ＣＤ１３８を標的とする剤及びその使用
【課題】実質的にそのマウス相当物の抗原結合領域を保持し、抗原に対する結合親和性の向上、及び標的細胞へのより均一な結合の少なくともいずれかを示す、ヒトマウスキメラ抗体を開示する。
【解決手段】ＣＤ１３８に対する非ヒト抗体の抗原結合領域（ＡＢＲ）と、少なくとも一部がヒト抗体のものである、更なる抗体領域と、を含む、ＣＤ１３８を認識する改変された標的抗体であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくともいずれかである抗体、（ａ）前記非ヒト抗体のＣＤ１３８に対する結合親和性を超える結合親和性でＣＤ１３８に結合する抗体、（ｂ）ＣＤ１３８発現細胞のＣＤ１３８に均一に結合する抗体である。
【解決手段】ＣＤ１３８に対する非ヒト抗体の抗原結合領域（ＡＢＲ）と、少なくとも一部がヒト抗体のものである、更なる抗体領域と、を含む、ＣＤ１３８を認識する改変された標的抗体であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくともいずれかである抗体、（ａ）前記非ヒト抗体のＣＤ１３８に対する結合親和性を超える結合親和性でＣＤ１３８に結合する抗体、（ｂ）ＣＤ１３８発現細胞のＣＤ１３８に均一に結合する抗体である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国特許仮出願第６１／０１６，６３０号明細書（２００７年１２月２６日出願）の利益を主張し、これらの全体を参照することにより本願に援用する。
【０００２】
本発明は、抗原ＣＤ１３８に対する改善された標的剤、該標的剤を含む組成物、及びこれらを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＣＤ１３８は、細胞外マトリックスの受容体として作用するものであり、多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞で高発現し、ＭＭ細胞の発生及び増殖の少なくともいずれかに影響を与えることが示されている。ＣＤ１３８はまた、数例を挙げると、卵巣癌腫細胞、腎臓癌腫細胞、胆嚢癌腫細胞、乳癌腫細胞、前立腺癌細胞、肺癌細胞、結腸癌腫細胞、ホジキンリンパ腫細胞、及び非ホジキンリンパ腫細胞細胞、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）細胞でも発現する。
【０００４】
本発明を説明するために、特に実施に関連する更なる詳細情報を提供するために、本明細書で用いられる特許文献などの刊行物及びその他の資料は、参照することにより援用される。便宜上、これらの刊行物については、その著者と発行年度を以下の本文中に記載するか、或いは添付の参考文献に著者名のアルファベット順に従って列挙する。
【０００５】
非特許文献１は、ＭＭ細胞の表面に発現するＣＤ１３８抗原に対する、マウスＩｇＧ１抗体Ｂ−Ｂ４の優れた結合性について報告している。非特許文献１はまた、エフェクタ分子としてマイタンシノイドＤＭ１を含む免疫複合体Ｂ−Ｂ４−ＤＭ１の、多発性骨髄腫細胞に対する細胞傷害活性が高いことについても報告している（特許文献１も参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００７／０１８３９７１号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｔａｓｓｏｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ，２００４，１０４（１２），ｐｐ．３６８８−３６９６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
Ｂ−Ｂ４に関連する、ある性質及び機能の少なくともいずれかを欠くＢ−Ｂ４に基づく標的剤、具体的には標的抗体に対する要求が依然として存する。かかる標的抗体は、１以上のヒト抗体の抗体領域を含んでいてもよい。特に、Ｂ−Ｂ４と同程度に有効にＣＤ１３８に結合するが、重篤な副作用を伴うことなくヒトに投与することができる、Ｂ−Ｂ４に基づくキメラ抗体に対する要求が存する。また、Ｂ−Ｂ４の結合親和性を超える結合親和性を有する標的剤に対する要求も依然として存する。また、そのマウスの相当物に比べて１以上の有利な性質を示す、Ｂ−Ｂ４に基づく該標的剤に対する要求も存する。これらの性質としては、特にＣＤ１３８発現腫瘍細胞とそれに付属する細胞を含む腫瘍細胞に対する抗原結合性の改善、及びより均一な結合性などが挙げられる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ＣＤ１３８に均一に結合させる方法であって、
ＣＤ１３８に対する非ヒト抗体の抗原結合領域と、
少なくとも一部がヒト抗体のものである、更なる抗体領域と、
を含む、改変された標的抗体を提供する工程と、
前記改変された標的抗体をＣＤ１３８発現細胞に接種する工程と、
を含み、
前記改変された標的抗体が、前記ＣＤ１３８発現細胞上で発現しているＣＤ１３８に均一に結合する方法に関する。
【００１０】
本発明はまた、免疫グロブリン重鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、前記免疫グロブリン重鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列が、配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、及び少なくとも９８％のいずれかの配列同一性を有し、前記免疫グロブリン重鎖及びその一部のいずれかを含む標的剤が、ＣＤ１３８を標的とする、単離ポリペプチドに関する。
【００１１】
免疫グロブリン重鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の残基３１〜３５、残基５１〜６８、及び残基９９〜１１１と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有していてもよく、標的剤は、改変された標的抗体であってもよい。
【００１２】
免疫グロブリン重鎖及びその一部のいずれかの定常領域は、ＩｇＧ４アイソタイプ定常領域であってもよい。
【００１３】
標的剤は、マウスヒトキメラ抗体であってもよい。
【００１４】
標的剤及び改変された標的抗体のいずれかは、ヒト化抗体であってもよい。
【００１５】
単離ポリペプチドは更に、免疫グロブリン軽鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列を更に含んでもよく、前記免疫グロブリン軽鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、及び少なくとも９８％のいずれかの配列同一性を有していてもよい。
【００１６】
単離ポリペプチドは更に、免疫グロブリン軽鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列を更に含んでいてもよく、前記免疫グロブリン軽鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列の残基２４〜３４、残基５０〜５６、及び残基８９〜９７と、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、及び少なくとも９７％のいずれかの配列同一性を有する。
【００１７】
免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一であってもよい。
【００１８】
免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一であってもよい。
【００１９】
本発明はまた、
ＣＤ１３８に対する非ヒト抗体の抗原結合領域と、
少なくとも一部がヒト抗体のものである、更なる抗体領域と、
を含み、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくともいずれかであるＣＤ１３８を認識する改変された標的抗体に関する、
（ａ）前記非ヒト抗体のＣＤ１３８に対する結合親和性を超える結合親和性でＣＤ１３８に結合する抗体、
（ｂ）ＣＤ１３８発現細胞のＣＤ１３８に均一に結合する抗体。
【００２０】
更なる抗体領域は、ヒト抗体の重鎖定常領域及びその一部のいずれかを含む、少なくとも１つの定常領域であってもよく、ここで改変された標的抗体はＩｇＧ４アイソタイプのものである。
【００２１】
改変された標的抗体は、キメラ抗体であってもよく、非ヒト抗体は、Ｂ−Ｂ４であってもよい。
【００２２】
改変された標的抗体は、ヒト化抗体であってもよく、非ヒト抗体は、Ｂ−Ｂ４であってもよい。
【００２３】
重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、及び少なくとも９８％のいずれかの配列同一性を有していてもよい。
【００２４】
改変された標的抗体は、少なくとも１本の軽鎖であって、そのアミノ酸配列が配列番号２で表されるアミノ酸配列と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、及び少なくとも９８％のいずれかの配列同一性を有する軽鎖を含んでいてもよい。
【００２５】
重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の残基３１〜３５、残基５１〜６８、及び残基９９〜１１１の少なくともいずれかと、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、及び１００％のいずれかの割合の配列同一性を有していてもよい。重鎖のアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列の残基２４〜３４、残基５０〜５６、及び残基８９〜９７の少なくともいずれかと、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、及び１００％のいずれかの配列同一性を有していてもよい。
【００２６】
更なる抗体領域は、
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１２３〜４４８、及び
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１０８〜２１４、の少なくともいずれかと、
以下の少なくともいずれかの突然変異とを含んでいてもよい、
改変された標的抗体の抗体依存性細胞傷害性及び補体依存性細胞傷害性の少なくともいずれかを、維持させる或いは低下させる突然変異、
改変された標的抗体を安定化させる突然変異。
【００２７】
更なる抗体領域は、ヒト抗体の定常重鎖領域であってもよい。
【００２８】
改変された標的抗体は、１５０％、１４０％、１３０％、１２０％、１１０％、１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、及び５０％のいずれか未満のターゲティング変動で、ＣＤ１３８に結合することができる。
【００２９】
重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、及び少なくとも９８％のいずれかの配列同一性を有していてもよい。
【００３０】
改変された標的抗体は、少なくとも１本の軽鎖であって、そのアミノ酸配列が配列番号２で表されるアミノ酸配列と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、及び少なくとも９８％のいずれかの配列同一性を有する軽鎖を含んでいてもよい。
【００３１】
重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の残基３１〜３５、残基５１〜６８、及び残基９９〜１１１と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、及び少なくとも９５％のいずれかの配列同一性を有していてもよい。
【００３２】
重鎖のアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列の残基２４〜３４、残基５０〜５６、及び残基８９〜９７と、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、及び少なくとも９７％のいずれかの配列同一性を有していてもよい。
【００３３】
本発明はまた、改変された標的抗体と、薬学的に許容される担体と、を含む、或いは本質的にこれらから成る、医薬組成物に関する。
【００３４】
改変された標的抗体を産生するハイブリドーマもまた、本発明の一部である。
【００３５】
本発明はまた、改変された標的抗体を含む、抗体に基づくアッセイを含む。
【００３６】
本発明は、医薬品で使用するための、本明細書に記載する改変された標的抗体を提供する。具体的には、改変された標的抗体は、
ＣＤ１３８に対する非ヒト抗体の抗原結合領域と、
少なくとも一部がヒト抗体のものである、更なる抗体領域と、
を含む。
【００３７】
より具体的には、改変された標的抗体は、腫瘍細胞を標的とする治療で用いるためのものである。
【００３８】
本発明はまた、腫瘍細胞を標的とする薬品の製造における、本明細書に記載する改変された標的抗体の使用を提供する。具体的には、改変された標的抗体は、
ＣＤ１３８に対する非ヒト抗体の抗原結合領域と、
少なくとも一部がヒト抗体のものである、更なる抗体領域と、
を含む。
【００３９】
より具体的には、本発明のこれらの医学的使用では、改変された標的抗体は、ＣＤ１３８発現細胞を有する個体に投与されるものである。更に、改変された標的抗体は、ＣＤ１３８発現細胞上で発現しているＣＤ１３８に均一に結合することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、結合したエフェクタ分子を有するｎＢＴ０６２の模式図を提供する。
【図２】図２は、ＢＴ０６２の化学式である。
【図３】図３は、アンサマイトシンＰ−３のマイタンシノールへの変換を示す（立体化学は単純化するために省略する）。
【図４】図４は、代表的なＤＭ４の合成スキームを示す。
【図５】図５は、（ｎＢＴ０６２のＤＭ４への）抗体複合体化の概略図を示す。
【図６】図６は、ｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、ｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１、ｎＢＴ０６２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、及びｎＢＴ０６２抗体のＯＰＭ−２細胞への結合の分析を示す。様々な濃度のｎＢＴ０６２及び複合体を細胞に与え、ＦＡＣＳ分析によって平均蛍光を測定した。
【図７Ａ】図７Ａは、ＭＯＬＰ−８（ＣＤ１３８＋）及びＢＪＡＢ（ＣＤ１３８−）に対するｎＢＴ０６２−ＤＭｘ複合体のインビトロ細胞傷害性を表す。細胞を平底プレートで培養し、指示した濃度の免疫複合体とともに５日間インキュベートした。ＷＳＴ試薬を更に３時間添加して、細胞生存性を評価した。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＭＯＬＰ−８（ＣＤ１３８＋）及びＢＪＡＢ（ＣＤ１３８−）に対するｎＢＴ０６２−ＤＭｘ複合体のインビトロ細胞傷害性を表す。細胞を平底プレートで培養し、指示した濃度の免疫複合体とともに５日間インキュベートした。ＷＳＴ試薬を更に３時間添加して、細胞生存性を評価した。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ＭＯＬＰ−８（ＣＤ１３８＋）及びＢＪＡＢ（ＣＤ１３８−）に対するｎＢＴ０６２−ＤＭｘ複合体のインビトロ細胞傷害性を表す。細胞を平底プレートで培養し、指示した濃度の免疫複合体とともに５日間インキュベートした。ＷＳＴ試薬を更に３時間添加して、細胞生存性を評価した。
【図７Ｄ】図７Ｄは、ｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の細胞傷害活性を、遮断抗体（１μＭのｎＢＴ０６２）の存在下及び非存在下のいずれかで分析した。
【図８Ａ】図８Ａは、ＭＯＬＰ−８腫瘍細胞に接種した後の、経時的な（日）、ＰＢＳで処理した個々のマウスの腫瘍体積を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＭＯＬＰ−８腫瘍細胞に接種した後の、経時的な（日）、ｎＢＴ０６２抗体で処理した個々のマウスの腫瘍体積を示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、ＭＯＬＰ−８腫瘍細胞に接種した後の、経時的な（日）、遊離ＤＭ４で処理した個々のマウスの腫瘍体積を示す。
【図８Ｄ】図８Ｄは、ＭＯＬＰ−８腫瘍細胞に接種した後の、経時的な（日）、非標的複合体ｈｕＣ２４２−ＤＭ４で処理した個々のマウスの腫瘍体積を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、ＭＯＬＰ−８腫瘍細胞に接種した後の、経時的な（日）、ＰＢＳで処理した個々のマウスの腫瘍体積を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＭＯＬＰ−８腫瘍細胞に接種した後の、経時的な（日）、ｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４で処理した個々のマウスの腫瘍体積を示す。
【図９Ｃ】図９Ｃは、ＭＯＬＰ−８腫瘍細胞に接種した後の、経時的な（日）、Ｂ−Ｂ４−ＳＰＰ−ＤＭ１で処理した個々のマウスの腫瘍体積を示す。
【図９Ｄ】図９Ｄは、ＭＯＬＰ−８腫瘍細胞に接種した後の、経時的な（日）、ｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１で処理した個々のマウスの腫瘍体積を示す。
【図１０】図１０は、接種後の、経時的な（日）、ＣＢ．１７ ＳＣＩＤマウスにおけるＭＯＬＰ−８ヒト多発性骨髄腫異種移植片の平均腫瘍体積（＋／−ＳＤ）を表す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ＳＣＩＤマウスの嵩高いＭＯＬＰ−８腫瘍モデルにおける、ＣＤ１３８＋ＭＯＬＰ−８腫瘍細胞に対するｎＢＴ０６２−ＤＭｘの抗腫瘍活性を示す。各群について、腫瘍体積を平均（＋／−ＳＤ）で示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ＳＣＩＤマウスの嵩高いＭＯＬＰ−８腫瘍モデルにおける、ＣＤ１３８＋ＭＯＬＰ−８腫瘍細胞に対するｎＢＴ０６２−ＤＭｘの抗腫瘍活性を示す。各群について、腫瘍体積を平均（＋／−ＳＤ）で示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明は、標的剤、具体的にはＣＤ１３８標的抗体、より具体的には、改変されたＣＤ１３８標的抗体に関する。該標的剤を含む免疫複合体により、エフェクタ分子（１及び複数のいずれか）の標的部位への送達と、標的細胞、標的組織、及び標的器官とそれらの近傍のいずれかにおけるエフェクタ分子（１及び複数のいずれか）の部位特異的放出とが可能になる。エフェクタ分子は、標的部位において、免疫複合体の標的剤部分から切断／解離されることにより活性化される。
【００４２】
本発明に係る抗体及びそれを含む免疫複合体の少なくともいずれかは、治療を必要としている被験体に投与してもよく、治療を必要とする被験体から単離した細胞に投与してもよい。エフェクタ分子（１及び複数のいずれか）は、標的細胞、標的組織、及び標的器官とそれらの近傍で切断／解離されて免疫複合体から放出され得る。
【００４３】
１例として、抗体ｎＢＴ０６２を呈色（ｃｈｒｏｍｏｇｒａｐｈｉｃ）アッセイで使用する。患者の、ホルマリンで固定したパラフィン包埋組織を提供する。抗体ｎＢＴ０６２を、一次抗体として添加すると、組織の表面で発現しているＣＤ１３８が抗体に結合する。検出抗体を添加して、ｎＢＴ０６２に結合させる。最終行程では、色素原を含む検出抗体と、ｎＢＴ０６２との結合を測定する。抗体ｎＢＴ０６２を用いて、造血細胞の中からヒト形質細胞を同定し、それにより種々の造血器腫瘍の診断を可能にする。方法はまた、特定の癌腫の進行を追うことを可能にする。Ｆｃ受容体との交差反応性の低下に起因して、マウス相当物とは対照的に、ｎＢＴ０６２を使用すると、非特異的検出の減少が観察される。
【００４４】
第２の例として、ｎＢＴ０６２抗体と、抗体ｎＢＴ０６２、並びにエフェクタ分子としての少なくとも１種の細胞傷害性の高い薬物及び免疫毒素のいずれかを含む免疫複合体とを提供し、癌患者に投与する。この例では、有効量のｎＢＴ０６２は、後に患者に静脈内投与して癌細胞に濃縮させる、治療に有効な量の免疫複合体から、ＣＤ１３８発現非腫瘍細胞を保護する。エフェクタ分子（１及び複数のいずれか）は、外的手段により抗体から放出されて、癌細胞における細胞死及び連続細胞周期停止を誘導する。
【００４５】
ＣＤ１３８、即ちシンデカン−１（ＳＹＮＤ１、ＳＹＮＤＥＣＡＮ、ＳＤＣ、ＳＣＤ１、ＣＤ１３８抗原としても記載される、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号：Ｐ１８８２７ ｈｕｍａｎ）は、元来上皮起源の細胞上に存在すると記載されており、後に造血細胞で見出された（Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ，１９８９）膜糖タンパク質である。ＣＤ１３８は、ヘパラン硫酸鎖を通して、可溶性分子（例えば、増殖因子ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ）、及び不溶性分子（例えば、細胞外マトリックス成分であるコラーゲン及びフィブロネクチン）に結合する、長い細胞外ドメインを有し（Ｌａｎｇｆｏｒｄ，１９９８；Ｙａｎｇ，２００７）、細胞外マトリックスの受容体として作用する。ＣＤ１３８はまた、接着性細胞が発現するヘパリン結合分子を通して細胞間接着を媒介する。ＣＤ１３８は骨髄腫細胞の増殖因子の共受容体としての役割を有することが示されている（Ｂｉｓｐｉｎｇ，２００６）。形質細胞の分化に関する研究で、ＣＤ１３８を分化抗原としても考えなければならないことが示された（Ｂａｔａｉｌｌｅ，２００６）。
【００４６】
悪性造血では、ＣＤ１３８は、ＭＭ細胞、卵巣癌腫細胞、腎臓癌腫細胞、胆嚢癌腫細胞、乳癌腫細胞、前立腺癌細胞、肺癌細胞、結腸癌腫細胞、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫の細胞、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）の細胞（Ｈｏｒｖａｔｈｏｖａ，１９９５）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）の細胞、急性骨髄芽球性白血病（ＡＭＬ）の細胞（Ｓｅｆｔａｌｉｏｇｌｕ，２００３（ａ）；Ｓｅｆｔａｌｉｏｇｌｕ，２００３（ｂ））、固形組織肉腫細胞、結腸癌腫細胞、その他の造血器悪性腫瘍細胞、及びＣＤ１３８を発現する固形腫瘍細胞（Ｃａｒｂｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｓｅｂｅｓｔｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｃｈａｒｎａｕｘ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｏｒｏｓｚ ａｎｄ Ｋｏｐｐｅｒ，２００１）の大部分で高度に発現する。
【００４７】
ＣＤ１３８発現陽性であることが示されているその他の癌は、多くの卵巣腺癌、移行性細胞膀胱癌腫、腎臓明細胞癌腫、扁平上皮細胞肺癌腫；乳癌腫、及び子宮癌（例えば、Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｂａｒｂａｒｅｓｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｍｅｎｎｅｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ａｎｔｔｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｗｉｊｄｅｎｅｓ，２００２を参照）である。
【００４８】
正常なヒト造血コンパートメントでは、ＣＤ１３８発現は形質細胞に限定されており（Ｗｉｊｄｅｎｅｓ，１９９６；Ｃｈｉｌｏｓｉ，１９９９）、ＣＤ１３８は、末梢血リンパ球、単球、顆粒球、及び赤血球では発現しない。特に、ＣＤ３４＋幹細胞及びＣＤ３４＋前駆細胞は、ＣＤ１３８を発現せず、抗ＣＤ１３８ ｍＡｂは、造血幹細胞培養におけるコロニー形成単位の数に影響を与えない（Ｗｉｊｄｅｎｅｓ，１９９６）。非造血コンパートメントでは、ＣＤ１３８は、肺、肝臓、皮膚、腎臓、及び腸内の単純及び重層化上皮上で主に発現する。内皮細胞上では僅かな染色しか見られなかった（Ｂｅｒｎｆｉｅｌｄ，１９９２；Ｖｏｏｉｊｓ，１９９６）。ＣＤ１３８は、ヒトリンパ腫細胞において多様な形で存在することが報告されている（Ｇａｔｔｅｉ，１９９９）。
【００４９】
モノクローナル抗体Ｂ−Ｂ４、ＢＣ／Ｂ−Ｂ４、Ｂ−Ｂ２、ＤＬ−１０１、１ Ｄ４、ＭＩ１５、１．ＢＢ．２１０、２Ｑ１４８４、５Ｆ７、１０４−９、２８１−２、特にＢ−Ｂ４は、ＣＤ１３８に対して特異的であることが報告されている。これらのうちＢ−Ｂ４、１Ｄ４、及びＭＩ１５は、ＣＤ１３８のインタクトな分子とコアタンパク質の両方を認識し、同一或いは密接に関連するエピトープ、を認識することが示された（Ｇａｔｔｅｉ，１９９９）。これまでの研究では、Ｂ−Ｂ４は可溶性ＣＤ１３８を認識せず、膜に結合した形のＣＤ１３８のみを認識することが報告されている（Ｗｉｊｄｅｎｅｓ，２００２）。
【００５０】
Ｂ−Ｂ４（マウスＩｇＧ１ ｍＡｂ）は、ヒトシンデカン−１（ＣＤ１３８）上のコアタンパク質の残基９０〜９５の線状エピトープに結合する（Ｗｉｊｄｅｎｅｓ，１９９６；Ｄｏｒｅ，１９９８）。ＣＤ１３８の発現パターンに一致して、Ｂ−Ｂ４は、形質細胞株ＲＰＭＩ８２２６に強く反応するが、内皮細胞には反応しないことが示された。またＣＤ１３８の発現パターンに一致して、Ｂ−Ｂ４はまた、上皮細胞株Ａ４３１（ケラチノサイト由来）及びＨｅｐＧ２（肝細胞由来）と反応した。免疫毒素Ｂ−Ｂ４−サポリンはまた、形質細胞株ＲＰＭＩ８２２６に対する毒性が強く、実際に遊離サポリンより遥かに毒性が強かった。しかしながら、試験した２種の上皮細胞株から、Ｂ−Ｂ４−サポリンは、細胞株Ａ４３１に対してのみ毒性を示したが、クローン原性アッセイでは、Ｂ−Ｂ４サポリンは、Ａ４３１細胞の増殖に対して阻害効果を示さなかった（Ｖｏｏｉｊｓ，１９９６）。他の研究者が、ＭＭ−関連抗原が腫瘍に対して特異性を有しないことを報告した（Ｃｏｕｔｕｒｉｅｒ，１９９９）。
【００５１】
ある成分から「本質的に成る」抗体は、本発明の状況では、該抗体が、特定の成分と、抗体の基本的特徴に実質的に影響を与えない任意の追加的な物質及び成分のいずれかから成ることを意味する。
本発明において使用される用語「腫瘍細胞」は、固形腫瘍の一部を形成してもしなくてもよい癌細胞及び前癌性細胞を含む。
本発明に係る「標的剤」は、標的細胞により発現される分子に結合することができ、ペプチド及び非ペプチドを含む。具体的には、本発明に係る標的剤としては、標的抗体、及び非免疫グロブリン標的分子が挙げられる。これらの分子は、ＡＦＦＩＬＩＮ（登録商標）分子、ＡＮＴＩＣＡＬＩＮＳ（登録商標）、及びＡＦＦＩＢＯＤＩＥＳ（登録商標）などの非免疫グロブリンタンパク質に基づいたものであってもよいが、非免疫グロブリンタンパク質はこれらに限定されない。非免疫グロブリン標的分子はまた、標的ＤＮＡ及びＲＮＡオリゴヌクレオチド（アプタマー）等の非ペプチド標的分子も含むが、生理学的リガンド、特にＣＤ１３８等の、対象とする抗原のリガンドも含む。
【００５２】
