高純度のＤ−乳酸を生成する微細藻と、これを用いたＤ−乳酸製造方法及び装置
【課題】 更なる精製を行なうことなしに、農薬や医薬品の原料にできる極めて光学的純度の高いＤ−乳酸を提供すること。
【解決手段】 細胞内澱粉から光学純度の高いＤ−乳酸を産生するナンノクロリス属に属する微細藻ナンノクロリス sp.26A4。
【解決手段】 細胞内澱粉から光学純度の高いＤ−乳酸を産生するナンノクロリス属に属する微細藻ナンノクロリス sp.26A4。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、農薬や医薬原料に適した光学純度の極めて高いＤ−乳酸の製造に関する。
【０００２】
【従来の技術】乳酸は、光学異性体を持ち、Ｄ体とＬ体が存在する。従来の乳酸製造は、乳酸菌と総称される微生物を用いた発酵を利用し、蔗糖、ブドウ糖、澱粉等のバイオマスを原料として行われる。このとき、使用する微生物種を選択することにより、Ｄ体、Ｌ体、又はラセミ体の乳酸を、ある程度の純度で選択的に得ることが可能である。
【０００３】Ｄ−乳酸だけを特異的に製造するためには、例えば、ブドウ糖を原料とし、Sporolactobacillus sp. 等により乳酸発酵を行なう方法が知られている。これにより得られるＤ−乳酸の光学純度は９７％程度である。残りの３％程度は、Ｌ−乳酸が不純物として存在する。
【０００４】このようなＤ−乳酸から、更に高純度のＤ−乳酸を得るためには、Ｌ−乳酸酸化酵素を作用させてＬ−乳酸を除去する方法や、乳酸にマグネシウムを加えて乳酸マグネシウムの沈澱を生じた後で、ブタノールによりＤ−乳酸を抽出する方法等が報告されている。しかし、これらの精製方法は、用いる酵素がバルクレベルで市販されていないため入手するには高価であったり、ブタノール抽出時にＤ−乳酸以外の乳酸等が混入し易い等の理由から実現性に乏しい。一方、光学異性体を分離精製する手法としては、光学分割カラムによる方法が報告されている。しかしながら、光学異性体分割用担体が非常に高価であるために、光学分割カラムを用いた精製を工場化することは困難である。このような理由から、市販されているＤ−乳酸の光学異性体純度は、最大でも約９７％であるのが実情である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】以上の状況に鑑み、本発明は、更なる精製を行なうことなしに、農薬や医薬品の原料にできる極めて光学的純度の高いＤ−乳酸を提供することを目的とする。具体的には、光学的に純度の高いＤ−乳酸を産生することが可能な微細藻、これを用いたＤ−乳酸産生方法及び製造装置を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】これまでに、本発明者らは、澱粉を含有する微細藻が暗嫌気条件において発酵生産物として乳酸を産生することを見出し、その製造プロセスについて別途出願している（特願平７−３１４１１９）。今回、乳酸を生産するこれらの微細藻を対象に、Ｄ−乳酸の生産性に関する鋭意探索を行なった。その結果、澱粉を多く含有し、且つ細胞内澱粉を暗嫌気条件で光学純度の非常に高いＤ−乳酸に変換できる微細藻を、長崎県崎戸町の海水より分離することに成功した。本発明は、このような発見の基に到達するに至った。
【０００７】発明者らは、下記の手段により上記課題を解決し、目的を達成することを見出した。即ち、（１） 細胞内澱粉から光学純度の高いＤ−乳酸を産生するナンノクロリス属に属する微細藻ナンノクロリス sp.26A4；
（２） （１）に記載の微細藻を培養した後で回収し、嫌気性雰囲気に保つことにより微細藻細胞内澱粉をＤ−乳酸に変換するＤ−乳酸を製造する方法；
（３） （１）に記載の微細藻を用いてＤ−乳酸を製造するための装置であって、微細藻を光合成独立栄養的に培養するための微細藻培養部と、培養して増殖した微細藻の濃縮スラリーを形成するための微細藻濃縮部と、得られた濃縮スラリーを嫌気性且つ暗い雰囲気に保つことにより発酵させ、前記微細藻内の澱粉をＤ−乳酸に変換する保持部と、得られたＤ−乳酸を分離濃縮するための乳酸分離濃縮部と、分離濃縮されたＤ−乳酸を安定に保存するための保存部と、を具備するＤ−乳酸製造装置；である。
【０００８】
【発明の実施の形態】１．微細藻本発明の微細藻株は、高純度のＤ−乳酸を生成する微細藻であり、具体的にはナンノクロリス属に属する新株ナンノクロリス sp. 26A4(Nannnochloris sp.26A4)株である。本株は、海洋性微細藻（Nannochloris sp.26A4）株として三菱重工基盤研究所内にて保存される。ここで「高純度」の語は、光学的に高い純度をいい、不純物としてのＬ−乳酸を３％未満、好ましくは０．１％以下しか含まないＤ−乳酸を示す。
【０００９】ナンノクロリス sp.26A4 株を海水から分離する方法を以下に説明する。
【００１０】入手した長崎県崎戸町の海水（約100mL）を３００ｍＬの三角フラスコに入れ、表１に示す組成になるように栄養塩等を添加し、蛍光灯を１５００Ｌｕｘ、２５℃で連続照射しながら緩やかに振盪した。
