２Ｄ−ＬＣＭＳ／ＭＳ・トータルスペクトラによるタンパク質プロファイリング法
【課題】本発明の課題は、ペプチド・タンパク質の修飾又はサブユニット構造差異の検出が可能な新規のプロテオーム解析法を提供することにある。
【解決手段】細胞抽出液から、分子量５０ｋＤａ以上のタンパク質を分離・回収し、２次元液体クロマトグラフィ（２Ｄ−ＬＣ）により分画した。得られたタンパク質の各画分をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ型質量分析計により分析し、タンパク質の同定を行った。このプロテオーム解析によって得られたデータから修飾タンパク質検出のためのマイニング方法を検討し、各タンパク質の２Ｄ−ＬＣの溶出位置（マッピング情報）と質量分析により検出・同定したペプチドイオンのトータルスペクトラで量的な重みを加えて３次元化した。この結果、ビメンチン及び熱ショックタンパク質について、複数の溶出ピークが検出されることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【解決手段】細胞抽出液から、分子量５０ｋＤａ以上のタンパク質を分離・回収し、２次元液体クロマトグラフィ（２Ｄ−ＬＣ）により分画した。得られたタンパク質の各画分をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ型質量分析計により分析し、タンパク質の同定を行った。このプロテオーム解析によって得られたデータから修飾タンパク質検出のためのマイニング方法を検討し、各タンパク質の２Ｄ−ＬＣの溶出位置（マッピング情報）と質量分析により検出・同定したペプチドイオンのトータルスペクトラで量的な重みを加えて３次元化した。この結果、ビメンチン及び熱ショックタンパク質について、複数の溶出ピークが検出されることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質プロファイリング法に関し、詳しくは、試料中のペプチド・タンパク質をその性質に基づいて分離し、分離されたそれぞれのペプチド・タンパク質を同定し、量的情報を付加するタンパク質の網羅的解析方法や、該解析方法を用いて試料中のタンパク質の翻訳後修飾及び／又はサブユニット構造の差異を検出する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ポストゲノム研究としてタンパク質の構造や機能の解析が急速に進められている。なかでも、タンパク質の構造・機能解析を網羅的に行うプロテオーム解析は、癌などの特定のフェノタイプに関与するタンパク質の探索に非常に有効である。
【０００３】
従来、細胞が発現するタンパク質のプロテオーム解析には、２次元電気泳動（２ＤＥ）が用いられている（例えば、非特許文献１）。２ＤＥを用いたプロテオーム解析では、発現したタンパク質をゲルに展開し、対象とするタンパク質に対応したスポットを切り出して、トリプシン消化後、質量分析を行うことによりその種類を網羅的に同定する。しかし、手法として再現性にばらつきが大きいことと、膜タンパク質に代表される疎水性タンパク質の可溶化に問題を有する。また、２次元目のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）では、タンパク質を完全に変性した条件で分析を行うため、タンパク質のサブユニット構造は解析出来ない。
【０００４】
また近年、多次元液体クロマトグラフィを利用したショットガン法がプロテオーム解析に広く用いられている（例えば、特許文献１）。この方法では、タンパク質の混合物をトリプシンで限定分解し、得られたペプチド断片混合物を液体クロマトグラフで分離し、オンラインで質量分析を行う。イオン化したペプチド断片（親イオン）の質量と、親イオンから衝突誘起解離によって派生する娘イオンの質量を精密測定し、ゲノムデータベースと照合することで元のタンパクを網羅的に同定する。しかし、これらの既存のプロテオーム解析法では、修飾タンパク質（ペプチド）の差異は分離できるが、実際に生体内で機能しているタンパク質分子のサブユニット構造について解析することは不可能であった。
【０００５】
タンパク質の機能はそのアミノ酸配列だけでなく、様々な修飾よって調節されることが知られている。タンパク質の翻訳後修飾はタンパク質の安定性や構造等に対して広い範囲の効果を有しており、糖鎖の付加によるグリコシル化、ＡＤＰ−リボシルの付加によるＡＤＰリボシル化、脂肪酸の付加によるプレミル化（ミリソイル化及びパルミトイル化を含む）、ユビキチンの付加による（ユビキチン化）や、リン酸基の付加による（リン酸化）等が良く知られた例である。
【０００６】
また、生体内のタンパク質は、他のタンパク質やペプチド、核酸(ＤＮＡやＲＮＡ)、脂質、低分子化合物などと複合体を形成することで特定の機能を発揮する。例えば、図７に示す熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）９０は、主要な細胞内分子シャペロンの１つであり、図８に示すように他の分子シャペロンと協調し、ＡＴＰ依存的に働くことが知られている（非特許文献２）。Ｈｓｐ９０のクライアントタンパク質は、細胞増殖やアポトーシスに関与する因子が含まれていることから（図９）、Ｈｓｐ９０は抗癌剤のターゲットとなる可能性がある（図１０）。Ｈｓｐ９０には相同性の高いＨｓｐ９０αとＨｓｐ９０βが存在し、生体内ではそれぞれ二量体で機能していると考えられている。以上のように、ペプチド・タンパク質のサブユニット構造について解析することは、新規のバイオマーカーの検索や、阻害剤のデザインなど、創薬研究を含める生命科学全般において重要な情報源となる。
【０００７】
機能性タンパク質のサブユニット構造を明らかにするために、個々のタンパク質間の相互作用の解明が進められている。現在のところ、タンパク質間の相互作用を探索する代表的な手法としては、酵母Two‐Hybrid法（非特許文献３及び４）や、Tandem Affinity Purification法 (非特許文献５)などが知られている。これらは遺伝学的あるいは生化学的な手法によって、相互作用するタンパク質を同定するものであるが、タンパク質間の相互作用についての網羅的な解析（インタラクトーム解析）には適さない。また、より特異的な相互作用を測定する手法としては、表面プラズモン共鳴法 (非特許文献６）や水晶発振子マイクロバランス法 (非特許文献７及び８）などを用いた方法が知られている。これらの手法は生体高分子間の解離定数（Ｋｄ値）を測定することができる画期的な方法であるが、タンパク質やリガンドをセンサーチップ上に固定しなければならないという問題点がある。従って、より生体内に近い状況におけるタンパク質間の相互作用、ならびに機能性タンパク質のサブユニット構造をを網羅的に解析するための方法論の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特願２００６−１７０７１０
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】O'Farrell PH., J BiolChem 250: 4007-4021 (1975)
【非特許文献２】Kamal A. et al., Trends Mol Med 10: 283-290 (2004)
【非特許文献３】Fields S. Song O., Nature 340: 245-246 (1989)
【非特許文献４】Fields S. Sternglanz R., Trends Genet 10: 286-292 (1994)
【非特許文献５】Rigaut G. et al., Nat Biotechnol 17: 1030-1032 (1999)
