５−ケトグルコン酸産生能を有する高温耐性菌、および高温耐性菌を用いた５−ケトグルコン酸の製造方法
【課題】工業的な５−ケト−Ｄ−グルコン酸生産に応用できる、高温耐性菌を提供する。
【解決手段】グルコノバクター属に属し、３０〜３８℃で５−ケト−Ｄ−グルコン酸産生能を有する、高温耐性菌、または、ＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子を破壊した変異株である、高温耐性菌。該高温耐性菌を、ＰＱＱおよび／またはＣａイオン存在下、３０〜３７℃で培養して、５−ケト−Ｄ−グルコン酸を生産させる、５−ケト−Ｄ−グルコン酸の製造方法。
【解決手段】グルコノバクター属に属し、３０〜３８℃で５−ケト−Ｄ−グルコン酸産生能を有する、高温耐性菌、または、ＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子を破壊した変異株である、高温耐性菌。該高温耐性菌を、ＰＱＱおよび／またはＣａイオン存在下、３０〜３７℃で培養して、５−ケト−Ｄ−グルコン酸を生産させる、５−ケト−Ｄ−グルコン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高温で５−ケトグルコン酸（５ＫＧＡ）産生能を有する高温耐性菌、および該高温耐性菌を用いた５ＫＧＡの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルコノバクターは、糖、糖アルコール、糖酸などの広い範囲の化合物を酸化することができ、酸化された産物を高い収率で培地中に蓄積できる酢酸菌の種類である。これらの酸化反応に関与する酵素は、Ｄ−グルコース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、グリセロール、グルコン酸やケトグルコン酸の脱水素酵素である。それら全ての酵素は、細胞質膜表層に固く結合しており、基質から引き抜かれた電子は、ユビキノンを介して末端のユビキノン酸化酵素へ伝達され、その電子伝達反応に伴って生物エネルギーを生成する。
【０００３】
Ｄ−グルコースのケト−Ｄ−グルコン酸への酸化は、細胞膜外に存在する酵素により触媒されることが知られている。Ｄ−グルコースは、膜結合ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）−グルコース脱水素酵素により、グルコノ−δ−ラクトンへ酸化され、グルコノ−δ−ラクトンは、グルコノラクトナーゼにより、Ｄ−グルコン酸へ変換される。グルコノバクター菌で見られたケトグルコン酸の形成は、膜結合グルコン酸脱水素酵素の２つのタイプにより触媒されることをＭａｔｓｕｓｈｉｔａらは報告している（非特許文献１）。１つは、ＦＡＤ含有２−ケトグルコン酸生産酵素、すなわちＦＡＤ−グルコン酸脱水素酵素（ＦＡＤ−ＧＡＤＨ：Ｇｌｕｃｏｎａｔｅ ２−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｆｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎ）、もう１つは、ＰＱＱ含有５ケト−Ｄ−ケトグルコン酸生産酵素、すなわちＰＱＱ−グリセロ−ル脱水素酵素（ＰＱＱ−ＧＬＤＨ：Ｐｙｒｒｏｌｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ ｑｕｉｎｏｎｅ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）である（図１）。また、ＦＡＤ−ＧＡＤＨが、３つのサブユニットを持つことは、Ｓｈｉｎａｇａｗａらにより報告されており（非特許文献２）、３つのサブユニットとは、ＦＡＤ含有脱水素酵素サブユニット、ｔｈｒｅｅ−ｈｅｍｅ含有チトクロームＣサブユニット、そして未公知の小さなサブユニットである。５ＫＧＡ生産を触媒する後者の酵素は、ＰＱＱ含有ポリオール脱水素酵素と同一であることが、Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａらにより明らかにされており（非特許文献３）、ＰＱＱ−ＧＬＤＨは、Ｄ−アラビトール脱水素酵素、Ｄ−ソルビトール脱水素酵素、あるいはグリセロール脱水素酵素など、種々の糖アルコールの酸化酵素として知られている。ＰＱＱ−ＧＬＤＨは、多方面の基質と反応できるが、いわゆる「Ｂｅｒｔｒａｎｄ−Ｈｕｄｓｏｎ法」に従って反応が触媒される高い立体特異性をもつ。この酵素は、５ＫＧＡをＤ−グルコン酸から生産するために、Ｄ−グルコン酸のＣ５位置だけを酸化することができるが、Ｄ−グルコン酸との酵素親和性は低い。この酵素の遺伝子は、グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ３２５５からクローニングされ、２つのオープンリーディングフレームが見出された。１つは、５−膜貫通領域の疎水性領域蛋白をコードすると推定され、もう１つは、いくつかのＰＱＱ依存酵素に類似した脱水素酵素サブユニットをコードしていて、特に膜結合グルコース脱水素酵素のＰＱＱドメインに類似している。一方、細胞質に位置する２ＫＧＡ還元酵素や５ＫＧＡ還元酵素は、輸送蛋白により、細胞質に輸送された後で、２ＫＧＡや５ＫＧＡをそれぞれＤ−グルコン酸へ変換し、資化するために機能している。
【０００４】
５ＫＧＡは酒石酸、キシル酸、ビタミンＣや重要な香料化合物などの原料となる有用な物質である（非特許文献４）。Ｇｒｅｙらは、５ＫＧＡを使用したビタミンＣの生産方法を提供しており、今日工業的に行われているＲｅｉｃｈｓｔｅｉｎｄ法よりも、緩和な条件下で工業的に製造可能な方法である（特許文献１、２）。
【０００５】
ほとんどのグルコノバクター菌株は、Ｄ−グルコースから２ＫＧＡと５ＫＧＡを生産する。このように、グルコノバクター菌による５ＫＧＡは、主な副生産物として２ＫＧＡを生産し、２つのケトグルコン酸の生産は生体内で競合する。本発明者らは、Ｄ-グルコ−スの基質に対し、変換率が８０％以上である５ＫＧＡを特異的生産するグルコノバクター菌を野生株から選別する方法を報告した（特許文献３）。また、２ＫＧＡ生産がＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子に触媒されることから、グルコノバクター・オキシダンス ６２１Ｈ （グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ１２５２８と同一）のＦＡＤ−ＧＡＤＨ欠損変異株を作製し、Ｄ−グルコースからほとんど特異的に５ＫＧＡを生産させたという報告がある（非特許文献５）。しかしながら、この常温菌株を使った５ＫＧＡの生産のための最適温度は２０℃近辺である。工業的規模の培養工程では、培養温度の上昇を下げるための冷却装置が必要である。コスト削減の面からも、より高温で５ＫＧＡを生産する菌株が望まれている。本発明者らは、タイ国において、種々の材料から得られた菌株について高温耐性を有するグルコノバクター属菌を報告した（非特許文献６）。しかしながら、高い５ＫＧＡ生産株については明らにしていない。
【非特許文献１】Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ，１９９４．ｐ．２４７−３０１．Ｉｎ Ｄ．Ｗ．Ｔ．Ａ．Ｈ．Ｒｏｓｅ（ｅｄ．），Ａｄｖａｎｃｅ Ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｙｓｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３６．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ
【非特許文献２】Ｓｈｉｎａｇａｗａ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４８：１５１７−１５２２，１９８４
【非特許文献３】Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６９：１９５９−１９６６，２００３
【非特許文献４】Ｓａｌｕｓｊａｒｖｉ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６５：３０６−３１４，２００４
【非特許文献５】Ｅｌｆａｒｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６６：６６８−６７４，２００５
【非特許文献６】Ｍｏｏｎｍａｎｇｍｅｅ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６４：２３０６−２３１５，２０００
【特許文献１】米国特許公報第２４２１６２１号
【特許文献２】米国特許公報第２４２１６１２号
【特許文献３】特開２００８−２３７１９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、工業的な５ＫＧＡ生産に応用できる高温耐性菌を提供することをその主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、常温菌が生育できない３７℃の高温で生育し、５ＫＧＡを生産できる菌株をスクリーニングすることにより、新規な３種の高温耐性グルコノバクター属菌を分離した。さらに、ＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子系の破壊を行うことにより、５ＫＧＡを特異的に生産できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（５）を提供する。
【０００９】
（１）グルコノバクター属に属し、３０〜３８℃で５ＫＧＡ産生能を有する高温耐性菌、またはその変異株である５ＫＧＡ産生能を有する高温耐性菌。
【００１０】
（２）上記（１）に記載の変異株が、ＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子を破壊した変異株である高温耐性菌。
【００１１】
（３）ＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子を破壊した変異株が、配列番号７，８，９に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅して得られたＰＣＲ産物に、カナマイシンカセットを挿入したプラスミドを細胞内に導入して相同組み換えを行うことにより構築した株である上記（２）に記載の高温耐性菌。
【００１２】
（４）グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＥ４２株（受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５５）、グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＧ ４２株（受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５７）、グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＦ５５株（受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５９）、グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＥ４２ ｇｎｄＧ：：Ｋｍ株（受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５６）、グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＧ４２ ｇｎｄＧ：：Ｋｍ株（受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５８）、グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＦ５５ ｇｎｄＧ：：Ｋｍ株（受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６６０）から選ばれる１種以上の５ＫＧＡ産生能を有する高温耐性菌。
【００１３】
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載のグルコノバクター属に属する高温耐性菌を、ＰＱＱおよび／またはＣａイオン存在下、３０〜３７℃で培養して５ＫＧＡを生産させ、５ＫＧＡを採取することを特徴とする、５ＫＧＡの製造方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、有用な工業製品の原料となる５ＫＧＡを、高温条件下で培養することが可能となり、培養中の適正な温度を維持するために、常温菌では必要とされる高い冷却コストを削減することができる。また、変異株は５ＫＧＡを特異的に生産するため、精製工程が容易で工業的に有利である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の高温耐性菌は、３０〜３８℃の高温で５ＫＧＡを生産できるグルコノバクター属菌である。グルコノバクター属菌としては、例えばグルコノバクター・サブオキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）、グルコノバクター・フラテウリ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｒｉｉ）などがあげられるが、さらに、これらの野生株を形質転換した変異株であっても良い。
【００１６】