【００１１】
【表１】
【００１２】約３週間後には、微細藻と考えられる緑色の微生物の存在が肉眼で認められる状態となった。この集積培養を行なった培養液（即ち、細胞の懸濁液）を海水で１００倍に希釈し、その０．５ｍｌを後述する寒天培地に滴下して寒天表面に塗布した。寒天培地は、表１に示す組成の培地に精製寒天を１．５重量％加え、オートクレーブにより滅菌後、シャーレに添加し、放冷固化したものである。塗布した寒天培地入りシャーレを蛍光灯下、１５００Lux、２５℃において、静置した結果、約３週間後に培地表面に緑色のコロニーが１５個出現した。個々のコロニーを表１に示す各組成の培地に移植し、培養増殖した後に、各細胞のＤ−乳酸生成能力を調べた。Ｄ−乳酸の生成能力は、生成した乳酸をガスクロマトグラフィーにより濃度を求め、更に、光学純度を光学異性体分離カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)にて確認した。
【００１３】試験に用いた微細藻の中で、最も優れたＤ−乳酸産生能を有する微細藻は、下記の表２に示す光合成色素成分、及び形態学的特徴を有していた。
【００１４】
【表２】
【００１５】以上の特徴から、本微細藻をナンノクロリス属と同定し、得られた藻株をナンノクロリス sp. 26A4(Nannnochloris sp.26A4)株と命名した。
【００１６】以下に示す本発明のＤ−乳酸生産方法において、使用可能な微細藻は、上記ナンノクロリス sp.26A4 株の他に、テトラセルミス sp.(Tetraselmis sp.)に属するＣＣＡＰ登録番号６６／３株を使用することも可能であるが、Ｄ−乳酸生産力がより高いことから、ナンノクロリス sp.26A4 株が特に好ましい。
【００１７】本藻株を使用したＤ−乳酸製造は、基本的には、本発明者らによる乳酸製造方法（特願平７−３１４１１９）で示したプロセスを用いて実施することができるが、好ましくは、以下のような改変法を用いる。
【００１８】２．Ｄ−乳酸の製造方法以下、改変法を図１を用いて説明する。図１において、微細藻培養工程１は、本願のＤ−乳酸生産微細藻を光合成独立栄養的に培養する工程である。また、この工程は、水深１０から３０ｃｍ程度の上面が開放された流水路型の培養槽等を用て行なうことができる。この工程において、本微細藻は、基本的には、海水から窒素及びリン等の無機栄養素を供給し、且つ太陽光を照射することにより培養することができる。ここで使用される海水は、濾過等により、海水中の微細藻の捕食生物等の異物を除去した後で、培養槽に供給される。
【００１９】次に、培養液中の微細藻の濃度が、培養液１リットル当たり０．１から１．０ｇ（乾燥固形分）程度になった時点で培養を止め、微細藻濃縮工程２において濃縮を行なう。微細藻濃縮工程２において、沈澱性の高い微細藻の場合には、一旦自然沈澱により固形分１から５ｗ／ｖ％（１リットル当たり１０から５０ｇ）前後に濃縮した後、遠心分離又はベルトフィルタ等によって更に固形分１０から２０Ｗ／Ｖ％に濃縮する。ここで、本工程における濃縮は、後段でのＤ−乳酸濃縮を有利にするために、即ち、スラリーとしての取り扱いを容易にし、且つ後段での乾燥攪拌を可能にし、更にＤ−乳酸濃度を高くするために、流動性を有する範囲内で可能な限り固形分に濃縮することが好ましい。
【００２０】このようにして得られた微細藻のスラリーを、暗く且つ嫌気性雰囲気に保持できる保持工程３に導き、Ｄ−乳酸の生産を行う。保持工程３は、スラリーポンプ或いは攪拌機等の緩速攪拌手段を備えたｐＨモニター付き半密閉型容器からなる装置内で行なうことが可能である。ここで、「暗い雰囲気」とは、光合成が行われない程度に光を遮断した状態をいう。即ち、外部からの微細藻スラリー表面への入射光を９０％以上、好ましくは９９．９％以上カットして得られる環境状況をいう。この保持工程３にスラリーを導入し、緩くかき混ぜながら暗く且つ嫌気性雰囲気に保持することにより、微細藻自身が行なう細胞内澱粉の発酵作用によってＤ−乳酸が産生される。この間、必要に応じ、ＮａＯＨ等のアルカリ溶液とＨＣｌ等の酸溶液を用いて、スラリーのｐＨを中性付近に維持することも可能である。或いは、ＣａＣＯ３を添加することにより、ｐＨを中性付近、好ましくは６．５〜８．０に維持してもよい。但し、生成する乳酸の濃度によってはｐＨの低下は抑制されるため、ｐＨの制御は必須ではない。保持工程３における微細藻の滞留時間は、微細藻の種類、保持条件等により異なるが、１０〜７０時間の範囲が一般的である。
【００２１】スラリー中のＤ−乳酸濃度が３０〜１００ｇ／リットル程度になった時点で、Ｄ−乳酸分離濃縮工程４に速やかに導き、Ｄ−乳酸の分離濃縮を行なう。このＤ−乳酸濃縮分離工程では、Ｄ−乳酸を含む発酵液中に微量に存在する乳酸酸化酵素等と、得られたＤ−乳酸との接触を避けることにより、生成した光学的純度の高いＤ−乳酸が劣化するのを防ぎながら、Ｄ−乳酸を濃縮する。
