９−ヒドロキシエリプチシン誘導体による悪性表現型の復帰変異
本発明は、癌を治療するための９−ヒドロキシエリプチシン誘導体の使用に関する。９−ヒドロキシエリプチシン誘導体は、転移癌又は従来の細胞毒性を有する化学療法を回避した癌の治療に特に有用であることが分かる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００６年８月２１日に出願された米国仮出願第６０／８３８，８６０号に対する利益を主張するものとし、その開示は、本明細書に十分に記載されるとすれば、参照により全体として本明細書中に援用される。
【０００２】
本発明は、癌を治療するための９−ヒドロキシエリプチシン誘導体の使用に関する。これらの９−ヒドロキシエリプチシン誘導体は、転移癌又は従来の細胞毒素を有する化学療法を回避した癌に治療に特に有用であることが分かる。
【背景技術】
【０００３】
癌でない細胞では、細胞外マトリックス及び隣接する細胞への接着は、細胞の生存、増殖、分化及び運動性の調節に中心的な役割を果たす（Ｋ．Ａ．Ｂｅｎｉｎｇｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５３（２００１），ｐｐ．８８１−８８８；Ｓ．Ｍ．Ｆｒｉｓｃｈ ａｎｄ Ｒ．Ａ．Ｓｃｒｅａｔｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３（２００１），ｐｐ．５５５−５６２、及びＦ．Ｍ．Ｗａｔｔ，ＥＭＢＯ Ｊ．２１（２００２），ｐｐ．３９１９−３９２６）。発癌性形質転換に応じて、細胞形態及び細胞骨格の編成、細胞運動性及び増殖因子又は接着依存性の細胞増殖において、著しい変化が生じる（総説としては、Ｇ．Ｐａｗｌａｋ ａｎｄ Ｄ．Ｍ．Ｈｅｌｆｍａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．１１（２００１），ｐｐ．４１−４７を参照されたい）。アクチン細胞骨格の崩壊及び接着斑数の同時減少は、種々の癌遺伝子によって誘導される細胞の形質転換を伴う共通の特徴である。アクチン細胞骨格が、腫瘍形成において基本的な役割を果たすことは、形質転換した細胞において、足場に依存しない増殖及び腫瘍原性とアクチンフィラメントネットワークの再配列との関連性によって示唆される（Ｐ．Ｋａｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．３６（１９８３），ｐｐ．６０５−６１１）。接着相互作用は、接合斑タンパク質を介した細胞骨格に連結している特定の膜貫通受容体を必要とする（総説としては、Ｎａｇａｆｕｃｈｉ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３（２００１），ｐｐ．６００−６０３を参照されたい）。α−アクチニン、ビンキュリン、トロポミオシン及びプロフィリンを含むいくつかのアクチン結合タンパク質の合成は、形質転換した細胞においてダウンレギュレートされ、腫瘍細胞におけるこれらのタンパク質の過剰発現により、腫瘍抑制因子として考えることができる形質転換した表現型が抑制される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
エリプチシンは、Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅファミリーの常緑樹から単離された天然の植物性アルカロイド産物であり、式（Ｉ）：
【０００５】
【化１】
【０００６】
を有する。
【０００７】
エリプチシンは、細胞毒性及び抗癌活性を有することが見出された（Ｄａｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，１９６７，２０，２７１５）。
【０００８】
９位でヒドロキシル化されたエリプチシン誘導体（９−ヒドロキシルエリプチシニウム）は、多くの実験腫瘍に関して、エリプチシンよりも高い抗腫瘍活性を有することが見出されたが（Ｌｅ Ｐｅｃｑ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，１９７４，７１，５０７８−５０８２）、ヒト癌を治療するには制限された活性を示すことが見出された（Ｌｅ Ｐｅｃｑ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９７６，３６，３０６７）。
【０００９】
ヒトの治療に適切であるエリプチシン誘導体を同定し、あるヒト癌の治療、特に乳癌の骨転移の治療に用いられているセリプチウム（Ｃｅｌｉｐｔｉｕｍ）、即ち、Ｎ２−メチル−９−ヒドロキシエリプチシニウム（ＮＭＨＥ）へと導くための研究が行われた。したがって、９−ヒドロキシエリプチシンから誘導される一連の化合物が開発され、それらは、式（ＩＩ）：
【００１０】
【化２】
【００１１】
（式中、
Ｒ及びＲ１は、水素又はアルキル基であり、Ｒ２は、場合により置換されたアルキル基であり、Ｘ-は、４級アニオンである）
を有していた。これらの化合物は、米国特許第４，３１０，６６７号に記載されている。
【００１２】
これらの化合物の平面の多環構造は、インターカレーションを介してＤＮＡと相互作用することが見出された。さらに、これらの化合物は、作用の複数の様式で関連していることが判明し、例えば、ＤＮＡ結合、酸化的酸素種の発生及び酵素機能の修飾；最も顕著にはトポイソメラーゼＩＩ及びテロメラーゼが含まれる（例えば、Ａｕｃｌａｉｒ，１９８７，Ａｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，２５９，１−１４を参照されたい）。
【００１３】
薬理学的には、多数の中毒性副作用は問題であることが示されている。特に、セリプチウムは、腎臓毒性を誘導することが分かった。しかしながら、いくつかのエリプチシン誘導体、例えば２−（ジエチルアミノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウム−クロリド（Ａｕｃｌａｉｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４７，６２５４−６２６１）は、動物において改善された安全性及び抗癌活性を有することが判明した。２−（ジエチルアミノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウム−クロリドの改善された性質が、フェーズＩ試行のために選択させるものであったが、この化合物の開発は中止された。
【００１４】
他の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体、例えば２−（ジエチルアミノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムアセテート、２−（ジイソプロピルアミノ−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムアセテート及び２−（ベータピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムは、例えば、米国特許第４，３１０，６６７号に記載されている。
【００１５】
ヒトの癌に対して有効であり、制限された中毒性副作用を有する薬物の開発は、重要な要件が残されている。このチャレンジは、特に、主として非細胞毒性プロセスを介して作用する抗癌剤の同定を成功することである。この調査の分野において、本発明者らは、細胞の表現型の変化、より具体的には細胞骨格の構造変化は、腫瘍進行の基礎となる主要な分子メカニズムの１つであり、適切な標的プロセスとなり得ると仮定した。
【００１６】
本発明者らは、限られた数の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体が非細胞毒性プロセス（即ち、細胞における生物学的損傷には直結しない）、例えば、アクチンネットワークの再構成、それによる接着の救援及び運動性制御の結果である腫瘍細胞の表現型の復帰変異（ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ）を誘導することによって媒介される抗癌活性を有することを予期せずに示した。さらに、表現型の復帰変異は、非細胞毒性濃度、即ち、細胞増殖及び細胞生存の両方にほとんど影響しない濃度で得られる。
【００１７】
このようにして、本発明者らによって同定された９−ヒドロキシエリプチシン誘導体は、主として非細胞毒性プロセスを介した抗癌剤作用を提供する。
【００１８】
エリプチシン誘導体
非細胞毒性濃度で悪性表現型の復帰変異を誘導するものとして同定された９−ヒドロキシエリプチシン誘導体は、式（ＩＩＩ）：
【００１９】
【化３】
【００２０】
（式中、
Ｘは、２又は３個の炭素原子を有するアルキル基であって、場合により分岐していてもよく、場合によりＯＨ、ＮＲＲ’、ＣＮ、ＯＲ、ＣＯＯＲで置換されてもよく、ここで、Ｒ及びＲ’は、独立してＨ又はＣ１−Ｃ４アルキル基であり；
Ｙは、−ＮＲ１Ｒ２であり、ここで、Ｒ１及びＲ２は、独立してＨ又はＣ１−Ｃ６アルキル基であるか、あるいはＲ１及びＲ２は、それらが結合しているＮ原子と一緒になって、飽和若しくは不飽和の５又は６員の複素環を形成し、ここで、−ＮＲ１Ｒ２は、式（Ｉ）で表される化合物が酸付加塩の形態となるように、医薬として許容される無機物又は有機酸の付加から得られる第４級アンモニウム塩の形態であってもよく；
あるいは、Ｙは、ベンジル、フェニル又はＣ５若しくはＣ６アリール又は５若しくは６−ヘテロアリール基であり；及び
Ｚ-は、医薬として許容される無機物又は有機酸の陰イオンであり；
−Ｘ−Ｙ側鎖は、必要に応じて、Ｔ、Ｕ、Ｖ又はＷに結合され；
Ｔ、Ｕ、Ｖ及びＷは、ピリジル環を形成するようにＣ原子又はＮ原子であり、残りのＴ、Ｕ、Ｖ及び／Ｗは、Ｃ原子であり、
ただし、−Ｘ−Ｙ側鎖は、Ｎ原子であるＴ、Ｕ、Ｖ及びＷの１つと結合しており、
理解されるように、
【化４】
は、必要に応じて、単結合又は二重結合を表し、その結果、縮合したピリジル環とともに形成した系は芳香族となり、生じる陽イオン：
【化５】
が形成される）
を有し、場合により酸付加塩の形態であってもよい。
【００２１】
一態様によれば、本発明の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体は、式（ＩＶ）：
【００２２】
【化６】
【００２３】
（式中、
Ｘは、２又は３個の炭素原子を有するアルキル基であって、場合により分岐していてもよく、場合によりＯＨ、ＮＲＲ’、ＣＮ、ＯＲ、ＣＯＯＲで置換されてもよく、ここで、Ｒ及びＲ’は、独立してＨ又はＣ１−Ｃ４アルキル基であり；
Ｙは、−ＮＲ１Ｒ２であり、ここで、Ｒ１及びＲ２は、独立してＨ又はＣ１−Ｃ６アルキル基であるか、あるいはＮ、Ｒ１及びＲ２は、場合により一緒になって、飽和若しくは不飽和の５又は６員の複素環を形成し、ここで、−ＮＲ１Ｒ２は、式（Ｉ）で表される化合物が酸付加塩の形態となるように、医薬として許容される無機物又は有機酸の付加から得られる第４級アンモニウム塩の形態であってもよく；
あるいは、Ｙは、ベンジル、フェニル又はＣ５若しくはＣ６アリール又は５若しくは６−ヘテロアリール基であり；及び
Ｚ-は、医薬として許容される無機物又は有機酸の陰イオンである）
を有する。
【００２４】
本明細書中で使用するとき、「アルキル」とは、鎖中に約１〜２０個の炭素原子を有する、線状又は分岐状であってもよい脂肪族炭化水素を意味する。好ましいアルキル基は、鎖中に１〜約１２個の炭素原子、さらに好ましくは１〜６個の炭素原子を有する。分岐とは、メチル、エチル又はプロピルなどの１個又は低級アルキル基が線状のアルキル鎖に結合したものを意味する。「低級アルキル」とは、線状又は分岐状であってもよい、約１〜約４個の炭素原子を意味する。アルキルは、同じであるか又は異なっていてもよい１以上のアルキル基置換基で置換されてもよく、例えば、ハロ、シクロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アシルアミノ、アロイルアミノ、カルボキシが挙げられる。
【００２５】
「アリール」とは、約５〜約１４個の炭素原子、好ましくは約６〜約１０個の炭素原子の芳香族単環式又は多環式環系を意味する。アリールは、同じであるか又は異なっていてもよい１以上の置換基で場合により置換され、本明細書中に記載されている通りである。例示的なアリール基には、フェニル若しくはナフチル、又は置換されたフェニル若しくは置換されたナフチルが挙げられる。
【００２６】
本明細書中で使用するとき、用語「ヘテロアリール」とは、５〜１４員、好ましくは５〜１０員の芳香族ヘテロ、単環式、二環式又は多環式環を指し、１個の水素原子の除去によって形成される。例としては、ピロリル、ピリジル、ピラゾリル、チエニル、ピリミジニル、ピラジニル、テトラゾリル、インドリル、キノリニル、プリニル、イミダゾリル、チエニル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、フラニル、ベンゾフラニル、１，２，４−チアジアゾリル、イソチアゾリル、トリアゾイル、テトラゾリル、イソキノリル、ベンゾチエニル、イソベンゾフリル、ピラゾリル、カルバゾリル、ベンズイミダゾリル、イソキサゾリルなどが挙げられる。
【００２７】
「医薬として許容される」とは、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などなしに、ヒト及びより下等な動物の細胞と接触させる使用に適切であることを意味し、合理的な損益比で釣り合いがとれている。
【００２８】
医薬として許容される無機物又は有機酸は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸、ヘキサフルオロリン酸、硝酸、カルボン酸、クエン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、酢酸、シュウ酸、マレイン酸、フマル酸、コハク酸、酒石酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、乳酸、マロン酸、安息香酸、シクロヘキサンスルファミン酸、及び桂皮酸からなる群から選択されてもよい。（例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ，ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ”，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，６６：ｐ．１−１９（１９７７）を参照されたい。）上記の一般式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）において、
− Ｚ-は、上記酸から誘導される対応する一価の陰イオンである。
【００２９】
好ましくは、上記式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）において、Ｚ-は、メタンスルホネート（メシラート、ＣＨ3ＳＯ3-とも呼ばれる）であり；さらに、
− −ＮＲ１Ｒ２は、上記で定義される医薬として許容される無機物又は有機酸、好ましくはメタンスルホン酸の添加から生じる第４級アンモニウムの形態であってもよく、その結果、式（Ｉ）で表される化合物は二価の正電荷を有することが可能となる。
【００３０】
上記の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体において、Ｘは、好ましくはエチル又はプロピルである。
【００３１】
Ｙがアリール基である場合、Ｙは、好都合には、ピリジン及びピリミジンからなる群から選択されてもよい。
【００３２】
Ｙが、−ＮＲ１Ｒ２である場合、好都合には、Ｒ１及びＲ２のそれぞれは、エチル基であってもよく、あるいは、Ｙはピペリジン又はピロリジン基であってもよい。
【００３３】
ある種の態様によれば、Ｘはエチルであり、Ｙはジエチルアミノ、ピロリジニル、ベンジル、フェニル、ピペリジン、ピリジン及びピリミジンからなる群から選択される。
【００３４】
また、ある種の態様によれば、Ｘはプロピルであり、Ｙはジエチルアミノ、ピロリジニル、ベンジル、フェニル、ピペリジン、ピリジン及びピリミジンからなる群から選択される。
【００３５】
好ましい９−ヒドロキシエリプチシン誘導体は、下記：
【００３６】
【化７】
【００３７】
であり、得られるそれらの第４級アンモニウム塩であり、式中、Ｚ-は、上記の一価の陰イオンから選択される。
【００３８】
より具体的には、本発明の使用のために、９−ヒドロキシエリプチシン誘導体は、２−（ジエチルアミノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムクロリド、２−（ジエチルアミノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムメタンスルホネート、２−（ベータピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムクロリド、２−（ベータピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムメタンスルホネート及び得られるそれらの第４級アンモニウム塩であってもよい。
【００３９】
さらに、好ましい９−ヒドロキシエリプチシン誘導体は、２−（ジエチルアミノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムメタンスルホネート、２−（ベータピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムクロリド、及び２−（ベータピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムメタンスルホネート、並びに得られるそれらの第４級アンモニウム塩である。
【００４０】
より好ましくは、本発明に係る９−ヒドロキシエリプチシン誘導体は、
【００４１】
【化８】
【００４２】
である。
【００４３】
９−ヒドロキシエリプチシン誘導体を調製する方法は、例えば、米国特許第４，３１０，６６７号に記載されている。
【００４４】
処置方法
上記の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体は、腫瘍細胞においてアクチン細胞骨格のリモデリングを誘導し、それにより、細胞運動性の減少及び細胞接着の回復へと導く。このプロセスは、インビボにおいて、最終的には、ＴＣＬ毒性効果を伴う可能性のある宿主の免疫応答から誘導される種々のメカニズムから生じる腫瘍細胞の選択的アポトーシスへと導く。
【００４５】
このようにして、本発明は、癌の治療が意図された薬剤を製造するための、式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体の使用に関する。本発明はまた、癌を治療し、腫瘍細胞の悪性表現型を復帰変異することによって癌を治療する方法に関し、それを必要とする被験者に、上記で定義される治療的に有効な量の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体を投与することを含む。しかしながら、この使用及び方法では、９−ヒドロキシエリプチシン誘導体は、２−（ジエチルアミノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムクロリド、２−（ジエチルアミノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムアセテート、２−（ジイソプロピルアミノ−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムアセテート、及び２−（ベータピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムアセテートではないことが好ましい場合がある。
【００４６】
