３’−標識ポリヌクレオチドの直接合成用の固体支持体試薬
【課題】３’−末端に位置する標識を有するポリヌクレオチドの直接合成に有用な合成支持体およびこのような支持体試薬の利用方法を提供する。
【解決手段】次式：
で示される特定の化合物。（式中、Ｔは酸開裂性の水酸基保護基であり；Ｌ1 は3'−末端窒素を炭素に結合するためのリンカーであり；Ｌ2およびＬ3 は酸素および炭素を結合するためのリンカーであり；Ｗは固体支持体であり；Ｌ4 は固体支持体を窒素に結合するためのリンカーであり；Ｒ1およびＲ2 は水素、低級アルキル、窒素保護基、または標識からなる群からそれぞれ選ばれる窒素置換基であり；そしてＲ3からＲ7 までは水素または低級アルキルからなる群からそれぞれ選ばれる炭素置換基である。）。
【解決手段】次式：
で示される特定の化合物。（式中、Ｔは酸開裂性の水酸基保護基であり；Ｌ1 は3'−末端窒素を炭素に結合するためのリンカーであり；Ｌ2およびＬ3 は酸素および炭素を結合するためのリンカーであり；Ｗは固体支持体であり；Ｌ4 は固体支持体を窒素に結合するためのリンカーであり；Ｒ1およびＲ2 は水素、低級アルキル、窒素保護基、または標識からなる群からそれぞれ選ばれる窒素置換基であり；そしてＲ3からＲ7 までは水素または低級アルキルからなる群からそれぞれ選ばれる炭素置換基である。）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に官能化ポリヌクレオチドの合成に有用な固体支持体試薬に関するものである。さらに特に、本発明は３’−末端に位置する標識を有するポリヌクレオチドの直接合成に有用な合成支持体およびこのような試薬の利用方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
同位体によらずに標識を付けたポリヌクレオチドプローブ、ＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法、自動化ＤＮＡ配列分析、およびバイオ活性アンチセンスおよびトリプレックス合成試薬を連続して迅速に開発することにより、化学的に修飾されたポリヌクレオチドに対する需要を大いに増した。特に有用なポリヌクレオチド修飾のひとつはオリゴヌクレオチドの３’−末端での標識の導入である。
【０００３】
合成ポリヌクレオチドのこのような３’−標識は２つの方法の一つで最も容易に行うことができる。第一の方法は、ここでは「２工程標識法」と呼ばれ、第一脂肪族アミンがポリヌクレオチドの３’−末端に導入され、続いてポリヌクレオチド合成が行われ、アミノ基は親電子的部分、例えば、イソチオシアネートまたは活性化エステル、例えば、ＮＨＳ−エステルを含む標識と反応する。第二の代替法は、ここでは「直接標識法」と呼ばれ、標識は合成中または前にポリヌクレオチドに直接組み込まれる。
【０００４】
合成ポリヌクレオチドの３’−末端に標識を導入する最も有効で手軽な方法は適当に官能化した合成支持体を使用する直接標識法を使用することである。その理由は(i)直接法は合成後の反応工程が不要であり、これにより３’−標識ポリヌクレオチドの合成を簡単にする；そして (ii) 直接法はアミノ標識オリゴヌクレオチドを標識、例えば、染料−ＮＨＳ−エステル標識と反応させるとき一般に出合う低い反応収率（＜60％)に関連した問題、即ち：(a) 過剰な標識物から標識オリゴヌクレオチドを精製すること；(b) 非標識オリゴヌクレオチドから標識オリゴヌクレオチドを精製すること；(c)大きい画分の非標識オリゴヌクレオチドを捨て去ることによる生成物の収率の減少に伴うコストの増加；および(d) 合成中の３’−アミン機能性の不可逆キャッピング、を避けるからである。
【０００５】
しかし、ポリヌクレオチドの直接３’−標識のために使用される現存の方法の重大な欠点は、支持体からオリゴヌクレオチドを分解するために使用される試薬がまた多くのタイプの標識、例えば、螢光染料、例えば、ローダミン基剤染料を化学的に分解し、これによりそれらの螢光性を徹底的に変化させることである。ここに参考文献として組み込まれるP.E.NelsonらのNucleicAcids Research 20(23): 6253-6259 (1992),および米国特許第5,401,837号および 5,141,813号を参照。従って、ローダミンまたは他の同様の染料は現行の固相合成プロトコルに使用されるときはいつも、あまり望ましくない２段階法を使用して結合しなければならない。
【０００６】
それ故に、塩基に不安定な標識に不適合な苛酷な分解条件を必要としない３’−標識ポリヌクレオチドの直接合成に有用な合成支持体を提供することが望まれてきた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は３’−標識ポリヌクレオチドの直接合成に有用なジグリコレート基剤合成支持体の発見に基づくものである。本発明の目的は、ポリヌクレオチド生成物の開裂が水酸化アンモニウムに関連した穏和な条件を使用して行われる合成支持体を提供することである。
【０００８】
本発明の目的はさらに、ポリヌクレオチド生成物の開裂を、ローダミン染料に危害を加えない条件を使用して行うことができる合成支持体を提供することである。本発明の他の目的は、３’−標識ポリヌクレオチドの直接合成を水酸化アンモニウムに不安定な標識、例えば、テトラメチルローダミンを使用して行うことができる合成支持体を提供することである。
【０００９】
さらに本発明の他の目的は、従来の合成支持体を使用するときよりも開裂反応が非常に速い合成支持体を提供することである。本発明の他の目的は、３’−標識ポリヌクレオチドの収率が従来の支持体を使用した場合よりも非常に高い合成支持体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第一の局面では、本発明の前記および他の目的は、式：
【００１１】
【化９】
【００１２】
（式中、Ｔは酸開裂性の水酸基保護基、例えば、4,4'−ジメトキシトリチルであり；Ｌ1 は3'−末端窒素を炭素に結合するためのリンカーであり；Ｌ2およびＬ3 は酸素および炭素を結合するためのリンカーであり；Ｗは固体支持体であり；Ｌ4 は固体支持体を窒素に結合するためのリンカーであり；Ｒ1およびＲ2 は水素、低級アルキル、窒素保護基、または標識からなる群からそれぞれ選ばれる窒素置換基であり；Ｒ3 からＲ7までは水素または低級アルキルからなる群からそれぞれ選ばれる炭素置換基である。）の化合物からなる合成支持体によって達成される。
【００１３】
好適例において、ＷはＣＰＧであり、Ｌ4 は
【００１４】
【化１０】
【００１５】
の構造を有する。また別の好適例では、Ｗは非膨潤性ポリスチレンであり、Ｌ4 はメチレンである。さらに他の好適例では、Ｌ1は
【００１６】
【化１１】
【００１７】
（式中、ｎは０から10のいずれかであり、さらに好ましくはｎ＝５である。）の構造を有する。第一の特に好適な例では、本発明の合成支持体は次の構造を有する。
【００１８】
【化１２】
【００１９】
（式中、ＤＭＴは4,4'−ジメトキシトリチルであり、Ｗはポリスチレンである。）
第二の特に好適な例では、本発明の合成支持体は次の構造を有する。
【００２０】
【化１３】
【００２１】
（式中のＤＭＴは4,4'−ジメトキシトリチルであり、ＷはＣＰＧである。）
第三の特に好適な例では、本発明の合成支持体は次の構造を有する。
【００２２】
【化１４】
【００２３】
（式中、ＤＭＴは4,4'−ジメトキシトリチルであり、Ｗはポリスチレンである。）
第四の特に好適な例では、本発明の合成支持体は次の構造を有する。
【００２４】
【化１５】
【００２５】
（式中のＤＭＴは4,4'−ジメトキシトリチルであり、ＷはＣＰＧである。）
第二の局面では、本発明は上記合成支持体と組み合わせて従来の合成技術を用いる３’−末端にて標識または窒素を有するポリヌクレオチドを合成するための方法を含む。特に、これらの方法は(i)上記のように合成支持体を提供し；(ii)合成支持体を酸で処理して酸開裂性水酸基保護基を除去し；(iii) 保護ヌクレオシドモノマーおよび弱酸を添加して結合体を形成し；(iv)固体支持体の未反応部位をキャッピングし；(v) 酸化剤を添加し；そして(vi) ポリヌクレオチド鎖の伸長が完了するまで上記工程を繰り返す、各工程を含む。３’−標識ポリヌクレオチドの合成後、開裂試薬を使用して固体支持体から生成物を開裂し、ポリヌクレオチドを脱保護する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００２７】
（発明の実施の形態）本発明は各図面および式を参照して以下に好適例を詳細に説明する。本発明は好適例について説明するが、これらの好適例に限定されるものではない。本発明は３’−標識ポリヌクレオチドの合成に有用な改良されたジグリコレート基剤合成支持体に関する。特に、本発明の合成支持体は次の一般式による構造を有する。
【００２８】
【化１６】
【００２９】
（式中のＴは酸開裂性水酸基保護基であり；Ｌ1 は３’−末端窒素を炭素に結合するためのリンカーであり；Ｌ2 およびＬ3は酸素および炭素を結合するためのリンカーであり；Ｗは固体支持体であり；Ｌ4 は固体支持体を窒素に結合するためのリンカーであり；Ｒ1およびＲ2 は水素、低級アルキル、窒素保護基、または標識をそれぞれ含む窒素置換基であり；Ｒ3 からＲ7までは水素または低級アルキルをそれぞれ含む炭素置換基である。）
本発明の合成支持体はポリヌクレオチドの合成に使用される現在の琥珀酸塩基剤の合成支持体を超える幾つかの重要な利点をもつ。この支持体の特に重要な利点は、一旦合成されると、３’−標識ポリヌクレオチドが、比較的穏和な開裂試薬、即ち、水酸化アンモニウムよりも弱い求核剤である開裂試薬を使用して固体支持体から開裂することができることである。例示的な穏和な開裂試薬はエタノールアミン、メチルアミン／水酸化アンモニウム混合物、およびｔ−ブチルアミン／水／メタノール（１：２：１）の混合物を含む、例えばここにその全体が参考文献として組み込まれる米国特許第5,231,191号参照。このような穏和な開裂試薬を使用できることは、水酸化アンモニウムに耐えられない標識、例えばテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ：時には「ＴＭＲ」とよばれる）、例えば６−カルボキシテトラメチルローダミンのようなローダミン染料を有する３’−標識ポリヌクレオチドを直接合成することができるので、実際に重要である。
【００３０】
本発明の第二の重要な利点は、穏和な開裂試薬を使用しても、開裂反応が実質的に従来の方法および試薬、例えば水酸化アンモニウム基剤試薬を琥珀酸塩基剤の合成支持体と組合せて使用して観察されるものよりも速いことである。本発明の支持体の第三の利点は手の介入や苛酷な開裂条件なしで高い生成収率が得られることである。現存する琥珀酸塩基剤の合成支持体を使用して高収率、即ち、99％台の収率を得るには、合成後に、ポリヌクレオチド含有合成支持体を反応カートリッジから手で除き、ガラス瓶に移し、開裂試薬を添加し、懸濁液を数時間約85℃で加熱する。この苛酷な開裂プロトコルを使用することによる好ましくない結果のため、固体支持体中に存在する汚染物質を開裂溶液中に抽出し、これによって生成物のオリゴヌクレオチドの精製を妥協しなければならない。現在入手できる支持体を使用するとき必要な厄介で苛酷なプロトコルに比べて、本発明の合成支持体を使用すると、合成支持体をポリヌクレオチド合成器から除去することなく、あるいは開裂反応を加熱することなく、完全に自動化した方法で99％の収率を得ることができる。さらに、苛酷な開裂条件を必要としないので、生成物は固体支持体から抽出される物質で汚染されない。
【００３１】
ここで使用される「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」の語は天然または改良されたヌクレオシドのオリゴマー、またはホスホジエステル結合によって結合した非ヌクレオシド類似体、または数単量体単位、例えば２〜５から数百単量体単位の大きさの範囲の類似体のオリゴマーを意味する。ここに使用される語「標識（LABEL)」は一般に、(i)検出を容易にする改質剤、例えば、染料、酵素、スピンラベル等；(ii) 固体支持体へのポリヌクレオチドの捕獲を容易にする改質剤、例えば、ビオチン、ヘプテン等；(iii)溶解性に影響を与え或いは細胞の取込みを改良する改質剤、例えば、ＰＥＧ、コレステリル、トリグリセリド等；および(iv) 化学反応に関係する部分を導入する改質剤、例えばプソラレン、ＥＤＴＡ、リン酸塩、核酸開裂試薬等を含む任意のポリヌクレオチドの３’−改質剤を意味する。
【００３２】
本発明では、Ｗはポリヌクレオチド合成が行われる固体支持体である。Ｗは種々の形態および組成を有することができるが、固体支持体は(i) ポリヌクレオチド合成試薬に殆ど溶解せず、(ii)ポリヌクレオチド合成試薬に化学的に安定であり、(iii) 化学誘導ができ、(iv) 望ましいオリゴヌクレオチドの装填ができ、(v) 処理中に出合う高圧に耐える十分な圧縮力をもち、そして(vi)望ましい粒径範囲と分布で入手できる必要がある。ここに使用されるように、「ポリヌクレオチド合成試薬」の語は一般にポリヌクレオチド合成工程に使用される溶媒および試薬を意味し、例えばヨウ素、塩化メチレン、アセトニトリル、テトラゾール、ｎ−メチルイミダゾール、ピリジン、無水酢酸、ルチジン、トリフルオロ酢酸等である。
【００３３】
好適例では、Ｗは無機ポリマーである。広範囲の無機ポリマーを本発明で使用でき、これらは、例えば、シリカ、有孔ガラス、アルミノシリケート、ボロシリケート、アルミナおよび酸化ニッケルのような金属酸化物、種々のクレー等を含む。好ましくは、無機固体支持体は制御有孔ガラス（ＣＰＧ）である。制御有孔ガラスは、制御した寸法の孔がハチの巣状になった均一に粉砕され殆どの純シリカ粒子をふるいわけした粒子からなる。特に熱処理してシリケートからホウ酸塩を分離したボロシリケート材料から製造される。孔は酸性エッチング工程によってホウ酸塩を除去して形成され、それらの寸法は加熱工程の性質に依存する。さらに好ましくは、ＣＰＧは500Åの孔を有する直径が 150μm の粒子の形である、例えば Users Manual Model 392 および394 PolynucleotideSynthesizers, 6-5から6-9頁、Applied Biosystems, Ver.2.00, Doc. Rev. A, Part No.902351(1992), Applied Biosystems Division of The Perkin-Elmer Corporation, フォスター市、CA(ABD)。