【００２２】このＤ−乳酸分離濃縮工程４では、工程３で得られたＤ−乳酸を含む微細藻スラリーにカルシウム等を添加して乳酸塩として沈澱させた後に、硫酸による脱水を行ない回収することにより、或いは、プロパン等の溶媒を用いた超臨界抽出法等を用いることにより、所望の濃度のＤ−乳酸に濃縮することができる。このようにして得られたＤ−乳酸は、Ｄ−乳酸保存工程５に保持される。Ｄ−乳酸保持工程５ではＤ−乳酸を冷暗所に保存することで、高い光学純度を保持することが可能である。冷暗所とは、３〜２０℃、望ましくは５〜１０℃の温度を維持し、且つ外部からの乳酸液表面への入射光を９０％以上、好ましくは９９．９％以上カットできる環境をいう。また、長期的に高い光学純度を維持する場合には、Ｄ−乳酸を保持した容器を負活性ガス、例えば、窒素やアルゴン、ヘリウム等で充填することが好ましい。
【００２３】また、Ｄ−乳酸を分離した後の残渣は、乾燥後、焼却等により処分したり、或いは発酵させて堆肥等にして再利用することも可能である。
【００２４】３．Ｄ−乳酸製造装置本願の更なる発明は、上述した本発明のＤ−乳酸製造方法を実施する装置である。本発明の方法によるＤ−乳酸生成は、従来の微細藻を使用した方法に比較し、光学的に非常に高純度でＤ−乳酸を生産することが可能である。また、本装置は、得られたＤ−乳酸の高純度を維持したままで長時間保持することが可能である。
【００２５】本発明の小型エタノール製造装置の好ましい例を、図２を用いて以下に説明する。本発明の好ましい装置は、微細藻を培養するための微細藻培養部１と、培養液中で増殖した微細藻を濃縮するための微細藻濃縮部２と、Ｄ−乳酸を生成するための保持部３と、得られたＤ−乳酸を分離濃縮するための乳酸分離濃縮部４と、分離濃縮されたＤ−乳酸を光学的に高い純度を維持しながら保存するＤ−乳酸保存部５とを具備する。
【００２６】微細藻培養部１と、微細藻濃縮部２と、保持部３と、乳酸分離濃縮部４と、Ｄ−乳酸保存部５は、１つの容器であってもよく、或いは、各々独立した容器であってもよい。
【００２７】本装置の作業工程は、図１に示す通りである。先ず、微細藻培養部１において微細藻を培養し、培養により増殖した微細藻を微細藻濃縮部２において濃縮して藻体濃縮スラリーにし、続いて、保持部３においてＤ−乳酸の生成を行う。Ｄ−乳酸生成は、暗嫌気性雰囲気で行われる。また、保持部３に接続されたｐＨ調整部を配置することも可能であり（図には示さず）、このｐＨ調製部により、Ｄ−乳酸生成部内の溶媒のｐＨが中性付近に維持されてもよい。Ｄ−乳酸生成完了後、乳酸分離濃縮部４においてＤ−乳酸を分離濃縮する。
【００２８】本装置の微細藻培養部１は、水深１０から３０ｃｍ程度が好ましく、また、その上面が開放された流水路型の培養槽が好ましくが、これに限られるものではない。その材質は、例えば、塩化ビニル、クロロスルホン化ポリエチレン等である。
【００２９】本装置のＤ−乳酸生成部２は、遮光可能な容器が適切であり、例えば、ステンレス等の容器である。
【００３０】保持部３は、スラリーポンプ或いは攪拌機等の緩速攪拌手段を備えたｐＨモニター付きの半密閉型容器からなることが好ましい。ｐＨ調整部は、ｐＨ調整溶液の収納に適する材質で形成されることが必要である。例えば、硬質ガラス、ポリプロフッ素樹脂、ポリプロピレン等である。
【００３１】また、乳酸分離濃縮部４は、Ｄ−乳酸の濃縮に適するように加熱、減圧等に耐えられる材質を使用することが好ましい。例えば、ステンレス、チタン等である。
【００３２】更に、Ｄ−乳酸保存部は、遮光可能であり、且つ気密性に優れた容器が好ましく、例えば、ステンレス、チタン等であり、蓋等が配置された場合に生じる隙間は、例えば、フッ素樹脂、シリコンゴムの材質の腐蝕性の低いパッキンが施されることが好ましい。また、Ｄ−乳酸保存部には、不活性ガスを注入又は排出するためのガス注入部及び排出部を配置することも可能であるが、その設置により気密性が損なわれないことは必要である。
【００３３】［実施例］以下、実施例を用いることにより本発明の内容を更に具体的に説明する。
【００３４】実施例１ナンノクロリス sp.26A4 株を、表1に示す改変ＥＳ培地の組成の３倍濃度の栄養を濾過海水に混合したものを培地として用いて培養した。この培地５０Ｌと、該ナンノクロリス sp.26A4 株の培養種（乾燥固形分として２ｇ）を偏平透明容器に入れ、白色蛍光灯で約１５，０００Luxの連続照射を行ない、空気（０．５％ＣＯ２添加）を通気しながら、２５℃で５日間培養し、５リットル中に１２ｇ（乾燥固形分として）の藻体を含む培養液を得た。
【００３５】前記操作と平衡し、この微細藻を４０（ｗ／ｖ）％の過塩素酸で加水分解し、含有される澱粉をグルコースにした後に、澱粉量に換算することにより澱粉含有率を求めた。その結果、この微細藻は、乾燥重量当たり、４０％の澱粉含有量であることが明らかとなった。次に、この培養液５リットルを遠心沈澱法により濃縮し、５０ｍｌの液中にナンノクロリス ｓｐ．２６Ａ４ 株の藻体１２ｇを含む藻体スラリー液とし、このスラリーをＤ−乳酸製造の原料とした。
