【００５３】
移植を受けたマウスは、２〜３日以内に標準化された血糖値を示し始めた。移植約１７日後、移植片を取り除くため、９個体のマウスのうちの６個体が腎臓摘出術を受けた。図２で示されるように、移植後、２日毎に血糖値をモニターし、再び腎臓摘出術を受けた。移植を受けていない又は培養していない骨髄細胞を移植した動物は高血糖のままであり、ＳＴＺ処置後１５日以上生存しなかった。これは、ＳＴＺが膵臓のベータ細胞を破壊し、糖尿病でマウスを死なせてしまうという順序を示唆している。移植を受けた動物は、移植の２日以内にグルコースのレベルをほとんど正常まで下げることができた。移植クラスターがグルコースレベルの正常化の原因であるかどうかを決定するため、ＩＰＣを移植したマウスは２つのグループに分けられた。１つのグループは移植片を維持した。一方、もう１つの移植されたマウスのグループは腎臓摘出術を行い、移植された細胞を戻し、正常血糖の回復を試験した。１７日後、移植片を置いた腎臓を取り出し、さらに試験をするためＯＣＴ中で凍結させた。移植片を除かれたマウスは高血糖になり、その後すぐに死んだ。移植したＩＰＣクラスターを維持した動物は、研究の残りの期間、ほとんど正常のグルコースレベルを維持することができ、１個体の動物はＳＴＺ処置後の９０日まで生存した。これは、クラスターが完全に膵臓の機能をする内分泌細胞へ成熟する可能性を有することを示唆している。移植を受けない又は非培養の骨髄細胞を受けたコントロールである動物は、持続性の高血糖を示し、その後、最終的に死んだ。
【００５４】
従来の実施例３と６で述べたように、従来のヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色、免疫組織化学ならびにインシュリン及びインシュリンｍＲＮＡに関するＩＳＨによって、移植された細胞を受けて、取り除かれた腎臓をさらに調べた。Ｈ＆Ｅ染色に見られるように、移植された細胞は生存可能で、クラスターの形成を維持したが、それら自身を腎臓へ組み入れなかった。Ｈ＆Ｅ染色により、細胞が、外観において、成人の膵臓で見られる成熟した膵島構造に典型的な立方形になったことが明らかになった。免疫組織化学とＩＳＨによって、腎臓被膜の下でインシュリン陽性細胞を観察した。インシュリンｍＲＮＡの発現を検出するために、ジゴキシゲニン標識ＤＮＡプローブを用いた。移植された細胞は、インシュリンｍＲＮＡの発現に対し陽性であった。ネガティブコントロールである移植されていない肝臓組織をＩＳＨのために用いた。このネガティブコントロールは、切片の全体にわたって陽性のシグナルを示さなかった。この結果は、骨髄由来細胞クラスターが、生体内でインシュリンを分泌する能力を保持し、糖尿病のマウスにおける高血糖値に反応して機能したことを裏付ける。
【実施例８】
【００５５】
（ＩＰＣクラスターの超微細構造分析）
超微細構造レベルでＩＰＣクラスターを調べた。これらの細胞の超微細構造の性質を特徴付けるため、１０日目のＩＰＣの電子顕微鏡観察を行った。ＩＰＣ球状体を固定し（０．１Ｍカコジル酸緩衝液中の０．１％グルタルアルデヒド／２％ホルムアルデヒド）、０．１Ｍのカコジル酸緩衝液に移し、埋め込んだ。超薄切片を、１０％のＨ2０2で処置し、０．９％のＮａＣｌで洗浄し、３％のＢＳＡでブロッキングをし、０．５％のＢＳＡ（ウサギ抗ラット・インシュリン、Santa Cruz社製）で補填したＰＢＳ中の一次抗体と一晩中インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、ヤギ血清で再ブロッキングした。金標識二次抗体（１５ｎｍの金の粒子、ヤギ抗ウサギ、Amersham Pharmacia)で一次抗体の結合の視覚化を行い、その後、電子顕微鏡のために切片の対比染色をした。
【００５６】
分化細胞は、粗面小胞体、ゴルジ複合体、少数の大きな液胞及び密顆粒を含有する分泌小胞を含む分泌細胞に典型的な構造を示した。分泌顆粒は、分化細胞の細胞質内に濃厚に密集した。成熟したベータ細胞の別の特性として報告されている、細胞膜に沿った微絨毛を見ることができた。骨髄由来のＩＰＣクラスター中で見られる多くの顆粒は青白く、結晶類似の特性を有していた。免疫金電子顕微鏡は、骨髄由来のＩＰＣクラスターの小分泌小胞内の顆粒にインシュリンが格納されていることを示した。金標識により、細胞の頂極で、綿状の低密度物質及び高電子密度核を有するいくつかの顆粒で満たされた、異なるサイズのかすかな球状の構造が検出された。核の中で又は細胞の他の場所で非特異性の標識化を観察しなかった。成体ベータ細胞で典型的に見られる超微細構造の特性がこれらのＩＰＣクラスターで見つかるという事実は、これらの細胞は培地中でインシュリンを産出できるベータ細胞状へ確かに分化していたことを示している。
【００５７】
（他の実施形態）
本発明の詳細な説明とともに本発明は記述されている一方、前述の説明は説明することを意図しており、本発明の範囲を限定することを意図していないのを理解するべきである。本発明の範囲は添付された特許請求の範囲の範囲によって定義される。他の側面、利点及び変更は次に述べる特許請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１は、膵臓におけるＤＰＰＩＶ細胞の発現を示すグラフである。ＤＰＰＩＶ発現細胞は、膵臓組織において、２，４，６，８，及び１０週目に数えた。白いバーは全ＤＰＰＩＶ発現細胞を示し、黒いバーはランゲルハンス島におけるＤＰＰＩＶ発現細胞を示す。ＤＰＰＩＶ陽性であるランゲルハンス島細胞／全細胞の割合として数を示す。
【図２】図２は、化学的に誘導された糖尿病マウスに移植後のＩＰＣ血糖値の経時変化を示すグラフである。グラフには、コントロールであるＳＴＺ処置マウス（非移植細胞；ｎ＝１０）、又は非培養骨髄細胞（骨髄細胞のみ；ｎ＝３）、及びインシュリン産生クラスターを誘導した約１５０のＢＭが移植されたマウス（ｎ＝９）を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の骨髄細胞を内分泌ホルモン産生細胞に分化する方法であって、
（Ａ）前記骨髄細胞を準備するステップと、
（Ｂ）ＤＭＳＯを含む低グルコース培地中で前記骨髄細胞を培養するステップと、
