高められたエフェクター機能をもつ抗体定常領域の製造用の宿主細胞株
抗体、抗体フラグメント、若しくは抗体由来融合タンパク質の生物医薬品製造のための宿主細胞株は、改良された細胞のエフェクター機能、例えばＦｃ媒介性エフェクター機能を誘導する能力を有するために選択される。該宿主細胞はラット骨髄腫細胞株ＹＢ２／０由来であり、そして既知組成培地中での増殖に適応される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えＤＮＡ技術において、および細胞培養物でのタンパク質の産生に有用な細胞、細胞株および細胞培養物に関する。より具体的には、本発明は、高められた抗体エフェクター機能を提供する、既知組成培地中で増殖することが可能なクローン性骨髄腫細胞株に向けられる。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、しばしば、体液性および細胞性免疫機構を結び付けるアダプター分子と称される。すなわち、体液性応答は、可変ドメインの固有の特異性により賦与されるところの標的抗原への高アフィニティー結合が可能な成熟した分泌型の循環抗体に主として帰される。細胞性応答は、抗体−抗原（ａｂ−ａｇ）複合体の結合、およびエフェクター細胞へのａｂ−ａｇ複合体結合の結果としての細胞メディエーターの遊離により引き起こされる下流の結果による細胞の活性化の結果に帰される。これらの細胞応答は、標的の中和、オプソニン化および感作（抗原が細胞の表面上に表示される場合）、肥満細胞の感作ならびに補体の活性化を包含する。細胞表面抗原である細胞標的について、これらのエフェクター機能は、抗体に指図される細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体媒介性の細胞傷害（ＣＤＣ）として一般に知られるものに至る。
【０００３】
特異的抗原認識の原因であるのが、抗体のいわゆる可変領域および超可変ドメイン、ならびに、抗体取り込みおよび細胞傷害性の機構すなわちＡＤＣＣ、ＣＤＣを包含するある種の機能に影響を及ぼしかつＣ１ｑタンパク質への結合を包含する多様な受容体への抗体結合にもまた影響を及ぼすように細胞を刺激することが可能な、多様な、通常は高度に移動性の細胞上に存在するこれらのＦｃ受容体と相互作用するのが、ヘテロ二量体のＨ鎖部分のいわゆる定常領域すなわちＦｃ部分である。これらの受容体はＦｃ受容体として知られる。
【０００４】
抗体アイソタイプ（例えばＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）のなかでＩｇＧが最も豊富であり、ＩｇＧ１サブクラスは最も有意の程度および範囲のエフェクター機能を表す。ＩｇＧ１タイプの抗体は癌免疫療法で最も一般に使用される抗体である。構造上、ＩｇＧヒンジ領域およびＣＨ２ドメインは抗体のエフェクター機能において主要な役割を演じている。（ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの二量体化により形成される）Ｆｃ領域に存在するＮ結合したオリゴ糖がエフェクター機能に影響を及ぼす（図１）。全部の天然に存在する抗体のＦｃ部分は、Ｈ鎖中の保存された位置で炭水化物鎖でさらに修飾される。ＩｇＧアイソタイプでは、Ｎ結合したグリコシル化部位は各ＣＨ２ドメイン中に存するＡｓｎ２９７でである。定常領域がアイソタイプとともに変動するため、各アイソタイプは異なる多数のＮ結合した炭水化物構造を有し、それらはタンパク質の集成、分泌若しくは機能的活性に多様に影響を及ぼす（非特許文献１）。結合されたＮ結合した炭水化物の構造はプロセシングの程度に依存してかなり変動し、そして、高マンノースの、複雑に分岐した、ならびに二分岐の複雑なオリゴ糖、ならびに図２に示される末端糖としてシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸すなわちＮＡＮＡ）、フコース、ガラクトースおよびＧｌｃＮａｃ（Ｎ−アセチルグルコサミン）残基を包含し得る。宿主細胞のエフェクター機能および抗体のオリゴ糖含量に対する影響は認識されている（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献１；非特許文献４）。さらに、抗体中の糖鎖に関して、抗体のＮ−グリコシド結合した糖鎖の還元端の近位のＮ−アセチルグルコサミンでのフコースの付加若しくは修飾が該抗体のＡＤＣＣ活性を有意に変化させることが報告されている（特許文献１）。
【０００５】
加えて、安定に工作された宿主細胞を使用する組換え治療タンパク質製造は、伝統的に、血清若しくは器官抽出物のような化学的に定義されない動物由来成分を補充した培地の使用を必要とした。バッチごとの変動性の問題のほかに、これらの汚染物質から生成物を精製する必要性、およびヒト病原体の伝播の可能性が、これらの成分を使用する場合に上昇する。この感受性は、狂牛病としてもまた知られる畜牛の神経変性疾患、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）が、ヒトを冒す疾患の病原体であると考えられる（非特許文献５）クロイツフェルト−ヤコブ（ｖＣＪＤ）と識別不可能であるという発見とともに、近年、より重大となった。従って、多くの規制当局は、細胞培地中での動物由来物質の中断若しくは制限された使用を強く推奨している。従って、無血清（ＳＦ）でありかつ／若しくは動物由来タンパク質を含まない（ＡＰＦ）哺乳動物細胞の増殖および維持のための既知組成（「ＣＤ」）培地が現在使用可能である。ＣＤ培地の欠点は、ほとんどの産生細胞株がそれ中での増殖に適応しないか、若しくはゆっくりと増殖しかつ乏しく産生することである。結果、グリコシル化が至適化された治療タンパク質の製造のための理想的産生細胞株は、ＣＤ培地中で増殖しつつ大スケールの商業的容量で組換えタンパク質を産生することもまた可能であることができる。
【０００６】
従って、治療的組換えタンパク質の工業的製造では、タンパク質の有効性を改良しかつ至適化されたグリコシル化パターンを達成するための例えば酵素的手段による収集後処理に対する必要性を回避する、無血清および／若しくは無タンパク質培地中で増殖される、発現かつプロセシングされたタンパク質の至適化された炭水化物パターンに影響を及ぼすことが可能な細胞株に対する必要性が存在する（例えば特許文献２を参照されたい）。
【０００７】
【特許文献１】第ＷＯ００／６１７３９号明細書
【特許文献２】米国特許第６，３９９，３３６号明細書
【非特許文献１】Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．とＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２６−３２（１９９７）
【非特許文献２】Ｌｉｆｅｌｙ，Ｍ．Ｒ．ら、１９９５ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：８１３−８２２
【非特許文献３】Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．ら、１９９８ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．１６３：５９−７６
【非特許文献４】Ｐｒｅｓｔａ Ｌ．２００３．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．１３（４）：５１９−２５
【非特許文献５】Ｂｒｕｃｅら Ｎａｔｕｒｅ ３８９：４９８−５０１、１９９７
【発明の開示】
【０００８】
［発明の要約］
本発明は、既知組成の動物タンパク質を含まない培地中での増殖、および至適にグリコシル化された免疫グロブリン由来治療タンパク質を産生することが可能な細胞、細胞株および細胞培養物に関する。好ましい一態様において、該細胞株は、ＣＤ培地中で増殖するよう適応されたＹＢ２／０ラット骨髄腫由来細胞株である。
【０００９】
好ましい一態様において、本発明の細胞、細胞株および細胞培養物は、組換えタンパク質を約１０ｍｇ／Ｌないし約１０，０００ｍｇ／Ｌ培地で産生する。別の態様において、本発明の細胞、細胞株および細胞培養物は、組換えタンパク質を約０．１ｐｇ／細胞／日ないし約１００ｎｇ／細胞／日の濃度で産生する。
【００１０】
本発明は、本発明の培養宿主細胞からの最低１種のタンパク質、例えば抗体若しくはＦｃ含有タンパク質の製造方法をさらに提供する。好ましい一態様において、最低１種の所望のタンパク質を発現する本発明の細胞は既知組成培地で培養され、そしてタンパク質は
既知組成培地若しくは細胞それら自身から単離される。
【００１１】
本発明の別の態様は、本発明の細胞株により産生される抗体若しくはＦｃ含有治療タンパク質を含んでなる。本発明の抗体若しくはＦｃ含有治療タンパク質は、限定されるものでないがヒト、マウス、ウサギ、ラット、げっ歯類、霊長類を挙げることができるいずれかの哺乳動物若しくはそれらのいずれかの組合せを包含し得るか若しくはそれらに由来し得、そして、単離されたヒト、霊長類、げっ歯類、哺乳動物、キメラ、ヒト化および／若しくはＣＤＲ移植抗体、免疫グロブリン、切断生成物、ならびにそれらの他の指定される部分およびバリアントを包含する。
【００１２】
本発明の一局面において、抗体は、抗インテグリン抗体、抗組織因子抗体、または、それによりｉｎ ｖｉｖｏで被験体内の細胞の増殖を低下若しくは予防することが望ましくかつその活性が本発明の細胞株での抗体の産生により賦与されるか若しくは高められる、被験体内の細胞の表面で表示される抗原を結合することが可能な他の抗体である。
【００１３】
［発明の詳細な記述］
略語
Ａｂ＝抗体、ポリクローナル若しくはモノクローナル；ＡＰＦ＝動物タンパク質を含まない；ＣＤ＝既知組成；ＣＤＲ＝相補性決定領域；Ｉｇ＝免疫グロブリン；ＩｇＧ＝免疫グロブリンＧ；Ｍａｂ＝モノクローナル抗体；ＴＦ＝組織因子。糖残基について：Ｆｕｃ＝フコシル；Ｇａｌ＝ガラクトシル；Ｇｌｃ＝グルコシル；ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミニル；Ｍａｎ＝マンノシル；およびＮＡＮＡ＝シアリル（Ｎ−アセチルノイラミニル、しかし５−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）若しくは５−Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ、ＮＧＮＡ）もまた「シアル酸」として包含し得る；Ｍａｂ＝モノクローナル抗体；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ＝マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析。
【００１４】
定義
「ＡＤＣＣ活性」という用語は、抗体依存性の細胞媒介性細胞傷害を表し、そして感作されないエフェクター細胞による抗体媒介性標的細胞破壊の現象を意味している。標的細胞の同一性は変動するが、しかし、それは、Ｆｃドメイン、若しくはＦｃ受容体活性化が可能なＦｃドメイン部分を有する結合された表面免疫グロブリンＧを有しなければならない。エフェクター細胞はＦｃ受容体を有する「キラー」細胞である。それは、例えば標的細胞の同一性に依存して慣習的Ｂ若しくはＴ細胞マーカーを欠くリンパ球、または単球、マクロファージ若しくは多核白血球でありうる。該反応は補体に依存しない。本発明の抗体若しくは他のＦｃ含有タンパク質のＡＤＣＣ活性は、ＡＤＣＣ媒介性の細胞死滅を示すその能力が、代替宿主細胞により産生される実質的に類似の配列の抗体若しくはタンパク質およびＦｃドメインの能力を凌ぐ場合に「高められる」。ＡＤＣＣ活性は、本明細書で論考されるアッセイのような細胞死滅の標準的ｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで測定しうる。好ましくは、高められたＡＤＣＣ活性を有する本発明の抗体は、代替宿主細胞で産生された参照抗体より低用量かつ／若しくは短時間で同一の効果（腫瘍細胞増殖の予防若しくは阻害）を達成する。好ましくは、本発明の範囲内の抗体および参照抗体の効力の間の差違は、例えば選択される標準的クロム遊離ＡＤＣＣアッセイでの並列比較により決定されるところの最低約１．５倍、より好ましくは最低約２倍、なおより好ましくは最低約３倍、最も好ましくは最低約５倍である。
【００１５】
「抗体」は、抗体分子全体、抗体フラグメント、若しくは免疫グロブリンのＦｃ領域に同等な領域を包含する融合タンパク質を包含することを意図している。
【００１６】
「抗体フラグメント」は、完全長抗体の一部分、一般にはその抗原結合すなわち可変ド
メインを含んでなる。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；二重特異性抗体；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成される多特異性抗体を包含する。こうした抗体フラグメントは、同一若しくは異なる種からの抗体のＦｃドメイン領域、または抗体の改変されたＦｃドメイン若しくはＣＨ２ドメインに融合しうる（図１はこうした抗体の基礎構造を示す）。
【００１７】
本明細書で使用されるところの「クローン化された」、「クローン的に派生した」若しくは「クローン性細胞株」という用語は、単一祖先細胞に由来する特定の細胞株からの遺伝的に同一の細胞の増殖する集団を意味している。ＹＢ２／０由来宿主細胞について、親細胞株は、米国特許第４，４７２，５００号明細書に記述されかつＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２として寄託されたラット骨髄腫細胞株である。
【００１８】
それが本明細書で使用されるところの抗体若しくは抗体アナログの「エフェクター機能」は、病原体若しくは異常な細胞例えば腫瘍細胞が破壊されかつ身体から除去される過程である。自然および獲得免疫応答は、病原体を排除するのにＡＤＣＣ、ＣＡ（補体活性化）、Ｃ１ｑ結合およびオプソニン化を包含する同一のエフェクター機構の大部分を使用する。
【００１９】
本明細書で使用されるところの「Ｆｃ」、「Ｆｃ含有タンパク質」若しくは「Ｆｃ含有分子」という用語は、最低１個の免疫グロブリンＣＨ２ドメインを有する二量体若しくはヘテロ二量体タンパク質を指す。ＣＨ２ドメインは該タンパク質／分子（例えば抗体）の二量体領域の少なくとも一部分を形成し得る。
【００２０】
フコシルトランスフェラーゼまたは「ｆｕｔ８」若しくは「ｆｕｄａｓｅ」は、ｆｕｔ８として知られる遺伝子、およびα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する遺伝子産物を指す。
【００２１】
「Ｆｃ含有治療タンパク質」は、抗原結合ドメイン、Ｆｃ領域を有するか若しくは最低１個の免疫グロブリンＣＨ２ドメインを含んでなる二量体若しくはヘテロ二量体タンパク質を意味することを意図しており、抗体のＦｃ若しくはＣＨ２を含んでなる部分は、グリコシル化されることが可能なアスパラギン残基を含有する。
【００２２】
本明細書で使用されるところの「宿主細胞」という用語は、抗体および抗体フラグメントを包含する目的のタンパク質、タンパク質フラグメント若しくはペプチドを生成するように工作し得るいかなる種類の細胞系も包括する。宿主細胞は、限定されるものでないが、培養細胞、例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＮＳＯ、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０のようなげっ歯類（ラット、マウス、モルモット若しくはハムスター）由来の哺乳動物培養細胞；またはヒト組織若しくはハイブリドーマ細胞、酵母細胞および昆虫細胞、しかしまたトランスジェニック動物若しくは培養組織内に含まれる細胞も挙げることができる。
【００２３】
本明細書で使用されるところの「モノクローナル抗体」若しくは「モノクローナル抗体組成物」または「Ｍａｂ」という用語は、実質的に単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定の１エピトープに対する単一の結合特異性およびアフィニティーを表す。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一抗原部位に向けられる。さらに、多様な決定子（エピトープ）に向けられた多様な抗体を典型的に包含する慣習的（ポリクローナル）抗体調製物と対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一決定子に向けられる。「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均質な集団から得られるところの抗体の特徴を示し、そしていずれかの特定の方法による抗体の製造を必要とすると解釈されるべきでない。例えば、本発明で使用されるべきモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）により最初に記述
されたハイブリドーマ法により作成しうるか、若しくは組換えＤＮＡ法（例えば米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい）により作成しうる。「モノクローナル抗体」はまた、例えばＣｌａｒｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に記述される技術を使用してファージ抗体ライブラリーからも単離しうる。
【００２４】
モノクローナル抗体は、本明細書で、Ｈおよび／若しくはＬ鎖の一部分が、特定の１種由来または特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一若しくはそれに相同である一方、該鎖（１本若しくは複数）の残部が、別の種由来または別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体、ならびにそれらが所望の生物学的活性を表す限りはこうした抗体のフラグメント中の対応する配列と同一若しくはそれに相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）をとりわけ包含する（米国特許第４，８１６，５６７号明細書およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８１：６８５１−６８５５（１９８４））。
【００２５】
「ヒト化」形態のヒト以外（例えばマウス）抗体は、ヒト以外の免疫グロブリンに由来した実質的に置換された配列部分を有するキメラ抗体である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域（相補性決定領域すなわちＣＤＲとしてもまた知られる）残基が、所望の特異性、アフィニティーおよび能力を有するマウス、ラット、ウサギ若しくはヒト以外の霊長類のようなヒト以外の種からの超可変領域残基（ドナー抗体）により置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンの枠組み領域（ＦＲ）残基は対応するヒト以外の残基により置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体若しくはドナー抗体中で見出されない残基を含みうる。これらの改変は抗体の性能をさらに改良するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、最低１および典型的には２個の可変ドメインの実質的に全部を含むことができ、ここで、超可変領域の全部若しくは実質的に全部がヒト以外の免疫グロブリンのものに対応し、また、ＦＲの全部若しくは実質的に全部がヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、場合によっては、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒトＩｇＧ免疫グロブリンのものの少なくとも一部分もまた含むことができる。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。
【００２６】
本明細書で使用されるところの「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変および／若しくは定常領域を有するアミノ酸配列を有する抗体を指す。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列を使用して、例えばヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを免疫すること、若しくはヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることによりある系から該抗体が得られる場合に、特定の一生殖系列配列「に由来し」、そして、ここで、選択されるヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列にアミノ酸配列が最低９０％、より好ましくは最低９５％、なおより好ましくは最低９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸配列（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏで無作為若しくは部位特異的突然変異誘発により、またはｉｎ ｖｉｖｏで体細胞突然変異により導入される突然変異）を包含することができ、そして、超可変配列若しくは相補性決定領域（ＣＤＲ）配列が抗体特異性の独特の決定子でありかつ生殖系列中でコードされない限りは、これらの領域は配列同一性分析から除外すべきである。
【００２７】
本明細書で使用されるところの「組換え抗体」という用語は、（ａ）ヒト免疫グロブリ
ン遺伝子に対しトランスジェニック若しくは導入染色体（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）である動物（例えばマウス）またはそれから調製したハイブリドーマ（さらに下述する）から単離された抗体、（ｂ）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えばトランスフェクトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）から単離された抗体、（ｃ）組換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを必要とするいずれかの他の手段により製造、発現、創製若しくは単離された抗体、のような組換え手段により製造、発現、創製若しくは単離される全部の抗体を包含する。組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変および定常領域を有する。ある態様においては、しかしながら、こうした組換えヒト抗体はｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発（若しくは、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックの動物を使用する場合にはｉｎ ｖｉｖｏ体細胞突然変異）にかけることができ、そして、従って、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列由来かつそれらに関係しつつ、ｉｎ ｖｉｖｏでのヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在しなくともよい配列である。
【００２８】
本明細書で使用されるところの「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことを意図している（例えば、組織因子に特異的に結合する単離された抗体は、組織因子以外の抗原を特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。ヒト組織因子の１エピトープ、アイソフォーム若しくはバリアントに特異的に結合する単離された抗体は、しかしながら、例えば他の種からの他の関連した抗原（例えば組織因子種ホモログ）に対する交差反応性を有しうる。さらに、単離された抗体は他の細胞物質および／若しくは化学物質を実質的に含まないことができる。本発明の一態様において、異なる特異性を有する「単離された」モノクローナル抗体の組合せは、十分に定義された組成物中で組合せられる。
【００２９】
「二特異性分子」という用語は、２種の異なる結合特異性を有するいかなる剤、例えばタンパク質、ペプチド、またはタンパク質若しくはペプチド複合体も包含することを意図している。例えば、該分子は（ａ）細胞表面抗原および（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体に結合若しくはそれらと相互作用しうる。「多特異性分子」若しくは「異種特異性分子」という用語は、２種以上の異なる結合特異性を有するいかなる剤、例えばタンパク質、ペプチド、またはタンパク質若しくはペプチド複合体も包含することを意図している。例えば、該分子は（ａ）細胞表面抗原、（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体、および（ｃ）最低１種の他の成分に結合若しくはそれらと相互作用しうる。従って、本発明は、限定されるものでないが、細胞表面受容体若しくはこうした受容体のリガンドでありうる標的タンパク質、およびエフェクター細胞上のＦｃ受容体のような他の標的に向けられる、二特異性、三特異性、四特異性および他の多特異性分子を挙げることができる。
【００３０】
本明細書で使用されるところの「異種抗体」という用語は、それらの最低２種が異なる特異性を有する、一緒に連結された２種若しくはそれ以上の抗体、抗体の結合フラグメント（例えばＦａｂ）、それらからの誘導体、若しくは抗原結合領域を指す。これらの異なる特異性は、エフェクター細胞上のＦｃ受容体に対する結合特異性、および標的細胞例えば腫瘍細胞上の抗原若しくはエピトープに対する結合特異性を包含する。
【００３１】
至適にグリコシル化された免疫グロブリン由来治療タンパク質は、Ｎ結合グリコシル化部位を有するヒト若しくはヒト由来ＣＨ２領域を含んでなる組換えタンパク質を含んでなり、それらの部位は、エフェクター機能として集合的に知られる、細胞免疫機構をｉｎ ｖｉｖｏで導き出す前記治療タンパク質の変えられた（相対的に高められた若しくは減少された）能力を賦与するグリカンにより占有される。
【００３２】
生物製薬学的製品を製造するために、組換えポリペプチド（１種若しくは複数）の効率的かつ再現可能な発現が可能な産生細胞株が必要とされる。該細胞株は安定かつ貯蔵可能（ｂａｎｋａｂｌｅ）である。該細胞株は、１ｍｌあたり５００，０００（５×１０５）細胞以上、好ましくは培養物１ｍｌ若しくはそれ以上あたり百万（１×１０６）以上の濃度でである高密度での増殖が可能である。多様な宿主細胞株を本目的上使用し得る。細胞の機構が生物治療生成物の最終量および組成にどのように影響するかの複雑さの理解として、必要とされる属性を生成物の製造法および組成に与えることができる宿主細胞株の選択がより明らかになる。
【００３３】
米国特許第４，４７２，５００号明細書は、ハイブリドーマ融合パートナーとして有用かつ優れた安定性および生産能力をもつラット骨髄腫細胞株を教示する。後者の細胞株は、Ｙ０、ＹＢ２、Ａｇ０、ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞、若しくはＹＢ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２）と多様に呼称され、そして下でＹＢ２／０と称するであろう。Ｌｉｆｅｌｙら（１９９５ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：８１３−８２２）は、ＣＨＯ細胞株、ＮＳ０細胞若しくはラット骨髄腫Ｙ０（ＹＢ２／０）細胞により産生されたＣＤＲ移植ヒトＩｇＧ１抗体ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈに結合された糖鎖の組成を比較した。加えてＡＤＣＣ活性を評価した。Ｙ０細胞により産生されたＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈは最高のＡＤＣＣ活性を示し、そしてＮ結合したオリゴ糖の分岐位置でＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の最高含量を有したことが報告された（図２Ａ−Ｅ）。これは、多様な型のＮ結合したオリゴ糖に分岐ＧｌｃＮＡｃを付加するグリコシルトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ ＩＩＩ）が通常はＣＨＯ細胞に存在しないためである（ＳｔａｎｌｅｙとＣａｍｐｅｌｌ、１９８４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１３３７０−１３３７８）。Ｃ２Ｂ８、リツキシマブのような治療抗体のＡＤＣＣ能力を増大させるための他の努力は、至適化されたレベルのＧｎＴ酵素をもつ宿主細胞株を工作することに焦点を当てた（Ｕｍａｎａら 米国特許第６６０２６８４号明細書）。後者の発明者は、ＧｎＴ ＩＩＩの高レベルまでの過剰発現が増殖阻害につながり、そして異なるグリコシルトランスフェラーゼＧｎＴ Ｖの過剰発現がそうであったように細胞に対し毒性であったことをさらに発見した。従って、低下された細胞生存率および生産性は、糖タンパク質を修飾するグリコシルトランスフェラーゼの過剰発現の一般的特徴でありうる。
