ＡＰＰの神経活性断片
本出願は、ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の新規の神経活性断片を提供する。断片は、ＡＰＰのＡβ領域に由来する配列を含むが、上流にも及ぶ。断片は水溶液に可溶性であり、大半のバンドは約１０ｋＤａ以上であり、二量体または三量体の予測分子量とは対応しない。断片およびその小断片は、脳内におけるＡβの沈着を特徴とするアルツハイマー病および他のアミロイド形成性疾患を治療する免疫療法における免疫原として用いることができる。ＡＰＰより上流の断片部分、またはＡβと上流配列との間の境界に対する抗体も、このような治療法において用いることができる。断片は、疾患の診断もしくは予後予測または作用物質のスクリーニングで検出することができるマーカーとしても有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、仮出願でなく、すべての目的でその全体が参照により組み込まれている２００６年６月１日出願の第６０／８１０，２４５号の利益を請求するものである。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、老年認知症を生じる進行性疾患である。全般にはＳｅｌｋｏｅ、ＴＩＮＳ、第１６巻、４０３〜４０９頁、１９９３年；Ｈａｒｄｙら、国際公開第９２／１３０６９号；Ｓｅｌｋｏｅ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、第５３巻、４３８〜４４７頁、１９９４年；Ｄｕｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ、第３７３巻、４７６〜４７７頁、１９９５年；Ｇａｍｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、第３７３巻、５２３頁、１９９５年を参照のこと。大まかに言って、該疾患は、老年（６５＋歳）に生じる遅発型、および老年期のはるか以前、すなわち、３５〜６０歳の間に発症する早発型の２つの型に分類される。疾患のいずれの型においても病態は同じであるが、若年に始まる症例における方が、異常がより重症でより広範に及ぶ。該疾患は、脳における少なくとも２つの型の病変である老人斑および神経原線維変化を特徴とする。老人斑とは、中央部に細胞外アミドイド沈着を伴う最大１５０μｍ径の無秩序な神経網領域であり、脳組織切片の顕微鏡解析により見ることができる。神経原線維変化は、互いに巻きつき合い対合する２つの線維体からなる微小管に関連するタウタンパク質の細胞内沈着である。
【０００３】
プラークの主要成分は、Ａβまたはβアミロイドペプチドと称するペプチドである。Ａβペプチドは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と称する前駆体タンパク質の３９〜４３アミノ酸からなる内部断片である。ＡＰＰタンパク質内における複数の突然変異が、アルツハイマー病の存在と相関している。例えば、Ｇｏａｔｅら、Ｎａｔｕｒｅ、第３４９巻、７０４頁、１９９１年（バリン７１７からイソロイシンへ）；Ｃｈａｒｔｉｅｒ−Ｈａｒｌｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、第３５３巻、８４４頁、１９９１年（バリン７１７からグリシンへ）；Ｍｕｒｒｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５４巻、９７頁、１９９１年（バリン７１７からフェニルアラニンへ）；Ｍｕｌｌａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．、第１巻、３４５頁、１９９２年（リシン５９５−メチオニン５９６をアスパラギン５９５−ロイシン５９６に変化させる二重突然変異）を参照のこと。このような突然変異が、ＡＰＰからＡβへのプロセシングの増大または変化、特に、長型のＡβ（すなわち、Ａβ１−４２およびＡβ１−４３）の量が増加するＡＰＰプロセシングによりアルツハイマー病を引き起こすと考えられる。プレセニリン遺伝子であるＰＳ１およびＰＳ２などの他の遺伝子における突然変異は、長型Ａβの量を増加させるＡＰＰプロセシングに間接的な影響を及ぼすと考えられる（Ｈａｒｄｙ、ＴＩＮＳ、第２０巻、１５４頁、１９９７年を参照のこと）。
【０００４】
プラークへと凝集したアミロイドペプチドの病理的役割は、多年にわたり知られている。しかし、認知症の重症度は、プラーク密度との相関が弱いのに対して、可溶性Ａβレベルとの間には著明な相関が存在する（ＭｃＬｅａｎら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、１９９９年、第４６巻、８６０〜８６６頁）。近年の研究は、Ａβオリゴマーが、ｈＡＰＰトランスジェニックマウスにおけるシナプス毒性および記憶障害に関わることを示唆している（Ｍｕｃｋｅら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、第２０巻、４０５０〜４０５８頁、２０００年；Ｍｏｒｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、第４０８巻、９８２〜９８５頁、２０００年；Ｄｏｄａｒｔら、Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、第５巻、４５２〜４５７頁、２００２年）。Ａβオリゴマーは、海馬長期増強をも阻害するが、同モノマーまたは同原線維はこれを阻害しない（Ｗａｌｓｈら、Ｎａｔｕｒｅ、第４１６巻、５３５〜５３９頁、２００２年）。「Ａβオリゴマー」の神経毒性種の一次構造が、活発な探求領域である。該神経毒性種は、Ａβの２位（アスパラギンに続くアラニン）に始まるＡβペプチドからなるオリゴマーであることが示唆されている（Ｐｏｄｌｉｓｎｙ，Ｍ．ら、ＪＢＣ、１９９５年、第２７０巻、９５６４〜９５７０頁）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ヒトアミロイド前駆体タンパク質の残基４４４〜５９５または４４４〜５９６（ＡＰＰ６９５の番号付け）内のエピトープに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体は、モルモットアミロイド前駆体タンパク質に対する特異的結合性を欠く。場合によっては、抗体は、ヒトアミロイド前駆体タンパク質の残基５５１〜５７０内のエピトープに特異的に結合する。場合によっては、抗体は、ヒトアミロイド前駆体タンパク質の残基５３０〜５８０内のエピトープに特異的に結合する。場合によっては、抗体は、ヒトアミロイド前駆体タンパク質の残基６７６〜６９５内のエピトープに特異的に結合する。場合によっては、抗体は、ヒトアミロイド前駆体タンパク質の残基５４５〜５５５内のエピトープに特異的に結合する。場合によっては、抗体は、ヒトアミロイド前駆体タンパク質に対する特異的結合について、モノクローナル抗体８Ｅ５と競合する。場合によっては、抗体は、ヒトアミロイド前駆体タンパク質に対する特異的結合について１８Ｂ１０と競合する。場合によっては、抗体は、８Ｅ５または１８Ｂ１０のヒト化形態またはキメラ形態である。場合によっては、抗体は、モノクローナル抗体である。
【０００６】
本発明は、アルツハイマー病を予防的または治療的に処置する方法であって、該疾患に罹患しているまたは該疾患の危険性がある患者に、ＡＰＰのアミノ酸５１６〜５９５または５９６の間の少なくとも４つの連続した残基を含む断片の治療的に有効なレジメンを施し、それによって該疾患を予防的または治療的に処置するステップを含む方法をさらに提供する。場合によっては、断片は、ＡＰＰのアミノ酸５５１〜５９５または５９６の間の少なくとも５つの連続した残基を含む。場合によっては、断片は、ＡＰＰのアミノ酸５４４〜５９６または５９７の間の少なくとも７つの連続した残基を含む。場合によっては、断片は、ＡＰＰの残基５５１〜５９５または５９６を含む。場合によっては、断片は、ＡＰＰの残基５５１〜６３８を含む。場合によっては、投与するステップでは、各々がＡＰＰの残基５５１〜５９５または５９６の間の少なくとも４つの連続したアミノ酸を含む複数の断片を投与する。場合によっては、断片は、ＡＰＰの残基５５１〜５９５または５９６の間の少なくとも４〜２０個の連続したアミノ酸を含む。場合によっては、断片は、ＡＰＰの残基５１６〜５９５または５９６の間の少なくとも４〜２０個の連続したアミノ酸を含む。場合によっては、断片は、ＡＰＰの残基５５１〜５９５または５９６の間の少なくとも４〜１０個の連続したアミノ酸を含む。場合によっては、断片は、ＡＰＰの残基５１６〜５９５または５９６の間の少なくとも４〜１０個の連続したアミノ酸を含む。場合によっては、断片は、第１および第２のセグメントを含み、第１のセグメントがＡβのセグメントであり、第２のセグメントがＡβの上流にあるＡＰＰセグメントである。場合によっては、第１および第２のセグメントは、ヒトＡＰＰの連続したセグメントである。場合によっては、断片は、コンジュゲートとして担体と連結し、その担体は、断片に対する抗体を含む免疫応答を引き起こす一助となる。場合によっては、該方法は、アジュバントを患者に投与するステップをさらに含み、アジュバントが、断片に対する抗体を含む免疫応答を引き起こす一助となる。場合によっては、方法は、Ａβに対する抗体または該抗体を生成する免疫原を投与するステップをさらに含む。場合によっては、免疫原を投与し、免疫原がＡβの断片である。
【０００７】
本発明は、アルツハイマー病を予防的または治療的に処置する方法であって、該疾患に罹患するまたは該疾患の危険性がある患者に、（ａ）ヒトＡＰＰの残基５１６〜５９５内のエピトープに特異的に結合する抗体、または（ｂ）このような抗体を生成する免疫原の治療的に有効なレジメンを投与し、それによって該疾患を予防的または治療的に処置するステップを含む方法をさらに提供する。
【０００８】
場合によっては、抗体は、ヒトＡＰＰの残基５３０〜５９５内のエピトープに特異的に結合する。場合によっては、抗体は、上記に定義される任意の抗体である。場合によっては、抗体は、ＡＰＰ断片のＮ末端に結合する末端特異的抗体であり、Ｎ末端が残基５３５〜５５５の間のアミノ酸残基である。場合によっては、抗体は、ＡＰＰ５１６〜６３８またはＡＰＰ５３６〜６３８のＮ末端に結合する末端特異的抗体である。場合によっては、その方法は、Ａβに対する抗体または該抗体を生成する免疫原を投与するステップをさらに含む。場合によっては、免疫原を投与し、免疫原がＡβの断片である。
【０００９】
本発明は、アルツハイマー病を治療するのに有用な活性について作用物質をスクリーニングする方法であって、非ヒトトランスジェニック動物を作用物質と接触させるステップであって、非ヒトトランスジェニック動物がＡＰＰをコードするセグメントを含むゲノムを含み、Ａβおよび他の断片にプロセシングされるアミロイド前駆体タンパク質へと発現されるステップと、ＡＰＰの５５１〜５９５または５９６位の間の少なくとも２５アミノ酸を含む５０〜１５０アミノ酸の水溶性ＡＰＰ断片を抽出するステップと、可溶性ＡＰＰ断片の量を、作用物質で処置していない対照トランスジェニックマウス由来の量と比較するステップであって、可溶性断片の量の減少から、作用物質がアルツハイマー病の治療に有用な活性を有することが示唆されるステップとを含む方法をさらに提供する。場合によっては、ＡＰＰはヒトＡＰＰである。場合によっては、断片は、ヒトＡＰＰの残基５５１〜６３８を含む。場合によっては、断片は、抗体８Ｅ５および／または１８Ｂ１０によって特異的に結合されうる。場合によっては、断片は、ＡＰＰ５１６〜６３８、ＡＰＰ５１６〜６３９、ＡＰＰ５３６〜６３８、またはＡＰＰ５３６〜６３９である。
【００１０】
本発明は、アルツハイマー病を治療するのに有用な活性について作用物質をスクリーニングする方法であって、単離された細胞を作用物質と接触させるステップであって、細胞がＡＰＰをコードする核酸を含み、核酸が、Ａβおよび他の断片にプロセシングされるアミロイド前駆体タンパク質へと発現されるステップと、ＡＰＰの５５１〜５９５または５９６位の間の少なくとも２５アミノ酸を含む５０〜１５０アミノ酸の水溶性ＡＰＰ断片を培地内で検出するステップと、可溶性ＡＰＰ断片の量を、作用物質で処置していない対照細胞の量と比較するステップであって、可溶性断片の量の減少から、作用物質がアルツハイマー病の治療に有用な活性を有することが示唆されるステップとを含む方法をさらに提供する。
【００１１】
場合によっては、単離された細胞に、ＡＰＰをコードする核酸を含む構築物をトランスフェクトする。場合によっては、水溶性断片は、ＡＰＰ５１６〜６３８、ＡＰＰ５１６〜６３９、ＡＰＰ５３６〜６３８、またはＡＰＰ５３６〜６３９である。
【００１２】
本発明は、アルツハイマー病を治療するのに有用な活性について作用物質をスクリーニングする方法であって、ＡＰＰの５５１〜５９５または５９６位の間の少なくとも２５アミノ酸を含む５０〜１５０アミノ酸の水溶性ＡＰＰ断片を、細胞集団および作用物質と接触させるステップと、作用物質のない状態で可溶性断片と接触させた対照細胞集団から残存した細胞と比較した、生存細胞の数を比較するステップであって、作用物質の存在下における生存細胞の増加から、作用物質がアルツハイマー病の治療に有用な活性を有することが示唆されるステップとを含む方法をさらに提供する。
【００１３】
場合によっては、細胞は、神経細胞である。場合によっては、水溶性断片は、ＡＰＰ５１６〜６３８、ＡＰＰ５１６〜６３９、ＡＰＰ５３６〜６３８、またはＡＰＰ５３６〜６３９である。
【００１４】
本発明は、ヒトＡＰＰの５５１〜５９５または５９６位の間の少なくとも２５アミノ酸を含む５０〜１５０アミノ酸のアミロイド前駆体タンパク質の単離された断片をさらに提供する。単離された断片は、場合によっては、ヒトＡＰＰの残基５５１〜６３８を含む。単離された断片は、場合によっては、ヒトＡＰＰの残基５５１〜６３８からなる。場合によっては、断片は、１００アミノ酸長以下の長さである。場合によっては、断片は、抗体８Ｅ５および／または１８Ｂ１０によって特異的に結合される。場合によっては、断片は、ＡＰＰ５１６〜６３８、ＡＰＰ５１６〜６３９、ＡＰＰ５３６〜６３８、およびＡＰＰ５３６〜６３９である。
【００１５】
本発明は、ヒトアミロイド前駆体タンパク質の残基５９５および５９６を含むエピトープにおいて、ヒトアミロイド前駆体タンパク質に特異的に結合する抗体をさらに提供する。本発明は、ヒトアミロイド前駆体タンパク質の残基５９６および５９７を含むエピトープにおいて、ヒトアミロイド前駆体タンパク質に特異的に結合する抗体をさらに提供する。
【００１６】
本発明は、ヒトＡＰＰ断片のＮ末端に特異的に結合する末端特異的抗体であって、Ｎ末端アミノ酸がヒトＡＰＰの残基５３５〜５５５の間に位置する末端特異的抗体をさらに提供する。
【００１７】
本発明は、ＡＰＰ５１６〜６３８、ＡＰＰ５１６〜６３９、ＡＰＰ５３６〜６３８、またはＡＰＰ５３６〜６３９のＮ末端に特異的に結合する、特許請求に係る末端特異的抗体をさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】抗Ａβ抗体および抗ＡＰＰ抗体によるＰＤＡＰＰマウス脳の免疫沈降（ＩＰ）およびウェスタンブロットを示す図である。
【図２】免疫沈降した脳調製物に対する各種の塩洗浄後における抗Ａβ（１２Ａ１１）抗体および抗ＡＰＰ（８Ｅ５）抗体によるＰＤＡＰＰマウス脳のＩＰおよびウェスタンブロットを示す図である（図２Ａおよび２Ｂ）。７ＰＡ２ ＣＭの免疫沈降は比較のためである。
【図３】抗Ａβ抗体および抗ＡＰＰ（８Ｅ５）抗体による７ＰＡ２ ＣＭのＩＰおよび８Ｅ５または２Ｈ３による画像化を示す図である。
【図４】７ＰＡ２ ＣＭのサイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を示す図である。
【図５Ａ】７ＰＡ２ ＣＭのＳＥＣを示す図である（図５Ａ、Ｂ、Ｃ）。８Ｅ５樹脂および１２Ｂ４樹脂により免疫沈降させた後で、３Ｄ６、８Ｅ５、および２Ｈ３によりウェスタンブロット法による画像化を行った分画を示す。
【図５Ｂ】７ＰＡ２ ＣＭのＳＥＣを示す図である（図５Ａ、Ｂ、Ｃ）。８Ｅ５樹脂および１２Ｂ４樹脂により免疫沈降させた後で、３Ｄ６、８Ｅ５および２Ｈ３によりウェスタンブロット法による画像化を行った分画を示す。
【図５Ｃ】７ＰＡ２ ＣＭのＳＥＣを示す図である（図５Ａ、Ｂ、Ｃ）。８Ｅ５樹脂および１２Ｂ４樹脂により免疫沈降させた後で、３Ｄ６、８Ｅ５および２Ｈ３によりウェスタンブロット法による画像化を行った分画を示す。
【図６Ａ】ヘパリンセファロース、８Ｅ５樹脂、および１２Ｂ４樹脂により免疫沈降させた後で、抗Ａβ抗体および抗ＡＰＰ抗体によりウェスタンブロット法による画像化を行った７ｐＡ２の馴化培地を示す図である（図６ＡおよびＢ）。
【図６Ｂ】ヘパリンセファロース、８Ｅ５樹脂、および１２Ｂ４樹脂により免疫沈降させた後で、抗Ａβ抗体および抗ＡＰＰ抗体によりウェスタンブロット法による画像化を行った７ｐＡ２の馴化培地を示す図である（図６ＡおよびＢ）。
【図７】７ＰＡ２ ＣＭの８Ｅ５による免疫親和性精製から得られたアミノ末端配列の結果を示す図である。
【図８】アラマーブルーにより分析した、ヒト皮質ニューロンに対するＡＰＰ５１６〜６３８ポリペプチドおよびＡＰＰ５３６〜６３８ポリペプチドの毒性を示す図である。
【図９】分枝点平均（９Ａ）または細胞体からの平均分枝点距離（９Ｂ）により分析した、ヒト皮質ニューロンに対するＡＰＰ５１６〜６３８ペプチドおよびＡＰＰ５３６〜６３８ペプチドの毒性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
定義
アミノ酸置換を保存的置換または非保存的置換に分類するため、アミノ酸を以下の通りに群別する。グループＩ（疎水性側鎖）：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；グループＩＩ（中性の親水性側鎖）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；グループＩＩＩ（酸性の側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ；グループＩＶ（塩基性の側鎖）：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；グループＶ（鎖の配向に影響する残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ；およびグループＶＩ（芳香族側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。保存的置換は、同じクラス内におけるアミノ酸間の置換に関与する。非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のメンバーと交換するステップを構成する。
【００２０】
「ａｌｌ−Ｄ」という用語は、≧７５％、≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９５％、および１００％のＤ立体配置アミノ酸を有するペプチドを指す。
【００２１】
「作用物質」という用語は、薬理活性を有するまたは有しうる化合物について述べるのに用いる。作用物質は、既知の薬剤、薬理活性が同定されているがさらなる治療的評価を受けつつある化合物、ならびに薬理活性についてスクリーニングされるコレクションおよびライブラリーのメンバーである化合物を含む。
【００２２】
本発明の治療的作用物質は、望ましくない不純物を実質的に含まないことが通例である。これは、作用物質が、通例少なくとも約５０％ ｗ／ｗ（重量／重量）の純度であるほか、干渉性のタンパク質および不純物を実質的に含まないことを意味する。作用物質が、少なくとも約８０％ ｗ／ｗの純度であり、より好ましくは、少なくとも９０または約９５％ ｗ／ｗの純度であることもある。しかし、既存のタンパク質精製技術を用いると、少なくとも９９％ ｗ／ｗの均一なペプチドを得ることができる。本発明の治療的作用物質は、アミロイド沈着と関連する疾患の症状を緩和するか、同疾患を予防する（prevent, effect prophylaxis of）か、または同疾患を治療しうる。
【００２３】
２つの実体の間の特異的結合とは、実体が、無関係の抗原や、異なる抗原に対する抗体などの対照に対する各実体の親和性を少なくとも１０倍、１００倍、または１００倍上回る相互の親和性を有することを意味する。２つの実体の相互の親和性は、少なくとも１０７、１０８、１０９Ｍ−１または１０１０Ｍ−１であることが通例である。１０８Ｍ−１を超える親和性が好ましい。Ａβ内のエピトープに対するポリクローナル抗体の特異的結合とは、ポリクローナル抗体集団内における抗体が、Ａβの他のエピトープに結合する（適合するよう変化する）ことなしに、Ａβの１つのエピトープに特異的に結合することを意味する。
【００２４】
「抗体」または「免疫グロブリン」という用語は、完全な抗体およびその結合断片を含むように用いられる。断片は通例、それらが由来した完全な抗体と、抗原断片に対する特異的結合について競合し、個別の重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、およびＦｖを含む。別個の鎖は、ナノボディー（Ｎａｎｏｂｏｄｙ）抗体（すなわち、場合によってはヒト化された、ラクダまたはラマに由来する抗体重鎖の単離されたＶＨ断片）を含む。単離されたＶＨ断片は、ヒト抗体など他の供給源からも得ることができる。断片は、組み換えＤＮＡ技術により、または完全な免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的分離により作製される。「抗体」という用語は、他のタンパク質との融合タンパク質と化学的にコンジュゲートする、または同融合タンパク質として発現される、１つまたは複数の免疫グロブリンをも含む。「抗体」という用語は、二重特異的な抗体をも含む。二重特異的または二重機能的な抗体は、２つの異なる重／軽鎖対合および２つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。二重特異的抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含む各種の方法により作製することができる。例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第７９巻、３１５〜３２１頁、１９９０年；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１４８巻、１５４７〜１５５３頁、１９９２年を参照のこと。
【００２５】
非凝集Ａβまたはその断片とは、単量体ペプチド単位を意味する。非凝集Ａβまたはその断片は、一般に可溶性であり、自己凝集して可溶性オリゴマーを形成する能力がある。Ａβオリゴマーおよびその断片は、可溶性であることが通例であり、おもにαヘリックスまたはランダムコイルとして存在する。単量体Ａβを調製する１つの方法は、凍結乾燥したペプチドを、純ＤＭＳＯ中で超音波処理により溶解することである。結果として得られる溶液は、遠心分離して任意の不溶性粒子を除去する。凝集Ａβまたはその断片とは、単量体単位が非共有結合により結合され、不溶性のβシート構築物に組み上げられる、Ａβオリゴマーまたはその免疫原性断片を意味する。凝集Ａβまたはその断片は、原線維ポリマーをも意味する。原線維は、不溶性であることが通例である。
【００２６】
「抗原」とは、抗体が特異的に結合する実体である。
【００２７】
「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が反応する抗原の部位を指す。Ｂ細胞エピトープは、連続したアミノ酸またはタンパク質の３次元的な折りたたみにより並置される連続しないアミノ酸のいずれからも形成することができる。連続したアミノ酸から形成されるエピトープは、変性溶媒への曝露時に保持されるのが通例であるのに対し、３次元的な折りたたみにより形成されるエピトープは、変性溶媒による処置時に失われるのが通例である。エピトープは、固有の空間的構造内に少なくとも３のアミノ酸を含むのが通例であり、また、少なくとも５または８〜１０のアミノ酸を含むのがより通例である。エピトープの空間的構造を決定する方法は、例えば、ｘ線結晶解析および２次元核磁気共鳴法を含む。例えば、「Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、第６６巻、Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編、１９９６年を参照のこと。同一のエピトープを認識する抗体は、１つの抗体が標的抗原に対する別の抗体の結合を遮断する能力を示す、簡素なイムノアッセイにより同定することができる。Ｔ細胞は、ＣＤ８細胞に対する約９アミノ酸からなる連続的なエピトープ、またはＣＤ４細胞に対する約１３〜１５アミノ酸からなる連続的なエピトープを認識する。エピトープを認識するＴ細胞は、エピトープに応答する、初回抗原刺激を受けたＴ細胞による３Ｈ−チミジンの取り込み（Ｂｕｒｋｅら、Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．、第１７０巻、１１１０〜１１１９頁、１９９４年）、抗原依存的死滅（細胞傷害性Ｔリンパ球アッセイ、Ｔｉｇｇｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１５６巻、３９０１〜３９１０頁）、またはサイトカイン分泌が決定する通り、抗原依存的増殖を測定するｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにより同定することができる。
【００２８】
「免疫学的」応答または「免疫」応答という用語は、受容患者においてアミロイドペプチドに対して向けられる有益な体液性（抗体を介する）応答および／または細胞性（抗原特異的なＴ細胞またはその分泌産物を介する）応答の発現である。このような反応は、免疫原の投与によって誘導される能動応答、または抗体もしくは初回抗原刺激を受けたＴ細胞の投与によって誘導される受動応答でありうる。細胞性免疫応答は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞および／またはＣＤ８＋細胞傷害Ｔ細胞を活性化する、抗原特異的なクラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣ分子と関連するポリペプチドエピトープの提示により引き起こされる。該応答は、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、好塩基球、樹状細胞、星状膠細胞、小グリア細胞、好酸球、または生得的免疫の他の成分の活性化にも関与しうる。細胞媒介免疫応答の存在は、増殖アッセイ（ＣＤ４＋Ｔ細胞）またはＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）アッセイ（Ｂｕｒｋｅ、前出；Ｔｉｇｇｅｓ、前出を参照のこと）により判定することができる。免疫原の保護的または治療的効果に対する体液性応答および細胞性応答の相対的な寄与は、免疫感作した同遺伝子型の動物に由来する抗体およびＴ細胞を個別に単離し、別の対象における保護的または治療的効果を測定することにより識別することができる。
【００２９】
「免疫原性作用物質」または「免疫原」は、哺乳動物への投与時に、場合によってはアジュバントとの併用で、それ自体に対する免疫応答を誘発することができる。
【００３０】
「裸のポリヌクレオチド」という用語は、コロイド状の物質と複合体を形成しないポリヌクレオチドを指す。裸のポリヌクレオチドは、プラスミドベクター中にクローン化されることがある。
【００３１】
「アジュバント」という用語は、抗原と併用投与すると抗原に対する免疫応答を増大させるが、単独で投与すると抗原に対する免疫応答を生じない化合物を指す。アジュバントは、リンパ球の動員、Ｂ細胞および／またはＴ細胞の刺激、ならびにマクロファージの刺激を含むいくつかの機序により、免疫応答を増大させることができる。
【００３２】
「患者」という用語は、予防的または治療的な処置を受けるヒト対象および他の哺乳動物対象を含む。
【００３３】
抗体間の競合は、試験下の免疫グロブリンが、Ａβなどの共通抗原に対する基準抗体の特異的結合を阻害するアッセイにより判定する。多くの種類の競合的結合アッセイ、例えば、固相の直接または間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相の直接または間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドウィッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第９巻、２４２〜２５３頁、１９８３年を参照のこと）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１３７巻、３６１４〜３６１９頁、１９８６年を参照のこと）；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドウィッチアッセイ（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ社、１９８８年を参照のこと）；Ｉ−１２５標識を用いる固相直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌら、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第２５巻、第１号、７〜１５頁、１９８８年を参照のこと）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第１７６巻、５４６〜５５２頁、１９９０年）；および直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第３２巻、７７〜８２頁、１９９０年）が知られている。通例、こうしたアッセイは、固体表面に結合した精製抗原またはこれらのいずれかを有する細胞、非標識被験免疫グロブリン、および標識基準免疫グロブリンの使用を含む。競合的阻害は、被験免疫グロブリンの存在下において、固体表面または細胞に結合した標識の量を決定することにより測定する。通常、被験免疫グロブリンは、過剰に存在する。競合アッセイにより同定される抗体（競合抗体）は、基準抗体と同一のエピトープに結合する抗体、および基準抗体が結合するエピトープの十分近くに隣接するエピトープに結合して立体障害が生じる抗体を含む。通常、競合抗体が過剰に存在すると、共通抗原に対する基準抗体の特異的結合を、少なくとも５０または７５％阻害する。
【００３４】
長期増強（ＬＴＰ）とは、シナプスを介してメッセージを繰り返し送受信することにより発現する、ある種の「感受性の上昇」である。
【００３５】
列挙した１つまたは複数の要素を「含む」組成物または方法は、具体的に列挙しない他の要素を含んでよい。例えば、Ａβペプチドを含む組成物は、単離されたＡβペプチドと、より大きなポリペプチド配列の一成分としてのＡβペプチドとの両方を含む。
【００３６】
文脈から別段に明らかでない限り、本発明の各実施形態、各要素、各ステップ、または各特徴は、任意の他の実施形態、他の要素、他のステップ、または他の特徴と併用することができる。
【００３７】
Ｉ．全般