（Ｃ）適当な条件下で、内分泌ホルモン産生細胞への前記細胞の分化を促進するための十分な時間、血清を含む高グルコース培地中で前記骨髄細胞を培養するステップと、を含むことを特徴とする哺乳類の骨髄細胞を内分泌ホルモン産生細胞に分化する方法。
【請求項２】
前記骨髄細胞は、齧歯類の細胞であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記齧歯類の細胞は、ラットの細胞であることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記内分泌ホルモン産生細胞は、インシュリンを産生することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記内分泌ホルモン産生細胞は、グルカゴンを産生することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記内分泌ホルモン産生細胞は、ソマトスタチンを産生することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記内分泌ホルモン産生細胞は、膵臓ポリペプチドを産生することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記低グルコース培地は、約５．５ｍＭの濃度のグルコースを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記高グルコース培地は、約２５ｍＭの濃度のグルコースを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１７】
前記高グルコース培地は、ＤＭＥＭ及びウシ胎児血清を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１８】
前記骨髄細胞を、前記高グルコース培地で約７日間培養することを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記請求項１記載の方法によって作製されたことを特徴とする内分泌ホルモン産生細胞。
【請求項２０】
（Ａ）損傷した膵臓を有する検体を準備するステップと、
（Ｂ）少なくとも一つの骨髄細胞を前記検体に投与するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
前記損傷した膵臓は、未損傷の膵臓より少ない膵島細胞を有することを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記検体が哺乳類であることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記哺乳類が齧歯類であることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記検体は、糖尿病で生じた高血糖を有することを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも一つの骨髄細胞を前記検体に投与することによって、前記検体中の高血糖を下げることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも一つの骨髄細胞を前記検体に投与することによって、前記検体中のインシュリン値を上げることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
糖尿病を有する哺乳類における高血糖を改善する方法であって、
（Ａ）糖尿病から起こる高血糖を有する哺乳類を準備するするステップと、
（Ｂ）前記哺乳類の高血糖を下げるのに十分な内分泌ホルモン産生細胞の用量を哺乳類に投与するステップとからなり、
なお、前記内分泌ホルモン産生細胞は、
ＤＭＳＯを含む低グルコース培地中で前記骨髄細胞を培養するステップと、
適当な条件下で、内分泌ホルモン産生細胞への前記細胞の分化を促進するための十分な時間、血清を含む高グルコース培地中で前記骨髄細胞を培養するステップと、からなる方法により作製されることを特徴とする糖尿病を有する哺乳類における高血糖を改善する方法。
【請求項２８】
前記骨髄細胞は、哺乳類から得られることを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記哺乳類は、ラットであることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記哺乳類は、ヒトであることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
前記内分泌ホルモン産生細胞は、インシュリンを産生することを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項３２】
前記内分泌ホルモン産生細胞は、グルカゴンを産生することを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項３３】
前記内分泌ホルモン産生細胞は、ソマトスタチンを産生することを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項３４】
前記内分泌ホルモン産生細胞は、膵臓ポリペプチドを産生することを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項１】
哺乳類の骨髄細胞を内分泌ホルモン産生細胞に分化する方法であって、
（Ａ）前記骨髄細胞を準備するステップと、
（Ｂ）ＤＭＳＯを含む低グルコース培地中で前記骨髄細胞を培養するステップと、
（Ｃ）適当な条件下で、内分泌ホルモン産生細胞への前記細胞の分化を促進するための十分な時間、血清を含む高グルコース培地中で前記骨髄細胞を培養するステップと、を含むことを特徴とする哺乳類の骨髄細胞を内分泌ホルモン産生細胞に分化する方法。
【請求項２】