【非特許文献６】Fagerstam L. et al., Biotechniques 11: 620-627 (1991)
【非特許文献７】Ebara Y. et al., Langmuir 12: 5165-5170 (1996)
【非特許文献８】Okahata Y. et al., Biochemistry 37: 5666-5672 (1998)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、ペプチド・タンパク質の修飾及び／又はサブユニット構造の解析が可能な新規のプロテオーム解析法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、卵巣癌由来細胞株の細胞抽出液から、分子量５０ｋＤａ以上のタンパク質を分離・回収し、２次元液体クロマトグラフィ（２Ｄ−ＬＣ）により分画した。こうして得られたタンパク質の各画分をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ型質量分析計により分析し、データベース検索でタンパク質の同定を行った。このプロテオーム解析によって得られたデータから修飾タンパク質検出のためのマイニング方法を検討し、各タンパク質の２Ｄ−ＬＣの溶出位置（マッピング情報）と質量分析により検出したペプチドイオンのトータルスペクトラで量的な重みを加えて３次元化した。このプロファイリングの結果、ビメンチン（Vimentin）及び熱ショックタンパク質（ＧＲＰ７８、Ｈｓｐ９０α及びＨｓｐ９０β）について、連続していない複数のフラクションからシグナルが検出され、量的な重み付けから複数の溶出ピークに分離できることを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明は、（１）試料中のペプチド・タンパク質をその性質に基づいて分離し、分離されたそれぞれのペプチド・タンパク質を同定し、量的情報を付加することを特徴とするペプチド・タンパク質の解析方法であって、（Ａ）試料を第１の液体クロマトグラフィにより分画し、第１分画プロファイルを得る工程と、（Ｂ）第１の液体クロマトグラフィにより分画された各フラクションを、第２の液体クロマトグラフィによりさらに分画し、第２分画プロファイルを得る工程と、（Ｃ）第２の液体クロマトグラフィにより分画された各フラクションを質量分析により解析し、得られた結果から各フラクションに含まれるタンパク質を同定し、量的情報を付加する工程とを順次備えることを特徴とする方法や、（２）上記（Ｃ）の工程の後に、さらに、（Ｄ）前記第１分画プロファイルと、前記第２分画プロファイルとを直交座標軸とする２次元座標上に、前記質量分析により同定されたそれぞれのタンパク質の量的情報を３次元座標値として表示する工程を備えることを特徴とする上記（１）記載の方法や、（３）第１の液体クロマトグラフィと第２の液体クロマトグラフィとが、異なる種類の液体クロマトグラフィであることを特徴とする上記（１）又は（２）記載の方法や、（４）質量分析が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載の方法に関する。
【００１３】
さらに本発明は、（５）上記（１）〜（４）のいずれか記載の方法を用いることを特徴とする、試料中のペプチド・タンパク質の翻訳後修飾又はサブユニット構造の差異を検出する方法や、（６）上記（１）〜（４）のいずれか記載の方法を用いることを特徴とする、試料中の翻訳後修飾されたペプチド・タンパク質、又は異なるサブユニットを構成するペプチド・タンパク質を分離・同定する方法や、（７）タンパク質が、熱ショックタンパク質、ビメンチン（Vimentin）又はサイトケラチンであることを特徴とする上記（５）又は（６）記載の方法や、（８）熱ショックタンパク質が、ＧＲＰ７８、Ｈｓｐ９０α及びＨｓｐ９０βから選択される１以上のタンパク質であることを特徴とする上記（７）記載の方法や、（９）サイトケラチンが、Ｉ型サイトケラチン９、Ｉ型サイトケラチン１０、Ｉ型サイトケラチン１６、Ｉ型サイトケラチン１９、ＩＩ型サイトケラチン１、ＩＩ型サイトケラチン１ｂ、ＩＩ型サイトケラチン２及びＩＩ型サイトケラチン６Ａから選択される１以上のサイトケラチンであることを特徴とする上記（７）記載の方法に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、ペプチド・タンパク質の修飾の有無を網羅的に解析できるだけでなく、タンパク質分子のサブユニット構造の差異を検出することが可能であり、バイオマーカーの探索等に非常に有効である。図４〜６に示すように、本発明の方法により細胞抽出液中のタンパク質を解析した結果、分子シャペロンである熱ショックタンパク質（ＧＲＰ７８、Ｈｓｐ９０α及びＨｓｐ９０β）について、異なる溶出ピークが検出された。これらの結果は、上記の熱ショックタンパク質が細胞内において異なる修飾及び／又はサブユニット構造を形成しているものと考えることが出来る。そのために分子種としては異なる性質を示すことを示唆している。このように本発明の方法を用いることにより、修飾及び／又はサブユニット構造の差異により異なる性質が付与されたペプチド・タンパク質の発現パターンを網羅的に解析することができ、癌をはじめとする様々な疾患の原因の解明や、新たな診断／治療法の確立が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の実験手順を示す図である。
【図２】本発明における、データのマイニングの概要を示す図である。
【図３】本発明の方法により解析されたタンパク質分子のプロファイルを示す図である。
【図４】本発明の方法により解析されたタンパク質分子の３次元プロファイルを示す図である。赤色のヒストグラム（三角印）がＧＲＰ７８、黄色のヒストグラム（三角印）がＨｓｐ９０α、青色のヒストグラム（三角印）がビメンチンをそれぞれ示している。
【図５】本発明の方法により解析されたタンパク質分子の３次元プロファイルを示す図である。赤色のヒストグラム（三角印）がＧＲＰ７８、黄色のヒストグラム（三角印）がＨｓｐ９０α、紫色のピークがＨｓｐ９０β、青色のヒストグラム（三角印）がビメンチンをそれぞれ示している。
【図６】本発明の方法により解析されたＨｓｐタンパク質の３次元プロファイルを示す図である。黄色のヒストグラム（三角印）がＨｓｐ９０α、紫色のヒストグラム（三角印）がＨｓｐ９０βをそれぞれ示している。
【図７】Ｈｓｐ９０タンパク質の構造及び機能について示す図である。
【図８】Ｈｓｐ９０タンパク質が新規抗癌剤のターゲットであることを示す図である。
【図９】Ｈｓｐ９０タンパク質のクライアントタンパク質が様々な細胞内シグナル伝達経路に関与することを示す図である。
【図１０】Ｈｓｐ９０阻害剤の腫瘍選択性について示す図である。
【図１１】本発明の方法により得られたＨｓｐタンパク質のＷＰＲＰカラム溶出パターンに差異が見られる理由を示す図である。
