本発明は、1,4-ブタンジオール(BDO)を生成するのに十分な量で発現され、さらにBDOの発現のために最適化されるBDO経路酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含むBDO経路を含む非天然微生物体を提供する。本発明は、また、当該微生物体を使用してBDOを生成する方法を提供する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
1,4-ブタンジオール(BDO)を生成するのに十分な量で発現されるBDO経路酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含むBDO経路を有する微生物体を含む非天然微生物体であって、外因性スクシニル-CoAシンテターゼを発現し;外因性アルファ-ケトグルタレートデカルボキシラーゼを発現し、外因性スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ及び4-ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ並びに場合により4-ヒドロキシブチリル-CoA/アセチル-CoAトランスフェラーゼを発現し;外因性ブチレートキナーゼ及びホスホトランスブチリラーゼを発現し;外因性4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクタ-ゼを発現し;外因性4-ヒドロキシブタナールレダクターゼを発現し;外因性ピルベートデヒドロゲナーゼを発現し;好気性呼吸器制御調節系をコードする遺伝子を破壊し;外因性NADH非感受性シトレートシンターゼを発現し;外因性ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼを発現するように遺伝子改変されている、前記非天然微生物体。
【請求項２】
前記スクシニル-CoAシンテターゼが大腸菌sucCD遺伝子によってコードされる、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項３】
前記アルファ-ケトグルタレートデカルボキシラーゼがウシ結核菌sucA遺伝子によってコードされる、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項４】
前記スクシネートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(CoA-依存性)、4-ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ及び4-ヒドロキシブチリル-CoA/アセチル-CoAトランスフェラーゼがポルフィロモナス・ギンギバリスW83遺伝子によってコードされる、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項５】
前記ブチレートキナーゼ及びホスホトランスブチリラーゼがクロストリジウム・アセトブチリクムbuk1及びptb遺伝子によってコードされる、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項６】
前記4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼがクロストリジウム・ベイジェリンキーald遺伝子によってコードされる、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項７】
前記4-ヒドロキシブタナールレダクターゼがゲオバシルス・サーモグルコシダシウスadh1遺伝子によってコードされる、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項８】
前記外因性ピルベートデヒドロゲナーゼがNADH非感受性である、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項９】
前記外因性ピルベートデヒドロゲナーゼがクレブシエラ肺桿菌lpdA遺伝子によってコードされる、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項１０】
前記微生物のピルベートデヒドロゲナーゼサブユニット遺伝子の1つ以上が、ピルベートホルメートリアーゼプロモーターの制御下にある、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項１１】
前記嫌気性呼吸器制御調節系の破壊がarcA遺伝子の破壊である、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項１２】
マレートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の破壊をさらに含む、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項１３】
NADH非感受性シトレートシンターゼがgltAによってコードされる、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項１４】
前記NADH非感受性シトレートシンターゼがgltAのR163L突然変異体によってコードされる、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項１５】
前記ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼがヘモフィルス・インフルエンザホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ遺伝子によってコードされる、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項１６】
前記外因的に発現される酵素をコードする1つ以上の遺伝子が宿主生物体のfimD座に組み込まれている、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項１７】
前記生物体が非ホスホトランスフェラーゼスクロース取込み系を発現する、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項１８】
前記生物体が、内因性ラクテートデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルベートホルメートリアーゼの破壊をさらに含む、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項１９】
前記BDO経路が、4-ヒドロキシブタノエートデヒドロゲナーゼ、スクシニル-CoAシンテターゼ、CoA依存性コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシブチレート:CoAトランスフェラーゼ、4-ブチレートキナーゼ、ホスホトランスブチリラーゼ、アルファ-ケトグルタレートデカルボキシラーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ又はアルデヒド/アルコールデヒドロゲナーゼを含む、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項２０】
前記BDO経路が、4-アミノブチレートCoAトランスフェラーゼ、4-アミノブチリル-CoAヒドロラーゼ、4-アミノブチレート-CoAリガーゼ、4-アミノブチリル-CoAオキシドレダクターゼ(脱アミノ化)、4-アミノブチリル-CoAトランスアミナーゼ又は4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼを含む、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項２１】
前記BDO経路が、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ(アルコール形成)、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ又は1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼをさらに含む、請求項20記載の非天然微生物体。
【請求項２２】
前記BDO経路が、4-アミノブチレートCoAトランスフェラーゼ、4-アミノブチリル-CoAヒドロラーゼ、4-アミノブチレート-CoAリガーゼ、4-アミノブチリル-CoAレダクターゼ(アルコール形成)、4-アミノブチリル-CoAレダクターゼ、4-アミノブタン-1-オールデヒドロゲナーゼ、4-アミノブタン-1-オールオキシドレダクターゼ(脱アミノ化)又は4-アミノブタン-1-オールトランスアミナーゼを含む、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項２３】