本出願は、部分的には、ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の新規の神経活性断片の同定を前提とする。断片は、ＡＰＰのＡβ領域に由来する配列を含むが、上流にも及ぶ。断片は通常水溶液中で可溶性であり、前述でＡβ「オリゴマー」として分類したのと同一の分子量分画において単離することができるのが通例である。大半のバンドは約１０ｋＤａ以上であり、Ａβ二量体または三量体の予測分子量には対応しない。Ａβオリゴマーとの分子量の類似性およびＡβ抗体に対する交差反応性のために、本断片は、擬似オリゴマー（fauxligomers）として知られる場合がある。断片とその小断片は、脳内におけるＡβの沈着を特徴とするアルツハイマー病および他のアミロイド形成性疾患を治療する免疫療法における免疫原として用いることができる。ＡＰＰの上流にある断片の一部に対する抗体、またはＡβと上流配列との間の境界も、このような治療法において用いることができる。断片は、疾患の診断もしくは予後予測または作用物質のスクリーニングで検出することができるマーカーとしても有用である。アルツハイマー病のトランスジェニック動物における、こうした断片のレベルを低減する能力について、作用物質をスクリーニングする。
【００３８】
ＩＩ．ＡＰＰとＡβ
ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、およびＡＰＰ７７０とは、それぞれ、ヒトＡＰＰ遺伝子がコードする、６９５、７５１、および７７０アミノ酸長のポリペプチドを指す。Ｋａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、第３２５巻、７７３頁、１９８７年；Ｐｏｎｔｅら、Ｎａｔｕｒｅ、第３３１巻、５２５頁、１９８８年；およびＫｉｔａｇｕｃｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ、第３３１巻、５３０頁、１９８８年を参照のこと。ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）内のアミノ酸には、別段に示さない限り、ＡＰＰ６９５アイソフォーム（配列番号２）の配列に従う番号が指定される。ヒト以外の種に由来するＡＰＰにおけるアミノ酸は、配列を最大限に整列した場合のヒトＡＰＰにおいて対応するアミノ酸の番号と同様に番号付けする。モルモットＡＰＰは、５４８および５５１位を含む複数の位置において、ヒトＡＰＰとは異なる。
【００３９】
アミロイド前駆体タンパク質は、その１つがＡβの産生をもたらす、少なくとも２つの経路を介してプロセシングされうる。Ａβの産生は、ＡβのＮ末端およびＡＴＦ−βＡＰＰとして知られるアミノ末端断片（米国特許第６，０１８，０２４号を参照のこと）を形成する、ＡＰＰの残基５９６および５９７の間におけるβセクレターゼによる切断により開始される。Ａβの末端は、ＡＰＰの膜貫通領域内での、γセクレターゼによる切断により形成される。別の、おそらくは非病理的経路では、ＡＰＰが、Ａβ配列内において、別の大きな分泌Ｎ末端断片およびＣ末端断片を産生するαセクレターゼにより切断される。
【００４０】
βアミロイドペプチド、またはＡ４ペプチドとしても知られる（米国特許第４，６６６，８２９号；ＧｌｅｎｎｅｒおよびＷｏｎｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ.Ｃｏｍｍｕｎ．、第１２０巻、１１３１頁、１９８４年を参照のこと）Ａβは、３９〜４３アミノ酸のペプチドであり、アルツハイマー病の特徴的なプラークの主要成分である。Ａβは、複数の自然発生形態を有する。Ａβの天然ヒト形態は、Ａβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２、およびＡβ４３と呼ばれる。これらのペプチドの配列およびＡＰＰ前駆体に対するその関係は、Ｈａｒｄｙら、ＴＩＮＳ、第２０巻、１５５〜１５８頁、１９９７年の図１により示される。例えば、Ａβ４２は、
【化１】
という配列を有する。
【００４１】
Ａβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２、およびＡβ４３などの用語は、それぞれ、アミノ酸残基１〜３９、１〜４０、１〜４１、１〜４２、および１〜４３を含むＡβペプチドを指す。Ａβ４１、Ａβ４０、およびＡβ３９は、Ｃ末端からのそれぞれ、Ａｌａ、Ａｌａ−Ｉｌｅ、およびＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｖａｌの欠落により、Ａβ４２とは異なる。Ａβ４３は、Ｃ末端におけるスレオニン残基の存在により、Ａβ４２とは異なる。同様に、ＡＰＰ５１６〜６３８という用語は、以下に記載の通り、ＡＰＰの残基５１６〜６３８からなるＡＰＰポリペプチド、好ましくは、Ｋａｎｇの天然ヒト配列を意味する。同様に、ＡＰＰ５３６〜６３８という用語は、残基５３６〜６３８からなるＡＰＰ断片を意味する。ＡＰＰ配列は、以下で詳細に論じる配列番号１のヒト配列またはその変異体でありうる。変異体を含む場合、変異体は、天然の対立遺伝子変異体、特に、コドン６４２（６９５の番号付け）における変異体の１つなど、アルツハイマー病に関連することが知られるまたは推測される天然の変異体であることが好ましい。このようなＡＰＰポリペプチドは、ＡＰＰに対する異種ペプチドに連結されうる、例えば、精製を支援しうる、または免疫応答を誘導しうる。類似の命名法を用いて、ＡＰＰ５１６〜６３９またはＡＰＰ５３６〜６３９など、他のＡＰＰ断片について記載する。
【００４２】
文脈から別段に明らかでない限り、ＡＰＰまたはＡβへの言及は、Ｋａｎｇ、前出（配列番号２）の天然ヒトアミノ酸配列のほか、対立遺伝子種および誘導された変異体を含む類似体を含む。ＡＰＰまたはＡβの類似体は、それぞれ、天然ヒトＡＰＰまたはＡβペプチドと特異的に結合する抗体を誘導する。ＡＰＰまたはＡβの類似体は、類似体の全長にわたり、天然ヒトＡＰＰまたはＡβ配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を示すことが通例である。アミノ酸置換は、保存的置換であることが多い。ＡＰＰにおける既知の対立遺伝子変異体の例は、Ｇｌｕ５９０Ａｓｐ（＊）、Ｌｙｓ／Ｍｅｔ５９５，５９６Ａｓｎ／Ｌｅｕ（＊、スウェーデン型）、Ａｌａ５９８Ｔｈｒ、Ｈｉｓ６０２Ａｒｇ（＊）、Ａｓｐ６０３Ａｓｎ（＊）、Ａｌａ６１７Ｇｌｙ、Ｇｌｕ６１８Ｇｌｙ（＊）、Ｇｌｕ６１８Ｇｌｎ、Ｇｌｕ６１８Ｌｙｓ、Ａｓｐ６１９Ａｓｎ（＊）、Ａｌａ６３８Ｔｈｒ（＊）、Ａｌａ６３８Ｖａｌ、Ｔｈｒ６３９Ｉｌｅ（＊）、Ｔｈｒ６３９Ａｌａ（＊）、Ｖａｌ６４０Ｍｅｔ（＊）、Ｖａｌ６４０Ｍｅｔ（＊）、Ｉｌｅ６４１Ｖａｌ（＊）、Ｉｌｅ６４１Ｔｈｒ（＊）、Ｖａｌ６４２Ｐｈｅ（＊）、Ｖａｌ６４２Ｇｌｙ（＊）、Ｖａｌ６４２Ｉｌｅ（＊）、Ｖａｌ６４２Ｌｅｕ（＊）、およびＬｅｕ６４８Ｐｒｏ（＊）を含む（＊＝アルツハイマー病と関連することが知られるまたは推測される）（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｒｕｍ ＡＰＰ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ、２００１年７月２４日改訂、を参照のこと）。断片は、天然のヒト配列と比べて、５つ以下の置換のみを含むことが通例である。
【００４３】
ＡＰＰまたはＡβまたはＡβ断片の一部の類似体はまた、１、２、５、１０箇所の位置において、またはすべての位置においても、非天然のアミノ酸またはＮ末端もしくはＣ末端のアミノ酸修飾を含む。例えば、Ａβの１および／または７位における天然のアスパラギン酸残基は、イソアスパラギン酸に置換されうる。非天然アミノ酸の例は、Ｄ−アミノ酸、αアミノ酸、α二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、４−ヒドロキシプロリン、γカルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、オメガ−Ｎ−メチルアルギニン、βアラニン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、チロキシン、γアミノ酪酸、ホモセリン、シトルリン、およびイソアスパラギン酸である。本発明の一部の治療的作用物質は、完全Ｄ型ペプチドである。断片および類似体は、以下に述べる通り、非処置またはプラセボ対照と比較するトランスジェニック動物において、予防的または治療的有効性についてスクリーニングすることができる。
【００４４】
ＡＰＰ、Ａβ、およびその断片、および類似体は、固相ペプチド合成もしくは組み換え発現により合成することができるか、または天然の供給源から得ることができる。自動ペプチド合成機が、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ州、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社など、多数の製造元から市販されている。組み換え発現は、大腸菌などの細菌、酵母、昆虫細胞または哺乳動物細胞などにおいて行うことができる。組み換え発現の手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、ニューヨーク、Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｐ．Ｐｒｅｓｓ社、第２版、１９８９年に記載されている。Ａβペプチドの一部の形態は、市販もされている（例えば、カリフォルニア州、サニーベール、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｃｏｍｐａｎｙ社、およびカリフォルニア州、ナパ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）。
【００４５】
ＩＩＩ．本発明による断片
本発明は、神経毒性を与えるＡＰＰ断片の新規のクラスを提供する。断片は、場合によっては、界面活性剤なしでも、中性ｐＨのトリス／ＮａＣｌ緩衝液中で、例えば、図８および／または図９Ａおよび図９Ｂに示す濃度範囲において可溶性である。断片は、ＡＰＰをコードする核酸をトランスフェクトしたトランスジェニック動物モデル、初代皮質細胞、および細胞系において見出されている。類似の分子量を有する断片は、アルツハイマー病患者においても見出すことができる。断片は、単離された形態においても提供される。断片は、例えば、実施例に記載の条件下において、ヒト皮質ニューロンに対する毒性を示すことが好ましい。断片は、ＡＰＰのＡβ領域の上流の配列の存在を特徴とする。上流の配列は、ＡＰＰの５５１〜５９５または５９６位の間の少なくとも２５の連続したアミノ酸であることが通例である。一部の断片は、ＡＰＰの５５１〜５９５または５９６位の間の各残基を含む。断片は、約５０〜２００アミノ酸、好ましくは、８０〜１００アミノ酸、８５〜９５アミノ酸の長さを有する。こうして、断片は、ＡＰＰのＮ末端の実質的な部分（例えば、少なくとも約１００〜約４００）を欠く。一部の断片は、ＡＰＰのＣ末端までいっぱいに延びるのでなく、残基６７６〜６９５からなるＡＰＰ断片に対して惹起された１３Ｇ８など、ＡＰＰのＣ末端抗体に対する特異的結合を欠く。一部の断片は、ＡＰＰのＡβ領域からの配列およびその上流の付加配列を含む。一部のこのような断片は、第１のセグメントがＡβに由来し、第２のセグメントがＡβの上流にあり、第１および第２のセグメントがＡＰＰの連続した断片を形成する第１および第２のセグメントを含む。例えば、一部の断片は、ＡＰＰの残基５４８または５５１に始まり残基６３６、６３７、６３８、または６３９（それぞれ、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２、およびＡβ４３のＣ末端）まで延びるＡＰＰのセグメントを含む。好ましい断片は、ＡＰＰの５４８〜６３８位に由来する残基からなる。一部の断片は、ＡＰＰの残基５１６〜５２５および／または５３６〜５４５を含む。一部の断片は、ＡＰＰの４４４〜５５０の間の残基に始まり、同６３６、６３７、６３８、または６３９からなる群から選択される残基に終わる。一部の断片は、ＡＰＰの４４４〜５５０の間の残基に始まり、６３６〜６７５位の間の残基に終わる。一部の断片は、ＡＰＰの４４４〜５５０位の間の残基に始まり、同残基５９５または５９６〜６７５の間の位置に終わる。一部の断片は、ＡＰＰの残基５３５または５３６に始まり、同残基６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、または６４２からなる群から選択される残基に終わる。一部の断片は、ＡＰＰの残基５１６に始まり、同残基６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、または６４２に終わる。好ましい断片は、ＡＰＰ５１６〜６３８、ＡＰＰ５１６〜６３９、ＡＰＰ５３６〜６３８、ＡＰＰ５３６〜６３９を含む。
【００４６】
一部の断片は、Ａβ領域の上流のＡＰＰにおいてエピトープを有するモノクローナル抗体に特異的に結合する能力を特徴とする。結合は、例えば、活性化ＮＨＳセファロース（登録商標）樹脂に連結された抗体を用いて検出することができる。これらの抗体は、（ＡＰＰ４４４〜５９２に対して産生された）８Ｅ５および（ＡＰＰ５３０〜５８０に対して産生された）８Ｅ１０を含む。一部の断片は、Ａβ内にエピトープを有する特定の抗体にも特異的に結合する（実施例を参照のこと）。
【００４７】
治療的な目的のためには、上記の断片の小断片を投与することができる。小断片は、ヒトＡＰＰの５５１〜５９５または５９６位の間の少なくとも４、５、７、１０、１５、または２５の連続した残基を含む、または同残基からなることが通例であるが、これらの配列座標を超えて延びることもありうる。場合によっては、ＡＰＰの小断片は、５１６〜５９６位の間、または５３６〜５９６位の間にある、ＡＰＰの４〜２５残基、好ましくは、ＡＰＰの５〜１５残基、もしくは同５〜１０残基からなる。
【００４８】
ＩＶ．本発明の抗体
本発明は、ヒトアミロイド前駆体タンパク質の残基４４４〜５９５、４４４〜５９６、または４４４〜５９２内のエピトープに特異的に結合する抗体を提供する。一部の抗体は、５４８および５５１位においてヒトＡＰＰと異なるモルモットＡＰＰには特異的に結合せず、ヒトＡＰＰに特異的に結合する能力を特徴とする。一部の抗体は、ヒトＡＰＰの残基５４０〜５９５、または同５４０〜５９６内のエピトープに特異的に結合する。一部の抗体は、ヒトＡＰＰの残基５４５〜５９５、または同５４５〜５９６内のエピトープに特異的に結合する。一部の抗体は、ヒトＡＰＰの残基５４５〜５５５内のエピトープに特異的に結合する。一部の抗体は、ヒトＡＰＰの残基５３０〜５８０内のエピトープに特異的に結合する。
【００４９】
２つの例示的な抗体は、８Ｅ５および１８Ｂ１０である。該抗体は、それぞれ、８Ｅ５および１８Ｂ１０と呼ばれるハイブリドーマにより産生されるマウスモノクローナル抗体である。本明細書で参照される他の抗体も同様に、別段に注記しない限り、同名のハイブリドーマから産生されるマウス抗体である。８Ｅ５は、残基４４４〜５９５からなるヒトＡＰＰの断片に対して惹起された。しかし、８Ｅ５は、残基５４８および５５１においてヒトＡＰＰと異なるモルモットＡＰＰには特異的に結合せず、これにより、ＡＰＰのこれらの残基を含むセグメントまたはこれに近接するセグメントにエピトープを限定する。１８Ｂ１０は、残基残基５３０〜５８０からなるＡＰＰ断片に対して惹起された。本発明は、ヒトＡＰＰに対する特異的結合について、８Ｅ５または１８Ｂ１０と競合する抗体をさらに提供する。抗体間の競合とは、これらが同一のエピトープ、または抗体の結合がヒトＡＰＰに対する互いの特異的結合を干渉し合うほどに近接するエピトープに結合することを指す。
【００５０】
本発明は、Ａβまたは上流配列に単独で特異的に結合することなく、Ａβと上流配列との間の接合部または境界に特異的に結合する抗体をも提供する。このような抗体のエピトープは、Ａβ領域に由来する少なくとも１つのＡＰＰ残基およびＡβ領域の上流の少なくとも１つの残基を含む。
【００５１】
本発明は、本発明の新規の断片のＮ末端に末端特異的アミノ酸をさらに提供する。このような断片のＮ末端は、ヒトＡＰＰのコドン５３０〜５６０の間、またはヒトＡＰＰの残基５４０〜５５１または同５３５〜５５５の間でありうる。一部の末端特異的抗体は、断片ＡＰＰ５１６〜６３８もしくはＡＰＰ５１６〜６３９、または断片ＡＰＰ５３６〜６３８もしくはＡＰＰ５３６〜６３９のＮ末端に末端特異的である。末端特異的とは、抗体が、全長ＡＰＰ（断片を内部配列として含む）に特異的に結合することなく、このような断片のＮ末端に特異的に結合することを意味する。
【００５２】
抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルでありうる。ポリクローナル血清は、ＡＰＰの全長に沿う複数のエピトープに特異的に結合する抗体の混合集団を含むことが通例である。しかし、ポリクローナル血清は、ＡＰＰ５５１〜５９５または同５５１〜５９６などの特定のＡＰＰセグメントに特異的でありうる。好ましい抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体（Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８６巻、１００２９〜１００３３頁、１９８９年、および国際公開第９０／０７８６１号、米国特許第５，６９３，７６２号、米国特許第５，６９３，７６１号、米国特許第５，６８５，０８９号、米国特許第５，５３０，１０１号、およびＷｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号を参照のこと）、またはヒト抗体（Ｌｏｎｂｅｒｇら、国際公開第９３／１２２２７号、１９９３年；米国特許第５，８７７，３９７号、米国特許第５，８７４，２９９号、米国特許第５，８１４，３１８号、米国特許第５，７８９，６５０号、米国特許第５，７７０，４２９号、米国特許第５，６６１，０１６号、米国特許第５，６３３，４２５号、米国特許第５，６２５，１２６号、米国特許第５，５６９，８２５号、米国特許第５，５４５，８０６号、Ｎａｔｕｒｅ、第１４８巻、１５４７〜１５５３頁、１９９４年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１４巻、８２６頁、１９９６年、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ、国際公開第９１／１０７４１号、１９９１年、欧州特許第１４８００８号、Ｂｌｅｃｋ、Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｊｏｕｒｎａｌ、第１巻、２００５年９／１０月、米国特許出願第２００４１３２０６６号、米国特許出願第２００５００８６２５号、国際公開第２００４０７２２６６号、国際公開第２００５０６５３４８号、国際公開第２００５０６９９７０号、および国際公開第２００６０５５７７８号）である。８Ｅ５または１８Ｂ１０のヒト化形態またはキメラ形態が好ましい。ヒト化抗体またはキメラ抗体には、ヒトアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４を用いることができる。ヒトアイソタイプＩｇＧ１は、食細胞におけるＦｃＲＩ受容体に対し、ヒトアイソタイプで最も高い親和性を有する。一部の抗体は、約１０７、１０８、１０９、または１０１０Ｍ−１以上の結合親和性でＡＰＰに特異的に結合する。
【００５３】
Ｖ．スクリーニング法
本発明の新規の断片は、アルツハイマー病および脳内におけるＡβの沈着を特徴とする他の疾患の治療に有用な薬理活性について作用物質をスクリーニングするのに有用である。スクリーニングは、アルツハイマー病のトランスジェニック動物モデルまたはＡＰＰを発現する細胞において実施するのが通例である。トランスジェニック動物モデルは、ＡＰＰを発現し、これをＡβおよび他の断片にプロセシングする。その１つまたは複数が本発明の断片である。同様に、ＡＰＰを発現する細胞は、これをＡβおよび本発明の１つまたは複数の断片にプロセシングする。該方法は、トランスジェニック動物モデルまたは細胞を被験作用物質に接触させるステップと、該動物の脳内または細胞培地内における本発明の断片のレベルを測定するステップとを伴う。断片は、脳から実施例に記載の可溶性分画中に抽出することができる。脳内また細胞培地内における断片のレベルは、スクリーニングされている作用物質で処置していない対照のトランスジェニック動物または細胞中における断片の対応するレベルと比較する。本発明の断片レベルが測定誤差の通常の限界を超えて低下する場合は、スクリーニングされている作用物質が、アルツハイマー病および脳内におけるＡβの沈着を特徴とする他の疾患の治療に有用な薬理活性を有することを示す。
【００５４】
トランスジェニック動物モデルは、一般に、ＡＰＰがＡβおよび他の断片にプロセシングされ、該動物がアルツハイマー病の１つまたは複数の特徴を発現しやすいよう、ＡＰＰおよびこれに作動的に連結する１つまたは複数の調節エレメントをコードする核酸を含むゲノムを有する。このようなモデルは、例えば、Ｇａｍｅｓら、前出が述べるＡＰＰの７１７（ＡＰＰ７７０の番号付け）突然変異を有するマウス、およびＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅら、米国特許第５，６１２，４８６号およびＨｓｉａｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７４巻、９９頁、１９９６年；Ｓｔａｕｆｅｎｂｉｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９４巻、１３２８７〜１３２９２頁、１９９７年；Ｓｔｕｒｃｈｌｅｒ−Ｐｉｅｒｒａｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９４巻、１３２８７〜１３２９２頁、１９９７年；Ｂｏｒｃｈｅｌｔら、Ｎｅｕｒｏｎ、第１９巻、９３９〜９４５頁、１９９７年；Ｒｉｃｈａｒｄｓら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．第２３巻、８９８９〜９００３頁、２００３年；Ｃｈｅｎｇ、Ｎａｔ Ｍｅｄ．、第１０巻、第１１号、１１９０〜１１９２頁、２００４年；Ｈｗａｎｇら、Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．、２００４年３月などが述べるＡＰＰの６７０／６７１（ＡＰＰ７７０の番号付け）スウェーデン変異を有するマウスを含む。トランスジェニック動物における封入体に適するＡＰＰ突然変異は、野生型Ｖａｌ７１７（ＡＰＰ７７０の番号付け）コドンのＩｌｅ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、またはＧｌｎに対するコドンへの転換を含む。Ｖａｌ７１７に対する好ましい置換はＰｈｅである。別の適切な突然変異は、北極変異Ｅ６９３Ｇ（ＡＰＰ７７０の番号付け）である。アミロイド前駆体タンパク質およびプレセニリントランス遺伝子をともに有するＰＳＡＰＰマウスは、Ｔａｋｅｕｃｈｉら、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２０００年、第１５７巻、３３１〜３３９頁に記載されている。アミロイド前駆体タンパク質、プレセニリン、およびタウトランス遺伝子を有する三重トランスジェニックマウスは、ＬａＦｅｒｌａ、２００３年、Ｎｅｕｒｏｎ、第３９巻、４０９〜４２１頁に記載されている。別の有用なトランスジェニックマウスは、ＡＰＰトランス遺伝子およびＴＧＦ−βトランス遺伝子を有する。トランス遺伝子中のタンパク質をコードする配列は、神経発現に適する１つまたは複数の調節エレメントと作動的に連結される。このようなエレメントは、ＰＤＧＦ、プリオンタンパク質、およびＴｈｙ−１プロモーターを含む。別の有用なトランスジェニックマウスは、スウェーデン変異および７１７変異をともに有するＡＰＰトランス遺伝子を有する。別の有用なトランスジェニックマウスは、北極変異（Ｅ６９３Ｇ）を有するＡＰＰトランス遺伝子を有する。
【００５５】
適切な細胞は、検出可能な量のＡＰＰを天然に発現する細胞、およびその発現を確保する少なくとも１つの調節的配列と作動的に連結されるＡＰＰをコードする核酸をトランスフェクトした細胞を含む。適切な細胞株にはヒト細胞株および動物細胞株が含まれ、２９３ヒト腎細胞株、ヒト神経膠腫細胞株、ヒトＨｅＬａ細胞、初代上皮細胞（例えば、ＨＵＶＥＣ細胞）、初代ヒト線維芽細胞または同リンパ芽球（ＡＰＰ突然変異を有する患者に由来する内生細胞を含む）、初代ヒト混合脳細胞（ニューロン、星状膠細胞および神経膠を含む）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などが含まれる。
【００５６】
本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて本発明の断片を神経細胞と接触させ、作用物質で処置しない同種類の対照細胞と比べた保護作用について作用物質をスクリーニングするスクリーニング法をさらに提供する。細胞は、皮質細胞、好ましくはヒト皮質細胞の初代培養物である。神経毒性は、ＬＤ５０値として、長期増強に対する効果として、アラマーブルー染色により、または実施例に記載の分枝数または分枝距離に対する効果により測定することができる。
【００５７】
このような方法により活性についてスクリーニングされる作用物質は、可溶性断片の濃度を多様な機序により低下させることができる。１つの機序は、断片を生成するのを担う酵素の阻害を介する。これらの酵素は、Ｃ末端を生成するγセクレターゼおよびＮ末端を生成する未だ同定されない酵素を含み得る。こうして、スクリーニング対象の作用物質は、βセクレターゼまたはγセクレターゼの阻害について既に同定されている阻害剤を含むプロテアーゼ阻害剤を含む。他の作用物質は、例えば、海洋微生物、藻類、植物、および真菌などの天然の供給源から得ることができる。あるいは、化合物は、ペプチドもしくは小分子を含む作用物質のコンビナトリアルライブラリーから、または産業において、例えば、化学産業、製薬産業、環境産業、農業、水産業、化粧品産業、製薬業、およびバイオテクノロジー産業により合成される化合物の既存のレパートリーから得ることができる。化合物は、例えば、薬剤、治療物質、環境作用物質、農業用作用物質、または産業用作用物質、汚染物質、化粧品、薬物、有機化合物、脂質、グルココルチコイド、抗生剤、ペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、およびキメラ分子を含むことができる。
【００５８】
ペプチドまたは他の化合物の無作為ライブラリーもスクリーニングすることができる。段階的に合成することのできる多種類の化合物について、コンビナトリアルライブラリーを作製することができる。このような化合物は、ポリペプチド、βターン模倣体、多糖、リン脂質、ホルモン、プロスタグラジン、ステロイド、芳香族化合物、ヘテロ環化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーＮ置換型グリシン、およびオリゴカルバミン酸を含む。大規模の化合物コンビナトリアルライブラリーは、Ａｆｆｙｍａｘ、国際公開第９５／１２６０８号、Ａｆｆｙｍａｘ、国際公開第９３／０６１２１号、コロンビア大学、国際公開第９４／０８０５１号、米国薬局方、国際公開第９５／３５５０３号、およびＳｃｒｉｐｐｓ、国際公開第９５／３０６４２号（これらの各々は、すべての目的について、参照により組み入れられる）に記載のコードされた合成ライブラリー（encoded synthetic libraries）（ＥＳＬ）法により構築することができる。ペプチドライブラリーは、ファージディスプレイ法によっても作製することができる。例えば、Ｄｅｖｌｉｎ、国際公開第９１／１８９８０号を参照のこと。
【００５９】
ＶＩ．コンジュゲート
ペプチドの免疫原は、適切な担体分子に連結することにより、該ペプチドに対する抗体を含む免疫応答を引き起こす一助となるコンジュゲートを形成することができる。単一の作用物質は、単一の担体に連結することができ、作用物質の多重コピーは、後に相互に連結し合う担体の多重コピーに連結することができ、作用物質の多重コピーは、担体の単一コピーに連結することができ、または作用物質の単一コピーは、担体の多重コピーもしくは異なる担体に連結することができる。適切な担体は、血清アルブミン、キーホールリンペットヒモシアニン、免疫グロブリン分子、Ｑβ（国際公開第０４／０１６２８２号）、サイログロブリン、オボアルブミン、破傷風トキソイド、あるいはジフテリア菌、大腸菌、コレラ菌もしくはピロリ菌などの他の病原菌に由来するトキソイドまたは弱毒化した毒素誘導体を含む。Ｔ細胞エピトープも、適切な担体分子である。他の適切な担体は、Ｂ型肝炎ウイルス、百日咳菌、破傷風菌、ペルツサリア・トラキタリーナ（Ｐｅｒｔｕｓａｒｉａ ｔｒａｃｈｙｔｈａｌｌｉｎａ）、大腸菌、トラコーマクラミジア、ジフテリア菌、熱帯熱マラリア原虫、およびマンソン住血吸虫に由来するヘルパーＴ細胞無差別エピトープ（米国特許第６，９０６，１６９号、米国特許出願第２００３−００６８３２５号、および国際公開第２００２／０９６３５０号を参照のこと）を含む。他の担体は、破傷風毒素、百日咳毒素、ジフテリア毒素、麻疹ウイルスＦタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、トラコーマクラミジア主要外膜タンパク質、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質、マンソン住血吸虫トリオースリン酸イソメラーゼ、または大腸菌ＴｒａＴに由来するヘルパーＴ細胞エピトープ（国際公開第０１／４２３０６号を参照のこと）である。
【００６０】
一部のコンジュゲートは、本発明の作用物質を免疫刺激性ポリマー分子（例えば、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリンシステイン（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）、マンナン（マンノースポリマー）、またはグルカン（β１→２ポリマー））、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１αおよびβペプチド、ＩＬ−２、γＩＮＦ、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ）、およびケモカイン（例えば、ＭＩＰ１αおよびβ、ならびにＲＡＮＴＥＳ）に連結することにより形成することができる。Ｏ’Ｍａｈｏｎｙ、国際公開第９７／１７６１３号および国際公開第９７／１７６１４号に記載の通り、免疫原性作用物質は、組織を横断しての輸送を高めるペプチドにも連結することができる。免疫原は、スペーサーアミノ酸（例えば、ｇｌｙ−ｇｌｙ）を有するまたは有さない担体に連結されうる。
【００６１】
一部のコンジュゲートは、本発明の作用物質を少なくとも１つのＴ細胞エピトープに連結することにより形成することができる。Ｔ細胞無差別エピトープもあるが、Ｔ細胞普遍エピトープもある。Ｔ細胞無差別エピトープは、多様なＨＬＡ型を示す広範な対象におけるＴ細胞免疫性の誘発を高める能力を有する。Ｔ細胞無差別エピトープに対して、Ｔ細胞普遍エピトープは、異なるＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子によりコードされる多様なＨＬＡ分子を示す対象の大半、例えば、少なくとも７５％におけるＴ細胞免疫性の誘発を高める能力を有する。
