（Ｓ，Ｒ）−３−フェニル−４，５−ジヒドロ−５−イソオキサゾール酢酸−一酸化窒素ならびに抗癌剤および抗ウイルス剤としてのその使用
本発明は、イソオキサゾール誘導体、以下ＧＩＴ２７−ＮＯと称す式（Ｉ）の化合物に関し、これは、以下ＶＧＸ−１０２７と称す（Ｓ，Ｒ）−３−フェニル−４，５−ジヒドロ−５−イソオキサソール（ｉｓｏｘａｓｏｌｅ）酢酸の、ＮＯ供与により構造的修飾された形である。３種の腫瘍細胞株、ラット星状細胞腫Ｃ６、マウス繊維肉腫Ｌ９２９、およびマウス黒色腫Ｂ１６の細胞をＧＩＴ２７−ＮＯで処理すると、細胞呼吸および生細胞数の有意な減少がもたらされたが、ＶＧＸ−１０２７はまったく効果がなかった。ＮＯスカベンジャーとして働くヘモグロビンは、細胞生存率を回復させ、このことから化合物（Ｉ）のＮＯ媒介性の殺腫瘍性作用が示された。ＧＩＴ２７−ＮＯはＬ９２９細胞培養物においてアポトーシス性細胞死を引き起こしたが、自食性細胞死がＣ６およびＢ１６細胞の生存率減少の主な原因である。さらに、ＧＩＴ２７−ＮＯは、抗酸化剤Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）によって無効化され得る活性酸素種の産生を誘発し、これによって活性酸素種（ＲＯＳ）が細胞生存率の低下に少なくとも部分的に関与していることが示された。ＧＩＴ２７−ＮＯの抗腫瘍活性は、細胞特異的な方法でＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１／２、ｐ３８、およびＪＮＫ）の活性化によって媒介される。ＭＡＰキナーゼの役割はさらに、これらの分子の特異的阻害剤ＰＤ９８０５９、ＳＢ２０２１９０、およびＳＰ６００１２５によって確認された。最後に、ＧＩＴ２７−ＮＯによるｉｎ ｖｉｖｏ処置は、Ｂ１６黒色腫を移植した同系Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腫瘍増殖を有意に低下させた。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はイソオキサゾリン化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
一酸化窒素（ＮＯ）は、多数の生理学的および病理学的過程に関与する高反応性分子である。血管拡張、神経伝達、および免疫におけるＮＯの役割は、多くの面で複雑である（Ｔａｒｒ、２００６年）。この分子はまた、非特異的抗腫瘍免疫応答の主な関与物質として知られている（Ｒｏｓｈｎｉ、２００３年）。しかし、最近の研究は、癌細胞との相互作用が以前考えられていたよりも複雑であることを示している。ＮＯは、腫瘍の増大および転移を阻害することができるが、促進させることもできる（Ｔａｒｒ、２００６年、Ｌｅｃｈｎｅｒ、２００５年）。腫瘍−ＮＯ相互作用の結果は、ＮＯ源、曝露細胞のタイプ、細胞内のＮＯの局在性、ＮＯ曝露の期間、およびＮＯが相互作用する可能性がある他のフリーラジカル種の存在に依存する（Ｔａｒｒ、２００６年）。一般に、宿主マクロファージおよびＮＫ細胞によって産生されたＮＯは、抗腫瘍応答を媒介する（Ｒｏｓｈｎｉ、２００３年）。一方、ＮＯの腫瘍化促進の役割は、この分子を生成し、それに応じて増殖を自己調節する腫瘍細胞の内因性潜在能力によるものとされている（Ｌｅｃｈｎｅｒ、２００５年）。ＮＯは、電子供与、ならびに鉄、亜鉛、および銅などの遷移金属との反応によって腫瘍細胞の増殖に直接影響を及ぼし、それ故に酵素活性および転写因子活性が調整される。ＮＯは、新しいラジカルの発生によって、細胞成分のさらなる破壊を間接的に媒介する（Ｌｉ、２００５年、Ｔａｒｒ、２００６年、Ｌｅｃｈｎｅｒ、２００５年）。
【０００３】
最近、いくつかの有効な抗癌剤が入手可能である。しかし、癌用薬の設計は、多くの科学者にとって依然として大きな難題である。調査は、効果を高め、副作用を低減し、投与経路が適切である物質の発見を目的としている。癌の予防および／または治療での特に重要な新規な治療法は、ＮＯ供与非ステロイド性抗炎症薬（ＮＯ−ＮＳＡＩＤ）によって代表される。
【０００４】
ＮＯ−ＮＳＡＩＤは、ＮＯ供与基が芳香族または脂肪族スペーサーによって共有結合されているＮＳＡＩＤからなる（ＲｉｇａｓおよびＫａｓｈｆｉ、２００４年を参照）。これらの薬剤はその親化合物といくつかの薬理学的性質を共有するが、現在のデータは、それらの構造変化が効力の向上および毒性の減少に寄与していることを示唆している（Ｋｅｅｂｌｅ、２００２年）。
【０００５】
ＮＯ−ＮＳＡＩＤは、アルツハイマー病、ならびに心血管、リウマチ、および肺疾患に有効である（Ｄｅｌ Ｓｏｌｄａｔｏら、１９９９年）。ＮＳＡＩＤのシクロオキシゲナーゼ阻害性とＮＯの殺腫瘍能とを組み合わせることにより、これらの薬剤は悪性疾患の治療に対する最適な候補になる（ＲｉｇａｓおよびＫａｓｈｆｉ、２００４年を参照）。
【０００６】
様々なＮＯ−ＮＳＡＩＤが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでもｉｎ ｖｉｖｏでも癌細胞の増殖に影響を及ぼすことが実証されている。これらの薬剤は、ヒトの膀胱、結腸、前立腺、肺、膵臓、および舌の癌細胞、ならびに白血病細胞株に対して強力な抗増殖能およびアポトーシス促進能を有する（Ｋａｓｈｆｉら、２００３年、Ｙｅｈ、２００４年、Ｈｕｇｕｅｎｉｎ、２００５年、Ｈｕｇｕｅｎｉｎ、２００４ａ年、Ｈｕｇｕｅｎｉｎ、２００４ｂ年、Ｇａｏ、２００５年、Ｎａｔｈ、２００４年、Ｓｐｉｅｇｅｌ、２００５年）。さらに、ＮＯ−アスピリンおよびＮＯ−インドメタシンは、ラットおよびマウスでの胃腸の癌発に対して有効である（Ｂａｋ、１９９８年、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、２００４年、Ｒａｏ）。ＮＯ供与アスピリンは、ハムスター腫瘍モデルでの膵臓癌を予防した（Ｏｕｙａｎｇ、２００６年）。これらの薬剤の作用に関与する正確な機序はまだ完全には理解されていないが、潜在的標的は、ＮＦ−κＢ、誘導型ＮＯ合成酵素、およびシクロオキシゲナーゼであると考えられている（Ｒｉｇａｓ、ｒｅｗ、２００４年）。
【０００７】
最近、イソオキサゾリン化合物、（Ｓ，Ｒ）−３−フェニル−４，５−ジヒドロ−５−イソオキサソール（ｉｓｏｘａｓｏｌｅ）酢酸（ＶＧＸ−１０２７）が強力な免疫調節特性を有することが示されている。ＶＧＸ−１０２７は、マクロファージおよび／またはＴ細胞からのＴＮＦ−α合成を阻害することによって、マウスをＬＰＳの致死作用から保護する（Ｓｔｏｊａｎｏｖｉｃら、印刷中）。さらに、自発型もしくは加速型の糖尿病、または低用量ストレプトゾトシンの複数回投与により誘発された免疫炎症性糖尿病のＮＯＤマウスにＶＧＸ−１０２７を投与すると、糖尿病の進行が有意に低減される（Ｓｔｏｓｉｃ−Ｇｒｕｊｉｃｉｃら、２００６年）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｔａｒｒ ＪＭ，Ｅｇｇｌｅｔｏｎ Ｐ，Ｗｉｎｙａｒｄ ＰＧ．Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｔｕｍｏｕｒ ｃｅｌｌｓ．Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．２００６；１２（３４）：４４４５−６８．
【非特許文献２】Ｌｅｃｈｎｅｒ Ｍ，Ｌｉｒｋ Ｐ，Ｒｉｅｄｅｒ Ｊ．Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ｉＮＯＳ）ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｂｉｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ ｔｗｏ ｓｉｄｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｉｎ．Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．２００５ Ａｕｇ；１５（４）：２７７−８９．
【非特許文献３】Ｌｉ ＣＱ，Ｗｏｇａｎ ＧＮ．Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ａｓ ａ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．２００５ Ａｕｇ ８；２２６（１）：１−１５．
【非特許文献４】Ｒｉｇａｓ Ｂ，Ｋａｓｈｆｉ Ｋ．Ｎｉｔｒｉｃ−ｏｘｉｄｅ−ｄｏｎａｔｉｎｇ ＮＳＡＩＤｓ ａｓ ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２００４ Ｊｕｌ；１０（７）：３２４−３０．
【非特許文献５】Ｋｅｅｂｌｅ ＪＥ，Ｍｏｏｒｅ ＰＫ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ−ｄｏｎａｔｉｎｇ ｄｒｕｇｓ．Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００２ Ｏｃｔ；１３７（３）：２９５−３１０．
【非特許文献６】Ｄｅｌ Ｓｏｌｄａｔｏ Ｐ，Ｓｏｒｒｅｎｔｉｎｏ Ｒ，Ｐｉｎｔｏ Ａ．ＮＯ ａｓｐｉｒｉｎｓ：ａ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｎｅｗ ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｎｄ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ．Ｔｈｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ １９９９；２０（８）：３１９−２３．
【非特許文献７】Ｋａｓｈｆｉ Ｋ，Ｒｙａｎ Ｙ，Ｑｉａｏ ＬＬ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＪＬ，Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｄｅｌ Ｓｏｌｄａｔｏ Ｐ，Ｔｒａｇａｎｏｓ Ｆ，Ｒｉｇａｓ Ｂ．Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ−ｄｏｎａｔｉｎｇ ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇｓ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｔｉｓｓｕｅ ｔｙｐｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔ．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２００２ Ｄｅｃ；３０３（３）：１２７３−８２．
【非特許文献８】Ｙｅｈ ＲＫ，Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＪＬ，Ｂａｌｕｃｈ Ｍ，Ｈｕｎｄｌｅｙ ＴＲ，Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ ＲＥ，Ｋａｌａｌａ Ｓ，Ｔｒａｇａｎｏｓ Ｆ，Ｂｅｎａｒｄｉｎｉ Ｆ，ｄｅｌ Ｓｏｌｄａｔｏ Ｐ，Ｋａｓｈｆｉ Ｋ，Ｒｉｇａｓ Ｂ．ＮＯ−ｄｏｎａｔｉｎｇ ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇｓ（ＮＳＡＩＤｓ）ｉｎｈｉｂｉｔ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｍｏｒｅ ｐｏｔｅｎｔｌｙ ｔｈａｎ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ＮＳＡＩＤｓ：ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｙ？ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００４ Ｊｕｎ １５；６７（１２）：２１９７−２０５．
【非特許文献９】Ｈｕｇｕｅｎｉｎ Ｓ，Ｖａｃｈｅｒｏｔ Ｆ，Ｆｌｅｕｒｙ−Ｆｅｉｔｈ Ｊ，Ｒｉｆｆａｕｄ ＪＰ，Ｃｈｏｐｉｎ ＤＫ，Ｂｏｌｌａ Ｍ，Ｊａｕｒａｎｄ ＭＣ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｒａｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ−ｄｏｎａｔｉｎｇ ｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇｓ（ＮＯ−ＮＳＡＩＤｓ）ｏｎ ｈｕｍａｎ ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．２００５ Ｆｅｂ １０；２１８（２）：１６３−７０．
【非特許文献１０】Ｈｕｇｕｅｎｉｎ Ｓ，Ｆｌｅｕｒｙ−Ｆｅｉｔｈ Ｊ，Ｋｈｅｕａｎｇ Ｌ，Ｊａｕｒａｎｄ ＭＣ，Ｂｏｌｌａ Ｍ，Ｒｉｆｆａｕｄ ＪＰ，Ｃｈｏｐｉｎ ＤＫ，Ｖａｃｈｅｒｏｔ Ｆ．Ｎｉｔｒｏｓｕｌｉｎｄａｃ（ＮＣＸ １１０２）：ａ ｎｅｗ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ−ｄｏｎａｔｉｎｇ ｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇ（ＮＯ−ＮＳＡＩＤ），ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ．２００４ Ｏｃｔ １；６１（２）：１３２−４１．
【非特許文献１１】Ｈｕｇｕｅｎｉｎ Ｓ，Ｖａｃｈｅｒｏｔ Ｆ，Ｋｈｅｕａｎｇ Ｌ，Ｆｌｅｕｒｙ−Ｆｅｉｔｈ Ｊ，Ｊａｕｒａｎｄ ＭＣ，Ｂｏｌｌａ Ｍ，Ｒｉｆｆａｕｄ ＪＰ，Ｃｈｏｐｉｎ ＤＫ．Ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｎｉｔｒｏｓｕｌｉｎｄａｃ（ＮＣＸ １１０２），ａ ｎｅｗ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ−ｄｏｎａｔｉｎｇ ｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇ，ｏｎ ｈｕｍａｎ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２００４ Ｍａｒ；３（３）：２９１−８．
【非特許文献１２】Ｇａｏ Ｊ，Ｌｉｕ Ｘ，Ｒｉｇａｓ Ｂ．Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ−ｄｏｎａｔｉｎｇ ａｓｐｉｒｉｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００５ Ｎｏｖ ２２；１０２（４７）：１７２０７−１２．
【非特許文献１３】Ｎａｔｈ Ｎ，Ｌａｂａｚｅ Ｇ，Ｒｉｇａｓ Ｂ，Ｋａｓｈｆｉ Ｋ．ＮＯ−ｄｏｎａｔｉｎｇ ａｓｐｉｒｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｌｅｕｋｅｍｉｃ Ｊｕｒｋａｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２００５ Ｊａｎ ７；３２６（１）：９３−９．
【非特許文献１４】Ｓｐｉｅｇｅｌ Ａ，Ｈｕｎｄｌｅｙ ＴＲ，Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｇａｏ Ｊ，Ｏｕｙａｎｇ Ｎ，Ｌｉｕ Ｘ，Ｇｏ ＭＦ，Ｔｓｉｏｕｌｉａｓ ＧＪ，Ｋａｓｈｆｉ Ｋ，Ｒｉｇａｓ Ｂ．ＮＯ−ｄｏｎａｔｉｎｇ ａｓｐｉｒｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｂｏｔｈ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎ ＨＴ−２９ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００５ Ｏｃｔ １；７０（７）：９９３−１０００．
【非特許文献１５】Ｂａｋ ＡＷ，ＭｃＫｎｉｇｈｔ Ｗ，Ｌｉ Ｐ，Ｄｅｌ Ｓｏｌｄａｔｏ Ｐ，Ｃａｌｉｇｎａｎｏ Ａ，Ｃｉｒｉｎｏ Ｇ，Ｗａｌｌａｃｅ ＪＬ．Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｎ ａｓｐｉｒｉｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｉｎ ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｃｏｌｏｎｉｃ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．１９９８；６２（２３）：ＰＬ ３６７−７３．
【非特許文献１６】Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＪＬ，Ｋａｓｈｆｉ Ｋ，Ｏｕｙａｎｇ Ｎ，ｄｅｌ Ｓｏｌｄａｔｏ Ｐ，Ｋｏｐｅｌｏｖｉｃｈ Ｌ，Ｒｉｇａｓ Ｂ．ＮＯ−ｄｏｎａｔｉｎｇ ａｓｐｉｒｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｍｉｎ（ＡＰＣ（Ｍｉｎ／＋））ｍｉｃｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２００４ Ｊａｎ １６；３１３（３）：７８４−８．
【非特許文献１７】Ｏｕｙａｎｇ Ｎ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＪＬ，Ｔｓｉｏｕｌｉａｓ ＧＪ，Ｇａｏ Ｊ，Ｉａｔｒｏｐｏｕｌｏｓ ＭＪ，Ｋｏｐｅｌｏｖｉｃｈ Ｌ，Ｋａｓｈｆｉ Ｋ，Ｒｉｇａｓ Ｂ．Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ−ｄｏｎａｔｉｎｇ ａｓｐｉｒｉｎ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ａ ｈａｍｓｔｅｒ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００６ Ａｐｒ １５；６６（８）：４５０３−１１．
【非特許文献１８】Ｉｖａｎａ Ｓｔｏｊａｎｏｖｉｃ；Ｓａｌｖａｔｏｒｅ Ｃｕｚｚｏｃｒｅａ；Ｋａｔｉａ Ｍａｎｇａｎｏ；Ｅｍａｎｕｅｌａ Ｍａｚｚｏｎ；Ｄｊｏｒｄｊｅ Ｍｉｌｊｋｏｖｉｃ；Ｍｉｎｇｊｕｎ Ｗａｎｇ；Ｍａｒｃｏ Ｄｏｎｉａ；Ｙｏｕｓｅｆ Ａｌ Ａｂｅｄ；Ｊｏｓｅｐｈ Ｋｉｍ；Ｓｔａｎｉｓｌａｖａ Ｓｔｏｓｉｃ−Ｇｒｕｊｉｃｉｃ；Ｍｏｇｅｎｓ Ｃｌａｅｓｓｏｎ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ，ｅｘ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｓｏｘａｚｏｌｉｎｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ＶＧＸ−１０２７：Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｔｈ ｏｒｇａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌｓ．Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，ｉｎ ｐｒｅｓｓ．