【００３６】実施例２実施例１で得た微細藻スラリーを容積０．１リットルの半密閉容器に移し、窒素ガスを短時間スラリー液に注入して容器内の酵素を除去した後、暗い条件下、３０℃で振盪（６５往復／分）し、Ｄ−乳酸の生成を行なった。この間、０．１ＮのＮａＯＨ及び０．１ＮのＨＣｌを追加して、スラリー液のｐＨを６．５〜８．０の範囲に保持した。生産された乳酸の分析をガスクロマトグラフィーによって行ない、Ｄ−乳酸濃度の経時変化を調べた結果、約３日後に４０ｇ／リットルの乳酸が得られた（図３）。これに、最終濃度５０ｇ／ｌの炭酸カルシウムを添加して沈澱し、それに硫酸を加えて硫酸カルシウムを沈澱し、この沈澱物を濾紙にて濾過することにより乳酸溶液を得た。尚、得られた乳酸の回収率は９５％であった。
【００３７】次に、得られた乳酸の光学異性体の純度を調べるために、光学活性体分離液体クロマトグラフィーによる分析を行なった。分析は得られた乳酸を適宜希釈し、細胞片等の微粒子をフィルターで除去したものを光学活性体分離液体クロマトグラフィーに供した。その結果、図４に示す通り、Ｌ−乳酸は検出されず、Ｄ−乳酸のみ生産され、その濃度は５１００μｇ／ｍｌであった。この光学活性体分離液体クロマトグラフィーの検出限界は５μｇ／ｍｌ以下のため、これからＤ−乳酸の光学純度を推定すると少なくとも９９．９％であることが判明した。
【００３８】このことから本発明による微細藻によって光学純度が極めて高いＤ−乳酸が生産可能となった。
【００３９】これより本発明の乳酸製造方法により、光学純度の極めて高いＤ−乳酸を生産できることが証明された。更に、得られたＤ−乳酸は遮光瓶に入れ不活性ガスのＨｅを補填し、１０℃の冷蔵容器にて約１年間に亘り維持したが、１年後のＤ−乳酸の光学純度は９９．９％を保っていた。不活性ガスで置換することによりＤ−乳酸の高光学的純度を長期的に維持することができた。
【００４０】
【発明の効果】本発明の微細藻ナンノクロリス sp.26A4 株を用いることにより、海水を利用して培養を行ない、培養液を濃縮して得られる藻体スラリーをｐHを中性付近に保ちながら暗く且つ嫌気性雰囲気に保持して光学純度の高いＤ−乳酸を製造することが可能となる。
【００４１】これにより、従来光学純度９７％程度のＤ−乳酸の生産であったものが、より高い光学純度の標準品が得られるようになり、農薬や医薬原料になる光学異性体純度の極めて高いＤ−乳酸を大量に製造することが出来る。
【００４２】また、本発明の製造方法は、低コストで大量に得られる海水を利用できる。従って、淡水の確保が困難な地域おいて、開発の困難な荒廃地を工場地として利用することも可能である。それによって、微細藻によりＤ−乳酸生産プロセスをより大規模に利用することが可能である。
【００４３】また、炭酸ガスを太陽光による光合成の作用で固定し、且つ有効利用できるために、地球規模での大気炭酸ガス減少対策としても非常に有効である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の微細藻ナンノクロリス sp.26A4 株を適用するＤ−乳酸製造プロセスの概要を示すフロー図。
【図２】 本発明のＤ−乳酸製造装置を説明するフロー図。
【図３】 本発明の微細藻ナンノクロリス ｓｐ．26Ａ4 株を用いたＤ−乳酸生産の実施例において、微細藻スラリー中に生成した乳酸濃度の経時変化を示す図。
【図４】 本発明の微細藻ナンノクロリス ｓｐ．26Ａ4 株を用いたＤ−乳酸生産における、Ｄ−乳酸の光学純度を示す図。
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、農薬や医薬原料に適した光学純度の極めて高いＤ−乳酸の製造に関する。
【０００２】
【従来の技術】乳酸は、光学異性体を持ち、Ｄ体とＬ体が存在する。従来の乳酸製造は、乳酸菌と総称される微生物を用いた発酵を利用し、蔗糖、ブドウ糖、澱粉等のバイオマスを原料として行われる。このとき、使用する微生物種を選択することにより、Ｄ体、Ｌ体、又はラセミ体の乳酸を、ある程度の純度で選択的に得ることが可能である。
【０００３】Ｄ−乳酸だけを特異的に製造するためには、例えば、ブドウ糖を原料とし、Sporolactobacillus sp. 等により乳酸発酵を行なう方法が知られている。これにより得られるＤ−乳酸の光学純度は９７％程度である。残りの３％程度は、Ｌ−乳酸が不純物として存在する。
【０００４】このようなＤ−乳酸から、更に高純度のＤ−乳酸を得るためには、Ｌ−乳酸酸化酵素を作用させてＬ−乳酸を除去する方法や、乳酸にマグネシウムを加えて乳酸マグネシウムの沈澱を生じた後で、ブタノールによりＤ−乳酸を抽出する方法等が報告されている。しかし、これらの精製方法は、用いる酵素がバルクレベルで市販されていないため入手するには高価であったり、ブタノール抽出時にＤ−乳酸以外の乳酸等が混入し易い等の理由から実現性に乏しい。一方、光学異性体を分離精製する手法としては、光学分割カラムによる方法が報告されている。しかしながら、光学異性体分割用担体が非常に高価であるために、光学分割カラムを用いた精製を工場化することは困難である。