本発明によれば、ＲＥＰ２遺伝子またはＦＬＰ遺伝子の少なくともいずれか一方の最後の機能的コドンの１つ後の塩基と、該遺伝子に隣接する逆方向反復内のＦＲＴ部位の１つ前の塩基との間に、ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換を含んでなる、２μｍ系プラスミドが提供される。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＥＰ２遺伝子またはＦＬＰ遺伝子の少なくともいずれか一方の最後の機能的コドンの１つ後の塩基と、該遺伝子に隣接する逆方向反復内のＦＲＴ部位の１つ前の塩基との間に、ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換を含んでなる、２μｍ系プラスミド。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換を除き、ＦＬＰ遺伝子および／またはＲＥＰ２遺伝子が、天然２μｍ系プラスミド由来のＦＬＰ遺伝子および／またはＲＥＰ２遺伝子の配列をそれぞれ有するものである、請求項１に記載の２μｍ系プラスミド。
【請求項３】
天然２μｍ系プラスミドが、チゴサッカロミセス・ルクシーから得られるようなｐＳＲ１、ｐＳＢ３またはｐＳＢ４、双方ともチゴサッカロミセス・バイリーから得られるようなｐＳＢ１またはｐＳＢ２、チゴサッカロミセス・フェルメンタチから得られるようなｐＳＭ１、クルイベロミセス・ドロソフィラルムから得られるようなｐＫＤ１、ピキア・メンブラネファシエンスから得られるようなｐＰＭ１、およびサッカロミセス・セレビシエから得られるような２μｍプラスミドから選択される、請求項１に記載の２μｍ系プラスミド。
【請求項４】
前記ＦＬＰおよび／またはＲＥＰ２遺伝子に隣接する逆方向反復の配列が、その遺伝子が由来する配列と同じ天然２μｍ系プラスミドの対応する逆方向反復の配列に由来するものである、請求項２または３に記載の２μｍ系プラスミド。
【請求項５】
天然２μｍ系プラスミドがサッカロミセス・セレビシエから得られるような２μｍプラスミドである、請求項２〜４のいずれか一項に記載の２μｍ系プラスミド。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換が、ＲＥＰ２遺伝子のコドン５９の最初の塩基と、隣接する逆方向反復内のＦＲＴ部位の１つ前の塩基の間の位置に存在する、請求項５に記載の２μｍ系プラスミド。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換を除き、ＲＥＰ２遺伝子および隣接する逆方向反復の配列が、配列番号１で定義されたものまたはその変異体である、請求項５または６に記載の２μｍ系プラスミド。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換が、逆方向反復の最初の塩基とＦＲＴ部位の１つ前の塩基の間の位置に存在する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の２μｍ系プラスミド。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換が、ＲＥＰ２コード配列の終末端の１つ後の塩基とＦＲＴ部位の１つ前の塩基の間、例えば、ＲＥＰ２コード配列の終末端の１つ後の塩基に存在する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の２μｍ系プラスミド。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換を除き、ＲＥＰ２コード配列の後に続く逆方向反復が、サッカロミセス・セレビシエから得られるような２μｍプラスミドの対応する領域に由来する配列を有し、好ましくは、そのポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換が逆方向反復内のＸｃｍＩ部位またはＦｓｐＩ部位に存在する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の２μｍ系プラスミド。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換が、ＦＬＰ遺伝子のコドン３４４の最初の塩基と、隣接する逆方向反復内のＦＲＴ部位の１つ前の塩基の間の位置に存在する、請求項５に記載の２μｍ系プラスミド。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換を除き、ＦＬＰコード配列および隣接する逆方向反復の配列が、配列番号２で定義されたもの、またはその変異体である、請求項５または１１に記載の２μｍ系プラスミド。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換が、逆方向反復の最初の塩基とＦＲＴ部位の１つ前の塩基の間の位置に存在する、請求項１１または１２に記載の２μｍ系プラスミド。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換が、ＦＬＰコード配列の終末端の１つ後の塩基と、ＦＲＴ部位の１つ前の塩基の間の位置に存在する、請求項１３に記載の２μｍ系プラスミド。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換が、ＦＬＰコード配列の終末端の１つ後の塩基に存在する、請求項１４に記載の２μｍ系プラスミド。