【非特許文献１９】Ｓｔｏｓｉｃ−Ｇｒｕｊｉｃｉｃ Ｓ，Ｃｖｅｔｋｏｖｉｃ Ｉ，Ｍａｎｇａｎｏ Ｋ，Ｆｒｅｓｔａ Ｍ，Ｍａｋｓｉｍｏｖｉｃ−Ｉｖａｎｉｃ Ｄ，Ｈａｒｈａｊｉ Ｌ，Ｐｏｐａｄｉｃ Ｄ，Ｍｏｍｃｉｌｏｖｉｃ Ｍ，Ｍｉｌｊｋｏｖｉｃ Ｄ，Ｋｉｍ Ｊ，Ａｂｅｄ ＹＡ，Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉ Ｆ．Ａ Ｐｏｔｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ，（Ｓ，Ｒ）−３−Ｐｈｅｎｙｌ−４，５−ｄｉｈｙｄｒｏ−５−ｉｓｏｘａｓｏｌｅ Ａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ，Ｐｒｅｖｅｎｔｓ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ａｎｄ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ Ｆｏｒｍｓ ｏｆ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ｉｎ ＮＯＤ Ｍｉｃｅ ａｎｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｌｏｗ Ｄｏｓｅｓ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ ｉｎ ＣＢＡ／Ｈ Ｍｉｃｅ．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２００７ Ｍａｒ；３２０（３）：１０３８−４９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の説明
本発明は、式（Ｉ）のイソオキサゾリン化合物に関し、
【００１０】
【化１】
【００１１】
これをまた以下（ＧＩＴ２７−ＮＯ）と称し、次の反応式によって合成することができる。
【００１２】
【化２】
【００１３】
化合物（Ｉ）は、動物モデルにおいて、抗腫瘍剤および抗ウイルス剤として胃潰瘍の予防および治療に有効であることが分かった。したがって、これは、抗腫瘍および抗ウイルス薬剤組成物の製剤化、ならびに当業者に周知の手順に従って賦形剤および／または媒体と共に製剤化することができる、虚血再灌流障害に関連する胃腸潰瘍、出血性ショック、および器官損傷を治療するように設計された組成物に使用することができる。薬剤組成物、非経口、経口、および局所用組成物、ならびに眼のウイルス感染治療のための点眼薬。
【００１４】
本発明の目的はまた、有効量の化合物（ＩＩ）の投与を含む、腫瘍病態およびウイルス感染症の治療方法である。投与の用量および時間は、患者の必要に応じて医師によって決定されるであろう。
【００１５】
本発明はまた、化合物（Ｉ）の前駆体、式（ＩＩ）の化合物に関し、
【００１６】
【化３】
【００１７】
これはまた、ＮＯを放出することができ、抗腫瘍剤および抗ウイルス剤として有効であることが証明されている。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】Ｃ６ラット星状細胞腫、Ｌ９２９マウス繊維肉腫、およびＢ１６マウス黒色腫を種々の濃度のＶＧＸ−１０２７またはＧＩＴ２７−ＮＯで２４時間インキュベートした後の細胞生存率を示す図である。
【図２】Ｃ６、Ｂ１６、およびＬ９２９細胞に対しての様々な細胞障害効率ならびにＧＩＴ２７−ＮＯの動態を示す図である。
【図３】ＧＩＴ２７−ＮＯがＣ６およびＢ１６細胞の自食性細胞死を誘発することを示す図である。
【図４】ＧＩＴ２７−ＮＯの細胞障害作用におけるＲＯＳの関与を示す図である。
【図５】ＧＩＴ２７−ＮＯがＭＡＰキナーゼおよびＰＴＫの活性化を特異的に調節することを示す図である。
【００１９】
次に、本発明を次の実験の部でより詳細に例示する。
【００２０】
実験の部
化学的性質
【００２１】
【化４】
【００２２】
この反応は、以下に開示の手順に従って実施した：テトロン酸および誘導体；パートＶＩ。新規な４−オキソ−２−フェニル−２Ｈ−４，６−ジヒドロフロ［３，４−ｄ］トリアゾールおよび４−オキソ−４，６−ジヒドロフロ［３，４−ｃ］フラザン系の簡便な合成。Ｐａｒｉｃｋ Ｐｏｌｌｅｔ、Ｓｕｚａｎｎｅ Ｇｅｌｉｎ。Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、１９７９年、９７７〜９７９頁。
【００２３】
亜硝酸ナトリウム（６．９ｇ、１００ｍｍｏｌ）を、テトロン酸（１０ｇ、１００ｍｍｏｌ）を含む３ＭのＨＣｌ（６０ｍＬ）撹拌溶液に少しずつ添加した。紫色の溶液を室温で１５分間撹拌し、次いで、激しく撹拌しているヒドロキシルアミン塩酸塩（１３．９ｇ、２００ｍｍｏｌ）を含む水溶液（１５０ｍＬ）に滴下した。紫色の呈色は、室温で徐々に退色し、３，４−ビス［ヒドロキシルイミノ］−２−オキソテトラヒドロフラン（９．１１ｇ、６３％）が白色針状晶として沈澱した。
【００２４】
【化５】
【００２５】
この反応は、ＤＥ４４０１１５０Ａ１に開示の手順に従って実施した。
【００２６】
３，４−ビス［ヒドロキシルイミノ］−２−オキソテトラヒドロフラン（５．５ｇ、３８．２ｍｍｏｌ）とＣＨ2Ｃｌ2（６０ｍＬ）とメタノール（２１ｍＬ）との混合物に、Ｐｂ（ＯＡｃ）4（１６．９ｇ、３８．２ｍｍｏｌ）を５〜１０℃で添加した。室温で２時間撹拌した後、トリエチルアミン（５ｍＬ、３８．２ｍｍｏｌ）を添加し、さらに３０分間撹拌した。ＣＨ2Ｃｌ2（１５０ｍＬ）を添加し、混合物を水で洗浄した。ＣＨ2Ｃｌ2抽出物をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣を酢酸イソプロピルと共に撹拌し、ろ過し、ろ液を酢酸イソプロピルから再結晶して、４−ヒドロキシメチル−２−オキシフラザン−３−カルボキシメチルエステル（１ｇ、１５％）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｃ3Ｄ6Ｏ）δ ３．９４（３Ｈ，ｓ）、４．８５（２Ｈ，ｓ）。13Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，Ｃ3Ｄ6Ｏ）δ ５２．６、５６．２、１０７．９、１５６．９、１５７．８。
【００２７】
【化６】
【００２８】
４−ヒドロキシメチル−２−オキシフラザン−３−カルボキシメチルエステル（６１１ｍｇ、３．５１ｍｍｏｌ）を、２Ｍのアンモニアと共にＭｅＯＨ（２５ｍＬ）中に添加した。溶液を室温で２時間撹拌した。反応混合物を真空下で濃縮して、４−ヒドロキシ−２−オキシフラザン−３−カルボン酸アミド（５５１ｍｇ、９８％）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｃ3Ｄ6Ｏ）δ ４．８０（２Ｈ，ｓ）。13Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，Ｃ3Ｄ6Ｏ）δ ５６．１、１１１．３、１５７．１、１５８．８。
【００２９】
【化７】
【００３０】
４−ヒドロキシ−２−オキシフラザン−３−カルボン酸アミド（１７０ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ）、（３−フェニル−４，５−ジヒドロ−イソオキサゾール−５−イル）酢酸（２６２ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（６５ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）を含むＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍＬ）の撹拌溶液を、ＤＣＣ（２６４ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ）。に添加した。室温で２４時間撹拌した後、ジエチルエーテル（５０ｍＬ）を添加し、混合物をセライトでろ過した。ろ液を濃縮し、続いて、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン＝４：１）にかけて、所望のエステル（３５６ｍｇ、９６％）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｃ3Ｄ6Ｏ）δ ２．７８（ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，１Ｈ）、２．９１（ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，１Ｈ）３．３０（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ）、３．６２（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ）、５．１４（ｍ，１Ｈ）、５．４８（ｓ，２Ｈ）、７．４２（ｍ，３Ｈ）、７．６８（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，Ｃ3Ｄ6Ｏ）δ ３９．２、３９．４、５７．１、７７．５、１１０．７、１２６．６、１２８．７、１３０．０、１５４．９、１５５．８、１５６．５、１６９．３。
【００３１】
【化８】
【００３２】
トリフルオロ酢酸無水物（０．３ｍＬ、２．０２ｍｍｏｌ）を、（３−フェニル−４，５−ジヒドロ−イソオキサゾール−５−イル）酢酸−４−カルバモイル−５−オキシフラザン−３−イルメチルエステル（３４８ｍｇ、１．０１ｍｍｏｌ）および乾燥ピリジン（０．１５ｍＬ、２．０２ｍｍｏｌ）を含むＴＨＦ（１０ｍＬ）の氷塩冷却下の撹拌溶液に滴下した。冷却浴を取り去り、撹拌を室温で１時間継続した。反応混合物を水に注ぎ、１０％ＨＣｌ（ａｑ）で酸性化し、ＥｔＯＡｃで抽出した。一緒にした有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、蒸発させて残渣を得、それをフラッシュクロマトグラフィーで精製して、所望のニトリル（２７５ｍｇ、８３％）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ ２．７９（ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，１Ｈ）、２．９３（ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，１Ｈ）、３．１２（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ）、３．５５（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ）、５．１１（ｍ，１Ｈ）、５．２９（ｓ，２Ｈ）、７．３８（ｍ，３Ｈ）、７．５９（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ）。13ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ ３９．２、４０．２、５６．２、７６．２、９６．５、１０５．２、１２６．８、１２８．９、１３０．６、１５２．５、１５６．８、１６９．２。
【００３３】
薬理作用
親化合物とＮＯ共役化合物（Ｉ）の両方の抗腫瘍効果を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのマウス繊維肉腫Ｌ９２９、マウス黒色腫Ｂ１６、およびラット星状細胞腫Ｃ６細胞株において、ならびにＣ５７ＢＬ／６マウスの黒色腫のｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて試験した。
【００３４】
材料および方法
試薬、細胞、および動物
アクリジンオレンジは、Ｌａｂｏ−Ｍｏｄｅｒｎａ（フランス）から得た。カルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステルは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（ユージーン、米国）から得た。ビスチロホスチンは、ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（アーヴィン、カリフォルニア州）から得た。実験で使用する他のすべての化学薬品は、Ｓｉｇｍａ（セントルイス、米国）から購入した。ＧＩＴ２７−ＮＯは、２．５％ＤＭＳＯを含むＨ2Ｏ中において５μｇ／ｍｌの濃度で＋４℃で保存し、使用直前に培地で希釈した。対照細胞培養物は、実験で使用するＧＩＴ２７−ＮＯの濃度が最も高い溶液と同量のＤＭＳＯを含有した。
【００３５】
ラットグリオーマ細胞株Ｃ６は、Ｄｒ．Ｐｅｄｒｏ Ｔｒａｎｑｕｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ ｄｅ Ｃａｓｔｉｌｌａ−Ｌａ Ｍａｎｃｈａ、アルベセテ、スペイン）からの寛大な寄贈品であり、ネズミメラノーマＢ１６細胞株は、Ｄｒ．Ｓｉｎｉｓａ Ｒａｄｕｌｏｖｉｃ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｅｒｂｉａ、ベオグラード、セルビア）からの寛大な寄贈品であり、マウス繊維肉腫Ｌ９２９は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ソールズベリー、英国）から得た。細胞は、５％ＦＣＳ、２ｍＭのグルタミン、０．０１％ピルビン酸ナトリウム、５×１０-5Ｍの２−メルカプトエタノール、および抗生物質（培地）を補充したＨＥＰＥＳ緩衝ＲＰＭＩ１６４０培地中で５％ＣＯの加湿雰囲気下において３７℃で増殖させた。従来のトリプシン処理後、細胞を、１０4細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに、２×１０5細胞／ウェルの濃度で６ウェルプレートに、または３×１０4細胞／ウェルで４ウェルチャンバースライドに播種し、一晩培養し、次いで試験化合物に曝露した。
【００３６】
近交系Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ「Ｓｉｎｉｓａ Ｓｔａｎｋｏｖｉｃ」（ベオグラード、セルビア）の本発明者らの施設からのものであり、標準的な実験室条件（非特定病原体除去）下で食物および水に自由に近づける状態にしておいた。動物の取り扱いおよび試験プロトコルは、国際的なガイドラインに従い、現地の研究機関の動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。
【００３７】
ＭＴＴ、ＣＶ、およびＣＦＳＥ染色
平底９６ウェルプレートに細胞を播種（１０4細胞／ウェル）し、培地の最終体積を２００μｌにし、一晩インキュベートし、次いで、種々の濃度の試験化合物で処理した。２４時間のインキュベーション後、細胞生存率を、すでに記載されているように（Ｍｉｊａｔｏｖｉｃら、ＣＭＬＳ、２００４年）、３−４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）からホルマザンへのミトコンドリア依存性還元に基づくＭＴＴ試験を使用するか、または付着細胞のクリスタルバイオレット（ＣＶ）染色によって評価した。結果は、未処理培養物で得られた対照値の％として示す。細胞増殖の速度はまた、ＣＦＳＥで標識した細胞のフローサイトメトリー分析を使用して決定した（Ｋａｎｇ、２００５年）。細胞を脱離し、１．５μＭのＣＦＳＥを添加し、３７℃で１５分間静置し、次いで２回洗浄し、２×１０5で６ウェルプレートに播種した。細胞を化合物で２４時間および４８時間処理し、トリプシン処理し、２回洗浄した。最後に、細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。４８８ｎｍの励起光で照射された細胞からの緑色蛍光発光をＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ、ハイデンベルグ、ドイツ）を用いて測定し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用して分析した。
【００３８】
細胞死の決定
壊死性細胞死のマーカーとして、ピルビン酸塩の存在下で２，４−ジニトロフェニルヒドラジンから可視のヒドラゾン沈澱物への転換を媒介する細胞内酵素ＬＤＨの放出を測定した。すでに記載されているように（Ｄｅｃｋｅｒら）、上記の通りに細胞を平底９６ウェルプレートに播種し、２４時間のインキュベーション後にアッセイを行った。死細胞のパーセンテージは、次式を使用して決定した：［（Ｅ−Ｃ）／（Ｔ−Ｃ）］×１００、式中、Ｅは、４９２ｎｍで測定された処理培養物の実験吸光度であり、Ｃは、対照未処理細胞の上澄み液の吸光度であり、Ｔは、トリトン溶解細胞の最大（１００％）ＬＤＨ放出に対応する吸光度である。文献（Ｍｉｊａｔｏｖｉｃ、ＣＭＬＳ、２００５年）に記載のように、細胞周期分析およびアポトーシス検出を正確に行った。酸性小胞の細胞小器官は、自食作用を特徴とし、生体染色色素アクリジンオレンジによって染色される。赤色蛍光の強度は細胞小器官の酸性度および体積に比例し、一方、細胞質および核小体は鮮緑色および暗赤色を発光する（Ｋａｎｚａｗａ、２００４年）。自食作用の検出に関しては、先に記載されているように細胞を６ウェルプレートで培養し、脱離し、１μｇ／ｍｌのアクリジンオレンジで室温にて１５分間染色した。インキュベーション期間の最後に、細胞を洗浄し、最後にＰＢＳ中に再懸濁させた。青色（４８８ｎｍ）励起光で照射された１０4細胞からの緑色（５１０〜５３０ｎｍ）および赤色（＞６５０ｎｍ）蛍光発光は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いて測定し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用して分析した。
【００３９】
ＲＯＳおよび亜硝酸塩蓄積の測定
６ウェルプレート中で増殖させた細胞を、試験化合物で処理する前に、１μＭのジヒドロローダミン１２３（ＤＨＲ）で２０分間染色した。培養期間の最後に、細胞を脱離し、洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁させた。ＲＯＳ放出の分析は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いて行い、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏソフトウェアを使用して分析した（Ｋａｌｕｄｊｅｒｏｖｉｃ、２００５年）。
【００４０】
すでに記載されているように（Ｍｉｊａｔｏｖｉｃら、ＣＭＬＳ、２００４年）、亜硝酸塩蓄積は、グリース反応によって測定した。
【００４１】
細胞ベースＥＬＩＳＡ
