本発明は、３０ヌクレオチド長未満、一般に１９〜２５ヌクレオチド長であり、Ａｈａ遺伝子の少なくとも一部と実質的に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖を含む、Ａｈａ遺伝子（Ａｈａ１遺伝子）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）に関する。本発明はまた、薬学的に許容可能なキャリアと共にｄｓＲＮＡを含む薬学的組成物、薬学的組成物を使用したＡｈａ１発現および遺伝子Ａｈａ遺伝子の発現に起因する疾患の治療方法、ならびに細胞中のＡｈａ遺伝子発現を阻害する方法に関する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、熱ショックタンパク質９０ＡＴＰアーゼ（Ａｈａ）の遺伝子アクチベーターのモジュレーターを使用した治療方法に関する。より詳細には、本発明は、Ａｈａの発現を下方制御する短い干渉ＲＮＡの投与による望ましくないＡｈａ活性に関連する障害の治療方法およびその際に有用な薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
熱ショックタンパク質９０ＡＴＰアーゼ１のアクチベーター（本明細書中で、Ａｈａ１）は、Ｈｓｐ９０のＡＴＰアーゼ活性のアクチベーターであり、酵母Ｈｓｐ９０の本来の活性の１２倍およびヒトＨｓｐ９０の本来の活性の５０倍を刺激することができる（非特許文献１）。生化学的研究では、Ａｈａ１がＨｓｐ９０の中間領域に結合することが示されており（非特許文献１、非特許文献２）、最近のＡｈａ１−Ｈｓｐ９０コア複合体の構造研究により、コシャペロンがＨｓｐ９０の触媒ループの中間セグメント（３７０〜３９０）の高次構造スイッチ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｓｗｉｔｃｈ）を促進し、触媒Ａｒｇ３８０を放出し、Ｎ末端ヌクレオチド結合ドメイン中のＡＴＰとのその相互作用を促進することが示唆される（非特許文献３）。
【０００３】
分子シャペロン熱ショックタンパク質９０（Ｈｓｐ９０）は、特異的クライアントタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ活性化または成熟を担う（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。かかる活性化には、Ｈｓｐ９０のＡＴＰアーゼ活性が不可欠であり（非特許文献８）、この活性はＨｓｐ９０二量体内のＮ−末端ヌクレオチド結合ドメインの一過性会合に関与する高次構造サイクルを駆動する（非特許文献９）。
【０００４】
分子シャペロンとして、ＨＳＰ９０は、多数の高次構造が不安定なクライアントタンパク質（そのほとんどが腫瘍細胞内でしばしば狂わされる生物学的過程（シグナル伝達、細胞周期の進行、およびアポトーシスなど）に関与する）の成熟を促進し、その安定性を維持する。結果として、他の分子標的化療法と対照的に、ＨＳＰ９０のインヒビターは、癌細胞内の多数の癌遺伝子基質の同時破壊による有望な抗癌活性を達成する（非特許文献１０；特許文献１）。さらに、ＨＳＰ９０は、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）の分解に関与している。ＣＦＴＲ遺伝子の変異により、ＨＳＰ９０ＡＴＰアーゼ活性の結果としてタンパク質が不完全に折り畳まれ、ユビキチン化する。ユビキチン化後、ＣＦＴＲはその活性部位に到達する前に分解される。次いで、活性なＣＦＴＲの欠如により、かかる変異を有するヒト対象が嚢胞性線維症を発症する。したがって、ＨＳＰ９０活性の阻害は、癌または嚢胞性線維症を罹患した対象に有益であり得る。
【０００５】
Ｈｓｐ９０は、全細胞タンパク質の約１〜２％に相当し（非特許文献１１）、アンタゴニストまたはインヒビターを用いたかかる大量のタンパク質の阻害には、細胞への過剰量のインヒビターまたはアンタゴニストの導入が潜在的に必要であろう。別のアプローチは、より少ない量で存在するＨＳＰ９０のＡＴＰアーゼ活性のアクチベーター（Ａｈａ１など）の阻害である。細胞中のＡｈａ１の存在量の下方制御により、ＨＳＰ９０の活性を実質的に低下させることができる。
【０００６】
ホモ・サピエンス（ＮＭ＿０１２１１１．１）、ハツカネズミ（ＮＭ＿１４６０３６．１）、およびチンパンジー（ＸＭ＿５１００９４．１）のＡｈａ１の間で配列が有意に相同する。Ａｈａ１の明確なラットホモログは同定されていないが、酵母Ａｈｓａ２とのその配列相補性に基づいて熱ショックタンパク質ＡＴＰアーゼホモログ２のアクチベーター（Ａｈｓａ２）と呼ばれているラット（ＸＭ＿２２３６８０．３）遺伝子が存在する。その配列は、ハツカネズミ ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ １１１００６４Ｐ０４遺伝子（ＮＭ＿１７２３９１．３）と相同であり、同様に、Ｎ末端短縮を除いてハツカネズミ（Ａｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）Ａｈａ１と配列が類似している。ホモ・サピエンスＡｈｓａ２（ＮＭ＿１５２３９２．１）も予想されているが、配列相同性は制限される。これらの後者の３つの遺伝子の機能は、十分に解明されていない。しかし、上記配列の全てが同一であり、ＲＮＡｉ因子の標的として使用することができる１つの領域が存在する。１つを超えるＡｈａ遺伝子の活性を阻害することが有利であり得る。
【０００７】
最近、二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として公知の高度に保存された調節機構において遺伝子発現を阻害することが示されている。ＷＯ９９／３２６１９（Ｆｉｒｅら）は、シー．エレガンスにおける遺伝子発現を阻害するための少なくとも２５ヌクレオチド長のｄｓＲＮＡの使用を開示している。ｄｓＲＮＡはまた、他の生物（植物（例えば、ＷＯ９９／５３０５０号、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、およびＨｅｉｆｅｔｚらのＷＯ ９９／６１６３１号を参照のこと）、ショウジョウバエ（例えば、Ｙａｎｇ，Ｄ．ら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．（２０００）１０：１１９１−１２００を参照のこと）、および哺乳動物（ＬｉｍｍｅｒのＷＯ００／４４８９５号およびＫｒｅｕｔｚｅｒらのドイツ特許第１０１ ００ ５８６．５号を参照のこと）が含まれる）において標的ＲＮＡを分解することが示されている。この天然の機構は、現在、異常なまたは望ましくない遺伝子調節に起因する障害の治療のための新規の医薬品クラスの開発で注目するようになっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第０３／０６７２６２号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｐａｎａｒｅｔｏｕ，Ｂ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ２００２，１０：１３０７-１３１８
【非特許文献２】Ｌｏｔｚ，Ｇ．Ｐ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００３，２７８：１７２２８-１７２３５
【非特許文献３】Ｍｅｙｅｒ，Ｐ．ら，ＥＭＢＯ Ｊ．２００４，２３：５１１-５１９
【非特許文献４】Ｐｉｃａｒｄ，Ｄ．，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．２００２，５９：１６４０-１６４８
【非特許文献５】Ｐｅａｒｌ，Ｌ．Ｈ．，およびＰｒｏｄｒｏｍｏｕ，Ｃ．，Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．２００２，５９：１５７-１８５
【非特許文献６】Ｐｒａｔｔ，Ｗ．Ｂ．，およびＴｏｆｔ，Ｄ．Ｏ．，Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２００３，２２８：１１１-１３３
【非特許文献７】Ｐｒｏｄｒｏｍｏｕ，Ｃ．，およびＰｅａｒｌ，Ｌ．Ｈ．，Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ２００３，３：３０１-３２３
【非特許文献８】Ｐａｎａｒｅｔｏｕ，Ｂ．ら，ＥＭＢＯ Ｊ．１９９８，１７：４８２９-４８３６
【非特許文献９】Ｐｒｏｄｒｏｍｏｕ，Ｃ．ら，ＥＭＢＯ Ｊ．２０００，１９：４３８３-４３９２
【非特許文献１０】Ｗｈｉｔｅｓｅｌｌ Ｌ，およびＤａｉ Ｃ．，Ｆｕｔｕｒｅ Ｏｎｃｏｌ．２００５；１：５２９−５４０
【非特許文献１１】Ｐｒａｔｔ，Ｗ．Ｂ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１９９７，３７：２９７−３２６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ＲＮＡｉ分野の有意な利点およびＨＳＰ９０によって媒介される病理学的過程の治療における利点にもかかわらず、細胞自体のＲＮＡｉ機構を使用したＨＳＰ９０ ＡＴＰアーゼ活性を選択的且つ有効に弱めることができる薬剤が必要であり続けている。かかる薬剤は、高い生物活性およびｉｎ ｖｉｖｏ安定性の両方を有し、Ａｈａ発現（例えば、Ａｈａ１発現）によって直接または間接的に媒介される病理学的過程の治療で使用するための標的Ａｈａ遺伝子（Ａｈａ１など）の発現を有効に阻害する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の概要
本発明は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）ならびにかかるｄｓＲＮＡを使用した細胞または哺乳動物におけるＡｈａ遺伝子の発現の阻害のための組成物および方法を提供する。本発明はまた、Ａｈａ遺伝子の発現によって媒介される病的状態および疾患（癌または嚢胞性線維症など）の治療のための組成物および方法を提供する。本発明のｄｓＲＮＡは、３０ヌクレオチド長未満、一般に、１９〜２４ヌクレオチド長であり、Ａｈａ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的な領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含む。
【００１２】
１つの態様では、本発明は、Ａｈａ遺伝子発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を提供する。ｄｓＲＮＡは、相互に相補的な少なくとも２つの配列を含む。ｄｓＲＮＡは、第１の配列を含むセンス鎖および第２の配列を含むアンチセンス鎖を含む。アンチセンス鎖はＡｈａ遺伝子をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的であるヌクレオチド配列を含み、相補領域は、３０ヌクレオチド長未満、一般に、１９〜２４ヌクレオチド長である。ｄｓＲＮＡは、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１および配列番号１８３の群から選択されるセンス鎖および後者のセンス鎖と相補的であり、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２および配列番号１８４の群から選択されるアンチセンス鎖を有する第２のｄｓＲＮＡの標的配列内でＡｈａ遺伝子をコードするｍＲＮＡを切断する（表１および表２を参照のこと）。Ａｈａ遺伝子は、好ましくはＡｈａ１遺伝子、より好ましくはホモ・サピエンスＡｈａ１遺伝子である。ｄｓＲＮＡは、Ａｈａ遺伝子を発現する細胞との接触の際に、前記細胞中（例えば、ＨｅＬａ細胞および／またはＭＬＥ１２細胞中）でのＡｈａ遺伝子の発現を、少なくとも２０％または少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８５％、９０％、または９５％阻害することができる。ｄｓＲＮＡは、前記第２のｄｓＲＮＡと異なり得るが、上記の命名したヌクレオチド配列の１つと同様に、鎖あたり少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも１８、または少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを有することができる。
【００１３】
好ましくは、第２のｄｓＲＮＡは、ＡＬ−ＤＰ−７３０１、ＡＬ−ＤＰ−７３０８、ＡＬ−ＤＰ−７３１８、ＡＬ−ＤＰ−７３２０、ＡＬ−ＤＰ−７３２２、ＡＬ−ＤＰ−７３２４、ＡＬ−ＤＰ−７３２５、ＡＬ−ＤＰ−７３２６、ＡＬ−ＤＰ−７３２７、ＡＬ−ＤＰ−７３２９、ＡＬ−ＤＰ−７３３１、ＡＬ−ＤＰ−７３３３、ＡＬ−ＤＰ−７３４０、ＡＬ−ＤＰ−７３４２、ＡＬ−ＤＰ−７３０３、ＡＬ−ＤＰ−７３０５、ＡＬ−ＤＰ−７３０７、ＡＬ−ＤＰ−７３０９、ＡＬ−ＤＰ−７３１６およびＡＬ−ＤＰ−７３３７、ＡＬ−ＤＰ−７３０４、ＡＬ−ＤＰ−７３１２、ＡＬ−ＤＰ−７３３９、ＡＬ−ＤＰ−７３４４、ＡＬ−ＤＰ−７３０６、ＡＬ−ＤＰ−７３１７、ＡＬ−ＤＰ−７３４６、ＡＬ−ＤＰ−７３１０、ＡＬ−ＤＰ−７３２３、ＡＬ−ＤＰ−７３３５、ＡＬ−ＤＰ−７３３８、ＡＬ−ＤＰ−７３４１、ＡＬ−ＤＰ−７３０２、ＡＬ−ＤＰ−７３１５、ＡＬ−ＤＰ−７３２８、ＡＬ−ＤＰ−７３３０、ＡＬ−ＤＰ−７３３６、ＡＬ−ＤＰ−７３４５、ＡＬ−ＤＰ−９２５０、ＡＬ−ＤＰ−９２５１、ＡＬ−ＤＰ−９２５２、ＡＬ−ＤＰ−９２５３、ＡＬ−ＤＰ−９２５４、ＡＬ−ＤＰ−９２５５、ＡＬ−ＤＰ−９２５６、ＡＬ−ＤＰ−９２５７、ＡＬ−ＤＰ−９２５８、ＡＬ−ＤＰ−９２５９、ＡＬ−ＤＰ−９２６０、ＡＬ−ＤＰ−９２６１、ＡＬ−ＤＰ−９２６２、ＡＬ−ＤＰ−９２６３、ＡＬ−ＤＰ−９２６４、ＡＬ−ＤＰ−９２６５、ＡＬ−ＤＰ−９２６６、ＡＬ−ＤＰ−９２６７、ＡＬ−ＤＰ−９２６８、ＡＬ−ＤＰ−９２６９、ＡＬ−ＤＰ−９２７０、ＡＬ−ＤＰ−９２７１、ＡＬ−ＤＰ−９２７２、ＡＬ−ＤＰ−９２７３、ＡＬ−ＤＰ−９２７４、ＡＬ−ＤＰ−９２７５、ＡＬ−ＤＰ−９２７６、ＡＬ−ＤＰ−９２７７、ＡＬ−ＤＰ−９２７９、ＡＬ−ＤＰ−９２８０、ＡＬ−ＤＰ−９２８１、ＡＬ−ＤＰ−９２８２、ＡＬ−ＤＰ−９２８３、ＡＬ−ＤＰ−９２８４、ＡＬ−ＤＰ−９２８５、ＡＬ−ＤＰ−９２８６、ＡＬ−ＤＰ−９２８７、ＡＬ−ＤＰ−９２８８およびＡＬ−ＤＰ−９２８９の群から選択される（表１および表２を参照のこと）。
【００１４】
あるいは、ｄｓＲＮＡ自体を、ＡＬ−ＤＰ−７３０１、ＡＬ−ＤＰ−７３０８、ＡＬ−ＤＰ−７３１８、ＡＬ−ＤＰ−７３２０、ＡＬ−ＤＰ−７３２２、ＡＬ−ＤＰ−７３２４、ＡＬ−ＤＰ−７３２５、ＡＬ−ＤＰ−７３２６、ＡＬ−ＤＰ−７３２７、ＡＬ−ＤＰ−７３２９、ＡＬ−ＤＰ−７３３１、ＡＬ−ＤＰ−７３３３、ＡＬ−ＤＰ−７３４０、ＡＬ−ＤＰ−７３４２、ＡＬ−ＤＰ−７３０３、ＡＬ−ＤＰ−７３０５、ＡＬ−ＤＰ−７３０７、ＡＬ−ＤＰ−７３０９、ＡＬ−ＤＰ−７３１６およびＡＬ−ＤＰ−７３３７、ＡＬ−ＤＰ−７３０４、ＡＬ−ＤＰ−７３１２、ＡＬ−ＤＰ−７３３９、ＡＬ−ＤＰ−７３４４、ＡＬ−ＤＰ−７３０６、ＡＬ−ＤＰ−７３１７、ＡＬ−ＤＰ−７３４６、ＡＬ−ＤＰ−７３１０、ＡＬ−ＤＰ−７３２３、ＡＬ−ＤＰ−７３３５、ＡＬ−ＤＰ−７３３８、ＡＬ−ＤＰ−７３４１、ＡＬ−ＤＰ−７３０２、ＡＬ−ＤＰ−７３１５、ＡＬ−ＤＰ−７３２８、ＡＬ−ＤＰ−７３３０、ＡＬ−ＤＰ−７３３６、ＡＬ−ＤＰ−７３４５、ＡＬ−ＤＰ−９２５０、ＡＬ−ＤＰ−９２５１、ＡＬ−ＤＰ−９２５２、ＡＬ−ＤＰ−９２５３、ＡＬ−ＤＰ−９２５４、ＡＬ−ＤＰ−９２５５、ＡＬ−ＤＰ−９２５６、ＡＬ−ＤＰ−９２５７、ＡＬ−ＤＰ−９２５８、ＡＬ−ＤＰ−９２５９、ＡＬ−ＤＰ−９２６０、ＡＬ−ＤＰ−９２６１、ＡＬ−ＤＰ−９２６２、ＡＬ−ＤＰ−９２６３、ＡＬ−ＤＰ−９２６４、ＡＬ−ＤＰ−９２６５、ＡＬ−ＤＰ−９２６６、ＡＬ−ＤＰ−９２６７、ＡＬ−ＤＰ−９２６８、ＡＬ−ＤＰ−９２６９、ＡＬ−ＤＰ−９２７０、ＡＬ−ＤＰ−９２７１、ＡＬ−ＤＰ−９２７２、ＡＬ−ＤＰ−９２７３、ＡＬ−ＤＰ−９２７４、ＡＬ−ＤＰ−９２７５、ＡＬ−ＤＰ−９２７６、ＡＬ−ＤＰ−９２７７、ＡＬ−ＤＰ−９２７９、ＡＬ−ＤＰ−９２８０、ＡＬ−ＤＰ−９２８１、ＡＬ−ＤＰ−９２８２、ＡＬ−ＤＰ−９２８３、ＡＬ−ＤＰ−９２８４、ＡＬ−ＤＰ−９２８５、ＡＬ−ＤＰ−９２８６、ＡＬ−ＤＰ−９２８７、ＡＬ−ＤＰ−９２８８およびＡＬ−ＤＰ−９２８９の群から選択することができる（表１および表２を参照のこと）。
【００１５】
ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むことができる。好ましくは、修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結した末端ヌクレオチドの群から選択される。あるいは、修飾ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、無塩基ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミダート、およびヌクレオチドを含む非天然塩基の群から選択される。
【００１６】
別の態様では、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡの１つを含む単離細胞を提供する。細胞は、一般に、ヒト細胞などの哺乳動物細胞である。本発明のｄｓＲＮＡを含む細胞の他の実施形態は、上記本発明の他の態様で提供する通りである。
【００１７】
さらに別の態様では、ｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容可能なキャリアを含み、ｄｓＲＮＡが相互に相補的な少なくとも２つの配列を含み、センス鎖が第１の配列を含み、アンチセンス鎖がＡｈａ遺伝子をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的な相補領域を含む第２の配列を含み、相補領域が、３０ヌクレオチド長未満であり、ｄｓＲＮＡが、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１および配列番号１８３の群から選択されるセンス鎖ならびに後者のセンス鎖と相補的であり、且つ配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２および配列番号１８４の群から選択されるアンチセンス鎖を有する第２のｄｓＲＮＡの標的配列内のＡｈａ遺伝子をコードするｍＲＮＡを切断する、生物中のＡｈａ遺伝子発現を阻害するための薬学的組成物を提供する（表１および表２を参照のこと）。そのうち、Ａｈａ遺伝子は、Ａｈａ１遺伝子、好ましくはホモ・サピエンスＡｈａ１遺伝子であり得る。薬学的組成物中に含まれるｄｓＲＮＡは、Ａｈａ遺伝子を発現する細胞との接触の際に、前記細胞中（例えば、ＨｅＬａ細胞および／またはＭＬＥ１２細胞中）でのＡｈａ遺伝子の発現を、少なくとも２０％、または少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８５％、９０％、もしくは９５％阻害する。ｄｓＲＮＡは、前記第２のｄｓＲＮＡと異なり得るが、上記の命名したヌクレオチド配列の１つと同様に、鎖あたり少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも１８、または少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを有することができる。
【００１８】
好ましくは、第２のｄｓＲＮＡは、ＡＬ−ＤＰ−７３０１、ＡＬ−ＤＰ−７３０８、ＡＬ−ＤＰ−７３１８、ＡＬ−ＤＰ−７３２０、ＡＬ−ＤＰ−７３２２、ＡＬ−ＤＰ−７３２４、ＡＬ−ＤＰ−７３２５、ＡＬ−ＤＰ−７３２６、ＡＬ−ＤＰ−７３２７、ＡＬ−ＤＰ−７３２９、ＡＬ−ＤＰ−７３３１、ＡＬ−ＤＰ−７３３３、ＡＬ−ＤＰ−７３４０、ＡＬ−ＤＰ−７３４２、ＡＬ−ＤＰ−７３０３、ＡＬ−ＤＰ−７３０５、ＡＬ−ＤＰ−７３０７、ＡＬ−ＤＰ−７３０９、ＡＬ−ＤＰ−７３１６およびＡＬ−ＤＰ−７３３７、ＡＬ−ＤＰ−７３０４、ＡＬ−ＤＰ−７３１２、ＡＬ−ＤＰ−７３３９、ＡＬ−ＤＰ−７３４４、ＡＬ−ＤＰ−７３０６、ＡＬ−ＤＰ−７３１７、ＡＬ−ＤＰ−７３４６、ＡＬ−ＤＰ−７３１０、ＡＬ−ＤＰ−７３２３、ＡＬ−ＤＰ−７３３５、ＡＬ−ＤＰ−７３３８、ＡＬ−ＤＰ−７３４１、ＡＬ−ＤＰ−７３０２、ＡＬ−ＤＰ−７３１５、ＡＬ−ＤＰ−７３２８、ＡＬ−ＤＰ−７３３０、ＡＬ−ＤＰ−７３３６、ＡＬ−ＤＰ−７３４５、ＡＬ−ＤＰ−９２５０、ＡＬ−ＤＰ−９２５１、ＡＬ−ＤＰ−９２５２、ＡＬ−ＤＰ−９２５３、ＡＬ−ＤＰ−９２５４、ＡＬ−ＤＰ−９２５５、ＡＬ−ＤＰ−９２５６、ＡＬ−ＤＰ−９２５７、ＡＬ−ＤＰ−９２５８、ＡＬ−ＤＰ−９２５９、ＡＬ−ＤＰ−９２６０、ＡＬ−ＤＰ−９２６１、ＡＬ−ＤＰ−９２６２、ＡＬ−ＤＰ−９２６３、ＡＬ−ＤＰ−９２６４、ＡＬ−ＤＰ−９２６５、ＡＬ−ＤＰ−９２６６、ＡＬ−ＤＰ−９２６７、ＡＬ−ＤＰ−９２６８、ＡＬ−ＤＰ−９２６９、ＡＬ−ＤＰ−９２７０、ＡＬ−ＤＰ−９２７１、ＡＬ−ＤＰ−９２７２、ＡＬ−ＤＰ−９２７３、ＡＬ−ＤＰ−９２７４、ＡＬ−ＤＰ−９２７５、ＡＬ−ＤＰ−９２７６、ＡＬ−ＤＰ−９２７７、ＡＬ−ＤＰ−９２７９、ＡＬ−ＤＰ−９２８０、ＡＬ−ＤＰ−９２８１、ＡＬ−ＤＰ−９２８２、ＡＬ−ＤＰ−９２８３、ＡＬ−ＤＰ−９２８４、ＡＬ−ＤＰ−９２８５、ＡＬ−ＤＰ−９２８６、ＡＬ−ＤＰ−９２８７、ＡＬ−ＤＰ−９２８８およびＡＬ−ＤＰ−９２８９の群から選択される（表１および表２を参照のこと）。
【００１９】
あるいは、薬学的組成物自体に含まれるｄｓＲＮＡを、ＡＬ−ＤＰ−７３０１、ＡＬ−ＤＰ−７３０８、ＡＬ−ＤＰ−７３１８、ＡＬ−ＤＰ−７３２０、ＡＬ−ＤＰ−７３２２、ＡＬ−ＤＰ−７３２４、ＡＬ−ＤＰ−７３２５、ＡＬ−ＤＰ−７３２６、ＡＬ−ＤＰ−７３２７、ＡＬ−ＤＰ−７３２９、ＡＬ−ＤＰ−７３３１、ＡＬ−ＤＰ−７３３３、ＡＬ−ＤＰ−７３４０、ＡＬ−ＤＰ−７３４２、ＡＬ−ＤＰ−７３０３、ＡＬ−ＤＰ−７３０５、ＡＬ−ＤＰ−７３０７、ＡＬ−ＤＰ−７３０９、ＡＬ−ＤＰ−７３１６およびＡＬ−ＤＰ−７３３７、ＡＬ−ＤＰ−７３０４、ＡＬ−ＤＰ−７３１２、ＡＬ−ＤＰ−７３３９、ＡＬ−ＤＰ−７３４４、ＡＬ−ＤＰ−７３０６、ＡＬ−ＤＰ−７３１７、ＡＬ−ＤＰ−７３４６、ＡＬ−ＤＰ−７３１０、ＡＬ−ＤＰ−７３２３、ＡＬ−ＤＰ−７３３５、ＡＬ−ＤＰ−７３３８、ＡＬ−ＤＰ−７３４１、ＡＬ−ＤＰ−７３０２、ＡＬ−ＤＰ−７３１５、ＡＬ−ＤＰ−７３２８、ＡＬ−ＤＰ−７３３０、ＡＬ−ＤＰ−７３３６、ＡＬ−ＤＰ−７３４５、ＡＬ−ＤＰ−９２５０、ＡＬ−ＤＰ−９２５１、ＡＬ−ＤＰ−９２５２、ＡＬ−ＤＰ−９２５３、ＡＬ−ＤＰ−９２５４、ＡＬ−ＤＰ−９２５５、ＡＬ−ＤＰ−９２５６、ＡＬ−ＤＰ−９２５７、ＡＬ−ＤＰ−９２５８、ＡＬ−ＤＰ−９２５９、ＡＬ−ＤＰ−９２６０、ＡＬ−ＤＰ−９２６１、ＡＬ−ＤＰ−９２６２、ＡＬ−ＤＰ−９２６３、ＡＬ−ＤＰ−９２６４、ＡＬ−ＤＰ−９２６５、ＡＬ−ＤＰ−９２６６、ＡＬ−ＤＰ−９２６７、ＡＬ−ＤＰ−９２６８、ＡＬ−ＤＰ−９２６９、ＡＬ−ＤＰ−９２７０、ＡＬ−ＤＰ−９２７１、ＡＬ−ＤＰ−９２７２、ＡＬ−ＤＰ−９２７３、ＡＬ−ＤＰ−９２７４、ＡＬ−ＤＰ−９２７５、ＡＬ−ＤＰ−９２７６、ＡＬ−ＤＰ−９２７７、ＡＬ−ＤＰ−９２７９、ＡＬ−ＤＰ−９２８０、ＡＬ−ＤＰ−９２８１、ＡＬ−ＤＰ−９２８２、ＡＬ−ＤＰ−９２８３、ＡＬ−ＤＰ−９２８４、ＡＬ−ＤＰ−９２８５、ＡＬ−ＤＰ−９２８６、ＡＬ−ＤＰ−９２８７、ＡＬ−ＤＰ−９２８８およびＡＬ−ＤＰ−９２８９の群から選択することができる（表１および表２を参照のこと）。
【００２０】
薬学的組成物中に含まれるｄｓＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むことができる。好ましくは、前記修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結した末端ヌクレオチドの群から選択される。あるいは、修飾ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、無塩基ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミダート、およびヌクレオチドを含む非天然塩基の群から選択される。
【００２１】
さらに別の態様では、細胞中のＡｈａ遺伝子の発現を阻害する方法であって、
（ａ）細胞中に二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を導入する工程であって、ｄｓＲＮＡが相互に相補的な少なくとも２つの配列を含み、センス鎖が第１の配列を含み、アンチセンス鎖がＡｈａ１をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的な相補領域を含む第２の配列を含み、相補領域が、３０ヌクレオチド長未満であり、ｄｓＲＮＡが、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１および配列番号１８３の群から選択されるセンス鎖ならびに後者のセンス鎖と相補的であり、且つ配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２および配列番号１８４の群から選択されるアンチセンス鎖を有する第２のｄｓＲＮＡの標的配列内のＡｈａ遺伝子をコードするｍＲＮＡを切断する、工程、および
（ｂ）工程（ａ）で産生された細胞を、Ａｈａ遺伝子のｍＲＮＡ転写物を分解するのに十分な時間維持し、それにより、細胞中のＡｈａ遺伝子の発現を阻害する工程、を含む方法を提供する。Ａｈａ遺伝子は、好ましくはＡｈａ１遺伝子、より好ましくはホモ・サピエンスＡｈａ１遺伝子である。ｄｓＲＮＡは、前記第２のｄｓＲＮＡと異なり得るが、上記の命名したヌクレオチド配列の１つと同様に、鎖あたり少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも１８、または少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを有することができる。
【００２２】
好ましくは、第２のｄｓＲＮＡは、ＡＬ−ＤＰ−７３０１、ＡＬ−ＤＰ−７３０８、ＡＬ−ＤＰ−７３１８、ＡＬ−ＤＰ−７３２０、ＡＬ−ＤＰ−７３２２、ＡＬ−ＤＰ−７３２４、ＡＬ−ＤＰ−７３２５、ＡＬ−ＤＰ−７３２６、ＡＬ−ＤＰ−７３２７、ＡＬ−ＤＰ−７３２９、ＡＬ−ＤＰ−７３３１、ＡＬ−ＤＰ−７３３３、ＡＬ−ＤＰ−７３４０、ＡＬ−ＤＰ−７３４２、ＡＬ−ＤＰ−７３０３、ＡＬ−ＤＰ−７３０５、ＡＬ−ＤＰ−７３０７、ＡＬ−ＤＰ−７３０９、ＡＬ−ＤＰ−７３１６およびＡＬ−ＤＰ−７３３７、ＡＬ−ＤＰ−７３０４、ＡＬ−ＤＰ−７３１２、ＡＬ−ＤＰ−７３３９、ＡＬ−ＤＰ−７３４４、ＡＬ−ＤＰ−７３０６、ＡＬ−ＤＰ−７３１７、ＡＬ−ＤＰ−７３４６、ＡＬ−ＤＰ−７３１０、ＡＬ−ＤＰ−７３２３、ＡＬ−ＤＰ−７３３５、ＡＬ−ＤＰ−７３３８、ＡＬ−ＤＰ−７３４１、ＡＬ−ＤＰ−７３０２、ＡＬ−ＤＰ−７３１５、ＡＬ−ＤＰ−７３２８、ＡＬ−ＤＰ−７３３０、ＡＬ−ＤＰ−７３３６、ＡＬ−ＤＰ−７３４５、ＡＬ−ＤＰ−９２５０、ＡＬ−ＤＰ−９２５１、ＡＬ−ＤＰ−９２５２、ＡＬ−ＤＰ−９２５３、ＡＬ−ＤＰ−９２５４、ＡＬ−ＤＰ−９２５５、ＡＬ−ＤＰ−９２５６、ＡＬ−ＤＰ−９２５７、ＡＬ−ＤＰ−９２５８、ＡＬ−ＤＰ−９２５９、ＡＬ−ＤＰ−９２６０、ＡＬ−ＤＰ−９２６１、ＡＬ−ＤＰ−９２６２、ＡＬ−ＤＰ−９２６３、ＡＬ−ＤＰ−９２６４、ＡＬ−ＤＰ−９２６５、ＡＬ−ＤＰ−９２６６、ＡＬ−ＤＰ−９２６７、ＡＬ−ＤＰ−９２６８、ＡＬ−ＤＰ−９２６９、ＡＬ−ＤＰ−９２７０、ＡＬ−ＤＰ−９２７１、ＡＬ−ＤＰ−９２７２、ＡＬ−ＤＰ−９２７３、ＡＬ−ＤＰ−９２７４、ＡＬ−ＤＰ−９２７５、ＡＬ−ＤＰ−９２７６、ＡＬ−ＤＰ−９２７７、ＡＬ−ＤＰ−９２７９、ＡＬ−ＤＰ−９２８０、ＡＬ−ＤＰ−９２８１、ＡＬ−ＤＰ−９２８２、ＡＬ−ＤＰ−９２８３、ＡＬ−ＤＰ−９２８４、ＡＬ−ＤＰ−９２８５、ＡＬ−ＤＰ−９２８６、ＡＬ−ＤＰ−９２８７、ＡＬ−ＤＰ−９２８８およびＡＬ−ＤＰ−９２８９の群から選択される（表１および表２を参照のこと）。
【００２３】
あるいは、ｄｓＲＮＡ自体は、ＡＬ−ＤＰ−７３０１、ＡＬ−ＤＰ−７３０８、ＡＬ−ＤＰ−７３１８、ＡＬ−ＤＰ−７３２０、ＡＬ−ＤＰ−７３２２、ＡＬ−ＤＰ−７３２４、ＡＬ−ＤＰ−７３２５、ＡＬ−ＤＰ−７３２６、ＡＬ−ＤＰ−７３２７、ＡＬ−ＤＰ−７３２９、ＡＬ−ＤＰ−７３３１、ＡＬ−ＤＰ−７３３３、ＡＬ−ＤＰ−７３４０、ＡＬ−ＤＰ−７３４２、ＡＬ−ＤＰ−７３０３、ＡＬ−ＤＰ−７３０５、ＡＬ−ＤＰ−７３０７、ＡＬ−ＤＰ−７３０９、ＡＬ−ＤＰ−７３１６およびＡＬ−ＤＰ−７３３７、ＡＬ−ＤＰ−７３０４、ＡＬ−ＤＰ−７３１２、ＡＬ−ＤＰ−７３３９、ＡＬ−ＤＰ−７３４４、ＡＬ−ＤＰ−７３０６、ＡＬ−ＤＰ−７３１７、ＡＬ−ＤＰ−７３４６、ＡＬ−ＤＰ−７３１０、ＡＬ−ＤＰ−７３２３、ＡＬ−ＤＰ−７３３５、ＡＬ−ＤＰ−７３３８、ＡＬ−ＤＰ−７３４１、ＡＬ−ＤＰ−７３０２、ＡＬ−ＤＰ−７３１５、ＡＬ−ＤＰ−７３２８、ＡＬ−ＤＰ−７３３０、ＡＬ−ＤＰ−７３３６、ＡＬ−ＤＰ−７３４５、ＡＬ−ＤＰ−９２５０、ＡＬ−ＤＰ−９２５１、ＡＬ−ＤＰ−９２５２、ＡＬ−ＤＰ−９２５３、ＡＬ−ＤＰ−９２５４、ＡＬ−ＤＰ−９２５５、ＡＬ−ＤＰ−９２５６、ＡＬ−ＤＰ−９２５７、ＡＬ−ＤＰ−９２５８、ＡＬ−ＤＰ−９２５９、ＡＬ−ＤＰ−９２６０、ＡＬ−ＤＰ−９２６１、ＡＬ−ＤＰ−９２６２、ＡＬ−ＤＰ−９２６３、ＡＬ−ＤＰ−９２６４、ＡＬ−ＤＰ−９２６５、ＡＬ−ＤＰ−９２６６、ＡＬ−ＤＰ−９２６７、ＡＬ−ＤＰ−９２６８、ＡＬ−ＤＰ−９２６９、ＡＬ−ＤＰ−９２７０、ＡＬ−ＤＰ−９２７１、ＡＬ−ＤＰ−９２７２、ＡＬ−ＤＰ−９２７３、ＡＬ−ＤＰ−９２７４、ＡＬ−ＤＰ−９２７５、ＡＬ−ＤＰ−９２７６、ＡＬ−ＤＰ−９２７７、ＡＬ−ＤＰ−９２７９、ＡＬ−ＤＰ−９２８０、ＡＬ−ＤＰ−９２８１、ＡＬ−ＤＰ−９２８２、ＡＬ−ＤＰ−９２８３、ＡＬ−ＤＰ−９２８４、ＡＬ−ＤＰ−９２８５、ＡＬ−ＤＰ−９２８６、ＡＬ−ＤＰ−９２８７、ＡＬ−ＤＰ−９２８８およびＡＬ−ＤＰ−９２８９の群から選択される。好ましくは、本方法を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行う。細胞中のＡｈａ遺伝子発現を阻害する方法の他の実施形態は、上記本発明の他の態様で提供する通りである。
【００２４】
さらに別の態様では、Ａｈａ発現によって媒介される病理学的過程を治療、予防、または管理する方法であって、治療または予防有効量のｄｓＲＮＡをかかる治療、予防、または管理を必要とする患者に投与する工程を含み、ｄｓＲＮＡが相互に相補的な少なくとも２つの配列を含み、センス鎖が第１の配列を含み、アンチセンス鎖がＡｈａ１をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的な相補領域を含む第２の配列を含み、相補領域が、３０ヌクレオチド長未満であり、ｄｓＲＮＡが、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１および配列番号１８３の群から選択されるセンス鎖ならびに後者のセンス鎖と相補的であり、且つ配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２および配列番号１８４の群から選択されるアンチセンス鎖を有する第２のｄｓＲＮＡの標的配列内のＡｈａ遺伝子をコードするｍＲＮＡを切断する、方法を提供する。ｄｓＲＮＡは、前記第２のｄｓＲＮＡと異なり得るが、上記の命名したヌクレオチド配列の１つと同様に、鎖あたり少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも１８、または少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを有することができる。
【００２５】
好ましくは、第２のｄｓＲＮＡは、ＡＬ−ＤＰ−７３０１、ＡＬ−ＤＰ−７３０８、ＡＬ−ＤＰ−７３１８、ＡＬ−ＤＰ−７３２０、ＡＬ−ＤＰ−７３２２、ＡＬ−ＤＰ−７３２４、ＡＬ−ＤＰ−７３２５、ＡＬ−ＤＰ−７３２６、ＡＬ−ＤＰ−７３２７、ＡＬ−ＤＰ−７３２９、ＡＬ−ＤＰ−７３３１、ＡＬ−ＤＰ−７３３３、ＡＬ−ＤＰ−７３４０、ＡＬ−ＤＰ−７３４２、ＡＬ−ＤＰ−７３０３、ＡＬ−ＤＰ−７３０５、ＡＬ−ＤＰ−７３０７、ＡＬ−ＤＰ−７３０９、ＡＬ−ＤＰ−７３１６およびＡＬ−ＤＰ−７３３７、ＡＬ−ＤＰ−７３０４、ＡＬ−ＤＰ−７３１２、ＡＬ−ＤＰ−７３３９、ＡＬ−ＤＰ−７３４４、ＡＬ−ＤＰ−７３０６、ＡＬ−ＤＰ−７３１７、ＡＬ−ＤＰ−７３４６、ＡＬ−ＤＰ−７３１０、ＡＬ−ＤＰ−７３２３、ＡＬ−ＤＰ−７３３５、ＡＬ−ＤＰ−７３３８、ＡＬ−ＤＰ−７３４１、ＡＬ−ＤＰ−７３０２、ＡＬ−ＤＰ−７３１５、ＡＬ−ＤＰ−７３２８、ＡＬ−ＤＰ−７３３０、ＡＬ−ＤＰ−７３３６、ＡＬ−ＤＰ−７３４５、ＡＬ−ＤＰ−９２５０、ＡＬ−ＤＰ−９２５１、ＡＬ−ＤＰ−９２５２、ＡＬ−ＤＰ−９２５３、ＡＬ−ＤＰ−９２５４、ＡＬ−ＤＰ−９２５５、ＡＬ−ＤＰ−９２５６、ＡＬ−ＤＰ−９２５７、ＡＬ−ＤＰ−９２５８、ＡＬ−ＤＰ−９２５９、ＡＬ−ＤＰ−９２６０、ＡＬ−ＤＰ−９２６１、ＡＬ−ＤＰ−９２６２、ＡＬ−ＤＰ−９２６３、ＡＬ−ＤＰ−９２６４、ＡＬ−ＤＰ−９２６５、ＡＬ−ＤＰ−９２６６、ＡＬ−ＤＰ−９２６７、ＡＬ−ＤＰ−９２６８、ＡＬ−ＤＰ−９２６９、ＡＬ−ＤＰ−９２７０、ＡＬ−ＤＰ−９２７１、ＡＬ−ＤＰ−９２７２、ＡＬ−ＤＰ−９２７３、ＡＬ−ＤＰ−９２７４、ＡＬ−ＤＰ−９２７５、ＡＬ−ＤＰ−９２７６、ＡＬ−ＤＰ−９２７７、ＡＬ−ＤＰ−９２７９、ＡＬ−ＤＰ−９２８０、ＡＬ−ＤＰ−９２８１、ＡＬ−ＤＰ−９２８２、ＡＬ−ＤＰ−９２８３、ＡＬ−ＤＰ−９２８４、ＡＬ−ＤＰ−９２８５、ＡＬ−ＤＰ−９２８６、ＡＬ−ＤＰ−９２８７、ＡＬ−ＤＰ−９２８８およびＡＬ−ＤＰ−９２８９の群から選択される（表１および表２を参照のこと）。
【００２６】
あるいは、ｄｓＲＮＡ自体は、ＡＬ−ＤＰ−７３０１、ＡＬ−ＤＰ−７３０８、ＡＬ−ＤＰ−７３１８、ＡＬ−ＤＰ−７３２０、ＡＬ−ＤＰ−７３２２、ＡＬ−ＤＰ−７３２４、ＡＬ−ＤＰ−７３２５、ＡＬ−ＤＰ−７３２６、ＡＬ−ＤＰ−７３２７、ＡＬ−ＤＰ−７３２９、ＡＬ−ＤＰ−７３３１、ＡＬ−ＤＰ−７３３３、ＡＬ−ＤＰ−７３４０、ＡＬ−ＤＰ−７３４２、ＡＬ−ＤＰ−７３０３、ＡＬ−ＤＰ−７３０５、ＡＬ−ＤＰ−７３０７、ＡＬ−ＤＰ−７３０９、ＡＬ−ＤＰ−７３１６およびＡＬ−ＤＰ−７３３７、ＡＬ−ＤＰ−７３０４、ＡＬ−ＤＰ−７３１２、ＡＬ−ＤＰ−７３３９、ＡＬ−ＤＰ−７３４４、ＡＬ−ＤＰ−７３０６、ＡＬ−ＤＰ−７３１７、ＡＬ−ＤＰ−７３４６、ＡＬ−ＤＰ−７３１０、ＡＬ−ＤＰ−７３２３、ＡＬ−ＤＰ−７３３５、ＡＬ−ＤＰ−７３３８、ＡＬ−ＤＰ−７３４１、ＡＬ−ＤＰ−７３０２、ＡＬ−ＤＰ−７３１５、ＡＬ−ＤＰ−７３２８、ＡＬ−ＤＰ−７３３０、ＡＬ−ＤＰ−７３３６、ＡＬ−ＤＰ−７３４５、ＡＬ−ＤＰ−９２５０、ＡＬ−ＤＰ−９２５１、ＡＬ−ＤＰ−９２５２、ＡＬ−ＤＰ−９２５３、ＡＬ−ＤＰ−９２５４、ＡＬ−ＤＰ−９２５５、ＡＬ−ＤＰ−９２５６、ＡＬ−ＤＰ−９２５７、ＡＬ−ＤＰ−９２５８、ＡＬ−ＤＰ−９２５９、ＡＬ−ＤＰ−９２６０、ＡＬ−ＤＰ−９２６１、ＡＬ−ＤＰ−９２６２、ＡＬ−ＤＰ−９２６３、ＡＬ−ＤＰ−９２６４、ＡＬ−ＤＰ−９２６５、ＡＬ−ＤＰ−９２６６、ＡＬ−ＤＰ−９２６７、ＡＬ−ＤＰ−９２６８、ＡＬ−ＤＰ−９２６９、ＡＬ−ＤＰ−９２７０、ＡＬ−ＤＰ−９２７１、ＡＬ−ＤＰ−９２７２、ＡＬ−ＤＰ−９２７３、ＡＬ−ＤＰ−９２７４、ＡＬ−ＤＰ−９２７５、ＡＬ−ＤＰ−９２７６、ＡＬ−ＤＰ−９２７７、ＡＬ−ＤＰ−９２７９、ＡＬ−ＤＰ−９２８０、ＡＬ−ＤＰ−９２８１、ＡＬ−ＤＰ−９２８２、ＡＬ−ＤＰ−９２８３、ＡＬ−ＤＰ−９２８４、ＡＬ−ＤＰ−９２８５、ＡＬ−ＤＰ−９２８６、ＡＬ−ＤＰ−９２８７、ＡＬ−ＤＰ−９２８８およびＡＬ−ＤＰ−９２８９の群から選択される。本発明のｄｓＲＮＡの投与を含む方法の他の実施形態は、上記本発明の他の態様で提供する通りである。
【００２７】
さらに別の態様では、細胞中のＡｈａ遺伝子の発現を阻害するためのベクターであって、前記ベクターがｄｓＲＮＡの少なくとも１つの鎖をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節配列を含み、前記ｄｓＲＮＡの鎖の１つが、Ａｈａ１をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的であり、前記ｄｓＲＮＡが３０塩基対長未満であり、ｄｓＲＮＡが、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１および配列番号１８３の群から選択されるセンス鎖ならびに後者のセンス鎖と相補的であり、且つ配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２および配列番号１８４の群から選択されるアンチセンス鎖を有する第２のｄｓＲＮＡの標的配列内のＡｈａ遺伝子をコードするｍＲＮＡを切断する、ベクターを提供する。ｄｓＲＮＡは、前記第２のｄｓＲＮＡと異なり得るが、上記の命名したヌクレオチド配列の１つと同様に、鎖あたり少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも１８、または少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを有することができる。
【００２８】
好ましくは、第２のｄｓＲＮＡは、ＡＬ−ＤＰ−７３０１、ＡＬ−ＤＰ−７３０８、ＡＬ−ＤＰ−７３１８、ＡＬ−ＤＰ−７３２０、ＡＬ−ＤＰ−７３２２、ＡＬ−ＤＰ−７３２４、ＡＬ−ＤＰ−７３２５、ＡＬ−ＤＰ−７３２６、ＡＬ−ＤＰ−７３２７、ＡＬ−ＤＰ−７３２９、ＡＬ−ＤＰ−７３３１、ＡＬ−ＤＰ−７３３３、ＡＬ−ＤＰ−７３４０、ＡＬ−ＤＰ−７３４２、ＡＬ−ＤＰ−７３０３、ＡＬ−ＤＰ−７３０５、ＡＬ−ＤＰ−７３０７、ＡＬ−ＤＰ−７３０９、ＡＬ−ＤＰ−７３１６およびＡＬ−ＤＰ−７３３７、ＡＬ−ＤＰ−７３０４、ＡＬ−ＤＰ−７３１２、ＡＬ−ＤＰ−７３３９、ＡＬ−ＤＰ−７３４４、ＡＬ−ＤＰ−７３０６、ＡＬ−ＤＰ−７３１７、ＡＬ−ＤＰ−７３４６、ＡＬ−ＤＰ−７３１０、ＡＬ−ＤＰ−７３２３、ＡＬ−ＤＰ−７３３５、ＡＬ−ＤＰ−７３３８、ＡＬ−ＤＰ−７３４１、ＡＬ−ＤＰ−７３０２、ＡＬ−ＤＰ−７３１５、ＡＬ−ＤＰ−７３２８、ＡＬ−ＤＰ−７３３０、ＡＬ−ＤＰ−７３３６、ＡＬ−ＤＰ−７３４５、ＡＬ−ＤＰ−９２５０、ＡＬ−ＤＰ−９２５１、ＡＬ−ＤＰ−９２５２、ＡＬ−ＤＰ−９２５３、ＡＬ−ＤＰ−９２５４、ＡＬ−ＤＰ−９２５５、ＡＬ−ＤＰ−９２５６、ＡＬ−ＤＰ−９２５７、ＡＬ−ＤＰ−９２５８、ＡＬ−ＤＰ−９２５９、ＡＬ−ＤＰ−９２６０、ＡＬ−ＤＰ−９２６１、ＡＬ−ＤＰ−９２６２、ＡＬ−ＤＰ−９２６３、ＡＬ−ＤＰ−９２６４、ＡＬ−ＤＰ−９２６５、ＡＬ−ＤＰ−９２６６、ＡＬ−ＤＰ−９２６７、ＡＬ−ＤＰ−９２６８、ＡＬ−ＤＰ−９２６９、ＡＬ−ＤＰ−９２７０、ＡＬ−ＤＰ−９２７１、ＡＬ−ＤＰ−９２７２、ＡＬ−ＤＰ−９２７３、ＡＬ−ＤＰ−９２７４、ＡＬ−ＤＰ−９２７５、ＡＬ−ＤＰ−９２７６、ＡＬ−ＤＰ−９２７７、ＡＬ−ＤＰ−９２７９、ＡＬ−ＤＰ−９２８０、ＡＬ−ＤＰ−９２８１、ＡＬ−ＤＰ−９２８２、ＡＬ−ＤＰ−９２８３、ＡＬ−ＤＰ−９２８４、ＡＬ−ＤＰ−９２８５、ＡＬ−ＤＰ−９２８６、ＡＬ−ＤＰ−９２８７、ＡＬ−ＤＰ−９２８８およびＡＬ−ＤＰ−９２８９の群から選択される（表１および表２を参照のこと）。本発明のベクターの他の実施形態は、上記本発明の他の態様で提供する通りである。
【００２９】
さらに別の態様では、上記ベクターを含む単離細胞を提供する。本発明のベクターを含む細胞の他の実施形態は、上記本発明の他の態様で提供する通りである。
【００３０】
表１：ホモ・サピエンス（ＮＭ＿０１２１１１．１）、ハツカネズミ（ＮＭ＿１４６０３６．１）、およびチンパンジー（ＸＭ＿５１００９４．１）のＡｈａ１を下方制御し、ラット細胞中でのオフターゲット相互作用が最小なＲＮＡｉ薬；ＡＬ−ＤＰ−７５６１、ＡＬ−ＤＰ−７５６２、ＡＬ−ＤＰ−７５６３、およびＡＬ−ＤＰ−７５６４は、ハツカネズミ（ＮＭ＿１７２３９１．３）およびラット（ＸＭ＿２２３６８０．３）Ａｈａ２に対してさらなる交差反応を示す。
【００３１】
【表１−１】