【００３４】
本発明のＬ4−ＮＨ部分のようなアミノ末端リンカーでＣＰＧ支持体を誘導化することは、ポリヌクレオチド合成の分野では既知である、例えば、Gait,Editor, Oligonucleotide Synthesis, 45-49頁 (IRL Press, 1984)、そして実際に、約100mmol/g の一次アミノ装填量のアルキルアミンで誘導化したＣＰＧビーズは市販品として入手できる（PierceChemical Company, Rockford, IL)。簡単には、アルキルアミノ基体の場合には、ＣＰＧはアミノアルキルトリメトキシシラン試薬とＣＰＧ粒子の懸濁液を反応させて、濾過し、乾燥させて誘導化される。
【００３５】
第二の好ましい固体支持体は非膨潤性有孔ポリスチレン、例えばここにその全体が参考文献として組み込まれる米国特許第5,047,524号がある。ここで使用される「非膨潤性」は有孔ポリスチレン物質が実質的に機械的に堅く、特に、ポリヌクレオチド合成試薬に曝すとき、認められるほどは容量が増加しないことを意味する。ここで使用される「有孔」は100と4000Åの間の範囲の実質的に均一の直径を有する孔を含む。
【００３６】
ポリスチレン支持体は標準法によってアミノ誘導化される、例えば、Wallaceら、 638-639頁、Scouten ed., SolidPhase Biochemistry (John Wiley & Sons, 1980) ；Wright et al. Tet. Lett., 34:3373-3376 (1993)；ここに参考文献として組み込まれる、Bayer et al, 米国特許第4,908,405号：AppliedBiosystems Research News, Model 390Z, 1994年２月。簡単に述べると、好適な方法では、ヒドロキシメチルフタルイミドは触媒量のメチルスルホン酸を用いてポリスチレン支持体と反応させてフタルイミドメチルポリスチレンを形成する。次にこの物質はヒドラジンで処理してフタルイミド保護基を除き、アミノメチル化ポリスチレンを与える。一般に、アミノ装填量は、非膨潤性有孔ポリスチレン１グラム当たり、アミノ官能基10ないし60μモルに変化する。装填水準は試薬濃度と反応時間を調整することによって制御することができる。
【００３７】
最近開発された代替のポリスチレン誘導化学は、ポリヌクレオチドと結合するために入手できる遊離水酸基をもつ幾つかのポリオキシエチレン残基または鎖を結合して、末端アミノ基を遊離水酸基と置換している、例えば、Bayerand Rapp, 米国特許第4,908,405号；Gao et al.,Tetrahedron Lett., 32(40): 5477-5480(1991)。
【００３８】
第三の好適例では、Ｗは非ポリスチレン有機ポリマー支持体である。ポリマー支持体は合成により改質される天然産材料、および／または合成材料から誘導することができる。特に関係するものは多糖類、特に架橋多糖類、例えばSepharose（登録商標）として入手できるアガロース、Sephadex（登録商標）として入手できるデキストラン、セルロース、澱粉等である。他の適当な材料はポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、シリコーン、Teflon（登録商標）等がある。Ｔは一般に酸開裂性水酸基保護基を示す。好ましくは、Ｔはトリフェニルメチル基およびその電子供与置換誘導体であり、ここでは、語「電子供与」は、一部である、即ち、隣接原子に関して電子陽性である分子中の隣接原子に価電子を放出する置換体の傾向を示す。好ましくは、電子供与置換体はアミノ、１ないし８個の炭素原子を有する低級アルキル、１ないし８個の炭素原子を有する低級アリール、１ないし８個の炭素原子を有する低級アルコキシ等を含む。さらに好ましくは、電子供与置換体はメトキシである。例示的なトリチルは4,4'−ジメトキシトリチル（即ち、ビス（ｐ−アニシル）フェニルメチル）、モノメトキシトリチル、α−ナフチルジフェニルメチル、トリ（ｐ−メトキシフェニル）メチル等を含む。これらおよび他のトリチルの結合と開裂の条件はGreene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd Edition (JohnWiley, New York, 1991)に見出すことができる。
【００３９】
リンカーＬ1、Ｌ2、Ｌ3およびＬ4は本発明の化合物の種々の要素を結合するために役立つ結合部分である。特に、Ｌ1は合成ポリヌクレオチドの3'−末端窒素をポリヌクレオチド自身に結合する働きをして、Ｌ2およびＬ3は炭素と酸素を結合する働きをして、Ｌ4は固体支持体を窒素に結合する働きをする。リンカーＬ1、Ｌ2、Ｌ3およびＬ4の追加の目的は、(i)標識が相補的標的へのポリヌクレオチドのハイブリッド形成を妨げる範囲を減じ、(ii) 標識および／または固体支持体がポリヌクレオチドの合成を妨げる範囲を減じ、そして(iii)ポリヌクレオチド合成中に標識の結合性を保護するために、標識、固体支持体、およびオリゴヌクレオチドの間に適当な空間を与えることである。好ましくは、リンカーＬ1、Ｌ2、Ｌ3およびＬ4はそれぞれ、低級アルキル、低級アルキレンオキシド、アミド、カルバメート、スルホンアミド、尿素、琥珀酸または他のジカルボン酸誘導体、またはそれらの任意の組合せであり、ここに使用されるアルキルアミドは次の部分構造を示す。
【００４０】
【化１７】
【００４１】
（式中のｎは０ないし20のいずれかである）。ジカルボン酸誘導体は次の部分構造を示す。
【００４２】
【化１８】
【００４３】
（式中のｎは２ないし20のいずれかである）。特に好適例では、ｎ＝２、即ち、リンカーは琥珀酸である。ここで使用される語「低級アルキル」は直鎖、分枝鎖、および１ないし10個の炭素原子を含む環状アルキル基を示し、語「低級アルキレンオキシド」は２ないし20個の炭素原子を含む直鎖、分枝鎖、および環状アルキレンオキシド基、例えばポリエチレンオキシドを示す。特に好適例では、Ｌ1はｎ−ブチルまたはｎ−ヘキシルアミドであり；Ｌ2およびＬ3はそれぞれメチレンであり；そしてＷがポリスチレンのとき、Ｌ4はメチレンであり、ＷがＣＰＧのとき、Ｌ4はアミノプロピルスクシニルヘキシルアミンである。
【００４４】
上記の好ましい結合部分に加えて、特に好適例において、リンカーＬ3は開裂するとき、一旦支持体から開裂されるとオリゴヌクレオチドを標識するための追加部位を与える内部開裂部位をもつ部分である。この目的に有用な例示部分はジチオスレイトール（ＤＴＴ）で開裂するとき−ＳＨ部分を形成するジスルフィド結合を含む部分である。特に好ましいＬ3部分は次の構造を有する。
【００４５】
−ＣＨ2−Ｓ−Ｓ−ＣＨ2−置換体Ｒ3−Ｒ7は炭素置換体である。好ましくはＲ3−Ｒ7は別々に低級アルキルまたは水素である。さらに好ましくは、Ｒ3−Ｒ7は水素である。Ｒ1およびＲ2は所望の最終生成物の性質によって大いに変わることができる窒素置換体である。Ｒ1およびＲ2は本発明の中心的な特徴ではなく、一般的な官能基を与えるので、Ｒ1は広範囲の形態を有することができる。Ｒ1およびＲ2は、合成および次のオリゴヌクレオチド開裂の間に、結合した窒素原子が化学的に安定であるように選択する。さらに、Ｒ1およびＲ2はそれ自体標準のポリヌクレオチド合成試薬に安定である。
【００４６】
反応性アミノ基かポリヌクレオチド開裂につづいて望ましいならば、Ｒ1およびＲ2は実質的に窒素の反応性を妨げない。この場合に、Ｒ1およびＲ2は好ましくは低級アルキル、水素、または窒素保護基、例えば、ＦＭＯＣ、ｔＢＯＣ、または他の類似の窒素保護基である。最も好ましくは、Ｒ1およびＲ2の一つは水素である。Ｒ1またはＲ2のいずれかまたは両方が、直接標識法の一部としてポリヌクレオチド合成前に導入される標識である場合に、標識がＤＮＡ合成試薬および穏和な開裂試薬の存在で安定である必要がある。このような標識は発螢光団、酵素、ビオチン、挿入剤、架橋剤、核酸開裂試薬、細胞取込みの改質剤等を含む。好ましくは、標識はローダミン染料、例えば、テトラメチルローダミンである。
【００４７】
ポリヌクレオチドを形成するために使用される化学の詳細な説明は他の場合にも提供されている、例えば、Caruthers et al., 米国特許第4,458,066号；Carutherset al., 米国特許第4,415,732号；Caruthers et al., Genetic Engineering, 4:1-17 (1982)；UsersManual Model 392および394 Polynucleotide Synthesizers, 6-1から6-22頁、AppliedBiosystems, Part No. 901237 (1991)。従って、これらの各文献はここに全体を参考文献として組み込まれる。
【００４８】
ポリヌクレオチド合成のホスホルアミダイト法は、その有効で迅速なカップリングおよび出発物質の安定性のため好ましい方法である。合成は固体支持体に結合した成長するポリヌクレオチド鎖を用いて行われ、過剰の試薬は液相状態で、容易に濾過によって除去することができ、これによりサイクル間の精製工程の必要がない。
【００４９】
次に、ホスホルアミダイト法を使用する代表的なポリヌクレオチド合成サイクルの工程を簡単に記載する。まず、固体支持体を酸、例えば、トリクロロ酢酸で処理し、水酸基保護基Ｔを除去し、水酸基を次のカップリング反応のためにフリーにする。次に同時に保護ホスホルアミダイトヌクレオシドモノマーおよび弱酸、例えば、テトラゾール等を反応物に添加して、活性化した中間体を生成する。弱酸は反応性の中間体を形成するホスホルアミダイトの窒素をプロトン化する。ヌクレオシドの添加は30秒以内で終了する。次に、キャッピング工程を行い、ヌクレオシドの付加を受けなかった任意のポリヌクレオチド鎖を終端する。キャッピングは好ましくは無水酢酸および１−メチルイミダゾールを用いて行われる。次に、好ましい酸化剤としてヨウ素、酸素ドナーとして水を使用して酸化によりインターヌクレオチド結合をホスファイトからさらに安定なホスホトリエステルに変換する。酸化後、水酸基保護基をプロトン性酸、例えば、トリクロロ酢酸またはジクロロ酢酸を用いて除去し、サイクルを鎖伸長が終了するまで繰り返す。合成後、ポリヌクレオチド鎖を塩基、例えば、水酸化アンモニウムまたはｔ−ブチルアミンを使用して支持体から開裂する。開裂反応はまた任意のホスフェート保護基、例えば、シアノエチルを除去する。最後に、塩基の環外アミンの保護基を高温、例えば55℃にて塩基中のポリヌクレオチド溶液を処理して除去する。
【実施例】
【００５０】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれにより制限されるものではない。
実施例１
構造式１４ａのＴＡＭＲＡ染料標識ＣＰＧ支持体の合成（図１参照）
化合物９の合成：セリノール（773mg, 8.50mmol)、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（574mg, 4.25mmol)、（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（1.61g,4.25mmol)、およびジイソプロピルエチルアミン（1.68g, 13mmol)を６−Ｎ−Fmoc−εーアミノカプロン酸のＤＭＦ（20ml) 攪拌溶液に添加した。反応混合物を２時間アルゴン雰囲気下に室温で攪拌した。DMFを減圧下に蒸発させて除去した。残渣をCHCl3(100ml) に溶解し、５％HCl水溶液 (1 ×50ml)、H2O (1×50ml) および飽和塩水 (１×50ml) で洗浄した。有機層を乾燥（MgSO4)し、蒸発させて得られたオイルをEtOH(10ml) に溶解し、冷却した。化合物９は無色の細かい針状に結晶した（1.2g, 66％) 。
【００５１】
1H NMR (CDCl3) d: 1.35 (m, 2H), 1.45 (m, 2H), 1.66(m, 2H), 2.23 (t,J=7.2Hz, 2H), 3.18 (m, 2H), 3.74 (dd, J=11.1, 4.2Hz, 2H), 3.82(dd, J=11.1, 3.9Hz, 2H), 3.95 (m, 1H), 4.20 (t, J=6.6Hz, 1H), 4.39 (d, J=6.6Hz,2H), 5.00 (bs, 1H), 6.40 (d, J=7.4Hz, 1H), 7.28-7.43 (m, 4H), 7.58 (d, J=7.2Hz,2H), 7.76 (d, J=7.2Hz, 2H).
【００５２】
化合物１０の合成：ジメトキシトリチルクロライド（1.16g, 3.43mmol)の乾燥ピリジン（20ml) 溶液を、化合物９（1.33g, 3.12mmol)のピリジン（20ml) 攪拌溶液に室温で窒素雰囲気下に一滴ずつ添加した。添加は30分で完了した。フラスコに栓をして、室温で48時間攪拌した。ＴＬＣは出発物質と生成物１０の存在を示した。ピリジンを減圧下に蒸発させ残渣をCHCl3(50ml)に溶解し、H2O (1×30ml) および飽和塩水 (１×30ml) で洗浄した。有機層を乾燥（MgSO4)し、蒸発させて黄色様オイルを得た。生成物をCHCl3中１％MeOHで溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィで単離した。適当な画分を合わせて蒸発させ無色の泡を得た（1.31g,57％）。
【００５３】
1H NMR (CDCl3) d: 1.26 (m,2H), 1.45 (m, 2H), 1.62 (m, 2H), 2.16 (t,J=7.2Hz, 2H), 2.85 (bs, 1H), 3.16 (m,2H), 3.28 (dd, J=9.9, 4.8Hz, 1H),3.33 (dd, J=9.9, 4.5Hz, 1H), 3.68 (m, 1H),3.74 (s, 6H), 3.81 (m, 1H), 4.09 (m, 1H), 4.19 (t, J=6.6Hz, 1H), 4.39 (d,J=6.6Hz, 2H), 4.91 (bs, 1H), 5.95 (d, J=7.8Hz, 1H), 6.82 (d, J=8.7Hz, 4H),7.20-7.42 (m, 13H), 7.58(d, J=7.2Hz, 2H), 7.75 (d, J=7.2Hz, 2H).