ＭＡＰキナーゼ（ｐ３８ＭＡＰＫ、細胞外シグナル制御キナーゼ−ＥＲＫ、およびＪｕｎ−Ｎ末端キナーゼ−ＪＮＫ）または核内因子−κＢ（ＮＦ−κＢ）の活性化は、Ｖｅｒｓｔｅｅｇらによる細胞ベースＥＬＩＳＡ（Ｖｅｒｓｔｅｅｇ、２０００年）をわずかに修正した方法によって決定した。本発明者らは、リン酸化形態にしたＭＡＰキナーゼ（ｐ−ｐ３８、ｐ−ＥＲＫ、およびｐ−ＪＮＫ）およびＩκＢ（ｐ−ＩκＢ）に特異的な抗体を使用した。と言うのは、ＭＡＰキナーゼはリン酸化によって活性化され、抑制性サブユニットＩκＢのリン酸化はＮＦ−κＢ活性化に必要なステップだからである。９６ウェル平底プレートにおいて０．５％ＦＣＳを含む培地で細胞を一晩増殖させ、次いで、従来の培地で希釈した試験化合物によって処理した。処理期間の最後に、細胞を４％パラホルムアルデヒドに固定し、内因性ペルオキシダーゼを１％Ｈ2Ｏ2を含む０．１％トリトンＸ−１００含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で失活させ、抗体の非特異的結合を１０％ＦＣＳ含有ＰＢＳＴ溶液で阻止した。ラット／マウスｐ−ＥＲＫ、ｐ−ｐ３８、ｐ−ＪＮＫ、ｐ−ＩκＢに特異的な一次マウスモノクローナル抗体（１：２００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからすべて入手、サンタクルーズ、カリフォルニア州）を、２％ウシ血清アルブミンを補充したＰＢＳＴ（ＰＢＳＴＢ）に加え、続いて、抗ｐ−ＥＲＫ、抗ｐ−ＪＮＫ、および抗ｐ−ＩκＢには二次ペルオキシダーゼ標識（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＰＢＳＴＢ中で１：２５００；ＵＳＢ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、クリーヴランド、オハイオ州）を、または抗ｐ−ｐ３８の検出には抗マウスＩｇＭ（１：４０００；ＵＳＢ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を加えた。抗体とのインキュベーションを３７℃で１時間実施した。ペルオキシダーゼ基質ＴＭＢと共にインキュベートし、続いて０．１ＭのＨＣｌを添加してから１５分後、４５０ｎｍの吸光度を自動マイクロプレートリーダーで測定した。処理と対照との間の比較を可能にするために、得られた吸光度は、オリジナルプロトコルに記載される、クリスタルバイオレット染色によって決定された細胞数に関して補正した。結果は、任意に１に設定した対照値と比較する相対表示として示す。
【００４２】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける黒色腫の誘発およびＧＩＴ２７−ＮＯでの処置
同系Ｃ５７ＢＬ／６マウスの背部右側の腰仙部にＢ１６黒色腫細胞２×１０5を皮下（ｓ．ｃ）注射して、原発腫瘍を誘発させた。腫瘍増殖は毎日観察され、ＧＩＴ２７−ＮＯでの処置は、最初の腫瘍が触知できた日（１０日）から開始した。ＧＩＴ２７−ＮＯは、処置直前に準備し、０．５ｍｇ／マウスの用量で１４日間連続してｉ．ｐ．（腹腔内）投与した。３０日まで動物を観察し、次いで屠殺し、各マウスからの個々の腫瘍を三次元測定して腫瘍増殖を決定した。腫瘍体積は、次式を使用して計算した：［０．５２×ａ×ｂ2］、式中、ａは、最長の直径であり、ｂは、最短の直径である（Ｓｍａｇｕｒら）。
【００４３】
ＮＭＲＩマウスにおけるコンカナバリン（ＣｏｎＡ）注射によって誘発された肝炎およびＧｉｔ２７−ＮＯを用いた処置
ＣｏｎＡ誘発肝炎は、ＣｏｎＡの単回静脈内注射によってマウス中に誘発することができるヒトの肝疾患の様々な免疫炎症状態に類似した細胞媒介性免疫炎症状態である。この疾患は、ＣｏｎＡ投与（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）後短時間（８〜２４時間）での血漿のトランスアミナーゼレベルの有意な上昇、ならびに好中球、マクロファージ、およびＴ細胞の肝臓への同時浸潤、それに続く肝細胞のアポトーシスおよび壊死を特徴とする。
【００４４】
肝炎は、６〜９週の米国海軍医学調査研究所（Ｎａｖａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＮＭＲＩ）の雄のマウスの尾静脈へのＣｏｎＡ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、セントルイス、ミズーリ州）注射によって誘発した。４グループのマウスをＣｏｎＡ投与の２４時間および１時間前にＧｉｔ２７−ＮＯで処置、すなわち、Ｇｉｔ２７−ＮＯを、または媒体と共に、０．５および１ｍｇ／マウスの用量でｉ．ｐ．投与、または５ｍｇ／マウスの用量でｐ．ｏ．（経口）投与した。ＣｏｎＡ注射の８時間後に血液採集のために動物を屠殺し、血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性を、二色（ｂｉｃｈｒｏｍａｔｉｃ）分析装置を使用して、標準光度アッセイによって決定した。
【００４５】
統計分析
結果は、別段の指示がない限り、類似の結果を示す少なくとも３つの実験を代表する実験の３点の観測値（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ）の平均値±ＳＤとして示す。様々な処置間の差の有意性は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＧＩＴ２７−ＮＯ効果を評価するための分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いてスチューデント−ニューマン−クールズ検定またはマン−ホイットニーＵ検定によって評価した。０．０５未満のｐ値は、有意であると考えた。
【００４６】
結果
ＧＩＴ２７−ＮＯ対ＶＧＸ−１０２７の抗腫瘍活性の評価
ＶＧＸ−１０２７およびＧＩＴ２７−ＮＯの抗腫瘍効果を評価するために、本発明者らは、３種の悪性細胞株、Ｃ６ラット星状細胞腫、Ｌ９２９マウス繊維肉腫、およびＢ１６マウス黒色腫を種々の濃度の薬剤と共に２４時間インキュベートし、次いで、細胞生存率をＭＴＴおよびＣＶ試験によって決定した。図１Ａに示すように、親化合物ＶＧＸ−１０２７は、腫瘍細胞の生存率に影響を及ぼさなかった。一方、３種の細胞株すべてを同じ濃度範囲のＧＩＴ２７−ＮＯで処理（図１Ｂ）すると、ミトコンドリア呼吸の用量依存的減少が引き起こされた。効果は、ＣＶによって推定される細胞数の減少に関して評価した（図１Ｃ）。したがって、不活性なＶＧＸ−１０２７の化学修飾が強力な殺腫瘍活性を有する新規化合物をもたらしたことは明白であった。これを考慮し、本発明者らは、更なる調査からＶＧＸ−１０２７を除外した。化合物（Ｉ）の抗腫瘍効果とそのＮＯ放出能との関係を評価するために、本発明者らは、細胞培養物の上澄み液中の亜硝酸塩の蓄積を培地だけの場合のその量と比較した。図１Ｄに示すように、ＧＩＴ２７−ＮＯは細胞がない状態ではＮＯを放出せず、亜硝酸塩を形成しないが、細胞の処理後は、有意量の亜硝酸塩が観察された。これらのデータは、従来の外因性ＮＯドナーと異なり、ＧＩＴ２７−ＮＯがＮＯの自発的な放出ができないことを示唆している。細胞生存率の下方調節を媒介するＧＩＴ２７−ＮＯにおけるＮＯの役割を調査するために、本発明者らは、ＮＯスカベンジャーヘモグロビンと同時に腫瘍細胞を培養した。こうした条件においてＧＩＴ２７−ＮＯで処理された細胞の生存率はほぼ完全に回復し、これによって薬物媒介性細胞毒性におけるＮＯの重要性が示された（図１Ｅ）。この現象はさらに、光学顕微鏡によって視覚化された（図１Ｆ）。
【００４７】
ＧＩＴ２７−ＮＯは異なるタイプの細胞死を誘発する
化合物（Ｉ）の抗増殖効果を決定するために、本発明者らは、ＧＩＴ２７−ＮＯを含むまたは含まない状態での２４時間培養中のＣＦＳＥ染色細胞のフローサイトメトリー分析を行った。ＧＩＴ２７−ＮＯでの処理後に生存しているＬ９２９およびＢ１６細胞の数が有意に減少したにもかかわらず（図１ＢおよびＣ）、これらの細胞は未処理対照細胞とほぼ同じ頻度で分裂しており（表１）、これによって増殖の阻害が観察された抗腫瘍効果の原因ではないことが示された。同時に、ＧＩＴ２７−ＮＯでの処理はＣ６細胞の増殖に影響を及ぼし（表１）、これによって生細胞の減少がこの細胞株に対する薬剤の細胞増殖阻害効果によって少なくとも部分的に媒介されていることが示唆された。続いて、本発明者らは、細胞をＧＩＴ２７−ＮＯで処理したときの様々なタイプの細胞死の存在を分析した。壊死は、死につつある細胞の乱された浸透性に基づいてＬＤＨ放出アッセイによって決定した。（図２ＡおよびＢ）に示すように、ＧＩＴ２７−ＮＯ処理は、試験した３種の細胞株すべてにおいてＬＤＨ放出を誘発した。ＬＤＨ放出は、用量依存的（図２Ａ）でも時間依存的（図２Ｂ）でもあった。しかし、有意量のＬＤＨが、初期の時点ではなく薬剤と共に培養した１８時間後に検出可能となり、これによって観察された効果が一次の壊死性細胞死ではなくアポトーシスの末期（二次的壊死）に起因する可能性があることが示唆された。化合物（Ｉ）と共に培養した２４時間後に行った細胞ＤＮＡ含量の分析から、Ｌ９２９培養物の低二倍体細胞（ＰＩ染色細胞のサブＧコンパートメント）の割合が有意に増加したことが明らかとなった（図２Ｃ）。一方、ＧＩＴ２７−ＮＯの存在下でインキュベートした後のサブＧコンパートメントにおけるＣ６およびＢ１６細胞のパーセンテージは、Ｌ９２９培養物中よりも低く（１０％未満）、これによって薬物媒介性細胞毒性における他のタイプの細胞死の重要性が示された（図２Ｃ）。さらに、Ｇ０／Ｇ１期での細胞周期停止が、ＧＩＴ−２７ＮＯで処理されたＣ６細胞に観察された（図２Ｃ）。したがって、凝縮したクロマチンおよび収縮した核を有する細胞が薬物曝露培養物中に目視され、これによってＢ１６およびＣ６細胞とは対照的にＬ９２９培養物でのアポトーシス性細胞死の広がりが確認された（図２Ｄ）。したがって、本発明者らは、ＧＩＴ２７−ＮＯで処理した後のＣ６およびＢ１６細胞において自食性細胞死として知られる別の様式の細胞死を分析した。自食作用に特有な酸性オートファゴソームの発生を確認するために、本発明者らは、アクリジンオレンジで染色された細胞のフローサイトメトリー分析を行った。図３Ａ〜Ｃに示すように、両方の細胞株において、ＧＩＴ２７−ＮＯは、酸性小胞の発生を示す鮮赤色蛍光の強度を有意に増大させた。化合物（Ｉ）に曝露された細胞の生存率低下における自食性細胞死の関連性を調査するために、本発明者らは、周知の自食作用の阻害剤バフィロマイシンＡ（Ｂａｆ）および３−メチルアデニン（３−ＭＡ）と同時に細胞を処理した。３−ＭＡは、ＰＩ−３キナーゼの阻害によって自食性分解（ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）を阻害し、Ｂａｆ、液胞型Ｈ+−ＡＴＰアーゼ阻害剤は、オートファゴソームとリソソームとの融合を阻止した（Ｋａｎｚａｗａ、２００４年）。ＭＴＴアッセイで判断されるように、ＧＩＴ２７−ＮＯで処理された細胞の生存率は、試験した両方の自食作用阻害剤の存在下で回復され、それによってＣ６およびＢ１６細胞へのＧＩＴ２７−ＮＯ細胞毒性における自食性細胞死の寄与が確認された（図３Ｅ）。光学顕微鏡によって、３−ＭＡの存在下で回復したＣ６細胞の生存率が確認された（図３Ｆ）。総合的に考えると、これらの結果は、様々な癌細胞において様々なタイプの細胞死を誘発する能力が、ＧＩＴ２７−ＮＯの特性に基づくものではなく、細胞型の固有の特異性に基づくものであることを示唆している。
【００４８】
【表１】
【００４９】
ＧＩＴ２７−ＮＯの細胞毒性はＲＯＳ発生に依存する
酸化ストレスが細胞死を引き起こすことは周知である。したがって、本発明者らは、観察されたＧＩＴ２７−ＮＯの細胞障害作用における酸化ストレスの役割を調査した。対照細胞と比べて、ＲＯＳの細胞内産生は、細胞内ＤＨＲ蛍光によって推定されるように、ＧＩＴ２７−ＮＯで細胞を処理した後に著しく増加した（図４Ａ〜Ｃ）。スカベンジャーＮＡＣによってＲＯＳを無効化すると、ＧＩＴ２７−ＮＯで処理された細胞の生存率が回復されて、ＲＯＳの放出が薬剤の殺腫瘍性作用の少なくとも部分的な原因であることが示された（図４Ｄ）。
【００５０】
ＧＩＴ２７−ＮＯは、Ｃ６、Ｂ１６、およびＬ９２９腫瘍細胞におけるＭＡＰキナーゼ経路を差次的に調節する
マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼは、生存、増殖、および死に含まれる、細胞外シグナルから重要な細胞内シグナルへの転換に不可欠なセリンスレオニンキナーゼのファミリーである（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ、２００１年、Ｗａｄａ、２００４年、Ａｒｂａｂｉ、２００２年）。したがって、本発明者らは、これらのシグナル伝達経路の活性化に対するＧＩＴ２７−ＮＯの影響を分析した。細胞ベースＥＬＩＳＡによって決定されるように、様々なシグナル伝達分子は、様々な細胞株での標的である。Ｃ６細胞では、ＧＩＴ２７−ＮＯは、ＥＲＫ１／２およびＪＮＫの永続的な活性化を誘発した（図５Ａ）。一方、Ｂ１６細胞の培養物において異なるパターンが観察された。ＧＩＴ２７−ＮＯはＢ１６細胞のＥＲＫ１／２の活性化に影響を及ぼさなかったが、ＪＮＫの時間依存性の有意な活性化およびｐ３８のほんのわずかな活性化が観察された（図５Ｂ）。最後に、Ｌ９２９をＧＩＴ２７−ＮＯで処理すると、ＪＮＫの発現に影響を及ぼすことなく、ＥＲＫ１／２の著しい持続的活性化およびｐ３８の有意な一時的活性化がもたらされた（図５Ｃ）。細胞生存率の減少におけるＭＡＰキナーゼ活性化の生物学的意義を評価するために、本発明者らは、これらの分子の既知の薬理学的阻害剤：ＥＲＫ活性化にはＰＤ９８０５９、ＪＮＫ活性化にはＳＰ６００１２５、およびｐ３８活性化にはＳＢ２０２１９０を使用した。ＧＩＴ２７−ＮＯと共にインキュベートする前に、これらの阻害剤の各々で当該細胞を３０分間パルスし、培養２４時間後にＭＴＴによって生存率を推定した。Ｃ６細胞を特異的なＥＲＫおよびＪＮＫ阻害剤で（図５Ｄ）、Ｂ１６細胞をＪＮＫ阻害剤で（図５Ｅ）、Ｌ９２９細胞をＥＲＫおよびｐ３８阻害剤（図５Ｆ）で処理すると、腫瘍細胞株の生存が有意に改善され、これによって薬物媒介性細胞毒性におけるこれらの分子の役割が確認された。したがって、データは、ＧＩＴ２７−ＮＯのシグナル伝達カスケードにおいて様々な分子を誘発する能力が、主に細胞型によって決定されることを示唆している。上流のシグナル伝達分子の影響を調査するために、本発明者らは、ＧＩＴ２７−ＮＯと同時に、タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）阻害剤、チロホスチンを用いて細胞を処理した。図５Ｇに示すように、ＰＴＫの阻害は試験した細胞株すべての生存率をほぼ完全に回復させ、これによって薬物作用の標的位置が同じであることが示された。光学顕微鏡によって、ＧＩＴ２７−ＮＯで処理されたＣ６細胞に対するチロホスチンの効果を視覚化した（図５Ｈ）。
【００５１】
ＧＩＴ２７−ＮＯは、Ｂ１６黒色腫を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスの腫瘍増殖を阻害する
本発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＧＩＴ２７−ＮＯの細胞毒性特性を実証した後、Ｂ１６黒色腫担持マウスにおけるそのｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍特性を評価した。表２に例示するように、ＧＩＴ２７−ＮＯによる短期処置（０．５ｍｇ／マウス／日を１０日間）は、最初の腫瘍が触知できた腫瘍移植１０日後に開始し、未処置対照動物に比べて腫瘍増殖の有意な低下を伴った。ＧＩＴ２７−ＮＯの投与を中断した後でも効果は安定していた。対照群では２匹の動物だけが死亡したが、ＧＩＴ２７−ＮＯで処置した動物はすべて、３０日間の追跡期間生存した（図示せず）。総合的に考えると、Ｂ１６黒色腫細胞へのＧＩＴ２７−ＮＯの細胞毒性特性は、そのｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果に関連している。
【００５２】
【表２】
【００５３】
ＧＩＴ２７−ＮＯは、ＣｏｎＡ誘発肝炎におけるＡＬＴグルコース血中濃度を低下させる
Ｇｉｔ２７−ＮＯによる予防的処置は、試験した用量すべてにおいて、媒体処置のマウスと比べてＡＬＴグルコース血中濃度を有意に低下させた。
【００５４】
【表３】
【００５５】
考察
この試験は、ＶＧＸ−１０２７の化学修飾によって、強力な殺腫瘍能を有する新規なＮＯ供与化合物が得られることを示すものである。３種の異なる細胞株、Ｌ９２９マウス繊維肉腫、Ｃ６ラット星状細胞腫、およびＢ１６黒色腫を修飾済み物質ＧＩＴ２７−ＮＯで処理すると、それらの生存率が劇的に低減された。対照的に、親化合物ＶＧＸ−１０２７は、ＧＩＴ２７−ＮＯと同じまたはより高い（データ不掲載）濃度範囲において腫瘍細胞増殖に影響を及ぼさなかった。ＧＩＴ２７−ＮＯの抗腫瘍効果は、その細胞増殖阻害効果によって媒介されるのではなく、むしろ細胞死誘導をまねく細胞内現象のカスケードを引き起こす能力に基づくものである。しかし、ＧＩＴ２７−ＮＯがＧ０／Ｇ１期での細胞分裂の停止を引き起こしたので、Ｃ６細胞株は例外となった。多数の証拠から、ＮＯが共有結合して修飾した抗炎症性非ステロイド薬の強力な抗悪性腫瘍特性が明らかとなった（Ｒｉｇａｓ、２００４年）。例えば、ヒトの膀胱、前立腺、結腸癌、およびジャーカット白血病細胞の有意な増殖低下は、様々なＮＯ−ＮＳＡＩＤでの処置時に観察された（Ｋａｓｈｆｉら、２００３年、Ｙｅｈ、２００４年、Ｈｕｇｕｅｎｉｎ、２００５年、Ｈｕｇｕｅｎｉｎ、２００４年、Ｈｕｇｕｅｎｉｎ、２００４年、Ｇａｏ、２００５年、Ｎａｔｈ、２００４年、Ｓｐｉｅｇｅｌ、２００５年）。本発明者らは、細胞の生存率の減少が、壊死性細胞死の典型的な特徴と見なされるＬＤＨの放出に付随するものであることを観察した。しかし、薬剤存在下での１８時間のインキュベーション後に壊死が観察され、これによってＬＤＨ放出が一次の壊死ではなく二次のアポトーシスに主として起因する可能性があることが示唆された。抗癌剤作用において最もよく起こる機序は、アポトーシスの誘導である（Ｆｅｒｒｅｉｒａ、２００２年）。腫瘍細胞がアポトーシス性細胞死に対して耐性があるという多くの証拠がある（Ｋｉｍ、２００５年）。この現象は、抗アポトーシス特性を有するシグナル伝達分子の過剰発現によって説明することができよう（Ｇａｂｒｉｅｌ、２００３年）。ＧＩＴ２７−ＮＯの非常に興味深い特徴は、殺腫瘍の機序を細胞特異性に適応させる能力である。Ｌ９２９細胞株は、中胚葉由来のものであり、主としてアポトーシスによって死滅した。したがって、ＮＯ−アスピリンは結腸癌細胞のアポトーシスを誘発することができ、一方、別の薬剤、ＮＯ−スリンダクは、膀胱および前立腺癌のアポトーシス性死に関与することが報告された（Ｇａｏ、２００５年、Ｈｕｇｕｅｎｉｎｇ、２００４年）。Ｌ９２９細胞とは対照的に、ＧＩＴ２７−ＮＯで処理されたＣ６およびＢ１６細胞中にほんの少量の低二倍体細胞が検出された。一方、ＧＩＴ２７−ＮＯは、Ｃ６およびＢ１６細胞株の培養物中で自食作用を誘発した。最近、放射線、およびタモキシフェン、アロエエモジン、三酸化ヒ素などの抗癌剤の作用様式としての自食作用の誘導が報告された（Ｍｉｊａｔｏｖｉｃ、２００５年、Ｋａｎｚａｗａ、２００４年、Ｂｉｌｉｒ、Ｐａｇｌｉｎ、Ｇｏｒｋａ、２００３年）。