さらに、本発明は、腫瘍細胞の悪性表現型が復帰変異されることが意図される薬剤を製造するための、式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体の使用に関する。本発明はまた、腫瘍細胞の形質転換した表現型を復帰変異する方法に関し、それを必要とする被験者に、上記で定義される治療的に有効な量の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体を投与することを含む。
【００４７】
本明細書中で使用するとき、用語「被験者」とは、哺乳動物、例えば、げっ歯類、ネコ、イヌ、及びブタを指す。好ましくは、本発明に係る被験者は、ヒトである。
【００４８】
本発明との関連で、用語「治療すること」又は「治療」とは、本明細書中で使用するとき、このような用語が適用される障害若しくは状態、又はこのような障害若しくは状態の１以上の症状を回復させ、軽減させ、それらの進行を阻害することを意味する。
【００４９】
「治療的に有効な量」とは、特定の障害又は疾患の症状の改善をもたらすのに十分である化合物の量を指す。好都合には、本発明の治療法は、細胞に毒性のない量の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体、即ち、細胞増殖及び細胞生存の両方にほとんど影響がない濃度を用いて実施されてもよい。
【００５０】
本明細書中で使用するとき、用語「形質転換された表現型」とは、（ｉ）細胞形態、及び／又は（ｉｉ）細胞骨格の編成、及び／又は（ｉｉｉ）細胞運動、及び／又は（ｉｖ）増殖因子若しくは接着依存性の細胞増殖において生じる可能性がある変化を指す。この形質転換された表現型は、腫瘍細胞の特徴である。
【００５１】
細胞形態の変化の例には、より丸くなった形状、細胞質拡張の低下、広がった領域の減少、及び細胞／細胞接触の低減を示す細胞が含まれる。細胞骨格編成の変化は、特に、アクチン細胞骨格の崩壊である場合があり、これは、典型的には、接着斑の数の同時減少と関連付けられる。
【００５２】
「腫瘍細胞の形質転換された表現型の復帰変異」とは、腫瘍細胞を正常な（即ち、腫瘍でない）細胞の表現型に回復させることを意味する。９−ヒドロキシエリプチシン誘導体による形質転換された表現型の復帰変異は、特に、アクチンネットワークの再配列によって誘導される。
【００５３】
形質転換された表現型の復帰変異は、当該技術分野において容易に知られるアッセイ法を用いる技術によって評価可能である。
【００５４】
これらの方法には、例えば：
−半固体又は軟寒天増殖アッセイ（クローン性アッセイ）；
−細胞運動アッセイ；
−国際出願公開ＷＯ２００４／０５７３３７に記載されている、細胞溶解物中の固定された重合アクチンの測定法、ここで、この方法は、腫瘍の攻撃性の指標から構成される。要約すると、この方法は、非変性条件下で細胞を溶解し、溶解物の全タンパク質濃度を調整し、蛍光標識したアクチン単量体及び内因性アクチンの重合に必要な成分（例えば、ＡＴＰ）を添加し、重合したアクチンを測定することを含む；
−アクチン、ジキシン（ｚｙｘｉｎ）、アクチニン又はＢ−カテニンラベリング、その後の慣用的な手法による顕微鏡観察による細胞の形態変化及び細胞骨格変性の評価
が含まれる。
【００５５】
本発明に係る医薬又は方法は、腫瘍細胞の選択的アポトーシスを誘導し、それにより、癌を治療するための非細胞毒性的な方法を提供する。
【００５６】
本発明によれば、腫瘍細胞は、いずれかの腫瘍、例えば、原発性若しくは転移腫瘍、固形腫瘍若しくは軟部組織腫瘍又は白血病起源の細胞であってもよい。固形又は軟部腫瘍細胞の例には、膀胱、乳房、骨、脳、頸部、結腸直腸、子宮内膜、腎臓、肝臓、肺、神経系、卵巣、前立腺、睾丸、甲状腺、子宮、膵臓及び皮膚の癌細胞が挙げられる。白血病には、例えば、慢性骨髄増殖性疾患、骨髄異形成症候群、急性リンパ性白血病、Ｂ−細胞急性リンパ性白血病、Ｔ−細胞急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、及び慢性リンパ増殖性疾患が含まれる。
【００５７】
９−ヒドロキシエリプチシン誘導体に最も応答性があると期待される腫瘍細胞は、細胞骨格崩壊、細胞運動の増加及び／又は細胞−細胞接着の減少と関連した浸潤性の表現型によって特徴付けられるものであり、それは、攻撃性肉腫、及び転移の初期段階で発生する上皮−間充織転移中に観察される場合があるためである。
【００５８】
細胞の悪性表現型を復帰変異する能力に準じて、本明細書中に記載される９−ヒドロキシエリプチシン誘導体は、真の抗浸潤剤を構築することは、本発明の利点である。したがって、一態様によれば、腫瘍細胞は転移細胞である。よって、本発明に係る医薬又は方法は、転移の治療が意図され得る。
【００５９】
さらに、本明細書に定義される９−ヒドロキシエリプチシン誘導体は、非細胞毒性プロセスによって媒介される抗癌活性を有する。これらの化合物は、好都合には、ＤＮＡ結合剤、特にアルキル化若しくはインターカレーティング剤、代謝拮抗剤、例えばＤＮＡポリメラーゼ阻害剤、又はトポイソメラーゼＩ若しくはＩＩ阻害剤などのＤＮＡ複製の阻害剤、あるいはアルカロイド類などの抗分裂剤を用いる従来の細胞毒性を有する化学療法を回避した被験者における癌を治療するために投与されてもよい。これらの細胞毒性化合物には、例えば、アクチノマイシンＤ、アドリアマイシン、ブレオマイシン、カルボプラチン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、ドキソルビシン、エトポシド、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリンメルファラン、メトトレキセート、パクリタキセル、タキソテレ、ビンブラスチン、及びビンクリスチンが挙げられる。
【００６０】
本明細書中で使用するとき、用語「細胞毒性を有する化学療法を回避した被験者」とは、特に、細胞毒性を有する化学療法が腫瘍進行を変更しない被験者を指す。
【００６１】
本明細書に定義される１以上の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体は、治療を受けるべき被験者に同時に又は連続して投与されてもよい。
【００６２】
さらに、９−ヒドロキシエリプチシン誘導体は、分化誘導薬、特に、ビタミンＡ、その合成類似体、及び代謝物（レチノイド類）、ビタミンＤ若しくはその類似体、又はペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ）リガンドを組み合わせて（即ち、同時に又は連続して）投与されてもよい。
【００６３】
レチノイドは、例えば、全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）、Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）レチンアミド（４ＨＰＲ）、１３−シス−レチノイン酸（１３−ＣＲＡ）又は９−シス−レチノイン酸（９−ＣＲＡ）であってもよい。
【００６４】
ビタミンＤ又はその類似体には、特に、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３）が含まれ、これは、ビタミンＤ３から通常は形成されるジヒドロキシル化された代謝物であり、１アルファ−ヒドロキシ−ビタミンＤ３、１アルファ−ヒドロキシビタミンＤ２、１アルファ−ヒドロキシビタミンＤ５、フッ素化ビタミンＤ誘導体である。
【００６５】
ＰＰＡＲリガンドは、特にＰＰＡＲα又はＰＰＡＲγアクチベーターである。選択的なＰＰＡＲγアゴニストには、クラシックなＴＺＤ（トログリタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、及びシグリチゾン；Ｆｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃｅｌｌ，８３：８０３−８１２；Ｌｅｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１２９５３−１２９５６を参照されたい）及び非ＴＺＤ型アゴニストが含まれる。後者の代表的なものには、Ｎ−（２−ベンゾイルフェニル）−Ｌ−チロシン誘導体、例えばＧＷ１９２９、ＧＩ２６２５７０、及びＧＷ７８４５が含まれ、今日までに同定された最も強力であり、選択的なＰＰＡＲγアゴニストの中にある（Ｈｅｎｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４１：５０２０−５０３６；Ｃｏｂｂ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４１：５０５５−５０６９を参照されたい）。ＧＷ２０２７、２，３−二置換インドール−５−カルボン酸はまた、強力かつ選択的なＰＰＡＲγアゴニストである（Ｈｅｎｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，９：３３２９−３３３４）。フィブレート又はファルネゾールは、ＰＰＡＲαアゴニストの例である。
【００６６】
したがって、本発明に従って有用な９−ヒドロキシエリプチシン誘導体はまた、別の化合物と混合されて、医薬組成物（希釈剤又は担体の有無を問わず）を形成することができ、投与されると、本発明の併用療法をもたらす有効成分の組み合わせの同時投与を提供する。特に、本発明は、上記で定義される式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体、及び分化誘導薬を含む医薬組成物を提供する。
【００６７】
同時投与に加えて、本発明に従って有用な９−ヒドロキシエリプチシン誘導体はまた、別の治療化合物、特に上記で定義される分化誘導薬と別々に又は連続して投与されてもよい。このようにして、本発明は、さらに、癌の治療、特に腫瘍細胞の形質転換した表現型を復帰変異するのに有用な同時の、別々の又は連続した使用のための組み合わせた調合物として、式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体、及び分化誘導薬を含む生成物を提供する。
【００６８】
９−ヒドロキシエリプチシン誘導体を単独で投与することは可能ではあるが、医薬組成物として提示することが好ましい。本発明に従って有用な、獣医用及びヒト用の医薬組成物は、上記で定義される少なくとも１つの９−ヒドロキシエリプチシン誘導体、及び１以上の医薬として許容される担体、場合により他の治療成分を含む。
【００６９】
ある種の好ましい態様では、併用療法に必要な有効成分は、同時投与のための１つの医薬組成物において組み合わせることができる。
【００７０】
本明細書中で使用するとき、「医薬として許容される」及び文法的にその変形は、それらが、組成物、担体、希釈剤及び試薬を意味する場合、交換可能に用いられ、材料が吐き気、目眩、異常亢進などの望ましくない生理学的な効果を生じることなしに、哺乳動物に又はその上に投与することができることを示す。
【００７１】
本明細書に開示され又は散見される有効成分を含む医薬組成物の調製は、当該技術分野において十分に理解され、製剤に基づいて限定されることを要しない。典型的には、このような組成物は、液体溶液又は懸濁液として注射可能なものとして調製される。しかしながら、使用前に溶液、又は懸濁液適した、液体に含まれる固体形態も好ましい。この調製物はまた、乳化することができる。特に、医薬組成物は、固体剤形、例えばカプセル、錠剤、丸薬、粉末、糖衣錠又は顆粒で調合されてもよい。
【００７２】
ビヒクルの選択、及びビヒクル中の活性物質の内容物は、一般に、活性化合物の溶解性及び化学的性質、投与の特別な様式、及び薬務において順守されるべき規定に従って測定される。例えば、賦形剤、例えばラクトース、クエン酸ナトリウム、カルボン酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、及び崩壊剤、例えばスターチ、アルギン酸、及びある種の複合ケイ酸塩は、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及びタルクなどの潤滑剤ととともに、錠剤の調製に使用されてもよい。カプセルを調製するために、ラクトース及び高分子量のポリエチレングリコールを用いることは有利である。水性懸濁液を用いる場合、それらに乳化剤、又は懸濁を促進する薬物を含めることができる。スクロース、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール及びクロロホルム又はそれらの混合物などの希釈剤も使用可能である。
【００７３】
医薬組成物は、経口、直腸、鼻腔、口腔、膣、非経口（例えば、皮下、筋内、静脈、皮内、髄腔及び硬膜外）、嚢内及び腹腔を含む局所又は全身投与によって、ヒト及び動物に適切な製剤で投与することができる。好ましい経路は、例えば、受領者の状態に基づいて変更されてもよいことは承認される。
【００７４】
この製剤は、製薬の技術分野において周知である方法のいずれかによって単位剤形で調製され得る。このような方法には、１以上の副成分を構成する担体と有効成分とを関連付けさせる工程を含む。一般に、製剤は、有効成分と、液体担体若しくは微細に分割した固体担体又はその両方と均一又は密接に関連付け、必要に応じて、製造物を成形することによって調製される。
【００７５】
１回又は分割した投薬量で被験者に投与される９−ヒドロキシエリプチシン誘導体の毎日の総服用量は、例えば、毎日約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、さらに好ましくは０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ／日、特に０．１〜１ｍｇ／ｋｇ／日、又は１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の量であってもよい。毎日の服用量の例は、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１２５ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．２５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、及び１０ｍｇ／ｋｇである。服用単位組成物は、さらに複数回の量を含んでもよく、毎日の服用量を作るように用いてもよい。しかしながら、任意の特定の患者に対する具体的な投薬レベルは、体重、一般的な健康、性別、食事、投与時間及び経路、吸収及び排出の速度、他の薬物との組み合わせ、治療されるべき特定の疾患の重症度を含む様々な因子に依存することは理解されよう。
本発明は、下記の実施例を考慮してさらに例証される。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】ＢＡ０１６ＤＤ５３７（２−（β−ピペリジノエチル）−９−ヒドロキシエリプチシニウムクロリド）の構造を示す。
【図２】ＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ抽出物におけるＢＡ０１６ＤＤ５３７によるアクチン重合の時間経過の描写である。重合バッファーとＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ抽出物と一緒にＢＡ０１６ＤＤ５３７をゼロ時に添加した。反応混合物は、下記の記号で示された濃度のＢＡ０１６ＤＤ５３７を含む：１００ｎＭ ＢＡ０１６ＤＤ５３７（黒三角）、２００ｎＭ ＢＡ０１６ＤＤ５３７（黒菱形）、対照の悪性ＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ細胞（黒逆三角）、対照の正常ＮＩＨ３Ｔ３細胞（黒四角）。データは、平均±標準偏差を示す；ｎ＝３。
【図３】ＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ抽出物における１００ｎＭ ＢＡ０１６ＤＤ５３７（黒菱形）、２００ｎＭ ＢＡ０１６ＣＡ１０７（白四角）、及び２００ｎＭ ＢＡ０１６ＣＡ７７（＊）によるアクチン重合の時間経過の描写である。重合バッファーとＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ抽出物と一緒に薬物をゼロ時に添加した。対照の悪性ＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ細胞（白三角）、対照の正常ＮＩＨ３Ｔ３細胞（白丸）も示される。データは、平均±標準偏差を示す；ｎ＝３。
【図４】ＢＡ０１６ＤＤ５３７で処理した又は処理していないＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ細胞におけるアクチン線維の蛍光顕微鏡試験であり、対照のＮＩＨ３Ｔ３細胞と比較した。形質転換されたＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ細胞において、ＢＡ０１６ＤＤ５３７はアクチン線維を増加させる。正常及び悪性ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、アクチン線維を視覚化するためにＦＩＴＣ−パロイジンを用い、核を視覚化するためにＤａｐｉを用いて、インサイチューの免疫蛍光によって分析した。（Ａ）対照の悪性ＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ細胞；（Ｂ）対処の正常ＮＩＨ３Ｔ３細胞；（Ｃ）１００ｎＭ ＢＡ０１６ＤＤ５３７で処理した悪性ＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ細胞；（Ｄ）２００ｎＭ ＢＡ０１６ＤＤ５３７で処理した悪性ＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ細胞。
【図５】ＢＡ０１６ＦＺ５３９（２−（ベータピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムメタンスルホネート）によって処理されたＭＩＡ ＰａＣａ−２細胞の形態変化を示す。Ａ：対照、Ｂ：４μＭ ＢＡ０１６ＦＺ５３９で３日間処理された細胞（２００×）。
【図６】１３ＣＲＡ及びＡＴＲＡの有無でＢＡ０１６ＤＤ５３７（２−（ベータピペリジノ−２−エチル）−９−ヒドロキシエリプチシニウムクロリド）で処理されたＢ１６ＢＬ６細胞の増殖試験を示す。使用されたレチノイン酸の濃度を１０ｎＭで固定した。
【実施例】
【００７７】
実施例１：アクチン動力学の調節
アクチン動力学は、腫瘍細胞において損なわれ、その後にＦ−アクチンとＧ−アクチンとの比が減少することが知られている。アクチン動力学は、Ｆ−アクチン伸長の速度定数（ｋ）及びＦ−アクチンの安定状態濃度（ΔｍＡ）に近づける蛍光異方性アッセイを用いて腫瘍細胞抽出物において定量した。
【００７８】
材料及び方法：
全ての反応は２２℃で行い、蛍光異方性シグナルはＢｅａｃｏｎ ２０００（Ｐａｎｖｅｒａ）において励起４９０ｎｍで５２０ｎｍで回収した。Ａｌｅｘａ ４８８アクチン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｌ５−５０Ｂ超遠心分離機で３５０００ｒｐｍ、２時間、４℃で遠心分離し、残りのアクチン重合体を沈殿させた。上清に残存している蛍光は、単量体又は小さなアクチン線維（５〜１０単量体）によるものと考えられ、前述の条件下ではペレットにならないものである。８０％の上清を回収した；濃度は、蛍光測定により決定した（４９０ｎｍで励起し、シグナルを５２０ｎｍで回収した）。超遠心分離したアクチン濃度は、標準として超遠心分離していないＡｌｅｘａ ４８８アクチンを用いて計算した。上清を分注し、液体窒素で凍結後、−８０℃で保存した。
【００７９】