【００５４】
化合物１１の合成：無水琥珀酸（82mg, 0.82mmol) 、Et3N (69mg, 0.68mmol)および４−ジメチルアミノピリジン（42mg,0.34mmol) を化合物１０（500mg, 0.68mmol)のCH2Cl2（15ml) 溶液に添加した。反応混合物を室温で３時間攪拌した。反応混合物をCH2Cl2（30ml)で希釈し、５％クエン酸（１×30ml) 水溶液および飽和塩水（２×30ml) で洗浄した。有機層を乾燥（MgSO4)し、蒸発させて泡が得られた。生成物をCHCl3-MeOHグラジエント（0-5％MeOH)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製した。適当な画分を合わせて蒸発させ無色の泡の化合物１１が得られた（439mg, 78％）。
【００５５】
1H NMR (CDCl3) d: 1.25 (m,2H), 1.45 (m, 2H), 1.60 (m, 2H), 2.18 (t,J=7.5Hz, 2H), 2.52 (s, 4H), 3.13 (m,3H), 3.25 (dd, J=8.7, 4.0Hz, 1H), 3.78 (s, 6H), 4.22 (m, 2H), 4.41 (m, 4H),5.00 (unresolved t, 1H), 6.10 (d, J=7.2Hz, 1H), 6.80 (d, J=8.5Hz, 4H),7.19-7.41 (m, 13H), 7.56 (d, J=7.5Hz, 2H), 7.75 (d, J=7.2Hz, 2H).
【００５６】
ＴＡＭＲＡ染料標識ＣＰＧ支持体１４ａの合成：CPG (500Å, 40μmol/g アミン装填、1g、40μmol, (ABD)) 、化合物１１（67mg, 80μmol)、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（11mg,80μmol)、（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（30mg, 80μmol)、ジイソプロピルエチルアミン（16mg,120μmol)の DMF（8ml) 溶液の混合物を手首で動かすシェーカーで４時間室温で攪拌した。支持体を DMF (３×10ml) 、CH3CN(2×10ml) およびCH2Cl2（１×10ml) で洗浄し、高真空下に終夜乾燥した。ニンヒドリンアッセイは支持体に６μmol/gのアミンの残留を示した。支持体を無水酢酸／ルチジンの THF（10％溶液、５ml) 溶液および１−メチルイミダゾールの THF（16％溶液、５ml) 溶液で２時間室温にてキャッピングした。
【００５７】
支持体１２ａをCH3CN (3×10ml) およびCH2Cl2（１×10ml) で洗浄し、次にDMF中20％ピペリジン（３×10ml、10分各洗浄) で処理し、Fmoc保護基を除去し支持体１３ａを与えた。Fmoc基の除去は302nmで溶液のＵＶ吸収を測定してモニターした。支持体１３ａをDMF (３×10ml) 、CH3CN (2×10ml) およびCH2Cl2（１×10ml)で洗浄し、真空下に終夜乾燥した。次に支持体（500mg, 16μmol) をシェカーで42時間TAMRA-NHS エステル (ABD, p/n 400981)(26mg, 49μmol) およびEt3N (10.1mg, 100 μmol)の DMF (5ml)溶液で処理し、染料標識支持体１４ａを得た。支持体をDMF (３×10ml) 、CH3CN (2×10ml) およびCH2Cl2（１×10ml)で洗浄し、高真空下に24時間乾燥した。ニンヒドリンアッセイは１μmol/g のアミンの残留を示した。次に支持体を無水酢酸／ルチジン混合物の THF（10％溶液、５ml)溶液および１−メチルイミダゾールの THF（16％溶液、５ml) 溶液で１時間キャッピングし、CH3CN (3×10ml) およびCH2Cl2（２×10ml)で洗浄し、高真空下に24時間乾燥した。トリチルカチオンアッセイは30.3μmol/g の最終装填量を示した。
【００５８】
実施例２
構造式１４ｂのＴＡＭＲＡ染料標識ポリスチレン支持体の合成（図１参照）
高架橋ポリスチレン（1000Å, 10μmol/g アミン装填、2g, 20μmol, (ABD))を実施例１からの化合物１１（34mg, 40μmol)、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（5.5mg,40μmol)、（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（15mg, 40μmol)、およびジイソプロピルエチルアミン（８mg,60μmol)の DMF（10ml) 溶液を手首で動かすシェーカーで４時間室温で反応させた。支持体を DMF (３×10ml) 、CH3CN(2×10ml) およびCH2Cl2（１×10ml) で洗浄し、高真空下に終夜乾燥した。ニンヒドリンアッセイは支持体に0.6μmol/g のアミンの残留を示した。支持体を無水酢酸／ルチジンの THF（10％溶液、５ml) 溶液および１−メチルイミダゾールの THF（16％溶液、５ml)溶液で２時間室温にてキャッピングした。支持体１２ｂをCH3CN (3×10ml) およびCH2Cl2（１×10ml)で洗浄した。トリチルカチオンアッセイはポリスチレン支持体に化合物１１が９μmol/g 装填されていることを示した。次に支持体１２ｂを20％ピペリジンの DMF(３×10ml, 10分各洗浄) で処理してFmoc保護基を除き支持体１３ｂが得られた。Fmoc基の除去は302nm で溶液のＵＶ吸収を測定してモニターした。支持体１３ｂをDMF (３×10ml) 、CH3CN (2×10ml) およびCH2Cl2（１×10ml)で洗浄し、真空下に終夜乾燥した。次に支持体（1g, 9μmol)をシェーカーで36時間 TAMRA-NHSエステル (15mg, 28.5μmol) およびEt3N(8.6mg, 85μmol) の DMF (10ml) 溶液で室温処理し、支持体１４ｂが得られた。支持体を DMF (３×10ml) 、CH3CN(2×10ml) およびCH2Cl2（１×10ml) で洗浄し、高真空下に24時間乾燥した。ニンヒドリンアッセイは0.5μmol/g以下のアミンの残留を示した。次に支持体を無水酢酸／ルチジンのＴＨＦ（10％溶液、５ml) 溶液および１−メチルイミダゾールのＴＨＦ（16％溶液、５ml) 溶液で１時間キャッピングし、CH3CN(3×10ml) およびCH2Cl2（２×10ml) で洗浄し、高真空下に24時間乾燥した。トリチルカチオンアッセイは8.8μmol/g の最終装填量を示した。
【００５９】
実施例３
構造式１８ａのＴＡＭＲＡ染料標識ＣＰＧ支持体の合成（図２参照）
１−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−（Ｎ−Fmoc−４−アミノブチル）−1, 3−プロパンジオール化合物４の合成：ネルソンらの Nucleic AcidsResearch 20:6253-6259 (1992) に記載されている方法によって合成した。ジメトキシトリチルクロライド（3.66g,10.82mmol) の乾燥ピリジン (60ml) 溶液を窒素雰囲気下、室温にて２−（Ｎ−Fmoc−４−アミノブチル）−1, 3−プロパンジオール（4.0g,10.82mmol)のピリジン（50ml) 攪拌溶液に一滴ずつ添加した。添加を２時間で完了した。フラスコに栓をして、室温で48時間攪拌した。ＴＬＣは出発物質と生成物４の存在を示した。ピリジンを減圧下に蒸発させ残渣をCHCl3(100ml) に溶解し、H2O (1×100ml) および飽和塩水 (１×100ml) で洗浄した。有機層を乾燥（MgSO4)し、蒸発させて黄色様オイルが得られた。生成物をCHCl3中１％MeOHで溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィで単離した。適当な画分を合わせて蒸発させ無色の泡を得た（3.4g,46％）。
【００６０】
1H NMR (CDCl3) d: 1.15-1.45 (m, 6H), 1.88 (m, 1H),2.44 (t, J=5.7Hz,1H), 3.07 (dd, J=9.3, 7.5Hz, 1H), 3.12 (m, 2H), 3.29 (dd,J=9.3, 4.2Hz,1H), 3.64 (m, 2H), 3.78 (s, 6H), 4.20 (t, J=6.8Hz, 1H), 4.39 (d,J=6.8Hz, 2H), 4.72 (unresolved t, 1H), 6.82 (d, J=9.0Hz, 4H), 7.25-7.43 (m,13H), 7.58 (d, J=7.2Hz, 2H), 7.75 (d, J=7.2Hz, 2H).
【００６１】
ジグリコレート１５の合成：無水ジグリコール酸（81mg, 0.94mmol) のCH2Cl2（５ml) 溶液をEt3N(90mg, 0.89mmol)、４−ジメチルアミノピリジン（45mg, 0.37mmol) 、および化合物４（500mg, 0.74mmol) のCH2Cl2(15ml) 溶液の混合物に０℃（氷浴）でアルゴン雰囲気下に一滴ずつ添加した。添加を完了（10分) 後、氷浴を除去し、反応混合物を室温で１時間攪拌した。反応混合物をCHCl3(30ml)で希釈し、５％クエン酸水（１×50ml) および飽和塩水 (２×50ml) で洗浄した。有機層を乾燥（MgSO4)し、蒸発させて泡が得られた。生成物をCHCl3-EtOHグラジエント（2-10％EtOH)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製した。適当な画分を合わせて蒸発させ無色の泡の化合物１５を得た（354mg, 60％）。
【００６２】
1H NMR (CDCl3) d: 1.00-1.25 (m, 6H), 1.75 (m, 1H),2.88 (m, 4H), 3.70(s, 6H), 3.96 (s, 2H), 4.04 (s, 2H), 4.13 (m, 3H), 4.31 (d,J=6.9Hz), 5.18 (bs, 1H), 6.74 (d, J=8.7Hz, 4H), 7.18-7.34 (m, 13H), 7.53 (d,J=7.5Hz, 2H), 7.67 (d, J=7.5Hz, 2H).
【００６３】
ＴＡＭＲＡ染料標識ＣＰＧ支持体１８ａの合成：ＣＰＧ（500Å, 40μmol/gアミン装填、2g,80μmol)、化合物１５（126mg, 160μmol)、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（22mg, 160μmol)、（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（61mg,160μmol)、およびジイソプロピルエチルアミン（35mg, 270μmol)のＤＭＦ（10ml) 溶液の混合物を手首で動かすシェーカーで４時間室温で攪拌した。支持体をDMF (３×10ml) 、CH3CN (2×10ml) およびCH2Cl2（１×10ml)で洗浄し、高真空下に終夜乾燥した。ニンヒドリンアッセイは支持体に３μmol/g のアミンの残留を示した。トリチルカチオンアッセイはＣＰＧ支持体上に37.5μmol/gの装填量の化合物１５を示した。支持体を無水酢酸／ルチジンのＴＨＦ（10％溶液、５ml) 溶液および１−メチルイミダゾールのＴＨＦ（16％溶液、５ml) 溶液で２時間室温にてキャッピングした。
【００６４】
支持体１６ａをCH3CN (3×10ml) およびCH2Cl2（１×10ml) で洗浄し、次に20％のピペリジンのDMF (３×10ml, 10分各洗浄) 溶液で処理し、Fmoc保護基を除去し遊離アミノ基を含む支持体１７ａを与えた。Fmoc基の除去は302nmで溶液のＵＶ吸収を測定してモニターした。支持体１７ａをDMF (３×10ml) 、CH3CN (2×10ml) およびCH2Cl2（１×10ml)で洗浄し、真空下に終夜乾燥した。次に支持体１７ａ（500mg, 19μmol) をシェカーで42時間 TAMRA-NHSエステル (30mg, 57μmol)およびEt3N(13.1mg, 130μmol)の DMF (５ml) 溶液で処理し、染料標識支持体１８ａが得られた。支持体を DMF (３×10ml) 、CH3CN(2×10ml) およびCH2Cl2（１×10ml) で洗浄し、高真空下に24時間乾燥した。ニンヒドリンアッセイは支持体に１μmol/gのアミンの存在を示した。支持体を次に無水酢酸／ルチジンのＴＨＦ（10％溶液、５ml) 溶液および１−メチルイミダゾールのＴＨＦ（16％溶液、５ml) 溶液で１時間キャッピングし、CH3CN(3×10ml) 、CH2Cl2（２×10ml) で洗浄し、高真空下に24時間乾燥した。トリチルカチオンアッセイは36μmol/gの最終装填量を示した。
【００６５】
実施例４
構造式１８ｂのＴＡＭＲＡ染料標識ポリスチレン支持体の合成（図２参照）
高架橋ポリスチレン（1000Å, 10μmol/g アミン装填、2g, 20μmol)を化合物１５（32mg, 40μmol)、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（5.5mg,40μmol)、（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（15mg, 40μmol)、およびジイソプロピルエチルアミン（8mg,60μmol)のＤＭＦ（10ml) 溶液を手首で動かすシェーカーで４時間室温で処理した。支持体を DMF (３×10ml) 、CH3CN(2×10ml) およびCH2Cl2（１×10ml) で洗浄し、高真空下に終夜乾燥した。ニンヒドリンアッセイは支持体に0.5μmol/gのアミンの存在を示した。支持体を無水酢酸／ルチジンのＴＨＦ（10％溶液、５ml) 溶液および１−メチルイミダゾールのＴＨＦ（16％溶液、５ml) 溶液で２時間室温にてキャッピングした。
【００６６】
支持体１６ｂをCH3CN (3×10ml) およびCH2Cl2（１×10ml) で洗浄した。トリチルカチオンアッセイはポリスチレン支持体上に９μmol/gの装填量の化合物１５を与えた。支持体１６ｂを20％のピペリジンの DMF (３×10ml, 10分各洗浄)溶液で処理し、Fmoc保護基を除去し支持体１７ｂを与えた。支持体１７ｂをDMF(３×10ml) 、CH3CN (2×10ml) およびCH2Cl2（１×10ml) で洗浄し、真空下に終夜乾燥した。次に支持体１７ｂ（1g,9μmol) をシェーカーで36時間室温にてTAMRA-NHSエステル (15mg, 28.5μmol)およびEt3N (8.6mg,85μmol)の DMF (10ml) 溶液で処理し、支持体１８ｂを得た。支持体を DMF (３×10ml) 、CH3CN (2×10ml)およびCH2Cl2（１×10ml) で洗浄し、高真空下に24時間乾燥した。ニンヒドリンアッセイは0.5μmol/g以下のアミンの残留を示した。支持体を無水酢酸／ルチジンのＴＨＦ（10％溶液、５ml) 溶液および１−メチルイミダゾールのＴＨＦ（16％溶液、５ml) 溶液で１時間キャッピングし、CH3CN(3×10ml) 、CH2Cl2（２×10ml) で洗浄し、高真空下に24時間乾燥した。トリチルカチオンアッセイは8.7μmol/gの最終装填量を示した。
【００６７】
実施例５
構造式２２ａのＴＡＭＲＡ染料標識ＣＰＧ支持体の合成（図３参照）
ジグリコレート１９の合成：無水ジグリコール酸（64mg, 0.55mmol) のCH2Cl2（５ml) 溶液をEt3N(67mg, 0.66mmol) 、４−ジメチルアミノピリジン（34mg,0.28mmol) および化合物１０（400mg, 0.55mmol)のCH2Cl2(15ml) 溶液の混合物にアルゴン雰囲気下０℃で添加した。添加を完了（10分) 後、氷浴を除去し、反応混合物を室温で１時間攪拌した。反応混合物をCH2Cl2(30ml) で希釈し、５％クエン酸水溶液（１×50ml) および飽和塩水 (２×50ml) で洗浄した。有機層を乾燥（MgSO4)し、蒸発させて泡が得られた。生成物をCHCl3-EtOHグラジエント（2-10％EtOH)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製した。適当な画分を合わせて蒸発させ無色の泡の化合物１９を得た（260mg, 56％）。
【００６８】
1H NMR (CDCl3) d: 1.20 (m, 2H), 1.39 (m, 2H), 1.58(m, 2H), 2.18 (t,J=7.5Hz, 2H), 2.90-3.25 (m, 4H), 3.80 (s, 6H), 3.86 (s, 4H),4.00-4.40 (m, 6H), 4.85 (unresolved t, 1H), 5.92 (d, J=7.2Hz, 1H), 6.75 (d,J=8.1Hz, 4H), 7.20-7.40 (m, 13H), 7.52 (d, J=7.2Hz, 2H), 7.69 (d, J=7.2Hz, 2H).