【００６２】
破傷風トキソイド（例えば、Ｐ２およびＰ３０エピトープ）、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、百日咳トキソイド、麻疹ウイルスＦタンパク質、トラコーマクラミジア主要外膜タンパク質、ジフテリアトキソイド、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質Ｔ、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質抗原、マンソン住血吸虫トリオースリン酸イソメラーゼ、大腸菌ＴｒａＴ、およびインフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）など多数の天然のＴ細胞エピトープが存在する。本発明の免疫原性ペプチドは、Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ Ｆ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、第３３６巻、７７８〜７８０頁、１９８８年；Ｃｈｉｅｚ Ｒ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、第１７８巻、２７〜４７頁、１９９３年；Ｈａｍｍｅｒ Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ、第７４巻、１９７〜２０３頁、１９９３年；Ｆａｌｋ Ｋ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、第３９巻、２３０〜２４２頁、１９９４年；国際公開第９８／２３６３５号；および、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄ Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１６０巻、３３６３〜３３７３頁、１９９８年（これらの各々は、すべての目的について、参照により組み入れられる）に記載のＴ細胞エピトープとコンジュゲートすることもできる。さらなる例は：
インフルエンザ赤血球凝集素：ＨＡ３０７〜３１９
マラリアスポロゾイト周囲タンパク質：Ｔ３エピトープ ＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶ（配列番号３）
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原：ＨＢｓＡｇ１９〜２８ ＦＦＬＬＴＲＩＬＴＩ（配列番号４）
熱ショックタンパク質６５：ｈｓｐ６５１５３〜１７１ ＤＱＳＩＧＤＬＩＡＥＡＭＤＫＶＧＮＥＧ（配列番号５）
カルメット−ゲラン桿菌 ＱＶＨＦＱＰＬＰＰＡＶＶＫＬ（配列番号６）
破傷風トキソイド：ＴＴ８３０〜８４４ ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号７）
破傷風トキソイド：ＴＴ９４７〜９６７ ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ（配列番号８）
ＨＩＶｇｐ１２０Ｔ１：ＫＱＩＩＮＭＷＱＥＶＧＫＡＭＹＡ（配列番号９）
【００６３】
あるいは、コンジュゲートは、本発明の作用物質を、ｐａｎ ＤＲエピトープ（「ＰＡＤＲＥ」）など、大部分のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有する、少なくとも１つの人工Ｔ細胞エピトープに連結することによって作製することができる。ＰＡＤＲＥは、米国特許第５，７３６１４１号、国際公開第９５／０７７０７号、およびＡｌｅｘａｎｄｅｒ Ｊら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、第１巻、７５１〜７６１頁、１９９４年（これらの各々は、すべての目的について、参照により組み入れられる）に記載されている。好ましいＰＡＤＲＥペプチドは、ＡＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号１１）であり、Ｘは、シクロヘキシルアラニンチロシンまたはフェニルアラニンであることが好ましく、シクロヘキシルアラニンが最も好ましい。
【００６４】
免疫原性作用物質は、化学的架橋形成により担体に連結することができる。免疫原を担体に連結する技術は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジル−チオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）およびスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸（ＳＭＣＣ）を用いるジスルフィド結合の形成を含む（ペプチドがスルフヒドリル基を欠く場合、システイン残基の付加により供給することができる）。これらの試薬は、自身と１つのタンパク質におけるペプチドのシステイン残基との間のジスルフィド結合、およびリシンにおけるイプシロンアミノ基または他のアミノ酸における他の遊離アミノ基を介するアミド結合を形成する。このような各種のジスルフィド／アミド形成試薬は、Ｉｍｍｕｎ．Ｒｅｖ.、第６２巻、１８５頁、１９８２年に記載されている。他の二機能結合作用物質は、ジスルフィド結合よりもむしろチオエーテルを形成する。これらのチオエーテル形成作用物質の多くは市販されており、６−マレイミドカプロン酸、２−ブロモ酢酸、および２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸の反応性エステルを含む。カルボキシル基は、これらをスクシンイミドまたは１−ヒドロキシル−２−ニトロ−４−スルホン酸、ナトリウム塩と組み合わせて活性化することができる。
【００６５】
免疫原性は、Ｔｈエピトープと本発明のペプチド免疫原との間にスペーサー残基（例えば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）を付加することにより改善することができる。ＴｈエピトープをＢ細胞エピトープ（すなわち、ペプチド免疫原）から物理的に分離することに加えて、グリシン残基が、Ｔｈエピトープをペプチド免疫原と接合することによって創出される任意の人工的な二次構造を解体し、それによってＴ細胞応答および／またはＢ細胞応答の間の干渉を除去することができる。こうして、ヘルパーエピトープと抗体誘発ドメインとの間の立体構造的分離が、提示される免疫原と適切なＴｈ細胞およびＢ細胞との間のより有効な相互作用を可能にする。
【００６６】
本発明の作用物質に対して多様なＨＬＡ型を示す大部分の対象におけるＴ細胞免疫性の誘発を高めるために、異なるＴｈ細胞エピトープを有するコンジュゲートの混合物を調製することができる。混合物は、異なるＴｈ細胞エピトープを有する少なくとも２つのコンジュゲートの混合物、異なるＴｈ細胞エピトープを有する少なくとも３つのコンジュゲートの混合物、または異なるＴｈ細胞エピトープを有する少なくとも４つのコンジュゲートの混合物を含んでよい。混合物は、アジュバントとともに投与してよい。
【００６７】
免疫原性ペプチドは、担体（すなわち、異種ペプチド）との融合タンパク質としても発現することができる。免疫原性ペプチドは、そのアミノ末端、カルボキシル末端、またはその両方において、担体と連結することができる。場合によっては、免疫原性ペプチドの多重反復が、融合タンパク質において存在しうる。場合によっては、免疫原性ペプチドは、例えば、該ペプチドのＮ末端およびＣ末端の両方において異種ペプチドの多重コピーに連結することができる。場合によっては、免疫原性ペプチドの多重コピーは、相互に連結し合う異種ペプチドの多重コピーに連結することができる。一部の担体ペプチドは、担体ペプチドに対するヘルパーＴ細胞反応を誘発する一助となる。次いで誘発されたヘルパーＴ細胞は、担体に連結された免疫原性ペプチドに対するＢ細胞応答を誘発する。
【００６８】
一部の融合タンパク質は、米国特許第５，１９６，５１２号、欧州特許第３７８，８８１号、および欧州特許第４２７，３４７号などに記載の破傷風トキソイドエピトープに連結された本発明のＡＰＰセグメントを含む。一部の融合タンパク質は、米国特許第５，７３６，１４２号に記載の少なくとも１つのＰＡＤＲＥペプチドに連結された本発明のＡＰＰセグメントを含む。Ｔ細胞無差別エピトープである異種ペプチドもあり、Ｔ細胞普遍エピトープである異種ペプチドもある。一部の方法において、投与用の作用物質は、単に、異種セグメントと線状形態で連結した本発明のＡＰＰセグメントとの単一の融合タンパク質である。本発明の治療用作用物質は、式を用いて表すことができる。例えば、一部の方法において、作用物質は、ｘを１〜５の整数とする式２ｘにより表される融合タンパク質のマルチマーである。ｘは、１、２、または３であることが好ましく、２が最も好ましい。ｘが２であるとき、このようなマルチマーは、ＭＡＰ４と呼ばれる（米国特許第５，２２９，４９０号を参照のこと）好ましい立体構造に連結された４つの融合タンパク質を有する。
【００６９】
担体の他の例は、国際公開第２００４０６９１８２号に記載されている。本出願に記載のＡＰＰ断片は、国際公開第２００４０６９１８２号に記載のコンジュゲートに連結されたＡβ断片の代わりに用いることができる。
【００７０】
同一または類似の担体タンパク質および連結法は、ＡＰＰまたはその免疫原性断片に対する抗体の生成に用いる免疫原の生成に用いることができる。例えば、担体に連結されたＡＰＰまたはＡＰＰの免疫原性断片は、ＡＰＰまたはその免疫原性断片に対するモノクローナル抗体の作製において、実験動物に投与することができる。
【００７１】
ＶＩＩ．ＤＮＡ免疫感作
ＡＰＰセグメントに対する免疫応答は、本発明の新規の断片およびその小断片、他のペプチド免疫原、または受動免疫感作に用いる抗体およびその成分鎖をコードする核酸の投与によっても誘発することができる。このような核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡでありうる。免疫原または抗体をコードする核酸セグメントは、目的とする患者の標的細胞におけるＤＮＡセグメントの発現を可能とするプロモーターおよびエンハンサーなどの調節エレメントに連結されることが通例である。軽鎖または重鎖免疫グロブリン遺伝子に由来するプロモーターおよびエンハンサーエレメントまたはＣＭＶ主要中間初期プロモーターおよび同エンハンサーが、発現を導くのに適する。連結された調節エレメントおよびコード配列は、ベクター内にクローン化されることが多い。二本鎖抗体を投与する場合は、同一または別個のベクターにおいて該二本鎖をクローン化することができる。
【００７２】
レトロウイルス系（例えば、ＬａｗｒｉｅおよびＴｕｍｉｎ、Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．、第３巻、１０２〜１０９頁、１９９３年を参照のこと）；アデノウイルスベクター（例えば、Ｂｅｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、第６７巻、５９１１頁、１９９３年を参照のこと）；アデノ関連ウイルスベクター（例えば、Ｚｈｏｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、第１７９巻、１８６７頁、１９９４年を参照のこと）、ワクシニアウイルスおよび鶏痘ウイルスを含むポックスファミリーに由来するウイルスベクター、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林熱ウイルスに由来するウイルスベクター（例えば、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、第７０巻、５０８〜５１９頁、１９９６年を参照のこと）などのアルファウイルス属に由来するウイルスベクター、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（米国特許第５，６４３，５７６号を参照のこと）、および水胞性口内炎ウイルス（国際公開第９６／３４６２５号を参照のこと）および乳頭腫ウイルス（Ｏｈｅら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、第６巻、３２５〜３３３頁、１９９５年；Ｗｏｏら、国際公開第９４／１２６２９号、ならびに、ＸｉａｏおよびＢｒａｎｄｓｍａ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２４巻、２６３０〜２６２２頁、１９９６年）などのラブドウイルスを含む多数のウイルスベクター系を用いることができる。
【００７３】
免疫原をコードするＤＮＡまたはそのＤＮＡを含むベクターは、リポソーム中に封入することができる。適切な脂質および関連の類似体は、米国特許第５，２０８，０３６号、同第５，２６４，６１８号、同第５，２７９，８３３号、および同第５，２８３，１８５号により記載されている。ベクターおよび免疫原をコードするＤＮＡは、その例がポリメチルメタクリレートポリマーおよびポリラクチドおよびポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（例えば、ＭｃＧｅｅら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏ Ｅｎｃａｐ．、１９９６年を参照のこと）を含む粒子状の担体に吸着または結合させることもできる。
【００７４】
遺伝子治療用ベクターまたは裸のＤＮＡは、通例では全身投与（例えば、静脈内注入、腹腔内注入、鼻腔内注入、胃内注入、皮内注入、筋肉内注入、皮下注入、または頭蓋内注入）または外用塗布（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照のこと）により、個々の患者にｉｎ ｖｉｖｏにおいて送達することができる。このようなベクターは、ブピバカイン（米国特許第５，５９３，９７０号）などの促進化作用物質をさらに含むことができる。ＤＮＡは、遺伝子銃を用いて投与することもできる。ＸｉａｏおよびＢｒａｎｄｓｍａ、前出、を参照のこと。免疫原をコードするＤＮＡは、微細な金属ビーズの表面に沈析させる。微小発射体は、ショック波または膨張ヘリウムガスにより加速され、複数細胞層の深さまで組織に貫入する。例えば、ウィスコンシン州、ミドルトン、Ａｇａｃｅｔｕｓ社製のＡｃｃｅｌ（商標）遺伝子送達器が適する。あるいは、単に、化学的または機械的な刺激とともに皮膚上にＤＮＡを塗布することにより、裸のＤＮＡは、皮膚を経て血流中に移行しうる（国際公開第９５／０５８５３号を参照のこと）。
【００７５】
さらなる変更において、免疫原をコードするベクターは、個々の患者から外植される細胞（例えば、リンパ球、骨髄吸引物、組織生検）または万能供血者の造血幹細胞などの細胞に、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて送達し、続いて、通常はベクターを組み込んだ細胞の選択後に該細胞を患者に再移植することができる。
【００７６】
ＶＩＩＩ．治療しやすい患者
治療しやすい患者は、疾患の危険性があるが症状を示さない個体のほか、現在症状を示す患者をも含む。治療対象となる疾患は、アルツハイマー病、ならびに、ダウン症および軽度の認知障害など、脳内におけるＡβの沈着を特徴とする他の疾患を含む。アルツハイマー病の場合、十分に長生きするほとんどだれもが、アルツハイマー病に罹患する危険性がある。従って、本方法は、対象患者の危険性に対する評価の必要なしに、一般の集団に予防的に実施することができる。本方法は、特に、アルツハイマー病の既知の遺伝的危険性を有する個体に有用である。このような個体は、本疾患を経験した親族を有する個体、遺伝的または生化学的マーカーの解析によりその危険性が決定される個体を含む。アルツハイマー病への危険性の遺伝的マーカーは、ＡＰＰ遺伝子における突然変異、特に、ハーディー変異およびスウェーデン変異と呼ばれる７１７位ならびに６７０および６７１位における突然変異を含む（Ｈａｒｄｙ、ＴＩＮＳ、前出、を参照のこと）。危険性の他のマーカーは、プレセニリン遺伝子であるＰＳ１およびＰＳ２、ならびにアポＥ４における突然変異、ＡＤ、高コレステロール血症、またはアテローム性動脈硬化の家族歴である。現在アルツハイマー病に罹患する個体は、特徴的な認知症のほか、上述の危険性因子の存在からも認知することができる。加えて、ＡＤを有する個体を同定する多数の診断検査が可能である。これらは、ＣＳＦ中のタウレベルおよびＡβ４２レベルの測定を含む。タウレベルの上昇およびＡβ４２レベルの低下が、ＡＤの存在を意味する。アルツハイマー病に罹患する個体は、実施例セクションで論じるＡＤＲＤＡ基準によっても診断することができる。
【００７７】
無症状患者の場合、治療はどの年齢（例えば、１０、２０、３０歳）においても開始することができる。しかし、患者が４０、５０、６０、または７０歳に達するまでは治療を開始する必要はないことが通例である。治療は、一定期間にわたる複数回投与を伴うのが通例である。治療は、治療用作用物質（例えば、Ａβペプチド）に対する抗体、または活性化Ｔ細胞もしくはＢ細胞の応答を経時的に分析することによりモニターすることができる。応答が低下する場合は、追加抗原投与が示唆される。潜在的なダウン症患者の場合、生前、母体に治療用作用物質を投与することによって、または生後すぐに治療を開始することができる。
【００７８】
ＩＸ．治療レジメン
予防的な適用の場合、本発明の作用物質（ペプチドまたは抗体）を含む薬剤組成物または薬剤は、アルツハイマー病に罹患しやすい、またはこれ以外にアルツハイマー病の危険性がある患者に、該疾患の生化学的、組織学的、および／または行動学的症状、その合併症、ならびに該疾患の発症中に存在する病理的な中間表現型を含む、該疾患の危険性を除去もしくは低減する、同重症度を軽減する、または同発症を遅延させるのに十分な量で投与される。治療的な適用の場合、組成物または薬剤は、このような疾患が推測される、または既にこれに罹患する患者に、その合併症、ならびに該疾患の発症における病理的な中間表現型を含む、該疾患の（生化学的、組織学的、および／または行動学的）症状を治癒させる、または少なくとも部分的に阻止するのに十分な量で投与される。こうして、該疾患を有するまたは有すると推測される患者の症状を少なくとも部分的に緩和するまたはそのさらなる悪化を抑制するレジメンは、患者が該疾患から完全に治癒するかどうかに関わりなく、患者を治療する。一部の方法において、作用物質の投与は、いまだ特徴的なアルツハイマー病の病態を発現していない患者における筋認知的な障害を軽減または除去する。
【００７９】
治療的または予防的処置を達成するのに十分な量は、治療的または予防的に有効な用量として定義される。治療的または予防的処置を達成するのに十分な投与量および投与回数は、治療的または予防的に有効なレジメンとして定義される。予防的レジメンおよび治療的レジメンのいずれにおいても、作用物質は、十分な免疫応答が達成されるまで複数回の投与において投与されるのが通例である。免疫応答をモニターし、免疫応答が減弱し始めたら反復投与を行うのが通例である。
【００８０】
前述の状態の治療のための、本発明の組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬剤、および処置が予防的であるかまたは治療的であるかを含む多数の異なる因子に応じて変化する。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物も治療することができる。治療用量は、漸増して安全性および有効性を最適化する必要がある。アジュバントなしの場合、より高用量が必要とされるので、免疫原の量は、アジュバントも投与するかどうかに依存する。免疫原の投与量は、患者当たり１〜５００μｇで変化することもあるが、ヒト投与の場合、注射当たり５〜５００μｇで変化するのが通例である。場合によっては、注射当たり１〜２ｍｇの高用量を用いる。ヒト注射ごとに約１０、２０、５０、または１００μｇを用いるのが通例である。免疫原の質量も、免疫原全体の質量に対する、免疫原内の免疫原性エピトープの質量比に依存する。マイクログラム単位の免疫原に対して、１０−３〜１０−５マイクロモルの免疫原性エピトープを用いるのが通例である。注射のタイミングは、１日１回から年に１回、１０年に１回まで有意に変化しうる。免疫原の用量を投与する任意の所定日において、該用量は、アジュバントも投与する場合は、患者当たり１μｇを上回り、患者当たり１０μｇを上回ることが通例であり、アジュバントなしの場合は、患者当たり１０μｇを上回り、１００μｇを上回ることが通例である。通例のレジメンは、免疫感作に続く、６週間隔などの時間間隔での追加抗原注射からなる。別のレジメンは、免疫感作に続く、１ヶ月後、２ヶ月後および１２ヶ月後での追加抗原注射からなる。別のレジメンは、生涯にわたる２カ月ごとの注射を伴う。あるいは、追加抗原注射は、免疫応答のモニタリングが指示する通りに、不規則に行うことができる。
【００８１】
抗体による受動免疫感作の場合、用量は、宿主体重に対して約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり、同０．０１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲であることがより通例である。例えば、用量は、体重比１ｍｇ／ｋｇまたは同１０ｍｇ／ｋｇまたは１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内でありうる。例示的な治療レジメンは、２週間ごとに１回または１カ月ごとに１回または３〜６カ月ごとに１回の投与を伴う。一部の方法では、異なる結合特異性を有する２種類以上のモノクローナル抗体を同時に投与し、この場合、投与される各抗体の用量は、指示される範囲内に該当する。抗体は、複数回において投与されるのが通例である。各投与間の間隔は、毎週、毎月、毎年でありうる。間隔は、患者におけるＡβに対する抗体の血中レベルを測定することにより示される通りに、不規則でもありうる。一部の方法では、用量を調整して１〜１０００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を達成し、また一部の方法では、２５〜３００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を達成する。あるいは、抗体は、徐放製剤として投与することができ、この場合、必要な投与回数は減少する。用量および投与回数は、患者における抗体の半減期に応じて変化する。一般に、ヒト抗体が最長の半減期を示し、これにヒト化抗体、キメラ抗体、および非ヒト抗体が続く。投与量および投与回数は、処置が予防的であるかまたは治療的であるかに応じて変化しうる。予防的な適用では、長期間にわたり、相対的に低頻度の間隔で相対的な低用量を投与する。患者によっては、残りの生涯にわたって治療を受け続ける。治療的な適用では、疾患の進行が低減または終結されるまで、好ましくは、患者が疾患症状の部分的または完全な改善を示すまで、相対的に短い間隔で相対的な高用量が必要とされることがある。その後、患者には、予防的なレジメンを実施することができる。
【００８２】
免疫原をコードする核酸の用量は、患者当たり約１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇ、または３０〜３００μｇの範囲のＤＮＡである。感染性ウイルスベクターの用量は、投与当たり１０〜１００ビリオンまたはそれ以上で変化する。
【００８３】
免疫応答を誘発する作用物質は、予防的および／または治療的処置のための非経口、外用、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭該内、腹腔内、鼻腔内、または筋肉内の投与手段により投与することができる。免疫原性作用物質の最も通例の投与経路は、皮下経路であるが、他の経路も同様に有効でありうる。これに次いで最も通例の経路は、筋肉内注射である。この種の注射は、腕部または脚部の筋肉において実施するのが最も通例である。一部の方法、例えば、頭該内注射では、沈着物が蓄積している特定の組織内に直接に作用物質を注射する。抗体投与では、静脈内注入に対して筋肉内注射が好まれる。一部の方法では、特定の治療用抗体が、頭該内に直接に注射される。一部の方法では、徐放組成物またはＭｅｄｉｐａｄ（商標）器などの徐放機器として、抗体を投与する。
【００８４】
本発明の作用物質は、場合によっては、アミロイド形成性疾患の治療において少なくとも部分的に有効な他の作用物質と併用して投与することができる。ＡＰＰのＡβ領域に由来するペプチドまたはＡβに特異的に結合する抗体を用いる能動免疫感作法および受動免疫感作法は、例えば、米国特許第６，８６６，８５０号、米国特許第６，７８７，６３７号、および米国特許第６，８１８，２１８号により記載されている。本発明の作用物質は、本発明の作用物質の血液脳関門の通過を増加させる他の作用物質と併用して投与することもできる。
【００８５】
ペプチドなど、本発明の免疫原性作用物質は、アジュバントと併用して投与されることがある。各種のアジュバントをＡＰＰ断片と併用して、免疫応答を引き起こすことができる。好ましいアジュバントは、応答の質的な形態に影響する、免疫原において立体構造変化を生じることなく、免疫原に対する内因性反応を増大させる。好ましいアジュバントは、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、３ Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ（商標））（英国特許第２２２０２１１号［現在Ｃｏｒｉｘａ社の一部をなす、モンタナ州、ハミルトン、ＲＩＢＩ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社］を参照のこと）を含む。Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）ＱＳ−２１は、南米原産のシャボンノキの樹皮から単離されたトリエルペングリコシドまたはサポニン（Ｋｅｎｓｉｌら、「Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編、ニューヨーク、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ社、１９９５年；米国特許第５，０５７，５４０号を参照のこと）（マサチューセッツ州、フラミンガム、Ａｑｕｉｌａ ＢｉｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社製）である。他のアジュバントは、場合によっては、モノホスホリル脂質Ａ（Ｓｔｏｕｔｅら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、第３３６巻、８６〜９１頁、１９９７年を参照のこと）などの免疫刺激剤との併用における水中油型乳剤（スクアレンまたはピーナッツ油など）である。別のアジュバントは、ＣｐＧ（国際公開第９８／４０１００号）である。あるいは、Ａβをアジュバントに結合させることができる。しかし、このような結合が、Ａβの立体構造を実質的に変化させ、それへの免疫応答の性質に影響を及ぼさないようにすべきである。アジュバントは、有効作用物質を有する治療用組成物の成分として、または治療用作用物質投与の前に、同投与と同時に、もしくは同投与の後に別個に投与することができる。
【００８６】
アジュバントの好ましいクラスは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなどのアルミニウム塩（ミョウバン）である。このようなアジュバントは、ＭＰＬまたは３−ＤＭＰ、ＱＳ−２１、ポリグルタミン酸またはポリリシンなどのポリマーアミノ酸または単量体アミノ酸などの他の特異的な免疫刺激作用物質とともに、またはこれらを伴わずに用いることができる。別のクラスのアジュバントは、水中油型乳剤による製剤である。このようなアジュバントは、ムラミルペプチド（例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソグル−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド（ＤＴＰ−ＤＰＰ）：Ｔｈｅｒａｍｉｄｅ（商標））、または他の細菌細胞壁成分などの他の特異的な免疫刺激作用物質とともに、またはこれらを伴わずに用いることができる。水中油型乳剤は、（ａ）１１０Ｙ型マイクロフルイダイザー（マサチューセッツ州、ニュートン、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社製）などのマイクロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子に調合した、５％スクアレン、０．５％ Ｔｗｅｅｎ ８０、および０．５％ Ｓｐａｎ ８５（場合によっては、様々な量のＭＴＰ−ＰＥを含む）を含むＭＦ５９（国際公開第９０／１４８３７号）と、（ｂ）サブミクロン乳剤にマイクロフルイダイズするか、またはより大きな粒径の乳剤を産生するようにボルテックスした、１０％スクアレン、０．４％ Ｔｗｅｅｎ ８０、５％のプルロニック型ブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含むＳＡＦと、（ｃ）２％スクアレン、０．２％ Ｔｗｅｅｎ ８０、ならびに、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））からなる群からの１つまたは複数の細菌細胞壁成分を含むＲｉｂｉ（商標）アジュバントシステム（ＲＡＳ）（モンタナ州、ハミルトン、ＲＩＢＩ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ社製）とを含む。好ましいアジュバントの別のクラスは、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）（ＱＳ−２１、マサチューセッツ州、フラミンガム、Ａｑｕｉｌａ社製）またはこれより産生されたＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸなどの粒子などのサポニンアジュバントである。他のアジュバントは、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）を含む。他のアジュバントは、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、およびＩＬ−１２）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのサイトカインを含む。
【００８７】