前記骨髄細胞は、齧歯類の細胞であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記齧歯類の細胞は、ラットの細胞であることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記内分泌ホルモン産生細胞は、インシュリンを産生することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記内分泌ホルモン産生細胞は、グルカゴンを産生することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記内分泌ホルモン産生細胞は、ソマトスタチンを産生することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記内分泌ホルモン産生細胞は、膵臓ポリペプチドを産生することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記低グルコース培地は、約５．５ｍＭの濃度のグルコースを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記高グルコース培地は、約２５ｍＭの濃度のグルコースを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１７】
前記高グルコース培地は、ＤＭＥＭ及びウシ胎児血清を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１８】
前記骨髄細胞を、前記高グルコース培地で約７日間培養することを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記請求項１記載の方法によって作製されたことを特徴とする内分泌ホルモン産生細胞。
【請求項２０】
（Ａ）損傷した膵臓を有する検体を準備するステップと、
（Ｂ）少なくとも一つの骨髄細胞を前記検体に投与するステップと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
前記損傷した膵臓は、未損傷の膵臓より少ない膵島細胞を有することを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記検体が哺乳類であることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記哺乳類が齧歯類であることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記検体は、糖尿病で生じた高血糖を有することを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも一つの骨髄細胞を前記検体に投与することによって、前記検体中の高血糖を下げることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも一つの骨髄細胞を前記検体に投与することによって、前記検体中のインシュリン値を上げることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
糖尿病を有する哺乳類における高血糖を改善する方法であって、
（Ａ）糖尿病から起こる高血糖を有する哺乳類を準備するするステップと、
（Ｂ）前記哺乳類の高血糖を下げるのに十分な内分泌ホルモン産生細胞の用量を哺乳類に投与するステップとからなり、
なお、前記内分泌ホルモン産生細胞は、
ＤＭＳＯを含む低グルコース培地中で前記骨髄細胞を培養するステップと、
適当な条件下で、内分泌ホルモン産生細胞への前記細胞の分化を促進するための十分な時間、血清を含む高グルコース培地中で前記骨髄細胞を培養するステップと、からなる方法により作製されることを特徴とする糖尿病を有する哺乳類における高血糖を改善する方法。
【請求項２８】
前記骨髄細胞は、哺乳類から得られることを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記哺乳類は、ラットであることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記哺乳類は、ヒトであることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
前記内分泌ホルモン産生細胞は、インシュリンを産生することを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項３２】
前記内分泌ホルモン産生細胞は、グルカゴンを産生することを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項３３】
前記内分泌ホルモン産生細胞は、ソマトスタチンを産生することを特徴とする請求項２７記載の方法。
【請求項３４】
前記内分泌ホルモン産生細胞は、膵臓ポリペプチドを産生することを特徴とする請求項２７記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００６−５０７０１１（Ｐ２００６−５０７０１１Ａ）
【公表日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０１４７９（Ｐ２００５−５０１４７９）
【出願日】平成１５年１０月１７日（２００３．１０．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３３１６５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３５７６１
【国際公開日】平成１６年４月２９日（２００４．４．２９）
【出願人】（５０２４１７２５４）ユニヴァーシティ オヴ フロリダ (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１０月１７日（２００３．１０．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３３１６５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３５７６１
【国際公開日】平成１６年４月２９日（２００４．４．２９）
【出願人】（５０２４１７２５４）ユニヴァーシティ オヴ フロリダ (3)
【Ｆターム（参考）】
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