実験前に、超遠心分離したＡｌｅｘａ ４８８アクチンのアリコートをＧバッファー（５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．１、２ｍＭ ＣａＣｌ2、０．２ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍＭ ＡＴＰ）で１ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。３μｌの希釈したＡｌｅｘａ ４８８アクチンは、１６８μｌのＧバッファーで混合し、アクチン単量体異方性は、４μｌの重合バッファー（２．５Ｍ ＫＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ2、２５ｍＭ ＡＴＰ）、化学分子の有無による５μｌのＧバッファー、２ｍｇ／ｍｌの濃度で２０μｌの正常なＮＩＨ３Ｔ３細胞又は悪性ＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ細胞の抽出物の添加前に測定した。Ａｌｅｘａ ４８８の最終濃度は、４ｎＭであった。非標識アクチンと標識アクチンとの比は、約１４０／４ｎＭであった。測定は、２００秒間、１０秒毎に行った。アクチン単量体異方性の値を差し引き、異方性増加（ΔｍＡ）を得た。データは、式Ｙ＝Ｙｍａｘ［１−ｅｘｐ（−Ｋ．Ｘ）］にフィットさせた。曲線はゼロで始まり、安定状態の異方性値（ΔｍＡ ｅｑ）に対応するＹｍａｘまで上昇し、速度定数はＫであった。Ｙは、単量体異方性が差し引かれた異方性値であり、Ｘは時間である。
【００８０】
結果：
これらのパラメータに対するＢＡ０１６ＤＤ５３７の効果は下記の通りである：
【００８１】
【表１】
【００８２】
異方性の増大は、２−（β−ピペリジノエチル）−９−ヒドロキシエリプチシニウムクロリド（ＢＡ０１６ＤＤ５３７）の存在下でＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ抽出物について観察し、ＢＡ０１６ＤＤ５３７無しで測定した異方性と比較した（図２）。
【００８３】
天然のＮＩＨ３Ｔ３細胞と比較すると、ＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ細胞は、アクチン伸長のより低い見せ掛けの一次速度定数、並びに安定状態でのより低量のＦ−アクチンを示す。したがって、ＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ細胞から調製した細胞質画分は、アクチン動力学を調節し得る分子をスクリーニングするための便利な材料であり、ＢＡ０１６ＤＤ５３７などのアクチン線維に選択的に結合することができるものが含まれる。アッセイ培地に添加すると、ＢＡ０１６ＤＤ５３７は、アクチン−Ｆ伸長の速度定数及びアクチン−Ｆ安定状態の値を増加させる。図２は、濃度増加したＢＡ０１６ＤＤ５３７の添加後に観察された典型的な動力学を示す。２００ｎＭのＢＡ０１６ＤＤ５３７の存在下では、ＮＩＨ３Ｔ３ＥＦの細胞質画分のアクチン動力学は、ＮＩＨ３Ｔ３の細胞質画分を用いて観察されるものと類似している。このようにして、ＢＡ０１６ＤＤ５３７は、アクチン重合促進剤として用いることができる。
【００８４】
実施例２：９−ヒドロキシ−２（ベータ−エチル）−エリプチシニウムアセテート（ＢＡ０１６ＣＡ１０７）及び９−ヒドロキシ−２（ベータ−メチル）−エリプチシニウムアセテート（セリプチウム（Ｃｅｌｉｐｔｉｕｍ）、ＢＡ０１６ＣＡ７７）によるアクチン動力学の調節及び細胞運動性のエクスビボ阻害
セリプチウムは、抗癌剤として知られていた。９−ヒドロキシ−２（ベータ−エチル）−エリプチシニウムアセテート（ＢＡ０１６ＣＡ１０７）及びセリプチウム（ＢＡ０１６ＣＡ７７）の作用機序は、安定状態の蛍光異方性測定アッセイ（材料及び方法、実施例１）によってＢＡ０１６ＤＤ５３７と比較された。また、細胞運動性を阻害するそれらの能力を調査した（材料及び方法、実施例４）。
【００８５】
結果：
図３に示されるように、ＢＡ０１６ＣＡ７７及びＢＡ０１６ＣＡ１０７は、アクチン−Ｆ伸長の速度定数及びアクチン−Ｆ安定状態の値を増加させない。２００ｎＭのＢＡ０１６ＣＡ７７及びＢＡ０１６ＣＡ１０７の存在下では、ＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ細胞質画分のアクチン動力学は、処置なしのＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ細胞質画分を用いて観察したものに類似している。このようにして、ＢＡ０１６ＣＡ７７及びＢＡ０１６ＣＡ１０７は、アクチン重合促進剤として用いることができない。
【００８６】
【表２】
【００８７】
ＢＡ０１６ＣＡ７７及びＢＡ０１６ＣＡ１０７薬物によって処理された悪性細胞の挙動はまた、創傷治癒アッセイにおける未処理の悪性細胞と比較された。処理された悪性細胞は、全領域に創傷の境界を超えて移動することが分かった（図４）。非毒性濃度の薬物で処理された細胞は、未処理の悪性細胞と同じように移動する。
【００８８】
結果として、９−ヒドロキシ−２（ベータ−エチル）−エリプチシニウムアセテート及び９−ヒドロキシ−２（ベータ−メチル）−エリプチシニウムアセテート（セリプチウム）のいずれも活性であることが判明し、したがって、２位の側鎖の性質はアクチン動力学を調節するためのそれらの能力において重要な役割を果たすことを指示している。
【００８９】
実施例３：腫瘍細胞におけるＦ−アクチンネットワークの救済
材料及び方法：
悪性ＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ細胞を２０００細胞／ｃｍ2の密度でガラス製のカバースリップ上に播種した。翌日、ＢＡ０１６ＤＤ５３７を種々の非毒性濃度（１００ｎＭ及び２００ｎＭ）でＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ細胞に適用した。３日後、細胞は、蛍光顕微鏡で試験される前に、４℃で３．７％のホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中で１０分間固定された。ホルムアルデヒド溶液は、５０ｍＭのＮＨ4Ｃｌで中和された。抽出は、ＰＢＳ中の０．４％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いて４分間行われた。細胞をブロッキングバッファー（ＰＢＳ中の３％ウシ血清アルブミン）と共に１時間インキュベートし、次に、２０分間、ＦＩＴＣ−ファロイジン（Ｓｉｇｍａ）を用いて室温でインキュベートした。カバースリップをＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄｋ（Ｚｙｍｅｄ）に置き、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）で観察した。
【００９０】
結果：
薬物ＢＡ０１６ＤＤ５３７は、図４に示される非毒性濃度で腫瘍細胞内のアクチンネットワークを再構築することができる。ＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ細胞は、非毒性濃度のＢＡ０１６ＤＤ５３７で処理され、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に近い形態を回復する：細胞は広がり、多数の細胞間接着を有し、アクチン細胞骨格はストレスファイバーネットワークにおいて十分に編成される。
【００９１】
同様の実験条件では、９−ヒドロキシ−２エチル）−エリプチシニウムアセテート及び９−ヒドロキシ−２（メチル）−エリプチシニウムアセテート（セリプチウム）はともに活性がないことが分かった。
【００９２】
実施例４：細胞運動性のエクスビボ阻害
癌の進行における後期である腫瘍細胞の浸潤及び転移は、細胞運動性と明確に関係している。細胞運動の主要なエンジン、及び一般には細胞形状変化は、細胞骨格であり、動物脂肪の移動に関与する細胞骨格の主要な成分はアクチンである。結論として、アクチン動力学の調節は、順番に浸潤及び転移を抑止するべき細胞運動の機能障害をもたらし得る。
これらの理由で、ＢＡ０１６ＤＤ５３７を細胞運動性アッセイにおいて試験した。
【００９３】
材料及び方法：
創傷治癒アッセイは、悪性ＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ細胞及びメラノーマ細胞株Ｂ１６Ｆ１０及びＢ１６ＢＬ６の運動性に対するＢＡ０１６ＤＤ５３７の効果を評価するために行った。全ての細胞は、加湿した５％のＣＯ２雰囲気下、３７℃でインキュベートされた。約１０００００〜２０００００細胞を６ウェルの培養プレートに播種し、ＢＡ０１６ＤＤ５３７は、様々な濃度で、２４時間後に添加した。細胞を３日間増殖し、約９０〜９５％のコンフルエントにし、小さなスクラッチ傷（約２００μｍ〜１ｍｍ幅）をピペットチップで作った。細胞の残骸を除去し、次に培養物を同濃度のＢＡ０１６ＤＤ５３７の存在下、１０時間完全培地でインキュベートした。その後、細胞は、４℃で、３．７％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中で１０分間固定された。治癒は、Ｚｅｉｓｓソフトウェアを用いて位相差光学顕微鏡で観察した。
【００９４】
結果：
浸潤した悪性細胞Ｂ１６Ｆ１０及びＢ１６ＢＬ６、並びに融合タンパク質ＥＷＳ−ＦＬＩ−１を発現している腫瘍性ＮＩＨ−３Ｔ３ＥＦ細胞は、高い運動性の表現型を示す。それらの運動性の全体の評価を得るために、ＢＡ０１６ＤＤ５３７で処理した薬物悪性細胞の挙動と未処理の悪性細胞の挙動とを創傷治癒アッセイにおいて比較した。未処理悪性細胞は、創傷の全領域に創傷の境界を超えて移動する。対照的に、ＢＡ０１６ＤＤ５３７で処理された悪性細胞は、創傷に全く移動しない。ＢＡ０１６ＤＤ５３７は、投薬量に依存して悪性細胞の運動性を阻害した。５０ｎＭ程度の低い濃度のＢＡ０１６ＤＤ５３７による細胞処理は、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ及びＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ細胞移動の完全な阻害をもたらす。また、非毒性濃度のＢＡ０１６ＤＤ５３７によるＢ１６ＢＬ６細胞の運動性の阻害が観察された。したがって、選択されたＢＡ０１６ＤＤ５３７薬物の効果は、毒性効果にはよらない。
【００９５】
実施例５：９−ヒドロキシエリプチシン誘導体のエクスビボの抗増殖効果
悪性細胞は、足場非依存的にメチルセルロースなどの半固体培地上で増殖する性質を示す。
【００９６】
表現型の復帰変異に関連した２−（ベータピペリジノ−２−エチル）−９−ヒドロキシエリプチシニウムクロリド（ＢＡ０１６ＤＤ５３７）及び２−（ベータピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムメタンスルホネート（ＢＡ０１６ＦＺ５３９）の抗腫瘍活性は、半固体培地中のコロニー形成の阻害によって評価した。いくつかの細胞株を調査した。コロニー形成の阻害は、ＭＴＴ還元によって測定される細胞増殖の阻害と比較した。
【００９７】
材料及び方法：
クローニングアッセイ
０．８％のメチルセルロース（Ｍｅｔｈｏｃｅｌ ＭＣ４０００、Ｓｉｇｍａ）で補足された完全培地中に細胞を埋め込み、３重で３５ｍｍディッシュ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−ｏｎｅ Ｒｅｆ６２７１０２、Ｄｏｍｉｎｉｑｕｅ Ｄｕｓｔｓｃｈｅｒ）に播種し、加湿した５％のＣＯ2雰囲気下、３７℃でインキュベートした。播種した細胞数は、１０００細胞／ディッシュであった。細胞株によって１〜３週間後、肉眼で見えるクローンをカウントした。
【００９８】
ＭＴＴアッセイ
増殖試験は、［３−（４，５ジメチルチアゾール−２−イル］−２．５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド］（Ｓｉｇｍａ）比色分析を用いて行った。
【００９９】
細胞株によって約１５００〜５０００細胞は、濃度増加したＢＡ０１６ＤＤ５３７又はＢＡ０１６ＦＺ５３９を添加する前に９６ウェル培養プレートで２４時間播種された。プレートは、３７℃で３日間インキュベートされた。１０μｌのＭＴＴストック溶液（リン酸緩衝生理食塩水の５ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルの９０μｌの完全培地に添加し、３時間、３７℃でインキュベートを継続した。１００μｌの溶解バッファー（１０％ドデシル硫酸ナトリウム、１％ ＨＣｌ １Ｎ；ｐＨ４．７）を各ウェルに添加した。プレートを一晩インキュベートした。吸光度は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＥＩＡ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ）を用いて、５７０ｎｍの波長で測定された。増殖率は、未処理の細胞を１００％として用いて、ＯＤの読み取りから計算された。
得られた典型的な結果を下記の表３〜６に示す。
【０１００】
【表３】
【０１０１】
【表４】
【０１０２】
【表５】
【０１０３】
【表６】
【０１０４】
このようにして、ＢＡ０１６ＤＤ５３７及びＢＡ０１６ＦＺ５３９は、半固体培地のコロニー形成における顕著な阻害活性を示すことが判明した。コロニー形成の阻害は、ＭＴＴ試験を用いて測定された非抗増殖濃度で生じる。
【０１０５】
実施例６：抗腫瘍活性
Ｂ１６メラノーマに対する抗腫瘍活性は、悪性細胞のｉ．ｐ．グラフト、その後のｉ．ｐ．処理を用いて、マウスにおいて評価することができる。様々なバイオディスポニビリティ（ｂｉｏｄｉｓｐｏｎｉｂｉｌｉｔｙ）パラメータを回避するこの種のプロトコールは、大雑把に、所定の腫瘍に期待され得る最大の抗腫瘍活性に関する情報を提供する。
【０１０６】
実験プロトコール：
メラノーマＢ１６細胞（４×１０5）は、Ｊ０でｉ．ｐ．経路を用いてＢ６Ｄ２Ｆ１マウスに注入された。薬物は、無菌の蒸留水（０．５ｍｌ）に溶解し、同様に、種々の濃度でＪ１〜Ｊ９までｉ．ｐ．経路を用いて毎日注入された。対照のマウスは、同じプロトコールに従って、蒸留水だけを受けた。
【０１０７】
処理したマウス及び対照マウスを毎日カウントした。Ｔ／Ｃ（処理されたマウスの生存の平均／対照マウスの生存の平均）をＪ９で計算した。Ｔ／Ｃ＞１２５％は、有意な抗腫瘍活性を示す。
この実験の結果を下記の表７に要約する。
【０１０８】
【表７Ａ】
【０１０９】
【表７Ｂ】
【０１１０】
このようにして、ＢＡ０１６ＤＤ５３７は、Ｂ１６メラノーマに対して顕著な抗腫瘍活性を示す。最適な用量である３．１２ｍｇ／ｋｇは、２１７％のＴ／Ｃを生じる。参照薬物セリプチウムは、このプロトコールを用いて、有意な抗腫瘍活性がない。
【０１１１】
実施例７：抗転移活性
Ｂ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞によって示される浸潤の表現型は、ｉ．ｖ．経路によって注入されるとき、肺で効率的に転移を形成する腫瘍細胞の能力によって特徴付けられる。抗浸潤性を評価するために、このプロセスに対する２−（ベータピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムメタンスルホネートの効果を試験した。
【０１１２】
実験プロトコール：
１００μｌのＢ１６Ｆ１０細胞の懸濁液（４．１０5細胞）をｉ．ｖ．経路を用いて、マウスの後眼窩洞に注入した。２−（ベータピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムメタンスルホネート（ＢＡ０１６ＦＺ５３９）溶液を５ｍｇ／Ｋｇ（第１実験）及び７．５ｍｇ／ｋｇ（第２実験）の投薬量で細胞注入後の２４時間及び７２時間でマウスにｉ．ｖ．投与した。対照群では、マウスは、生理学的な血清をｉｖ注入された。数日後、マウスを屠殺し、肺を摘出し、転移塊を解剖顕微鏡下でカウントした。
【０１１３】
【表８】
【０１１４】
使用された実験条件では、ＢＡ０１６ＦＺ５３９は、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞のｉ．ｖ．注入後の肺転移の有意な減少によって評価されるように、有意な抗浸潤活性を示す。
【０１１５】
実施例８：小細胞の肺癌細胞株に対する９−ヒドロキシエリプチシン誘導体のインビトロの抗増殖効果
ＢＡ０１６ＦＺ５３９（２−（ベータピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムメタンスルホネート）の抗腫瘍活性は、スルホルホダミン試験によって測定されるように、細胞増殖の阻害によって評価された。
【０１１６】
３つの小細胞の肺癌細胞株：ＮＣＩ−Ｈ５１０、ＮＣＩ−Ｈ４４６及びＮＣＩ−Ｈ１８７を試験した。
【０１１７】
小細胞の肺癌（ＳＣＬＣ）は、毎年診断される全ての肺癌の１５〜２５％を占める（Ｂｏｎｆｉｌｌ ｅｔ ａｌ．１９７５−１９７７及び１９８７−１９８９．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ６５：７５１−７５４，１９９６）。ＳＣＬＣ細胞株は、２つの主要なクラス：神経内分泌マーカーレベルの上昇を表す古典的なＳＣＬＣ細胞株（ＮＣＩ−Ｈ１８７及びＮＣＩ−Ｈ５１０）、１以上の神経内分泌マーカーを表さない変異ＳＣＬＣ細胞株にさらに分類することができる。
【０１１８】
いくつかの試験では、変異細胞株は、古典的な細胞株とは対照的に、インビトロで放射線耐性であり、ｃ−ｍｙｃ癌遺伝子（Ｃａｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４５，２９１３−２９２３，Ｊｕｎｅ １９８５）の発現増加があることを示している。
【０１１９】
材料及び方法：ＳＲＢアッセイ
スルホルホダミンＢ（ＳＲＢ）比色分析（Ｓｉｇｍａ）を用いて、増殖試験を行った。
ＳＲＢアッセイは、細胞のタンパク質含量の測定に基づいて、細胞密度測定のために用いられる。この方法は、９６ウェルフォーマットで接着細胞における化合物の毒性スクリーニングに最適化されていた（Ｓｋｅｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９８９，３０：２４３６）。
【０１２０】
濃度増加したＢＡ０１６ＦＺ５３９を添加しながら、約５００００個のＮＣＩ−Ｈ５１０、ＮＣＩ−Ｈ４４６又はＮＣＩ−Ｈ１８７細胞を９６ウェル培養プレートに播種した。
【０１２１】
インキュベーション時間後、細胞の単層を１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）トリクロロ酢酸で固定し、３０分間染色する。その後、過剰の色素を１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の酢酸で繰り返しの洗浄によって除去する。タンパク質に結合した色素は、マイクロプレートリーダーを用いて、５１０ｎｍで光密度測定（ＯＤ）に対して１０ｍＭ Ｔｒｉｓ系溶液に溶解される。
【０１２２】
増殖率は、未処理の細胞を１００％として用いて、ＯＤ読み取りから計算された。
ＳＲＢタンパク質染色アッセイは、様々なヒトの小細胞の肺癌細胞株のインビトロの化学的感受性試験のために、テトラゾリム（ＭＴＴ）比色分析と比較した。
【０１２３】
ＳＲＢアッセイは、ＭＴＴアッセイよりもいくつか利点がある。例えば、いくつかの化合物は、細胞生存率に対する影響を与えることなしに、ＭＴＴ還元と直接的に干渉することができるが、ＳＲＢ染色は、稀に、この種の干渉によって影響を及ぼす。さらに、ＳＲＢ染色は、細胞の運動活性に依存しない。
【０１２４】
結果：
【０１２５】
【表９】
【０１２６】
表９では、変異ＳＣＬＣ細胞株（ＮＣＩ−Ｈ４４６）は、古典的なＳＣＬＣ細胞株（ＮＣＩ−Ｈ５１０及びＮＣＩ−Ｈ１８７）よりもＢＡ０１６ＦＺ５３９に良好な耐性を示す。
【０１２７】
実施例９：膵癌細胞株に対する９−ヒドロキシエリプチシン誘導体のインビトロの抗増殖効果
ＢＡ０１６ＦＺ５３９（２−（ベータピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムメタンスルホネート）の抗腫瘍活性は、スルホルホダミン試験によって測定されるように、細胞増殖の阻害によって評価された。