前記BDO経路が、4-アミノブチレートキナーゼ、4-アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ(リン酸化)、4-アミノブタン-1-オールデヒドロゲナーゼ、4-アミノブタン-1-オールオキシドレダクターゼ(脱アミノ化)、4-アミノブタン-1-オールトランスアミナーゼ、[(4-アミノブタノリル)オキシ]ホスホン酸オキシドレダクターゼ(脱アミノ化)、[(4-アミノブタノリル)オキシ]ホスホン酸トランスアミナーゼ、4-ヒドロキシブチリルホスフェートデヒドロゲナーゼ又は4-ヒドロキシブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ(リン酸化)を含む、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項２４】
前記BDO経路が1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼをさらに含む、請求項23記載の非天然微生物体。
【請求項２５】
前記BDO経路が、アルファ-ケトグルタレート5-キナーゼ、2,5-ジオキソペンタン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(リン酸化)、2,5-ジオキソペンタン酸レダクターゼ、アルファ-ケトグルタレートCoAトランスフェラーゼ、アルファ-ケトグルタリル-CoAヒドロラーゼ、アルファ-ケトグルタリル-CoAリガーゼ、アルファ-ケトグルタリル-CoAレダクターゼ、5-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸デヒドロゲナーゼ、アルファ-ケトグルタリル-CoAレダクターゼ(アルコール形成)、5-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸デカルボキシラーゼ又は5-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸デヒドロゲナーゼ(脱カルボキシル化)を含む、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項２６】
前記BDO経路が、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ(アルコール形成)、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ又は1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼをさらに含む、請求項25記載の非天然微生物体。
【請求項２７】
前記BDO経路が、グルタメートCoAトランスフェラーゼ、グルタミル-CoAヒドロラーゼ、グルタミル-CoAリガーゼ、グルタメート5-キナーゼ、グルタメート-5-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(リン酸化)、グルタミル-CoAレダクターゼ、グルタメート-5-セミアルデヒドレダクターゼ、グルタミル-CoAレダクターゼ(アルコール形成)、2-アミノ-5-ヒドロキシペンタン酸オキシドレダクターゼ(脱アミノ化)、2-アミノ-5-ヒドロキシペンタン酸トランスアミナーゼ、5-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸デカルボキシラーゼ、5-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸デヒドロゲナーゼ(脱カルボキシル化)を含む、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項２８】
前記BDO経路が、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ(アルコール形成)、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ又は1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼをさらに含む、請求項27記載の非天然微生物体。
【請求項２９】
前記BDO経路が、3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ、3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ、ビニルアセチル-CoAΔ-イソメラーゼ又は4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼを含む、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項３０】
前記BDO経路が、ホモセリンデアミナーゼ、ホモセリンCoAトランスフェラーゼ、ホモセリン-CoAヒドロラーゼ、ホモセリン-CoAリガーゼ、ホモセリン-CoAデアミナーゼ、4-ヒドロキシブタ-2-エノイル-CoAトランスフェラーゼ、4-ヒドロキシブタ-2-エノイル-CoAヒドロラーゼ、4-ヒドロキシブタ-2-エノイル-CoAリガーゼ、4-ヒドロキシブタ-2-エノエートレダクターゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAトランスフェラーゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAヒドロラーゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAリガーゼ又は4-ヒドロキシブタ-2-エノイル-CoAレダクターゼを含む、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項３１】
前記BDO経路が、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ(アルコール形成)、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ又は1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼをさらに含む、請求項30記載の非天然微生物体。
【請求項３２】
前記BDO経路が、スクシニル-CoAレダクターゼ(アルコール形成)、4-ヒドロキシブチリル-CoAヒドロラーゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAリガーゼ又は4-ヒドロキシブタナールデヒドロゲナーゼ(リン酸化)を含む、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項３３】
前記BDO経路が、スクシニル-CoAレダクターゼ、4-ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAトランスフェラーゼ、4-ヒドロキシブチレートキナーゼ、ホスホトランス-4-ヒドロキシブチリラーゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ(アルコール形成)又は1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼをさらに含む、請求項32記載の非天然微生物体。
【請求項３４】
前記BDO経路が、グルタメートデヒドロゲナーゼ、4-アミノブチレートオキシドレダクターゼ(脱アミノ化)、4-アミノブチレートトランスアミナーゼ、グルタメートデカルボキシラーゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAヒドロラーゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAリガーゼ又は4-ヒドロキシブタナールデヒドロゲナーゼ(リン酸化)を含む、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項３５】
前記BDO経路が、アルファ-ケトグルタレートデカルボキシラーゼ、4-ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAトランスフェラーゼ、4-ヒドロキシブチレートキナーゼ、ホスホトランス-4-ヒドロキシブチリラーゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ(アルコール形成)又は1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼをさらに含む、請求項34記載の非天然微生物体。
【請求項３６】
1,4-ブタンジオール(BDO)を生成するのに十分な量で発現されるBDO経路酵素をコードする少なくとも1つの外因性核酸を含むBDO経路を有する微生物体を含む非天然微生物体であって、表28の菌株3〜20のいずれかに記載するように遺伝子改変されている、前記非天然微生物体。
【請求項３７】
1,4-ブタンジオール(BDO)を生成するための方法であって、請求項1から36のいずれかに記載の非天然微生物体を、BDOを生成するための条件下で、且つ十分な期間にわたって培養してBDOを生成することを含む、前記方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９Ａ】