【００３４】
多様な細胞宿主により産生されたＭａｂのオリゴ糖組成についての第二の観察結果（Ｌｉｆｅｌｙ 上記）は、ＣＨＯおよびＮＳＯが産生したＭａｂは優先的にフコシル化されたオリゴ糖を有した（図２Ｃ〜Ｄ、構造１６−３０）一方、ＹＢ２／０が産生したＭａｂは、より多くのフコシル化されない構造を包含したより複雑なパターンを有した（図２Ａ、ＢおよびＥ；構造１−１５および３１−３６）ことであった。
【００３５】
この観察結果の後、Ｎ結合したオリゴ糖構造をフコシル化する原因である酵素、すなわちｆｕｔ８の遺伝子産物かつ「ｆｕダーゼ」ともまた称されるα−１，６−フコシルトランスフェラーゼが、ＣＨＯ若しくはＮＳＯ細胞株でよりＹＢ２／０細胞中でより低かったことが示された。従って、ｆｕｔ８遺伝子は類似の効果を伴い、宿主細胞株中で操作し得る（Ｓｈｉｎｋａｗａら ２００３ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７８：３４６６−３４７３；欧州特許第ＥＰ１１７６１９５Ａ１号明細書）。さらに、二分岐オリゴ糖のガラクトシル化の相対的寄与、分岐ＧｌｃＮＡｃの存在、およびフコシル化は、フコシル化されないＭａｂが、Ｎ結合した二分岐オリゴ糖構造への他の修飾よりも、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで測定されるところのＡＤＣＣを高めるより大きな能力を表すことを示す（Ｓｈｉｅｌｄｓら ２００２．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−４０；Ｎｉｎｗａら ２００４．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４：２１２７−２１３３）。
【００３６】
目的に駆動される細胞株の開発
産生細胞株の開発は、典型的に、（マウス骨髄腫Ｓｐ２／０、ＣＤを適応させたＳｐ２／０（Ｃ４６３）およびＮＳ／０のような）宿主細胞株への抗体遺伝子のトランスフェクション、ならびに高レベルの所望の抗体を発現するトランスフェクトーマを単離することを必要とする。いくつかの例、例えば、治療抗体が生物学的標的分子を中和するよう作用するｃＡ２抗体において、抗体は、循環ＴＮＦ−αを結合しかつその後枯渇させることにより機能する。他の例において、抗体は、特定の抗原、例えば組織因子を過剰発現する癌細胞を標的とすることにより機能する。組織因子への抗体の結合は組織因子活性を中和する一方、癌細胞は、結合されたＦｃの認識により活性化される抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）経路により死滅される。抗体が標的とする細胞への溶解攻撃であるＡＤＣＣは、抗体の定常領域（Ｆｃ）へのリンパ球受容体ＦｃγＲの結合に際して誘発される。
【００３７】
本発明の組成物
本発明は、ＣＤ培地中で継続的に増殖する能力を有するクローン性骨髄腫細胞株に関する。一態様において、クローン性骨髄腫細胞株は、ＦＢＳ補充したＣＤ−Ｈｙｂ（ＣＤ−ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、Ｇｉｂｃｏ）培地から６継代にわたり培養物を徐々に離脱する（ｗｅａｎ）ことにより、ＹＢ２／０細胞バンクからクローン化される自然突然変異体である。本態様において、クローン性骨髄腫細胞株をＣ１０８３Ｂと称する。Ｃ１０８３Ｂの特徴付けは、該細胞株が親ＹＢ２／０細胞と関連しない多数の独特の増殖の特徴を有することを示した。例えば、Ｃ１０８３Ｂは血清（ＹＢ２／０親細胞株の必要な低温保存剤）の非存在下で凍結かつ融解しうる。加えて、親株と異なり、Ｃ１０８３ＢはＣＤ培地中で高細胞密度まで増殖し得る。さらなる特徴付けは、ＣＤ培地中で増殖させたＣ１０８３Ｂが、血清を補充した増殖培地中で細胞を維持する場合に観察されるものと同様若しくはより優れている、生存可能細胞密度および倍加時間を包含する増殖パラメータを表すことを示した。Ｃ１０８３Ｅと称されるＣ１０８３Ａの第二のサブクローンを、６ｍＭグルタミンのみを補充したＣＤ−Ｈｙｂ培地中へ直接の３週間のＣ１０８３Ａ細胞培養物の増殖により選択した。
【００３８】
別の態様において、クローン性骨髄腫細胞株は、レクチンを補充したＣＤ培地を用いる選択によりＣ１０８３Ｂ細胞バンクから派生される。この場合に使用するレクチンはレンズマメ（Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）アグルチニン（ＬＣＡ）であるが；しかしながら、２種のフコース特異的レクチンのいずれも選択に使用しうる。本態様において、クローン性骨髄腫細胞株をＣ１０８３ＣおよびＣ１０８３Ｄと称する。Ｃ１０８３ＣおよびＣ１０８３Ｄの増殖の特徴付けは、それらがＣＤ−Ｈｙｂ中でＣ１０８３Ｂに比較可能であったことを示した。
【００３９】
従って、Ｃ１０８３Ｂ細胞および誘導体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで無限の維持、成長および増殖が可能である。Ｃ１０８３Ｂ細胞は、増殖し、継代培養し得（すなわち新たな培養容器に繰り返し継代し得）、そして長期間低温保存し（例えば、１０％ジメチルスルホキシド若しくはグリセロールのような低温保存剤とともに液体窒素の蒸気相中に保存し）得る。Ｃ１０８３Ｂ細胞は細胞株として長期培養物で維持し得る。
【００４０】
ほとんどの部分について、本発明の細胞は、ガス交換が可能な適して無菌の環境を提供する、細胞を培養するのに使用されるいかなる容器、フラスコ、組織培養皿若しくは装置中でも増殖される。典型的には、本発明で使用される基礎（ｆｏｕｎｄａｔｉｖｅ）培養物は、細胞を既存の親Ｃ１０８３Ｂ細胞ストックから取り出し、血清含有および無血清培地中で培養容器中に入れ、そしてその後本明細書に詳細に記述されるとおり無血清状態に継代するものである。
【００４１】
好ましい一態様において、本発明の細胞、細胞株および細胞培養物は、げっ歯類若しく
は霊長類由来の免疫グロブリン若しくはそのフラグメントを産生しうる。より具体的には、免疫グロブリン若しくはそのフラグメントはマウス若しくはヒト由来でありうる。あるいは、免疫グロブリン若しくはそのフラグメントはキメラでありうるか若しくは工作されていることができる。事実、本発明は、ヒト化、ＣＤＲ移植、ファージに表示、トランスジェニックマウスに産生、至適化、突然変異誘発、無作為化され若しくは組換えられている免疫グロブリン若しくはそのフラグメントを産生する細胞、細胞株および細胞培養物をさらに企図している。
【００４２】
抗体のクラス若しくはアイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭ）は、Ｈ鎖定常領域遺伝子によりコードされる定常領域により与えられる。ヒトＩｇＧクラスのなかに、４種のサブクラス若しくはサブタイプ、すなわち最高から出発して最低への血清中のその天然の豊富さの順序で命名されたＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４が存在する。ＩｇＡ抗体は２種のサブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２として見出される。本明細書で使用されるところの「アイソタイプスイッチ」は、ＩｇＧサブクラス若しくはサブタイプ間の変化もまた指す。
【００４３】
本発明の細胞、細胞株および細胞培養物は、限定されるものでないがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ｓｌｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびそれらのいずれかの構造若しくは機能アナログを挙げることができる、免疫グロブリン若しくはそのフラグメントを産生しうる。特定の一態様において、本発明の細胞、細胞株および細胞培養物で発現される免疫グロブリンはＣＮＴＯ８６０（ヒトｈｕＩｇＧ１由来定常ドメインに融合されたｃＣＬＢ８可変ドメイン）である。
【００４４】
本発明は、抗原、サイトカイン、インテグリン、抗体、増殖因子、細胞周期タンパク質、ホルモン、神経伝達物質、受容体若しくはそれらの融合タンパク質、血液タンパク質、それらのいずれかのフラグメント、および前述のいずれかのいかなる構造若しくは機能アナログも結合する、ＣＨ２ドメイン中のグリコシル化が可能な免疫グロブリン若しくはそのフラグメントを発現する細胞、細胞株および細胞培養物をさらに提供する。好ましい一態様において、免疫グロブリン、そのフラグメント若しくは誘導体は標的細胞の表面上の抗原を結合する。とりわけ好ましい一態様において、標的細胞は腫瘍細胞、腫瘍脈管構造の細胞若しくは免疫細胞である。特定の一態様において、免疫グロブリン、そのフラグメント若しくは誘導体は組織因子に結合する。本発明の抗組織因子抗体の一例は、Ｃ１２６１と称される細胞株により産生されるＣＮＴＯ８６０である。
【００４５】
なお別の態様において、本発明の細胞、細胞株および細胞培養物は、増殖因子若しくはホルモンを含んでなる融合タンパク質を検出可能に発現しうる。本発明により企図される増殖因子の例は、限定されるものでないが、ヒト成長因子、血小板由来増殖因子、上皮細胞成長因子、線維芽細胞増殖因子、神経成長因子、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、骨形成タンパク質、トランスフォーミング増殖因子、インスリン様増殖因子、若しくはグルカゴン様ペプチド、およびそれらのいずれかの構造若しくは機能アナログを挙げることができる。
【００４６】
本発明の単離された抗体は、ＡＤＣＣ活性をもつ抗体アイソタイプ、とりわけヒトＩｇＧ１（例えばＩｇＧ１κおよびＩｇＧ１λ）を有するものを包含し、そして、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３がより少なく好ましいか、若しくはＦｃドメイン中の特定の残基に変えられた残基を含有するハイブリッドアイソタイプが他の種からのそれらの対照物である。抗体は完全長抗体（例えばＩｇＧ１）であり得るか、または、抗原結合部分、ならびにＡＤＣＣ、補体活性化およびＣ１ｑ結合を包含するエフェクター機能を導き出すことが可能なＦｃの部分若しくはドメインのみを包含し得る。
【００４７】
さらに、本発明の細胞、細胞株および細胞培養物により産生される免疫グロブリンフラグメントは、限定されるものでないが、Ｆｃ若しくは他のＣＨ２ドメイン含有構造およびそれらのいずれかの構造若しくは機能アナログを挙げることができる。一態様において、免疫グロブリンフラグメントは二量体の受容体ドメイン融合ポリペプチドである。特定の一態様において、二量体受容体ドメイン融合ポリペプチドはエタネルセプトである。エタネルセプトは、皮下に投与されかつ患者の血清中のＴＮＦαに結合してそれを生物学的に不活性にする、組換えの可溶性ＴＮＦα受容体分子である。エタネルセプトは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に連結されたヒト７５キロダルトン（ｐ７５）腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）の細胞外リガンド結合部分よりなる二量体融合タンパク質である。エタネルセプトのＦｃ成分はＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびヒンジ領域を含有するが、しかしＩｇＧ１のＣＨ１ドメインを含有しない。
【００４８】
本発明の細胞株を使用する製造に従いやすい他の生成物は、他の型の動物細胞株により現在製造されかつグリコシル化されることが可能なＣＨ２を有する治療若しくは予防タンパク質を包含する。細胞表面上の標的抗原に結合する治療的なグリコシル化されたＣＨ２ドメイン含有タンパク質がとりわけ好ましく、その細胞型は能力を奪うか若しくは身体から排除することが望ましい。多数のこうした治療抗体が、ヒトＩｇＧ１、とりわけヒトＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含んでなるＩｇＧ１κ、Ｈ鎖を含有するよう工作されている。こうした治療タンパク質は、限定されるものでないが：
【００４９】
現在ＲＥＭＩＣＡＤＥ（Ｒ）として販売されるインフリキシマブ。インフリキシマブは、１４９，０００ダルトンのおよその分子量をもつキメラＩｇＧ１κモノクローナル抗体である。それはヒト定常およびマウス可変領域から構成される。インフリキシマブは１０１０Ｍ−１の会合定数でヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ（α））に特異的に結合する。インフリキシマブは、可溶性および膜貫通の形態のＴＮＦ（α）に高アフィニティーで結合することによりＴＮＦ（α）の生物学的活性を中和し、そしてＴＮＦ（α）のその受容体との結合を阻害する。インフリキシマブにより結合された膜貫通ＴＮＦ（α）を発現する細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ ｖｉｖｏで溶解され得る。インフリキシマブは、関節リウマチ、クローン病および強直性脊椎炎の処置に指示される。インフリキシマブは、静脈内注入として与えられる３ないし５ｍｇ／ｋｇの用量、次いで処置されるべき疾患に依存してその後２、６および／若しくは８週の、ならびに８週ごとの間隔での付加的な類似の用量として与えられる。
【００５０】
ダクリズマブ（ＺＥＮＡＰＡＸ（Ｒ）として販売される）は、活性化されたリンパ球の表面上で発現されるヒト高アフィニティーインターロイキン−２（ＩＬ−２）受容体のαサブユニット（ｐ５５ α、ＣＤ２５若しくはＴａｃサブユニット）に特異的に結合する、組換えＤＮＡ技術により製造された免疫抑制性ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ダクリズマブは、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植されたマウス−ヒトキメラ抗体である。ヒト配列は、ヒトＩｇＧ１の定常ドメインおよびＥｕ骨髄腫抗体の可変枠組み領域由来であった。マウス配列はマウス抗Ｔａｃ抗体のＣＤＲ由来であった。ダクリズマブは、腎移植を受領する患者での急性臓器拒絶の予防に指示され、また、一般に、シクロスポリンおよびコルチコステロイドを包含する免疫抑制レジメンの一部として使用される。
【００５１】
バシリキシマブ（ＳＩＭＵＬＥＣＴ（Ｒ）として販売される）は、活性化されたＴリンパ球の表面上のインターロイキン−２受容体（α）−鎖（ＩＬ−２Ｒ（α）、ＣＤ２５抗原としてもまた知られる）に特異的に結合しかつ阻害する免疫抑制剤として機能する、組換えＤＮＡ技術により製造されるキメラ（マウス／ヒト）モノクローナル抗体である。アミノ酸配列に基づき、該タンパク質の計算される分子量は１４４キロダルトンである。それは、ヒトＨおよびＬ鎖定常領域遺伝子（ＩｇＧ１）、ならびにＩＬ−２Ｒ（α）に選択的に結合するＲＦＴ５抗体をコードするマウスＨおよびＬ鎖可変領域遺伝子を含有するプラスミドを発現するよう遺伝子的に工作された、樹立マウス骨髄腫細胞株の醗酵から得ら
れる糖タンパク質である。バシリキシマブは、シクロスポリンおよびコルチコステロイドを包含する免疫抑制レジメンの一部として使用される場合に、腎移植を受領する患者での急性臓器拒絶の予防に指示される。
【００５２】
アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（Ｒ）として販売される）は、ヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に特異的な組換えヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体である。アダリムマブは、ヒト由来ＨおよびＬ鎖可変領域ならびにヒトＩｇＧ１ κ定常領域をもつ抗体をもたらすファージディスプレイ技術を使用して創製された。ＨＵＭＩＲＡ（Ｒ）は、１種若しくはそれ以上のＤＭＡＲＤに対する不十分な応答を有した、中程度ないし重度に活動性の関節リウマチを伴う成人患者での構造の損傷の徴候および症状を低下させかつその進行を阻害するために指示される。ＨＵＭＩＲＡ（Ｒ）は単独でまたはＭＴＸ若しくは他のＤＭＡＲＤと組合せで使用し得る。
【００５３】
リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（Ｒ）として販売される）は、正常および悪性Ｂリンパ球の表面上で見出されるＣＤ２０抗原に向けられた、遺伝子的に工作されたキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体である。該抗体は、マウスＬおよびＨ鎖可変領域配列ならびにヒト定常領域配列を含有するＩｇＧ１ κ免疫グロブリンである。リツキシマブは、およそ８．０ｎＭのＣＤ２０抗原に対する結合アフィニティーを有する。リツキシマブは再発性若しくは難治性の低グレード若しくは濾胞性ＣＤ２０陽性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫を伴う患者の処置に指示される。ＲＩＴＵＸＡＮ（Ｒ）は４若しくは８用量にわたり週１回３７５ｍｇ／ｍ ２ ＩＶ注入で与えられる。
【００５４】
トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（Ｒ）として販売される）は、ヒト上皮細胞成長因子受容体２タンパク質ＨＥＲ２の細胞外ドメインに、細胞に基づくアッセイで高アフィニティー（Ｋｄ＝５ｎＭ）で選択的に結合する、組換えＤＮＡ由来ヒト化モノクローナル抗体である。該抗体は、ＨＥＲ２に結合するマウス抗体（４Ｄ５）の相補性決定領域とともにヒト枠組み領域を含有するＩｇＧ １ κである。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮは、その腫瘍がＨＥＲ２タンパク質を過剰発現しかつ彼らの転移性疾患に対し１種若しくはそれ以上の化学療法レジメンを受領した転移性乳癌を伴う患者の処置のための単剤療法として指示される。パクリタキセルと組合せのＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（Ｒ）は、その腫瘍がＨＥＲ２タンパク質を過剰発現しかつ彼らの転移性疾患に対し化学療法を受領したことがない転移性乳癌を伴う患者の処置に指示される。推奨される投薬量は、９０分注入として投与される４ｍｇ／ｋｇトラスツズマブの初期負荷用量、および初期負荷用量が十分に耐えられた場合に３０分注入として投与し得る２ｍｇ／ｋｇトラスツズマブの週１回維持用量である。
【００５５】
アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（Ｒ）として販売される）は、２１〜２８ｋＤの細胞表面糖タンパク質ＣＤ５２に向けられる組換えＤＮＡ由来ヒト化モノクローナル抗体（Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ）である。アレムツズマブは、本質的に全部のＢおよびＴリンパ球、単球、マクロファージおよびＮＫ細胞の大多数、顆粒球の一亜集団、ならびに男性生殖器官の組織の表面上に存在する非調節抗原ＣＤ５２に結合する。Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ抗体は、ヒト可変枠組みおよび定常領域、ならびにマウス（ラット）モノクローナル抗体（Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｇ）からの相補性決定領域をもつＩｇＧ１ κである。Ｃａｍｐａｔｈは、アルキル化剤で処置されかつフルダラビン療法に失敗した患者でのＢ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）の処置に指示される。Ｃａｍｐａｔｈの有効性の決定は全体奏功率に基づく。Ｃａｍｐａｔｈは、当初１日に２時間のＩＶ注入として投与される３ｍｇで与えられ；一旦耐えられれば、１日用量を１０ｍｇに増加させかつ耐えられるまで継続すべきである。この用量レベルが一旦耐えられれば、Ｃａｍｐａｔｈ ３０ｍｇの維持用量を開始することができ、そして１２週まで週あたり３回投与しうる。大部分の患者で、３０ｍｇへの増加は３〜７日で達成し得る。
【００５６】
オマリズマブ（ＸＯＬＡＩＲ（Ｒ）として販売される）は、ヒト免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に選択的に結合する組換えヒト化ＩｇＧ１（κ）モノクローナル抗体である。オマリズマブは、肥満細胞および好塩基球の表面上の高アフィニティーＩｇＥ受容体（Ｆｃ（ε）ＲＩ）へのＩｇＥの結合を阻害する。Ｆｃ（ε）ＲＩを持つ細胞上の表面に結合したＩｇＥの減少は、アレルギー応答のメディエーターの遊離の程度を制限する。オマリズマブでの処置はまた、アトピー患者での好塩基球上のＦｃ（ε）ＲＩ受容体の数も減少させる。オマリズマブは、通年性空気アレルゲンに対する陽性の皮膚試験若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏ反応性を有しかつその症状が吸入コルチコステロイドで不十分に制御される、中等度ないし重度の持続性喘息を伴う成人および青年（１２歳およびより上）に指示される。オマリズマブは１５０ないし３７５ｍｇの用量で２若しくは４週ごとにＳＣ投与する。
【００５７】
エファリズマブ（ＲＡＰＴＩＶＡ（Ｒ））は、ヒトＣＤ１１ａに結合する免疫抑制性組換えヒト化ＩｇＧ１ κアイソタイプモノクローナル抗体である。エファリズマブは、全白血球上で発現される白血球機能抗原−１（ＬＦＡ−１）の（α）サブユニットＣＤ１１ａに結合し、そしてＣＤ１１ａの細胞表面発現を減少させる。エファリズマブは、細胞内接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）へのＬＦＡ−１の結合を阻害して、それにより他の細胞型への白血球の接着を阻害する。ＬＦＡ−１とＩＣＡＭ−１の間の相互作用は、Ｔリンパ球の活性化、内皮細胞へのＴリンパ球の接着、および乾癬の皮膚を包含する炎症の部位へのＴリンパ球の移動を包含する複数の過程の開始および維持に寄与する。リンパ球の活性化および皮膚への輸送は慢性の尋常性乾癬の病態生理学である役割を演じている。乾癬の皮膚では、ＩＣＡＭ−１の細胞表面発現が内皮およびケラチノサイト上で上方制御されている。ＣＤ１１ａは、Ｂリンパ球、単球、好中球、ナチュラルキラー細胞および他の白血球の表面上でもまた発現されている。従って、エファリズマブがＴリンパ球以外の細胞の活性化、接着、移動および数に影響を及ぼす可能性が存在する。ＲＡＰＴＩＶＡ（Ｒ）の推奨用量は、単回の０．７ｍｇ／ｋｇ ＳＣ馴化用量、次いで１ｍｇ／ｋｇの週１回のＳＣ用量（合計２００ｍｇを超えない最大単回用量）である。
を挙げることができる。
【００５８】
別の態様において、本発明の細胞株は、免疫グロブリンに由来しないポリペプチドを発現するように安定にトランスフェクト若しくは別の方法で工作されている。
【００５９】
なお別の態様において、本発明の細胞、細胞株および細胞培養物は、組換え血液タンパク質若しくは他の結合組織タンパク質を検出可能に発現しうる。こうした組換えタンパク質は、限定されるものでないが、エリスロポエチン、トロンボポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、フィブリノーゲン、ヘモグロビン、トランスフェリン、アルブミン、プロテインｃ、コラーゲン、およびそれらのいずれかの構造若しくは機能アナログを挙げることができる。特定の一態様において、本発明の細胞、細胞株および細胞培養物は組織プラスミノーゲンアクチベーターを発現する。
【００６０】
本発明の抗体およびタンパク質をコードする核酸は、当該技術分野で公知のいくつかの方法で派生させ得る。一局面において、抗体は、マウスを本発明のペプチドで免疫することにより製造されるハイブリドーマから便宜的に得られる。抗体は従って、当該技術分野で公知のハイブリドーマ技術（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ニューヨーク（１９８７−２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）；ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク（１９９４−２００１）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州ニューヨーク（１９９７−２００１）（それぞれそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい）のいずれを使用しても得ることができる。
【００６１】
抗体の標的結合部分、典型的には抗体の可変Ｈおよび／若しくは可変Ｌドメインの別の便宜的派生方法において、例えばファージライブラリーで創製されるこうした結合ドメインのライブラリーからこれらの部分を選択する。ファージライブラリーは、無作為オリゴヌクレオチドのライブラリー、または免疫した動物若しくはヒトのＢ細胞からのような目的の配列を含有するポリヌクレオチドのライブラリー（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５−１３１７）を挿入することにより創製し得る。抗体ファージライブラリーは、１ファージ中にＨおよびＬ鎖可変領域対を含有し、一本鎖Ｆｖフラグメント若しくはＦａｂフラグメントの発現を可能にする（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら
２０００、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１（８）３７１−８）。ファージミドライブラリーの多様性は、付加的な所望のヒトモノクローナル抗体を製造しかつその後同定するようにライブラリーのモノクローナル抗体の免疫特異性を増大しかつ／若しくは変えるように操作し得る。例えば、Ｈ鎖およびＬ鎖免疫グロブリン分子をコードする遺伝子を、集成された免疫グロブリン分子中で新たなＨＬ対を創製するように無作為に混合（シャッフル）し得る。加えて、ＨおよびＬ鎖をコードする遺伝子のいずれか若しくは双方を、免疫グロブリンポリペプチドの可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）中で突然変異誘発し得、そしてその後、所望のアフィニティーおよび中和能力についてスクリーニングし得る。抗体ライブラリーは、１種若しくはそれ以上のヒト枠組み配列を選択すること、およびヒト抗体レパートリー由来のＣＤＲカセットの集合物を導入することにより、または設計された変動（Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒとｖｏｎ Ｒｕｄｅｎ ２０００、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３：５９８−６０２）によってもまた合成で創製し得る。多様性の位置はＣＤＲに制限されないが、しかし、可変領域の枠組みセグメントもまた包含し得るか、若しくはペプチドのような抗体可変領域以外を包含しうる。
【００６２】