【請求項１６】
前記ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換を除き、ＦＬＰ遺伝子の後に続く逆方向反復が、サッカロミセス・セレビシエから得られるような２μｍプラスミドの対応する領域に由来する配列を有し、好ましくは、前記ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換が逆方向反復内のＨｇａＩ部位またはＦｓｐＩ部位に存在する、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の２μｍ系プラスミド。
【請求項１７】
ＲＥＰ２遺伝子およびＦＬＰ遺伝子の双方の最後の機能的コドンの１つ後の塩基と、該遺伝子の各々に隣接する逆方向反復内のＦＲＴ部位の１つ前の塩基との間に、ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換を含んでなり、これらのポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換が同じであっても異なっていてもよい、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の２μｍ系プラスミド。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項で定義された位置にはない、ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換をさらに含んでなる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の２μｍ系プラスミド。
【請求項１９】
前記ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換が、ＡＲＳ配列の前後の非転写領域内に存在する、請求項１８に記載の２μｍ系プラスミド。
【請求項２０】
前記ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失および／または置換、またはその少なくとも一つがポリヌクレオチド配列の挿入である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の２μｍ系プラスミド。
【請求項２１】
前記ポリヌクレオチド配列の挿入がオープンリーディングフレームをコードするものである、請求項２０に記載の２μｍ系プラスミド。
【請求項２２】
前記オープンリーディングフレームが非２μｍ系プラスミドタンパク質をコードするものである、請求項２１に記載の２μｍ系プラスミド。
【請求項２３】
前記非２μｍ系プラスミドタンパク質が、タンパク質フォールディングに関与する、またはシャペロン活性を有するか、もしくは折り畳み異常タンパク質応答に関与するタンパク質、アルブミン、モノクローナル抗体、エトポシド、血清タンパク質（例えば、血液凝固因子）、アンチスタシン、ｔｉｃｋ抗凝固ペプチド、トランスフェリン、ラクトフェリン、エンドスタチン、アンギオスタチン、コラーゲン、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンに基づく分子またはいずれかの断片（例えば、ｄＡｂ、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＡｂ、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ断片）、Ｋｕｎｉｔｚドメインタンパク質、インターフェロン、インターロイキン、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ２、インターフェロンα種および亜種、インターフェロンβ種および亜種、インターフェロンγ種および亜種、レプチン、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＦ_ＡＸ１５、ＩＬ１−受容体アンタゴニスト、エリスロポエチン（ＥＰＯ）およびＥＰＯ模倣体、トロンボポエチン（ＴＰＯ）およびＴＰＯ模倣体、プロサプチド、シアノビリン−Ｎ，５−ヘリックス、Ｔ２０ペプチド、Ｔ１２４９ペプチド、ＨＩＶｇｐ４１、ＨＩＶ ｇｐ１２０、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ｔＰＡ、ヒルディン、血小板由来増殖因子、副甲状腺ホルモン、プロインスリン、インスリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、インスリン様増殖因子、カルシトニン、成長ホルモン、トランスフォーミング増殖因子β、腫瘍壊死因子、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、プレ型および活性型双方の凝固因子（限定されるものではないが、プラスミノーゲン、フィブリノーゲン、トロンビン、プレトロンビン、プロトロンビン、フォン・ウィルブランド因子、α_１アンチトリプシン、プラスミノーゲンアクチベーター、因子VII、因子VIII、因子IX、因子Ｘおよび因子XIIIを含む）、神経増殖因子、ＬＡＣＩ、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、グルコースオキシダーゼ、血清コリンエステラーゼ、アプロチニン、アミロイド前駆体タンパク質、インターαトリプシン阻害剤、抗トロンビンIII、アポリポタンパク質種、Ｃタンパク質、Ｓタンパク質、または前記のいずれかの変異体もしくは断片の配列を含むものである、請求項２２に記載の２μｍ系プラスミド。
【請求項２４】
前記非２μｍ系プラスミドタンパク質が、アルブミン、その変異体もしくは断片、またはこれらのいずれかの配列を含む融合タンパク質の配列を含むものである、請求項２３に記載の２μｍ系プラスミド。
【請求項２５】
前記非２μｍ系プラスミドタンパク質が、トランスフェリン、その変異体もしくは断片、またはこれらのいずれかの配列を含む融合タンパク質の配列を含むものである、請求項２３に記載の２μｍ系プラスミド。
【請求項２６】
前記非２μｍ系プラスミドタンパク質が、ラクトフェリン、その変異体もしくは断片、またはこれらのいずれかの配列を含む融合タンパク質の配列を含むものである、請求項２３に記載の２μｍ系プラスミド。
【請求項２７】
前記非２μｍ系プラスミドタンパク質が、Ｆｃ、その変異体もしくはその断片、またはこれらのいずれかの配列を含む融合タンパク質の配列を含むものである、請求項２３に記載の２μｍ系プラスミド。
【請求項２８】
前記非２μｍ系プラスミドタンパク質が、ＡＨＡ１、ＣＣＴ２、ＣＣＴ３、ＣＣＴ４、ＣＣＴ５、ＣＣＴ６、ＣＣＴ７、ＣＣＴ８、ＣＮＳ１、ＣＰＲ３、ＣＰＲ６、ＥＰＳ１、ＥＲＯ１、ＥＵＧ１、ＦＭＯ１、ＨＣＨ１、ＨＳＰ１０、ＨＳＰ１２、ＨＳＰ１０４、ＨＳＰ２６、ＨＳＰ３０、ＨＳＰ４２、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７８、ＨＳＰ８２、ＪＥＭ１、ＭＤＪ１、ＭＤＪ２、ＭＰＤ１、ＭＰＤ２、ＰＤＩ１、ＰＦＤ１、ＡＢＣ１、ＡＰＪ１、ＡＴＰ１１、ＡＴＰ１２、ＢＴＴ１、ＣＤＣ３７、ＣＰＲ７、ＨＳＣ８２、ＫＡＲ２、ＬＨＳ１、ＭＧＥ１、ＭＲＳ１１、ＮＯＢ１、ＥＣＭ１０、ＳＳＡ１、ＳＳＡ２、ＳＳＡ３、ＳＳＡ４、ＳＳＣ１、ＳＳＥ２、ＳＩＬ１、ＳＬＳ１、ＵＢＩ４、ＯＲＭ１、ＯＲＭ２、ＰＥＲ１、ＰＴＣ２、ＰＳＥ１およびＨＡＣ１または末端切断型イントロンレスＨＡＣ１のいずれか一つによりコードされているような、タンパク質フォールディングに関与する、またはシャペロン活性を有するか、もしくは折り畳み異常タンパク質応答に関与するタンパク質の配列を含むものである、請求項２３に記載の２μｍ系プラスミド。
【請求項２９】
前記シャペロンが、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）であるか、またはＯＲＭ２、ＳＳＡ１もしくはＰＳＥ１によりコードされるタンパク質である、請求項２３または２８に記載の２μｍ系プラスミド。
【請求項３０】
前記非２μｍ系プラスミドタンパク質が分泌リーダー配列を含むものである、請求項２２〜２９のいずれか一項に記載の２μｍ系プラスミド。
【請求項３１】
前記非２μｍ系プラスミドタンパク質が細菌選択マーカーおよび／または酵母選択マーカーの配列を含むものである、請求項２２に記載の２μｍ系プラスミド。
【請求項３２】
前記細菌選択マーカーがβ−ラクタマーゼ遺伝子であり、かつ／または前記酵母選択マーカーがＬＥＵ２選択マーカーである、請求項３１に記載の２μｍ系プラスミド。
【請求項３３】
（ｉ）非２μｍ系プラスミドタンパク質をコードする異種配列；（ii）タンパク質フォールディングに関与するタンパク質、シャペロン、または折り畳み異常タンパク質応答に関与するタンパク質、好ましくはタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの配列を含むタンパク質をコードする異種配列；および（iii）選択マーカーの配列を含むタンパク質をコードする異種配列、を含んでなり、これらの異種配列のうち少なくとも一つが請求項１〜１６のいずれか一項で定義された位置に存在する、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の２μｍ系プラスミド。
【請求項３４】
請求項１〜３３のいずれか一項で定義されたプラスミドを作製する方法であって、