細胞を特異的阻害剤３−ＭＡおよびバフィロマイシンＡで処理すると、細胞生存率が回復され、これによって本発明者らの条件下では自食作用は救済（ｓａｌｖａｇｉｎｇ）機序ではなく破壊機序として働くことが確認されている。細胞が既知のＰＩ−３Ｋ阻害剤３−ＭＡによってＧＩＴ２７−ＮＯ誘発毒性から効率的に救出されたことにより、この経路の重要性が指摘された。これは今後の研究の対象となろう。アポトーシス性細胞死と自食性細胞死との間の相互作用は、十分立証されている。これらの２タイプの細胞死は細胞中で共存し、状況に応じて、両者は互いを誘因または阻害することができよう（Ｋｉｍ、２００６年）。しかし、アロエエモジンはアポトーシス誘発剤と考えられているが、本発明者らは、この薬剤がグリオーマ細胞株では自食性細胞死の誘発によって優先的に作用することを見出した（Ｐｅｃｅｒｅ、２０００年、ＣＭＬＳ、２００５年）。興味深いことに、ＧＩＴ２７−ＮＯは、外因性ドナーのようにＮＯを自発的に放出することはできないが、細胞の存在下では有意量の亜硝酸塩を検出することができた。したがって、ＮＯ放出に関して、ＧＩＴ２７−ＮＯが細胞との接触を必要とすることは明白である。さらに、ＮＯスカベンジャーヘモグロビンはこの化合物の効果をほぼ完全に無効にし、これによって腫瘍増殖の抑制におけるＮＯの重大な役割が確認された。ＮＯが、遊離のアミノ酸、ペプチド、もしくはタンパク質のチオール基への強力な親和性、電子供与性、および／または新規なフリーラジカルを形成する能力を有する高反応性種であることは周知である（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ、２００１年）。ＲＯＳおよびＲＮＳがアポトーシス性および自食性細胞死を媒介することは以前示された（Ｌｉ、２００５年、Ｋａｎｚａｗａ、２００４年、Ｅｒｄａｌ、２００５年）。ＶＧＸ−１０２７で細胞を処理してもＲＯＳは放出されないが（データ不掲載）、ＧＩＴ２７−ＮＯの存在下では有意量のＲＯＳが測定された。ＤＨＲはまたペルオキシ亜硝酸塩も検出し、これはＯ2-とＮＯとの反応生成物であり、実際に最も反応性のある破壊分子（ｄｅｓｔｒｏｙｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の１つである（Ｌｅｃｈｎｅｒ ２００５年、Ｌｉ ２００５年）。ＮＯ放出が反応性ラジカルの産生を引き起こし、結果として細胞生存率の低下をまねいたことは明白であり、これは抗酸化剤ＮＡＣでの処置によってさらに確認された。本発明者らの研究と一致して、Ｇａｏらは、ＮＯ供与アスピリンが酸化ストレスの誘発によってヒト結腸癌細胞でアポトーシスを誘発したことを示した（Ｇａｏ、ＰＮＡＳ）。さらに、ＮＯが、酵素および転写因子の活性を劇的に調節し、その結果、増殖、分化、および細胞死過程の調節に含まれる細胞シグナル伝達経路を変えることは周知である（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ、２００１年）。ＮＯ供与アスピリンの抗腫瘍効果は、ＭＡＰキナーゼの活性化によって媒介される（Ｈｕｎｄｌｅｙ、２００５年）。ＮＯ供与薬が結腸癌細胞中のＪＮＫおよびｐ３８を活性化し、その結果ＡＰ−１複合体の活性化が導かれたが、特異的阻害剤によるこれらのキナーゼの阻害が薬剤の細胞障害効果を部分的に阻止したことがこれらの著者らにより報告された。ＧＩＴ２７−ＮＯは、細胞型に応じてＭＡＰキナーゼファミリーのメンバーの活性を特異的に変更した。Ｌ９２９細胞では、ＧＩＴ２７−ＮＯが、ＥＲＫ１／２の強力な時間依存的上方調節、続いてｐ−３８の一過性上方調節を誘発したが、Ｂ１６細胞を同じ薬剤で処理すると、ＪＮＫの強力なリン酸化およびｐ３８のほんのわずかな増加がもたらされた。Ｃ６グリオーマ細胞は処理中にＪＮＫおよびＥＲＫを同時に上方調節したが、ｐ３８の活性は影響を受けなかった。ＧＩＴ２７−ＮＯに対する細胞応答の変化が細胞死の機序に関係するという仮説が成り立つ。シスプラチンによって誘発されるＬ９２９細胞でのＥＲＫ１／２の強力な活性化が細胞をアポトーシスヘ導き、その抑制が薬剤の抗腫瘍能を無効にすることは周知である。したがって、ＧＩＴ２７−ＮＯでの処理時に上方調節したＥＲＫ１／２がＬ９２９細胞の優先的なアポトーシスの原因と思われる。これは、試験した３種の細胞株すべてにおいてＰＴＫ阻害が薬剤の細胞毒性を打ち消したと述べるに値する。これは、薬物作用が最初は同じであり、各細胞株中の異なるシグナル伝達経路の活性化から差が生じ得ることを証明した。本発明者らは、ＮＯ−ＮＳＡＩＤが癌を含むいくつかの障害のための非常に有望なクラスの薬剤であることをすでに述べている（Ｒｉｇｇｓ、２００４年、概説）。ＮＯ−ＮＳＡＩＤは、Ｍｉｎマウス、結腸癌のラットモデルでの腸の発癌、さらにハムスター腫瘍モデルでの膵臓癌を阻止した（Ｏｕａｎｇ、Ｂａｋ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｒａｏ）。注目すべきことは、ＧＩＴ２７−ＮＯが、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでのＢ１６黒色腫の増殖を有意に抑制したことである。親化合物の機能変換により、ＮＯが主に媒介する強力な殺腫瘍性が決定された。各タイプの処理済み細胞に対する作用機序の適応性は、他の化学療法と比べて有利である。本発明者らの結果は、化合物（Ｉ）の可能な治療用途のさらなる研究の開始点となろう。
【００５６】
図の説明
図１。ＧＩＴ２７−ＮＯは、ＮＯ放出によって腫瘍細胞の生存率を下方調節させる。Ｂ１６黒色腫、Ｌ９２９繊維肉腫、およびＣ６星状細胞腫の細胞（１×１０4／ウェル）を、様々な濃度のＶＧＸ−１０２７またはＧＩＴ２７−ＮＯで処理した。２４時間の培養後、細胞生存率を、ＭＴＴ（Ａ、Ｂ）およびＣＶ試験（Ｃ）によって決定した。培地での亜硝酸塩の蓄積（Ｄ）は、ＧＩＴ２７−ＮＯの存在下でＣ６細胞を２４時間処理した後に、または細胞を含まないＧＩＴ２７−ＮＯの示した希釈液において検出した。２４時間のインキュベーション後、ＧＩＴ２７−ＮＯ（２５ｍｇ／ｍｌ）と同時にヘモグロビン（１２．５μＭ）で２４時間処理したＣ６細胞のＭＴＴアッセイ（Ｅ）および光学顕微鏡分析（Ｆ）を行った。データは、独立した３つの実験の代表からの平均値±ＳＤとして示す。*ｐ＜０．０５は、未処理培養物を指す。
【００５７】
図２。Ｃ６、Ｂ１６、およびＬ９２９細胞に対しての様々な細胞障害効率ならびにＧＩＴ２７−ＮＯの動態。（Ａ）細胞を様々な用量のＧＩＴ２７−ＮＯと共に２４時間インキュベートし、あるいは（Ｂ）では動態学的評価のために２５μｇ／ｍｌのＧＩＴ２７−ＮＯと共に２４時間インキュベートし、ＬＤＨ放出アッセイを行った（*ｐ＜０．０５）。（Ｃ）細胞を２５μｇ／ｍｌのＧＩＴ２７−ＮＯと共に２４時間インキュベートした後にＰＩで染色し、細胞周期をフローサイトメトリーによって分析した。（Ｄ）細胞を２５μｇ／ｍｌのＧＩＴ２７−ＮＯで２４時間処理し、ＰＩ染色後にアポトーシス（矢印）の核形態特性を蛍光顕微鏡法によって調査した。
【００５８】
図３。ＧＩＴ２７−ＮＯは、Ｃ６およびＢ１６細胞の自食性細胞死を誘発する。（Ａ〜Ｄ）ＧＩＴ２７−ＮＯなしでまたはＧＩＴ２７−ＮＯ（２５μｇ／ｍｌ）と共に２４時間培養した後、Ｃ６およびＢ１６細胞をアクリジンオレンジで染色し、橙赤色の酸性自食小胞の存在に関してフローサイトメトリーによって分析した。（Ｅ）示すように、細胞を、何もなしで、またはＧＩＴ２７−ＮＯ（２５μｇ／ｍｌ）、３−ＭＡ（１ｍｇ／ｍｌ）、および／もしくはＢａｆ（０．５μＭ）と共に２４時間インキュベートし、ＭＴＴアッセイを行った。*ｐ＜０．０５は、適切な対照を指す。（Ｆ）何もなしで（対照）、またはＧＩＴ２７−ＮＯ（２５μｇ／ｍｌ）および／もしくは３−ＭＡ（１ｍｇ／ｍｌ）と共に２４時間インキュベートしたＣ６細胞の光顕微鏡写真図。
【００５９】
図４。ＧＩＴ２７−ＮＯの細胞障害作用におけるＲＯＳの関与。（Ａ〜Ｃ）細胞を、ＧＩＴ２７−ＮＯ（２５μｇ／ｍｌ）がない状態（対照）またはある状態でインキュベートし、２４時間後にＲＯＳの産生をＤＨＲ蛍光のフローサイトメトリーによって検出した。（Ｄ）抗酸化剤ＮＡＣ（２．５μＭ）がある状態またはない状態でＧＩＴ２７−ＮＯなしでまたはＧＩＴ２７−ＮＯ（２５μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした細胞の生存率を、２４時間後にＭＴＴアッセイによって決定した。*ｐ＜０．０５は、適切な対照を指す。
【００６０】
図５。ＧＩＴ２７−ＮＯは、ＭＡＰキナーゼおよびＰＴＫの活性化を特異的に調節する。（Ａ〜Ｃ）細胞を２５μｇ／ｍｌのＧＩＴ２７−ＮＯと共にインキュベートし、示した時点でのＪＮＫ、ＥＲＫ、およびｐ３８ＭＡＰＫの活性化を細胞ベースＥＬＩＳＡによって評価した。データは、０時点での未処理対照培養物（*ｐ＜０．０５）で得られた値に対する倍率（ｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ）として示す。（Ｄ〜Ｇ）細胞を、特異的阻害剤ＰＤ９８０５９（ＰＤ、５０μＭ）、ＳＰ６００１２５（ＳＰ、０．７５μＭ）、ＳＢ２０２１９０（ＳＢ、２０μＭ）、またはチロホスチン（Ｔｙｒ、５μＭ）がある状態またはない状態で、ＧＩＴ２７−ＮＯなしで（対照）またはＧＩＴ２７−ＮＯ（２５μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートし、２４時間のインキュベーション後にＭＴＴアッセイを行った。*ｐ＜０．０５は、適切な対照を指す。（Ｇ）何もなしで（対照）、またはＧＩＴ２７−ＮＯ（２５μｇ／ｍｌ）および／もしくはＴｙｒ（５μＭ）と共に２４時間インキュベートしたＣ６細胞の光顕微鏡写真図。
【００６１】
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Ｓｔｏｓｉｃ−Ｇｒｕｊｉｃｉｃ Ｓ，Ｃｖｅｔｋｏｖｉｃ Ｉ，Ｍａｎｇａｎｏ Ｋ，Ｆｒｅｓｔａ Ｍ，Ｍａｋｓｉｍｏｖｉｃ−Ｉｖａｎｉｃ Ｄ，Ｈａｒｈａｊｉ Ｌ，Ｐｏｐａｄｉｃ Ｄ，Ｍｏｍｃｉｌｏｖｉｃ Ｍ，Ｍｉｌｊｋｏｖｉｃ Ｄ，Ｋｉｍ Ｊ，Ａｂｅｄ ＹＡ，Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉ Ｆ．Ａ Ｐｏｔｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ，（Ｓ，Ｒ）−３−Ｐｈｅｎｙｌ−４，５−ｄｉｈｙｄｒｏ−５−ｉｓｏｘａｓｏｌｅ Ａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ，Ｐｒｅｖｅｎｔｓ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ａｎｄ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ Ｆｏｒｍｓ ｏｆ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ｉｎ ＮＯＤ Ｍｉｃｅ ａｎｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｌｏｗ Ｄｏｓｅｓ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ ｉｎ ＣＢＡ／Ｈ Ｍｉｃｅ．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２００７ Ｍａｒ；３２０（３）：１０３８−４９．
Ｈｕｇｕｅｎｉｎ Ｓ，Ｖａｃｈｅｒｏｔ Ｆ，Ｆｌｅｕｒｙ−Ｆｅｉｔｈ Ｊ，Ｒｉｆｆａｕｄ ＪＰ，Ｃｈｏｐｉｎ ＤＫ，Ｂｏｌｌａ Ｍ，Ｊａｕｒａｎｄ ＭＣ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｒａｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ−ｄｏｎａｔｉｎｇ ｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇｓ（ＮＯ−ＮＳＡＩＤｓ）ｏｎ ｈｕｍａｎ ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．２００５ Ｆｅｂ １０；２１８（２）：１６３−７０．
Ｈｕｇｕｅｎｉｎ Ｓ，Ｆｌｅｕｒｙ−Ｆｅｉｔｈ Ｊ，Ｋｈｅｕａｎｇ Ｌ，Ｊａｕｒａｎｄ ＭＣ，Ｂｏｌｌａ Ｍ，Ｒｉｆｆａｕｄ ＪＰ，Ｃｈｏｐｉｎ ＤＫ，Ｖａｃｈｅｒｏｔ Ｆ．Ｎｉｔｒｏｓｕｌｉｎｄａｃ（ＮＣＸ １１０２）：ａ ｎｅｗ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ−ｄｏｎａｔｉｎｇ ｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇ（ＮＯ−ＮＳＡＩＤ），ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ．２００４ Ｏｃｔ １；６１（２）：１３２−４１．
Ｈｕｇｕｅｎｉｎ Ｓ，Ｖａｃｈｅｒｏｔ Ｆ，Ｋｈｅｕａｎｇ Ｌ，Ｆｌｅｕｒｙ−Ｆｅｉｔｈ Ｊ，Ｊａｕｒａｎｄ ＭＣ，Ｂｏｌｌａ Ｍ，Ｒｉｆｆａｕｄ ＪＰ，Ｃｈｏｐｉｎ ＤＫ．Ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｎｉｔｒｏｓｕｌｉｎｄａｃ（ＮＣＸ １１０２），ａ ｎｅｗ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ−ｄｏｎａｔｉｎｇ ｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇ，ｏｎ ｈｕｍａｎ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２００４ Ｍａｒ；３（３）：２９１−８．
Ｂａｋ ＡＷ，ＭｃＫｎｉｇｈｔ Ｗ，Ｌｉ Ｐ，Ｄｅｌ Ｓｏｌｄａｔｏ Ｐ，Ｃａｌｉｇｎａｎｏ Ａ，Ｃｉｒｉｎｏ Ｇ，Ｗａｌｌａｃｅ ＪＬ．Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｎ ａｓｐｉｒｉｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｉｎ ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｃｏｌｏｎｉｃ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．１９９８；６２（２３）：ＰＬ ３６７−７３．
Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ Ｈ，Ｂｏｇｄａｎ Ｃ．ＮＯ ａｓ ａ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｋｉｎａｓｅｓ．
Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００１ Ａｕｇ；１（８）：１４４３−５５．
Ｋａｎｚａｗａ Ｔ，Ｋｏｎｄｏ Ｙ，Ｉｔｏ Ｈ，Ｋｏｎｄｏ Ｓ，Ｇｅｒｍａｎｏ Ｉ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｇｌｉｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｒｓｅｎｉｃ ｔｒｉｏｘｉｄｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００３；６３：２１０３−８．
Ｂｉｌｉｒ Ａ，Ａｌｔｉｎｏｚ ＭＡ，Ｅｒｋａｎ Ｍ，Ｏｚｍｅｎ Ｖ，Ａｙｄｉｎｅｒ Ａ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ＦＭ３Ａ ｂｒｅａｓｔ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ，ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ａｎｄ ｔａｍｏｘｉｆｅｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００１；６９：１２０−６．
Ｐａｇｌｉｎ Ｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ Ｔ，Ｄｅｌｏｈｅｒｙ Ｔ，Ｈａｃｋｅｔｔ Ｎ，ＭｃＭａｈｉｌｌ Ｍ，Ｓｐｈｉｃａｓ Ｅ，Ｄｏｍｉｎｇｏ Ｄ，Ｙａｈａｌｏｍ Ｊ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｉｎｖｏｌｖｅｓ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ａｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｉｄｉｃ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００１；６１：４３９−４４．
Ｇｏｒｋａ Ｍ，Ｄａｎｉｅｗｓｋｉ ＷＭ，Ｇａｊｋｏｗｓｋａ Ｂ，Ｌｕｓａｋｏｗｓｋａ Ｅ，Ｇｏｄｌｅｗｓｋｉ ＭＭ，Ｍｏｔｙｌ Ｔ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｉｓ ｔｈｅ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｔｙｐｅ ｏｆ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ＭＣＦ−７ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ＡＧＳ １１５ ａｎｄ ＥＦＤＡＣ，ｎｅｗ ｓｅｓｑｕｉｔｅｒｐｅｎｅ ａｎａｌｏｇｓ ｏｆ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ ２００５；１６：７７７−８８．
Ｋｉｍ Ｒ，Ｅｍｉ Ｍ，Ｔａｎａｂｅ Ｋ，Ｍｕｒａｋａｍｉ Ｓ，Ｕｃｈｉｄａ Ｙ，Ａｒｉｈｉｒｏ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｐｌａｙ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ａｎｄ ｎｏｎ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２００６ Ｆｅｂ；２０８（３）：３１９−２６．
Ｐｅｃｅｒｅ Ｔ，Ｇａｚｚｏｌａ ＭＶ，Ｍｕｃｉｇｎａｔ Ｃ，Ｐａｒｏｌｉｎ Ｃ，Ｖｅｃｃｈｉａ ＦＤ，Ｃａｖａｇｇｉｏｎｉ Ａ，Ｂａｓｓｏ Ｇ，Ｄｉａｓｐｒｏ Ａ，Ｓａｌｖａｔｏ Ｂ，Ｃａｒｌｉ Ｍ，Ｐａｌｕ Ｇ．Ａｌｏｅ−ｅｍｏｄｉｎ ｉｓ ａ ｎｅｗ ｔｙｐｅ ｏｆ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ａｇｅｎｔ ｗｉｔｈ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ ｔｕｍｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０００；６０：２８００−４．