このような理由から、市販されているＤ−乳酸の光学異性体純度は、最大でも約９７％であるのが実情である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】以上の状況に鑑み、本発明は、更なる精製を行なうことなしに、農薬や医薬品の原料にできる極めて光学的純度の高いＤ−乳酸を提供することを目的とする。具体的には、光学的に純度の高いＤ−乳酸を産生することが可能な微細藻、これを用いたＤ−乳酸産生方法及び製造装置を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】これまでに、本発明者らは、澱粉を含有する微細藻が暗嫌気条件において発酵生産物として乳酸を産生することを見出し、その製造プロセスについて別途出願している（特願平７−３１４１１９）。今回、乳酸を生産するこれらの微細藻を対象に、Ｄ−乳酸の生産性に関する鋭意探索を行なった。その結果、澱粉を多く含有し、且つ細胞内澱粉を暗嫌気条件で光学純度の非常に高いＤ−乳酸に変換できる微細藻を、長崎県崎戸町の海水より分離することに成功した。本発明は、このような発見の基に到達するに至った。
【０００７】発明者らは、下記の手段により上記課題を解決し、目的を達成することを見出した。即ち、（１） 細胞内澱粉から光学純度の高いＤ−乳酸を産生するナンノクロリス属に属する微細藻ナンノクロリス sp.26A4；
（２） （１）に記載の微細藻を培養した後で回収し、嫌気性雰囲気に保つことにより微細藻細胞内澱粉をＤ−乳酸に変換するＤ−乳酸を製造する方法；
（３） （１）に記載の微細藻を用いてＤ−乳酸を製造するための装置であって、微細藻を光合成独立栄養的に培養するための微細藻培養部と、培養して増殖した微細藻の濃縮スラリーを形成するための微細藻濃縮部と、得られた濃縮スラリーを嫌気性且つ暗い雰囲気に保つことにより発酵させ、前記微細藻内の澱粉をＤ−乳酸に変換する保持部と、得られたＤ−乳酸を分離濃縮するための乳酸分離濃縮部と、分離濃縮されたＤ−乳酸を安定に保存するための保存部と、を具備するＤ−乳酸製造装置；である。
【０００８】
【発明の実施の形態】１．微細藻本発明の微細藻株は、高純度のＤ−乳酸を生成する微細藻であり、具体的にはナンノクロリス属に属する新株ナンノクロリス sp. 26A4(Nannnochloris sp.26A4)株である。本株は、海洋性微細藻（Nannochloris sp.26A4）株として三菱重工基盤研究所内にて保存される。ここで「高純度」の語は、光学的に高い純度をいい、不純物としてのＬ−乳酸を３％未満、好ましくは０．１％以下しか含まないＤ−乳酸を示す。
【０００９】ナンノクロリス sp.26A4 株を海水から分離する方法を以下に説明する。
【００１０】入手した長崎県崎戸町の海水（約100mL）を３００ｍＬの三角フラスコに入れ、表１に示す組成になるように栄養塩等を添加し、蛍光灯を１５００Ｌｕｘ、２５℃で連続照射しながら緩やかに振盪した。
【００１１】
【表１】
【００１２】約３週間後には、微細藻と考えられる緑色の微生物の存在が肉眼で認められる状態となった。この集積培養を行なった培養液（即ち、細胞の懸濁液）を海水で１００倍に希釈し、その０．５ｍｌを後述する寒天培地に滴下して寒天表面に塗布した。寒天培地は、表１に示す組成の培地に精製寒天を１．５重量％加え、オートクレーブにより滅菌後、シャーレに添加し、放冷固化したものである。塗布した寒天培地入りシャーレを蛍光灯下、１５００Lux、２５℃において、静置した結果、約３週間後に培地表面に緑色のコロニーが１５個出現した。個々のコロニーを表１に示す各組成の培地に移植し、培養増殖した後に、各細胞のＤ−乳酸生成能力を調べた。Ｄ−乳酸の生成能力は、生成した乳酸をガスクロマトグラフィーにより濃度を求め、更に、光学純度を光学異性体分離カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)にて確認した。
【００１３】試験に用いた微細藻の中で、最も優れたＤ−乳酸産生能を有する微細藻は、下記の表２に示す光合成色素成分、及び形態学的特徴を有していた。
【００１４】
【表２】
【００１５】以上の特徴から、本微細藻をナンノクロリス属と同定し、得られた藻株をナンノクロリス sp. 26A4(Nannnochloris sp.26A4)株と命名した。
【００１６】以下に示す本発明のＤ−乳酸生産方法において、使用可能な微細藻は、上記ナンノクロリス sp.26A4 株の他に、テトラセルミス sp.(Tetraselmis sp.)に属するＣＣＡＰ登録番号６６／３株を使用することも可能であるが、Ｄ−乳酸生産力がより高いことから、ナンノクロリス sp.26A4 株が特に好ましい。
【００１７】本藻株を使用したＤ−乳酸製造は、基本的には、本発明者らによる乳酸製造方法（特願平７−３１４１１９）で示したプロセスを用いて実施することができるが、好ましくは、以下のような改変法を用いる。