２つの膵癌細胞株：ＭＩＡ ＰａＣａ−２及びＰＡＮＣ−１を調査した。
【０１２８】
材料及び方法：
ＭＩＡ ＰａＣａ−２及びＰＡＮＣ−１膵細胞の増殖に対するＢＡ０１６ＦＺ５３９の効果は、５００μＭ〜０．１６μＭの濃度範囲で試験され、ＳＲＢ比色分析を用いて測定された。
【０１２９】
濃度増加したＢＡ０１６ＦＺ５３９を添加しながら、約５０００ＭＩＡ ＰａＣａ−２又はＰＡＮＣ−１細胞を９６ウェル培養プレートに播種した。
膵細胞株の形態と数の変化は、顕微鏡観察で観察された（図５）。
【０１３０】
結果：
【０１３１】
【表１０】
【０１３２】
図５は、ＢＡ０１６ＦＺ５３９によるＭＩＡ ＰａＣａ−２細胞株における形質転換した表現型（図５、Ａ）から正常な表現型（図５、Ｂ）への復帰変異を示す。
【０１３３】
この効果は、ＭＩＡ ＰａＣａ−２細胞株にのみ観察され、ＰＡＮＣ−１細胞株では見られなかった。形質転換した表現型の復帰変異は、ここでは、より多くの細胞質の伸長及び細胞の広がり領域の増加を含む細胞形態の変化と関連している。このようにして、ＢＡ０１６ＦＺ５３９は、ＰＡＮＣ−１細胞株よりもＭＩＡ ＰａＣａ−２細胞株に対して、優れた抗腫瘍活性を示す（表１０）。
【０１３４】
結論として、ここに示されたデータは、ＢＡ０１６ＦＺ５３９が、ヒトの癌細胞株に対する複数の抗腫瘍活性を発揮することを示す。ＢＡ０１６ＦＺ５３９は、６〜２０μＭのＩＣ５０でＳＣＬＣ及び膵癌細胞の細胞増殖を有意に阻害することを見出した。これらの結果はまた、膵細胞株であるＭＩＡ ＰａＣａ−２の悪性表現型を復帰変異する能力を示唆する。ＢＡ０１６ＦＺ５３９で処理されたこれらの細胞は、細胞骨格編成の調節を示唆する形態変化を示す。
【０１３５】
実施例１０：細胞運動性のエクスビボ阻害
９−ヒドロキシエリプチシン誘導体は、分化誘導薬、特にビタミンＡ、その合成類似体、及び代謝物（レチノイド）、ビタミンＤ又はその類似体と併用して投与されてもよい。レチノイドは、例えば、全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）、Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）レチンアミド（４ＨＰＲ）、１３−シス−レチノイン酸（１３ＣＲＡ）又は９−シス−レチノイン酸（９ＣＲＡ）であってもよい。
【０１３６】
この実施例では、ＢＡ０１６ＤＤ５３７（２−（ベータピペリジノ−２−エチル）−９−ヒドロキシエリプチシニウムクロリド）と上記のレチノイドとの組み合わせの効果を試験した。
【０１３７】
材料及び方法：
レチノイド１３ＣＲＡとＡＴＲＡの存在下でＢＡ０１６ＤＤ５３７によるエクスビボの細胞生存性の阻害は、３−（４，５ジメチルチアゾール−２−イル）−２．５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）比色分析を用いて、Ｂ１６ＢＬ６メラノーマ細胞株に対して試験された。
【０１３８】
１０ｎＭのレチノイドの有無で、１ｐＭ〜１００ｐＭの濃度増加したＢＡ０１６ＤＤ５３７を添加する前の２４時間、９６ウェル培養プレートに約１０００個の細胞を播種した。３７℃で３日間、プレートをインキュベートした。１０μｌのＭＴＴストック溶液（リン酸緩衝生理食塩水中の５ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルの９０μｌの完全培地に添加し、３時間、３７℃でインキュベーションを継続した。１００μｌの溶解バッファー（２０％ドデシル硫酸ナトリウム、１０ｍＭ ＨＣｌ、１×ＰＢＳ）を各ウェルに添加し、プレートを一晩インキュベートした。吸光度は、５７０ｎｍの波長で、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＥＩＡ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ）を用いて測定された。
【０１３９】
結果
Ｂ１６ＢＬ６浸潤性メラノーマ細胞株は、高い浸潤性表現型を示す。相乗効果アッセイの目的は、ＢＡ０１６ＤＤ５３７の最小濃度で腫瘍細胞の生存性を阻害することであった。１０ｎＭのレチノイド１３ＣＲＡ及びＡＴＲＡだけの存在下では、細胞の生存性の阻害は観察されなかった。１０ｎＭのレチノイドの存在下で、ＢＡ０１６ＤＤ５３７のより低い投薬量での細胞処理は、腫瘍細胞の生存性の阻害を増加する結果となる（図６）。
【０１４０】
同時に、レチノイドがない場合に、最小濃度のＢＡ０１６ＤＤ５３７の活性は観察されなかった。１００ｎＭのＢＡ０１６ＤＤ５３７の効果は、ＡＴＲＡ １０ｎＭの存在下の１ｐＭと同じであった。このようにして、ＢＡ０１６ＤＤ５３７の投薬は、レチノイドなしで用いた場合より同じ結果を得るために、レチノイドを併用した場合、１０００００倍減少することができる。
【０１４１】
実施例１１：２つの９−ヒドロキシエリプチシン誘導体：モノメシレート及びビメシレートの生物学的活性の比較
２つのエリプチシン誘導体である、ＢＡ０１６ＦＺ５３９（２−（ベータピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムメタンスルホネート、又は「モノメシレート」）及び対応するビメシレート誘導体：
【０１４２】
【化９】
【０１４３】
（以下、「ビメシレート」）の抗腫瘍活性は、２つの独立した実験を用いて評価された。半固体培地におけるコロニー形成の阻害は、マウスのメラノーマ細胞株Ｂ１６Ｆ１０上でクローニングアッセイを用いて初めに評価された。
【０１４４】
第２に、２つのヒト膵細胞株（ＭＩＡ ＰａＣＡ−２及びＰＡＮＣ１）及び１つのマウスのメラノーマ細胞株（Ｂ１６Ｆ１０）の細胞増殖は、ＳＲＢ及びＭＴＴ試験を用いて、モノメシレート及びビメシレートの存在下で定量された。
【０１４５】
材料及び方法：
クローニングアッセイ
０．８％のメチルセルロース（Ｍｅｔｈｏｃｅｌ ＭＣ４０００、Ｓｉｇｍａ）で補足された完全培地に細胞を埋め込まれ、３重で３５ｍｍディッシュに播種し、３７℃、加湿した５％ＣＯ2雰囲気下でインキュベートした。播種した細胞数は、１０００細胞／ディッシュであった。９日後、マウスのメラノーマ細胞株Ｂ１６Ｆ１０の肉眼で見えるコロニーをカウントした。
【０１４６】
ＭＴＴ及びＳＲＢ試験
ＭＴＴ及びＳＲＢ比色分析（Ｓｉｇｍａ）を用いて増殖試験を行った。濃度増加したモノメシレート又はビメシレートを添加する前に、９６ウェルの培養プレートに約１５００個のＢ１６Ｆ１０又は３０００個の膵細胞（ＭＩＡ ＰａＣａ−２及びＰＡＮＣ１）を播種した。
【０１４７】
プレートを３７℃で３日間インキュベートし、次に、ＳＲＢ又はＭＴＴプロトコール（材料及び方法を参照）に従って処理した。
【０１４８】
これらの２つの例では、増殖率は、未処理の細胞を１００％として用いて、ＯＤ読み取りから計算された。
【０１４９】
結果：
【０１５０】
【表１１】
【０１５１】
Ｂ１６Ｆ１０細胞は、ＳＲＢ及びＭＴＴアッセイの両方で試験され、ＰＡＮＣ１はＳＲＢアッセイのみで調査された。モノメシレート及びビメシレートのＩＣ５０の間に有意な差はなかった。
【０１５２】
【表１２】
【０１５３】
モノメシレート及びビメシレートは、半固体培地におけるコロニー形成に対して類似の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を示し、それぞれ６７及び２１ｎＭであった。
【０１５４】
浸潤性メラノーマ細胞株Ｂ１６Ｆ１０の増殖に対する顕著な阻害効果は、これらの２つの薬物の存在下でメチルセルロースにおいて効果的に観察された。
【０１５５】
また、コロニー形成の阻害は、ＭＴＴ試験を用いて測定される非増殖濃度で生じることを本発明者らのデータは検証した。
【０１５６】
結果として、モノメシレート及びビメシレートは、クローニングアッセイ及び細胞増殖試験の結果に関して、同じ生物学的活性を有する。
【０１５７】
これらのデータを一緒にすると、エリプチシン誘導体は抗腫瘍剤として開発に潜在性を有することを強く示唆している。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００６年８月２１日に出願された米国仮出願第６０／８３８，８６０号に対する利益を主張するものとし、その開示は、本明細書に十分に記載されるとすれば、参照により全体として本明細書中に援用される。
【０００２】
本発明は、癌を治療するための９−ヒドロキシエリプチシン誘導体の使用に関する。これらの９−ヒドロキシエリプチシン誘導体は、転移癌又は従来の細胞毒素を有する化学療法を回避した癌に治療に特に有用であることが分かる。
【背景技術】
【０００３】
癌でない細胞では、細胞外マトリックス及び隣接する細胞への接着は、細胞の生存、増殖、分化及び運動性の調節に中心的な役割を果たす（Ｋ．Ａ．Ｂｅｎｉｎｇｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５３（２００１），ｐｐ．８８１−８８８；Ｓ．Ｍ．Ｆｒｉｓｃｈ ａｎｄ Ｒ．Ａ．Ｓｃｒｅａｔｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３（２００１），ｐｐ．５５５−５６２、及びＦ．Ｍ．Ｗａｔｔ，ＥＭＢＯ Ｊ．２１（２００２），ｐｐ．３９１９−３９２６）。発癌性形質転換に応じて、細胞形態及び細胞骨格の編成、細胞運動性及び増殖因子又は接着依存性の細胞増殖において、著しい変化が生じる（総説としては、Ｇ．Ｐａｗｌａｋ ａｎｄ Ｄ．Ｍ．Ｈｅｌｆｍａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．１１（２００１），ｐｐ．４１−４７を参照されたい）。アクチン細胞骨格の崩壊及び接着斑数の同時減少は、種々の癌遺伝子によって誘導される細胞の形質転換を伴う共通の特徴である。アクチン細胞骨格が、腫瘍形成において基本的な役割を果たすことは、形質転換した細胞において、足場に依存しない増殖及び腫瘍原性とアクチンフィラメントネットワークの再配列との関連性によって示唆される（Ｐ．Ｋａｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．３６（１９８３），ｐｐ．６０５−６１１）。接着相互作用は、接合斑タンパク質を介した細胞骨格に連結している特定の膜貫通受容体を必要とする（総説としては、Ｎａｇａｆｕｃｈｉ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３（２００１），ｐｐ．６００−６０３を参照されたい）。α−アクチニン、ビンキュリン、トロポミオシン及びプロフィリンを含むいくつかのアクチン結合タンパク質の合成は、形質転換した細胞においてダウンレギュレートされ、腫瘍細胞におけるこれらのタンパク質の過剰発現により、腫瘍抑制因子として考えることができる形質転換した表現型が抑制される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
エリプチシンは、Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅファミリーの常緑樹から単離された天然の植物性アルカロイド産物であり、式（Ｉ）：
【０００５】
【化１】
【０００６】
を有する。
【０００７】
エリプチシンは、細胞毒性及び抗癌活性を有することが見出された（Ｄａｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，１９６７，２０，２７１５）。
【０００８】
９位でヒドロキシル化されたエリプチシン誘導体（９−ヒドロキシルエリプチシニウム）は、多くの実験腫瘍に関して、エリプチシンよりも高い抗腫瘍活性を有することが見出されたが（Ｌｅ Ｐｅｃｑ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，１９７４，７１，５０７８−５０８２）、ヒト癌を治療するには制限された活性を示すことが見出された（Ｌｅ Ｐｅｃｑ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９７６，３６，３０６７）。
【０００９】
ヒトの治療に適切であるエリプチシン誘導体を同定し、あるヒト癌の治療、特に乳癌の骨転移の治療に用いられているセリプチウム（Ｃｅｌｉｐｔｉｕｍ）、即ち、Ｎ２−メチル−９−ヒドロキシエリプチシニウム（ＮＭＨＥ）へと導くための研究が行われた。したがって、９−ヒドロキシエリプチシンから誘導される一連の化合物が開発され、それらは、式（ＩＩ）：
【００１０】
【化２】
【００１１】
（式中、
Ｒ及びＲ１は、水素又はアルキル基であり、Ｒ２は、場合により置換されたアルキル基であり、Ｘ-は、４級アニオンである）
を有していた。これらの化合物は、米国特許第４，３１０，６６７号に記載されている。
【００１２】
これらの化合物の平面の多環構造は、インターカレーションを介してＤＮＡと相互作用することが見出された。さらに、これらの化合物は、作用の複数の様式で関連していることが判明し、例えば、ＤＮＡ結合、酸化的酸素種の発生及び酵素機能の修飾；最も顕著にはトポイソメラーゼＩＩ及びテロメラーゼが含まれる（例えば、Ａｕｃｌａｉｒ，１９８７，Ａｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，２５９，１−１４を参照されたい）。
【００１３】
薬理学的には、多数の中毒性副作用は問題であることが示されている。特に、セリプチウムは、腎臓毒性を誘導することが分かった。しかしながら、いくつかのエリプチシン誘導体、例えば２−（ジエチルアミノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウム−クロリド（Ａｕｃｌａｉｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４７，６２５４−６２６１）は、動物において改善された安全性及び抗癌活性を有することが判明した。２−（ジエチルアミノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウム−クロリドの改善された性質が、フェーズＩ試行のために選択させるものであったが、この化合物の開発は中止された。
【００１４】
他の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体、例えば２−（ジエチルアミノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムアセテート、２−（ジイソプロピルアミノ−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムアセテート及び２−（ベータピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムは、例えば、米国特許第４，３１０，６６７号に記載されている。
【００１５】
ヒトの癌に対して有効であり、制限された中毒性副作用を有する薬物の開発は、重要な要件が残されている。このチャレンジは、特に、主として非細胞毒性プロセスを介して作用する抗癌剤の同定を成功することである。この調査の分野において、本発明者らは、細胞の表現型の変化、より具体的には細胞骨格の構造変化は、腫瘍進行の基礎となる主要な分子メカニズムの１つであり、適切な標的プロセスとなり得ると仮定した。
【００１６】
本発明者らは、限られた数の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体が非細胞毒性プロセス（即ち、細胞における生物学的損傷には直結しない）、例えば、アクチンネットワークの再構成、それによる接着の救援及び運動性制御の結果である腫瘍細胞の表現型の復帰変異（ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ）を誘導することによって媒介される抗癌活性を有することを予期せずに示した。さらに、表現型の復帰変異は、非細胞毒性濃度、即ち、細胞増殖及び細胞生存の両方にほとんど影響しない濃度で得られる。
【００１７】
このようにして、本発明者らによって同定された９−ヒドロキシエリプチシン誘導体は、主として非細胞毒性プロセスを介した抗癌剤作用を提供する。
【００１８】
エリプチシン誘導体
非細胞毒性濃度で悪性表現型の復帰変異を誘導するものとして同定された９−ヒドロキシエリプチシン誘導体は、式（ＩＩＩ）：
【００１９】
【化３】
【００２０】
（式中、
Ｘは、２又は３個の炭素原子を有するアルキル基であって、場合により分岐していてもよく、場合によりＯＨ、ＮＲＲ’、ＣＮ、ＯＲ、ＣＯＯＲで置換されてもよく、ここで、Ｒ及びＲ’は、独立してＨ又はＣ１−Ｃ４アルキル基であり；
Ｙは、−ＮＲ１Ｒ２であり、ここで、Ｒ１及びＲ２は、独立してＨ又はＣ１−Ｃ６アルキル基であるか、あるいはＲ１及びＲ２は、それらが結合しているＮ原子と一緒になって、飽和若しくは不飽和の５又は６員の複素環を形成し、ここで、−ＮＲ１Ｒ２は、式（Ｉ）で表される化合物が酸付加塩の形態となるように、医薬として許容される無機物又は有機酸の付加から得られる第４級アンモニウム塩の形態であってもよく；
あるいは、Ｙは、ベンジル、フェニル又はＣ５若しくはＣ６アリール又は５若しくは６−ヘテロアリール基であり；及び
Ｚ-は、医薬として許容される無機物又は有機酸の陰イオンであり；
−Ｘ−Ｙ側鎖は、必要に応じて、Ｔ、Ｕ、Ｖ又はＷに結合され；
Ｔ、Ｕ、Ｖ及びＷは、ピリジル環を形成するようにＣ原子又はＮ原子であり、残りのＴ、Ｕ、Ｖ及び／Ｗは、Ｃ原子であり、
ただし、−Ｘ−Ｙ側鎖は、Ｎ原子であるＴ、Ｕ、Ｖ及びＷの１つと結合しており、
理解されるように、
【化４】
は、必要に応じて、単結合又は二重結合を表し、その結果、縮合したピリジル環とともに形成した系は芳香族となり、生じる陽イオン：
【化５】
が形成される）
を有し、場合により酸付加塩の形態であってもよい。
【００２１】
一態様によれば、本発明の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体は、式（ＩＶ）：
【００２２】
【化６】
【００２３】
（式中、
Ｘは、２又は３個の炭素原子を有するアルキル基であって、場合により分岐していてもよく、場合によりＯＨ、ＮＲＲ’、ＣＮ、ＯＲ、ＣＯＯＲで置換されてもよく、ここで、Ｒ及びＲ’は、独立してＨ又はＣ１−Ｃ４アルキル基であり；
Ｙは、−ＮＲ１Ｒ２であり、ここで、Ｒ１及びＲ２は、独立してＨ又はＣ１−Ｃ６アルキル基であるか、あるいはＮ、Ｒ１及びＲ２は、場合により一緒になって、飽和若しくは不飽和の５又は６員の複素環を形成し、ここで、−ＮＲ１Ｒ２は、式（Ｉ）で表される化合物が酸付加塩の形態となるように、医薬として許容される無機物又は有機酸の付加から得られる第４級アンモニウム塩の形態であってもよく；
あるいは、Ｙは、ベンジル、フェニル又はＣ５若しくはＣ６アリール又は５若しくは６−ヘテロアリール基であり；及び
Ｚ-は、医薬として許容される無機物又は有機酸の陰イオンである）
を有する。
【００２４】
本明細書中で使用するとき、「アルキル」とは、鎖中に約１〜２０個の炭素原子を有する、線状又は分岐状であってもよい脂肪族炭化水素を意味する。好ましいアルキル基は、鎖中に１〜約１２個の炭素原子、さらに好ましくは１〜６個の炭素原子を有する。分岐とは、メチル、エチル又はプロピルなどの１個又は低級アルキル基が線状のアルキル鎖に結合したものを意味する。「低級アルキル」とは、線状又は分岐状であってもよい、約１〜約４個の炭素原子を意味する。アルキルは、同じであるか又は異なっていてもよい１以上のアルキル基置換基で置換されてもよく、例えば、ハロ、シクロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アシルアミノ、アロイルアミノ、カルボキシが挙げられる。
【００２５】
「アリール」とは、約５〜約１４個の炭素原子、好ましくは約６〜約１０個の炭素原子の芳香族単環式又は多環式環系を意味する。アリールは、同じであるか又は異なっていてもよい１以上の置換基で場合により置換され、本明細書中に記載されている通りである。例示的なアリール基には、フェニル若しくはナフチル、又は置換されたフェニル若しくは置換されたナフチルが挙げられる。
【００２６】