本発明の高温耐性菌は、以下のスクリーニング法で得ることができる。すなわち、初期スクリーニングとして、適切な培地、例えばポテト寒天培地に保存した高温耐性グルコノバクター属菌から１つのコロニーをグルコース−グルコン酸培地に接種し、３０℃〜３７℃で２〜３日間培養し、培地中に茶色の化合物を生産した菌株を２，５−ジケトグルコン酸（２，５ＤＫＧＡ）生産株として除外する。２，５ＤＫＧＡは，いくつかのグルコノバクター属菌に存在する膜結合ＦＡＤ−２−ケトグルコン酸脱水素酵素により触媒された２ＫＧＡ酸化産物である。２，５ＤＫＧＡを多く生産する菌株は、２ＫＧＡを多く形成し、５ＫＧＡ形成は低いと予想されるため、それらの菌株は除くことが望ましい。残りの菌について、さらに３０〜３８℃で、グルコース−グルコン酸培地で培養し、培養液の５ＫＧＡを定量することで、５ＫＧＡ生産株を選ぶ。５ＫＧＡの生産量は、例えば、還元反応により発色するレゾルシノール試薬による発色反応などで調べることができる。
【００１７】
得られた高温耐性グルコノバクター属の野生株は、日本国に寄託されている。受託番号は、グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＥ４２株が、受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５５、グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＧ ４２株が、受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５７、グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＦ５５株が、受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５９である。
【００１８】
本発明の高温で５ＫＧＡ生産能を有する高温耐性グルコノバクター属菌の変異株は、親株として上記野生株だけではなく、２，５ＤＫＧＡ生産株からも選ぶことができ、親株の２ＫＧＡを形成に関与する酵素であるＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子を破壊することによって、特異的に５ＫＧＡの生産を行うよう改変されたものである。ＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子が破壊された欠損株は、野生株の染色体上のＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子、またはその一部のＤＮＡ配列を欠失、あるいは該遺伝子の内部に薬剤耐性遺伝子を挿入するなどして正常に機能する酵素を産生しないように修飾した遺伝子を含むＤＮＡで菌を形質転換し、染色体上の正常な遺伝子との間で相同組換えを起こさせることにより、染色体上の該遺伝子を破壊することによって作製する。このような相同組換えの遺伝子置換による遺伝子破壊は、直鎖状ＤＮＡやプラスミドを用いる方法として既に確立している。本発明の高温耐性グルコノバクター属菌のＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子破壊株の作製は、以下の操作方法、手順で行なうことができる。
【００１９】
１）高温耐性グルコノバクター属菌からＤＮＡの抽出を行う。高温耐性グルコノバクター属菌のからのゲノムＤＮＡ抽出法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ，１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）により行うことができる。
【００２０】
２）ターゲットとなるＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子のクローニングをする。ＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子のクローニングは、常温性グルコノバクター属菌や、エルビニア菌のＧＡＤＨの遺伝子の中の脱水素酵素サブユニットに維持されている領域からデザインしたプライマーを用いたＰＣＲ法や、ＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子を用いたハイブリダイゼーションにより行うことができるが、最も効率的な方法としては、グルコノバクター・オキシダンス ６２１Ｈのゲノムで報告されている、ＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子の配列を基にデザインしたプライマーを用い、１）で得られたゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子の全長を含む遺伝子をＰＣＲにより増幅・取得することができる。クローニングした遺伝子の全配列は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用して、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）やＣｌｏｎｅ Ｍａｎａｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｃａｒｙ，ＮＣ）などのソフトウエアで解析し、配列データを得ることができる。また、ホモロジー検索や整列解析（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）は、それぞれＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）やＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ）を使用して得ることができる。
【００２１】
本発明のＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子をクローニングして得られるＤＮＡ断片としては、ｇｎｄＦ（配列番号７）、ｇｎｄＧ（配列番号８）、ｇｎｄＨ（配列番号９）などがあげられる。これらのＤＮＡ断片は増幅して、ＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子破壊用プラスミドに使用することができる。
【００２２】
３）クローニングした遺伝子の配列情報を基に、ＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子破壊用プラスミドを作製する。ＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子の破壊用プラスミドの作製は、高温耐性グルコノバクター属菌内で複製不可能なｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ等の大腸菌ベクターに、ＰＣＲで増幅したＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子を組み込み、得られたＤＮＡの制限酵素サイトに、カナマイシン等の薬剤耐性物質等からなるカセットを挿入して作製することができる。
【００２３】
４）ついで、プラスミド導入によるＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子破壊株の作製を行う。ＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子破壊株の作製は、上記遺伝子破壊用プラスミドを、高温耐性グルコノバクター属菌への電気パルス法（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４：４４３−４４７，１９９０、Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１４４：１８１−１８５，１９９３）や、プラスミドを接合法（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）などの高効率遺伝子導入法により細胞内に導入し、染色体への相同性組換えにより、ＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子を破壊（または不活性化）することにより行うことができる。ＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子の破壊の確認は、薬剤耐性遺伝子断片が染色体に挿入されている菌株を、適切な濃度の当該薬剤を含むプレート培地上に塗布することにより形質転換された高温耐性グルコノバクター属菌を選抜し、選抜した菌株で２ＫＧＡ生産のための酵素活性が消失していることを確かめることにより行うことができる。
【００２４】
上記の如くして作製された、本発明の形質転換した高温耐性グルコノバクター属菌は、適切な培地、例えばポテト寒天培地（２０gグリセロール、５gグルコース、１０g酵母エキス、１０gポリペプトン、２ｇ寒天、１００ｍｌのポテトエキスを蒸留水で１Ｌとする）で、０〜５℃の低温で保存しておくことができる。長期間の保存は５０％グリセロールを含むポテト培地を用い、−８０℃で行うことが出来る。
【００２５】
本発明の形質転換した高温耐性グルコノバクター属菌の変異株としては次の菌があげられる。グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＥ４２株（受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５５）の変異株が、グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＥ４２ ｇｎｄＧ：：Ｋｍ株で、受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５６として日本国に寄託されている。また、グルコノバクター・フラテウリＴＨＧ ４２株（受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５７）の変異株は、グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＧ４２ ｇｎｄＧ：：Ｋｍ株で、受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５８として同様に寄託されており、さらに、グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＦ５５株（受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５９）の変異株は、グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＦ５５ ｇｎｄＧ：：Ｋｍで、受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６６０として同様に寄託されている。
【００２６】
本発明の５ＫＧＡの生産においては、本発明の高温耐性グルコノバクター属菌の野生株または変異株を、好気条件下で増殖培養し、培地中に５ＫＧＡを生成蓄積させることができる。
【００２７】
本発明の高温耐性グルコノバクター属菌の培養は、炭素源、窒素源および無機塩等を含む通常の栄養培地を用いて行うことが出来る。炭素源として、例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトースやマンノースなどの単糖類、ラクトース、シュークロース、マルトースなどの二糖類、グルコン酸ナトリウムやグルコン酸ポタジウムなどのグルコン酸塩、グリセリン、マルチトール、ラクリトール、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、アラビトールなどの糖アルコール類が用いられ、このうち、グルコースまたはグルコン酸が好ましく、グルコースが最も好ましい。
【００２８】
窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムまたは尿素等をそれぞれ単独もしくは混合して用いることが出来る。また、無機塩として、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸ニ水素カリウムまたは硫酸マグネシウム等を使用することが出来る。この他にも必要に応じて、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、ポテトエキス、コーンスティープリカー等の各種栄養素を培地に適宜添加することもできる。
【００２９】
また、本発明においては、５ＫＧＡの生産に関わる酵素のために培地にコファクターを添加することができる。本発明の５ＫＧＡの生産に関わるＰＱＱ−ＧＬＤＨは、高温耐性グルコノバクター属菌を高温で生育するとき、酵素の構造的な変化を起こすことが明らかになっている。そのため、培地にコファクターを補充することにより酵素の活性を高い状態で維持することができる。コファクターとしては、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、アンモニウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオンがあげられ、これらのイオンは、塩化マグネシウム、炭酸マグネシウム、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなどの化合物で培地中に添加することができる。好ましい化合物としては、塩化マグネシウム、炭酸マグネシウム、塩化カルシウム、炭酸カルシウムであり、最も好ましいのは、塩化カルシウムである。これらの化合物の培地への添加量は、１〜５０ｍＭ、好ましくは５ｍＭである。