抗体可変領域以外を包含しうる標的結合成分の他のライブラリーは、リボソームディスプレイ、酵母ディスプレイおよび細菌ディスプレイである。リボソームディスプレイは、タンパク質をＲＮＡに結合されたまま保ちながらのｍＲＮＡのそれらの同族のタンパク質への翻訳方法である。核酸のコーディング配列はＲＴ−ＰＣＲにより回収される（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ，Ｌ．Ｃ．ら １９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１、９０２２）。酵母ディスプレイは、膜結合α−アグルチニン酵母接着受容体ａｇａ１およびａｇａ２（接合型系の一部）の融合タンパク質の構築に基づく（Ｂｒｏｄｅｒら １９９７．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５：５５３−７）。細菌ディスプレイは、細胞膜若しくは細胞壁と会合する輸送された細菌タンパク質への標的の融合に基づく（ＣｈｅｎとＧｅｏｒｇｉｏｕ ２００２．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ、７９：４９６−５０３）。
【００６３】
ハイブリドーマ技術に比較して、ファージおよび他の抗体ディスプレイ法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでかつ抗原に対する宿主の影響の可能性の制限なしに、若しくはその逆で、抗原標的に対する選択を操作する機会を提供する。
【００６４】
製造方法
安定にトランスフェクトされたとして一旦樹立されれば、本発明のＹＢ２／０細胞株を低温保存しかつ製造操作を開始するために再生し得る。典型的には、該細胞株は１０％ＤＭＳＯを補充したＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ培地中、バイアルあたり１×１０７細胞で貯
蔵する。製造操作の開始時に、細胞のバイアルを融解し、１０ｍｌのＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ培地を含有するフラスコに内容物を移し、そしてフラスコを３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートする、その後、培養物をより大きな容器中で増殖させ、それを順に所望の容量の灌流バイオリアクターに移す（Ｄｅｏら １９９６．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１２：５７−６４）。
【００６５】
例えば、本発明のクローン性骨髄腫細胞株は、約０．０１ｍｇ／Ｌないし約１０，０００ｍｇ／Ｌ培地の濃度で組換えタンパク質を産生するよう操作しうる。別の態様において、本発明のクローン性骨髄腫細胞株は、約０．１ｐｇ／細胞／日ないし約１００ｎｇ／細胞／日の濃度で組換えタンパク質を産生するよう操作しうる。
【００６６】
本発明のＣ１０８３Ｂ〜Ｅ細胞の増殖および維持を支援するために本発明で有用な培地若しくは増殖培地は、無血清培地（ＳＦＭ）、無タンパク質培地（ＰＦ）、動物由来成分を含まない（ＡＤＣＦ）培地、および既知組成（ＣＤ）処方を包含する。本発明で使用されるところのＣＤ培地は、血清、血清タンパク質、加水分解物、若しくは未知組成の化合物を包含する動物起源のいかなる成分も欠く増殖培地を含んでなる。ＣＤ培地の全成分は既知の化学構造を有し、以前に論考されたバッチごとの変動性の排除をもたらす。
【００６７】
本発明で使用されるＣＤ培地は、限定されるものでないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州カールズバッドにより製造されるＣＤ培地、ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（カタログ番号１１２７９）を挙げることができる。ＣＤ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ培地は、多様なハイブリドーマおよび骨髄腫の増殖、ならびに静止若しくは攪拌懸濁系でのモノクローナル抗体の製造に至適化された既知組成の無タンパク質培地である。ＣＤ
Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ培地は動物、植物若しくは合成起源のタンパク質を含有しない。処方中に、定義されないライセート若しくは加水分解物もまた存在しない。ＣＤ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ培地は、増大された安定性のためＬ−グルタミンを含まず処方される。グルタミンは、使用前の培地１，０００ｍｌあたり４０ｍｌの２００ｍＭ Ｌ−グルタミン若しくは４０ｍｌのＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ−Ｉ補充物（またＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）として添加しうる。Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ培地のマスターファイルがＦＤＡに提出されている。ＣＤ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ培地は、ＮＳＯ由来株のような脂質依存性若しくはコレステロール依存性の培養物に対し至適化されていない。
【００６８】
増殖プロファイルのため、ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ培地に１ｇ／Ｌ ＮａＨＣＯ３、および６ｍＭの最終濃度までのＬ−グルタミンを補充した。本発明は、「Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ Ｆｏｒ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（培養哺乳動物細胞のための既知組成培地）」と題されたＰＣＴ公開第ＷＯ ０２／０６６６０３号明細書（引用することにより明らかに組み込まれる）に記述される「ＣＤＭ培地」を包含する既知組成培地の使用もまた企図している。
【００６９】
エフェクター機能の評価方法
治療的Ｆｃ含有タンパク質の消失および従って薬物動態における抗体グリコシル化の役割は不明である。すなわち、循環からのＩｇＧ除去の原因と考えられる新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合は、抗体のＦｃ部分のＮ結合したオリゴ糖の欠如により破壊されないようである。
【００７０】
細胞のエフェクター機能とＩｇＧ抗体媒介性免疫応答を結びつけるＩｇＧ Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）は、Ｆｃγ受容体、すなわちＦｃＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を包含する。全３種は単球上に表示されて見出される。しかしながら、多様な標的細胞上のこれらの受容体の生成は差別的にかつ他の因子に応答して起こるようである。従って、Ｆｃγ受容体に対するグリコシル化が改変されたＦｃ含有生物学的治療薬のアフィニティーの測定は、高められたエフェクター機能を予測するた
めの１つの適切な測定である。
【００７１】
それらのＦｃグリカン中の低レベルのフコースを伴うヒトＩｇＧ１ Ａｂは、ヒトＣＤ１６ ＦｃＲに対するより大きいアフィニティー、および、ヒトＰＢＭＣエフェクター細胞を使用するＡＤＣＣアッセイで劇的に高められたｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を有することが報告された（Ｓｈｉｎｋａｗａら Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８（５）：３４６６−３４７３、２００３；Ｓｈｉｅｌｄｓら Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７（３０）：２６７３３−２６７４０、２００２；Ｕｍａｎａら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ １７：１７６−１８０、１９９９）。しかしながら、マウスＣＤ１６およびＣＤ３２ ＦｃＲに対するこうしたＡｂのアフィニティーは高フコースＡｂのものより高くなかったという報告（Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００２）後は、マウスで低フコースＡｂを研究するより少ない動機が存在した。にもかかわらず、ＣＣケモカイン受容体４に対するキメラヒトＩｇＧ１ Ａｂの高フコースおよび低フコースバージョンの抗腫瘍活性を比較した場合に、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣ活性の差違は観察されなかった（マウスエフェクター細胞を使用して）が、しかしながら、低フコースＡｂはｉｎ ｖｉｖｏでより強力な有効性を示した。ヒトエフェクター細胞は提供されず、そしてマウスは内因性ＮＫ細胞を保持する（Ｎｉｗａら Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６４：２１２７−２１３３、２００４）。
【００７２】
ヒトＮＫ細胞上のＣＤ１６受容体は、ＩｇＧ１ Ａｂのフコースレベルに対する高められた感受性を示したため、これらのデータは、ヒトエフェクター細胞で研究されたものと異なる機構がマウスで作動していることを示唆する。１つの可能性は、より最近発見されたマウスＣＤ１６−２受容体である（Ｍｅｃｈｅｔｉｎａら Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ ５４：４６３−４６８、２００２）。マウスＣＤ１６−２の細胞外ドメインは、より良好に知られているマウスＣＤ１６受容体が有するよりもヒトＣＤ１６Ａに対する有意により高い配列同一性（６５％）を有し、それが結合するＩｇＧのフコースレベルに対しマウスＣＤ１６よりもそれがより感受性でありうることを示唆する。マウスマクロファージ様Ｊ７７４細胞でのその報告された発現は、ＣＤ１６−２を発現するマウスマクロファージが、Ｎｉｗａら（２００４）により記述された低フコースＡｂによるより大きな抗腫瘍活性の原因でありうる可能性と矛盾しない。従って、マウスエフェクター細胞へのヒトＩｇＧ１型Ｆｃ含有タンパク質によるＦｃ受容体の結合の研究は予測的でない。
【００７３】
エフェクター機能の別の評価方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイを定量的様式で使用することによる。従って、標的およびエフェクター細胞株の正しい選択、ならびに駆動することを継続することの細胞の不能若しくは内的含有物の遊離、例えば５１クロム遊離のいずれかにより細胞の「死滅」を評価することにより、その同族のリガンドを表示する細胞の破壊を引き起こす結合した抗体の能力を測定するように、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを設計し得る。標的細胞は、本発明の抗体、抗体フラグメント若しくは融合タンパク質の標的リガンドを通常発現する細胞株でありうるか、または標的タンパク質をその表面上で発現しかつ保持するよう工作しうる。こうした工作された細胞株の一例がＫ２細胞、すなわち成熟サイトカインのアミノ酸１−１２の欠失の導入により膜貫通形態として留まる組換えヒトＴＮＦをその表面上で安定に発現するＳｐ２／０マウス骨髄腫細胞株である（Ｐｅｒｅｚら、Ｃｅｌｌ ６３：２５１−２５８、１９９０）。この細胞株は、抗ＴＮＦ抗体、抗体フラグメント、またはＦｃドメイン若しくはＦｃドメイン活性を有する工作された抗ＴＮＦαを標的とする融合タンパク質のＡＤＣＣ活性の変化を評価するのに有用である。
【００７４】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣ活性アッセイのためのエフェクター細胞は、ヒト若しくは他の哺乳動物供給源のＰＢＭＣ（末梢血単球細胞）でありうる。ＰＢＭＣエフェクター細胞は、承認された方法によりドナーから血液を収集した後から新たに単離し得る。使用しうる他の単球若しくはマクロファージ細胞は、腹腔滲出液のような滲出液由来からのもの
でありうる。
【００７５】
本発明を全般的条件で記述した一方、本発明の態様は以下の実施例にさらに開示されるであろう。
【００７６】
実施例
【実施例１】
【００７７】
ＡＰＦ−ＹＢ２／０細胞株の適応およびクローニング
５％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳ）中で培養したラットハイブリドーマ細胞株ＹＢ２／０（Ｃ１０８３Ａ）を、２種の異なる方法により、ＡＰＦ培地ＣＤ−ＨｙｂすなわちＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（Ｇｉｂｃｏ）中で増殖するように適応させた：
【００７８】
方法１．細胞を、６ｍＭグルタミンを補充したＣＤ−Ｈｙｂ培地中で１：１で繰り返し継代することにより、ＦＢＳ含有培地からゆっくり離脱させた。６継代後に該細胞はＡＰＦ培地中での増殖が可能となった。この細胞株をＣ１０８３Ｂと称した（表Ｉ）。ＣＤ−ＨｙｂおよびＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳ中でのＣ１０８３Ｂの増殖の特徴は比較可能であった（図３）。Ｃ１０８３Ｂからの個々のクローンを、ＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳを使用する限界希釈法により単離した。２４個のクローンをスケールアップのため移し、そしてこの実験からの８クローンをさらなる研究のため選択した。これらの８クローンの選択の基準は、平均倍加時間（ＭＤＴ）、振とうフラスコ培養物中で高細胞密度に達する能力、および複数の継代にわたる安定性を包含した。
【００７９】
【表１】
【００８０】
方法２．２００、５００、１０００若しくは５０００個のＣ１０８３Ａ細胞を、６ｍＭグルタミンを補充したＣＤ−Ｈｙｂ培地中で９６ウェルプレート（各範疇について５プレート）のウェルにつきプレーティングした。３週のインキュベーション後、５０００細胞／ウェルを含むプレートのみがおよそ１０ウェル／プレートのコロニーを有した。２４個のクローンを増殖のため２４ウェルプレートに移した。平均倍加時間、振とうフラスコ培養物中で高細胞密度に達する能力、および複数の継代にわたる安定性に基づき、４クローンをさらなる研究のため採った。
【００８１】
方法１により生成された８個および方法２により生成された４個の１２クローンを、ＣＤ−Ｈｙｂ培地中での増殖の特徴、すなわち平均倍加時間、振とうフラスコ培養物中で高細胞密度に達する能力、および複数の継代にわたる安定性について比較した。４クローンを、さらなる研究のためこの実験から選択した（Ｃ１０８３Ｂ−１、Ｃ１０８３Ｂ−１２
、Ｃ１０８３−Ｈ１８およびＣ１０８３−Ｈ２１）。全４種は比較可能な増殖の特徴を有した。それらのＭＤＴはおよそ２２時間であり、また、それらは振とうフラスコ培養物中で高細胞密度（＞２×１０６／ｍｌ）に達することが可能であった（図４）。該４種の細胞株のうち３種（Ｃ１０８３Ｂ−１、Ｃ１０８３Ｂ−１２およびＣ１０８３−Ｈ２１）をその後、ＡＭＡＸＡ電気穿孔装置、および骨髄腫細胞株のトランスフェクションについて以前に至適化された設定を使用して、それらのトランスフェクション効率を決定するため試験した。細胞株Ｃ１０８３Ｂ−１２を、所望の特徴をもつＡＰＦ−ＹＢ２／０細胞株としてこの試験から選び、そしてＣ１０８３Ｂに加えて代替のトランスフェクション宿主細胞株としてはたらくことができる。それをＣ１０８３Ｅと称した。
【実施例２】
【００８２】
フコース特異的レクチンに耐性のＹＢ２／０クローンの単離
レクチンは特定の１つの型のオリゴ糖を発現する細胞株を選択するのに使用し得る（ＲｉｐｋａとＳｔａｎｌｅｙ、１９８６．Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｇｅｎ １２：５１−６２）。利用可能な２種のフコース特異的レクチンのうち、レンズマメ（Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）アグルチニン（ＬＣＡ）を、Ｃ１０８３Ｂを使用する（棒グラフの形態の）死滅曲線（図５）を生成するため選択した。（ＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳ中で培養した）Ｃ１０８３Ｂ細胞を、多様な濃度のＬＣＡレクチンの存在下に９６ウェルプレートに５０００細胞／ウェルでプレーティングした。５日後に、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイ（Ｖｙｂｒａｎｔ細胞代謝アッセイキット、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）により生存率を測定した。
【００８３】
低下されたレベルのｆｕｔ８ ｍＲＮＡ（配列番号１）を発現するＣ１０８３Ｂのまれな天然のバリアントを、５０μｇ／ｍｌのＬＣＡの存在下に９６ウェルプレート中で５細胞／ウェルをプレーティングすることにより選択した。３週後に１７個の耐性クローン（プレーティングした２×１０４細胞から）を同定した。これらをスケールアップし、そしてＣＤ−Ｈｙｂ培地中で複数回継代した。１７クローンのうち８個を、確実な増殖、振とうフラスコ培養物中で高細胞密度に達する能力、および複数回の継代にわたる培養物の安定性に基づき選択した。全ＲＮＡをこれらのクローンから単離した。２組のラット特異的ｆｕｔ８ Ｔａｑｍａｎプローブ（下線を付ける）およびプライマー（斜体にする）（配列番号２〜７、図６Ａ）を使用する定量的ＰＣＲ実験。
【００８４】
これらの分析は、１クローン（Ａ４）が６倍より少ないｆｕｔ８ ｍＲＮＡを有した一方、２種の他のクローン（Ａ８およびＡ９）がおよそ２倍より少ないｆｕｔ８ ｍＲＮＡを有したことを示した（図６Ｂ）。クローンＡ４をＣ１０８３Ｃと称し、また、クローンＡ９をＣ１０８３Ｄと称した。図７ＡおよびＢからのデータは、ＣＤ−Ｈｙｂ中でのＣ１０８３ＣおよびＣ１０８３Ｄの増殖の特徴が、培地容量あたりの生存可能細胞（図７Ａ）および全細胞生存率（図７Ｂ）に基づき、親株Ｃ１０８３Ｂのものに匹敵することを示す。
【実施例３】
【００８５】
抗組織因子抗体ＤＮＡでのＣ１０８３Ｂ細胞のトランスフェクション
抗ヒト組織因子抗体ＣＮＴＯ ８６０は、マウスでの癌のヒト異種移植モデルで試験されたところの腫瘍増殖を低下若しくは予防することにおけるその有効性のため選択した。図８に示されるところのＣＮＴＯ ８６０ ＨおよびＬ鎖をコードする発現ベクター（ｐ２４０１およびｐ２４０２）は第ＷＯ／０４１１０３６３号および米国特許出願第１１／０１０，７９７号明細書にさらに記述される）をｐＳＶ２ＤＨＦＲ（Ｐｒｏｍｅｇａ）とコトランスフェクトし、そして、選択マーカーＭＨＸ、（ミコフェノール酸、ヒポキサンチンおよびキサンチン）に耐性のクローンを、抗体発現についてＥＬＩＳＡにより分析した。１個の高発現細胞株Ｃ１２６１Ａをさらなる研究のため選択した。それは振とうフラ
スコ培養物でＣＤ−Ｈｙｂ培地中で４５〜５０ｍｇ／Ｌを産生し、そして複数の継代にわたる発現の安定性を示した（図９）。増殖および抗体力価を１×Ｌｉｐｉｄ（Ｇｉｂｃｏ）の非存在および存在下でモニターした。
【実施例４】
【００８６】
Ｃ１０８３Ｂ由来の抗組織因子抗体のＡＤＣＣ活性の測定
一連のｉｎ ｖｉｔｒｏ ５１Ｃｒ遊離細胞傷害性アッセイを、数種の抗組織因子抗体、すなわち、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃを含有するＣＮＴＯ８５９（欧州特許第ＥＰ８３３９１１Ｂ１号明細書に記述される）；ＣＮＴＯ８５９と同一の抗原結合領域を有するがしかしヒトＩｇＧ１枠組みにクローン化されており、そして従ってＨ鎖について配列番号８およびＬ鎖について配列番号９の配列を有するヒト化抗体を産生するＣＮＴＯ８６０（２００４年１２月１３日出願の米国特許出願第１１／０１０７９７号明細書に記述されるところの）；ならびにＹＢ２／０ ＣＤ−Ｈｙｂに適応させた細胞株でＣＮＴＯ８６０抗体を産生することの結果としてのグリコシル化バリアント、若しくはｆｕｔ８欠損バリアントのＡＤＣＣ活性の増強を示すために使用した。
【００８７】
組織因子を発現するヒト結腸癌細胞ＨＣＴ １１６を標的細胞として使用した。細胞は、１０％熱不活性化ＦＢＳおよび１％ＬＮＮを補充したマッコイ５Ａ培地（Ｍ５Ａ−１０）中で維持した。アッセイの日に細胞をトリプシン処理し、収集し、そして１ｍＬのＭ５Ａ−１０中３７℃で２００μＣｉのＮａ５１ＣｒＯ４（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、マサチューセッツ州ボストン）あたり１０×１０６細胞で２時間標識した。標識した細胞は、５０ｍＬのカルシウム若しくはマグネシウムを含まないＰＢＳ（ＰＢＳ−）で２回洗浄し、そして４×１０５細胞／ｍＬ Ｍ５Ａ−１０に再懸濁した。
【００８８】
ＰＢＭＣは健康ドナーから単離した。静脈血をヘパリン化シリンジに収集し、そして等容量のＰＢＳ−で５０ｍＬコニカルチューブに希釈した（２０ｍＬ：２０ｍＬ）。この血液溶液の上に１３ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、スウェーデン・ウプサラ）を置き、そして室温（ＲＴ）で２２００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上の血漿層を吸引し、そしてＰＢＭＣを含有する界面（バフィ層）を収集した。エフェクター細胞をＰＢＳ−で３回洗浄し、そしてその後５×１０６細胞／ｍＬでＭ５Ａ−１０に再懸濁した。２５：１というエフェクター対標的比を全実験に使用した。
【００８９】
第一の実験で、組織因子に対するモノクローナル抗体すなわちＣＮＴＯ ８５９、ＣＮＴＯ ８６０およびＣＮＴＯ ８６０ ＹＢ２／０のＡＤＣＣ活性を、２名の異なるドナーからのＰＢＭＣを使用して特徴付けした（図１０Ａ）。特異的溶解を４時間後に測定し、そして各棒は双方のドナーからの３検体の平均を代表する。自発および最大遊離の対照サンプルは、それぞれ、２μｇ／ｍＬの抗体の存在下しかしエフェクター細胞の非存在下で培地単独で処理したか、若しくは０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で処理した。各サンプル中の特異的溶解の比率は、自然に遊離したｃｐｍにより補正したＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００により遊離されたｃｐｍ（最大遊離）に基づき計算した。
【００９０】
ＩｇＧ４サブタイプ、ＣＮＴＯ ８５９は、マウス骨髄腫宿主細胞株Ｃ４６３により産生されるＩｇＧ１サブタイプ、ＣＮＴＯ ８６０に比較して最小のＡＤＣＣ活性を有する。対照的に、ＹＢ２／０宿主細胞株Ｃ１０８３Ｂ由来のＣＮＴＯ ８６０は、それらのＥＣ５０および最大溶解値を比較した場合に、Ｃ４６３由来のものよりおよそ２０〜６０倍より強力であった（図１０Ａ）。ＹＢ２／０由来のＣＮＴＯ ８６０は、９９％フコシル化されたＣ４６３由来のＣＮＴＯ ８６０に比較して、４０％フコシル化された。
【００９１】
第二の実験で、３種の細胞株由来のＣＮＴＯ ８６０、すなわちＣ４６３；無動物タンパク質に適応させたＹＢ２／０細胞株Ｃ１０８３Ｂ、およびｆｕｔ８枯渇ＹＢ２／０細胞
株Ｃ１０８３Ｃを、それらの相対ＡＤＣＣ効力について比較した。特異的溶解を４時間後に測定し、そして、棒は単一ドナーからの３検体の平均を表す。
【００９２】
Ｃ１０８３Ｂ細胞株由来のＣＮＴＯ ８６０は、マウス骨髄腫宿主細胞株Ｃ４６３由来のものよりおよそ１０倍より強力であった（図１０Ｂ）。
【００９３】
親ＹＢ２／０由来細胞株Ｃ１０８３Ｂおよびｆｕｔ８枯渇クローンＡ４−２、Ｃ１０８３Ｃ由来のＣＮＴＯ ８６０の間で、ＡＤＣＣ活性の差違は観察されなかった。これらの結果は、フコースレベルをさらに低下させることによるＡＤＣＣ活性のさらなる増大はｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ法を使用して測定可能でなかったことを示す。
【実施例５】
【００９４】
抗体グリコシル化の分析
Ｃ４６３および多様なトランスフェクション宿主細胞株で生成されたＣＮＴＯ ８６０のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を実施した。
【００９５】
Ｃ４６３（図１１Ａ）、ＡＰＦに適応させたラット骨髄腫ＹＢ２／０宿主細胞株Ｃ１０８３Ｂ（図１１Ｂ）およびｆｕｔ８枯渇ＹＢ２／０宿主細胞株Ｃ１０８３Ｃ（図１１Ｃ）で生成されたＣＮＴＯ ８６０を、公表されたプロトコル（Ｐａｐａｃら、１９９６；Ｐａｐａｃら、１９９８；Ｒａｊｕら、２０００）に従ってＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析にかけた。
【００９６】
試験Ａｂを多様な方法により構造解析した。無傷のＩｇＧ ＡｂのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を実施するため、ＩｇＧサンプルを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．０中にもたらし、そして濃度を約１ｍｇ／ｍＬ緩衝液に調節した。約２μｌのＩｇＧ溶液を２μｌのマトリックス溶液（マトリックス溶液は、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水中５０％アセトニトリル１．０ｍｌに１０ｍｇのシナピン酸を溶解することにより調製した）と混合し、そしてこの溶液２ｍｌを標的に負荷しかつ風乾させた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳはＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティ）からのＶｏｙａｇｅｒ ＤＥ装置を使用して取得した。
【００９７】
遊離されたＦｃグリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を実施するため、ＩｇＧサンプル（約５０μｇ）を１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（５０μｌ）ｐＨ７．０中でＰＮＧアーゼＦで３７℃で４時間消化した。反応混合物を５０％酢酸（約５μｌ）で酸性化することにより消化を停止し、そしてその後、以前に記述された（Ｐａｐａｃら、１９９６；Ｐａｐａｃら、１９９８；Ｒａｊｕら、２０００）とおり陽イオン交換樹脂カラムを通過させた。酸性および中性のオリゴ糖の混合物を含有するこれらのサンプルを、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティ）からのＶｏｙａｇｅｒ ＤＥ装置を使用して、別の場所（Ｐａｐａｃら、１９９６；Ｐａｐａｃら、１９９８；Ｒａｊｕら、２０００）に記述されたとおり、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより陽および陰イオンモードで分析した。
【００９８】
多様なＹＢ２／０細胞で産生された抗体サンプルからの遊離されたグリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を図１１Ａ〜Ｃに示し、また、該オリゴ糖の構造を図２Ａ〜Ｅに描く。オリゴ糖は、コアフコース、分岐ＧｌｃＮＡｃの存在、シアル酸、ガラクトースなどのような末端糖の存在若しくは非存在に基づき配列中で番号付けする。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳデータは、ＹＢ２／０細胞で産生された抗体サンプルが増大された量のフコシル化されていないオリゴ糖を含有することを示唆する（図２Ａ〜Ｂ、構造１−１５）。フコシル化されていないオリゴ糖の量は、ある種の抗体サンプルについて５０％から９５％まで変動する。加えて、分岐ＧｌｃＮＡｃを含有するフコシル化されていないオリゴ糖の増
大もまた、ＹＢ２／０由来抗体サンプルで観察された。さらに、ＹＢ２／０細胞由来の抗体サンプルは、フコシル化されずかつ分岐ＧｌｃＮＡｃを含有するオリゴ糖の存在により、増大された均質性および／若しくはより均質な構造いずれかを含有する。対照的に、他の細胞型で産生された抗体サンプルは、オリゴ糖のより不均質な構造を含有する傾向があり（図２Ａ〜Ｅ、構造１−３６）、より規定されかつ均質なオリゴ糖構造の存在による増大された活性を伴う治療抗体サンプルを産生するＹＢ２／０細胞の価値を示す。さらに、ＹＢ２／０細胞で産生された抗体サンプルは、ＨＥＫ若しくはＮＳ／０のような他の細胞株で産生された抗体サンプルに比較して、より低い比率の高マンノース含量を伴う構造を含有する傾向がある（図２Ｅ、構造３１−３６）。
【実施例６】
【００９９】
抗ＴＮＦα ＭａｂのＣ１０８３Ｂ／Ｃ発現