アジュバントは、免疫原とともに単一の組成物として投与することもでき、免疫原の投与前に、同投与と同時に、もしくは同投与後に投与することもできる。免疫原およびアジュバントは、同一のバイアルに包装して供給することもでき、個別のバイアルに包装して使用前に混合することもできる。免疫原およびアジュバントは、目的とする治療適用を示す表示とともに包装されるのが通例である。免疫原およびアジュバントを個別に包装する場合、該包装は、使用前の混合についての指示書を含むのが通例である。アジュバントおよび／または担体の選択は、アジュバントを含む免疫原製剤の安定性、投与経路、投与スケジュール、ワクチン投与される種に対するアジュバントの有効性に依存し、ヒトの場合、薬剤として許容されるアジュバントは、ヒトへの投与に関し関連の規制機関により承認された、または承認可能なアジュバントである。例えば、フロイント完全アジュバントは、ヒトへの投与には適さない。ミョウバン、ＭＰＬ、およびＱＳ−２１が好ましい。ＲＣ５２９−ＳＥ（Ｃｏｒｉｘａ社製）も、好ましいアジュバントである。場合によっては、２つ以上の異なるアジュバントを同時に用いることができる。好ましい組み合わせは、ＭＰＬとミョウバン、ＱＳ−２１とミョウバン、ＱＳ−２１とＭＰＬ、ならびにミョウバン、ＱＳ−２１、およびＭＰＬをともにである。場合によっては、ミョウバン、ＱＳ−２１、およびＭＰＬのいずれか、およびそのすべての組み合わせとの併用で、フロイント不完全アジュバントを用いることもできる（Ｃｈａｎｇら、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ、第３２巻、１７３〜１８６頁、１９９８年）。
【００８８】
本発明の作用物質は、有効治療作用物質および薬剤として許容される他の多様な成分を含む、薬剤組成物として投与されることが多い。「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ」、第１５版、ペンシルベニア州、イーストン、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ社、１９８０年を参照のこと。好ましい形態は、意図する投与方式および治療適用に依存する。組成物は、所望の製剤に応じて、薬剤として許容される無毒性の担体または希釈剤であって、動物またはヒトへの投与のための薬剤組成物を調合するのに用いるのが通例である媒体として定義される担体または希釈剤をも含みうる。希釈剤は、組み合わせの生物学的活性に影響しないように選択される。このような希釈剤の例は、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩液、リンゲル液、デキストロース溶液、ハンクス液である。加えて、薬剤組成物または製剤は、他の担体、アジュバント、または無毒性、非治療用、非免疫原性の安定剤などをも含んでよい。
【００８９】
薬剤組成物は、タンパク質、キトサンなどの多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびコポリマー（ラテックス官能化セファロース（商標）、アガロース、セルロースなど）、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、および脂質凝集体（油滴またはリポソームなど）など、大型で代謝の遅い高分子をも含みうる。加えて、これらの担体は、免疫刺激作用物質（すなわち、アジュバント）として機能しうる。
【００９０】
非経口投与の場合、本発明の作用物質は、水油、生理食塩液、グリセロール、またはエタノールなどの無菌液体でありうる薬剤担体を有する、生理的に許容される希釈剤中における物質の注射可能な用量の溶液または懸濁液として投与することができる。加えて、湿潤剤または乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質が、組成物中に存在しうる。薬剤組成物の他の成分は、石油、動物、植物、または合成起源の成分、例えば、ピーナッツ油、大豆油、およびミネラル油である。一般に、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールが、特に、注射可能な溶液に好ましい液体の担体である。抗体は、蓄積注射、または、有効成分の徐放を可能とする方式で調合しうる移植式製剤の形態で投与することができる。例示的な組成物は、ＨＣｌによりｐＨ６．０に調整した、５０ｍＭ Ｌ−ヒスチジン、１５０ｍＭ ＮａＣｌからなる水溶性緩衝液中で調合された５ｍｇ／ｍＬのモノクローナル抗体を含む。
【００９１】
組成物は、溶液または懸濁液として、注射剤として調製されるのが通例であるが、溶液または懸濁液に適する固体形態を、注射前に液体の媒体中で調製することもできる。製剤は、上記に論じた通り、乳化するか、あるいはリポソーム、またはポリラクチド、ポリグリコリド、もしくはアジュバント効果を高めるコポリマーなどの微粒子中に封入することもできる（Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４９巻、１５２７頁、１９９０年、およびＨａｎｅｓ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ、第２８巻、９７〜１１９頁、１９９７年を参照のこと）。本発明の作用物質は、蓄積注射、または、有効成分の徐放またはパルス放出を可能とする方式で調合しうる移植式製剤の形態で投与することができる。
【００９２】
他の投与方式に適するさらなる製剤は、経口製剤、鼻腔内製剤、および肺内製剤、坐薬、ならびに外用塗布剤を含む。
【００９３】
坐薬の場合、結合剤および担体は、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含み、このような坐薬は、０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲にある有効成分を含む混合物から作製することができる。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、および炭酸マグネシウムなどの賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放製剤、または粉末の形態をとり、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の有効成分を含む。
【００９４】
外用塗布剤は、経皮送達または皮内送達をもたらすことができる。外用投与は、コレラトキシンまたはその無毒化した誘導体もしくはサブユニット、あるいは他の同様の細菌性トキシンを有する作用物質の共投与により容易化することができる（Ｇｌｅｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、第３９１巻、８５１頁、１９９８年）。共投与は、該成分を混合物として、または化学的架橋形成もしくは融合タンパク質としての発現により得られる連結分子として用いることにより達成することができる。
【００９５】
あるいは、経皮送達は、皮膚用パッチ剤を用いるか、またはトランスフェロソーム（Ｐａｕｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第２５巻、３５２１〜３５２４頁、１９９５年；Ｃｅｖｃら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、第１３６８号、２０１〜２１５頁、１９９８年）を用いて達成することができる。
【実施例】
【００９６】
これらの実施例は、馴化細胞培地およびＰＤＡＰＰ脳抽出物に由来する分子量の明らかなＡβオリゴマーによる免疫反応種の概略を示す。
【００９７】
コンフルエントに近い細胞に由来する無血清培地中での１５〜１８時間の後、７ＰＡ２細胞由来の馴化培地（ＣＭ）を回収した。１，０００ｒｐｍで３０分間、ＣＭをスピンした。ＣＭを新しい試験管に移してすぐに評価するか、または−８０℃で凍結させた。ＣＭは、ＮＨＳセファロース樹脂に結合した抗体により免疫沈降（ＩＰ）させ、ウェスタンブロット法により対応する物質を検出した。
【００９８】
Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｊ．、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、２００１年、第７９巻、５９５〜６０５頁により最初に記載された通りに、ＰＤＡＰＰ脳組織に由来する可溶性のオリゴマー種を評価するプロトコールを実施した。略述すると、氷上、２％ ＳＤＳおよびプロテアーゼ阻害剤（１／１０ｗｔ／ｖｏｌ）を含む２０ｍＭトリス、ｐＨ７．６、１３７ｍＭ ＮａＣｌ中で、Ｄｏｕｎｃｅ社製ホモジナイザーにより脳組織をホモジナイズした。１回目の遠心分離後、可溶種を含む上清を、２００，０００ｇで２時間遠心分離した。上清を等量に分割し、−８０℃で貯蔵するか、または間をおかずに免疫沈降に用いた。
【００９９】
１２カ月齢のマウスに由来するＰＤＡＰＰ皮質抽出物における免疫反応バンドのプロファイルを、図１の上方に示す。抗Ａβ抗体樹脂および抗ＡＰＰ抗体樹脂によりＩＰを実施した後で、Ａβのアミノ酸４〜６に対するエピトープを有する抗Ａβ抗体である２Ｈ３によりウェスタンブロット画像を得た。１２Ａ１１ ＩＰと８Ｅ５ ＩＰとの比較は、ウェスタンブロット画像に示される分子量マーカー７ｋＤａ〜３４ｋＤａの間の領域において、同様の免疫反応プロファイルを示す。免疫沈降に用いた各種抗体のエピトープ特異性は、Ａβのアミノ酸１〜５に対する３Ｄ６、Ａβのアミノ酸３〜７に対する１２Ａ１１、Ａβのアミノ酸１６〜２３に対する２６６、Ａβのアミノ酸１９〜２２に対する６Ｈ９、ＡＰＰ（エピトープのマッピングなし）のアミノ酸４４４〜５９２に対する８Ｅ５である。
【０１００】
図２ＡおよびＢの上方におけるウェスタンブロット画像より、ＩＰ物を様々な濃度のＮａＣｌで洗浄した。８Ｅ５樹脂または１２Ａ１１樹脂によりＰＤＡＰＰ脳から同定される免疫反応バンドのＩＰプロファイルは、異ならないように見える。両抗体による逐次的な免疫沈降をも評価した。１２Ａ１１および８Ｅ５による７ＰＡ２ ＣＭ免疫反応バンドは、１２Ａ１１免疫沈降により同定される単量体Ａβバンド（約４ｋＤａ）を例外として、８Ｅ５抗体および１２Ａ１１抗体により免疫沈降した皮質脳ホモジネートときわめて類似するプロファイルを示す。図２ＡおよびＢは、同じブロットの濃い露光と軽い露光である。
【０１０１】
抗Ａβ抗体（２６６、１２Ｂ４、１２Ａ１１、および２１Ｆ１２）および抗ＡＰＰ抗体８Ｅ５からの免疫沈降物を、８Ｅ５または２Ｈ３（Ａβのアミノ酸３〜７）によりプローブされるウェスタンブロット画像において同定した。８Ｅ５の免疫反応プロファイルは、２Ｈ３により画像化される抗Ａβ抗体のＩＰにより検出される約４ｋＤａの単量体Ａβを例外として、抗Ａβ抗体による、８Ｅ５または２Ｈ３により画像化されるウェスタンブロットからのプロファイルときわめて類似した（図３）。Ａβのアミノ酸３〜７に対するブロット１２Ｂ４、Ａβのアミノ酸３４〜４３に対するブロット２１Ｆ１２、エピトープのマッピングがないＡＰＰの４４４〜５９２に対するブロット１Ｇ５５において、さらなる抗体特異性を用いた。
【０１０２】
サイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を実施して、異なるＡβオリゴマー種を分離し、これらを機能アッセイまたは配列決定に用いることができた。プロトコールは、７ＰＡ２細胞に由来する馴化培地を用いて最適化した。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ５，０００ ＭＷＣＯにより、３０ｍｌのＣＭを２．５ｍｌに濃縮した。濃縮したＣＭは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５分取グレード１６／６０カラムに投入した。溶出緩衝液として５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液を用い、ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ＋０．０５％ ＮａＮ３により予め一晩ブロックした９６ウェルプレートに３５０μｌ分画を回収した。２６６／３Ｄ６によるＥＬＩＳＡ法を用いて、総Ａβについて分画を分析した。プールした分画を、１２Ａ１１−ＮＨＳセファロース樹脂によっても免疫沈降させ、対応する物質をウェスタンブロット法により検出した。ＥＬＩＳＡ法により総Ａβについて分画を分析したところ、分画１〜３１ではＡβが検出されず、分画３１〜８１にＡβの主要なピークが存在した（図４、下パネル）。
【０１０３】
分画から免疫沈降した物質を、１６％トリシンゲルにロードし、２Ｈ３抗体（Ａβ ４のアミノ酸４〜６）により、対応するブロットをプローブした（図４、上パネル）。
【０１０４】
上述のＳＥＣ手順を用いた後に、図４に述べたＩＰ／ウェスタンブロット手順を続けた。プールした分画（プール当たりの分画ｎ＝１０）をＳＥＣプレート３から回収し、図４の上側で免疫反応性を同定した。７ＰＡ２ ＳＥＣからプールした分画は、８Ｅ５樹脂または１２Ｂ４樹脂により免疫沈降させ、これに３Ｄ６（Ａβのアミノ酸１〜５）、８Ｅ５（ＡＰＰのアミノ酸４４４〜５９２）、または２Ｈ３（Ａβのアミノ酸４〜６）による画像化を続けた。３Ｄ６によるウェスタンブロット画像は、１２Ｂ４−ＩＰによる約４ｋＤａバンドに免疫反応性を示した（図５Ａ、Ｂ、Ｃ）。８Ｅ５ウェスタンブロット画像は、８Ｅ５樹脂または１２Ｂ４樹脂により免疫沈降させた免疫反応バンドのいくつかが同様にみえることを示す。このことは、２Ｈ３のウェスタンブロット画像に従う。８Ｅ５ ＩＰによる左の２Ｈ３画像は、の分子量マーカー７ｋＤａを超える免疫反応バンドを示す。１２Ｂ４ ＩＰによる２Ｈ３画像は、８Ｅ５ ＩＰと比べて同数以上の免疫反応バンドを示し、１２Ｂ４ ＩＰ−２Ｈ３画像は、８Ｅ５が捕捉しない７〜８ｋＤａ範囲におけるバンドを捕捉する。
【０１０５】
図６ＡおよびＢは、７ＰＡ２馴化培地（ＣＭ）をヘパリンセファロース８Ｅ５樹脂および１２Ｂ４樹脂により免疫沈降し、その後抗Ａβ抗体および抗ＡＰＰ抗体を用いるウェスタンブロット法による画像化を示す。図６Ａは、７ＰＡ２ ＣＭに由来する、１２Ｂ４および８Ｅ５によりＩＰした免疫反応バンドを比較する。ヘパリンセファロースは、ＡＰＰ種に結合するので別の比較物であるＡＰＰに結合する。図６Ｂは、ＡＰＰにおける類似の領域に対する２つの抗体である、８Ｅ５および１８Ｇ１０により画像化したウェスタンブロットを示す。これらは、類似の免疫反応性を示す。Ａβ特異抗体２Ｇ３によるブロットも、８Ｅ５ ＩＰ物および１２Ｂ４ ＩＰ物の双方における１２ｋＤａバンドの反応性を示す。
【０１０６】
８Ｅ５免疫沈降断片のＮ末端のエドマン配列決定（試料当たり１０サイクル）によりＡＰＰ内に２つの配列を同定した（図５Ａ、Ｂ、Ｃに示す）。ＡＰＰ６９５の番号付けに基づいて、同定された配列は、ＡＰＰ５１６〜５２５および同５３６〜５４５であった。いずれの配列も、４４４〜５９２である８Ｅ５免疫原内に該当した。Ａβ４２末端特異抗体２１Ｆ１２による免疫沈降法は、少なくとも一部の同定した断片がＡβの残基４２で終結することを示唆した。このことから、同定した２つの断片が、ＡＰＰの残基５１６〜６３８および同５３６〜６３８であることを意味した。他の断片は他のＡβ末端部位を含む可能性が高く、これらは、ＡＰＰの残基約６３４〜６４２に及ぶ。
【０１０７】
Ｎ末端エドマン配列決定から得られたデータに基づき、ＡＰＰ５１６〜６３８断片およびＡＰＰ５３６〜６３８断片をコードするＤＮＡ断片を、ＡＰＰ断片のＮ末端に隣接して６×ヒスチジンタグおよび因子Ｘａプロテアーゼ切断部位を有するｐＥＴ２１細菌発現ベクター内にクローン化した。ＡＰＰ断片は、ＢＬ２１（ＤＥ３）化学的コンピテント細胞に形質転換され、通例のＩＰＴＧ誘導プロトコールにより１６℃で発現した。該断片を、まず、固定化金属親和性カラム（ＩＭＡＣ）に通し、６×ヒスチジン親和性タグにより均質に精製した。組み換えＡＰＰ５１６〜６３８断片およびＡＰＰ５３６〜６３８断片を生成するため、４℃で一晩かけて、ＩＭＡＣにより精製した断片を因子Ｘａにより切断した。タンデムＩＭＡＣおよび因子Ｘａ除去樹脂により、非切断断片、切断した６×ヒスチジンタグ、および遊離因子Ｘａを反応混合物から除去した。均一の組み換えＡＰＰ断片は、特性解析用のアッセイ緩衝液に緩衝液交換した。
【０１０８】
Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ社製のＮｅｕｒｏｎａｌ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｂｉｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎを用いて、ニューロン形態を定量化した。ＮＰ Ｂｉｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎは、２〜６個のイメージングチャネルからの情報を統合して、細胞ベースの測定を実行する。ＤＮＡに結合するヘキスト染料により細胞を染色し、核領域を同定する。大きさ、形状、および明暗度など、核の特徴を測定する。
【０１０９】
チューブリンに対するモノクローナル抗体を用いて神経細胞体および神経突起を同定し、次いで、蛍光標識した二次抗体で染色した。Ｂｉｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎにより、ニューロン長、平均カウント分枝点（ＢＰＡＣ）、および細胞体からの平均分枝点距離（ＢＰＡＤＣＢ）などの神経突起の特徴を自動的に計算した。ＮＰ Ｂｉｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎにおける最も有用なリードアウトパラメータの１つであるＢＰＡＤＣＢは、具体的に、選択した細胞体からのすべての神経突起の分枝点距離の和を、分枝点総カウントで除して計算した。さらにＢＰＡＣは、分枝点総カウントを神経突起カウントで除して計算した。細胞は、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ社製のＡｒｒａｙＳｃａｎ Ｒｅａｄｅｒを用いて、２４、９６、または３８４ウェル形式で画像化できる。
【０１１０】
図８は、アラマーブルーを用いる代謝活性に関する８日間アッセイ用の、精製済み５１６および５３６物質により処置したヒト皮質ニューロンを示す。調べた最高用量（５１６に対して４０ｕＭ、および５３６に対して２２ｕＭ）において、ペプチドによる処置は、５１６および５３６の処理細胞の生存率をいずれも２０〜３０％低下させた。
【０１１１】
図９Ａおよび９Ｂは、精製済み５１６および５３６物質により１日間処置したヒト皮質ニューロンを示し、細胞を固定し、βチューブリンについて染色して、細胞形態を同定した。細胞は、細胞当たりの神経突起分枝点の平均数（９Ａ）と、細胞体からの平均分枝点距離（９Ｂ）とを含むニューロン形態について、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ社製のＡｒｒａｙＳｃａｎを用いて分析した。ペプチドによる処理は、対照と比べてニューロン形態のいずれのパラメータをも低下させ、これは、神経毒性の初期徴候を示す。
【化２−１】
【化２−２】
【０１１２】
上記の実施例は、例示的であるにすぎず、本発明を定義するものではない。当業者には、他の変形が容易に明らかであろう。本発明の適用範囲は、本明細書から生じる１つまたは複数の任意の特許請求の範囲により包含される。従って、本発明の適用範囲は、上記の記載を参照して決定されるのではなく、むしろ、これと等価な記載の全適用範囲を含んで発される特許請求の範囲を参照して決定されるべきである。本出願において引用されたすべての刊行物、参照物、および特許文献は、各個の刊行物または特許文献が個別に示されると仮定した場合と同程度に、すべての目的について、その全体において、参照により組み入れられる。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、仮出願でなく、すべての目的でその全体が参照により組み込まれている２００６年６月１日出願の第６０／８１０，２４５号の利益を請求するものである。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、老年認知症を生じる進行性疾患である。全般にはＳｅｌｋｏｅ、ＴＩＮＳ、第１６巻、４０３〜４０９頁、１９９３年；Ｈａｒｄｙら、国際公開第９２／１３０６９号；Ｓｅｌｋｏｅ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、第５３巻、４３８〜４４７頁、１９９４年；Ｄｕｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ、第３７３巻、４７６〜４７７頁、１９９５年；Ｇａｍｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、第３７３巻、５２３頁、１９９５年を参照のこと。大まかに言って、該疾患は、老年（６５＋歳）に生じる遅発型、および老年期のはるか以前、すなわち、３５〜６０歳の間に発症する早発型の２つの型に分類される。疾患のいずれの型においても病態は同じであるが、若年に始まる症例における方が、異常がより重症でより広範に及ぶ。該疾患は、脳における少なくとも２つの型の病変である老人斑および神経原線維変化を特徴とする。老人斑とは、中央部に細胞外アミドイド沈着を伴う最大１５０μｍ径の無秩序な神経網領域であり、脳組織切片の顕微鏡解析により見ることができる。神経原線維変化は、互いに巻きつき合い対合する２つの線維体からなる微小管に関連するタウタンパク質の細胞内沈着である。
【０００３】
プラークの主要成分は、Ａβまたはβアミロイドペプチドと称するペプチドである。Ａβペプチドは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と称する前駆体タンパク質の３９〜４３アミノ酸からなる内部断片である。ＡＰＰタンパク質内における複数の突然変異が、アルツハイマー病の存在と相関している。例えば、Ｇｏａｔｅら、Ｎａｔｕｒｅ、第３４９巻、７０４頁、１９９１年（バリン７１７からイソロイシンへ）；Ｃｈａｒｔｉｅｒ−Ｈａｒｌｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、第３５３巻、８４４頁、１９９１年（バリン７１７からグリシンへ）；Ｍｕｒｒｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５４巻、９７頁、１９９１年（バリン７１７からフェニルアラニンへ）；Ｍｕｌｌａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．、第１巻、３４５頁、１９９２年（リシン５９５−メチオニン５９６をアスパラギン５９５−ロイシン５９６に変化させる二重突然変異）を参照のこと。このような突然変異が、ＡＰＰからＡβへのプロセシングの増大または変化、特に、長型のＡβ（すなわち、Ａβ１−４２およびＡβ１−４３）の量が増加するＡＰＰプロセシングによりアルツハイマー病を引き起こすと考えられる。プレセニリン遺伝子であるＰＳ１およびＰＳ２などの他の遺伝子における突然変異は、長型Ａβの量を増加させるＡＰＰプロセシングに間接的な影響を及ぼすと考えられる（Ｈａｒｄｙ、ＴＩＮＳ、第２０巻、１５４頁、１９９７年を参照のこと）。
【０００４】
プラークへと凝集したアミロイドペプチドの病理的役割は、多年にわたり知られている。しかし、認知症の重症度は、プラーク密度との相関が弱いのに対して、可溶性Ａβレベルとの間には著明な相関が存在する（ＭｃＬｅａｎら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、１９９９年、第４６巻、８６０〜８６６頁）。近年の研究は、Ａβオリゴマーが、ｈＡＰＰトランスジェニックマウスにおけるシナプス毒性および記憶障害に関わることを示唆している（Ｍｕｃｋｅら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、第２０巻、４０５０〜４０５８頁、２０００年；Ｍｏｒｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、第４０８巻、９８２〜９８５頁、２０００年；Ｄｏｄａｒｔら、Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、第５巻、４５２〜４５７頁、２００２年）。Ａβオリゴマーは、海馬長期増強をも阻害するが、同モノマーまたは同原線維はこれを阻害しない（Ｗａｌｓｈら、Ｎａｔｕｒｅ、第４１６巻、５３５〜５３９頁、２００２年）。「Ａβオリゴマー」の神経毒性種の一次構造が、活発な探求領域である。該神経毒性種は、Ａβの２位（アスパラギンに続くアラニン）に始まるＡβペプチドからなるオリゴマーであることが示唆されている（Ｐｏｄｌｉｓｎｙ，Ｍ．ら、ＪＢＣ、１９９５年、第２７０巻、９５６４〜９５７０頁）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ヒトアミロイド前駆体タンパク質の残基４４４〜５９５または４４４〜５９６（ＡＰＰ６９５の番号付け）内のエピトープに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体は、モルモットアミロイド前駆体タンパク質に対する特異的結合性を欠く。場合によっては、抗体は、ヒトアミロイド前駆体タンパク質の残基５５１〜５７０内のエピトープに特異的に結合する。場合によっては、抗体は、ヒトアミロイド前駆体タンパク質の残基５３０〜５８０内のエピトープに特異的に結合する。場合によっては、抗体は、ヒトアミロイド前駆体タンパク質の残基６７６〜６９５内のエピトープに特異的に結合する。場合によっては、抗体は、ヒトアミロイド前駆体タンパク質の残基５４５〜５５５内のエピトープに特異的に結合する。場合によっては、抗体は、ヒトアミロイド前駆体タンパク質に対する特異的結合について、モノクローナル抗体８Ｅ５と競合する。場合によっては、抗体は、ヒトアミロイド前駆体タンパク質に対する特異的結合について１８Ｂ１０と競合する。場合によっては、抗体は、８Ｅ５または１８Ｂ１０のヒト化形態またはキメラ形態である。場合によっては、抗体は、モノクローナル抗体である。
【０００６】
本発明は、アルツハイマー病を予防的または治療的に処置する方法であって、該疾患に罹患しているまたは該疾患の危険性がある患者に、ＡＰＰのアミノ酸５１６〜５９５または５９６の間の少なくとも４つの連続した残基を含む断片の治療的に有効なレジメンを施し、それによって該疾患を予防的または治療的に処置するステップを含む方法をさらに提供する。場合によっては、断片は、ＡＰＰのアミノ酸５５１〜５９５または５９６の間の少なくとも５つの連続した残基を含む。場合によっては、断片は、ＡＰＰのアミノ酸５４４〜５９６または５９７の間の少なくとも７つの連続した残基を含む。場合によっては、断片は、ＡＰＰの残基５５１〜５９５または５９６を含む。場合によっては、断片は、ＡＰＰの残基５５１〜６３８を含む。場合によっては、投与するステップでは、各々がＡＰＰの残基５５１〜５９５または５９６の間の少なくとも４つの連続したアミノ酸を含む複数の断片を投与する。場合によっては、断片は、ＡＰＰの残基５５１〜５９５または５９６の間の少なくとも４〜２０個の連続したアミノ酸を含む。場合によっては、断片は、ＡＰＰの残基５１６〜５９５または５９６の間の少なくとも４〜２０個の連続したアミノ酸を含む。場合によっては、断片は、ＡＰＰの残基５５１〜５９５または５９６の間の少なくとも４〜１０個の連続したアミノ酸を含む。場合によっては、断片は、ＡＰＰの残基５１６〜５９５または５９６の間の少なくとも４〜１０個の連続したアミノ酸を含む。場合によっては、断片は、第１および第２のセグメントを含み、第１のセグメントがＡβのセグメントであり、第２のセグメントがＡβの上流にあるＡＰＰセグメントである。場合によっては、第１および第２のセグメントは、ヒトＡＰＰの連続したセグメントである。場合によっては、断片は、コンジュゲートとして担体と連結し、その担体は、断片に対する抗体を含む免疫応答を引き起こす一助となる。場合によっては、該方法は、アジュバントを患者に投与するステップをさらに含み、アジュバントが、断片に対する抗体を含む免疫応答を引き起こす一助となる。場合によっては、方法は、Ａβに対する抗体または該抗体を生成する免疫原を投与するステップをさらに含む。場合によっては、免疫原を投与し、免疫原がＡβの断片である。
【０００７】
本発明は、アルツハイマー病を予防的または治療的に処置する方法であって、該疾患に罹患するまたは該疾患の危険性がある患者に、（ａ）ヒトＡＰＰの残基５１６〜５９５内のエピトープに特異的に結合する抗体、または（ｂ）このような抗体を生成する免疫原の治療的に有効なレジメンを投与し、それによって該疾患を予防的または治療的に処置するステップを含む方法をさらに提供する。
【０００８】
場合によっては、抗体は、ヒトＡＰＰの残基５３０〜５９５内のエピトープに特異的に結合する。場合によっては、抗体は、上記に定義される任意の抗体である。場合によっては、抗体は、ＡＰＰ断片のＮ末端に結合する末端特異的抗体であり、Ｎ末端が残基５３５〜５５５の間のアミノ酸残基である。場合によっては、抗体は、ＡＰＰ５１６〜６３８またはＡＰＰ５３６〜６３８のＮ末端に結合する末端特異的抗体である。場合によっては、その方法は、Ａβに対する抗体または該抗体を生成する免疫原を投与するステップをさらに含む。場合によっては、免疫原を投与し、免疫原がＡβの断片である。
【０００９】
本発明は、アルツハイマー病を治療するのに有用な活性について作用物質をスクリーニングする方法であって、非ヒトトランスジェニック動物を作用物質と接触させるステップであって、非ヒトトランスジェニック動物がＡＰＰをコードするセグメントを含むゲノムを含み、Ａβおよび他の断片にプロセシングされるアミロイド前駆体タンパク質へと発現されるステップと、ＡＰＰの５５１〜５９５または５９６位の間の少なくとも２５アミノ酸を含む５０〜１５０アミノ酸の水溶性ＡＰＰ断片を抽出するステップと、可溶性ＡＰＰ断片の量を、作用物質で処置していない対照トランスジェニックマウス由来の量と比較するステップであって、可溶性断片の量の減少から、作用物質がアルツハイマー病の治療に有用な活性を有することが示唆されるステップとを含む方法をさらに提供する。場合によっては、ＡＰＰはヒトＡＰＰである。場合によっては、断片は、ヒトＡＰＰの残基５５１〜６３８を含む。場合によっては、断片は、抗体８Ｅ５および／または１８Ｂ１０によって特異的に結合されうる。場合によっては、断片は、ＡＰＰ５１６〜６３８、ＡＰＰ５１６〜６３９、ＡＰＰ５３６〜６３８、またはＡＰＰ５３６〜６３９である。
【００１０】
本発明は、アルツハイマー病を治療するのに有用な活性について作用物質をスクリーニングする方法であって、単離された細胞を作用物質と接触させるステップであって、細胞がＡＰＰをコードする核酸を含み、核酸が、Ａβおよび他の断片にプロセシングされるアミロイド前駆体タンパク質へと発現されるステップと、ＡＰＰの５５１〜５９５または５９６位の間の少なくとも２５アミノ酸を含む５０〜１５０アミノ酸の水溶性ＡＰＰ断片を培地内で検出するステップと、可溶性ＡＰＰ断片の量を、作用物質で処置していない対照細胞の量と比較するステップであって、可溶性断片の量の減少から、作用物質がアルツハイマー病の治療に有用な活性を有することが示唆されるステップとを含む方法をさらに提供する。
【００１１】
場合によっては、単離された細胞に、ＡＰＰをコードする核酸を含む構築物をトランスフェクトする。場合によっては、水溶性断片は、ＡＰＰ５１６〜６３８、ＡＰＰ５１６〜６３９、ＡＰＰ５３６〜６３８、またはＡＰＰ５３６〜６３９である。
【００１２】
本発明は、アルツハイマー病を治療するのに有用な活性について作用物質をスクリーニングする方法であって、ＡＰＰの５５１〜５９５または５９６位の間の少なくとも２５アミノ酸を含む５０〜１５０アミノ酸の水溶性ＡＰＰ断片を、細胞集団および作用物質と接触させるステップと、作用物質のない状態で可溶性断片と接触させた対照細胞集団から残存した細胞と比較した、生存細胞の数を比較するステップであって、作用物質の存在下における生存細胞の増加から、作用物質がアルツハイマー病の治療に有用な活性を有することが示唆されるステップとを含む方法をさらに提供する。