【００３２】
【表１−２】

表２：ホモ・サピエンス（ＮＭ＿０１２１１１．１）、ハツカネズミ（ＮＭ＿１４６０３６．１）、およびチンパンジー（ＸＭ＿５１００９４．１）のＡｈａ１を下方制御し、ヒト細胞中でのオフターゲット相互作用が最小なＲＮＡｉ薬。
【００３３】
【表２−１】

【００３４】
【表２−２】

【発明を実施するための形態】
【００３５】
発明の詳細な説明
本発明は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）、ならびにｄｓＲＮＡを使用した細胞または哺乳動物中のＡｈａ遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法を提供する。本発明はまた、ｄｓＲＮＡを使用したＡｈａ遺伝子の発現に起因する哺乳動物の病的状態および疾患を治療するための組成物および方法を提供する。ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として公知の過程によるｍＲＮＡの配列特異的分解を指示する。
【００３６】
本発明のｄｓＲＮＡは、３０ヌクレオチド長未満、一般に１９〜２４ヌクレオチド長であり、Ａｈａ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的な領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含む。これらのｄｓＲＮＡの使用により、哺乳動物中の癌細胞の複製および／または維持および／または誤折り畳み嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）の分解に関与する遺伝子のｍＲＮＡの標的化分解が可能である。細胞ベースのアッセイおよび動物アッセイを使用して、本発明者らは、これらのｄｓＲＮＡの非常に低い投薬量がＲＮＡｉを特異的且つ有効に媒介し、それにより、Ａｈａ遺伝子の発現を有意に阻害することができることを証明した。したがって、これらのｄｓＲＮＡを含む本発明の方法および組成物は、タンパク質分解に関与する遺伝子のターゲティングによるＡｈａ発現によって媒介される病理学的過程（例えば、癌および／または嚢胞性線維症）の治療に有用である。
【００３７】
以下の詳細な説明は、Ａｈａ遺伝子の発現を阻害するためのｄｓＲＮＡおよびｄｓＲＮＡを含む組成物の作製および使用方法ならびにＡｈａ遺伝子の発現に起因する疾患および障害（癌および／または嚢胞性線維症など）の治療のための組成物および方法を開示する。本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能なキャリアと共に、３０ヌクレオチド長未満、一般に１９〜２４ヌクレオチド長であり、Ａｈａ遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的な相補領域を含むアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡを含む。
【００３８】
したがって、本発明の一定の態様は、薬学的に許容可能なキャリアと共に本発明のｄｓＲＮＡを含む薬学的組成物、Ａｈａ遺伝子の発現を阻害するための組成物の使用方法、およびＡｈａ遺伝子の発現に起因する疾患を治療するための薬学的組成物の使用方法を提供する。
【００３９】
定義
便宜上、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲中で使用される一定の用語および句の意味を以下に示す。本明細書の他の部分中の用語の使用法と本項で提供した定義との間に明らかな矛盾が生じる場合、本項の定義を優先するものとする。
【００４０】
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」、および「Ｕ」（大文字または小文字で記載されているかに関係なく）は、それぞれ一般に、塩基として、それぞれ、グアニン、シトシン、アデニン、チミン、およびウラシルを含むヌクレオチドを示す。しかし、用語「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」は、以下にさらに詳述の修飾ヌクレオチドまたは代理置換部分をいうことができると理解されるであろう。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、チミン、およびウラシルを、かかる置換部分を保有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合特性を実質的に変化させることなく、他の部分と置換することができることを十分に承知している。例えば、制限されないが、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含むヌクレオチドと塩基対合することができる。したがって、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含むヌクレオチドを、本発明のヌクレオチド配列中の、例えば、イノシンを含むヌクレオチドと置換することができる。かかる置換部分を含む配列は、本発明の実施形態である。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、「Ａｈａ遺伝子」は、熱ショックタンパク質９０ＡＴＰアーゼ遺伝子のアクチベーターをいう。「Ａｈａ１」は、熱ショックタンパク質９０ＡＴＰアーゼ１遺伝子のアクチベーターをいい、その限定的な例は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿０１２１１１．１（ホモ・サピエンス）、ＮＭ＿１４６０３６．１（ハツカネズミ）、およびＸＭ＿５１００９４．１（チンパンジー）で見出される。「Ａｈａ２」は、Ａｈｓａ２としても公知の熱ショックタンパク質９０ＡＴＰアーゼ２遺伝子の推定アクチベーターをいい、その限定的な例を、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿１７２３９１．３（ハツカネズミ）およびＸＭ＿２２３６８０．３（ラット）に見出すことができる。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、「標的配列」は、Ａｈａ遺伝子の転写中に形成されたｍＲＮＡ分子（一次転写産物のＲＮＡプロセシング産物であるｍＲＮＡが含まれる）のヌクレオチド配列の連続的部分をいう。本発明の任意の所与のＲＮＡｉ薬の標的配列は、かかる配列とのＲＮＡｉ薬のアンチセンス鎖の相補性によってＲＮＡｉ薬によってターゲティングされ、接触した場合にアンチセンス鎖がｍＲＮＡとハイブリッド形成することができるＸヌクレオチド（ここで、Ｘは、アンチセンス鎖中のヌクレオチド数およびセンス鎖（存在する場合）の一本鎖オーバーハング中のヌクレオチド数である）のｍＲＮＡ配列を意味する。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、用語「配列を含む鎖」は、標準的なヌクレオチド命名法を使用して参照する配列によって記載されるヌクレオチド鎖を含むオリゴヌクレオチドをいう。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、他で示さない限り、用語「相補性」は、当業者に理解されるように、第２のヌクレオチド配列と比較した第１のヌクレオチド配列を説明するために使用する場合、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが一定の条件下で第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリッド形成して二重鎖構造を形成する能力をいう。かかる条件は、例えば、ストリンジェントな条件であり得、ストリンジェントな条件には、以下が含まれ得る：４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２〜１６時間、およびその後の洗浄。生物内で遭遇し得る他の条件（生理学的に関連する条件など）を適用することができる。当業者は、ハイブリッド形成されたヌクレオチドの最終的適用にしたがって２つの配列の相補性試験に最も適切な条件組を決定することができるであろう。
【００４５】
これには、第１および第２のヌクレオチド配列の全長にわたる、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドへの塩基対合が含まれる。かかる配列を、本明細書中で、相互に関して「完全に相補的」ということができる。しかし、本明細書中で第１の配列が第２の配列に関して「実質的に相補的」という場合、ハイブリッド形成の際、２つの配列は完全に相補的であり得るか、２つの配列は、その最終的な適用に最も関連する条件下でハイブリッド形成する能力を保持しながら、１つ以上であるが、一般に、多くて４、３、または２個のミスマッチ塩基対を形成することができる。しかし、２つのオリゴヌクレオチドがハイブリッド形成の際に１つ以上の一本鎖オーバーハングを形成するようにデザインする場合、かかるオーバーハングは、相補性決定に関してミスマッチと見なされないものとする。例えば、２１ヌクレオチド長の一方のオリゴヌクレオチドおよび２３ヌクレオチド長の他方のオリゴヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡ（ここで、より長いオリゴヌクレオチドは、より短いオリゴヌクレオチドに完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を含む）を、本発明の目的のために、依然として「完全に相補的」ということができる。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、「相補」配列には、そのハイブリッド形成能力に関する上記要件を満たす限り、非ワトソン−クリック塩基対および／または非天然ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドから形成した塩基対も含まれ得るか、これらから完全に形成することができる。
【００４７】
用語「相補的」、「完全に相補的」、および「実質的に相補的」を、本明細書中で、その使用状況から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間またはｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列との間の塩基マッチングに関して使用することができる。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）「の少なくとも一部と実質的に相補的な」ポリヌクレオチドは、（例えば、Ａｈａ１をコードする）目的のｍＲＮＡの連続部分と実質的に相補的なポリヌクレオチドをいう。例えば、ポリヌクレオチドは、配列がＡｈａ１をコードするｍＲＮＡの非干渉部分と実質的に相補的である場合、Ａｈａ１ ｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、用語「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」は、２つの逆平行で実質的に相補的な上記定義の核酸鎖を含む二重鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体をいう。二重鎖構造を形成する２つの鎖は、１つのより巨大なＲＮＡ分子の異なる部分であり得るか、個別のＲＮＡ分子であり得る。２つの鎖が１つのより巨大な分子の一部であり、それにより、一方の鎖の３’末端とそれぞれの他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの非干渉鎖によって接続されて二重鎖構造を形成する場合、接続されたＲＮＡ鎖を、「ヘアピンループ」という。２つの鎖が一方の鎖の３’末端とそれぞれの他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの非干渉鎖以外の手段によって共有結合されて二重鎖構造を形成する場合、接続構造を、「リンカー」という。ＲＮＡ鎖は、同数または異なる数のヌクレオチドを有することができる。塩基対の最大数は、最も短いｄｓＲＮＡ鎖中のヌクレオチド数−二重鎖中に存在する任意のオーバーハングである。二重鎖構造に加えて、ｄｓＲＮＡは、１つ以上のヌクレオチドオーバーハングを含み得る。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、「ヌクレオチドオーバーハング」は、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を超えて伸長する（またはその逆）場合にｄｓＲＮＡの二重鎖構造から突き出す非対合ヌクレオチドをいう。「ブラント（ｂｌｕｎｔ）」または「平滑末端」は、ｄｓＲＮＡの末端に非対合ヌクレオチドが存在しない（すなわち、ヌクレオチドオーバーハングが存在しない）ことを意味する。「平滑末端」ｄｓＲＮＡは、分子のいずれかの末端にヌクレオチドオーバーハングを持たないｄｓＲＮＡである。
【００５１】
用語「アンチセンス鎖」は、標的配列と実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡの鎖をいう。本明細書中で使用される場合、用語「相補領域」は、本明細書中で定義する配列（例えば、標的配列）と実質的に相補的なアンチセンス鎖上の領域をいう。相補領域が標的配列と完全に相補的ではない場合、ミスマッチは、末端領域中で最も許容され、存在する場合、一般に、末端領域（例えば、５’および／または３’末端の６、５、４、３、または２ヌクレオチド以内）中に存在する。最も好ましくは、ミスマッチは、アンチセンス鎖の５’末端および／またはセンス鎖の３’末端の６、５、４、３、または２ヌクレオチド以内に存在する。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、用語「センス鎖」は、アンチセンス鎖領域と実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡの鎖をいう。
【００５３】
ｄｓＲＮＡをいう場合、「細胞への導入」は、当業者に理解されるように、細胞への取り込みまたは吸収の促進を意味する。ｄｓＲＮＡの吸収または取り込みは、援助のない拡散性または能動的な細胞過程によるか、助剤または補助デバイスによって起こり得る。この用語の意味は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞に制限されず、ｄｓＲＮＡを、「細胞に導入する」こともでき、この細胞は生きた生物の一部である。かかる例では、細胞への導入には、生物への送達が含まれるであろう。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ送達のために、ｄｓＲＮＡを、組織部位に注射するか、全身投与することができる。細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ導入には、エレクトロポレーションおよびリポフェクションなどの当該分野で公知の方法が含まれる。
【００５４】
用語「サイレンス」および「〜の発現を阻害する」は、Ａｈａ遺伝子（例えば、Ａｈａ１遺伝子）をいう限り、本明細書中で、Ａｈａ遺伝子が転写され、Ａｈａ遺伝子の発現が阻害されるように処理された第１の細胞または細胞群から単離することができるＡｈａ遺伝子から転写したｍＲＮＡ量の減少によって示したところ、第１の細胞または細胞群と実質的に同一であるがそのように処理されていない第２の細胞または細胞群（コントロール細胞）と比較した場合にＡｈａ遺伝子（例えば、Ａｈａ１遺伝子）発現の少なくとも部分的な抑制をいう。好ましくは、細胞は、ＨｅＬａ細胞またはＭＬＥ１２細胞である。阻害度を、通常、以下のように示す。
【００５５】
【数１】