（ａ）ＲＥＰ２遺伝子とＲＥＰ２遺伝子の後に続く逆方向反復、またはＦＬＰ遺伝子とＦＬＰ遺伝子の後に続く逆方向反復の配列を含んでなり、それぞれの場合において、その逆方向反復がＦＲＴ部位を含むものである、プラスミドを準備すること、
（ｂ）ポリヌクレオチド配列を準備し、そのポリヌクレオチド配列を、プラスミドの請求項１〜１６のいずれか一項で定義された位置に挿入すること、および／または
（ｃ）請求項１〜１６のいずれか一項で定義された位置のヌクレオチド塩基の一部または総てを欠失させること、および／または
（ｄ）請求項１〜１６のいずれか一項で定義された位置のヌクレオチド塩基の一部または総てを別のヌクレオチド塩基で置換すること
を含んでなる、方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法によって得られる、プラスミド。
【請求項３６】
請求項１〜３３および３５のいずれか一項で定義されたプラスミドを含んでなる、宿主細胞。
【請求項３７】
酵母細胞である、請求項３６に記載の宿主細胞。
【請求項３８】
プラスミドがマルチコピープラスミドとして安定である、請求項３６または３７に記載の宿主細胞。
【請求項３９】
プラスミドがｐＳＲ１、ｐＳＢ３もしくはｐＳＢ４に基づくものであって、酵母細胞がチゴサッカロミセス・ルクシーであるか、プラスミドがｐＳＢ１もしくはｐＳＢ２に基づくものであって、酵母細胞がチゴサッカロミセス・バイリーであるか、プラスミドがｐＳＭ１に基づくものであって、酵母細胞がチゴサッカロミセス・フェルメンタチであるか、プラスミドがｐＫＤ１に基づくものであって、酵母細胞がクルイベロミセス・ドロソフィラルムであるか、プラスミドがｐＰＭ１に基づくものであって、酵母細胞がピキア・メンブラネファシエンスであるか、またはプラスミドが２μｍプラスミドに基づくものであって、酵母細胞がサッカロミセス・セレビシエもしくはサッカロミセス・カルルスベルゲネシスである、請求項３８に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
プラスミドが選択マーカーを含むか、または含むように改変されている場合に、マーカーの欠損によって測定される安定性が、５世代後に、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％または実質的に１００％である、請求項３８または３９に記載の宿主細胞。
【請求項４１】
タンパク質を製造する方法であって、
（ａ）請求項１〜３３または３５のいずれか一項で定義されたプラスミドを準備する工程、
（ｂ）好適な宿主細胞を準備する工程、
（ｃ）宿主細胞をそのプラスミドで形質転換する工程、および
（ｄ）その形質転換宿主細胞を培養培地中で培養する工程、
（ｅ）これによりタンパク質を生産する工程
を含んでなる、方法。
【請求項４２】
タンパク質を製造する方法であって、請求項１〜３３または３５のいずれか一項で定義されたプラスミドを含む、請求項３６〜４０のいずれか一項で定義された宿主細胞を準備する工程、およびその宿主細胞を培養培地中で培養することによってタンパク質を生産する工程を含んでなる、方法。
【請求項４３】
生産されたタンパク質を培養宿主細胞または培養培地から単離する工程をさらに含んでなる、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
単離されたタンパク質を商業上許容されるレベルの純度にまで精製する工程をさらに含んでなる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
精製されたタンパク質を担体または希釈剤とともに製剤化する工程、および、所望により、このようにして製剤化されたタンパク質を単位形で提供する工程をさらに含んでなる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
単離されたタンパク質を医薬上許容されるレベルの純度にまで精製する工程をさらに含んでなる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
精製されたタンパク質を医薬上許容される担体または希釈剤とともに製剤化する工程、および、所望により、このようにして製剤化されたタンパク質を単位投与形で提供する工程をさらに含んでなる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
宿主酵母細胞においてその必須タンパク質をコードする遺伝子が欠失または不活性化された場合に、その宿主細胞は培養系では生存できず、かつ、その欠陥が培養培地に対する付加または改変によっては補償できないという意味で、宿主酵母細胞の生存力に必須のタンパク質をコードする遺伝子を単独の酵母選択マーカーとして含んでなる、プラスミド。
【請求項４９】
前記必須タンパク質をコードする遺伝子が、プラスミドによりコードされる単独の選択マーカーである、請求項４８に記載のプラスミド。
【請求項５０】
前記必須タンパク質がシャペロンである、請求項４８または４９に記載のプラスミド。