本発明に係る「標的抗体」は、天然の抗体であるか、天然の抗体に基づく抗体であるか、合成的或いは遺伝子工学的に産生され、対象細胞（１及び複数のいずれか）（標的細胞（１及び複数のいずれか））上の抗原に結合する。本発明に係る標的抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片が挙げられる。標的抗体は、例えば、その標的細胞に対する親和性を改善する（Ｒｏｓｓ，２００３）、或いはその免疫原性を低下させるように改変してもよい。標的抗体は、エフェクタ分子を含むリポソーム製剤に結合することができる（Ｃａｒｔｅｒ，２００３）。抗体断片は、インタクトな抗体の一部、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合領域及び可変領域のいずれかを含む。本発明に係る抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片が挙げられるが、二重特異性抗体；ドメイン抗体（ｄＡｂ）（Ｗａｒｄ，１９８９；米国特許第６，００５，０７９号明細書）；線状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体も含む。単鎖可変断片抗体（ｓｃＦｖ）では、重鎖及び軽鎖（ＶＨ及びＶＬ）は、例えば、配列（グリシン４セリン）ｎを有する短いアミノ酸リンカーにより結合することができ、このリンカーは、２つのドメインが機能的抗原結合ポケットを構築することを可能にするのに十分な柔軟性を有する。種々のシグナル配列の付加により、標的抗体のより正確なターゲティングが可能になる場合がある。軽鎖定常領域（ＣＬ）の付加により、ジスルフィド結合を介した二量体化が可能になる場合があり、これによって安定性及び結合力が増す。ｓｃＦｖを構築するための可変領域は、対象とする標的に対するｍＡｂが利用可能である場合、親ハイブリドーマから抽出されたｍＲＮＡの可変領域をクローン化するＲＴ−ＰＣＲにより得ることができる。或いは、ｓｃＦｖは、ファージディスプレイ技術により新たに作製することができる（Ｓｍｉｔｈ，２００１）。本明細書で使用する用語「機能的断片」は、標的抗体について用いられる場合、該標的抗体の一部分であって、該抗体が特異的に結合する抗原に特異的に結合することができる一部分を意味することを意図する。本発明の二重特異性抗体は、例えば、標的組織に対して反応性を有する少なくとも１本の腕と、リンカー部分に対して反応性を有する１本の腕を有することができる（米国特許出願公開第２００２／０００６３７９号明細書）。本発明の二重特異性抗体はまた、標的細胞上の２種以上の抗原に結合することができる（Ｃａｒｔｅｒ，２００３）。本発明の抗体は、例えば、チオール基を導入するために、システイン残基を導入することにより修飾してもよい（Ｏｌａｆｓｅｎ，２００４）。
【００５３】
本発明に従って、標的抗体はいずれの源に由来してもよく、ラクダ抗体、マウス抗体、キメラヒト／マウス抗体、及びキメラヒト／サル抗体、特にｎＢＴ０６２のようなキメラヒト／マウス抗体のいずれであってもよいが、これらに限定されない。
【００５４】
ヒト化抗体は、ヒト抗体及び非ヒト抗体に由来する配列を含む抗体であり、これもまた本発明の範囲内である。抗体をヒト化するのに好適な方法としては、ＣＤＲグラフティング（相補性決定領域グラフティング）（欧州特許第０ ２３９ ４００号明細書；国際公開第９１／０９９６７号；米国特許第５，５３０，１０１号明細書；及び米国特許第５，５８５，０８９号明細書）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）及び再表面化（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第０ ５９２ １０６号明細書；欧州特許第０ ５１９ ５９６号明細書；Ｐａｄｌａｎ，１９９；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４）、鎖シャフリング（米国特許第５，５６５，３３２号明細書）のいずれか、並びにＤｅＩｍｍｕｎｏｓａｔｉｏｎ（商標）（Ｂｉｏｖａｔｉｏｎ，ＬＴＤ）が挙げられる。ＣＤＲグラフティングでは、例えば、ｍＡｂ Ｂ−Ｂ４由来のマウス相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ヒト可変フレームワークにグラフトし、次いでこれをヒト定常領域に結合させて、ヒトＢ−Ｂ４抗体（ｈＢ−Ｂ４）を作り出す。ＭＹＬＯＴＡＲＧ（Ｓｉｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００１）、及びＨＥＣＥＰＴＩＮ（Ｐｅｇｒａｍ ｅｔ ａｌ，１９９８）を含む、ＣＤＲグラフティングによりヒト化された幾つかの抗体が、現在臨床使用されている。
【００５５】
再表面化技術は、分子モデリング、統計解析、及び突然変異誘発の組み合わせを用いて、標的とするホストの既知の抗体の表面に類似するように、抗体可変領域の非ＣＤＲ表面を変化させる。抗体を再表面化するためのストラテジー及び方法、並びに異なるホスト内で抗体の免疫原性を低下させるための他の方法は、例えば、米国特許第５，６３９，６４１号明細書に開示されている。ヒト抗体は、ファージディスプレイ法を含む、当該技術分野において既知である種々の方法により作製することができる。また、米国特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号明細書、同第５，５４５，８０６号明細書、及び同第５，８１４，３１８号明細書；並びに国際公開第９８／４６６４５号、同第９８／５０４３３号、同第９８／２４８９３号、同第９８／１６６５４号、同第９６／３４０９６号、同第９６／３３７３５号、及び同第９１／１０７４１号を参照。
【００５６】
キメラヒト／マウス抗体或いはキメラヒト／サル抗体など、何らかの非天然修飾が施されている標的抗体、例えば、その標的細胞に対する親和性を改善する、或いはその免疫原性を低下させるよう改変されたヒト化抗体（１及び複数のいずれか）、また抗体断片、特に何らかの非天然修飾が施されている該標的抗体の機能的断片、ダイアボディ、ドメイン抗体、線状抗体、単鎖抗体分子、及び多重特異性抗体を、本明細書においては、改変された標的抗体と称する。
【００５７】
キメラ抗体は、その基となる非ヒト抗体、例えばマウス抗体の抗体結合領域（ＡＢＲ及びＦａｂ領域のいずれか）を保持しているが、定常領域は、例えばヒト抗体のものであってもよい。一般に、抗体のキメラ化及び抗体の定常領域の交換の少なくともいずれかは、抗原結合に寄与する抗体の領域がこの交換により影響を受けないため、抗体の親和性に影響を与えない。本発明の好ましい実施形態では、改変された、特にキメラ化された本発明の抗体は、その基となるそれぞれの非ヒト抗体よりも高い結合親和性（ＫＤ値により表される）を有することができる。特に、マウスＢ−Ｂ４に基づくｎＢＴ０６２抗体（１及び複数のいずれか）は、マウスＢ−Ｂ４よりも高い抗体親和性を有することができる。本発明の他の好ましい実施形態においては、改変された／キメラ化された抗体を含む免疫複合体もまた、このような高い抗体親和性を示す。これらの免疫複合体はまた、ある実施形態では、そのＢ−Ｂ４を含む相当物より腫瘍の減少量が多い等の、更なる有利な特性を示す場合がある。好ましい実施形態においては、改変された、特にキメラ化された標的抗体は、１．６未満、１．５未満、約１．４或いは１．４未満の解離定数ＫＤ（ｎＭ）によって特徴付けられる結合親和性を示し、一方そのマウス相当物は、約１．６及び１．６超のいずれか解離定数ＫＤ（ｎＭ）によって特徴付けられる。２．６未満、２．５未満、２．４未満、２．３未満、２．２未満、２．１未満、２．０未満、１．９未満、及び約１．９のいずれかの解離定数ＫＤ（ｎＭ）によって特徴付けられる、標的抗体のような標的剤を含む免疫複合体が好ましいが、マウスの相当物抗体を含む免疫複合体は、約２．６、及び２．６超のいずれかの解離定数ＫＤ（ｎＭ）によって特徴付けられる（表３、材料及び方法と比較）。
【００５８】
完全ヒト抗体を用いてもよい。これらの抗体は、ファージディスプレイアプローチにより選択することができ、この場合ＣＤ１３８及びその抗原決定基のいずれかが用いられて、例えばＢ−Ｂ４可変領域を発現しているファージに選択的に結合する（Ｋｒｅｂｓ，２００１を参照）。このアプローチを、親和性成熟技術と組み合わせることは有利であり、これにより抗体の親和性が向上する。本明細書で抗体と称されるものは全て、単離された抗体である。
【００５９】
１つの実施形態では、標的抗体は、コンジュゲートされていない形態であり、中程度に内在化される、或いは内在化が不十分である。中程度の内在化は、３７℃で３時間インキュベートした後の抗体の内在化の約３０％〜約７５％に相当し、不十分な内在化は、約０．０１％〜約３０％に相当する。他の好ましい実施形態では、標的抗体は、ＣＤ１３８、例えば、抗体Ｂ−Ｂ４、ＢＣ／Ｂ−Ｂ４、Ｂ−Ｂ２、ＤＬ−１０１、１ Ｄ４、ＭＩ１５、１．ＢＢ．２１０、２Ｑ１４８４、５Ｆ７、１０４−９、２８１−２、特にＢ−Ｂ４に結合する。ハイブリドーマ細胞（ＳＰ０２／０骨髄腫細胞をＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞とハイブリダイズさせることにより作製した）は、２００７年１２月１１日に、ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １，Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）に寄託されている。これらのＢ−Ｂ４発現ハイブリドーマ細胞の識別番号は、ＤＳＭ ＡＣＣ２８７４である。別の実施形態では、標的抗体は、細胞表面に発現していないＣＤ１３８に実質的に結合しない。本発明の状況では、「ｎＢＴ０６２標的抗体」のように、特定の抗体の名称を用語「標的抗体」と組み合わせたとき、これは、この標的抗体が抗体ｎＢＴ０６２の結合特異性を有することを意味する。標的抗体が、特定の抗体に「基づく」と言われる場合、これは、この標的抗体がこの抗体の結合特異性を有するが、標的抗体の上記記載に一致するいずれの形態をとってもよいことを意味する。本発明の状況では、「ＣＤ１３８標的抗体」のように、特定の抗原の名称を用語「標的抗体」と組み合わせたとき、これは、この標的抗体がＣＤ１３８に対する結合特異性を有することを意味する。本発明の状況では、標的抗体が、「細胞表面で発現するＣＤ１３８を選択的に標的とする」のように、「選択的に」何かをする、或いは何かに対して「選択的」であると言うとき、これは、与えられた例の場合、他のいずれかの抗原と比べて、細胞表面に発現するＣＤ１３８に対して有意な選択性が存在する（即ち、ＣＤ１３８陰性細胞に比べて、ＣＤ１３８陽性細胞に対する親和性が高い）ことを意味する。所定の環境における有害な副作用は、この選択性によって実質的に低減されるか、或いは回避されることさえもある。
【００６０】
本発明に係る「非免疫グロブリン標的分子」は、非免疫グロブリンタンパク質、及び非ペプチド性標的分子に由来する標的分子を含む。この定義に含まれる小さな非免疫グロブリンタンパク質は、特に表面に発現するＣＤ１３８に対して特異的親和性を有するよう設計される。これらの小さな非免疫グロブリンタンパク質としては、１０ｋＤａ〜２０ｋＤａ等の比較的低分子量のＡｆｆｉｌｉｎ（登録商標）分子等の、スカフォールドに基づく改変された分子を含む。適切なスカフォールドとしては、例えば、ガンマクリスタリンが挙げられる。これらの分子は、天然の状態では、標的分子に対する非特異的結合活性を有する。溶媒に曝露されたアミノ酸の局所的に定義されたランダム化を通して、タンパク質表面を改変することにより、全く新しい結合部位が作り出される。前者の非結合タンパク質は、それによって特異的結合タンパク質に変換される。このような分子は、ＣＤ１３８等の標的に結合し、１種以上のエフェクタ分子の特異的送達を可能にするよう、特別に設計することができる（ｗｗｗ．ｓｃｉｌｐｒｏｔｅｉｎｓ．ｃｏｍにおけるｓｃｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧｍｂＨ，２００４を参照）。別の種類の非免疫グロブリン標的分子は、リポカリンに由来し、例えば、若干免疫グロブリンの構造に類似している、ＡＮＴＩＣＡＬＩＮＳ（登録商標）が挙げられる。しかしながら、リポカリンは、１６０〜１８０アミノ酸残基を有する単一ポリペプチドから構成されている。リポカリンの結合ポケットは、高親和性及び特異性により対象分子を認識するよう再形成することができる（例えば、Ｂｅｓｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９を参照）。商標Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）（Ａｆｆｉｂｏｄｙ ＡＢ）として市販されているもの等の、人工細菌受容体もまた、本発明の範囲内である。これらの人工細菌受容体は、小さく単純なタンパク質であり、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインのうち１つのスカフォールドに基づいた、３つのヘリックスバンドルから構成されていてもよい（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）。これらの分子は、多くの免疫グロブリンに類似の結合特性を有するが、実質的に小さく（１０ｋＤａを超えない分子量を有することが多い）、また比較的安定である。好適な人工細胞受容体分子は、例えば、米国特許第５，８３１，０１２号明細書、同第６，５３４，６２８号明細書、及び同第６，７４０，７３４号明細書に記載されている。
【００６１】
本発明に係る「エフェクタ分子」は、標的剤、特に標的抗体及び改変された標的抗体の少なくともいずれかに結合し、例えば、標的細胞（１及び複数のいずれか）にアポトーシス、別の種類のいずれかの細胞死及び連続細胞周期停止のいずれか等の所望の効果を及ぼす分子及び誘導体のいずれか、並びにその類似体のいずれかである。本発明に係るエフェクタ分子は、標的細胞に所望の効果を及ぼすことができる分子を含み、毒素、薬物、特に低分子量細胞傷害性薬物、放射性核種、生物反応調節剤、ポア形成剤、リボヌクレアーゼ、アポトーシス誘導活性を有するアポトーシス性シグナル伝達カスケードのタンパク質、細胞傷害性酵素、プロドラッグ活性化酵素、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体及びサイトカインのいずれか、並びにその機能的誘導体と、類似体／断片との少なくともいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。毒素は、ジフテリア毒素及び外毒素Ａのいずれか等であるがこれらに限定されない細菌毒素、リシン等であるがこれらに限定されない植物毒素を含んでいてもよい。アポトーシス誘導活性を有するアポトーシス性シグナル伝達カスケードのタンパク質としては、グランザイムＢ、グランザイムＡ、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９、切頭型Ｂｉｄ（ｔＢｉｄ）、Ｂａｘ、及びＢａｋが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
好ましい実施形態では、エフェクタは、特に免疫複合体の標的抗体の基となる抗体の天然型の内在化能が不十分であるとき、免疫複合体の内部エフェクタ送達を増加させる。別の好ましい実施形態では、エフェクタは、その天然型では非選択的である。ある実施形態では、エフェクタは、天然型であるとき、全身毒性を含む、高い非選択的毒性を有する。本発明のエフェクタ分子の「天然型」は、標的剤に結合して、免疫複合体を形成する前のエフェクタ分子である。別の好ましい実施形態では、エフェクタ分子の非選択的毒性は、標的剤に複合体化すると実質的になくなる。別の好ましい実施形態では、エフェクタ分子は、標的細胞に到達したとき、標的細胞において死及び連続細胞周期停止のいずれかを引き起こす。本発明に係る薬物−エフェクタ分子としては、例えば、マイタンシノイド、ドラスタチン、アウリスタチン、及びクリトフィシン等のチューブリン重合の阻害剤として作用する、高い細胞傷害性を有する小さい薬物；ＣＣ−１０６５類似体及び誘導体のいずれか、及びデュオカルマイシン等のＤＮＡアルキル化剤（米国特許第５，４７５，０９２号明細書；同第５，５８５，４９９号明細書；同第６，７１６，８２１号明細書）；カリチアマイシン及びエスペラミシン等のエイジイン抗生物質；並びに強力なタキソイド（タキサン）薬物（Ｐａｙｎｅ，２００３）、を含む薬物が挙げられるが、これらに限定されない。マイタンシノイド及びカリチアマイシンが特に好ましい。エフェクタマイタンシノイドとしては、合成マイタンシノール、並びにマイタンシノール類似体及び誘導体が挙げられるが、これらに限定されない、任意の起源のマイタンシノイドが挙げられる。ドキソルビシン、ダウノマイシン、メトトレキサート、ビンブラスチン、ネオカルチノスタチン、マクロマイシン、トレニモン、及びα−アマニチンは、本発明の範囲内の幾つかの他のエフェクタ分子である。また、エフェクタ分子としてのアンチセンスＤＮＡ分子も本発明の範囲内である。例えば、特定の薬物及び薬物のクラスのいずれかの名称を、本明細書で用語「エフェクタ」及び「エフェクタ分子」のいずれかと組み合わせるとき、その特定の薬物及び薬物のクラスのいずれかに基づく本発明に係る免疫複合体のエフェクタに言及する。
【００６３】
マイタンシンは、元々エチオピアの灌木であるＭａｙｔｅｎｕｓ ｓｅｒｒａｔａに由来する天然物である（Ｒｅｍｉｌｌａｒｄ，１９７５；米国特許第３，８９６，１１１号明細書）。この薬物は、チューブリン重合を阻害し、その結果有糸分裂の遮断、及び細胞死が生じる（Ｒｅｍｉｌｌａｒｄ，１９７５；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ，１９７７；Ｋｕｐｃｈａｎ，１９７８）。マイタンシンの細胞傷害性は、ビンカアルカノイド及びタキソールのいずれか等の、チューブリン重合に影響を与える、臨床的に用いられている抗癌剤より２００〜１０００倍高い。しかしながら、マイタンシンの臨床試験により、その高い全身毒性のために治療域を欠くことが示された。マイタンシン及びマイタンシノイドは、細胞傷害性は高いが、それを癌治療において臨床的に使用することは、主に腫瘍に対する選択性が不十分であることに起因する、重篤な全身性副作用により非常に限定されている。マイタンシンを用いた臨床試験は、中枢神経系及び消化器系に重大な副作用を示した。
【００６４】
マイタンシノイドは、Ｔｒｅｗｉａ ｎｕｄｉｆｌｏｒａの種子組織を含む、他の植物からも単離されている（米国特許第４，４１８，０６４号明細書）。
【００６５】
ある微生物もまた、マイタンシノール、及びＣ−３マイタンシノールエステルのような、マイタンシノイドを産生する（米国特許第４，１５１，０４２号明細書）。
【００６６】
本発明は、例えば、米国特許第４，１３７，２３０号明細書；同第４，２４８，８７０号明細書；同第４，２５６，７４６号明細書；同第４，２６０，６０８号明細書；同第４，２６５，８１４号明細書；同第４，２９４，７５７号明細書；同第４，３０７，０１６号明細書；同第４，３０８，２６８号明細書；同第４，３０８，２６９号明細書；同第４，３０９，４２８号明細書；同第４，３１３，９４６号明細書；同第４，３１５，９２９号明細書；同第４，３１７，８２１号明細書；同第４，３２２，３４８号明細書；同第４，３３１，５９８号明細書；同第４，３６１，６５０号明細書；同第４，３６２，６６３号明細書；同第４，３６４，８６６号明細書；同第４，３７１，５３３号明細書；同第４，４２４，２１９号明細書、及び同第４，１５１，０４２号明細書に開示されている、合成マイタンシノール及びマイタンシノール類似体を含む、任意の起源のマイタンシノイドに関する。
【００６７】
好ましい実施形態では、マイタンシノイドは、チオールを含有するマイタンシノイドであり、より好ましくは米国特許第６，３３３，４１０号明細書（Ｃｈａｒｉら）及びＣｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．（Ｃｈａｒｉ，１９９２）のいずれかに開示されているプロセスに従って製造される。
【００６８】
ＤＭ−１（Ｎ２−デアセチル−Ｎ２−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン）は、本発明の状況において好ましいエフェクタ分子である。ＤＭ１は、マイタンシンの３倍〜１０倍細胞傷害性が高く、腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体へ、ジスルフィド結合（１及び複数のいずれか）を介して、結合することにより、プロドラックに変換されている。あるこれらの複合体（時に「腫瘍活性化プロドラッグ」（ＴＡＰ）と呼ばれる）は、血液コンパートメントにおいて細胞傷害性ではない。その理由は、それらは標的細胞に結合して活性化され、内在化し、それにより薬物を放出するためである（Ｂｌａｅｔｔｌｅｒ，２００１）。幾つかの抗体−ＤＭ１複合体が開発されており（Ｐａｙｎｅ，２００３）、臨床試験で評価されている。例えば、結腸直腸癌患者のｈｕＣ２４２−ＤＭ１治療は、耐容性良好であり、検出可能な免疫反応を全く誘導せず、循環時間が長かった（Ｔｏｌｃｈｅｒ，２００３）。
【００６９】
マイタンシノイドＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシン（「ＤＭ３」とも呼ばれる）、及びＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシン（「ＤＭ４」とも呼ばれる）等であるが、これらに限定されない、他の特に好ましいマイタンシノイドは、立体障害のあるチオール結合を含む側鎖を含む。ＤＭ４の合成を図３及び図４に示し、本明細書の他の箇所に記載する。ＤＭ４は、そのαＣにメチル基を有する点でＤＭ１及びＤＭ３とは異なる。これにより、ＤＭ４が、リンカー、具体的にはこれに限定されないがジスルフィド結合を含むリンガーを介して、ｎＢＴ０６２のような標的剤に結合するとき、立体障害が生じる。立体障害のあるチオール基を有する広範なマイタンシノイド（１つ及び２つのいずれかの置換基、具体的には、ＤＭ４のメチル置換基のような、アルキル置換基を有する）が、２００４年１１月２５日公開の米国特許出願公開第２００４／０２３５８４０号明細書に開示されており、この全体を参照することにより本願に援用する。
【００７０】
米国特許出願公開第２００６／０２３３８１４号明細書で、Ｇｏｌｄｍａｈｋｅｒらにより報告されているように、いったん薬物がその標的で放出されると、このような障害は遊離薬物のアルキル化（例えば、メチル化）を誘導する。アルキル化は、薬物の安定性を増し、いわゆるバイスタンダー（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）効果を可能にすることができる。しかしながら、当業者が認識しているように、エフェクタがリンカーを介して標的剤に結合するとき、立体障害が生じる位置にアルキル基等の置換基を含む他のエフェクタ分子も、本発明の一部である。好ましくは、この障害は、遊離薬物のアルキル化等の化学修飾を誘導して、その全体の安定性を高め、これによって薬物が、ＣＤ１３８発現腫瘍細胞における細胞死及び連続細胞周期停止のいずれかを誘導するだけでなく、任意的に、例えば腫瘍、具体的には腫瘍間質及び腫瘍脈管構造の細胞を支持し或いは薬物から保護し、一般にＣＤ１３８を発現しない補助細胞に影響を与え、その支持機能及び保護機能のいずれかを低下させるか、或いは失わせることも可能にする。
【００７１】
ＤＮＡアルキル化剤はまた、エフェクタ分子として特に好ましく、ＣＣ−１０６５類似体及び誘導体のいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。ＣＣ−１０６５は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｚｅｌｅｎｓｉｓの培養物から単離された強力な抗腫瘍抗生物質であり、インビトロで極めて細胞傷害性が高いことが示されている（米国特許第４，１６９，８８８号明細書）。例えば、米国特許第５，４７５，０９２号明細書、同第５，５８５，４９９号明細書、及び同第５，７３９，３５０号に記載されているＣＣ−１０６５類似体及び誘導体のいずれかも、本発明の範囲内である。当業者であれば容易に理解されるように、米国特許第５，８４６，５４５号明細書に記載されているような修飾されたＣＣ−１０６５類似体及び誘導体のいずれか、並びに例えば米国特許第６，７５６，３９７号明細書に記載されているようなＣＣ−１０６５類似体及び誘導体のいずれかのプロドラッグも、本発明の範囲内である。本発明のある実施形態では、ＣＣ−１０６５類似体及び誘導体のいずれかは、例えば、米国特許第６，５３４，６６０号明細書に記載されているように合成することができる。
【００７２】
好ましいエフェクタ分子を作製する化合物の別の群は、特に非常に強力で、チオール及びジスルフィド基のいずれかを含むタキサンである。タキサンは、チューブリンの脱重合を阻害する紡錘体毒であり、結果として微小管の組み立て及び細胞死の速度を上昇させる。本発明の範囲内であるタキサンは、例えば、米国特許第６，４３６，９３１号明細書、同第６，３４０，７０１号明細書、同第６，７０６，７０８号明細書、並びに米国特許出願公開第２００４／００８７６４９号明細書、同第２００４／００２４０４９号明細書、及び同第２００３／０００４２１０号明細書に開示されている。他のタキサンは、例えば、米国特許第６，００２，０２３号明細書、米国特許第５，９９８，６５６号明細書、米国特許第５，８９２，０６３号明細書、米国特許第５，７６３，４７７号明細書、米国特許第５，７０５，５０８号明細書、米国特許第５，７０３，２４７号明細書、及び米国特許第５，３６７，０８６号明細書に開示されている。当業者であれば、米国特許第６，５９６，７５７号明細書に記載されているもの等の、ＰＥＧ化タキサンもまた本発明の範囲内であることが理解されよう。
【００７３】
本発明に係るカリチアマイシンエフェクタ分子としては、ガンマ１ｌ、Ｎ−アセチルカリチアマイシン、及び他のカリチアマイシン誘導体が挙げられる。カリチアマイシンは、配列特異的な方式で、ＤＮＡの副溝に結合し、再編成され、フリーラジカルに曝されるため、二本鎖ＤＮＡの破壊を導き、細胞のアポトーシス及び細胞死をもたらす。本発明の状況で用いることができるカリチアマイシンエフェクタ分子の１例は、米国特許第５，０５３，３９４号明細書に記載されている。
【００７４】
本発明に係る免疫複合体は、少なくとも１種の標的剤、具体的には、改変された標的抗体等の標的抗体と、１種のエフェクタ分子とを含む。免疫複合体は、例えば安定化のために更に分子を含んでいてもよい。免疫複合体について、用語「複合体」は、一般に、標的剤と１以上のエフェクタ分子との機能的結合を定義するために用いられ、機能的結合のいずれかの種類のみを指すことを意図せず、特に化学的「複合体化」に限定されるものではない。標的剤が標的部位に結合することができ、結合したエフェクタが、特に標的部位に送達されたときに、意図した通りに十分に機能する限り、どのような結合様式も好適である。本発明に係る複合体化法としては、エフェクタ分子、及び標的抗体の少なくともいずれかを予め修飾して、或いは修飾せずに、標的抗体にエフェクタ分子を直接結合させること、及びリンカーを介して結合させることのいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。リンカーは、例えば、酸に不安定なリンカー、感光性リンカー、ペプチダーゼにより切断できるリンカー等の酵素で切断可能なリンカーに、機能的に分類することができる。切断可能なリンカーが、本発明の多くの実施形態で好ましい。このような切断可能なリンカーは、細胞環境、特に細胞内環境に存在し、切断時に放出される薬物に対して有害な作用を有しない条件下で切断され得る。リンカーが細胞内のある部分に存在するとき、ｐＨ４〜５のような低ｐＨによって、酸に不安定なリンカーが切断され、一方感光性リンカーは、例えば赤外光により切断され得る。しかしながら、大部分の細胞内に存在する生理学的条件により／生理学的条件下で切断されるリンカーが好ましく、本明細書では生理学的に切断可能なリンカーと称する。従って、ジスルフィドリンカーが、本発明の多くの実施形態で好ましい。これらのリンカーは、ジスルフィド交換を通して切断可能であり、これは生理学的条件下で生じ得る。好ましいヘテロ二官能性ジスルフィドリンカーとしては、Ｎ−スクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（例えば、Ｃａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９７８）を参照）、Ｎ−スクシニミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）（例えば、米国特許第４，５６３，３０４号明細書を参照）、Ｎ−スクシニミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）（例えば、ＣＡＳ登録番号３４１４９８−０８−６）、Ｎ−スクシニミジル４−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）（例えば、Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，（１９７９）を参照）、及びＮ−スクシニミジル４−メチル−４−［２−（５−ニトロ−ピリジル）−ジチオ］ペンタノエート（ＳＭＮＰ）（例えば、米国特許第４，５６３，３０４号明細書を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の組成物で使用するのに最も好ましいリンカー分子は、ＳＰＰ、ＳＭＣＣ、及びＳＰＤＢである。