【図１２】本発明の方法により解析されたサイトケラチンのプロファイルを示す図である。上図（Ｃｏｎｔｒｏｌ）は、ゲルダナマイシン処理を行わなかった細胞（ＳＫ−ＢＲ−３）のプロファイリングを示し、下図（＋ＧＡ）は、ゲルダナマイシン処理を行った細胞（ＳＫ−ＢＲ−３）のプロファイリングを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の、試料中のペプチド・タンパク質をその性質に基づいて分離し、分離されたそれぞれのペプチド・タンパク質を同定し、量的情報を付加したペプチド・タンパク質の網羅的解析方法としては、（Ａ）試料を第１の液体クロマトグラフィにより分画し、第１分画プロファイルを得る工程；（Ｂ）第１の液体クロマトグラフィにより分画された各フラクションを、第２の液体クロマトグラフィによりさらに分画し、第２分画プロファイルを得る工程；（Ｃ）第２の液体クロマトグラフィにより分画された各フラクションを質量分析により解析し、得られた結果から各フラクションに含まれるタンパク質を同定し、量的情報を付加する工程；を順次備えるものであれば特に制限されるものではないが、上記（Ｃ）の工程の後に、さらに、（Ｄ）前記第１分画プロファイルと、前記第２分画プロファイルとを直交座標軸とする２次元座標上に、前記質量分析により同定されたそれぞれのタンパク質の量的情報を３次元座標値として表示する工程；を備えることにより、視覚的により理解し易い表示を分析者に提供でき、分析者は迅速で正確な解析を行うことができる。ここで「量的情報」とは、質量分析により得られたペプチドイオンデータから、データベース解析により同定されたペプチド断片数（種類）の総和であり、２Ｄ−ＬＣにより分画された各画分に含まれる該タンパク質の量の指標となるものである。この原理は、「同一タンパク質において、量的に多いタンパク質ほど数多くのペプチド断片を検出できる」という、Protein abundance index (ＰＡＩ)法に基づくものである（Rappsilber J. et al., Genome Res. 12: 1231-1245 (2002)）。上記データベース解析は、質量分析の結果からタンパク質を同定するための公知の検索ツールにより行うことができ、例えば、Ｍａｓｃｏｔ、Ｘ！Ｔａｎｄｅｍ、ＰｒｏＦｏｕｎｄ、ＰｒｏｔｅｉｎＰｒｏｓｐｅｃｔｅｒ、ＥｘＰＡＳｙ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｔｏｏｌｓ、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅａｒｃｈ等を用いて行うことができるが、なかでも、ＭａｓｃｏｔとＸ！Ｔａｎｄｅｍを組み合わせて用いることが好ましい。また、上記試料としては、ペプチド・タンパク質を含むものであれば特に制限されるものではなく、例えば、培養細胞や、培養細胞の培養上清や、生体より採取された生体試料（血液、唾液、リンパ液、細胞、組織等）などを好適に示すことができる。また上記試料は、第一の液体クロマトグラフィに供する前に、予め前処理されていることが好ましく、上記前処理としては、特に制限されるものではないが、例えば、Complete Lysis-M（ロシュ社製）等の公知の溶解試薬を用いた細胞及びタンパク質の溶解処理や、飽和硫酸アンモニウム溶液によるタンパク質の濃縮処理等を挙げることができる他、ゲル濾過法や限外濾過法等により試料中のペプチド・タンパクを分子量により分離する処理方法などを好適に示すことができ、これらの前処理方法を適切に選択し、組み合わせることにより、より精度の高い解析が可能となる。
【００１７】
本発明の方法に使用する液体クロマトグラフィとしては、公知の方法であれば特に制限されるものではなく、例えば、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）や、陰イオン交換クロマトグラフィや、陽イオン交換クロマトグラフィや、イオン対逆相クロマトグラフィ等を挙げることができる。本発明において、第一の液体クロマトグラフィで得られた各分画には、実質的に等しい物理化学的性質を有するタンパク質、具体的には、等しい溶出時間、疎水性、親水性、移動時間又はクロマトグラフィ保持時間等を有するタンパク質がプールされているため、第２の液体クロマトグラフィでは、上記プールされているタンパク質を、溶出時間、疎水性、親水性、移動時間又はクロマトグラフィー保持時間等に基づきさらに分離できるように、第１の液体クロマトグラフィーとは異なる方法を選択することが好ましい。
【００１８】
また、本発明の方法において使用する質量分析法は、公知の質量分析法であれば特に制限されるものではなく、イオン化法としては、例えば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法、電子イオン化法、化学イオン化法、電界離脱法、高速原子衝突法、エレクトロスプレーイオン化法、大気圧化学イオン化法等をの方法を用いることができ、また、分析法としては、例えば、飛行時間型（ＴＯＦ）、磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型等の方法を用いることができるが、なかでも、イオン化法としてＭＡＬＤＩ法を、分析法としてＴＯＦを組み合わせて用いたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法を好例として挙げることができる。
【００１９】
本発明の試料中のペプチド・タンパク質の翻訳後修飾及び／又はサブユニット構造の差異を検出する方法や、試料中の翻訳後修飾されたペプチド・タンパク質及び／又はサブユニット構造を形成するペプチド・タンパク質を分離・同定する方法としては、上記本発明のペプチド・タンパク質の網羅的解析方法を用いたものであれば特に制限されるものではなく、ここで翻訳後修飾とは、リン酸化、アシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー化、ユビキチン化などが含まれ、また上記タンパク質サブユニット構造とは、タンパク質−タンパク質間、ＤＮＡ−タンパク質、低分子化合物−タンパク質などの分子種が含まれる。これらの翻訳後修飾及び／又はサブユニット構造は、ペプチド・タンパク質の性質に影響を及ぼすことから、同一のペプチド・タンパク質であっても、異なる翻訳後修飾及び／又はタンパク質サブユニットを構成する場合、２次元液体クロマトグラフィ（２Ｄ−ＬＣ）により異なる画分として回収することができる。このため、同一のタンパク質が、複数の溶出画分から検出された場合には、該タンパク質が、試料中で異なる複数の翻訳後修飾及び／又はタンパク質サブユニットを構成していたと判断できる。例えば、図１１に示すように、本発明の方法を用いて癌細胞抽出液を解析した結果、Ｈｓｐ９０α及びＨｓｐ９０βは、３つの不連続なフラクションからシグナルが検出されたことから、細胞内で異なる３つの翻訳後修飾、あるいは異なるサブユニット構造を形成している可能性が考えられる。このように、上記本発明の網羅的解析方法を用いることにより、試料中のペプチド・タンパク質の翻訳後修飾及び／又はサブユニット構造の差異を検出することが可能となる。また、異なる試料を用いて、ペプチド・タンパク質の溶出パターンを比較検討することにより、それぞれの試料におけるペプチド・タンパク質の翻訳後修飾及び／又はサブユニット構造の差異について両者の違いを検出することが可能である。
【００２０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２１】
１．細胞培養
Ｈｅｒ２を高発現するヒト卵巣癌由来細胞株ＳＫ−ＯＶ−３細胞を、ウシ胎児血清（fetal bovine serum：ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium）培地（シグマ社製）を用いて３７℃、５％ＣＯ２存在下で２ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／フラスコとなるようＴ−７５フラスコで培養した。
【００２２】
２．培養細胞からのサンプル調製（前処理）