【００６９】
ＴＡＭＲＡ染料標識ＣＰＧ支持体２２ａの合成：ＣＰＧ（500Å, 33μmol/gアミン装填、1g, 33μmol)、化合物１９（56mg, 66μmol)、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（9mg,66μmol)、（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（25mg, 66μmol)、およびジイソプロピルエチルアミン（13mg,100μmol)のＤＭＦ（6ml)溶液の混合物を手首で動かすシェーカーで４時間室温で攪拌した。支持体を DMF(３×８ml) 、CH3CN(2×８ml) およびCH2Cl2（１×８ml) で洗浄し、高真空下に終夜乾燥した。ニンヒドリンアッセイは支持体に３μmol/gのアミンの残留を示した。トリチルカチオンアッセイはＣＰＧ支持体に29μmol/g の装填量の化合物１９を示した。支持体を無水酢酸／ルチジンの THF（10％溶液、３ml)溶液および１−メチルイミダゾールのＴＨＦ（16％溶液、３ml) 溶液で２時間室温にてキャッピングした。
【００７０】
支持体２０ａをCH3CN (3×８ml) およびCH2Cl2（１×８ml) で洗浄し、20％のピペリジンのDMF (3 ×５ml, 10分各洗浄) 溶液で処理し、Fmoc保護基を除去し遊離アミノ基を含む支持体２１ａを得た。支持体２１ａを DMF (３×８ml) 、CH3CN(2×８ml) およびCH2Cl2（１×８ml) で洗浄し、真空下に終夜乾燥した。次に支持体２１ａ（500mg,15μmol)をシェーカーで42時間TAMRA-NHS エステル (24mg, 45μmol)およびEt3N (11mg, 110μmol)のDMF (５ml) 溶液で処理し、染料標識支持体２２ａを得た。支持体２２ａを DMF (３×８ml) 、CH3CN (2×８ml)およびCH2Cl2（１×８ml)で洗浄し、高真空下に24時間乾燥した。ニンヒドリンアッセイは支持体に1.2μmol/g のアミンの残留を示した。支持体を無水酢酸／ルチジンのＴＨＦ（10％溶液、３ml)溶液および１−メチルイミダゾールのＴＨＦ（16％溶液、３ml) 溶液で１時間キャッピングし、CH3CN (3×８ml) 、CH2Cl2（２×８ml)で洗浄し、高真空下に24時間乾燥した。トリチルカチオンアッセイは28μmol/g の最終装填量を示した。
【００７１】
実施例６
構造式２２ｂのＴＡＭＲＡ染料標識ポリスチレン支持体の合成（図３参照）
高架橋ポリスチレン（1000Å, 10μmol/g アミン装填、1g, 10μmol)を化合物１９（17mg, 20μmol)、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（3mg,20μmol)、（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（８mg, 20μmol)、およびジイソプロピルエチルアミン（8mg,60μmol)のＤＭＦ（10ml) 溶液を手首で動かすシェーカーで４時間室温で処理し２０ｂを得た。支持体を DMF (３×10ml) 、CH3CN(2×10ml)およびCH2Cl2（１×10ml) で洗浄し、高真空下に終夜乾燥した。ニンヒドリンアッセイは支持体に0.5μmol/gのアミンの残留を示した。支持体を無水酢酸／ルチジンのＴＨＦ（10％溶液、５ml) 溶液および１−メチルイミダゾールのＴＨＦ（16％溶液、５ml) 溶液で２時間室温にてキャッピングした。
【００７２】
支持体２０ｂをCH3CN (3×10ml) およびCH2Cl2（１×10ml) で洗浄した。トリチルカチオンアッセイはポリスチレン支持体に9.2μmol/gの装填量の化合物１９を与えた。支持体２０ｂを20％のピペリジンの DMF (3 ×10ml, 10分各洗浄)溶液で処理し、Fmoc保護基を除去し支持体２１ｂを得た。支持体２１ｂをDMF (３×10ml) 、CH3CN (2×10ml) およびCH2Cl2（１×10ml)で洗浄し、真空下に終夜乾燥した。支持体２１ｂ（1g, 9.2μmol) をシェーカーで36時間 TAMRA-NHSエステル (15mg, 28.5μmol) およびEt3N(8.6mg, 85μmol) の DMF (10ml) 溶液で処理し、支持体２２ｂを得た。支持体を DMF (３×10ml) 、CH3CN(2×10ml)およびCH2Cl2（１×10ml) で洗浄し、高真空下に24時間乾燥した。ニンヒドリンアッセイは支持体に0.5μmol/g以下のアミンの残留を示した。支持体を無水酢酸／ルチジンの THF（10％溶液、５ml) 溶液および１−メチルイミダゾールの THF（16％溶液、５ml) 溶液で１時間キャッピングし、CH3CN(3×10ml) 、CH2Cl2（２×10ml) で洗浄し、高真空下に24時間乾燥した。トリチルカチオンアッセイは8.8μmol/gの最終装填量を示した。
【００７３】
実施例７
本発明の支持体を使用する二重染料標識オリゴヌクレオチドの合成二重染料標識オリゴヌクレオチドを、TAMRA 標識支持体１４ａ、１４ｂ、１８ａ、１８ｂおよび２２ａ、ＤＮＡファーストホスホルアミダイトおよび螢光染料アミダイト FAM-,TET-, HEX- を40-1000nmol のスケールで使用して合成した。ここで「FAM」は6-カルボキシフルオレセイン、「TET」は6-カルボキシ-4,7,2',7'-テトラクロロフルオレセイン、および「HEX」は6-カルボキシ-4,7,2',4',5',7'-ヘキサクロロフルオレセインを示す。自動化オリゴヌクレオチド合成は操作者マニュアルに記載された一般法に従ってアプライドバイオシステムズのモデル394DNA/RNA合成器（ＡＢＤ）で行った。
【００７４】
オリゴヌクレオチド配列 5'＞FAM-TCA CAG TCT GAT CTC GAT-TAMRA＜3'は0.2μmol スケールで TAMRA標識支持体１８ａおよび２２ａ、ＤＮＡファーストホスホルアミダイト（ユーザーブレタン番号85,1994, Applied Biosystems Division) およびＦＡＭアミダイト（ユーザーブレタン番号78, 1994, AppliedBiosystems Division) を使用して合成された。標準0.2μmol 合成サイクルは追加の120 s（ユーザーブレタン番号78, 1994,Applied Biosystems Division) によってFAM-アミダイトのカップリング時間を延長して僅かに改良した。合成完了後、オリゴヌクレオチドは、MeOH:t-BuNH2:H2O(1:1:2)の混合物で支持体を処理して支持体から自動開裂させた、例えば、その全体をここに参考文献として組み込む米国特許第5,231,191号は、アプライドバイオシステムズのモデル394 DNA/RNA合成器のための操作マニュアルに記載されるような１時間自動開裂法（「END CE法」) を使用している。塩基保護基は85℃で１時間または65℃で３時間混合物を加熱して除去した。99％以上のオリゴヌクレオチドを各支持体から開裂した。
【００７５】
上記の同じオリゴヌクレオチド配列はまたTAMRA 標識支持体１８ｂ、ＤＮＡファーストホスホルアミダイト（ユーザーブレタン番号85, 1994,Applied Biosystems Division) およびＦＡＭアミダイト（ユーザーブレタン番号78, 1994, Applied BiosystemsDivision) を使用して40ナノモルのスケールで 394 DNA/RNA合成器で合成した。同様に標準40ナノモル合成サイクルをさらに 120秒ＦＡＭのカップリング時間を延長して僅かに改変した（ユーザーブレタン番号78,1994, Applied Biosystems Division)。99％以上のオリゴヌクレオチドを各支持体から開裂した。
【００７６】
TAMRA 標識支持体１４ａおよび１４ｂはまた上記のように0.2μmol スケールで上記オリゴヌクレオチドを合成するために使用した。オリゴヌクレオチドはMeOH:t-BuNH2:H2O(1:1:2)を使用して 394 DNA/RNAのための操作者マニュアルに記載されている２時間自動開裂プロトコル（END RNA) によって支持体から開裂した。92％以上のオリゴヌクレオチドを支持体から２時間で開裂した。しかしながらオリゴヌクレオチドは１mlのMeOH:t-BuNH2:H2O(1:1:2)中、85℃で１時間オリゴヌクレオチドを結合した支持体を処理することにより支持体から開裂し塩基を脱保護した。99％以上のオリゴヌクレオチドを各支持体から開裂した。固体支持体マトリックス、ＣＰＧまたはポリスチレンは支持体からオリゴヌクレオチドを開裂する割合に差異がなかった。上記オリゴヌクレオチドの粗収率は0.2μモルスケールで 25-30 ODU、40ナノモルスケールで 7-10 ODU であった。粗オリゴヌクレオチドを逆相およびアニオン交換 HPLC で分析した。
【００７７】
オリゴヌクレオチド生成物を分析するために使用した逆相 HPLC システムは次の通りである：ABI 783Aプログラム可能検出器を備えたパーキンエルマーシリーズ200溶媒供給システム、パーキンエルマー ISS200 オートサンプラーおよびＰＥネルソン 900シリーズデーターシステム、RP-18 逆相カラム（220 ×4.6mm,Applied Biosystems Division) 、溶媒Ａ： 0.1M トリエチルアンモニウムアセテート、溶媒Ｂ：CH3CN 、グラジエント：24分で8-20％Ｂ、10分で20-40％Ｂ、２分で40-8％Ｂ、７分間８％Ｂ、流速：１ml/min、検出器：260nm。オリゴヌクレオチド生成物を分析するために使用したアニオン交換 HPLC は次の通りである：ABI783Aプログラム可能検出器を備えたパーキンエルマーシリーズ200 溶媒供給システム、パーキンエルマー ISS200 オートサンプラーおよびＰＥネルソン900シリーズデーターシステム、Nucleopac PA-100カラム（250 ×4mm, Dionex Corporation)；溶媒Ａ：20mMLiClO4 および20mM NaOAc in H2O:CH3CN (9:1, pH6.5)；溶媒Ｂ：600mM LiClO4 および20mM NaOAc in H2O:CH3CN (9:1,pH6.5)；流速１ml/min；グラジエント：40分で0-60％Ｂ；検出器、260nm 。
【００７８】
実施例８
実施例７で調製した二重染料標識オリゴヌクレオチドの酵素分析ヘビ毒ホスホジエステラーゼおよびアルカリ性ホスファターゼを用いた酵素消化：ヘビ毒ホスホジエステラーゼ（crotalus adamanteus) およびアルカリ性ホスホジエステラーゼ（E. coli) をファーマシア、ニュージャージイ州ピスカタウェイから購入した。ヘビ毒ホスホジエステラーゼは１mg/mlで水に溶解する粉末として得た。各試料の消化混合物（55μl)を次の試薬を混合して調製した：水（44μl)、１M MgCl2 (0.8μl)、0.5Mトリス緩衝液、pH7.5(3.5μl)、アルカリ性ホスファターゼ (4.0μl) およびヘビ毒ホスホジエステラーゼ（2.4μl)。一般に、0.2 ないし0.4 Ａ260 のオリゴヌクレオチドを消化混合物に溶解し、37℃で８時間加熱した。インキュベーション後、３Ｍ酢酸ナトリウム（７μl)およびエタノール（155μl) を各試料に添加した。各試料を渦巻攪拌し、ドライアイスで10分間冷却し、次に10分間遠心分離した。上澄みを注意深く一組の新しいチューブに移しエタノール（452μl)を各試料に添加した。試料を渦巻攪拌しドライアイスで10分間冷却し10分間遠心分離した。上澄みを注意深く一組の新しいチューブに移した。試料を乾燥するまで減圧蒸発させた。各試料を水（60μl)に溶解し、下記のように逆相HPLCによって分析した。
【００７９】
酵素消化物の逆相HPLC分析：HPLC分析はABI 783Aプログラム可能検出器、パーキンエルマー ISS200 オートサンプラーおよびＰＥネルソン900シリーズデーターシステムを備えたアプライドバイオシステムズ400 溶媒供給システムで行った。アプライドバイオシステムズ RP-18逆相カラム（220×4.6mm)を使用した。検出器は260nmでセットした。溶媒Ａは３％アセトニトリルの 0.1M トリチルアンモニウムアセテート溶液、溶媒Ｂは90％アセトニトリル水溶液であった。グラジエントは５分間100％Ａ、30分で100-90％Ａ、30分で90-0％Ａ、５分間100％Ｂ、２分で0-100％Ａ、15分間100％Ａ、流速 0.5ml/minであった。流出の順番はdC、dG、Ｔ、dA、６−カルボキシフルオレセイン−（６−ヒドロキシヘキシルアミド）、チミジン−TAMRAリンカー共役体であった。酵素消化の研究は期待されたヌクレオシド組成物を与え、塩基修飾を何も示さなかった。
【００８０】
数例のみを上記のように詳細に述べたが、ポリヌクレオチド合成の当業者にはこの教示から離れることなく多くの変更が好適例において可能であることが明らかであろう。このような変更は本発明の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１は、本発明の好ましい合成支持体の合成を示す概略図である。
【図２】図２は、本発明の好ましい合成支持体の合成を示す概略図である。
【図３】図３は、本発明の好ましい合成支持体の合成を示す概略図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に官能化ポリヌクレオチドの合成に有用な固体支持体試薬に関するものである。さらに特に、本発明は３’−末端に位置する標識を有するポリヌクレオチドの直接合成に有用な合成支持体およびこのような試薬の利用方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
同位体によらずに標識を付けたポリヌクレオチドプローブ、ＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法、自動化ＤＮＡ配列分析、およびバイオ活性アンチセンスおよびトリプレックス合成試薬を連続して迅速に開発することにより、化学的に修飾されたポリヌクレオチドに対する需要を大いに増した。特に有用なポリヌクレオチド修飾のひとつはオリゴヌクレオチドの３’−末端での標識の導入である。