【００７５】
他の好適なリンカーとしては、スルホスクシニミジルマレイミドメチルシクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）（これは化合物をＳＨ−含有化合物と結合することができるヘテロ二官能性リンカーである）等であるが、これらに限定されない「切断不可能な」結合を含んでいてもよい。Ｓ−（２−チオピリジル）−Ｌ−システインヒドラジド（ＴＰＣＨ）等の、炭水化物指向性ヘテロ二官能性リンカー分子等の、二官能性及びヘテロ二官能性リンカー分子もまた、本発明の範囲内である（Ｖｏｇｅｌ，２００４）。マイタンシノイドのようなエフェクタ分子は、２段階反応プロセスを介して標的抗体と複合体化することができ、第１の工程として、Ｎ−スクシニミジルピリジルジチオプロピオネート（ＳＰＤＰ）のような架橋試薬によって、標的抗体を修飾して、標的抗体にジチオピリジル基を導入する工程を含む。第２の工程では、ＤＭ１のような、チオール基を有する反応性マイタンシノイドを、修飾された抗体に添加して、修飾された抗体におけるチオピリジル基の置換、及びジスルフィド結合した細胞傷害性マイタンシノイド／抗体複合体の産生を生じさせる（米国特許第５，２０８，０２０号明細書）。しかしながら、米国特許出願公開第２００３００５５２２６号明細書（Ｃｈａｒｉら）に開示されているもののような１段階複合体化プロセスもまた、本発明の範囲内である。本発明の１つの実施形態では、同一種類及び異なる種類のいずれかの複数のエフェクタ分子が、標的抗体に結合する。
【００７６】
ＣＣ−１０６５類似体及び誘導体のいずれかは、例えば、米国特許第６，７１６，８２１号明細書に記載されているようなＰＥＧ結合基を介して、標的剤と複合体化することができる。カリチアマイシンは、リンカー（米国特許第５，８７７，２９６号明細書、及び米国特許第５，７７３，００１号明細書）を介して、或いは米国特許第５，７１２，３７４号、及び米国特許第５，７１４，５８６号明細書に開示されている複合体化方法に従って、標的抗体と複合体化することができる。カリチアマイシン複合体を調製するための別の好ましい方法は、米国特許出願公開第２００４００８２７６４号明細書に開示されている。本発明の免疫複合体は、組み換え融合タンパク質の形態をとってもよい。
【００７７】
用語配列同一性は、ヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列のいずれかの同一性の程度を指す。一般に、最も高い水準の一致が得られるように、配列を整列させる。「同一性」は、それ自体、当該技術分野で認識されている意味を有し、公開されている技術を用いて判定することができる（例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１を参照）。２つのポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のいずれかの間の同一性を測定するための、多くの方法が存在するが、用語「同一性」は当業者に周知である（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．＆Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３（１９８８））。
【００７８】
特定の核酸分子のいずれかが、例えば、ｎＢＴ０６２核酸配列、及びその一部のいずれかに対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％のいずれか同一であるがどうかは、従来法で、初期配列整列用のＤＮＡｓｉｓソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｂｒｕｎｏ，Ｃａｌｉｆ．）、続いて複数の配列整列用のＥＳＥＥバージョン３．０ ＤＮＡ／タンパク質配列ソフトウェア（ｃａｂｏｔ＠ｔｒｏｇ．ｍｂｂ．ｓｆｕ．ｃａ）等の、既知のコンピュータプログラムを用いて決定することができる。
【００７９】
アミノ酸配列が、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列及び配列番号２で表されるアミノ酸配列のいずれか、並びにその一部のいずれかに対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％のいずれか同一であるかどうかは、従来法で、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７１１）等の、既知のコンピュータプログラムを用いて決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９ （１９８１）のローカルホモロジーアルゴリズムを用いて、２つの配列間で最良の相同セグメントを見つける。
【００８０】
ＤＮＡｓｉｓ、ＥＳＥＥ、ＢＥＳＴＦＩＴ、及び他の配列整列プログラムのいずれかを用いて、特定の配列が、例えば、本発明に係る参照配列に対して９５％同一であるかどうかを決定するとき、同一性の割合が参照核酸及びアミノ酸配列のいずれかの完全長に対して計算され、相同性において、参照配列中のヌクレオチドの合計数の最大５％のギャップが許容されるように、パラメータを設定する。
【００８１】
本発明の状況において、特定の配列の残基の組み合わせと共に、ある配列同一性について言及する場合、この配列同一性は特定された全ての残基の合計に関連する。
【００８２】
基本的な抗体分子は、可変領域が抗原に結合し、一方残りの定常領域が抗原非依存性反応を誘発することができる、二機能性構造である。抗体の主なクラスである、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭは、定常領域により決定される。これらのクラスは、サブクラス（アイソタイプ）に更に分類することができる。例えば、ＩｇＧクラスは、定常領域により決定される、４つのアイソタイプ、即ちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を有する。種々のヒト抗体のクラスのうち、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＭのみが、補体系を有効に活性化することが知られている。定常領域は、抗原結合部位を形成しないが、定常領域、及びヒンジ領域の配置は、分子に、それが抗原と結合することを可能にする、セグメンタルフレキシビリティ（ｓｅｇｍｅｎｔａｌ ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）を付与することができる。
【００８３】
様々なＩｇＧアイソタイプが、単球、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞のような細胞上のＦｃ受容体に結合し、それにより細胞を活性化して、サイトカインを放出させることができる。様々なアイソタイプはまた、補体を活性化して、局所及び全身炎症のいずれかを引き起こす恐れがある。具体的には、様々なＩｇＧアイソタイプが、ＦｃγＲに、様々な程度結合することができる。ＦｃγＲは、Ｉｇスーパーファミリーに属する表面糖タンパク質の群であり、大部分は白血球上で発現する。ＦｃγＲ糖タンパク質は、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）と名付けられた３つのクラスに分類される。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ３は、様々なこれらのクラスのＦｃγＲ糖タンパク質に強く結合するが、ＩｇＧ４は非常に弱い結合を示す。具体的には、ＩｇＧ４は、ＦｃγＲＩの中間結合剤であり、これは比較的低いＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）を生じさせるか、或いは全くＡＤＣＣを生じさせず、ＦｃγＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＡのいずれにも結合しない。ＩｇＧ４はまた、阻害性受容体であるＦｃγＲＩＩＢの弱い結合剤でもある。更に、ＩｇＧ４は、補体結合を僅かにしか媒介しないか、或いは全く媒介せず、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を僅かにしか媒介しないか、或いは全く媒介しない。本発明の状況では、ＩｇＧ４がＬＳＥＣ（肝類洞内皮細胞）上のＦｃＲγＩＩと全く相互作用を示さず、クッパー細胞（マクロファージ）上のＦｃＲγＩ−ＩＩＩと全く相互作用を示さない、及び弱い相互作用しか示さない、のいずれかであり、肝ＮＫ細胞上のＦｃＲγＩＩＩと全く相互作用を示さないとき、ＩｇＧ４を特異的に使用して、肝臓のＦｃＲのＦｃ媒介性標的を防ぐことができる。いずれかのＣＤＣを更に減少させる特定の突然変異もまた、本発明の一部である。例えば、位置３２７、３３０、及び３３１におけるＩｇＧ４残基は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）、及びＣＤＣを減少させることが示されている（Ａｍｏｕｒ，１９９９；Ｓｈｉｅｌｄｓ，２００１）。抗体を安定化する突然変異の中の１つもまた、本発明の一部である（本明細書では、「安定化突然変異」とも称される）。これらの突然変異は、具体的には、ＩｇＧ４のＣＨ２領域におけるロイシンからグルタミン酸への突然変異、及びＩｇＧ４のヒンジコアにおけるセリンからプロリンへの交換を含む。これらの突然変異は、本発明のある実施形態では、半分子（ｈａｌｆ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の量を、１０％未満、５％未満、好ましくは２％及び１％未満のいずれかに減少させる。更に、このように安定化した抗体のインビボ半減期は、１、２、３、４、及び５日超のいずれかを含む、数日間増加する場合がある（Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ，１９９９）。
【００８４】
本明細書に開示する標的抗体、具体的には改変された標的抗体を含む標的剤はまた、抗原、具体的にはＣＤ１３８に対するその結合親和性の観点で説明或いは特定することができる。標的抗体、具体的には改変された標的抗体等の標的剤の好ましい結合親和性は、１．６未満、１．５未満、並びに約１．４及びそれ未満のいずれかの解離定数ＫＤ（ｎＭ）を特徴とする。標的抗体等の標的剤を含む免疫複合体では、１．６未満、１．５未満、或いは２．５未満、２．４未満、２．３未満、２．２未満、２．１未満、２．０未満、１．９未満、及び約１．９のいずれかの解離定数ＫＤ（ｎＭ）が好ましい。
【００８５】
本発明に係る抗原結合領域（ＡＢＲ）は、使用される標的抗体及び改変された標的抗体のいずれかの種類に基づいて変化する。天然に存在する抗体、並びに大部分のキメラ及びヒト化抗体では、抗原結合領域は、軽鎖、及び重鎖の最初の２つのドメインで構成される。しかしながら、軽鎖を有しない重鎖抗体では、抗原結合領域は、例えば重鎖の最初の２つのドメインのみで構成され、一方単鎖抗体（ＳｃＦｖ）（抗体分子の軽鎖及び重鎖可変ドメインを１つのポリペプチド鎖に結合させた）では、ＡＢＲは、１つのポリペプチド分子のみによって提供される。ＦＡＢ断片は、通常、パパイン消化により得られ、１本の軽鎖及び重鎖の一部を有し、よって抗原結合部位を１つだけ有するＡＢＲを含む。他方、二重特異性抗体は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗原断片である。しかしながら、本発明の状況では、標的抗体及び改変された標的抗体のいずれかの抗原結合領域は、標的抗体及び改変された標的抗体のいずれかの結合親和性を主に決定するいずれかの領域である。
【００８６】
ＡＢＲ及び別の標的抗体領域のいずれかが「ある抗体のもの」である、例えばヒト抗体及び非ヒト抗体のいずれかのものであると言う場合、これは、本発明の状況では、ＡＢＲが対応する天然に存在するＡＢＲと同一である、及びそれに基づいている、のいずれかであることを意味する。ＡＢＲは、天然に存在するＡＢＲの結合特異性を有するとき、天然に存在するＡＢＲに基づく。しかしながら、このようなＡＢＲは、例えば、点変異、付加、欠失、及びグリコシル化のいずれかのような翻訳後修飾を含んでいてもよい。このようなＡＢＲは、具体的には、天然に存在するＡＢＲの配列と、７０％超、８０％超、９０％超、好ましくは９５％超、９８％超、及び９９％超のいずれかの配列同一性を有してもよい。
【００８７】
標的抗体などの標的剤の、特にそれを含む免疫複合体の均一なターゲティングは、本発明の状況では、標的剤による前記標的の所望の結果を得ることに関連する分散の尺度である。本発明のある実施形態では、所望の結果は、標的への単純な結合により得られる。これは、例えば、ある標的剤がその後の結合を遮断する実施形態の場合である。しかしながら、標的剤の均一性は、例えば、前記標的剤を含む免疫複合体の有効性を介して、容易に評価することができる。例えば、腫瘍細胞の破壊、及び腫瘍の増殖停止の少なくともいずれかに関するエフェクタを含む、ＣＤ１３８のような腫瘍抗原に対する前記免疫複合体の有効性は、ＣＤ１３８抗原を発現している細胞を含む腫瘍の増殖抑制の程度により決定することができる。該免疫複合体は、その有効性が大きく変動する場合がある。例えば、その免疫複合体は時に、高い有効性によって腫瘍増殖を停止することができるが、他の時には、対照の効力を殆ど上回らない有効性しか有しない。他方、免疫複合体の有効性における変動が少ないことは、免疫複合体及び標的剤の少なくともいずれかが、それぞれ、一貫して所望の結果を提供することを示す。ターゲティングの均一性を定量化する１つの方法は、ターゲティング変動を計算することである。ある標的剤を含む免疫複合体により腫瘍増殖が停止される状況では、ターゲティング変動は、先ず腫瘍が、所定の体積、例えば３００ｍｍ３に達する時間を決定することにより計算できる。好ましくは、所定の体積は、前記所定の体積に達する前、及び達した後の任意の腫瘍増殖が、ほぼ同一速度で着実に増加するように選択される。このような時間を被験体の群について決定した後、被験体（例えば、ＳＣＩＤマウス、及び均一な腫瘍増殖を示す別の好適なモデルのいずれか）の群におけるこれらの時間の平均（Ｔｍ）を計算する。次いで、以下の式に従って、所定の体積についてのターゲティング変動を計算することにより、ターゲティング効率が最低であり、よって前記所定の体積に達するのに必要な時間が最も短い（Ｔｆ）腫瘍に関連する群の被験体と、他方、ターゲティング効率が最高であり、よって前記所定の体積に達するのに必要な時間が最も長い（Ｔｓ）腫瘍に関連する群の被験体とにおいて得られた知見とＴｍを相互に関連づける。
ターゲティング変動［％］＝Ｔｓ−Ｔｆ／Ｔｍ×１００
【００８８】
好ましい実施形態では、本発明の改変された標的抗体のターゲティング変動は、１５０％未満、１４０％未満、１３０％未満、１２０％未満、１１０％未満、１００％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、及び５０％未満のいずれかであり、ある実施形態では、４５％未満でさえある。好ましくは、ターゲティング変動は、約１０％〜約１５０％であり、好ましくは約１０％〜約１００％、約１０％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約１０％〜約６０％、約１０％〜約５０％である。
【００８９】
標的の均一性（本明細書では特定の抗原に対する結合性の均一性とも称される）はまた、腫瘍増殖の遅延の測定のような他の手段により定量化することもできる。また、当業者は、特定の大きさの腫瘍体積が、基準のターゲティング変動を決定することができるただ１つのパラメータであることを、容易に理解する。所望の結果に応じて、時間（例えば、腫瘍増殖の遅延を測定するための）、及び結合の割合（％）のいずれかを含む他のパラメータを使用してもよい。当業者は、このような他のパラメータを容易に決定することができる。
【００９０】
ｎＢＴ０６２（図１を参照）は、Ｂ−Ｂ４のキメラ化バージョンである、マウスヒトキメラＩｇＧ４ｍＡｂである。このＢ−Ｂ４のキメラ化バージョンは、ＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）反応は低下するが、ＣＤ１３８に対するＢ−Ｂ４の抗体結合領域の機能性は維持するよう作製した。驚くべきことに、このキメラ抗体は、Ｂ−Ｂ４に対して改善された結合親和性を示すことが見出された。また驚くべきことに、キメラ抗体は、均一なターゲティングに関連し、この均一なターゲティングにより、該抗体及びそれを含む免疫複合体のいずれかを用いたときに得られる結果より分散が減少する。ｎＢＴ０６２を産生するためのプロトコルを、以下に記す。ｎＢＴ０６２を発現しているチャイニーズハムスター卵巣細胞は、２００７年１２月１１日に、ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ，Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １，Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇに寄託されている。識別番号は、ＤＳＭ ＡＣＣ２８７５である。Ｂ−Ｂ４に基づくＣＤ１３８特異的キメラ抗体を、一般に、本明細書ではｃＢ−Ｂ４と称する。
【００９１】
重鎖及び軽鎖の両方のアミノ酸配列は、ｎＢＲ０６２のヌクレオチド配列の翻訳から予測されている。重鎖及び軽鎖について予測されるアミノ酸配列を、表１に示す。予測される可変領域を太字で表し、予測されるＣＤＲに下線を引く。
【００９２】
表１は、ｎＢＴ０６２の予測されるアミノ酸配列である。
【表１】
Ｃ末端のリジンは、クリッピングする傾向があり、ある程度不完全なクリッピングのために存在する場合があり、配列番号１で表されるアミノ酸配列の一部ではない。
【００９３】
表２は、Ｋｒａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの一般的なＣＤＲの定義と、ＢＴ０６２についての予測ＣＤＲとの比較を示す。
【表２】
【００９４】
ＢＴ０６２は、細胞分裂停止性マイタンシノイド誘導体ＤＭ４に、リンカー、ここではＳＰＤＢを介して結合した、ＣＤ１３８標的キメラ抗体ｎＢＴ０６２を含む、免疫複合体である。ＢＴ０６２の化学的表現を図１及び図２に提供する。ｎＢＴ０６２及びマイタンシノイドエフェクタ分子を含む免疫複合体は、そのリンカー、及びマイタンシノイドエフェクタの観点で特徴付けられることが多く、例えばｎＢＴ０６２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１は、ｎＢＴ０６２、ＳＭＣＣ（チオエステル結合を含む「切断不可能な」リンカー）、及びエフェクタとしてＤＭ１を含む免疫複合体である。より一般的に、ｎＢＴ０６２及びエフェクタ分子を含む免疫複合体はまた、ｎＢＴ０６２−リンカー−エフェクタ、及びただｎＢＴ０６２−エフェクタ（ｎＢＴ０６２Ｎ）（Ｎは本明細書に記載するエフェクタのいずれかである）のいずれかとして記載することもある。
【００９５】
本明細書では、切断可能なリンカー（ＣＬ）を介してエフェクタ分子に結合している、ＣＤ１３８に対する改変された標的抗体を含む免疫複合体の立体障害のない相当物（ＵＩ：立体障害のない免疫複合体）（本明細書では、ＵＩＣＬと記載する）について言及し、これを前記エフェクタ分子に対する立体障害があるが、切断可能なリンカーを含む免疫複合体（ＨＩＣＬ）と対比させる。ＵＩＣＬは、改変された標的抗体を含むが、エフェクタ分子に対する立体障害のないＨＩＣＬに相当する免疫複合体である。ＨＩＣＬ／ＵＩＣＬ対の例は、ＢＴ０６２及びｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１である。切断不可能なリンカーを含むこのような免疫複合体の立体障害のない相当物（ＵＩＮＣＬ）は、エフェクタ分子の立体障害がなく、切断不可能なリンカーを含む、改変された標的抗体を含む同等の免疫複合体を指す。ＢＴ０６２では、ｎＢＴ０６２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１は、このような切断不可能なリンカーを含む立体障害のない相当物の例を構成する。
【００９６】
免疫複合体の腫瘍の増殖を阻害する活性（＝腫瘍増殖阻害活性）は、相対的な測定値である。腫瘍増殖阻害活性は、最高の性能の免疫複合体（この活性を１００％として設定する）の活性に対する、複合体の腫瘍増殖阻害活性を表す。例えば、最高の性能の免疫複合体、例えば、ＢＴ０６２の活性（３２日の腫瘍増殖の遅延（ＴＧＤ）を引き起こす）を１００％として設定した場合、例えば、１８日の腫瘍増殖の遅延（ＴＧＤ）を示す、ｎＢＴ０６２−ＤＭ１の活性は、以下のように計算される。
腫瘍増殖阻害活性＝１００×（ＴＧＤｎＢＴ０６２−ＤＭ１／ＴＧＤＢＴ０６２）、
より一般的には、
腫瘍増殖阻害活性＝１００×（ＴＧＤサンプル／ＴＧＤリファレンス）。
【００９７】
表３は、図１１Ｂに示した結果から好適な例を提供する。
【表３】
表３：４５０μｇ／ｋｇの用量を投与された処理群に基づく、ＳＣＩＤマウスのＭＯＬＰ−８腫瘍異種移植片に対する、ｎＢＴ０６２−ＤＭｘの腫瘍増殖の遅延（ＴＧＤ）及び活性（％）
（＊）処理群が所定の大きさ（１６０ｍｍ３）に達する平均時間（日）から、対照群がこの所定の大きさに達する平均時間を引いたときの、腫瘍増殖遅延（ＴＧＤ）（日）
（＊＊）腫瘍増殖阻害活性＝１００×（ＴＧＤサンプル／ＴＧＤＢＴ０６２）。ＢＴ０６２の活性を１００％であると定義する。
【００９８】
表２に提供した例では、ＢＴ０６２は、その立体障害のない相当物（ｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１）を６０％上回る腫瘍増殖阻害活性、及び切断不可能なリンカーを含む、立体障害のない相当物の免疫複合体（ｎＢＴ０６２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）を４４％上回る腫瘍増殖阻害活性を提供する。
【００９９】
免疫複合体における切断可能なリンカーは、いわゆるバイスタンダー効果を提供することが、既に報告されている。Ｇｏｌｄｍａｈｋｅｒら（米国特許出願公開第２００６／０２３３８１４号明細書）はまた、標的剤から切断されて、エフェクタ分子が更なる修飾、具体的にはアルキル化を受けるとき、バイスタンダー効果が特に顕著であることも開示している。Ｇｏｌｄｍａｈｋｅｒらはまた、ＵＩＣＬが、それぞれのＵＩＮＣＬより良好なＴＧＤを示すことを示し、この事実もまたバイスタンダー効果と称されるものに起因していた（例えば、米国特許出願公開第２００６／０２３３８１４号明細書の図６を参照）。
ここで、驚くべきことに、高単回用量レジメン（２５０μｇ／ｋｇ）におけるＵＩＣＬは、実際ＵＩＮＣＬより良い結果を全く示さないことが見出された。要するに、このようなレジメンにおけるＵＩＣＬで観察されたＴＧＤの日数は、実際ＵＩＮＣＬより短かった。この観察は、用量の増加につれて（４５０μｇ／ｋｇ）より顕著になった。即ち、単回投与実験において、予想以上に、ＨＩＣＬはＵＩＣＬより優れていた。加えて、ＵＩＮＣＬは、高用量において、予想外にＵＩＣＬより優れていた。
【０１００】
本明細書に開示する、標的剤、具体的には、標的抗体、及び免疫複合体の少なくともいずれかは、静脈内に、非経口的に、経口的に、筋肉内に、髄腔内に、及びエアゾールとしてのいずれかを含む、いずれの経路で投与してもよい。送達方式は、所望の効果に応じて決定される。当業者は、本発明に従って、特定の処理についての最良の投与経路を容易に知る。適切な用量は、投与経路、及び指示された処理に応じて決定され、現在の治療プロトコルを考慮して当業者が容易に決定することができる。
【０１０１】
活性成分として、本発明の複合体化していない標的剤、及び免疫複合体を含有する医薬組成物は、従来の医薬品調合技術に従って調製することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ Ｅｄ．（１９８５，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）を参照。典型的には、有効量の活性成分を、薬学的に許容される担体と混合する。担体は、例えば、静脈内、経口、非経口、髄腔内、経皮、及びエアゾールのいずれかとして等、投与にとって望ましい製剤形態に応じて、広範な形態をとることができる。
【０１０２】
経口投与では、標的剤及び免疫複合体の少なくともいずれかを、カプセル、丸剤、錠剤、ロゼンジ剤、溶解物（ｍｅｌｔ）、粉剤、懸濁液、及びエマルションのいずれか等の、固体製剤及び液体製剤のいずれかに配合することができる。経口剤形の組成物の調製では、経口液体製剤（例えば、懸濁液、エリキシル剤、及び溶液）の場合、例えば、水、グリコール、油、アルコール、着香剤、防腐剤、着色剤、懸濁剤等、或いは経口固体製剤（例えば、粉剤、カプセル、及び錠剤）の場合、デンプン、砂糖、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤等の、通常の医薬媒質のいずれを使用してもよい。投与が容易であるため、錠剤及びカプセルが最も有利な経口単位剤形を表し、この場合無論固体医薬担体が使用される。必要に応じて、錠剤は、標準的な技術により糖コーティングしてもよく、腸溶性コーティングを施してもよい。活性剤は、消化管を通過するために安定でなければならない。必要な場合、安定な通過に好適な薬剤を用いてもよく、文献に記載されているリン脂質及びレシチン誘導体のいずれか、並びにリポソーム、微粒子（ミクロスフィア及びマクロスフィアを含む）を含んでいてもよい。
【０１０３】
非経口投与では、標的剤及び免疫複合体の少なくともいずれかを、医薬担体に溶解させ、溶液及び懸濁液のいずれかとして投与してもよい。好適な担体の例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）、デキストロース溶液、フラクトース溶液、エタノール、並びに動物油、植物油、及び合成起源の油の少なくともいずれかである。担体はまた、他の成分、例えば、防腐剤、懸濁剤、可溶化剤、緩衝剤等を含有していてもよい。複合体化していない標的剤、及び免疫複合体の少なくともいずれかを、脳室内、及び髄腔内のいずれかに投与するとき、それらはまた脳脊髄液に溶解する場合もある。
【０１０４】