数種の骨髄腫宿主細胞株（Ｓｐ２／０、ＮＳ０およびＹＢ２／０）でのＣＮＴＯ ８６０発現レベルの検査は、これらの細胞株で産生される他の抗体に比較して比較的より低レベルの抗体産生を示した。従って、本発明のＹＢ２／０由来宿主細胞株での発現に代替抗体を選択した。Ｃ１０８３Ｂ ＹＢ２／０細胞およびＣ１０８３Ｃ ＹＢ２／０細胞を、記述される（Ｋｎｉｇｈｔら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３０：１４４３−１４５３、１９９３；第ＷＯ０２／０１２５０２号明細書）ところの電気穿孔法により、ＣＮＴＯ １４８と称されるヒト抗ＴＮＦα Ｍａｂ（Ｇｌｉｍｕｍａｂ）をコードする、Ｈ（これの可変領域は配列番号１０である）およびＬ鎖（これの可変領域は配列番号１１である）をコードするプラスミド（それぞれプラスミドｐ１７８３およびｐ１７７６）でトランスフェクトした。トランスフェクトしたＹＢ２／０由来細胞のミコフェノール酸耐性コロニーを、記述される（Ｋｎｉｇｈｔら、１９９３）ところのヒトＩｇＧについてのＥＬＩＳＡにより、それらの培養上清中のＣＮＴＯ １４８の存在についてアッセイした。トランスフェクタント（＃１４ Ｃ１０８３Ｂトランスフェクタントおよび＃１ Ｃ１０８３Ｃトランスフェクタント）を、ＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ、１％グルタミン、１×ＭＨＸ選択（０．５μｇ／ｍｌミコフェノール酸、２．５μｇ／ｍｌヒポキサンチン、５０μｇ／ｍｌキサンチン）中で１リットルの容量までスケールアップし、細胞生存率が＜２０％になるまで培養物を過剰増殖させた。標準的プロテインＡクロマトグラフィーはＣＮＴＯ １４８の２サンプルを精製するために使用した。該精製は、Ｃ１０８３Ｂトランスフェクト細胞から１．３ｍｇのＣＮＴＯ １４８およびＣ１０８３Ｃトランスフェクト細胞から３．２ｍｇのＣＮＴＯ １４８を生じた。
【０１００】
Ｃ１０８３Ｂ−１４８−１４および別のクローンＣ１０８３Ｂ−１４８−３３をハロ（Ｈａｌｏ）サブクローニングにかけた。２１個のハロをクローン３３の第１回のハロ（Ｈａｌｏ）から採り、その１サブクローンＣ１０８３Ｂ−１４８−３３−１９が振とうフラスコ中で約８９μｇ／ｍＬを発現した。増殖および２回目のハロ（Ｈａｌｏ）に際して、サブクローンＣ１０８３Ｂ−１４８−３３−１９−４２が振とうフラスコ中で約１０５μｇ／ｍＬの力価を表した。このクローンはＡＰＦ培地に適応されている。
【０１０１】
ＹＢ２／０由来ＣＮＴＯ １４８の生物分析的特徴付け
ＰＮＧアーゼＦに遊離されるオリゴ糖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析（図１２Ａ〜Ｃ）は、ＹＢ２／）由来宿主細胞Ｃ１０８３ＢおよびＣ１０８３Ｂからのオリゴ糖の８０％以上がフコシル化されていなかったことを示した。予期しないことに、Ｃ１０８３Ｃ由来ＣＮＴＯ １４８のフコース含量は、Ｃ１０８３Ｂ由来ＣＮＴＯ １４８のものより低くないことが見出された（図１２ＢおよびＣ）。これらの抗体サンプルからのオリゴ糖は、増大された量のフコースを伴わない分岐ＧｌｃＮＡｃもまた含有し、ＮＳ／０宿主細胞で産生された抗体からのオリゴ糖よりもより均質であるようである（図１２Ａ）。
【０１０２】
ＹＢ２／０由来ＣＮＴＯ １４８を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイ。Ｋ２
若しくはＣ４８０Ａ細胞と称される標的細胞は、成熟サイトカインのアミノ酸１−１２の欠失の導入により膜貫通形態として留まる組換えヒトＴＮＦをその表面上で安定に発現するＳｐ２／０マウス骨髄腫細胞株である（Ｐｅｒｅｚら、１９９０ 上記）。Ｋ２細胞を、熱不活性化ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸および１×ＭＨＸ選択を含有するイスコフ培地中で培養した。Ｋ２細胞は２〜３日ごとに１：５で継代した。
【０１０３】
アッセイの日に、Ｋ２細胞を遠心分離しかつＰＢＳで１回洗浄した。細胞を培地で約１×１０６細胞／ｍｌに調節し、そして、１５マイクロリットルのＢＡＴＤＡ蛍光標識試薬（Ｄｅｌｆｉａ ＥｕＴＤＡ細胞傷害性試薬キット中、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ中）を５ｍｌの細胞に添加した（Ｂｌｏｍｂｅｒｇら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９３：１９９−２０６、１９９６）。細胞を３７℃で３０分間インキュベートし、その後ＰＢＳで１０００ｒｐｍで５分間２回洗浄した。ＰＢＭＣエフェクター細胞と混合する直前に標的細胞を遠心分離し、そして１％ＢＳＡを含有するイスコフ培地に２×１０５細胞／ｍｌで再懸濁した。
【０１０４】
ＰＢＭＣエフェクター細胞は、ヘパリン化ヴァキュテーナーに血液を収集しかつＰＢＳで２倍に希釈した後に健康ドナーから単離した。３０ｍｌの希釈血液を、５０ｍｌコニカルチューブ中で１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、スウェーデン・ウプサラ）の上に重ね、そして室温ＲＴで１５００ｒｐｍで３０分遠心分離した。ＰＢＭＣを含有する界面（バフィ層）を収集しかつＰＢＳで２回洗浄し、そして１２００ｒｐｍ、１０分間ＲＴで遠心分離した。細胞を、５％熱不活性化ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび０．１ｍＭ非必須アミノ酸を含有するイスコフ培地に再懸濁した。ＯＫＴ３（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ、Ｏｒｔｈｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）で４℃で一夜被覆しかつＰＢＳですすいだ１００ｍｍ組織培養皿上でインキュベートすることにより、ＰＢＭＣを３７℃、５％ＣＯ２でおよそ４時間活性化した。ＰＢＭＣを収集し、１％ＢＳＡを含有するイスコフ培地で１回洗浄し、計数しかつおよそ１×１０７細胞／ｍｌに再懸濁した。
【０１０５】
ＣＮＴＯ １４８試験サンプルをイスコフ、１％ＢＳＡ培地で連続希釈した。５０マイクロリットルの標的細胞（約１０，０００）および１００マイクロリットルの抗体を丸底９６ウェルプレートに添加した。５０マイクロリットルのエフェクター細胞（約５００，０００細胞）を混合物に添加し、そしてプレートを１０００ｒｐｍ、５分間、ＲＴで遠心分離した。エフェクター細胞対標的細胞比（Ｅ：Ｔ）は５０：１であった。バックグラウンド蛍光を測定するため、ウェルを、抗体を含まない、培地中のエフェクター細胞および標的細胞の混合物とインキュベートした。最大蛍光を確立するため、１０マイクロリットルの溶解溶液（Ｄｅｌｆｉａ ＥｕＴＤＡ細胞傷害性キットから）をバックグラウンドウェルに添加した。ＡＤＣＣアッセイのため、細胞を３７℃、５％ＣＯ２でおよそ２時間インキュベートした。２０マイクロリットルの上清を９６ウェル平底プレートに移した。２００マイクロリットルのユーロピウム溶液（Ｄｅｌｆｉａ ＥｕＴＤＡ細胞傷害性キット）を添加し、そしてプレートをプレート振とう器上にＲＴで１０分間置いた。時間分解蛍光計ＥｎＶｉｓｉｏｎ装置（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で蛍光を測定した。各サンプル中の特異的溶解の比率を、以下の式すなわち％特異的遊離＝（［実験遊離−自発遊離］÷［最大遊離−自発遊離］）×１００に従って計算した。
【０１０６】
ＡＤＣＣアッセイの結果は、Ｃ１０８３Ｂ由来ＣＮＴＯ １４８が参照物質すなわちマウス骨髄腫細胞からのＣＮＴＯ １４８よりおよそ７０倍より強力であったことを示した（図１３）。Ｃ１０８３Ｃ由来ＣＮＴＯ １４８は、それらが非常に類似のフコースレベルを有したことを示した生物分析データと一致して、Ｃ１０８３Ｂ由来ＣＮＴＯ １４８と実質的に同一の効力を示した。フコースレベルの予期されない類似性の結果として、こ
れらのＡｂロットは、超低レベルのフコース（１０〜２０％）が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＮＴＯ ８６０（およびｉｎ ｖｉｖｏで２Ｃ１１）で観察されたところの中程度のレベルのフコース（４０〜５０％）を有することに比較してＡＤＣＣ活性のさらなる増強に変わったかどうかを試験するための手段を提供しなかった。にもかかわらず、これらの結果は、代替宿主細胞で発現された同一Ａｂに関して顕著に高められたＡＤＣＣ活性を示す、Ｃ１０８３Ｂ若しくはＣ１０８３Ｃいずれかで発現されたＡｂの別の例を提供する。
【実施例７】
【０１０７】
ＨＥＫ ２９３Ｅ細胞、Ｃ１０８３Ａ細胞およびＣ１０８３Ｃ細胞で発現された抗ＣＤ３Ａｂのｉｎ ｖｉｖｏアゴニスト活性
抗ＣＤ３モノクローナルＡｂによるＴ細胞活性化が、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）を結合するそれらのＡｂの能力に依存することを示す以前の報告に基づき、単純なモデル系を使用して、マウスが、そのＦｃグリカン中の異なるレベルのフコースを伴うヒトＩｇＧ１ Ａｂに対する異なる程度のＦｃ依存性応答を示すかどうかを試験した。組換えハムスター抗マウスＣＤ３ ε鎖Ａｂ、１４５−２Ｃ１１（２Ｃ１１）をこれらの研究に使用した。一本鎖Ｆｃバージョン２Ｃ１１をコードするプラスミドはＪｅｆｆｒｅｙ Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ博士（カリフォルニア大学サンフランシスコ校）により恵与された。このプラスミド中のＨおよびＬ鎖可変（Ｖ）領域コーディング配列を事前にＰＣＲ増幅し、そして該増幅されたＤＮＡフラグメントを最初にゲノムＨおよびＬ鎖Ｖ領域ベクターに、ならびにその後それぞれマウスＩｇＧ２ａおよびκ鎖のゲノム定常領域発現ベクターにクローン化した。
【０１０８】
２Ｃ１１のヒトＩｇＧ１バリアントを製造するため、Ｈ鎖可変領域をコードするＤＮＡは、以前に製造したプラスミドの１種ｐ２２１３から増幅し、そしてヒトＧ１定常領域コーディング配列を含有する２種の異なる発現ベクターにクローン化した。これは、Ａｂ遺伝子転写がＣＭＶプロモーターにより駆動された発現プラスミドｐ２６４８、および転写がマウス免疫グロブリンプロモーターにより駆動されたｐ２６９４の生成をもたらした。２Ｃ１１ Ｌ鎖可変領域はプラスミドｐ２２０８から増幅し、そしてＣＭＶプロモーター若しくは免疫グロブリンプロモーターいずれかにより駆動されるヒトκ定常領域を含有する発現ベクターにクローン化した。これは、Ａｂ遺伝子転写がＣＭＶプロモーターにより駆動された発現プラスミドｐ２６２３、および転写が免疫グロブリンプロモーターにより駆動されたｐ２６６９の生成をもたらした。ＣＭＶプロモーター含有プラスミドをＨＥＫ
２９３Ｅ細胞で一過性に発現させた。およそ３．５×１０８細胞を、１０層の細胞スタック（ｃｅｌｌ ｓｔａｃｋ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中、増殖培地（１０％ＦＢＳ中を含むＤＭＥＭ）中で５％ＣＯ２中３７℃で一夜増殖させた。４０ｍｌのＯｐｔｉｍｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）中で１．４ｍｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を各３００μｇのプラスミドｐ２６４８若しくはｐ２６２２およびｐ２６２３と混合することにより調製したトランスフェクションカクテルを細胞スタックに添加し、そして３７℃で一夜インキュベートした。翌日、トランスフェクションカクテルを含む培地を１リットルの２９３ ＳＦＭＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）＋４ｍＭ酪酸ナトリウムで置換し、そして細胞を３７℃で４日間インキュベートした。発現された抗体を含有する上清を収集し、遠心分離および０．８ミクロン濾過により澄明にした。発現された抗体は標準的プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【０１０９】
免疫グロブリンプロモーター含有プラスミドを、安定なトランスフェクションを介してＣ１０８３ＡおよびＣ１０８３Ｃ ＹＢ２／０細胞に導入した。およそ２×１０７のＹＢ２／０細胞を、電気穿孔法により各１０μｇのプラスミドｐ２６９４およびｐ２６６９でトランスフェクトし、そして、１０％ＦＢＳ、ＮＥＡＡ、Ｌ−グルタミンおよびピルビン酸ナトリウムを補充したαＭＥＭを含有する増殖培地中、９６ウェル細胞培養皿にプレーティングした。ミコフェノール酸を用いてプラスミドの安定な組込みについて細胞を選択
した。抗体を分泌するミコフェノール酸耐性のクローンを抗ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。高発現の安定なクローンを、５％ＦＢＳを含有する培地中でスケールアップした。発現された抗体は標準的プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【０１１０】
Ｃ１０８３Ａ ＹＢ２／０細胞中で発現された、製造された２Ｃ１１ ｈｕＧ１ Ａｂを、上の実施例５および６に記述されたところのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにかけた（図１４）。この分析は、該細胞株が、血清の存在下で培養されたとは言え、支配的な種がフコシル化されていない（図２中のような構造２）グリコシル化生成物Ａｂを産生することを継続したことを示した。２Ｃ１１調製物を、ＦｃγＲ結合能力を欠いた対照Ａｂを製造するために酵素で脱グリコシル化した。該脱グリコシル化は、Ａｂを１０００単位のＰＮＧアーゼＦで３７℃で２４時間処理することにより行った（緩衝液１．０ｍＬ中約１０ｍｇのＡｂ）。酵素の別のアリコートを添加し、そしてインキュベーションを追加の２４時間継続した。脱グリコシル化されたＩｇＧサンプルをＨｉＴｒａｐプロテインＡカラムを使用して精製し、そしてリン酸緩衝生理的食塩水、ｐＨ７．０に処方した。２Ｃ１１ Ｇｎｏと命名された生じる糖形態は、徹底的に脱グリコシル化されていたことがＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより示された（示されない）。
【０１１１】
各Ａｂサンプルの濃度を、分光光度法によりＯＤ２８０を測定すること、ならびにＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの染色により測定した。汚染するエンドトキシンレベルを測定するために全試験ＡｂでＬＡＬアッセイを実施した。上述されたとおり実施したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳおよびＨＰＬＣ分析は、ＨＥＫ ２９３Ｅ由来Ａｂ（２Ｃ１１ ｈｕＧ１、ＨＥＫ）、Ｃ１０８３Ａ由来Ａｂ（２Ｃ１１ ｈｕＧ１、Ｃ１０８３Ａ）およびＣ１０８３Ｃ由来Ａｂ（２Ｃ１１ ｈｕＧ１、Ｃ１０８３Ｃ）中のＦｃグリカンがそれぞれおよそ９５％、４０％および１５％フコシル化されていたことを示した。新たに単離したマウス脾細胞上のＣＤ３に対する定量的結合分析は、該３種の異なるＡｂ調製物の抗原アフィニティーの検出可能な差違を示さなかった（データは示されない）。
【０１１２】
該３種のＡｂがそれらのｉｎ ｖｉｖｏ Ｔ細胞活性化特性に関して相互にどのように匹敵したかを評価するため、正常雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に変動する量の試験Ａｂの単一腹腔内注入を投与した。試験Ａｂ注入のおよそ２４時間後に全マウスをＣ０２窒息により安楽死させ、心穿刺を介して終末血サンプルを収集し、そして脾を収集しかつ冷収集培地（ＲＰＭＩ １６４０、５％熱不活性化ウシ胎児血清、１％Ｌ−グルタミン）を含有するチューブに入れた。１００μｍナイロンメッシュ篩を通して脾を穏やかに押すこと、およびＲＰＭＩ−１６４０培地で１回洗浄することにより、脾細胞の単細胞懸濁液を調製した。該単細胞懸濁液をその後、製造元の説明書（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に従ってＮＨ４Ｃｌ低張溶解溶液を使用して無核化（ａｎｕｃｌｅａｔｅｄ）赤血球を枯渇させた。脾細胞を２回洗浄し、そして０．２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ、０．５％ＢＳＡに再懸濁した。ＣＤ４ ＰＥ＋／ＣＤ２５ ＡＰＣ＋／ＣＤ８および７−ＡＡＤ生存率色素を使用して脾細胞を免疫染色しかつフローサイトメトリーにより分析した。全染色は、Ｆｃ受容体結合により媒介される染色を遮断するために抗ＣＤ１６／ＣＤ３２ ｍＡｂ、２．４Ｇ２の存在下で行った。
【０１１３】
該結果は、高フコースバリアントに比較して中程度フコースバリアントを投与したマウスでのより大きなＴ細胞活性化を示し、高フコースバリアントは同一程度のＴ細胞活性化を達成するためにおよそ４倍より多いＡｂを投与することを必要とした（図１５）。しかしながら、低フコースバリアントは中程度フコースバリアントより活性でなく、フコースの完全な非存在が、マウスで低フコースバリアントの最大に高められたＦｃ機能を達成するために必要でないことを示唆した。ヒト低アフィニティーＦｃγＲの１種、ＦｃγＲＩＩＩＡがＦｃフコースレベルに感受性であることを考えれば、これらの知見は、マウスが
以前に考えられたよりもヒト細胞によるＦｃ依存性応答をより緊密に模倣しうることを示唆する。
【０１１４】
本明細書で挙げられる全部の刊行物および特許は、例えば現在記述される発明に関して使用されうる、該刊行物で記述される構築物および方法論を記述かつ開示する目的上、引用することにより本明細書に組み込まれる。上でおよび本文を通じて論考される刊行物は、単に本出願の出願日前のそれらの開示のため提供される。本明細書の何物も、本発明が以前の発明によってこうした開示を見越す権利を与えられないことの承認として解釈されるべきでない。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】典型的なＩｇＧサブクラスの哺乳動物抗体、ドメインおよびグリコシル化点を描く図である。
【図２Ａ−２Ｅ】天然の若しくは哺乳動物細胞由来の組換え抗体と関連する支配的な二分岐オリゴ糖構造を示す。すなわち、略記される糖構造 Ｆｕｃ＝フコース；Ｇａｌ＝ガラクトース；Ｇｌｃ＝グルコース；ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミン；Ｍａｎ＝マンノース；およびＮＡＮＡ*＝シアリル（Ｎ−アセチルノイラミン酸）が同定される。
【図３Ａ−３Ｂ】無血清および血清含有培地中で培養したＡＰＦ−ＹＢ２／０（Ｃ１０８３Ｂ）細胞株の複数世代にわたる増殖および生存率の比較を示す。Ｃ１０８３Ｂを、ＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳ、および６ｍＭグルタミンを補充したＣＤ−Ｈｙｂ培地中で培養した。細胞は２〜３×１０５細胞／ｍｌの播種密度を使用して週あたり３回継代した。すなわち（Ａ）増殖曲線および（Ｂ）生存率。
【図４】Ｃ１０８３Ｂ由来の４種のＡＰＦ−ＹＢ２／０細胞株の相対増殖特性を示す。ＣＤ−Ｈｙｂに適応させたクローンを２方法すなわち離脱（Ｃ１０８３Ｂ−１およびＣ１０８３Ｂ−１２）ならびに直接選択（Ｃ１０８３−Ｈ１８およびＣ１０８３−Ｈ２１）により単離した。細胞を、６ｍＭグルタミンを補充したＣＤ−Ｈｙｂ中で培養した。細胞は２〜３×１０５細胞／ｍｌの播種密度を使用して週あたり３回継代した。
【図５】５日後のＣ１０８３Ｂに対するＬＣＡレクチンの毒性を示すグラフである。
【図６Ａ−６Ｂ】（Ａ）プローブおよびプライマー組の位置を伴うラットｆｕｔ８ ｍＲＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ（ＮＭ＿００１００２２８９）のヌクレオチド配列、ならびに印を付けた（「Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ」ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して設計したプライマー（下線を付ける）およびプローブ（斜体にする））Ｃ１０８３Ｂのバリアントでのｆｕｔ８ ｍＲＮＡの発現、ならびに（Ｂ）Ｃ１０８３Ｂ由来の８種のレクチン耐性細胞株のＱＰＣＲ分析。各細胞株はＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳ中で培養し、そして１×１０７細胞を指数増殖期に収集した。各クローンのｆｕｔ８ ｍＲＮＡのレベルをＱＰＣＲにより分析した。を示す。
【図７Ａ−７Ｂ】Ｃ１０８３Ｂ由来のフコース枯渇クローンの（Ａ）生存可能細胞密度および（Ｂ）生存率のグラフを表す。細胞株は６ｍＭグルタミンを補充したＣＤ−Ｈｙｂ培地中で培養した。
【図８Ａ−８Ｂ】細胞株生成に使用したＣＮＴＯ ８６０発現ベクターの図解である。すなわち（Ａ）ｐ２４０１はＨ鎖発現ベクターであり、および（Ｂ）ｐ２４０２はＬ鎖発現ベクターである。
【図９Ａ−９Ｂ】Ｃ１０８３Ｂから工作した、抗組織因子抗体ＣＮＴＯ ８６０を発現する細胞株Ｃ１２６１Ａの時間にわたる安定性を示すグラフである。継代１１の細胞を振とうフラスコ培養物中、ＣＤ−Ｈｙｂ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で２検体で（２×１０５／ｍｌで）播種した。増殖および抗体力価を１×Ｌｉｐｉｄ（Ｇｉｂｃｏ）の非存在および存在下でモニターした。
【図１０Ａ−１０Ｂ】（Ａ）マウス骨髄腫株Ｃ４６３およびラットＹＢ２／０宿主細胞株Ｃ１０８３Ｂで生成されるＣＮＴＯ ８５９およびＣＮＴＯ ８６０により導き出される用量依存性の抗体特異的細胞溶解を示す棒グラフ。（Ｂ）Ｃ１０８３Ｂおよびｆｕｔ８枯渇ＹＢ２／０細胞株Ｃ１０８３Ｃ（Ａ４−３）と比較したＣ４６３からのＣＮＴＯ ８６０の間のＡＤＣＣの差違を示す棒グラフ。である。
【図１１Ａ−１１Ｃ】多様な細胞株により産生されるＣＮＴＯ８６０のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析からのレコーダ出力波形を示し；（Ａ）Ｃ４６３すなわちＡＰＦに適応させたラット骨髄腫ＹＢ２／０宿主細胞株、（Ｂ）Ｃ１０８３Ｂ、および（Ｃ）ｆｕｔ８欠乏ＹＢ２／０宿主細胞株Ｃ１０８３Ｃ。
【図１２Ａ−１２Ｃ】多様な細胞株により産生されるＣＮＴＯ１４８のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析からのレコーダ出力波形を示し；（Ａ）Ｃ４６３すなわちＡＰＦに適応させたラット骨髄腫ＹＢ２／０宿主細胞株、（Ｂ）Ｃ１０８３Ｂ、および（Ｃ）ｆｕｔ８欠乏ＹＢ２／０宿主細胞株Ｃ１０８３Ｃ。
【図１３】多様な宿主細胞で発現された数バッチの抗ＴＮＦα Ｍａｂ、ＣＮＴＯ １４８の濃度依存性および（標的細胞特異的溶解により測定されるところの）相対ＡＤＣＣ活性を示すグラフである。
【図１４】ＹＢ２／０宿主細胞株Ｃ１０８３Ａにより産生される２Ｃ１１ 抗ＣＤ３ ＭａｂのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析からのレコーダ出力波形を示す。
【図１５】示されるところの多様な抗体調製物を投与したマウスから収集した脾細胞上の脾細胞マーカーにより測定されるところのＴ細胞活性化を示すグラフである。
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えＤＮＡ技術において、および細胞培養物でのタンパク質の産生に有用な細胞、細胞株および細胞培養物に関する。より具体的には、本発明は、高められた抗体エフェクター機能を提供する、既知組成培地中で増殖することが可能なクローン性骨髄腫細胞株に向けられる。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、しばしば、体液性および細胞性免疫機構を結び付けるアダプター分子と称される。すなわち、体液性応答は、可変ドメインの固有の特異性により賦与されるところの標的抗原への高アフィニティー結合が可能な成熟した分泌型の循環抗体に主として帰される。細胞性応答は、抗体−抗原（ａｂ−ａｇ）複合体の結合、およびエフェクター細胞へのａｂ−ａｇ複合体結合の結果としての細胞メディエーターの遊離により引き起こされる下流の結果による細胞の活性化の結果に帰される。これらの細胞応答は、標的の中和、オプソニン化および感作（抗原が細胞の表面上に表示される場合）、肥満細胞の感作ならびに補体の活性化を包含する。細胞表面抗原である細胞標的について、これらのエフェクター機能は、抗体に指図される細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体媒介性の細胞傷害（ＣＤＣ）として一般に知られるものに至る。
【０００３】
特異的抗原認識の原因であるのが、抗体のいわゆる可変領域および超可変ドメイン、ならびに、抗体取り込みおよび細胞傷害性の機構すなわちＡＤＣＣ、ＣＤＣを包含するある種の機能に影響を及ぼしかつＣ１ｑタンパク質への結合を包含する多様な受容体への抗体結合にもまた影響を及ぼすように細胞を刺激することが可能な、多様な、通常は高度に移動性の細胞上に存在するこれらのＦｃ受容体と相互作用するのが、ヘテロ二量体のＨ鎖部分のいわゆる定常領域すなわちＦｃ部分である。これらの受容体はＦｃ受容体として知られる。
【０００４】
抗体アイソタイプ（例えばＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）のなかでＩｇＧが最も豊富であり、ＩｇＧ１サブクラスは最も有意の程度および範囲のエフェクター機能を表す。ＩｇＧ１タイプの抗体は癌免疫療法で最も一般に使用される抗体である。構造上、ＩｇＧヒンジ領域およびＣＨ２ドメインは抗体のエフェクター機能において主要な役割を演じている。（ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの二量体化により形成される）Ｆｃ領域に存在するＮ結合したオリゴ糖がエフェクター機能に影響を及ぼす（図１）。全部の天然に存在する抗体のＦｃ部分は、Ｈ鎖中の保存された位置で炭水化物鎖でさらに修飾される。ＩｇＧアイソタイプでは、Ｎ結合したグリコシル化部位は各ＣＨ２ドメイン中に存するＡｓｎ２９７でである。定常領域がアイソタイプとともに変動するため、各アイソタイプは異なる多数のＮ結合した炭水化物構造を有し、それらはタンパク質の集成、分泌若しくは機能的活性に多様に影響を及ぼす（非特許文献１）。結合されたＮ結合した炭水化物の構造はプロセシングの程度に依存してかなり変動し、そして、高マンノースの、複雑に分岐した、ならびに二分岐の複雑なオリゴ糖、ならびに図２に示される末端糖としてシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸すなわちＮＡＮＡ）、フコース、ガラクトースおよびＧｌｃＮａｃ（Ｎ−アセチルグルコサミン）残基を包含し得る。宿主細胞のエフェクター機能および抗体のオリゴ糖含量に対する影響は認識されている（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献１；非特許文献４）。さらに、抗体中の糖鎖に関して、抗体のＮ−グリコシド結合した糖鎖の還元端の近位のＮ−アセチルグルコサミンでのフコースの付加若しくは修飾が該抗体のＡＤＣＣ活性を有意に変化させることが報告されている（特許文献１）。
【０００５】
加えて、安定に工作された宿主細胞を使用する組換え治療タンパク質製造は、伝統的に、血清若しくは器官抽出物のような化学的に定義されない動物由来成分を補充した培地の使用を必要とした。バッチごとの変動性の問題のほかに、これらの汚染物質から生成物を精製する必要性、およびヒト病原体の伝播の可能性が、これらの成分を使用する場合に上昇する。この感受性は、狂牛病としてもまた知られる畜牛の神経変性疾患、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）が、ヒトを冒す疾患の病原体であると考えられる（非特許文献５）クロイツフェルト−ヤコブ（ｖＣＪＤ）と識別不可能であるという発見とともに、近年、より重大となった。従って、多くの規制当局は、細胞培地中での動物由来物質の中断若しくは制限された使用を強く推奨している。従って、無血清（ＳＦ）でありかつ／若しくは動物由来タンパク質を含まない（ＡＰＦ）哺乳動物細胞の増殖および維持のための既知組成（「ＣＤ」）培地が現在使用可能である。ＣＤ培地の欠点は、ほとんどの産生細胞株がそれ中での増殖に適応しないか、若しくはゆっくりと増殖しかつ乏しく産生することである。結果、グリコシル化が至適化された治療タンパク質の製造のための理想的産生細胞株は、ＣＤ培地中で増殖しつつ大スケールの商業的容量で組換えタンパク質を産生することもまた可能であることができる。