【００３０】
さらに、本発明における５ＫＧＡの生産に関わる酵素活性のため、培地に添加するコファクターとして、補酵素のピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）があげられる。酵素活性を維持するために、補酵素の培地への補充を行い、５ＫＧＡの生産を高めることができる。ＰＱＱの添加量は、０．１〜１００μＭ、好ましくは１〜１０μＭを培地中に添加する。
【００３１】
培養は、通常、通気撹拌または振盪等の好気的条件下、２８℃〜３８℃、好ましくは３０〜３７℃の温度で行うことができる。培養時のｐＨは約５〜７の範囲がよく、培養中のｐＨ調整は酸またはアルカリを添加することにより行うことが出来る。培養期間は、１〜７日間、好ましくは２〜５日間行うことにより５ＫＧＡが得られる。５ＫＧＡの生産は、最初の成長段階で見られるが、最も高い生産量は、成長安定期に見られる。
【００３２】
本発明の高温耐性グルコノバクター属菌の培養菌体および培地からの５ＫＧＡの回収は、一般的な発酵生産法に準じて行うことができ、例えば遠心分離、膜分離、カラムクロマトグラフィー等の公知の方法を用いることができる。
【００３３】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げるが本発明はこれに限定されない。
【実施例１】
【００３４】
＜グルコノバクター菌の高温耐性５ＫＧＡ生産株のスクリーニング＞
【００３５】
１．野生株のスクリーニング
スクリーニング実験に使用する全てのグルコノバクター菌は、タイ国の種々の材料からＭｏｏｎｍａｎｇｍｅｅ，Ｄ．らの方法（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６４：２３０６−２３１５，２０００）で分離し、ポテト寒天培地（２０gグリセロール、５gグルコース、１０g酵母エキス、１０gポリペプトン、２ｇ寒天、１００ｍｌのポテトエキスを蒸留水で１Ｌとする）に保存した。初期スクリーニングのために、分離菌全てから１つのコロニーを２％グルコース−グルコン酸培地（２０gグルコース、２０gグルコン酸ナトリウム、３gポリペプトン、３g酵母エキスを蒸留水で１Ｌとする）に接種し、３０℃で４８時間、または３７℃で６０時間培養し、培地中に茶色の化合物を生産した菌株を２，５−ジケトグルコン酸生産株として除外した。その後、２００μｌの培地と、１ｍｌのＲｅｓｏｒｃｉｎｏｌ試薬（０．５％Ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ４９ｍｌ、濃塩酸１６８ｍｌ、蒸留水２７３ｍｌ）とを、８０℃で２０分間反応させた。Ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ試薬とＤ−グルコースの反応生成物は赤い化合物で、５ＫＧＡの場合は黒い茶系緑色の沈殿が生じた。一方、Ｄ−グルコン酸と２ＫＧＡは確認反応生産物には見出されなかった。高温耐性の５ＫＧＡ生産株として最も優れた菌株を得るために、初期スクリーニングで分離した２４株の菌(表１)をポテト培地（２０gグリセロール、５gグルコース、１０g酵母エキス、１０gポリペプトン、１００ｍｌのポテトエキスを蒸留水で１Ｌとする）で１日予備培養し、その後、培養液１０μｌを２％グルコース−グルコン酸培地の１ｍｌに接種し、３０℃で３６時間、または３７℃で４８時間培養した。培養液は、Ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ試薬で反応させた。さらに、生育と５ＫＧＡ蓄積は、反応で生じた反応生産物の吸光度を測定することにより比較した。
【００３６】
２．２ＫＧＡと５ＫＧＡの決定
２ＫＧＡと５ＫＧＡは、それぞれ２ＫＧＡ還元酵素と５ＫＧＡ還元酵素により、Ｓａｉｃｈａｎａ．Ｉらの方法（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７１：２４７８−２４８６，２００７）に準じて酵素的に定量した。２ＫＧＡと５ＫＧＡの定性分析は、薄層クロマトグラフィー分析で行った。サンプルはシリカゲル６０プレート（メルク製）にスポットし、酢酸エチル：酢酸：メタノール：無イオン水（６：１．５：１．５：１）を含む溶媒で展開した。プレートを乾燥し、発色試薬（２ｇのジフェニルアミン、２ｍｌのアニリン、１００ｍｌのアセトン、１５ｍｌのリン酸の使用前調整液）をスプレーし、発色するまで１２０℃で１０〜２０分間加熱した。５ＫＧＡと２ＫＧＡは、それぞれ濃紫色と、赤褐色のスポットとして現れた。
【００３７】
３．スクリーニング結果
２４分離株の中の３株、ＴＨＥ４２，ＴＨＦ５５，ＴＨＧ４２について、３０℃、３７℃の両方で５ＫＧＡの高い生産が見られた（表１）。
【００３８】
【表１】
【００３９】
選ばれた３つの高温耐性菌による５ＫＧＡの形成は、図２のＴＬＣにより確認し、３つの菌株の生育と生産の特徴については、３０℃と３７℃における２ＫＧＡと５ＫＧＡ生産を、常温菌の５ＫＧＡ生産グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ１２５２８菌と、比較して検討した。結果を表２に示した。３つの高温耐性菌は、生育も、主生産物として２ＫＧＡを生産することも同じであった。３０℃、４８時間の培養で、常温菌は高温耐性菌に比べ、低い生育、低い２ＫＧＡ生産、高い５ＫＧＡ生産を示した。３７℃では、３０℃よりも全ての菌の生育が遅いことから、２ＫＧＡと５ＫＧＡの生産物を高めるために培養時間を７２時間とした。常温菌は、３７℃でほとんど成長せず、低い２ＫＧＡと５ＫＧＡの生産を示した。この温度で３つの高温耐性菌は、３０℃と比較して、生育、および２ＫＧＡと５ＫＧＡの生産は低いものの、常温菌では不可能であった３７℃での成長と５ＫＧＡ生産の可能性を示した。
【００４０】
【表２】
【実施例２】
【００４１】
＜高温耐性グルコノバクター菌の変異株の作製＞
高温耐性グルコノバクター菌について、特異的に５ＫＧＡを生産する菌を作製した。２ＫＧＡはＦＡＤ−グルコン酸脱水素酵素（ＦＡＤ−ＧＡＤＨ）により生成される。５ＫＧＡと競合して、主生産物に２ＫＧＡを生産する分離した高温耐性グルコノバクター菌において、ＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子を破壊することにより、２ＫＧＡ生産を排除した。以下のクローニングに使用するプライマーは、表３に示した。
【００４２】
【表３】
【００４３】
１．高温耐性グルコノバクター菌からＦＡＤ−グルコン酸脱水素酵素遺伝子のクローニング
ＦＡＤ−ＧＡＤＨ構造遺伝子は、グルコノバクター・オキシダンス ６２１Ｈのゲノム配列中で報告されている（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１９５−２００，２００５）。３つのサブユニット（脱水素酵素サブユニット、チトクロムサブユニット、小サブユニット）から構成されている。このＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子の配列を基にデザインしたｇｎｄＬ−Ｆプライマー（配列番号１）とｇｎｄＬ−Ｒのプライマー（配列番号２）をＰＣＲ用プライマーとした。この配列は、エルビニア・シプリペディ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７９：６５６６−６５７２，１９９７）、グルコノバクター・ジオキシアセトニカスＩＦＯ３２７１（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ７３：６５５１−６５５６，２００７）、グルコノバクター・オキシダンス ６２１Ｈ（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１９５−２００，２００５）のＧＡＤＨ遺伝子の中の脱水素酵素サブユニットに保存されている領域から設計した。このプライマーペアを、各高温耐性菌のゲノムＤＮＡを鋳型として使用し、ＰｕＲｅＴａｑ Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ ＰＣＲ Ｂｅａｄｓ ｋｉｔ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ｍＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用い、ＰＣＲの温度サイクルは、以下のように行った。９５℃で３０秒を１サイクル、その後、９５℃で３０秒、５５℃で１分、６８℃で１分を２５サイクル行い、すべてのサイクルが終了すると最後は３７℃に保った。ＤＮＡ断片は、アガロースゲルで分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ， Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）や ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｅｒ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で精製した。この結果、ＰＣＲの５２５ｂｐ生産物が得られた。この配列は、グルコノバクター・オキシダンス ６２１ＨのＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子の脱水素酵素サブユニットであるＧＯＸ１２３１と相同性が見られた。
【００４４】
遺伝子の全配列を得るために、上記ＰＣＲ生産物をシークエンスして得られた配列からデザインした特異的なプライマーペアである、Ｆ−ｉｇＬ−１（配列番号３）とＦ−ｉｇＬ−２（配列番号４）を用い、ゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化物の再環状化したものを鋳型として、ＴａＫａＲａ ＬＡ ＴａｑＴＭ（タカラバイオ社製）に２ｍＭ ＭｇＣｌ２と０．５％ ＤＭＳＯを添加してＰＣＲを行った。９５℃で３０秒を１サイクル、その後、９５℃で３０秒、５５℃で１分、６８℃で６分を２５サイクル行い、すべてのサイクルが終了すると最後は３７℃に保った。脱水素酵素と小サブユニットの遺伝子の全配列は、ゲノムＤＮＡのＳａｃＩＩまたはＥｃｏＲＩ消化物を再環状化したものを鋳型として、プライマーのＦ−ｉｇＬ−１（配列番号３）とＲ−ｉｇＬ−２（配列番号４）で増幅した。チトクロームＣサブユニットの遺伝子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏクローニング法から得られた。
【００４５】
各菌株から得られたＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子由来と予測される３つのＯＲＦ（ｇｎｄＦ、ｇｎｄＧ、ｇｎｄＨ）と、機能不明のタンパク質をコードする３ＯＲＦを含む６ｋｂ以上の断片をシークエンスし、配列を同定した。配列は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用して行った。配列データは、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ （Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社製）やＣｌｏｎｅ Ｍａｎａｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）を使用して解析した。ホモロジー検索や整列解析（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）は、それぞれＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）とＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ）を使用して行った。１例としてＴＨＦ５５菌株から得られた断片地図を図３に示した。ＯＲＦ−１、ＯＲＦ−２、ＯＲＦ−３は、グルコノバクター・オキシダンス ６２１Ｈのゲノムで示されているＧＯＸ１２３４、ＧＯＸ１２３３、ＧＯＸ１２２９でコード化されている機能不明タンパク質に相同性を示した。ｇｎｄＦ、ｇｎｄＧ、ｇｎｄＨの３つのＯＲＦは、ゲノムでＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子と確認されたＧＯＸ１２３２、ＧＯＸ１２３１，ＧＯＸ１２３０に７６％、８９％、６８％の同一性があった。この研究で得られた配列は、ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）に登録申請中である。
【００４６】
決定したＧｎｄＦのアミノ酸配列は、Ｎ末端に、Ｂｅｒｋｓ，Ｂ．Ｃ．らが報告した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３５：２６０−２７４，２０００）、２つのアルギニン残基を含むｔａｔ依存の特殊なシグナル配列が存在することがわかった。ＧｎｄＦはまた、ＦＡＤ−ＧＡＤＨの小サブユニットとして、Ｔｏｙａｍａ．Ｈらの報告（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ７３：６５５１−６５５６，２００７）で明らかにされたグルコノバクター・ジオキシアセトニカス ＩＦＯ３２７１のＧｎｄＳへ４４％の同一性を示した。
【００４７】