被験体に投与される用量は、被験体（ヒト及び非ヒト動物を含む）の表面積当たり、定められた量であってもよい。用量は、このような被験体に、好ましくは、約５ｍｇ／ｍ２〜約３００ｍｇ／ｍ２（約２０ｍｇ／ｍ２、約５０ｍｇ／ｍ２、約１００ｍｇ／ｍ２、約１５０ｍｇ／ｍ２、約２００ｍｇ／ｍ２、及び約２５０ｍｇ／ｍ２を含む）であるが、これに限らない量投与することができる。標的剤／免疫複合体は、好適には、１回に、及び一連の処理の間のいずれかに投与される。複数回投与レジメンでは、これらの量を、１日１回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、５週間に１回、及び６週間に１回のいずれかの間隔で投与してもよい。単一高用量、及び互いの直後に、続いてより長い間隔で投与される複数回の低用量のいずれかを含む負荷用量が、本発明の好ましい実施形態を構成する。好ましい実施形態では、投薬のタイミングは、２回目の処理及び任意のその後の処理のいずれかの前に十分な時間が経過し、その結果前回の用量が実質的に代謝されているが、被験体の系に存在する免疫複合体の量が、依然として腫瘍の増殖の阻害、遅延、及び防止の少なくともいずれかを行うように、被験体に応じて調整される。代表的な「反復単回用量」レジメンは、３週間に１回、約２００ｍｇ／ｍ２の免疫複合体の初期量を投与することを含む。或いは、高初期量に続いて、１週間に２回、約１５０μｇ／ｍ２の維持量を投与してもよい。しかしながら、他の投薬レジメンが有用である場合がある。この治療の進行は、既知の技術及びアッセイにより容易にモニタされる。用量は、それが予防目的のために投与されるか治療目的のために投与されるか、任意のそれ以前の治療の過程、患者の臨床歴、及び標的剤／免疫複合体に対する反応、並びに主治医の裁量に応じて、変更してもよい。
【０１０５】
本発明に従って、例としてｎＢＴ０６２及びＢＴ０６２を用いて、ＭＭを以下のように治療する。この例は、如何なる方法によっても本発明を限定することを意図するものではなく、当業者は、本発明の範囲内である他の免疫複合体及びｎＢＴ０６２に基づく系、及びＭＭのような疾患の治療に利用することができる他の治療レジメンを容易に決定することができる。
【０１０６】
血流が接近可能な細胞上における、患者のＭＭ細胞上でのＣＤ１３８の選択的発現、血流中におけるｎＢＴ０６２の特異性、及びＢＴ０６２の安定性により、ＢＴ０６２はＤＭ４の全身毒性を除去し、ＤＭ４エフェクタ分子（１及び複数のいずれか）の送達を標的とする機会を提供する。ある用量のｎＢＴ０６２の投与は、低発現ＣＤ１３８陽性非腫瘍細胞のＢＴ０６２との結合、好ましくは破壊に対する、これらの細胞の保護に有利であり、一方本発明の免疫複合体は、エフェクタ分子が免疫複合体から放出され得る細胞部位に、エフェクタ分子を有効に投与するための手段を提供する。現在の化学療法が提供する寛解は時に不完全であるため、この標的とされる送達及び放出は、多発性骨髄腫の治療を著しく進歩させる。
【実施例】
【０１０７】
本発明は、以下の実施例を参照することにより更に説明されるが、実施例は例示目的のために提供され、如何なる方法によっても本発明を限定することを意図するものではない。当該技術分野において周知である標準的な技術、及び以下に明確に記載されている技術のいずれかが利用される。
【０１０８】
材料及び方法
キメラ抗体の構築（ｃＢ−Ｂ４：ｎＢＴ０６２）
Ｂ−Ｂ４
既に特性評価されているマウス抗体Ｂ−Ｂ４（Ｗｉｊｄｅｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．，９４（１９９６），３１８）を、これらの実験で用いた。
【０１０９】
Ｂ−Ｂ４及びｃＢ−Ｂ４／ｎＢＴ０６２のクローニング及び発現
Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；２ｎｄ Ｅｄ．（１９８９），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＵＳＡなどのテキストブックに詳述されているように、或いはキットを用いる場合は製造業者の取扱説明書により推奨されているように、標準的な組み換えＤＮＡ技術を実施した。マウス可変領域のＰＣＲ−クローニング及び修飾は、標準的なＰＣＲ法を用いて実施した。用いたプライマーはそれぞれの結果のセクションに示した。
【０１１０】
ｃＢ−Ｂ４／ｎＢＴ０６２の発現
１０％のＦＣＳ、５８０μｇ／ｍＬのＬ−グルタミン、５０ユニット／ｍＬのペニシリン、及び５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ中で培養した、対数増殖期のＣＯＳ細胞を、トリプシン処理により回収し、遠心分離して、ＰＢＳで洗浄した。最終濃度が１×１０７細胞／ｍＬになるように、細胞をＰＢＳに再懸濁した。７００μＬのＣＯＳ細胞懸濁液を、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒキュベットに移し、重鎖及びカッパ軽鎖発現ベクターＤＮＡ（それぞれ１０μｇ、及び１３μｇのいずれかのＳｕｐｅｒｖｅｃｔｏｒ）と混合した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒを用いて、１９００Ｖ、２５μＦで細胞を電気穿孔処理した。形質転換された細胞を、１０％のガンマグロブリン遊離ＦＢＳ、５８０μｇ／ｍＬのＬ−グルタミン、５０ユニット／ｍＬのペニシリン、及び５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ中で７２時間培養し、その後、抗体含有細胞培養上清を回収した。
【０１１１】
ｃＢ−Ｂ４／ｎＢＴ０６２の発現レベルを測定するためのキャプチャーＥＬＩＳＡ
９６ウェルプレートを、ＰＢＳで希釈した０．４μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体の１００μＬのアリコートでコーティングした（４℃、一晩）。プレートを、２００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。ウェルを、０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０−ＰＢＳ溶液でブロッキングして、その後分泌された抗体を含有する２００μＬの細胞培養上清（３７℃で１時間インキュベート）を添加した。ウェルを、洗浄バッファーで６回洗浄し、その後ヤギ抗ヒトカッパ軽鎖ペルオキシダ−ゼ複合体と結合した抗体を検出した。
【０１１２】
細胞培養上清からのｃＢ−Ｂ４／ｎＢＴ０６２の精製
製造業者の推奨に従って、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ Ｐｌｕｓ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて、形質転換されたＣＯＳ７細胞の上清から、ｃＢ−Ｂ４抗体を精製した。
【０１１３】
ｃＢ−Ｂ４結合及び競合アッセイ
Ｂ−Ｂ４及びｃＢ−Ｂ４のＣＤ１３８への結合活性の分析を、Ｄｉａｃｌｏｎｅ（Ｂｅｓａｎｃｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）ｓＣＤ１３８ ｋｉｔを用いて、製造業者の推奨に従って、結果のセクションに記載した変化を考慮して実施した。
【０１１４】
ＲＮＡ調製及びｃＤＮＡ合成
ハイブリドーマＢ−Ｂ４細胞を増殖させ、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｄｉ ｋｉｔ（Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて処理して、製造業者のプロトコルに従ってＲＮＡを単離した。約５μｇのＢ−Ｂ４ ＲＮＡを逆転写させて、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔを用いて、製造業者のプロトコルに従ってＢ−Ｂ４ ｃＤＮＡを作製した。
【０１１５】
Ｂ−Ｂ４免疫グロブリンｃＤＮＡのクローニング
免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）ｃＤＮＡを、ＩｇＨプライマーＭＨＶ７（５’−ＡＴＧＧＧＣＡＴＣＡＡＧＡＴＧＧＡＧＴＣＡＣＡＧＡＣＣＣＡＧＧ−３’）（配列番号３）、及びＩｇＧ１定常領域プライマーＭＨＣＧ１（５’−ＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧ−３’）（配列番号４）を用いて、ＰＣＲにより増幅した。同様に、免疫グロブリン軽鎖（ＩｇＬ）を、それぞれプライマーＭＫＣ（５’−ＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧ−３’）（配列番号８）と組み合わせた、３種の異なるＩｇＫプライマーＭＫＶ２（５’−ＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴＧＧＧＴＧ−３’）（配列番号５）、ＭＫＶ４（５’−ＡＴＧＡＧＧＧＣＣＣＣＴＧＣＴＣＡＧＴＴＴＴＴＴＧＧＣＴＴＣＴＴＧ−３’）（配列番号６）、及びＭＫＶ９（５’−ＡＴＧＧＴＡＴＣＣＡＣＡＣＣＴＣＡＧＴＴＣＣＴＴＧ−３’）（配列番号７）を用いて増幅した。全ての増幅産物を、製造業者の取扱説明書に従って、ＴＯＰＯ−ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターと直接ライゲーションした。
ライゲーションしたｐＣＲ２．１ベクターのコンストラクトで形質転換したＥ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０ ｂａｃｔｅｒｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ＬＢ−アンピシリン−Ｘｇａｌ寒天プレート上で選択した。少量の培養物に単一白色コロニーを接種し、一晩増殖させ、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔを用いて、製造業者の取扱説明書に従って、プラスミドを単離した。
【０１１６】
ｃＤＮＡの配列決定
ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｖ３．０ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、プラスミドの配列を決定した。選択された各プラスミドを、１２１０及び１２３３プライマーを用いて、ＧｅｎｅＡｍｐ９６００ＰＣＲ装置で増幅させ（ｃｙｃｌｅ）両方向に配列決定した。電気泳動配列分析を、ＡＢＩキャピラリシーケンサで行った。
ＲＴ−ＰＣＲの完全サイクル、クローニング、及びＤＮＡ配列分析を繰り返して、各免疫グロブリン鎖について、完全に独立な３つの配列情報のセットを得た。
【０１１７】
Ｂ−Ｂ４ ＶＫのＤＮＡ配列
１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓを３つの独立な反応で実施した。プライマーＭＫＣ及びＭＫＶ２（上記配列）を用いて作製したＲＣＰ産物を、製造業者の取扱説明書に従ってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにライゲーションした。ＲＴ−ＰＣＲ反応のそれぞれの独立なセットから得られたクローンを、両方向に配列決定した。ＭＫＶ−２プライマーを用いた産物の配列は、ＭＯＰＣ−２１、ＳＰ２、及びＡｇ８のような骨髄腫融合パートナーを起源とする無菌カッパ転写産物に非常に類似していたため（（Ｃａｒｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２５（１９８８），９９１；Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，４０（１９８５）；１５７）、無視した。
【０１１８】
ＭＫＶ４及びＭＫＶ９プライマーとともにＭＫＣを用いたＰＣＲ産物は、互いに類似しており、リーダー配列プライマー内のゆらぎ（ｗｏｂｂｌｅ）の位置のみが異なっていた。
【０１１９】
Ｂ−Ｂ４ ＶＨ ＤＮＡ配列
１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ合成を３つの独立な反応において実施し、ＰＣＲ産物を各１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ産物からクローニングおよび配列決定した。５つのクローンを各１ｓｔ ｓｔｒａｎｄから配列決定した。
【０１２０】
キメラｃＢ−Ｂ４発現ベクターの構築
キメラ発現ベクターの構築は、ＶＨ及びＶＫに、ＢａｍＨＩ制限酵素部位及びＫｏｚａｋ配列が先行する、好適なリーダー配列を付加することを必要とする。Ｋｏｚａｋ共通配列は、可変領域配列の効率的翻訳にとって極めて重要である。Ｋｏｚａｋ共通配列は、そこからリボソームが翻訳を開始することができる正確なＡＵＧコドンを規定し、１つの最も重要な塩基は、ＡＵＧ開始の上流、−３の位置にあるアデニン（或いはそれ程好ましくはないが、グアニン）である。リーダー配列は、Ｋａｂａｔデータベースにおいて最も類似する配列として選択される（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，ＮＩＨ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ，１９９１）。これらの付加は、フォワード（Ｆｏｒ）プライマー内にコードされる（両方、配列５’−ＡＧＡＧＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＴＴＧＣＣＴＣＴＧＣＴＣＡＧＴＴＣＣＴＴＧＧＴＣＴＣＣ−３’（配列番号９）を有する；制限酵素部位には下線をひき、ＧＣＣＧＣＣＡＣＣはＫｏｚａｋ配列である）。更に、キメラ発現ベクターの構築は、Ｂ−Ｂ４のＪ領域の３’末端に隣接する、天然ＡｐａＩ制限酵素部位に至るまで、ヒトガンマ１定常領域の５’断片を導入し、軽鎖には、スプライス供与部位及びＨｉｎｄＩＩＩ部位を付加することを必要とする。スプライス供与部位は、可変領域配列を、適切な定常領域へ正確にインフレームで結合させ、Ｖ：Ｃイントロンを切り出すのに重要である。カッパイントロン＋ＣＫは、Ｂ−Ｂ４のＶＫ配列の下流の発現コンストラクトにコードされる。同様に、ガンマ−４ ＣＨは、Ｂ−Ｂ４ ＶＨ配列の下流の発現コンストラクトにコードされる。
Ｂ−Ｂ４ ＶＨ及びＶＫ遺伝子を先ず注意深く分析して、不所望のスプライス供与部位、スプライス受容部位、Ｋｏｚａｋ配列、並びにその後機能的全抗体のサブクローニング及び発現の少なくともいずれかに干渉する、任意の余分なサブクローニング制限酵素部位の存在を全て同定した。アミノ酸配列を変化させることなくＰＣＲを介して部位特異的突然変異誘発により除去する必要があった、不所望なＨｉｎｄＩＩＩ部位がＶＫ配列中に見出された。この反応では、オリゴヌクレオチドプライマーＢＴ０３（５’−ＣＡＡＣＡＧＴＡＴＡＧＴＡＡＧＣＴＣＣＣＴＣＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＧ−３’）（配列番号１０）及びＢＴ０４（５’−ＣＣＡＣＣＧＡＡＣＧＴＣＣＧＡＧＧＧＡＧＣＴＴＡＣＴＡＴＡＣＴＧＴＴＧ−３’）（配列番号１１）を用いて、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔのプロトコルに従って突然変異誘発を実施した。
【０１２１】
カッパ鎖キメラ化プライマー
非多義性Ｂ−Ｂ４ ＶＫリーダー配列（ＰＣＲプライマー配列とは独立）を、Ｋａｂａｔデータベースにおけるマウスリーダー配列と整列させた。Ｂ−Ｂ４ ＶＨリーダー配列に最もよく一致していたのは、ＶＫ−１０ ＡＲＳ−Ａであった（Ｓａｎｚ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，８４（１９８７），１０８５）。このリーダー配列は、ＳｉｇｎａｌＰアルゴリズムにより正確に切断されることが予測される（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ，１０（１９９７）；１）。ｐＫＮ１００発現ベクターにクローニングするために、プライマーＣＢＢ４Ｋｆｏｒ（上記参照）及びｇ２２５８（５’−ＣＧＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＡＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＣＴＣＣ−３’（配列番号１２）；制限酵素部位に下線を引く）を設計して、この完全リーダー、Ｂ−Ｂ４ ＶＫ領域、並びにＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ末端制限酵素部位を含むＰＣＲ産物を作製した。フォワードプライマーＣＢＢ４Ｋは、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位、Ｋｏｚａｋ翻訳開始部位、及びＶＫ−１０ ＡＲＳ−Ａリーダー配列を導入する。リバースプライマーｇ２２５８は、スプライス供与部位、及びＢａｍＨＩ制限酵素部位を導入する。得られた断片を、ｐＫＮ１００のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ制限酵素部位にクローニングした。
【０１２２】
重鎖キメラ化プライマー
非多義性Ｂ−Ｂ４ ＶＨリーダー配列（ＰＣＲプライマー配列とは独立）を、Ｋａｂａｔデータベースにおけるマウスリーダー配列と整列させた。Ｂ−Ｂ４ ＶＫリーダーに最もよく一致したのは、ＶＨ１７−１Ａ（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，８４（１９８７），２１４）であった。このリーダー配列は、ＳｉｇｎａｌＰアルゴリズムにより正確に切断されことが予測される。ｐＧ４Ｄ２００発現ベクターにクローニングするために、プライマーｃＢＢ４Ｈｆｏｒ（上記参照）及びｇ２２９４９（５’−ＣＧＡＴＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧＴＴＣＣ−３’（配列番号１３）；制限酵素部位に下線を引く）を設計して、ＶＨ１７−１Ａリーダー、Ｂ−Ｂ４のＶＨ領域、並びに末端ＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａＩ制限酵素部位を含むＰＣＲ産物を作製した。フォワードプライマーＣＢＢＨＦｏｒは、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位、Ｋｏｚａｋ翻訳開始部位、及びＶＫ−１７ １Ａリーダー配列を導入する。リバースプライマーｇ２２９４９は、ガンマ４ Ｃ領域の５’末端、及び天然ＡｐａＩ制限酵素部位を導入する。得られた断片を、ｐＧ４Ｄ２００のＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｐａＩ制限酵素部位にクローニングし、ベクターｐＧ４Ｄ２００ｃＢＢ４を得た。
【０１２３】
ｃＢＢ４抗体の産生
バイアル瓶１本分のＣＯＳ７細胞を解凍し、抗生物質を含む１０％の胎児クローンＩ血清を添加したＤＭＥＭ中で増殖させた。１週間後、細胞（１０７細胞／ｍＬで０．７ｍＬ）を、ｐＧ４Ｄ２００ｃＢＢ４＋ｐＫＮ１００ｃＢＢ４（それぞれ１０μｇのＤＮＡ）を用いて、或いはＤＮＡを用いずに電気穿孔処理した。細胞を４日間８ｍＬの増殖培地にプレーティングした。電気穿孔処理を７回繰り返した。
【０１２４】
キメラ抗体の検出
サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、ＣＯＳ７上清中の抗体濃度を測定した。一過性に形質転換されたＣＯＳ７細胞は、約６，９５６ｎｇ／ｍＬの抗体を分泌した（データは示さず）。
【０１２５】
ｃＢ−Ｂ４の結合活性
ＣＯＳ７培養上清におけるｃＢ−Ｂ４の結合活性を検定するために、Ｄｉａｃｌｏｎｅ ｓＣＤ１３８キットを用いた（固相サンドイッチＥＬＩＳＡ）。ｓＣＤ１３８に特異的なモノクローナル抗体で、提供されたマイクロタイターストリップのウェルをコーティングした。最初のインキュベート中、ｓＣＤ１３８及びビオチン化Ｂ−Ｂ４（ｂｉｏ−Ｂ−Ｂ４）抗体を、非標識試験抗体（Ｂ−Ｂ４及びｃＢ−Ｂ４のいずれか）の希釈系列とともに同時にインキュベートした。
低濃度の非標識抗体と競合させるために、この検定におけるｂｉｏ−Ｂ−Ｂ４の濃度を低下させた（さもなければ、ＣＯＳ７細胞培養上清におけるｃＢ−Ｂ４の濃度は、十分な競合を得るには低過ぎた）。この検定の結果から、両方の抗体がＣＤ１３８に対して同一の特異性を有することが明らかになる（データは示さず）。
【０１２６】
ｃＢ−Ｂ４の精製
キメラＢ−Ｂ４を、製造業者の推奨に従って、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ Ｐｌｕｓ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、ＣＯＳ７細胞上清から精製した（データは示さず）。
【０１２７】
ＫＤ−決定：比較 ｎＢＴ０６２／ＢＢ４
可溶性ＣＤ１３８の精製
Ｕ−２６６細胞培養上清由来の可溶性ＣＤ１３８抗原を、Ｂ−Ｂ４にカップリングした１ｍＬの「ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−活性化ＨＰ」カラムを用いて、ＦＰＬＣにより精製した。細胞培養上清を、カラム上のＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）にロードし、その後ＣＤ１３８抗原を、５０ｍＭのトリエチルアミン（ｐＨ１１）で、２ｍＬの画分に溶出させた。溶出したＣＤ１３８を、３７５μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ３）で直ちに中和して、構造的損傷及び機能的損傷の少なくともいずれかを防いだ。
【０１２８】
ＣＤ１３８のビオチン化
スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、ＣＤ１３８を標識した。ＮＨＳ−活性化ビオチンは、ｐＨ７〜９の緩衝液中で、リジン残基のような一級アミノ基と効率よく反応して、安定なアミド結合を形成する。
ＣＤ１３８のビオチン化では、５０μＬのＣＤ１３８を、タンパク質脱塩スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて脱塩した。ビオチン化試薬（ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ，Ｐｉｅｒｃｅ）を、最終濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるように氷冷した脱イオン水に溶解させた。捕捉試薬に比べて、１２倍モル過剰であるビオチン化試薬を有する（５０ｐｍｏｌのＣＤ１３８に対して６００ｐｍｏｌのビオチン化試薬）、ビオチン化試薬及び捕捉試薬溶液を混合し、バイアル瓶を穏やかに振盪しながら、室温で１時間インキュベートした。非結合ビオチン化試薬を、タンパク質脱塩カラムを用いて除去した。
【０１２９】
ＣＤ１３８の固定化
ＢＩＡＣＯＲＥ検定で用いるセンサチップ（ＳＥＮＳＯＲ ＣＨＩＰ ＳＡ、ＢＩＡＣＯＲＥ ＡＢ）を、ＢＩＡＣＯＲＥシステムにおける相互作用分析のためにビオチン化分子に結合するよう設計した。表面は、ストレプトアビジンで予め固定化されたカルボキシメチル化デキストランマトリックスから成り、ビオチン化リガンドの高親和性捕捉の準備が整っている。手動注入により、１０μＬ／分の流速を用いて、ＳＥＮＳＯＲ ＣＨＩＰ ＳＡ上で、ｂＣＤ１３８の固定化を実施した。５０ｍＭのＮａＯＨ中の１ＭのＮａＣｌを、３回連続して１分間注入することにより、チップ表面を調整した。次いで、ビオチン化ＣＤ１３８を１分間注入した。
【０１３０】
ＢＩＡＣＯＲＥを用いる異なる抗体のＫＤ−決定
ＢＩＡＣＯＲＥ Ｃのソフトウェアは、異なる実験に対して、ある設計のみを変化させることができる、予め規定されたマスク、いわゆる「ウィザード」を用いる。ＢＩＡＣＯＲＥ Ｃは、元々濃度を測定するために開発されたため、親和性測定を実行するよう設計されたウィザードが存在しない。しかしながら、適切な設定を行えば、「非特異的結合」のためのウィザードを用いて、親和性速度定数を測定することができたため、ＫＤ−決定に用いた。このウィザードでは、ＢＩＡＣＯＲＥランニング緩衝液を用いて「再生（Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）１」を実施することにより、２つのフローセルを測定し、解離相を９０秒に設定した。真の再生に相当する「再生２」を、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）を用いて実施した。この工程後、リガンドＣＤ１３８は、再び結合競合状態になった。全手順の間、ＨＢＳ−ＥＰをランニング及び希釈緩衝液として用いた。様々な抗体（〜１５０ｋＤａ）のＣＤ１３８への結合を決定するために、会合及び解離を様々な濃度（１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、及び３．１３ｎＭ）で分析した。速度定数ｋａ及びｋｄを計算することにより、解離平衡定数を決定した。その後、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアでｋｄ及びｋａの商を求めることにより、分析物のＫＤ−値を計算した。結果を表４に示す。
【表４】
表４：ｎＢＴ０６２及びＢ−Ｂ４のＫＤ値の比較分析。標準偏差は、平均ＫＤ値について得た。
【０１３１】
考察
各抗体の平均ＫＤ値を、３つの独立な実験から計算した。結果は、全ての実験において、ｎＢＴ０６２が、Ｂ−Ｂ４に比べて僅かに低いＫＤ値を呈することを示す（それぞれ、平均ＫＤ値は１．４ｎＭ及び１．６ｎＭであった）。
【０１３２】
免疫複合体の調製
ｎＢＴ０６２−ＤＭ１及びｈｕＣ２４２−ＤＭ１
チオール含有マイタンシノイドＤＭ１を、Ｃｈａｒｉ（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１（１９９２），１２７）により既に記載されているように、微生物の発酵産物であるアンサマイトシンＰ−３から合成した。ヒト化Ｃ２４２（ｈｕＣ２４２）の調製（（Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，９１（１９９４），９６９）は、既に記載されている。抗体−薬物複合体を、既に記載されているように調製した（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，９３（１９９６），８６１８）。抗体分子１つ当たり、平均３．５個のＤＭ１分子が結合した。
【０１３３】
ｎＢＴ０６２−ＤＭ４
ＢＴ０６２は、ｎＢＴ０６２キメラ化モノクローナル抗体に、リンカーを介して、ジスルフィド結合で結合した、細胞傷害性マイタンシノイド薬であるＤＭ４から構成される、抗体−薬物複合体である。マイタンシノイドは、チューブリン重合及び微小管の組み立てを阻害する有糸分裂阻害剤である（Ｒｅｍｉｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １８９（１９７７），１００２）。ＢＴ０６２（ｎＢＴ０６２−ＤＭ４）の化学的及び模式的表現を図１及び２に示す。
【０１３４】
ＤＭ４の合成
ＤＭ４は、周知の誘導体マイタンシノールから調製される（Ｋｕｐｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．，２１（１９７８），３１）。マイタンシノールは、微生物の発酵産物である、アンサマイトシンＰ３のエステル部分を、リチウムトリメトキシアルミニウム水素化物で還元的に切断することにより調製される（図３参照）。
ＤＭ４は、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）及び塩化亜鉛の存在下で、マイタンシノールを、Ｎ−メチル−Ｎ−（４−メチジチオペンタノイル）−Ｌ−アラニン（ＤＭ４側鎖）でアシル化して、ジスルフィド含有マイタンシノイドＤＭ４−ＳＭｅを得ることにより合成される。ＤＭ４−ＳＭｅは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元されて、所望のチオール含有マイタンシノイドＤＭ４になる（ＤＭ４のプロセスフロー図については図４を参照）。
【０１３５】
免疫複合体ＢＴ０６２