【０００６】
従って、治療的組換えタンパク質の工業的製造では、タンパク質の有効性を改良しかつ至適化されたグリコシル化パターンを達成するための例えば酵素的手段による収集後処理に対する必要性を回避する、無血清および／若しくは無タンパク質培地中で増殖される、発現かつプロセシングされたタンパク質の至適化された炭水化物パターンに影響を及ぼすことが可能な細胞株に対する必要性が存在する（例えば特許文献２を参照されたい）。
【０００７】
【特許文献１】第ＷＯ００／６１７３９号明細書
【特許文献２】米国特許第６，３９９，３３６号明細書
【非特許文献１】Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．とＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２６−３２（１９９７）
【非特許文献２】Ｌｉｆｅｌｙ，Ｍ．Ｒ．ら、１９９５ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：８１３−８２２
【非特許文献３】Ｊｅｆｆｅｒｉｓ，Ｒ．ら、１９９８ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．１６３：５９−７６
【非特許文献４】Ｐｒｅｓｔａ Ｌ．２００３．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．１３（４）：５１９−２５
【非特許文献５】Ｂｒｕｃｅら Ｎａｔｕｒｅ ３８９：４９８−５０１、１９９７
【発明の開示】
【０００８】
［発明の要約］
本発明は、既知組成の動物タンパク質を含まない培地中での増殖、および至適にグリコシル化された免疫グロブリン由来治療タンパク質を産生することが可能な細胞、細胞株および細胞培養物に関する。好ましい一態様において、該細胞株は、ＣＤ培地中で増殖するよう適応されたＹＢ２／０ラット骨髄腫由来細胞株である。
【０００９】
好ましい一態様において、本発明の細胞、細胞株および細胞培養物は、組換えタンパク質を約１０ｍｇ／Ｌないし約１０，０００ｍｇ／Ｌ培地で産生する。別の態様において、本発明の細胞、細胞株および細胞培養物は、組換えタンパク質を約０．１ｐｇ／細胞／日ないし約１００ｎｇ／細胞／日の濃度で産生する。
【００１０】
本発明は、本発明の培養宿主細胞からの最低１種のタンパク質、例えば抗体若しくはＦｃ含有タンパク質の製造方法をさらに提供する。好ましい一態様において、最低１種の所望のタンパク質を発現する本発明の細胞は既知組成培地で培養され、そしてタンパク質は
既知組成培地若しくは細胞それら自身から単離される。
【００１１】
本発明の別の態様は、本発明の細胞株により産生される抗体若しくはＦｃ含有治療タンパク質を含んでなる。本発明の抗体若しくはＦｃ含有治療タンパク質は、限定されるものでないがヒト、マウス、ウサギ、ラット、げっ歯類、霊長類を挙げることができるいずれかの哺乳動物若しくはそれらのいずれかの組合せを包含し得るか若しくはそれらに由来し得、そして、単離されたヒト、霊長類、げっ歯類、哺乳動物、キメラ、ヒト化および／若しくはＣＤＲ移植抗体、免疫グロブリン、切断生成物、ならびにそれらの他の指定される部分およびバリアントを包含する。
【００１２】
本発明の一局面において、抗体は、抗インテグリン抗体、抗組織因子抗体、または、それによりｉｎ ｖｉｖｏで被験体内の細胞の増殖を低下若しくは予防することが望ましくかつその活性が本発明の細胞株での抗体の産生により賦与されるか若しくは高められる、被験体内の細胞の表面で表示される抗原を結合することが可能な他の抗体である。
【００１３】
［発明の詳細な記述］
略語
Ａｂ＝抗体、ポリクローナル若しくはモノクローナル；ＡＰＦ＝動物タンパク質を含まない；ＣＤ＝既知組成；ＣＤＲ＝相補性決定領域；Ｉｇ＝免疫グロブリン；ＩｇＧ＝免疫グロブリンＧ；Ｍａｂ＝モノクローナル抗体；ＴＦ＝組織因子。糖残基について：Ｆｕｃ＝フコシル；Ｇａｌ＝ガラクトシル；Ｇｌｃ＝グルコシル；ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミニル；Ｍａｎ＝マンノシル；およびＮＡＮＡ＝シアリル（Ｎ−アセチルノイラミニル、しかし５−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）若しくは５−Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮｅｕＧｃ、ＮＧＮＡ）もまた「シアル酸」として包含し得る；Ｍａｂ＝モノクローナル抗体；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ＝マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析。
【００１４】
定義
「ＡＤＣＣ活性」という用語は、抗体依存性の細胞媒介性細胞傷害を表し、そして感作されないエフェクター細胞による抗体媒介性標的細胞破壊の現象を意味している。標的細胞の同一性は変動するが、しかし、それは、Ｆｃドメイン、若しくはＦｃ受容体活性化が可能なＦｃドメイン部分を有する結合された表面免疫グロブリンＧを有しなければならない。エフェクター細胞はＦｃ受容体を有する「キラー」細胞である。それは、例えば標的細胞の同一性に依存して慣習的Ｂ若しくはＴ細胞マーカーを欠くリンパ球、または単球、マクロファージ若しくは多核白血球でありうる。該反応は補体に依存しない。本発明の抗体若しくは他のＦｃ含有タンパク質のＡＤＣＣ活性は、ＡＤＣＣ媒介性の細胞死滅を示すその能力が、代替宿主細胞により産生される実質的に類似の配列の抗体若しくはタンパク質およびＦｃドメインの能力を凌ぐ場合に「高められる」。ＡＤＣＣ活性は、本明細書で論考されるアッセイのような細胞死滅の標準的ｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで測定しうる。好ましくは、高められたＡＤＣＣ活性を有する本発明の抗体は、代替宿主細胞で産生された参照抗体より低用量かつ／若しくは短時間で同一の効果（腫瘍細胞増殖の予防若しくは阻害）を達成する。好ましくは、本発明の範囲内の抗体および参照抗体の効力の間の差違は、例えば選択される標準的クロム遊離ＡＤＣＣアッセイでの並列比較により決定されるところの最低約１．５倍、より好ましくは最低約２倍、なおより好ましくは最低約３倍、最も好ましくは最低約５倍である。
【００１５】
「抗体」は、抗体分子全体、抗体フラグメント、若しくは免疫グロブリンのＦｃ領域に同等な領域を包含する融合タンパク質を包含することを意図している。
【００１６】
「抗体フラグメント」は、完全長抗体の一部分、一般にはその抗原結合すなわち可変ド
メインを含んでなる。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；二重特異性抗体；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成される多特異性抗体を包含する。こうした抗体フラグメントは、同一若しくは異なる種からの抗体のＦｃドメイン領域、または抗体の改変されたＦｃドメイン若しくはＣＨ２ドメインに融合しうる（図１はこうした抗体の基礎構造を示す）。
【００１７】
本明細書で使用されるところの「クローン化された」、「クローン的に派生した」若しくは「クローン性細胞株」という用語は、単一祖先細胞に由来する特定の細胞株からの遺伝的に同一の細胞の増殖する集団を意味している。ＹＢ２／０由来宿主細胞について、親細胞株は、米国特許第４，４７２，５００号明細書に記述されかつＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２として寄託されたラット骨髄腫細胞株である。
【００１８】
それが本明細書で使用されるところの抗体若しくは抗体アナログの「エフェクター機能」は、病原体若しくは異常な細胞例えば腫瘍細胞が破壊されかつ身体から除去される過程である。自然および獲得免疫応答は、病原体を排除するのにＡＤＣＣ、ＣＡ（補体活性化）、Ｃ１ｑ結合およびオプソニン化を包含する同一のエフェクター機構の大部分を使用する。
【００１９】
本明細書で使用されるところの「Ｆｃ」、「Ｆｃ含有タンパク質」若しくは「Ｆｃ含有分子」という用語は、最低１個の免疫グロブリンＣＨ２ドメインを有する二量体若しくはヘテロ二量体タンパク質を指す。ＣＨ２ドメインは該タンパク質／分子（例えば抗体）の二量体領域の少なくとも一部分を形成し得る。
【００２０】
フコシルトランスフェラーゼまたは「ｆｕｔ８」若しくは「ｆｕｄａｓｅ」は、ｆｕｔ８として知られる遺伝子、およびα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性を有する遺伝子産物を指す。
【００２１】
「Ｆｃ含有治療タンパク質」は、抗原結合ドメイン、Ｆｃ領域を有するか若しくは最低１個の免疫グロブリンＣＨ２ドメインを含んでなる二量体若しくはヘテロ二量体タンパク質を意味することを意図しており、抗体のＦｃ若しくはＣＨ２を含んでなる部分は、グリコシル化されることが可能なアスパラギン残基を含有する。
【００２２】
本明細書で使用されるところの「宿主細胞」という用語は、抗体および抗体フラグメントを包含する目的のタンパク質、タンパク質フラグメント若しくはペプチドを生成するように工作し得るいかなる種類の細胞系も包括する。宿主細胞は、限定されるものでないが、培養細胞、例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＮＳＯ、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０のようなげっ歯類（ラット、マウス、モルモット若しくはハムスター）由来の哺乳動物培養細胞；またはヒト組織若しくはハイブリドーマ細胞、酵母細胞および昆虫細胞、しかしまたトランスジェニック動物若しくは培養組織内に含まれる細胞も挙げることができる。
【００２３】
本明細書で使用されるところの「モノクローナル抗体」若しくは「モノクローナル抗体組成物」または「Ｍａｂ」という用語は、実質的に単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定の１エピトープに対する単一の結合特異性およびアフィニティーを表す。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一抗原部位に向けられる。さらに、多様な決定子（エピトープ）に向けられた多様な抗体を典型的に包含する慣習的（ポリクローナル）抗体調製物と対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一決定子に向けられる。「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均質な集団から得られるところの抗体の特徴を示し、そしていずれかの特定の方法による抗体の製造を必要とすると解釈されるべきでない。例えば、本発明で使用されるべきモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）により最初に記述
されたハイブリドーマ法により作成しうるか、若しくは組換えＤＮＡ法（例えば米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい）により作成しうる。「モノクローナル抗体」はまた、例えばＣｌａｒｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に記述される技術を使用してファージ抗体ライブラリーからも単離しうる。
【００２４】
モノクローナル抗体は、本明細書で、Ｈおよび／若しくはＬ鎖の一部分が、特定の１種由来または特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一若しくはそれに相同である一方、該鎖（１本若しくは複数）の残部が、別の種由来または別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体、ならびにそれらが所望の生物学的活性を表す限りはこうした抗体のフラグメント中の対応する配列と同一若しくはそれに相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）をとりわけ包含する（米国特許第４，８１６，５６７号明細書およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８１：６８５１−６８５５（１９８４））。
【００２５】
「ヒト化」形態のヒト以外（例えばマウス）抗体は、ヒト以外の免疫グロブリンに由来した実質的に置換された配列部分を有するキメラ抗体である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域（相補性決定領域すなわちＣＤＲとしてもまた知られる）残基が、所望の特異性、アフィニティーおよび能力を有するマウス、ラット、ウサギ若しくはヒト以外の霊長類のようなヒト以外の種からの超可変領域残基（ドナー抗体）により置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンの枠組み領域（ＦＲ）残基は対応するヒト以外の残基により置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体若しくはドナー抗体中で見出されない残基を含みうる。これらの改変は抗体の性能をさらに改良するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、最低１および典型的には２個の可変ドメインの実質的に全部を含むことができ、ここで、超可変領域の全部若しくは実質的に全部がヒト以外の免疫グロブリンのものに対応し、また、ＦＲの全部若しくは実質的に全部がヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、場合によっては、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒトＩｇＧ免疫グロブリンのものの少なくとも一部分もまた含むことができる。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。
【００２６】
本明細書で使用されるところの「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変および／若しくは定常領域を有するアミノ酸配列を有する抗体を指す。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列を使用して、例えばヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを免疫すること、若しくはヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることによりある系から該抗体が得られる場合に、特定の一生殖系列配列「に由来し」、そして、ここで、選択されるヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列にアミノ酸配列が最低９０％、より好ましくは最低９５％、なおより好ましくは最低９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸配列（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏで無作為若しくは部位特異的突然変異誘発により、またはｉｎ ｖｉｖｏで体細胞突然変異により導入される突然変異）を包含することができ、そして、超可変配列若しくは相補性決定領域（ＣＤＲ）配列が抗体特異性の独特の決定子でありかつ生殖系列中でコードされない限りは、これらの領域は配列同一性分析から除外すべきである。
【００２７】
本明細書で使用されるところの「組換え抗体」という用語は、（ａ）ヒト免疫グロブリ
ン遺伝子に対しトランスジェニック若しくは導入染色体（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）である動物（例えばマウス）またはそれから調製したハイブリドーマ（さらに下述する）から単離された抗体、（ｂ）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えばトランスフェクトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）から単離された抗体、（ｃ）組換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを必要とするいずれかの他の手段により製造、発現、創製若しくは単離された抗体、のような組換え手段により製造、発現、創製若しくは単離される全部の抗体を包含する。組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変および定常領域を有する。ある態様においては、しかしながら、こうした組換えヒト抗体はｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発（若しくは、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックの動物を使用する場合にはｉｎ ｖｉｖｏ体細胞突然変異）にかけることができ、そして、従って、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列由来かつそれらに関係しつつ、ｉｎ ｖｉｖｏでのヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在しなくともよい配列である。
【００２８】
本明細書で使用されるところの「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことを意図している（例えば、組織因子に特異的に結合する単離された抗体は、組織因子以外の抗原を特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。ヒト組織因子の１エピトープ、アイソフォーム若しくはバリアントに特異的に結合する単離された抗体は、しかしながら、例えば他の種からの他の関連した抗原（例えば組織因子種ホモログ）に対する交差反応性を有しうる。さらに、単離された抗体は他の細胞物質および／若しくは化学物質を実質的に含まないことができる。本発明の一態様において、異なる特異性を有する「単離された」モノクローナル抗体の組合せは、十分に定義された組成物中で組合せられる。
【００２９】
「二特異性分子」という用語は、２種の異なる結合特異性を有するいかなる剤、例えばタンパク質、ペプチド、またはタンパク質若しくはペプチド複合体も包含することを意図している。例えば、該分子は（ａ）細胞表面抗原および（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体に結合若しくはそれらと相互作用しうる。「多特異性分子」若しくは「異種特異性分子」という用語は、２種以上の異なる結合特異性を有するいかなる剤、例えばタンパク質、ペプチド、またはタンパク質若しくはペプチド複合体も包含することを意図している。例えば、該分子は（ａ）細胞表面抗原、（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体、および（ｃ）最低１種の他の成分に結合若しくはそれらと相互作用しうる。従って、本発明は、限定されるものでないが、細胞表面受容体若しくはこうした受容体のリガンドでありうる標的タンパク質、およびエフェクター細胞上のＦｃ受容体のような他の標的に向けられる、二特異性、三特異性、四特異性および他の多特異性分子を挙げることができる。
【００３０】
本明細書で使用されるところの「異種抗体」という用語は、それらの最低２種が異なる特異性を有する、一緒に連結された２種若しくはそれ以上の抗体、抗体の結合フラグメント（例えばＦａｂ）、それらからの誘導体、若しくは抗原結合領域を指す。これらの異なる特異性は、エフェクター細胞上のＦｃ受容体に対する結合特異性、および標的細胞例えば腫瘍細胞上の抗原若しくはエピトープに対する結合特異性を包含する。
【００３１】
至適にグリコシル化された免疫グロブリン由来治療タンパク質は、Ｎ結合グリコシル化部位を有するヒト若しくはヒト由来ＣＨ２領域を含んでなる組換えタンパク質を含んでなり、それらの部位は、エフェクター機能として集合的に知られる、細胞免疫機構をｉｎ ｖｉｖｏで導き出す前記治療タンパク質の変えられた（相対的に高められた若しくは減少された）能力を賦与するグリカンにより占有される。
【００３２】
生物製薬学的製品を製造するために、組換えポリペプチド（１種若しくは複数）の効率的かつ再現可能な発現が可能な産生細胞株が必要とされる。該細胞株は安定かつ貯蔵可能（ｂａｎｋａｂｌｅ）である。該細胞株は、１ｍｌあたり５００，０００（５×１０５）細胞以上、好ましくは培養物１ｍｌ若しくはそれ以上あたり百万（１×１０６）以上の濃度でである高密度での増殖が可能である。多様な宿主細胞株を本目的上使用し得る。細胞の機構が生物治療生成物の最終量および組成にどのように影響するかの複雑さの理解として、必要とされる属性を生成物の製造法および組成に与えることができる宿主細胞株の選択がより明らかになる。
【００３３】
米国特許第４，４７２，５００号明細書は、ハイブリドーマ融合パートナーとして有用かつ優れた安定性および生産能力をもつラット骨髄腫細胞株を教示する。後者の細胞株は、Ｙ０、ＹＢ２、Ａｇ０、ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞、若しくはＹＢ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２）と多様に呼称され、そして下でＹＢ２／０と称するであろう。Ｌｉｆｅｌｙら（１９９５ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：８１３−８２２）は、ＣＨＯ細胞株、ＮＳ０細胞若しくはラット骨髄腫Ｙ０（ＹＢ２／０）細胞により産生されたＣＤＲ移植ヒトＩｇＧ１抗体ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈに結合された糖鎖の組成を比較した。加えてＡＤＣＣ活性を評価した。Ｙ０細胞により産生されたＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈは最高のＡＤＣＣ活性を示し、そしてＮ結合したオリゴ糖の分岐位置でＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の最高含量を有したことが報告された（図２Ａ−Ｅ）。これは、多様な型のＮ結合したオリゴ糖に分岐ＧｌｃＮＡｃを付加するグリコシルトランスフェラーゼ、ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ ＩＩＩ）が通常はＣＨＯ細胞に存在しないためである（ＳｔａｎｌｅｙとＣａｍｐｅｌｌ、１９８４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１３３７０−１３３７８）。Ｃ２Ｂ８、リツキシマブのような治療抗体のＡＤＣＣ能力を増大させるための他の努力は、至適化されたレベルのＧｎＴ酵素をもつ宿主細胞株を工作することに焦点を当てた（Ｕｍａｎａら 米国特許第６６０２６８４号明細書）。後者の発明者は、ＧｎＴ ＩＩＩの高レベルまでの過剰発現が増殖阻害につながり、そして異なるグリコシルトランスフェラーゼＧｎＴ Ｖの過剰発現がそうであったように細胞に対し毒性であったことをさらに発見した。従って、低下された細胞生存率および生産性は、糖タンパク質を修飾するグリコシルトランスフェラーゼの過剰発現の一般的特徴でありうる。
【００３４】
多様な細胞宿主により産生されたＭａｂのオリゴ糖組成についての第二の観察結果（Ｌｉｆｅｌｙ 上記）は、ＣＨＯおよびＮＳＯが産生したＭａｂは優先的にフコシル化されたオリゴ糖を有した（図２Ｃ〜Ｄ、構造１６−３０）一方、ＹＢ２／０が産生したＭａｂは、より多くのフコシル化されない構造を包含したより複雑なパターンを有した（図２Ａ、ＢおよびＥ；構造１−１５および３１−３６）ことであった。
【００３５】
この観察結果の後、Ｎ結合したオリゴ糖構造をフコシル化する原因である酵素、すなわちｆｕｔ８の遺伝子産物かつ「ｆｕダーゼ」ともまた称されるα−１，６−フコシルトランスフェラーゼが、ＣＨＯ若しくはＮＳＯ細胞株でよりＹＢ２／０細胞中でより低かったことが示された。従って、ｆｕｔ８遺伝子は類似の効果を伴い、宿主細胞株中で操作し得る（Ｓｈｉｎｋａｗａら ２００３ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７８：３４６６−３４７３；欧州特許第ＥＰ１１７６１９５Ａ１号明細書）。さらに、二分岐オリゴ糖のガラクトシル化の相対的寄与、分岐ＧｌｃＮＡｃの存在、およびフコシル化は、フコシル化されないＭａｂが、Ｎ結合した二分岐オリゴ糖構造への他の修飾よりも、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで測定されるところのＡＤＣＣを高めるより大きな能力を表すことを示す（Ｓｈｉｅｌｄｓら ２００２．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−４０；Ｎｉｎｗａら ２００４．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４：２１２７−２１３３）。
【００３６】
目的に駆動される細胞株の開発
産生細胞株の開発は、典型的に、（マウス骨髄腫Ｓｐ２／０、ＣＤを適応させたＳｐ２／０（Ｃ４６３）およびＮＳ／０のような）宿主細胞株への抗体遺伝子のトランスフェクション、ならびに高レベルの所望の抗体を発現するトランスフェクトーマを単離することを必要とする。いくつかの例、例えば、治療抗体が生物学的標的分子を中和するよう作用するｃＡ２抗体において、抗体は、循環ＴＮＦ−αを結合しかつその後枯渇させることにより機能する。他の例において、抗体は、特定の抗原、例えば組織因子を過剰発現する癌細胞を標的とすることにより機能する。組織因子への抗体の結合は組織因子活性を中和する一方、癌細胞は、結合されたＦｃの認識により活性化される抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）経路により死滅される。抗体が標的とする細胞への溶解攻撃であるＡＤＣＣは、抗体の定常領域（Ｆｃ）へのリンパ球受容体ＦｃγＲの結合に際して誘発される。
【００３７】
本発明の組成物
本発明は、ＣＤ培地中で継続的に増殖する能力を有するクローン性骨髄腫細胞株に関する。一態様において、クローン性骨髄腫細胞株は、ＦＢＳ補充したＣＤ−Ｈｙｂ（ＣＤ−ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、Ｇｉｂｃｏ）培地から６継代にわたり培養物を徐々に離脱する（ｗｅａｎ）ことにより、ＹＢ２／０細胞バンクからクローン化される自然突然変異体である。本態様において、クローン性骨髄腫細胞株をＣ１０８３Ｂと称する。Ｃ１０８３Ｂの特徴付けは、該細胞株が親ＹＢ２／０細胞と関連しない多数の独特の増殖の特徴を有することを示した。例えば、Ｃ１０８３Ｂは血清（ＹＢ２／０親細胞株の必要な低温保存剤）の非存在下で凍結かつ融解しうる。加えて、親株と異なり、Ｃ１０８３ＢはＣＤ培地中で高細胞密度まで増殖し得る。さらなる特徴付けは、ＣＤ培地中で増殖させたＣ１０８３Ｂが、血清を補充した増殖培地中で細胞を維持する場合に観察されるものと同様若しくはより優れている、生存可能細胞密度および倍加時間を包含する増殖パラメータを表すことを示した。Ｃ１０８３Ｅと称されるＣ１０８３Ａの第二のサブクローンを、６ｍＭグルタミンのみを補充したＣＤ−Ｈｙｂ培地中へ直接の３週間のＣ１０８３Ａ細胞培養物の増殖により選択した。
【００３８】
別の態様において、クローン性骨髄腫細胞株は、レクチンを補充したＣＤ培地を用いる選択によりＣ１０８３Ｂ細胞バンクから派生される。この場合に使用するレクチンはレンズマメ（Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）アグルチニン（ＬＣＡ）であるが；しかしながら、２種のフコース特異的レクチンのいずれも選択に使用しうる。本態様において、クローン性骨髄腫細胞株をＣ１０８３ＣおよびＣ１０８３Ｄと称する。Ｃ１０８３ＣおよびＣ１０８３Ｄの増殖の特徴付けは、それらがＣＤ−Ｈｙｂ中でＣ１０８３Ｂに比較可能であったことを示した。
【００３９】