【０００３】
合成ポリヌクレオチドのこのような３’−標識は２つの方法の一つで最も容易に行うことができる。第一の方法は、ここでは「２工程標識法」と呼ばれ、第一脂肪族アミンがポリヌクレオチドの３’−末端に導入され、続いてポリヌクレオチド合成が行われ、アミノ基は親電子的部分、例えば、イソチオシアネートまたは活性化エステル、例えば、ＮＨＳ−エステルを含む標識と反応する。第二の代替法は、ここでは「直接標識法」と呼ばれ、標識は合成中または前にポリヌクレオチドに直接組み込まれる。
【０００４】
合成ポリヌクレオチドの３’−末端に標識を導入する最も有効で手軽な方法は適当に官能化した合成支持体を使用する直接標識法を使用することである。その理由は(i)直接法は合成後の反応工程が不要であり、これにより３’−標識ポリヌクレオチドの合成を簡単にする；そして (ii) 直接法はアミノ標識オリゴヌクレオチドを標識、例えば、染料−ＮＨＳ−エステル標識と反応させるとき一般に出合う低い反応収率（＜60％)に関連した問題、即ち：(a) 過剰な標識物から標識オリゴヌクレオチドを精製すること；(b) 非標識オリゴヌクレオチドから標識オリゴヌクレオチドを精製すること；(c)大きい画分の非標識オリゴヌクレオチドを捨て去ることによる生成物の収率の減少に伴うコストの増加；および(d) 合成中の３’−アミン機能性の不可逆キャッピング、を避けるからである。
【０００５】
しかし、ポリヌクレオチドの直接３’−標識のために使用される現存の方法の重大な欠点は、支持体からオリゴヌクレオチドを分解するために使用される試薬がまた多くのタイプの標識、例えば、螢光染料、例えば、ローダミン基剤染料を化学的に分解し、これによりそれらの螢光性を徹底的に変化させることである。ここに参考文献として組み込まれるP.E.NelsonらのNucleicAcids Research 20(23): 6253-6259 (1992),および米国特許第5,401,837号および 5,141,813号を参照。従って、ローダミンまたは他の同様の染料は現行の固相合成プロトコルに使用されるときはいつも、あまり望ましくない２段階法を使用して結合しなければならない。
【０００６】
それ故に、塩基に不安定な標識に不適合な苛酷な分解条件を必要としない３’−標識ポリヌクレオチドの直接合成に有用な合成支持体を提供することが望まれてきた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は３’−標識ポリヌクレオチドの直接合成に有用なジグリコレート基剤合成支持体の発見に基づくものである。本発明の目的は、ポリヌクレオチド生成物の開裂が水酸化アンモニウムに関連した穏和な条件を使用して行われる合成支持体を提供することである。
【０００８】
本発明の目的はさらに、ポリヌクレオチド生成物の開裂を、ローダミン染料に危害を加えない条件を使用して行うことができる合成支持体を提供することである。本発明の他の目的は、３’−標識ポリヌクレオチドの直接合成を水酸化アンモニウムに不安定な標識、例えば、テトラメチルローダミンを使用して行うことができる合成支持体を提供することである。
【０００９】
さらに本発明の他の目的は、従来の合成支持体を使用するときよりも開裂反応が非常に速い合成支持体を提供することである。本発明の他の目的は、３’−標識ポリヌクレオチドの収率が従来の支持体を使用した場合よりも非常に高い合成支持体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第一の局面では、本発明の前記および他の目的は、式：
【００１１】
【化９】
【００１２】
（式中、Ｔは酸開裂性の水酸基保護基、例えば、4,4'−ジメトキシトリチルであり；Ｌ1 は3'−末端窒素を炭素に結合するためのリンカーであり；Ｌ2およびＬ3 は酸素および炭素を結合するためのリンカーであり；Ｗは固体支持体であり；Ｌ4 は固体支持体を窒素に結合するためのリンカーであり；Ｒ1およびＲ2 は水素、低級アルキル、窒素保護基、または標識からなる群からそれぞれ選ばれる窒素置換基であり；Ｒ3 からＲ7までは水素または低級アルキルからなる群からそれぞれ選ばれる炭素置換基である。）の化合物からなる合成支持体によって達成される。
【００１３】
好適例において、ＷはＣＰＧであり、Ｌ4 は
【００１４】
【化１０】
【００１５】
の構造を有する。また別の好適例では、Ｗは非膨潤性ポリスチレンであり、Ｌ4 はメチレンである。さらに他の好適例では、Ｌ1は
【００１６】
【化１１】
【００１７】
（式中、ｎは０から10のいずれかであり、さらに好ましくはｎ＝５である。）の構造を有する。第一の特に好適な例では、本発明の合成支持体は次の構造を有する。
【００１８】
【化１２】
【００１９】
（式中、ＤＭＴは4,4'−ジメトキシトリチルであり、Ｗはポリスチレンである。）
第二の特に好適な例では、本発明の合成支持体は次の構造を有する。
【００２０】
【化１３】
【００２１】
（式中のＤＭＴは4,4'−ジメトキシトリチルであり、ＷはＣＰＧである。）
第三の特に好適な例では、本発明の合成支持体は次の構造を有する。
【００２２】
【化１４】
【００２３】
（式中、ＤＭＴは4,4'−ジメトキシトリチルであり、Ｗはポリスチレンである。）
第四の特に好適な例では、本発明の合成支持体は次の構造を有する。
【００２４】
【化１５】
【００２５】
（式中のＤＭＴは4,4'−ジメトキシトリチルであり、ＷはＣＰＧである。）
第二の局面では、本発明は上記合成支持体と組み合わせて従来の合成技術を用いる３’−末端にて標識または窒素を有するポリヌクレオチドを合成するための方法を含む。特に、これらの方法は(i)上記のように合成支持体を提供し；(ii)合成支持体を酸で処理して酸開裂性水酸基保護基を除去し；(iii) 保護ヌクレオシドモノマーおよび弱酸を添加して結合体を形成し；(iv)固体支持体の未反応部位をキャッピングし；(v) 酸化剤を添加し；そして(vi) ポリヌクレオチド鎖の伸長が完了するまで上記工程を繰り返す、各工程を含む。３’−標識ポリヌクレオチドの合成後、開裂試薬を使用して固体支持体から生成物を開裂し、ポリヌクレオチドを脱保護する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００２７】
（発明の実施の形態）本発明は各図面および式を参照して以下に好適例を詳細に説明する。本発明は好適例について説明するが、これらの好適例に限定されるものではない。本発明は３’−標識ポリヌクレオチドの合成に有用な改良されたジグリコレート基剤合成支持体に関する。特に、本発明の合成支持体は次の一般式による構造を有する。
【００２８】
【化１６】
【００２９】
（式中のＴは酸開裂性水酸基保護基であり；Ｌ1 は３’−末端窒素を炭素に結合するためのリンカーであり；Ｌ2 およびＬ3は酸素および炭素を結合するためのリンカーであり；Ｗは固体支持体であり；Ｌ4 は固体支持体を窒素に結合するためのリンカーであり；Ｒ1およびＲ2 は水素、低級アルキル、窒素保護基、または標識をそれぞれ含む窒素置換基であり；Ｒ3 からＲ7までは水素または低級アルキルをそれぞれ含む炭素置換基である。）
本発明の合成支持体はポリヌクレオチドの合成に使用される現在の琥珀酸塩基剤の合成支持体を超える幾つかの重要な利点をもつ。この支持体の特に重要な利点は、一旦合成されると、３’−標識ポリヌクレオチドが、比較的穏和な開裂試薬、即ち、水酸化アンモニウムよりも弱い求核剤である開裂試薬を使用して固体支持体から開裂することができることである。例示的な穏和な開裂試薬はエタノールアミン、メチルアミン／水酸化アンモニウム混合物、およびｔ−ブチルアミン／水／メタノール（１：２：１）の混合物を含む、例えばここにその全体が参考文献として組み込まれる米国特許第5,231,191号参照。このような穏和な開裂試薬を使用できることは、水酸化アンモニウムに耐えられない標識、例えばテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ：時には「ＴＭＲ」とよばれる）、例えば６−カルボキシテトラメチルローダミンのようなローダミン染料を有する３’−標識ポリヌクレオチドを直接合成することができるので、実際に重要である。
【００３０】
本発明の第二の重要な利点は、穏和な開裂試薬を使用しても、開裂反応が実質的に従来の方法および試薬、例えば水酸化アンモニウム基剤試薬を琥珀酸塩基剤の合成支持体と組合せて使用して観察されるものよりも速いことである。本発明の支持体の第三の利点は手の介入や苛酷な開裂条件なしで高い生成収率が得られることである。現存する琥珀酸塩基剤の合成支持体を使用して高収率、即ち、99％台の収率を得るには、合成後に、ポリヌクレオチド含有合成支持体を反応カートリッジから手で除き、ガラス瓶に移し、開裂試薬を添加し、懸濁液を数時間約85℃で加熱する。この苛酷な開裂プロトコルを使用することによる好ましくない結果のため、固体支持体中に存在する汚染物質を開裂溶液中に抽出し、これによって生成物のオリゴヌクレオチドの精製を妥協しなければならない。現在入手できる支持体を使用するとき必要な厄介で苛酷なプロトコルに比べて、本発明の合成支持体を使用すると、合成支持体をポリヌクレオチド合成器から除去することなく、あるいは開裂反応を加熱することなく、完全に自動化した方法で99％の収率を得ることができる。さらに、苛酷な開裂条件を必要としないので、生成物は固体支持体から抽出される物質で汚染されない。
【００３１】
ここで使用される「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」の語は天然または改良されたヌクレオシドのオリゴマー、またはホスホジエステル結合によって結合した非ヌクレオシド類似体、または数単量体単位、例えば２〜５から数百単量体単位の大きさの範囲の類似体のオリゴマーを意味する。ここに使用される語「標識（LABEL)」は一般に、(i)検出を容易にする改質剤、例えば、染料、酵素、スピンラベル等；(ii) 固体支持体へのポリヌクレオチドの捕獲を容易にする改質剤、例えば、ビオチン、ヘプテン等；(iii)溶解性に影響を与え或いは細胞の取込みを改良する改質剤、例えば、ＰＥＧ、コレステリル、トリグリセリド等；および(iv) 化学反応に関係する部分を導入する改質剤、例えばプソラレン、ＥＤＴＡ、リン酸塩、核酸開裂試薬等を含む任意のポリヌクレオチドの３’−改質剤を意味する。
【００３２】
本発明では、Ｗはポリヌクレオチド合成が行われる固体支持体である。Ｗは種々の形態および組成を有することができるが、固体支持体は(i) ポリヌクレオチド合成試薬に殆ど溶解せず、(ii)ポリヌクレオチド合成試薬に化学的に安定であり、(iii) 化学誘導ができ、(iv) 望ましいオリゴヌクレオチドの装填ができ、(v) 処理中に出合う高圧に耐える十分な圧縮力をもち、そして(vi)望ましい粒径範囲と分布で入手できる必要がある。ここに使用されるように、「ポリヌクレオチド合成試薬」の語は一般にポリヌクレオチド合成工程に使用される溶媒および試薬を意味し、例えばヨウ素、塩化メチレン、アセトニトリル、テトラゾール、ｎ−メチルイミダゾール、ピリジン、無水酢酸、ルチジン、トリフルオロ酢酸等である。
【００３３】
好適例では、Ｗは無機ポリマーである。広範囲の無機ポリマーを本発明で使用でき、これらは、例えば、シリカ、有孔ガラス、アルミノシリケート、ボロシリケート、アルミナおよび酸化ニッケルのような金属酸化物、種々のクレー等を含む。好ましくは、無機固体支持体は制御有孔ガラス（ＣＰＧ）である。制御有孔ガラスは、制御した寸法の孔がハチの巣状になった均一に粉砕され殆どの純シリカ粒子をふるいわけした粒子からなる。特に熱処理してシリケートからホウ酸塩を分離したボロシリケート材料から製造される。孔は酸性エッチング工程によってホウ酸塩を除去して形成され、それらの寸法は加熱工程の性質に依存する。さらに好ましくは、ＣＰＧは500Åの孔を有する直径が 150μm の粒子の形である、例えば Users Manual Model 392 および394 PolynucleotideSynthesizers, 6-5から6-9頁、Applied Biosystems, Ver.2.00, Doc. Rev. A, Part No.902351(1992), Applied Biosystems Division of The Perkin-Elmer Corporation, フォスター市、CA(ABD)。
【００３４】
本発明のＬ4−ＮＨ部分のようなアミノ末端リンカーでＣＰＧ支持体を誘導化することは、ポリヌクレオチド合成の分野では既知である、例えば、Gait,Editor, Oligonucleotide Synthesis, 45-49頁 (IRL Press, 1984)、そして実際に、約100mmol/g の一次アミノ装填量のアルキルアミンで誘導化したＣＰＧビーズは市販品として入手できる（PierceChemical Company, Rockford, IL)。簡単には、アルキルアミノ基体の場合には、ＣＰＧはアミノアルキルトリメトキシシラン試薬とＣＰＧ粒子の懸濁液を反応させて、濾過し、乾燥させて誘導化される。
【００３５】
第二の好ましい固体支持体は非膨潤性有孔ポリスチレン、例えばここにその全体が参考文献として組み込まれる米国特許第5,047,524号がある。ここで使用される「非膨潤性」は有孔ポリスチレン物質が実質的に機械的に堅く、特に、ポリヌクレオチド合成試薬に曝すとき、認められるほどは容量が増加しないことを意味する。ここで使用される「有孔」は100と4000Åの間の範囲の実質的に均一の直径を有する孔を含む。
【００３６】