あるいは、阻害度を、Ａｈａ遺伝子転写と機能的に関連するパラメーター（例えば、細胞によって分泌されるか、かかる細胞の溶解後に溶液中で見出されるＡｈａ遺伝子によってコードされるタンパク質の量または一定の表現型（例えば、アポトーシスまたは細胞表面ＣＦＴＲ）を示す細胞数）の減少に関して示すことができる。原理上、Ａｈａ遺伝子サイレンシングを、構成性またはゲノム工学のいずれかで標的を発現する任意の細胞中で、任意の適切なアッセイによって決定することができる。しかし、所与のｄｓＲＮＡが一定の程度でＡｈａ遺伝子の発現を阻害するかどうかを決定するための基準が必要であり、従って、以下の実施例で提供したアッセイがかかる基準としての機能を果たすものとし、本発明に含まれる。
【００５６】
例えば、一定の例では、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、Ａｈａ遺伝子（例えば、Ａｈａ１遺伝子）の発現が、少なくとも約２０％、２５％、３５％、または５０％抑制される。いくつかの実施形態では、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、Ａｈａ遺伝子（例えば、Ａｈａ１遺伝子）が、少なくとも約６０％、７０％、または８０％抑制される。いくつかの実施形態では、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、Ａｈａ遺伝子（例えば、Ａｈａ１遺伝子）が、少なくとも約８５％、９０％、または９５％抑制される。表６は、種々の本発明のｄｓＲＮＡ分子を使用したＡｈａ１発現の阻害値を示す。
【００５７】
Ａｈａ発現（例えば、Ａｈａ１発現）の文脈において本明細書中で使用される場合、用語「治療する」、「治療」などは、Ａｈａ発現によって媒介される病理学的過程からの軽減または緩和をいう。本発明の文脈では、以下に引用した任意の他の容態（Ａｈａ発現によって媒介される病理学的過程以外）に関する限り、用語「治療する」、「治療」などは、かかる容態に関連する少なくとも１つの症状の軽減もしくは緩和またはかかる容態の進行の遅延もしくは逆転を意味する。
【００５８】
本明細書中で使用される場合、句「治療有効量」および「予防有効量」は、Ａｈａ発現によって媒介される病理学的過程またはＡｈａ発現によって媒介される病理学的過程の明白な症状の治療、予防、または管理で治療的利点を提供する量をいう。通常の医療従事者は、治療に有効な特定の量を容易に決定することができ、この量は、当該分野で公知の要因（例えば、Ａｈａ発現によって媒介される病理学的過程の型、患者の病歴および年齢、Ａｈａ発現によって媒介される病理学的過程の段階、およびＡｈａ発現因子によって媒介される他の抗病理学的過程薬（ａｎｔｉ−ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）の投与など）に応じて変化し得る。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、「薬学的組成物」は、薬理学的有効量のｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む。本明細書中で使用される場合、「薬理学的有効量」、「治療有効量」、または単純に「有効量」は、意図する薬理学的結果、治療上の結果、または予防上の結果を得るのに有効なＲＮＡの量をいう。例えば、疾患または障害に関連する測定可能なパラメーターが少なくとも２５％減少する場合に所与の臨床的治療を有効と見なす場合、その疾患または障害の治療薬の治療有効量は、パラメーターを少なくとも２５％減少させるのに必要な量である。
【００６０】
用語「薬学的に許容可能なキャリア」は、治療薬投与のためのキャリアをいう。かかるキャリアには、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。この用語は、細胞培養培地を特異的に排除する。経口投与される薬物のために、薬学的に許容可能なキャリアには、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、甘味剤、香味物質、着色剤、および防腐剤などの薬学的に許容可能な賦形剤が含まれるが、これらに限定されない。適切な不活性希釈剤には、炭酸ナトリウムおよび炭酸カルシウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カルシウム、ならびにラクトースが含まれ、トウモロコシデンプンおよびアルギン酸は適切な崩壊剤である。結合剤には、デンプンおよびゼラチンが含まれ得、潤滑剤は、存在する場合、一般に、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクであろう。必要に応じて、錠剤を、胃腸管での吸収を遅延させるために、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの材料でコーティングすることができる。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、「形質転換細胞」は、ｄｓＲＮＡ分子を発現することができるベクターを導入した細胞である。
【００６２】
二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）
１つの実施形態では、本発明は、細胞または哺乳動物中でのＡｈａ遺伝子（例えば、Ａｈａ１遺伝子）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子であって、ｄｓＲＮＡがＡｈａ遺伝子（例えば、Ａｈａ１遺伝子）の発現で形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的な相補領域を含むアンチセンス鎖を含み、相補領域が３０ヌクレオチド長未満、一般に１９〜２４ヌクレオチド長である、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を提供する。ｄｓＲＮＡは、表１および表２に示すｄｓＲＮＡの１つと同一であり得るか、表１および表２に示すｄｓＲＮＡの１つの標的配列内のＡｈａ遺伝子をコードするｍＲＮＡを切断することができる。好ましくは、ｄｓＲＮＡは、表１および表２に示すｄｓＲＮＡの１つの少なくとも１つの鎖、好ましくは両方の鎖と同様に鎖あたり少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも１８、または少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを有する。表１および表２に示すｄｓＲＮＡの１つの標的配列中の他の場所をターゲティングする別のｄｓＲＮＡを、標的配列および隣接Ａｈａ１配列を使用して容易に決定することができる。
【００６３】
ｄｓＲＮＡは、ハイブリッド形成して二重鎖構造を形成するのに十分に相補的な２つのＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、Ａｈａ遺伝子発現中に形成されるｍＲＮＡ配列由来の標的配列と実質的に相補的、一般に完全に相補的な相補領域を含み、他方の鎖（センス鎖）は、適切な条件下で組み合わせた場合に２つの鎖がハイブリッド形成して二重鎖構造を形成するようにアンチセンス鎖に相補的な領域を含む。一般に、二重鎖構造は、１５塩基対長と３０塩基対長との間、より一般には１８塩基対長と２５塩基対長との間、さらにより一般的には１９塩基対長と２４塩基対長との間、最も一般的には１９塩基対長と２１塩基対長との間である。同様に、標的配列に対する相補領域は、１５ヌクレオチド長と３０ヌクレオチド長との間、より一般的には１８ヌクレオチド長と２５ヌクレオチド長との間、さらにより一般的には１９ヌクレオチド長と２４ヌクレオチド長との間、最も一般的には１９ヌクレオチド長と２１ヌクレオチド長との間である。本発明のｄｓＲＮＡは、さらに、１つ以上の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含むことができる。ｄｓＲＮＡを、以下でさらに考察する当該分野で公知の標準的な方法（例えば、自動化ＤＮＡ合成機（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．から市販されるものなど）の使用）によって合成することができる。好ましい実施形態では、Ａｈａ遺伝子は、ヒトＡｈａ１遺伝子である。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡの第１の鎖は、ＲＮＡｉ薬（ＡＬ−ＤＰ−７３０１−ＡＬ−ＤＰ−７３４６およびＡＬ−ＤＰ−７５６１−ＡＬ−ＤＰ−７５６４（表１）ならびにＡＬ−ＤＰ−９２５０−ＡＬ−ＤＰ−９２８９（表２））のセンス鎖を含み、第２の配列は、ＡＬ−ＤＰ−７３０１−ＡＬ−ＤＰ−７３４６およびＡＬ−ＤＰ−７５６１−ＡＬ−ＤＰ−７５６４（表１）ならびにＡＬ−ＤＰ−９２５０−ＡＬ−ＤＰ−９２８９（表２）のアンチセンス鎖からなる群から選択される。
【００６４】
さらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡｉ薬（ＡＬ−ＤＰ−７３０１−ＡＬ−ＤＰ−７３４６およびＡＬ−ＤＰ−７５６１−ＡＬ−ＤＰ−７５６４（表１）ならびにＡＬ−ＤＰ−９２５０−ＡＬ−ＤＰ−９２８９（表２））について上記で提供した配列群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、この群から選択される少なくとも２つの鎖を含み、ここで、少なくとも２つの配列の一方は少なくとも２つの配列の他方と相補的であり、少なくとも２つの配列の一方は、Ａｈａ遺伝子（例えば、Ａｈａ１遺伝子）の発現で生成されたｍＲＮＡの配列と実質的に相補的である。一般に、ｄｓＲＮＡは２つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで、１つのオリゴヌクレオチドを、ＲＮＡｉ薬（ＡＬ−ＤＰ−７３０１−ＡＬ−ＤＰ−７３４６およびＡＬ−ＤＰ−７５６１−ＡＬ−ＤＰ−７５６４（表１）ならびにＡＬ−ＤＰ−９２５０−ＡＬ−ＤＰ−９２８９（表２））の１つ中のセンス鎖として記載することができ、第２のオリゴヌクレオチドを、ＲＮＡｉ薬（ＡＬ−ＤＰ−７３０１−ＡＬ−ＤＰ−７３４６およびＡＬ−ＤＰ−７５６１−ＡＬ−ＤＰ−７５６４（表１）ならびにＡＬ−ＤＰ−９２５０−ＡＬ−ＤＰ−９２８９（表２））の１つ中のアンチセンス鎖として記載することができる。
【００６５】
当業者は、２０塩基対と２３塩基対との間であるが、特に２１塩基対の二重鎖構造を含むｄｓＲＮＡがＲＮＡ干渉の誘導で特に有効であると支持されていることを十分に承知している（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、ＥＭＢＯ ２００１、２０：６８７７−６８８８）。しかし、他の者は、より短いかより長いｄｓＲＮＡが同様に有効であり得ることを見出している。上記の実施形態では、ＲＮＡｉ薬（ＡＬ−ＤＰ−７３０１−ＡＬ−ＤＰ−７３４６およびＡＬ−ＤＰ−７５６１−ＡＬ−ＤＰ−７５６４（表１）ならびにＡＬ−ＤＰ−９２５０−ＡＬ−ＤＰ−９２８９（表２））のために提供されたオリゴヌクレオチド配列の性質により、本発明のｄｓＲＮＡは、最小で２１ｎｔの長さの少なくとも１つの鎖を含むことができる。本明細書中でＲＮＡｉ薬（ＡＬ−ＤＰ−７３０１−ＡＬ−ＤＰ−７３４６およびＡＬ−ＤＰ−７５６１−ＡＬ−ＤＰ−７５６４（表１）ならびにＡＬ−ＤＰ−９２５０−ＡＬ−ＤＰ−９２８９（表２））のために提供された配列の１つを含むより短いｄｓＲＮＡ−一方または両方の末端上のほんのわずかなヌクレオチドが上記ｄｓＲＮＡと比較して同様に有効であり得ると予想することが妥当であり得る。したがって、ＲＮＡｉ薬（ＡＬ−ＤＰ−７３０１−ＡＬ−ＤＰ−７３４６およびＡＬ−ＤＰ−７５６１−ＡＬ−ＤＰ−７５６４（表１）ならびにＡＬ−ＤＰ−９２５０−ＡＬ−ＤＰ−９２８９（表２））の配列の１つに由来する少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の連続するヌクレオチドの部分的配列を含み、下記のＦＡＣＳアッセイにおけるＡｈａ遺伝子（例えば、Ａｈａ１遺伝子）の発現を阻害する能力が、全長配列を含むｄｓＲＮＡ由来の阻害の多くて５、１０、１５、２０、２５、または３０％相違するｄｓＲＮＡが、本発明によって意図される。
【００６６】
ＲＮＡｉ薬（ＡＬ−ＤＰ−７３０１−ＡＬ−ＤＰ−７３４６およびＡＬ−ＤＰ−７５６１−ＡＬ−ＤＰ−７５６４（表１）ならびにＡＬ−ＤＰ−９２５０−ＡＬ−ＤＰ−９２８９（表２））の標的配列内で切断するさらなるｄｓＲＮＡを、Ａｈａ１遺伝子配列および各標的配列を使用して容易に作製することができる。表１および表２に示したＲＮＡｉ薬は、ＲＮＡｉベースの切断に感受性を示すＡｈａ１ ｍＲＮＡ中の部位を同定する。そのようなものとして、本発明は、本発明の薬剤の１つによってターゲティングされる配列内でターゲティングするＲＮＡｉ薬を含む。本明細書中で使用される場合、ｄｓＲＮＡが第２のｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と相補的なｍＲＮＡ内のいずれかのメッセージを切断する場合、ｄｓＲＮＡは第２のｄｓＲＮＡの配列内でターゲティングするという。かかるｄｓＲＮＡは、一般に、Ａｈａ遺伝子をコードするｍＲＮＡ中の選択された配列に連続する領域から採取したさらなるヌクレオチド配列にカップリングした表１および表２中に示す配列の１つ由来の最小で５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも１８、または少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを有するであろう。例えば、標的Ａｈａ１遺伝子由来の次の６個のヌクレオチドと組み合わせたＡＬ−ＤＰ−７３０１の標的配列の３’側のほとんどの１５ヌクレオチドにより、表１および表２に示す配列の１つに基づく２１ヌクレオチドの一本鎖薬（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ａｇｅｎｔ）が産生される。
【００６７】
好ましくは、第２のｄｓＲＮＡを、適切なアッセイ（本明細書中に記載のアッセイなど）においてＡｈａ遺伝子の発現を阻害する一定の能力を有するｄｓＲＮＡ群から選択する。したがって、一定の好ましい実施形態では、第２のｄｓＲＮＡは、ＡＬ−ＤＰ−７３０１、ＡＬ−ＤＰ−７３０８、ＡＬ−ＤＰ−７３１８、ＡＬ−ＤＰ−７３２０、ＡＬ−ＤＰ−７３２２、ＡＬ−ＤＰ−７３２４、ＡＬ−ＤＰ−７３２５、ＡＬ−ＤＰ−７３２６、ＡＬ−ＤＰ−７３２７、ＡＬ−ＤＰ−７３２９、ＡＬ−ＤＰ−７３３１、ＡＬ−ＤＰ−７３３３、ＡＬ−ＤＰ−７３４０、ＡＬ−ＤＰ−７３４２、ＡＬ−ＤＰ−７３０３、ＡＬ−ＤＰ−７３０５、ＡＬ−ＤＰ−７３０７、ＡＬ−ＤＰ−７３０９、ＡＬ−ＤＰ−７３１６およびＡＬ−ＤＰ−７３３７、ＡＬ−ＤＰ−７３０４、ＡＬ−ＤＰ−７３１２、ＡＬ−ＤＰ−７３３９、ＡＬ−ＤＰ−７３４４、ＡＬ−ＤＰ−７３０６、ＡＬ−ＤＰ−７３１７、ＡＬ−ＤＰ−７３４６、ＡＬ−ＤＰ−７３１０、ＡＬ−ＤＰ−７３２３、ＡＬ−ＤＰ−７３３５、ＡＬ−ＤＰ−７３３８、ＡＬ−ＤＰ−７３４１、ＡＬ−ＤＰ−７３０２、ＡＬ−ＤＰ−７３１５、ＡＬ−ＤＰ−７３２８、ＡＬ−ＤＰ−７３３０、ＡＬ−ＤＰ−７３３６、ＡＬ−ＤＰ−７３４５、ＡＬ−ＤＰ−９２５０、ＡＬ−ＤＰ−９２５１、ＡＬ−ＤＰ−９２５２、ＡＬ−ＤＰ−９２５３、ＡＬ−ＤＰ−９２５４、ＡＬ−ＤＰ−９２５５、ＡＬ−ＤＰ−９２５６、ＡＬ−ＤＰ−９２５７、ＡＬ−ＤＰ−９２５８、ＡＬ−ＤＰ−９２５９、ＡＬ−ＤＰ−９２６０、ＡＬ−ＤＰ−９２６１、ＡＬ−ＤＰ−９２６２、ＡＬ−ＤＰ−９２６３、ＡＬ−ＤＰ−９２６４、ＡＬ−ＤＰ−９２６５、ＡＬ−ＤＰ−９２６６、ＡＬ−ＤＰ−９２６７、ＡＬ−ＤＰ−９２６８、ＡＬ−ＤＰ−９２６９、ＡＬ−ＤＰ−９２７０、ＡＬ−ＤＰ−９２７１、ＡＬ−ＤＰ−９２７２、ＡＬ−ＤＰ−９２７３、ＡＬ−ＤＰ−９２７４、ＡＬ−ＤＰ−９２７５、ＡＬ−ＤＰ−９２７６、ＡＬ−ＤＰ−９２７７、ＡＬ−ＤＰ−９２７９、ＡＬ−ＤＰ−９２８０、ＡＬ−ＤＰ−９２８１、ＡＬ−ＤＰ−９２８２、ＡＬ−ＤＰ−９２８３、ＡＬ−ＤＰ−９２８４、ＡＬ−ＤＰ−９２８５、ＡＬ−ＤＰ−９２８６、ＡＬ−ＤＰ−９２８７、ＡＬ−ＤＰ−９２８８およびＡＬ−ＤＰ−９２８９の群から選択される。
【００６８】
本発明のｄｓＲＮＡは、標的配列に対する１つ以上のミスマッチを含むことができる。好ましい実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、わずか３個のミスマッチを含む。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含む場合、ミスマッチ領域が相補領域の中央に存在しないことが好ましい。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含む場合、ミスマッチがいずれかの末端から５ヌクレオチド、例えば、相補領域の５’末端または３’末端のいずれか、好ましくは５’末端から５、４、３、２、または１ヌクレオチドに制限されることが好ましい。例えば、Ａｈａ遺伝子の相補領域である２３ヌクレオチドのｄｓＲＮＡ鎖について、ｄｓＲＮＡは、一般に、中央の１３ヌクレオチド内にいかなるミスマッチも含まない。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の１位または２位から９位または１０位（５’−３’に計算）の領域中にいかなるミスマッチも含まない。本発明に記載の方法を使用して、標的配列に対するミスマッチを含むｄｓＲＮＡがＡｈａ遺伝子発現の阻害に有効であるかどうかを決定することができる。特に、Ａｈａ遺伝子中の特定の相補領域が集団内に多形性の配列多様性を有することが公知である場合、Ａｈａ遺伝子発現の阻害におけるミスマッチを有するｄｓＲＮＡの有効性を考慮することが重要である。
【００６９】
１つの実施形態では、ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの末端は、１〜４個、一般に１個または２個のヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを有する。少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、その平滑末端対応物よりも予想外に優れた阻害特性を有する。さらに、本発明者らは、たった１つのヌクレオチドオーバーハングの存在が、その全体的な安定性に影響を及ぼすことなくｄｓＲＮＡの干渉活性を強化することを発見した。たった１つのオーバーハングを有するｄｓＲＮＡが、ｉｎ ｖｉｖｏならびに種々の細胞、細胞培養培地、血液、および血清中で特に安定且つ有効であることが証明された。一般に、一本鎖オーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端、あるいは、センス鎖の３’末端に存在する。ｄｓＲＮＡはまた、一般に、アンチセンス鎖の５’末端に存在する平滑末端を有することができる。かかるｄｓＲＮＡは、安定性および阻害活性が改良されているので、低投薬量（すなわち、５ｍｇ／ｋｇレシピエント体重／日未満）で投与することが可能である。一般に、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、５’末端は平滑末端である。別の実施形態では、オーバーハング中の１つ以上のヌクレオチドを、ヌクレオシドチオホスファートと置換する。
【００７０】
さらに別の実施形態では、安定性を増強するためにｄｓＲＮＡを化学修飾する。本発明の核酸を、当該分野で十分に確立されている方法（“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ら（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ（本明細書中で参照により援用される）に記載の方法など）によって合成および／または修飾することができる。本発明で有用な好ましいｄｓＲＮＡ化合物の具体例には、修飾骨格または非天然のヌクレオシド間結合を含むｄｓＲＮＡが含まれる。本明細書中で定義するように、修飾骨格を有するｄｓＲＮＡには、骨格中にリン原子が保持されたｄｓＲＮＡおよび骨格中にリン原子を持たないｄｓＲＮＡが含まれる。本明細書の目的のために、当該分野で時折参照されるように、そのヌクレオシド間骨格中にリン原子を持たない修飾ｄｓＲＮＡもオリゴヌクレオシドと見なすことができる。
【００７１】
好ましい修飾ｄｓＲＮＡ骨格には、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホナート（３’−アルキレンホスホナートおよびキラルホスホナートが含まれる）、ホスフィナート、ホスホルアミダート（３’−アミノホスホルアミダートおよびアミノアルキルホスホルアミダートが含まれる）、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに通常の３’−５’結合を有するボラノホスファート（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、これらの２’−５’結合アナログ、およびヌクレオシド単位の隣接対が３’−５’から５’−３’または２’−５’から５’−２’で結合した逆の極性を有するものが含まれる。種々の塩、混合塩、および遊離酸形態も含まれる。
【００７２】
上記のリン含有結合の調製を教示した代表的米国特許には、以下が含まれるが、これらに限定されない：米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９５号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３１６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；および同第５，６２５，０５０号（それぞれ本明細書中で参照により援用される）。
【００７３】
リン原子を中に含まない好ましい修飾ｄｓＲＮＡ骨格は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子、およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から一部形成される）を有する骨格；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファマート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホナートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合したＮ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ_２成分の一部を有する他の骨格が含まれる。
【００７４】
上記オリゴヌクレオシドの調製を教示した代表的米国特許には、以下が含まれるが、これらに限定されない：米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；および同第５，６７７，４３９号（それぞれ本明細書中で参照により援用される）。
【００７５】
他の好ましいｄｓＲＮＡ模倣物では、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合（すなわち、骨格）の両方を、新規の基と置換する。塩基単位を、適切な核酸標的化合物とのハイブリッド形成のために維持する。１つのかかるオリゴマー化合物（優れたハイブリッド形成特性を有することが示されているｄｓＲＮＡ模倣物）を、ペプチド核酸（ＰＮＡ）という。ＰＮＡ化合物では、ｄｓＲＮＡの糖骨格を、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格と置換する。核酸塩基を保持し、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示した代表的米国特許には、以下が含まれるが、これらに限定されない：米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号（それぞれ本明細書中で参照により援用される）。ＰＮＡ化合物のさらなる教示を、Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００で見出すことができる。
【００７６】
本発明の最も好ましい実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するｄｓＲＮＡおよびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシド、特に、上記で参照した米国特許第５，４８９，６７７号の−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｏ−ＣＨ_２−（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として公知）、−ＣＨ_２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−、および−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−ＣＨ_２−（式中、天然ホスホジエステル骨格を、−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ_２−として示す）および上記で参照した米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格である。上記で参照した米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有するｄｓＲＮＡも好ましい。
【００７７】
修飾ｄｓＲＮＡはまた、１つ以上の置換糖部分を含むことができる。好ましいｄｓＲＮＡは、２’位に以下のうちの１つを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル（式中、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキルまたはＣ_２〜Ｃ_１０アルケニル、およびアルキニルであり得る）。Ｏ［（ＣＨ_２）_ｎＯ］_ｍＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＯＮＨ_２、およびＯ（ＣＨ_２）_ｎＯＮ［（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３）］_２（式中、ｎおよびｍは、１〜約１０である）が特に好ましい。他の好ましいｄｓＲＮＡは、２’位に以下のうちの１つを含む：Ｃ_１〜Ｃ_１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル、またはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、介入物、ｄｓＲＮＡの薬物動態学的性質を改良するための基、ｄｓＲＮＡの薬力学的性質を改良するための基、および類似の性質を有する他の置換基。好ましい修飾には、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても公知）（Ｍａｒｔｉｎら，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４）（すなわち、アルコキシ−アルコキシ基）が含まれる。さらに好ましい修飾には、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ（すなわち、以下の実施例に記載のＯ（ＣＨ_２）_２ＯＮ（ＣＨ_３）_２基（２’−ＤＭＡＯＥとしても公知）および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該分野で、２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても公知）（すなわち、以下の実施例にも記載の２’−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_２）_２）が含まれる。
【００７８】
他の好ましい修飾には、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ_３），２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が含まれる。ｄｓＲＮＡ上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上または２’−５’結合ｄｓＲＮＡ中の糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位に類似の修飾を作製することもできる。ｄｓＲＮＡは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣物を有することもできる。かかる修飾糖構造の調製を教示した代表的な米国特許には、以下が含まれるが、これらに限定されない：米国特許第４，９８１，９５７号；同第５，１１８，８００号；同第５，３１９，０８０号；同第５，３５９，０４４号；同第５，３９３，８７８号；同第５，４４６，１３７号；同第５，４６６，７８６号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５１９，１３４号；同第５，５６７，８１１号；同第５，５７６，４２７号；同第５，５９１，７２２号；同第５，５９７，９０９号；同第５，６１０，３００号；同第５，６２７，０５３号；同第５，６３９，８７３号；同第５，６４６，２６５号；同第５，６５８，８７３号；同第５，６７０，６３３号；および同第５，７００，９２０号（そのいくつかは本願と共有され、それぞれその全体が本明細書中で参照により援用される）。
【００７９】
ｄｓＲＮＡには、核酸塩基（しばしば、当該分野で単純に「塩基」と呼ばれる）の修飾物または置換物も含まれ得る。本明細書中で使用される場合、「無修飾」または「天然」核酸塩基には、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾核酸塩基には、他の合成および天然の核酸塩基（５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、およびアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、および（ａｎａｌ）他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザ（ｄａａｚａ）アデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなど）が含まれる。さらなる核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示の核酸塩基、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に開示の核酸塩基、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３に開示の核酸塩基、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３に開示の核酸塩基が含まれる。これらの核酸塩基のいくつかは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性の増加に特に有用である。これらには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６、および０−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンが含まれる）が含まれる。５−メチルシトシン置換物は、０．６〜１．２℃で核酸二重鎖安定性を増加させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、現在好ましい塩基置換物であり、特に２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾物と組み合わせた場合、さらに好ましい塩基置換物である。
【００８０】
上記修飾核酸塩基および他の修飾核酸塩基のいくつかの調製を教示した代表的な米国特許には、以下が含まれるが、これらに限定されない：上記米国特許第３，６８７，８０８ならびに米国特許第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９４，１２１，５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；および同第５，６８１，９４１号（それぞれ、本明細書中で参照により援用される）および米国特許第５，７５０，６９２号（これも本明細書中で参照により援用される）。
【００８１】
本発明のｄｓＲＮＡの別の修飾は、ｄｓＲＮＡの活性、細胞分布、または細胞取り込みを増強する１つ以上の部分または抱合体のｄｓＲＮＡへの化学結合を含む。かかる部分には、コレステロール部分などの脂質部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９，８６，６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４ ４ １０５３−１０６０）、チオエーテル（例えば、ベリル−Ｓ−トリチルチオール）（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３−５３８）、脂肪族鎖（例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基）（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら，ＥＭＢＯ Ｊ，１９９１，１０，１１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９−５４）、リン脂質（例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチル−アンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホナート）（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４；Ｓｈｅａら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７−３７８３）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９−９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９−２３７）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３−９３７）が含まれるが、これらに限定されない。
【００８２】
かかるｄｓＲＮＡ抱合体の調製を教示した代表的な米国特許には、以下が含まれるが、これらに限定されない：米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７，５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１，５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３，５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８、および同第５，６８８，９４１号（それぞれ、本明細書中で参照により援用される）。
【００８３】
所与の化合物の全ての位置を均一に修飾する必要はなく、実際、１つを超える上記修飾を１つの化合物中、またはｄｓＲＮＡ内の１つのヌクレオシドにも組み込むことができる。本発明はまた、キメラ化合物であるｄｓＲＮＡ化合物を含む。本発明の文脈における「キメラ」ｄｓＲＮＡ化合物または「キメラ」は、ｄｓＲＮＡ化合物、特に、それぞれ少なくとも１つの単量体単位（すなわち、ｄｓＲＮＡ化合物の場合、ヌクレオチド）から構成される２つ以上の化学的に異なる領域を含むｄｓＲＮＡである。これらのｄｓＲＮＡは、典型的には、ｄｓＲＮＡのヌクレアーゼ分解耐性の増加、細胞取り込みの増加、および／または標的核酸に対する結合親和性の増加を付与するようにｄｓＲＮＡが修飾される少なくとも１つの領域を含む。ｄｓＲＮＡのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素の基質としての機能を果たし得る。一例として、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮアーゼＨの活性化により、ＲＮＡ標的が切断され、そにより、遺伝子発現のｄｓＲＮＡ阻害の効率性が非常に増大する。したがって、キメラｄｓＲＮＡを使用する場合、同一の標的領域とハイブリッド形成するホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して短いｄｓＲＮＡを使用してしばしば類似の結果を得ることができる。ＲＮＡ標的の切断を、当該分野で公知のゲル電気泳動および（必要に応じて）関連する核酸ハイブリッド形成技術によって日常的に検出することができる。
【００８４】
一定の例では、ｄｓＲＮＡを、非リガンド基によって修飾することができる。ｄｓＲＮＡの活性、細胞分布、または細胞取り込みを増強するために多数の非リガンド分子がｄｓＲＮＡに抱合されており、かかる抱合の実施手順は、科学文献から入手可能である。かかる非リガンド部分には、コレステロールなどの脂質部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、チオエーテル（例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール）（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、脂肪族鎖（例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基）（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０：１１１；Ｋａｂａｎｏｖら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９）、リン脂質（例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホナート）（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１；Ｓｈｅａら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）が含まれていた。かかるｄｓＲＮＡ抱合体の調製を教示した代表的な米国特許は、上記に列挙している。典型的な抱合プロトコールは、配列の１つ以上の位置にアミノリンカーを保有するｄｓＲＮＡの合成を含む。次いで、アミノ基を、適切なカップリング試薬または活性化試薬を使用して抱合された分子と反応させる。抱合反応を、固体支持体に依然として結合しているｄｓＲＮＡを用いるか、液相でのｄｓＲＮＡの切断後に行うことができる。ＨＰＬＣによるｄｓＲＮＡ抱合体の精製により、典型的には、純粋な抱合体が得られる。
【００８５】
ベクターコードＲＮＡｉ薬
本発明のｄｓＲＮＡを、ｉｎ ｖｉｖｏにて細胞内で組換えウイルスベクターから発現することもできる。本発明の組換えウイルスベクターは、本発明のｄｓＲＮＡをコードする配列およびｄｓＲＮＡ配列の発現のための任意の適切なプロモーターを含む。適切なプロモーターには、例えば、Ｕ６またはＨ１ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列およびサイトメガロウイルスプロモーターが含まれる。他の適切なプロモーターの選択は、当業者の範囲内である。本発明の組換えウイルスベクターは、特定の組織または特定の細胞内環境におけるｄｓＲＮＡ発現のための誘導性プロモーターまたは調節性プロモーターも含むことができる。本発明のｄｓＲＮＡをｉｎ ｖｉｖｏで細胞に送達させるための組換えウイルスベクターの使用を、以下でより詳細に考察する。
【００８６】
本発明のｄｓＲＮＡを、２つの個別の相補ＲＮＡ分子としてか２つの相補領域を有する１つのＲＮＡ分子として組換えウイルスベクターから発現することができる。
【００８７】
発現すべきｄｓＲＮＡ分子のコード配列を許容することができる任意のウイルスベクター（例えば、アデノウイルス（ＡＶ）；アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）；ヘルペスウイルス由来のベクターなど）を使用することができる。ウイルスベクターの向性を、他のウイルス由来のエンベロープタンパク質もしくは他の表面抗原を用いたベクターのシュードタイピングまたは必要に応じた異なるウイルスキャプシドタンパク質の置換によって修飾することができる。
【００８８】
例えば、本発明のレンチウイルスベクターを、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、モコラウイルスなど由来の表面タンパク質を使用してシュードタイピングすることができる。本発明のＡＡＶベクターを、異なるキャプシドタンパク質血清型を発現するようにベクターを操作することによって異なる細胞をターゲティングするように作製することができる。例えば、血清型２ゲノム上で血清型２キャプシドを発現するＡＡＶベクターを、ＡＡＶ２／２と呼ぶ。ＡＡＶ２／２ベクター中のこの血清型２キャプシド遺伝子を、血清型５キャプシド遺伝子と置換して、ＡＡＶ２／５ベクターを産生することができる。異なるキャプシドタンパク質血清型を発現するＡＡＶベクターの構築技術は、当業者の範囲内である。例えば、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ Ｊ Ｅら（２００２），Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：７９１−８０１（その開示全体が本明細書中で参照により援用される）を参照のこと。
【００８９】
本発明での使用に適切な組換えウイルスベクターの選択、ベクターにｄｓＲＮＡを発現するための核酸配列の挿入方法、および目的の細胞へのウイルスベクターの送達方法は、当業者の範囲内である。例えば、Ｄｏｒｎｂｕｒｇ Ｒ（１９９５），Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．２：３０１−３１０；Ｅｇｌｉｔｉｓ Ｍ Ａ（１９８８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６０８−６１４；Ｍｉｌｌｅｒ Ａ Ｄ（１９９０），Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．１：５−１４；Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｗ Ｆ（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２５−３０；およびＲｕｂｉｎｓｏｎ Ｄ Ａら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３：４０１−４０６（その開示全体が本明細書中で参照により援用される）を参照のこと。