決定したＧｎｄＧのアミノ酸配列は、いくつかのＦＡＤ含有酵素に同様の配列がみられるように、Ｎ末端にＦＡＤが結合するためのシグナルであるグリシンボックス（ＧｘＧｘｘＧ）を示した。ＧｎｄＧは、コファクターとしてのＦＡＤと結合する蛋白ファミリーであるグルコース−メタノール−コリン（ＧＭＣ）酸化還元酵素ファミリーの中に維持された領域配列を持っていた。また、前記Ｔｏｙａｍａ．Ｈらが見出したグルコノバクター・ジオキシアセトニカス ＩＦＯ３２７１のＦＡＤ−ＧＡＤＨの脱水素酵素サブユニッのＧｎｄＬと６１％の同一性を示した。
【００４８】
ＧｎｄＨは、アルコール脱水素酵素、ソルビトール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素のように、グルコノバクター菌で見出される膜結合の多くのチトクロームｃサブユニットと類似し、３つのヘムｃ結合モチーフ（ＣｘｘＣＨ）配列を示した。さらに、グルコノバクター・ジオキシアセトニカス ＩＦＯ３２７１（２０）のＧｎｄＣに４４％の同一性を示した。
【００４９】
２．高温耐性グルコノバクター属菌のFAD-ＧＡＤＨ依存変異株の構築
テンプレートとするゲノムＤＮＡは、Ｍａｒｍｕｒの方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３：２０８−２１８，１９６１）に準じて、対数増殖期におけるグルコノバクター菌から分離した。ｇｎｄＧの破壊のためのプラスミドは、大腸菌 ＤＨ５α株から、ＱＩＡ Ｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用して調製した。Ｆ−ｇｎＤＨ−３プライマー（配列番号５）とＲ−ｇｎＤＨ−２プライマー（配列番号６）を使用し、テンプレートのゲノムDNAを増幅して得られた１．９ｋｂのＰＣＲ断片のＳｍａＩサイトに、ｐＴＫｍからＫｍｒカセットを含むＥｃｏＲＶ断片を挿入することにより構築した（ｐＧＥＭ−ＣＡ−Ｆ：：Ｋｍ）。制限酵素切断パターンの分析により、ＫｍｒカセットはｇｎｄＧと同じ転写方向に挿入したことを確認した。作製したプラスミドをエレクトロポレーションで、グルコノバクター菌へ導入し、導入した細胞は、遺伝子組み換えのために３０℃で６時間、ポテト培地で培養した。２〜３日後、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＳＧ寒天培地（１％ソルビトール、１％グリセロール、０．３％ポリペプトン、０．３％酵母エキス、２％寒天）上に得られたコロニーをピックアップしてカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含む１ｍｌのＳＧ培地（１％ソルビトール、１％グリセロール、０．３％ポリペプトン、０．３％酵母エキス）へ接種した。その後、変異株は、カナマイシン５０μg／ｍｌと、アンピシリン５０μg／ｍｌ添加または無添加の２つの新しい寒天培地に接種し、カナマイシン耐性コロニーでアンピシリンに耐性を示さないものを選抜した。Ｋｍｒカセットの挿入領域をカバーして増幅するプライマーを用いたＰＣＲで遺伝子破壊を確かめた（図４）。その結果、ＴＨＥ４２，ＴＨＦ５５，ＴＨＧ４２株からのｇｎｄＧ：Ｋｍ変異株が得られ、３つの変異株全ては、ＴＬＣ分析から２ＫＧＡ生産性がないことを確認した（図５）。
【００５０】
３．酵素活性による変異株の確認
野生株と変異株のＤ−アラビトールやグルコースに対する膜結合酵素活性は、３０℃と３７℃で生育させた細胞から膜分画により調製し、Ｔｏｙａｍａ．Ｈらの方法（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６９：１１２０−１１２９，２００５）で行った。膜結合酵素活性は、フェリシアナイドとＰＭＳを用いた還元活性により測定し、フェリシアナイド還元酵素活性、あるいはＰＭＳ−ＤＣＩＰ還元酵素活性として表した（図６ａ，ｂ）。
【００５１】
フェリシアナイド還元酵素活性は、カリウムフェリシアナイドを電子受容体として測定した。２５℃で、０．１Ｍの基質、ＭｃＩｌｖａｉｎｅ ｂｕｆｆｅｒ（ＭｃＢ，ｐＨ ５．０）、および適当な量の酵素液を含む０．９ｍｌの反応液を、５分間インキュベート後、０．１Ｍのカリウムフェリシアナイドの０．１ｍｌを添加し、撹拌した。一定時間のインキュベート後、０．５ｍｌ Ｄｕｐａｎｏｌ試薬（０．３％ Ｆｅ２（ＳＯ４）３、８．１％リン酸、０．３％ＳＤＳ）を添加して反応を止めた。色が安定するため２０分間放置した後、混合液の総量が５ｍｌになるよう３．５ｍｌの蒸留水で希釈し、分光光度計Ｕ２０００（日立製作所社製）で、６６０ｎｍの吸光度を測定した。酵素活性の１ユニットは、１分間に１μモルの基質を酸化した酵素の量とした。
【００５２】
膜画分のフェナジンメソスルフェイト（ＰＭＳ）還元活性は、２５℃で、１ｍｌの反応液中、１００ｍＭの基質、０．２ｍＭのＰＭＳ、１．２ｍＭのＮａＮ３、適量の酵素、ＭｃＢ（ｐＨ５．０）を、０．１１ｍＭの２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）とカップリング反応させ、６００ｎｍの青色の退色を分光光度計Ｕ２０００（日立製作所社製）で測定した。酵素活性の１ユニットは、このアッセイ系で１分間に１μモルの基質を酸化した酵素の量とした。
【００５３】
図６ａに示すように、３０℃で生育した野生株と変異株のＤ−アラビトール脱水素酵素活性は、同じであったが、Ｄ−グルコン酸脱水素酵素活性は変異株で野生株の３０％以上減少した。活性の減少は、ＦＡＤ−ＧＡＤＨの脱水素酵素サブユニットをコードするｇｎｄＧ遺伝子の不活性化によるのであり、Ｄ−グルコン酸に反応するＰＱＱ−ＧＬＤＨ活性はそのまま維持した。図６ｂでは、野生株と変異株において、３７℃で生育した細胞からの膜結合酵素活性が、３０℃での活性より低く、変異株のＤ−アラビトール脱水素酵素活性は野生株と同じであったが、変異株におけるＤ−グルコン酸脱水素酵素活性が、３０℃の場合と同じように減少したことを示した。また、３７℃では、ＰＱＱの添加により、野生株と変異株両方で、活性が２倍以上増加した。このことは、菌が高温で生育するときに、ＰＱＱ−ＧＬＤＨに必要なＰＱＱが不足していることを示している。
【実施例３】
【００５４】
＜ＦＡＤ−ＧＡＤＨ欠損変異株による５ＫＧＡの生産＞
野生株と変異株は、２％グルコース−２％グルコン酸培地で３０℃と３７℃で培養し、２ＫＧＡと５ＫＧＡの生産量を培養時間に沿って測定した（図７ａ，ｂ）。３７℃における野生株の生育は３０℃よりわずかに低く、３０℃と３７℃両方で主生産物として２ＫＧＡを生産しており、生産量も５ＫＧＡの２倍以上であった。２つの生産物の生産は、最初の生育段階から見られたが、最も高い生産量は、生育定常期に見られた。３０℃では、２ＫＧＡと５ＫＧＡの減少が培養６０時間以降に見られたが、これは３７℃の培養では見られなかった。ｇｎｄＧ：：Ｋｍ変異株による５ＫＧＡの生産を、野生株と比較した場合、３０℃で、３つの変異株全てで、５ＫＧＡ生産が主で２ＫＧＡ生産はわずかとなった。２ＫＧＡと５ＫＧＡの最も高い生産量は、野生株と同様に６０時間後に見られた。３７℃においても、変異株はやはり５ＫＧＡを主に生産し、２ＫＧＡの生産はわずかであったが、生産量は３０℃での生産量の半分であった。最終的な変換の収量は、３７℃、９６時間培養で原料の５０％であった。
【実施例４】
【００５５】
＜高温での５ＫＧＡ生産の改良＞
３７℃での野生株と変異株のＰＱＱ−ＧＬＤＨ活性はコファクター（ＰＱＱおよび／またはＣａ２＋）の添加に依存した（図８ａ）。種々の濃度のＣａＣｌ２をグルコノバクター属 ＴＨＦ５５（ｇｎｄＧ：：Ｋｍ）の培地に添加して、３７℃で培養した結果、培養３日後に５ＫＧＡの蓄積を確認した。ＣａＣｌ２添加による生育への効果は認められないが、５ｍＭのＣａＣｌ２添加で、５ＫＧＡの生産に高い効果を起こした。これは原料の９０％が５ＫＧＡに変換される収率であった。５ｍＭより高い濃度のＣａＣｌ２添加では、５ＫＧＡ生産は減少し、生育もわずかに阻害された。この結果より、３７℃の培養において、５ＫＧＡ生産を増加させる適正なＣａＣｌ２の添加濃度は５ｍＭであった（図８ｂ）。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の菌株を用いた５ＫＧＡの発酵生産法は、高温条件下で培養することにより、培地を冷却する必要がなくなり、コストを大幅に削減することができる。また、本発明のグルコノバクター属菌の変異株は、５ＫＧＡを特異的に生産するため精製工程が容易になることから、本発明の新規な菌株は、工業的に利用される可能性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】グルコースから５ＫＧＡおよび２ＫＧＡを生成する酵素反応を示す図面である。
【図２】分離された高温耐性グルコノバクター属菌による培地中の２ＫＧＡと５ＫＧＡの生産を示す図面に代わる写真である。（１：Ｄ−グルコース、２：ＮａＧＡ、３：２ＫＧＡ、４：５ＫＧＡ、５：培地、６：ＴＨＥ４２、７：ＴＨＦ５５、８：ＴＨＧ４２、９：ＴＨＥ４２、１０：ＴＨＦ５５、１１：ＴＨＧ４２、ただし、６−８は３０℃で、９−１１は３７℃で培養した。）
【図３】高温耐性グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＦ５５株から得られたゲノム断片の模式図である。
【図４】高温耐性グルコノバクター属菌のカナマイシン耐性カセットでの変異をＰＣＲで確認したことを示す図面に代わる写真である。（Ｍ：マーカーであるλＤＮＡ、１：ＴＨＥ４２、２：ＴＨＥ４２ ｇｎｄＧ：：Ｋｍ、３：ＴＨＦ５５、４：ＴＨＦ５５ ｇｎｄＧ：：Ｋｍ、５：ＴＨＧ４２、６：ＴＨＧ４２ ｇｎｄＧ：：Ｋｍ）
【図５】高温耐性グルコノバクター属菌のＦＡＤ欠損株による２ＫＧＡと５ＫＧＡの生産を示す図面に代わる写真である。（１：Ｄ−グルコース、２：ＮａＧＡ、３：２ＫＧＡ、４：５ＫＧＡ、５：培地、６：ＴＨＥ４２ ｇｎｄＧ：：Ｋｍ、７：ＴＨＦ５５ ｇｎｄＧ：：Ｋｍ、８：ＴＨＧ４２ ｇｎｄＧ：：Ｋｍ、９：ＴＨＥ４２ ｇｎｄＧ：：Ｋｍ、１０：ＴＨＦ５５ ｇｎｄＧ：：Ｋｍ、１１：ＴＨＧ４２ ｇｎｄＧ：：Ｋｍ、ただし、６−８は３０℃で、９−１１は３７℃で培養した。）
【図６】高温耐性グルコノバクター属菌のＤ−アラビトールとＤ−グルコースに対する膜結合酵素の活性を示す図面である。（ａ：３０℃で培養、ｂ：３７℃で培養、グレイのカラム：コファクター無添加で培養したＤ−アラビトールの活性、黒のカラム：１５μＭＰＱＱと１０ｍＭＣａＣｌ２添加で培養したＤ−アラビトールの活性、白のカラム：コファクター無添加で培養したＤ−グルコースの活性、斜線のカラム：１５μＭＰＱＱと１０ｍＭＣａＣｌ２添加で培養したＤ−グルコースの活性）
【図７】高温耐性グルコノバクター属菌のケトグルコン酸生産を示す図面である。（ａ：３０℃で培養、ｂ：３７℃で培養、グレイのカラム：２ＫＧＡ濃度、黒のカラム：５ＫＧＡ濃度）
【図８】高温耐性グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＦ５５株の３７℃での培養において、菌の生育と５ＫＧＡ生産へのＣａＣｌ２の添加効果を示す図面である。（ａ：生育曲線（黒の四角：０ｍＭ、黒のダイヤモンド型２．５ｍＭ、白の三角：５ｍＭ、４方クロス：７．５ｍＭ、６方クロス：１０ｍＭ）、ｂ：５ＫＧＡ生産量）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高温で５−ケトグルコン酸（５ＫＧＡ）産生能を有する高温耐性菌、および該高温耐性菌を用いた５ＫＧＡの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルコノバクターは、糖、糖アルコール、糖酸などの広い範囲の化合物を酸化することができ、酸化された産物を高い収率で培地中に蓄積できる酢酸菌の種類である。これらの酸化反応に関与する酵素は、Ｄ−グルコース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、グリセロール、グルコン酸やケトグルコン酸の脱水素酵素である。それら全ての酵素は、細胞質膜表層に固く結合しており、基質から引き抜かれた電子は、ユビキノンを介して末端のユビキノン酸化酵素へ伝達され、その電子伝達反応に伴って生物エネルギーを生成する。
【０００３】
Ｄ−グルコースのケト−Ｄ−グルコン酸への酸化は、細胞膜外に存在する酵素により触媒されることが知られている。Ｄ−グルコースは、膜結合ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）−グルコース脱水素酵素により、グルコノ−δ−ラクトンへ酸化され、グルコノ−δ−ラクトンは、グルコノラクトナーゼにより、Ｄ−グルコン酸へ変換される。グルコノバクター菌で見られたケトグルコン酸の形成は、膜結合グルコン酸脱水素酵素の２つのタイプにより触媒されることをＭａｔｓｕｓｈｉｔａらは報告している（非特許文献１）。１つは、ＦＡＤ含有２−ケトグルコン酸生産酵素、すなわちＦＡＤ−グルコン酸脱水素酵素（ＦＡＤ−ＧＡＤＨ：Ｇｌｕｃｏｎａｔｅ ２−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｆｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎ）、もう１つは、ＰＱＱ含有５ケト−Ｄ−ケトグルコン酸生産酵素、すなわちＰＱＱ−グリセロ−ル脱水素酵素（ＰＱＱ−ＧＬＤＨ：Ｐｙｒｒｏｌｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ ｑｕｉｎｏｎｅ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）である（図１）。また、ＦＡＤ−ＧＡＤＨが、３つのサブユニットを持つことは、Ｓｈｉｎａｇａｗａらにより報告されており（非特許文献２）、３つのサブユニットとは、ＦＡＤ含有脱水素酵素サブユニット、ｔｈｒｅｅ−ｈｅｍｅ含有チトクロームＣサブユニット、そして未公知の小さなサブユニットである。５ＫＧＡ生産を触媒する後者の酵素は、ＰＱＱ含有ポリオール脱水素酵素と同一であることが、Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａらにより明らかにされており（非特許文献３）、ＰＱＱ−ＧＬＤＨは、Ｄ−アラビトール脱水素酵素、Ｄ−ソルビトール脱水素酵素、あるいはグリセロール脱水素酵素など、種々の糖アルコールの酸化酵素として知られている。ＰＱＱ−ＧＬＤＨは、多方面の基質と反応できるが、いわゆる「Ｂｅｒｔｒａｎｄ−Ｈｕｄｓｏｎ法」に従って反応が触媒される高い立体特異性をもつ。この酵素は、５ＫＧＡをＤ−グルコン酸から生産するために、Ｄ−グルコン酸のＣ５位置だけを酸化することができるが、Ｄ−グルコン酸との酵素親和性は低い。この酵素の遺伝子は、グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ３２５５からクローニングされ、２つのオープンリーディングフレームが見出された。１つは、５−膜貫通領域の疎水性領域蛋白をコードすると推定され、もう１つは、いくつかのＰＱＱ依存酵素に類似した脱水素酵素サブユニットをコードしていて、特に膜結合グルコース脱水素酵素のＰＱＱドメインに類似している。一方、細胞質に位置する２ＫＧＡ還元酵素や５ＫＧＡ還元酵素は、輸送蛋白により、細胞質に輸送された後で、２ＫＧＡや５ＫＧＡをそれぞれＤ−グルコン酸へ変換し、資化するために機能している。