ｎＢＴ０６２−ＤＭ４の調製手順を図５に概説する。ｎＢＴ０６２抗体を、Ｎ−スクシニミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブチラート（ＳＰＤＢリンカー）で修飾して、ジチオピリジル基を導入する。ＤＭ４を、ジチオピリジル基の等量を超える濃度で、修飾された抗体と混合する。ＤＭ４のチオール基と、リンカーを介して抗体に導入されたジチオピリジル基との間のジスルフィド交換反応により、ＢＴ０６２複合体を形成する。クロマトグラフィー及び透析ろ過により精製して、低分子量反応体（ＤＭ４）及び反応産物（チオピリジン）、並びに複合体化抗体の凝集物を除去し、バルク原体を作製する。
【０１３６】
ＦＡＣＳ分析及びＷＳＴ細胞傷害性検定
ＦＡＣＳ分析
ＯＰＭ−２細胞は、ＣＤ１３８を高発現している形質細胞白血病細胞株である。ＯＰＭ−２細胞を、様々な濃度のｎＢＴ０６２、ｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、ｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１、及びｎＢＴ０６２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１のいずれかとともにインキュベートした（図６に示す）。細胞を洗浄し、ＣＤ１３８に結合した抗体及び複合体のいずれかを、ＦＡＣＳ分析において蛍光標識された二次抗体を用いて検出した。これらの実験で測定された平均蛍光を、抗体濃度に対してプロットした。
【０１３７】
細胞生存性アッセイ
ＣＤ１３８＋ＭＯＬＰ−８細胞を、３，０００細胞／ウェルで平底プレートに播種した。ＣＤ１３８−ＢＪＡＢ対照細胞を１，０００細胞／ウェルで播種した。細胞を、様々な濃度のｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、ｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１、及びｎＢＴ０６２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１のいずれか（図７Ａ〜Ｄに示す）で５日間処理した。製造業者の取扱説明書（ＲＯＣＨＥ）に従って、細胞生存性を測定するために、ＷＳＴ試薬（水溶性テトラゾリウム塩、ＲＯＣＨＥ）を添加した。試薬をＭＯＬＰ−８細胞上で７．５時間、及びＢＪＡＢ細胞上で２時間インキュベートした。標準的な手順を用いてマイクロタイターリーダープレートで測定した光学密度に基づいて、生存細胞の割合を計算した。
【０１３８】
考察
ｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、ｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１、ｎＢＴ０６２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、及びｎＢＴ０６２のいずれかの結合をＦＡＣＳにより分析した。標的細胞として、ＣＤ１３８＋ＯＰＭ−２を、ｎＢＴ０６２及び免疫複合体のいずれかとともにインキュベートし、細胞に結合した分子を、蛍光標識された二次抗体を用いて検出した。図６では、細胞に結合した抗体の量の尺度として平均蛍光を、様々な抗体及び複合体のいずれかの濃度に対してプロットした。結果は、ｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、ｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１、及びｎＢＴ０６２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１は、非常に類似する結合特性を示すことを示す。更に、結果は、複合体化していない抗体の結合特性が、複合体化した毒素により影響を受けないことを強く示唆する。
細胞生存性アッセイでは、ＣＤ１３８＋ＭＯＬＰ−８標的細胞、及びＣＤ１３８−ＢＪＡＢ Ｂ−リンパ芽球腫対照細胞に対する抗体の細胞傷害活性を分析した。両方の細胞株を平底プレートに播種し、濃度の上昇する免疫複合体とともにインキュベートした。複合体化していない抗体を対照として用いた。細胞生存性を測定するために、ＷＳＴ試薬を用いることにより、免疫複合体の添加後５日間、細胞傷害活性を分析した。図７Ａ〜Ｃでは、ビヒクル対照で処理した対照細胞に対する生存細胞の割合を、上昇する免疫複合体濃度に対してプロットした。結果は、ＭＯＬＰ−８細胞に対する、ｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、ｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１、及びｎＢＴ０６２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１の細胞傷害活性が非常に類似していることを示す。予想通り、ＣＤ１３８−ＢＪＡＢ対照細胞は、免疫複合体により死滅せず、これは全ての免疫複合体がＣＤ１３８への細胞特異的結合を介して作用することを示す。競合実験では、ＭＯＬＰ−８細胞を、モル過剰な複合体化していないｎＢＴ０６２とともにプレインキュベートした。プレインキュベートにより、ｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の細胞傷害性が実質的に遮断され、これは免疫複合体が細胞表面上のＣＤ１３８への特異的結合を介して細胞を死滅させるという更なるエビデンスを提供する（図７Ｄ）。
【０１３９】
異種移植マウス実験
Ｂ−Ｂ４抗体のヒトキメラバージョンであるｎＢＴ０６２の抗体−マイタンシノイド複合体の抗腫瘍活性に対する、ＣＤ１３８標的の重要性を評価するために、異種移植マウス実験を実施した。ジスルフィド結合の化学的安定性の異なる可能性のある、ｎＢＴ０６２−マイタンシノイド複合体の２つのバージョンを調製した（ｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１及びｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４）。これらの抗体−薬物複合体の抗腫瘍活性を、Ｂ−Ｂ４−ＳＰＰ−ＤＭ１複合体（マウス親抗体を含む）、並びに複合体化していない遊離マイタンシノイド（ＤＭ４）、ネイティブな非修飾ｎＢＴ０６２抗体、及び標的ではない（無関係な）ＩｇＧ１−マイタンシノイド複合体の活性と比較した。重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスにおいて、ヒト多発性骨髄腫のＣＤ１３８陽性異種移植モデル（ＭＯＬＰ−８）で、複合体を評価した。
これらのマウスでは、ＭＯＬＰ−８細胞懸濁液を接種することにより、皮下腫瘍を確立した（雌ＣＢ．１７ ＳＣＩＤマウス）。腫瘍体積が平均１１３ｍｍ３に達したとき、単回ボーラス静脈内注射による処理を実施した。腫瘍体積及び体重の変化を、１週間に２回モニタした。腫瘍細胞の接種後、６８日間に亘って実験を実行した。
【０１４０】
異種移植マウス実験Ａ
マウス
雌ＣＢ．１７ ＳＣＩＤマウス（５週齢）を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。
ヒト腫瘍細胞株
ＭＯＬＰ−８（ヒト多発性骨髄腫細胞株）は、ＡＴＣＣから供給された。ＭＯＬＰ−８細胞（その細胞表面上でＣＤ１３８抗原を発現し、ＳＣＩＤマウスにおいて異種移植腫瘍を発達させる）を、４ｍＭのＬ−グルタミン（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１０％のウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）、及び１％のストレプトマイシン／ペニシリンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地で、５％のＣＯ２を含む湿気のある大気中にて、３７℃で維持した。
【０１４１】
パートＩ
マウスにおける腫瘍増殖
各マウスの右肩下の領域に、１×１０７個のＭＯＬＰ−８細胞を皮下接種した。総体積はマウス当たり０．２ｍＬであり、ここで血清を含有しない培地の、マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に対する比は１／１（ｖ／ｖ）であった。処理前に、異種移植腫瘍を毎日モニタし、確立を可能にした。腫瘍体積は、腫瘍細胞接種後約１１日で、およそ１１３ｍｍ３に達した。ＣＢ．１７ ＳＣＩＤマウスの腫瘍発現率（ｔａｋｅ ｒａｔｅ）は１００％であった。
腫瘍細胞接種の１１日後、４２匹のマウスを腫瘍体積及び体重に基づいて選択した。腫瘍体積は、６８．２ｍｍ３〜１３５．９ｍｍ３の範囲であった。４２匹のマウスを、それぞれ腫瘍体積に基づいて、無作為に６匹の動物の７群（Ａ〜Ｇ）に分けた。
Ａ群の６匹のマウスにはそれぞれ、ビヒクル対照として２００μＬのＰＢＳを投与した。Ｂ群のマウスにはそれぞれ、１３．８ｍｇ／ｋｇのｎＢＴ０６２のネイキッド（ｎａｋｅｄ）抗体を投与した。この用量は、２５０μｇ／ｋｇのマイタンシノイドが結合した抗体中のｎＢＴ０６２抗体成分の量に相当する。複合体分子中のマイタンシノイドのｎＢＴ０６２抗体に対する分子量の比は、約１／５５である。Ｃ群のマウスにはそれぞれ、２５０μｇ／ｋｇのＤＭ４を投与した。Ｄ群のマウスにはそれぞれ、２５０μｇ／ｋｇのｈｕＣ２４２−ＤＭ４を投与した。Ｅ、Ｆ、及びＧ群のマウスには、それぞれ、２５０μｇ／ｋｇのｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、Ｂ−Ｂ４−ＳＰＰ−ＤＭ１、及びｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１を投与した。
２７ゲージの、１／２インチの針を備える１ｍＬの注射器を用いて、外側尾静脈を通して、単回ボーラス注射として、全ての薬剤を静脈内投与した。投与前に、ｎＢＴ０６２抗体、ｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、及びｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１の原液を、滅菌ＰＢＳで、それぞれ２ｍｇ／ｍＬ、２８．１μｇ／ｍＬ、及び２８．１μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、その結果各マウスに注射された体積は１２０〜２２０μＬであった。
【０１４２】
パートＩＩ
第２の実験セットでは、血清を含有しない培地及びマトリゲルの５０：５０混合物に懸濁したＭＯＬＰ−８細胞（マウス当たり１．５×１０７細胞）を、右肩下の領域に１００μＬ皮下注射した。腫瘍体積は、細胞接種後１１日目に約８０ｍｍ３に達し、対照の平均は２５日目で約７５０ｍｍ３であった。腫瘍の倍加時間は、４．５８日であると推定された。対照群の各マウス（ｎ＝６）には、０．２ｍＬの滅菌ＰＢＳを、ボーラス注射で外側尾静脈に投与した（ｉ．ｖ．）。全ての処理用量は、複合体化マイタンシノイドに基づいた。それぞれ、４５０μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、及び１００μｇ／ｋｇの用量で、ｎＢＴ０６２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、及びｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１のいずれかを単回静脈内注射することにより、９群（ｎ＝６）を処理した。追加群（ｎ＝６）には、反復投与（週１回５週間）で２５０μｇ／ｋｇのｎＢＴ０６２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１を投与した。ＬａｂＣａｔプログラムを用いて、腫瘍体積により、マウスを１１群（ｎ＝６）に無作為に分けた。腫瘍体積は、４０．０ｍｍ３〜１５２．５ｍｍ３の範囲であった。マウスには、個体の体重に基づいて投薬した。
腫瘍の大きさを、ＬａｂＣａｔシステム（Ｔｕｍｏｒ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ｔｒａｃｋｉｎｇ，Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，Ｉｎｃ．，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）を用いて、３次元で１週間に２回測定した。腫瘍体積（ｍｍ３）を、Ｔｏｍａｙｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２４（１９８９），１４８に記載の方法を用いて計算した：
体積＝長さ×幅×高さ×１／２
Ｌｏｇ１０細胞死滅（ｃｅｌｌ ｋｉｌｌ）を、Ｂｉｓｓｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５１（１９９１），４８４５に記載の式を用いて計算した：
Ｌｏｇ１０細胞死滅＝（Ｔ−Ｃ）／Ｔｄ×３．３２
式中、（Ｔ−Ｃ）、即ち腫瘍増殖遅延は、処理群（Ｔ）及び対照群（Ｃ）の腫瘍が、所定の大きさ（６００ｍｍ３）に達するのに必要な日数の中央時間である。Ｔｄは、対照マウスの中央腫瘍体積に基づいた、腫瘍倍加時間であり、３．３２は、細胞増殖の対数当たりの細胞倍加数である。
【０１４３】
結果
個々のマウスにおける腫瘍増殖を図８Ａ〜９Ｄに示す。各群の平均（＋／−ＳＤ）腫瘍増殖を図１０に示す。
ＰＢＳ処理した動物における腫瘍増殖と比べて、ｎＢＴ０６２抗体、複合体化していない遊離ＤＭ４、及び無関係の非標的複合体ｈｕＣ２４２−ＤＭ４のいずれかによる処理は、腫瘍増殖をそれ程阻害しなかった。
２５０μｇ／ｋｇの用量では、３つ全てのＣＤ１３８標的複合体、ｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、Ｂ−Ｂ４−ＳＰＰ−ＤＭ１、及びｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１が、腫瘍増殖の著しい遅延を引き起こした。処理群で測定した平均腫瘍体積に基づくと、ＤＭ４複合体ｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の活性が最も高く、一方ｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１は、そのマウス相当物Ｂ−Ｂ４−ＳＰＰ−ＤＭ１に比べて、僅かに高い活性を示した（図１０）。加えて、個々のマウスで得られた結果は、Ｂ−Ｂ４−ＳＰＰ−ＤＭ１で得られた抗腫瘍活性がより不均一であり、それ故ｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１で処理したマウスにおける測定値より予測が難しい。抗腫瘍活性の均一性の観点では、標的抗体としてｎＢＴ０６２を用いる他の複合体、ｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４はｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１に類似した挙動を示した。
いずれの処理群でも体重減少は見られず、これは処理が耐容性良好であったことを示唆する。
【０１４４】
考察
実験動物における３種のＣＤ１３８標的複合体の分析結果は、抗腫瘍活性にいとって、標的送達が重要であることを示す。ヒトキメラｎＢＴ０６２及びマウスＢ−Ｂ４抗体のマイタンシノイド複合体は、対数細胞死滅により測定したとき、非常に高い活性を示すが、複合体化していないＤＭ４、修飾されていないネイティブなｈｕＢＴ０６２抗体、及び非標的対照複合体（ｈｕＣ２４２−ＤＭ４）のいずれかによる処理は、腫瘍増殖に対してそれ程影響を与えなかった。
ヒトキメラ抗体から調製した免疫複合体、ｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１は、そのマウス相当物から調製した複合体、Ｂ−Ｂ４−ＳＰＰ−ＤＭ１より（ｔｈｅｎ）、僅かに高い抗腫瘍活性をもたらした。加えて、ｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１及びｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４で処理することにより、Ｂ−Ｂ４−ＳＰＰ−ＤＭ１による処理と比べて、個々のマウスにおいてより均一な反応が得られた。Ｂ−Ｂ４−ＳＰＰ−ＤＭ１の高結合変異は、接種後の経時的な（日）、ＣＢ．１７ ＳＣＩＤマウスにおけるＭＯＬＰ−８ヒト多発性骨髄腫異種移植片の中央腫瘍体積（＋／−ＳＤ）が、実際に、ｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１よりも、Ｂ−Ｂ４−ＳＰＰ−ＤＭ１について、比較的良好な結果をもたらしたことを説明した（データは示さず）。標的抗体としてｎＢＴ０６２を用いる免疫複合体のこの特徴は、特に複合体の治療的用途に有益であると思われる。
最後に、ＳＣＩＤマウスのＭＯＬＰ−８異種移植モデルにおいて単回ｉｖ投与した後、最も強力なマイタンシノイド複合体はｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４であった。
【０１４５】
異種移植マウス実験Ｂ
この実験セットでは、８５匹のマウスの右肩にＭＯＬＰ−８細胞（１．５×１０７細胞／マウス）を皮下接種した。腫瘍発現率は１００％であった。平均腫瘍体積が約８０ｍｍ３である、嵩高いＭＯＬＰ−８腫瘍を有する６６匹のＳＣＩＤマウスを、１１の処理群（ｎ＝６）に無作為に分けた。マウスを、３種の複合体（ｎＢＴ０６２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、及びｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１のいずれか）のうち１種の単回用量で処理した。追加群には、週用量のｎＢＴ０６２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１を５回投与し、対照群には単回用量のＰＢＳを投与した。平均腫瘍体積を図１１Ａに示す。各複合体について、用量反応が確立された。ＰＢＳ処理した動物では、２５日目に中央腫瘍体積が７５０ｍｍ３に達した。対照腫瘍増殖の対数線形プロット上において最も適合した線形回帰曲線適合により決定された腫瘍倍加時間は、４．５８日であった。４５０μｇ／ｋｇのｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４で処理した動物が、最高の対数細胞死滅（ＬＣＫ＝２．８９）を有し、続いて、２５０μｇ／ｋｇの週用量のｎＢＴ０６２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１で処理した動物（ＬＣＫ＝２．１；表５を参照）であった。ダネットの多重比較試験を実施してＡＮＯＶＡを反復測定することによる、処理群の平均腫瘍体積曲線の比較は、ＰＢＳ対照群と、４５０μｇ／ｋｇのｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４（ｐ＜０．０１）、２５０μｇ／ｋｇのｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４（ｐ＜０．０５）、及び２５０μｇ／ｋｇの週用量５回のｎＢＴ０６２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１（ｐ＜０．０５）との間に有意な差を示した。接種後８５日目までに腫瘍が部分的に縮小した、４５０μｇ／ｋｇのｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４を投与した動物を除いて、いずれの処理群でも、部分的腫瘍縮小及び完全な腫瘍縮小のいずれも生じなかった。
【０１４６】
表５は、様々な投薬スキームにおける、様々なｎＢＴ０６２−ＤＭｘ複合体の抗腫瘍活性尺度としての対数細胞死滅（ＬＣＫ）値である。ＬＣＫ値の計算に関する情報については、材料及び方法の部分を参照。
【表５】
【０１４７】
参考文献
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Ｂｉｓｐｉｎｇ Ｇ， Ｋｒｏｐｆｆ Ｍ， Ｗｅｎｎｉｎｇ Ｄ， Ｄｒｅｙｅｒ Ｂ， Ｂｅｓｓｏｎｏｖ Ｓ， Ｈｉｌｂｅｒｇ Ｆ， Ｒｏｔｈ ＧＪ， Ｍｕｎｚｅｒｔ Ｇ， Ｓｔｅｆａｎｉｃ Ｍ， Ｓｔｅｌｌｊｅｓ Ｍ， Ｓｃｈｅｆｆｏｌｄ Ｃ， Ｍｕｌｌｅｒ−Ｔｉｄｏｗ Ｃ， Ｌｉｅｂｉｓｃｈ Ｐ， Ｌａｎｇ Ｎ， Ｔｃｈｉｎｄａ Ｊ， Ｓｅｒｖｅ ＨＬ， Ｍｅｓｔｅｒｓ ＲＭ， Ｂｅｒｄｅｌ ＷＥ， Ｋｉｅｎａｓｔ Ｊ． Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｉｎａｓｅｓ ｂｙ ａ ｎｏｖｅｌ ｉｎｄｏｌｉｎｏｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ： ａｂｒｏｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｏｍａ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ． Ｂｌｏｏｄ． ２００６ Ｍａｒ １；１０７（５）：２０７９−８９． Ｅｐｕｂ ２００５ Ｎｏｖ ８．
Ｂｌａｅｔｔｌｅｒ ＷＡ ａｎｄ Ｃｈａｒｉ ＲＶＪ． Ｄｒｕｇｓ ｔｏ Ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｓ Ｔｕｍｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ． Ｉｎ： Ｏｊｉｍａ， Ｉ．， Ｖｉｔｅ， Ｇ．Ｄ． ａｎｄ Ａｌｔｍａｎｎ， Ｋ．−Ｈ．， Ｅｄｉｔｏｒｓ， ２００１． Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔｓ−Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ， ｐｐ． ３１７−３３８．
Ｂｒｏｓｓ ＰＦ， Ｂｅｉｔｚ Ｊ， Ｃｈｅｎ Ｇ， Ｃｈｅｎ ＸＨ， Ｄｕｆｆｙ Ｅ， Ｋｉｅｆｆｅｒ Ｌ， Ｒｏｙ Ｓ， Ｓｒｉｄｈａｒａ Ｒ， Ｒａｈｍａｎ Ａ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｇ， Ｐａｚｄｕｒ Ｒ． Ａｐｐｒｏｖａｌ ｓｕｍｍａｒｙ： ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ ｉｎ ｒｅｌａｐｓｅｄ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００１；７：１４９０−１４９６．
Ｃａｒｂｏｎｅ Ａ， Ｇａｉｄａｎｏ Ｇ， Ｇｌｏｇｈｉｎｉ Ａ， Ｆｅｒｌｉｔｏ Ａ， Ｒｉｎａｌｄｏ Ａ， Ｓｔｅｉｎ Ｈ． ＡＩＤＳ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｌａｓｍａ− ｂｌａｓｔｉｃ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒａｌ ｃａｖｉｔｙ ａｎｄ ｊａｗｓ： ａ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｄｉｌｅｍｍａ．Ａｎｎ． Ｏｔｏｌ． Ｒｈｉｎｏｌ． Ｌａｒｙｎｇｏｌ． １９９９； １０８： ９５−９９．
Ｃａｒｌｓｓｏｎ Ｊ， Ｄｒｅｖｉｎ Ｈ， Ａｘｅｎ Ｒ． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈｉｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ． Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ， ａ ｎｅｗ ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅａｇｅｎｔ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ １９７８； １７３： ７２３−７３７．
Ｃａｒｔｅｒ Ｐ． Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ． ２００１；１：１１８−１２９．
Ｃｈａｒｉ ＲＶ， Ｍａｒｔｅｌｌ ＢＡ， Ｇｒｏｓｓ ＪＬ， Ｃｏｏｋ ＳＢ， Ｓｈａｈ ＳＡ， Ｂｌａｔｔｌｅｒ ＷＡ， ＭｃＫｅｎｚｉｅ ＳＪ， Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒ ＶＳ． Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｎｏｖｅｌ ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ： ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９２；５２：１２７−１３１．
Ｃｈａｒｉ ＲＶ， Ｊａｃｋｅｌ ＫＡ， Ｂｏｕｒｒｅｔ ＬＡ， Ｄｅｒｒ ＳＭ， Ｔａｄａｙｏｎｉ ＢＭ， Ｍａｔｔｏｃｋｓ ＫＭ， Ｓｈａｈ ＳＡ， Ｌｉｕ Ｃ， Ｂｌａｅｔｔｌｅｒ ＷＡ ａｎｄ Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒ ＶＳ． Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａ ＣＣ−１０６５ ａｎａｌｏｇｕｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９５； ５５： ４０７９−４０８４．
Ｃｈａｒｎａｕｘ Ｎ， Ｂｒｕｌｅ Ｓ， Ｃｈａｉｇｎｅａｕ Ｔ， Ｓａｆｆａｒ Ｌ， Ｓｕｔｔｏｎ Ａ， Ｈａｍｏｎ Ｍ， Ｐｒｏｓｔ Ｃ， Ｌｉｅｖｒｅ Ｎ， Ｖｉｔａ Ｃ， Ｇａｔｔｅｇｎｏ Ｌ． ＲＡＮＴＥＳ （ＣＣＬ５） ｉｎｄｕｃｅｓ ａ ＣＣＲ５−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｓｈｅｄｄｉｎｇ ｏｆ ｓｙｎｄｅｃａｎ−１ （ＣＤ１３８） ａｎｄ ｓｙｎｄｅｃａｎ−４ ｆｒｏｍ ＨｅＬａ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｆｏｒｍｓ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｈｅｄ ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ＣＤ４４． Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ． ２００４ Ｓｅｐ ８ ［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］
Ｃｈｅｎ ＢＰ， Ｇａｌｙ Ａ， Ｋｙｏｉｚｕｍｉ Ｓ， Ｎａｍｉｋａｗａ Ｒ， Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ Ｊ， Ｗｅｂｂ Ｓ， Ｆｏｒｄ Ｂ， Ｃｅｎ ＤＺ， Ｃｈｅｎ ＳＣ． Ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎ ＳＣＩＤ−ｈｕ ｍｉｃｅ． Ｂｌｏｏｄ． １９９４；８４：２４９７−２５０５．
Ｃｈｉｌｏｓｉ Ｍ， Ａｄａｍｉ Ｆ， Ｌｅｓｔａｎｉ Ｍ， Ｍｏｎｔａｇｎａ Ｌ， Ｃｉｍａｒｏｓｔｏ Ｌ， Ｓｅｍｅｎｚａｔｏ Ｇ， Ｐｉｚｚｏｌｏ Ｇ， Ｍｅｎｅｓｔｒｉｎａ Ｆ． ＣＤ１３８／ｓｙｎｄｅｃａｎ−１： ａ ｕｓｅｆｕｌ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌｓ ｏｎ ｒｏｕｔｉｎｅ ｔｒｅｐｈｉｎｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｂｉｏｐｓｉｅｓ． Ｍｏｄ Ｐａｔｈｏｌ． １９９９；１２：１１０１−１１０６．