従って、Ｃ１０８３Ｂ細胞および誘導体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで無限の維持、成長および増殖が可能である。Ｃ１０８３Ｂ細胞は、増殖し、継代培養し得（すなわち新たな培養容器に繰り返し継代し得）、そして長期間低温保存し（例えば、１０％ジメチルスルホキシド若しくはグリセロールのような低温保存剤とともに液体窒素の蒸気相中に保存し）得る。Ｃ１０８３Ｂ細胞は細胞株として長期培養物で維持し得る。
【００４０】
ほとんどの部分について、本発明の細胞は、ガス交換が可能な適して無菌の環境を提供する、細胞を培養するのに使用されるいかなる容器、フラスコ、組織培養皿若しくは装置中でも増殖される。典型的には、本発明で使用される基礎（ｆｏｕｎｄａｔｉｖｅ）培養物は、細胞を既存の親Ｃ１０８３Ｂ細胞ストックから取り出し、血清含有および無血清培地中で培養容器中に入れ、そしてその後本明細書に詳細に記述されるとおり無血清状態に継代するものである。
【００４１】
好ましい一態様において、本発明の細胞、細胞株および細胞培養物は、げっ歯類若しく
は霊長類由来の免疫グロブリン若しくはそのフラグメントを産生しうる。より具体的には、免疫グロブリン若しくはそのフラグメントはマウス若しくはヒト由来でありうる。あるいは、免疫グロブリン若しくはそのフラグメントはキメラでありうるか若しくは工作されていることができる。事実、本発明は、ヒト化、ＣＤＲ移植、ファージに表示、トランスジェニックマウスに産生、至適化、突然変異誘発、無作為化され若しくは組換えられている免疫グロブリン若しくはそのフラグメントを産生する細胞、細胞株および細胞培養物をさらに企図している。
【００４２】
抗体のクラス若しくはアイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭ）は、Ｈ鎖定常領域遺伝子によりコードされる定常領域により与えられる。ヒトＩｇＧクラスのなかに、４種のサブクラス若しくはサブタイプ、すなわち最高から出発して最低への血清中のその天然の豊富さの順序で命名されたＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４が存在する。ＩｇＡ抗体は２種のサブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２として見出される。本明細書で使用されるところの「アイソタイプスイッチ」は、ＩｇＧサブクラス若しくはサブタイプ間の変化もまた指す。
【００４３】
本発明の細胞、細胞株および細胞培養物は、限定されるものでないがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ｓｌｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびそれらのいずれかの構造若しくは機能アナログを挙げることができる、免疫グロブリン若しくはそのフラグメントを産生しうる。特定の一態様において、本発明の細胞、細胞株および細胞培養物で発現される免疫グロブリンはＣＮＴＯ８６０（ヒトｈｕＩｇＧ１由来定常ドメインに融合されたｃＣＬＢ８可変ドメイン）である。
【００４４】
本発明は、抗原、サイトカイン、インテグリン、抗体、増殖因子、細胞周期タンパク質、ホルモン、神経伝達物質、受容体若しくはそれらの融合タンパク質、血液タンパク質、それらのいずれかのフラグメント、および前述のいずれかのいかなる構造若しくは機能アナログも結合する、ＣＨ２ドメイン中のグリコシル化が可能な免疫グロブリン若しくはそのフラグメントを発現する細胞、細胞株および細胞培養物をさらに提供する。好ましい一態様において、免疫グロブリン、そのフラグメント若しくは誘導体は標的細胞の表面上の抗原を結合する。とりわけ好ましい一態様において、標的細胞は腫瘍細胞、腫瘍脈管構造の細胞若しくは免疫細胞である。特定の一態様において、免疫グロブリン、そのフラグメント若しくは誘導体は組織因子に結合する。本発明の抗組織因子抗体の一例は、Ｃ１２６１と称される細胞株により産生されるＣＮＴＯ８６０である。
【００４５】
なお別の態様において、本発明の細胞、細胞株および細胞培養物は、増殖因子若しくはホルモンを含んでなる融合タンパク質を検出可能に発現しうる。本発明により企図される増殖因子の例は、限定されるものでないが、ヒト成長因子、血小板由来増殖因子、上皮細胞成長因子、線維芽細胞増殖因子、神経成長因子、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、骨形成タンパク質、トランスフォーミング増殖因子、インスリン様増殖因子、若しくはグルカゴン様ペプチド、およびそれらのいずれかの構造若しくは機能アナログを挙げることができる。
【００４６】
本発明の単離された抗体は、ＡＤＣＣ活性をもつ抗体アイソタイプ、とりわけヒトＩｇＧ１（例えばＩｇＧ１κおよびＩｇＧ１λ）を有するものを包含し、そして、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３がより少なく好ましいか、若しくはＦｃドメイン中の特定の残基に変えられた残基を含有するハイブリッドアイソタイプが他の種からのそれらの対照物である。抗体は完全長抗体（例えばＩｇＧ１）であり得るか、または、抗原結合部分、ならびにＡＤＣＣ、補体活性化およびＣ１ｑ結合を包含するエフェクター機能を導き出すことが可能なＦｃの部分若しくはドメインのみを包含し得る。
【００４７】
さらに、本発明の細胞、細胞株および細胞培養物により産生される免疫グロブリンフラグメントは、限定されるものでないが、Ｆｃ若しくは他のＣＨ２ドメイン含有構造およびそれらのいずれかの構造若しくは機能アナログを挙げることができる。一態様において、免疫グロブリンフラグメントは二量体の受容体ドメイン融合ポリペプチドである。特定の一態様において、二量体受容体ドメイン融合ポリペプチドはエタネルセプトである。エタネルセプトは、皮下に投与されかつ患者の血清中のＴＮＦαに結合してそれを生物学的に不活性にする、組換えの可溶性ＴＮＦα受容体分子である。エタネルセプトは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に連結されたヒト７５キロダルトン（ｐ７５）腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）の細胞外リガンド結合部分よりなる二量体融合タンパク質である。エタネルセプトのＦｃ成分はＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびヒンジ領域を含有するが、しかしＩｇＧ１のＣＨ１ドメインを含有しない。
【００４８】
本発明の細胞株を使用する製造に従いやすい他の生成物は、他の型の動物細胞株により現在製造されかつグリコシル化されることが可能なＣＨ２を有する治療若しくは予防タンパク質を包含する。細胞表面上の標的抗原に結合する治療的なグリコシル化されたＣＨ２ドメイン含有タンパク質がとりわけ好ましく、その細胞型は能力を奪うか若しくは身体から排除することが望ましい。多数のこうした治療抗体が、ヒトＩｇＧ１、とりわけヒトＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含んでなるＩｇＧ１κ、Ｈ鎖を含有するよう工作されている。こうした治療タンパク質は、限定されるものでないが：
【００４９】
現在ＲＥＭＩＣＡＤＥ（Ｒ）として販売されるインフリキシマブ。インフリキシマブは、１４９，０００ダルトンのおよその分子量をもつキメラＩｇＧ１κモノクローナル抗体である。それはヒト定常およびマウス可変領域から構成される。インフリキシマブは１０１０Ｍ−１の会合定数でヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ（α））に特異的に結合する。インフリキシマブは、可溶性および膜貫通の形態のＴＮＦ（α）に高アフィニティーで結合することによりＴＮＦ（α）の生物学的活性を中和し、そしてＴＮＦ（α）のその受容体との結合を阻害する。インフリキシマブにより結合された膜貫通ＴＮＦ（α）を発現する細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ ｖｉｖｏで溶解され得る。インフリキシマブは、関節リウマチ、クローン病および強直性脊椎炎の処置に指示される。インフリキシマブは、静脈内注入として与えられる３ないし５ｍｇ／ｋｇの用量、次いで処置されるべき疾患に依存してその後２、６および／若しくは８週の、ならびに８週ごとの間隔での付加的な類似の用量として与えられる。
【００５０】
ダクリズマブ（ＺＥＮＡＰＡＸ（Ｒ）として販売される）は、活性化されたリンパ球の表面上で発現されるヒト高アフィニティーインターロイキン−２（ＩＬ−２）受容体のαサブユニット（ｐ５５ α、ＣＤ２５若しくはＴａｃサブユニット）に特異的に結合する、組換えＤＮＡ技術により製造された免疫抑制性ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ダクリズマブは、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植されたマウス−ヒトキメラ抗体である。ヒト配列は、ヒトＩｇＧ１の定常ドメインおよびＥｕ骨髄腫抗体の可変枠組み領域由来であった。マウス配列はマウス抗Ｔａｃ抗体のＣＤＲ由来であった。ダクリズマブは、腎移植を受領する患者での急性臓器拒絶の予防に指示され、また、一般に、シクロスポリンおよびコルチコステロイドを包含する免疫抑制レジメンの一部として使用される。
【００５１】
バシリキシマブ（ＳＩＭＵＬＥＣＴ（Ｒ）として販売される）は、活性化されたＴリンパ球の表面上のインターロイキン−２受容体（α）−鎖（ＩＬ−２Ｒ（α）、ＣＤ２５抗原としてもまた知られる）に特異的に結合しかつ阻害する免疫抑制剤として機能する、組換えＤＮＡ技術により製造されるキメラ（マウス／ヒト）モノクローナル抗体である。アミノ酸配列に基づき、該タンパク質の計算される分子量は１４４キロダルトンである。それは、ヒトＨおよびＬ鎖定常領域遺伝子（ＩｇＧ１）、ならびにＩＬ−２Ｒ（α）に選択的に結合するＲＦＴ５抗体をコードするマウスＨおよびＬ鎖可変領域遺伝子を含有するプラスミドを発現するよう遺伝子的に工作された、樹立マウス骨髄腫細胞株の醗酵から得ら
れる糖タンパク質である。バシリキシマブは、シクロスポリンおよびコルチコステロイドを包含する免疫抑制レジメンの一部として使用される場合に、腎移植を受領する患者での急性臓器拒絶の予防に指示される。
【００５２】
アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（Ｒ）として販売される）は、ヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に特異的な組換えヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体である。アダリムマブは、ヒト由来ＨおよびＬ鎖可変領域ならびにヒトＩｇＧ１ κ定常領域をもつ抗体をもたらすファージディスプレイ技術を使用して創製された。ＨＵＭＩＲＡ（Ｒ）は、１種若しくはそれ以上のＤＭＡＲＤに対する不十分な応答を有した、中程度ないし重度に活動性の関節リウマチを伴う成人患者での構造の損傷の徴候および症状を低下させかつその進行を阻害するために指示される。ＨＵＭＩＲＡ（Ｒ）は単独でまたはＭＴＸ若しくは他のＤＭＡＲＤと組合せで使用し得る。
【００５３】
リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（Ｒ）として販売される）は、正常および悪性Ｂリンパ球の表面上で見出されるＣＤ２０抗原に向けられた、遺伝子的に工作されたキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体である。該抗体は、マウスＬおよびＨ鎖可変領域配列ならびにヒト定常領域配列を含有するＩｇＧ１ κ免疫グロブリンである。リツキシマブは、およそ８．０ｎＭのＣＤ２０抗原に対する結合アフィニティーを有する。リツキシマブは再発性若しくは難治性の低グレード若しくは濾胞性ＣＤ２０陽性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫を伴う患者の処置に指示される。ＲＩＴＵＸＡＮ（Ｒ）は４若しくは８用量にわたり週１回３７５ｍｇ／ｍ ２ ＩＶ注入で与えられる。
【００５４】
トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（Ｒ）として販売される）は、ヒト上皮細胞成長因子受容体２タンパク質ＨＥＲ２の細胞外ドメインに、細胞に基づくアッセイで高アフィニティー（Ｋｄ＝５ｎＭ）で選択的に結合する、組換えＤＮＡ由来ヒト化モノクローナル抗体である。該抗体は、ＨＥＲ２に結合するマウス抗体（４Ｄ５）の相補性決定領域とともにヒト枠組み領域を含有するＩｇＧ １ κである。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮは、その腫瘍がＨＥＲ２タンパク質を過剰発現しかつ彼らの転移性疾患に対し１種若しくはそれ以上の化学療法レジメンを受領した転移性乳癌を伴う患者の処置のための単剤療法として指示される。パクリタキセルと組合せのＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（Ｒ）は、その腫瘍がＨＥＲ２タンパク質を過剰発現しかつ彼らの転移性疾患に対し化学療法を受領したことがない転移性乳癌を伴う患者の処置に指示される。推奨される投薬量は、９０分注入として投与される４ｍｇ／ｋｇトラスツズマブの初期負荷用量、および初期負荷用量が十分に耐えられた場合に３０分注入として投与し得る２ｍｇ／ｋｇトラスツズマブの週１回維持用量である。
【００５５】
アレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ（Ｒ）として販売される）は、２１〜２８ｋＤの細胞表面糖タンパク質ＣＤ５２に向けられる組換えＤＮＡ由来ヒト化モノクローナル抗体（Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ）である。アレムツズマブは、本質的に全部のＢおよびＴリンパ球、単球、マクロファージおよびＮＫ細胞の大多数、顆粒球の一亜集団、ならびに男性生殖器官の組織の表面上に存在する非調節抗原ＣＤ５２に結合する。Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ抗体は、ヒト可変枠組みおよび定常領域、ならびにマウス（ラット）モノクローナル抗体（Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｇ）からの相補性決定領域をもつＩｇＧ１ κである。Ｃａｍｐａｔｈは、アルキル化剤で処置されかつフルダラビン療法に失敗した患者でのＢ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）の処置に指示される。Ｃａｍｐａｔｈの有効性の決定は全体奏功率に基づく。Ｃａｍｐａｔｈは、当初１日に２時間のＩＶ注入として投与される３ｍｇで与えられ；一旦耐えられれば、１日用量を１０ｍｇに増加させかつ耐えられるまで継続すべきである。この用量レベルが一旦耐えられれば、Ｃａｍｐａｔｈ ３０ｍｇの維持用量を開始することができ、そして１２週まで週あたり３回投与しうる。大部分の患者で、３０ｍｇへの増加は３〜７日で達成し得る。
【００５６】
オマリズマブ（ＸＯＬＡＩＲ（Ｒ）として販売される）は、ヒト免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に選択的に結合する組換えヒト化ＩｇＧ１（κ）モノクローナル抗体である。オマリズマブは、肥満細胞および好塩基球の表面上の高アフィニティーＩｇＥ受容体（Ｆｃ（ε）ＲＩ）へのＩｇＥの結合を阻害する。Ｆｃ（ε）ＲＩを持つ細胞上の表面に結合したＩｇＥの減少は、アレルギー応答のメディエーターの遊離の程度を制限する。オマリズマブでの処置はまた、アトピー患者での好塩基球上のＦｃ（ε）ＲＩ受容体の数も減少させる。オマリズマブは、通年性空気アレルゲンに対する陽性の皮膚試験若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏ反応性を有しかつその症状が吸入コルチコステロイドで不十分に制御される、中等度ないし重度の持続性喘息を伴う成人および青年（１２歳およびより上）に指示される。オマリズマブは１５０ないし３７５ｍｇの用量で２若しくは４週ごとにＳＣ投与する。
【００５７】
エファリズマブ（ＲＡＰＴＩＶＡ（Ｒ））は、ヒトＣＤ１１ａに結合する免疫抑制性組換えヒト化ＩｇＧ１ κアイソタイプモノクローナル抗体である。エファリズマブは、全白血球上で発現される白血球機能抗原−１（ＬＦＡ−１）の（α）サブユニットＣＤ１１ａに結合し、そしてＣＤ１１ａの細胞表面発現を減少させる。エファリズマブは、細胞内接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）へのＬＦＡ−１の結合を阻害して、それにより他の細胞型への白血球の接着を阻害する。ＬＦＡ−１とＩＣＡＭ−１の間の相互作用は、Ｔリンパ球の活性化、内皮細胞へのＴリンパ球の接着、および乾癬の皮膚を包含する炎症の部位へのＴリンパ球の移動を包含する複数の過程の開始および維持に寄与する。リンパ球の活性化および皮膚への輸送は慢性の尋常性乾癬の病態生理学である役割を演じている。乾癬の皮膚では、ＩＣＡＭ−１の細胞表面発現が内皮およびケラチノサイト上で上方制御されている。ＣＤ１１ａは、Ｂリンパ球、単球、好中球、ナチュラルキラー細胞および他の白血球の表面上でもまた発現されている。従って、エファリズマブがＴリンパ球以外の細胞の活性化、接着、移動および数に影響を及ぼす可能性が存在する。ＲＡＰＴＩＶＡ（Ｒ）の推奨用量は、単回の０．７ｍｇ／ｋｇ ＳＣ馴化用量、次いで１ｍｇ／ｋｇの週１回のＳＣ用量（合計２００ｍｇを超えない最大単回用量）である。
を挙げることができる。
【００５８】
別の態様において、本発明の細胞株は、免疫グロブリンに由来しないポリペプチドを発現するように安定にトランスフェクト若しくは別の方法で工作されている。
【００５９】
なお別の態様において、本発明の細胞、細胞株および細胞培養物は、組換え血液タンパク質若しくは他の結合組織タンパク質を検出可能に発現しうる。こうした組換えタンパク質は、限定されるものでないが、エリスロポエチン、トロンボポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、フィブリノーゲン、ヘモグロビン、トランスフェリン、アルブミン、プロテインｃ、コラーゲン、およびそれらのいずれかの構造若しくは機能アナログを挙げることができる。特定の一態様において、本発明の細胞、細胞株および細胞培養物は組織プラスミノーゲンアクチベーターを発現する。
【００６０】
本発明の抗体およびタンパク質をコードする核酸は、当該技術分野で公知のいくつかの方法で派生させ得る。一局面において、抗体は、マウスを本発明のペプチドで免疫することにより製造されるハイブリドーマから便宜的に得られる。抗体は従って、当該技術分野で公知のハイブリドーマ技術（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ニューヨーク（１９８７−２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）；ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク（１９９４−２００１）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州ニューヨーク（１９９７−２００１）（それぞれそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい）のいずれを使用しても得ることができる。
【００６１】
抗体の標的結合部分、典型的には抗体の可変Ｈおよび／若しくは可変Ｌドメインの別の便宜的派生方法において、例えばファージライブラリーで創製されるこうした結合ドメインのライブラリーからこれらの部分を選択する。ファージライブラリーは、無作為オリゴヌクレオチドのライブラリー、または免疫した動物若しくはヒトのＢ細胞からのような目的の配列を含有するポリヌクレオチドのライブラリー（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５−１３１７）を挿入することにより創製し得る。抗体ファージライブラリーは、１ファージ中にＨおよびＬ鎖可変領域対を含有し、一本鎖Ｆｖフラグメント若しくはＦａｂフラグメントの発現を可能にする（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら
２０００、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１（８）３７１−８）。ファージミドライブラリーの多様性は、付加的な所望のヒトモノクローナル抗体を製造しかつその後同定するようにライブラリーのモノクローナル抗体の免疫特異性を増大しかつ／若しくは変えるように操作し得る。例えば、Ｈ鎖およびＬ鎖免疫グロブリン分子をコードする遺伝子を、集成された免疫グロブリン分子中で新たなＨＬ対を創製するように無作為に混合（シャッフル）し得る。加えて、ＨおよびＬ鎖をコードする遺伝子のいずれか若しくは双方を、免疫グロブリンポリペプチドの可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）中で突然変異誘発し得、そしてその後、所望のアフィニティーおよび中和能力についてスクリーニングし得る。抗体ライブラリーは、１種若しくはそれ以上のヒト枠組み配列を選択すること、およびヒト抗体レパートリー由来のＣＤＲカセットの集合物を導入することにより、または設計された変動（Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒとｖｏｎ Ｒｕｄｅｎ ２０００、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３：５９８−６０２）によってもまた合成で創製し得る。多様性の位置はＣＤＲに制限されないが、しかし、可変領域の枠組みセグメントもまた包含し得るか、若しくはペプチドのような抗体可変領域以外を包含しうる。
【００６２】
抗体可変領域以外を包含しうる標的結合成分の他のライブラリーは、リボソームディスプレイ、酵母ディスプレイおよび細菌ディスプレイである。リボソームディスプレイは、タンパク質をＲＮＡに結合されたまま保ちながらのｍＲＮＡのそれらの同族のタンパク質への翻訳方法である。核酸のコーディング配列はＲＴ−ＰＣＲにより回収される（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ，Ｌ．Ｃ．ら １９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１、９０２２）。酵母ディスプレイは、膜結合α−アグルチニン酵母接着受容体ａｇａ１およびａｇａ２（接合型系の一部）の融合タンパク質の構築に基づく（Ｂｒｏｄｅｒら １９９７．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５：５５３−７）。細菌ディスプレイは、細胞膜若しくは細胞壁と会合する輸送された細菌タンパク質への標的の融合に基づく（ＣｈｅｎとＧｅｏｒｇｉｏｕ ２００２．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ、７９：４９６−５０３）。
【００６３】
ハイブリドーマ技術に比較して、ファージおよび他の抗体ディスプレイ法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでかつ抗原に対する宿主の影響の可能性の制限なしに、若しくはその逆で、抗原標的に対する選択を操作する機会を提供する。
【００６４】
製造方法
安定にトランスフェクトされたとして一旦樹立されれば、本発明のＹＢ２／０細胞株を低温保存しかつ製造操作を開始するために再生し得る。典型的には、該細胞株は１０％ＤＭＳＯを補充したＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ培地中、バイアルあたり１×１０７細胞で貯
蔵する。製造操作の開始時に、細胞のバイアルを融解し、１０ｍｌのＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ培地を含有するフラスコに内容物を移し、そしてフラスコを３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートする、その後、培養物をより大きな容器中で増殖させ、それを順に所望の容量の灌流バイオリアクターに移す（Ｄｅｏら １９９６．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１２：５７−６４）。
【００６５】
例えば、本発明のクローン性骨髄腫細胞株は、約０．０１ｍｇ／Ｌないし約１０，０００ｍｇ／Ｌ培地の濃度で組換えタンパク質を産生するよう操作しうる。別の態様において、本発明のクローン性骨髄腫細胞株は、約０．１ｐｇ／細胞／日ないし約１００ｎｇ／細胞／日の濃度で組換えタンパク質を産生するよう操作しうる。
【００６６】
本発明のＣ１０８３Ｂ〜Ｅ細胞の増殖および維持を支援するために本発明で有用な培地若しくは増殖培地は、無血清培地（ＳＦＭ）、無タンパク質培地（ＰＦ）、動物由来成分を含まない（ＡＤＣＦ）培地、および既知組成（ＣＤ）処方を包含する。本発明で使用されるところのＣＤ培地は、血清、血清タンパク質、加水分解物、若しくは未知組成の化合物を包含する動物起源のいかなる成分も欠く増殖培地を含んでなる。ＣＤ培地の全成分は既知の化学構造を有し、以前に論考されたバッチごとの変動性の排除をもたらす。
【００６７】
本発明で使用されるＣＤ培地は、限定されるものでないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州カールズバッドにより製造されるＣＤ培地、ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（カタログ番号１１２７９）を挙げることができる。ＣＤ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ培地は、多様なハイブリドーマおよび骨髄腫の増殖、ならびに静止若しくは攪拌懸濁系でのモノクローナル抗体の製造に至適化された既知組成の無タンパク質培地である。ＣＤ
Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ培地は動物、植物若しくは合成起源のタンパク質を含有しない。処方中に、定義されないライセート若しくは加水分解物もまた存在しない。ＣＤ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ培地は、増大された安定性のためＬ−グルタミンを含まず処方される。グルタミンは、使用前の培地１，０００ｍｌあたり４０ｍｌの２００ｍＭ Ｌ−グルタミン若しくは４０ｍｌのＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ−Ｉ補充物（またＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）として添加しうる。Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ培地のマスターファイルがＦＤＡに提出されている。ＣＤ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ培地は、ＮＳＯ由来株のような脂質依存性若しくはコレステロール依存性の培養物に対し至適化されていない。
【００６８】
増殖プロファイルのため、ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ培地に１ｇ／Ｌ ＮａＨＣＯ３、および６ｍＭの最終濃度までのＬ−グルタミンを補充した。本発明は、「Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ Ｆｏｒ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（培養哺乳動物細胞のための既知組成培地）」と題されたＰＣＴ公開第ＷＯ ０２／０６６６０３号明細書（引用することにより明らかに組み込まれる）に記述される「ＣＤＭ培地」を包含する既知組成培地の使用もまた企図している。
【００６９】
エフェクター機能の評価方法