【０００４】
５ＫＧＡは酒石酸、キシル酸、ビタミンＣや重要な香料化合物などの原料となる有用な物質である（非特許文献４）。Ｇｒｅｙらは、５ＫＧＡを使用したビタミンＣの生産方法を提供しており、今日工業的に行われているＲｅｉｃｈｓｔｅｉｎｄ法よりも、緩和な条件下で工業的に製造可能な方法である（特許文献１、２）。
【０００５】
ほとんどのグルコノバクター菌株は、Ｄ−グルコースから２ＫＧＡと５ＫＧＡを生産する。このように、グルコノバクター菌による５ＫＧＡは、主な副生産物として２ＫＧＡを生産し、２つのケトグルコン酸の生産は生体内で競合する。本発明者らは、Ｄ-グルコ−スの基質に対し、変換率が８０％以上である５ＫＧＡを特異的生産するグルコノバクター菌を野生株から選別する方法を報告した（特許文献３）。また、２ＫＧＡ生産がＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子に触媒されることから、グルコノバクター・オキシダンス ６２１Ｈ （グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ１２５２８と同一）のＦＡＤ−ＧＡＤＨ欠損変異株を作製し、Ｄ−グルコースからほとんど特異的に５ＫＧＡを生産させたという報告がある（非特許文献５）。しかしながら、この常温菌株を使った５ＫＧＡの生産のための最適温度は２０℃近辺である。工業的規模の培養工程では、培養温度の上昇を下げるための冷却装置が必要である。コスト削減の面からも、より高温で５ＫＧＡを生産する菌株が望まれている。本発明者らは、タイ国において、種々の材料から得られた菌株について高温耐性を有するグルコノバクター属菌を報告した（非特許文献６）。しかしながら、高い５ＫＧＡ生産株については明らにしていない。
【非特許文献１】Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ，１９９４．ｐ．２４７−３０１．Ｉｎ Ｄ．Ｗ．Ｔ．Ａ．Ｈ．Ｒｏｓｅ（ｅｄ．），Ａｄｖａｎｃｅ Ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｙｓｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３６．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ
【非特許文献２】Ｓｈｉｎａｇａｗａ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４８：１５１７−１５２２，１９８４
【非特許文献３】Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６９：１９５９−１９６６，２００３
【非特許文献４】Ｓａｌｕｓｊａｒｖｉ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６５：３０６−３１４，２００４
【非特許文献５】Ｅｌｆａｒｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６６：６６８−６７４，２００５
【非特許文献６】Ｍｏｏｎｍａｎｇｍｅｅ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６４：２３０６−２３１５，２０００
【特許文献１】米国特許公報第２４２１６２１号
【特許文献２】米国特許公報第２４２１６１２号
【特許文献３】特開２００８−２３７１９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、工業的な５ＫＧＡ生産に応用できる高温耐性菌を提供することをその主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、常温菌が生育できない３７℃の高温で生育し、５ＫＧＡを生産できる菌株をスクリーニングすることにより、新規な３種の高温耐性グルコノバクター属菌を分離した。さらに、ＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子系の破壊を行うことにより、５ＫＧＡを特異的に生産できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（５）を提供する。
【０００９】
（１）グルコノバクター属に属し、３０〜３８℃で５ＫＧＡ産生能を有する高温耐性菌、またはその変異株である５ＫＧＡ産生能を有する高温耐性菌。
【００１０】
（２）上記（１）に記載の変異株が、ＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子を破壊した変異株である高温耐性菌。
【００１１】
（３）ＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子を破壊した変異株が、配列番号７，８，９に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅して得られたＰＣＲ産物に、カナマイシンカセットを挿入したプラスミドを細胞内に導入して相同組み換えを行うことにより構築した株である上記（２）に記載の高温耐性菌。
【００１２】
（４）グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＥ４２株（受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５５）、グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＧ ４２株（受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５７）、グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＦ５５株（受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５９）、グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＥ４２ ｇｎｄＧ：：Ｋｍ株（受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５６）、グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＧ４２ ｇｎｄＧ：：Ｋｍ株（受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５８）、グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＦ５５ ｇｎｄＧ：：Ｋｍ株（受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６６０）から選ばれる１種以上の５ＫＧＡ産生能を有する高温耐性菌。
【００１３】
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載のグルコノバクター属に属する高温耐性菌を、ＰＱＱおよび／またはＣａイオン存在下、３０〜３７℃で培養して５ＫＧＡを生産させ、５ＫＧＡを採取することを特徴とする、５ＫＧＡの製造方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、有用な工業製品の原料となる５ＫＧＡを、高温条件下で培養することが可能となり、培養中の適正な温度を維持するために、常温菌では必要とされる高い冷却コストを削減することができる。また、変異株は５ＫＧＡを特異的に生産するため、精製工程が容易で工業的に有利である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の高温耐性菌は、３０〜３８℃の高温で５ＫＧＡを生産できるグルコノバクター属菌である。グルコノバクター属菌としては、例えばグルコノバクター・サブオキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）、グルコノバクター・フラテウリ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｒｉｉ）などがあげられるが、さらに、これらの野生株を形質転換した変異株であっても良い。
【００１６】
本発明の高温耐性菌は、以下のスクリーニング法で得ることができる。すなわち、初期スクリーニングとして、適切な培地、例えばポテト寒天培地に保存した高温耐性グルコノバクター属菌から１つのコロニーをグルコース−グルコン酸培地に接種し、３０℃〜３７℃で２〜３日間培養し、培地中に茶色の化合物を生産した菌株を２，５−ジケトグルコン酸（２，５ＤＫＧＡ）生産株として除外する。２，５ＤＫＧＡは，いくつかのグルコノバクター属菌に存在する膜結合ＦＡＤ−２−ケトグルコン酸脱水素酵素により触媒された２ＫＧＡ酸化産物である。２，５ＤＫＧＡを多く生産する菌株は、２ＫＧＡを多く形成し、５ＫＧＡ形成は低いと予想されるため、それらの菌株は除くことが望ましい。残りの菌について、さらに３０〜３８℃で、グルコース−グルコン酸培地で培養し、培養液の５ＫＧＡを定量することで、５ＫＧＡ生産株を選ぶ。５ＫＧＡの生産量は、例えば、還元反応により発色するレゾルシノール試薬による発色反応などで調べることができる。
【００１７】
得られた高温耐性グルコノバクター属の野生株は、日本国に寄託されている。受託番号は、グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＥ４２株が、受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５５、グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＧ ４２株が、受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５７、グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＦ５５株が、受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５９である。
【００１８】
本発明の高温で５ＫＧＡ生産能を有する高温耐性グルコノバクター属菌の変異株は、親株として上記野生株だけではなく、２，５ＤＫＧＡ生産株からも選ぶことができ、親株の２ＫＧＡを形成に関与する酵素であるＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子を破壊することによって、特異的に５ＫＧＡの生産を行うよう改変されたものである。ＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子が破壊された欠損株は、野生株の染色体上のＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子、またはその一部のＤＮＡ配列を欠失、あるいは該遺伝子の内部に薬剤耐性遺伝子を挿入するなどして正常に機能する酵素を産生しないように修飾した遺伝子を含むＤＮＡで菌を形質転換し、染色体上の正常な遺伝子との間で相同組換えを起こさせることにより、染色体上の該遺伝子を破壊することによって作製する。このような相同組換えの遺伝子置換による遺伝子破壊は、直鎖状ＤＮＡやプラスミドを用いる方法として既に確立している。本発明の高温耐性グルコノバクター属菌のＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子破壊株の作製は、以下の操作方法、手順で行なうことができる。
【００１９】
１）高温耐性グルコノバクター属菌からＤＮＡの抽出を行う。高温耐性グルコノバクター属菌のからのゲノムＤＮＡ抽出法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ，１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）により行うことができる。
【００２０】