培養後の細胞（８ｘ１０７ｃｅｌｌｓ）を遠心回収した後、リン酸緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline：ＰＢＳ）に再懸濁し遠心回収することで余剰の培地を除いた。回収した細胞に２ｍＬのComplete Lysis-M（ロシュ社製）を加え、室温で５分間ゆるやかに振とうすることで細胞を破砕し、１４０００ ｘ ｇで１０分間の遠心分離を行った後、上清を細胞粗抽出液（crude extract）として回収した。２ｍＬの細胞粗抽出液に、４ｍＬの飽和硫酸アンモニウム溶液（終濃度６６．７％）を加え氷上で１時間静置後、１４０００ ｘ ｇで１０分間の遠心分離を行った。沈殿物（ｐｐｔ）を、０．４ｍＬのComplete Lysis-Mで溶解し、硫安沈殿画分（ＡＳ）とした。
【００２３】
３．２次元液体クロマトグラフィ（２Ｄ−ＬＣ）
ＡＳ画分をＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷカラム（東ソー社製）を用いてゲル濾過し、溶出時間１１〜１８分の溶出液１３．５ｍＬを回収し、分子量５０ｋＤａ以上のタンパク質を含むプールＡとした。次に、陰イオン交換カラムであるＭｏｎｏＱ ５／５０カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いてプールＡの分画を行い、フラクション番号１１〜３０（０．５ｍＬ／フラクション）を回収した。回収した各フラクションをさらに、逆相カラムであるＩｎｔｒａｄａＷＰ−ＲＰカラム（インタクト社製）を用いて分画し、ｗｅｌｌ番号Ｂ０１〜Ｈ１２（１２５μＬ／ｗｅｌｌ）のフラクションを９６穴プレートに回収した。ゲル濾過は、流速０．５ｍｌ／分、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．４の単一溶媒で分離を行った。イオン交換カラムは、流速１ｍＬ／分、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．４、０．１−１．０Ｍ／１５分 ＮａＣｌ濃度勾配を用いた。逆相カラムの分離では、Ａ溶媒：０．１％トリフルオロ酢酸（trifluoroaceticacid：ＴＦＡ）水溶液、Ｂ溶媒：０．０８％ＴＦＡ、アセトニトリル、以上二溶媒を用いて、流速０．５ｍＬ／分、％Ｂ：２０−１００／３０分の条件で行った。
【００２４】
４．質量分析
得られたサンプルを９６穴プレート上で減圧乾固した後、１３ｎｇトリプシン（プロメガ社製）、０．１％ＲａｐｉＧｅｓｔ（Waters社製）を含む５０ｍＭ重炭酸アンモニウム３０μＬで可溶化した後、３７℃で９０分間トリプシン加水分解を行い、塩酸を加えて（終濃度０．０５Ｎ）反応を停止した。得られたトリプシン加水分解物をＺｉｐＴｉｐ（ミリポア社製）処理により脱塩・濃縮を行った後、２．４ｍｇ／ｍＬ、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（α-cyano-4-hydroxy-cynnamic acid：ＣＨＣＡ）５０％アセトニトリル溶液４μＬに溶解し、Proteomics analyzer 4700（Matrix-assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry、Applied Biosystems社製）を用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ質量分析を行った。得られたＭＳ／ＭＳスペクトルについて、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースを用いたＭＡＳＣＯＴ（www.matrixscience.com）及びＸ！Ｔａｎｄｅｍ（www.thegpm.org）サーチを行い、タンパク質の同定を行った。タンパク質の同定基準は、親イオンの許容誤差範囲（parent tolerance）：０．８Ｄａ（モノアイソトピック質量）、フラグメントイオンの許容誤差範囲（fragment tolerance）：０．８Ｄａ（モノアイソトピック質量）で行った。Scaffold (www.proteomesoftware.com)によりデータマイニングを行った。ＭＡＳＣＯＴサーチの結果とＸ！Ｔａｎｄｅｍサーチの結果を統合し、ペプチド許容基準：９０％以上、タンパク質許容基準：９０％以上、これらの基準を満たしたペプチドイオンについて、各タンパク質で集計を行いトータルスペクトラとした。
【００２５】
５．タンパク質プロファイリング
以上のようにして得られた、各タンパク質の２Ｄ−ＬＣのマッピング情報と質量分析で検出したペプチドのトータルスペクトラとを組み合わせ、マイクロソフトエクセル(登録商標；www.microsoft.com)によりタンパク質のプロファイリングを行った（図３）。その結果、ＧＲＰ７８、ビメンチン（Vimentin）、Ｈｓｐ９０α、Ｈｓｐ９０β及びサイトケラチンについて、連続していない複数のフラクションからシグナルが検出され、異なる溶出ピークの出現を確認した（図４〜６、１１、１２）。このような複数の溶出ピークを示すタンパク質は、細胞内において異なる複数の翻訳後修飾又は異なるサブユニット構造を形成していたと考えられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質プロファイリング法に関し、詳しくは、試料中のペプチド・タンパク質をその性質に基づいて分離し、分離されたそれぞれのペプチド・タンパク質を同定し、量的情報を付加するタンパク質の網羅的解析方法や、該解析方法を用いて試料中のタンパク質の翻訳後修飾及び／又はサブユニット構造の差異を検出する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ポストゲノム研究としてタンパク質の構造や機能の解析が急速に進められている。なかでも、タンパク質の構造・機能解析を網羅的に行うプロテオーム解析は、癌などの特定のフェノタイプに関与するタンパク質の探索に非常に有効である。
【０００３】
従来、細胞が発現するタンパク質のプロテオーム解析には、２次元電気泳動（２ＤＥ）が用いられている（例えば、非特許文献１）。２ＤＥを用いたプロテオーム解析では、発現したタンパク質をゲルに展開し、対象とするタンパク質に対応したスポットを切り出して、トリプシン消化後、質量分析を行うことによりその種類を網羅的に同定する。しかし、手法として再現性にばらつきが大きいことと、膜タンパク質に代表される疎水性タンパク質の可溶化に問題を有する。また、２次元目のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）では、タンパク質を完全に変性した条件で分析を行うため、タンパク質のサブユニット構造は解析出来ない。
【０００４】
また近年、多次元液体クロマトグラフィを利用したショットガン法がプロテオーム解析に広く用いられている（例えば、特許文献１）。この方法では、タンパク質の混合物をトリプシンで限定分解し、得られたペプチド断片混合物を液体クロマトグラフで分離し、オンラインで質量分析を行う。イオン化したペプチド断片（親イオン）の質量と、親イオンから衝突誘起解離によって派生する娘イオンの質量を精密測定し、ゲノムデータベースと照合することで元のタンパクを網羅的に同定する。しかし、これらの既存のプロテオーム解析法では、修飾タンパク質（ペプチド）の差異は分離できるが、実際に生体内で機能しているタンパク質分子のサブユニット構造について解析することは不可能であった。
【０００５】
タンパク質の機能はそのアミノ酸配列だけでなく、様々な修飾よって調節されることが知られている。タンパク質の翻訳後修飾はタンパク質の安定性や構造等に対して広い範囲の効果を有しており、糖鎖の付加によるグリコシル化、ＡＤＰ−リボシルの付加によるＡＤＰリボシル化、脂肪酸の付加によるプレミル化（ミリソイル化及びパルミトイル化を含む）、ユビキチンの付加による（ユビキチン化）や、リン酸基の付加による（リン酸化）等が良く知られた例である。