治療的Ｆｃ含有タンパク質の消失および従って薬物動態における抗体グリコシル化の役割は不明である。すなわち、循環からのＩｇＧ除去の原因と考えられる新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合は、抗体のＦｃ部分のＮ結合したオリゴ糖の欠如により破壊されないようである。
【００７０】
細胞のエフェクター機能とＩｇＧ抗体媒介性免疫応答を結びつけるＩｇＧ Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）は、Ｆｃγ受容体、すなわちＦｃＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を包含する。全３種は単球上に表示されて見出される。しかしながら、多様な標的細胞上のこれらの受容体の生成は差別的にかつ他の因子に応答して起こるようである。従って、Ｆｃγ受容体に対するグリコシル化が改変されたＦｃ含有生物学的治療薬のアフィニティーの測定は、高められたエフェクター機能を予測するた
めの１つの適切な測定である。
【００７１】
それらのＦｃグリカン中の低レベルのフコースを伴うヒトＩｇＧ１ Ａｂは、ヒトＣＤ１６ ＦｃＲに対するより大きいアフィニティー、および、ヒトＰＢＭＣエフェクター細胞を使用するＡＤＣＣアッセイで劇的に高められたｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を有することが報告された（Ｓｈｉｎｋａｗａら Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８（５）：３４６６−３４７３、２００３；Ｓｈｉｅｌｄｓら Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７（３０）：２６７３３−２６７４０、２００２；Ｕｍａｎａら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ １７：１７６−１８０、１９９９）。しかしながら、マウスＣＤ１６およびＣＤ３２ ＦｃＲに対するこうしたＡｂのアフィニティーは高フコースＡｂのものより高くなかったという報告（Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００２）後は、マウスで低フコースＡｂを研究するより少ない動機が存在した。にもかかわらず、ＣＣケモカイン受容体４に対するキメラヒトＩｇＧ１ Ａｂの高フコースおよび低フコースバージョンの抗腫瘍活性を比較した場合に、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣ活性の差違は観察されなかった（マウスエフェクター細胞を使用して）が、しかしながら、低フコースＡｂはｉｎ ｖｉｖｏでより強力な有効性を示した。ヒトエフェクター細胞は提供されず、そしてマウスは内因性ＮＫ細胞を保持する（Ｎｉｗａら Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６４：２１２７−２１３３、２００４）。
【００７２】
ヒトＮＫ細胞上のＣＤ１６受容体は、ＩｇＧ１ Ａｂのフコースレベルに対する高められた感受性を示したため、これらのデータは、ヒトエフェクター細胞で研究されたものと異なる機構がマウスで作動していることを示唆する。１つの可能性は、より最近発見されたマウスＣＤ１６−２受容体である（Ｍｅｃｈｅｔｉｎａら Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ ５４：４６３−４６８、２００２）。マウスＣＤ１６−２の細胞外ドメインは、より良好に知られているマウスＣＤ１６受容体が有するよりもヒトＣＤ１６Ａに対する有意により高い配列同一性（６５％）を有し、それが結合するＩｇＧのフコースレベルに対しマウスＣＤ１６よりもそれがより感受性でありうることを示唆する。マウスマクロファージ様Ｊ７７４細胞でのその報告された発現は、ＣＤ１６−２を発現するマウスマクロファージが、Ｎｉｗａら（２００４）により記述された低フコースＡｂによるより大きな抗腫瘍活性の原因でありうる可能性と矛盾しない。従って、マウスエフェクター細胞へのヒトＩｇＧ１型Ｆｃ含有タンパク質によるＦｃ受容体の結合の研究は予測的でない。
【００７３】
エフェクター機能の別の評価方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイを定量的様式で使用することによる。従って、標的およびエフェクター細胞株の正しい選択、ならびに駆動することを継続することの細胞の不能若しくは内的含有物の遊離、例えば５１クロム遊離のいずれかにより細胞の「死滅」を評価することにより、その同族のリガンドを表示する細胞の破壊を引き起こす結合した抗体の能力を測定するように、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを設計し得る。標的細胞は、本発明の抗体、抗体フラグメント若しくは融合タンパク質の標的リガンドを通常発現する細胞株でありうるか、または標的タンパク質をその表面上で発現しかつ保持するよう工作しうる。こうした工作された細胞株の一例がＫ２細胞、すなわち成熟サイトカインのアミノ酸１−１２の欠失の導入により膜貫通形態として留まる組換えヒトＴＮＦをその表面上で安定に発現するＳｐ２／０マウス骨髄腫細胞株である（Ｐｅｒｅｚら、Ｃｅｌｌ ６３：２５１−２５８、１９９０）。この細胞株は、抗ＴＮＦ抗体、抗体フラグメント、またはＦｃドメイン若しくはＦｃドメイン活性を有する工作された抗ＴＮＦαを標的とする融合タンパク質のＡＤＣＣ活性の変化を評価するのに有用である。
【００７４】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣ活性アッセイのためのエフェクター細胞は、ヒト若しくは他の哺乳動物供給源のＰＢＭＣ（末梢血単球細胞）でありうる。ＰＢＭＣエフェクター細胞は、承認された方法によりドナーから血液を収集した後から新たに単離し得る。使用しうる他の単球若しくはマクロファージ細胞は、腹腔滲出液のような滲出液由来からのもの
でありうる。
【００７５】
本発明を全般的条件で記述した一方、本発明の態様は以下の実施例にさらに開示されるであろう。
【００７６】
実施例
【実施例１】
【００７７】
ＡＰＦ−ＹＢ２／０細胞株の適応およびクローニング
５％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳ）中で培養したラットハイブリドーマ細胞株ＹＢ２／０（Ｃ１０８３Ａ）を、２種の異なる方法により、ＡＰＦ培地ＣＤ−ＨｙｂすなわちＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（Ｇｉｂｃｏ）中で増殖するように適応させた：
【００７８】
方法１．細胞を、６ｍＭグルタミンを補充したＣＤ−Ｈｙｂ培地中で１：１で繰り返し継代することにより、ＦＢＳ含有培地からゆっくり離脱させた。６継代後に該細胞はＡＰＦ培地中での増殖が可能となった。この細胞株をＣ１０８３Ｂと称した（表Ｉ）。ＣＤ−ＨｙｂおよびＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳ中でのＣ１０８３Ｂの増殖の特徴は比較可能であった（図３）。Ｃ１０８３Ｂからの個々のクローンを、ＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳを使用する限界希釈法により単離した。２４個のクローンをスケールアップのため移し、そしてこの実験からの８クローンをさらなる研究のため選択した。これらの８クローンの選択の基準は、平均倍加時間（ＭＤＴ）、振とうフラスコ培養物中で高細胞密度に達する能力、および複数の継代にわたる安定性を包含した。
【００７９】
【表１】
【００８０】
方法２．２００、５００、１０００若しくは５０００個のＣ１０８３Ａ細胞を、６ｍＭグルタミンを補充したＣＤ−Ｈｙｂ培地中で９６ウェルプレート（各範疇について５プレート）のウェルにつきプレーティングした。３週のインキュベーション後、５０００細胞／ウェルを含むプレートのみがおよそ１０ウェル／プレートのコロニーを有した。２４個のクローンを増殖のため２４ウェルプレートに移した。平均倍加時間、振とうフラスコ培養物中で高細胞密度に達する能力、および複数の継代にわたる安定性に基づき、４クローンをさらなる研究のため採った。
【００８１】
方法１により生成された８個および方法２により生成された４個の１２クローンを、ＣＤ−Ｈｙｂ培地中での増殖の特徴、すなわち平均倍加時間、振とうフラスコ培養物中で高細胞密度に達する能力、および複数の継代にわたる安定性について比較した。４クローンを、さらなる研究のためこの実験から選択した（Ｃ１０８３Ｂ−１、Ｃ１０８３Ｂ−１２
、Ｃ１０８３−Ｈ１８およびＣ１０８３−Ｈ２１）。全４種は比較可能な増殖の特徴を有した。それらのＭＤＴはおよそ２２時間であり、また、それらは振とうフラスコ培養物中で高細胞密度（＞２×１０６／ｍｌ）に達することが可能であった（図４）。該４種の細胞株のうち３種（Ｃ１０８３Ｂ−１、Ｃ１０８３Ｂ−１２およびＣ１０８３−Ｈ２１）をその後、ＡＭＡＸＡ電気穿孔装置、および骨髄腫細胞株のトランスフェクションについて以前に至適化された設定を使用して、それらのトランスフェクション効率を決定するため試験した。細胞株Ｃ１０８３Ｂ−１２を、所望の特徴をもつＡＰＦ−ＹＢ２／０細胞株としてこの試験から選び、そしてＣ１０８３Ｂに加えて代替のトランスフェクション宿主細胞株としてはたらくことができる。それをＣ１０８３Ｅと称した。
【実施例２】
【００８２】
フコース特異的レクチンに耐性のＹＢ２／０クローンの単離
レクチンは特定の１つの型のオリゴ糖を発現する細胞株を選択するのに使用し得る（ＲｉｐｋａとＳｔａｎｌｅｙ、１９８６．Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｇｅｎ １２：５１−６２）。利用可能な２種のフコース特異的レクチンのうち、レンズマメ（Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）アグルチニン（ＬＣＡ）を、Ｃ１０８３Ｂを使用する（棒グラフの形態の）死滅曲線（図５）を生成するため選択した。（ＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳ中で培養した）Ｃ１０８３Ｂ細胞を、多様な濃度のＬＣＡレクチンの存在下に９６ウェルプレートに５０００細胞／ウェルでプレーティングした。５日後に、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅアッセイ（Ｖｙｂｒａｎｔ細胞代謝アッセイキット、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）により生存率を測定した。
【００８３】
低下されたレベルのｆｕｔ８ ｍＲＮＡ（配列番号１）を発現するＣ１０８３Ｂのまれな天然のバリアントを、５０μｇ／ｍｌのＬＣＡの存在下に９６ウェルプレート中で５細胞／ウェルをプレーティングすることにより選択した。３週後に１７個の耐性クローン（プレーティングした２×１０４細胞から）を同定した。これらをスケールアップし、そしてＣＤ−Ｈｙｂ培地中で複数回継代した。１７クローンのうち８個を、確実な増殖、振とうフラスコ培養物中で高細胞密度に達する能力、および複数回の継代にわたる培養物の安定性に基づき選択した。全ＲＮＡをこれらのクローンから単離した。２組のラット特異的ｆｕｔ８ Ｔａｑｍａｎプローブ（下線を付ける）およびプライマー（斜体にする）（配列番号２〜７、図６Ａ）を使用する定量的ＰＣＲ実験。
【００８４】
これらの分析は、１クローン（Ａ４）が６倍より少ないｆｕｔ８ ｍＲＮＡを有した一方、２種の他のクローン（Ａ８およびＡ９）がおよそ２倍より少ないｆｕｔ８ ｍＲＮＡを有したことを示した（図６Ｂ）。クローンＡ４をＣ１０８３Ｃと称し、また、クローンＡ９をＣ１０８３Ｄと称した。図７ＡおよびＢからのデータは、ＣＤ−Ｈｙｂ中でのＣ１０８３ＣおよびＣ１０８３Ｄの増殖の特徴が、培地容量あたりの生存可能細胞（図７Ａ）および全細胞生存率（図７Ｂ）に基づき、親株Ｃ１０８３Ｂのものに匹敵することを示す。
【実施例３】
【００８５】
抗組織因子抗体ＤＮＡでのＣ１０８３Ｂ細胞のトランスフェクション
抗ヒト組織因子抗体ＣＮＴＯ ８６０は、マウスでの癌のヒト異種移植モデルで試験されたところの腫瘍増殖を低下若しくは予防することにおけるその有効性のため選択した。図８に示されるところのＣＮＴＯ ８６０ ＨおよびＬ鎖をコードする発現ベクター（ｐ２４０１およびｐ２４０２）は第ＷＯ／０４１１０３６３号および米国特許出願第１１／０１０，７９７号明細書にさらに記述される）をｐＳＶ２ＤＨＦＲ（Ｐｒｏｍｅｇａ）とコトランスフェクトし、そして、選択マーカーＭＨＸ、（ミコフェノール酸、ヒポキサンチンおよびキサンチン）に耐性のクローンを、抗体発現についてＥＬＩＳＡにより分析した。１個の高発現細胞株Ｃ１２６１Ａをさらなる研究のため選択した。それは振とうフラ
スコ培養物でＣＤ−Ｈｙｂ培地中で４５〜５０ｍｇ／Ｌを産生し、そして複数の継代にわたる発現の安定性を示した（図９）。増殖および抗体力価を１×Ｌｉｐｉｄ（Ｇｉｂｃｏ）の非存在および存在下でモニターした。
【実施例４】
【００８６】
Ｃ１０８３Ｂ由来の抗組織因子抗体のＡＤＣＣ活性の測定
一連のｉｎ ｖｉｔｒｏ ５１Ｃｒ遊離細胞傷害性アッセイを、数種の抗組織因子抗体、すなわち、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃを含有するＣＮＴＯ８５９（欧州特許第ＥＰ８３３９１１Ｂ１号明細書に記述される）；ＣＮＴＯ８５９と同一の抗原結合領域を有するがしかしヒトＩｇＧ１枠組みにクローン化されており、そして従ってＨ鎖について配列番号８およびＬ鎖について配列番号９の配列を有するヒト化抗体を産生するＣＮＴＯ８６０（２００４年１２月１３日出願の米国特許出願第１１／０１０７９７号明細書に記述されるところの）；ならびにＹＢ２／０ ＣＤ−Ｈｙｂに適応させた細胞株でＣＮＴＯ８６０抗体を産生することの結果としてのグリコシル化バリアント、若しくはｆｕｔ８欠損バリアントのＡＤＣＣ活性の増強を示すために使用した。
【００８７】
組織因子を発現するヒト結腸癌細胞ＨＣＴ １１６を標的細胞として使用した。細胞は、１０％熱不活性化ＦＢＳおよび１％ＬＮＮを補充したマッコイ５Ａ培地（Ｍ５Ａ−１０）中で維持した。アッセイの日に細胞をトリプシン処理し、収集し、そして１ｍＬのＭ５Ａ−１０中３７℃で２００μＣｉのＮａ５１ＣｒＯ４（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、マサチューセッツ州ボストン）あたり１０×１０６細胞で２時間標識した。標識した細胞は、５０ｍＬのカルシウム若しくはマグネシウムを含まないＰＢＳ（ＰＢＳ−）で２回洗浄し、そして４×１０５細胞／ｍＬ Ｍ５Ａ−１０に再懸濁した。
【００８８】
ＰＢＭＣは健康ドナーから単離した。静脈血をヘパリン化シリンジに収集し、そして等容量のＰＢＳ−で５０ｍＬコニカルチューブに希釈した（２０ｍＬ：２０ｍＬ）。この血液溶液の上に１３ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、スウェーデン・ウプサラ）を置き、そして室温（ＲＴ）で２２００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上の血漿層を吸引し、そしてＰＢＭＣを含有する界面（バフィ層）を収集した。エフェクター細胞をＰＢＳ−で３回洗浄し、そしてその後５×１０６細胞／ｍＬでＭ５Ａ−１０に再懸濁した。２５：１というエフェクター対標的比を全実験に使用した。
【００８９】
第一の実験で、組織因子に対するモノクローナル抗体すなわちＣＮＴＯ ８５９、ＣＮＴＯ ８６０およびＣＮＴＯ ８６０ ＹＢ２／０のＡＤＣＣ活性を、２名の異なるドナーからのＰＢＭＣを使用して特徴付けした（図１０Ａ）。特異的溶解を４時間後に測定し、そして各棒は双方のドナーからの３検体の平均を代表する。自発および最大遊離の対照サンプルは、それぞれ、２μｇ／ｍＬの抗体の存在下しかしエフェクター細胞の非存在下で培地単独で処理したか、若しくは０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で処理した。各サンプル中の特異的溶解の比率は、自然に遊離したｃｐｍにより補正したＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００により遊離されたｃｐｍ（最大遊離）に基づき計算した。
【００９０】
ＩｇＧ４サブタイプ、ＣＮＴＯ ８５９は、マウス骨髄腫宿主細胞株Ｃ４６３により産生されるＩｇＧ１サブタイプ、ＣＮＴＯ ８６０に比較して最小のＡＤＣＣ活性を有する。対照的に、ＹＢ２／０宿主細胞株Ｃ１０８３Ｂ由来のＣＮＴＯ ８６０は、それらのＥＣ５０および最大溶解値を比較した場合に、Ｃ４６３由来のものよりおよそ２０〜６０倍より強力であった（図１０Ａ）。ＹＢ２／０由来のＣＮＴＯ ８６０は、９９％フコシル化されたＣ４６３由来のＣＮＴＯ ８６０に比較して、４０％フコシル化された。
【００９１】
第二の実験で、３種の細胞株由来のＣＮＴＯ ８６０、すなわちＣ４６３；無動物タンパク質に適応させたＹＢ２／０細胞株Ｃ１０８３Ｂ、およびｆｕｔ８枯渇ＹＢ２／０細胞
株Ｃ１０８３Ｃを、それらの相対ＡＤＣＣ効力について比較した。特異的溶解を４時間後に測定し、そして、棒は単一ドナーからの３検体の平均を表す。
【００９２】
Ｃ１０８３Ｂ細胞株由来のＣＮＴＯ ８６０は、マウス骨髄腫宿主細胞株Ｃ４６３由来のものよりおよそ１０倍より強力であった（図１０Ｂ）。
【００９３】
親ＹＢ２／０由来細胞株Ｃ１０８３Ｂおよびｆｕｔ８枯渇クローンＡ４−２、Ｃ１０８３Ｃ由来のＣＮＴＯ ８６０の間で、ＡＤＣＣ活性の差違は観察されなかった。これらの結果は、フコースレベルをさらに低下させることによるＡＤＣＣ活性のさらなる増大はｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ法を使用して測定可能でなかったことを示す。
【実施例５】
【００９４】
抗体グリコシル化の分析
Ｃ４６３および多様なトランスフェクション宿主細胞株で生成されたＣＮＴＯ ８６０のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を実施した。
【００９５】
Ｃ４６３（図１１Ａ）、ＡＰＦに適応させたラット骨髄腫ＹＢ２／０宿主細胞株Ｃ１０８３Ｂ（図１１Ｂ）およびｆｕｔ８枯渇ＹＢ２／０宿主細胞株Ｃ１０８３Ｃ（図１１Ｃ）で生成されたＣＮＴＯ ８６０を、公表されたプロトコル（Ｐａｐａｃら、１９９６；Ｐａｐａｃら、１９９８；Ｒａｊｕら、２０００）に従ってＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析にかけた。
【００９６】
試験Ａｂを多様な方法により構造解析した。無傷のＩｇＧ ＡｂのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を実施するため、ＩｇＧサンプルを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．０中にもたらし、そして濃度を約１ｍｇ／ｍＬ緩衝液に調節した。約２μｌのＩｇＧ溶液を２μｌのマトリックス溶液（マトリックス溶液は、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水中５０％アセトニトリル１．０ｍｌに１０ｍｇのシナピン酸を溶解することにより調製した）と混合し、そしてこの溶液２ｍｌを標的に負荷しかつ風乾させた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳはＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティ）からのＶｏｙａｇｅｒ ＤＥ装置を使用して取得した。
【００９７】
遊離されたＦｃグリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を実施するため、ＩｇＧサンプル（約５０μｇ）を１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（５０μｌ）ｐＨ７．０中でＰＮＧアーゼＦで３７℃で４時間消化した。反応混合物を５０％酢酸（約５μｌ）で酸性化することにより消化を停止し、そしてその後、以前に記述された（Ｐａｐａｃら、１９９６；Ｐａｐａｃら、１９９８；Ｒａｊｕら、２０００）とおり陽イオン交換樹脂カラムを通過させた。酸性および中性のオリゴ糖の混合物を含有するこれらのサンプルを、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティ）からのＶｏｙａｇｅｒ ＤＥ装置を使用して、別の場所（Ｐａｐａｃら、１９９６；Ｐａｐａｃら、１９９８；Ｒａｊｕら、２０００）に記述されたとおり、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより陽および陰イオンモードで分析した。
【００９８】
多様なＹＢ２／０細胞で産生された抗体サンプルからの遊離されたグリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を図１１Ａ〜Ｃに示し、また、該オリゴ糖の構造を図２Ａ〜Ｅに描く。オリゴ糖は、コアフコース、分岐ＧｌｃＮＡｃの存在、シアル酸、ガラクトースなどのような末端糖の存在若しくは非存在に基づき配列中で番号付けする。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳデータは、ＹＢ２／０細胞で産生された抗体サンプルが増大された量のフコシル化されていないオリゴ糖を含有することを示唆する（図２Ａ〜Ｂ、構造１−１５）。フコシル化されていないオリゴ糖の量は、ある種の抗体サンプルについて５０％から９５％まで変動する。加えて、分岐ＧｌｃＮＡｃを含有するフコシル化されていないオリゴ糖の増
大もまた、ＹＢ２／０由来抗体サンプルで観察された。さらに、ＹＢ２／０細胞由来の抗体サンプルは、フコシル化されずかつ分岐ＧｌｃＮＡｃを含有するオリゴ糖の存在により、増大された均質性および／若しくはより均質な構造いずれかを含有する。対照的に、他の細胞型で産生された抗体サンプルは、オリゴ糖のより不均質な構造を含有する傾向があり（図２Ａ〜Ｅ、構造１−３６）、より規定されかつ均質なオリゴ糖構造の存在による増大された活性を伴う治療抗体サンプルを産生するＹＢ２／０細胞の価値を示す。さらに、ＹＢ２／０細胞で産生された抗体サンプルは、ＨＥＫ若しくはＮＳ／０のような他の細胞株で産生された抗体サンプルに比較して、より低い比率の高マンノース含量を伴う構造を含有する傾向がある（図２Ｅ、構造３１−３６）。
【実施例６】
【００９９】
抗ＴＮＦα ＭａｂのＣ１０８３Ｂ／Ｃ発現
数種の骨髄腫宿主細胞株（Ｓｐ２／０、ＮＳ０およびＹＢ２／０）でのＣＮＴＯ ８６０発現レベルの検査は、これらの細胞株で産生される他の抗体に比較して比較的より低レベルの抗体産生を示した。従って、本発明のＹＢ２／０由来宿主細胞株での発現に代替抗体を選択した。Ｃ１０８３Ｂ ＹＢ２／０細胞およびＣ１０８３Ｃ ＹＢ２／０細胞を、記述される（Ｋｎｉｇｈｔら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３０：１４４３−１４５３、１９９３；第ＷＯ０２／０１２５０２号明細書）ところの電気穿孔法により、ＣＮＴＯ １４８と称されるヒト抗ＴＮＦα Ｍａｂ（Ｇｌｉｍｕｍａｂ）をコードする、Ｈ（これの可変領域は配列番号１０である）およびＬ鎖（これの可変領域は配列番号１１である）をコードするプラスミド（それぞれプラスミドｐ１７８３およびｐ１７７６）でトランスフェクトした。トランスフェクトしたＹＢ２／０由来細胞のミコフェノール酸耐性コロニーを、記述される（Ｋｎｉｇｈｔら、１９９３）ところのヒトＩｇＧについてのＥＬＩＳＡにより、それらの培養上清中のＣＮＴＯ １４８の存在についてアッセイした。トランスフェクタント（＃１４ Ｃ１０８３Ｂトランスフェクタントおよび＃１ Ｃ１０８３Ｃトランスフェクタント）を、ＩＭＤＭ、５％ＦＢＳ、１％グルタミン、１×ＭＨＸ選択（０．５μｇ／ｍｌミコフェノール酸、２．５μｇ／ｍｌヒポキサンチン、５０μｇ／ｍｌキサンチン）中で１リットルの容量までスケールアップし、細胞生存率が＜２０％になるまで培養物を過剰増殖させた。標準的プロテインＡクロマトグラフィーはＣＮＴＯ １４８の２サンプルを精製するために使用した。該精製は、Ｃ１０８３Ｂトランスフェクト細胞から１．３ｍｇのＣＮＴＯ １４８およびＣ１０８３Ｃトランスフェクト細胞から３．２ｍｇのＣＮＴＯ １４８を生じた。
【０１００】
Ｃ１０８３Ｂ−１４８−１４および別のクローンＣ１０８３Ｂ−１４８−３３をハロ（Ｈａｌｏ）サブクローニングにかけた。２１個のハロをクローン３３の第１回のハロ（Ｈａｌｏ）から採り、その１サブクローンＣ１０８３Ｂ−１４８−３３−１９が振とうフラスコ中で約８９μｇ／ｍＬを発現した。増殖および２回目のハロ（Ｈａｌｏ）に際して、サブクローンＣ１０８３Ｂ−１４８−３３−１９−４２が振とうフラスコ中で約１０５μｇ／ｍＬの力価を表した。このクローンはＡＰＦ培地に適応されている。
【０１０１】
ＹＢ２／０由来ＣＮＴＯ １４８の生物分析的特徴付け
ＰＮＧアーゼＦに遊離されるオリゴ糖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析（図１２Ａ〜Ｃ）は、ＹＢ２／）由来宿主細胞Ｃ１０８３ＢおよびＣ１０８３Ｂからのオリゴ糖の８０％以上がフコシル化されていなかったことを示した。予期しないことに、Ｃ１０８３Ｃ由来ＣＮＴＯ １４８のフコース含量は、Ｃ１０８３Ｂ由来ＣＮＴＯ １４８のものより低くないことが見出された（図１２ＢおよびＣ）。これらの抗体サンプルからのオリゴ糖は、増大された量のフコースを伴わない分岐ＧｌｃＮＡｃもまた含有し、ＮＳ／０宿主細胞で産生された抗体からのオリゴ糖よりもより均質であるようである（図１２Ａ）。
【０１０２】
ＹＢ２／０由来ＣＮＴＯ １４８を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイ。Ｋ２
若しくはＣ４８０Ａ細胞と称される標的細胞は、成熟サイトカインのアミノ酸１−１２の欠失の導入により膜貫通形態として留まる組換えヒトＴＮＦをその表面上で安定に発現するＳｐ２／０マウス骨髄腫細胞株である（Ｐｅｒｅｚら、１９９０ 上記）。Ｋ２細胞を、熱不活性化ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸および１×ＭＨＸ選択を含有するイスコフ培地中で培養した。Ｋ２細胞は２〜３日ごとに１：５で継代した。
【０１０３】
アッセイの日に、Ｋ２細胞を遠心分離しかつＰＢＳで１回洗浄した。細胞を培地で約１×１０６細胞／ｍｌに調節し、そして、１５マイクロリットルのＢＡＴＤＡ蛍光標識試薬（Ｄｅｌｆｉａ ＥｕＴＤＡ細胞傷害性試薬キット中、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ中）を５ｍｌの細胞に添加した（Ｂｌｏｍｂｅｒｇら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９３：１９９−２０６、１９９６）。細胞を３７℃で３０分間インキュベートし、その後ＰＢＳで１０００ｒｐｍで５分間２回洗浄した。ＰＢＭＣエフェクター細胞と混合する直前に標的細胞を遠心分離し、そして１％ＢＳＡを含有するイスコフ培地に２×１０５細胞／ｍｌで再懸濁した。
【０１０４】
ＰＢＭＣエフェクター細胞は、ヘパリン化ヴァキュテーナーに血液を収集しかつＰＢＳで２倍に希釈した後に健康ドナーから単離した。３０ｍｌの希釈血液を、５０ｍｌコニカルチューブ中で１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、スウェーデン・ウプサラ）の上に重ね、そして室温ＲＴで１５００ｒｐｍで３０分遠心分離した。ＰＢＭＣを含有する界面（バフィ層）を収集しかつＰＢＳで２回洗浄し、そして１２００ｒｐｍ、１０分間ＲＴで遠心分離した。細胞を、５％熱不活性化ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび０．１ｍＭ非必須アミノ酸を含有するイスコフ培地に再懸濁した。ＯＫＴ３（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ、Ｏｒｔｈｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）で４℃で一夜被覆しかつＰＢＳですすいだ１００ｍｍ組織培養皿上でインキュベートすることにより、ＰＢＭＣを３７℃、５％ＣＯ２でおよそ４時間活性化した。ＰＢＭＣを収集し、１％ＢＳＡを含有するイスコフ培地で１回洗浄し、計数しかつおよそ１×１０７細胞／ｍｌに再懸濁した。
【０１０５】