【００９０】
好ましいウイルスベクターは、ＡＶおよびＡＡＶに由来するウイルスベクターである。特に好ましい実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡを、例えば、Ｕ６もしくはＨ１ ＲＮＡプロモーターまたはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのいずれかを含む組換えＡＡＶベクターから２つの個別の相補一本鎖ＲＮＡ分子として発現する。
【００９１】
本発明のｄｓＲＮＡの発現に適切なＡＶベクター、組換えＡＶベクターの構築方法、および標的細胞へのベクターの送達方法は、Ｘｉａ Ｈら（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６−１０１０に記載されている。
【００９２】
本発明のｄｓＲＮＡの発現に適切なＡＡＶベクター、組換えＡＶベクターの構築方法、および標的細胞へのベクターの送達方法は、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒら（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１；Ｆｉｓｈｅｒ Ｋ Ｊら（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７０：５２０−５３２；Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒら（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２６；米国特許第５，２５２，４７９；米国特許第５，１３９，９４１；国際特許出願番号ＷＯ ９４／１３７８８；および国際特許出願番号ＷＯ ９３／２４６４１（その全開示が、本明細書中で参照により援用される）に記載されている。
【００９３】
ｄｓＲＮＡを含む薬学的組成物
１つの実施形態では、本発明は、本明細書中に記載のｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。ｄｓＲＮＡを含む薬学的組成物は、Ａｈａ遺伝子の発現または活性に関連する疾患または障害（Ａｈａ１発現によって媒介される病理学的過程など）の治療に有用である。かかる薬学的組成物を、送達様式に基づいて処方する。１つの例は、非経口送達による全身投与のために処方した組成物である。
【００９４】
本発明の薬学的組成物を、Ａｈａ遺伝子発現の阻害に十分な投薬量で投与する。本発明者らは、その改良された効率により、本発明のｄｓＲＮＡを含む組成物を、驚くべき低投薬量で投与することができることを見出した。５ｍｇｄｓＲＮＡ／ｋｇレシピエント体重／日の最大投薬量で、Ａｈａ遺伝子の発現を阻害するか完全に抑制するのに十分である。
【００９５】
一般に、ｄｓＲＮＡの適切な用量は、０．０１μｇ〜５．０ｍｇ／ｋｇレシピエント体重／日、一般に、１μｇ〜１ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲であろう。薬学的組成物を、１日１回投与することができるか、ｄｓＲＮＡを、１日を通して２回、３回、またはそれを超える部分用量（ｓｕｂ−ｄｏｓｅｓ）として適切な間隔で投与することができるか、持続注入または制御放出処方物による送達を使用しても投与することができる。その場合、各部分用量に含まれるｄｓＲＮＡは、総１日投薬量を達成するために相応に小さくなければならない。例えば、数日間にわたってｄｓＲＮＡを徐放する従来の徐放処方物を使用して、数日間にわたる送達のために投薬単位を混合することもできる。徐放処方物は当該分野で周知であり、特に、薬剤（本発明の薬剤と共に使用することができる薬剤など）の膣内送達に有用である。この実施形態では、投薬単位は、対応する複数の１日量を含む。
【００９６】
当業者は、一定の要因（疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の一般的な健康状態および／または年齢、ならびに他の疾患の存在が含まれるが、これらに限定されない）が対象を有効に治療するために必要な投薬量およびタイミングに影響を及ぼし得ることを認識するであろう。さらに、治療有効量の組成物での対象の治療には、単一の治療または一連の治療が含まれ得る。本発明に含まれる各ｄｓＲＮＡの有効投薬量およびｉｎ ｖｉｖｏ半減期を、本明細書中の他の場所に記載の従来の方法を使用するか適切な動物モデルを使用したｉｎ ｖｉｖｏ試験に基づいて評価することができる。
【００９７】
マウス遺伝学の進歩により、種々のヒト疾患（Ａｈａ発現によって媒介される病理学的過程など）の研究のための多数のマウスモデルが得られている。かかるモデルを、ｄｓＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ試験および治療有効用量の決定のために使用する。
【００９８】
本発明はまた、本発明のｄｓＲＮＡ化合物を含む薬学的組成物および処方物を含む。本発明の薬学的組成物を、局所または全身投与のいずれが望ましいか、および治療すべき領域に応じて多数の方法で投与することができる。投与は、局所、肺（例えば、粉末またはエアゾールの吸入または吹送（噴霧器が含まれる））、気管内、鼻腔内、上皮および経皮、経口、または非経口であり得る。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内への注射または注入、または頭蓋内（例えば、髄腔内または脳室内）投与が含まれる。
【００９９】
局所投与のための薬学的組成物および処方物には、経皮貼布、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴薬、座剤、スプレー、液体、および粉末が含まれ得る。従来の薬学的キャリア、水溶液、粉末、または油性の基剤、および増粘剤などが必要であり得るか望ましいかもしれない。コーティングされたコンドームおよびグローブなども有用であり得る。好ましい局所処方物には、本発明のｄｓＲＮＡが脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤、および界面活性剤などの局所送達薬との混合物中に存在する局所処方物が含まれる。好ましい脂質およびリポソームには、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン＝ＤＯＰＥ、ジミリストイルホスファチジルコリン＝ＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰イオン性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロール＝ＤＭＰＧ）、および陽イオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピル＝ＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン＝ＤＯＴＭＡ）が含まれる。本発明のｄｓＲＮＡを、リポソーム内にカプセル化することができるか、リポソーム、特に陽イオン性リポソームと複合体を形成することができる。あるいは、ｄｓＲＮＡを、脂質、特に、陽イオン性脂質と複合体化することができる。好ましい脂肪酸およびエステルには、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプラート、トリカプラート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプラート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ_１〜１０アルキルエステル（例えば、ミリスチン酸イソプロピル、ＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド、またはその薬学的に許容可能な塩が含まれるが、これらに限定されない。局所処方物は、１９９９年５月２０日に出願された米国特許出願番号０９／３１５，２９８号（その全体が本明細書中で参照により援用される）に詳述されている。
【０１００】
経口投与のための組成物および処方物には、粉末または顆粒、微粒子、ナノ粒子、水または非水性媒質の懸濁液または溶液、カプセル、ゲルカプセル、サシェ、錠剤、またはミニタブレット（ｍｉｎｉｔａｂｌｅｔ）が含まれる。増粘剤、香味物質、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が望ましいかもしれない。好ましい経口処方物は、本発明のｄｓＲＮＡを１つ以上の浸透増強剤、界面活性剤、およびキレート剤と併せて投与する処方物である。好ましい界面活性剤には、脂肪酸および／またはそのエステルもしくは塩、胆汁酸および／またはその塩が含まれる。好ましい胆汁酸／塩には、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸（ｇｌｕｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、グリコール酸（ｇｌｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシド酸ナトリウムおよびグリコジヒドロフシド酸ナトリウムが含まれる。好ましい脂肪酸には、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプラート、トリカプラート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプラート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセリド、ジグリセリド、またはその薬学的に許容可能な塩（たとえば、ナトリウム）が含まれる。浸透増強剤の組み合わせ（例えば、胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩）も好ましい。特に好ましい組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸、およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらなる浸透増強剤には、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが含まれる。本発明のｄｓＲＮＡを、顆粒形態（噴霧乾燥粒子が含まれる）で経口送達させることができるか、複合体化して微粒子またはナノ粒子を形成することができる。ｄｓＲＮＡ錯化剤には、ポリアミノ酸；ポリイミン；ポリアクリラート；ポリアルキルアクリラート、ポリオキシエタン（ｐｏｌｙｏｘｅｔｈａｎｅ）、ポリアルキルシアノアクリラート；カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリラート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびデンプン；ポリアルキルシアノアクリラート；ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン、汚染物質、セルロース、およびデンプンが含まれる。特に好ましい錯化剤には、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレン Ｐ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリラート）、ポリ（エチルシアノアクリラート）、ポリ（ブチルシアノアクリラート）、ポリ（イソブチルシアノアクリラート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリラート）、ＤＥＡＥ−メタクリラート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリラート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミンおよびＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリラート、ポリヘキシルアクリラート、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギナート、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。ｄｓＲＮＡの経口処方物およびその調製は、米国特許出願番号０８／８８６，８２９号（１９９７年７月１日出願）、米国特許出願番号０９／１０８，６７３号（１９９８年７月１日出願）、米国特許出願番号０９／２５６，５１５号（１９９９年２月２３日出願）、米国特許出願番号０９／０８２，６２４号（１９９８年５月２１日）、および米国特許出願番号０９／３１５，２９８号（１９９９年５月２０日出願）（それぞれ、その全体が本明細書中で参照により援用される）に詳述されている。
【０１０１】
非経口投与、髄腔内投与、または脳室内投与のための組成物および処方物は、緩衝液、希釈剤、および他の適切な添加剤（浸透増強剤，キャリア化合物、および他の薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤などであるが、これらに限定されない）も含むことができる滅菌水溶液を含むことができる。
【０１０２】
本発明の薬学的組成物には、溶液、乳濁液、およびリポソーム含有処方物が含まれるが、これらに限定されない。これらの組成物を、種々の成分（事前に形成した液体、自己乳化固体、および自己乳化半固体が含まれるが、これらに限定されない）から生成することができる。
【０１０３】
単位投薬形態で都合良く存在することができる本発明の薬学的処方物を、製薬産業で周知の従来技術にしたがって調製することができる。かかる技術は、有効成分を薬学的キャリアまたは賦形剤と組み合わせる工程を含む。一般に、処方物を、有効成分を液体キャリアまたは微粉化固体キャリアまたはその両方と均一且つ緊密に組み合わせ、次いで、必要に応じて、生成物を成形することによって調製する。
【０１０４】
本発明の組成物を、多数の可能な投薬形態（錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、ソフトゲル、座剤、および浣腸剤などであるが、これらに限定されない）のいずれかに処方することができる。本発明の組成物を、水性媒質、非水性媒質、または混合媒質の懸濁液として処方することもできる。水性懸濁液は、懸濁液の粘度を増大させる物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランが含まれる）をさらに含むことができる。懸濁液は、安定剤も含むことができる。
【０１０５】
本発明の１つの実施形態では、薬学的組成物を処方し、フォームとして使用することができる。薬学的フォームには、乳濁液、マイクロエマルジョン、クリーム、ゼリー、およびリポソームなどの処方物が含まれるが、これらに限定されない。性質上基本的に類似する一方で、これらの処方物は、最終精製物の成分および一貫性が異なる。かかる組成物および処方物の調製は、一般に、薬学分野および処方分野の当業者に公知であり、本発明の組成物の処方に適用することができる。
【０１０６】
乳濁液
本発明の組成物を、乳濁液として調製し、処方することができる。乳濁液は、典型的には、通常、直径０．１μｍを超える液滴形態の一方の液体が他方の液体に分散した不均一系である（Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｐ．３３５；Ｈｉｇｕｃｈｉら，ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．３０１）。乳濁液は、しばしば、相互に緊密に混合し、分散させた２つの不混和性液相を含む二相系である。一般に、乳濁液は、油中水滴型（ｗ／ｏ）または水中油滴型（ｏ／ｗ）のいずれかであり得る。水相が細かく分割し、微小液滴として大量の油相に分散される場合、得られた組成物を油注水滴型（ｗ／ｏ）乳濁液と呼ぶ。あるいは、油相が細かく分割し、微小液滴として大量の水相に分散される場合、得られた組成物を水中油滴型（ｏ／ｗ）乳濁的と呼ぶ。乳濁液は、分散相に加えてさらなる成分および水相、油相のいずれかの溶液としてか、それ自体が個別の相として存在することができる活性薬（ａｃｔｉｖｅ ｄｒｕｇ）を含むことができる。薬学的賦形剤（乳化剤、安定剤、色素、および抗酸化剤など）は、必要に応じて乳濁的中に存在することもできる。薬学的乳濁液はまた、２つを超える相から構成される多相乳濁液（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ）であり得る（例えば、油−水−油（ｏ／ｗ／ｏ）乳濁液および水−油−水（ｗ／ｏ／ｗ）乳濁液の場合など）。かかる複合処方物（ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は、しばしば、単純な二成分乳濁液では得られない一定の利点が得られる。ｏ／ｗ乳濁液の各油滴が小さな水滴を取り囲んだ多相乳濁液は、ｗ／ｏ／ｗ乳濁液を構成する。同様に、油性連続系中に安定化された水小球中に取り囲まれた油滴の系により、ｏ／ｗ／ｏ乳濁液が得られる。
【０１０７】
乳濁液は、熱力学的安定性がほとんどないか全くないことによって特徴づけられる。しばしば、乳濁液の分散相または不連続相は、外相または連続相に十分に分散されており、乳化剤または処方物の粘度によってこの形態が維持される。乳濁液のいずれかの相は、乳濁液型軟膏基剤およびクリームの場合のように半固体または固体であり得る。乳濁液の他の安定化手段は、乳濁液のいずれかの相に組み込むことができる乳化剤の使用を必要とする。乳化剤は、以下の４つのカテゴリーに大きく分類することができる：合成界面活性剤、天然に存在する乳濁液、吸収基剤、微細分散した固体（Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。
【０１０８】
表面活性剤としても公知の合成界面活性剤は、乳濁液の処方で広範な適用性があることが見出されており、文献で概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。界面活性剤は、典型的には、両親媒性であり、親水性部分および疎水性部分を含む。界面活性剤の疎水性に対する親水性の比は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と呼ばれており、処方物の調製における界面活性剤の分類および選択での有益なツールである。界面活性剤を、以下の親水基の性質に基づいて異なるクラスに分類することができる：非イオン性、陰イオン性、陽イオン性、および両性（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５）。
【０１０９】
乳濁液処方で使用される天然に存在する乳化剤には、ラノリン、蜜蝋、ホスファチド、レシチン、およびアカシアが含まれる。吸収基剤は、水を吸い上げてｗ／ｏ乳濁液を形成するが一貫して半固体を保持するような親水性を有する（無水ラノリンおよび親水性ペトロラタムなど）。特に界面活性剤と組み合わせた粘性調製物中の良好な乳化剤として微粉化固体も使用されている。これらには、極性無機固体（重金属水酸化物など）、非膨潤クレイ（ベントナイト、アタパルガイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウム、およびコロイド状ケイ酸アルミニウムマグネシウムなど）、色素、および非極性固体（炭素またはトリステアリン酸グリセリルなど）が含まれる。
【０１１０】
多種多様な非乳化物質も乳濁液処方物に含まれ、乳濁液の性質に寄与する。これらには、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、保湿剤、親水コロイド、防腐剤、および抗酸化剤が含まれる（Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。
【０１１１】
親水コロイドまたはハイドロコロイドには、天然に存在するゴムおよび合成ポリマー（ポリサッカリド（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラギーナン、グアガム、カラヤゴム、およびトラガカント）など）、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、および合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）が含まれる。これらは、水中で分散または膨潤してコロイド溶液を形成し、分散相の液滴周囲に強い界面薄膜を形成し、外相の粘度が増大することによって乳濁液を安定化する。
【０１１２】
乳濁液は、しばしば、微生物の成長を容易に支持することができる多数の成分（炭水化物、タンパク質、ステロール、およびホスファチドなど）を含むので、これらの処方物に、しばしば、防腐剤を組み込む。乳濁液処方物中に含まれる一般的に使用される防腐剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、第四級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびホウ酸が含まれる。一般に、処方物の劣化を回避するために、乳濁液処方物に抗酸化剤も添加する。使用される抗酸化剤は、フリーラジカルスカベンジャー（トコフェロールなど）、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、または還元剤（アスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムなど）、および抗酸化共力剤（クエン酸、酒石酸、およびレシチン）であり得る。
【０１１３】
皮膚、経口、および非経口経路を介した乳濁液処方物の適用およびその製造方法は、文献に概説されている（Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。経口送達用の乳濁液処方物は、処方の容易さならびに吸収および生体利用能の観点からの有効性により、非常に広範に使用されている（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。そのうち、鉱物油基剤の緩下薬、油溶性ビタミン、および高脂肪栄養調製物は、一般にｏ／ｗ乳濁液として投与される材料である。
【０１１４】
本発明の１つの実施形態では、ｄｓＲＮＡおよび核酸の組成物を、マイクロエマルジョンとして処方する。マイクロエマルジョンを、単一の光学的に等方性であり、熱力学的に安定な溶液である水、油、および両親媒性物質の系と定義することができる（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５）。典型的には、マイクロエマルジョンは、最初に界面活性剤水溶液中に油を分散させ、次いで十分な量の第４の成分（一般に、中鎖アルコール）を添加して透明な系を形成することによって調製される系である。したがって、マイクロエマルジョンは、界面活性分子の界面薄膜によって安定される２つの不混和性液体の熱力学的に安定な等方性に透明な分散物とも説明されている（ＬｅｕｎｇおよびＳｈａｈ，ｉｎ：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．，Ｅｄ．，１９８９，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ １８５−２１５）。マイクロエマルジョンを、一般に、油、水、界面活性剤、共界面活性剤（ｃｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）、および電解質を含む３〜５つの成分の組み合わせによって調製する。マイクロエマルジョンが油中水滴型（ｗ／ｏ）または水中油滴型（ｏ／ｗ）に由来するかどうかは、使用した油および界面活性剤の性質ならびに界面活性分子の極性頭部（ｐｏｌａｒ ｈｅａｄ）および炭化水素テールの構造および幾何学的充填（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ｐａｃｋｉｎｇ）に依存する（Ｓｃｈｏｔｔ，ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．２７１）。
【０１１５】
状態図を使用した現象論的アプローチは広範に研究されており、当業者は、マイクロエマルジョンの処方方法についての包括的知識を得ている（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５）。従来の乳濁液と比較して、マイクロエマルジョンは、自発的に形成される熱力学的に安定な液滴の処方において不水溶性薬物が可溶化するという利点が得られる。
【０１１６】
マイクロエマルジョンの調製で使用される界面活性剤には、単独または共界面活性剤と組み合わせたイオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウラート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレアート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレアート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレアート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプラート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレアート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセスキオレアート（ｄｅｃａｇｌｙｃｅｒｏｌ ｓｅｑｕｉｏｌｅａｔｅ）（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレアート（ＤＡＯ７５０）が含まれるが、これらに限定されない。共界面活性剤は、通常、短鎖アルコール（エタノール、１−プロパノール、および１−ブタノールなど）であり、界面活性薄膜（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｆｉｌｍ）への透過およびそれによる界面活性分子間に生成された空隙による不規則な薄膜の作製によって界面流動性を増大するのに役立つ。しかし、マイクロエマルジョンを、共界面活性剤を使用することなく調製することができ、無アルコール自己乳化マイクロエマルジョン系が当該分野で公知である。水相は、典型的には、水、薬物の水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコールの誘導体であり得るが、これらに限定されない。油相には、Ｃａｐｔｅｘ３００、Ｃａｐｔｅｘ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ_８〜Ｃ_１２）モノ、ジ、およびトリ−グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ_８〜Ｃ_１０グリセリド、植物油、およびシリコーン油などの材料が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０１１７】
マイクロエマルジョンは、薬物可溶化および薬物吸収の増強の観点から特に興味深い。脂質ベースのマイクロエマルジョン（ｏ／ｗおよびｗ／ｏの両方）は、薬物（ペプチドが含まれる）の経口生体利用性を増強すると提案されている（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓら，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５−１３９０；Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９３，１３，２０５）。マイクロエマルジョンは、薬物可溶化の改良、酵素加水分解からの薬物の保護、界面活性剤に誘導された膜流動性および膜透過性の変化に起因する薬物吸収の増強可能性、調製の容易さ、固体投薬形態を超える経口投与の容易さ、臨床効力（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｏｔｅｎｃｙ）の改善、および毒性の減少という利点を付与した（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓら，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５；Ｈｏら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５，１３８−１４３）。しばしば、マイクロエマルジョンは、その成分が周囲温度で合わされた場合に自発的に形成することができる。これは、特に、熱不安定性薬物、ペプチド、またはｄｓＲＮＡを処方する場合に有利であり得る。マイクロエマルジョンは、美容的および薬学的適用の両方での有効成分の経皮送達でも有効である。本発明のマイクロエマルジョン組成物および処方物が、胃腸管からのｄｓＲＮＡおよび核酸の全身吸収の増大を促進し、胃腸管、膣、口腔、および他の投与領域内でのｄｓＲＮＡおよび核酸の局所細胞取り込みを改良すると予想される。
【０１１８】
本発明のマイクロエマルジョンはまた、処方物の性質を改善し、本発明のｄｓＲＮＡおよび核酸の吸収を増大するためのさらなる成分および添加物（ソルビタンモノステアラート（Ｇｒｉｌｌ ３）、Ｌａｂｒａｓｏｌ、および浸透増強剤など）を含むことができる。本発明のマイクロエマルジョンで使用される浸透増強剤を、以下の５つの広範なカテゴリーの１つに属するように分類することができる：界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、及び非キレート化非界面活性剤（Ｌｅｅら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。これらの各クラスは、上記で考察されている。
【０１１９】
リポソーム
薬物の処方のために研究および使用されているマイクロエマルジョンに加えて、多数の組織化された界面活性剤の構造が存在する。これらには、単分子層、ミセル、二分子層、および小胞が含まれる。リポソームなどの小胞は、薬物送達の観点から、それらの持つ特異性および作用の持続時間により、非常に関心を引いた。本発明で使用される場合、用語「リポソーム」は、球状二分子層に配置された両親媒性脂質から構成される小胞を意味する。
【０１２０】
リポソームは、親油性材料および水性内部から形成される膜を有する単層および多層の小胞である。水性部分は、送達すべき成分を含む。陽イオン性リポソームは、細胞壁と融合することができるという利点を有する。非陽イオン性リポソームは、細胞壁と有効に融合することができないが、ｉｎ ｖｉｖｏでマクロファージによって取り込まれる。
【０１２１】
インタクトな哺乳動物の皮膚を通過するために、脂質小胞は、適切な経皮勾配の影響下でそれぞれ直径５０ｎｍ未満の一連の細孔を通過しなければならない。したがって、高度に変形可能であり、且つかかる細孔を通過することができるリポソームを使用することが望ましい。
【０１２２】
リポソームのさらなる利点には、以下が含まれる：天然リン脂質から得たリポソームは生体適合性および生分解性を示すこと、リポソームは広範な水溶性および脂溶性の薬物を組み込むことができること、リポソームは、その内部区画中にカプセル化された薬物を代謝および分解から保護することができること（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５）。リポソーム処方物の調製における重要な検討事項は、リポソームの脂質表面の電荷、小胞サイズ、および水容積（ａｑｕｅｏｕｓ ｖｏｌｕｍｅ）である。
【０１２３】
リポソームは、作用部位への有効成分の輸送および送達に有用である。リポソーム膜が生体膜と構造的に類似しているので、リポソームを組織に適用する場合、リポソームは細胞膜と融合し始め、リポソームと細胞の融合が進行するにつれて、リポソーム内容物は細胞に流入し、細胞で活性成分（ａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）が作用することができる。
【０１２４】
リポソーム処方物は、多数の薬物のための送達様式として広範な調査の焦点である。局所投与のために、リポソームは、他の処方物を超えるいくつかの利点を提供するという証拠が増加している。かかる利点には、投与した薬物の全身吸収の高さに関連する副作用の軽減、投与した薬物の所望の標的での蓄積の増加、および広範な薬物（親水性および疎水性の両方）の皮膚への投与能力が含まれる。
【０１２５】
いくつかの報告により、リポソームが薬剤（高分子量ＤＮＡが含まれる）を皮膚に送達する能力が詳述されている。鎮痛薬、抗体、ホルモン、および高分子量ＤＮＡを含む化合物を、皮膚に投与した。適用の大部分が、表皮上層がターゲティングされた。
【０１２６】
リポソームは、２つの広範なクラスに分類される。陽イオン性リポソームは正電荷のリポソームであり、負電荷のＤＮＡ分子と相互作用して安定な複合体を形成する。正電荷のＤＮＡ／リポソーム複合体は、負電荷の細胞表面に結合し、エンドソーム中に内在化する。エンドソーム内の酸性ｐＨにより、リポソームが破裂し、その内容物が細胞質に放出される（Ｗａｎｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８７，１４７，９８０−９８５）。
【０１２７】
ｐＨ感受性または負電荷のリポソームは、ＤＮＡと複合体化するよりもむしろＤＮＡを捕捉する。ＤＮＡおよび脂質の両方が同様に荷電しているので、複合体形成よりもむしろ反発が起こる。それにもかかわらず、いくつかのＤＮＡは、これらのリポソームの水性内部に捕捉される。ｐＨ感受性リポソームを使用して、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを培養物中の細胞単層に送達した。外因性遺伝子の発現を、標的細胞中で検出した（Ｚｈｏｕら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９２，１９，２６９−２７４）。
【０１２８】
１つの主なリポソーム組成物型には、天然に誘導されたホスファチジルコリン以外のリン脂質が含まれる。中性リポソーム組成物を、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。陰イオン性リポソーム組成物を、一般に、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成する一方で、陰イオン性融合誘導リポソームを、主に、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成する。別のリポソーム組成物型を、ホスファチジルコリン（ＰＣ）（例えば、ダイズＰＣおよびタマゴＰＣなど）から形成する。別の型を、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成する。
【０１２９】
いくつかの研究により、リポソーム薬処方物の皮膚への局所送達を評価した。インターフェロンを含むリポソームのモルモット皮膚への適用により、皮膚ヘルペスの疼痛が軽減された一方で、他の手段（例えば、溶液または乳濁液として）を介したインターフェロンの送達は効果が無かった（Ｗｅｉｎｅｒら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，２，４０５−４１０）。さらに、さらなる研究により、水系を使用したインターフェロンの投与に対するリポソーム処方物の一部として投与されたインターフェロンの有効性を試験し、リポソーム処方物が水性投与よりも優れていると結論づけられた（ｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓら，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９２，１８，２５９−２６５）。
【０１３０】
非イオン性リポソーム系、特に、非イオン性界面活性剤およびコレステロールを含む系も試験し、皮膚への薬物の送達におけるその有用性を決定した。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（グリセリルジラウラート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム処方物を使用して、シクロスポリン−Ａをマウス皮膚の真皮に送達させた。結果は、かかる非イオン性リポソーム系が異なる皮膚層へのシクロスポリン−Ａの沈積の促進に有効であることが示された（Ｈｕら、Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，１９９４，４，６，４６６）。
【０１３１】
リポソームには、「立体的に安定化された」リポソームも含まれ、この用語は、本明細書中で使用される場合、リポソーム中に組み込まれた場合、かかる特殊化脂質を欠くリポソームと比較して循環半減期が増強される１つ以上の特殊化脂質を含むリポソームをいう。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞形成脂質部分（Ａ）の一部が１つ以上の糖脂質（モノシアロガングリオシド、Ｇｍ１）を含むか、（Ｂ）が１つ以上の親水性ポリマー（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分など）を用いて誘導体化されるリポソームである。いかなる特定の理論に拘束されることも望まないが、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ誘導体化脂質を含む少なくとも立体的に安定化されたリポソームについて、これらの立体的に安定化されたリポソームの循環半減期の増強が、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞への取り込みの減少に由来すると当該分野で考えられる（Ａｌｌｅｎら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８７，２２３，４２；Ｗｕら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９３，５３，３７６５）。
【０１３２】
１つ以上の糖脂質を含む種々のリポソームは、当該分野で公知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８７，５０７，６４）は、モノシアロガングリオシド（Ｇｍ１）、硫酸ガラクトセレブロシド、およびホスファチジルイノシトールがリポソームの血中半減期を改善する能力を報告した。これらの所見は、Ｇａｂｉｚｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８８，８５，６９４９）に詳述されている。米国特許第４，８３７，０２８号およびＷＯ８８／０４９２４号（共に、Ａｌｌｅｎら）は、（１）スフィンゴミエリンおよび（２）ガングリオシド（Ｇｍ１）またはガラクトセレブロシドの硫酸エステルを含むリポソームを開示している。米国特許第５，５４３，１５２号（Ｗｅｂｂら）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示している。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、ＷＯ９７／１３４９９号（Ｌｉｍら）に開示されている。
【０１３３】
１つ以上の親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含む多数のリポソームおよびその調製方法は、当該分野で公知である。Ｓｕｎａｍｏｔｏら（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，１９８０，５３，２７７８）は、ＰＥＧ部分を含む非イオン性界面活性剤２Ｃ_{１２１５Ｇ}を含むリポソームを記載している。Ｉｌｌｕｍら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９８４，１６７，７９）は、高分子グリコールでのポリスチレン粒子の親水性コーティングによって血中半減期が有意に増強されることに注目した。ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）のカルボン酸基の結合によって修飾された合成リン脂質は、Ｓｅａｒｓ（米国特許第４，４２６，３３０号および同第４，５３４，８９９号）に記載されている。Ｋｌｉｂａｎｏｖら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２６８，２３５）は、ＰＥＧまたはステアリン酸ＰＥＧで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームが血中循環半減期を有意に増大させることを証明する実験を記載している。Ｂｌｕｍｅら（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，９１）は、かかる所見を他のＰＥＧ誘導体化リン脂質（例えば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）とＰＥＧとの組み合わせから形成されたＤＳＰＥ−ＰＥＧ）に拡大した。その外部表面上に共有結合したＰＥＧ部分を有するリポソームは、Ｆｉｓｈｅｒの欧州特許第ＥＰ０４４５１３１Ｂ１およびＷＯ９０／０４３８４号（Ｆｉｓｈｅｒ）に記載されている。１〜２０モルパーセントのＰＥＧで誘導体化されたＰＥを含むリポソーム組成物およびその使用方法は、Ｗｏｏｄｌｅら（米国特許第５，０１３，５５６および同第５，３５６，６３３号）およびＭａｒｔｉｎら（米国特許第５，２１３，８０４号および欧州特許第ＥＰ０４９６８１３Ｂ１号）によって記載されている。多数の他の脂質−ポリマー抱合体を含むリポソームは、ＷＯ９１／０５５４５号および米国特許第５，２２５，２１２号（共にＭａｒｔｉｎら）ならびにＷＯ９４／２００７３号（Ｚａｌｉｐｓｋｙら）に開示されている。ＰＥＧ修飾セラミド脂質を含むリポソームは、ＷＯ９６／１０３９１号（Ｃｈｏｉら）に記載されている。米国特許第５，５４０，９３５号（Ｍｉｙａｚａｋｉら）および米国特許第５，５５６，９４８号（Ｔａｇａｗａら）は、その表面上の官能部分でさらに誘導体化することができるＰＥＧ含有リポソームを記載している。
【０１３４】
核酸を含む限定された数のリポソームが当該分野で公知である。ＴｈｉｅｒｒｙらのＷＯ９６／４００６２号は、リポソーム中への高分子量の核酸のカプセル化方法を開示している。Ｔａｇａｗａらの米国特許第５，２６４，２２１号は、タンパク質結合リポソームを開示し、かかるリポソームの内容物がｄｓＲＮＡを含むことができると強く主張している。Ｒａｈｍａｎらの米国特許第５，６６５，７１０は、リポソーム中へのオリゴデオキシヌクレオチドの一定のカプセル化方法を記載している。ＬｏｖｅらのＷＯ９７／０４７８７号は、ｒａｆ遺伝子にターゲティングしたｄｓＲＮＡを含むリポソームを開示している。