【００１８】２．Ｄ−乳酸の製造方法以下、改変法を図１を用いて説明する。図１において、微細藻培養工程１は、本願のＤ−乳酸生産微細藻を光合成独立栄養的に培養する工程である。また、この工程は、水深１０から３０ｃｍ程度の上面が開放された流水路型の培養槽等を用て行なうことができる。この工程において、本微細藻は、基本的には、海水から窒素及びリン等の無機栄養素を供給し、且つ太陽光を照射することにより培養することができる。ここで使用される海水は、濾過等により、海水中の微細藻の捕食生物等の異物を除去した後で、培養槽に供給される。
【００１９】次に、培養液中の微細藻の濃度が、培養液１リットル当たり０．１から１．０ｇ（乾燥固形分）程度になった時点で培養を止め、微細藻濃縮工程２において濃縮を行なう。微細藻濃縮工程２において、沈澱性の高い微細藻の場合には、一旦自然沈澱により固形分１から５ｗ／ｖ％（１リットル当たり１０から５０ｇ）前後に濃縮した後、遠心分離又はベルトフィルタ等によって更に固形分１０から２０Ｗ／Ｖ％に濃縮する。ここで、本工程における濃縮は、後段でのＤ−乳酸濃縮を有利にするために、即ち、スラリーとしての取り扱いを容易にし、且つ後段での乾燥攪拌を可能にし、更にＤ−乳酸濃度を高くするために、流動性を有する範囲内で可能な限り固形分に濃縮することが好ましい。
【００２０】このようにして得られた微細藻のスラリーを、暗く且つ嫌気性雰囲気に保持できる保持工程３に導き、Ｄ−乳酸の生産を行う。保持工程３は、スラリーポンプ或いは攪拌機等の緩速攪拌手段を備えたｐＨモニター付き半密閉型容器からなる装置内で行なうことが可能である。ここで、「暗い雰囲気」とは、光合成が行われない程度に光を遮断した状態をいう。即ち、外部からの微細藻スラリー表面への入射光を９０％以上、好ましくは９９．９％以上カットして得られる環境状況をいう。この保持工程３にスラリーを導入し、緩くかき混ぜながら暗く且つ嫌気性雰囲気に保持することにより、微細藻自身が行なう細胞内澱粉の発酵作用によってＤ−乳酸が産生される。この間、必要に応じ、ＮａＯＨ等のアルカリ溶液とＨＣｌ等の酸溶液を用いて、スラリーのｐＨを中性付近に維持することも可能である。或いは、ＣａＣＯ３を添加することにより、ｐＨを中性付近、好ましくは６．５〜８．０に維持してもよい。但し、生成する乳酸の濃度によってはｐＨの低下は抑制されるため、ｐＨの制御は必須ではない。保持工程３における微細藻の滞留時間は、微細藻の種類、保持条件等により異なるが、１０〜７０時間の範囲が一般的である。
【００２１】スラリー中のＤ−乳酸濃度が３０〜１００ｇ／リットル程度になった時点で、Ｄ−乳酸分離濃縮工程４に速やかに導き、Ｄ−乳酸の分離濃縮を行なう。このＤ−乳酸濃縮分離工程では、Ｄ−乳酸を含む発酵液中に微量に存在する乳酸酸化酵素等と、得られたＤ−乳酸との接触を避けることにより、生成した光学的純度の高いＤ−乳酸が劣化するのを防ぎながら、Ｄ−乳酸を濃縮する。
【００２２】このＤ−乳酸分離濃縮工程４では、工程３で得られたＤ−乳酸を含む微細藻スラリーにカルシウム等を添加して乳酸塩として沈澱させた後に、硫酸による脱水を行ない回収することにより、或いは、プロパン等の溶媒を用いた超臨界抽出法等を用いることにより、所望の濃度のＤ−乳酸に濃縮することができる。このようにして得られたＤ−乳酸は、Ｄ−乳酸保存工程５に保持される。Ｄ−乳酸保持工程５ではＤ−乳酸を冷暗所に保存することで、高い光学純度を保持することが可能である。冷暗所とは、３〜２０℃、望ましくは５〜１０℃の温度を維持し、且つ外部からの乳酸液表面への入射光を９０％以上、好ましくは９９．９％以上カットできる環境をいう。また、長期的に高い光学純度を維持する場合には、Ｄ−乳酸を保持した容器を負活性ガス、例えば、窒素やアルゴン、ヘリウム等で充填することが好ましい。
【００２３】また、Ｄ−乳酸を分離した後の残渣は、乾燥後、焼却等により処分したり、或いは発酵させて堆肥等にして再利用することも可能である。
【００２４】３．Ｄ−乳酸製造装置本願の更なる発明は、上述した本発明のＤ−乳酸製造方法を実施する装置である。本発明の方法によるＤ−乳酸生成は、従来の微細藻を使用した方法に比較し、光学的に非常に高純度でＤ−乳酸を生産することが可能である。また、本装置は、得られたＤ−乳酸の高純度を維持したままで長時間保持することが可能である。
【００２５】本発明の小型エタノール製造装置の好ましい例を、図２を用いて以下に説明する。本発明の好ましい装置は、微細藻を培養するための微細藻培養部１と、培養液中で増殖した微細藻を濃縮するための微細藻濃縮部２と、Ｄ−乳酸を生成するための保持部３と、得られたＤ−乳酸を分離濃縮するための乳酸分離濃縮部４と、分離濃縮されたＤ−乳酸を光学的に高い純度を維持しながら保存するＤ−乳酸保存部５とを具備する。
【００２６】微細藻培養部１と、微細藻濃縮部２と、保持部３と、乳酸分離濃縮部４と、Ｄ−乳酸保存部５は、１つの容器であってもよく、或いは、各々独立した容器であってもよい。
【００２７】本装置の作業工程は、図１に示す通りである。先ず、微細藻培養部１において微細藻を培養し、培養により増殖した微細藻を微細藻濃縮部２において濃縮して藻体濃縮スラリーにし、続いて、保持部３においてＤ−乳酸の生成を行う。Ｄ−乳酸生成は、暗嫌気性雰囲気で行われる。また、保持部３に接続されたｐＨ調整部を配置することも可能であり（図には示さず）、このｐＨ調製部により、Ｄ−乳酸生成部内の溶媒のｐＨが中性付近に維持されてもよい。Ｄ−乳酸生成完了後、乳酸分離濃縮部４においてＤ−乳酸を分離濃縮する。