２）ターゲットとなるＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子のクローニングをする。ＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子のクローニングは、常温性グルコノバクター属菌や、エルビニア菌のＧＡＤＨの遺伝子の中の脱水素酵素サブユニットに維持されている領域からデザインしたプライマーを用いたＰＣＲ法や、ＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子を用いたハイブリダイゼーションにより行うことができるが、最も効率的な方法としては、グルコノバクター・オキシダンス ６２１Ｈのゲノムで報告されている、ＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子の配列を基にデザインしたプライマーを用い、１）で得られたゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子の全長を含む遺伝子をＰＣＲにより増幅・取得することができる。クローニングした遺伝子の全配列は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用して、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）やＣｌｏｎｅ Ｍａｎａｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｃａｒｙ，ＮＣ）などのソフトウエアで解析し、配列データを得ることができる。また、ホモロジー検索や整列解析（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）は、それぞれＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）やＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ）を使用して得ることができる。
【００２１】
本発明のＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子をクローニングして得られるＤＮＡ断片としては、ｇｎｄＦ（配列番号７）、ｇｎｄＧ（配列番号８）、ｇｎｄＨ（配列番号９）などがあげられる。これらのＤＮＡ断片は増幅して、ＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子破壊用プラスミドに使用することができる。
【００２２】
３）クローニングした遺伝子の配列情報を基に、ＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子破壊用プラスミドを作製する。ＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子の破壊用プラスミドの作製は、高温耐性グルコノバクター属菌内で複製不可能なｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ等の大腸菌ベクターに、ＰＣＲで増幅したＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子を組み込み、得られたＤＮＡの制限酵素サイトに、カナマイシン等の薬剤耐性物質等からなるカセットを挿入して作製することができる。
【００２３】
４）ついで、プラスミド導入によるＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子破壊株の作製を行う。ＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子破壊株の作製は、上記遺伝子破壊用プラスミドを、高温耐性グルコノバクター属菌への電気パルス法（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４：４４３−４４７，１９９０、Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１４４：１８１−１８５，１９９３）や、プラスミドを接合法（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）などの高効率遺伝子導入法により細胞内に導入し、染色体への相同性組換えにより、ＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子を破壊（または不活性化）することにより行うことができる。ＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子の破壊の確認は、薬剤耐性遺伝子断片が染色体に挿入されている菌株を、適切な濃度の当該薬剤を含むプレート培地上に塗布することにより形質転換された高温耐性グルコノバクター属菌を選抜し、選抜した菌株で２ＫＧＡ生産のための酵素活性が消失していることを確かめることにより行うことができる。
【００２４】
上記の如くして作製された、本発明の形質転換した高温耐性グルコノバクター属菌は、適切な培地、例えばポテト寒天培地（２０gグリセロール、５gグルコース、１０g酵母エキス、１０gポリペプトン、２ｇ寒天、１００ｍｌのポテトエキスを蒸留水で１Ｌとする）で、０〜５℃の低温で保存しておくことができる。長期間の保存は５０％グリセロールを含むポテト培地を用い、−８０℃で行うことが出来る。
【００２５】
本発明の形質転換した高温耐性グルコノバクター属菌の変異株としては次の菌があげられる。グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＥ４２株（受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５５）の変異株が、グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＥ４２ ｇｎｄＧ：：Ｋｍ株で、受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５６として日本国に寄託されている。また、グルコノバクター・フラテウリＴＨＧ ４２株（受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５７）の変異株は、グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＧ４２ ｇｎｄＧ：：Ｋｍ株で、受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５８として同様に寄託されており、さらに、グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＦ５５株（受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５９）の変異株は、グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＦ５５ ｇｎｄＧ：：Ｋｍで、受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６６０として同様に寄託されている。
【００２６】
本発明の５ＫＧＡの生産においては、本発明の高温耐性グルコノバクター属菌の野生株または変異株を、好気条件下で増殖培養し、培地中に５ＫＧＡを生成蓄積させることができる。
【００２７】
本発明の高温耐性グルコノバクター属菌の培養は、炭素源、窒素源および無機塩等を含む通常の栄養培地を用いて行うことが出来る。炭素源として、例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトースやマンノースなどの単糖類、ラクトース、シュークロース、マルトースなどの二糖類、グルコン酸ナトリウムやグルコン酸ポタジウムなどのグルコン酸塩、グリセリン、マルチトール、ラクリトール、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、アラビトールなどの糖アルコール類が用いられ、このうち、グルコースまたはグルコン酸が好ましく、グルコースが最も好ましい。
【００２８】
窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムまたは尿素等をそれぞれ単独もしくは混合して用いることが出来る。また、無機塩として、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸ニ水素カリウムまたは硫酸マグネシウム等を使用することが出来る。この他にも必要に応じて、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、ポテトエキス、コーンスティープリカー等の各種栄養素を培地に適宜添加することもできる。
【００２９】
また、本発明においては、５ＫＧＡの生産に関わる酵素のために培地にコファクターを添加することができる。本発明の５ＫＧＡの生産に関わるＰＱＱ−ＧＬＤＨは、高温耐性グルコノバクター属菌を高温で生育するとき、酵素の構造的な変化を起こすことが明らかになっている。そのため、培地にコファクターを補充することにより酵素の活性を高い状態で維持することができる。コファクターとしては、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、アンモニウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオンがあげられ、これらのイオンは、塩化マグネシウム、炭酸マグネシウム、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなどの化合物で培地中に添加することができる。好ましい化合物としては、塩化マグネシウム、炭酸マグネシウム、塩化カルシウム、炭酸カルシウムであり、最も好ましいのは、塩化カルシウムである。これらの化合物の培地への添加量は、１〜５０ｍＭ、好ましくは５ｍＭである。
【００３０】
さらに、本発明における５ＫＧＡの生産に関わる酵素活性のため、培地に添加するコファクターとして、補酵素のピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）があげられる。酵素活性を維持するために、補酵素の培地への補充を行い、５ＫＧＡの生産を高めることができる。ＰＱＱの添加量は、０．１〜１００μＭ、好ましくは１〜１０μＭを培地中に添加する。
【００３１】
培養は、通常、通気撹拌または振盪等の好気的条件下、２８℃〜３８℃、好ましくは３０〜３７℃の温度で行うことができる。培養時のｐＨは約５〜７の範囲がよく、培養中のｐＨ調整は酸またはアルカリを添加することにより行うことが出来る。培養期間は、１〜７日間、好ましくは２〜５日間行うことにより５ＫＧＡが得られる。５ＫＧＡの生産は、最初の成長段階で見られるが、最も高い生産量は、成長安定期に見られる。
【００３２】
本発明の高温耐性グルコノバクター属菌の培養菌体および培地からの５ＫＧＡの回収は、一般的な発酵生産法に準じて行うことができ、例えば遠心分離、膜分離、カラムクロマトグラフィー等の公知の方法を用いることができる。
【００３３】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げるが本発明はこれに限定されない。
【実施例１】
【００３４】
＜グルコノバクター菌の高温耐性５ＫＧＡ生産株のスクリーニング＞
【００３５】
１．野生株のスクリーニング
スクリーニング実験に使用する全てのグルコノバクター菌は、タイ国の種々の材料からＭｏｏｎｍａｎｇｍｅｅ，Ｄ．らの方法（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６４：２３０６−２３１５，２０００）で分離し、ポテト寒天培地（２０gグリセロール、５gグルコース、１０g酵母エキス、１０gポリペプトン、２ｇ寒天、１００ｍｌのポテトエキスを蒸留水で１Ｌとする）に保存した。初期スクリーニングのために、分離菌全てから１つのコロニーを２％グルコース−グルコン酸培地（２０gグルコース、２０gグルコン酸ナトリウム、３gポリペプトン、３g酵母エキスを蒸留水で１Ｌとする）に接種し、３０℃で４８時間、または３７℃で６０時間培養し、培地中に茶色の化合物を生産した菌株を２，５−ジケトグルコン酸生産株として除外した。その後、２００μｌの培地と、１ｍｌのＲｅｓｏｒｃｉｎｏｌ試薬（０．５％Ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ４９ｍｌ、濃塩酸１６８ｍｌ、蒸留水２７３ｍｌ）とを、８０℃で２０分間反応させた。Ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ試薬とＤ−グルコースの反応生成物は赤い化合物で、５ＫＧＡの場合は黒い茶系緑色の沈殿が生じた。一方、Ｄ−グルコン酸と２ＫＧＡは確認反応生産物には見出されなかった。高温耐性の５ＫＧＡ生産株として最も優れた菌株を得るために、初期スクリーニングで分離した２４株の菌(表１)をポテト培地（２０gグリセロール、５gグルコース、１０g酵母エキス、１０gポリペプトン、１００ｍｌのポテトエキスを蒸留水で１Ｌとする）で１日予備培養し、その後、培養液１０μｌを２％グルコース−グルコン酸培地の１ｍｌに接種し、３０℃で３６時間、または３７℃で４８時間培養した。培養液は、Ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ試薬で反応させた。さらに、生育と５ＫＧＡ蓄積は、反応で生じた反応生産物の吸光度を測定することにより比較した。
【００３６】
２．２ＫＧＡと５ＫＧＡの決定