【０１３５】
トランスフェルソーム（Ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ）は、さらに別のリポソーム型であり、高度に変形可能な脂質凝集体であり、薬物送達ビヒクルの魅力的な候補である。トランスフェルソームは、液滴より小さな孔を容易に透過することができる非常に高度に変形可能な脂質液滴と説明することができる。トランスフェルソームは、これが使用される環境に適合することができる。例えば、トランスフェルソームは、自己最適化し（皮膚内の孔の形状に適合する）、自己修復性を示し、断片化することなく頻繁に標的に到達し、しばしば、自己負荷される（ｓｅｌｆ−ｌｏａｄｉｎｇ）。トランスフェルソームを作製するために、表面輪部アクチベーター（ｓｕｒｆａｃｅ ｅｄｇｅ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、（通常、界面活性剤）を標準的なリポソーム組成物に添加することが可能である。トランスフェルソームを使用して、血清アルブミンを皮膚に送達させた。血清アルブミンのトランスフェルソーム媒介送達は、血清アルブミンを含む溶液の皮下注射と同等に有効であることが示されている。
【０１３６】
界面活性剤は、乳濁液（マイクロエマルジョンが含まれる）およびリポソームなどの処方物で広範に適用されている。多数の異なる界面活性剤型（天然および合成の両方）の性質の最も一般的な分類および順位付け方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用による方法である。親水基（「頭部（ｈｅａｄ）としても公知」）の性質により、処方物中で使用される異なる界面活性剤の最も有用な分類方法が得られる（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
【０１３７】
界面活性剤分子がイオン化されない場合、これを非イオン性界面活性剤と分類する。非イオン性界面活性剤は、医薬品および化粧品で広範に適用され、広範なｐＨ値で使用可能である。一般に、そのＨＬＢ値は、その構造に応じて、２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤には、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシル化エステルなどの非イオン性エステルが含まれる。非イオン性アルカノールアミドおよびエーテル（脂肪アルコールエトキシラート、プロポキシル化アルコール、およびエトキシル化／プロポキシル化ブロック重合体など）もこのクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤クラスの最も一般的なメンバーである。
【０１３８】
水に溶解または分散した場合に界面活性剤分子が負電荷を有する場合、界面活性剤を陰イオン性に分類する。陰イオン性界面活性剤には、カルボキシラート（セッケンなど）、アシルラクチラート、アミノ酸のアシルアミド、硫酸のエステル（アルキルスルファートおよびエトキシル化アルキルスルファートなど）、スルホナート（アルキルベンゼンスルホナートなど）、アシルイセチオナート、アシルタウラートおよびスルホスクシナート、およびホスファートが含まれる。陰イオン性界面活性剤クラスの最も重要なメンバーは、アルキルスルファートおよびセッケンである。
【０１３９】
水に溶解または分散した場合に界面活性剤分子が正電荷を有する場合、界面活性剤を陽イオン性に分類する。陽イオン性界面活性剤には、第四級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンが含まれる。第四級アンモニウム塩は、このクラスの最も使用されているメンバーである。
【０１４０】
界面活性剤分子が正電荷または負電荷のいずれかを有する能力を有する場合、界面活性剤を両性に分類する。両性界面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン、およびホスファチドが含まれる。
【０１４１】
製剤、処方物、および乳濁液中の界面活性剤の使用は、概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
【０１４２】
浸透増強剤
１つの実施形態では、本発明は、核酸、特にｄｓＲＮＡを動物の皮膚に効率的に送達させるための種々の浸透増強剤を使用する。ほとんどの薬物は、イオン化形態および非イオン化形態両方の溶液中に存在する。しかし、通常、脂溶性または親油性の薬物のみが、細胞膜を容易に通過する。通過する膜を浸透増強剤で処理した場合、非親油性薬物でさえも細胞膜を通過し得ることが発見されている。細胞膜を通過する非親油性薬物の拡散の補助に加えて、浸透増強剤は、親油性薬物の透過性も増強する。
【０１４３】
浸透増強剤を、５つの広範なカテゴリー（すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、および非キレート化非界面活性剤）のうちの１つに属するように分類することができる（Ｌｅｅら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。上記の各浸透増強剤クラスを、以下により詳細に記載する。
【０１４４】
界面活性剤：本発明に関連して、界面活性剤（または「表面活性剤」）は、水溶液に溶解した場合に溶液の表面張力または水溶液と別の液体との間の界面張力を減少させる化学物質であり、これにより、粘膜を介したｄｓＲＮＡの吸収が増強される。胆汁酸塩および脂肪酸に加えて、これらの浸透増強剤には、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム，ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル）（Ｌｅｅら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）およびペルフルオロ化学乳濁液（ＦＣ−４３など）（Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２）が含まれる。
【０１４５】
脂肪酸：浸透増強剤として作用する種々の脂肪酸およびその誘導体には、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプラート、トリカプラート、モノオレイン（１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノカプラート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、そのＣ_１〜Ｃ_１０アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピル、およびｔ−ブチル）、ならびにそのモノおよびジグリセリド（すなわち、オレアート、ラウラート、カプラート、ミリスタート、パルミタート、ステアラート、リロノレアートなど）が含まれる（Ｌｅｅら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｙｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｅｌ Ｈａｒｉｒｉら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１−６５４）。
【０１４６】
胆汁酸塩：胆汁の生理学的役割には、脂質および脂溶性ビタミンの拡散および吸収の促進が含まれる（Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３８ ｉｎ：Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎら Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９６，ｐｐ．９３４−９３５）。種々の天然胆汁酸塩およびその合成誘導体は、浸透増強剤として作用する。したがって、用語「胆汁酸塩」には、胆汁の任意の天然に存在する成分および任意のその合成誘導体が含まれる。本発明の胆汁酸塩には、例えば、コール酸（または薬学的に許容可能なナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリコール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシド酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシド酸ナトリウム、およびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が含まれる（Ｌｅｅら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２；Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３９ Ｉｎ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０，ｐａｇｅｓ ７８２−７８３；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３，２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９，５７９−５８３）。
【０１４７】
キレート剤：本発明に関連して使用する場合、キレート剤を、複合体の形成によって溶液から金属イオンを除去し、それにより、粘膜を介したｄｓＲＮＡの吸収が増強される化合物と定義することができる。本発明における浸透増強剤としてのその使用に関して、最も特徴づけられたＤＮＡヌクレアーゼが触媒のための２価の金属イオンを必要とし、それにより、キレート剤によって阻害されるので、キレート剤は、ＤＮアーゼインヒビターとしての機能も果たすというさらなる利点を有する（Ｊａｒｒｅｔｔ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、１９９３、６１８、３１５−３３９）。本発明のキレート剤には、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチラート（例えば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチラート、およびホモバニラート）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９、およびβ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）（Ｌｅｅら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｂｕｕｒら，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３−５１）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４８】
非キレート化非界面活性剤：本明細書中で使用される場合、非キレート化非界面活性浸透増強化合物を、キレート剤または界面活性剤として有意でない活性を示すが、それにもかかわらず、消化器粘膜を介したｄｓＲＮＡの吸収を増強する化合物と定義することができる（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３）。この浸透増強剤クラスには、例えば、不飽和環状尿素，１−アルキル−および１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２）および非ステロイド系抗炎症薬（ジクロフェナックナトリウム、インドメタシン、およびフェニルブタゾンなど）（Ｙａｍａｓｈｉｔａら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１−６２６）が含まれる。
【０１４９】
細胞レベルでｄｓＲＮＡの取り込みを増強する薬剤を、本発明の薬学的組成物および他の組成物に添加することもできる。例えば、陽イオン性脂質（リポフェクチンなど）（Ｊｕｎｉｃｈｉらの米国特許第５，７０５，１８８号）、陽イオン性グリセロール誘導体、および多陽イオン性（ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎｉｃ）分子（ポリリジンなど）（Ｌｏｌｌｏら，ＰＣＴ出願ＷＯ９７／３０７３１号）も、ｄｓＲＮＡの細胞取り込みを増強することが公知である。
【０１５０】
他の薬剤を使用して、投与した核酸の浸透を増強することができる（エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのグリコール、２−ピロールなどのピロール、アゾン、およびならびにリモネンおよびメトンなどのテルペンが含まれる）。
【０１５１】
キャリア
本発明の一定の組成物に、処方物中のキャリア化合物も組み込む。本明細書中で使用される場合、「キャリア化合物」または「キャリア」は、不活性である（すなわち、それ自体が生物活性を持たない）が、例えば、生物学的に活性な核酸を分解するか、循環からのその除去を促進することによって生物活性を有する核酸の生体利用性を減少させるｉｎ ｖｉｖｏ過程によって核酸として認識される核酸またはそのアナログをいうことができる。核酸およびキャリア化合物、典型的には過剰な後者の物質との同時投与により、肝臓、腎臓、または他の循環外リザーバ（ｅｘｔｒａｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）中の核酸の回収量を実質的に減少させることができ、これはおそらく共通の受容体についてのキャリア化合物と核酸との間の競合に起因する。例えば、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジン酸（ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、または４−アセトアミド−４’イソチオシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸と同時投与した場合、肝臓組織中の部分的なホスホロチオエートｄｓＲＮＡの回収を減少させることができる。（Ｍｉｙａｏら，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５，５，１１５−１２１；Ｔａｋａｋｕｒａら，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，１９９６，６，１７７−１８３）。
【０１５２】
賦形剤
キャリア化合物と対照的に、「薬学的キャリア」または「賦形剤」は、１つ以上の核酸を動物に送達させるための薬学的に許容可能な溶媒、懸濁剤、または任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は、液体または固体であり得、核酸および所与の薬学的組成物の他の成分と組み合わせた場合に、所望の嵩、一貫性などが得られるように計画された投与様式を考慮して選択される。典型的な薬学的キャリアには、結合剤（例えば、α化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリラート、またはリン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアラート、硬化植物油、トウモロコシデンプン、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）；および湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５３】
核酸と有害に反応しない非経口投与以外に適切な薬学的に許容可能な有機または無機の賦形剤を使用して、本発明の組成物を処方することもできる。適切な薬学的に許容可能なキャリアには、水、塩水、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、およびポリビニルピロリドンなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５４】
核酸の局所投与のための処方物は、滅菌および非滅菌水溶液、非水溶液（一般に、アルコールなどの溶媒）、または液体もしくは固体の油性基剤中の核酸溶液を含むことができる。溶液は、緩衝液、希釈剤、および他の適切な添加物も含むことができる。核酸と有害に反応しない非経口投与以外に適切な薬学的に許容可能な有機または無機の賦形剤を使用することができる。
【０１５５】
適切な薬学的に許容可能な賦形剤には、水、塩水、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、およびポリビニルピロリドンなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５６】
気道への送達のための薬学的組成物
本発明の別の態様は、特に、嚢胞性線維症の治療のための気道へのＩＲＮＡ薬の送達を提供する。気道には、上気道（中咽頭および喉頭が含まれる）、それに続く下気道（気管が含まれる）、それに続く気管支および細気管支への分岐が含まれる。上気道および下気道を、誘導気管支と呼ぶ。次いで、末端細気管支は、呼吸細気管支に分岐し、最終的な呼吸領域（肺胞）（すなわち、肺深部）に続く。肺深部（すなわち、肺胞）は、ｉＲＮＡ薬の全身送達のための吸入された治療エアゾールの第１の標的である。
【０１５７】
肺送達組成物を、分散物内の組成物、好ましくはｉＲＮＡ薬が肺に到達することができ、例えば、肺で分散物を肺胞領域を介して血液循環に容易に直接吸収することができるような患者による分散物の吸入によって送達することができる。肺送達は、肺疾患を治療するための全身送達および局所送達の両方に有効であり得る。
【０１５８】
肺送達を、異なるアプローチ（噴霧、エアゾール化、ミセル、および乾燥粉末ベースの処方物の使用が含まれる）で行うことができ、吸入による投与は、経口および／または鼻腔内であり得る。液体噴霧器、エアゾールベースの吸入器、および乾燥粉末分散デバイスを使用して送達することができる。定量デバイスが好ましい。霧吹きまたは吸入器使用の利点の１つは、デバイスが自給式であるので、汚染が最小になる可能性があることである。乾燥粉末分散デバイスは、例えば、乾燥粉末として容易に処方することができる薬物を送達する。ｉＲＮＡ組成物自体を凍結乾燥または噴霧乾燥粉末としてか、適切な粉末キャリアと組み合わせて安定に保存することができる。吸入用組成物の送達を、投与時期調節要素（ｄｏｓｉｎｇ ｔｉｍｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）（タイマー、用量カウンター（ｄｏｓｅ ｃｏｕｎｔｅｒ）、時間測定デバイス、または時間表示器が含まれる）によって媒介することができる。これらは、デバイスに組み込んだ場合に用量を追跡し、服薬順守をモニタリングし、そして／またはエアゾール薬の投与中に患者に投薬を開始することができる。
【０１５９】
エアゾール送達用の薬学的デバイスの例には、定量吸入器（ＭＤＩ），ドライパウダー吸入器（ＤＰＩ）、およびエアジェット噴霧器が含まれる。本発明のｉＲＮＡ薬の送達のために容易に適合することができる例示的な吸入による送達系は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号；同第５，８５８，７８４号；ならびにＰＣＴ出願ＷＯ９８／３１３４６号；ＷＯ９８／１０７９６号；ＷＯ００／２７３５９号；ＷＯ０１／５４６６４号；ＷＯ０２／０６０４１２号に記載されている。ｉＲＮＡ薬の送達のために使用することができる他のエアゾール処方物は、米国特許第６，２９４，１５３号；同第６，３４４，１９４号；同第６，０７１，４９７号、ならびにＰＣＴ出願ＷＯ０２／０６６０７８号；ＷＯ０２／０５３１９０号；ＷＯ０１／６０４２０号；ＷＯ００／６６２０６号に記載されている。さらに、ｉＲＮＡ薬の送達方法を、吸入による他のオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の送達で使用した方法から適合することができる（Ｔｅｍｐｌｉｎら，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ，２０００，１０：３５９−６８；Ｓａｎｄｒａｓａｇｒａら，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ，２００１，１：９７９−８３；Ｓａｎｄｒａｓａｇｒａら，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ，２００２，１２：１７７−８１などに記載）。
【０１６０】
本発明の薬剤の送達は、いわゆる「プロドラッグ」（すなわち、好ましくはその作用を望む部位で治療物質を放出するために対象生物に固有の系によってプロセシングまたは輸送されるいくつかの形態を必要とする治療物質の処方物または化学修飾物）の投与も含むことができる。この後者の実施形態を、気道送達と組み合わせて使用することができるが、本発明の他の実施形態と共に使用することもできる。例えば、ヒト肺は、数分から数時間の範囲の期間にわたって加水切断可能な沈着エアゾールを除去するか迅速に分解することができる。上気道では、線毛上皮は、粒子が気道から口腔に向かって押し寄せる「粘膜線毛エスカレーター（ｍｕｃｏｃｉｌｉａｒｙ ｅｘｃａｌａｔｏｒ）」に寄与する。Ｐａｖｉａ，Ｄ．，“Ｌｕｎｇ Ｍｕｃｏｃｉｌｉａｒｙ Ｃｌｅａｒａｎｃｅ，” ｉｎ Ａｅｒｏｓｏｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｌｕｎｇ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ，Ｃｌａｒｋｅ，Ｓ．Ｗ．およびＰａｖｉａ，Ｄ．，Ｅｄｓ．，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８４。肺深部では、肺胞マクロファージは、その沈積直後に粒子を貪食することができる。Ｗａｒｈｅｉｔら Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．，２６：４１２−４２２（１９９３）；およびＢｒａｉｎ，Ｊ．Ｄ．，“Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，” ｉｎ Ｔｈｅ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｓ．Ｍ．ＲｅｉｃｈａｒｄおよびＪ．Ｆｉｌｋｉｎｓ，Ｅｄｓ．，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ．Ｙｏｒｋ．，ｐｐ．３１５−３２７，１９８５。
【０１６１】
好ましい実施形態では、特に、ｉＲＮＡ薬の全身投与が望ましい場合、エアゾール化ｉＲＮＡ薬を、微粒子として処方する。直径０．５ミクロンと１０ミクロンとの間の微粒子は、ほとんどの天然バリアを通過して肺に浸透することができる。喉を迂回するために１０ミクロン未満の直径が必要であり、吐出を回避するために直径０．５ミクロン以上が必要である。
【０１６２】
他の成分
本発明の組成物は、その分野で確立された使用レベルで薬学的組成物中に伝統的に見出される他の付加成分をさらに含むことができる。したがって、例えば、組成物は、さらなる適合可能な薬学的に活性な材料（例えば、止痒薬、収斂薬、局所麻酔薬、または抗炎症薬など）を含むことができるか、種々の投薬形態の本発明の組成物の物理的処方に有用なさらなる材料（色素、香味物質、防腐剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、および安定剤など）を含むことができる。しかし、かかる材料は、添加する場合、本発明の組成物の成分の生物活性を過度に干渉すべきではない。処方物を、滅菌し、必要に応じて、処方物の核酸と有害に相互作用しない助剤（例えば、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼす塩、緩衝液、着色剤、香味物質、および／または芳香物質など）と混合することができる。
【０１６３】
水性懸濁液は、懸濁液の粘度を増大させる物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランが含まれる）を含むことができる。懸濁液は、安定剤も含むことができる。
【０１６４】
本発明の一定の実施形態は、（ａ）１つ以上のｄｓＲＮＡ薬および（ｂ）非ＲＮＡ干渉機構によって機能する１つ以上の他の化学療法薬を含む薬学的組成物を提供する。かかる化学療法薬の例には、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マホスファミド、イフォスファミド、シトシンアラビノシド、ビス−クロロエチルニトロソ尿素、ブスルファン、マイトマイシン Ｃ、アクチノマイシン Ｄ、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロソ尿素、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシコフォルマイシン、４−ヒドロキシペルオキシシクロホスホラミド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−フルオロデオキシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（ＶＰ−１６）、トリメトトレキサート、イリノテカン、トポテカン、ゲムシタビン、テニポシド、シスプラチン、およびジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）が含まれるが、これらに限定されない。一般に、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，１５ｔｈ Ｅｄ．１９８７，ｐｐ．１２０６−１２２８，Ｂｅｒｋｏｗら，ｅｄｓ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．を参照のこと。本発明の化合物と共に使用する場合、かかる化学療法薬を、個別に（例えば、５−ＦＵおよびオリゴヌクレオチド）、連続的に（例えば、５−ＦＵおよびオリゴヌクレオチドを使用し、一定期間後にＭＴＸおよびオリゴヌクレオチドを使用する）、または１つ以上の他のかかる化学療法薬と組み合わせて（例えば、５−ＦＵ、ＭＴＸ、およびオリゴヌクレオチド、または５−ＦＵ、放射線療法、およびオリゴヌクレオチド）使用することができる。抗炎症薬（非ステロイド性抗炎症薬およびコルチコステロイドが含まれるが、これらに限定されない）および抗ウイルス薬（リビビリン、ビダラビン、アシクロビル、およびガンシクロビルが含まれるが、これらに限定されない）を、本発明の組成物と組み合わせることもできる。一般に、それぞれ、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，１５ｔｈ Ｅｄ．，Ｂｅｒｋｏｗら，ｅｄｓ．，１９８７，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，ｐａｇｅｓ ２４９９−２５０６及び４６−４９を参照のこと）。他の非ｄｓＲＮＡ化学療法薬も本発明の範囲内である。２つ以上の化合物の組み合わせを、同時または連続的に使用することができる。
【０１６５】
かかる化合物の毒性および治療効果を、細胞培養または実験動物（例えば、ＬＤ５０（集団の５０％が死亡する用量）およびＥＤ５０（集団の５０％で治療有効な用量）の決定のため）における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性と治療効果との間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として示すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。
【０１６６】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータを、ヒトで使用するための処方物の投薬量範囲で使用することができる。本発明の組成物の投薬量は、一般に、循環濃度の範囲内であり、毒性をほとんど示さないか全く示さないＥＤ５０が含まれる。投薬量は、使用した投薬形態および使用した投与経路に応じてこの範囲内で変化し得る。本発明の方法で使用した任意の化合物について、治療有効用量を、最初に細胞培養アッセイから評価することができる。必要に応じて、化合物、または、必要に応じて、標的配列のポリペプチド産物の循環血漿濃度範囲を達成する（例えば、ポリペプチド濃度を減少させる）用量（細胞培養で決定したＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）が含まれる）を動物モデルに処方することができる。かかる情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿レベルを、例えば、高速液体クロマトグラフィによって測定することができる。
【０１６７】
上記で考察した個別または複数の投与に加えて、本発明のｄｓＲＮＡを、Ａｈａ発現によって媒介される病理学的過程の治療で有効な他の公知の薬剤と組み合わせて投与することができる。いずれにしても、投与する医師は、当該分野で公知であるか本明細書中に記載の標準的な有効性の基準を使用して認められた結果に基づいて、ｄｓＲＮＡの投与の量およびタイミングを調整することができる。
【０１６８】
Ａｈａ遺伝子発現に起因する疾患の治療方法
本発明は、特に、嚢胞性線維症の治療のためのｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡから調製された薬学的組成物の使用に関する。Ａｈａ１発現の阻害効果により、本発明のｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡから調製された薬学的組成物は、嚢胞性線維症患者の生活の質を増強することができる。
【０１６９】
さらに、本発明は、癌の治療（例えば、腫瘍成長および腫瘍転移の阻害）を目的とした本発明のｄｓＲＮＡまたは薬学的組成物の使用に関する。例えば、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡから調製された薬学的組成物を、乳癌、肺癌、頭頸部癌、脳腫瘍、腹部癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、消化管癌、膠腫、肝臓癌、舌癌、神経芽細胞腫、骨肉種、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、多発性骨髄腫のような固形腫瘍の治療、黒色腫のような皮膚癌の治療、リンパ腫および血液の癌の治療のために使用することができる。本発明は、さらに、異なる癌型（例えば、乳癌、肺癌、頭部癌、頸部癌、脳腫瘍、腹部癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、消化管癌、膠腫、肝臓癌、舌癌、神経芽細胞腫、骨肉種、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、多発性骨髄腫、皮膚癌、黒色腫、リンパ腫、および血液の癌）におけるＡｈａ１発現の阻害および／または腹水および胸水の蓄積の阻害のための本発明のｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡから調製された薬学的組成物の使用に関する。Ａｈａ１発現の阻害効果により、本発明のｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡから調製された薬学的組成物は、癌患者の生活の質を増強することができる。
【０１７０】
本発明は、さらに、例えば、他の医薬品および／または他の治療方法（例えば、公知の医薬品および／または公知の治療方法（例えば、嚢胞性線維症または癌の治療および／または腫瘍転移の防止のために現在使用されているものなど））と組み合わせた、嚢胞性線維症もしくは癌の治療または腫瘍転移の防止のためのｄｓＲＮＡまたはその薬学的組成物の使用に関する。薬学的組成物が嚢胞性線維症の治療を目的とする場合、毎日の胸部理学療法、膵臓酵素の経口適用、肺感染に対抗するための毎日の抗生物質の経口投与または吸入、抗喘息療法薬の吸入、コルチコステロイド錠、食事ビタミンサプリメント，（特に、ビタミンＡおよびＤ）、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（商標）の吸入、便秘を軽減するか、酵素サプリメントの活性を改良するための薬物、ＣＦ関連糖尿病のためのインスリン、ＣＦ関連肝臓疾患のための薬物、および呼吸を補助するための酸素と組み合わせて投与することが好ましい。
【０１７１】
薬学的組成物が、癌の治療および／または腫瘍転移の防止を目的とする場合、放射線療法および化学療法薬（シスプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシン、またはタモキシフェンなど）と組み合わせて投与することが好ましい。
【０１７２】
本発明を、特定のＲＮＡｉ薬と共に別の抗癌化学療法薬（任意の従来の化学療法薬など）を含めることによって実施することもできる。特定の結合剤とかかる他の薬剤との組み合わせにより、化学療法プロトコールを増強することができる。本発明の方法に組み込むことができる多数の化学療法プロトコールが、当業者によって想像されるであろう。任意の化学療法薬（アルキル化剤、代謝拮抗物質、ホルモン、およびアンタゴニストが含まれる）、放射性同位体、ならびに天然産物を使用することができる。例えば、本発明の化合物を、抗生物質（ドキソルビシンなど）および他のアントラサイクリンアナログ、ナイトロジェンマスタード（シクロホスファミドなど）、ピリミジンアナログ（５−フルオロウラシル、シスプラチン、ヒドロキシ尿素、タキソールなど）、ならびに天然および合成の誘導体などと共に投与することができる。別の例として、混合腫瘍（乳房の腺癌など）の場合（腫瘍がゴナドトロピン依存性細胞およびゴナドトロピン非依存性細胞を含む場合）、化合物を、ロイプロリドまたはゴセレリン（ＬＨ−ＲＨの合成ペプチドアナログ）と併せて投与することができる。他の抗新生物プロトコールには、別の治療方法（例えば、手術、照射など）を使用したテトラサイクリン化合物の使用が含まれ、これを、本明細書中で「付加抗新生物方法（ａｄｊｕｎｃｔ ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｍｏｄａｌｉｔｉｅｓ）」とも呼ぶ。したがって、本発明の方法を、副作用の軽減および有効性の増強に有利なように、かかる従来のレジメとともに使用することができる。
【０１７３】
Ａｈａ遺伝子発現の阻害方法
さらに別の態様では、本発明は、哺乳動物におけるＡｈａ遺伝子発現の阻害方法を提供する。本方法は、標的Ａｈａ遺伝子（例えば、Ａｈａ１）の発現がサイレンシングされるように本発明の組成物を哺乳動物に投与する工程を含む。その高い特異性により、本発明のｄｓＲＮＡは、標的Ａｈａ遺伝子の（一次またはプロセシングされた）ＲＮＡを特異的にターゲティングする。ｄｓＲＮＡを使用したこれらのＡｈａ遺伝子発現を阻害するための組成物および方法を、本明細書中の他の場所に記載のように行うことができる。
【０１７４】
１つの実施形態では、本方法は、ｄｓＲＮＡを含む組成物を投与する工程であって、ｄｓＲＮＡが治療すべき哺乳動物のＡｈａ遺伝子（例えば、Ａｈａ１）のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を含む、投与する工程を含む。治療すべき生物がヒトなどの哺乳動物である場合、組成物を、当該分野で公知の任意の手段（経口または非経口経路（静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアゾール）、鼻腔、直腸、膣、および局所（口腔内および舌下が含まれる）投与が含まれる）が含まれるが、これらに限定されない）によって投与することができる。好ましい実施形態では、組成物を、静脈内注入または注射によって投与する。
【０１７５】
他に定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解される意味を有する。本明細書中に記載のものと類似するか等価な方法および材料を、本発明の実施または試験で使用することができるが、適切な方法および材料を、以下に記載する。本明細書中で言及した全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が本明細書中で参照により援用される。矛盾する場合、本明細書（定義が含まれる）が優先される。さらに、材料、方法、および実施例は、例示のみを目的とし、本発明を制限することを意図しない。
【実施例】
【０１７６】
Ａｈａ遺伝子の遺伝子歩行
Ａｈａ１をターゲティングするｓｉＲＮＡが同定されるようにｓｉＲＮＡをデザインした。ホモ・サピエンス（ＮＭ＿０１２１１１．１）、ハツカネズミ（ＮＭ＿１４６０３６．１）、およびチンパンジー（ＸＭ＿５１００９４．１）Ａｈａ１のｍＲＮＡ配列を、コンピュータ分析によって試験して、これら３つの種間で交差反応性を示すＲＮＡｉ薬が得られる１９または２１ヌクレオチドの相同配列を同定した。同定された配列のうち、ラットにおける的外れの相互作用を最小にするための４８本のかかる配列（ラットゲノム中の任意の他の遺伝子に対する少なくとも３つのミスマッチまたはラットゲノム中の任意の他の遺伝子に対する少なくとも２つのミスマッチ、ここで、前記少なくとも２つのミスマッチのうちの１つが、対応するＲＮＡｉ薬のアンチセンス鎖の９位または１０位（５’→３’方向で計算する）に相補的な位置に存在する）およびスクリーニングのために合成した対応するｄｓＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−７３０１−ＡＬ−ＤＰ−７３４６、表１を参照のこと）を選択した。ハツカネズミ（ＮＭ＿１７２３９１．３）およびラット（ＸＭ＿２２３６８０．３）Ａｈａ２に対してさらなる交差反応性を示すＡＬ−ＤＰ−７５６１、ＡＬ−ＤＰ−７５６２、ＡＬ−ＤＰ−７５６３、およびＡＬ−ＤＰ−７５６４も合成し、スクリーニングした。さらに、ヒトにおける予想される的外れの相互作用を最小にするためのさらなる４０本の配列（ヒトゲノム中の任意の他の遺伝子に対する少なくとも３つのミスマッチまたはヒトゲノム中の任意の他の遺伝子に対する少なくとも２つのミスマッチ、ここで前記少なくとも２つのミスマッチのうちの１つが、対応するＲＮＡｉ薬のアンチセンス鎖の９位または１０位（５’→３’方向で計算する）に相補的な位置に存在する）およびスクリーニングのために合成した対応するｄｓＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−９２５０−ＡＬ−ＤＰ−９２８９、表２を参照のこと）を選択した。１７本の配列を、両方の組に属すると同定した（ＡＬ−ＤＰ−７３０１、ＡＬ−ＤＰ−７３０４、ＡＬ−ＤＰ−７３０５、ＡＬ−ＤＰ−７３０７、ＡＬ−ＤＰ−７３１０、ＡＬ−ＤＰ−７３１２、ＡＬ−ＤＰ−７３１５、ＡＬ−ＤＰ−７３１６、ＡＬ−ＤＰ−７３１７、ＡＬ−ＤＰ−７３２３、ＡＬ−ＤＰ−７３２４、ＡＬ−ＤＰ−７３３２、ＡＬ−ＤＰ−７３３６、ＡＬ−ＤＰ−７３３７、ＡＬ−ＤＰ−７３３８、ＡＬ−ＤＰ−７３４２、およびＡＬ−ＤＰ−７３４４）。
【０１７７】
ｄｓＲＮＡ合成
試薬の供給元
試薬の供給元を本明細書中に特記しない場合、分子生物学での適用に標準的な質／純度のかかる試薬を、分子生物学用試薬の任意の供給者から入手することができる。
【０１７８】
ｓｉＲＮＡの合成
一本鎖ＲＮＡを、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｐｐｌｅｒａ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および固体支持体としての細孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ，５００Å，Ｐｒｏｌｉｇｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、１μｍｏｌｅのスケールで固相合成によって産生した。ＲＮＡおよびＲＮＡ含有２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを、対応するホスホルアミダイトおよび２’−Ｏ−メチルホスホルアミダイトをそれぞれ使用した固相合成によって生成した（Ｐｒｏｌｉｇｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。これらの基礎単位を、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ら（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡなどに記載の標準的なヌクレオシドホスホルアミダイト化学を使用して、オリゴリボヌクレオチド鎖の配列内の選択された部位に組み込んだ。ホスホロチオエート結合を、ヨウ素酸化溶液のＢｅａｕｃａｇｅ試薬（Ｃｈｒｕａｃｈｅｍ Ｌｔｄ，Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ）のアセトニトリル溶液（１％）との置換によって導入した。さらなる補助試薬（ａｎｃｉｌｌａｒｙ ｒｅａｇｅｎｔ）を、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｂａｋｅｒ（Ｇｒｉｅｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。
【０１７９】
陰イオン交換ＨＰＬＣによる粗オリゴリボヌクレオチドの脱保護および精製を、確立された手順に従って行った。収率および濃度を、分光光度計（ＤＵ ６４０Ｂ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＧｍｂＨ，Ｕｎｔｅｒｓｃｈｌｅｉｓｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した２６０ｎｍの波長での各ＲＮＡ溶液のＵＶ吸収によって決定した。二本鎖ＲＮＡを、水浴中で８０〜９０℃で３分間加熱し、３〜４時間にわたって室温に冷却するアニーリング緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１００ｍＭ塩化ナトリウム）中での相補鎖の等モル溶液の混合によって生成した。アニーリングしたＲＮＡ溶液を、使用するまで−２０℃で保存した。
【０１８０】
３’−コレステロール抱合ｓｉＲＮＡ（本明細書中で、−Ｃｈｏｌ−３’と呼ぶ）の合成のために、適切に修飾した固体支持体を、ＲＮＡ合成のために使用した。修飾固体支持体を、以下のように調製した。
【０１８１】
ジエチル−２−アザブタン−１，４−ジカルボキシラート（ＡＡ）
【０１８２】
【化１】