【０００６】
また、生体内のタンパク質は、他のタンパク質やペプチド、核酸(ＤＮＡやＲＮＡ)、脂質、低分子化合物などと複合体を形成することで特定の機能を発揮する。例えば、図７に示す熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）９０は、主要な細胞内分子シャペロンの１つであり、図８に示すように他の分子シャペロンと協調し、ＡＴＰ依存的に働くことが知られている（非特許文献２）。Ｈｓｐ９０のクライアントタンパク質は、細胞増殖やアポトーシスに関与する因子が含まれていることから（図９）、Ｈｓｐ９０は抗癌剤のターゲットとなる可能性がある（図１０）。Ｈｓｐ９０には相同性の高いＨｓｐ９０αとＨｓｐ９０βが存在し、生体内ではそれぞれ二量体で機能していると考えられている。以上のように、ペプチド・タンパク質のサブユニット構造について解析することは、新規のバイオマーカーの検索や、阻害剤のデザインなど、創薬研究を含める生命科学全般において重要な情報源となる。
【０００７】
機能性タンパク質のサブユニット構造を明らかにするために、個々のタンパク質間の相互作用の解明が進められている。現在のところ、タンパク質間の相互作用を探索する代表的な手法としては、酵母Two‐Hybrid法（非特許文献３及び４）や、Tandem Affinity Purification法 (非特許文献５)などが知られている。これらは遺伝学的あるいは生化学的な手法によって、相互作用するタンパク質を同定するものであるが、タンパク質間の相互作用についての網羅的な解析（インタラクトーム解析）には適さない。また、より特異的な相互作用を測定する手法としては、表面プラズモン共鳴法 (非特許文献６）や水晶発振子マイクロバランス法 (非特許文献７及び８）などを用いた方法が知られている。これらの手法は生体高分子間の解離定数（Ｋｄ値）を測定することができる画期的な方法であるが、タンパク質やリガンドをセンサーチップ上に固定しなければならないという問題点がある。従って、より生体内に近い状況におけるタンパク質間の相互作用、ならびに機能性タンパク質のサブユニット構造をを網羅的に解析するための方法論の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特願２００６−１７０７１０
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】O'Farrell PH., J BiolChem 250: 4007-4021 (1975)
【非特許文献２】Kamal A. et al., Trends Mol Med 10: 283-290 (2004)
【非特許文献３】Fields S. Song O., Nature 340: 245-246 (1989)
【非特許文献４】Fields S. Sternglanz R., Trends Genet 10: 286-292 (1994)
【非特許文献５】Rigaut G. et al., Nat Biotechnol 17: 1030-1032 (1999)
【非特許文献６】Fagerstam L. et al., Biotechniques 11: 620-627 (1991)
【非特許文献７】Ebara Y. et al., Langmuir 12: 5165-5170 (1996)
【非特許文献８】Okahata Y. et al., Biochemistry 37: 5666-5672 (1998)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、ペプチド・タンパク質の修飾及び／又はサブユニット構造の解析が可能な新規のプロテオーム解析法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、卵巣癌由来細胞株の細胞抽出液から、分子量５０ｋＤａ以上のタンパク質を分離・回収し、２次元液体クロマトグラフィ（２Ｄ−ＬＣ）により分画した。こうして得られたタンパク質の各画分をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ型質量分析計により分析し、データベース検索でタンパク質の同定を行った。このプロテオーム解析によって得られたデータから修飾タンパク質検出のためのマイニング方法を検討し、各タンパク質の２Ｄ−ＬＣの溶出位置（マッピング情報）と質量分析により検出したペプチドイオンのトータルスペクトラで量的な重みを加えて３次元化した。このプロファイリングの結果、ビメンチン（Vimentin）及び熱ショックタンパク質（ＧＲＰ７８、Ｈｓｐ９０α及びＨｓｐ９０β）について、連続していない複数のフラクションからシグナルが検出され、量的な重み付けから複数の溶出ピークに分離できることを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明は、（１）試料中のペプチド・タンパク質をその性質に基づいて分離し、分離されたそれぞれのペプチド・タンパク質を同定し、量的情報を付加することを特徴とするペプチド・タンパク質の解析方法であって、（Ａ）試料を第１の液体クロマトグラフィにより分画し、第１分画プロファイルを得る工程と、（Ｂ）第１の液体クロマトグラフィにより分画された各フラクションを、第２の液体クロマトグラフィによりさらに分画し、第２分画プロファイルを得る工程と、（Ｃ）第２の液体クロマトグラフィにより分画された各フラクションを質量分析により解析し、得られた結果から各フラクションに含まれるタンパク質を同定し、量的情報を付加する工程とを順次備えることを特徴とする方法や、（２）上記（Ｃ）の工程の後に、さらに、（Ｄ）前記第１分画プロファイルと、前記第２分画プロファイルとを直交座標軸とする２次元座標上に、前記質量分析により同定されたそれぞれのタンパク質の量的情報を３次元座標値として表示する工程を備えることを特徴とする上記（１）記載の方法や、（３）第１の液体クロマトグラフィと第２の液体クロマトグラフィとが、異なる種類の液体クロマトグラフィであることを特徴とする上記（１）又は（２）記載の方法や、（４）質量分析が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載の方法に関する。
【００１３】
さらに本発明は、（５）上記（１）〜（４）のいずれか記載の方法を用いることを特徴とする、試料中のペプチド・タンパク質の翻訳後修飾又はサブユニット構造の差異を検出する方法や、（６）上記（１）〜（４）のいずれか記載の方法を用いることを特徴とする、試料中の翻訳後修飾されたペプチド・タンパク質、又は異なるサブユニットを構成するペプチド・タンパク質を分離・同定する方法や、（７）タンパク質が、熱ショックタンパク質、ビメンチン（Vimentin）又はサイトケラチンであることを特徴とする上記（５）又は（６）記載の方法や、（８）熱ショックタンパク質が、ＧＲＰ７８、Ｈｓｐ９０α及びＨｓｐ９０βから選択される１以上のタンパク質であることを特徴とする上記（７）記載の方法や、（９）サイトケラチンが、Ｉ型サイトケラチン９、Ｉ型サイトケラチン１０、Ｉ型サイトケラチン１６、Ｉ型サイトケラチン１９、ＩＩ型サイトケラチン１、ＩＩ型サイトケラチン１ｂ、ＩＩ型サイトケラチン２及びＩＩ型サイトケラチン６Ａから選択される１以上のサイトケラチンであることを特徴とする上記（７）記載の方法に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、ペプチド・タンパク質の修飾の有無を網羅的に解析できるだけでなく、タンパク質分子のサブユニット構造の差異を検出することが可能であり、バイオマーカーの探索等に非常に有効である。図４〜６に示すように、本発明の方法により細胞抽出液中のタンパク質を解析した結果、分子シャペロンである熱ショックタンパク質（ＧＲＰ７８、Ｈｓｐ９０α及びＨｓｐ９０β）について、異なる溶出ピークが検出された。これらの結果は、上記の熱ショックタンパク質が細胞内において異なる修飾及び／又はサブユニット構造を形成しているものと考えることが出来る。そのために分子種としては異なる性質を示すことを示唆している。このように本発明の方法を用いることにより、修飾及び／又はサブユニット構造の差異により異なる性質が付与されたペプチド・タンパク質の発現パターンを網羅的に解析することができ、癌をはじめとする様々な疾患の原因の解明や、新たな診断／治療法の確立が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の実験手順を示す図である。