Ｃｌｅｍｅｎｔ Ｃ， Ｖｏｏｉｊｓ， Ｗ．Ｃ．， Ｋｌｅｉｎ， Ｂ．， ａｎｄ Ｗｉｊｄｅｎｅｓ， Ｊ． Ｉｎ： ａｌ． ＳＦＳｅ， ｅｄ． Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ Ｖ． Ｏｘｆｏｒｄ： Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ； １９９５：７１４−７１５．
Ｃｏｕｔｕｒｉｅｒ Ｏ， Ｆａｉｖｒｅ−Ｃｈａｕｖｅｔ Ａ ； Ｆｉｌｉｐｐｏｖｉｃｈ ＩＶ； Ｔｈｅｄｒｅｚ Ｐ， Ｓａｉｅ−Ｍａｕｒｅｌ Ｃ； Ｂａｒｄｉｅｓ Ｍ； Ｍｉｓｈｒａ ＡＫ； Ｇａｕｖｒｉｔ Ｍ； Ｂｌａｉｎ Ｇ；Ａｐｏｓｔｏｌｉｄｉｓ Ｃ； Ｍｏｌｉｎｅｔ Ｒ； Ａｂｂｅ ＪＣ； Ｂａｔｅｉｌｌｅ Ｒ； Ｗｉｊｄｅｎｅｓ Ｊ； Ｃｈａｔａｌ ＪＦ； Ｃｈｅｒｅｌ Ｍ； Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ２１３Ｂｉ−ａｌｐｈａ ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５（１０ Ｓｕｐｐｌ．） （Ｏｃｔ １９９９） ３１６５ｓ−３１７０ｓ．
Ｄａｖｉｅｓ ＥＪ ｅｔ ａｌ． ， Ｂｌａｃｋｈａｌｌ ＦＨ， Ｓｈａｎｋｓ ＪＨ， Ｄａｖｉｄ Ｇ， ＭｃＧｏｗｎ ＡＴ， Ｓｗｉｎｄｅｌｌ Ｒ， Ｓｌａｄｅ ＲＪ， Ｍａｒｔｉｎ−Ｈｉｒｓｃｈ Ｐ， Ｇａｌｌａｇｈｅｒ ＪＴ， Ｊａｙｓｏｎ ＧＣ． Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ Ｈｅｐａｒａｎ Ｓｕｌｆａｔｅ Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ ｉｎ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００４； １０（１５）：５１７８−８６．
Ｄｈｏｄａｐｋａｒ ＭＶ， Ａｂｅ Ｅ， Ｔｈｅｕｓ Ａ， Ｌａｃｙ Ｍ， Ｌａｎｇｆｏｒｄ ＪＫ， Ｂａｒｌｏｇｉｅ Ｂ， Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ ＲＤ． Ｓｙｎｄｅｃａｎ−１ ｉｓ ａ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｍｙｅｌｏｍａ ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ： ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ， ｇｒｏｗｔｈ， ａｎｄ ｂｏｎｅ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ． Ｂｌｏｏｄ． １９９８；９１：２６７９−２６８８．
Ｄｏｒｅ ＪＭ， Ｍｏｒａｒｄ Ｆ， Ｖｉｔａ Ｎ， Ｗｉｊｄｅｎｅｓ Ｊ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｎ ｓｙｎｄｅｃａｎ−１ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｆ Ｂ−Ｂ２ ａｎｄ Ｂ−Ｂ４ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． １９９８；４２６：６７−７０．
Ｄｏｗｅｌｌ ＪＡ， Ｋｏｒｔｈ−Ｂｒａｄｌｅｙ Ｊ， Ｌｉｕ Ｈ， Ｋｉｎｇ ＳＰ， Ｂｅｒｇｅｒ ＭＳ． Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ， ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎ ｆｉｒｓｔ ｒｅｌａｐｓｅ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２００１；４１：１２０６−１２１４．
Ｅｄｉｎｇｅｒ Ｍ， Ｓｗｅｅｎｅｙ ＴＪ， Ｔｕｃｋｅｒ ＡＡ， Ｏｌｏｍｕ ＡＢ， Ｎｅｇｒｉｎ ＲＳ， Ｃｏｎｔａｇ ＣＨ． Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ． Ｎｅｏｐｌａｓｉａ． １９９９；１：３０３−３１０．
Ｇａｔｔｅｉ Ｖ， Ｇｏｄｅａｓ Ｃ， Ｄｅｇａｎ Ｍ， Ｒｏｓｓｉ ＦＭ， Ａｌｄｉｎｕｃｃｉ Ｄ， Ｐｉｎｔｏ Ａ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉ−ＣＤ１３８ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｆ ｓｙｎｄｅｃａｎ−１ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｃｅｌｌｓ． Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ． １９９９；１０４：１５２−１６２．
Ｈａｍａｎｎ ＰＲ， Ｈｉｎｍａｎ ＬＭ， Ｂｅｙｅｒ ＣＦ， Ｌｉｎｄｈ Ｄ， Ｕｐｅｓｌａｃｉｓ Ｊ， Ｆｌｏｗｅｒｓ ＤＡ， Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ Ｉ． Ａｎ ａｎｔｉ−ＣＤ３３ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ． Ｃｈｏｉｃｅ ｏｆ ｌｉｎｋｅｒ． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ． ２００２；１３：４０−４６．
Ｈａｎ Ｉ， Ｐａｒｋ Ｈ， Ｏｈ ＥＳ． Ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｓｙｎｄｅｃａｎ−２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｍｏｕｒｉｇｅｎｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｍｏｌ Ｈｉｓｔｏｌ． ２００４： ３５（３）：３１９−２６．
Ｈｏｒｖａｔｈｏｖａ Ｍ， Ｇａｉｌｌａｒｄ， Ｊ．−Ｐ．， Ｌｉｕｔａｒｄ， Ｊ．， Ｄｕｐｅｒｒａｙ， Ｃ．， Ｌａｖａｂｒｅ−Ｂｅｒｔｒａｎｄ， Ｔ．， Ｂｏｕｒｑｕａｒｄ， Ｐ ｅｔ ａｌ． Ｉｎ： ａｌ． ＳＦＳｅ， ｅｄ． Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ Ｖ． Ｏｘｆｏｒｄ： Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ； １９９５：７１３−７１４．
Ｋｒｅｂｓ Ｂ， Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ Ｒ， Ｒｅｉｆｆｅｒｔ Ｓ， Ｒｏｔｈｅ Ｃ， Ｔｅｓａｒ Ｍ， Ｔｈｏｍａｓｓｅｎ Ｅ， Ｃａｏ Ｍ， Ｄｒｅｉｅｒ Ｔ， Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｄ， Ｈｏｓｓ Ａ ｅｔ ａｌ． Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． ２００１． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５４， ｐｐ． ６７−８４．
Ｋｕｐｃｈａｎ ＳＭ， Ｓｎｅｄｅｎ ＡＴ， Ｂｒａｎｆｍａｎ ＡＲ， Ｈｏｗｉｅ ＧＡ， Ｒｅｂｈｕｎ ＬＩ， ＭｃＩｖｏｒ ＷＥ， Ｗａｎｇ ＲＷ， Ｓｃｈｎａｉｔｍａｎ ＴＣ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ａｎｔｉｌｅｕｋｅｍｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ． Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． １９７８；２１：３１−３７．
Ｋｙｏｉｚｕｍｉ Ｓ， Ｂａｕｍ ＣＭ， Ｋａｎｅｓｈｉｍａ Ｈ， ＭｃＣｕｎｅ ＪＭ， Ｙｅｅ ＥＪ， Ｎａｍｉｋａｗａ Ｒ． Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｉｎ ＳＣＩＤ−ｈｕ ｍｉｃｅ． Ｂｌｏｏｄ． １９９２；７９：１７０４−１７１１．
Ｋｙｏｉｚｕｍｉ Ｓ， Ｍｕｒｒａｙ ＬＪ， Ｎａｍｉｋａｗａ Ｒ． Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｔｈｅ ＳＣＩＤ−ｈｕ ｍｏｕｓｅ． Ｂｌｏｏｄ． １９９３；８１：１４７９−１４８８．
Ｌａｎｇｆｏｒｄ ＪＫ， Ｓｔａｎｌｅｙ ＭＪ， Ｃａｏ Ｄ， Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ ＲＤ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｃｈａｉｎｓ ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍａｌ ｓｙｎｄｅｃａｎ−１ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． １９９８ Ｎｏｖ ６；２７３（４５）：２９９６５−７１．
Ｌｉｕ Ｃ， Ｔａｄａｙｏｎｉ ＢＭ， Ｂｏｕｒｒｅｔ ＬＡ， Ｍａｔｔｏｃｋｓ ＫＭ， Ｄｅｒｒ ＳＭ， Ｗｉｄｄｉｓｏｎ ＷＣ， Ｋｅｄｅｒｓｈａ ＮＬ， Ａｒｉｎｉｅｌｌｏ ＰＤ， Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒ ＶＳ， Ｌａｍｂｅｒｔ ＪＭ， Ｂｌａｔｔｌｅｒ ＷＡ， Ｃｈａｒｉ ＲＶ． Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｃｏｌｏｎ ｔｕｍｏｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９６；９３：８６１８−８６２３．
ＭｃＣｕｎｅ ＪＭ， Ｎａｍｉｋａｗａ Ｒ， Ｋａｎｅｓｈｉｍａ Ｈ， Ｓｈｕｌｔｚ ＬＤ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ Ｍ， Ｗｅｉｓｓｍａｎ ＩＬ． Ｔｈｅ ＳＣＩＤ−ｈｕ ｍｏｕｓｅ： ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｍａｔｏｌｙｍｐｈｏｉｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９８８；２４１：１６３２−１６３９．
Ｍｅｎｎｅｒｉｃｈ Ｄ， Ｖｏｇｅｌ Ａ， Ｋｌａｍａｎ Ｉ， Ｄａｈｌ Ｅ， Ｌｉｃｈｔｎｅｒ ＲＢ， Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ Ａ， Ｐｏｈｌｅｎｚ ＨＤ， Ｔｈｉｅｒａｕｃｈ ＫＨ， Ｓｏｍｍｅｒ Ａ． Ｓｈｉｆｔ ｏｆ ｓｙｎｄｅｃａｎ−１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｒｏｍ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｔｏ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｄｕｒｉｎｇ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｕｒｓ． Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ． ２００４ Ｊｕｎ； ４０（９）：１３７３−８２．
Ｍｏｓｍａｎｎ Ｔ． Ｒａｐｉｄ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ： ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ． １９８３；６５：５５−６３．
Ｎａｍｉｋａｗａ Ｒ， Ｕｅｄａ Ｒ， Ｋｙｏｉｚｕｍｉ Ｓ． Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｍａｒｒｏｗ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｏｆ ＳＣＩＤ−ｈｕ ｍｉｃｅ． Ｂｌｏｏｄ． １９９３；８２：２５２６−２５３６．
Ｏ‘Ｃｏｎｎｅｌｌ ＦＰ， Ｐｉｎｋｕｓ ＪＬ， Ｐｉｎｋｕｓ ＧＳ． ＣＤ１３８ （Ｓｙｎｄｅｃａｎ−１）， ａ Ｐｌａｓｍａ Ｃｅｌｌ Ｍａｒｋｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｆｉｌｅ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ａｎｄ Ｎｏｎｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｎｅｏｐｌａｓｍｓ． Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ ２００４； １２１：２５４−２６３．
Ｏｊｉｍａ Ｉ， Ｇｅｎｇ Ｘ， Ｗｕ Ｘ， Ｑｕ Ｃ， Ｂｏｒｅｌｌａ ＣＰ， Ｘｉｅ Ｈ， Ｗｉｌｈｅｌｍ ＳＤ， Ｌｅｅｃｅ ＢＡ， Ｂａｒｔｌｅ ＬＭ， Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒ ＶＳ ａｎｄ Ｃｈａｒｉ ＲＶ． Ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｏｖｅｌ ｔａｘｏｉｄ−ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ． ２００２． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４５， ｐｐ． ５６２０−５６２３．
Ｏｌａｆｓｅｎ，Ｔ， Ｃｈｅｕｎｇ， ＣＣ， Ｙａｚａｋｉ， ＰＪ， Ｌｉ Ｌ， Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎ Ｇ， Ｇａｍｂｈｉｒ ＳＳ， Ｓｈｅｒｍａｎ， ＭＡ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ， ＬＥ， Ｓｈｉｖｅｌｙ， ＪＥ， Ｒａｕｂｉｔｓｃｈｅｋ， ＡＡ， ａｎｄ Ｗｕ， ＡＭ． Ｃｏｖａｌｅｎｔ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｌｉｎｋｅｄ ａｎｔｉ−ＣＥＡ ｄｉａｂｏｄｙ ａｌｌｏｗｓ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｉｎｇ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． ２００４； Ｐｒｏｔ． Ｅｎｇ． Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ １７：１： ２１−２７．
Ｏｒｏｓｚ Ｚ， Ｋｏｐｐｅｒ Ｌ． Ｓｙｎｄｅｃａｎ−１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｏｆｔ ｔｉｓｓｕｅ ｔｕｍｏｕｒｓ． Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００１： ２１（１Ｂ）：７３３−７．
Ｐａｄｌａｎ， ＥＡ． Ａ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｗｈｉｌｅ ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ ｔｈｅｉｒ ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ． Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９１； ２８： ４８９−４９８．
Ｐａｙｎｅ Ｇ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ． ２００３；３：２０７−２１２．
Ｐｅｇｒａｍ ＭＤ， Ｌｉｐｔｏｎ Ａ， Ｈａｙｅｓ ＤＦ， Ｗｅｂｅｒ ＢＬ， Ｂａｓｅｌｇａ ＪＭ， Ｔｒｉｐａｔｈｙ Ｄ， Ｂａｌｙ Ｄ， Ｂａｕｇｈｍａｎ ＳＡ， Ｔｗａｄｄｅｌｌ Ｔ， Ｇｌａｓｐｙ ＪＡ ａｎｄ Ｓｌａｍｏｎ ＤＪ． Ｐｈａｓｅ ＩＩ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉ−ｐ１８５ＨＥＲ２／ｎｅｕ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｌｕｓ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｔｏ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ． １９９８． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １６， ｐｐ． ２６５９−２６７１．
Ｒａｗｓｔｒｏｎ ＡＣ， Ｏｗｅｎ ＲＧ， Ｄａｖｉｅｓ ＦＥ， Ｊｏｈｎｓｏｎ ＲＪ， Ｊｏｎｅｓ ＲＡ， Ｒｉｃｈａｒｄｓ ＳＪ， Ｅｖａｎｓ ＰＡ， Ｃｈｉｌｄ ＪＡ， Ｓｍｉｔｈ ＧＭ， Ｊａｃｋ ＡＳ， Ｍｏｒｇａｎ ＧＪ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ： ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｔａｇｅ． Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ． １９９７；９７：４６−５５．
Ｒｅｍｉｌｌａｒｄ Ｓ， Ｒｅｂｈｕｎ ＬＩ， Ｈｏｗｉｅ ＧＡ， Ｋｕｐｃｈａｎ ＳＭ． Ａｎｔｉｍｉｔｏｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔ ｔｕｍｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９７５；１８９：１００２−１００５．
Ｒｏｇｕｓｋａ ＭＡ， Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ＪＴ， Ｋｅｄｄｙ ＣＡ， Ｈｅｎｒｙ ＡＨ， Ｓｅａｒｌｅ ＳＪ， Ｌａｍｂｅｒｔ ＪＭ， Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒ ＶＳ， Ｂｌａｔｔｌｅｒ ＷＡ， Ｒｅｅｓ ＡＲ， Ｇｕｉｌｄ ＢＣ． Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９４；９１：９６９−９７３．
Ｒｏｓｓ Ｓ， Ｓｐｅｎｃｅｒ ＳＤ， Ｈｏｌｃｏｍｂ Ｉ ， Ｔａｎ Ｃ， Ｈｏｎｇｏ Ｊ， Ｄｅｖａｕｘ Ｂ， Ｒａｎｇｅｌｌ Ｌ， Ｋｅｌｌｅｒ ＧＡ， Ｓｃｈｏｗ Ｐ， Ｓｔｅｅｖｅｓ ＲＭ， Ｌｕｔｚ ＲＪ， Ｆｒａｎｔｚ Ｇ， Ｈｉｌｌａｎ Ｋ， Ｐｅａｌｅ Ｆ， Ｔｏｂｉｎ Ｐ， Ｅｂｅｒｈａｒｄ Ｄ， Ｒｕｂｉｎ ＭＡ， Ｌａｓｋｙ ＬＡ， Ｋｏｅｐｐｅｎ Ｈ． Ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ａｓ ｔｈｅｒａｐｙ ｔａｒｇｅｔ： ｔｉｓｓｕｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａｎ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００２ Ｍａｙ １；６２（９）：２５４６−５３．
Ｒｏｓｓ ＪＳ， Ｇｒａｙ Ｋ， Ｇｒａｙ Ｇ， Ｗｏｒｌａｎｄ ＰＪ， Ｒｏｌｆｅ Ｍ． Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈ． （４／１７／２００３）．
Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ ＲＤ， Ｌａｌｏｒ Ｐ， Ｂｅｒｎｆｉｅｌｄ Ｍ． Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓ ａｎｄ ｌｏｓｅ ｓｙｎｄｅｃａｎ ａｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｔａｇｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｕｌ． １９８９；１：２７−３５．
Ｓａｎｄｈｕ ＪＳ， Ｃｌａｒｋ ＢＲ， Ｂｏｙｎｔｏｎ ＥＬ， Ａｔｋｉｎｓ Ｈ， Ｍｅｓｓｎｅｒ Ｈ， Ｋｅａｔｉｎｇ Ａ， Ｈｏｚｕｍｉ Ｎ． Ｈｕｍａｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ｉｎ ＳＣＩＤ ｍｉｃｅ ｉｍｐｌａｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ａｄｕｌｔ ｃａｎｃｅｌｌｏｕｓ ｂｏｎｅ． Ｂｌｏｏｄ． １９９６；８８：１９７３−１９８２．
Ｓａｓａｋｉ Ａ， Ｂｏｙｃｅ ＢＦ， Ｓｔｏｒｙ Ｂ， Ｗｒｉｇｈｔ ＫＲ， Ｃｈａｐｍａｎ Ｍ， Ｂｏｙｃｅ Ｒ， Ｍｕｎｄｙ ＧＲ， Ｙｏｎｅｄａ Ｔ． Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ ｒｉｓｅｄｒｏｎａｔｅ ｒｅｄｕｃｅｓ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｂｕｒｄｅｎ ｉｎ ｂｏｎｅ ｉｎ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９５；５５：３５５１−３５５７．
Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｕ， ｖａｎ Ｌｅｓｓｅｎ Ａ， Ｈｕｈｎ Ｄ， Ｓｅｒｋｅ Ｓ． Ｔｗｏ ｓｕｂｓｅｔｓ ｏｆ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌｓ ｄｅｆｉｎｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＤ４５ ａｎｔｉｇｅｎ． Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ． １９９７；９７：５６−６４．
Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ Ｊ， Ｖａｎ Ｒｅｅ Ｒ ， Ｇ． Ｊ． Ｐｅｒｄｏｋ ＧＪ ， Ｖａｎ Ｄｏｏｒｎ ＨＲ ， Ｔａｎ ＫＹ， Ａａｌｂｅｒｓｅ ＲＣ， Ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ４ ｉｓ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ： ｉｔ ｈａｓ ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ−ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｓｉｔｅｓ， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９９； ９７：６９３−６９８．
Ｓｅｂｅｓｔｙｅｎ Ａ， Ｂｅｒｃｚｉ Ｌ， Ｍｉｈａｌｉｋ Ｒ， Ｐａｋｕ Ｓ， Ｍａｔｏｌｃｓｙ Ａ， Ｋｏｐｐｅｒ Ｌ． Ｓｙｎｄｅｃａｎ−１ （ＣＤ１３８） ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ． Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ． １９９９； １０４（２）：４１２−９．
Ｓｅｆｔａｌｉｏｇｌｕ Ａ， Ｋａｒａｋｕｓ Ｓ． Ｓｙｎｄｅｃａｎ−１／ＣＤ１３８ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｍｙｅｌｏｉｄ， ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ａｎｄ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ． Ａｃｔａ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． ２００３；１０５：２１３−２２１．
Ｓｅｆｔａｌｉｏｇｌｕ Ａ， Ｋａｒａｋｕｓ Ｓ， Ｄｕｎｄａｒ Ｓ， Ｃａｎ Ｂ， Ｅｒｄｅｍｌｉ Ｅ， Ｉｒｍａｋ ＭＫ， Ｏｚｔａｓ Ｅ， Ｋｏｒｋｍａｚ Ｃ， Ｙａｚａｒ Ｆ， Ｃａｖｕｓｏｇｌｕ Ｉ． Ｓｙｎｄｅｃａｎ−１ （ＣＤ１３８） ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ−−ａｎ ｉｍｍｕｎｏ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ｓｔｕｄｙ． Ａｃｔａ Ｏｎｃｏｌ． ２００３；４２：７１−７４．
Ｓｅｎｔｅｒ ＰＤ， Ｄｏｒｏｎｉｎａ Ｓ， Ｃｅｒｖｅｎｙ Ｃ， Ｃｈａｃｅ Ｄ， Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ Ｊ， Ｋｌｕｓｓｍａｎ Ｋ， Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ Ｂ， Ｍｅｙｅｒ Ｄ， Ｓｉｅｇａｌｌ ＣＢ， Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｊ ｅｔ ａｌ． （２００２）． Ｃｕｒｅｓ ａｎｄ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｕｍｏｒｓ ｗｉｔｈ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ． Ａｂｓｔｒａｃｔ ＃２０６２， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． （Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ： Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）， ４１４．
Ｓｈｉｅｌｄｓ ＲＬ， Ｎａｍｅｎｕｋ ＡＫ， Ｈｏｎｇ Ｋ， Ｍｅｎｇ ＹＧ， Ｒａｅ Ｊ， Ｂｒｉｇｇｓ Ｊ， Ｘｉｅ Ｄ， Ｌａｉ Ｊ， Ｓｔａｄｌｅｎ Ａ， Ｌｉ Ｂ， Ｆｏｘ ＪＡ， Ｐｒｅｓｔａ ＬＧ．． Ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｎ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ｆｏｒ Ｆｃ ｇａｍｍａ ＲＩ， Ｆｃ ｇａｍｍａ ＲＩＩ， Ｆｃ ｇａｍｍａ ＲＩＩＩ， ａｎｄ ＦｃＲｎ ａｎｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ＩｇＧ１ ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ Ｆｃ ｇａｍｍａ Ｒ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２００１； ２７６（９）：６５９１−６０４．
Ｓｉｅｖｅｒｓ ＥＬ， Ｌａｒｓｏｎ Ｒ．Ａ．， Ｓｔａｄｔｍａｕｅｒ， Ｅ．Ａ．， Ｅｓｔｅｙ， Ｅ．， Ｌｏｗｅｎｂｅｒｇ， Ｂ．， Ｄｏｍｂｒｅｔ， Ｈ．， Ｋａｒａｎｅｓ， Ｃ．， Ｔｈｅｏｂａｌｄ， Ｍ．， Ｂｅｎｎｅｔｔ， Ｊ．Ｍ．， Ｓｈｅｒｍａｎ， Ｍ．Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＣＤ３３−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎ ｆｉｒｓｔ ｒｅｌａｐｓｅ． ２００１． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １９， ｐｐ． ３２４４−３２５４．