Ｍｉｊａｔｏｖｉｃ Ｓ，Ｍａｋｓｉｍｏｖｉｃ−Ｉｖａｎｉｃ Ｄ，Ｒａｄｏｖｉｃ Ｊ，Ｍｉｌｊｋｏｖｉｃ Ｄ，Ｋａｌｕｄｊｅｒｏｖｉｃ ＧＮ，Ｓａｂｏ ＴＪ，Ｔｒａｊｋｏｖｉｃ Ｖ．Ａｌｏｅ ｅｍｏｄｉｎ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｔｈｅ ＥＲＫ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．２００５ Ｊｕｎ；６２（１１）：１２７５−８２．
Ｔａｒｒ ＪＭ，Ｅｇｇｌｅｔｏｎ Ｐ，Ｗｉｎｙａｒｄ ＰＧ．Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｔｕｍｏｕｒ ｃｅｌｌｓ．Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．２００６；１２（３４）：４４４５−６８．
Ｈｏｆｓｅｔｈ ＬＪ，Ｈｕｓｓａｉｎ ＳＰ，Ｗｏｇａｎ ＧＮ，Ｈａｒｒｉｓ ＣＣ．Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．２００３ Ａｐｒ １５；３４（８）：９５５−６８．
Ｋｅｅｂｌｅ ＪＥ，Ｍｏｏｒｅ ＰＫ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ−ｄｏｎａｔｉｎｇ ｄｒｕｇｓ．Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００２ Ｏｃｔ；１３７（３）：２９５−３１０．
Ｗａｄａ Ｔ，Ｐｅｎｎｉｎｇｅｒ ＪＭ．Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ ｉｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００４ Ａｐｒ １２；２３（１６）：２８３８−４９．
Ｅｒｄａｌ Ｈ，Ｂｅｒｎｄｔｓｓｏｎ Ｍ，Ｃａｓｔｒｏ Ｊ，Ｂｒｕｎｋ Ｕ，Ｓｈｏｓｈａｎ ＭＣ，Ｌｉｎｄｅｒ Ｓ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｔｈａｔ ａｃｔｉｖａｔｅ ｐ５３−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００５ Ｊａｎ ４；１０２（１）：１９２−７．
Ｍｉｔｒａ Ｒ，Ｓｉｎｇｈ Ｓ，Ｋｈａｒ Ａ：Ａｎｔｉｔｕｍｏｕｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２００３ Ｊａｎ １３；２００３：１−２２．
Ｇａｂｒｉｅｌ Ｂ，Ｓｕｒｅａｕ Ｆ，Ｃａｓｓｅｌｙｎ Ｍ，Ｔｅｉｓｓｉｅ Ｊ，Ｐｅｔｉｔ ＰＸ．Ｒｅｔｒｏａｃｔｉｖｅ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｉｎ ｅｌｅｃｔｒｏｌｏａｄｅｄ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｂｃｌ−２ ａｎｄ Ｂｃｌ−ＸＬ．Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２００３ Ｏｃｔ １；２８９（２）：１９５−２１０．
Ｌｉ ＣＱ，Ｗｏｇａｎ ＧＮ．Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ａｓ ａ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．２００５ Ａｕｇ ８；２２６（１）：１−１５．
Ｌｅｃｈｎｅｒ Ｍ，Ｌｉｒｋ Ｐ，Ｒｉｅｄｅｒ Ｊ．Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ｉＮＯＳ）ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｂｉｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ ｔｗｏ ｓｉｄｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｉｎ．Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．２００５ Ａｕｇ；１５（４）：２７７−８９．
Ｆｅｒｒｅｉｒａ ＣＧ，Ｅｐｐｉｎｇ Ｍ，Ｋｒｕｙｔ ＦＡ，Ｇｉａｃｃｏｎｅ Ｇ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．
Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００２ Ｊｕｌ；８（７）：２０２４−３４．
Ｉｖａｎａ Ｓｔｏｊａｎｏｖｉｃ；Ｓａｌｖａｔｏｒｅ Ｃｕｚｚｏｃｒｅａ；Ｋａｔｉａ Ｍａｎｇａｎｏ；Ｅｍａｎｕｅｌａ Ｍａｚｚｏｎ；Ｄｊｏｒｄｊｅ Ｍｉｌｊｋｏｖｉｃ；Ｍｉｎｇｊｕｎ Ｗａｎｇ；Ｍａｒｃｏ Ｄｏｎｉａ；Ｙｏｕｓｅｆ Ａｌ Ａｂｅｄ；Ｊｏｓｅｐｈ Ｋｉｍ；Ｓｔａｎｉｓｌａｖａ Ｓｔｏｓｉｃ−Ｇｒｕｊｉｃｉｃ；Ｍｏｇｅｎｓ Ｃｌａｅｓｓｏｎ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ，ｅｘ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｓｏｘａｚｏｌｉｎｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ＶＧＸ−１０２７：Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｔｈ ｏｒｇａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌｓ．Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，ｉｎ ｐｒｅｓｓ．
【技術分野】
【０００１】
本発明はイソオキサゾリン化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
一酸化窒素（ＮＯ）は、多数の生理学的および病理学的過程に関与する高反応性分子である。血管拡張、神経伝達、および免疫におけるＮＯの役割は、多くの面で複雑である（Ｔａｒｒ、２００６年）。この分子はまた、非特異的抗腫瘍免疫応答の主な関与物質として知られている（Ｒｏｓｈｎｉ、２００３年）。しかし、最近の研究は、癌細胞との相互作用が以前考えられていたよりも複雑であることを示している。ＮＯは、腫瘍の増大および転移を阻害することができるが、促進させることもできる（Ｔａｒｒ、２００６年、Ｌｅｃｈｎｅｒ、２００５年）。腫瘍−ＮＯ相互作用の結果は、ＮＯ源、曝露細胞のタイプ、細胞内のＮＯの局在性、ＮＯ曝露の期間、およびＮＯが相互作用する可能性がある他のフリーラジカル種の存在に依存する（Ｔａｒｒ、２００６年）。一般に、宿主マクロファージおよびＮＫ細胞によって産生されたＮＯは、抗腫瘍応答を媒介する（Ｒｏｓｈｎｉ、２００３年）。一方、ＮＯの腫瘍化促進の役割は、この分子を生成し、それに応じて増殖を自己調節する腫瘍細胞の内因性潜在能力によるものとされている（Ｌｅｃｈｎｅｒ、２００５年）。ＮＯは、電子供与、ならびに鉄、亜鉛、および銅などの遷移金属との反応によって腫瘍細胞の増殖に直接影響を及ぼし、それ故に酵素活性および転写因子活性が調整される。ＮＯは、新しいラジカルの発生によって、細胞成分のさらなる破壊を間接的に媒介する（Ｌｉ、２００５年、Ｔａｒｒ、２００６年、Ｌｅｃｈｎｅｒ、２００５年）。
【０００３】
最近、いくつかの有効な抗癌剤が入手可能である。しかし、癌用薬の設計は、多くの科学者にとって依然として大きな難題である。調査は、効果を高め、副作用を低減し、投与経路が適切である物質の発見を目的としている。癌の予防および／または治療での特に重要な新規な治療法は、ＮＯ供与非ステロイド性抗炎症薬（ＮＯ−ＮＳＡＩＤ）によって代表される。
【０００４】
ＮＯ−ＮＳＡＩＤは、ＮＯ供与基が芳香族または脂肪族スペーサーによって共有結合されているＮＳＡＩＤからなる（ＲｉｇａｓおよびＫａｓｈｆｉ、２００４年を参照）。これらの薬剤はその親化合物といくつかの薬理学的性質を共有するが、現在のデータは、それらの構造変化が効力の向上および毒性の減少に寄与していることを示唆している（Ｋｅｅｂｌｅ、２００２年）。
【０００５】
ＮＯ−ＮＳＡＩＤは、アルツハイマー病、ならびに心血管、リウマチ、および肺疾患に有効である（Ｄｅｌ Ｓｏｌｄａｔｏら、１９９９年）。ＮＳＡＩＤのシクロオキシゲナーゼ阻害性とＮＯの殺腫瘍能とを組み合わせることにより、これらの薬剤は悪性疾患の治療に対する最適な候補になる（ＲｉｇａｓおよびＫａｓｈｆｉ、２００４年を参照）。
【０００６】
様々なＮＯ−ＮＳＡＩＤが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでもｉｎ ｖｉｖｏでも癌細胞の増殖に影響を及ぼすことが実証されている。これらの薬剤は、ヒトの膀胱、結腸、前立腺、肺、膵臓、および舌の癌細胞、ならびに白血病細胞株に対して強力な抗増殖能およびアポトーシス促進能を有する（Ｋａｓｈｆｉら、２００３年、Ｙｅｈ、２００４年、Ｈｕｇｕｅｎｉｎ、２００５年、Ｈｕｇｕｅｎｉｎ、２００４ａ年、Ｈｕｇｕｅｎｉｎ、２００４ｂ年、Ｇａｏ、２００５年、Ｎａｔｈ、２００４年、Ｓｐｉｅｇｅｌ、２００５年）。さらに、ＮＯ−アスピリンおよびＮＯ−インドメタシンは、ラットおよびマウスでの胃腸の癌発に対して有効である（Ｂａｋ、１９９８年、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、２００４年、Ｒａｏ）。ＮＯ供与アスピリンは、ハムスター腫瘍モデルでの膵臓癌を予防した（Ｏｕｙａｎｇ、２００６年）。これらの薬剤の作用に関与する正確な機序はまだ完全には理解されていないが、潜在的標的は、ＮＦ−κＢ、誘導型ＮＯ合成酵素、およびシクロオキシゲナーゼであると考えられている（Ｒｉｇａｓ、ｒｅｗ、２００４年）。
【０００７】
最近、イソオキサゾリン化合物、（Ｓ，Ｒ）−３−フェニル−４，５−ジヒドロ−５−イソオキサソール（ｉｓｏｘａｓｏｌｅ）酢酸（ＶＧＸ−１０２７）が強力な免疫調節特性を有することが示されている。ＶＧＸ−１０２７は、マクロファージおよび／またはＴ細胞からのＴＮＦ−α合成を阻害することによって、マウスをＬＰＳの致死作用から保護する（Ｓｔｏｊａｎｏｖｉｃら、印刷中）。さらに、自発型もしくは加速型の糖尿病、または低用量ストレプトゾトシンの複数回投与により誘発された免疫炎症性糖尿病のＮＯＤマウスにＶＧＸ−１０２７を投与すると、糖尿病の進行が有意に低減される（Ｓｔｏｓｉｃ−Ｇｒｕｊｉｃｉｃら、２００６年）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｔａｒｒ ＪＭ，Ｅｇｇｌｅｔｏｎ Ｐ，Ｗｉｎｙａｒｄ ＰＧ．Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｔｕｍｏｕｒ ｃｅｌｌｓ．Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．２００６；１２（３４）：４４４５−６８．
【非特許文献２】Ｌｅｃｈｎｅｒ Ｍ，Ｌｉｒｋ Ｐ，Ｒｉｅｄｅｒ Ｊ．Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ｉＮＯＳ）ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｂｉｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ ｔｗｏ ｓｉｄｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｉｎ．Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．２００５ Ａｕｇ；１５（４）：２７７−８９．
【非特許文献３】Ｌｉ ＣＱ，Ｗｏｇａｎ ＧＮ．Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ａｓ ａ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．２００５ Ａｕｇ ８；２２６（１）：１−１５．
【非特許文献４】Ｒｉｇａｓ Ｂ，Ｋａｓｈｆｉ Ｋ．Ｎｉｔｒｉｃ−ｏｘｉｄｅ−ｄｏｎａｔｉｎｇ ＮＳＡＩＤｓ ａｓ ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２００４ Ｊｕｌ；１０（７）：３２４−３０．
【非特許文献５】Ｋｅｅｂｌｅ ＪＥ，Ｍｏｏｒｅ ＰＫ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ−ｄｏｎａｔｉｎｇ ｄｒｕｇｓ．Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００２ Ｏｃｔ；１３７（３）：２９５−３１０．
【非特許文献６】Ｄｅｌ Ｓｏｌｄａｔｏ Ｐ，Ｓｏｒｒｅｎｔｉｎｏ Ｒ，Ｐｉｎｔｏ Ａ．ＮＯ ａｓｐｉｒｉｎｓ：ａ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｎｅｗ ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｎｄ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ．Ｔｈｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ １９９９；２０（８）：３１９−２３．
【非特許文献７】Ｋａｓｈｆｉ Ｋ，Ｒｙａｎ Ｙ，Ｑｉａｏ ＬＬ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＪＬ，Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｄｅｌ Ｓｏｌｄａｔｏ Ｐ，Ｔｒａｇａｎｏｓ Ｆ，Ｒｉｇａｓ Ｂ．Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ−ｄｏｎａｔｉｎｇ ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇｓ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｔｉｓｓｕｅ ｔｙｐｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔ．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２００２ Ｄｅｃ；３０３（３）：１２７３−８２．
【非特許文献８】Ｙｅｈ ＲＫ，Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＪＬ，Ｂａｌｕｃｈ Ｍ，Ｈｕｎｄｌｅｙ ＴＲ，Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ ＲＥ，Ｋａｌａｌａ Ｓ，Ｔｒａｇａｎｏｓ Ｆ，Ｂｅｎａｒｄｉｎｉ Ｆ，ｄｅｌ Ｓｏｌｄａｔｏ Ｐ，Ｋａｓｈｆｉ Ｋ，Ｒｉｇａｓ Ｂ．ＮＯ−ｄｏｎａｔｉｎｇ ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇｓ（ＮＳＡＩＤｓ）ｉｎｈｉｂｉｔ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｍｏｒｅ ｐｏｔｅｎｔｌｙ ｔｈａｎ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ＮＳＡＩＤｓ：ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｙ？ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００４ Ｊｕｎ １５；６７（１２）：２１９７−２０５．
【非特許文献９】Ｈｕｇｕｅｎｉｎ Ｓ，Ｖａｃｈｅｒｏｔ Ｆ，Ｆｌｅｕｒｙ−Ｆｅｉｔｈ Ｊ，Ｒｉｆｆａｕｄ ＪＰ，Ｃｈｏｐｉｎ ＤＫ，Ｂｏｌｌａ Ｍ，Ｊａｕｒａｎｄ ＭＣ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｒａｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ−ｄｏｎａｔｉｎｇ ｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇｓ（ＮＯ−ＮＳＡＩＤｓ）ｏｎ ｈｕｍａｎ ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．２００５ Ｆｅｂ １０；２１８（２）：１６３−７０．
【非特許文献１０】Ｈｕｇｕｅｎｉｎ Ｓ，Ｆｌｅｕｒｙ−Ｆｅｉｔｈ Ｊ，Ｋｈｅｕａｎｇ Ｌ，Ｊａｕｒａｎｄ ＭＣ，Ｂｏｌｌａ Ｍ，Ｒｉｆｆａｕｄ ＪＰ，Ｃｈｏｐｉｎ ＤＫ，Ｖａｃｈｅｒｏｔ Ｆ．Ｎｉｔｒｏｓｕｌｉｎｄａｃ（ＮＣＸ １１０２）：ａ ｎｅｗ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ−ｄｏｎａｔｉｎｇ ｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇ（ＮＯ−ＮＳＡＩＤ），ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ．２００４ Ｏｃｔ １；６１（２）：１３２−４１．
【非特許文献１１】Ｈｕｇｕｅｎｉｎ Ｓ，Ｖａｃｈｅｒｏｔ Ｆ，Ｋｈｅｕａｎｇ Ｌ，Ｆｌｅｕｒｙ−Ｆｅｉｔｈ Ｊ，Ｊａｕｒａｎｄ ＭＣ，Ｂｏｌｌａ Ｍ，Ｒｉｆｆａｕｄ ＪＰ，Ｃｈｏｐｉｎ ＤＫ．Ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｎｉｔｒｏｓｕｌｉｎｄａｃ（ＮＣＸ １１０２），ａ ｎｅｗ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ−ｄｏｎａｔｉｎｇ ｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇ，ｏｎ ｈｕｍａｎ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２００４ Ｍａｒ；３（３）：２９１−８．
【非特許文献１２】Ｇａｏ Ｊ，Ｌｉｕ Ｘ，Ｒｉｇａｓ Ｂ．Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ−ｄｏｎａｔｉｎｇ ａｓｐｉｒｉｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００５ Ｎｏｖ ２２；１０２（４７）：１７２０７−１２．
【非特許文献１３】Ｎａｔｈ Ｎ，Ｌａｂａｚｅ Ｇ，Ｒｉｇａｓ Ｂ，Ｋａｓｈｆｉ Ｋ．ＮＯ−ｄｏｎａｔｉｎｇ ａｓｐｉｒｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｌｅｕｋｅｍｉｃ Ｊｕｒｋａｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２００５ Ｊａｎ ７；３２６（１）：９３−９．