本明細書中で使用するとき、用語「ヘテロアリール」とは、５〜１４員、好ましくは５〜１０員の芳香族ヘテロ、単環式、二環式又は多環式環を指し、１個の水素原子の除去によって形成される。例としては、ピロリル、ピリジル、ピラゾリル、チエニル、ピリミジニル、ピラジニル、テトラゾリル、インドリル、キノリニル、プリニル、イミダゾリル、チエニル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、フラニル、ベンゾフラニル、１，２，４−チアジアゾリル、イソチアゾリル、トリアゾイル、テトラゾリル、イソキノリル、ベンゾチエニル、イソベンゾフリル、ピラゾリル、カルバゾリル、ベンズイミダゾリル、イソキサゾリルなどが挙げられる。
【００２７】
「医薬として許容される」とは、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などなしに、ヒト及びより下等な動物の細胞と接触させる使用に適切であることを意味し、合理的な損益比で釣り合いがとれている。
【００２８】
医薬として許容される無機物又は有機酸は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸、ヘキサフルオロリン酸、硝酸、カルボン酸、クエン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、酢酸、シュウ酸、マレイン酸、フマル酸、コハク酸、酒石酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、乳酸、マロン酸、安息香酸、シクロヘキサンスルファミン酸、及び桂皮酸からなる群から選択されてもよい。（例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ，ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ”，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，６６：ｐ．１−１９（１９７７）を参照されたい。）上記の一般式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）において、
− Ｚ-は、上記酸から誘導される対応する一価の陰イオンである。
【００２９】
好ましくは、上記式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）において、Ｚ-は、メタンスルホネート（メシラート、ＣＨ3ＳＯ3-とも呼ばれる）であり；さらに、
− −ＮＲ１Ｒ２は、上記で定義される医薬として許容される無機物又は有機酸、好ましくはメタンスルホン酸の添加から生じる第４級アンモニウムの形態であってもよく、その結果、式（Ｉ）で表される化合物は二価の正電荷を有することが可能となる。
【００３０】
上記の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体において、Ｘは、好ましくはエチル又はプロピルである。
【００３１】
Ｙがアリール基である場合、Ｙは、好都合には、ピリジン及びピリミジンからなる群から選択されてもよい。
【００３２】
Ｙが、−ＮＲ１Ｒ２である場合、好都合には、Ｒ１及びＲ２のそれぞれは、エチル基であってもよく、あるいは、Ｙはピペリジン又はピロリジン基であってもよい。
【００３３】
ある種の態様によれば、Ｘはエチルであり、Ｙはジエチルアミノ、ピロリジニル、ベンジル、フェニル、ピペリジン、ピリジン及びピリミジンからなる群から選択される。
【００３４】
また、ある種の態様によれば、Ｘはプロピルであり、Ｙはジエチルアミノ、ピロリジニル、ベンジル、フェニル、ピペリジン、ピリジン及びピリミジンからなる群から選択される。
【００３５】
好ましい９−ヒドロキシエリプチシン誘導体は、下記：
【００３６】
【化７】
【００３７】
であり、得られるそれらの第４級アンモニウム塩であり、式中、Ｚ-は、上記の一価の陰イオンから選択される。
【００３８】
より具体的には、本発明の使用のために、９−ヒドロキシエリプチシン誘導体は、２−（ジエチルアミノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムクロリド、２−（ジエチルアミノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムメタンスルホネート、２−（ベータピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムクロリド、２−（ベータピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムメタンスルホネート及び得られるそれらの第４級アンモニウム塩であってもよい。
【００３９】
さらに、好ましい９−ヒドロキシエリプチシン誘導体は、２−（ジエチルアミノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムメタンスルホネート、２−（ベータピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムクロリド、及び２−（ベータピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムメタンスルホネート、並びに得られるそれらの第４級アンモニウム塩である。
【００４０】
より好ましくは、本発明に係る９−ヒドロキシエリプチシン誘導体は、
【００４１】
【化８】
【００４２】
である。
【００４３】
９−ヒドロキシエリプチシン誘導体を調製する方法は、例えば、米国特許第４，３１０，６６７号に記載されている。
【００４４】
処置方法
上記の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体は、腫瘍細胞においてアクチン細胞骨格のリモデリングを誘導し、それにより、細胞運動性の減少及び細胞接着の回復へと導く。このプロセスは、インビボにおいて、最終的には、ＴＣＬ毒性効果を伴う可能性のある宿主の免疫応答から誘導される種々のメカニズムから生じる腫瘍細胞の選択的アポトーシスへと導く。
【００４５】
このようにして、本発明は、癌の治療が意図された薬剤を製造するための、式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体の使用に関する。本発明はまた、癌を治療し、腫瘍細胞の悪性表現型を復帰変異することによって癌を治療する方法に関し、それを必要とする被験者に、上記で定義される治療的に有効な量の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体を投与することを含む。しかしながら、この使用及び方法では、９−ヒドロキシエリプチシン誘導体は、２−（ジエチルアミノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムクロリド、２−（ジエチルアミノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムアセテート、２−（ジイソプロピルアミノ−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムアセテート、及び２−（ベータピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムアセテートではないことが好ましい場合がある。
【００４６】
さらに、本発明は、腫瘍細胞の悪性表現型が復帰変異されることが意図される薬剤を製造するための、式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体の使用に関する。本発明はまた、腫瘍細胞の形質転換した表現型を復帰変異する方法に関し、それを必要とする被験者に、上記で定義される治療的に有効な量の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体を投与することを含む。
【００４７】
本明細書中で使用するとき、用語「被験者」とは、哺乳動物、例えば、げっ歯類、ネコ、イヌ、及びブタを指す。好ましくは、本発明に係る被験者は、ヒトである。
【００４８】
本発明との関連で、用語「治療すること」又は「治療」とは、本明細書中で使用するとき、このような用語が適用される障害若しくは状態、又はこのような障害若しくは状態の１以上の症状を回復させ、軽減させ、それらの進行を阻害することを意味する。
【００４９】
「治療的に有効な量」とは、特定の障害又は疾患の症状の改善をもたらすのに十分である化合物の量を指す。好都合には、本発明の治療法は、細胞に毒性のない量の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体、即ち、細胞増殖及び細胞生存の両方にほとんど影響がない濃度を用いて実施されてもよい。
【００５０】
本明細書中で使用するとき、用語「形質転換された表現型」とは、（ｉ）細胞形態、及び／又は（ｉｉ）細胞骨格の編成、及び／又は（ｉｉｉ）細胞運動、及び／又は（ｉｖ）増殖因子若しくは接着依存性の細胞増殖において生じる可能性がある変化を指す。この形質転換された表現型は、腫瘍細胞の特徴である。
【００５１】
細胞形態の変化の例には、より丸くなった形状、細胞質拡張の低下、広がった領域の減少、及び細胞／細胞接触の低減を示す細胞が含まれる。細胞骨格編成の変化は、特に、アクチン細胞骨格の崩壊である場合があり、これは、典型的には、接着斑の数の同時減少と関連付けられる。
【００５２】
「腫瘍細胞の形質転換された表現型の復帰変異」とは、腫瘍細胞を正常な（即ち、腫瘍でない）細胞の表現型に回復させることを意味する。９−ヒドロキシエリプチシン誘導体による形質転換された表現型の復帰変異は、特に、アクチンネットワークの再配列によって誘導される。
【００５３】
形質転換された表現型の復帰変異は、当該技術分野において容易に知られるアッセイ法を用いる技術によって評価可能である。
【００５４】
これらの方法には、例えば：
−半固体又は軟寒天増殖アッセイ（クローン性アッセイ）；
−細胞運動アッセイ；
−国際出願公開ＷＯ２００４／０５７３３７に記載されている、細胞溶解物中の固定された重合アクチンの測定法、ここで、この方法は、腫瘍の攻撃性の指標から構成される。要約すると、この方法は、非変性条件下で細胞を溶解し、溶解物の全タンパク質濃度を調整し、蛍光標識したアクチン単量体及び内因性アクチンの重合に必要な成分（例えば、ＡＴＰ）を添加し、重合したアクチンを測定することを含む；
−アクチン、ジキシン（ｚｙｘｉｎ）、アクチニン又はＢ−カテニンラベリング、その後の慣用的な手法による顕微鏡観察による細胞の形態変化及び細胞骨格変性の評価
が含まれる。
【００５５】
本発明に係る医薬又は方法は、腫瘍細胞の選択的アポトーシスを誘導し、それにより、癌を治療するための非細胞毒性的な方法を提供する。
【００５６】
本発明によれば、腫瘍細胞は、いずれかの腫瘍、例えば、原発性若しくは転移腫瘍、固形腫瘍若しくは軟部組織腫瘍又は白血病起源の細胞であってもよい。固形又は軟部腫瘍細胞の例には、膀胱、乳房、骨、脳、頸部、結腸直腸、子宮内膜、腎臓、肝臓、肺、神経系、卵巣、前立腺、睾丸、甲状腺、子宮、膵臓及び皮膚の癌細胞が挙げられる。白血病には、例えば、慢性骨髄増殖性疾患、骨髄異形成症候群、急性リンパ性白血病、Ｂ−細胞急性リンパ性白血病、Ｔ−細胞急性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、及び慢性リンパ増殖性疾患が含まれる。
【００５７】
９−ヒドロキシエリプチシン誘導体に最も応答性があると期待される腫瘍細胞は、細胞骨格崩壊、細胞運動の増加及び／又は細胞−細胞接着の減少と関連した浸潤性の表現型によって特徴付けられるものであり、それは、攻撃性肉腫、及び転移の初期段階で発生する上皮−間充織転移中に観察される場合があるためである。
【００５８】
細胞の悪性表現型を復帰変異する能力に準じて、本明細書中に記載される９−ヒドロキシエリプチシン誘導体は、真の抗浸潤剤を構築することは、本発明の利点である。したがって、一態様によれば、腫瘍細胞は転移細胞である。よって、本発明に係る医薬又は方法は、転移の治療が意図され得る。
【００５９】
さらに、本明細書に定義される９−ヒドロキシエリプチシン誘導体は、非細胞毒性プロセスによって媒介される抗癌活性を有する。これらの化合物は、好都合には、ＤＮＡ結合剤、特にアルキル化若しくはインターカレーティング剤、代謝拮抗剤、例えばＤＮＡポリメラーゼ阻害剤、又はトポイソメラーゼＩ若しくはＩＩ阻害剤などのＤＮＡ複製の阻害剤、あるいはアルカロイド類などの抗分裂剤を用いる従来の細胞毒性を有する化学療法を回避した被験者における癌を治療するために投与されてもよい。これらの細胞毒性化合物には、例えば、アクチノマイシンＤ、アドリアマイシン、ブレオマイシン、カルボプラチン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、ドキソルビシン、エトポシド、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリンメルファラン、メトトレキセート、パクリタキセル、タキソテレ、ビンブラスチン、及びビンクリスチンが挙げられる。
【００６０】
本明細書中で使用するとき、用語「細胞毒性を有する化学療法を回避した被験者」とは、特に、細胞毒性を有する化学療法が腫瘍進行を変更しない被験者を指す。
【００６１】
本明細書に定義される１以上の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体は、治療を受けるべき被験者に同時に又は連続して投与されてもよい。
【００６２】
さらに、９−ヒドロキシエリプチシン誘導体は、分化誘導薬、特に、ビタミンＡ、その合成類似体、及び代謝物（レチノイド類）、ビタミンＤ若しくはその類似体、又はペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ）リガンドを組み合わせて（即ち、同時に又は連続して）投与されてもよい。
【００６３】
レチノイドは、例えば、全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）、Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）レチンアミド（４ＨＰＲ）、１３−シス−レチノイン酸（１３−ＣＲＡ）又は９−シス−レチノイン酸（９−ＣＲＡ）であってもよい。
【００６４】
ビタミンＤ又はその類似体には、特に、２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３）が含まれ、これは、ビタミンＤ３から通常は形成されるジヒドロキシル化された代謝物であり、１アルファ−ヒドロキシ−ビタミンＤ３、１アルファ−ヒドロキシビタミンＤ２、１アルファ−ヒドロキシビタミンＤ５、フッ素化ビタミンＤ誘導体である。
【００６５】
ＰＰＡＲリガンドは、特にＰＰＡＲα又はＰＰＡＲγアクチベーターである。選択的なＰＰＡＲγアゴニストには、クラシックなＴＺＤ（トログリタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、及びシグリチゾン；Ｆｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃｅｌｌ，８３：８０３−８１２；Ｌｅｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１２９５３−１２９５６を参照されたい）及び非ＴＺＤ型アゴニストが含まれる。後者の代表的なものには、Ｎ−（２−ベンゾイルフェニル）−Ｌ−チロシン誘導体、例えばＧＷ１９２９、ＧＩ２６２５７０、及びＧＷ７８４５が含まれ、今日までに同定された最も強力であり、選択的なＰＰＡＲγアゴニストの中にある（Ｈｅｎｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４１：５０２０−５０３６；Ｃｏｂｂ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４１：５０５５−５０６９を参照されたい）。ＧＷ２０２７、２，３−二置換インドール−５−カルボン酸はまた、強力かつ選択的なＰＰＡＲγアゴニストである（Ｈｅｎｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，９：３３２９−３３３４）。フィブレート又はファルネゾールは、ＰＰＡＲαアゴニストの例である。
【００６６】
したがって、本発明に従って有用な９−ヒドロキシエリプチシン誘導体はまた、別の化合物と混合されて、医薬組成物（希釈剤又は担体の有無を問わず）を形成することができ、投与されると、本発明の併用療法をもたらす有効成分の組み合わせの同時投与を提供する。特に、本発明は、上記で定義される式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体、及び分化誘導薬を含む医薬組成物を提供する。
【００６７】
同時投与に加えて、本発明に従って有用な９−ヒドロキシエリプチシン誘導体はまた、別の治療化合物、特に上記で定義される分化誘導薬と別々に又は連続して投与されてもよい。このようにして、本発明は、さらに、癌の治療、特に腫瘍細胞の形質転換した表現型を復帰変異するのに有用な同時の、別々の又は連続した使用のための組み合わせた調合物として、式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体、及び分化誘導薬を含む生成物を提供する。
【００６８】
９−ヒドロキシエリプチシン誘導体を単独で投与することは可能ではあるが、医薬組成物として提示することが好ましい。本発明に従って有用な、獣医用及びヒト用の医薬組成物は、上記で定義される少なくとも１つの９−ヒドロキシエリプチシン誘導体、及び１以上の医薬として許容される担体、場合により他の治療成分を含む。
【００６９】
ある種の好ましい態様では、併用療法に必要な有効成分は、同時投与のための１つの医薬組成物において組み合わせることができる。
【００７０】
本明細書中で使用するとき、「医薬として許容される」及び文法的にその変形は、それらが、組成物、担体、希釈剤及び試薬を意味する場合、交換可能に用いられ、材料が吐き気、目眩、異常亢進などの望ましくない生理学的な効果を生じることなしに、哺乳動物に又はその上に投与することができることを示す。
【００７１】
本明細書に開示され又は散見される有効成分を含む医薬組成物の調製は、当該技術分野において十分に理解され、製剤に基づいて限定されることを要しない。典型的には、このような組成物は、液体溶液又は懸濁液として注射可能なものとして調製される。しかしながら、使用前に溶液、又は懸濁液適した、液体に含まれる固体形態も好ましい。この調製物はまた、乳化することができる。特に、医薬組成物は、固体剤形、例えばカプセル、錠剤、丸薬、粉末、糖衣錠又は顆粒で調合されてもよい。
【００７２】
ビヒクルの選択、及びビヒクル中の活性物質の内容物は、一般に、活性化合物の溶解性及び化学的性質、投与の特別な様式、及び薬務において順守されるべき規定に従って測定される。例えば、賦形剤、例えばラクトース、クエン酸ナトリウム、カルボン酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、及び崩壊剤、例えばスターチ、アルギン酸、及びある種の複合ケイ酸塩は、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及びタルクなどの潤滑剤ととともに、錠剤の調製に使用されてもよい。カプセルを調製するために、ラクトース及び高分子量のポリエチレングリコールを用いることは有利である。水性懸濁液を用いる場合、それらに乳化剤、又は懸濁を促進する薬物を含めることができる。スクロース、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール及びクロロホルム又はそれらの混合物などの希釈剤も使用可能である。