Ｓｉｅｖｅｒｓ ＥＬ ａｎｄ Ｌｉｎｅｎｂｅｒｇｅｒ Ｍ． Ｍｙｌｏｔａｒｇ： ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｃｏｍｅｓ ｏｆ ａｇｅ． ２００１． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １３， ｐｐ． ５２２−５２７．
Ｓｍｉｔｈ Ｒ．， Ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ；ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ 〜ｓｍｉｔｈｒ／ｓｃｉｅｎｃｅ／ｓｃｆｖ．ｈｔｍｌ（ｌａｓｔ ｕｐｄａｔｅｄ ｏｎ Ｍａｙ， ２００１）．
Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ＧＭ， Ｓｏａｒｅｓ Ｓ， Ｂｅｔｔｅｒ Ｍ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＲＥ， Ｎａｄｅｌｌ Ｒ， Ｈｏｒｗｉｔｚ ＡＨ． Ｈｕｍａｎ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｒｅｔａｉｎ ｆｕｌｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ ｎｏｎ−ＣＤＲ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｒｅｓｉｄｕｅｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １９９４： ７（６）： ８０５−８１４．
Ｔａｓｓｏｎｅ Ｐ， Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒ ＶＳ， Ｎｅｒｉ Ｐ， Ｇｏｚｚｉｎｉ Ａ， Ｓｈａｍｍａｓ ＭＡ， Ｗｈｉｔｅｍａｎ ＫＡ， Ｈｙｌａｎｄｅｒ−Ｇａｎｓ ＬＬ， Ｃａｒｒａｓｃｏ ＤＲ， Ｈｉｄｅｓｈｉｍａ Ｔ， Ｓｈｒｉｎｇａｒｐｕｒｅ Ｒ， Ｓｈｉ Ｊ， Ａｌｌａｍ ＣＫ， Ｗｉｊｄｅｎｅｓ Ｊ， Ｖｅｎｕｔａ Ｓ， Ｍｕｎｓｈｉ ＮＣ， Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＫＣ， Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｂ−Ｂ４−ＤＭ１ ａｇａｉｎｓｔ ＣＤ１３８＋ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ， Ｂｌｏｏｄ， ２００４， １０４ （１２）， ｐｐ． ３６８８−３６９６．
Ｔｏｌｃｈｅｒ ＡＷ， Ｏｃｈｏａ Ｌ， Ｈａｍｍｏｎｄ ＬＡ， Ｐａｔｎａｉｋ Ａ， Ｅｄｗａｒｄｓ Ｔ， Ｔａｋｉｍｏｔｏ Ｃ， Ｓｍｉｔｈ Ｌ， ｄｅ Ｂｏｎｏ Ｊ， Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｇ， Ｍａｙｓ Ｔ， Ｊｏｎａｋ ＺＬ， Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｒ， ＤｅＷｉｔｔｅ Ｍ， Ｍａｒｔｉｎｏ Ｈ， Ａｕｄｅｔｔｅ Ｃ， Ｍａｅｓ Ｋ， Ｃｈａｒｉ ＲＶ， Ｌａｍｂｅｒｔ ＪＭ， Ｒｏｗｉｎｓｋｙ ＥＫ． Ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ， ａ ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ＣａｎＡｇ ａｎｔｉｇｅｎ： ａ ｐｈａｓｅ Ｉ， ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ， ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ． ２００３；２１：２１１−２２２．
Ｕｒａｓｈｉｍａ Ｍ， Ｃｈｅｎ ＢＰ， Ｃｈｅｎ Ｓ， Ｐｉｎｋｕｓ ＧＳ， Ｂｒｏｎｓｏｎ ＲＴ， Ｄｅｄｅｒａ ＤＡ， Ｈｏｓｈｉ Ｙ， Ｔｅｏｈ Ｇ， Ｏｇａｔａ Ａ， Ｔｒｅｏｎ ＳＰ， Ｃｈａｕｈａｎ Ｄ， Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＫＣ． Ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｏｍｉｎｇ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ． Ｂｌｏｏｄ． １９９７；９０：７５４−７６５．
Ｖｏｇｅｌ ＣＷ． Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｍｏｉｅｔｉｅｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ． ２００４；２８３：０８７−１０８．
Ｖｏｏｉｊｓ ＷＣ， Ｐｏｓｔ Ｊ， Ｗｉｊｄｅｎｅｓ Ｊ， Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ ＨＪ， Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ Ａ， Ｐｏｌｉｔｏ Ｌ， Ｓｔｉｒｐｅ Ｆ， Ｂａｓｔ ＥＪ， ｄｅ Ｇａｓｔ ＧＣ． Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｐｌａｓｍａ−ｃｅｌｌ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｂ−Ｂ２ ａｎｄ Ｂ−Ｂ４ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． １９９６；４２：３１９−３２８．
Ｗａｒｄ， Ｅ．Ｓ．， Ｄ． Ｇｕｓｓｏｗ， Ａ．Ｄ． Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ， Ｐ．Ｔ． Ｊｏｎｅｓ， ａｎｄ Ｇ． Ｗｉｎｔｅｒ． Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｎａｔｕｒｅ． １９８９． ３４１：５４４−５４６．
Ｗａｒｇａｌｌａ ＵＣ， Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ＲＡ． Ｒａｔｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． １９８９；８６：５１４６−５１５０．
Ｗｉｊｄｅｎｅｓ Ｊ， Ｖｏｏｉｊｓ ＷＣ， Ｃｌｅｍｅｎｔ Ｃ， Ｐｏｓｔ Ｊ， Ｍｏｒａｒｄ Ｆ， Ｖｉｔａ Ｎ， Ｌａｕｒｅｎｔ Ｐ， Ｓｕｎ ＲＸ， Ｋｌｅｉｎ Ｂ， Ｄｏｒｅ ＪＭ． Ａ ｐｌａｓｍｏｃｙｔｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ （Ｂ−Ｂ４） ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ ｓｙｎｄｅｃａｎ−１． Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ． １９９６；９４：３１８−３２３．
Ｗｉｊｄｅｎｅｓ Ｊ， Ｄｏｒｅ ＪＭ， Ｃｌｅｍｅｎｔ Ｃ， Ｖｅｒｍｏｔ−Ｄｅｓｒｏｃｈｅｓ Ｃ． ＣＤ１３８， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ Ｈｏｍｅｏｓｔ Ａｇｅｎｔｓ． ２００２ Ａｐｒ−Ｊｕｎ；１６（２）：１５２−５．
Ｗｉｔｚｉｇ ＴＥ， Ｋｉｍｌｉｎｇｅｒ ＴＫ， Ａｈｍａｎｎ ＧＪ， Ｋａｔｚｍａｎｎ ＪＡ， Ｇｒｅｉｐｐ ＰＲ． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ． Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ． １９９６；２６：１１３−１２０．
Ｘｉｅ Ｈ， Ａｕｄｅｔｔｅ Ｃ， Ｈｏｆｆｅｅ Ｍ， Ｌａｍｂｅｒｔ ＪＭ， Ｂｌａｅｔｔｌｅｒ Ｗ． Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ， ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ （ｈｕＣ２４２−ＤＭ１）， ａｎｄ ｉｔｓ ｔｗｏ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ． ２００４ Ｍａｒ；３０８（３）：１０７３−８２．
Ｙａｎｇ Ｍ， Ｊｉａｎｇ Ｐ， Ａｎ Ｚ， Ｂａｒａｎｏｖ Ｅ， Ｌｉ Ｌ， Ｈａｓｅｇａｗａ Ｓ， Ａｌ−Ｔｕｗａｉｊｒｉ Ｍ， Ｃｈｉｓｈｉｍａ Ｔ， Ｓｈｉｍａｄａ Ｈ， Ｍｏｏｓｓａ ＡＲ， Ｈｏｆｆｍａｎ ＲＭ． Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｍｅｌａｎｏｍａ ｂｏｎｅ ａｎｄ ｏｒｇａｎ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｍｏｄｅｌｓ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９９；５：３５４９−３５５９．
Ｙａｎｇ Ｍ， Ｂａｒａｎｏｖ Ｅ， Ｊｉａｎｇ Ｐ， Ｓｕｎ ＦＸ， Ｌｉ ＸＭ， Ｌｉ Ｌ， Ｈａｓｅｇａｗａ Ｓ， Ｂｏｕｖｅｔ Ｍ， Ａｌ−Ｔｕｗａｉｊｒｉ Ｍ， Ｃｈｉｓｈｉｍａ Ｔ， Ｓｈｉｍａｄａ Ｈ， Ｍｏｏｓｓａ ＡＲ， Ｐｅｎｍａｎ Ｓ， Ｈｏｆｆｍａｎ ＲＭ． Ｗｈｏｌｅ−ｂｏｄｙ ｏｐｔｉｃａｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｕｍｏｒｓ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２０００；９７：１２０６−１２１１．
Ｙａｎｇ Ｙ， ＭａｃＬｅｏｄ Ｖ， Ｄａｉ Ｙ， Ｋｈｏｔｓｋａｙａ−Ｓａｍｐｌｅ Ｙ， Ｓｈｒｉｖｅｒ Ｚ， Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ Ｇ， Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ Ｒ， Ｎａｇｇｉ Ａ， Ｔｏｒｒｉ Ｇ， Ｃａｓｕ Ｂ， Ｖｌｏｄａｖｓｋｙ Ｉ， Ｓｕｖａ ＬＪ， Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｊ， Ｙａｃｃｏｂｙ Ｓ， Ｓｈａｕｇｈｎｅｓｓｙ ＪＤ Ｊｒ， Ｂａｒｌｏｇｉｅ Ｂ， Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ ＲＤ． Ｔｈｅ ｓｙｎｄｅｃａｎ−１ ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ｉｓ ａ ｖｉａｂｌｅ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｍｙｅｌｏｍａ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｌｏｏｄ． ２００７ Ｓｅｐ １５；１１０（６）：２０４１−８． Ｅｐｕｂ ２００７ Ｍａｙ ２９．
Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ Ｓ， Ｙａｍａｄａ Ｙ， Ｉｓｈｉｋａｗａ Ｅ， Ｍａｓｓｅｙｅｆｆ Ｒ． Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ａｎｄ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ ｏｆ Ｎ−（４−ｃａｒｂｏｘｙｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｍｅｔｈｙｌ）−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ． Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９７９；１０１：３９５−３９９．
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国特許仮出願第６１／０１６，６３０号明細書（２００７年１２月２６日出願）の利益を主張し、これらの全体を参照することにより本願に援用する。
【０００２】
本発明は、抗原ＣＤ１３８に対する改善された標的剤、該標的剤を含む組成物、及びこれらを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＣＤ１３８は、細胞外マトリックスの受容体として作用するものであり、多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞で高発現し、ＭＭ細胞の発生及び増殖の少なくともいずれかに影響を与えることが示されている。ＣＤ１３８はまた、数例を挙げると、卵巣癌腫細胞、腎臓癌腫細胞、胆嚢癌腫細胞、乳癌腫細胞、前立腺癌細胞、肺癌細胞、結腸癌腫細胞、ホジキンリンパ腫細胞、及び非ホジキンリンパ腫細胞細胞、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）細胞でも発現する。
【０００４】
本発明を説明するために、特に実施に関連する更なる詳細情報を提供するために、本明細書で用いられる特許文献などの刊行物及びその他の資料は、参照することにより援用される。便宜上、これらの刊行物については、その著者と発行年度を以下の本文中に記載するか、或いは添付の参考文献に著者名のアルファベット順に従って列挙する。
【０００５】
非特許文献１は、ＭＭ細胞の表面に発現するＣＤ１３８抗原に対する、マウスＩｇＧ１抗体Ｂ−Ｂ４の優れた結合性について報告している。非特許文献１はまた、エフェクタ分子としてマイタンシノイドＤＭ１を含む免疫複合体Ｂ−Ｂ４−ＤＭ１の、多発性骨髄腫細胞に対する細胞傷害活性が高いことについても報告している（特許文献１も参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００７／０１８３９７１号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｔａｓｓｏｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ，２００４，１０４（１２），ｐｐ．３６８８−３６９６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
Ｂ−Ｂ４に関連する、ある性質及び機能の少なくともいずれかを欠くＢ−Ｂ４に基づく標的剤、具体的には標的抗体に対する要求が依然として存する。かかる標的抗体は、１以上のヒト抗体の抗体領域を含んでいてもよい。特に、Ｂ−Ｂ４と同程度に有効にＣＤ１３８に結合するが、重篤な副作用を伴うことなくヒトに投与することができる、Ｂ−Ｂ４に基づくキメラ抗体に対する要求が存する。また、Ｂ−Ｂ４の結合親和性を超える結合親和性を有する標的剤に対する要求も依然として存する。また、そのマウスの相当物に比べて１以上の有利な性質を示す、Ｂ−Ｂ４に基づく該標的剤に対する要求も存する。これらの性質としては、特にＣＤ１３８発現腫瘍細胞とそれに付属する細胞を含む腫瘍細胞に対する抗原結合性の改善、及びより均一な結合性などが挙げられる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ＣＤ１３８に均一に結合させる方法であって、
ＣＤ１３８に対する非ヒト抗体の抗原結合領域と、
少なくとも一部がヒト抗体のものである、更なる抗体領域と、
を含む、改変された標的抗体を提供する工程と、
前記改変された標的抗体をＣＤ１３８発現細胞に接種する工程と、
を含み、
前記改変された標的抗体が、前記ＣＤ１３８発現細胞上で発現しているＣＤ１３８に均一に結合する方法に関する。
【００１０】
本発明はまた、免疫グロブリン重鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、前記免疫グロブリン重鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列が、配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、及び少なくとも９８％のいずれかの配列同一性を有し、前記免疫グロブリン重鎖及びその一部のいずれかを含む標的剤が、ＣＤ１３８を標的とする、単離ポリペプチドに関する。
【００１１】
免疫グロブリン重鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の残基３１〜３５、残基５１〜６８、及び残基９９〜１１１と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有していてもよく、標的剤は、改変された標的抗体であってもよい。
【００１２】
免疫グロブリン重鎖及びその一部のいずれかの定常領域は、ＩｇＧ４アイソタイプ定常領域であってもよい。
【００１３】
標的剤は、マウスヒトキメラ抗体であってもよい。
【００１４】
標的剤及び改変された標的抗体のいずれかは、ヒト化抗体であってもよい。
【００１５】
単離ポリペプチドは更に、免疫グロブリン軽鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列を更に含んでもよく、前記免疫グロブリン軽鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、及び少なくとも９８％のいずれかの配列同一性を有していてもよい。
【００１６】
単離ポリペプチドは更に、免疫グロブリン軽鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列を更に含んでいてもよく、前記免疫グロブリン軽鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列の残基２４〜３４、残基５０〜５６、及び残基８９〜９７と、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、及び少なくとも９７％のいずれかの配列同一性を有する。
【００１７】
免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一であってもよい。
【００１８】
免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一であってもよい。
【００１９】
本発明はまた、
ＣＤ１３８に対する非ヒト抗体の抗原結合領域と、
少なくとも一部がヒト抗体のものである、更なる抗体領域と、
を含み、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくともいずれかであるＣＤ１３８を認識する改変された標的抗体に関する、
（ａ）前記非ヒト抗体のＣＤ１３８に対する結合親和性を超える結合親和性でＣＤ１３８に結合する抗体、
（ｂ）ＣＤ１３８発現細胞のＣＤ１３８に均一に結合する抗体。
【００２０】
更なる抗体領域は、ヒト抗体の重鎖定常領域及びその一部のいずれかを含む、少なくとも１つの定常領域であってもよく、ここで改変された標的抗体はＩｇＧ４アイソタイプのものである。
【００２１】
改変された標的抗体は、キメラ抗体であってもよく、非ヒト抗体は、Ｂ−Ｂ４であってもよい。
【００２２】
改変された標的抗体は、ヒト化抗体であってもよく、非ヒト抗体は、Ｂ−Ｂ４であってもよい。
【００２３】
重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、及び少なくとも９８％のいずれかの配列同一性を有していてもよい。
【００２４】
改変された標的抗体は、少なくとも１本の軽鎖であって、そのアミノ酸配列が配列番号２で表されるアミノ酸配列と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、及び少なくとも９８％のいずれかの配列同一性を有する軽鎖を含んでいてもよい。
【００２５】
重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の残基３１〜３５、残基５１〜６８、及び残基９９〜１１１の少なくともいずれかと、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、及び１００％のいずれかの割合の配列同一性を有していてもよい。重鎖のアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列の残基２４〜３４、残基５０〜５６、及び残基８９〜９７の少なくともいずれかと、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、及び１００％のいずれかの配列同一性を有していてもよい。
【００２６】
更なる抗体領域は、
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１２３〜４４８、及び
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１０８〜２１４、の少なくともいずれかと、
以下の少なくともいずれかの突然変異とを含んでいてもよい、
改変された標的抗体の抗体依存性細胞傷害性及び補体依存性細胞傷害性の少なくともいずれかを、維持させる或いは低下させる突然変異、
改変された標的抗体を安定化させる突然変異。
【００２７】
更なる抗体領域は、ヒト抗体の定常重鎖領域であってもよい。
【００２８】
改変された標的抗体は、１５０％、１４０％、１３０％、１２０％、１１０％、１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、及び５０％のいずれか未満のターゲティング変動で、ＣＤ１３８に結合することができる。
【００２９】
重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、及び少なくとも９８％のいずれかの配列同一性を有していてもよい。
【００３０】
改変された標的抗体は、少なくとも１本の軽鎖であって、そのアミノ酸配列が配列番号２で表されるアミノ酸配列と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、及び少なくとも９８％のいずれかの配列同一性を有する軽鎖を含んでいてもよい。
【００３１】
重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の残基３１〜３５、残基５１〜６８、及び残基９９〜１１１と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、及び少なくとも９５％のいずれかの配列同一性を有していてもよい。
【００３２】
重鎖のアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列の残基２４〜３４、残基５０〜５６、及び残基８９〜９７と、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、及び少なくとも９７％のいずれかの配列同一性を有していてもよい。
【００３３】
本発明はまた、改変された標的抗体と、薬学的に許容される担体と、を含む、或いは本質的にこれらから成る、医薬組成物に関する。
【００３４】
改変された標的抗体を産生するハイブリドーマもまた、本発明の一部である。
【００３５】
本発明はまた、改変された標的抗体を含む、抗体に基づくアッセイを含む。
【００３６】
本発明は、医薬品で使用するための、本明細書に記載する改変された標的抗体を提供する。具体的には、改変された標的抗体は、
ＣＤ１３８に対する非ヒト抗体の抗原結合領域と、
少なくとも一部がヒト抗体のものである、更なる抗体領域と、
を含む。
【００３７】
より具体的には、改変された標的抗体は、腫瘍細胞を標的とする治療で用いるためのものである。
【００３８】
本発明はまた、腫瘍細胞を標的とする薬品の製造における、本明細書に記載する改変された標的抗体の使用を提供する。具体的には、改変された標的抗体は、
ＣＤ１３８に対する非ヒト抗体の抗原結合領域と、
少なくとも一部がヒト抗体のものである、更なる抗体領域と、
を含む。
【００３９】
より具体的には、本発明のこれらの医学的使用では、改変された標的抗体は、ＣＤ１３８発現細胞を有する個体に投与されるものである。更に、改変された標的抗体は、ＣＤ１３８発現細胞上で発現しているＣＤ１３８に均一に結合することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、結合したエフェクタ分子を有するｎＢＴ０６２の模式図を提供する。
【図２】図２は、ＢＴ０６２の化学式である。
【図３】図３は、アンサマイトシンＰ−３のマイタンシノールへの変換を示す（立体化学は単純化するために省略する）。
【図４】図４は、代表的なＤＭ４の合成スキームを示す。
【図５】図５は、（ｎＢＴ０６２のＤＭ４への）抗体複合体化の概略図を示す。
【図６】図６は、ｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、ｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１、ｎＢＴ０６２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、及びｎＢＴ０６２抗体のＯＰＭ−２細胞への結合の分析を示す。様々な濃度のｎＢＴ０６２及び複合体を細胞に与え、ＦＡＣＳ分析によって平均蛍光を測定した。
【図７Ａ】図７Ａは、ＭＯＬＰ−８（ＣＤ１３８＋）及びＢＪＡＢ（ＣＤ１３８−）に対するｎＢＴ０６２−ＤＭｘ複合体のインビトロ細胞傷害性を表す。細胞を平底プレートで培養し、指示した濃度の免疫複合体とともに５日間インキュベートした。ＷＳＴ試薬を更に３時間添加して、細胞生存性を評価した。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＭＯＬＰ−８（ＣＤ１３８＋）及びＢＪＡＢ（ＣＤ１３８−）に対するｎＢＴ０６２−ＤＭｘ複合体のインビトロ細胞傷害性を表す。細胞を平底プレートで培養し、指示した濃度の免疫複合体とともに５日間インキュベートした。ＷＳＴ試薬を更に３時間添加して、細胞生存性を評価した。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ＭＯＬＰ−８（ＣＤ１３８＋）及びＢＪＡＢ（ＣＤ１３８−）に対するｎＢＴ０６２−ＤＭｘ複合体のインビトロ細胞傷害性を表す。細胞を平底プレートで培養し、指示した濃度の免疫複合体とともに５日間インキュベートした。ＷＳＴ試薬を更に３時間添加して、細胞生存性を評価した。
【図７Ｄ】図７Ｄは、ｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の細胞傷害活性を、遮断抗体（１μＭのｎＢＴ０６２）の存在下及び非存在下のいずれかで分析した。
【図８Ａ】図８Ａは、ＭＯＬＰ−８腫瘍細胞に接種した後の、経時的な（日）、ＰＢＳで処理した個々のマウスの腫瘍体積を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＭＯＬＰ−８腫瘍細胞に接種した後の、経時的な（日）、ｎＢＴ０６２抗体で処理した個々のマウスの腫瘍体積を示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、ＭＯＬＰ−８腫瘍細胞に接種した後の、経時的な（日）、遊離ＤＭ４で処理した個々のマウスの腫瘍体積を示す。