【図２】本発明における、データのマイニングの概要を示す図である。
【図３】本発明の方法により解析されたタンパク質分子のプロファイルを示す図である。
【図４】本発明の方法により解析されたタンパク質分子の３次元プロファイルを示す図である。赤色のヒストグラム（三角印）がＧＲＰ７８、黄色のヒストグラム（三角印）がＨｓｐ９０α、青色のヒストグラム（三角印）がビメンチンをそれぞれ示している。
【図５】本発明の方法により解析されたタンパク質分子の３次元プロファイルを示す図である。赤色のヒストグラム（三角印）がＧＲＰ７８、黄色のヒストグラム（三角印）がＨｓｐ９０α、紫色のピークがＨｓｐ９０β、青色のヒストグラム（三角印）がビメンチンをそれぞれ示している。
【図６】本発明の方法により解析されたＨｓｐタンパク質の３次元プロファイルを示す図である。黄色のヒストグラム（三角印）がＨｓｐ９０α、紫色のヒストグラム（三角印）がＨｓｐ９０βをそれぞれ示している。
【図７】Ｈｓｐ９０タンパク質の構造及び機能について示す図である。
【図８】Ｈｓｐ９０タンパク質が新規抗癌剤のターゲットであることを示す図である。
【図９】Ｈｓｐ９０タンパク質のクライアントタンパク質が様々な細胞内シグナル伝達経路に関与することを示す図である。
【図１０】Ｈｓｐ９０阻害剤の腫瘍選択性について示す図である。
【図１１】本発明の方法により得られたＨｓｐタンパク質のＷＰＲＰカラム溶出パターンに差異が見られる理由を示す図である。
【図１２】本発明の方法により解析されたサイトケラチンのプロファイルを示す図である。上図（Ｃｏｎｔｒｏｌ）は、ゲルダナマイシン処理を行わなかった細胞（ＳＫ−ＢＲ−３）のプロファイリングを示し、下図（＋ＧＡ）は、ゲルダナマイシン処理を行った細胞（ＳＫ−ＢＲ−３）のプロファイリングを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の、試料中のペプチド・タンパク質をその性質に基づいて分離し、分離されたそれぞれのペプチド・タンパク質を同定し、量的情報を付加したペプチド・タンパク質の網羅的解析方法としては、（Ａ）試料を第１の液体クロマトグラフィにより分画し、第１分画プロファイルを得る工程；（Ｂ）第１の液体クロマトグラフィにより分画された各フラクションを、第２の液体クロマトグラフィによりさらに分画し、第２分画プロファイルを得る工程；（Ｃ）第２の液体クロマトグラフィにより分画された各フラクションを質量分析により解析し、得られた結果から各フラクションに含まれるタンパク質を同定し、量的情報を付加する工程；を順次備えるものであれば特に制限されるものではないが、上記（Ｃ）の工程の後に、さらに、（Ｄ）前記第１分画プロファイルと、前記第２分画プロファイルとを直交座標軸とする２次元座標上に、前記質量分析により同定されたそれぞれのタンパク質の量的情報を３次元座標値として表示する工程；を備えることにより、視覚的により理解し易い表示を分析者に提供でき、分析者は迅速で正確な解析を行うことができる。ここで「量的情報」とは、質量分析により得られたペプチドイオンデータから、データベース解析により同定されたペプチド断片数（種類）の総和であり、２Ｄ−ＬＣにより分画された各画分に含まれる該タンパク質の量の指標となるものである。この原理は、「同一タンパク質において、量的に多いタンパク質ほど数多くのペプチド断片を検出できる」という、Protein abundance index (ＰＡＩ)法に基づくものである（Rappsilber J. et al., Genome Res. 12: 1231-1245 (2002)）。上記データベース解析は、質量分析の結果からタンパク質を同定するための公知の検索ツールにより行うことができ、例えば、Ｍａｓｃｏｔ、Ｘ！Ｔａｎｄｅｍ、ＰｒｏＦｏｕｎｄ、ＰｒｏｔｅｉｎＰｒｏｓｐｅｃｔｅｒ、ＥｘＰＡＳｙ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｔｏｏｌｓ、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｅａｒｃｈ等を用いて行うことができるが、なかでも、ＭａｓｃｏｔとＸ！Ｔａｎｄｅｍを組み合わせて用いることが好ましい。また、上記試料としては、ペプチド・タンパク質を含むものであれば特に制限されるものではなく、例えば、培養細胞や、培養細胞の培養上清や、生体より採取された生体試料（血液、唾液、リンパ液、細胞、組織等）などを好適に示すことができる。また上記試料は、第一の液体クロマトグラフィに供する前に、予め前処理されていることが好ましく、上記前処理としては、特に制限されるものではないが、例えば、Complete Lysis-M（ロシュ社製）等の公知の溶解試薬を用いた細胞及びタンパク質の溶解処理や、飽和硫酸アンモニウム溶液によるタンパク質の濃縮処理等を挙げることができる他、ゲル濾過法や限外濾過法等により試料中のペプチド・タンパクを分子量により分離する処理方法などを好適に示すことができ、これらの前処理方法を適切に選択し、組み合わせることにより、より精度の高い解析が可能となる。
【００１７】
本発明の方法に使用する液体クロマトグラフィとしては、公知の方法であれば特に制限されるものではなく、例えば、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）や、陰イオン交換クロマトグラフィや、陽イオン交換クロマトグラフィや、イオン対逆相クロマトグラフィ等を挙げることができる。本発明において、第一の液体クロマトグラフィで得られた各分画には、実質的に等しい物理化学的性質を有するタンパク質、具体的には、等しい溶出時間、疎水性、親水性、移動時間又はクロマトグラフィ保持時間等を有するタンパク質がプールされているため、第２の液体クロマトグラフィでは、上記プールされているタンパク質を、溶出時間、疎水性、親水性、移動時間又はクロマトグラフィー保持時間等に基づきさらに分離できるように、第１の液体クロマトグラフィーとは異なる方法を選択することが好ましい。
【００１８】
また、本発明の方法において使用する質量分析法は、公知の質量分析法であれば特に制限されるものではなく、イオン化法としては、例えば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法、電子イオン化法、化学イオン化法、電界離脱法、高速原子衝突法、エレクトロスプレーイオン化法、大気圧化学イオン化法等をの方法を用いることができ、また、分析法としては、例えば、飛行時間型（ＴＯＦ）、磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型等の方法を用いることができるが、なかでも、イオン化法としてＭＡＬＤＩ法を、分析法としてＴＯＦを組み合わせて用いたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法を好例として挙げることができる。