ＣＮＴＯ １４８試験サンプルをイスコフ、１％ＢＳＡ培地で連続希釈した。５０マイクロリットルの標的細胞（約１０，０００）および１００マイクロリットルの抗体を丸底９６ウェルプレートに添加した。５０マイクロリットルのエフェクター細胞（約５００，０００細胞）を混合物に添加し、そしてプレートを１０００ｒｐｍ、５分間、ＲＴで遠心分離した。エフェクター細胞対標的細胞比（Ｅ：Ｔ）は５０：１であった。バックグラウンド蛍光を測定するため、ウェルを、抗体を含まない、培地中のエフェクター細胞および標的細胞の混合物とインキュベートした。最大蛍光を確立するため、１０マイクロリットルの溶解溶液（Ｄｅｌｆｉａ ＥｕＴＤＡ細胞傷害性キットから）をバックグラウンドウェルに添加した。ＡＤＣＣアッセイのため、細胞を３７℃、５％ＣＯ２でおよそ２時間インキュベートした。２０マイクロリットルの上清を９６ウェル平底プレートに移した。２００マイクロリットルのユーロピウム溶液（Ｄｅｌｆｉａ ＥｕＴＤＡ細胞傷害性キット）を添加し、そしてプレートをプレート振とう器上にＲＴで１０分間置いた。時間分解蛍光計ＥｎＶｉｓｉｏｎ装置（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で蛍光を測定した。各サンプル中の特異的溶解の比率を、以下の式すなわち％特異的遊離＝（［実験遊離−自発遊離］÷［最大遊離−自発遊離］）×１００に従って計算した。
【０１０６】
ＡＤＣＣアッセイの結果は、Ｃ１０８３Ｂ由来ＣＮＴＯ １４８が参照物質すなわちマウス骨髄腫細胞からのＣＮＴＯ １４８よりおよそ７０倍より強力であったことを示した（図１３）。Ｃ１０８３Ｃ由来ＣＮＴＯ １４８は、それらが非常に類似のフコースレベルを有したことを示した生物分析データと一致して、Ｃ１０８３Ｂ由来ＣＮＴＯ １４８と実質的に同一の効力を示した。フコースレベルの予期されない類似性の結果として、こ
れらのＡｂロットは、超低レベルのフコース（１０〜２０％）が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＮＴＯ ８６０（およびｉｎ ｖｉｖｏで２Ｃ１１）で観察されたところの中程度のレベルのフコース（４０〜５０％）を有することに比較してＡＤＣＣ活性のさらなる増強に変わったかどうかを試験するための手段を提供しなかった。にもかかわらず、これらの結果は、代替宿主細胞で発現された同一Ａｂに関して顕著に高められたＡＤＣＣ活性を示す、Ｃ１０８３Ｂ若しくはＣ１０８３Ｃいずれかで発現されたＡｂの別の例を提供する。
【実施例７】
【０１０７】
ＨＥＫ ２９３Ｅ細胞、Ｃ１０８３Ａ細胞およびＣ１０８３Ｃ細胞で発現された抗ＣＤ３Ａｂのｉｎ ｖｉｖｏアゴニスト活性
抗ＣＤ３モノクローナルＡｂによるＴ細胞活性化が、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）を結合するそれらのＡｂの能力に依存することを示す以前の報告に基づき、単純なモデル系を使用して、マウスが、そのＦｃグリカン中の異なるレベルのフコースを伴うヒトＩｇＧ１ Ａｂに対する異なる程度のＦｃ依存性応答を示すかどうかを試験した。組換えハムスター抗マウスＣＤ３ ε鎖Ａｂ、１４５−２Ｃ１１（２Ｃ１１）をこれらの研究に使用した。一本鎖Ｆｃバージョン２Ｃ１１をコードするプラスミドはＪｅｆｆｒｅｙ Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ博士（カリフォルニア大学サンフランシスコ校）により恵与された。このプラスミド中のＨおよびＬ鎖可変（Ｖ）領域コーディング配列を事前にＰＣＲ増幅し、そして該増幅されたＤＮＡフラグメントを最初にゲノムＨおよびＬ鎖Ｖ領域ベクターに、ならびにその後それぞれマウスＩｇＧ２ａおよびκ鎖のゲノム定常領域発現ベクターにクローン化した。
【０１０８】
２Ｃ１１のヒトＩｇＧ１バリアントを製造するため、Ｈ鎖可変領域をコードするＤＮＡは、以前に製造したプラスミドの１種ｐ２２１３から増幅し、そしてヒトＧ１定常領域コーディング配列を含有する２種の異なる発現ベクターにクローン化した。これは、Ａｂ遺伝子転写がＣＭＶプロモーターにより駆動された発現プラスミドｐ２６４８、および転写がマウス免疫グロブリンプロモーターにより駆動されたｐ２６９４の生成をもたらした。２Ｃ１１ Ｌ鎖可変領域はプラスミドｐ２２０８から増幅し、そしてＣＭＶプロモーター若しくは免疫グロブリンプロモーターいずれかにより駆動されるヒトκ定常領域を含有する発現ベクターにクローン化した。これは、Ａｂ遺伝子転写がＣＭＶプロモーターにより駆動された発現プラスミドｐ２６２３、および転写が免疫グロブリンプロモーターにより駆動されたｐ２６６９の生成をもたらした。ＣＭＶプロモーター含有プラスミドをＨＥＫ
２９３Ｅ細胞で一過性に発現させた。およそ３．５×１０８細胞を、１０層の細胞スタック（ｃｅｌｌ ｓｔａｃｋ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中、増殖培地（１０％ＦＢＳ中を含むＤＭＥＭ）中で５％ＣＯ２中３７℃で一夜増殖させた。４０ｍｌのＯｐｔｉｍｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）中で１．４ｍｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を各３００μｇのプラスミドｐ２６４８若しくはｐ２６２２およびｐ２６２３と混合することにより調製したトランスフェクションカクテルを細胞スタックに添加し、そして３７℃で一夜インキュベートした。翌日、トランスフェクションカクテルを含む培地を１リットルの２９３ ＳＦＭＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）＋４ｍＭ酪酸ナトリウムで置換し、そして細胞を３７℃で４日間インキュベートした。発現された抗体を含有する上清を収集し、遠心分離および０．８ミクロン濾過により澄明にした。発現された抗体は標準的プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【０１０９】
免疫グロブリンプロモーター含有プラスミドを、安定なトランスフェクションを介してＣ１０８３ＡおよびＣ１０８３Ｃ ＹＢ２／０細胞に導入した。およそ２×１０７のＹＢ２／０細胞を、電気穿孔法により各１０μｇのプラスミドｐ２６９４およびｐ２６６９でトランスフェクトし、そして、１０％ＦＢＳ、ＮＥＡＡ、Ｌ−グルタミンおよびピルビン酸ナトリウムを補充したαＭＥＭを含有する増殖培地中、９６ウェル細胞培養皿にプレーティングした。ミコフェノール酸を用いてプラスミドの安定な組込みについて細胞を選択
した。抗体を分泌するミコフェノール酸耐性のクローンを抗ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。高発現の安定なクローンを、５％ＦＢＳを含有する培地中でスケールアップした。発現された抗体は標準的プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【０１１０】
Ｃ１０８３Ａ ＹＢ２／０細胞中で発現された、製造された２Ｃ１１ ｈｕＧ１ Ａｂを、上の実施例５および６に記述されたところのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにかけた（図１４）。この分析は、該細胞株が、血清の存在下で培養されたとは言え、支配的な種がフコシル化されていない（図２中のような構造２）グリコシル化生成物Ａｂを産生することを継続したことを示した。２Ｃ１１調製物を、ＦｃγＲ結合能力を欠いた対照Ａｂを製造するために酵素で脱グリコシル化した。該脱グリコシル化は、Ａｂを１０００単位のＰＮＧアーゼＦで３７℃で２４時間処理することにより行った（緩衝液１．０ｍＬ中約１０ｍｇのＡｂ）。酵素の別のアリコートを添加し、そしてインキュベーションを追加の２４時間継続した。脱グリコシル化されたＩｇＧサンプルをＨｉＴｒａｐプロテインＡカラムを使用して精製し、そしてリン酸緩衝生理的食塩水、ｐＨ７．０に処方した。２Ｃ１１ Ｇｎｏと命名された生じる糖形態は、徹底的に脱グリコシル化されていたことがＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより示された（示されない）。
【０１１１】
各Ａｂサンプルの濃度を、分光光度法によりＯＤ２８０を測定すること、ならびにＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの染色により測定した。汚染するエンドトキシンレベルを測定するために全試験ＡｂでＬＡＬアッセイを実施した。上述されたとおり実施したＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳおよびＨＰＬＣ分析は、ＨＥＫ ２９３Ｅ由来Ａｂ（２Ｃ１１ ｈｕＧ１、ＨＥＫ）、Ｃ１０８３Ａ由来Ａｂ（２Ｃ１１ ｈｕＧ１、Ｃ１０８３Ａ）およびＣ１０８３Ｃ由来Ａｂ（２Ｃ１１ ｈｕＧ１、Ｃ１０８３Ｃ）中のＦｃグリカンがそれぞれおよそ９５％、４０％および１５％フコシル化されていたことを示した。新たに単離したマウス脾細胞上のＣＤ３に対する定量的結合分析は、該３種の異なるＡｂ調製物の抗原アフィニティーの検出可能な差違を示さなかった（データは示されない）。
【０１１２】
該３種のＡｂがそれらのｉｎ ｖｉｖｏ Ｔ細胞活性化特性に関して相互にどのように匹敵したかを評価するため、正常雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に変動する量の試験Ａｂの単一腹腔内注入を投与した。試験Ａｂ注入のおよそ２４時間後に全マウスをＣ０２窒息により安楽死させ、心穿刺を介して終末血サンプルを収集し、そして脾を収集しかつ冷収集培地（ＲＰＭＩ １６４０、５％熱不活性化ウシ胎児血清、１％Ｌ−グルタミン）を含有するチューブに入れた。１００μｍナイロンメッシュ篩を通して脾を穏やかに押すこと、およびＲＰＭＩ−１６４０培地で１回洗浄することにより、脾細胞の単細胞懸濁液を調製した。該単細胞懸濁液をその後、製造元の説明書（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に従ってＮＨ４Ｃｌ低張溶解溶液を使用して無核化（ａｎｕｃｌｅａｔｅｄ）赤血球を枯渇させた。脾細胞を２回洗浄し、そして０．２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ、０．５％ＢＳＡに再懸濁した。ＣＤ４ ＰＥ＋／ＣＤ２５ ＡＰＣ＋／ＣＤ８および７−ＡＡＤ生存率色素を使用して脾細胞を免疫染色しかつフローサイトメトリーにより分析した。全染色は、Ｆｃ受容体結合により媒介される染色を遮断するために抗ＣＤ１６／ＣＤ３２ ｍＡｂ、２．４Ｇ２の存在下で行った。
【０１１３】
該結果は、高フコースバリアントに比較して中程度フコースバリアントを投与したマウスでのより大きなＴ細胞活性化を示し、高フコースバリアントは同一程度のＴ細胞活性化を達成するためにおよそ４倍より多いＡｂを投与することを必要とした（図１５）。しかしながら、低フコースバリアントは中程度フコースバリアントより活性でなく、フコースの完全な非存在が、マウスで低フコースバリアントの最大に高められたＦｃ機能を達成するために必要でないことを示唆した。ヒト低アフィニティーＦｃγＲの１種、ＦｃγＲＩＩＩＡがＦｃフコースレベルに感受性であることを考えれば、これらの知見は、マウスが
以前に考えられたよりもヒト細胞によるＦｃ依存性応答をより緊密に模倣しうることを示唆する。
【０１１４】
本明細書で挙げられる全部の刊行物および特許は、例えば現在記述される発明に関して使用されうる、該刊行物で記述される構築物および方法論を記述かつ開示する目的上、引用することにより本明細書に組み込まれる。上でおよび本文を通じて論考される刊行物は、単に本出願の出願日前のそれらの開示のため提供される。本明細書の何物も、本発明が以前の発明によってこうした開示を見越す権利を与えられないことの承認として解釈されるべきでない。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】典型的なＩｇＧサブクラスの哺乳動物抗体、ドメインおよびグリコシル化点を描く図である。
【図２Ａ−２Ｅ】天然の若しくは哺乳動物細胞由来の組換え抗体と関連する支配的な二分岐オリゴ糖構造を示す。すなわち、略記される糖構造 Ｆｕｃ＝フコース；Ｇａｌ＝ガラクトース；Ｇｌｃ＝グルコース；ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミン；Ｍａｎ＝マンノース；およびＮＡＮＡ*＝シアリル（Ｎ−アセチルノイラミン酸）が同定される。
【図３Ａ−３Ｂ】無血清および血清含有培地中で培養したＡＰＦ−ＹＢ２／０（Ｃ１０８３Ｂ）細胞株の複数世代にわたる増殖および生存率の比較を示す。Ｃ１０８３Ｂを、ＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳ、および６ｍＭグルタミンを補充したＣＤ−Ｈｙｂ培地中で培養した。細胞は２〜３×１０５細胞／ｍｌの播種密度を使用して週あたり３回継代した。すなわち（Ａ）増殖曲線および（Ｂ）生存率。
【図４】Ｃ１０８３Ｂ由来の４種のＡＰＦ−ＹＢ２／０細胞株の相対増殖特性を示す。ＣＤ−Ｈｙｂに適応させたクローンを２方法すなわち離脱（Ｃ１０８３Ｂ−１およびＣ１０８３Ｂ−１２）ならびに直接選択（Ｃ１０８３−Ｈ１８およびＣ１０８３−Ｈ２１）により単離した。細胞を、６ｍＭグルタミンを補充したＣＤ−Ｈｙｂ中で培養した。細胞は２〜３×１０５細胞／ｍｌの播種密度を使用して週あたり３回継代した。
【図５】５日後のＣ１０８３Ｂに対するＬＣＡレクチンの毒性を示すグラフである。
【図６Ａ−６Ｂ】（Ａ）プローブおよびプライマー組の位置を伴うラットｆｕｔ８ ｍＲＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ（ＮＭ＿００１００２２８９）のヌクレオチド配列、ならびに印を付けた（「Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ」ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して設計したプライマー（下線を付ける）およびプローブ（斜体にする））Ｃ１０８３Ｂのバリアントでのｆｕｔ８ ｍＲＮＡの発現、ならびに（Ｂ）Ｃ１０８３Ｂ由来の８種のレクチン耐性細胞株のＱＰＣＲ分析。各細胞株はＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳ中で培養し、そして１×１０７細胞を指数増殖期に収集した。各クローンのｆｕｔ８ ｍＲＮＡのレベルをＱＰＣＲにより分析した。を示す。
【図７Ａ−７Ｂ】Ｃ１０８３Ｂ由来のフコース枯渇クローンの（Ａ）生存可能細胞密度および（Ｂ）生存率のグラフを表す。細胞株は６ｍＭグルタミンを補充したＣＤ−Ｈｙｂ培地中で培養した。
【図８Ａ−８Ｂ】細胞株生成に使用したＣＮＴＯ ８６０発現ベクターの図解である。すなわち（Ａ）ｐ２４０１はＨ鎖発現ベクターであり、および（Ｂ）ｐ２４０２はＬ鎖発現ベクターである。
【図９Ａ−９Ｂ】Ｃ１０８３Ｂから工作した、抗組織因子抗体ＣＮＴＯ ８６０を発現する細胞株Ｃ１２６１Ａの時間にわたる安定性を示すグラフである。継代１１の細胞を振とうフラスコ培養物中、ＣＤ−Ｈｙｂ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で２検体で（２×１０５／ｍｌで）播種した。増殖および抗体力価を１×Ｌｉｐｉｄ（Ｇｉｂｃｏ）の非存在および存在下でモニターした。
【図１０Ａ−１０Ｂ】（Ａ）マウス骨髄腫株Ｃ４６３およびラットＹＢ２／０宿主細胞株Ｃ１０８３Ｂで生成されるＣＮＴＯ ８５９およびＣＮＴＯ ８６０により導き出される用量依存性の抗体特異的細胞溶解を示す棒グラフ。（Ｂ）Ｃ１０８３Ｂおよびｆｕｔ８枯渇ＹＢ２／０細胞株Ｃ１０８３Ｃ（Ａ４−３）と比較したＣ４６３からのＣＮＴＯ ８６０の間のＡＤＣＣの差違を示す棒グラフ。である。
【図１１Ａ−１１Ｃ】多様な細胞株により産生されるＣＮＴＯ８６０のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析からのレコーダ出力波形を示し；（Ａ）Ｃ４６３すなわちＡＰＦに適応させたラット骨髄腫ＹＢ２／０宿主細胞株、（Ｂ）Ｃ１０８３Ｂ、および（Ｃ）ｆｕｔ８欠乏ＹＢ２／０宿主細胞株Ｃ１０８３Ｃ。
【図１２Ａ−１２Ｃ】多様な細胞株により産生されるＣＮＴＯ１４８のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析からのレコーダ出力波形を示し；（Ａ）Ｃ４６３すなわちＡＰＦに適応させたラット骨髄腫ＹＢ２／０宿主細胞株、（Ｂ）Ｃ１０８３Ｂ、および（Ｃ）ｆｕｔ８欠乏ＹＢ２／０宿主細胞株Ｃ１０８３Ｃ。
【図１３】多様な宿主細胞で発現された数バッチの抗ＴＮＦα Ｍａｂ、ＣＮＴＯ １４８の濃度依存性および（標的細胞特異的溶解により測定されるところの）相対ＡＤＣＣ活性を示すグラフである。
【図１４】ＹＢ２／０宿主細胞株Ｃ１０８３Ａにより産生される２Ｃ１１ 抗ＣＤ３ ＭａｂのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析からのレコーダ出力波形を示す。
【図１５】示されるところの多様な抗体調製物を投与したマウスから収集した脾細胞上の脾細胞マーカーにより測定されるところのＴ細胞活性化を示すグラフである。
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体の製造に有用なラット骨髄腫細胞株ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ １６６２）由来の単離された細胞株であって、ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ １６６２）を使用して製造されるポリペプチドに比較して有意に低下されたフコース含量を有することを特徴とするグリコシル化ポリペプチドを産生する、上記細胞株。
【請求項２】
細胞株が、動物タンパク質を含まない培地、ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（ＣＤ−Ｈｙｂ）中で増殖するようにラットハイブリドーマ細胞株ＹＢ２／０（Ｃ１０８３Ａ）を適応させることにより該細胞株から発生され、そしてＣ１０８３Ｂと称される、請求項１に記載の細胞株。
【請求項３】
細胞株が、高トランスフェクション効率、短い平均倍加時間、およびＣＤ−Ｈｙｂ中で高細胞密度に達する能力の最低１つに基づき選択されるＣ１０８３Ｂのサブクローンであり、かつ、該細胞株がＣ１０８３Ｅと称される、請求項１に記載の細胞株。
【請求項４】
ｆｕｔ８ ｍＲＮＡレベルが野生型ＹＢ２／０細胞株のレベルより低い、請求項１に記載の細胞株。
【請求項５】
細胞株がレクチンに対する耐性について選択される、請求項１に記載の細胞株。
【請求項６】
細胞株のグリコシル化ペプチドが、野生型骨髄腫細胞株およびＣＨＯ細胞株により産生されるペプチドに比較して実質的に低下されたフコース含量を有する、請求項２に記載の細胞株。
【請求項７】
分子が、優先的にフコシル化されないＮ結合オリゴ糖基を有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載のトランスフェクトした宿主細胞株により産生される抗体。
【請求項８】
抗体が、野生型ＹＢ２／０細胞株で産生された抗組織因子抗体に比較して増大されたＡＤＣＣ活性を有する、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
製薬学的に許容できる担体と組合さった請求項７に記載の抗体を含んでなる生物製薬学的組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の細胞株に、抗体をコードするポリヌクレオチド配列をトランスフェクトすること；および
該抗体を検出可能若しくは回収可能な量で発現すること
を含んでなる、抗体の製造方法。
【請求項１１】
ポリヌクレオチド配列によりコードされる抗体がヒト抗体である、請求項１０に記載の抗体の製造方法。
【請求項１２】
ポリヌクレオチド配列によりコードされる抗体がヒト化抗体である、請求項１０に記載の抗体の製造方法。
【請求項１３】
ポリヌクレオチド配列によりコードされる抗体が、細胞の表面に結合されうるヒトポリペプチドの一領域に結合する、請求項１１若しくは１２に記載の抗体の製造方法。
【請求項１４】
ポリヌクレオチド配列によりコードされる回収された抗体が、優先的にフコシル化されないＮ結合オリゴ糖基を有することを特徴とする、請求項１０に記載の方法により製造さ
れた抗体。
【請求項１５】
配列番号９のＬ鎖アミノ酸配列および配列番号８のＨ鎖アミノ酸配列を含んでなる、請求項１０に記載の方法により製造された抗体。
【請求項１６】
配列番号１１のＬ鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号１０のＨ鎖可変領域アミノ酸配列を含んでなる、請求項１０に記載の方法により製造された抗体。
【請求項１７】
被験体、細胞若しくは組織に、請求項１４〜１６のいずれかに記載の抗体を投与もしくはそれらと接触させることを含んでなる、疾患若しくは状態の処置方法。
【請求項１８】
疾患若しくは状態が、該抗体が結合することが可能であるポリペプチドを表示する細胞の破壊が望ましい腫瘍性疾患若しくは免疫媒介性障害である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
抗体が結合することが可能であるポリペプチドが、ヒト組織因子若しくはヒトＴＮＦαである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
疾患若しくは状態が、関節リウマチ、黄斑変性、乾癬および糖尿病性網膜症よりなる群から選択される異常な血管新生を特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
疾患若しくは状態が、前記細胞からの前記ポリペプチドの遊離を特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
本明細書に開示されるいずれかの発明。
【請求項１】
抗体の製造に有用なラット骨髄腫細胞株ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ １６６２）由来の単離された細胞株であって、ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ １６６２）を使用して製造されるポリペプチドに比較して有意に低下されたフコース含量を有することを特徴とするグリコシル化ポリペプチドを産生する、上記細胞株。
【請求項２】
細胞株が、動物タンパク質を含まない培地、ＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（ＣＤ−Ｈｙｂ）中で増殖するようにラットハイブリドーマ細胞株ＹＢ２／０（Ｃ１０８３Ａ）を適応させることにより該細胞株から発生され、そしてＣ１０８３Ｂと称される、請求項１に記載の細胞株。
【請求項３】
細胞株が、高トランスフェクション効率、短い平均倍加時間、およびＣＤ−Ｈｙｂ中で高細胞密度に達する能力の最低１つに基づき選択されるＣ１０８３Ｂのサブクローンであり、かつ、該細胞株がＣ１０８３Ｅと称される、請求項１に記載の細胞株。
【請求項４】
ｆｕｔ８ ｍＲＮＡレベルが野生型ＹＢ２／０細胞株のレベルより低い、請求項１に記載の細胞株。
【請求項５】
細胞株がレクチンに対する耐性について選択される、請求項１に記載の細胞株。
【請求項６】
細胞株のグリコシル化ペプチドが、野生型骨髄腫細胞株およびＣＨＯ細胞株により産生されるペプチドに比較して実質的に低下されたフコース含量を有する、請求項２に記載の細胞株。
【請求項７】
分子が、優先的にフコシル化されないＮ結合オリゴ糖基を有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載のトランスフェクトした宿主細胞株により産生される抗体。
【請求項８】
抗体が、野生型ＹＢ２／０細胞株で産生された抗組織因子抗体に比較して増大されたＡＤＣＣ活性を有する、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
製薬学的に許容できる担体と組合さった請求項７に記載の抗体を含んでなる生物製薬学的組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の細胞株に、抗体をコードするポリヌクレオチド配列をトランスフェクトすること；および
該抗体を検出可能若しくは回収可能な量で発現すること
を含んでなる、抗体の製造方法。
【請求項１１】
ポリヌクレオチド配列によりコードされる抗体がヒト抗体である、請求項１０に記載の抗体の製造方法。
【請求項１２】
ポリヌクレオチド配列によりコードされる抗体がヒト化抗体である、請求項１０に記載の抗体の製造方法。
【請求項１３】
ポリヌクレオチド配列によりコードされる抗体が、細胞の表面に結合されうるヒトポリペプチドの一領域に結合する、請求項１１若しくは１２に記載の抗体の製造方法。
【請求項１４】
ポリヌクレオチド配列によりコードされる回収された抗体が、優先的にフコシル化されないＮ結合オリゴ糖基を有することを特徴とする、請求項１０に記載の方法により製造さ
れた抗体。
【請求項１５】
配列番号９のＬ鎖アミノ酸配列および配列番号８のＨ鎖アミノ酸配列を含んでなる、請求項１０に記載の方法により製造された抗体。
【請求項１６】
配列番号１１のＬ鎖可変領域アミノ酸配列および配列番号１０のＨ鎖可変領域アミノ酸配列を含んでなる、請求項１０に記載の方法により製造された抗体。
【請求項１７】
被験体、細胞若しくは組織に、請求項１４〜１６のいずれかに記載の抗体を投与もしくはそれらと接触させることを含んでなる、疾患若しくは状態の処置方法。
【請求項１８】
疾患若しくは状態が、該抗体が結合することが可能であるポリペプチドを表示する細胞の破壊が望ましい腫瘍性疾患若しくは免疫媒介性障害である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
抗体が結合することが可能であるポリペプチドが、ヒト組織因子若しくはヒトＴＮＦαである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
疾患若しくは状態が、関節リウマチ、黄斑変性、乾癬および糖尿病性網膜症よりなる群から選択される異常な血管新生を特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
疾患若しくは状態が、前記細胞からの前記ポリペプチドの遊離を特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
本明細書に開示されるいずれかの発明。
【図４】
【図５】
【図１５】
【図１】
【図３Ａ−３Ｂ】
【図６Ａ−６Ｂ】
【図７Ａ−７Ｂ】
【図８Ａ−８Ｂ】
【図９Ａ−９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１３】
【図１４】
【図５】
【図１５】
【図１】
【図３Ａ−３Ｂ】
【図６Ａ−６Ｂ】
【図７Ａ−７Ｂ】
【図８Ａ−８Ｂ】
【図９Ａ−９Ｂ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２００９−５０８４７６（Ｐ２００９−５０８４７６Ａ）
【公表日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２９３５０（Ｐ２００８−５２９３５０）
【出願日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３４３８２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０２８１０６
【国際公開日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【出願人】（５０３０５４１２２）セントカー・インコーポレーテツド (74)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３４３８２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０２８１０６
【国際公開日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【出願人】（５０３０５４１２２）セントカー・インコーポレーテツド (74)
【Ｆターム（参考）】
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