【図９Ｂ−Ｃ】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４Ａ】

【図１４Ｂ】

【図１４Ｃ】

【図１５−１】

【図１５−２】

【図１６】

【図１７】

【図１８Ａ】

【図１８Ｂ】

【図１９Ａ】

【図１９Ｂ】

【図２０Ａ】

【図２０Ｂ】

【図２１Ａ】

【図２１Ｂ】

【図２２Ａ】

【図２２Ｂ】

【図２３−１】

【図２３−２】

【図２４−１】

【図２４−２】

【図２５】

【図２６】

【図２７Ａ】

【図２７Ｂ】

【図２８−１】

【図２８−２】

【図２８−３】

【図２９】

【図３０】

【図３１Ａ】

【図３１Ｂ】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５−１】

【図３５−２】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【図３９−１】

【図３９−２】

【図４０】

【図４１】

【図４１Ｂ】

【図４２】

【図４３】

【図４４】

【図４５】

【図４６】

【図４７】

【図４８−１】

【図４８−２】

【図４９】

【図５０】

【図５１】

【図５２−１】

【図５２−２】

【図５３−１】

【図５３−２】

【図５４】

【図５５−１】

【図５５−２】

【図５５−３】

【図５５−４】

【図５５−５】

【図５６】

【図５７】

【公表番号】特表２０１２−５２９２６７（Ｐ２０１２−５２９２６７Ａ）
【公表日】平成２４年１１月２２日（２０１２．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１４２１３（Ｐ２０１２−５１４２１３）
【出願日】平成２２年６月４日（２０１０．６．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３７５４４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４１９２０
【国際公開日】平成２２年１２月９日（２０１０．１２．９）
【出願人】（５１１０６２８１８）ゲノマチカ，　インク． (10)
【Ｆターム（参考）】