【非特許文献１４】Ｓｐｉｅｇｅｌ Ａ，Ｈｕｎｄｌｅｙ ＴＲ，Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｇａｏ Ｊ，Ｏｕｙａｎｇ Ｎ，Ｌｉｕ Ｘ，Ｇｏ ＭＦ，Ｔｓｉｏｕｌｉａｓ ＧＪ，Ｋａｓｈｆｉ Ｋ，Ｒｉｇａｓ Ｂ．ＮＯ−ｄｏｎａｔｉｎｇ ａｓｐｉｒｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｂｏｔｈ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎ ＨＴ−２９ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００５ Ｏｃｔ １；７０（７）：９９３−１０００．
【非特許文献１５】Ｂａｋ ＡＷ，ＭｃＫｎｉｇｈｔ Ｗ，Ｌｉ Ｐ，Ｄｅｌ Ｓｏｌｄａｔｏ Ｐ，Ｃａｌｉｇｎａｎｏ Ａ，Ｃｉｒｉｎｏ Ｇ，Ｗａｌｌａｃｅ ＪＬ．Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｎ ａｓｐｉｒｉｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｉｎ ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｃｏｌｏｎｉｃ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．１９９８；６２（２３）：ＰＬ ３６７−７３．
【非特許文献１６】Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＪＬ，Ｋａｓｈｆｉ Ｋ，Ｏｕｙａｎｇ Ｎ，ｄｅｌ Ｓｏｌｄａｔｏ Ｐ，Ｋｏｐｅｌｏｖｉｃｈ Ｌ，Ｒｉｇａｓ Ｂ．ＮＯ−ｄｏｎａｔｉｎｇ ａｓｐｉｒｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｍｉｎ（ＡＰＣ（Ｍｉｎ／＋））ｍｉｃｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２００４ Ｊａｎ １６；３１３（３）：７８４−８．
【非特許文献１７】Ｏｕｙａｎｇ Ｎ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＪＬ，Ｔｓｉｏｕｌｉａｓ ＧＪ，Ｇａｏ Ｊ，Ｉａｔｒｏｐｏｕｌｏｓ ＭＪ，Ｋｏｐｅｌｏｖｉｃｈ Ｌ，Ｋａｓｈｆｉ Ｋ，Ｒｉｇａｓ Ｂ．Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ−ｄｏｎａｔｉｎｇ ａｓｐｉｒｉｎ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ａ ｈａｍｓｔｅｒ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００６ Ａｐｒ １５；６６（８）：４５０３−１１．
【非特許文献１８】Ｉｖａｎａ Ｓｔｏｊａｎｏｖｉｃ；Ｓａｌｖａｔｏｒｅ Ｃｕｚｚｏｃｒｅａ；Ｋａｔｉａ Ｍａｎｇａｎｏ；Ｅｍａｎｕｅｌａ Ｍａｚｚｏｎ；Ｄｊｏｒｄｊｅ Ｍｉｌｊｋｏｖｉｃ；Ｍｉｎｇｊｕｎ Ｗａｎｇ；Ｍａｒｃｏ Ｄｏｎｉａ；Ｙｏｕｓｅｆ Ａｌ Ａｂｅｄ；Ｊｏｓｅｐｈ Ｋｉｍ；Ｓｔａｎｉｓｌａｖａ Ｓｔｏｓｉｃ−Ｇｒｕｊｉｃｉｃ；Ｍｏｇｅｎｓ Ｃｌａｅｓｓｏｎ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ，ｅｘ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｓｏｘａｚｏｌｉｎｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ＶＧＸ−１０２７：Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｔｈ ｏｒｇａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌｓ．Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，ｉｎ ｐｒｅｓｓ．
【非特許文献１９】Ｓｔｏｓｉｃ−Ｇｒｕｊｉｃｉｃ Ｓ，Ｃｖｅｔｋｏｖｉｃ Ｉ，Ｍａｎｇａｎｏ Ｋ，Ｆｒｅｓｔａ Ｍ，Ｍａｋｓｉｍｏｖｉｃ−Ｉｖａｎｉｃ Ｄ，Ｈａｒｈａｊｉ Ｌ，Ｐｏｐａｄｉｃ Ｄ，Ｍｏｍｃｉｌｏｖｉｃ Ｍ，Ｍｉｌｊｋｏｖｉｃ Ｄ，Ｋｉｍ Ｊ，Ａｂｅｄ ＹＡ，Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉ Ｆ．Ａ Ｐｏｔｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ，（Ｓ，Ｒ）−３−Ｐｈｅｎｙｌ−４，５−ｄｉｈｙｄｒｏ−５−ｉｓｏｘａｓｏｌｅ Ａｃｅｔｉｃ Ａｃｉｄ，Ｐｒｅｖｅｎｔｓ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ａｎｄ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ Ｆｏｒｍｓ ｏｆ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ｉｎ ＮＯＤ Ｍｉｃｅ ａｎｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｌｏｗ Ｄｏｓｅｓ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ ｉｎ ＣＢＡ／Ｈ Ｍｉｃｅ．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２００７ Ｍａｒ；３２０（３）：１０３８−４９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の説明
本発明は、式（Ｉ）のイソオキサゾリン化合物に関し、
【００１０】
【化１】
【００１１】
これをまた以下（ＧＩＴ２７−ＮＯ）と称し、次の反応式によって合成することができる。
【００１２】
【化２】
【００１３】
化合物（Ｉ）は、動物モデルにおいて、抗腫瘍剤および抗ウイルス剤として胃潰瘍の予防および治療に有効であることが分かった。したがって、これは、抗腫瘍および抗ウイルス薬剤組成物の製剤化、ならびに当業者に周知の手順に従って賦形剤および／または媒体と共に製剤化することができる、虚血再灌流障害に関連する胃腸潰瘍、出血性ショック、および器官損傷を治療するように設計された組成物に使用することができる。薬剤組成物、非経口、経口、および局所用組成物、ならびに眼のウイルス感染治療のための点眼薬。
【００１４】
本発明の目的はまた、有効量の化合物（ＩＩ）の投与を含む、腫瘍病態およびウイルス感染症の治療方法である。投与の用量および時間は、患者の必要に応じて医師によって決定されるであろう。
【００１５】
本発明はまた、化合物（Ｉ）の前駆体、式（ＩＩ）の化合物に関し、
【００１６】
【化３】
【００１７】
これはまた、ＮＯを放出することができ、抗腫瘍剤および抗ウイルス剤として有効であることが証明されている。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】Ｃ６ラット星状細胞腫、Ｌ９２９マウス繊維肉腫、およびＢ１６マウス黒色腫を種々の濃度のＶＧＸ−１０２７またはＧＩＴ２７−ＮＯで２４時間インキュベートした後の細胞生存率を示す図である。
【図２】Ｃ６、Ｂ１６、およびＬ９２９細胞に対しての様々な細胞障害効率ならびにＧＩＴ２７−ＮＯの動態を示す図である。
【図３】ＧＩＴ２７−ＮＯがＣ６およびＢ１６細胞の自食性細胞死を誘発することを示す図である。
【図４】ＧＩＴ２７−ＮＯの細胞障害作用におけるＲＯＳの関与を示す図である。
【図５】ＧＩＴ２７−ＮＯがＭＡＰキナーゼおよびＰＴＫの活性化を特異的に調節することを示す図である。
【００１９】
次に、本発明を次の実験の部でより詳細に例示する。
【００２０】
実験の部
化学的性質
【００２１】
【化４】
【００２２】
この反応は、以下に開示の手順に従って実施した：テトロン酸および誘導体；パートＶＩ。新規な４−オキソ−２−フェニル−２Ｈ−４，６−ジヒドロフロ［３，４−ｄ］トリアゾールおよび４−オキソ−４，６−ジヒドロフロ［３，４−ｃ］フラザン系の簡便な合成。Ｐａｒｉｃｋ Ｐｏｌｌｅｔ、Ｓｕｚａｎｎｅ Ｇｅｌｉｎ。Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、１９７９年、９７７〜９７９頁。
【００２３】
亜硝酸ナトリウム（６．９ｇ、１００ｍｍｏｌ）を、テトロン酸（１０ｇ、１００ｍｍｏｌ）を含む３ＭのＨＣｌ（６０ｍＬ）撹拌溶液に少しずつ添加した。紫色の溶液を室温で１５分間撹拌し、次いで、激しく撹拌しているヒドロキシルアミン塩酸塩（１３．９ｇ、２００ｍｍｏｌ）を含む水溶液（１５０ｍＬ）に滴下した。紫色の呈色は、室温で徐々に退色し、３，４−ビス［ヒドロキシルイミノ］−２−オキソテトラヒドロフラン（９．１１ｇ、６３％）が白色針状晶として沈澱した。
【００２４】
【化５】
【００２５】
この反応は、ＤＥ４４０１１５０Ａ１に開示の手順に従って実施した。
【００２６】
３，４−ビス［ヒドロキシルイミノ］−２−オキソテトラヒドロフラン（５．５ｇ、３８．２ｍｍｏｌ）とＣＨ2Ｃｌ2（６０ｍＬ）とメタノール（２１ｍＬ）との混合物に、Ｐｂ（ＯＡｃ）4（１６．９ｇ、３８．２ｍｍｏｌ）を５〜１０℃で添加した。室温で２時間撹拌した後、トリエチルアミン（５ｍＬ、３８．２ｍｍｏｌ）を添加し、さらに３０分間撹拌した。ＣＨ2Ｃｌ2（１５０ｍＬ）を添加し、混合物を水で洗浄した。ＣＨ2Ｃｌ2抽出物をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣を酢酸イソプロピルと共に撹拌し、ろ過し、ろ液を酢酸イソプロピルから再結晶して、４−ヒドロキシメチル−２−オキシフラザン−３−カルボキシメチルエステル（１ｇ、１５％）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｃ3Ｄ6Ｏ）δ ３．９４（３Ｈ，ｓ）、４．８５（２Ｈ，ｓ）。13Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，Ｃ3Ｄ6Ｏ）δ ５２．６、５６．２、１０７．９、１５６．９、１５７．８。
【００２７】
【化６】
【００２８】
４−ヒドロキシメチル−２−オキシフラザン−３−カルボキシメチルエステル（６１１ｍｇ、３．５１ｍｍｏｌ）を、２Ｍのアンモニアと共にＭｅＯＨ（２５ｍＬ）中に添加した。溶液を室温で２時間撹拌した。反応混合物を真空下で濃縮して、４−ヒドロキシ−２−オキシフラザン−３−カルボン酸アミド（５５１ｍｇ、９８％）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｃ3Ｄ6Ｏ）δ ４．８０（２Ｈ，ｓ）。13Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，Ｃ3Ｄ6Ｏ）δ ５６．１、１１１．３、１５７．１、１５８．８。
【００２９】
【化７】
【００３０】
４−ヒドロキシ−２−オキシフラザン−３−カルボン酸アミド（１７０ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ）、（３−フェニル−４，５−ジヒドロ−イソオキサゾール−５−イル）酢酸（２６２ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（６５ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）を含むＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍＬ）の撹拌溶液を、ＤＣＣ（２６４ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ）。に添加した。室温で２４時間撹拌した後、ジエチルエーテル（５０ｍＬ）を添加し、混合物をセライトでろ過した。ろ液を濃縮し、続いて、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン＝４：１）にかけて、所望のエステル（３５６ｍｇ、９６％）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｃ3Ｄ6Ｏ）δ ２．７８（ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，１Ｈ）、２．９１（ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，１Ｈ）３．３０（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ）、３．６２（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ）、５．１４（ｍ，１Ｈ）、５．４８（ｓ，２Ｈ）、７．４２（ｍ，３Ｈ）、７．６８（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，Ｃ3Ｄ6Ｏ）δ ３９．２、３９．４、５７．１、７７．５、１１０．７、１２６．６、１２８．７、１３０．０、１５４．９、１５５．８、１５６．５、１６９．３。
【００３１】
【化８】
【００３２】
トリフルオロ酢酸無水物（０．３ｍＬ、２．０２ｍｍｏｌ）を、（３−フェニル−４，５−ジヒドロ−イソオキサゾール−５−イル）酢酸−４−カルバモイル−５−オキシフラザン−３−イルメチルエステル（３４８ｍｇ、１．０１ｍｍｏｌ）および乾燥ピリジン（０．１５ｍＬ、２．０２ｍｍｏｌ）を含むＴＨＦ（１０ｍＬ）の氷塩冷却下の撹拌溶液に滴下した。冷却浴を取り去り、撹拌を室温で１時間継続した。反応混合物を水に注ぎ、１０％ＨＣｌ（ａｑ）で酸性化し、ＥｔＯＡｃで抽出した。一緒にした有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、蒸発させて残渣を得、それをフラッシュクロマトグラフィーで精製して、所望のニトリル（２７５ｍｇ、８３％）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ ２．７９（ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，１Ｈ）、２．９３（ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ，１Ｈ）、３．１２（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ）、３．５５（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ）、５．１１（ｍ，１Ｈ）、５．２９（ｓ，２Ｈ）、７．３８（ｍ，３Ｈ）、７．５９（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ）。13ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ ３９．２、４０．２、５６．２、７６．２、９６．５、１０５．２、１２６．８、１２８．９、１３０．６、１５２．５、１５６．８、１６９．２。
【００３３】
薬理作用
親化合物とＮＯ共役化合物（Ｉ）の両方の抗腫瘍効果を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのマウス繊維肉腫Ｌ９２９、マウス黒色腫Ｂ１６、およびラット星状細胞腫Ｃ６細胞株において、ならびにＣ５７ＢＬ／６マウスの黒色腫のｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて試験した。
【００３４】
材料および方法
試薬、細胞、および動物
アクリジンオレンジは、Ｌａｂｏ−Ｍｏｄｅｒｎａ（フランス）から得た。カルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステルは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（ユージーン、米国）から得た。ビスチロホスチンは、ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（アーヴィン、カリフォルニア州）から得た。実験で使用する他のすべての化学薬品は、Ｓｉｇｍａ（セントルイス、米国）から購入した。ＧＩＴ２７−ＮＯは、２．５％ＤＭＳＯを含むＨ2Ｏ中において５μｇ／ｍｌの濃度で＋４℃で保存し、使用直前に培地で希釈した。対照細胞培養物は、実験で使用するＧＩＴ２７−ＮＯの濃度が最も高い溶液と同量のＤＭＳＯを含有した。
【００３５】
ラットグリオーマ細胞株Ｃ６は、Ｄｒ．Ｐｅｄｒｏ Ｔｒａｎｑｕｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｄａｄ ｄｅ Ｃａｓｔｉｌｌａ−Ｌａ Ｍａｎｃｈａ、アルベセテ、スペイン）からの寛大な寄贈品であり、ネズミメラノーマＢ１６細胞株は、Ｄｒ．Ｓｉｎｉｓａ Ｒａｄｕｌｏｖｉｃ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｅｒｂｉａ、ベオグラード、セルビア）からの寛大な寄贈品であり、マウス繊維肉腫Ｌ９２９は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ソールズベリー、英国）から得た。細胞は、５％ＦＣＳ、２ｍＭのグルタミン、０．０１％ピルビン酸ナトリウム、５×１０-5Ｍの２−メルカプトエタノール、および抗生物質（培地）を補充したＨＥＰＥＳ緩衝ＲＰＭＩ１６４０培地中で５％ＣＯの加湿雰囲気下において３７℃で増殖させた。従来のトリプシン処理後、細胞を、１０4細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに、２×１０5細胞／ウェルの濃度で６ウェルプレートに、または３×１０4細胞／ウェルで４ウェルチャンバースライドに播種し、一晩培養し、次いで試験化合物に曝露した。
【００３６】
近交系Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ「Ｓｉｎｉｓａ Ｓｔａｎｋｏｖｉｃ」（ベオグラード、セルビア）の本発明者らの施設からのものであり、標準的な実験室条件（非特定病原体除去）下で食物および水に自由に近づける状態にしておいた。動物の取り扱いおよび試験プロトコルは、国際的なガイドラインに従い、現地の研究機関の動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。
【００３７】
ＭＴＴ、ＣＶ、およびＣＦＳＥ染色