【００７３】
医薬組成物は、経口、直腸、鼻腔、口腔、膣、非経口（例えば、皮下、筋内、静脈、皮内、髄腔及び硬膜外）、嚢内及び腹腔を含む局所又は全身投与によって、ヒト及び動物に適切な製剤で投与することができる。好ましい経路は、例えば、受領者の状態に基づいて変更されてもよいことは承認される。
【００７４】
この製剤は、製薬の技術分野において周知である方法のいずれかによって単位剤形で調製され得る。このような方法には、１以上の副成分を構成する担体と有効成分とを関連付けさせる工程を含む。一般に、製剤は、有効成分と、液体担体若しくは微細に分割した固体担体又はその両方と均一又は密接に関連付け、必要に応じて、製造物を成形することによって調製される。
【００７５】
１回又は分割した投薬量で被験者に投与される９−ヒドロキシエリプチシン誘導体の毎日の総服用量は、例えば、毎日約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、さらに好ましくは０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ／日、特に０．１〜１ｍｇ／ｋｇ／日、又は１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の量であってもよい。毎日の服用量の例は、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１２５ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．２５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、及び１０ｍｇ／ｋｇである。服用単位組成物は、さらに複数回の量を含んでもよく、毎日の服用量を作るように用いてもよい。しかしながら、任意の特定の患者に対する具体的な投薬レベルは、体重、一般的な健康、性別、食事、投与時間及び経路、吸収及び排出の速度、他の薬物との組み合わせ、治療されるべき特定の疾患の重症度を含む様々な因子に依存することは理解されよう。
本発明は、下記の実施例を考慮してさらに例証される。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】ＢＡ０１６ＤＤ５３７（２−（β−ピペリジノエチル）−９−ヒドロキシエリプチシニウムクロリド）の構造を示す。
【図２】ＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ抽出物におけるＢＡ０１６ＤＤ５３７によるアクチン重合の時間経過の描写である。重合バッファーとＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ抽出物と一緒にＢＡ０１６ＤＤ５３７をゼロ時に添加した。反応混合物は、下記の記号で示された濃度のＢＡ０１６ＤＤ５３７を含む：１００ｎＭ ＢＡ０１６ＤＤ５３７（黒三角）、２００ｎＭ ＢＡ０１６ＤＤ５３７（黒菱形）、対照の悪性ＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ細胞（黒逆三角）、対照の正常ＮＩＨ３Ｔ３細胞（黒四角）。データは、平均±標準偏差を示す；ｎ＝３。
【図３】ＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ抽出物における１００ｎＭ ＢＡ０１６ＤＤ５３７（黒菱形）、２００ｎＭ ＢＡ０１６ＣＡ１０７（白四角）、及び２００ｎＭ ＢＡ０１６ＣＡ７７（＊）によるアクチン重合の時間経過の描写である。重合バッファーとＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ抽出物と一緒に薬物をゼロ時に添加した。対照の悪性ＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ細胞（白三角）、対照の正常ＮＩＨ３Ｔ３細胞（白丸）も示される。データは、平均±標準偏差を示す；ｎ＝３。
【図４】ＢＡ０１６ＤＤ５３７で処理した又は処理していないＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ細胞におけるアクチン線維の蛍光顕微鏡試験であり、対照のＮＩＨ３Ｔ３細胞と比較した。形質転換されたＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ細胞において、ＢＡ０１６ＤＤ５３７はアクチン線維を増加させる。正常及び悪性ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、アクチン線維を視覚化するためにＦＩＴＣ−パロイジンを用い、核を視覚化するためにＤａｐｉを用いて、インサイチューの免疫蛍光によって分析した。（Ａ）対照の悪性ＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ細胞；（Ｂ）対処の正常ＮＩＨ３Ｔ３細胞；（Ｃ）１００ｎＭ ＢＡ０１６ＤＤ５３７で処理した悪性ＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ細胞；（Ｄ）２００ｎＭ ＢＡ０１６ＤＤ５３７で処理した悪性ＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ細胞。
【図５】ＢＡ０１６ＦＺ５３９（２−（ベータピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムメタンスルホネート）によって処理されたＭＩＡ ＰａＣａ−２細胞の形態変化を示す。Ａ：対照、Ｂ：４μＭ ＢＡ０１６ＦＺ５３９で３日間処理された細胞（２００×）。
【図６】１３ＣＲＡ及びＡＴＲＡの有無でＢＡ０１６ＤＤ５３７（２−（ベータピペリジノ−２−エチル）−９−ヒドロキシエリプチシニウムクロリド）で処理されたＢ１６ＢＬ６細胞の増殖試験を示す。使用されたレチノイン酸の濃度を１０ｎＭで固定した。
【実施例】
【００７７】
実施例１：アクチン動力学の調節
アクチン動力学は、腫瘍細胞において損なわれ、その後にＦ−アクチンとＧ−アクチンとの比が減少することが知られている。アクチン動力学は、Ｆ−アクチン伸長の速度定数（ｋ）及びＦ−アクチンの安定状態濃度（ΔｍＡ）に近づける蛍光異方性アッセイを用いて腫瘍細胞抽出物において定量した。
【００７８】
材料及び方法：
全ての反応は２２℃で行い、蛍光異方性シグナルはＢｅａｃｏｎ ２０００（Ｐａｎｖｅｒａ）において励起４９０ｎｍで５２０ｎｍで回収した。Ａｌｅｘａ ４８８アクチン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｌ５−５０Ｂ超遠心分離機で３５０００ｒｐｍ、２時間、４℃で遠心分離し、残りのアクチン重合体を沈殿させた。上清に残存している蛍光は、単量体又は小さなアクチン線維（５〜１０単量体）によるものと考えられ、前述の条件下ではペレットにならないものである。８０％の上清を回収した；濃度は、蛍光測定により決定した（４９０ｎｍで励起し、シグナルを５２０ｎｍで回収した）。超遠心分離したアクチン濃度は、標準として超遠心分離していないＡｌｅｘａ ４８８アクチンを用いて計算した。上清を分注し、液体窒素で凍結後、−８０℃で保存した。
【００７９】
実験前に、超遠心分離したＡｌｅｘａ ４８８アクチンのアリコートをＧバッファー（５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．１、２ｍＭ ＣａＣｌ2、０．２ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍＭ ＡＴＰ）で１ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。３μｌの希釈したＡｌｅｘａ ４８８アクチンは、１６８μｌのＧバッファーで混合し、アクチン単量体異方性は、４μｌの重合バッファー（２．５Ｍ ＫＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ2、２５ｍＭ ＡＴＰ）、化学分子の有無による５μｌのＧバッファー、２ｍｇ／ｍｌの濃度で２０μｌの正常なＮＩＨ３Ｔ３細胞又は悪性ＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ細胞の抽出物の添加前に測定した。Ａｌｅｘａ ４８８の最終濃度は、４ｎＭであった。非標識アクチンと標識アクチンとの比は、約１４０／４ｎＭであった。測定は、２００秒間、１０秒毎に行った。アクチン単量体異方性の値を差し引き、異方性増加（ΔｍＡ）を得た。データは、式Ｙ＝Ｙｍａｘ［１−ｅｘｐ（−Ｋ．Ｘ）］にフィットさせた。曲線はゼロで始まり、安定状態の異方性値（ΔｍＡ ｅｑ）に対応するＹｍａｘまで上昇し、速度定数はＫであった。Ｙは、単量体異方性が差し引かれた異方性値であり、Ｘは時間である。
【００８０】
結果：
これらのパラメータに対するＢＡ０１６ＤＤ５３７の効果は下記の通りである：
【００８１】
【表１】
【００８２】
異方性の増大は、２−（β−ピペリジノエチル）−９−ヒドロキシエリプチシニウムクロリド（ＢＡ０１６ＤＤ５３７）の存在下でＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ抽出物について観察し、ＢＡ０１６ＤＤ５３７無しで測定した異方性と比較した（図２）。
【００８３】
天然のＮＩＨ３Ｔ３細胞と比較すると、ＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ細胞は、アクチン伸長のより低い見せ掛けの一次速度定数、並びに安定状態でのより低量のＦ−アクチンを示す。したがって、ＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ細胞から調製した細胞質画分は、アクチン動力学を調節し得る分子をスクリーニングするための便利な材料であり、ＢＡ０１６ＤＤ５３７などのアクチン線維に選択的に結合することができるものが含まれる。アッセイ培地に添加すると、ＢＡ０１６ＤＤ５３７は、アクチン−Ｆ伸長の速度定数及びアクチン−Ｆ安定状態の値を増加させる。図２は、濃度増加したＢＡ０１６ＤＤ５３７の添加後に観察された典型的な動力学を示す。２００ｎＭのＢＡ０１６ＤＤ５３７の存在下では、ＮＩＨ３Ｔ３ＥＦの細胞質画分のアクチン動力学は、ＮＩＨ３Ｔ３の細胞質画分を用いて観察されるものと類似している。このようにして、ＢＡ０１６ＤＤ５３７は、アクチン重合促進剤として用いることができる。
【００８４】
実施例２：９−ヒドロキシ−２（ベータ−エチル）−エリプチシニウムアセテート（ＢＡ０１６ＣＡ１０７）及び９−ヒドロキシ−２（ベータ−メチル）−エリプチシニウムアセテート（セリプチウム（Ｃｅｌｉｐｔｉｕｍ）、ＢＡ０１６ＣＡ７７）によるアクチン動力学の調節及び細胞運動性のエクスビボ阻害
セリプチウムは、抗癌剤として知られていた。９−ヒドロキシ−２（ベータ−エチル）−エリプチシニウムアセテート（ＢＡ０１６ＣＡ１０７）及びセリプチウム（ＢＡ０１６ＣＡ７７）の作用機序は、安定状態の蛍光異方性測定アッセイ（材料及び方法、実施例１）によってＢＡ０１６ＤＤ５３７と比較された。また、細胞運動性を阻害するそれらの能力を調査した（材料及び方法、実施例４）。
【００８５】
結果：
図３に示されるように、ＢＡ０１６ＣＡ７７及びＢＡ０１６ＣＡ１０７は、アクチン−Ｆ伸長の速度定数及びアクチン−Ｆ安定状態の値を増加させない。２００ｎＭのＢＡ０１６ＣＡ７７及びＢＡ０１６ＣＡ１０７の存在下では、ＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ細胞質画分のアクチン動力学は、処置なしのＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ細胞質画分を用いて観察したものに類似している。このようにして、ＢＡ０１６ＣＡ７７及びＢＡ０１６ＣＡ１０７は、アクチン重合促進剤として用いることができない。
【００８６】
【表２】
【００８７】
ＢＡ０１６ＣＡ７７及びＢＡ０１６ＣＡ１０７薬物によって処理された悪性細胞の挙動はまた、創傷治癒アッセイにおける未処理の悪性細胞と比較された。処理された悪性細胞は、全領域に創傷の境界を超えて移動することが分かった（図４）。非毒性濃度の薬物で処理された細胞は、未処理の悪性細胞と同じように移動する。
【００８８】
結果として、９−ヒドロキシ−２（ベータ−エチル）−エリプチシニウムアセテート及び９−ヒドロキシ−２（ベータ−メチル）−エリプチシニウムアセテート（セリプチウム）のいずれも活性であることが判明し、したがって、２位の側鎖の性質はアクチン動力学を調節するためのそれらの能力において重要な役割を果たすことを指示している。
【００８９】
実施例３：腫瘍細胞におけるＦ−アクチンネットワークの救済
材料及び方法：
悪性ＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ細胞を２０００細胞／ｃｍ2の密度でガラス製のカバースリップ上に播種した。翌日、ＢＡ０１６ＤＤ５３７を種々の非毒性濃度（１００ｎＭ及び２００ｎＭ）でＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ細胞に適用した。３日後、細胞は、蛍光顕微鏡で試験される前に、４℃で３．７％のホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中で１０分間固定された。ホルムアルデヒド溶液は、５０ｍＭのＮＨ4Ｃｌで中和された。抽出は、ＰＢＳ中の０．４％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いて４分間行われた。細胞をブロッキングバッファー（ＰＢＳ中の３％ウシ血清アルブミン）と共に１時間インキュベートし、次に、２０分間、ＦＩＴＣ−ファロイジン（Ｓｉｇｍａ）を用いて室温でインキュベートした。カバースリップをＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄｋ（Ｚｙｍｅｄ）に置き、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）で観察した。
【００９０】
結果：
薬物ＢＡ０１６ＤＤ５３７は、図４に示される非毒性濃度で腫瘍細胞内のアクチンネットワークを再構築することができる。ＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ細胞は、非毒性濃度のＢＡ０１６ＤＤ５３７で処理され、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に近い形態を回復する：細胞は広がり、多数の細胞間接着を有し、アクチン細胞骨格はストレスファイバーネットワークにおいて十分に編成される。
【００９１】
同様の実験条件では、９−ヒドロキシ−２エチル）−エリプチシニウムアセテート及び９−ヒドロキシ−２（メチル）−エリプチシニウムアセテート（セリプチウム）はともに活性がないことが分かった。
【００９２】
実施例４：細胞運動性のエクスビボ阻害
癌の進行における後期である腫瘍細胞の浸潤及び転移は、細胞運動性と明確に関係している。細胞運動の主要なエンジン、及び一般には細胞形状変化は、細胞骨格であり、動物脂肪の移動に関与する細胞骨格の主要な成分はアクチンである。結論として、アクチン動力学の調節は、順番に浸潤及び転移を抑止するべき細胞運動の機能障害をもたらし得る。
これらの理由で、ＢＡ０１６ＤＤ５３７を細胞運動性アッセイにおいて試験した。
【００９３】
材料及び方法：
創傷治癒アッセイは、悪性ＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ細胞及びメラノーマ細胞株Ｂ１６Ｆ１０及びＢ１６ＢＬ６の運動性に対するＢＡ０１６ＤＤ５３７の効果を評価するために行った。全ての細胞は、加湿した５％のＣＯ２雰囲気下、３７℃でインキュベートされた。約１０００００〜２０００００細胞を６ウェルの培養プレートに播種し、ＢＡ０１６ＤＤ５３７は、様々な濃度で、２４時間後に添加した。細胞を３日間増殖し、約９０〜９５％のコンフルエントにし、小さなスクラッチ傷（約２００μｍ〜１ｍｍ幅）をピペットチップで作った。細胞の残骸を除去し、次に培養物を同濃度のＢＡ０１６ＤＤ５３７の存在下、１０時間完全培地でインキュベートした。その後、細胞は、４℃で、３．７％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中で１０分間固定された。治癒は、Ｚｅｉｓｓソフトウェアを用いて位相差光学顕微鏡で観察した。
【００９４】
結果：
浸潤した悪性細胞Ｂ１６Ｆ１０及びＢ１６ＢＬ６、並びに融合タンパク質ＥＷＳ−ＦＬＩ−１を発現している腫瘍性ＮＩＨ−３Ｔ３ＥＦ細胞は、高い運動性の表現型を示す。それらの運動性の全体の評価を得るために、ＢＡ０１６ＤＤ５３７で処理した薬物悪性細胞の挙動と未処理の悪性細胞の挙動とを創傷治癒アッセイにおいて比較した。未処理悪性細胞は、創傷の全領域に創傷の境界を超えて移動する。対照的に、ＢＡ０１６ＤＤ５３７で処理された悪性細胞は、創傷に全く移動しない。ＢＡ０１６ＤＤ５３７は、投薬量に依存して悪性細胞の運動性を阻害した。５０ｎＭ程度の低い濃度のＢＡ０１６ＤＤ５３７による細胞処理は、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ及びＮＩＨ３Ｔ３ＥＦ細胞移動の完全な阻害をもたらす。また、非毒性濃度のＢＡ０１６ＤＤ５３７によるＢ１６ＢＬ６細胞の運動性の阻害が観察された。したがって、選択されたＢＡ０１６ＤＤ５３７薬物の効果は、毒性効果にはよらない。
【００９５】
実施例５：９−ヒドロキシエリプチシン誘導体のエクスビボの抗増殖効果
悪性細胞は、足場非依存的にメチルセルロースなどの半固体培地上で増殖する性質を示す。
【００９６】
表現型の復帰変異に関連した２−（ベータピペリジノ−２−エチル）−９−ヒドロキシエリプチシニウムクロリド（ＢＡ０１６ＤＤ５３７）及び２−（ベータピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムメタンスルホネート（ＢＡ０１６ＦＺ５３９）の抗腫瘍活性は、半固体培地中のコロニー形成の阻害によって評価した。いくつかの細胞株を調査した。コロニー形成の阻害は、ＭＴＴ還元によって測定される細胞増殖の阻害と比較した。
【００９７】
材料及び方法：
クローニングアッセイ
０．８％のメチルセルロース（Ｍｅｔｈｏｃｅｌ ＭＣ４０００、Ｓｉｇｍａ）で補足された完全培地中に細胞を埋め込み、３重で３５ｍｍディッシュ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−ｏｎｅ Ｒｅｆ６２７１０２、Ｄｏｍｉｎｉｑｕｅ Ｄｕｓｔｓｃｈｅｒ）に播種し、加湿した５％のＣＯ2雰囲気下、３７℃でインキュベートした。播種した細胞数は、１０００細胞／ディッシュであった。細胞株によって１〜３週間後、肉眼で見えるクローンをカウントした。
【００９８】
ＭＴＴアッセイ
増殖試験は、［３−（４，５ジメチルチアゾール−２−イル］−２．５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド］（Ｓｉｇｍａ）比色分析を用いて行った。
【００９９】
細胞株によって約１５００〜５０００細胞は、濃度増加したＢＡ０１６ＤＤ５３７又はＢＡ０１６ＦＺ５３９を添加する前に９６ウェル培養プレートで２４時間播種された。プレートは、３７℃で３日間インキュベートされた。１０μｌのＭＴＴストック溶液（リン酸緩衝生理食塩水の５ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルの９０μｌの完全培地に添加し、３時間、３７℃でインキュベートを継続した。１００μｌの溶解バッファー（１０％ドデシル硫酸ナトリウム、１％ ＨＣｌ １Ｎ；ｐＨ４．７）を各ウェルに添加した。プレートを一晩インキュベートした。吸光度は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＥＩＡ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ）を用いて、５７０ｎｍの波長で測定された。増殖率は、未処理の細胞を１００％として用いて、ＯＤの読み取りから計算された。