【００１３】
場合によっては、細胞は、神経細胞である。場合によっては、水溶性断片は、ＡＰＰ５１６〜６３８、ＡＰＰ５１６〜６３９、ＡＰＰ５３６〜６３８、またはＡＰＰ５３６〜６３９である。
【００１４】
本発明は、ヒトＡＰＰの５５１〜５９５または５９６位の間の少なくとも２５アミノ酸を含む５０〜１５０アミノ酸のアミロイド前駆体タンパク質の単離された断片をさらに提供する。単離された断片は、場合によっては、ヒトＡＰＰの残基５５１〜６３８を含む。単離された断片は、場合によっては、ヒトＡＰＰの残基５５１〜６３８からなる。場合によっては、断片は、１００アミノ酸長以下の長さである。場合によっては、断片は、抗体８Ｅ５および／または１８Ｂ１０によって特異的に結合される。場合によっては、断片は、ＡＰＰ５１６〜６３８、ＡＰＰ５１６〜６３９、ＡＰＰ５３６〜６３８、およびＡＰＰ５３６〜６３９である。
【００１５】
本発明は、ヒトアミロイド前駆体タンパク質の残基５９５および５９６を含むエピトープにおいて、ヒトアミロイド前駆体タンパク質に特異的に結合する抗体をさらに提供する。本発明は、ヒトアミロイド前駆体タンパク質の残基５９６および５９７を含むエピトープにおいて、ヒトアミロイド前駆体タンパク質に特異的に結合する抗体をさらに提供する。
【００１６】
本発明は、ヒトＡＰＰ断片のＮ末端に特異的に結合する末端特異的抗体であって、Ｎ末端アミノ酸がヒトＡＰＰの残基５３５〜５５５の間に位置する末端特異的抗体をさらに提供する。
【００１７】
本発明は、ＡＰＰ５１６〜６３８、ＡＰＰ５１６〜６３９、ＡＰＰ５３６〜６３８、またはＡＰＰ５３６〜６３９のＮ末端に特異的に結合する、特許請求に係る末端特異的抗体をさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】抗Ａβ抗体および抗ＡＰＰ抗体によるＰＤＡＰＰマウス脳の免疫沈降（ＩＰ）およびウェスタンブロットを示す図である。
【図２】免疫沈降した脳調製物に対する各種の塩洗浄後における抗Ａβ（１２Ａ１１）抗体および抗ＡＰＰ（８Ｅ５）抗体によるＰＤＡＰＰマウス脳のＩＰおよびウェスタンブロットを示す図である（図２Ａおよび２Ｂ）。７ＰＡ２ ＣＭの免疫沈降は比較のためである。
【図３】抗Ａβ抗体および抗ＡＰＰ（８Ｅ５）抗体による７ＰＡ２ ＣＭのＩＰおよび８Ｅ５または２Ｈ３による画像化を示す図である。
【図４】７ＰＡ２ ＣＭのサイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を示す図である。
【図５Ａ】７ＰＡ２ ＣＭのＳＥＣを示す図である（図５Ａ、Ｂ、Ｃ）。８Ｅ５樹脂および１２Ｂ４樹脂により免疫沈降させた後で、３Ｄ６、８Ｅ５、および２Ｈ３によりウェスタンブロット法による画像化を行った分画を示す。
【図５Ｂ】７ＰＡ２ ＣＭのＳＥＣを示す図である（図５Ａ、Ｂ、Ｃ）。８Ｅ５樹脂および１２Ｂ４樹脂により免疫沈降させた後で、３Ｄ６、８Ｅ５および２Ｈ３によりウェスタンブロット法による画像化を行った分画を示す。
【図５Ｃ】７ＰＡ２ ＣＭのＳＥＣを示す図である（図５Ａ、Ｂ、Ｃ）。８Ｅ５樹脂および１２Ｂ４樹脂により免疫沈降させた後で、３Ｄ６、８Ｅ５および２Ｈ３によりウェスタンブロット法による画像化を行った分画を示す。
【図６Ａ】ヘパリンセファロース、８Ｅ５樹脂、および１２Ｂ４樹脂により免疫沈降させた後で、抗Ａβ抗体および抗ＡＰＰ抗体によりウェスタンブロット法による画像化を行った７ｐＡ２の馴化培地を示す図である（図６ＡおよびＢ）。
【図６Ｂ】ヘパリンセファロース、８Ｅ５樹脂、および１２Ｂ４樹脂により免疫沈降させた後で、抗Ａβ抗体および抗ＡＰＰ抗体によりウェスタンブロット法による画像化を行った７ｐＡ２の馴化培地を示す図である（図６ＡおよびＢ）。
【図７】７ＰＡ２ ＣＭの８Ｅ５による免疫親和性精製から得られたアミノ末端配列の結果を示す図である。
【図８】アラマーブルーにより分析した、ヒト皮質ニューロンに対するＡＰＰ５１６〜６３８ポリペプチドおよびＡＰＰ５３６〜６３８ポリペプチドの毒性を示す図である。
【図９】分枝点平均（９Ａ）または細胞体からの平均分枝点距離（９Ｂ）により分析した、ヒト皮質ニューロンに対するＡＰＰ５１６〜６３８ペプチドおよびＡＰＰ５３６〜６３８ペプチドの毒性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
定義
アミノ酸置換を保存的置換または非保存的置換に分類するため、アミノ酸を以下の通りに群別する。グループＩ（疎水性側鎖）：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；グループＩＩ（中性の親水性側鎖）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；グループＩＩＩ（酸性の側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ；グループＩＶ（塩基性の側鎖）：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；グループＶ（鎖の配向に影響する残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ；およびグループＶＩ（芳香族側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。保存的置換は、同じクラス内におけるアミノ酸間の置換に関与する。非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のメンバーと交換するステップを構成する。
【００２０】
「ａｌｌ−Ｄ」という用語は、≧７５％、≧８０％、≧８５％、≧９０％、≧９５％、および１００％のＤ立体配置アミノ酸を有するペプチドを指す。
【００２１】
「作用物質」という用語は、薬理活性を有するまたは有しうる化合物について述べるのに用いる。作用物質は、既知の薬剤、薬理活性が同定されているがさらなる治療的評価を受けつつある化合物、ならびに薬理活性についてスクリーニングされるコレクションおよびライブラリーのメンバーである化合物を含む。
【００２２】
本発明の治療的作用物質は、望ましくない不純物を実質的に含まないことが通例である。これは、作用物質が、通例少なくとも約５０％ ｗ／ｗ（重量／重量）の純度であるほか、干渉性のタンパク質および不純物を実質的に含まないことを意味する。作用物質が、少なくとも約８０％ ｗ／ｗの純度であり、より好ましくは、少なくとも９０または約９５％ ｗ／ｗの純度であることもある。しかし、既存のタンパク質精製技術を用いると、少なくとも９９％ ｗ／ｗの均一なペプチドを得ることができる。本発明の治療的作用物質は、アミロイド沈着と関連する疾患の症状を緩和するか、同疾患を予防する（prevent, effect prophylaxis of）か、または同疾患を治療しうる。
【００２３】
２つの実体の間の特異的結合とは、実体が、無関係の抗原や、異なる抗原に対する抗体などの対照に対する各実体の親和性を少なくとも１０倍、１００倍、または１００倍上回る相互の親和性を有することを意味する。２つの実体の相互の親和性は、少なくとも１０７、１０８、１０９Ｍ−１または１０１０Ｍ−１であることが通例である。１０８Ｍ−１を超える親和性が好ましい。Ａβ内のエピトープに対するポリクローナル抗体の特異的結合とは、ポリクローナル抗体集団内における抗体が、Ａβの他のエピトープに結合する（適合するよう変化する）ことなしに、Ａβの１つのエピトープに特異的に結合することを意味する。
【００２４】
「抗体」または「免疫グロブリン」という用語は、完全な抗体およびその結合断片を含むように用いられる。断片は通例、それらが由来した完全な抗体と、抗原断片に対する特異的結合について競合し、個別の重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、およびＦｖを含む。別個の鎖は、ナノボディー（Ｎａｎｏｂｏｄｙ）抗体（すなわち、場合によってはヒト化された、ラクダまたはラマに由来する抗体重鎖の単離されたＶＨ断片）を含む。単離されたＶＨ断片は、ヒト抗体など他の供給源からも得ることができる。断片は、組み換えＤＮＡ技術により、または完全な免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的分離により作製される。「抗体」という用語は、他のタンパク質との融合タンパク質と化学的にコンジュゲートする、または同融合タンパク質として発現される、１つまたは複数の免疫グロブリンをも含む。「抗体」という用語は、二重特異的な抗体をも含む。二重特異的または二重機能的な抗体は、２つの異なる重／軽鎖対合および２つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。二重特異的抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含む各種の方法により作製することができる。例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第７９巻、３１５〜３２１頁、１９９０年；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１４８巻、１５４７〜１５５３頁、１９９２年を参照のこと。
【００２５】
非凝集Ａβまたはその断片とは、単量体ペプチド単位を意味する。非凝集Ａβまたはその断片は、一般に可溶性であり、自己凝集して可溶性オリゴマーを形成する能力がある。Ａβオリゴマーおよびその断片は、可溶性であることが通例であり、おもにαヘリックスまたはランダムコイルとして存在する。単量体Ａβを調製する１つの方法は、凍結乾燥したペプチドを、純ＤＭＳＯ中で超音波処理により溶解することである。結果として得られる溶液は、遠心分離して任意の不溶性粒子を除去する。凝集Ａβまたはその断片とは、単量体単位が非共有結合により結合され、不溶性のβシート構築物に組み上げられる、Ａβオリゴマーまたはその免疫原性断片を意味する。凝集Ａβまたはその断片は、原線維ポリマーをも意味する。原線維は、不溶性であることが通例である。
【００２６】
「抗原」とは、抗体が特異的に結合する実体である。
【００２７】
「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が反応する抗原の部位を指す。Ｂ細胞エピトープは、連続したアミノ酸またはタンパク質の３次元的な折りたたみにより並置される連続しないアミノ酸のいずれからも形成することができる。連続したアミノ酸から形成されるエピトープは、変性溶媒への曝露時に保持されるのが通例であるのに対し、３次元的な折りたたみにより形成されるエピトープは、変性溶媒による処置時に失われるのが通例である。エピトープは、固有の空間的構造内に少なくとも３のアミノ酸を含むのが通例であり、また、少なくとも５または８〜１０のアミノ酸を含むのがより通例である。エピトープの空間的構造を決定する方法は、例えば、ｘ線結晶解析および２次元核磁気共鳴法を含む。例えば、「Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、第６６巻、Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編、１９９６年を参照のこと。同一のエピトープを認識する抗体は、１つの抗体が標的抗原に対する別の抗体の結合を遮断する能力を示す、簡素なイムノアッセイにより同定することができる。Ｔ細胞は、ＣＤ８細胞に対する約９アミノ酸からなる連続的なエピトープ、またはＣＤ４細胞に対する約１３〜１５アミノ酸からなる連続的なエピトープを認識する。エピトープを認識するＴ細胞は、エピトープに応答する、初回抗原刺激を受けたＴ細胞による３Ｈ−チミジンの取り込み（Ｂｕｒｋｅら、Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．、第１７０巻、１１１０〜１１１９頁、１９９４年）、抗原依存的死滅（細胞傷害性Ｔリンパ球アッセイ、Ｔｉｇｇｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１５６巻、３９０１〜３９１０頁）、またはサイトカイン分泌が決定する通り、抗原依存的増殖を測定するｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにより同定することができる。
【００２８】
「免疫学的」応答または「免疫」応答という用語は、受容患者においてアミロイドペプチドに対して向けられる有益な体液性（抗体を介する）応答および／または細胞性（抗原特異的なＴ細胞またはその分泌産物を介する）応答の発現である。このような反応は、免疫原の投与によって誘導される能動応答、または抗体もしくは初回抗原刺激を受けたＴ細胞の投与によって誘導される受動応答でありうる。細胞性免疫応答は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞および／またはＣＤ８＋細胞傷害Ｔ細胞を活性化する、抗原特異的なクラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣ分子と関連するポリペプチドエピトープの提示により引き起こされる。該応答は、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、好塩基球、樹状細胞、星状膠細胞、小グリア細胞、好酸球、または生得的免疫の他の成分の活性化にも関与しうる。細胞媒介免疫応答の存在は、増殖アッセイ（ＣＤ４＋Ｔ細胞）またはＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）アッセイ（Ｂｕｒｋｅ、前出；Ｔｉｇｇｅｓ、前出を参照のこと）により判定することができる。免疫原の保護的または治療的効果に対する体液性応答および細胞性応答の相対的な寄与は、免疫感作した同遺伝子型の動物に由来する抗体およびＴ細胞を個別に単離し、別の対象における保護的または治療的効果を測定することにより識別することができる。
【００２９】
「免疫原性作用物質」または「免疫原」は、哺乳動物への投与時に、場合によってはアジュバントとの併用で、それ自体に対する免疫応答を誘発することができる。
【００３０】
「裸のポリヌクレオチド」という用語は、コロイド状の物質と複合体を形成しないポリヌクレオチドを指す。裸のポリヌクレオチドは、プラスミドベクター中にクローン化されることがある。
【００３１】
「アジュバント」という用語は、抗原と併用投与すると抗原に対する免疫応答を増大させるが、単独で投与すると抗原に対する免疫応答を生じない化合物を指す。アジュバントは、リンパ球の動員、Ｂ細胞および／またはＴ細胞の刺激、ならびにマクロファージの刺激を含むいくつかの機序により、免疫応答を増大させることができる。
【００３２】
「患者」という用語は、予防的または治療的な処置を受けるヒト対象および他の哺乳動物対象を含む。
【００３３】
抗体間の競合は、試験下の免疫グロブリンが、Ａβなどの共通抗原に対する基準抗体の特異的結合を阻害するアッセイにより判定する。多くの種類の競合的結合アッセイ、例えば、固相の直接または間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相の直接または間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドウィッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第９巻、２４２〜２５３頁、１９８３年を参照のこと）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１３７巻、３６１４〜３６１９頁、１９８６年を参照のこと）；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドウィッチアッセイ（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ社、１９８８年を参照のこと）；Ｉ−１２５標識を用いる固相直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌら、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第２５巻、第１号、７〜１５頁、１９８８年を参照のこと）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第１７６巻、５４６〜５５２頁、１９９０年）；および直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第３２巻、７７〜８２頁、１９９０年）が知られている。通例、こうしたアッセイは、固体表面に結合した精製抗原またはこれらのいずれかを有する細胞、非標識被験免疫グロブリン、および標識基準免疫グロブリンの使用を含む。競合的阻害は、被験免疫グロブリンの存在下において、固体表面または細胞に結合した標識の量を決定することにより測定する。通常、被験免疫グロブリンは、過剰に存在する。競合アッセイにより同定される抗体（競合抗体）は、基準抗体と同一のエピトープに結合する抗体、および基準抗体が結合するエピトープの十分近くに隣接するエピトープに結合して立体障害が生じる抗体を含む。通常、競合抗体が過剰に存在すると、共通抗原に対する基準抗体の特異的結合を、少なくとも５０または７５％阻害する。
【００３４】
長期増強（ＬＴＰ）とは、シナプスを介してメッセージを繰り返し送受信することにより発現する、ある種の「感受性の上昇」である。
【００３５】
列挙した１つまたは複数の要素を「含む」組成物または方法は、具体的に列挙しない他の要素を含んでよい。例えば、Ａβペプチドを含む組成物は、単離されたＡβペプチドと、より大きなポリペプチド配列の一成分としてのＡβペプチドとの両方を含む。
【００３６】
文脈から別段に明らかでない限り、本発明の各実施形態、各要素、各ステップ、または各特徴は、任意の他の実施形態、他の要素、他のステップ、または他の特徴と併用することができる。
【００３７】
Ｉ．全般
本出願は、部分的には、ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の新規の神経活性断片の同定を前提とする。断片は、ＡＰＰのＡβ領域に由来する配列を含むが、上流にも及ぶ。断片は通常水溶液中で可溶性であり、前述でＡβ「オリゴマー」として分類したのと同一の分子量分画において単離することができるのが通例である。大半のバンドは約１０ｋＤａ以上であり、Ａβ二量体または三量体の予測分子量には対応しない。Ａβオリゴマーとの分子量の類似性およびＡβ抗体に対する交差反応性のために、本断片は、擬似オリゴマー（fauxligomers）として知られる場合がある。断片とその小断片は、脳内におけるＡβの沈着を特徴とするアルツハイマー病および他のアミロイド形成性疾患を治療する免疫療法における免疫原として用いることができる。ＡＰＰの上流にある断片の一部に対する抗体、またはＡβと上流配列との間の境界も、このような治療法において用いることができる。断片は、疾患の診断もしくは予後予測または作用物質のスクリーニングで検出することができるマーカーとしても有用である。アルツハイマー病のトランスジェニック動物における、こうした断片のレベルを低減する能力について、作用物質をスクリーニングする。
【００３８】
ＩＩ．ＡＰＰとＡβ
ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１、およびＡＰＰ７７０とは、それぞれ、ヒトＡＰＰ遺伝子がコードする、６９５、７５１、および７７０アミノ酸長のポリペプチドを指す。Ｋａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、第３２５巻、７７３頁、１９８７年；Ｐｏｎｔｅら、Ｎａｔｕｒｅ、第３３１巻、５２５頁、１９８８年；およびＫｉｔａｇｕｃｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ、第３３１巻、５３０頁、１９８８年を参照のこと。ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）内のアミノ酸には、別段に示さない限り、ＡＰＰ６９５アイソフォーム（配列番号２）の配列に従う番号が指定される。ヒト以外の種に由来するＡＰＰにおけるアミノ酸は、配列を最大限に整列した場合のヒトＡＰＰにおいて対応するアミノ酸の番号と同様に番号付けする。モルモットＡＰＰは、５４８および５５１位を含む複数の位置において、ヒトＡＰＰとは異なる。
【００３９】
アミロイド前駆体タンパク質は、その１つがＡβの産生をもたらす、少なくとも２つの経路を介してプロセシングされうる。Ａβの産生は、ＡβのＮ末端およびＡＴＦ−βＡＰＰとして知られるアミノ末端断片（米国特許第６，０１８，０２４号を参照のこと）を形成する、ＡＰＰの残基５９６および５９７の間におけるβセクレターゼによる切断により開始される。Ａβの末端は、ＡＰＰの膜貫通領域内での、γセクレターゼによる切断により形成される。別の、おそらくは非病理的経路では、ＡＰＰが、Ａβ配列内において、別の大きな分泌Ｎ末端断片およびＣ末端断片を産生するαセクレターゼにより切断される。
【００４０】
βアミロイドペプチド、またはＡ４ペプチドとしても知られる（米国特許第４，６６６，８２９号；ＧｌｅｎｎｅｒおよびＷｏｎｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ.Ｃｏｍｍｕｎ．、第１２０巻、１１３１頁、１９８４年を参照のこと）Ａβは、３９〜４３アミノ酸のペプチドであり、アルツハイマー病の特徴的なプラークの主要成分である。Ａβは、複数の自然発生形態を有する。Ａβの天然ヒト形態は、Ａβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２、およびＡβ４３と呼ばれる。これらのペプチドの配列およびＡＰＰ前駆体に対するその関係は、Ｈａｒｄｙら、ＴＩＮＳ、第２０巻、１５５〜１５８頁、１９９７年の図１により示される。例えば、Ａβ４２は、
【化１】
という配列を有する。
【００４１】
Ａβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２、およびＡβ４３などの用語は、それぞれ、アミノ酸残基１〜３９、１〜４０、１〜４１、１〜４２、および１〜４３を含むＡβペプチドを指す。Ａβ４１、Ａβ４０、およびＡβ３９は、Ｃ末端からのそれぞれ、Ａｌａ、Ａｌａ−Ｉｌｅ、およびＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｖａｌの欠落により、Ａβ４２とは異なる。Ａβ４３は、Ｃ末端におけるスレオニン残基の存在により、Ａβ４２とは異なる。同様に、ＡＰＰ５１６〜６３８という用語は、以下に記載の通り、ＡＰＰの残基５１６〜６３８からなるＡＰＰポリペプチド、好ましくは、Ｋａｎｇの天然ヒト配列を意味する。同様に、ＡＰＰ５３６〜６３８という用語は、残基５３６〜６３８からなるＡＰＰ断片を意味する。ＡＰＰ配列は、以下で詳細に論じる配列番号１のヒト配列またはその変異体でありうる。変異体を含む場合、変異体は、天然の対立遺伝子変異体、特に、コドン６４２（６９５の番号付け）における変異体の１つなど、アルツハイマー病に関連することが知られるまたは推測される天然の変異体であることが好ましい。このようなＡＰＰポリペプチドは、ＡＰＰに対する異種ペプチドに連結されうる、例えば、精製を支援しうる、または免疫応答を誘導しうる。類似の命名法を用いて、ＡＰＰ５１６〜６３９またはＡＰＰ５３６〜６３９など、他のＡＰＰ断片について記載する。
【００４２】
文脈から別段に明らかでない限り、ＡＰＰまたはＡβへの言及は、Ｋａｎｇ、前出（配列番号２）の天然ヒトアミノ酸配列のほか、対立遺伝子種および誘導された変異体を含む類似体を含む。ＡＰＰまたはＡβの類似体は、それぞれ、天然ヒトＡＰＰまたはＡβペプチドと特異的に結合する抗体を誘導する。ＡＰＰまたはＡβの類似体は、類似体の全長にわたり、天然ヒトＡＰＰまたはＡβ配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を示すことが通例である。アミノ酸置換は、保存的置換であることが多い。ＡＰＰにおける既知の対立遺伝子変異体の例は、Ｇｌｕ５９０Ａｓｐ（＊）、Ｌｙｓ／Ｍｅｔ５９５，５９６Ａｓｎ／Ｌｅｕ（＊、スウェーデン型）、Ａｌａ５９８Ｔｈｒ、Ｈｉｓ６０２Ａｒｇ（＊）、Ａｓｐ６０３Ａｓｎ（＊）、Ａｌａ６１７Ｇｌｙ、Ｇｌｕ６１８Ｇｌｙ（＊）、Ｇｌｕ６１８Ｇｌｎ、Ｇｌｕ６１８Ｌｙｓ、Ａｓｐ６１９Ａｓｎ（＊）、Ａｌａ６３８Ｔｈｒ（＊）、Ａｌａ６３８Ｖａｌ、Ｔｈｒ６３９Ｉｌｅ（＊）、Ｔｈｒ６３９Ａｌａ（＊）、Ｖａｌ６４０Ｍｅｔ（＊）、Ｖａｌ６４０Ｍｅｔ（＊）、Ｉｌｅ６４１Ｖａｌ（＊）、Ｉｌｅ６４１Ｔｈｒ（＊）、Ｖａｌ６４２Ｐｈｅ（＊）、Ｖａｌ６４２Ｇｌｙ（＊）、Ｖａｌ６４２Ｉｌｅ（＊）、Ｖａｌ６４２Ｌｅｕ（＊）、およびＬｅｕ６４８Ｐｒｏ（＊）を含む（＊＝アルツハイマー病と関連することが知られるまたは推測される）（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｒｕｍ ＡＰＰ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ、２００１年７月２４日改訂、を参照のこと）。断片は、天然のヒト配列と比べて、５つ以下の置換のみを含むことが通例である。
【００４３】
ＡＰＰまたはＡβまたはＡβ断片の一部の類似体はまた、１、２、５、１０箇所の位置において、またはすべての位置においても、非天然のアミノ酸またはＮ末端もしくはＣ末端のアミノ酸修飾を含む。例えば、Ａβの１および／または７位における天然のアスパラギン酸残基は、イソアスパラギン酸に置換されうる。非天然アミノ酸の例は、Ｄ−アミノ酸、αアミノ酸、α二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、４−ヒドロキシプロリン、γカルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、オメガ−Ｎ−メチルアルギニン、βアラニン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、チロキシン、γアミノ酪酸、ホモセリン、シトルリン、およびイソアスパラギン酸である。本発明の一部の治療的作用物質は、完全Ｄ型ペプチドである。断片および類似体は、以下に述べる通り、非処置またはプラセボ対照と比較するトランスジェニック動物において、予防的または治療的有効性についてスクリーニングすることができる。
【００４４】
ＡＰＰ、Ａβ、およびその断片、および類似体は、固相ペプチド合成もしくは組み換え発現により合成することができるか、または天然の供給源から得ることができる。自動ペプチド合成機が、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ州、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社など、多数の製造元から市販されている。組み換え発現は、大腸菌などの細菌、酵母、昆虫細胞または哺乳動物細胞などにおいて行うことができる。組み換え発現の手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、ニューヨーク、Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｐ．Ｐｒｅｓｓ社、第２版、１９８９年に記載されている。Ａβペプチドの一部の形態は、市販もされている（例えば、カリフォルニア州、サニーベール、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｃｏｍｐａｎｙ社、およびカリフォルニア州、ナパ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）。
【００４５】
ＩＩＩ．本発明による断片
本発明は、神経毒性を与えるＡＰＰ断片の新規のクラスを提供する。断片は、場合によっては、界面活性剤なしでも、中性ｐＨのトリス／ＮａＣｌ緩衝液中で、例えば、図８および／または図９Ａおよび図９Ｂに示す濃度範囲において可溶性である。断片は、ＡＰＰをコードする核酸をトランスフェクトしたトランスジェニック動物モデル、初代皮質細胞、および細胞系において見出されている。類似の分子量を有する断片は、アルツハイマー病患者においても見出すことができる。断片は、単離された形態においても提供される。断片は、例えば、実施例に記載の条件下において、ヒト皮質ニューロンに対する毒性を示すことが好ましい。断片は、ＡＰＰのＡβ領域の上流の配列の存在を特徴とする。上流の配列は、ＡＰＰの５５１〜５９５または５９６位の間の少なくとも２５の連続したアミノ酸であることが通例である。一部の断片は、ＡＰＰの５５１〜５９５または５９６位の間の各残基を含む。断片は、約５０〜２００アミノ酸、好ましくは、８０〜１００アミノ酸、８５〜９５アミノ酸の長さを有する。こうして、断片は、ＡＰＰのＮ末端の実質的な部分（例えば、少なくとも約１００〜約４００）を欠く。一部の断片は、ＡＰＰのＣ末端までいっぱいに延びるのでなく、残基６７６〜６９５からなるＡＰＰ断片に対して惹起された１３Ｇ８など、ＡＰＰのＣ末端抗体に対する特異的結合を欠く。一部の断片は、ＡＰＰのＡβ領域からの配列およびその上流の付加配列を含む。一部のこのような断片は、第１のセグメントがＡβに由来し、第２のセグメントがＡβの上流にあり、第１および第２のセグメントがＡＰＰの連続した断片を形成する第１および第２のセグメントを含む。例えば、一部の断片は、ＡＰＰの残基５４８または５５１に始まり残基６３６、６３７、６３８、または６３９（それぞれ、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２、およびＡβ４３のＣ末端）まで延びるＡＰＰのセグメントを含む。好ましい断片は、ＡＰＰの５４８〜６３８位に由来する残基からなる。一部の断片は、ＡＰＰの残基５１６〜５２５および／または５３６〜５４５を含む。一部の断片は、ＡＰＰの４４４〜５５０の間の残基に始まり、同６３６、６３７、６３８、または６３９からなる群から選択される残基に終わる。一部の断片は、ＡＰＰの４４４〜５５０の間の残基に始まり、６３６〜６７５位の間の残基に終わる。一部の断片は、ＡＰＰの４４４〜５５０位の間の残基に始まり、同残基５９５または５９６〜６７５の間の位置に終わる。一部の断片は、ＡＰＰの残基５３５または５３６に始まり、同残基６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、または６４２からなる群から選択される残基に終わる。一部の断片は、ＡＰＰの残基５１６に始まり、同残基６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、または６４２に終わる。好ましい断片は、ＡＰＰ５１６〜６３８、ＡＰＰ５１６〜６３９、ＡＰＰ５３６〜６３８、ＡＰＰ５３６〜６３９を含む。
【００４６】
一部の断片は、Ａβ領域の上流のＡＰＰにおいてエピトープを有するモノクローナル抗体に特異的に結合する能力を特徴とする。結合は、例えば、活性化ＮＨＳセファロース（登録商標）樹脂に連結された抗体を用いて検出することができる。これらの抗体は、（ＡＰＰ４４４〜５９２に対して産生された）８Ｅ５および（ＡＰＰ５３０〜５８０に対して産生された）８Ｅ１０を含む。一部の断片は、Ａβ内にエピトープを有する特定の抗体にも特異的に結合する（実施例を参照のこと）。