２ＫＧＡと５ＫＧＡは、それぞれ２ＫＧＡ還元酵素と５ＫＧＡ還元酵素により、Ｓａｉｃｈａｎａ．Ｉらの方法（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７１：２４７８−２４８６，２００７）に準じて酵素的に定量した。２ＫＧＡと５ＫＧＡの定性分析は、薄層クロマトグラフィー分析で行った。サンプルはシリカゲル６０プレート（メルク製）にスポットし、酢酸エチル：酢酸：メタノール：無イオン水（６：１．５：１．５：１）を含む溶媒で展開した。プレートを乾燥し、発色試薬（２ｇのジフェニルアミン、２ｍｌのアニリン、１００ｍｌのアセトン、１５ｍｌのリン酸の使用前調整液）をスプレーし、発色するまで１２０℃で１０〜２０分間加熱した。５ＫＧＡと２ＫＧＡは、それぞれ濃紫色と、赤褐色のスポットとして現れた。
【００３７】
３．スクリーニング結果
２４分離株の中の３株、ＴＨＥ４２，ＴＨＦ５５，ＴＨＧ４２について、３０℃、３７℃の両方で５ＫＧＡの高い生産が見られた（表１）。
【００３８】
【表１】
【００３９】
選ばれた３つの高温耐性菌による５ＫＧＡの形成は、図２のＴＬＣにより確認し、３つの菌株の生育と生産の特徴については、３０℃と３７℃における２ＫＧＡと５ＫＧＡ生産を、常温菌の５ＫＧＡ生産グルコノバクター・サブオキシダンス ＩＦＯ１２５２８菌と、比較して検討した。結果を表２に示した。３つの高温耐性菌は、生育も、主生産物として２ＫＧＡを生産することも同じであった。３０℃、４８時間の培養で、常温菌は高温耐性菌に比べ、低い生育、低い２ＫＧＡ生産、高い５ＫＧＡ生産を示した。３７℃では、３０℃よりも全ての菌の生育が遅いことから、２ＫＧＡと５ＫＧＡの生産物を高めるために培養時間を７２時間とした。常温菌は、３７℃でほとんど成長せず、低い２ＫＧＡと５ＫＧＡの生産を示した。この温度で３つの高温耐性菌は、３０℃と比較して、生育、および２ＫＧＡと５ＫＧＡの生産は低いものの、常温菌では不可能であった３７℃での成長と５ＫＧＡ生産の可能性を示した。
【００４０】
【表２】
【実施例２】
【００４１】
＜高温耐性グルコノバクター菌の変異株の作製＞
高温耐性グルコノバクター菌について、特異的に５ＫＧＡを生産する菌を作製した。２ＫＧＡはＦＡＤ−グルコン酸脱水素酵素（ＦＡＤ−ＧＡＤＨ）により生成される。５ＫＧＡと競合して、主生産物に２ＫＧＡを生産する分離した高温耐性グルコノバクター菌において、ＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子を破壊することにより、２ＫＧＡ生産を排除した。以下のクローニングに使用するプライマーは、表３に示した。
【００４２】
【表３】
【００４３】
１．高温耐性グルコノバクター菌からＦＡＤ−グルコン酸脱水素酵素遺伝子のクローニング
ＦＡＤ−ＧＡＤＨ構造遺伝子は、グルコノバクター・オキシダンス ６２１Ｈのゲノム配列中で報告されている（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１９５−２００，２００５）。３つのサブユニット（脱水素酵素サブユニット、チトクロムサブユニット、小サブユニット）から構成されている。このＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子の配列を基にデザインしたｇｎｄＬ−Ｆプライマー（配列番号１）とｇｎｄＬ−Ｒのプライマー（配列番号２）をＰＣＲ用プライマーとした。この配列は、エルビニア・シプリペディ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７９：６５６６−６５７２，１９９７）、グルコノバクター・ジオキシアセトニカスＩＦＯ３２７１（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ７３：６５５１−６５５６，２００７）、グルコノバクター・オキシダンス ６２１Ｈ（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１９５−２００，２００５）のＧＡＤＨ遺伝子の中の脱水素酵素サブユニットに保存されている領域から設計した。このプライマーペアを、各高温耐性菌のゲノムＤＮＡを鋳型として使用し、ＰｕＲｅＴａｑ Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ ＰＣＲ Ｂｅａｄｓ ｋｉｔ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ｍＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）を用い、ＰＣＲの温度サイクルは、以下のように行った。９５℃で３０秒を１サイクル、その後、９５℃で３０秒、５５℃で１分、６８℃で１分を２５サイクル行い、すべてのサイクルが終了すると最後は３７℃に保った。ＤＮＡ断片は、アガロースゲルで分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ， Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）や ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｅｒ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で精製した。この結果、ＰＣＲの５２５ｂｐ生産物が得られた。この配列は、グルコノバクター・オキシダンス ６２１ＨのＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子の脱水素酵素サブユニットであるＧＯＸ１２３１と相同性が見られた。
【００４４】
遺伝子の全配列を得るために、上記ＰＣＲ生産物をシークエンスして得られた配列からデザインした特異的なプライマーペアである、Ｆ−ｉｇＬ−１（配列番号３）とＦ−ｉｇＬ−２（配列番号４）を用い、ゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化物の再環状化したものを鋳型として、ＴａＫａＲａ ＬＡ ＴａｑＴＭ（タカラバイオ社製）に２ｍＭ ＭｇＣｌ２と０．５％ ＤＭＳＯを添加してＰＣＲを行った。９５℃で３０秒を１サイクル、その後、９５℃で３０秒、５５℃で１分、６８℃で６分を２５サイクル行い、すべてのサイクルが終了すると最後は３７℃に保った。脱水素酵素と小サブユニットの遺伝子の全配列は、ゲノムＤＮＡのＳａｃＩＩまたはＥｃｏＲＩ消化物を再環状化したものを鋳型として、プライマーのＦ−ｉｇＬ−１（配列番号３）とＲ−ｉｇＬ−２（配列番号４）で増幅した。チトクロームＣサブユニットの遺伝子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏクローニング法から得られた。
【００４５】
各菌株から得られたＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子由来と予測される３つのＯＲＦ（ｇｎｄＦ、ｇｎｄＧ、ｇｎｄＨ）と、機能不明のタンパク質をコードする３ＯＲＦを含む６ｋｂ以上の断片をシークエンスし、配列を同定した。配列は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用して行った。配列データは、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ （Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社製）やＣｌｏｎｅ Ｍａｎａｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）を使用して解析した。ホモロジー検索や整列解析（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）は、それぞれＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）とＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ）を使用して行った。１例としてＴＨＦ５５菌株から得られた断片地図を図３に示した。ＯＲＦ−１、ＯＲＦ−２、ＯＲＦ−３は、グルコノバクター・オキシダンス ６２１Ｈのゲノムで示されているＧＯＸ１２３４、ＧＯＸ１２３３、ＧＯＸ１２２９でコード化されている機能不明タンパク質に相同性を示した。ｇｎｄＦ、ｇｎｄＧ、ｇｎｄＨの３つのＯＲＦは、ゲノムでＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子と確認されたＧＯＸ１２３２、ＧＯＸ１２３１，ＧＯＸ１２３０に７６％、８９％、６８％の同一性があった。この研究で得られた配列は、ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）に登録申請中である。
【００４６】
決定したＧｎｄＦのアミノ酸配列は、Ｎ末端に、Ｂｅｒｋｓ，Ｂ．Ｃ．らが報告した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３５：２６０−２７４，２０００）、２つのアルギニン残基を含むｔａｔ依存の特殊なシグナル配列が存在することがわかった。ＧｎｄＦはまた、ＦＡＤ−ＧＡＤＨの小サブユニットとして、Ｔｏｙａｍａ．Ｈらの報告（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ７３：６５５１−６５５６，２００７）で明らかにされたグルコノバクター・ジオキシアセトニカス ＩＦＯ３２７１のＧｎｄＳへ４４％の同一性を示した。
【００４７】
決定したＧｎｄＧのアミノ酸配列は、いくつかのＦＡＤ含有酵素に同様の配列がみられるように、Ｎ末端にＦＡＤが結合するためのシグナルであるグリシンボックス（ＧｘＧｘｘＧ）を示した。ＧｎｄＧは、コファクターとしてのＦＡＤと結合する蛋白ファミリーであるグルコース−メタノール−コリン（ＧＭＣ）酸化還元酵素ファミリーの中に維持された領域配列を持っていた。また、前記Ｔｏｙａｍａ．Ｈらが見出したグルコノバクター・ジオキシアセトニカス ＩＦＯ３２７１のＦＡＤ−ＧＡＤＨの脱水素酵素サブユニッのＧｎｄＬと６１％の同一性を示した。
【００４８】
ＧｎｄＨは、アルコール脱水素酵素、ソルビトール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素のように、グルコノバクター菌で見出される膜結合の多くのチトクロームｃサブユニットと類似し、３つのヘムｃ結合モチーフ（ＣｘｘＣＨ）配列を示した。さらに、グルコノバクター・ジオキシアセトニカス ＩＦＯ３２７１（２０）のＧｎｄＣに４４％の同一性を示した。
【００４９】
２．高温耐性グルコノバクター属菌のFAD-ＧＡＤＨ依存変異株の構築
テンプレートとするゲノムＤＮＡは、Ｍａｒｍｕｒの方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３：２０８−２１８，１９６１）に準じて、対数増殖期におけるグルコノバクター菌から分離した。ｇｎｄＧの破壊のためのプラスミドは、大腸菌 ＤＨ５α株から、ＱＩＡ Ｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用して調製した。Ｆ−ｇｎＤＨ−３プライマー（配列番号５）とＲ−ｇｎＤＨ−２プライマー（配列番号６）を使用し、テンプレートのゲノムDNAを増幅して得られた１．９ｋｂのＰＣＲ断片のＳｍａＩサイトに、ｐＴＫｍからＫｍｒカセットを含むＥｃｏＲＶ断片を挿入することにより構築した（ｐＧＥＭ−ＣＡ−Ｆ：：Ｋｍ）。制限酵素切断パターンの分析により、ＫｍｒカセットはｇｎｄＧと同じ転写方向に挿入したことを確認した。作製したプラスミドをエレクトロポレーションで、グルコノバクター菌へ導入し、導入した細胞は、遺伝子組み換えのために３０℃で６時間、ポテト培地で培養した。２〜３日後、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＳＧ寒天培地（１％ソルビトール、１％グリセロール、０．３％ポリペプトン、０．３％酵母エキス、２％寒天）上に得られたコロニーをピックアップしてカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含む１ｍｌのＳＧ培地（１％ソルビトール、１％グリセロール、０．３％ポリペプトン、０．３％酵母エキス）へ接種した。その後、変異株は、カナマイシン５０μg／ｍｌと、アンピシリン５０μg／ｍｌ添加または無添加の２つの新しい寒天培地に接種し、カナマイシン耐性コロニーでアンピシリンに耐性を示さないものを選抜した。Ｋｍｒカセットの挿入領域をカバーして増幅するプライマーを用いたＰＣＲで遺伝子破壊を確かめた（図４）。その結果、ＴＨＥ４２，ＴＨＦ５５，ＴＨＧ４２株からのｇｎｄＧ：Ｋｍ変異株が得られ、３つの変異株全ては、ＴＬＣ分析から２ＫＧＡ生産性がないことを確認した（図５）。
【００５０】
３．酵素活性による変異株の確認
野生株と変異株のＤ−アラビトールやグルコースに対する膜結合酵素活性は、３０℃と３７℃で生育させた細胞から膜分画により調製し、Ｔｏｙａｍａ．Ｈらの方法（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６９：１１２０−１１２９，２００５）で行った。膜結合酵素活性は、フェリシアナイドとＰＭＳを用いた還元活性により測定し、フェリシアナイド還元酵素活性、あるいはＰＭＳ−ＤＣＩＰ還元酵素活性として表した（図６ａ，ｂ）。
【００５１】