平底９６ウェルプレートに細胞を播種（１０4細胞／ウェル）し、培地の最終体積を２００μｌにし、一晩インキュベートし、次いで、種々の濃度の試験化合物で処理した。２４時間のインキュベーション後、細胞生存率を、すでに記載されているように（Ｍｉｊａｔｏｖｉｃら、ＣＭＬＳ、２００４年）、３−４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）からホルマザンへのミトコンドリア依存性還元に基づくＭＴＴ試験を使用するか、または付着細胞のクリスタルバイオレット（ＣＶ）染色によって評価した。結果は、未処理培養物で得られた対照値の％として示す。細胞増殖の速度はまた、ＣＦＳＥで標識した細胞のフローサイトメトリー分析を使用して決定した（Ｋａｎｇ、２００５年）。細胞を脱離し、１．５μＭのＣＦＳＥを添加し、３７℃で１５分間静置し、次いで２回洗浄し、２×１０5で６ウェルプレートに播種した。細胞を化合物で２４時間および４８時間処理し、トリプシン処理し、２回洗浄した。最後に、細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。４８８ｎｍの励起光で照射された細胞からの緑色蛍光発光をＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ、ハイデンベルグ、ドイツ）を用いて測定し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用して分析した。
【００３８】
細胞死の決定
壊死性細胞死のマーカーとして、ピルビン酸塩の存在下で２，４−ジニトロフェニルヒドラジンから可視のヒドラゾン沈澱物への転換を媒介する細胞内酵素ＬＤＨの放出を測定した。すでに記載されているように（Ｄｅｃｋｅｒら）、上記の通りに細胞を平底９６ウェルプレートに播種し、２４時間のインキュベーション後にアッセイを行った。死細胞のパーセンテージは、次式を使用して決定した：［（Ｅ−Ｃ）／（Ｔ−Ｃ）］×１００、式中、Ｅは、４９２ｎｍで測定された処理培養物の実験吸光度であり、Ｃは、対照未処理細胞の上澄み液の吸光度であり、Ｔは、トリトン溶解細胞の最大（１００％）ＬＤＨ放出に対応する吸光度である。文献（Ｍｉｊａｔｏｖｉｃ、ＣＭＬＳ、２００５年）に記載のように、細胞周期分析およびアポトーシス検出を正確に行った。酸性小胞の細胞小器官は、自食作用を特徴とし、生体染色色素アクリジンオレンジによって染色される。赤色蛍光の強度は細胞小器官の酸性度および体積に比例し、一方、細胞質および核小体は鮮緑色および暗赤色を発光する（Ｋａｎｚａｗａ、２００４年）。自食作用の検出に関しては、先に記載されているように細胞を６ウェルプレートで培養し、脱離し、１μｇ／ｍｌのアクリジンオレンジで室温にて１５分間染色した。インキュベーション期間の最後に、細胞を洗浄し、最後にＰＢＳ中に再懸濁させた。青色（４８８ｎｍ）励起光で照射された１０4細胞からの緑色（５１０〜５３０ｎｍ）および赤色（＞６５０ｎｍ）蛍光発光は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いて測定し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用して分析した。
【００３９】
ＲＯＳおよび亜硝酸塩蓄積の測定
６ウェルプレート中で増殖させた細胞を、試験化合物で処理する前に、１μＭのジヒドロローダミン１２３（ＤＨＲ）で２０分間染色した。培養期間の最後に、細胞を脱離し、洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁させた。ＲＯＳ放出の分析は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いて行い、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏソフトウェアを使用して分析した（Ｋａｌｕｄｊｅｒｏｖｉｃ、２００５年）。
【００４０】
すでに記載されているように（Ｍｉｊａｔｏｖｉｃら、ＣＭＬＳ、２００４年）、亜硝酸塩蓄積は、グリース反応によって測定した。
【００４１】
細胞ベースＥＬＩＳＡ
ＭＡＰキナーゼ（ｐ３８ＭＡＰＫ、細胞外シグナル制御キナーゼ−ＥＲＫ、およびＪｕｎ−Ｎ末端キナーゼ−ＪＮＫ）または核内因子−κＢ（ＮＦ−κＢ）の活性化は、Ｖｅｒｓｔｅｅｇらによる細胞ベースＥＬＩＳＡ（Ｖｅｒｓｔｅｅｇ、２０００年）をわずかに修正した方法によって決定した。本発明者らは、リン酸化形態にしたＭＡＰキナーゼ（ｐ−ｐ３８、ｐ−ＥＲＫ、およびｐ−ＪＮＫ）およびＩκＢ（ｐ−ＩκＢ）に特異的な抗体を使用した。と言うのは、ＭＡＰキナーゼはリン酸化によって活性化され、抑制性サブユニットＩκＢのリン酸化はＮＦ−κＢ活性化に必要なステップだからである。９６ウェル平底プレートにおいて０．５％ＦＣＳを含む培地で細胞を一晩増殖させ、次いで、従来の培地で希釈した試験化合物によって処理した。処理期間の最後に、細胞を４％パラホルムアルデヒドに固定し、内因性ペルオキシダーゼを１％Ｈ2Ｏ2を含む０．１％トリトンＸ−１００含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で失活させ、抗体の非特異的結合を１０％ＦＣＳ含有ＰＢＳＴ溶液で阻止した。ラット／マウスｐ−ＥＲＫ、ｐ−ｐ３８、ｐ−ＪＮＫ、ｐ−ＩκＢに特異的な一次マウスモノクローナル抗体（１：２００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからすべて入手、サンタクルーズ、カリフォルニア州）を、２％ウシ血清アルブミンを補充したＰＢＳＴ（ＰＢＳＴＢ）に加え、続いて、抗ｐ−ＥＲＫ、抗ｐ−ＪＮＫ、および抗ｐ−ＩκＢには二次ペルオキシダーゼ標識（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＰＢＳＴＢ中で１：２５００；ＵＳＢ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、クリーヴランド、オハイオ州）を、または抗ｐ−ｐ３８の検出には抗マウスＩｇＭ（１：４０００；ＵＳＢ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を加えた。抗体とのインキュベーションを３７℃で１時間実施した。ペルオキシダーゼ基質ＴＭＢと共にインキュベートし、続いて０．１ＭのＨＣｌを添加してから１５分後、４５０ｎｍの吸光度を自動マイクロプレートリーダーで測定した。処理と対照との間の比較を可能にするために、得られた吸光度は、オリジナルプロトコルに記載される、クリスタルバイオレット染色によって決定された細胞数に関して補正した。結果は、任意に１に設定した対照値と比較する相対表示として示す。
【００４２】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける黒色腫の誘発およびＧＩＴ２７−ＮＯでの処置
同系Ｃ５７ＢＬ／６マウスの背部右側の腰仙部にＢ１６黒色腫細胞２×１０5を皮下（ｓ．ｃ）注射して、原発腫瘍を誘発させた。腫瘍増殖は毎日観察され、ＧＩＴ２７−ＮＯでの処置は、最初の腫瘍が触知できた日（１０日）から開始した。ＧＩＴ２７−ＮＯは、処置直前に準備し、０．５ｍｇ／マウスの用量で１４日間連続してｉ．ｐ．（腹腔内）投与した。３０日まで動物を観察し、次いで屠殺し、各マウスからの個々の腫瘍を三次元測定して腫瘍増殖を決定した。腫瘍体積は、次式を使用して計算した：［０．５２×ａ×ｂ2］、式中、ａは、最長の直径であり、ｂは、最短の直径である（Ｓｍａｇｕｒら）。
【００４３】
ＮＭＲＩマウスにおけるコンカナバリン（ＣｏｎＡ）注射によって誘発された肝炎およびＧｉｔ２７−ＮＯを用いた処置
ＣｏｎＡ誘発肝炎は、ＣｏｎＡの単回静脈内注射によってマウス中に誘発することができるヒトの肝疾患の様々な免疫炎症状態に類似した細胞媒介性免疫炎症状態である。この疾患は、ＣｏｎＡ投与（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）後短時間（８〜２４時間）での血漿のトランスアミナーゼレベルの有意な上昇、ならびに好中球、マクロファージ、およびＴ細胞の肝臓への同時浸潤、それに続く肝細胞のアポトーシスおよび壊死を特徴とする。
【００４４】
肝炎は、６〜９週の米国海軍医学調査研究所（Ｎａｖａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＮＭＲＩ）の雄のマウスの尾静脈へのＣｏｎＡ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、セントルイス、ミズーリ州）注射によって誘発した。４グループのマウスをＣｏｎＡ投与の２４時間および１時間前にＧｉｔ２７−ＮＯで処置、すなわち、Ｇｉｔ２７−ＮＯを、または媒体と共に、０．５および１ｍｇ／マウスの用量でｉ．ｐ．投与、または５ｍｇ／マウスの用量でｐ．ｏ．（経口）投与した。ＣｏｎＡ注射の８時間後に血液採集のために動物を屠殺し、血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性を、二色（ｂｉｃｈｒｏｍａｔｉｃ）分析装置を使用して、標準光度アッセイによって決定した。
【００４５】
統計分析
結果は、別段の指示がない限り、類似の結果を示す少なくとも３つの実験を代表する実験の３点の観測値（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ）の平均値±ＳＤとして示す。様々な処置間の差の有意性は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＧＩＴ２７−ＮＯ効果を評価するための分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いてスチューデント−ニューマン−クールズ検定またはマン−ホイットニーＵ検定によって評価した。０．０５未満のｐ値は、有意であると考えた。
【００４６】
結果
ＧＩＴ２７−ＮＯ対ＶＧＸ−１０２７の抗腫瘍活性の評価
ＶＧＸ−１０２７およびＧＩＴ２７−ＮＯの抗腫瘍効果を評価するために、本発明者らは、３種の悪性細胞株、Ｃ６ラット星状細胞腫、Ｌ９２９マウス繊維肉腫、およびＢ１６マウス黒色腫を種々の濃度の薬剤と共に２４時間インキュベートし、次いで、細胞生存率をＭＴＴおよびＣＶ試験によって決定した。図１Ａに示すように、親化合物ＶＧＸ−１０２７は、腫瘍細胞の生存率に影響を及ぼさなかった。一方、３種の細胞株すべてを同じ濃度範囲のＧＩＴ２７−ＮＯで処理（図１Ｂ）すると、ミトコンドリア呼吸の用量依存的減少が引き起こされた。効果は、ＣＶによって推定される細胞数の減少に関して評価した（図１Ｃ）。したがって、不活性なＶＧＸ−１０２７の化学修飾が強力な殺腫瘍活性を有する新規化合物をもたらしたことは明白であった。これを考慮し、本発明者らは、更なる調査からＶＧＸ−１０２７を除外した。化合物（Ｉ）の抗腫瘍効果とそのＮＯ放出能との関係を評価するために、本発明者らは、細胞培養物の上澄み液中の亜硝酸塩の蓄積を培地だけの場合のその量と比較した。図１Ｄに示すように、ＧＩＴ２７−ＮＯは細胞がない状態ではＮＯを放出せず、亜硝酸塩を形成しないが、細胞の処理後は、有意量の亜硝酸塩が観察された。これらのデータは、従来の外因性ＮＯドナーと異なり、ＧＩＴ２７−ＮＯがＮＯの自発的な放出ができないことを示唆している。細胞生存率の下方調節を媒介するＧＩＴ２７−ＮＯにおけるＮＯの役割を調査するために、本発明者らは、ＮＯスカベンジャーヘモグロビンと同時に腫瘍細胞を培養した。こうした条件においてＧＩＴ２７−ＮＯで処理された細胞の生存率はほぼ完全に回復し、これによって薬物媒介性細胞毒性におけるＮＯの重要性が示された（図１Ｅ）。この現象はさらに、光学顕微鏡によって視覚化された（図１Ｆ）。
【００４７】
ＧＩＴ２７−ＮＯは異なるタイプの細胞死を誘発する
化合物（Ｉ）の抗増殖効果を決定するために、本発明者らは、ＧＩＴ２７−ＮＯを含むまたは含まない状態での２４時間培養中のＣＦＳＥ染色細胞のフローサイトメトリー分析を行った。ＧＩＴ２７−ＮＯでの処理後に生存しているＬ９２９およびＢ１６細胞の数が有意に減少したにもかかわらず（図１ＢおよびＣ）、これらの細胞は未処理対照細胞とほぼ同じ頻度で分裂しており（表１）、これによって増殖の阻害が観察された抗腫瘍効果の原因ではないことが示された。同時に、ＧＩＴ２７−ＮＯでの処理はＣ６細胞の増殖に影響を及ぼし（表１）、これによって生細胞の減少がこの細胞株に対する薬剤の細胞増殖阻害効果によって少なくとも部分的に媒介されていることが示唆された。続いて、本発明者らは、細胞をＧＩＴ２７−ＮＯで処理したときの様々なタイプの細胞死の存在を分析した。壊死は、死につつある細胞の乱された浸透性に基づいてＬＤＨ放出アッセイによって決定した。（図２ＡおよびＢ）に示すように、ＧＩＴ２７−ＮＯ処理は、試験した３種の細胞株すべてにおいてＬＤＨ放出を誘発した。ＬＤＨ放出は、用量依存的（図２Ａ）でも時間依存的（図２Ｂ）でもあった。しかし、有意量のＬＤＨが、初期の時点ではなく薬剤と共に培養した１８時間後に検出可能となり、これによって観察された効果が一次の壊死性細胞死ではなくアポトーシスの末期（二次的壊死）に起因する可能性があることが示唆された。化合物（Ｉ）と共に培養した２４時間後に行った細胞ＤＮＡ含量の分析から、Ｌ９２９培養物の低二倍体細胞（ＰＩ染色細胞のサブＧコンパートメント）の割合が有意に増加したことが明らかとなった（図２Ｃ）。一方、ＧＩＴ２７−ＮＯの存在下でインキュベートした後のサブＧコンパートメントにおけるＣ６およびＢ１６細胞のパーセンテージは、Ｌ９２９培養物中よりも低く（１０％未満）、これによって薬物媒介性細胞毒性における他のタイプの細胞死の重要性が示された（図２Ｃ）。さらに、Ｇ０／Ｇ１期での細胞周期停止が、ＧＩＴ−２７ＮＯで処理されたＣ６細胞に観察された（図２Ｃ）。したがって、凝縮したクロマチンおよび収縮した核を有する細胞が薬物曝露培養物中に目視され、これによってＢ１６およびＣ６細胞とは対照的にＬ９２９培養物でのアポトーシス性細胞死の広がりが確認された（図２Ｄ）。したがって、本発明者らは、ＧＩＴ２７−ＮＯで処理した後のＣ６およびＢ１６細胞において自食性細胞死として知られる別の様式の細胞死を分析した。自食作用に特有な酸性オートファゴソームの発生を確認するために、本発明者らは、アクリジンオレンジで染色された細胞のフローサイトメトリー分析を行った。図３Ａ〜Ｃに示すように、両方の細胞株において、ＧＩＴ２７−ＮＯは、酸性小胞の発生を示す鮮赤色蛍光の強度を有意に増大させた。化合物（Ｉ）に曝露された細胞の生存率低下における自食性細胞死の関連性を調査するために、本発明者らは、周知の自食作用の阻害剤バフィロマイシンＡ（Ｂａｆ）および３−メチルアデニン（３−ＭＡ）と同時に細胞を処理した。３−ＭＡは、ＰＩ−３キナーゼの阻害によって自食性分解（ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）を阻害し、Ｂａｆ、液胞型Ｈ+−ＡＴＰアーゼ阻害剤は、オートファゴソームとリソソームとの融合を阻止した（Ｋａｎｚａｗａ、２００４年）。ＭＴＴアッセイで判断されるように、ＧＩＴ２７−ＮＯで処理された細胞の生存率は、試験した両方の自食作用阻害剤の存在下で回復され、それによってＣ６およびＢ１６細胞へのＧＩＴ２７−ＮＯ細胞毒性における自食性細胞死の寄与が確認された（図３Ｅ）。光学顕微鏡によって、３−ＭＡの存在下で回復したＣ６細胞の生存率が確認された（図３Ｆ）。総合的に考えると、これらの結果は、様々な癌細胞において様々なタイプの細胞死を誘発する能力が、ＧＩＴ２７−ＮＯの特性に基づくものではなく、細胞型の固有の特異性に基づくものであることを示唆している。
【００４８】
【表１】
【００４９】
ＧＩＴ２７−ＮＯの細胞毒性はＲＯＳ発生に依存する
酸化ストレスが細胞死を引き起こすことは周知である。したがって、本発明者らは、観察されたＧＩＴ２７−ＮＯの細胞障害作用における酸化ストレスの役割を調査した。対照細胞と比べて、ＲＯＳの細胞内産生は、細胞内ＤＨＲ蛍光によって推定されるように、ＧＩＴ２７−ＮＯで細胞を処理した後に著しく増加した（図４Ａ〜Ｃ）。スカベンジャーＮＡＣによってＲＯＳを無効化すると、ＧＩＴ２７−ＮＯで処理された細胞の生存率が回復されて、ＲＯＳの放出が薬剤の殺腫瘍性作用の少なくとも部分的な原因であることが示された（図４Ｄ）。
【００５０】
ＧＩＴ２７−ＮＯは、Ｃ６、Ｂ１６、およびＬ９２９腫瘍細胞におけるＭＡＰキナーゼ経路を差次的に調節する
マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼは、生存、増殖、および死に含まれる、細胞外シグナルから重要な細胞内シグナルへの転換に不可欠なセリンスレオニンキナーゼのファミリーである（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ、２００１年、Ｗａｄａ、２００４年、Ａｒｂａｂｉ、２００２年）。したがって、本発明者らは、これらのシグナル伝達経路の活性化に対するＧＩＴ２７−ＮＯの影響を分析した。細胞ベースＥＬＩＳＡによって決定されるように、様々なシグナル伝達分子は、様々な細胞株での標的である。Ｃ６細胞では、ＧＩＴ２７−ＮＯは、ＥＲＫ１／２およびＪＮＫの永続的な活性化を誘発した（図５Ａ）。一方、Ｂ１６細胞の培養物において異なるパターンが観察された。ＧＩＴ２７−ＮＯはＢ１６細胞のＥＲＫ１／２の活性化に影響を及ぼさなかったが、ＪＮＫの時間依存性の有意な活性化およびｐ３８のほんのわずかな活性化が観察された（図５Ｂ）。最後に、Ｌ９２９をＧＩＴ２７−ＮＯで処理すると、ＪＮＫの発現に影響を及ぼすことなく、ＥＲＫ１／２の著しい持続的活性化およびｐ３８の有意な一時的活性化がもたらされた（図５Ｃ）。細胞生存率の減少におけるＭＡＰキナーゼ活性化の生物学的意義を評価するために、本発明者らは、これらの分子の既知の薬理学的阻害剤：ＥＲＫ活性化にはＰＤ９８０５９、ＪＮＫ活性化にはＳＰ６００１２５、およびｐ３８活性化にはＳＢ２０２１９０を使用した。ＧＩＴ２７−ＮＯと共にインキュベートする前に、これらの阻害剤の各々で当該細胞を３０分間パルスし、培養２４時間後にＭＴＴによって生存率を推定した。Ｃ６細胞を特異的なＥＲＫおよびＪＮＫ阻害剤で（図５Ｄ）、Ｂ１６細胞をＪＮＫ阻害剤で（図５Ｅ）、Ｌ９２９細胞をＥＲＫおよびｐ３８阻害剤（図５Ｆ）で処理すると、腫瘍細胞株の生存が有意に改善され、これによって薬物媒介性細胞毒性におけるこれらの分子の役割が確認された。したがって、データは、ＧＩＴ２７−ＮＯのシグナル伝達カスケードにおいて様々な分子を誘発する能力が、主に細胞型によって決定されることを示唆している。上流のシグナル伝達分子の影響を調査するために、本発明者らは、ＧＩＴ２７−ＮＯと同時に、タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）阻害剤、チロホスチンを用いて細胞を処理した。図５Ｇに示すように、ＰＴＫの阻害は試験した細胞株すべての生存率をほぼ完全に回復させ、これによって薬物作用の標的位置が同じであることが示された。光学顕微鏡によって、ＧＩＴ２７−ＮＯで処理されたＣ６細胞に対するチロホスチンの効果を視覚化した（図５Ｈ）。
【００５１】
ＧＩＴ２７−ＮＯは、Ｂ１６黒色腫を担持するＣ５７ＢＬ／６マウスの腫瘍増殖を阻害する
本発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＧＩＴ２７−ＮＯの細胞毒性特性を実証した後、Ｂ１６黒色腫担持マウスにおけるそのｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍特性を評価した。表２に例示するように、ＧＩＴ２７−ＮＯによる短期処置（０．５ｍｇ／マウス／日を１０日間）は、最初の腫瘍が触知できた腫瘍移植１０日後に開始し、未処置対照動物に比べて腫瘍増殖の有意な低下を伴った。ＧＩＴ２７−ＮＯの投与を中断した後でも効果は安定していた。対照群では２匹の動物だけが死亡したが、ＧＩＴ２７−ＮＯで処置した動物はすべて、３０日間の追跡期間生存した（図示せず）。総合的に考えると、Ｂ１６黒色腫細胞へのＧＩＴ２７−ＮＯの細胞毒性特性は、そのｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果に関連している。