【００４７】
治療的な目的のためには、上記の断片の小断片を投与することができる。小断片は、ヒトＡＰＰの５５１〜５９５または５９６位の間の少なくとも４、５、７、１０、１５、または２５の連続した残基を含む、または同残基からなることが通例であるが、これらの配列座標を超えて延びることもありうる。場合によっては、ＡＰＰの小断片は、５１６〜５９６位の間、または５３６〜５９６位の間にある、ＡＰＰの４〜２５残基、好ましくは、ＡＰＰの５〜１５残基、もしくは同５〜１０残基からなる。
【００４８】
ＩＶ．本発明の抗体
本発明は、ヒトアミロイド前駆体タンパク質の残基４４４〜５９５、４４４〜５９６、または４４４〜５９２内のエピトープに特異的に結合する抗体を提供する。一部の抗体は、５４８および５５１位においてヒトＡＰＰと異なるモルモットＡＰＰには特異的に結合せず、ヒトＡＰＰに特異的に結合する能力を特徴とする。一部の抗体は、ヒトＡＰＰの残基５４０〜５９５、または同５４０〜５９６内のエピトープに特異的に結合する。一部の抗体は、ヒトＡＰＰの残基５４５〜５９５、または同５４５〜５９６内のエピトープに特異的に結合する。一部の抗体は、ヒトＡＰＰの残基５４５〜５５５内のエピトープに特異的に結合する。一部の抗体は、ヒトＡＰＰの残基５３０〜５８０内のエピトープに特異的に結合する。
【００４９】
２つの例示的な抗体は、８Ｅ５および１８Ｂ１０である。該抗体は、それぞれ、８Ｅ５および１８Ｂ１０と呼ばれるハイブリドーマにより産生されるマウスモノクローナル抗体である。本明細書で参照される他の抗体も同様に、別段に注記しない限り、同名のハイブリドーマから産生されるマウス抗体である。８Ｅ５は、残基４４４〜５９５からなるヒトＡＰＰの断片に対して惹起された。しかし、８Ｅ５は、残基５４８および５５１においてヒトＡＰＰと異なるモルモットＡＰＰには特異的に結合せず、これにより、ＡＰＰのこれらの残基を含むセグメントまたはこれに近接するセグメントにエピトープを限定する。１８Ｂ１０は、残基残基５３０〜５８０からなるＡＰＰ断片に対して惹起された。本発明は、ヒトＡＰＰに対する特異的結合について、８Ｅ５または１８Ｂ１０と競合する抗体をさらに提供する。抗体間の競合とは、これらが同一のエピトープ、または抗体の結合がヒトＡＰＰに対する互いの特異的結合を干渉し合うほどに近接するエピトープに結合することを指す。
【００５０】
本発明は、Ａβまたは上流配列に単独で特異的に結合することなく、Ａβと上流配列との間の接合部または境界に特異的に結合する抗体をも提供する。このような抗体のエピトープは、Ａβ領域に由来する少なくとも１つのＡＰＰ残基およびＡβ領域の上流の少なくとも１つの残基を含む。
【００５１】
本発明は、本発明の新規の断片のＮ末端に末端特異的アミノ酸をさらに提供する。このような断片のＮ末端は、ヒトＡＰＰのコドン５３０〜５６０の間、またはヒトＡＰＰの残基５４０〜５５１または同５３５〜５５５の間でありうる。一部の末端特異的抗体は、断片ＡＰＰ５１６〜６３８もしくはＡＰＰ５１６〜６３９、または断片ＡＰＰ５３６〜６３８もしくはＡＰＰ５３６〜６３９のＮ末端に末端特異的である。末端特異的とは、抗体が、全長ＡＰＰ（断片を内部配列として含む）に特異的に結合することなく、このような断片のＮ末端に特異的に結合することを意味する。
【００５２】
抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルでありうる。ポリクローナル血清は、ＡＰＰの全長に沿う複数のエピトープに特異的に結合する抗体の混合集団を含むことが通例である。しかし、ポリクローナル血清は、ＡＰＰ５５１〜５９５または同５５１〜５９６などの特定のＡＰＰセグメントに特異的でありうる。好ましい抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体（Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８６巻、１００２９〜１００３３頁、１９８９年、および国際公開第９０／０７８６１号、米国特許第５，６９３，７６２号、米国特許第５，６９３，７６１号、米国特許第５，６８５，０８９号、米国特許第５，５３０，１０１号、およびＷｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号を参照のこと）、またはヒト抗体（Ｌｏｎｂｅｒｇら、国際公開第９３／１２２２７号、１９９３年；米国特許第５，８７７，３９７号、米国特許第５，８７４，２９９号、米国特許第５，８１４，３１８号、米国特許第５，７８９，６５０号、米国特許第５，７７０，４２９号、米国特許第５，６６１，０１６号、米国特許第５，６３３，４２５号、米国特許第５，６２５，１２６号、米国特許第５，５６９，８２５号、米国特許第５，５４５，８０６号、Ｎａｔｕｒｅ、第１４８巻、１５４７〜１５５３頁、１９９４年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１４巻、８２６頁、１９９６年、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ、国際公開第９１／１０７４１号、１９９１年、欧州特許第１４８００８号、Ｂｌｅｃｋ、Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｊｏｕｒｎａｌ、第１巻、２００５年９／１０月、米国特許出願第２００４１３２０６６号、米国特許出願第２００５００８６２５号、国際公開第２００４０７２２６６号、国際公開第２００５０６５３４８号、国際公開第２００５０６９９７０号、および国際公開第２００６０５５７７８号）である。８Ｅ５または１８Ｂ１０のヒト化形態またはキメラ形態が好ましい。ヒト化抗体またはキメラ抗体には、ヒトアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４を用いることができる。ヒトアイソタイプＩｇＧ１は、食細胞におけるＦｃＲＩ受容体に対し、ヒトアイソタイプで最も高い親和性を有する。一部の抗体は、約１０７、１０８、１０９、または１０１０Ｍ−１以上の結合親和性でＡＰＰに特異的に結合する。
【００５３】
Ｖ．スクリーニング法
本発明の新規の断片は、アルツハイマー病および脳内におけるＡβの沈着を特徴とする他の疾患の治療に有用な薬理活性について作用物質をスクリーニングするのに有用である。スクリーニングは、アルツハイマー病のトランスジェニック動物モデルまたはＡＰＰを発現する細胞において実施するのが通例である。トランスジェニック動物モデルは、ＡＰＰを発現し、これをＡβおよび他の断片にプロセシングする。その１つまたは複数が本発明の断片である。同様に、ＡＰＰを発現する細胞は、これをＡβおよび本発明の１つまたは複数の断片にプロセシングする。該方法は、トランスジェニック動物モデルまたは細胞を被験作用物質に接触させるステップと、該動物の脳内または細胞培地内における本発明の断片のレベルを測定するステップとを伴う。断片は、脳から実施例に記載の可溶性分画中に抽出することができる。脳内また細胞培地内における断片のレベルは、スクリーニングされている作用物質で処置していない対照のトランスジェニック動物または細胞中における断片の対応するレベルと比較する。本発明の断片レベルが測定誤差の通常の限界を超えて低下する場合は、スクリーニングされている作用物質が、アルツハイマー病および脳内におけるＡβの沈着を特徴とする他の疾患の治療に有用な薬理活性を有することを示す。
【００５４】
トランスジェニック動物モデルは、一般に、ＡＰＰがＡβおよび他の断片にプロセシングされ、該動物がアルツハイマー病の１つまたは複数の特徴を発現しやすいよう、ＡＰＰおよびこれに作動的に連結する１つまたは複数の調節エレメントをコードする核酸を含むゲノムを有する。このようなモデルは、例えば、Ｇａｍｅｓら、前出が述べるＡＰＰの７１７（ＡＰＰ７７０の番号付け）突然変異を有するマウス、およびＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅら、米国特許第５，６１２，４８６号およびＨｓｉａｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２７４巻、９９頁、１９９６年；Ｓｔａｕｆｅｎｂｉｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９４巻、１３２８７〜１３２９２頁、１９９７年；Ｓｔｕｒｃｈｌｅｒ−Ｐｉｅｒｒａｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９４巻、１３２８７〜１３２９２頁、１９９７年；Ｂｏｒｃｈｅｌｔら、Ｎｅｕｒｏｎ、第１９巻、９３９〜９４５頁、１９９７年；Ｒｉｃｈａｒｄｓら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．第２３巻、８９８９〜９００３頁、２００３年；Ｃｈｅｎｇ、Ｎａｔ Ｍｅｄ．、第１０巻、第１１号、１１９０〜１１９２頁、２００４年；Ｈｗａｎｇら、Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．、２００４年３月などが述べるＡＰＰの６７０／６７１（ＡＰＰ７７０の番号付け）スウェーデン変異を有するマウスを含む。トランスジェニック動物における封入体に適するＡＰＰ突然変異は、野生型Ｖａｌ７１７（ＡＰＰ７７０の番号付け）コドンのＩｌｅ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、またはＧｌｎに対するコドンへの転換を含む。Ｖａｌ７１７に対する好ましい置換はＰｈｅである。別の適切な突然変異は、北極変異Ｅ６９３Ｇ（ＡＰＰ７７０の番号付け）である。アミロイド前駆体タンパク質およびプレセニリントランス遺伝子をともに有するＰＳＡＰＰマウスは、Ｔａｋｅｕｃｈｉら、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２０００年、第１５７巻、３３１〜３３９頁に記載されている。アミロイド前駆体タンパク質、プレセニリン、およびタウトランス遺伝子を有する三重トランスジェニックマウスは、ＬａＦｅｒｌａ、２００３年、Ｎｅｕｒｏｎ、第３９巻、４０９〜４２１頁に記載されている。別の有用なトランスジェニックマウスは、ＡＰＰトランス遺伝子およびＴＧＦ−βトランス遺伝子を有する。トランス遺伝子中のタンパク質をコードする配列は、神経発現に適する１つまたは複数の調節エレメントと作動的に連結される。このようなエレメントは、ＰＤＧＦ、プリオンタンパク質、およびＴｈｙ−１プロモーターを含む。別の有用なトランスジェニックマウスは、スウェーデン変異および７１７変異をともに有するＡＰＰトランス遺伝子を有する。別の有用なトランスジェニックマウスは、北極変異（Ｅ６９３Ｇ）を有するＡＰＰトランス遺伝子を有する。
【００５５】
適切な細胞は、検出可能な量のＡＰＰを天然に発現する細胞、およびその発現を確保する少なくとも１つの調節的配列と作動的に連結されるＡＰＰをコードする核酸をトランスフェクトした細胞を含む。適切な細胞株にはヒト細胞株および動物細胞株が含まれ、２９３ヒト腎細胞株、ヒト神経膠腫細胞株、ヒトＨｅＬａ細胞、初代上皮細胞（例えば、ＨＵＶＥＣ細胞）、初代ヒト線維芽細胞または同リンパ芽球（ＡＰＰ突然変異を有する患者に由来する内生細胞を含む）、初代ヒト混合脳細胞（ニューロン、星状膠細胞および神経膠を含む）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などが含まれる。
【００５６】
本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて本発明の断片を神経細胞と接触させ、作用物質で処置しない同種類の対照細胞と比べた保護作用について作用物質をスクリーニングするスクリーニング法をさらに提供する。細胞は、皮質細胞、好ましくはヒト皮質細胞の初代培養物である。神経毒性は、ＬＤ５０値として、長期増強に対する効果として、アラマーブルー染色により、または実施例に記載の分枝数または分枝距離に対する効果により測定することができる。
【００５７】
このような方法により活性についてスクリーニングされる作用物質は、可溶性断片の濃度を多様な機序により低下させることができる。１つの機序は、断片を生成するのを担う酵素の阻害を介する。これらの酵素は、Ｃ末端を生成するγセクレターゼおよびＮ末端を生成する未だ同定されない酵素を含み得る。こうして、スクリーニング対象の作用物質は、βセクレターゼまたはγセクレターゼの阻害について既に同定されている阻害剤を含むプロテアーゼ阻害剤を含む。他の作用物質は、例えば、海洋微生物、藻類、植物、および真菌などの天然の供給源から得ることができる。あるいは、化合物は、ペプチドもしくは小分子を含む作用物質のコンビナトリアルライブラリーから、または産業において、例えば、化学産業、製薬産業、環境産業、農業、水産業、化粧品産業、製薬業、およびバイオテクノロジー産業により合成される化合物の既存のレパートリーから得ることができる。化合物は、例えば、薬剤、治療物質、環境作用物質、農業用作用物質、または産業用作用物質、汚染物質、化粧品、薬物、有機化合物、脂質、グルココルチコイド、抗生剤、ペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、およびキメラ分子を含むことができる。
【００５８】
ペプチドまたは他の化合物の無作為ライブラリーもスクリーニングすることができる。段階的に合成することのできる多種類の化合物について、コンビナトリアルライブラリーを作製することができる。このような化合物は、ポリペプチド、βターン模倣体、多糖、リン脂質、ホルモン、プロスタグラジン、ステロイド、芳香族化合物、ヘテロ環化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーＮ置換型グリシン、およびオリゴカルバミン酸を含む。大規模の化合物コンビナトリアルライブラリーは、Ａｆｆｙｍａｘ、国際公開第９５／１２６０８号、Ａｆｆｙｍａｘ、国際公開第９３／０６１２１号、コロンビア大学、国際公開第９４／０８０５１号、米国薬局方、国際公開第９５／３５５０３号、およびＳｃｒｉｐｐｓ、国際公開第９５／３０６４２号（これらの各々は、すべての目的について、参照により組み入れられる）に記載のコードされた合成ライブラリー（encoded synthetic libraries）（ＥＳＬ）法により構築することができる。ペプチドライブラリーは、ファージディスプレイ法によっても作製することができる。例えば、Ｄｅｖｌｉｎ、国際公開第９１／１８９８０号を参照のこと。
【００５９】
ＶＩ．コンジュゲート
ペプチドの免疫原は、適切な担体分子に連結することにより、該ペプチドに対する抗体を含む免疫応答を引き起こす一助となるコンジュゲートを形成することができる。単一の作用物質は、単一の担体に連結することができ、作用物質の多重コピーは、後に相互に連結し合う担体の多重コピーに連結することができ、作用物質の多重コピーは、担体の単一コピーに連結することができ、または作用物質の単一コピーは、担体の多重コピーもしくは異なる担体に連結することができる。適切な担体は、血清アルブミン、キーホールリンペットヒモシアニン、免疫グロブリン分子、Ｑβ（国際公開第０４／０１６２８２号）、サイログロブリン、オボアルブミン、破傷風トキソイド、あるいはジフテリア菌、大腸菌、コレラ菌もしくはピロリ菌などの他の病原菌に由来するトキソイドまたは弱毒化した毒素誘導体を含む。Ｔ細胞エピトープも、適切な担体分子である。他の適切な担体は、Ｂ型肝炎ウイルス、百日咳菌、破傷風菌、ペルツサリア・トラキタリーナ（Ｐｅｒｔｕｓａｒｉａ ｔｒａｃｈｙｔｈａｌｌｉｎａ）、大腸菌、トラコーマクラミジア、ジフテリア菌、熱帯熱マラリア原虫、およびマンソン住血吸虫に由来するヘルパーＴ細胞無差別エピトープ（米国特許第６，９０６，１６９号、米国特許出願第２００３−００６８３２５号、および国際公開第２００２／０９６３５０号を参照のこと）を含む。他の担体は、破傷風毒素、百日咳毒素、ジフテリア毒素、麻疹ウイルスＦタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、トラコーマクラミジア主要外膜タンパク質、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質、マンソン住血吸虫トリオースリン酸イソメラーゼ、または大腸菌ＴｒａＴに由来するヘルパーＴ細胞エピトープ（国際公開第０１／４２３０６号を参照のこと）である。
【００６０】
一部のコンジュゲートは、本発明の作用物質を免疫刺激性ポリマー分子（例えば、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリンシステイン（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）、マンナン（マンノースポリマー）、またはグルカン（β１→２ポリマー））、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１αおよびβペプチド、ＩＬ−２、γＩＮＦ、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ）、およびケモカイン（例えば、ＭＩＰ１αおよびβ、ならびにＲＡＮＴＥＳ）に連結することにより形成することができる。Ｏ’Ｍａｈｏｎｙ、国際公開第９７／１７６１３号および国際公開第９７／１７６１４号に記載の通り、免疫原性作用物質は、組織を横断しての輸送を高めるペプチドにも連結することができる。免疫原は、スペーサーアミノ酸（例えば、ｇｌｙ−ｇｌｙ）を有するまたは有さない担体に連結されうる。
【００６１】
一部のコンジュゲートは、本発明の作用物質を少なくとも１つのＴ細胞エピトープに連結することにより形成することができる。Ｔ細胞無差別エピトープもあるが、Ｔ細胞普遍エピトープもある。Ｔ細胞無差別エピトープは、多様なＨＬＡ型を示す広範な対象におけるＴ細胞免疫性の誘発を高める能力を有する。Ｔ細胞無差別エピトープに対して、Ｔ細胞普遍エピトープは、異なるＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子によりコードされる多様なＨＬＡ分子を示す対象の大半、例えば、少なくとも７５％におけるＴ細胞免疫性の誘発を高める能力を有する。
【００６２】
破傷風トキソイド（例えば、Ｐ２およびＰ３０エピトープ）、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、百日咳トキソイド、麻疹ウイルスＦタンパク質、トラコーマクラミジア主要外膜タンパク質、ジフテリアトキソイド、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質Ｔ、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質抗原、マンソン住血吸虫トリオースリン酸イソメラーゼ、大腸菌ＴｒａＴ、およびインフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）など多数の天然のＴ細胞エピトープが存在する。本発明の免疫原性ペプチドは、Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ Ｆ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、第３３６巻、７７８〜７８０頁、１９８８年；Ｃｈｉｅｚ Ｒ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、第１７８巻、２７〜４７頁、１９９３年；Ｈａｍｍｅｒ Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ、第７４巻、１９７〜２０３頁、１９９３年；Ｆａｌｋ Ｋ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、第３９巻、２３０〜２４２頁、１９９４年；国際公開第９８／２３６３５号；および、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄ Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１６０巻、３３６３〜３３７３頁、１９９８年（これらの各々は、すべての目的について、参照により組み入れられる）に記載のＴ細胞エピトープとコンジュゲートすることもできる。さらなる例は：
インフルエンザ赤血球凝集素：ＨＡ３０７〜３１９
マラリアスポロゾイト周囲タンパク質：Ｔ３エピトープ ＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶ（配列番号３）
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原：ＨＢｓＡｇ１９〜２８ ＦＦＬＬＴＲＩＬＴＩ（配列番号４）
熱ショックタンパク質６５：ｈｓｐ６５１５３〜１７１ ＤＱＳＩＧＤＬＩＡＥＡＭＤＫＶＧＮＥＧ（配列番号５）
カルメット−ゲラン桿菌 ＱＶＨＦＱＰＬＰＰＡＶＶＫＬ（配列番号６）
破傷風トキソイド：ＴＴ８３０〜８４４ ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥＬ（配列番号７）
破傷風トキソイド：ＴＴ９４７〜９６７ ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ（配列番号８）
ＨＩＶｇｐ１２０Ｔ１：ＫＱＩＩＮＭＷＱＥＶＧＫＡＭＹＡ（配列番号９）
【００６３】
あるいは、コンジュゲートは、本発明の作用物質を、ｐａｎ ＤＲエピトープ（「ＰＡＤＲＥ」）など、大部分のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有する、少なくとも１つの人工Ｔ細胞エピトープに連結することによって作製することができる。ＰＡＤＲＥは、米国特許第５，７３６１４１号、国際公開第９５／０７７０７号、およびＡｌｅｘａｎｄｅｒ Ｊら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、第１巻、７５１〜７６１頁、１９９４年（これらの各々は、すべての目的について、参照により組み入れられる）に記載されている。好ましいＰＡＤＲＥペプチドは、ＡＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号１１）であり、Ｘは、シクロヘキシルアラニンチロシンまたはフェニルアラニンであることが好ましく、シクロヘキシルアラニンが最も好ましい。
【００６４】
免疫原性作用物質は、化学的架橋形成により担体に連結することができる。免疫原を担体に連結する技術は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジル−チオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）およびスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸（ＳＭＣＣ）を用いるジスルフィド結合の形成を含む（ペプチドがスルフヒドリル基を欠く場合、システイン残基の付加により供給することができる）。これらの試薬は、自身と１つのタンパク質におけるペプチドのシステイン残基との間のジスルフィド結合、およびリシンにおけるイプシロンアミノ基または他のアミノ酸における他の遊離アミノ基を介するアミド結合を形成する。このような各種のジスルフィド／アミド形成試薬は、Ｉｍｍｕｎ．Ｒｅｖ.、第６２巻、１８５頁、１９８２年に記載されている。他の二機能結合作用物質は、ジスルフィド結合よりもむしろチオエーテルを形成する。これらのチオエーテル形成作用物質の多くは市販されており、６−マレイミドカプロン酸、２−ブロモ酢酸、および２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸の反応性エステルを含む。カルボキシル基は、これらをスクシンイミドまたは１−ヒドロキシル−２−ニトロ−４−スルホン酸、ナトリウム塩と組み合わせて活性化することができる。
【００６５】
免疫原性は、Ｔｈエピトープと本発明のペプチド免疫原との間にスペーサー残基（例えば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）を付加することにより改善することができる。ＴｈエピトープをＢ細胞エピトープ（すなわち、ペプチド免疫原）から物理的に分離することに加えて、グリシン残基が、Ｔｈエピトープをペプチド免疫原と接合することによって創出される任意の人工的な二次構造を解体し、それによってＴ細胞応答および／またはＢ細胞応答の間の干渉を除去することができる。こうして、ヘルパーエピトープと抗体誘発ドメインとの間の立体構造的分離が、提示される免疫原と適切なＴｈ細胞およびＢ細胞との間のより有効な相互作用を可能にする。
【００６６】
本発明の作用物質に対して多様なＨＬＡ型を示す大部分の対象におけるＴ細胞免疫性の誘発を高めるために、異なるＴｈ細胞エピトープを有するコンジュゲートの混合物を調製することができる。混合物は、異なるＴｈ細胞エピトープを有する少なくとも２つのコンジュゲートの混合物、異なるＴｈ細胞エピトープを有する少なくとも３つのコンジュゲートの混合物、または異なるＴｈ細胞エピトープを有する少なくとも４つのコンジュゲートの混合物を含んでよい。混合物は、アジュバントとともに投与してよい。
【００６７】
免疫原性ペプチドは、担体（すなわち、異種ペプチド）との融合タンパク質としても発現することができる。免疫原性ペプチドは、そのアミノ末端、カルボキシル末端、またはその両方において、担体と連結することができる。場合によっては、免疫原性ペプチドの多重反復が、融合タンパク質において存在しうる。場合によっては、免疫原性ペプチドは、例えば、該ペプチドのＮ末端およびＣ末端の両方において異種ペプチドの多重コピーに連結することができる。場合によっては、免疫原性ペプチドの多重コピーは、相互に連結し合う異種ペプチドの多重コピーに連結することができる。一部の担体ペプチドは、担体ペプチドに対するヘルパーＴ細胞反応を誘発する一助となる。次いで誘発されたヘルパーＴ細胞は、担体に連結された免疫原性ペプチドに対するＢ細胞応答を誘発する。
【００６８】
一部の融合タンパク質は、米国特許第５，１９６，５１２号、欧州特許第３７８，８８１号、および欧州特許第４２７，３４７号などに記載の破傷風トキソイドエピトープに連結された本発明のＡＰＰセグメントを含む。一部の融合タンパク質は、米国特許第５，７３６，１４２号に記載の少なくとも１つのＰＡＤＲＥペプチドに連結された本発明のＡＰＰセグメントを含む。Ｔ細胞無差別エピトープである異種ペプチドもあり、Ｔ細胞普遍エピトープである異種ペプチドもある。一部の方法において、投与用の作用物質は、単に、異種セグメントと線状形態で連結した本発明のＡＰＰセグメントとの単一の融合タンパク質である。本発明の治療用作用物質は、式を用いて表すことができる。例えば、一部の方法において、作用物質は、ｘを１〜５の整数とする式２ｘにより表される融合タンパク質のマルチマーである。ｘは、１、２、または３であることが好ましく、２が最も好ましい。ｘが２であるとき、このようなマルチマーは、ＭＡＰ４と呼ばれる（米国特許第５，２２９，４９０号を参照のこと）好ましい立体構造に連結された４つの融合タンパク質を有する。
【００６９】
担体の他の例は、国際公開第２００４０６９１８２号に記載されている。本出願に記載のＡＰＰ断片は、国際公開第２００４０６９１８２号に記載のコンジュゲートに連結されたＡβ断片の代わりに用いることができる。
【００７０】
同一または類似の担体タンパク質および連結法は、ＡＰＰまたはその免疫原性断片に対する抗体の生成に用いる免疫原の生成に用いることができる。例えば、担体に連結されたＡＰＰまたはＡＰＰの免疫原性断片は、ＡＰＰまたはその免疫原性断片に対するモノクローナル抗体の作製において、実験動物に投与することができる。
【００７１】
ＶＩＩ．ＤＮＡ免疫感作
ＡＰＰセグメントに対する免疫応答は、本発明の新規の断片およびその小断片、他のペプチド免疫原、または受動免疫感作に用いる抗体およびその成分鎖をコードする核酸の投与によっても誘発することができる。このような核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡでありうる。免疫原または抗体をコードする核酸セグメントは、目的とする患者の標的細胞におけるＤＮＡセグメントの発現を可能とするプロモーターおよびエンハンサーなどの調節エレメントに連結されることが通例である。軽鎖または重鎖免疫グロブリン遺伝子に由来するプロモーターおよびエンハンサーエレメントまたはＣＭＶ主要中間初期プロモーターおよび同エンハンサーが、発現を導くのに適する。連結された調節エレメントおよびコード配列は、ベクター内にクローン化されることが多い。二本鎖抗体を投与する場合は、同一または別個のベクターにおいて該二本鎖をクローン化することができる。
【００７２】
レトロウイルス系（例えば、ＬａｗｒｉｅおよびＴｕｍｉｎ、Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．、第３巻、１０２〜１０９頁、１９９３年を参照のこと）；アデノウイルスベクター（例えば、Ｂｅｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、第６７巻、５９１１頁、１９９３年を参照のこと）；アデノ関連ウイルスベクター（例えば、Ｚｈｏｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、第１７９巻、１８６７頁、１９９４年を参照のこと）、ワクシニアウイルスおよび鶏痘ウイルスを含むポックスファミリーに由来するウイルスベクター、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林熱ウイルスに由来するウイルスベクター（例えば、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、第７０巻、５０８〜５１９頁、１９９６年を参照のこと）などのアルファウイルス属に由来するウイルスベクター、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（米国特許第５，６４３，５７６号を参照のこと）、および水胞性口内炎ウイルス（国際公開第９６／３４６２５号を参照のこと）および乳頭腫ウイルス（Ｏｈｅら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、第６巻、３２５〜３３３頁、１９９５年；Ｗｏｏら、国際公開第９４／１２６２９号、ならびに、ＸｉａｏおよびＢｒａｎｄｓｍａ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２４巻、２６３０〜２６２２頁、１９９６年）などのラブドウイルスを含む多数のウイルスベクター系を用いることができる。
【００７３】
免疫原をコードするＤＮＡまたはそのＤＮＡを含むベクターは、リポソーム中に封入することができる。適切な脂質および関連の類似体は、米国特許第５，２０８，０３６号、同第５，２６４，６１８号、同第５，２７９，８３３号、および同第５，２８３，１８５号により記載されている。ベクターおよび免疫原をコードするＤＮＡは、その例がポリメチルメタクリレートポリマーおよびポリラクチドおよびポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（例えば、ＭｃＧｅｅら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏ Ｅｎｃａｐ．、１９９６年を参照のこと）を含む粒子状の担体に吸着または結合させることもできる。