４．７Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）を、撹拌した氷冷エチルグリシナート塩酸塩溶液（３２．１９ｇ、０．２３ｍｏｌｅ）を含む水（５０ｍＬ）に添加した。次いで、アクリル酸エチル（２３．１ｇ、０．２３ｍｏｌｅ）を添加し、ＴＬＣによって反応の完了が確認されるまで混合物を室温で撹拌した。１９時間後、溶液をジクロロメタン（３×１００ｍＬ）で分配した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させた。残渣を蒸留して、ＡＡを得た（２８．８ｇ、６１％）。
【０１８３】
３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル−アミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステル（ＡＢ）
【０１８４】
【化２】

Ｆｍｏｃ−６−アミノ−ヘキサン酸（９．１２ｇ、２５．８３ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、氷で冷却した。ジイソプロピルカルボジイミド（３．２５ｇ、３．９９ｍＬ、２５．８３ｍｍｏｌ）を、０℃の溶液に添加した。その後にジエチル−アザブタン−１，４−ジカルボキシラート（５ｇ、２４．６ｍｍｏｌ）およびジメチルアミノピリジン（０．３０５ｇ、２．５ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を室温にし、６時間さらに撹拌した。ＴＬＣによって反応の完了を確認した。反応混合物を、真空下で濃縮し、酢酸エチルを添加して、ジイソプロピル尿素を沈殿させた。懸濁液を濾過した。濾過物を、５％塩酸水溶液、５％重炭酸ナトリウム、および水で洗浄した。合わせた有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して粗生成物を得て、これをカラムクロマトグラフィ（５０％ＥｔＯＡＣ／ヘキサン）によって精製して、１１．８７ｇ（８８％）のＡＢを得た。
【０１８５】
３−［（６−アミノ−ヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−プロピオン酸エチルエステル（ＡＣ）
【０１８６】
【化３】