【００２８】本装置の微細藻培養部１は、水深１０から３０ｃｍ程度が好ましく、また、その上面が開放された流水路型の培養槽が好ましくが、これに限られるものではない。その材質は、例えば、塩化ビニル、クロロスルホン化ポリエチレン等である。
【００２９】本装置のＤ−乳酸生成部２は、遮光可能な容器が適切であり、例えば、ステンレス等の容器である。
【００３０】保持部３は、スラリーポンプ或いは攪拌機等の緩速攪拌手段を備えたｐＨモニター付きの半密閉型容器からなることが好ましい。ｐＨ調整部は、ｐＨ調整溶液の収納に適する材質で形成されることが必要である。例えば、硬質ガラス、ポリプロフッ素樹脂、ポリプロピレン等である。
【００３１】また、乳酸分離濃縮部４は、Ｄ−乳酸の濃縮に適するように加熱、減圧等に耐えられる材質を使用することが好ましい。例えば、ステンレス、チタン等である。
【００３２】更に、Ｄ−乳酸保存部は、遮光可能であり、且つ気密性に優れた容器が好ましく、例えば、ステンレス、チタン等であり、蓋等が配置された場合に生じる隙間は、例えば、フッ素樹脂、シリコンゴムの材質の腐蝕性の低いパッキンが施されることが好ましい。また、Ｄ−乳酸保存部には、不活性ガスを注入又は排出するためのガス注入部及び排出部を配置することも可能であるが、その設置により気密性が損なわれないことは必要である。
【００３３】［実施例］以下、実施例を用いることにより本発明の内容を更に具体的に説明する。
【００３４】実施例１ナンノクロリス sp.26A4 株を、表1に示す改変ＥＳ培地の組成の３倍濃度の栄養を濾過海水に混合したものを培地として用いて培養した。この培地５０Ｌと、該ナンノクロリス sp.26A4 株の培養種（乾燥固形分として２ｇ）を偏平透明容器に入れ、白色蛍光灯で約１５，０００Luxの連続照射を行ない、空気（０．５％ＣＯ２添加）を通気しながら、２５℃で５日間培養し、５リットル中に１２ｇ（乾燥固形分として）の藻体を含む培養液を得た。
【００３５】前記操作と平衡し、この微細藻を４０（ｗ／ｖ）％の過塩素酸で加水分解し、含有される澱粉をグルコースにした後に、澱粉量に換算することにより澱粉含有率を求めた。その結果、この微細藻は、乾燥重量当たり、４０％の澱粉含有量であることが明らかとなった。次に、この培養液５リットルを遠心沈澱法により濃縮し、５０ｍｌの液中にナンノクロリス ｓｐ．２６Ａ４ 株の藻体１２ｇを含む藻体スラリー液とし、このスラリーをＤ−乳酸製造の原料とした。
【００３６】実施例２実施例１で得た微細藻スラリーを容積０．１リットルの半密閉容器に移し、窒素ガスを短時間スラリー液に注入して容器内の酵素を除去した後、暗い条件下、３０℃で振盪（６５往復／分）し、Ｄ−乳酸の生成を行なった。この間、０．１ＮのＮａＯＨ及び０．１ＮのＨＣｌを追加して、スラリー液のｐＨを６．５〜８．０の範囲に保持した。生産された乳酸の分析をガスクロマトグラフィーによって行ない、Ｄ−乳酸濃度の経時変化を調べた結果、約３日後に４０ｇ／リットルの乳酸が得られた（図３）。これに、最終濃度５０ｇ／ｌの炭酸カルシウムを添加して沈澱し、それに硫酸を加えて硫酸カルシウムを沈澱し、この沈澱物を濾紙にて濾過することにより乳酸溶液を得た。尚、得られた乳酸の回収率は９５％であった。
【００３７】次に、得られた乳酸の光学異性体の純度を調べるために、光学活性体分離液体クロマトグラフィーによる分析を行なった。分析は得られた乳酸を適宜希釈し、細胞片等の微粒子をフィルターで除去したものを光学活性体分離液体クロマトグラフィーに供した。その結果、図４に示す通り、Ｌ−乳酸は検出されず、Ｄ−乳酸のみ生産され、その濃度は５１００μｇ／ｍｌであった。この光学活性体分離液体クロマトグラフィーの検出限界は５μｇ／ｍｌ以下のため、これからＤ−乳酸の光学純度を推定すると少なくとも９９．９％であることが判明した。
【００３８】このことから本発明による微細藻によって光学純度が極めて高いＤ−乳酸が生産可能となった。
【００３９】これより本発明の乳酸製造方法により、光学純度の極めて高いＤ−乳酸を生産できることが証明された。更に、得られたＤ−乳酸は遮光瓶に入れ不活性ガスのＨｅを補填し、１０℃の冷蔵容器にて約１年間に亘り維持したが、１年後のＤ−乳酸の光学純度は９９．９％を保っていた。不活性ガスで置換することによりＤ−乳酸の高光学的純度を長期的に維持することができた。
【００４０】
【発明の効果】本発明の微細藻ナンノクロリス sp.26A4 株を用いることにより、海水を利用して培養を行ない、培養液を濃縮して得られる藻体スラリーをｐHを中性付近に保ちながら暗く且つ嫌気性雰囲気に保持して光学純度の高いＤ−乳酸を製造することが可能となる。
【００４１】これにより、従来光学純度９７％程度のＤ−乳酸の生産であったものが、より高い光学純度の標準品が得られるようになり、農薬や医薬原料になる光学異性体純度の極めて高いＤ−乳酸を大量に製造することが出来る。