【００７４】
遺伝子治療用ベクターまたは裸のＤＮＡは、通例では全身投与（例えば、静脈内注入、腹腔内注入、鼻腔内注入、胃内注入、皮内注入、筋肉内注入、皮下注入、または頭蓋内注入）または外用塗布（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照のこと）により、個々の患者にｉｎ ｖｉｖｏにおいて送達することができる。このようなベクターは、ブピバカイン（米国特許第５，５９３，９７０号）などの促進化作用物質をさらに含むことができる。ＤＮＡは、遺伝子銃を用いて投与することもできる。ＸｉａｏおよびＢｒａｎｄｓｍａ、前出、を参照のこと。免疫原をコードするＤＮＡは、微細な金属ビーズの表面に沈析させる。微小発射体は、ショック波または膨張ヘリウムガスにより加速され、複数細胞層の深さまで組織に貫入する。例えば、ウィスコンシン州、ミドルトン、Ａｇａｃｅｔｕｓ社製のＡｃｃｅｌ（商標）遺伝子送達器が適する。あるいは、単に、化学的または機械的な刺激とともに皮膚上にＤＮＡを塗布することにより、裸のＤＮＡは、皮膚を経て血流中に移行しうる（国際公開第９５／０５８５３号を参照のこと）。
【００７５】
さらなる変更において、免疫原をコードするベクターは、個々の患者から外植される細胞（例えば、リンパ球、骨髄吸引物、組織生検）または万能供血者の造血幹細胞などの細胞に、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて送達し、続いて、通常はベクターを組み込んだ細胞の選択後に該細胞を患者に再移植することができる。
【００７６】
ＶＩＩＩ．治療しやすい患者
治療しやすい患者は、疾患の危険性があるが症状を示さない個体のほか、現在症状を示す患者をも含む。治療対象となる疾患は、アルツハイマー病、ならびに、ダウン症および軽度の認知障害など、脳内におけるＡβの沈着を特徴とする他の疾患を含む。アルツハイマー病の場合、十分に長生きするほとんどだれもが、アルツハイマー病に罹患する危険性がある。従って、本方法は、対象患者の危険性に対する評価の必要なしに、一般の集団に予防的に実施することができる。本方法は、特に、アルツハイマー病の既知の遺伝的危険性を有する個体に有用である。このような個体は、本疾患を経験した親族を有する個体、遺伝的または生化学的マーカーの解析によりその危険性が決定される個体を含む。アルツハイマー病への危険性の遺伝的マーカーは、ＡＰＰ遺伝子における突然変異、特に、ハーディー変異およびスウェーデン変異と呼ばれる７１７位ならびに６７０および６７１位における突然変異を含む（Ｈａｒｄｙ、ＴＩＮＳ、前出、を参照のこと）。危険性の他のマーカーは、プレセニリン遺伝子であるＰＳ１およびＰＳ２、ならびにアポＥ４における突然変異、ＡＤ、高コレステロール血症、またはアテローム性動脈硬化の家族歴である。現在アルツハイマー病に罹患する個体は、特徴的な認知症のほか、上述の危険性因子の存在からも認知することができる。加えて、ＡＤを有する個体を同定する多数の診断検査が可能である。これらは、ＣＳＦ中のタウレベルおよびＡβ４２レベルの測定を含む。タウレベルの上昇およびＡβ４２レベルの低下が、ＡＤの存在を意味する。アルツハイマー病に罹患する個体は、実施例セクションで論じるＡＤＲＤＡ基準によっても診断することができる。
【００７７】
無症状患者の場合、治療はどの年齢（例えば、１０、２０、３０歳）においても開始することができる。しかし、患者が４０、５０、６０、または７０歳に達するまでは治療を開始する必要はないことが通例である。治療は、一定期間にわたる複数回投与を伴うのが通例である。治療は、治療用作用物質（例えば、Ａβペプチド）に対する抗体、または活性化Ｔ細胞もしくはＢ細胞の応答を経時的に分析することによりモニターすることができる。応答が低下する場合は、追加抗原投与が示唆される。潜在的なダウン症患者の場合、生前、母体に治療用作用物質を投与することによって、または生後すぐに治療を開始することができる。
【００７８】
ＩＸ．治療レジメン
予防的な適用の場合、本発明の作用物質（ペプチドまたは抗体）を含む薬剤組成物または薬剤は、アルツハイマー病に罹患しやすい、またはこれ以外にアルツハイマー病の危険性がある患者に、該疾患の生化学的、組織学的、および／または行動学的症状、その合併症、ならびに該疾患の発症中に存在する病理的な中間表現型を含む、該疾患の危険性を除去もしくは低減する、同重症度を軽減する、または同発症を遅延させるのに十分な量で投与される。治療的な適用の場合、組成物または薬剤は、このような疾患が推測される、または既にこれに罹患する患者に、その合併症、ならびに該疾患の発症における病理的な中間表現型を含む、該疾患の（生化学的、組織学的、および／または行動学的）症状を治癒させる、または少なくとも部分的に阻止するのに十分な量で投与される。こうして、該疾患を有するまたは有すると推測される患者の症状を少なくとも部分的に緩和するまたはそのさらなる悪化を抑制するレジメンは、患者が該疾患から完全に治癒するかどうかに関わりなく、患者を治療する。一部の方法において、作用物質の投与は、いまだ特徴的なアルツハイマー病の病態を発現していない患者における筋認知的な障害を軽減または除去する。
【００７９】
治療的または予防的処置を達成するのに十分な量は、治療的または予防的に有効な用量として定義される。治療的または予防的処置を達成するのに十分な投与量および投与回数は、治療的または予防的に有効なレジメンとして定義される。予防的レジメンおよび治療的レジメンのいずれにおいても、作用物質は、十分な免疫応答が達成されるまで複数回の投与において投与されるのが通例である。免疫応答をモニターし、免疫応答が減弱し始めたら反復投与を行うのが通例である。
【００８０】
前述の状態の治療のための、本発明の組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬剤、および処置が予防的であるかまたは治療的であるかを含む多数の異なる因子に応じて変化する。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物も治療することができる。治療用量は、漸増して安全性および有効性を最適化する必要がある。アジュバントなしの場合、より高用量が必要とされるので、免疫原の量は、アジュバントも投与するかどうかに依存する。免疫原の投与量は、患者当たり１〜５００μｇで変化することもあるが、ヒト投与の場合、注射当たり５〜５００μｇで変化するのが通例である。場合によっては、注射当たり１〜２ｍｇの高用量を用いる。ヒト注射ごとに約１０、２０、５０、または１００μｇを用いるのが通例である。免疫原の質量も、免疫原全体の質量に対する、免疫原内の免疫原性エピトープの質量比に依存する。マイクログラム単位の免疫原に対して、１０−３〜１０−５マイクロモルの免疫原性エピトープを用いるのが通例である。注射のタイミングは、１日１回から年に１回、１０年に１回まで有意に変化しうる。免疫原の用量を投与する任意の所定日において、該用量は、アジュバントも投与する場合は、患者当たり１μｇを上回り、患者当たり１０μｇを上回ることが通例であり、アジュバントなしの場合は、患者当たり１０μｇを上回り、１００μｇを上回ることが通例である。通例のレジメンは、免疫感作に続く、６週間隔などの時間間隔での追加抗原注射からなる。別のレジメンは、免疫感作に続く、１ヶ月後、２ヶ月後および１２ヶ月後での追加抗原注射からなる。別のレジメンは、生涯にわたる２カ月ごとの注射を伴う。あるいは、追加抗原注射は、免疫応答のモニタリングが指示する通りに、不規則に行うことができる。
【００８１】
抗体による受動免疫感作の場合、用量は、宿主体重に対して約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり、同０．０１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲であることがより通例である。例えば、用量は、体重比１ｍｇ／ｋｇまたは同１０ｍｇ／ｋｇまたは１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内でありうる。例示的な治療レジメンは、２週間ごとに１回または１カ月ごとに１回または３〜６カ月ごとに１回の投与を伴う。一部の方法では、異なる結合特異性を有する２種類以上のモノクローナル抗体を同時に投与し、この場合、投与される各抗体の用量は、指示される範囲内に該当する。抗体は、複数回において投与されるのが通例である。各投与間の間隔は、毎週、毎月、毎年でありうる。間隔は、患者におけるＡβに対する抗体の血中レベルを測定することにより示される通りに、不規則でもありうる。一部の方法では、用量を調整して１〜１０００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を達成し、また一部の方法では、２５〜３００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を達成する。あるいは、抗体は、徐放製剤として投与することができ、この場合、必要な投与回数は減少する。用量および投与回数は、患者における抗体の半減期に応じて変化する。一般に、ヒト抗体が最長の半減期を示し、これにヒト化抗体、キメラ抗体、および非ヒト抗体が続く。投与量および投与回数は、処置が予防的であるかまたは治療的であるかに応じて変化しうる。予防的な適用では、長期間にわたり、相対的に低頻度の間隔で相対的な低用量を投与する。患者によっては、残りの生涯にわたって治療を受け続ける。治療的な適用では、疾患の進行が低減または終結されるまで、好ましくは、患者が疾患症状の部分的または完全な改善を示すまで、相対的に短い間隔で相対的な高用量が必要とされることがある。その後、患者には、予防的なレジメンを実施することができる。
【００８２】
免疫原をコードする核酸の用量は、患者当たり約１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇ、または３０〜３００μｇの範囲のＤＮＡである。感染性ウイルスベクターの用量は、投与当たり１０〜１００ビリオンまたはそれ以上で変化する。
【００８３】
免疫応答を誘発する作用物質は、予防的および／または治療的処置のための非経口、外用、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭該内、腹腔内、鼻腔内、または筋肉内の投与手段により投与することができる。免疫原性作用物質の最も通例の投与経路は、皮下経路であるが、他の経路も同様に有効でありうる。これに次いで最も通例の経路は、筋肉内注射である。この種の注射は、腕部または脚部の筋肉において実施するのが最も通例である。一部の方法、例えば、頭該内注射では、沈着物が蓄積している特定の組織内に直接に作用物質を注射する。抗体投与では、静脈内注入に対して筋肉内注射が好まれる。一部の方法では、特定の治療用抗体が、頭該内に直接に注射される。一部の方法では、徐放組成物またはＭｅｄｉｐａｄ（商標）器などの徐放機器として、抗体を投与する。
【００８４】
本発明の作用物質は、場合によっては、アミロイド形成性疾患の治療において少なくとも部分的に有効な他の作用物質と併用して投与することができる。ＡＰＰのＡβ領域に由来するペプチドまたはＡβに特異的に結合する抗体を用いる能動免疫感作法および受動免疫感作法は、例えば、米国特許第６，８６６，８５０号、米国特許第６，７８７，６３７号、および米国特許第６，８１８，２１８号により記載されている。本発明の作用物質は、本発明の作用物質の血液脳関門の通過を増加させる他の作用物質と併用して投与することもできる。
【００８５】
ペプチドなど、本発明の免疫原性作用物質は、アジュバントと併用して投与されることがある。各種のアジュバントをＡＰＰ断片と併用して、免疫応答を引き起こすことができる。好ましいアジュバントは、応答の質的な形態に影響する、免疫原において立体構造変化を生じることなく、免疫原に対する内因性反応を増大させる。好ましいアジュバントは、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、３ Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ（商標））（英国特許第２２２０２１１号［現在Ｃｏｒｉｘａ社の一部をなす、モンタナ州、ハミルトン、ＲＩＢＩ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社］を参照のこと）を含む。Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）ＱＳ−２１は、南米原産のシャボンノキの樹皮から単離されたトリエルペングリコシドまたはサポニン（Ｋｅｎｓｉｌら、「Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編、ニューヨーク、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ社、１９９５年；米国特許第５，０５７，５４０号を参照のこと）（マサチューセッツ州、フラミンガム、Ａｑｕｉｌａ ＢｉｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社製）である。他のアジュバントは、場合によっては、モノホスホリル脂質Ａ（Ｓｔｏｕｔｅら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、第３３６巻、８６〜９１頁、１９９７年を参照のこと）などの免疫刺激剤との併用における水中油型乳剤（スクアレンまたはピーナッツ油など）である。別のアジュバントは、ＣｐＧ（国際公開第９８／４０１００号）である。あるいは、Ａβをアジュバントに結合させることができる。しかし、このような結合が、Ａβの立体構造を実質的に変化させ、それへの免疫応答の性質に影響を及ぼさないようにすべきである。アジュバントは、有効作用物質を有する治療用組成物の成分として、または治療用作用物質投与の前に、同投与と同時に、もしくは同投与の後に別個に投与することができる。
【００８６】
アジュバントの好ましいクラスは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなどのアルミニウム塩（ミョウバン）である。このようなアジュバントは、ＭＰＬまたは３−ＤＭＰ、ＱＳ−２１、ポリグルタミン酸またはポリリシンなどのポリマーアミノ酸または単量体アミノ酸などの他の特異的な免疫刺激作用物質とともに、またはこれらを伴わずに用いることができる。別のクラスのアジュバントは、水中油型乳剤による製剤である。このようなアジュバントは、ムラミルペプチド（例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソグル−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド（ＤＴＰ−ＤＰＰ）：Ｔｈｅｒａｍｉｄｅ（商標））、または他の細菌細胞壁成分などの他の特異的な免疫刺激作用物質とともに、またはこれらを伴わずに用いることができる。水中油型乳剤は、（ａ）１１０Ｙ型マイクロフルイダイザー（マサチューセッツ州、ニュートン、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ社製）などのマイクロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子に調合した、５％スクアレン、０．５％ Ｔｗｅｅｎ ８０、および０．５％ Ｓｐａｎ ８５（場合によっては、様々な量のＭＴＰ−ＰＥを含む）を含むＭＦ５９（国際公開第９０／１４８３７号）と、（ｂ）サブミクロン乳剤にマイクロフルイダイズするか、またはより大きな粒径の乳剤を産生するようにボルテックスした、１０％スクアレン、０．４％ Ｔｗｅｅｎ ８０、５％のプルロニック型ブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含むＳＡＦと、（ｃ）２％スクアレン、０．２％ Ｔｗｅｅｎ ８０、ならびに、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））からなる群からの１つまたは複数の細菌細胞壁成分を含むＲｉｂｉ（商標）アジュバントシステム（ＲＡＳ）（モンタナ州、ハミルトン、ＲＩＢＩ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ社製）とを含む。好ましいアジュバントの別のクラスは、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）（ＱＳ−２１、マサチューセッツ州、フラミンガム、Ａｑｕｉｌａ社製）またはこれより産生されたＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸなどの粒子などのサポニンアジュバントである。他のアジュバントは、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）を含む。他のアジュバントは、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、およびＩＬ−１２）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのサイトカインを含む。
【００８７】
アジュバントは、免疫原とともに単一の組成物として投与することもでき、免疫原の投与前に、同投与と同時に、もしくは同投与後に投与することもできる。免疫原およびアジュバントは、同一のバイアルに包装して供給することもでき、個別のバイアルに包装して使用前に混合することもできる。免疫原およびアジュバントは、目的とする治療適用を示す表示とともに包装されるのが通例である。免疫原およびアジュバントを個別に包装する場合、該包装は、使用前の混合についての指示書を含むのが通例である。アジュバントおよび／または担体の選択は、アジュバントを含む免疫原製剤の安定性、投与経路、投与スケジュール、ワクチン投与される種に対するアジュバントの有効性に依存し、ヒトの場合、薬剤として許容されるアジュバントは、ヒトへの投与に関し関連の規制機関により承認された、または承認可能なアジュバントである。例えば、フロイント完全アジュバントは、ヒトへの投与には適さない。ミョウバン、ＭＰＬ、およびＱＳ−２１が好ましい。ＲＣ５２９−ＳＥ（Ｃｏｒｉｘａ社製）も、好ましいアジュバントである。場合によっては、２つ以上の異なるアジュバントを同時に用いることができる。好ましい組み合わせは、ＭＰＬとミョウバン、ＱＳ−２１とミョウバン、ＱＳ−２１とＭＰＬ、ならびにミョウバン、ＱＳ−２１、およびＭＰＬをともにである。場合によっては、ミョウバン、ＱＳ−２１、およびＭＰＬのいずれか、およびそのすべての組み合わせとの併用で、フロイント不完全アジュバントを用いることもできる（Ｃｈａｎｇら、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ、第３２巻、１７３〜１８６頁、１９９８年）。
【００８８】
本発明の作用物質は、有効治療作用物質および薬剤として許容される他の多様な成分を含む、薬剤組成物として投与されることが多い。「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ」、第１５版、ペンシルベニア州、イーストン、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ社、１９８０年を参照のこと。好ましい形態は、意図する投与方式および治療適用に依存する。組成物は、所望の製剤に応じて、薬剤として許容される無毒性の担体または希釈剤であって、動物またはヒトへの投与のための薬剤組成物を調合するのに用いるのが通例である媒体として定義される担体または希釈剤をも含みうる。希釈剤は、組み合わせの生物学的活性に影響しないように選択される。このような希釈剤の例は、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩液、リンゲル液、デキストロース溶液、ハンクス液である。加えて、薬剤組成物または製剤は、他の担体、アジュバント、または無毒性、非治療用、非免疫原性の安定剤などをも含んでよい。
【００８９】
薬剤組成物は、タンパク質、キトサンなどの多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびコポリマー（ラテックス官能化セファロース（商標）、アガロース、セルロースなど）、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、および脂質凝集体（油滴またはリポソームなど）など、大型で代謝の遅い高分子をも含みうる。加えて、これらの担体は、免疫刺激作用物質（すなわち、アジュバント）として機能しうる。
【００９０】
非経口投与の場合、本発明の作用物質は、水油、生理食塩液、グリセロール、またはエタノールなどの無菌液体でありうる薬剤担体を有する、生理的に許容される希釈剤中における物質の注射可能な用量の溶液または懸濁液として投与することができる。加えて、湿潤剤または乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質が、組成物中に存在しうる。薬剤組成物の他の成分は、石油、動物、植物、または合成起源の成分、例えば、ピーナッツ油、大豆油、およびミネラル油である。一般に、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールが、特に、注射可能な溶液に好ましい液体の担体である。抗体は、蓄積注射、または、有効成分の徐放を可能とする方式で調合しうる移植式製剤の形態で投与することができる。例示的な組成物は、ＨＣｌによりｐＨ６．０に調整した、５０ｍＭ Ｌ−ヒスチジン、１５０ｍＭ ＮａＣｌからなる水溶性緩衝液中で調合された５ｍｇ／ｍＬのモノクローナル抗体を含む。
【００９１】
組成物は、溶液または懸濁液として、注射剤として調製されるのが通例であるが、溶液または懸濁液に適する固体形態を、注射前に液体の媒体中で調製することもできる。製剤は、上記に論じた通り、乳化するか、あるいはリポソーム、またはポリラクチド、ポリグリコリド、もしくはアジュバント効果を高めるコポリマーなどの微粒子中に封入することもできる（Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４９巻、１５２７頁、１９９０年、およびＨａｎｅｓ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ、第２８巻、９７〜１１９頁、１９９７年を参照のこと）。本発明の作用物質は、蓄積注射、または、有効成分の徐放またはパルス放出を可能とする方式で調合しうる移植式製剤の形態で投与することができる。
【００９２】
他の投与方式に適するさらなる製剤は、経口製剤、鼻腔内製剤、および肺内製剤、坐薬、ならびに外用塗布剤を含む。
【００９３】
坐薬の場合、結合剤および担体は、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含み、このような坐薬は、０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲にある有効成分を含む混合物から作製することができる。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、および炭酸マグネシウムなどの賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放製剤、または粉末の形態をとり、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の有効成分を含む。
【００９４】
外用塗布剤は、経皮送達または皮内送達をもたらすことができる。外用投与は、コレラトキシンまたはその無毒化した誘導体もしくはサブユニット、あるいは他の同様の細菌性トキシンを有する作用物質の共投与により容易化することができる（Ｇｌｅｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、第３９１巻、８５１頁、１９９８年）。共投与は、該成分を混合物として、または化学的架橋形成もしくは融合タンパク質としての発現により得られる連結分子として用いることにより達成することができる。
【００９５】
あるいは、経皮送達は、皮膚用パッチ剤を用いるか、またはトランスフェロソーム（Ｐａｕｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第２５巻、３５２１〜３５２４頁、１９９５年；Ｃｅｖｃら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、第１３６８号、２０１〜２１５頁、１９９８年）を用いて達成することができる。
【実施例】
【００９６】
これらの実施例は、馴化細胞培地およびＰＤＡＰＰ脳抽出物に由来する分子量の明らかなＡβオリゴマーによる免疫反応種の概略を示す。
【００９７】
コンフルエントに近い細胞に由来する無血清培地中での１５〜１８時間の後、７ＰＡ２細胞由来の馴化培地（ＣＭ）を回収した。１，０００ｒｐｍで３０分間、ＣＭをスピンした。ＣＭを新しい試験管に移してすぐに評価するか、または−８０℃で凍結させた。ＣＭは、ＮＨＳセファロース樹脂に結合した抗体により免疫沈降（ＩＰ）させ、ウェスタンブロット法により対応する物質を検出した。
【００９８】
Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｊ．、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、２００１年、第７９巻、５９５〜６０５頁により最初に記載された通りに、ＰＤＡＰＰ脳組織に由来する可溶性のオリゴマー種を評価するプロトコールを実施した。略述すると、氷上、２％ ＳＤＳおよびプロテアーゼ阻害剤（１／１０ｗｔ／ｖｏｌ）を含む２０ｍＭトリス、ｐＨ７．６、１３７ｍＭ ＮａＣｌ中で、Ｄｏｕｎｃｅ社製ホモジナイザーにより脳組織をホモジナイズした。１回目の遠心分離後、可溶種を含む上清を、２００，０００ｇで２時間遠心分離した。上清を等量に分割し、−８０℃で貯蔵するか、または間をおかずに免疫沈降に用いた。
【００９９】
１２カ月齢のマウスに由来するＰＤＡＰＰ皮質抽出物における免疫反応バンドのプロファイルを、図１の上方に示す。抗Ａβ抗体樹脂および抗ＡＰＰ抗体樹脂によりＩＰを実施した後で、Ａβのアミノ酸４〜６に対するエピトープを有する抗Ａβ抗体である２Ｈ３によりウェスタンブロット画像を得た。１２Ａ１１ ＩＰと８Ｅ５ ＩＰとの比較は、ウェスタンブロット画像に示される分子量マーカー７ｋＤａ〜３４ｋＤａの間の領域において、同様の免疫反応プロファイルを示す。免疫沈降に用いた各種抗体のエピトープ特異性は、Ａβのアミノ酸１〜５に対する３Ｄ６、Ａβのアミノ酸３〜７に対する１２Ａ１１、Ａβのアミノ酸１６〜２３に対する２６６、Ａβのアミノ酸１９〜２２に対する６Ｈ９、ＡＰＰ（エピトープのマッピングなし）のアミノ酸４４４〜５９２に対する８Ｅ５である。
【０１００】
図２ＡおよびＢの上方におけるウェスタンブロット画像より、ＩＰ物を様々な濃度のＮａＣｌで洗浄した。８Ｅ５樹脂または１２Ａ１１樹脂によりＰＤＡＰＰ脳から同定される免疫反応バンドのＩＰプロファイルは、異ならないように見える。両抗体による逐次的な免疫沈降をも評価した。１２Ａ１１および８Ｅ５による７ＰＡ２ ＣＭ免疫反応バンドは、１２Ａ１１免疫沈降により同定される単量体Ａβバンド（約４ｋＤａ）を例外として、８Ｅ５抗体および１２Ａ１１抗体により免疫沈降した皮質脳ホモジネートときわめて類似するプロファイルを示す。図２ＡおよびＢは、同じブロットの濃い露光と軽い露光である。
【０１０１】
抗Ａβ抗体（２６６、１２Ｂ４、１２Ａ１１、および２１Ｆ１２）および抗ＡＰＰ抗体８Ｅ５からの免疫沈降物を、８Ｅ５または２Ｈ３（Ａβのアミノ酸３〜７）によりプローブされるウェスタンブロット画像において同定した。８Ｅ５の免疫反応プロファイルは、２Ｈ３により画像化される抗Ａβ抗体のＩＰにより検出される約４ｋＤａの単量体Ａβを例外として、抗Ａβ抗体による、８Ｅ５または２Ｈ３により画像化されるウェスタンブロットからのプロファイルときわめて類似した（図３）。Ａβのアミノ酸３〜７に対するブロット１２Ｂ４、Ａβのアミノ酸３４〜４３に対するブロット２１Ｆ１２、エピトープのマッピングがないＡＰＰの４４４〜５９２に対するブロット１Ｇ５５において、さらなる抗体特異性を用いた。
【０１０２】
サイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を実施して、異なるＡβオリゴマー種を分離し、これらを機能アッセイまたは配列決定に用いることができた。プロトコールは、７ＰＡ２細胞に由来する馴化培地を用いて最適化した。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ５，０００ ＭＷＣＯにより、３０ｍｌのＣＭを２．５ｍｌに濃縮した。濃縮したＣＭは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５分取グレード１６／６０カラムに投入した。溶出緩衝液として５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液を用い、ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ＋０．０５％ ＮａＮ３により予め一晩ブロックした９６ウェルプレートに３５０μｌ分画を回収した。２６６／３Ｄ６によるＥＬＩＳＡ法を用いて、総Ａβについて分画を分析した。プールした分画を、１２Ａ１１−ＮＨＳセファロース樹脂によっても免疫沈降させ、対応する物質をウェスタンブロット法により検出した。ＥＬＩＳＡ法により総Ａβについて分画を分析したところ、分画１〜３１ではＡβが検出されず、分画３１〜８１にＡβの主要なピークが存在した（図４、下パネル）。
【０１０３】
分画から免疫沈降した物質を、１６％トリシンゲルにロードし、２Ｈ３抗体（Ａβ ４のアミノ酸４〜６）により、対応するブロットをプローブした（図４、上パネル）。
【０１０４】
上述のＳＥＣ手順を用いた後に、図４に述べたＩＰ／ウェスタンブロット手順を続けた。プールした分画（プール当たりの分画ｎ＝１０）をＳＥＣプレート３から回収し、図４の上側で免疫反応性を同定した。７ＰＡ２ ＳＥＣからプールした分画は、８Ｅ５樹脂または１２Ｂ４樹脂により免疫沈降させ、これに３Ｄ６（Ａβのアミノ酸１〜５）、８Ｅ５（ＡＰＰのアミノ酸４４４〜５９２）、または２Ｈ３（Ａβのアミノ酸４〜６）による画像化を続けた。３Ｄ６によるウェスタンブロット画像は、１２Ｂ４−ＩＰによる約４ｋＤａバンドに免疫反応性を示した（図５Ａ、Ｂ、Ｃ）。８Ｅ５ウェスタンブロット画像は、８Ｅ５樹脂または１２Ｂ４樹脂により免疫沈降させた免疫反応バンドのいくつかが同様にみえることを示す。このことは、２Ｈ３のウェスタンブロット画像に従う。８Ｅ５ ＩＰによる左の２Ｈ３画像は、の分子量マーカー７ｋＤａを超える免疫反応バンドを示す。１２Ｂ４ ＩＰによる２Ｈ３画像は、８Ｅ５ ＩＰと比べて同数以上の免疫反応バンドを示し、１２Ｂ４ ＩＰ−２Ｈ３画像は、８Ｅ５が捕捉しない７〜８ｋＤａ範囲におけるバンドを捕捉する。
【０１０５】