３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステル（ＡＢ）（１１．５ｇ、２１．３ｍｍｏｌ）を、０℃の２０％ピペリジンを含むジメチルホルムアミド中に溶解した。溶液を、１時間撹拌し続けた。反応混合物を真空下で濃縮し、水を残渣に添加し、生成物を酢酸エチルで抽出した。粗生成物を、その塩酸塩への変換によって精製した。
【０１８７】
３−（｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝エトキシカルボニルメチル−アミノ）−プロピオン酸エチルエステル（ＡＤ）
【０１８８】
【化４】

３−［（６−アミノ−ヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−プロピオン酸エチルエステルＡＣの塩酸塩（４．７ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン中に溶解した。懸濁液を、氷上で０℃に冷却した。懸濁液に、ジイソプロピルエチルアミン（３．８７ｇ、５．２ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液に、コレステリルクロロホルマート（６．６７５ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、一晩撹拌した。反応混合物を、ジクロロメタンで希釈し、１０％塩酸で洗浄した。生成物を、フラッシュクロマトグラフィによって精製した（１０．３ｇ、９２％）。
【０１８９】
１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−４−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸エチルエステル（ＡＥ）
【０１９０】
【化５】

カリウムｔ−ブトキシド（１．１ｇ、９．８ｍｍｏｌ）を、３０ｍＬの乾燥トルエン中でスラリーにした。混合物を、氷上で０℃に冷却し、５ｇ（６．６ｍｍｏｌ）のジエステル（ＡＤ）を撹拌しながら２０分以内にゆっくり添加した。添加中、温度を５℃未満に保持した。０℃で３０分間撹拌し続け、１ｍＬの氷酢酸を添加し、その直後に４ｇのＮａＨ_２ＰＯ_４・Ｈ_２Ｏを含む４０ｍＬの水を添加した。得られた混合物を、１００ｍＬのジクロロメタンでそれぞれ２回抽出し、合わせた有機抽出物を１０ｍＬのリン酸緩衝液でそれぞれ２回洗浄し、乾燥させ、蒸発乾燥させた。残渣を、６０ｍＬのトルエンに溶解し、０℃に冷却し、５０ｍＬずつの冷炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で３回抽出した。水抽出物を、リン酸でｐＨ３に調整し、４０ｍＬずつのクロロホルムで５回抽出し、これらを合わせ、乾燥させ、蒸発乾固させた。残渣を、２５％酢酸エチル／ヘキサンを使用したカラムクロマトグラフィによって精製して、１．９ｇのｂ−ケトエステル（３９％）を得た。
【０１９１】
［６−（３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−ピロリジン−１−イル）−６−オキソ−ヘキシル］−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステル（ＡＦ）
【０１９２】
【化６】

メタノール（２ｍＬ）を、ｂ−ケトエステル（ＡＥ）（１．５ｇ、２．２ｍｍｏｌ）と水素化ホウ素ナトリウム（０．２２６ｇ、６ｍｍｏｌ）を含むテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）との還流混合物に１時間にわたって滴下した。還流温度で１時間撹拌し続けた。室温への冷却後、１Ｎ ＨＣｌ（１２．５ｍＬ）を添加し、混合物を、酢酸エチル（３×４０ｍＬ）で抽出した。合わせた酢酸エチル層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空下で濃縮して生成物を得て、これをカラムクロマトグラフィ（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ_３）によって精製した（８９％）。
【０１９３】
（６−｛３−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−４−ヒドロキシ−ピロリジン−１−イル｝−６−オキソ−ヘキシル）−カルバミン酸 １７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステル（ＡＧ）
【０１９４】
【化７】

ジオール（ＡＦ）（１．２５ｇｍ、１．９９４ｍｍｏｌ）を、真空下でのピリジン（２×５ｍＬ）を用いた蒸発によって乾燥させた。無水ピリジン（１０ｍＬ）および４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（０．７２４ｇ、２．１３ｍｍｏｌ）を、撹拌しながら添加した。反応を、室温で一晩行った。反応を、メタノールの添加によって停止させた。反応混合物を、真空下で濃縮し、残渣にジクロロメタン（５０ｍＬ）を添加した。有機層を、１Ｍ重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残存ピリジンを、トルエンとの蒸発によって除去した。粗生成物を、カラムクロマトグラフィ（２％ＭｅＯＨ／クロロホルム、Ｒｆ＝０．５、５％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ_３）によって精製した（１．７５ｇ、９５％）。
【０１９５】
コハク酸モノ−（４−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル ２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−ピロリジン−３−イル）エステル（ＡＨ）
【０１９６】
【化８】

化合物ＡＧ（１．０ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）を、無水コハク酸（０．１５０ｇ、１．５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．０７３ｇ、０．６ｍｍｏｌ）と混合し、４０℃の真空下で一晩乾燥させた。混合物を、無水ジクロロエタン（３ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．３１８ｇ、０．４４０ｍＬ、３．１５ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を、アルゴン雰囲気下にて室温で１６時間撹拌した。次いで、これを、ジクロロメタン（４０ｍＬ）で希釈し、氷冷クエン酸水溶液（５ｗｔ％、３０ｍＬ）および水（２×２０ｍＬ）で洗浄した。有機相を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮乾固させた。残渣を、次の工程のためにそのまま使用した。
【０１９７】
コレステロール誘導体化ＣＰＧ（ＡＩ）
【０１９８】
【化９】

コハク酸塩（ＡＨ）（０．２５４ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン／アセトニトリルの混合物（３：２、３ｍＬ）に溶解した。この溶液に、ＤＭＡＰ（０．０２９６ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）を含むアセトニトリル（１．２５ｍＬ）を添加し、２，２’−ジチオ−ビス（５−ニトロピリジン）（０．０７５ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）を含むアセトニトリル／ジクロロエタン（３：１、１．２５ｍＬ）を連続的に添加した。得られた溶液に、トリフェニルホスフィン（０．０６４ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）を含むアセトニトリル（０．６ ｍｌ）を添加した。反応混合物が鮮やかな橙色を呈した。溶液を、リストアクションシェーカー（ｗｒｉｓｔ−ａｃｔｉｏｎ ｓｈａｋｅｒ）で短期間（５分間）撹拌した。長鎖アルキルアミン−ＣＰＧ（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）（１．５ｇ、６１ｍＭ）を添加した。懸濁液を、２時間撹拌した。ＣＰＧを、焼結漏斗で濾過し、アセトニトリル、ジクロロメタン、およびエーテルで連続的に洗浄した。未反応のアミノ基を、無水酢酸／ピリジンを使用してマスキングした。達成されたＣＰＧ負荷を、ＵＶ測定によって測定した（３７ｍＭ／ｇ）。
【０１９９】
５’−１２−ドデカン酸ビスデシルアミド基（本明細書中で、「５’−Ｃ３２−」と呼ぶ）または５’−コレステリル誘導体基（本明細書中で、「５’−Ｃｈｏｌ−」と呼ぶ）を有するｓｉＲＮＡの合成を、コレステリル誘導体について、核酸オリゴマーの５末端にホスホロチオエート結合を導入するためにＢｅａｕｃａｇｅ試薬を使用して酸化工程を行ったことを除いてＷＯ２００４／０６５６０１号に記載のように行った。
【０２００】
標準的な命名法、特に、表２の略語を使用して、核酸配列を以下に示す。
【０２０１】
表３：核酸配列表示で使用したヌクレオチド単量体の略語。これらの単量体は、オリゴヌクレオチド中に存在する場合、５’−３’−ホスホジエステル結合によって相互に結合していると理解されるであろう。
【０２０２】
【表３】

ｄｓＲＮＡ発現ベクター
本発明の別の態様では、Ａｈａ１遺伝子発現活性を調整するＡｈａ１特異的ｄｓＲＮＡ分子を、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターに挿入した転写単位から発現する（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅ， Ａら，ＴＩＧ．（１９９６），１２：５−１０；Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａ．らのＰＣＴ国際公開番号ＷＯ００／２２１１３号、ＣｏｎｒａｄのＰＣＴ国際公開番号ＷＯ００／２２１１４号、およびＣｏｎｒａｄの米国特許第６，０５４，２９９号を参照のこと）。これらの導入遺伝子を、線状構築物、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入することができ、これらは、宿主ゲノムに取り込まれた導入遺伝子として組み込み、遺伝することができる。導入遺伝子を、染色体外プラスミドとして遺伝するように構築することもできる（Ｇａｓｓｍａｎｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：１２９２）。
【０２０３】
ｄｓＲＮＡの各鎖を、２つの個別の発現ベクター上のプロモーターによって転写し、標的細胞に同時トランスフェクトすることができる。あるいは、ｄｓＲＮＡの各鎖を、プロモーターによって転写することができ、その両方は、同一の発現プラスミド上に存在する。好ましい実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡがステム構造およびループ構造を有するようにリンカーポリヌクレオチド配列によって連結された逆反復として発現する。
【０２０４】
組換えｄｓＲＮＡ発現ベクターは、一般に、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。ｄｓＲＮＡ発現ウイルスベクターを、アデノ随伴ウイルス（概説については、Ｍｕｚｙｃｚｋａら，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７−１２９）を参照のこと）；アデノウイルス（例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９８）６：６１６），Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４），およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２），Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５）を参照のこと）；またはアルファウイルスならびに当該分野で公知の他のウイルス（これらに制限されない）に基づいて構築することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏで、レトロウイルスを使用して、種々の遺伝子が多数の異なる細胞型（上皮細胞が含まれる）に導入されている（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：１３９５−１３９８；ＤａｎｏｓおよびＭｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８）８５：６４６０−６４６４；Ｗｉｌｓｏｎら，１９８８，Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３０１４−３０１８；Ａｒｍｅｎｔａｎｏら，１９９０，Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６１４１６１４５；Ｈｕｂｅｒら，１９９１，Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８０３９−８０４３；Ｆｅｒｒｙら，１９９１，Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８３７７−８３８１；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１８０２−１８０５；ｖａｎ Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ．ら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｄ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７６４０−１９；Ｋａｙら，１９９２，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：６４１−６４７；Ｄａｉら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０８９２−１０８９５；Ｈｗｕら，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４−４１１５；米国特許第４，８６８，１１６；米国特許第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０７１３６号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０２４６８号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０５３４５号；およびＰＣＴ出願ＷＯ９２／０７５７３号を参照のこと）。細胞ゲノムに挿入した遺伝子を形質導入して発現することができる組換えレトロウイルスベクターを、組換えレトロウイルスゲノムの適切なパッケージング細胞株（ＰＡ３１７およびＰｓｉ−ＣＲＩＰなど）へのトランスフェクションによって産生することができる（Ｃｏｍｅｔｔｅら，１９９１，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：５−１０；Ｃｏｎｅら，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６３４９）。組換えアデノウイルスベクターを使用して、感受性宿主（例えば、ラット、ハムスター、イヌ、およびチンパンジー）中の広範な種々の細胞および組織に感染させることができ（Ｈｓｕら，１９９２，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，１６６：７６９）、これは、感染に有糸分裂的に活性な細胞を必要としないという利点も有する。
【０２０５】
本発明のＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターのいずれかでのｄｓＲＮＡ発現を駆動するプロモーターは、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（例えば、リボゾームＲＮＡプロモーター）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（例えば、ＣＭＶ初期プロモーターまたはアクチンプロモーターまたはＵ１ ｓｎＲＮＡプロモーター）、または一般にＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６ ｓｎＲＮＡまたは７ＳＫ ＲＮＡプロモーター）、または原核生物プロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター）（発現プラスミドがＴ７プロモーター由来の転写に必要なＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードする場合）であり得る。プロモーターは、膵臓に導入遺伝子発現を指示することもできる（例えば、膵臓のインスリン調節配列（Ｂｕｃｃｈｉｎｉら，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：２５１１−２５１５）を参照のこと）。
【０２０６】
さらに、導入遺伝子の発現を、例えば、誘導性調節配列および発現系（一定の生理学的レギュレーター（例えば、循環血糖値）またはホルモンに感受性を示す調節配列など）の使用によって正確に調節することができる（Ｄｏｃｈｅｒｔｙら，１９９４，ＦＡＳＥＢ Ｊ．８：２０−２４）。細胞または哺乳動物中の導入遺伝子発現の調節に適切なかかる誘導性発現系には、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体化の化学的インデューサー、およびイソプロピル−β−Ｄ１−チオガラクトピラノシド（ＥＰＴＧ）による調節が含まれる。当業者は、ｄｓＲＮＡ導入遺伝子の意図する使用に基づいて、適切な調節／プロモーター配列を選択することができるであろう。
【０２０７】
一般に、ｄｓＲＮＡ分子を発現することができる組換えベクターを、下記のように送達させ、標的細胞中で保持する。あるいは、ｄｓＲＮＡ分子を一過性に発現するウイルスベクターを使用することができる。かかるベクターを、必要に応じて、繰り返し投与することができる。一旦発現されると、ｄｓＲＮＡは、標的ＲＮＡに結合し、その機能または発現を調整する。ｄｓＲＮＡ発現ベクターの送達は、静脈内または筋肉内投与、患者から外植された標的細胞の投与およびその後の患者への再導入、または所望の標的細胞に導入する任意の他の手段などによる全身送達であり得る。
【０２０８】
ｄｓＲＮＡ発現ＤＮＡプラスミドを、典型的には、陽イオン性脂質キャリア（例えば、オリゴフェクタミン）または非陽イオン性脂質ベースのキャリア（例えば、Ｔｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯ（商標））との複合体として標的細胞にトランスフェクトする。１週間またはそれを超える期間にわたる１つのＡｈａ１遺伝子または複数のＡｈａ１遺伝子の異なる領域をターゲティングするｄｓＲＮＡ媒介ノックダウンの多脂質トランスフェクションも本発明で意図される。本発明のベクターの宿主細胞への首尾のよい導入を、種々の公知の方法を使用してモニタリングすることができる。例えば、一過性トランスフェクションを、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光マーカーなどのレポーターでシグナリングすることができる。ｅｘ ｖｉｖｏ細胞の安定なトランスフェクションを、特定の環境因子（例えば、抗生物質および薬物）に耐性を示す（ハイグロマイシンＢ耐性など）トランスフェクトされた細胞が得られるマーカーを使用して確認することができる。
【０２０９】
Ａｈａ１特異的ｄｓＲＮＡ分子を、ベクターに挿入し、ヒト患者のための遺伝子療法ベクターとして使用することもできる。遺伝子療法ベクターを、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）、または定位注射によって対象にと送達することができる（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３０５４−３０５７を参照のこと）。遺伝子療法ベクターの薬学的調製物は、許容可能な希釈剤中の遺伝子療法ベクターを含むことができるか、遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた徐放マトリックスを含むことができる。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターを組換え細胞（例えば、レトロウイルスベクター）からインタクトに産生することができる場合、薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１つ以上の細胞を含むことができる。
【０２１０】
Ａｈａ１ ｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング
ＨｅＬａ細胞およびＭＬＥ１２細胞の単回用量スクリーニング
ＨｅＬａ細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＢ−８０６５）から入手し、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ０１１５）、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ２２１３）を含むように捕捉したＨａｍ’ｓ Ｆ１２（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｃａｔ．Ｎｏ．ＦＧ０８１５）中にて、加湿インキュベーター（Ｈｅｒａｅｕｓ ＨＥＲＡｃｅｌｌ，Ｋｅｎｄｒｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｌａｎｇｅｎｓｅｌｂｏｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中の５％ＣＯ_２を含む３７℃の大気中で培養した。
【０２１１】
ＭＬＥ１２細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＲＬ−２１１０）から入手し、２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ０１１５）、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ２２１３）、４ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｃａｔ．Ｎｏ：Ｋ０２８２）、１×インスリン／トランスフェリン／Ｎａ−Ｓｅｌｅｎｉｔ（Ｇｉｂｃｏ：５１５００−０５６）、１０ｎＭ ヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｃａｔ．Ｎｏ：Ｈ６９０９）、１０ｎＭ β−エストラジオール（Ｓｉｇｍａ Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｃａｔ．Ｎｏ：Ｅ２２５７）、および１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＵＳＢ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍＢＨ，Ｓｔａｕｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ ｃａｔ．Ｎｏ．：１６９２６）を含むように捕捉したＨＩＴＥＳ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＭＥＭ （Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｃａｔ．Ｎｏ：Ｆ０４３５）＋Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｃａｔ．Ｎｏ：ＦＧ０８１５）の１：１混合物）中にて、加湿インキュベーター（Ｈｅｒａｅｕｓ ＨＥＲＡｃｅｌｌ，Ｋｅｎｄｒｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｌａｎｇｅｎｓｅｌｂｏｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中の５％ＣＯ_２を含む３７℃の大気中で培養した。
【０２１２】
トランスフェクションおよびｍＲＮＡの定量
ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションのために、ＨｅＬａ細胞およびＭＬＥ１２細胞を、２．０×１０^４細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、直接トランスフェクトした。ｓｉＲＮＡ（３０ｎＭ）のトランスフェクションを、製造者が説明するように、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｍｂＨ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｃａｔ．Ｎｏ．１１６６８−０１９）を使用して行った。トランスフェクションから２４時間後、細胞を溶解し、Ａｈａ１ ｍＲＮＡレベルを、製造者のプロトコールに従って、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ Ｅｘｐｌｏｒｅ Ｋｉｔ（Ｇｅｎｏｓｐｒｅｃｔｒａ，Ｄｕｍｂａｒｔｏｎ Ｃｉｒｃｌｅ Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＵＳＡ，ｃａｔ．Ｎｏ．ＱＧ−０００−０２）を使用して定量した。Ａｈａ１ ｍＲＮＡレベルを、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡに規準化した。各ｓｉＲＮＡについて、四連で読み取った。Ａｈａ１遺伝子に関連しないｓｉＲＮＡ二重鎖を、コントロールとして使用した。所与のＡｈａ１特異的ｓｉＲＮＡ二重鎖の活性を、コントロールｓｉＲＮＡ二重鎖で処理した細胞中のＡｈａ１ ｍＲＮＡ濃度と比較した処置細胞中のＡｈａ１ ｍＲＮＡ濃度の比率として示した。
【０２１３】
表４：ホモ・サピエンス（ｈｓ）Ａｈａ１の定量におけるＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ Ｅｘｐｌｏｒｅ Ｋｉｔ（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ）と共に使用したプローブ配列
【０２１４】
【表４】

表５：ハツカネズミ（ｍｍ）Ａｈａ１の定量におけるＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ Ｅｘｐｌｏｒｅ Ｋｉｔ（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ）と共に使用したプローブ配列
【０２１５】
【表５】

ＨｅＬａ細胞の用量−応答曲線
トランスフェクションおよびｍＲＮＡの定量：ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションのために、ＨｅＬａ細胞を、２．０×１０^４細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、直接トランスフェクトした。ｓｉＲＮＡのトランスフェクションを、製造者が説明するように、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｍｂＨ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｃａｔ．Ｎｏ．１１６６８−０１９）を使用して行った。ｓｉＲＮＡを、３倍希釈の３０ｎＭから１４ｐＭに濃縮した。トランスフェクションから２４時間後、ＨｅＬａ細胞を溶解し、Ａｈａ１ ｍＲＮＡレベルを、製造者のプロトコールに従って、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ Ｅｘｐｌｏｒｅ Ｋｉｔ（Ｇｅｎｏｓｐｒｅｃｔｒａ，Ｄｕｍｂａｒｔｏｎ Ｃｉｒｃｌｅ Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＵＳＡ，ｃａｔ．Ｎｏ．ＱＧ−０００−０２）を使用して定量した。Ａｈａ１ ｍＲＮＡレベルを、ＧＡＰ−ＤＨ ｍＲＮＡに規準化した。各ｓｉＲＮＡについて、４つの個々のデータポイントを回収した。Ａｈａ１遺伝子に関連しないｓｉＲＮＡ二重鎖を、コントロールとして使用した。所与のＡｈａ１特異的ｓｉＲＮＡ二重鎖の活性を、コントロールｓｉＲＮＡ二重鎖で処理した細胞中のＡｈａ１ ｍＲＮＡ濃度と比較した処置細胞中のＡｈａ１ ｍＲＮＡ濃度の比率として示した。ＸＬ−ｆｉｔを使用して、ＩＣ_５０値を計算した。
【０２１６】
表６は、本発明の種々のｄｓＲＮＡ分子を使用したＡｈａ１発現の阻害値を示す。
【０２１７】
表６：Ａｈａ１に特異的な３０ｎＭの種々のＲＮＡｉ薬溶液で処理したＨｅＬａ細胞およびＭＬＥ１２細胞中のコントロールのＡｈａ１ ｍＲＮＡの残存率（％）およびＨｅＬａ細胞中で決定された選択されたＲＮＡｉ薬のＩＣ_５０。
【０２１８】
【表６−１】