【請求項５１】
前記シャペロンがタンパク質ジスルフィドイソメラーゼまたはＰｓｅ１ｐである、請求項５１に記載のプラスミド。
【請求項５２】
請求項２３〜２７のいずれか一項で定義されたタンパク質のような、非２μｍ系プラスミドタンパク質をコードする遺伝子をさらに含んでなる、請求項４８〜５１のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項５３】
２μｍ系プラスミドである、請求項４８〜５２のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項５４】
請求項１〜３３のいずれか一項で定義されたプラスミドである、請求項５３に記載のプラスミド。
【請求項５５】
その宿主細胞の生存力に必須のタンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミドを含んでなる宿主細胞であって、該プラスミドの不在下では宿主細胞は必須タンパク質が生産できず、かつ、培養培地に対する付加または改変によっては生存力が得られない、宿主細胞。
【請求項５６】
前記プラスミドが請求項１〜３３または４８〜５４のいずれか一項に記載のプラスミドである、請求項５５に記載の宿主細胞。
【請求項５７】
前記プラスミドの不在下では生存できない、請求項５５または５６に記載の宿主細胞。
【請求項５８】
請求項２３〜２７のいずれか一項で定義されたタンパク質のような、目的のタンパク質をコードする組換え遺伝子をさらに含んでなる、請求項５５〜５７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５９】
目的のタンパク質が請求項２３〜２７のいずれか一項で定義された非２μｍ系プラスミドタンパク質である、請求項５８に記載の宿主細胞。
【請求項６０】
前記必須タンパク質が、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼまたはＰＳＥ１などのシャペロンである、請求項５９に記載の宿主細胞。
【請求項６１】
前記組換え遺伝子が、前記必須タンパク質をコードする遺伝子と同じプラスミド上に存在している、請求項５９または６０に記載の宿主細胞。
【請求項６２】
目的の組換えタンパク質を製造する方法であって、請求項５９〜６１のいずれか一項で定義された宿主細胞を準備する工程、該宿主細胞を、培養培地中、必須タンパク質および目的のタンパク質の発現を可能とする条件下で培養する工程、ならびに、所望により、このようにして発現した目的のタンパク質を培養宿主細胞または培養培地から単離する工程、ならびに、所望により、このようにして単離された目的のタンパク質を商業上許容されるレベルの純度にまで精製する工程、さらには、所望により、このようにして精製されたタンパク質を凍結乾燥するか、または精製された目的のタンパク質を担体または希釈剤（例えば、医薬上許容される担体または希釈剤）とともに製剤化する工程、ならびに、所望により、このようにして製剤化された目的のタンパク質を単位投与形で提供する工程を含んでなる、方法。
【請求項６３】
宿主細胞を培養する工程が、宿主細胞を複合培地または富栄養培地などの非選択培地で培養することを含む、請求項６２に記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３Ａ】

【図３３Ｂ】

【図３３Ｃ】

【図３３Ｄ】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【図３９】

【図４０】

【図４１】

【図４２】

【図４３】

【図４４】

【図４５】

【図４６】

【図４７】

【図４８】

【図４９】

【図５０】

【図５１】

【図５２】

【図５３】

【図５４】

【図５５】

【図５６】

【図５７】

【図５８】

【図５９】

【図６０】

【図６１】

【図６２】

【図６３】

【図６４】

【図６５】

【図６６】

【図６７】

【図６８】

【図６９】

【図７０】

【図７１】

【図７２】

【図７３】

【図７４】

【図７５】

【図７６】

【公表番号】特表２００７−５１５９６１（Ｐ２００７−５１５９６１Ａ）
【公表日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４６３２８（Ｐ２００６−５４６３２８）
【出願日】平成１６年１２月２３日（２００４．１２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００５４３５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０６１７１９
【国際公開日】平成１７年７月７日（２００５．７．７）
【出願人】（５９１１３１５２３）ノボザイムス、デルタ、リミテッド (9)
【氏名又は名称原語表記】ＮＯＶＯＺＹＭＥＳ　ＤＥＬＴＡ　ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】