得られた典型的な結果を下記の表３〜６に示す。
【０１００】
【表３】
【０１０１】
【表４】
【０１０２】
【表５】
【０１０３】
【表６】
【０１０４】
このようにして、ＢＡ０１６ＤＤ５３７及びＢＡ０１６ＦＺ５３９は、半固体培地のコロニー形成における顕著な阻害活性を示すことが判明した。コロニー形成の阻害は、ＭＴＴ試験を用いて測定された非抗増殖濃度で生じる。
【０１０５】
実施例６：抗腫瘍活性
Ｂ１６メラノーマに対する抗腫瘍活性は、悪性細胞のｉ．ｐ．グラフト、その後のｉ．ｐ．処理を用いて、マウスにおいて評価することができる。様々なバイオディスポニビリティ（ｂｉｏｄｉｓｐｏｎｉｂｉｌｉｔｙ）パラメータを回避するこの種のプロトコールは、大雑把に、所定の腫瘍に期待され得る最大の抗腫瘍活性に関する情報を提供する。
【０１０６】
実験プロトコール：
メラノーマＢ１６細胞（４×１０5）は、Ｊ０でｉ．ｐ．経路を用いてＢ６Ｄ２Ｆ１マウスに注入された。薬物は、無菌の蒸留水（０．５ｍｌ）に溶解し、同様に、種々の濃度でＪ１〜Ｊ９までｉ．ｐ．経路を用いて毎日注入された。対照のマウスは、同じプロトコールに従って、蒸留水だけを受けた。
【０１０７】
処理したマウス及び対照マウスを毎日カウントした。Ｔ／Ｃ（処理されたマウスの生存の平均／対照マウスの生存の平均）をＪ９で計算した。Ｔ／Ｃ＞１２５％は、有意な抗腫瘍活性を示す。
この実験の結果を下記の表７に要約する。
【０１０８】
【表７Ａ】
【０１０９】
【表７Ｂ】
【０１１０】
このようにして、ＢＡ０１６ＤＤ５３７は、Ｂ１６メラノーマに対して顕著な抗腫瘍活性を示す。最適な用量である３．１２ｍｇ／ｋｇは、２１７％のＴ／Ｃを生じる。参照薬物セリプチウムは、このプロトコールを用いて、有意な抗腫瘍活性がない。
【０１１１】
実施例７：抗転移活性
Ｂ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞によって示される浸潤の表現型は、ｉ．ｖ．経路によって注入されるとき、肺で効率的に転移を形成する腫瘍細胞の能力によって特徴付けられる。抗浸潤性を評価するために、このプロセスに対する２−（ベータピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムメタンスルホネートの効果を試験した。
【０１１２】
実験プロトコール：
１００μｌのＢ１６Ｆ１０細胞の懸濁液（４．１０5細胞）をｉ．ｖ．経路を用いて、マウスの後眼窩洞に注入した。２−（ベータピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムメタンスルホネート（ＢＡ０１６ＦＺ５３９）溶液を５ｍｇ／Ｋｇ（第１実験）及び７．５ｍｇ／ｋｇ（第２実験）の投薬量で細胞注入後の２４時間及び７２時間でマウスにｉ．ｖ．投与した。対照群では、マウスは、生理学的な血清をｉｖ注入された。数日後、マウスを屠殺し、肺を摘出し、転移塊を解剖顕微鏡下でカウントした。
【０１１３】
【表８】
【０１１４】
使用された実験条件では、ＢＡ０１６ＦＺ５３９は、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞のｉ．ｖ．注入後の肺転移の有意な減少によって評価されるように、有意な抗浸潤活性を示す。
【０１１５】
実施例８：小細胞の肺癌細胞株に対する９−ヒドロキシエリプチシン誘導体のインビトロの抗増殖効果
ＢＡ０１６ＦＺ５３９（２−（ベータピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムメタンスルホネート）の抗腫瘍活性は、スルホルホダミン試験によって測定されるように、細胞増殖の阻害によって評価された。
【０１１６】
３つの小細胞の肺癌細胞株：ＮＣＩ−Ｈ５１０、ＮＣＩ−Ｈ４４６及びＮＣＩ−Ｈ１８７を試験した。
【０１１７】
小細胞の肺癌（ＳＣＬＣ）は、毎年診断される全ての肺癌の１５〜２５％を占める（Ｂｏｎｆｉｌｌ ｅｔ ａｌ．１９７５−１９７７及び１９８７−１９８９．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ６５：７５１−７５４，１９９６）。ＳＣＬＣ細胞株は、２つの主要なクラス：神経内分泌マーカーレベルの上昇を表す古典的なＳＣＬＣ細胞株（ＮＣＩ−Ｈ１８７及びＮＣＩ−Ｈ５１０）、１以上の神経内分泌マーカーを表さない変異ＳＣＬＣ細胞株にさらに分類することができる。
【０１１８】
いくつかの試験では、変異細胞株は、古典的な細胞株とは対照的に、インビトロで放射線耐性であり、ｃ−ｍｙｃ癌遺伝子（Ｃａｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４５，２９１３−２９２３，Ｊｕｎｅ １９８５）の発現増加があることを示している。
【０１１９】
材料及び方法：ＳＲＢアッセイ
スルホルホダミンＢ（ＳＲＢ）比色分析（Ｓｉｇｍａ）を用いて、増殖試験を行った。
ＳＲＢアッセイは、細胞のタンパク質含量の測定に基づいて、細胞密度測定のために用いられる。この方法は、９６ウェルフォーマットで接着細胞における化合物の毒性スクリーニングに最適化されていた（Ｓｋｅｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９８９，３０：２４３６）。
【０１２０】
濃度増加したＢＡ０１６ＦＺ５３９を添加しながら、約５００００個のＮＣＩ−Ｈ５１０、ＮＣＩ−Ｈ４４６又はＮＣＩ−Ｈ１８７細胞を９６ウェル培養プレートに播種した。
【０１２１】
インキュベーション時間後、細胞の単層を１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）トリクロロ酢酸で固定し、３０分間染色する。その後、過剰の色素を１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の酢酸で繰り返しの洗浄によって除去する。タンパク質に結合した色素は、マイクロプレートリーダーを用いて、５１０ｎｍで光密度測定（ＯＤ）に対して１０ｍＭ Ｔｒｉｓ系溶液に溶解される。
【０１２２】
増殖率は、未処理の細胞を１００％として用いて、ＯＤ読み取りから計算された。
ＳＲＢタンパク質染色アッセイは、様々なヒトの小細胞の肺癌細胞株のインビトロの化学的感受性試験のために、テトラゾリム（ＭＴＴ）比色分析と比較した。
【０１２３】
ＳＲＢアッセイは、ＭＴＴアッセイよりもいくつか利点がある。例えば、いくつかの化合物は、細胞生存率に対する影響を与えることなしに、ＭＴＴ還元と直接的に干渉することができるが、ＳＲＢ染色は、稀に、この種の干渉によって影響を及ぼす。さらに、ＳＲＢ染色は、細胞の運動活性に依存しない。
【０１２４】
結果：
【０１２５】
【表９】
【０１２６】
表９では、変異ＳＣＬＣ細胞株（ＮＣＩ−Ｈ４４６）は、古典的なＳＣＬＣ細胞株（ＮＣＩ−Ｈ５１０及びＮＣＩ−Ｈ１８７）よりもＢＡ０１６ＦＺ５３９に良好な耐性を示す。
【０１２７】
実施例９：膵癌細胞株に対する９−ヒドロキシエリプチシン誘導体のインビトロの抗増殖効果
ＢＡ０１６ＦＺ５３９（２−（ベータピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムメタンスルホネート）の抗腫瘍活性は、スルホルホダミン試験によって測定されるように、細胞増殖の阻害によって評価された。
２つの膵癌細胞株：ＭＩＡ ＰａＣａ−２及びＰＡＮＣ−１を調査した。
【０１２８】
材料及び方法：
ＭＩＡ ＰａＣａ−２及びＰＡＮＣ−１膵細胞の増殖に対するＢＡ０１６ＦＺ５３９の効果は、５００μＭ〜０．１６μＭの濃度範囲で試験され、ＳＲＢ比色分析を用いて測定された。
【０１２９】
濃度増加したＢＡ０１６ＦＺ５３９を添加しながら、約５０００ＭＩＡ ＰａＣａ−２又はＰＡＮＣ−１細胞を９６ウェル培養プレートに播種した。
膵細胞株の形態と数の変化は、顕微鏡観察で観察された（図５）。
【０１３０】
結果：
【０１３１】
【表１０】
【０１３２】
図５は、ＢＡ０１６ＦＺ５３９によるＭＩＡ ＰａＣａ−２細胞株における形質転換した表現型（図５、Ａ）から正常な表現型（図５、Ｂ）への復帰変異を示す。
【０１３３】
この効果は、ＭＩＡ ＰａＣａ−２細胞株にのみ観察され、ＰＡＮＣ−１細胞株では見られなかった。形質転換した表現型の復帰変異は、ここでは、より多くの細胞質の伸長及び細胞の広がり領域の増加を含む細胞形態の変化と関連している。このようにして、ＢＡ０１６ＦＺ５３９は、ＰＡＮＣ−１細胞株よりもＭＩＡ ＰａＣａ−２細胞株に対して、優れた抗腫瘍活性を示す（表１０）。
【０１３４】
結論として、ここに示されたデータは、ＢＡ０１６ＦＺ５３９が、ヒトの癌細胞株に対する複数の抗腫瘍活性を発揮することを示す。ＢＡ０１６ＦＺ５３９は、６〜２０μＭのＩＣ５０でＳＣＬＣ及び膵癌細胞の細胞増殖を有意に阻害することを見出した。これらの結果はまた、膵細胞株であるＭＩＡ ＰａＣａ−２の悪性表現型を復帰変異する能力を示唆する。ＢＡ０１６ＦＺ５３９で処理されたこれらの細胞は、細胞骨格編成の調節を示唆する形態変化を示す。
【０１３５】
実施例１０：細胞運動性のエクスビボ阻害
９−ヒドロキシエリプチシン誘導体は、分化誘導薬、特にビタミンＡ、その合成類似体、及び代謝物（レチノイド）、ビタミンＤ又はその類似体と併用して投与されてもよい。レチノイドは、例えば、全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）、Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）レチンアミド（４ＨＰＲ）、１３−シス−レチノイン酸（１３ＣＲＡ）又は９−シス−レチノイン酸（９ＣＲＡ）であってもよい。
【０１３６】
この実施例では、ＢＡ０１６ＤＤ５３７（２−（ベータピペリジノ−２−エチル）−９−ヒドロキシエリプチシニウムクロリド）と上記のレチノイドとの組み合わせの効果を試験した。
【０１３７】
材料及び方法：
レチノイド１３ＣＲＡとＡＴＲＡの存在下でＢＡ０１６ＤＤ５３７によるエクスビボの細胞生存性の阻害は、３−（４，５ジメチルチアゾール−２−イル）−２．５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）比色分析を用いて、Ｂ１６ＢＬ６メラノーマ細胞株に対して試験された。
【０１３８】
１０ｎＭのレチノイドの有無で、１ｐＭ〜１００ｐＭの濃度増加したＢＡ０１６ＤＤ５３７を添加する前の２４時間、９６ウェル培養プレートに約１０００個の細胞を播種した。３７℃で３日間、プレートをインキュベートした。１０μｌのＭＴＴストック溶液（リン酸緩衝生理食塩水中の５ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルの９０μｌの完全培地に添加し、３時間、３７℃でインキュベーションを継続した。１００μｌの溶解バッファー（２０％ドデシル硫酸ナトリウム、１０ｍＭ ＨＣｌ、１×ＰＢＳ）を各ウェルに添加し、プレートを一晩インキュベートした。吸光度は、５７０ｎｍの波長で、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＥＩＡ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ）を用いて測定された。
【０１３９】
結果
Ｂ１６ＢＬ６浸潤性メラノーマ細胞株は、高い浸潤性表現型を示す。相乗効果アッセイの目的は、ＢＡ０１６ＤＤ５３７の最小濃度で腫瘍細胞の生存性を阻害することであった。１０ｎＭのレチノイド１３ＣＲＡ及びＡＴＲＡだけの存在下では、細胞の生存性の阻害は観察されなかった。１０ｎＭのレチノイドの存在下で、ＢＡ０１６ＤＤ５３７のより低い投薬量での細胞処理は、腫瘍細胞の生存性の阻害を増加する結果となる（図６）。
【０１４０】
同時に、レチノイドがない場合に、最小濃度のＢＡ０１６ＤＤ５３７の活性は観察されなかった。１００ｎＭのＢＡ０１６ＤＤ５３７の効果は、ＡＴＲＡ １０ｎＭの存在下の１ｐＭと同じであった。このようにして、ＢＡ０１６ＤＤ５３７の投薬は、レチノイドなしで用いた場合より同じ結果を得るために、レチノイドを併用した場合、１０００００倍減少することができる。
【０１４１】
実施例１１：２つの９−ヒドロキシエリプチシン誘導体：モノメシレート及びビメシレートの生物学的活性の比較
２つのエリプチシン誘導体である、ＢＡ０１６ＦＺ５３９（２−（ベータピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムメタンスルホネート、又は「モノメシレート」）及び対応するビメシレート誘導体：
【０１４２】
【化９】
【０１４３】
（以下、「ビメシレート」）の抗腫瘍活性は、２つの独立した実験を用いて評価された。半固体培地におけるコロニー形成の阻害は、マウスのメラノーマ細胞株Ｂ１６Ｆ１０上でクローニングアッセイを用いて初めに評価された。
【０１４４】
第２に、２つのヒト膵細胞株（ＭＩＡ ＰａＣＡ−２及びＰＡＮＣ１）及び１つのマウスのメラノーマ細胞株（Ｂ１６Ｆ１０）の細胞増殖は、ＳＲＢ及びＭＴＴ試験を用いて、モノメシレート及びビメシレートの存在下で定量された。
【０１４５】
材料及び方法：
クローニングアッセイ
０．８％のメチルセルロース（Ｍｅｔｈｏｃｅｌ ＭＣ４０００、Ｓｉｇｍａ）で補足された完全培地に細胞を埋め込まれ、３重で３５ｍｍディッシュに播種し、３７℃、加湿した５％ＣＯ2雰囲気下でインキュベートした。播種した細胞数は、１０００細胞／ディッシュであった。９日後、マウスのメラノーマ細胞株Ｂ１６Ｆ１０の肉眼で見えるコロニーをカウントした。
【０１４６】
ＭＴＴ及びＳＲＢ試験
ＭＴＴ及びＳＲＢ比色分析（Ｓｉｇｍａ）を用いて増殖試験を行った。濃度増加したモノメシレート又はビメシレートを添加する前に、９６ウェルの培養プレートに約１５００個のＢ１６Ｆ１０又は３０００個の膵細胞（ＭＩＡ ＰａＣａ−２及びＰＡＮＣ１）を播種した。
【０１４７】
プレートを３７℃で３日間インキュベートし、次に、ＳＲＢ又はＭＴＴプロトコール（材料及び方法を参照）に従って処理した。
【０１４８】
これらの２つの例では、増殖率は、未処理の細胞を１００％として用いて、ＯＤ読み取りから計算された。
【０１４９】
結果：
【０１５０】
【表１１】
【０１５１】
Ｂ１６Ｆ１０細胞は、ＳＲＢ及びＭＴＴアッセイの両方で試験され、ＰＡＮＣ１はＳＲＢアッセイのみで調査された。モノメシレート及びビメシレートのＩＣ５０の間に有意な差はなかった。
【０１５２】
【表１２】
【０１５３】
モノメシレート及びビメシレートは、半固体培地におけるコロニー形成に対して類似の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を示し、それぞれ６７及び２１ｎＭであった。
【０１５４】
浸潤性メラノーマ細胞株Ｂ１６Ｆ１０の増殖に対する顕著な阻害効果は、これらの２つの薬物の存在下でメチルセルロースにおいて効果的に観察された。
【０１５５】
また、コロニー形成の阻害は、ＭＴＴ試験を用いて測定される非増殖濃度で生じることを本発明者らのデータは検証した。
【０１５６】
結果として、モノメシレート及びビメシレートは、クローニングアッセイ及び細胞増殖試験の結果に関して、同じ生物学的活性を有する。
【０１５７】
これらのデータを一緒にすると、エリプチシン誘導体は抗腫瘍剤として開発に潜在性を有することを強く示唆している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の治療が意図された薬剤を製造するための、場合により酸付加塩の形態である、式（ＩＩＩ）：
【化１】
（式中、
Ｘは、２又は３個の炭素原子を有するアルキル基であって、場合により分岐していてもよく、場合によりＯＨ、ＮＲＲ’、ＣＮ、ＯＲ、ＣＯＯＲで置換されてもよく、ここで、Ｒ及びＲ’は、独立してＨ又はＣ１−Ｃ４アルキル基であり；
Ｙは、−ＮＲ１Ｒ２であり、ここで、Ｒ１及びＲ２は、独立してＨ又はＣ１−Ｃ６アルキル基であるか、あるいはＲ１及びＲ２は、それらが結合しているＮ原子と一緒になって、飽和若しくは不飽和の５又は６員の複素環を形成し、ここで、−ＮＲ１Ｒ２は、式（Ｉ）で表される化合物が酸付加塩の形態となるように、医薬として許容される無機物又は有機酸の付加から得られる第４級アンモニウム塩の形態であってもよく；
あるいは、Ｙは、ベンジル、フェニル又はＣ５若しくはＣ６アリール又は５若しくは６−ヘテロアリール基であり；及び
Ｚ-は、医薬として許容される無機物又は有機酸の陰イオンであり；
−Ｘ−Ｙ側鎖は、必要に応じて、Ｔ、Ｕ、Ｖ又はＷに結合され；
Ｔ、Ｕ、Ｖ及びＷは、ピリジル環を形成するようにＣ原子又はＮ原子であり、残りのＴ、Ｕ、Ｖ及び／Ｗは、Ｃ原子であり、
ただし、−Ｘ−Ｙ側鎖は、Ｎ原子であるＴ、Ｕ、Ｖ及びＷの１つと結合しており、
理解されるように、
【化２】
は、必要に応じて単結合又は二重結合を表し、その結果、縮合したピリジル環とともに形成した系は芳香族となり、生じる陽イオン：
【化３】
が形成される）
で表される９−ヒドロキシエリプチシン誘導体の使用。
【請求項２】
前記９−ヒドロキシエリプチシン誘導体が、場合により酸付加塩の形態である、式（ＩＶ）：
【化４】
（式中、Ｘ、Ｙ及びＺ-は、請求項１に定義される通りである）
を有する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ｘが、エチル又はプロピルである、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
Ｙが、−ＮＲ１Ｒ２であり、Ｒ１とＲ２の各々が、エチル基であり、ここで、−ＮＲ１Ｒ２は、式（Ｉ）で表される化合物が酸付加塩の形態となるように、医薬として許容される無機物又は有機酸の付加から得られる第４級アンモニウム塩の形態であってもよい、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
Ｙが、ピペリジン、ピロリジニル、ピリジン及びピリミジン、並びにそれらの第４級アンモニウム塩からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記９−ヒドロキシエリプチシン誘導体が、
【化５】
であるか又は得られるその第４級アンモニウム塩である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記９−ヒドロキシエリプチシン誘導体が、
【化６】
であるか又は得られるその第４級アンモニウム塩である、請求項１、２、３及び５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
Ｚ-がメタンスルホネートである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記９−ヒドロキシエリプチシン誘導体が、
【化７】
である、請求項１、２、３、５及び７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
前記薬剤が、腫瘍細胞の形質転換された表現型を復帰変異（ｒｅｖｅｒｓｅ）するように意図される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
前記腫瘍細胞が、浸潤性の表現型によって特徴付けられる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
前記薬剤が、転移を治療するように意図される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
前記薬剤が、細胞毒性を有する化学療法を回避した被験者の癌を治療するように意図される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
前記薬剤が、分化誘導薬を併用して投与される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