ポリスチレン支持体は標準法によってアミノ誘導化される、例えば、Wallaceら、 638-639頁、Scouten ed., SolidPhase Biochemistry (John Wiley & Sons, 1980) ；Wright et al. Tet. Lett., 34:3373-3376 (1993)；ここに参考文献として組み込まれる、Bayer et al, 米国特許第4,908,405号：AppliedBiosystems Research News, Model 390Z, 1994年２月。簡単に述べると、好適な方法では、ヒドロキシメチルフタルイミドは触媒量のメチルスルホン酸を用いてポリスチレン支持体と反応させてフタルイミドメチルポリスチレンを形成する。次にこの物質はヒドラジンで処理してフタルイミド保護基を除き、アミノメチル化ポリスチレンを与える。一般に、アミノ装填量は、非膨潤性有孔ポリスチレン１グラム当たり、アミノ官能基10ないし60μモルに変化する。装填水準は試薬濃度と反応時間を調整することによって制御することができる。
【００３７】
最近開発された代替のポリスチレン誘導化学は、ポリヌクレオチドと結合するために入手できる遊離水酸基をもつ幾つかのポリオキシエチレン残基または鎖を結合して、末端アミノ基を遊離水酸基と置換している、例えば、Bayerand Rapp, 米国特許第4,908,405号；Gao et al.,Tetrahedron Lett., 32(40): 5477-5480(1991)。
【００３８】
第三の好適例では、Ｗは非ポリスチレン有機ポリマー支持体である。ポリマー支持体は合成により改質される天然産材料、および／または合成材料から誘導することができる。特に関係するものは多糖類、特に架橋多糖類、例えばSepharose（登録商標）として入手できるアガロース、Sephadex（登録商標）として入手できるデキストラン、セルロース、澱粉等である。他の適当な材料はポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、シリコーン、Teflon（登録商標）等がある。Ｔは一般に酸開裂性水酸基保護基を示す。好ましくは、Ｔはトリフェニルメチル基およびその電子供与置換誘導体であり、ここでは、語「電子供与」は、一部である、即ち、隣接原子に関して電子陽性である分子中の隣接原子に価電子を放出する置換体の傾向を示す。好ましくは、電子供与置換体はアミノ、１ないし８個の炭素原子を有する低級アルキル、１ないし８個の炭素原子を有する低級アリール、１ないし８個の炭素原子を有する低級アルコキシ等を含む。さらに好ましくは、電子供与置換体はメトキシである。例示的なトリチルは4,4'−ジメトキシトリチル（即ち、ビス（ｐ−アニシル）フェニルメチル）、モノメトキシトリチル、α−ナフチルジフェニルメチル、トリ（ｐ−メトキシフェニル）メチル等を含む。これらおよび他のトリチルの結合と開裂の条件はGreene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd Edition (JohnWiley, New York, 1991)に見出すことができる。
【００３９】
リンカーＬ1、Ｌ2、Ｌ3およびＬ4は本発明の化合物の種々の要素を結合するために役立つ結合部分である。特に、Ｌ1は合成ポリヌクレオチドの3'−末端窒素をポリヌクレオチド自身に結合する働きをして、Ｌ2およびＬ3は炭素と酸素を結合する働きをして、Ｌ4は固体支持体を窒素に結合する働きをする。リンカーＬ1、Ｌ2、Ｌ3およびＬ4の追加の目的は、(i)標識が相補的標的へのポリヌクレオチドのハイブリッド形成を妨げる範囲を減じ、(ii) 標識および／または固体支持体がポリヌクレオチドの合成を妨げる範囲を減じ、そして(iii)ポリヌクレオチド合成中に標識の結合性を保護するために、標識、固体支持体、およびオリゴヌクレオチドの間に適当な空間を与えることである。好ましくは、リンカーＬ1、Ｌ2、Ｌ3およびＬ4はそれぞれ、低級アルキル、低級アルキレンオキシド、アミド、カルバメート、スルホンアミド、尿素、琥珀酸または他のジカルボン酸誘導体、またはそれらの任意の組合せであり、ここに使用されるアルキルアミドは次の部分構造を示す。
【００４０】
【化１７】
【００４１】
（式中のｎは０ないし20のいずれかである）。ジカルボン酸誘導体は次の部分構造を示す。
【００４２】
【化１８】
【００４３】
（式中のｎは２ないし20のいずれかである）。特に好適例では、ｎ＝２、即ち、リンカーは琥珀酸である。ここで使用される語「低級アルキル」は直鎖、分枝鎖、および１ないし10個の炭素原子を含む環状アルキル基を示し、語「低級アルキレンオキシド」は２ないし20個の炭素原子を含む直鎖、分枝鎖、および環状アルキレンオキシド基、例えばポリエチレンオキシドを示す。特に好適例では、Ｌ1はｎ−ブチルまたはｎ−ヘキシルアミドであり；Ｌ2およびＬ3はそれぞれメチレンであり；そしてＷがポリスチレンのとき、Ｌ4はメチレンであり、ＷがＣＰＧのとき、Ｌ4はアミノプロピルスクシニルヘキシルアミンである。
【００４４】
上記の好ましい結合部分に加えて、特に好適例において、リンカーＬ3は開裂するとき、一旦支持体から開裂されるとオリゴヌクレオチドを標識するための追加部位を与える内部開裂部位をもつ部分である。この目的に有用な例示部分はジチオスレイトール（ＤＴＴ）で開裂するとき−ＳＨ部分を形成するジスルフィド結合を含む部分である。特に好ましいＬ3部分は次の構造を有する。
【００４５】
−ＣＨ2−Ｓ−Ｓ−ＣＨ2−置換体Ｒ3−Ｒ7は炭素置換体である。好ましくはＲ3−Ｒ7は別々に低級アルキルまたは水素である。さらに好ましくは、Ｒ3−Ｒ7は水素である。Ｒ1およびＲ2は所望の最終生成物の性質によって大いに変わることができる窒素置換体である。Ｒ1およびＲ2は本発明の中心的な特徴ではなく、一般的な官能基を与えるので、Ｒ1は広範囲の形態を有することができる。Ｒ1およびＲ2は、合成および次のオリゴヌクレオチド開裂の間に、結合した窒素原子が化学的に安定であるように選択する。さらに、Ｒ1およびＲ2はそれ自体標準のポリヌクレオチド合成試薬に安定である。
【００４６】
反応性アミノ基かポリヌクレオチド開裂につづいて望ましいならば、Ｒ1およびＲ2は実質的に窒素の反応性を妨げない。この場合に、Ｒ1およびＲ2は好ましくは低級アルキル、水素、または窒素保護基、例えば、ＦＭＯＣ、ｔＢＯＣ、または他の類似の窒素保護基である。最も好ましくは、Ｒ1およびＲ2の一つは水素である。Ｒ1またはＲ2のいずれかまたは両方が、直接標識法の一部としてポリヌクレオチド合成前に導入される標識である場合に、標識がＤＮＡ合成試薬および穏和な開裂試薬の存在で安定である必要がある。このような標識は発螢光団、酵素、ビオチン、挿入剤、架橋剤、核酸開裂試薬、細胞取込みの改質剤等を含む。好ましくは、標識はローダミン染料、例えば、テトラメチルローダミンである。
【００４７】
ポリヌクレオチドを形成するために使用される化学の詳細な説明は他の場合にも提供されている、例えば、Caruthers et al., 米国特許第4,458,066号；Carutherset al., 米国特許第4,415,732号；Caruthers et al., Genetic Engineering, 4:1-17 (1982)；UsersManual Model 392および394 Polynucleotide Synthesizers, 6-1から6-22頁、AppliedBiosystems, Part No. 901237 (1991)。従って、これらの各文献はここに全体を参考文献として組み込まれる。
【００４８】
ポリヌクレオチド合成のホスホルアミダイト法は、その有効で迅速なカップリングおよび出発物質の安定性のため好ましい方法である。合成は固体支持体に結合した成長するポリヌクレオチド鎖を用いて行われ、過剰の試薬は液相状態で、容易に濾過によって除去することができ、これによりサイクル間の精製工程の必要がない。
【００４９】
次に、ホスホルアミダイト法を使用する代表的なポリヌクレオチド合成サイクルの工程を簡単に記載する。まず、固体支持体を酸、例えば、トリクロロ酢酸で処理し、水酸基保護基Ｔを除去し、水酸基を次のカップリング反応のためにフリーにする。次に同時に保護ホスホルアミダイトヌクレオシドモノマーおよび弱酸、例えば、テトラゾール等を反応物に添加して、活性化した中間体を生成する。弱酸は反応性の中間体を形成するホスホルアミダイトの窒素をプロトン化する。ヌクレオシドの添加は30秒以内で終了する。次に、キャッピング工程を行い、ヌクレオシドの付加を受けなかった任意のポリヌクレオチド鎖を終端する。キャッピングは好ましくは無水酢酸および１−メチルイミダゾールを用いて行われる。次に、好ましい酸化剤としてヨウ素、酸素ドナーとして水を使用して酸化によりインターヌクレオチド結合をホスファイトからさらに安定なホスホトリエステルに変換する。酸化後、水酸基保護基をプロトン性酸、例えば、トリクロロ酢酸またはジクロロ酢酸を用いて除去し、サイクルを鎖伸長が終了するまで繰り返す。合成後、ポリヌクレオチド鎖を塩基、例えば、水酸化アンモニウムまたはｔ−ブチルアミンを使用して支持体から開裂する。開裂反応はまた任意のホスフェート保護基、例えば、シアノエチルを除去する。最後に、塩基の環外アミンの保護基を高温、例えば55℃にて塩基中のポリヌクレオチド溶液を処理して除去する。
【実施例】
【００５０】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれにより制限されるものではない。
実施例１
構造式１４ａのＴＡＭＲＡ染料標識ＣＰＧ支持体の合成（図１参照）
化合物９の合成：セリノール（773mg, 8.50mmol)、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（574mg, 4.25mmol)、（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（1.61g,4.25mmol)、およびジイソプロピルエチルアミン（1.68g, 13mmol)を６−Ｎ−Fmoc−εーアミノカプロン酸のＤＭＦ（20ml) 攪拌溶液に添加した。反応混合物を２時間アルゴン雰囲気下に室温で攪拌した。DMFを減圧下に蒸発させて除去した。残渣をCHCl3(100ml) に溶解し、５％HCl水溶液 (1 ×50ml)、H2O (1×50ml) および飽和塩水 (１×50ml) で洗浄した。有機層を乾燥（MgSO4)し、蒸発させて得られたオイルをEtOH(10ml) に溶解し、冷却した。化合物９は無色の細かい針状に結晶した（1.2g, 66％) 。
【００５１】
1H NMR (CDCl3) d: 1.35 (m, 2H), 1.45 (m, 2H), 1.66(m, 2H), 2.23 (t,J=7.2Hz, 2H), 3.18 (m, 2H), 3.74 (dd, J=11.1, 4.2Hz, 2H), 3.82(dd, J=11.1, 3.9Hz, 2H), 3.95 (m, 1H), 4.20 (t, J=6.6Hz, 1H), 4.39 (d, J=6.6Hz,2H), 5.00 (bs, 1H), 6.40 (d, J=7.4Hz, 1H), 7.28-7.43 (m, 4H), 7.58 (d, J=7.2Hz,2H), 7.76 (d, J=7.2Hz, 2H).
【００５２】
化合物１０の合成：ジメトキシトリチルクロライド（1.16g, 3.43mmol)の乾燥ピリジン（20ml) 溶液を、化合物９（1.33g, 3.12mmol)のピリジン（20ml) 攪拌溶液に室温で窒素雰囲気下に一滴ずつ添加した。添加は30分で完了した。フラスコに栓をして、室温で48時間攪拌した。ＴＬＣは出発物質と生成物１０の存在を示した。ピリジンを減圧下に蒸発させ残渣をCHCl3(50ml)に溶解し、H2O (1×30ml) および飽和塩水 (１×30ml) で洗浄した。有機層を乾燥（MgSO4)し、蒸発させて黄色様オイルを得た。生成物をCHCl3中１％MeOHで溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィで単離した。適当な画分を合わせて蒸発させ無色の泡を得た（1.31g,57％）。
【００５３】
1H NMR (CDCl3) d: 1.26 (m,2H), 1.45 (m, 2H), 1.62 (m, 2H), 2.16 (t,J=7.2Hz, 2H), 2.85 (bs, 1H), 3.16 (m,2H), 3.28 (dd, J=9.9, 4.8Hz, 1H),3.33 (dd, J=9.9, 4.5Hz, 1H), 3.68 (m, 1H),3.74 (s, 6H), 3.81 (m, 1H), 4.09 (m, 1H), 4.19 (t, J=6.6Hz, 1H), 4.39 (d,J=6.6Hz, 2H), 4.91 (bs, 1H), 5.95 (d, J=7.8Hz, 1H), 6.82 (d, J=8.7Hz, 4H),7.20-7.42 (m, 13H), 7.58(d, J=7.2Hz, 2H), 7.75 (d, J=7.2Hz, 2H).
【００５４】
化合物１１の合成：無水琥珀酸（82mg, 0.82mmol) 、Et3N (69mg, 0.68mmol)および４−ジメチルアミノピリジン（42mg,0.34mmol) を化合物１０（500mg, 0.68mmol)のCH2Cl2（15ml) 溶液に添加した。反応混合物を室温で３時間攪拌した。反応混合物をCH2Cl2（30ml)で希釈し、５％クエン酸（１×30ml) 水溶液および飽和塩水（２×30ml) で洗浄した。有機層を乾燥（MgSO4)し、蒸発させて泡が得られた。生成物をCHCl3-MeOHグラジエント（0-5％MeOH)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製した。適当な画分を合わせて蒸発させ無色の泡の化合物１１が得られた（439mg, 78％）。
【００５５】
1H NMR (CDCl3) d: 1.25 (m,2H), 1.45 (m, 2H), 1.60 (m, 2H), 2.18 (t,J=7.5Hz, 2H), 2.52 (s, 4H), 3.13 (m,3H), 3.25 (dd, J=8.7, 4.0Hz, 1H), 3.78 (s, 6H), 4.22 (m, 2H), 4.41 (m, 4H),5.00 (unresolved t, 1H), 6.10 (d, J=7.2Hz, 1H), 6.80 (d, J=8.5Hz, 4H),7.19-7.41 (m, 13H), 7.56 (d, J=7.5Hz, 2H), 7.75 (d, J=7.2Hz, 2H).