図６ＡおよびＢは、７ＰＡ２馴化培地（ＣＭ）をヘパリンセファロース８Ｅ５樹脂および１２Ｂ４樹脂により免疫沈降し、その後抗Ａβ抗体および抗ＡＰＰ抗体を用いるウェスタンブロット法による画像化を示す。図６Ａは、７ＰＡ２ ＣＭに由来する、１２Ｂ４および８Ｅ５によりＩＰした免疫反応バンドを比較する。ヘパリンセファロースは、ＡＰＰ種に結合するので別の比較物であるＡＰＰに結合する。図６Ｂは、ＡＰＰにおける類似の領域に対する２つの抗体である、８Ｅ５および１８Ｇ１０により画像化したウェスタンブロットを示す。これらは、類似の免疫反応性を示す。Ａβ特異抗体２Ｇ３によるブロットも、８Ｅ５ ＩＰ物および１２Ｂ４ ＩＰ物の双方における１２ｋＤａバンドの反応性を示す。
【０１０６】
８Ｅ５免疫沈降断片のＮ末端のエドマン配列決定（試料当たり１０サイクル）によりＡＰＰ内に２つの配列を同定した（図５Ａ、Ｂ、Ｃに示す）。ＡＰＰ６９５の番号付けに基づいて、同定された配列は、ＡＰＰ５１６〜５２５および同５３６〜５４５であった。いずれの配列も、４４４〜５９２である８Ｅ５免疫原内に該当した。Ａβ４２末端特異抗体２１Ｆ１２による免疫沈降法は、少なくとも一部の同定した断片がＡβの残基４２で終結することを示唆した。このことから、同定した２つの断片が、ＡＰＰの残基５１６〜６３８および同５３６〜６３８であることを意味した。他の断片は他のＡβ末端部位を含む可能性が高く、これらは、ＡＰＰの残基約６３４〜６４２に及ぶ。
【０１０７】
Ｎ末端エドマン配列決定から得られたデータに基づき、ＡＰＰ５１６〜６３８断片およびＡＰＰ５３６〜６３８断片をコードするＤＮＡ断片を、ＡＰＰ断片のＮ末端に隣接して６×ヒスチジンタグおよび因子Ｘａプロテアーゼ切断部位を有するｐＥＴ２１細菌発現ベクター内にクローン化した。ＡＰＰ断片は、ＢＬ２１（ＤＥ３）化学的コンピテント細胞に形質転換され、通例のＩＰＴＧ誘導プロトコールにより１６℃で発現した。該断片を、まず、固定化金属親和性カラム（ＩＭＡＣ）に通し、６×ヒスチジン親和性タグにより均質に精製した。組み換えＡＰＰ５１６〜６３８断片およびＡＰＰ５３６〜６３８断片を生成するため、４℃で一晩かけて、ＩＭＡＣにより精製した断片を因子Ｘａにより切断した。タンデムＩＭＡＣおよび因子Ｘａ除去樹脂により、非切断断片、切断した６×ヒスチジンタグ、および遊離因子Ｘａを反応混合物から除去した。均一の組み換えＡＰＰ断片は、特性解析用のアッセイ緩衝液に緩衝液交換した。
【０１０８】
Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ社製のＮｅｕｒｏｎａｌ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｂｉｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎを用いて、ニューロン形態を定量化した。ＮＰ Ｂｉｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎは、２〜６個のイメージングチャネルからの情報を統合して、細胞ベースの測定を実行する。ＤＮＡに結合するヘキスト染料により細胞を染色し、核領域を同定する。大きさ、形状、および明暗度など、核の特徴を測定する。
【０１０９】
チューブリンに対するモノクローナル抗体を用いて神経細胞体および神経突起を同定し、次いで、蛍光標識した二次抗体で染色した。Ｂｉｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎにより、ニューロン長、平均カウント分枝点（ＢＰＡＣ）、および細胞体からの平均分枝点距離（ＢＰＡＤＣＢ）などの神経突起の特徴を自動的に計算した。ＮＰ Ｂｉｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎにおける最も有用なリードアウトパラメータの１つであるＢＰＡＤＣＢは、具体的に、選択した細胞体からのすべての神経突起の分枝点距離の和を、分枝点総カウントで除して計算した。さらにＢＰＡＣは、分枝点総カウントを神経突起カウントで除して計算した。細胞は、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ社製のＡｒｒａｙＳｃａｎ Ｒｅａｄｅｒを用いて、２４、９６、または３８４ウェル形式で画像化できる。
【０１１０】
図８は、アラマーブルーを用いる代謝活性に関する８日間アッセイ用の、精製済み５１６および５３６物質により処置したヒト皮質ニューロンを示す。調べた最高用量（５１６に対して４０ｕＭ、および５３６に対して２２ｕＭ）において、ペプチドによる処置は、５１６および５３６の処理細胞の生存率をいずれも２０〜３０％低下させた。
【０１１１】
図９Ａおよび９Ｂは、精製済み５１６および５３６物質により１日間処置したヒト皮質ニューロンを示し、細胞を固定し、βチューブリンについて染色して、細胞形態を同定した。細胞は、細胞当たりの神経突起分枝点の平均数（９Ａ）と、細胞体からの平均分枝点距離（９Ｂ）とを含むニューロン形態について、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ社製のＡｒｒａｙＳｃａｎを用いて分析した。ペプチドによる処理は、対照と比べてニューロン形態のいずれのパラメータをも低下させ、これは、神経毒性の初期徴候を示す。
【化２−１】
【化２−２】
【０１１２】
上記の実施例は、例示的であるにすぎず、本発明を定義するものではない。当業者には、他の変形が容易に明らかであろう。本発明の適用範囲は、本明細書から生じる１つまたは複数の任意の特許請求の範囲により包含される。従って、本発明の適用範囲は、上記の記載を参照して決定されるのではなく、むしろ、これと等価な記載の全適用範囲を含んで発される特許請求の範囲を参照して決定されるべきである。本出願において引用されたすべての刊行物、参照物、および特許文献は、各個の刊行物または特許文献が個別に示されると仮定した場合と同程度に、すべての目的について、その全体において、参照により組み入れられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトアミロイド前駆体タンパク質の残基４４４〜５９５（ＡＰＰ６９５の番号付け）内のエピトープに特異的に結合する抗体。
【請求項２】
モルモットアミロイド前駆体タンパク質に対する特異的結合性を欠く、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ヒトアミロイド前駆体タンパク質の残基５５１〜５７０内のエピトープに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
ヒトアミロイド前駆体タンパク質の残基５３０〜５８０内のエピトープに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
ヒトアミロイド前駆体タンパク質の残基５７６〜５９５内のエピトープに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
ヒトアミロイド前駆体タンパク質の残基５４５〜５５５内のエピトープに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
ヒトアミロイド前駆体タンパク質に対する特異的結合についてモノクローナル抗体８Ｅ５と競合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
ヒトアミロイド前駆体タンパク質に対する特異的結合について１８Ｂ１０と競合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
８Ｅ５またはそのヒト化形態もしくはキメラ形態である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
１８Ｂ１０またはそのヒト化形態もしくはそのキメラ形態である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
モノクローナル抗体である、請求項１〜１０のいずれかに記載の抗体。
【請求項１２】
アルツハイマー病を予防的または治療的に処置する方法であって、前記疾患に罹患しているまたは前記疾患の危険性がある患者に、ＡＰＰのアミノ酸５１６〜５９５の間の少なくとも４つの連続した残基を含む断片の治療的に有効なレジメンを施し、それによって前記疾患を予防的または治療的に処置するステップを含む方法。
【請求項１３】
断片が、ＡＰＰのアミノ酸５５１〜５９５の間の少なくとも５つの連続した残基を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
断片が、ＡＰＰのアミノ酸５４４〜５９６または５９７の間の少なくとも７つの連続した残基を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
断片が、ＡＰＰの残基５５１〜５９５を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
断片が、ＡＰＰの残基５５１〜６３８を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
施すステップで、各々がＡＰＰの残基５５１〜５９５の間の少なくとも４つの連続したアミノ酸を含む複数の断片を投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
断片が、ＡＰＰの残基５５１〜５９５の間の４〜２０個の連続したアミノ酸を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
断片が、ＡＰＰの残基５１６〜５９５の間の４〜２０個の連続したアミノ酸を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
断片が、ＡＰＰの残基５５１〜５９５の間の４〜１０個の連続したアミノ酸を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
断片が、ＡＰＰの残基５１６〜５９５の間の４〜１０個の連続したアミノ酸を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
断片が第１および第２のセグメントを含み、第１のセグメントがＡβのセグメントであり、第２のセグメントがＡβの上流にあるＡＰＰのセグメントである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
第１および第２のセグメントが、ヒトＡＰＰの連続したセグメントである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２４】
断片がコンジュゲートとして担体と連結し、担体が、断片に対する抗体を含む免疫応答を引き起こす一助となる、請求項１２に記載の方法。
【請求項２５】
アジュバントを患者に投与するステップをさらに含み、アジュバントが断片に対する抗体を含む免疫応答を引き起こす一助となる、請求項１２に記載の方法。
【請求項２６】
Ａβに対する抗体または前記抗体を生成する免疫原を投与するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２７】
免疫原を投与し、免疫原がＡβの断片である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２８】
アルツハイマー病を予防的または治療的に処置する方法であって、前記疾患に罹患するまたは前記疾患の危険性がある患者に、（ａ）ヒトＡＰＰの残基５１６〜５９５内のエピトープに特異的に結合する抗体、または（ｂ）このような抗体を生成する免疫原、のいずれかの治療的に有効なレジメンを施し、それによって前記疾患を予防的または治療的に処置するステップを含む方法。
【請求項２９】
抗体が、ヒトＡＰＰの残基５３０〜５９５内のエピトープに特異的に結合する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
抗体が、請求項２から８のいずれかにおいて定義される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
抗体が、ＡＰＰ断片のＮ未満に結合する末端特異的抗体であり、Ｎ末端が残基５３５〜５５５の間のアミノ酸残基である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
抗体が、ＡＰＰ５１６〜６３８またはＡＰＰ５３６〜６３８のＮ末端に結合する末端特異的抗体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
Ａβに対する抗体または前記抗体を生成する免疫原を投与するステップをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
免疫原を投与し、免疫原がＡβの断片である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
アルツハイマー病を治療するのに有用な活性について作用物質をスクリーニングする方法であって、
非ヒトトランスジェニック動物を作用物質と接触させるステップであって、非ヒトトランスジェニック動物が、ＡＰＰをコードするセグメントを含むゲノムを含み、セグメントがＡβおよび他の断片にプロセシングされるアミロイド前駆体タンパク質へと発現されるステップと、
ＡＰＰの５５１〜５９５位の間の少なくとも２５アミノ酸を含む５０〜１５０アミノ酸の水溶性ＡＰＰ断片を抽出するステップと、
可溶性ＡＰＰ断片の量を、作用物質で処置していない対照トランスジェニックマウスの量と比較するステップであって、可溶性断片の量の減少から、作用物質がアルツハイマー病の治療に有用な活性を有することを示すステップと
を含む方法。
【請求項３６】
ＡＰＰがヒトＡＰＰである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
断片が、ヒトＡＰＰの残基５５１〜６３８を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
断片が、抗体８Ｅ５および／または１８Ｂ１０によって特異的に結合されうる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
断片が、ＡＰＰ５１６〜６３８、ＡＰＰ５１６〜６３９、ＡＰＰ５３６〜６３８、またはＡＰＰ５３６〜６３９である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
アルツハイマー病を治療するのに有用な活性について作用物質をスクリーニングする方法であって、
単離された細胞を作用物質と接触させるステップであって、細胞がＡＰＰをコードする核酸を含み、核酸が、Ａβおよび他の断片にプロセシングされるアミロイド前駆体タンパク質へと発現されるステップと、
ＡＰＰの５５１〜５９５位の間の少なくとも２５アミノ酸を含む５０〜１５０アミノ酸の水溶性ＡＰＰ断片を培地内で検出するステップと、
可溶性ＡＰＰ断片の量を、作用物質で処置していない対照細胞の量と比較するステップであって、可溶性断片の量の減少から、作用物質がアルツハイマー病の治療に有用な活性を有することを示すステップと
を含む方法。
【請求項４１】
単離された細胞に、ＡＰＰをコードする核酸を含む構築物をトランスフェクトする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
水溶性断片が、ＡＰＰ５１６〜６３８、ＡＰＰ５１６〜６３９、ＡＰＰ５３６〜６３８、またはＡＰＰ５３６〜６３９である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
アルツハイマー病を治療するのに有用な活性について作用物質をスクリーニングする方法であって、
ＡＰＰの５５１〜５９５位の間の少なくとも２５アミノ酸を含む５０〜１５０アミノ酸の水溶性ＡＰＰ断片を、細胞集団および作用物質と接触させるステップと、
作用物質のない状態で可溶性断片と接触させた対照細胞集団から残存した細胞と比較して、生細胞数を比較するステップであって、作用物質の存在下における生細胞の増加から、作用物質がアルツハイマー病の治療に有用な活性を有することを示すステップと
を含む方法。
【請求項４４】
細胞が神経細胞である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
水溶性断片が、ＡＰＰ５１６〜６３８、ＡＰＰ５１６〜６３９、ＡＰＰ５３６〜６３８、またはＡＰＰ５３６〜６３９である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
ヒトＡＰＰの５５１〜５９５位の間の少なくとも２５アミノ酸を含む５０〜１５０アミノ酸のアミロイド前駆体タンパク質の単離された断片。
【請求項４７】
ヒトＡＰＰの残基５５１〜６３８を含む、請求項４３に記載の単離された断片。
【請求項４８】
ヒトＡＰＰの残基５５１〜６３８からなる、請求項４３に記載の単離された断片。
【請求項４９】
断片が、１００アミノ酸以下の長さである、請求項４３に記載の単離された断片。
【請求項５０】
断片が、抗体８Ｅ５および／または１８Ｂ１０によって特異的に結合される、請求項４３に記載の単離された断片。
【請求項５１】
ＡＰＰ５１６〜６３８、ＡＰＰ５１６〜６３９、ＡＰＰ５３６〜６３８、およびＡＰＰ５３６〜６３９である、特許請求に係る単離された断片。
【請求項５２】
ヒトアミロイド前駆体タンパク質の残基５９６および５９７を含むエピトープにおいて、ヒトアミロイド前駆体タンパク質に特異的に結合する抗体。
【請求項５３】
ヒトＡＰＰ断片のＮ末端に特異的に結合する末端特異的抗体であって、Ｎ末端アミノ酸がヒトＡＰＰの残基５３５〜５５５の間に位置する末端特異的抗体。
【請求項５４】
ＡＰＰ５１６〜６３８またはＡＰＰ５３６〜６３８のＮ末端に特異的に結合する、特許請求に係る末端特異的抗体。
【請求項１】
ヒトアミロイド前駆体タンパク質の残基４４４〜５９５（ＡＰＰ６９５の番号付け）内のエピトープに特異的に結合する抗体。
【請求項２】
モルモットアミロイド前駆体タンパク質に対する特異的結合性を欠く、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ヒトアミロイド前駆体タンパク質の残基５５１〜５７０内のエピトープに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
ヒトアミロイド前駆体タンパク質の残基５３０〜５８０内のエピトープに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
ヒトアミロイド前駆体タンパク質の残基５７６〜５９５内のエピトープに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
ヒトアミロイド前駆体タンパク質の残基５４５〜５５５内のエピトープに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
ヒトアミロイド前駆体タンパク質に対する特異的結合についてモノクローナル抗体８Ｅ５と競合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
ヒトアミロイド前駆体タンパク質に対する特異的結合について１８Ｂ１０と競合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
８Ｅ５またはそのヒト化形態もしくはキメラ形態である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
１８Ｂ１０またはそのヒト化形態もしくはそのキメラ形態である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
モノクローナル抗体である、請求項１〜１０のいずれかに記載の抗体。
【請求項１２】
アルツハイマー病を予防的または治療的に処置する方法であって、前記疾患に罹患しているまたは前記疾患の危険性がある患者に、ＡＰＰのアミノ酸５１６〜５９５の間の少なくとも４つの連続した残基を含む断片の治療的に有効なレジメンを施し、それによって前記疾患を予防的または治療的に処置するステップを含む方法。
【請求項１３】
断片が、ＡＰＰのアミノ酸５５１〜５９５の間の少なくとも５つの連続した残基を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
断片が、ＡＰＰのアミノ酸５４４〜５９６または５９７の間の少なくとも７つの連続した残基を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
断片が、ＡＰＰの残基５５１〜５９５を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
断片が、ＡＰＰの残基５５１〜６３８を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
施すステップで、各々がＡＰＰの残基５５１〜５９５の間の少なくとも４つの連続したアミノ酸を含む複数の断片を投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
断片が、ＡＰＰの残基５５１〜５９５の間の４〜２０個の連続したアミノ酸を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
断片が、ＡＰＰの残基５１６〜５９５の間の４〜２０個の連続したアミノ酸を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
断片が、ＡＰＰの残基５５１〜５９５の間の４〜１０個の連続したアミノ酸を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
断片が、ＡＰＰの残基５１６〜５９５の間の４〜１０個の連続したアミノ酸を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
断片が第１および第２のセグメントを含み、第１のセグメントがＡβのセグメントであり、第２のセグメントがＡβの上流にあるＡＰＰのセグメントである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
第１および第２のセグメントが、ヒトＡＰＰの連続したセグメントである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２４】
断片がコンジュゲートとして担体と連結し、担体が、断片に対する抗体を含む免疫応答を引き起こす一助となる、請求項１２に記載の方法。
【請求項２５】
アジュバントを患者に投与するステップをさらに含み、アジュバントが断片に対する抗体を含む免疫応答を引き起こす一助となる、請求項１２に記載の方法。
【請求項２６】
Ａβに対する抗体または前記抗体を生成する免疫原を投与するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２７】
免疫原を投与し、免疫原がＡβの断片である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２８】
アルツハイマー病を予防的または治療的に処置する方法であって、前記疾患に罹患するまたは前記疾患の危険性がある患者に、（ａ）ヒトＡＰＰの残基５１６〜５９５内のエピトープに特異的に結合する抗体、または（ｂ）このような抗体を生成する免疫原、のいずれかの治療的に有効なレジメンを施し、それによって前記疾患を予防的または治療的に処置するステップを含む方法。
【請求項２９】
抗体が、ヒトＡＰＰの残基５３０〜５９５内のエピトープに特異的に結合する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
抗体が、請求項２から８のいずれかにおいて定義される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
抗体が、ＡＰＰ断片のＮ未満に結合する末端特異的抗体であり、Ｎ末端が残基５３５〜５５５の間のアミノ酸残基である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
抗体が、ＡＰＰ５１６〜６３８またはＡＰＰ５３６〜６３８のＮ末端に結合する末端特異的抗体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
Ａβに対する抗体または前記抗体を生成する免疫原を投与するステップをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
免疫原を投与し、免疫原がＡβの断片である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
アルツハイマー病を治療するのに有用な活性について作用物質をスクリーニングする方法であって、
非ヒトトランスジェニック動物を作用物質と接触させるステップであって、非ヒトトランスジェニック動物が、ＡＰＰをコードするセグメントを含むゲノムを含み、セグメントがＡβおよび他の断片にプロセシングされるアミロイド前駆体タンパク質へと発現されるステップと、
ＡＰＰの５５１〜５９５位の間の少なくとも２５アミノ酸を含む５０〜１５０アミノ酸の水溶性ＡＰＰ断片を抽出するステップと、
可溶性ＡＰＰ断片の量を、作用物質で処置していない対照トランスジェニックマウスの量と比較するステップであって、可溶性断片の量の減少から、作用物質がアルツハイマー病の治療に有用な活性を有することを示すステップと
を含む方法。
【請求項３６】
ＡＰＰがヒトＡＰＰである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
断片が、ヒトＡＰＰの残基５５１〜６３８を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
断片が、抗体８Ｅ５および／または１８Ｂ１０によって特異的に結合されうる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
断片が、ＡＰＰ５１６〜６３８、ＡＰＰ５１６〜６３９、ＡＰＰ５３６〜６３８、またはＡＰＰ５３６〜６３９である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
アルツハイマー病を治療するのに有用な活性について作用物質をスクリーニングする方法であって、
単離された細胞を作用物質と接触させるステップであって、細胞がＡＰＰをコードする核酸を含み、核酸が、Ａβおよび他の断片にプロセシングされるアミロイド前駆体タンパク質へと発現されるステップと、
ＡＰＰの５５１〜５９５位の間の少なくとも２５アミノ酸を含む５０〜１５０アミノ酸の水溶性ＡＰＰ断片を培地内で検出するステップと、
可溶性ＡＰＰ断片の量を、作用物質で処置していない対照細胞の量と比較するステップであって、可溶性断片の量の減少から、作用物質がアルツハイマー病の治療に有用な活性を有することを示すステップと
を含む方法。
【請求項４１】
単離された細胞に、ＡＰＰをコードする核酸を含む構築物をトランスフェクトする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
水溶性断片が、ＡＰＰ５１６〜６３８、ＡＰＰ５１６〜６３９、ＡＰＰ５３６〜６３８、またはＡＰＰ５３６〜６３９である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
アルツハイマー病を治療するのに有用な活性について作用物質をスクリーニングする方法であって、
ＡＰＰの５５１〜５９５位の間の少なくとも２５アミノ酸を含む５０〜１５０アミノ酸の水溶性ＡＰＰ断片を、細胞集団および作用物質と接触させるステップと、
作用物質のない状態で可溶性断片と接触させた対照細胞集団から残存した細胞と比較して、生細胞数を比較するステップであって、作用物質の存在下における生細胞の増加から、作用物質がアルツハイマー病の治療に有用な活性を有することを示すステップと
を含む方法。
【請求項４４】
細胞が神経細胞である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
水溶性断片が、ＡＰＰ５１６〜６３８、ＡＰＰ５１６〜６３９、ＡＰＰ５３６〜６３８、またはＡＰＰ５３６〜６３９である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
ヒトＡＰＰの５５１〜５９５位の間の少なくとも２５アミノ酸を含む５０〜１５０アミノ酸のアミロイド前駆体タンパク質の単離された断片。
【請求項４７】
ヒトＡＰＰの残基５５１〜６３８を含む、請求項４３に記載の単離された断片。
【請求項４８】
ヒトＡＰＰの残基５５１〜６３８からなる、請求項４３に記載の単離された断片。
【請求項４９】
断片が、１００アミノ酸以下の長さである、請求項４３に記載の単離された断片。
【請求項５０】
断片が、抗体８Ｅ５および／または１８Ｂ１０によって特異的に結合される、請求項４３に記載の単離された断片。
【請求項５１】
ＡＰＰ５１６〜６３８、ＡＰＰ５１６〜６３９、ＡＰＰ５３６〜６３８、およびＡＰＰ５３６〜６３９である、特許請求に係る単離された断片。
【請求項５２】
ヒトアミロイド前駆体タンパク質の残基５９６および５９７を含むエピトープにおいて、ヒトアミロイド前駆体タンパク質に特異的に結合する抗体。
【請求項５３】
ヒトＡＰＰ断片のＮ末端に特異的に結合する末端特異的抗体であって、Ｎ末端アミノ酸がヒトＡＰＰの残基５３５〜５５５の間に位置する末端特異的抗体。
【請求項５４】
ＡＰＰ５１６〜６３８またはＡＰＰ５３６〜６３８のＮ末端に特異的に結合する、特許請求に係る末端特異的抗体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００９−５３８９２４（Ｐ２００９−５３８９２４Ａ）
【公表日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１３３３２（Ｐ２００９−５１３３３２）
【出願日】平成１９年６月１日（２００７．６．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１３１２８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０４２０２４
【国際公開日】平成２０年４月１０日（２００８．４．１０）
【出願人】（３９９０１３９７１）エラン ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド (75)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１１月１２日（２００９．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月１日（２００７．６．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１３１２８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０４２０２４
【国際公開日】平成２０年４月１０日（２００８．４．１０）
【出願人】（３９９０１３９７１）エラン ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド (75)
【Ｆターム（参考）】
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