【００４２】また、本発明の製造方法は、低コストで大量に得られる海水を利用できる。従って、淡水の確保が困難な地域おいて、開発の困難な荒廃地を工場地として利用することも可能である。それによって、微細藻によりＤ−乳酸生産プロセスをより大規模に利用することが可能である。
【００４３】また、炭酸ガスを太陽光による光合成の作用で固定し、且つ有効利用できるために、地球規模での大気炭酸ガス減少対策としても非常に有効である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の微細藻ナンノクロリス sp.26A4 株を適用するＤ−乳酸製造プロセスの概要を示すフロー図。
【図２】 本発明のＤ−乳酸製造装置を説明するフロー図。
【図３】 本発明の微細藻ナンノクロリス ｓｐ．26Ａ4 株を用いたＤ−乳酸生産の実施例において、微細藻スラリー中に生成した乳酸濃度の経時変化を示す図。
【図４】 本発明の微細藻ナンノクロリス ｓｐ．26Ａ4 株を用いたＤ−乳酸生産における、Ｄ−乳酸の光学純度を示す図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 細胞内澱粉から光学純度の高いＤ−乳酸を産生するナンノクロリス属に属する微細藻ナンノクロリス sp.26A4。
【請求項２】 請求項１に記載の微細藻を培養した後で回収し、嫌気性雰囲気に保つことにより微細藻細胞内澱粉をＤ−乳酸に変換するＤ−乳酸を製造する方法。
【請求項３】 請求項１に記載の微細藻を用いたＤ−乳酸の製造方法であって、微細藻を光合成独立栄養的に培養することと、培養して増殖した微細藻を濃縮スラリーにすることと、得られた濃縮スラリーを嫌気性且つ暗い雰囲気に保つことにより発酵させ、前記微細藻内の澱粉をＤ−乳酸に変換することと、得られたＤ−乳酸を冷暗所で発酵液と分離して濃縮することとを具備するＤ−乳酸製造方法。
【請求項４】 請求項２又は３の何れか一方で得られたＤ−乳酸を冷暗所で発酵液と分離濃縮した後に、冷暗所に保持することにより光学純度を維持することを特徴とするＤ−乳酸の保存方法。
【請求項５】 請求項１に記載の微細藻を用いてＤ−乳酸を製造するための装置であって、微細藻を光合成独立栄養的に培養するための微細藻培養部と、培養して増殖した微細藻の濃縮スラリーを形成するための微細藻濃縮部と、得られた濃縮スラリーを嫌気性且つ暗い雰囲気に保つことにより発酵させ、前記微細藻内の澱粉をＤ−乳酸に変換する保持部と、得られたＤ−乳酸を分離濃縮するための乳酸分離濃縮部と、分離濃縮されたＤ−乳酸を安定に保存するための保存部と、を具備するＤ−乳酸製造装置。
【請求項１】 細胞内澱粉から光学純度の高いＤ−乳酸を産生するナンノクロリス属に属する微細藻ナンノクロリス sp.26A4。
【請求項２】 請求項１に記載の微細藻を培養した後で回収し、嫌気性雰囲気に保つことにより微細藻細胞内澱粉をＤ−乳酸に変換するＤ−乳酸を製造する方法。
【請求項３】 請求項１に記載の微細藻を用いたＤ−乳酸の製造方法であって、微細藻を光合成独立栄養的に培養することと、培養して増殖した微細藻を濃縮スラリーにすることと、得られた濃縮スラリーを嫌気性且つ暗い雰囲気に保つことにより発酵させ、前記微細藻内の澱粉をＤ−乳酸に変換することと、得られたＤ−乳酸を冷暗所で発酵液と分離して濃縮することとを具備するＤ−乳酸製造方法。
【請求項４】 請求項２又は３の何れか一方で得られたＤ−乳酸を冷暗所で発酵液と分離濃縮した後に、冷暗所に保持することにより光学純度を維持することを特徴とするＤ−乳酸の保存方法。
【請求項５】 請求項１に記載の微細藻を用いてＤ−乳酸を製造するための装置であって、微細藻を光合成独立栄養的に培養するための微細藻培養部と、培養して増殖した微細藻の濃縮スラリーを形成するための微細藻濃縮部と、得られた濃縮スラリーを嫌気性且つ暗い雰囲気に保つことにより発酵させ、前記微細藻内の澱粉をＤ−乳酸に変換する保持部と、得られたＤ−乳酸を分離濃縮するための乳酸分離濃縮部と、分離濃縮されたＤ−乳酸を安定に保存するための保存部と、を具備するＤ−乳酸製造装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００１−２９０６３（Ｐ２００１−２９０６３Ａ）
【公開日】平成１３年２月６日（２００１．２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願平１１−２０４５５１
【出願日】平成１１年７月１９日（１９９９．７．１９）
【出願人】（０００００６２０８）三菱重工業株式会社 (10,378)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１３年２月６日（２００１．２．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１１年７月１９日（１９９９．７．１９）
【出願人】（０００００６２０８）三菱重工業株式会社 (10,378)
【Ｆターム（参考）】
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