【００５６】
ＴＡＭＲＡ染料標識ＣＰＧ支持体１４ａの合成：CPG (500Å, 40μmol/g アミン装填、1g、40μmol, (ABD)) 、化合物１１（67mg, 80μmol)、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（11mg,80μmol)、（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（30mg, 80μmol)、ジイソプロピルエチルアミン（16mg,120μmol)の DMF（8ml) 溶液の混合物を手首で動かすシェーカーで４時間室温で攪拌した。支持体を DMF (３×10ml) 、CH3CN(2×10ml) およびCH2Cl2（１×10ml) で洗浄し、高真空下に終夜乾燥した。ニンヒドリンアッセイは支持体に６μmol/gのアミンの残留を示した。支持体を無水酢酸／ルチジンの THF（10％溶液、５ml) 溶液および１−メチルイミダゾールの THF（16％溶液、５ml) 溶液で２時間室温にてキャッピングした。
【００５７】
支持体１２ａをCH3CN (3×10ml) およびCH2Cl2（１×10ml) で洗浄し、次にDMF中20％ピペリジン（３×10ml、10分各洗浄) で処理し、Fmoc保護基を除去し支持体１３ａを与えた。Fmoc基の除去は302nmで溶液のＵＶ吸収を測定してモニターした。支持体１３ａをDMF (３×10ml) 、CH3CN (2×10ml) およびCH2Cl2（１×10ml)で洗浄し、真空下に終夜乾燥した。次に支持体（500mg, 16μmol) をシェカーで42時間TAMRA-NHS エステル (ABD, p/n 400981)(26mg, 49μmol) およびEt3N (10.1mg, 100 μmol)の DMF (5ml)溶液で処理し、染料標識支持体１４ａを得た。支持体をDMF (３×10ml) 、CH3CN (2×10ml) およびCH2Cl2（１×10ml)で洗浄し、高真空下に24時間乾燥した。ニンヒドリンアッセイは１μmol/g のアミンの残留を示した。次に支持体を無水酢酸／ルチジン混合物の THF（10％溶液、５ml)溶液および１−メチルイミダゾールの THF（16％溶液、５ml) 溶液で１時間キャッピングし、CH3CN (3×10ml) およびCH2Cl2（２×10ml)で洗浄し、高真空下に24時間乾燥した。トリチルカチオンアッセイは30.3μmol/g の最終装填量を示した。
【００５８】
実施例２
構造式１４ｂのＴＡＭＲＡ染料標識ポリスチレン支持体の合成（図１参照）
高架橋ポリスチレン（1000Å, 10μmol/g アミン装填、2g, 20μmol, (ABD))を実施例１からの化合物１１（34mg, 40μmol)、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（5.5mg,40μmol)、（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（15mg, 40μmol)、およびジイソプロピルエチルアミン（８mg,60μmol)の DMF（10ml) 溶液を手首で動かすシェーカーで４時間室温で反応させた。支持体を DMF (３×10ml) 、CH3CN(2×10ml) およびCH2Cl2（１×10ml) で洗浄し、高真空下に終夜乾燥した。ニンヒドリンアッセイは支持体に0.6μmol/g のアミンの残留を示した。支持体を無水酢酸／ルチジンの THF（10％溶液、５ml) 溶液および１−メチルイミダゾールの THF（16％溶液、５ml)溶液で２時間室温にてキャッピングした。支持体１２ｂをCH3CN (3×10ml) およびCH2Cl2（１×10ml)で洗浄した。トリチルカチオンアッセイはポリスチレン支持体に化合物１１が９μmol/g 装填されていることを示した。次に支持体１２ｂを20％ピペリジンの DMF(３×10ml, 10分各洗浄) で処理してFmoc保護基を除き支持体１３ｂが得られた。Fmoc基の除去は302nm で溶液のＵＶ吸収を測定してモニターした。支持体１３ｂをDMF (３×10ml) 、CH3CN (2×10ml) およびCH2Cl2（１×10ml)で洗浄し、真空下に終夜乾燥した。次に支持体（1g, 9μmol)をシェーカーで36時間 TAMRA-NHSエステル (15mg, 28.5μmol) およびEt3N(8.6mg, 85μmol) の DMF (10ml) 溶液で室温処理し、支持体１４ｂが得られた。支持体を DMF (３×10ml) 、CH3CN(2×10ml) およびCH2Cl2（１×10ml) で洗浄し、高真空下に24時間乾燥した。ニンヒドリンアッセイは0.5μmol/g以下のアミンの残留を示した。次に支持体を無水酢酸／ルチジンのＴＨＦ（10％溶液、５ml) 溶液および１−メチルイミダゾールのＴＨＦ（16％溶液、５ml) 溶液で１時間キャッピングし、CH3CN(3×10ml) およびCH2Cl2（２×10ml) で洗浄し、高真空下に24時間乾燥した。トリチルカチオンアッセイは8.8μmol/g の最終装填量を示した。
【００５９】
実施例３
構造式１８ａのＴＡＭＲＡ染料標識ＣＰＧ支持体の合成（図２参照）
１−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−（Ｎ−Fmoc−４−アミノブチル）−1, 3−プロパンジオール化合物４の合成：ネルソンらの Nucleic AcidsResearch 20:6253-6259 (1992) に記載されている方法によって合成した。ジメトキシトリチルクロライド（3.66g,10.82mmol) の乾燥ピリジン (60ml) 溶液を窒素雰囲気下、室温にて２−（Ｎ−Fmoc−４−アミノブチル）−1, 3−プロパンジオール（4.0g,10.82mmol)のピリジン（50ml) 攪拌溶液に一滴ずつ添加した。添加を２時間で完了した。フラスコに栓をして、室温で48時間攪拌した。ＴＬＣは出発物質と生成物４の存在を示した。ピリジンを減圧下に蒸発させ残渣をCHCl3(100ml) に溶解し、H2O (1×100ml) および飽和塩水 (１×100ml) で洗浄した。有機層を乾燥（MgSO4)し、蒸発させて黄色様オイルが得られた。生成物をCHCl3中１％MeOHで溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィで単離した。適当な画分を合わせて蒸発させ無色の泡を得た（3.4g,46％）。
【００６０】
1H NMR (CDCl3) d: 1.15-1.45 (m, 6H), 1.88 (m, 1H),2.44 (t, J=5.7Hz,1H), 3.07 (dd, J=9.3, 7.5Hz, 1H), 3.12 (m, 2H), 3.29 (dd,J=9.3, 4.2Hz,1H), 3.64 (m, 2H), 3.78 (s, 6H), 4.20 (t, J=6.8Hz, 1H), 4.39 (d,J=6.8Hz, 2H), 4.72 (unresolved t, 1H), 6.82 (d, J=9.0Hz, 4H), 7.25-7.43 (m,13H), 7.58 (d, J=7.2Hz, 2H), 7.75 (d, J=7.2Hz, 2H).
【００６１】
ジグリコレート１５の合成：無水ジグリコール酸（81mg, 0.94mmol) のCH2Cl2（５ml) 溶液をEt3N(90mg, 0.89mmol)、４−ジメチルアミノピリジン（45mg, 0.37mmol) 、および化合物４（500mg, 0.74mmol) のCH2Cl2(15ml) 溶液の混合物に０℃（氷浴）でアルゴン雰囲気下に一滴ずつ添加した。添加を完了（10分) 後、氷浴を除去し、反応混合物を室温で１時間攪拌した。反応混合物をCHCl3(30ml)で希釈し、５％クエン酸水（１×50ml) および飽和塩水 (２×50ml) で洗浄した。有機層を乾燥（MgSO4)し、蒸発させて泡が得られた。生成物をCHCl3-EtOHグラジエント（2-10％EtOH)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製した。適当な画分を合わせて蒸発させ無色の泡の化合物１５を得た（354mg, 60％）。
【００６２】
1H NMR (CDCl3) d: 1.00-1.25 (m, 6H), 1.75 (m, 1H),2.88 (m, 4H), 3.70(s, 6H), 3.96 (s, 2H), 4.04 (s, 2H), 4.13 (m, 3H), 4.31 (d,J=6.9Hz), 5.18 (bs, 1H), 6.74 (d, J=8.7Hz, 4H), 7.18-7.34 (m, 13H), 7.53 (d,J=7.5Hz, 2H), 7.67 (d, J=7.5Hz, 2H).
【００６３】
ＴＡＭＲＡ染料標識ＣＰＧ支持体１８ａの合成：ＣＰＧ（500Å, 40μmol/gアミン装填、2g,80μmol)、化合物１５（126mg, 160μmol)、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（22mg, 160μmol)、（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（61mg,160μmol)、およびジイソプロピルエチルアミン（35mg, 270μmol)のＤＭＦ（10ml) 溶液の混合物を手首で動かすシェーカーで４時間室温で攪拌した。支持体をDMF (３×10ml) 、CH3CN (2×10ml) およびCH2Cl2（１×10ml)で洗浄し、高真空下に終夜乾燥した。ニンヒドリンアッセイは支持体に３μmol/g のアミンの残留を示した。トリチルカチオンアッセイはＣＰＧ支持体上に37.5μmol/gの装填量の化合物１５を示した。支持体を無水酢酸／ルチジンのＴＨＦ（10％溶液、５ml) 溶液および１−メチルイミダゾールのＴＨＦ（16％溶液、５ml) 溶液で２時間室温にてキャッピングした。
【００６４】
支持体１６ａをCH3CN (3×10ml) およびCH2Cl2（１×10ml) で洗浄し、次に20％のピペリジンのDMF (３×10ml, 10分各洗浄) 溶液で処理し、Fmoc保護基を除去し遊離アミノ基を含む支持体１７ａを与えた。Fmoc基の除去は302nmで溶液のＵＶ吸収を測定してモニターした。支持体１７ａをDMF (３×10ml) 、CH3CN (2×10ml) およびCH2Cl2（１×10ml)で洗浄し、真空下に終夜乾燥した。次に支持体１７ａ（500mg, 19μmol) をシェカーで42時間 TAMRA-NHSエステル (30mg, 57μmol)およびEt3N(13.1mg, 130μmol)の DMF (５ml) 溶液で処理し、染料標識支持体１８ａが得られた。支持体を DMF (３×10ml) 、CH3CN(2×10ml) およびCH2Cl2（１×10ml) で洗浄し、高真空下に24時間乾燥した。ニンヒドリンアッセイは支持体に１μmol/gのアミンの存在を示した。支持体を次に無水酢酸／ルチジンのＴＨＦ（10％溶液、５ml) 溶液および１−メチルイミダゾールのＴＨＦ（16％溶液、５ml) 溶液で１時間キャッピングし、CH3CN(3×10ml) 、CH2Cl2（２×10ml) で洗浄し、高真空下に24時間乾燥した。トリチルカチオンアッセイは36μmol/gの最終装填量を示した。
【００６５】
実施例４
構造式１８ｂのＴＡＭＲＡ染料標識ポリスチレン支持体の合成（図２参照）
高架橋ポリスチレン（1000Å, 10μmol/g アミン装填、2g, 20μmol)を化合物１５（32mg, 40μmol)、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（5.5mg,40μmol)、（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（15mg, 40μmol)、およびジイソプロピルエチルアミン（8mg,60μmol)のＤＭＦ（10ml) 溶液を手首で動かすシェーカーで４時間室温で処理した。支持体を DMF (３×10ml) 、CH3CN(2×10ml) およびCH2Cl2（１×10ml) で洗浄し、高真空下に終夜乾燥した。ニンヒドリンアッセイは支持体に0.5μmol/gのアミンの存在を示した。支持体を無水酢酸／ルチジンのＴＨＦ（10％溶液、５ml) 溶液および１−メチルイミダゾールのＴＨＦ（16％溶液、５ml) 溶液で２時間室温にてキャッピングした。
【００６６】
支持体１６ｂをCH3CN (3×10ml) およびCH2Cl2（１×10ml) で洗浄した。トリチルカチオンアッセイはポリスチレン支持体上に９μmol/gの装填量の化合物１５を与えた。支持体１６ｂを20％のピペリジンの DMF (３×10ml, 10分各洗浄)溶液で処理し、Fmoc保護基を除去し支持体１７ｂを与えた。支持体１７ｂをDMF(３×10ml) 、CH3CN (2×10ml) およびCH2Cl2（１×10ml) で洗浄し、真空下に終夜乾燥した。次に支持体１７ｂ（1g,9μmol) をシェーカーで36時間室温にてTAMRA-NHSエステル (15mg, 28.5μmol)およびEt3N (8.6mg,85μmol)の DMF (10ml) 溶液で処理し、支持体１８ｂを得た。支持体を DMF (３×10ml) 、CH3CN (2×10ml)およびCH2Cl2（１×10ml) で洗浄し、高真空下に24時間乾燥した。ニンヒドリンアッセイは0.5μmol/g以下のアミンの残留を示した。支持体を無水酢酸／ルチジンのＴＨＦ（10％溶液、５ml) 溶液および１−メチルイミダゾールのＴＨＦ（16％溶液、５ml) 溶液で１時間キャッピングし、CH3CN(3×10ml) 、CH2Cl2（２×10ml) で洗浄し、高真空下に24時間乾燥した。トリチルカチオンアッセイは8.7μmol/gの最終装填量を示した。
【００６７】
実施例５
構造式２２ａのＴＡＭＲＡ染料標識ＣＰＧ支持体の合成（図３参照）
ジグリコレート１９の合成：無水ジグリコール酸（64mg, 0.55mmol) のCH2Cl2（５ml) 溶液をEt3N(67mg, 0.66mmol) 、４−ジメチルアミノピリジン（34mg,0.28mmol) および化合物１０（400mg, 0.55mmol)のCH2Cl2(15ml) 溶液の混合物にアルゴン雰囲気下０℃で添加した。添加を完了（10分) 後、氷浴を除去し、反応混合物を室温で１時間攪拌した。反応混合物をCH2Cl2(30ml) で希釈し、５％クエン酸水溶液（１×50ml) および飽和塩水 (２×50ml) で洗浄した。有機層を乾燥（MgSO4)し、蒸発させて泡が得られた。生成物をCHCl3-EtOHグラジエント（2-10％EtOH)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィで精製した。適当な画分を合わせて蒸発させ無色の泡の化合物１９を得た（260mg, 56％）。
【００６８】
1H NMR (CDCl3) d: 1.20 (m, 2H), 1.39 (m, 2H), 1.58(m, 2H), 2.18 (t,J=7.5Hz, 2H), 2.90-3.25 (m, 4H), 3.80 (s, 6H), 3.86 (s, 4H),4.00-4.40 (m, 6H), 4.85 (unresolved t, 1H), 5.92 (d, J=7.2Hz, 1H), 6.75 (d,J=8.1Hz, 4H), 7.20-7.40 (m, 13H), 7.52 (d, J=7.2Hz, 2H), 7.69 (d, J=7.2Hz, 2H).