【０２１９】
【表６−２】

【０２２０】
【表６−３】

まとめると、ＡＬ−ＤＰ−７３０１、ＡＬ−ＤＰ−７３０８、ＡＬ−ＤＰ−７３１８、ＡＬ−ＤＰ−７３２０、ＡＬ−ＤＰ−７３２２、ＡＬ−ＤＰ−７３２４、ＡＬ−ＤＰ−７３２５、ＡＬ−ＤＰ−７３２６、ＡＬ−ＤＰ−７３２７、ＡＬ−ＤＰ−７３２９、ＡＬ−ＤＰ−７３３１、ＡＬ−ＤＰ−７３３３、ＡＬ−ＤＰ−７３４０、およびＡＬ−ＤＰ−７３４２は、Ａｈａ１発現を、ＨｅＬａ細胞およびＭＬＥ１２細胞の両方で少なくとも８０％阻害した。ＡＬ−ＤＰ−７３０３、ＡＬ−ＤＰ−７３０５、ＡＬ−ＤＰ−７３０７、ＡＬ−ＤＰ−７３０９、ＡＬ−ＤＰ−７３１６、およびＡＬ−ＤＰ−７３３７は、Ａｈａ１発現をＨｅＬａ細胞で少なくとも８０％阻害し、ＭＬＥ１２細胞で少なくとも７０％阻害した。ＡＬ−ＤＰ−７３０４、ＡＬ−ＤＰ−７３１２、ＡＬ−ＤＰ−７３３９、およびＡＬ−ＤＰ−７３４４は、Ａｈａ１発現を、ＨｅＬａ細胞で少なくとも８０％阻害し、ＭＬＥ１２細胞で少なくとも６０％阻害した。ＡＬ−ＤＰ−７３０６、ＡＬ−ＤＰ−７３１７、およびＡＬ−ＤＰ−７３４６は、Ａｈａ１発現を、ＨｅＬａ細胞で少なくとも７０％阻害し、ＭＬＥ１２細胞で少なくとも５０％阻害した。ＡＬ−ＤＰ−７３１０、ＡＬ−ＤＰ−７３２３、ＡＬ−ＤＰ−７３３５、ＡＬ−ＤＰ−７３３８、およびＡＬ−ＤＰ−７３４１は、Ａｈａ１発現を、ＨｅＬａ細胞およびＭＬＥ１２細胞の両方で少なくとも４０％阻害した。ＡＬ−ＤＰ−７３０２、ＡＬ−ＤＰ−７３１５、ＡＬ−ＤＰ−７３２８、ＡＬ−ＤＰ−７３３０、ＡＬ−ＤＰ−７３３６、およびＡＬ−ＤＰ−７３４５は、Ａｈａ１発現を、ＨｅＬａ細胞およびＭＬＥ１２細胞の両方で少なくとも２０％阻害した。
【０２２１】
さらに、ＡＬ−ＤＰ−９２５０、ＡＬ−ＤＰ−９２５２、ＡＬ−ＤＰ−９２５３、ＡＬ−ＤＰ−９２５４、ＡＬ−ＤＰ−９２５５、ＡＬ−ＤＰ−９２５６、ＡＬ−ＤＰ−９２５７、ＡＬ−ＤＰ−９２５８、ＡＬ−ＤＰ−９２５９、ＡＬ−ＤＰ−９２６０、ＡＬ−ＤＰ−９２６４、ＡＬ−ＤＰ−９２６５、ＡＬ−ＤＰ−９２６６、ＡＬ−ＤＰ−９２６８、ＡＬ−ＤＰ−９２６９、ＡＬ−ＤＰ−９２７０、ＡＬ−ＤＰ−９２７１、ＡＬ−ＤＰ−９２７３、ＡＬ−ＤＰ−９２７４、ＡＬ−ＤＰ−９２７５、ＡＬ−ＤＰ−９２７６、ＡＬ−ＤＰ−９２７７、ＡＬ−ＤＰ−９２７９、ＡＬ−ＤＰ−９２８０、ＡＬ−ＤＰ−９２８１、ＡＬ−ＤＰ−９２８２、ＡＬ−ＤＰ−９２８３、ＡＬ−ＤＰ−９２８５、ＡＬ−ＤＰ−９２８７、およびＡＬ−ＤＰ−９２８９は、Ａｈａ１発現を、ＨｅＬａ細胞で少なくとも８０％阻害した。ＡＬ−ＤＰ−９２６１、ＡＬ−ＤＰ−９２６２、ＡＬ−ＤＰ−９２６３、ＡＬ−ＤＰ−９２７２、およびＡＬ−ＤＰ−９２８８は、Ａｈａ１発現を、ＨｅＬａ細胞で少なくとも７０％阻害した。ＡＬ−ＤＰ−９２６３は、Ａｈａ１発現を、ＨｅＬａ細胞で少なくとも６０％阻害した。ＡＬ−ＤＰ−９２６７は、Ａｈａ１発現を、ＨｅＬａ細胞で少なくとも５０％阻害した。ＡＬ−ＤＰ−９２５１は、Ａｈａ１発現を、ＨｅＬａ細胞で少なくとも４０％阻害した。ＡＬ−ＤＰ−９２８６は、Ａｈａ１発現を、ＨｅＬａ細胞で少なくとも３０％阻害した。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中のヒトＡｈａ遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、該ｄｓＲＮＡが相互に相補的な少なくとも２つの配列を含み、センス鎖が第１の配列を含み、アンチセンス鎖がＡｈａ遺伝子をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的な相補領域を含む第２の配列を含み、該相補領域が、３０ヌクレオチド長未満であり、該ｄｓＲＮＡが、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１および配列番号１８３の群から選択されるセンス鎖ならびに後者のセンス鎖と相補的であり、且つ配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２および配列番号１８４の群から選択されるアンチセンス鎖を有する第２のｄｓＲＮＡの標的配列内のＡｈａ遺伝子をコードするｍＲＮＡを切断する、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）。
【請求項２】
前記Ａｈａ遺伝子がＡｈａ１遺伝子、好ましくはホモ・サピエンスＡｈａ１遺伝子である、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項３】
前記Ａｈａ遺伝子を発現する細胞との接触の際、前記ｄｓＲＮＡが該細胞中のＡｈａ遺伝子の発現を少なくとも２０％阻害する、請求項１または請求項２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４】
Ａｈａ遺伝子発現の前記少なくとも２０％阻害を、ＨｅＬａ細胞および／またはＭＬＥ１２細胞中で行う、請求項３に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項５】
前記ｄｓＲＮＡが、ＡＬ−ＤＰ−７３０１、ＡＬ−ＤＰ−７３０８、ＡＬ−ＤＰ−７３１８、ＡＬ−ＤＰ−７３２０、ＡＬ−ＤＰ−７３２２、ＡＬ−ＤＰ−７３２４、ＡＬ−ＤＰ−７３２５、ＡＬ−ＤＰ−７３２６、ＡＬ−ＤＰ−７３２７、ＡＬ−ＤＰ−７３２９、ＡＬ−ＤＰ−７３３１、ＡＬ−ＤＰ−７３３３、ＡＬ−ＤＰ−７３４０、ＡＬ−ＤＰ−７３４２、ＡＬ−ＤＰ−７３０３、ＡＬ−ＤＰ−７３０５、ＡＬ−ＤＰ−７３０７、ＡＬ−ＤＰ−７３０９、ＡＬ−ＤＰ−７３１６およびＡＬ−ＤＰ−７３３７、ＡＬ−ＤＰ−７３０４、ＡＬ−ＤＰ−７３１２、ＡＬ−ＤＰ−７３３９、ＡＬ−ＤＰ−７３４４、ＡＬ−ＤＰ−７３０６、ＡＬ−ＤＰ−７３１７、ＡＬ−ＤＰ−７３４６、ＡＬ−ＤＰ−７３１０、ＡＬ−ＤＰ−７３２３、ＡＬ−ＤＰ−７３３５、ＡＬ−ＤＰ−７３３８、ＡＬ−ＤＰ−７３４１、ＡＬ−ＤＰ−７３０２、ＡＬ−ＤＰ−７３１５、ＡＬ−ＤＰ−７３２８、ＡＬ−ＤＰ−７３３０、ＡＬ−ＤＰ−７３３６、ＡＬ−ＤＰ−７３４５、ＡＬ−ＤＰ−９２５０、ＡＬ−ＤＰ−９２５１、ＡＬ−ＤＰ−９２５２、ＡＬ−ＤＰ−９２５３、ＡＬ−ＤＰ−９２５４、ＡＬ−ＤＰ−９２５５、ＡＬ−ＤＰ−９２５６、ＡＬ−ＤＰ−９２５７、ＡＬ−ＤＰ−９２５８、ＡＬ−ＤＰ−９２５９、ＡＬ−ＤＰ−９２６０、ＡＬ−ＤＰ−９２６１、ＡＬ−ＤＰ−９２６２、ＡＬ−ＤＰ−９２６３、ＡＬ−ＤＰ−９２６４、ＡＬ−ＤＰ−９２６５、ＡＬ−ＤＰ−９２６６、ＡＬ−ＤＰ−９２６７、ＡＬ−ＤＰ−９２６８、ＡＬ−ＤＰ−９２６９、ＡＬ−ＤＰ−９２７０、ＡＬ−ＤＰ−９２７１、ＡＬ−ＤＰ−９２７２、ＡＬ−ＤＰ−９２７３、ＡＬ−ＤＰ−９２７４、ＡＬ−ＤＰ−９２７５、ＡＬ−ＤＰ−９２７６、ＡＬ−ＤＰ−９２７７、ＡＬ−ＤＰ−９２７９、ＡＬ−ＤＰ−９２８０、ＡＬ−ＤＰ−９２８１、ＡＬ−ＤＰ−９２８２、ＡＬ−ＤＰ−９２８３、ＡＬ−ＤＰ−９２８４、ＡＬ−ＤＰ−９２８５、ＡＬ−ＤＰ−９２８６、ＡＬ−ＤＰ−９２８７、ＡＬ−ＤＰ−９２８８およびＡＬ−ＤＰ−９２８９の群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項６】
前記ｄｓＲＮＡが、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項７】
前記修飾ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結した末端ヌクレオチドの群から選択される、請求項６に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項８】
前記修飾ヌクレオチドが、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、無塩基ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミダート、およびヌクレオチドを含む非天然塩基の群から選択される、請求項６に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡを含む細胞。
【請求項１０】
ｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む、生物中のＡｈａ遺伝子発現を阻害するための薬学的組成物であって、該ｄｓＲＮＡが相互に相補的な少なくとも２つの配列を含み、センス鎖が第１の配列を含み、アンチセンス鎖がＡｈａ遺伝子をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的な相補領域を含む第２の配列を含み、該相補領域が、３０ヌクレオチド長未満であり、該ｄｓＲＮＡが、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１および配列番号１８３の群から選択されるセンス鎖ならびに後者のセンス鎖と相補的であり、且つ配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２および配列番号１８４の群から選択されるアンチセンス鎖を有する第２のｄｓＲＮＡの標的配列内のＡｈａ遺伝子をコードするｍＲＮＡを切断する、薬学的組成物。
【請求項１１】
前記Ａｈａ遺伝子がＡｈａ１遺伝子、好ましくはホモ・サピエンスＡｈａ１遺伝子である、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記Ａｈａ遺伝子を発現する細胞との接触の際、前記ｄｓＲＮＡが該細胞中のＡｈａ遺伝子の発現を少なくとも２０％阻害する、請求項１０または請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
Ａｈａ遺伝子発現の前記少なくとも２０％阻害を、ＨｅＬａ細胞および／またはＭＬＥ１２細胞中で行う、請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
前記ｄｓＲＮＡが、ＡＬ−ＤＰ−７３０１、ＡＬ−ＤＰ−７３０８、ＡＬ−ＤＰ−７３１８、ＡＬ−ＤＰ−７３２０、ＡＬ−ＤＰ−７３２２、ＡＬ−ＤＰ−７３２４、ＡＬ−ＤＰ−７３２５、ＡＬ−ＤＰ−７３２６、ＡＬ−ＤＰ−７３２７、ＡＬ−ＤＰ−７３２９、ＡＬ−ＤＰ−７３３１、ＡＬ−ＤＰ−７３３３、ＡＬ−ＤＰ−７３４０、ＡＬ−ＤＰ−７３４２、ＡＬ−ＤＰ−７３０３、ＡＬ−ＤＰ−７３０５、ＡＬ−ＤＰ−７３０７、ＡＬ−ＤＰ−７３０９、ＡＬ−ＤＰ−７３１６およびＡＬ−ＤＰ−７３３７、ＡＬ−ＤＰ−７３０４、ＡＬ−ＤＰ−７３１２、ＡＬ−ＤＰ−７３３９、ＡＬ−ＤＰ−７３４４、ＡＬ−ＤＰ−７３０６、ＡＬ−ＤＰ−７３１７、ＡＬ−ＤＰ−７３４６、ＡＬ−ＤＰ−７３１０、ＡＬ−ＤＰ−７３２３、ＡＬ−ＤＰ−７３３５、ＡＬ−ＤＰ−７３３８、ＡＬ−ＤＰ−７３４１、ＡＬ−ＤＰ−７３０２、ＡＬ−ＤＰ−７３１５、ＡＬ−ＤＰ−７３２８、ＡＬ−ＤＰ−７３３０、ＡＬ−ＤＰ−７３３６、ＡＬ−ＤＰ−７３４５、ＡＬ−ＤＰ−９２５０、ＡＬ−ＤＰ−９２５１、ＡＬ−ＤＰ−９２５２、ＡＬ−ＤＰ−９２５３、ＡＬ−ＤＰ−９２５４、ＡＬ−ＤＰ−９２５５、ＡＬ−ＤＰ−９２５６、ＡＬ−ＤＰ−９２５７、ＡＬ−ＤＰ−９２５８、ＡＬ−ＤＰ−９２５９、ＡＬ−ＤＰ−９２６０、ＡＬ−ＤＰ−９２６１、ＡＬ−ＤＰ−９２６２、ＡＬ−ＤＰ−９２６３、ＡＬ−ＤＰ−９２６４、ＡＬ−ＤＰ−９２６５、ＡＬ−ＤＰ−９２６６、ＡＬ−ＤＰ−９２６７、ＡＬ−ＤＰ−９２６８、ＡＬ−ＤＰ−９２６９、ＡＬ−ＤＰ−９２７０、ＡＬ−ＤＰ−９２７１、ＡＬ−ＤＰ−９２７２、ＡＬ−ＤＰ−９２７３、ＡＬ−ＤＰ−９２７４、ＡＬ−ＤＰ−９２７５、ＡＬ−ＤＰ−９２７６、ＡＬ−ＤＰ−９２７７、ＡＬ−ＤＰ−９２７９、ＡＬ−ＤＰ−９２８０、ＡＬ−ＤＰ−９２８１、ＡＬ−ＤＰ−９２８２、ＡＬ−ＤＰ−９２８３、ＡＬ−ＤＰ−９２８４、ＡＬ−ＤＰ−９２８５、ＡＬ−ＤＰ−９２８６、ＡＬ−ＤＰ−９２８７、ＡＬ−ＤＰ−９２８８およびＡＬ−ＤＰ−９２８９の群から選択される、請求項１０〜請求項１３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記ｄｓＲＮＡが、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１０〜請求項１４のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
前記修飾ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結した末端ヌクレオチドの群から選択される、請求項１５に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
前記修飾ヌクレオチドが、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、無塩基ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミダート、およびヌクレオチドを含む非天然塩基の群から選択される、請求項１５に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
細胞中のＡｈａ遺伝子の発現を阻害するための方法であって、
（ａ）該細胞中に二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を導入する工程であって、該ｄｓＲＮＡが相互に相補的な少なくとも２つの配列を含み、センス鎖が第１の配列を含み、アンチセンス鎖がＡｈａ１をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的な相補領域を含む第２の配列を含み、該相補領域が、３０ヌクレオチド長未満であり、該ｄｓＲＮＡが、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１および配列番号１８３の群から選択されるセンス鎖ならびに後者のセンス鎖と相補的であり、且つ配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２および配列番号１８４の群から選択されるアンチセンス鎖を有する第２のｄｓＲＮＡの標的配列内のＡｈａ遺伝子をコードするｍＲＮＡを切断する、工程、および
（ｂ）工程（ａ）で産生された細胞を、Ａｈａ遺伝子のｍＲＮＡ転写物を分解するのに十分な時間維持し、それにより、該細胞中のＡｈａ遺伝子の発現を阻害する、工程、を含む方法。
【請求項１９】
前記遺伝子がＡｈａ１遺伝子、好ましくはホモ・サピエンスＡｈａ１遺伝子である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ｄｓＲＮＡが、ＡＬ−ＤＰ−７３０１、ＡＬ−ＤＰ−７３０８、ＡＬ−ＤＰ−７３１８、ＡＬ−ＤＰ−７３２０、ＡＬ−ＤＰ−７３２２、ＡＬ−ＤＰ−７３２４、ＡＬ−ＤＰ−７３２５、ＡＬ−ＤＰ−７３２６、ＡＬ−ＤＰ−７３２７、ＡＬ−ＤＰ−７３２９、ＡＬ−ＤＰ−７３３１、ＡＬ−ＤＰ−７３３３、ＡＬ−ＤＰ−７３４０、ＡＬ−ＤＰ−７３４２、ＡＬ−ＤＰ−７３０３、ＡＬ−ＤＰ−７３０５、ＡＬ−ＤＰ−７３０７、ＡＬ−ＤＰ−７３０９、ＡＬ−ＤＰ−７３１６およびＡＬ−ＤＰ−７３３７、ＡＬ−ＤＰ−７３０４、ＡＬ−ＤＰ−７３１２、ＡＬ−ＤＰ−７３３９、ＡＬ−ＤＰ−７３４４、ＡＬ−ＤＰ−７３０６、ＡＬ−ＤＰ−７３１７、ＡＬ−ＤＰ−７３４６、ＡＬ−ＤＰ−７３１０、ＡＬ−ＤＰ−７３２３、ＡＬ−ＤＰ−７３３５、ＡＬ−ＤＰ−７３３８、ＡＬ−ＤＰ−７３４１、ＡＬ−ＤＰ−７３０２、ＡＬ−ＤＰ−７３１５、ＡＬ−ＤＰ−７３２８、ＡＬ−ＤＰ−７３３０、ＡＬ−ＤＰ−７３３６、ＡＬ−ＤＰ−７３４５、ＡＬ−ＤＰ−９２５０、ＡＬ−ＤＰ−９２５１、ＡＬ−ＤＰ−９２５２、ＡＬ−ＤＰ−９２５３、ＡＬ−ＤＰ−９２５４、ＡＬ−ＤＰ−９２５５、ＡＬ−ＤＰ−９２５６、ＡＬ−ＤＰ−９２５７、ＡＬ−ＤＰ−９２５８、ＡＬ−ＤＰ−９２５９、ＡＬ−ＤＰ−９２６０、ＡＬ−ＤＰ−９２６１、ＡＬ−ＤＰ−９２６２、ＡＬ−ＤＰ−９２６３、ＡＬ−ＤＰ−９２６４、ＡＬ−ＤＰ−９２６５、ＡＬ−ＤＰ−９２６６、ＡＬ−ＤＰ−９２６７、ＡＬ−ＤＰ−９２６８、ＡＬ−ＤＰ−９２６９、ＡＬ−ＤＰ−９２７０、ＡＬ−ＤＰ−９２７１、ＡＬ−ＤＰ−９２７２、ＡＬ−ＤＰ−９２７３、ＡＬ−ＤＰ−９２７４、ＡＬ−ＤＰ−９２７５、ＡＬ−ＤＰ−９２７６、ＡＬ−ＤＰ−９２７７、ＡＬ−ＤＰ−９２７９、ＡＬ−ＤＰ−９２８０、ＡＬ−ＤＰ−９２８１、ＡＬ−ＤＰ−９２８２、ＡＬ−ＤＰ−９２８３、ＡＬ−ＤＰ−９２８４、ＡＬ−ＤＰ−９２８５、ＡＬ−ＤＰ−９２８６、ＡＬ−ＤＰ−９２８７、ＡＬ−ＤＰ−９２８８およびＡＬ−ＤＰ−９２８９の群から選択される、請求項１８または請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法をｉｎ ｖｉｔｒｏで行う、請求項１８〜請求項２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
Ａｈａ発現によって媒介される病理学的過程を治療、予防、または管理する方法であって、治療または予防有効量のｄｓＲＮＡをかかる治療、予防、または管理を必要とする患者に投与する工程を含み、該ｄｓＲＮＡが相互に相補的な少なくとも２つの配列を含み、センス鎖が第１の配列を含み、アンチセンス鎖がＡｈａ１をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的な相補領域を含む第２の配列を含み、該相補領域が、３０ヌクレオチド長未満であり、該ｄｓＲＮＡが、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１および配列番号１８３の群から選択されるセンス鎖ならびに後者のセンス鎖と相補的であり、且つ配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２および配列番号１８４の群から選択されるアンチセンス鎖を有する第２のｄｓＲＮＡの標的配列内のＡｈａ遺伝子をコードするｍＲＮＡを切断する、方法。
【請求項２３】
前記ｄｓＲＮＡが、ＡＬ−ＤＰ−７３０１、ＡＬ−ＤＰ−７３０８、ＡＬ−ＤＰ−７３１８、ＡＬ−ＤＰ−７３２０、ＡＬ−ＤＰ−７３２２、ＡＬ−ＤＰ−７３２４、ＡＬ−ＤＰ−７３２５、ＡＬ−ＤＰ−７３２６、ＡＬ−ＤＰ−７３２７、ＡＬ−ＤＰ−７３２９、ＡＬ−ＤＰ−７３３１、ＡＬ−ＤＰ−７３３３、ＡＬ−ＤＰ−７３４０、ＡＬ−ＤＰ−７３４２、ＡＬ−ＤＰ−７３０３、ＡＬ−ＤＰ−７３０５、ＡＬ−ＤＰ−７３０７、ＡＬ−ＤＰ−７３０９、ＡＬ−ＤＰ−７３１６およびＡＬ−ＤＰ−７３３７、ＡＬ−ＤＰ−７３０４、ＡＬ−ＤＰ−７３１２、ＡＬ−ＤＰ−７３３９、ＡＬ−ＤＰ−７３４４、ＡＬ−ＤＰ−７３０６、ＡＬ−ＤＰ−７３１７、ＡＬ−ＤＰ−７３４６、ＡＬ−ＤＰ−７３１０、ＡＬ−ＤＰ−７３２３、ＡＬ−ＤＰ−７３３５、ＡＬ−ＤＰ−７３３８、ＡＬ−ＤＰ−７３４１、ＡＬ−ＤＰ−７３０２、ＡＬ−ＤＰ−７３１５、ＡＬ−ＤＰ−７３２８、ＡＬ−ＤＰ−７３３０、ＡＬ−ＤＰ−７３３６、ＡＬ−ＤＰ−７３４５、ＡＬ−ＤＰ−９２５０、ＡＬ−ＤＰ−９２５１、ＡＬ−ＤＰ−９２５２、ＡＬ−ＤＰ−９２５３、ＡＬ−ＤＰ−９２５４、ＡＬ−ＤＰ−９２５５、ＡＬ−ＤＰ−９２５６、ＡＬ−ＤＰ−９２５７、ＡＬ−ＤＰ−９２５８、ＡＬ−ＤＰ−９２５９、ＡＬ−ＤＰ−９２６０、ＡＬ−ＤＰ−９２６１、ＡＬ−ＤＰ−９２６２、ＡＬ−ＤＰ−９２６３、ＡＬ−ＤＰ−９２６４、ＡＬ−ＤＰ−９２６５、ＡＬ−ＤＰ−９２６６、ＡＬ−ＤＰ−９２６７、ＡＬ−ＤＰ−９２６８、ＡＬ−ＤＰ−９２６９、ＡＬ−ＤＰ−９２７０、ＡＬ−ＤＰ−９２７１、ＡＬ−ＤＰ−９２７２、ＡＬ−ＤＰ−９２７３、ＡＬ−ＤＰ−９２７４、ＡＬ−ＤＰ−９２７５、ＡＬ−ＤＰ−９２７６、ＡＬ−ＤＰ−９２７７、ＡＬ−ＤＰ−９２７９、ＡＬ−ＤＰ−９２８０、ＡＬ−ＤＰ−９２８１、ＡＬ−ＤＰ−９２８２、ＡＬ−ＤＰ−９２８３、ＡＬ−ＤＰ−９２８４、ＡＬ−ＤＰ−９２８５、ＡＬ−ＤＰ−９２８６、ＡＬ−ＤＰ−９２８７、ＡＬ−ＤＰ−９２８８およびＡＬ−ＤＰ−９２８９の群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
細胞中のＡｈａ遺伝子の発現を阻害するためのベクターであって、該ベクターがｄｓＲＮＡの少なくとも１つの鎖をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節配列を含み、該ｄｓＲＮＡ鎖の１つが、Ａｈａ１をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的であり、該ｄｓＲＮＡが３０塩基対長未満であり、該ｄｓＲＮＡが、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８１および配列番号１８３の群から選択されるセンス鎖ならびに後者のセンス鎖と相補的であり、且つ配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６４、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８２および配列番号１８４の群から選択されるアンチセンス鎖を有する第２のｄｓＲＮＡの標的配列内のＡｈａ遺伝子をコードするｍＲＮＡを切断する、ベクター。
【請求項２５】
請求項２４に記載のベクターを含む細胞。

【公表番号】特表２００９−５３７１５３（Ｐ２００９−５３７１５３Ａ）
【公表日】平成２１年１０月２９日（２００９．１０．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１１２４６（Ｐ２００９−５１１２４６）
【出願日】平成１９年５月１８日（２００７．５．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６９２２９
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３７１５６
【国際公開日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【出願人】（５０８２９０９１０）アルニラム　ファーマシューティカルズ，　インコーポレイテッド (8)
【出願人】（５０１２４４２２２）ザ　スクリプス　リサーチ　インスティテュート (33)
【Ｆターム（参考）】