フェリシアナイド還元酵素活性は、カリウムフェリシアナイドを電子受容体として測定した。２５℃で、０．１Ｍの基質、ＭｃＩｌｖａｉｎｅ ｂｕｆｆｅｒ（ＭｃＢ，ｐＨ ５．０）、および適当な量の酵素液を含む０．９ｍｌの反応液を、５分間インキュベート後、０．１Ｍのカリウムフェリシアナイドの０．１ｍｌを添加し、撹拌した。一定時間のインキュベート後、０．５ｍｌ Ｄｕｐａｎｏｌ試薬（０．３％ Ｆｅ２（ＳＯ４）３、８．１％リン酸、０．３％ＳＤＳ）を添加して反応を止めた。色が安定するため２０分間放置した後、混合液の総量が５ｍｌになるよう３．５ｍｌの蒸留水で希釈し、分光光度計Ｕ２０００（日立製作所社製）で、６６０ｎｍの吸光度を測定した。酵素活性の１ユニットは、１分間に１μモルの基質を酸化した酵素の量とした。
【００５２】
膜画分のフェナジンメソスルフェイト（ＰＭＳ）還元活性は、２５℃で、１ｍｌの反応液中、１００ｍＭの基質、０．２ｍＭのＰＭＳ、１．２ｍＭのＮａＮ３、適量の酵素、ＭｃＢ（ｐＨ５．０）を、０．１１ｍＭの２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）とカップリング反応させ、６００ｎｍの青色の退色を分光光度計Ｕ２０００（日立製作所社製）で測定した。酵素活性の１ユニットは、このアッセイ系で１分間に１μモルの基質を酸化した酵素の量とした。
【００５３】
図６ａに示すように、３０℃で生育した野生株と変異株のＤ−アラビトール脱水素酵素活性は、同じであったが、Ｄ−グルコン酸脱水素酵素活性は変異株で野生株の３０％以上減少した。活性の減少は、ＦＡＤ−ＧＡＤＨの脱水素酵素サブユニットをコードするｇｎｄＧ遺伝子の不活性化によるのであり、Ｄ−グルコン酸に反応するＰＱＱ−ＧＬＤＨ活性はそのまま維持した。図６ｂでは、野生株と変異株において、３７℃で生育した細胞からの膜結合酵素活性が、３０℃での活性より低く、変異株のＤ−アラビトール脱水素酵素活性は野生株と同じであったが、変異株におけるＤ−グルコン酸脱水素酵素活性が、３０℃の場合と同じように減少したことを示した。また、３７℃では、ＰＱＱの添加により、野生株と変異株両方で、活性が２倍以上増加した。このことは、菌が高温で生育するときに、ＰＱＱ−ＧＬＤＨに必要なＰＱＱが不足していることを示している。
【実施例３】
【００５４】
＜ＦＡＤ−ＧＡＤＨ欠損変異株による５ＫＧＡの生産＞
野生株と変異株は、２％グルコース−２％グルコン酸培地で３０℃と３７℃で培養し、２ＫＧＡと５ＫＧＡの生産量を培養時間に沿って測定した（図７ａ，ｂ）。３７℃における野生株の生育は３０℃よりわずかに低く、３０℃と３７℃両方で主生産物として２ＫＧＡを生産しており、生産量も５ＫＧＡの２倍以上であった。２つの生産物の生産は、最初の生育段階から見られたが、最も高い生産量は、生育定常期に見られた。３０℃では、２ＫＧＡと５ＫＧＡの減少が培養６０時間以降に見られたが、これは３７℃の培養では見られなかった。ｇｎｄＧ：：Ｋｍ変異株による５ＫＧＡの生産を、野生株と比較した場合、３０℃で、３つの変異株全てで、５ＫＧＡ生産が主で２ＫＧＡ生産はわずかとなった。２ＫＧＡと５ＫＧＡの最も高い生産量は、野生株と同様に６０時間後に見られた。３７℃においても、変異株はやはり５ＫＧＡを主に生産し、２ＫＧＡの生産はわずかであったが、生産量は３０℃での生産量の半分であった。最終的な変換の収量は、３７℃、９６時間培養で原料の５０％であった。
【実施例４】
【００５５】
＜高温での５ＫＧＡ生産の改良＞
３７℃での野生株と変異株のＰＱＱ−ＧＬＤＨ活性はコファクター（ＰＱＱおよび／またはＣａ２＋）の添加に依存した（図８ａ）。種々の濃度のＣａＣｌ２をグルコノバクター属 ＴＨＦ５５（ｇｎｄＧ：：Ｋｍ）の培地に添加して、３７℃で培養した結果、培養３日後に５ＫＧＡの蓄積を確認した。ＣａＣｌ２添加による生育への効果は認められないが、５ｍＭのＣａＣｌ２添加で、５ＫＧＡの生産に高い効果を起こした。これは原料の９０％が５ＫＧＡに変換される収率であった。５ｍＭより高い濃度のＣａＣｌ２添加では、５ＫＧＡ生産は減少し、生育もわずかに阻害された。この結果より、３７℃の培養において、５ＫＧＡ生産を増加させる適正なＣａＣｌ２の添加濃度は５ｍＭであった（図８ｂ）。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の菌株を用いた５ＫＧＡの発酵生産法は、高温条件下で培養することにより、培地を冷却する必要がなくなり、コストを大幅に削減することができる。また、本発明のグルコノバクター属菌の変異株は、５ＫＧＡを特異的に生産するため精製工程が容易になることから、本発明の新規な菌株は、工業的に利用される可能性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】グルコースから５ＫＧＡおよび２ＫＧＡを生成する酵素反応を示す図面である。
【図２】分離された高温耐性グルコノバクター属菌による培地中の２ＫＧＡと５ＫＧＡの生産を示す図面に代わる写真である。（１：Ｄ−グルコース、２：ＮａＧＡ、３：２ＫＧＡ、４：５ＫＧＡ、５：培地、６：ＴＨＥ４２、７：ＴＨＦ５５、８：ＴＨＧ４２、９：ＴＨＥ４２、１０：ＴＨＦ５５、１１：ＴＨＧ４２、ただし、６−８は３０℃で、９−１１は３７℃で培養した。）
【図３】高温耐性グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＦ５５株から得られたゲノム断片の模式図である。
【図４】高温耐性グルコノバクター属菌のカナマイシン耐性カセットでの変異をＰＣＲで確認したことを示す図面に代わる写真である。（Ｍ：マーカーであるλＤＮＡ、１：ＴＨＥ４２、２：ＴＨＥ４２ ｇｎｄＧ：：Ｋｍ、３：ＴＨＦ５５、４：ＴＨＦ５５ ｇｎｄＧ：：Ｋｍ、５：ＴＨＧ４２、６：ＴＨＧ４２ ｇｎｄＧ：：Ｋｍ）
【図５】高温耐性グルコノバクター属菌のＦＡＤ欠損株による２ＫＧＡと５ＫＧＡの生産を示す図面に代わる写真である。（１：Ｄ−グルコース、２：ＮａＧＡ、３：２ＫＧＡ、４：５ＫＧＡ、５：培地、６：ＴＨＥ４２ ｇｎｄＧ：：Ｋｍ、７：ＴＨＦ５５ ｇｎｄＧ：：Ｋｍ、８：ＴＨＧ４２ ｇｎｄＧ：：Ｋｍ、９：ＴＨＥ４２ ｇｎｄＧ：：Ｋｍ、１０：ＴＨＦ５５ ｇｎｄＧ：：Ｋｍ、１１：ＴＨＧ４２ ｇｎｄＧ：：Ｋｍ、ただし、６−８は３０℃で、９−１１は３７℃で培養した。）
【図６】高温耐性グルコノバクター属菌のＤ−アラビトールとＤ−グルコースに対する膜結合酵素の活性を示す図面である。（ａ：３０℃で培養、ｂ：３７℃で培養、グレイのカラム：コファクター無添加で培養したＤ−アラビトールの活性、黒のカラム：１５μＭＰＱＱと１０ｍＭＣａＣｌ２添加で培養したＤ−アラビトールの活性、白のカラム：コファクター無添加で培養したＤ−グルコースの活性、斜線のカラム：１５μＭＰＱＱと１０ｍＭＣａＣｌ２添加で培養したＤ−グルコースの活性）
【図７】高温耐性グルコノバクター属菌のケトグルコン酸生産を示す図面である。（ａ：３０℃で培養、ｂ：３７℃で培養、グレイのカラム：２ＫＧＡ濃度、黒のカラム：５ＫＧＡ濃度）
【図８】高温耐性グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＦ５５株の３７℃での培養において、菌の生育と５ＫＧＡ生産へのＣａＣｌ２の添加効果を示す図面である。（ａ：生育曲線（黒の四角：０ｍＭ、黒のダイヤモンド型２．５ｍＭ、白の三角：５ｍＭ、４方クロス：７．５ｍＭ、６方クロス：１０ｍＭ）、ｂ：５ＫＧＡ生産量）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコノバクター属に属し、３０〜３８℃で５−ケト−Ｄ−グルコン酸（５ＫＧＡ）産生能を有する高温耐性菌、またはその変異株である５ＫＧＡ産生能を有する高温耐性菌。
【請求項２】
請求項１に記載の変異株が、ＦＡＤ−グルコン酸脱水素酵素（ＦＡＤ−ＧＡＤＨ）遺伝子を破壊した変異株である高温耐性菌。
【請求項３】
ＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子を破壊した変異株が、配列番号７，８，９に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅して得られたＰＣＲ産物に、カナマイシンカセットを挿入したプラスミドを細胞内に導入して相同組み換えを行うことにより構築した株である請求項２に記載の高温耐性菌。
【請求項４】
グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＥ４２株（受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５５）、グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＧ ４２株（受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５７）、グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＦ５５株（受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５９）、グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＥ４２ ｇｎｄＧ：：Ｋｍ株（受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５６）、グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＧ４２ ｇｎｄＧ：：Ｋｍ株（受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５８）、グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＦ５５ ｇｎｄＧ：：Ｋｍ株（受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６６０）から選ばれる１種以上の５ＫＧＡ産生能を有する高温耐性菌。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のグルコノバクター属に属する高温耐性菌を、ＰＱＱおよび／またはＣａイオン存在下、３０〜３７℃で培養して５ＫＧＡを生産させ、５ＫＧＡを採取することを特徴とする、５ＫＧＡの製造方法。
【請求項１】
グルコノバクター属に属し、３０〜３８℃で５−ケト−Ｄ−グルコン酸（５ＫＧＡ）産生能を有する高温耐性菌、またはその変異株である５ＫＧＡ産生能を有する高温耐性菌。
【請求項２】
請求項１に記載の変異株が、ＦＡＤ−グルコン酸脱水素酵素（ＦＡＤ−ＧＡＤＨ）遺伝子を破壊した変異株である高温耐性菌。
【請求項３】
ＦＡＤ−ＧＡＤＨ遺伝子を破壊した変異株が、配列番号７，８，９に示す塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅して得られたＰＣＲ産物に、カナマイシンカセットを挿入したプラスミドを細胞内に導入して相同組み換えを行うことにより構築した株である請求項２に記載の高温耐性菌。
【請求項４】
グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＥ４２株（受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５５）、グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＧ ４２株（受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５７）、グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＦ５５株（受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５９）、グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＥ４２ ｇｎｄＧ：：Ｋｍ株（受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５６）、グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＧ４２ ｇｎｄＧ：：Ｋｍ株（受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６５８）、グルコノバクター・フラテウリ ＴＨＦ５５ ｇｎｄＧ：：Ｋｍ株（受託番号 ＮＩＴＥ−Ｐ−６６０）から選ばれる１種以上の５ＫＧＡ産生能を有する高温耐性菌。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のグルコノバクター属に属する高温耐性菌を、ＰＱＱおよび／またはＣａイオン存在下、３０〜３７℃で培養して５ＫＧＡを生産させ、５ＫＧＡを採取することを特徴とする、５ＫＧＡの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１２−４４８６８（Ｐ２０１２−４４８６８Ａ）
【公開日】平成２４年３月８日（２０１２．３．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３２０８６７（Ｐ２００８−３２０８６７）
【出願日】平成２０年１２月１７日（２００８．１２．１７）
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月８日（２０１２．３．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月１７日（２００８．１２．１７）
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【Ｆターム（参考）】
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