【００５２】
【表２】
【００５３】
ＧＩＴ２７−ＮＯは、ＣｏｎＡ誘発肝炎におけるＡＬＴグルコース血中濃度を低下させる
Ｇｉｔ２７−ＮＯによる予防的処置は、試験した用量すべてにおいて、媒体処置のマウスと比べてＡＬＴグルコース血中濃度を有意に低下させた。
【００５４】
【表３】
【００５５】
考察
この試験は、ＶＧＸ−１０２７の化学修飾によって、強力な殺腫瘍能を有する新規なＮＯ供与化合物が得られることを示すものである。３種の異なる細胞株、Ｌ９２９マウス繊維肉腫、Ｃ６ラット星状細胞腫、およびＢ１６黒色腫を修飾済み物質ＧＩＴ２７−ＮＯで処理すると、それらの生存率が劇的に低減された。対照的に、親化合物ＶＧＸ−１０２７は、ＧＩＴ２７−ＮＯと同じまたはより高い（データ不掲載）濃度範囲において腫瘍細胞増殖に影響を及ぼさなかった。ＧＩＴ２７−ＮＯの抗腫瘍効果は、その細胞増殖阻害効果によって媒介されるのではなく、むしろ細胞死誘導をまねく細胞内現象のカスケードを引き起こす能力に基づくものである。しかし、ＧＩＴ２７−ＮＯがＧ０／Ｇ１期での細胞分裂の停止を引き起こしたので、Ｃ６細胞株は例外となった。多数の証拠から、ＮＯが共有結合して修飾した抗炎症性非ステロイド薬の強力な抗悪性腫瘍特性が明らかとなった（Ｒｉｇａｓ、２００４年）。例えば、ヒトの膀胱、前立腺、結腸癌、およびジャーカット白血病細胞の有意な増殖低下は、様々なＮＯ−ＮＳＡＩＤでの処置時に観察された（Ｋａｓｈｆｉら、２００３年、Ｙｅｈ、２００４年、Ｈｕｇｕｅｎｉｎ、２００５年、Ｈｕｇｕｅｎｉｎ、２００４年、Ｈｕｇｕｅｎｉｎ、２００４年、Ｇａｏ、２００５年、Ｎａｔｈ、２００４年、Ｓｐｉｅｇｅｌ、２００５年）。本発明者らは、細胞の生存率の減少が、壊死性細胞死の典型的な特徴と見なされるＬＤＨの放出に付随するものであることを観察した。しかし、薬剤存在下での１８時間のインキュベーション後に壊死が観察され、これによってＬＤＨ放出が一次の壊死ではなく二次のアポトーシスに主として起因する可能性があることが示唆された。抗癌剤作用において最もよく起こる機序は、アポトーシスの誘導である（Ｆｅｒｒｅｉｒａ、２００２年）。腫瘍細胞がアポトーシス性細胞死に対して耐性があるという多くの証拠がある（Ｋｉｍ、２００５年）。この現象は、抗アポトーシス特性を有するシグナル伝達分子の過剰発現によって説明することができよう（Ｇａｂｒｉｅｌ、２００３年）。ＧＩＴ２７−ＮＯの非常に興味深い特徴は、殺腫瘍の機序を細胞特異性に適応させる能力である。Ｌ９２９細胞株は、中胚葉由来のものであり、主としてアポトーシスによって死滅した。したがって、ＮＯ−アスピリンは結腸癌細胞のアポトーシスを誘発することができ、一方、別の薬剤、ＮＯ−スリンダクは、膀胱および前立腺癌のアポトーシス性死に関与することが報告された（Ｇａｏ、２００５年、Ｈｕｇｕｅｎｉｎｇ、２００４年）。Ｌ９２９細胞とは対照的に、ＧＩＴ２７−ＮＯで処理されたＣ６およびＢ１６細胞中にほんの少量の低二倍体細胞が検出された。一方、ＧＩＴ２７−ＮＯは、Ｃ６およびＢ１６細胞株の培養物中で自食作用を誘発した。最近、放射線、およびタモキシフェン、アロエエモジン、三酸化ヒ素などの抗癌剤の作用様式としての自食作用の誘導が報告された（Ｍｉｊａｔｏｖｉｃ、２００５年、Ｋａｎｚａｗａ、２００４年、Ｂｉｌｉｒ、Ｐａｇｌｉｎ、Ｇｏｒｋａ、２００３年）。細胞を特異的阻害剤３−ＭＡおよびバフィロマイシンＡで処理すると、細胞生存率が回復され、これによって本発明者らの条件下では自食作用は救済（ｓａｌｖａｇｉｎｇ）機序ではなく破壊機序として働くことが確認されている。細胞が既知のＰＩ−３Ｋ阻害剤３−ＭＡによってＧＩＴ２７−ＮＯ誘発毒性から効率的に救出されたことにより、この経路の重要性が指摘された。これは今後の研究の対象となろう。アポトーシス性細胞死と自食性細胞死との間の相互作用は、十分立証されている。これらの２タイプの細胞死は細胞中で共存し、状況に応じて、両者は互いを誘因または阻害することができよう（Ｋｉｍ、２００６年）。しかし、アロエエモジンはアポトーシス誘発剤と考えられているが、本発明者らは、この薬剤がグリオーマ細胞株では自食性細胞死の誘発によって優先的に作用することを見出した（Ｐｅｃｅｒｅ、２０００年、ＣＭＬＳ、２００５年）。興味深いことに、ＧＩＴ２７−ＮＯは、外因性ドナーのようにＮＯを自発的に放出することはできないが、細胞の存在下では有意量の亜硝酸塩を検出することができた。したがって、ＮＯ放出に関して、ＧＩＴ２７−ＮＯが細胞との接触を必要とすることは明白である。さらに、ＮＯスカベンジャーヘモグロビンはこの化合物の効果をほぼ完全に無効にし、これによって腫瘍増殖の抑制におけるＮＯの重大な役割が確認された。ＮＯが、遊離のアミノ酸、ペプチド、もしくはタンパク質のチオール基への強力な親和性、電子供与性、および／または新規なフリーラジカルを形成する能力を有する高反応性種であることは周知である（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ、２００１年）。ＲＯＳおよびＲＮＳがアポトーシス性および自食性細胞死を媒介することは以前示された（Ｌｉ、２００５年、Ｋａｎｚａｗａ、２００４年、Ｅｒｄａｌ、２００５年）。ＶＧＸ−１０２７で細胞を処理してもＲＯＳは放出されないが（データ不掲載）、ＧＩＴ２７−ＮＯの存在下では有意量のＲＯＳが測定された。ＤＨＲはまたペルオキシ亜硝酸塩も検出し、これはＯ2-とＮＯとの反応生成物であり、実際に最も反応性のある破壊分子（ｄｅｓｔｒｏｙｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の１つである（Ｌｅｃｈｎｅｒ ２００５年、Ｌｉ ２００５年）。ＮＯ放出が反応性ラジカルの産生を引き起こし、結果として細胞生存率の低下をまねいたことは明白であり、これは抗酸化剤ＮＡＣでの処置によってさらに確認された。本発明者らの研究と一致して、Ｇａｏらは、ＮＯ供与アスピリンが酸化ストレスの誘発によってヒト結腸癌細胞でアポトーシスを誘発したことを示した（Ｇａｏ、ＰＮＡＳ）。さらに、ＮＯが、酵素および転写因子の活性を劇的に調節し、その結果、増殖、分化、および細胞死過程の調節に含まれる細胞シグナル伝達経路を変えることは周知である（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ、２００１年）。ＮＯ供与アスピリンの抗腫瘍効果は、ＭＡＰキナーゼの活性化によって媒介される（Ｈｕｎｄｌｅｙ、２００５年）。ＮＯ供与薬が結腸癌細胞中のＪＮＫおよびｐ３８を活性化し、その結果ＡＰ−１複合体の活性化が導かれたが、特異的阻害剤によるこれらのキナーゼの阻害が薬剤の細胞障害効果を部分的に阻止したことがこれらの著者らにより報告された。ＧＩＴ２７−ＮＯは、細胞型に応じてＭＡＰキナーゼファミリーのメンバーの活性を特異的に変更した。Ｌ９２９細胞では、ＧＩＴ２７−ＮＯが、ＥＲＫ１／２の強力な時間依存的上方調節、続いてｐ−３８の一過性上方調節を誘発したが、Ｂ１６細胞を同じ薬剤で処理すると、ＪＮＫの強力なリン酸化およびｐ３８のほんのわずかな増加がもたらされた。Ｃ６グリオーマ細胞は処理中にＪＮＫおよびＥＲＫを同時に上方調節したが、ｐ３８の活性は影響を受けなかった。ＧＩＴ２７−ＮＯに対する細胞応答の変化が細胞死の機序に関係するという仮説が成り立つ。シスプラチンによって誘発されるＬ９２９細胞でのＥＲＫ１／２の強力な活性化が細胞をアポトーシスヘ導き、その抑制が薬剤の抗腫瘍能を無効にすることは周知である。したがって、ＧＩＴ２７−ＮＯでの処理時に上方調節したＥＲＫ１／２がＬ９２９細胞の優先的なアポトーシスの原因と思われる。これは、試験した３種の細胞株すべてにおいてＰＴＫ阻害が薬剤の細胞毒性を打ち消したと述べるに値する。これは、薬物作用が最初は同じであり、各細胞株中の異なるシグナル伝達経路の活性化から差が生じ得ることを証明した。本発明者らは、ＮＯ−ＮＳＡＩＤが癌を含むいくつかの障害のための非常に有望なクラスの薬剤であることをすでに述べている（Ｒｉｇｇｓ、２００４年、概説）。ＮＯ−ＮＳＡＩＤは、Ｍｉｎマウス、結腸癌のラットモデルでの腸の発癌、さらにハムスター腫瘍モデルでの膵臓癌を阻止した（Ｏｕａｎｇ、Ｂａｋ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｒａｏ）。注目すべきことは、ＧＩＴ２７−ＮＯが、Ｃ５７ＢＬ／６マウスでのＢ１６黒色腫の増殖を有意に抑制したことである。親化合物の機能変換により、ＮＯが主に媒介する強力な殺腫瘍性が決定された。各タイプの処理済み細胞に対する作用機序の適応性は、他の化学療法と比べて有利である。本発明者らの結果は、化合物（Ｉ）の可能な治療用途のさらなる研究の開始点となろう。
【００５６】
図の説明
図１。ＧＩＴ２７−ＮＯは、ＮＯ放出によって腫瘍細胞の生存率を下方調節させる。Ｂ１６黒色腫、Ｌ９２９繊維肉腫、およびＣ６星状細胞腫の細胞（１×１０4／ウェル）を、様々な濃度のＶＧＸ−１０２７またはＧＩＴ２７−ＮＯで処理した。２４時間の培養後、細胞生存率を、ＭＴＴ（Ａ、Ｂ）およびＣＶ試験（Ｃ）によって決定した。培地での亜硝酸塩の蓄積（Ｄ）は、ＧＩＴ２７−ＮＯの存在下でＣ６細胞を２４時間処理した後に、または細胞を含まないＧＩＴ２７−ＮＯの示した希釈液において検出した。２４時間のインキュベーション後、ＧＩＴ２７−ＮＯ（２５ｍｇ／ｍｌ）と同時にヘモグロビン（１２．５μＭ）で２４時間処理したＣ６細胞のＭＴＴアッセイ（Ｅ）および光学顕微鏡分析（Ｆ）を行った。データは、独立した３つの実験の代表からの平均値±ＳＤとして示す。*ｐ＜０．０５は、未処理培養物を指す。
【００５７】
図２。Ｃ６、Ｂ１６、およびＬ９２９細胞に対しての様々な細胞障害効率ならびにＧＩＴ２７−ＮＯの動態。（Ａ）細胞を様々な用量のＧＩＴ２７−ＮＯと共に２４時間インキュベートし、あるいは（Ｂ）では動態学的評価のために２５μｇ／ｍｌのＧＩＴ２７−ＮＯと共に２４時間インキュベートし、ＬＤＨ放出アッセイを行った（*ｐ＜０．０５）。（Ｃ）細胞を２５μｇ／ｍｌのＧＩＴ２７−ＮＯと共に２４時間インキュベートした後にＰＩで染色し、細胞周期をフローサイトメトリーによって分析した。（Ｄ）細胞を２５μｇ／ｍｌのＧＩＴ２７−ＮＯで２４時間処理し、ＰＩ染色後にアポトーシス（矢印）の核形態特性を蛍光顕微鏡法によって調査した。
【００５８】
図３。ＧＩＴ２７−ＮＯは、Ｃ６およびＢ１６細胞の自食性細胞死を誘発する。（Ａ〜Ｄ）ＧＩＴ２７−ＮＯなしでまたはＧＩＴ２７−ＮＯ（２５μｇ／ｍｌ）と共に２４時間培養した後、Ｃ６およびＢ１６細胞をアクリジンオレンジで染色し、橙赤色の酸性自食小胞の存在に関してフローサイトメトリーによって分析した。（Ｅ）示すように、細胞を、何もなしで、またはＧＩＴ２７−ＮＯ（２５μｇ／ｍｌ）、３−ＭＡ（１ｍｇ／ｍｌ）、および／もしくはＢａｆ（０．５μＭ）と共に２４時間インキュベートし、ＭＴＴアッセイを行った。*ｐ＜０．０５は、適切な対照を指す。（Ｆ）何もなしで（対照）、またはＧＩＴ２７−ＮＯ（２５μｇ／ｍｌ）および／もしくは３−ＭＡ（１ｍｇ／ｍｌ）と共に２４時間インキュベートしたＣ６細胞の光顕微鏡写真図。
【００５９】
図４。ＧＩＴ２７−ＮＯの細胞障害作用におけるＲＯＳの関与。（Ａ〜Ｃ）細胞を、ＧＩＴ２７−ＮＯ（２５μｇ／ｍｌ）がない状態（対照）またはある状態でインキュベートし、２４時間後にＲＯＳの産生をＤＨＲ蛍光のフローサイトメトリーによって検出した。（Ｄ）抗酸化剤ＮＡＣ（２．５μＭ）がある状態またはない状態でＧＩＴ２７−ＮＯなしでまたはＧＩＴ２７−ＮＯ（２５μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした細胞の生存率を、２４時間後にＭＴＴアッセイによって決定した。*ｐ＜０．０５は、適切な対照を指す。
【００６０】
図５。ＧＩＴ２７−ＮＯは、ＭＡＰキナーゼおよびＰＴＫの活性化を特異的に調節する。（Ａ〜Ｃ）細胞を２５μｇ／ｍｌのＧＩＴ２７−ＮＯと共にインキュベートし、示した時点でのＪＮＫ、ＥＲＫ、およびｐ３８ＭＡＰＫの活性化を細胞ベースＥＬＩＳＡによって評価した。データは、０時点での未処理対照培養物（*ｐ＜０．０５）で得られた値に対する倍率（ｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ）として示す。（Ｄ〜Ｇ）細胞を、特異的阻害剤ＰＤ９８０５９（ＰＤ、５０μＭ）、ＳＰ６００１２５（ＳＰ、０．７５μＭ）、ＳＢ２０２１９０（ＳＢ、２０μＭ）、またはチロホスチン（Ｔｙｒ、５μＭ）がある状態またはない状態で、ＧＩＴ２７−ＮＯなしで（対照）またはＧＩＴ２７−ＮＯ（２５μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートし、２４時間のインキュベーション後にＭＴＴアッセイを行った。*ｐ＜０．０５は、適切な対照を指す。（Ｇ）何もなしで（対照）、またはＧＩＴ２７−ＮＯ（２５μｇ／ｍｌ）および／もしくはＴｙｒ（５μＭ）と共に２４時間インキュベートしたＣ６細胞の光顕微鏡写真図。
【００６１】
参考文献
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Ｌｅｃｈｎｅｒ Ｍ，Ｌｉｒｋ Ｐ，Ｒｉｅｄｅｒ Ｊ．Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ｉＮＯＳ）ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｂｉｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ ｔｗｏ ｓｉｄｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｉｎ．Ｓｅｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．２００５ Ａｕｇ；１５（４）：２７７−８９．
Ｆｅｒｒｅｉｒａ ＣＧ，Ｅｐｐｉｎｇ Ｍ，Ｋｒｕｙｔ ＦＡ，Ｇｉａｃｃｏｎｅ Ｇ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．
Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００２ Ｊｕｌ；８（７）：２０２４−３４．
Ｉｖａｎａ Ｓｔｏｊａｎｏｖｉｃ；Ｓａｌｖａｔｏｒｅ Ｃｕｚｚｏｃｒｅａ；Ｋａｔｉａ Ｍａｎｇａｎｏ；Ｅｍａｎｕｅｌａ Ｍａｚｚｏｎ；Ｄｊｏｒｄｊｅ Ｍｉｌｊｋｏｖｉｃ；Ｍｉｎｇｊｕｎ Ｗａｎｇ；Ｍａｒｃｏ Ｄｏｎｉａ；Ｙｏｕｓｅｆ Ａｌ Ａｂｅｄ；Ｊｏｓｅｐｈ Ｋｉｍ；Ｓｔａｎｉｓｌａｖａ Ｓｔｏｓｉｃ−Ｇｒｕｊｉｃｉｃ；Ｍｏｇｅｎｓ Ｃｌａｅｓｓｏｎ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ，ｅｘ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｓｏｘａｚｏｌｉｎｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ＶＧＸ−１０２７：Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｔｈ ｏｒｇａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌｓ．Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，ｉｎ ｐｒｅｓｓ．
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物。
【化１】
【請求項２】
式（ＩＩ）の化合物。
【化２】
【請求項３】
適切な賦形剤および／または媒体との混合物として請求項１または２に記載の化合物を含む薬剤組成物。
【請求項４】
治療有効量の請求項１または２に記載の化合物の投与を含む、腫瘍の治療方法。
【請求項５】
治療有効量の請求項１または２に記載の化合物の投与を含む、ウイルス感染症の治療方法。
【請求項６】
治療有効量の請求項１または２に記載の化合物の投与を含む、急性または慢性Ｂ型およびＣ型肝炎ならびに自己免疫性肝炎の間に生じるものなどの肝臓の免疫炎症事象の治療方法。
【請求項７】
治療有効量の請求項１または２に記載の化合物の投与を含む、虚血再灌流障害および関連する病態中の組織損傷に伴う胃潰瘍、出血性ショック、およびいくつかの病態の治療方法。
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物。
【化１】
【請求項２】
式（ＩＩ）の化合物。
【化２】
【請求項３】
適切な賦形剤および／または媒体との混合物として請求項１または２に記載の化合物を含む薬剤組成物。
【請求項４】
治療有効量の請求項１または２に記載の化合物の投与を含む、腫瘍の治療方法。
【請求項５】
治療有効量の請求項１または２に記載の化合物の投与を含む、ウイルス感染症の治療方法。
【請求項６】
治療有効量の請求項１または２に記載の化合物の投与を含む、急性または慢性Ｂ型およびＣ型肝炎ならびに自己免疫性肝炎の間に生じるものなどの肝臓の免疫炎症事象の治療方法。
【請求項７】
治療有効量の請求項１または２に記載の化合物の投与を含む、虚血再灌流障害および関連する病態中の組織損傷に伴う胃潰瘍、出血性ショック、およびいくつかの病態の治療方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１０−５２６１１２（Ｐ２０１０−５２６１１２Ａ）
【公表日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０６８４５（Ｐ２０１０−５０６８４５）
【出願日】平成２０年５月６日（２００８．５．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００３６２６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３８５１６
【国際公開日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【出願人】（５０９３０７４６２）ガニアル イミュノテラペウティクス インコーポレイテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＧＡＮＩＡＬ ＩＭＭＵＮＯＴＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月６日（２００８．５．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００３６２６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３８５１６
【国際公開日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【出願人】（５０９３０７４６２）ガニアル イミュノテラペウティクス インコーポレイテッド (2)
【氏名又は名称原語表記】ＧＡＮＩＡＬ ＩＭＭＵＮＯＴＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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