前記分化誘導薬が、ビタミンＡ及びその合成類似体、レチノイド、ビタミンＤ及びその類似体、及びペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ）リガンドからなる群から選択される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
医薬として許容される担体に含まれる、請求項１〜９のいずれか１項において定義される式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）で表される９−ヒドロキシエリプチシン誘導体及び分化誘導薬を含む医薬組成物。
【請求項１７】
前記分化誘導薬が、ビタミンＡ及びその合成類似体、レチノイド、ビタミンＤ及びその類似体、及びペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ）リガンドからなる群から選択される、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
癌の治療用の同時の、別々の又は連続した使用のための併用調製物としての、請求項１〜９のいずれか１項において定義される式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）で表される９−ヒドロキシエリプチシン誘導体及び分化誘導薬を含む製造物。
【請求項１９】
腫瘍細胞の形質転換された表現型を復帰変異するための同時、別々の又は連続した使用のための併用調製物としての請求項１８に記載の製造物。
【請求項２０】
前記分化誘導薬が、ビタミンＡ及びその合成類似体、レチノイド、ビタミンＤ及びその類似体、及びペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ）リガンドからなる群から選択される、請求項１８又は１９に記載の製造物。
【請求項２１】
場合により酸付加塩の形態である、式（ＩＩＩ）：
【化８】
（式中、
Ｘは、２又は３個の炭素原子を有するアルキル基であって、場合により分岐していてもよく、場合によりＯＨ、ＮＲＲ’、ＣＮ、ＯＲ、ＣＯＯＲで置換されてもよく、ここで、Ｒ及びＲ’は、独立してＨ又はＣ１−Ｃ４アルキル基であり；
Ｙは、−ＮＲ１Ｒ２であり、ここで、Ｒ１及びＲ２は、独立してＨ又はＣ１−Ｃ６アルキル基であるか、あるいはＲ１及びＲ２は、それらが結合しているＮ原子と一緒になって、飽和若しくは不飽和の５又は６員の複素環を形成し、ここで、−ＮＲ１Ｒ２は、式（Ｉ）で表される化合物が酸付加塩の形態となるように、医薬として許容される無機物又は有機酸の付加から得られる第４級アンモニウム塩の形態であってもよく；
あるいは、Ｙは、ベンジル、フェニル又はＣ５若しくはＣ６アリール又は５若しくは６−ヘテロアリール基であり；及び
Ｚ-は、医薬として許容される無機物又は有機酸の陰イオンであり；
−Ｘ−Ｙ側鎖は、必要に応じて、Ｔ、Ｕ、Ｖ又はＷに結合され；
Ｔ、Ｕ、Ｖ及びＷは、ピリジル環を形成するようにＣ原子又はＮ原子であり、残りのＴ、Ｕ、Ｖ及び／Ｗは、Ｃ原子であり、
ただし、−Ｘ−Ｙ側鎖は、Ｎ原子であるＴ、Ｕ、Ｖ及びＷの１つと結合しており、
理解されるように、
【化９】
は、必要に応じて単結合又は二重結合を表し、その結果、縮合したピリジル環とともに形成した系は芳香族となり、生じる陽イオン：
【化１０】
が形成される）
で表される９−ヒドロキシエリプチシン誘導体であって、ただし、２−（ジエチルアミノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムクロリド、２−（ジエチルアミノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムアセテート、２−（ジイソプロピルアミノ−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムアセテート、及び２−（ベータピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムアセテートではない前記９−ヒドロキシエリプチシン誘導体。
【請求項２２】
場合により酸付加塩の形態である、前記９−ヒドロキシエリプチシン誘導体が、式（ＩＶ）：
【化１１】
（式中、Ｘ、Ｙ及びＺ-は、請求項１９に定義される通りである）
を有し、ただし、２−（ジエチルアミノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムクロリド、２−（ジエチルアミノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムアセテート、２−（ジイソプロピルアミノ−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムアセテート、及び２−（ベータピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムアセテートではない、請求項２１に記載の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体。
【請求項２３】
Ｘがエチルであり、Ｙがピペリジンである、請求項２２に記載の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体であって、ただし、２−（ベータピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムアセテートでない、前記９−ヒドロキシエリプチシン誘導体。
【請求項２４】
２−（ベータピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムメタンスルホネート又は得られるその第４級アンモニウム塩である、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載９−ヒドロキシエリプチシン誘導体。
【請求項２５】
下式：
【化１２】
である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体。
【請求項２６】
２−（ジエチルアミノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムメタンスルホネート又は得られるその第４級アンモニウム塩である、請求項２１又は２２に記載の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体。
【請求項２７】
医薬として許容される担体に含まれる、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体を含む医薬組成物。
【請求項１】
癌の治療が意図された薬剤を製造するための、場合により酸付加塩の形態である、式（ＩＩＩ）：
【化１】
（式中、
Ｘは、２又は３個の炭素原子を有するアルキル基であって、場合により分岐していてもよく、場合によりＯＨ、ＮＲＲ’、ＣＮ、ＯＲ、ＣＯＯＲで置換されてもよく、ここで、Ｒ及びＲ’は、独立してＨ又はＣ１−Ｃ４アルキル基であり；
Ｙは、−ＮＲ１Ｒ２であり、ここで、Ｒ１及びＲ２は、独立してＨ又はＣ１−Ｃ６アルキル基であるか、あるいはＲ１及びＲ２は、それらが結合しているＮ原子と一緒になって、飽和若しくは不飽和の５又は６員の複素環を形成し、ここで、−ＮＲ１Ｒ２は、式（Ｉ）で表される化合物が酸付加塩の形態となるように、医薬として許容される無機物又は有機酸の付加から得られる第４級アンモニウム塩の形態であってもよく；
あるいは、Ｙは、ベンジル、フェニル又はＣ５若しくはＣ６アリール又は５若しくは６−ヘテロアリール基であり；及び
Ｚ-は、医薬として許容される無機物又は有機酸の陰イオンであり；
−Ｘ−Ｙ側鎖は、必要に応じて、Ｔ、Ｕ、Ｖ又はＷに結合され；
Ｔ、Ｕ、Ｖ及びＷは、ピリジル環を形成するようにＣ原子又はＮ原子であり、残りのＴ、Ｕ、Ｖ及び／Ｗは、Ｃ原子であり、
ただし、−Ｘ−Ｙ側鎖は、Ｎ原子であるＴ、Ｕ、Ｖ及びＷの１つと結合しており、
理解されるように、
【化２】
は、必要に応じて単結合又は二重結合を表し、その結果、縮合したピリジル環とともに形成した系は芳香族となり、生じる陽イオン：
【化３】
が形成される）
で表される９−ヒドロキシエリプチシン誘導体の使用。
【請求項２】
前記９−ヒドロキシエリプチシン誘導体が、場合により酸付加塩の形態である、式（ＩＶ）：
【化４】
（式中、Ｘ、Ｙ及びＺ-は、請求項１に定義される通りである）
を有する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ｘが、エチル又はプロピルである、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
Ｙが、−ＮＲ１Ｒ２であり、Ｒ１とＲ２の各々が、エチル基であり、ここで、−ＮＲ１Ｒ２は、式（Ｉ）で表される化合物が酸付加塩の形態となるように、医薬として許容される無機物又は有機酸の付加から得られる第４級アンモニウム塩の形態であってもよい、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
Ｙが、ピペリジン、ピロリジニル、ピリジン及びピリミジン、並びにそれらの第４級アンモニウム塩からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記９−ヒドロキシエリプチシン誘導体が、
【化５】
であるか又は得られるその第４級アンモニウム塩である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記９−ヒドロキシエリプチシン誘導体が、
【化６】
であるか又は得られるその第４級アンモニウム塩である、請求項１、２、３及び５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
Ｚ-がメタンスルホネートである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記９−ヒドロキシエリプチシン誘導体が、
【化７】
である、請求項１、２、３、５及び７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
前記薬剤が、腫瘍細胞の形質転換された表現型を復帰変異（ｒｅｖｅｒｓｅ）するように意図される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
前記腫瘍細胞が、浸潤性の表現型によって特徴付けられる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
前記薬剤が、転移を治療するように意図される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
前記薬剤が、細胞毒性を有する化学療法を回避した被験者の癌を治療するように意図される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
前記薬剤が、分化誘導薬を併用して投与される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
前記分化誘導薬が、ビタミンＡ及びその合成類似体、レチノイド、ビタミンＤ及びその類似体、及びペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ）リガンドからなる群から選択される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
医薬として許容される担体に含まれる、請求項１〜９のいずれか１項において定義される式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）で表される９−ヒドロキシエリプチシン誘導体及び分化誘導薬を含む医薬組成物。
【請求項１７】
前記分化誘導薬が、ビタミンＡ及びその合成類似体、レチノイド、ビタミンＤ及びその類似体、及びペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ）リガンドからなる群から選択される、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
癌の治療用の同時の、別々の又は連続した使用のための併用調製物としての、請求項１〜９のいずれか１項において定義される式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）で表される９−ヒドロキシエリプチシン誘導体及び分化誘導薬を含む製造物。
【請求項１９】
腫瘍細胞の形質転換された表現型を復帰変異するための同時、別々の又は連続した使用のための併用調製物としての請求項１８に記載の製造物。
【請求項２０】
前記分化誘導薬が、ビタミンＡ及びその合成類似体、レチノイド、ビタミンＤ及びその類似体、及びペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ）リガンドからなる群から選択される、請求項１８又は１９に記載の製造物。
【請求項２１】
場合により酸付加塩の形態である、式（ＩＩＩ）：
【化８】
（式中、
Ｘは、２又は３個の炭素原子を有するアルキル基であって、場合により分岐していてもよく、場合によりＯＨ、ＮＲＲ’、ＣＮ、ＯＲ、ＣＯＯＲで置換されてもよく、ここで、Ｒ及びＲ’は、独立してＨ又はＣ１−Ｃ４アルキル基であり；
Ｙは、−ＮＲ１Ｒ２であり、ここで、Ｒ１及びＲ２は、独立してＨ又はＣ１−Ｃ６アルキル基であるか、あるいはＲ１及びＲ２は、それらが結合しているＮ原子と一緒になって、飽和若しくは不飽和の５又は６員の複素環を形成し、ここで、−ＮＲ１Ｒ２は、式（Ｉ）で表される化合物が酸付加塩の形態となるように、医薬として許容される無機物又は有機酸の付加から得られる第４級アンモニウム塩の形態であってもよく；
あるいは、Ｙは、ベンジル、フェニル又はＣ５若しくはＣ６アリール又は５若しくは６−ヘテロアリール基であり；及び
Ｚ-は、医薬として許容される無機物又は有機酸の陰イオンであり；
−Ｘ−Ｙ側鎖は、必要に応じて、Ｔ、Ｕ、Ｖ又はＷに結合され；
Ｔ、Ｕ、Ｖ及びＷは、ピリジル環を形成するようにＣ原子又はＮ原子であり、残りのＴ、Ｕ、Ｖ及び／Ｗは、Ｃ原子であり、
ただし、−Ｘ−Ｙ側鎖は、Ｎ原子であるＴ、Ｕ、Ｖ及びＷの１つと結合しており、
理解されるように、
【化９】
は、必要に応じて単結合又は二重結合を表し、その結果、縮合したピリジル環とともに形成した系は芳香族となり、生じる陽イオン：
【化１０】
が形成される）
で表される９−ヒドロキシエリプチシン誘導体であって、ただし、２−（ジエチルアミノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムクロリド、２−（ジエチルアミノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムアセテート、２−（ジイソプロピルアミノ−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムアセテート、及び２−（ベータピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムアセテートではない前記９−ヒドロキシエリプチシン誘導体。
【請求項２２】
場合により酸付加塩の形態である、前記９−ヒドロキシエリプチシン誘導体が、式（ＩＶ）：
【化１１】
（式中、Ｘ、Ｙ及びＺ-は、請求項１９に定義される通りである）
を有し、ただし、２−（ジエチルアミノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムクロリド、２−（ジエチルアミノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムアセテート、２−（ジイソプロピルアミノ−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムアセテート、及び２−（ベータピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムアセテートではない、請求項２１に記載の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体。
【請求項２３】
Ｘがエチルであり、Ｙがピペリジンである、請求項２２に記載の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体であって、ただし、２−（ベータピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムアセテートでない、前記９−ヒドロキシエリプチシン誘導体。
【請求項２４】
２−（ベータピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムメタンスルホネート又は得られるその第４級アンモニウム塩である、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載９−ヒドロキシエリプチシン誘導体。
【請求項２５】
下式：
【化１２】
である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体。
【請求項２６】
２−（ジエチルアミノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムメタンスルホネート又は得られるその第４級アンモニウム塩である、請求項２１又は２２に記載の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体。
【請求項２７】
医薬として許容される担体に含まれる、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体を含む医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【公表番号】特表２００９−５３７６２６（Ｐ２００９−５３７６２６Ａ）
【公表日】平成２１年１０月２９日（２００９．１０．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１１５９５（Ｐ２００９−５１１５９５）
【出願日】平成１９年５月２１日（２００７．５．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００７／００１３０７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３５５３８
【国際公開日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【出願人】（５０７３９６３２３）
【出願人】（５０７０８８９６７）
【出願人】（５０１０８９８６３）サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェサイアンティフィク（セエヌエールエス） (173)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１０月２９日（２００９．１０．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月２１日（２００７．５．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００７／００１３０７
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３５５３８
【国際公開日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【出願人】（５０７３９６３２３）
【出願人】（５０７０８８９６７）
【出願人】（５０１０８９８６３）サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェサイアンティフィク（セエヌエールエス） (173)
【Ｆターム（参考）】
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