【００６９】
ＴＡＭＲＡ染料標識ＣＰＧ支持体２２ａの合成：ＣＰＧ（500Å, 33μmol/gアミン装填、1g, 33μmol)、化合物１９（56mg, 66μmol)、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（9mg,66μmol)、（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（25mg, 66μmol)、およびジイソプロピルエチルアミン（13mg,100μmol)のＤＭＦ（6ml)溶液の混合物を手首で動かすシェーカーで４時間室温で攪拌した。支持体を DMF(３×８ml) 、CH3CN(2×８ml) およびCH2Cl2（１×８ml) で洗浄し、高真空下に終夜乾燥した。ニンヒドリンアッセイは支持体に３μmol/gのアミンの残留を示した。トリチルカチオンアッセイはＣＰＧ支持体に29μmol/g の装填量の化合物１９を示した。支持体を無水酢酸／ルチジンの THF（10％溶液、３ml)溶液および１−メチルイミダゾールのＴＨＦ（16％溶液、３ml) 溶液で２時間室温にてキャッピングした。
【００７０】
支持体２０ａをCH3CN (3×８ml) およびCH2Cl2（１×８ml) で洗浄し、20％のピペリジンのDMF (3 ×５ml, 10分各洗浄) 溶液で処理し、Fmoc保護基を除去し遊離アミノ基を含む支持体２１ａを得た。支持体２１ａを DMF (３×８ml) 、CH3CN(2×８ml) およびCH2Cl2（１×８ml) で洗浄し、真空下に終夜乾燥した。次に支持体２１ａ（500mg,15μmol)をシェーカーで42時間TAMRA-NHS エステル (24mg, 45μmol)およびEt3N (11mg, 110μmol)のDMF (５ml) 溶液で処理し、染料標識支持体２２ａを得た。支持体２２ａを DMF (３×８ml) 、CH3CN (2×８ml)およびCH2Cl2（１×８ml)で洗浄し、高真空下に24時間乾燥した。ニンヒドリンアッセイは支持体に1.2μmol/g のアミンの残留を示した。支持体を無水酢酸／ルチジンのＴＨＦ（10％溶液、３ml)溶液および１−メチルイミダゾールのＴＨＦ（16％溶液、３ml) 溶液で１時間キャッピングし、CH3CN (3×８ml) 、CH2Cl2（２×８ml)で洗浄し、高真空下に24時間乾燥した。トリチルカチオンアッセイは28μmol/g の最終装填量を示した。
【００７１】
実施例６
構造式２２ｂのＴＡＭＲＡ染料標識ポリスチレン支持体の合成（図３参照）
高架橋ポリスチレン（1000Å, 10μmol/g アミン装填、1g, 10μmol)を化合物１９（17mg, 20μmol)、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（3mg,20μmol)、（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（８mg, 20μmol)、およびジイソプロピルエチルアミン（8mg,60μmol)のＤＭＦ（10ml) 溶液を手首で動かすシェーカーで４時間室温で処理し２０ｂを得た。支持体を DMF (３×10ml) 、CH3CN(2×10ml)およびCH2Cl2（１×10ml) で洗浄し、高真空下に終夜乾燥した。ニンヒドリンアッセイは支持体に0.5μmol/gのアミンの残留を示した。支持体を無水酢酸／ルチジンのＴＨＦ（10％溶液、５ml) 溶液および１−メチルイミダゾールのＴＨＦ（16％溶液、５ml) 溶液で２時間室温にてキャッピングした。
【００７２】
支持体２０ｂをCH3CN (3×10ml) およびCH2Cl2（１×10ml) で洗浄した。トリチルカチオンアッセイはポリスチレン支持体に9.2μmol/gの装填量の化合物１９を与えた。支持体２０ｂを20％のピペリジンの DMF (3 ×10ml, 10分各洗浄)溶液で処理し、Fmoc保護基を除去し支持体２１ｂを得た。支持体２１ｂをDMF (３×10ml) 、CH3CN (2×10ml) およびCH2Cl2（１×10ml)で洗浄し、真空下に終夜乾燥した。支持体２１ｂ（1g, 9.2μmol) をシェーカーで36時間 TAMRA-NHSエステル (15mg, 28.5μmol) およびEt3N(8.6mg, 85μmol) の DMF (10ml) 溶液で処理し、支持体２２ｂを得た。支持体を DMF (３×10ml) 、CH3CN(2×10ml)およびCH2Cl2（１×10ml) で洗浄し、高真空下に24時間乾燥した。ニンヒドリンアッセイは支持体に0.5μmol/g以下のアミンの残留を示した。支持体を無水酢酸／ルチジンの THF（10％溶液、５ml) 溶液および１−メチルイミダゾールの THF（16％溶液、５ml) 溶液で１時間キャッピングし、CH3CN(3×10ml) 、CH2Cl2（２×10ml) で洗浄し、高真空下に24時間乾燥した。トリチルカチオンアッセイは8.8μmol/gの最終装填量を示した。
【００７３】
実施例７
本発明の支持体を使用する二重染料標識オリゴヌクレオチドの合成二重染料標識オリゴヌクレオチドを、TAMRA 標識支持体１４ａ、１４ｂ、１８ａ、１８ｂおよび２２ａ、ＤＮＡファーストホスホルアミダイトおよび螢光染料アミダイト FAM-,TET-, HEX- を40-1000nmol のスケールで使用して合成した。ここで「FAM」は6-カルボキシフルオレセイン、「TET」は6-カルボキシ-4,7,2',7'-テトラクロロフルオレセイン、および「HEX」は6-カルボキシ-4,7,2',4',5',7'-ヘキサクロロフルオレセインを示す。自動化オリゴヌクレオチド合成は操作者マニュアルに記載された一般法に従ってアプライドバイオシステムズのモデル394DNA/RNA合成器（ＡＢＤ）で行った。
【００７４】
オリゴヌクレオチド配列 5'＞FAM-TCA CAG TCT GAT CTC GAT-TAMRA＜3'は0.2μmol スケールで TAMRA標識支持体１８ａおよび２２ａ、ＤＮＡファーストホスホルアミダイト（ユーザーブレタン番号85,1994, Applied Biosystems Division) およびＦＡＭアミダイト（ユーザーブレタン番号78, 1994, AppliedBiosystems Division) を使用して合成された。標準0.2μmol 合成サイクルは追加の120 s（ユーザーブレタン番号78, 1994,Applied Biosystems Division) によってFAM-アミダイトのカップリング時間を延長して僅かに改良した。合成完了後、オリゴヌクレオチドは、MeOH:t-BuNH2:H2O(1:1:2)の混合物で支持体を処理して支持体から自動開裂させた、例えば、その全体をここに参考文献として組み込む米国特許第5,231,191号は、アプライドバイオシステムズのモデル394 DNA/RNA合成器のための操作マニュアルに記載されるような１時間自動開裂法（「END CE法」) を使用している。塩基保護基は85℃で１時間または65℃で３時間混合物を加熱して除去した。99％以上のオリゴヌクレオチドを各支持体から開裂した。
【００７５】
上記の同じオリゴヌクレオチド配列はまたTAMRA 標識支持体１８ｂ、ＤＮＡファーストホスホルアミダイト（ユーザーブレタン番号85, 1994,Applied Biosystems Division) およびＦＡＭアミダイト（ユーザーブレタン番号78, 1994, Applied BiosystemsDivision) を使用して40ナノモルのスケールで 394 DNA/RNA合成器で合成した。同様に標準40ナノモル合成サイクルをさらに 120秒ＦＡＭのカップリング時間を延長して僅かに改変した（ユーザーブレタン番号78,1994, Applied Biosystems Division)。99％以上のオリゴヌクレオチドを各支持体から開裂した。
【００７６】
TAMRA 標識支持体１４ａおよび１４ｂはまた上記のように0.2μmol スケールで上記オリゴヌクレオチドを合成するために使用した。オリゴヌクレオチドはMeOH:t-BuNH2:H2O(1:1:2)を使用して 394 DNA/RNAのための操作者マニュアルに記載されている２時間自動開裂プロトコル（END RNA) によって支持体から開裂した。92％以上のオリゴヌクレオチドを支持体から２時間で開裂した。しかしながらオリゴヌクレオチドは１mlのMeOH:t-BuNH2:H2O(1:1:2)中、85℃で１時間オリゴヌクレオチドを結合した支持体を処理することにより支持体から開裂し塩基を脱保護した。99％以上のオリゴヌクレオチドを各支持体から開裂した。固体支持体マトリックス、ＣＰＧまたはポリスチレンは支持体からオリゴヌクレオチドを開裂する割合に差異がなかった。上記オリゴヌクレオチドの粗収率は0.2μモルスケールで 25-30 ODU、40ナノモルスケールで 7-10 ODU であった。粗オリゴヌクレオチドを逆相およびアニオン交換 HPLC で分析した。
【００７７】
オリゴヌクレオチド生成物を分析するために使用した逆相 HPLC システムは次の通りである：ABI 783Aプログラム可能検出器を備えたパーキンエルマーシリーズ200溶媒供給システム、パーキンエルマー ISS200 オートサンプラーおよびＰＥネルソン 900シリーズデーターシステム、RP-18 逆相カラム（220 ×4.6mm,Applied Biosystems Division) 、溶媒Ａ： 0.1M トリエチルアンモニウムアセテート、溶媒Ｂ：CH3CN 、グラジエント：24分で8-20％Ｂ、10分で20-40％Ｂ、２分で40-8％Ｂ、７分間８％Ｂ、流速：１ml/min、検出器：260nm。オリゴヌクレオチド生成物を分析するために使用したアニオン交換 HPLC は次の通りである：ABI783Aプログラム可能検出器を備えたパーキンエルマーシリーズ200 溶媒供給システム、パーキンエルマー ISS200 オートサンプラーおよびＰＥネルソン900シリーズデーターシステム、Nucleopac PA-100カラム（250 ×4mm, Dionex Corporation)；溶媒Ａ：20mMLiClO4 および20mM NaOAc in H2O:CH3CN (9:1, pH6.5)；溶媒Ｂ：600mM LiClO4 および20mM NaOAc in H2O:CH3CN (9:1,pH6.5)；流速１ml/min；グラジエント：40分で0-60％Ｂ；検出器、260nm 。
【００７８】
実施例８
実施例７で調製した二重染料標識オリゴヌクレオチドの酵素分析ヘビ毒ホスホジエステラーゼおよびアルカリ性ホスファターゼを用いた酵素消化：ヘビ毒ホスホジエステラーゼ（crotalus adamanteus) およびアルカリ性ホスホジエステラーゼ（E. coli) をファーマシア、ニュージャージイ州ピスカタウェイから購入した。ヘビ毒ホスホジエステラーゼは１mg/mlで水に溶解する粉末として得た。各試料の消化混合物（55μl)を次の試薬を混合して調製した：水（44μl)、１M MgCl2 (0.8μl)、0.5Mトリス緩衝液、pH7.5(3.5μl)、アルカリ性ホスファターゼ (4.0μl) およびヘビ毒ホスホジエステラーゼ（2.4μl)。一般に、0.2 ないし0.4 Ａ260 のオリゴヌクレオチドを消化混合物に溶解し、37℃で８時間加熱した。インキュベーション後、３Ｍ酢酸ナトリウム（７μl)およびエタノール（155μl) を各試料に添加した。各試料を渦巻攪拌し、ドライアイスで10分間冷却し、次に10分間遠心分離した。上澄みを注意深く一組の新しいチューブに移しエタノール（452μl)を各試料に添加した。試料を渦巻攪拌しドライアイスで10分間冷却し10分間遠心分離した。上澄みを注意深く一組の新しいチューブに移した。試料を乾燥するまで減圧蒸発させた。各試料を水（60μl)に溶解し、下記のように逆相HPLCによって分析した。
【００７９】
酵素消化物の逆相HPLC分析：HPLC分析はABI 783Aプログラム可能検出器、パーキンエルマー ISS200 オートサンプラーおよびＰＥネルソン900シリーズデーターシステムを備えたアプライドバイオシステムズ400 溶媒供給システムで行った。アプライドバイオシステムズ RP-18逆相カラム（220×4.6mm)を使用した。検出器は260nmでセットした。溶媒Ａは３％アセトニトリルの 0.1M トリチルアンモニウムアセテート溶液、溶媒Ｂは90％アセトニトリル水溶液であった。グラジエントは５分間100％Ａ、30分で100-90％Ａ、30分で90-0％Ａ、５分間100％Ｂ、２分で0-100％Ａ、15分間100％Ａ、流速 0.5ml/minであった。流出の順番はdC、dG、Ｔ、dA、６−カルボキシフルオレセイン−（６−ヒドロキシヘキシルアミド）、チミジン−TAMRAリンカー共役体であった。酵素消化の研究は期待されたヌクレオシド組成物を与え、塩基修飾を何も示さなかった。
【００８０】
数例のみを上記のように詳細に述べたが、ポリヌクレオチド合成の当業者にはこの教示から離れることなく多くの変更が好適例において可能であることが明らかであろう。このような変更は本発明の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１は、本発明の好ましい合成支持体の合成を示す概略図である。
【図２】図２は、本発明の好ましい合成支持体の合成を示す概略図である。
【図３】図３は、本発明の好ましい合成支持体の合成を示す概略図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００８−２４７９０８（Ｐ２００８−２４７９０８Ａ）
【公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−９４３０３（Ｐ２００８−９４３０３）
【出願日】平成２０年３月３１日（２００８．３．３１）
【分割の表示】特願平９−２７３２６の分割
【原出願日】平成９年１月２８日（１９９７．１．２８）
【出願人】（５０００６９０５７）アプレラ コーポレイション (120)
【住所又は居所原語表記】８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｒｅ Ｄｒｉｖｅ Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡＬＩＦＯＲＮＩＡ ９４４０４ Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月３１日（２００８．３．３１）
【分割の表示】特願平９−２７３２６の分割
【原出願日】平成９年１月２８日（１９９７．１．２８）
【出願人】（５０００６９０５７）アプレラ コーポレイション (120)
【住所又は居所原語表記】８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｒｅ Ｄｒｉｖｅ Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡＬＩＦＯＲＮＩＡ ９４４０４ Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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