【００１９】
本発明の試料中のペプチド・タンパク質の翻訳後修飾及び／又はサブユニット構造の差異を検出する方法や、試料中の翻訳後修飾されたペプチド・タンパク質及び／又はサブユニット構造を形成するペプチド・タンパク質を分離・同定する方法としては、上記本発明のペプチド・タンパク質の網羅的解析方法を用いたものであれば特に制限されるものではなく、ここで翻訳後修飾とは、リン酸化、アシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー化、ユビキチン化などが含まれ、また上記タンパク質サブユニット構造とは、タンパク質−タンパク質間、ＤＮＡ−タンパク質、低分子化合物−タンパク質などの分子種が含まれる。これらの翻訳後修飾及び／又はサブユニット構造は、ペプチド・タンパク質の性質に影響を及ぼすことから、同一のペプチド・タンパク質であっても、異なる翻訳後修飾及び／又はタンパク質サブユニットを構成する場合、２次元液体クロマトグラフィ（２Ｄ−ＬＣ）により異なる画分として回収することができる。このため、同一のタンパク質が、複数の溶出画分から検出された場合には、該タンパク質が、試料中で異なる複数の翻訳後修飾及び／又はタンパク質サブユニットを構成していたと判断できる。例えば、図１１に示すように、本発明の方法を用いて癌細胞抽出液を解析した結果、Ｈｓｐ９０α及びＨｓｐ９０βは、３つの不連続なフラクションからシグナルが検出されたことから、細胞内で異なる３つの翻訳後修飾、あるいは異なるサブユニット構造を形成している可能性が考えられる。このように、上記本発明の網羅的解析方法を用いることにより、試料中のペプチド・タンパク質の翻訳後修飾及び／又はサブユニット構造の差異を検出することが可能となる。また、異なる試料を用いて、ペプチド・タンパク質の溶出パターンを比較検討することにより、それぞれの試料におけるペプチド・タンパク質の翻訳後修飾及び／又はサブユニット構造の差異について両者の違いを検出することが可能である。
【００２０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２１】
１．細胞培養
Ｈｅｒ２を高発現するヒト卵巣癌由来細胞株ＳＫ−ＯＶ−３細胞を、ウシ胎児血清（fetal bovine serum：ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium）培地（シグマ社製）を用いて３７℃、５％ＣＯ２存在下で２ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／フラスコとなるようＴ−７５フラスコで培養した。
【００２２】
２．培養細胞からのサンプル調製（前処理）
培養後の細胞（８ｘ１０７ｃｅｌｌｓ）を遠心回収した後、リン酸緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline：ＰＢＳ）に再懸濁し遠心回収することで余剰の培地を除いた。回収した細胞に２ｍＬのComplete Lysis-M（ロシュ社製）を加え、室温で５分間ゆるやかに振とうすることで細胞を破砕し、１４０００ ｘ ｇで１０分間の遠心分離を行った後、上清を細胞粗抽出液（crude extract）として回収した。２ｍＬの細胞粗抽出液に、４ｍＬの飽和硫酸アンモニウム溶液（終濃度６６．７％）を加え氷上で１時間静置後、１４０００ ｘ ｇで１０分間の遠心分離を行った。沈殿物（ｐｐｔ）を、０．４ｍＬのComplete Lysis-Mで溶解し、硫安沈殿画分（ＡＳ）とした。
【００２３】
３．２次元液体クロマトグラフィ（２Ｄ−ＬＣ）
ＡＳ画分をＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷカラム（東ソー社製）を用いてゲル濾過し、溶出時間１１〜１８分の溶出液１３．５ｍＬを回収し、分子量５０ｋＤａ以上のタンパク質を含むプールＡとした。次に、陰イオン交換カラムであるＭｏｎｏＱ ５／５０カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いてプールＡの分画を行い、フラクション番号１１〜３０（０．５ｍＬ／フラクション）を回収した。回収した各フラクションをさらに、逆相カラムであるＩｎｔｒａｄａＷＰ−ＲＰカラム（インタクト社製）を用いて分画し、ｗｅｌｌ番号Ｂ０１〜Ｈ１２（１２５μＬ／ｗｅｌｌ）のフラクションを９６穴プレートに回収した。ゲル濾過は、流速０．５ｍｌ／分、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．４の単一溶媒で分離を行った。イオン交換カラムは、流速１ｍＬ／分、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．４、０．１−１．０Ｍ／１５分 ＮａＣｌ濃度勾配を用いた。逆相カラムの分離では、Ａ溶媒：０．１％トリフルオロ酢酸（trifluoroaceticacid：ＴＦＡ）水溶液、Ｂ溶媒：０．０８％ＴＦＡ、アセトニトリル、以上二溶媒を用いて、流速０．５ｍＬ／分、％Ｂ：２０−１００／３０分の条件で行った。
【００２４】
４．質量分析
得られたサンプルを９６穴プレート上で減圧乾固した後、１３ｎｇトリプシン（プロメガ社製）、０．１％ＲａｐｉＧｅｓｔ（Waters社製）を含む５０ｍＭ重炭酸アンモニウム３０μＬで可溶化した後、３７℃で９０分間トリプシン加水分解を行い、塩酸を加えて（終濃度０．０５Ｎ）反応を停止した。得られたトリプシン加水分解物をＺｉｐＴｉｐ（ミリポア社製）処理により脱塩・濃縮を行った後、２．４ｍｇ／ｍＬ、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（α-cyano-4-hydroxy-cynnamic acid：ＣＨＣＡ）５０％アセトニトリル溶液４μＬに溶解し、Proteomics analyzer 4700（Matrix-assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry、Applied Biosystems社製）を用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ質量分析を行った。得られたＭＳ／ＭＳスペクトルについて、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースを用いたＭＡＳＣＯＴ（www.matrixscience.com）及びＸ！Ｔａｎｄｅｍ（www.thegpm.org）サーチを行い、タンパク質の同定を行った。タンパク質の同定基準は、親イオンの許容誤差範囲（parent tolerance）：０．８Ｄａ（モノアイソトピック質量）、フラグメントイオンの許容誤差範囲（fragment tolerance）：０．８Ｄａ（モノアイソトピック質量）で行った。Scaffold (www.proteomesoftware.com)によりデータマイニングを行った。ＭＡＳＣＯＴサーチの結果とＸ！Ｔａｎｄｅｍサーチの結果を統合し、ペプチド許容基準：９０％以上、タンパク質許容基準：９０％以上、これらの基準を満たしたペプチドイオンについて、各タンパク質で集計を行いトータルスペクトラとした。
【００２５】
５．タンパク質プロファイリング
以上のようにして得られた、各タンパク質の２Ｄ−ＬＣのマッピング情報と質量分析で検出したペプチドのトータルスペクトラとを組み合わせ、マイクロソフトエクセル(登録商標；www.microsoft.com)によりタンパク質のプロファイリングを行った（図３）。その結果、ＧＲＰ７８、ビメンチン（Vimentin）、Ｈｓｐ９０α、Ｈｓｐ９０β及びサイトケラチンについて、連続していない複数のフラクションからシグナルが検出され、異なる溶出ピークの出現を確認した（図４〜６、１１、１２）。このような複数の溶出ピークを示すタンパク質は、細胞内において異なる複数の翻訳後修飾又は異なるサブユニット構造を形成していたと考えられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のペプチド・タンパク質をその性質に基づいて分離し、分離されたそれぞれのペプチド・タンパク質を同定し、量的情報を付加することを特徴とするペプチド・タンパク質の解析方法であって、以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程を順次備えることを特徴とする方法。（Ａ）試料を第１の液体クロマトグラフィにより分画し、第１分画プロファイルを得る工程；
（Ｂ）第１の液体クロマトグラフィにより分画された各フラクションを、第２の液体クロマトグラフィによりさらに分画し、第２分画プロファイルを得る工程；
（Ｃ）第２の液体クロマトグラフィにより分画された各フラクションを質量分析により解析し、得られた結果から各フラクションに含まれるタンパク質を同定し、量的情報を付加する工程；
【請求項２】
（Ｃ）の工程の後に、さらに、以下の（Ｄ）の工程を備えることを特徴とする請求項１記載の方法。
（Ｄ）前記第１分画プロファイルと、前記第２分画プロファイルとを直交座標軸とする２次元座標上に、前記質量分析により同定されたそれぞれのタンパク質の量的情報を３次元座標値として表示する工程；
【請求項３】
第１の液体クロマトグラフィと第２の液体クロマトグラフィとが、異なる種類の液体クロマトグラフィであることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
質量分析が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか記載の方法を用いることを特徴とする、試料中のペプチド・タンパク質の翻訳後修飾又はサブユニット構造の差異を検出する方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか記載の方法を用いることを特徴とする、試料中の翻訳後修飾されたペプチド・タンパク質、又は異なるサブユニットを構成するペプチド・タンパク質を分離・同定する方法。
【請求項７】
タンパク質が、熱ショックタンパク質、ビメンチン（Vimentin）又はサイトケラチンであることを特徴とする請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
熱ショックタンパク質が、ＧＲＰ７８、Ｈｓｐ９０α及びＨｓｐ９０βから選択される１以上のタンパク質であることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
サイトケラチンが、Ｉ型サイトケラチン９、Ｉ型サイトケラチン１０、Ｉ型サイトケラチン１６、Ｉ型サイトケラチン１９、ＩＩ型サイトケラチン１、ＩＩ型サイトケラチン１ｂ、ＩＩ型サイトケラチン２及びＩＩ型サイトケラチン６Ａから選択される１以上のサイトケラチンであることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項１】
試料中のペプチド・タンパク質をその性質に基づいて分離し、分離されたそれぞれのペプチド・タンパク質を同定し、量的情報を付加することを特徴とするペプチド・タンパク質の解析方法であって、以下の（Ａ）〜（Ｃ）の工程を順次備えることを特徴とする方法。（Ａ）試料を第１の液体クロマトグラフィにより分画し、第１分画プロファイルを得る工程；
（Ｂ）第１の液体クロマトグラフィにより分画された各フラクションを、第２の液体クロマトグラフィによりさらに分画し、第２分画プロファイルを得る工程；
（Ｃ）第２の液体クロマトグラフィにより分画された各フラクションを質量分析により解析し、得られた結果から各フラクションに含まれるタンパク質を同定し、量的情報を付加する工程；
【請求項２】
（Ｃ）の工程の後に、さらに、以下の（Ｄ）の工程を備えることを特徴とする請求項１記載の方法。
（Ｄ）前記第１分画プロファイルと、前記第２分画プロファイルとを直交座標軸とする２次元座標上に、前記質量分析により同定されたそれぞれのタンパク質の量的情報を３次元座標値として表示する工程；
【請求項３】
第１の液体クロマトグラフィと第２の液体クロマトグラフィとが、異なる種類の液体クロマトグラフィであることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
質量分析が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ法であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか記載の方法を用いることを特徴とする、試料中のペプチド・タンパク質の翻訳後修飾又はサブユニット構造の差異を検出する方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか記載の方法を用いることを特徴とする、試料中の翻訳後修飾されたペプチド・タンパク質、又は異なるサブユニットを構成するペプチド・タンパク質を分離・同定する方法。
【請求項７】
タンパク質が、熱ショックタンパク質、ビメンチン（Vimentin）又はサイトケラチンであることを特徴とする請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
熱ショックタンパク質が、ＧＲＰ７８、Ｈｓｐ９０α及びＨｓｐ９０βから選択される１以上のタンパク質であることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
サイトケラチンが、Ｉ型サイトケラチン９、Ｉ型サイトケラチン１０、Ｉ型サイトケラチン１６、Ｉ型サイトケラチン１９、ＩＩ型サイトケラチン１、ＩＩ型サイトケラチン１ｂ、ＩＩ型サイトケラチン２及びＩＩ型サイトケラチン６Ａから選択される１以上のサイトケラチンであることを特徴とする請求項７記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２０１０−４４０６４（Ｐ２０１０−４４０６４Ａ）
【公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１７０５９６（Ｐ２００９−１７０５９６）
【出願日】平成２１年７月２１日（２００９．７．２１）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度、文部科学省、地域科学技術振興事業委託事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５９０００２３８９）静岡県 (173)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月２１日（２００９．７．２１）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度、文部科学省、地域科学技術振興事業委託事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５９０００２３８９）静岡県 (173)
【Ｆターム（参考）】
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