【図８Ｄ】図８Ｄは、ＭＯＬＰ−８腫瘍細胞に接種した後の、経時的な（日）、非標的複合体ｈｕＣ２４２−ＤＭ４で処理した個々のマウスの腫瘍体積を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、ＭＯＬＰ−８腫瘍細胞に接種した後の、経時的な（日）、ＰＢＳで処理した個々のマウスの腫瘍体積を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＭＯＬＰ−８腫瘍細胞に接種した後の、経時的な（日）、ｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４で処理した個々のマウスの腫瘍体積を示す。
【図９Ｃ】図９Ｃは、ＭＯＬＰ−８腫瘍細胞に接種した後の、経時的な（日）、Ｂ−Ｂ４−ＳＰＰ−ＤＭ１で処理した個々のマウスの腫瘍体積を示す。
【図９Ｄ】図９Ｄは、ＭＯＬＰ−８腫瘍細胞に接種した後の、経時的な（日）、ｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１で処理した個々のマウスの腫瘍体積を示す。
【図１０】図１０は、接種後の、経時的な（日）、ＣＢ．１７ ＳＣＩＤマウスにおけるＭＯＬＰ−８ヒト多発性骨髄腫異種移植片の平均腫瘍体積（＋／−ＳＤ）を表す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ＳＣＩＤマウスの嵩高いＭＯＬＰ−８腫瘍モデルにおける、ＣＤ１３８＋ＭＯＬＰ−８腫瘍細胞に対するｎＢＴ０６２−ＤＭｘの抗腫瘍活性を示す。各群について、腫瘍体積を平均（＋／−ＳＤ）で示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ＳＣＩＤマウスの嵩高いＭＯＬＰ−８腫瘍モデルにおける、ＣＤ１３８＋ＭＯＬＰ−８腫瘍細胞に対するｎＢＴ０６２−ＤＭｘの抗腫瘍活性を示す。各群について、腫瘍体積を平均（＋／−ＳＤ）で示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明は、標的剤、具体的にはＣＤ１３８標的抗体、より具体的には、改変されたＣＤ１３８標的抗体に関する。該標的剤を含む免疫複合体により、エフェクタ分子（１及び複数のいずれか）の標的部位への送達と、標的細胞、標的組織、及び標的器官とそれらの近傍のいずれかにおけるエフェクタ分子（１及び複数のいずれか）の部位特異的放出とが可能になる。エフェクタ分子は、標的部位において、免疫複合体の標的剤部分から切断／解離されることにより活性化される。
【００４２】
本発明に係る抗体及びそれを含む免疫複合体の少なくともいずれかは、治療を必要としている被験体に投与してもよく、治療を必要とする被験体から単離した細胞に投与してもよい。エフェクタ分子（１及び複数のいずれか）は、標的細胞、標的組織、及び標的器官とそれらの近傍で切断／解離されて免疫複合体から放出され得る。
【００４３】
１例として、抗体ｎＢＴ０６２を呈色（ｃｈｒｏｍｏｇｒａｐｈｉｃ）アッセイで使用する。患者の、ホルマリンで固定したパラフィン包埋組織を提供する。抗体ｎＢＴ０６２を、一次抗体として添加すると、組織の表面で発現しているＣＤ１３８が抗体に結合する。検出抗体を添加して、ｎＢＴ０６２に結合させる。最終行程では、色素原を含む検出抗体と、ｎＢＴ０６２との結合を測定する。抗体ｎＢＴ０６２を用いて、造血細胞の中からヒト形質細胞を同定し、それにより種々の造血器腫瘍の診断を可能にする。方法はまた、特定の癌腫の進行を追うことを可能にする。Ｆｃ受容体との交差反応性の低下に起因して、マウス相当物とは対照的に、ｎＢＴ０６２を使用すると、非特異的検出の減少が観察される。
【００４４】
第２の例として、ｎＢＴ０６２抗体と、抗体ｎＢＴ０６２、並びにエフェクタ分子としての少なくとも１種の細胞傷害性の高い薬物及び免疫毒素のいずれかを含む免疫複合体とを提供し、癌患者に投与する。この例では、有効量のｎＢＴ０６２は、後に患者に静脈内投与して癌細胞に濃縮させる、治療に有効な量の免疫複合体から、ＣＤ１３８発現非腫瘍細胞を保護する。エフェクタ分子（１及び複数のいずれか）は、外的手段により抗体から放出されて、癌細胞における細胞死及び連続細胞周期停止を誘導する。
【００４５】
ＣＤ１３８、即ちシンデカン−１（ＳＹＮＤ１、ＳＹＮＤＥＣＡＮ、ＳＤＣ、ＳＣＤ１、ＣＤ１３８抗原としても記載される、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号：Ｐ１８８２７ ｈｕｍａｎ）は、元来上皮起源の細胞上に存在すると記載されており、後に造血細胞で見出された（Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ，１９８９）膜糖タンパク質である。ＣＤ１３８は、ヘパラン硫酸鎖を通して、可溶性分子（例えば、増殖因子ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ）、及び不溶性分子（例えば、細胞外マトリックス成分であるコラーゲン及びフィブロネクチン）に結合する、長い細胞外ドメインを有し（Ｌａｎｇｆｏｒｄ，１９９８；Ｙａｎｇ，２００７）、細胞外マトリックスの受容体として作用する。ＣＤ１３８はまた、接着性細胞が発現するヘパリン結合分子を通して細胞間接着を媒介する。ＣＤ１３８は骨髄腫細胞の増殖因子の共受容体としての役割を有することが示されている（Ｂｉｓｐｉｎｇ，２００６）。形質細胞の分化に関する研究で、ＣＤ１３８を分化抗原としても考えなければならないことが示された（Ｂａｔａｉｌｌｅ，２００６）。
【００４６】
悪性造血では、ＣＤ１３８は、ＭＭ細胞、卵巣癌腫細胞、腎臓癌腫細胞、胆嚢癌腫細胞、乳癌腫細胞、前立腺癌細胞、肺癌細胞、結腸癌腫細胞、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫の細胞、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）の細胞（Ｈｏｒｖａｔｈｏｖａ，１９９５）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）の細胞、急性骨髄芽球性白血病（ＡＭＬ）の細胞（Ｓｅｆｔａｌｉｏｇｌｕ，２００３（ａ）；Ｓｅｆｔａｌｉｏｇｌｕ，２００３（ｂ））、固形組織肉腫細胞、結腸癌腫細胞、その他の造血器悪性腫瘍細胞、及びＣＤ１３８を発現する固形腫瘍細胞（Ｃａｒｂｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｓｅｂｅｓｔｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｃｈａｒｎａｕｘ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｏｒｏｓｚ ａｎｄ Ｋｏｐｐｅｒ，２００１）の大部分で高度に発現する。
【００４７】
ＣＤ１３８発現陽性であることが示されているその他の癌は、多くの卵巣腺癌、移行性細胞膀胱癌腫、腎臓明細胞癌腫、扁平上皮細胞肺癌腫；乳癌腫、及び子宮癌（例えば、Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｂａｒｂａｒｅｓｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｍｅｎｎｅｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ａｎｔｔｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｗｉｊｄｅｎｅｓ，２００２を参照）である。
【００４８】
正常なヒト造血コンパートメントでは、ＣＤ１３８発現は形質細胞に限定されており（Ｗｉｊｄｅｎｅｓ，１９９６；Ｃｈｉｌｏｓｉ，１９９９）、ＣＤ１３８は、末梢血リンパ球、単球、顆粒球、及び赤血球では発現しない。特に、ＣＤ３４＋幹細胞及びＣＤ３４＋前駆細胞は、ＣＤ１３８を発現せず、抗ＣＤ１３８ ｍＡｂは、造血幹細胞培養におけるコロニー形成単位の数に影響を与えない（Ｗｉｊｄｅｎｅｓ，１９９６）。非造血コンパートメントでは、ＣＤ１３８は、肺、肝臓、皮膚、腎臓、及び腸内の単純及び重層化上皮上で主に発現する。内皮細胞上では僅かな染色しか見られなかった（Ｂｅｒｎｆｉｅｌｄ，１９９２；Ｖｏｏｉｊｓ，１９９６）。ＣＤ１３８は、ヒトリンパ腫細胞において多様な形で存在することが報告されている（Ｇａｔｔｅｉ，１９９９）。
【００４９】
モノクローナル抗体Ｂ−Ｂ４、ＢＣ／Ｂ−Ｂ４、Ｂ−Ｂ２、ＤＬ−１０１、１ Ｄ４、ＭＩ１５、１．ＢＢ．２１０、２Ｑ１４８４、５Ｆ７、１０４−９、２８１−２、特にＢ−Ｂ４は、ＣＤ１３８に対して特異的であることが報告されている。これらのうちＢ−Ｂ４、１Ｄ４、及びＭＩ１５は、ＣＤ１３８のインタクトな分子とコアタンパク質の両方を認識し、同一或いは密接に関連するエピトープ、を認識することが示された（Ｇａｔｔｅｉ，１９９９）。これまでの研究では、Ｂ−Ｂ４は可溶性ＣＤ１３８を認識せず、膜に結合した形のＣＤ１３８のみを認識することが報告されている（Ｗｉｊｄｅｎｅｓ，２００２）。
【００５０】
Ｂ−Ｂ４（マウスＩｇＧ１ ｍＡｂ）は、ヒトシンデカン−１（ＣＤ１３８）上のコアタンパク質の残基９０〜９５の線状エピトープに結合する（Ｗｉｊｄｅｎｅｓ，１９９６；Ｄｏｒｅ，１９９８）。ＣＤ１３８の発現パターンに一致して、Ｂ−Ｂ４は、形質細胞株ＲＰＭＩ８２２６に強く反応するが、内皮細胞には反応しないことが示された。またＣＤ１３８の発現パターンに一致して、Ｂ−Ｂ４はまた、上皮細胞株Ａ４３１（ケラチノサイト由来）及びＨｅｐＧ２（肝細胞由来）と反応した。免疫毒素Ｂ−Ｂ４−サポリンはまた、形質細胞株ＲＰＭＩ８２２６に対する毒性が強く、実際に遊離サポリンより遥かに毒性が強かった。しかしながら、試験した２種の上皮細胞株から、Ｂ−Ｂ４−サポリンは、細胞株Ａ４３１に対してのみ毒性を示したが、クローン原性アッセイでは、Ｂ−Ｂ４サポリンは、Ａ４３１細胞の増殖に対して阻害効果を示さなかった（Ｖｏｏｉｊｓ，１９９６）。他の研究者が、ＭＭ−関連抗原が腫瘍に対して特異性を有しないことを報告した（Ｃｏｕｔｕｒｉｅｒ，１９９９）。
【００５１】
ある成分から「本質的に成る」抗体は、本発明の状況では、該抗体が、特定の成分と、抗体の基本的特徴に実質的に影響を与えない任意の追加的な物質及び成分のいずれかから成ることを意味する。
本発明において使用される用語「腫瘍細胞」は、固形腫瘍の一部を形成してもしなくてもよい癌細胞及び前癌性細胞を含む。
本発明に係る「標的剤」は、標的細胞により発現される分子に結合することができ、ペプチド及び非ペプチドを含む。具体的には、本発明に係る標的剤としては、標的抗体、及び非免疫グロブリン標的分子が挙げられる。これらの分子は、ＡＦＦＩＬＩＮ（登録商標）分子、ＡＮＴＩＣＡＬＩＮＳ（登録商標）、及びＡＦＦＩＢＯＤＩＥＳ（登録商標）などの非免疫グロブリンタンパク質に基づいたものであってもよいが、非免疫グロブリンタンパク質はこれらに限定されない。非免疫グロブリン標的分子はまた、標的ＤＮＡ及びＲＮＡオリゴヌクレオチド（アプタマー）等の非ペプチド標的分子も含むが、生理学的リガンド、特にＣＤ１３８等の、対象とする抗原のリガンドも含む。
【００５２】
本発明に係る「標的抗体」は、天然の抗体であるか、天然の抗体に基づく抗体であるか、合成的或いは遺伝子工学的に産生され、対象細胞（１及び複数のいずれか）（標的細胞（１及び複数のいずれか））上の抗原に結合する。本発明に係る標的抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片が挙げられる。標的抗体は、例えば、その標的細胞に対する親和性を改善する（Ｒｏｓｓ，２００３）、或いはその免疫原性を低下させるように改変してもよい。標的抗体は、エフェクタ分子を含むリポソーム製剤に結合することができる（Ｃａｒｔｅｒ，２００３）。抗体断片は、インタクトな抗体の一部、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合領域及び可変領域のいずれかを含む。本発明に係る抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片が挙げられるが、二重特異性抗体；ドメイン抗体（ｄＡｂ）（Ｗａｒｄ，１９８９；米国特許第６，００５，０７９号明細書）；線状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体も含む。単鎖可変断片抗体（ｓｃＦｖ）では、重鎖及び軽鎖（ＶＨ及びＶＬ）は、例えば、配列（グリシン４セリン）ｎを有する短いアミノ酸リンカーにより結合することができ、このリンカーは、２つのドメインが機能的抗原結合ポケットを構築することを可能にするのに十分な柔軟性を有する。種々のシグナル配列の付加により、標的抗体のより正確なターゲティングが可能になる場合がある。軽鎖定常領域（ＣＬ）の付加により、ジスルフィド結合を介した二量体化が可能になる場合があり、これによって安定性及び結合力が増す。ｓｃＦｖを構築するための可変領域は、対象とする標的に対するｍＡｂが利用可能である場合、親ハイブリドーマから抽出されたｍＲＮＡの可変領域をクローン化するＲＴ−ＰＣＲにより得ることができる。或いは、ｓｃＦｖは、ファージディスプレイ技術により新たに作製することができる（Ｓｍｉｔｈ，２００１）。本明細書で使用する用語「機能的断片」は、標的抗体について用いられる場合、該標的抗体の一部分であって、該抗体が特異的に結合する抗原に特異的に結合することができる一部分を意味することを意図する。本発明の二重特異性抗体は、例えば、標的組織に対して反応性を有する少なくとも１本の腕と、リンカー部分に対して反応性を有する１本の腕を有することができる（米国特許出願公開第２００２／０００６３７９号明細書）。本発明の二重特異性抗体はまた、標的細胞上の２種以上の抗原に結合することができる（Ｃａｒｔｅｒ，２００３）。本発明の抗体は、例えば、チオール基を導入するために、システイン残基を導入することにより修飾してもよい（Ｏｌａｆｓｅｎ，２００４）。
【００５３】
本発明に従って、標的抗体はいずれの源に由来してもよく、ラクダ抗体、マウス抗体、キメラヒト／マウス抗体、及びキメラヒト／サル抗体、特にｎＢＴ０６２のようなキメラヒト／マウス抗体のいずれであってもよいが、これらに限定されない。
【００５４】
ヒト化抗体は、ヒト抗体及び非ヒト抗体に由来する配列を含む抗体であり、これもまた本発明の範囲内である。抗体をヒト化するのに好適な方法としては、ＣＤＲグラフティング（相補性決定領域グラフティング）（欧州特許第０ ２３９ ４００号明細書；国際公開第９１／０９９６７号；米国特許第５，５３０，１０１号明細書；及び米国特許第５，５８５，０８９号明細書）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）及び再表面化（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第０ ５９２ １０６号明細書；欧州特許第０ ５１９ ５９６号明細書；Ｐａｄｌａｎ，１９９；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４）、鎖シャフリング（米国特許第５，５６５，３３２号明細書）のいずれか、並びにＤｅＩｍｍｕｎｏｓａｔｉｏｎ（商標）（Ｂｉｏｖａｔｉｏｎ，ＬＴＤ）が挙げられる。ＣＤＲグラフティングでは、例えば、ｍＡｂ Ｂ−Ｂ４由来のマウス相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ヒト可変フレームワークにグラフトし、次いでこれをヒト定常領域に結合させて、ヒトＢ−Ｂ４抗体（ｈＢ−Ｂ４）を作り出す。ＭＹＬＯＴＡＲＧ（Ｓｉｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００１）、及びＨＥＣＥＰＴＩＮ（Ｐｅｇｒａｍ ｅｔ ａｌ，１９９８）を含む、ＣＤＲグラフティングによりヒト化された幾つかの抗体が、現在臨床使用されている。
【００５５】
再表面化技術は、分子モデリング、統計解析、及び突然変異誘発の組み合わせを用いて、標的とするホストの既知の抗体の表面に類似するように、抗体可変領域の非ＣＤＲ表面を変化させる。抗体を再表面化するためのストラテジー及び方法、並びに異なるホスト内で抗体の免疫原性を低下させるための他の方法は、例えば、米国特許第５，６３９，６４１号明細書に開示されている。ヒト抗体は、ファージディスプレイ法を含む、当該技術分野において既知である種々の方法により作製することができる。また、米国特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号明細書、同第５，５４５，８０６号明細書、及び同第５，８１４，３１８号明細書；並びに国際公開第９８／４６６４５号、同第９８／５０４３３号、同第９８／２４８９３号、同第９８／１６６５４号、同第９６／３４０９６号、同第９６／３３７３５号、及び同第９１／１０７４１号を参照。
【００５６】
キメラヒト／マウス抗体或いはキメラヒト／サル抗体など、何らかの非天然修飾が施されている標的抗体、例えば、その標的細胞に対する親和性を改善する、或いはその免疫原性を低下させるよう改変されたヒト化抗体（１及び複数のいずれか）、また抗体断片、特に何らかの非天然修飾が施されている該標的抗体の機能的断片、ダイアボディ、ドメイン抗体、線状抗体、単鎖抗体分子、及び多重特異性抗体を、本明細書においては、改変された標的抗体と称する。
【００５７】
キメラ抗体は、その基となる非ヒト抗体、例えばマウス抗体の抗体結合領域（ＡＢＲ及びＦａｂ領域のいずれか）を保持しているが、定常領域は、例えばヒト抗体のものであってもよい。一般に、抗体のキメラ化及び抗体の定常領域の交換の少なくともいずれかは、抗原結合に寄与する抗体の領域がこの交換により影響を受けないため、抗体の親和性に影響を与えない。本発明の好ましい実施形態では、改変された、特にキメラ化された本発明の抗体は、その基となるそれぞれの非ヒト抗体よりも高い結合親和性（ＫＤ値により表される）を有することができる。特に、マウスＢ−Ｂ４に基づくｎＢＴ０６２抗体（１及び複数のいずれか）は、マウスＢ−Ｂ４よりも高い抗体親和性を有することができる。本発明の他の好ましい実施形態においては、改変された／キメラ化された抗体を含む免疫複合体もまた、このような高い抗体親和性を示す。これらの免疫複合体はまた、ある実施形態では、そのＢ−Ｂ４を含む相当物より腫瘍の減少量が多い等の、更なる有利な特性を示す場合がある。好ましい実施形態においては、改変された、特にキメラ化された標的抗体は、１．６未満、１．５未満、約１．４或いは１．４未満の解離定数ＫＤ（ｎＭ）によって特徴付けられる結合親和性を示し、一方そのマウス相当物は、約１．６及び１．６超のいずれか解離定数ＫＤ（ｎＭ）によって特徴付けられる。２．６未満、２．５未満、２．４未満、２．３未満、２．２未満、２．１未満、２．０未満、１．９未満、及び約１．９のいずれかの解離定数ＫＤ（ｎＭ）によって特徴付けられる、標的抗体のような標的剤を含む免疫複合体が好ましいが、マウスの相当物抗体を含む免疫複合体は、約２．６、及び２．６超のいずれかの解離定数ＫＤ（ｎＭ）によって特徴付けられる（表３、材料及び方法と比較）。
【００５８】
完全ヒト抗体を用いてもよい。これらの抗体は、ファージディスプレイアプローチにより選択することができ、この場合ＣＤ１３８及びその抗原決定基のいずれかが用いられて、例えばＢ−Ｂ４可変領域を発現しているファージに選択的に結合する（Ｋｒｅｂｓ，２００１を参照）。このアプローチを、親和性成熟技術と組み合わせることは有利であり、これにより抗体の親和性が向上する。本明細書で抗体と称されるものは全て、単離された抗体である。
【００５９】
１つの実施形態では、標的抗体は、コンジュゲートされていない形態であり、中程度に内在化される、或いは内在化が不十分である。中程度の内在化は、３７℃で３時間インキュベートした後の抗体の内在化の約３０％〜約７５％に相当し、不十分な内在化は、約０．０１％〜約３０％に相当する。他の好ましい実施形態では、標的抗体は、ＣＤ１３８、例えば、抗体Ｂ−Ｂ４、ＢＣ／Ｂ−Ｂ４、Ｂ−Ｂ２、ＤＬ−１０１、１ Ｄ４、ＭＩ１５、１．ＢＢ．２１０、２Ｑ１４８４、５Ｆ７、１０４−９、２８１−２、特にＢ−Ｂ４に結合する。ハイブリドーマ細胞（ＳＰ０２／０骨髄腫細胞をＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞とハイブリダイズさせることにより作製した）は、２００７年１２月１１日に、ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １，Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）に寄託されている。これらのＢ−Ｂ４発現ハイブリドーマ細胞の識別番号は、ＤＳＭ ＡＣＣ２８７４である。別の実施形態では、標的抗体は、細胞表面に発現していないＣＤ１３８に実質的に結合しない。本発明の状況では、「ｎＢＴ０６２標的抗体」のように、特定の抗体の名称を用語「標的抗体」と組み合わせたとき、これは、この標的抗体が抗体ｎＢＴ０６２の結合特異性を有することを意味する。標的抗体が、特定の抗体に「基づく」と言われる場合、これは、この標的抗体がこの抗体の結合特異性を有するが、標的抗体の上記記載に一致するいずれの形態をとってもよいことを意味する。本発明の状況では、「ＣＤ１３８標的抗体」のように、特定の抗原の名称を用語「標的抗体」と組み合わせたとき、これは、この標的抗体がＣＤ１３８に対する結合特異性を有することを意味する。本発明の状況では、標的抗体が、「細胞表面で発現するＣＤ１３８を選択的に標的とする」のように、「選択的に」何かをする、或いは何かに対して「選択的」であると言うとき、これは、与えられた例の場合、他のいずれかの抗原と比べて、細胞表面に発現するＣＤ１３８に対して有意な選択性が存在する（即ち、ＣＤ１３８陰性細胞に比べて、ＣＤ１３８陽性細胞に対する親和性が高い）ことを意味する。所定の環境における有害な副作用は、この選択性によって実質的に低減されるか、或いは回避されることさえもある。
【００６０】
本発明に係る「非免疫グロブリン標的分子」は、非免疫グロブリンタンパク質、及び非ペプチド性標的分子に由来する標的分子を含む。この定義に含まれる小さな非免疫グロブリンタンパク質は、特に表面に発現するＣＤ１３８に対して特異的親和性を有するよう設計される。これらの小さな非免疫グロブリンタンパク質としては、１０ｋＤａ〜２０ｋＤａ等の比較的低分子量のＡｆｆｉｌｉｎ（登録商標）分子等の、スカフォールドに基づく改変された分子を含む。適切なスカフォールドとしては、例えば、ガンマクリスタリンが挙げられる。これらの分子は、天然の状態では、標的分子に対する非特異的結合活性を有する。溶媒に曝露されたアミノ酸の局所的に定義されたランダム化を通して、タンパク質表面を改変することにより、全く新しい結合部位が作り出される。前者の非結合タンパク質は、それによって特異的結合タンパク質に変換される。このような分子は、ＣＤ１３８等の標的に結合し、１種以上のエフェクタ分子の特異的送達を可能にするよう、特別に設計することができる（ｗｗｗ．ｓｃｉｌｐｒｏｔｅｉｎｓ．ｃｏｍにおけるｓｃｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧｍｂＨ，２００４を参照）。別の種類の非免疫グロブリン標的分子は、リポカリンに由来し、例えば、若干免疫グロブリンの構造に類似している、ＡＮＴＩＣＡＬＩＮＳ（登録商標）が挙げられる。しかしながら、リポカリンは、１６０〜１８０アミノ酸残基を有する単一ポリペプチドから構成されている。リポカリンの結合ポケットは、高親和性及び特異性により対象分子を認識するよう再形成することができる（例えば、Ｂｅｓｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９を参照）。商標Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）（Ａｆｆｉｂｏｄｙ ＡＢ）として市販されているもの等の、人工細菌受容体もまた、本発明の範囲内である。これらの人工細菌受容体は、小さく単純なタンパク質であり、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインのうち１つのスカフォールドに基づいた、３つのヘリックスバンドルから構成されていてもよい（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）。これらの分子は、多くの免疫グロブリンに類似の結合特性を有するが、実質的に小さく（１０ｋＤａを超えない分子量を有することが多い）、また比較的安定である。好適な人工細胞受容体分子は、例えば、米国特許第５，８３１，０１２号明細書、同第６，５３４，６２８号明細書、及び同第６，７４０，７３４号明細書に記載されている。
【００６１】
本発明に係る「エフェクタ分子」は、標的剤、特に標的抗体及び改変された標的抗体の少なくともいずれかに結合し、例えば、標的細胞（１及び複数のいずれか）にアポトーシス、別の種類のいずれかの細胞死及び連続細胞周期停止のいずれか等の所望の効果を及ぼす分子及び誘導体のいずれか、並びにその類似体のいずれかである。本発明に係るエフェクタ分子は、標的細胞に所望の効果を及ぼすことができる分子を含み、毒素、薬物、特に低分子量細胞傷害性薬物、放射性核種、生物反応調節剤、ポア形成剤、リボヌクレアーゼ、アポトーシス誘導活性を有するアポトーシス性シグナル伝達カスケードのタンパク質、細胞傷害性酵素、プロドラッグ活性化酵素、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体及びサイトカインのいずれか、並びにその機能的誘導体と、類似体／断片との少なくともいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。毒素は、ジフテリア毒素及び外毒素Ａのいずれか等であるがこれらに限定されない細菌毒素、リシン等であるがこれらに限定されない植物毒素を含んでいてもよい。アポトーシス誘導活性を有するアポトーシス性シグナル伝達カスケードのタンパク質としては、グランザイムＢ、グランザイムＡ、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９、切頭型Ｂｉｄ（ｔＢｉｄ）、Ｂａｘ、及びＢａｋが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
好ましい実施形態では、エフェクタは、特に免疫複合体の標的抗体の基となる抗体の天然型の内在化能が不十分であるとき、免疫複合体の内部エフェクタ送達を増加させる。別の好ましい実施形態では、エフェクタは、その天然型では非選択的である。ある実施形態では、エフェクタは、天然型であるとき、全身毒性を含む、高い非選択的毒性を有する。本発明のエフェクタ分子の「天然型」は、標的剤に結合して、免疫複合体を形成する前のエフェクタ分子である。別の好ましい実施形態では、エフェクタ分子の非選択的毒性は、標的剤に複合体化すると実質的になくなる。別の好ましい実施形態では、エフェクタ分子は、標的細胞に到達したとき、標的細胞において死及び連続細胞周期停止のいずれかを引き起こす。本発明に係る薬物−エフェクタ分子としては、例えば、マイタンシノイド、ドラスタチン、アウリスタチン、及びクリトフィシン等のチューブリン重合の阻害剤として作用する、高い細胞傷害性を有する小さい薬物；ＣＣ−１０６５類似体及び誘導体のいずれか、及びデュオカルマイシン等のＤＮＡアルキル化剤（米国特許第５，４７５，０９２号明細書；同第５，５８５，４９９号明細書；同第６，７１６，８２１号明細書）；カリチアマイシン及びエスペラミシン等のエイジイン抗生物質；並びに強力なタキソイド（タキサン）薬物（Ｐａｙｎｅ，２００３）、を含む薬物が挙げられるが、これらに限定されない。マイタンシノイド及びカリチアマイシンが特に好ましい。エフェクタマイタンシノイドとしては、合成マイタンシノール、並びにマイタンシノール類似体及び誘導体が挙げられるが、これらに限定されない、任意の起源のマイタンシノイドが挙げられる。ドキソルビシン、ダウノマイシン、メトトレキサート、ビンブラスチン、ネオカルチノスタチン、マクロマイシン、トレニモン、及びα−アマニチンは、本発明の範囲内の幾つかの他のエフェクタ分子である。また、エフェクタ分子としてのアンチセンスＤＮＡ分子も本発明の範囲内である。例えば、特定の薬物及び薬物のクラスのいずれかの名称を、本明細書で用語「エフェクタ」及び「エフェクタ分子」のいずれかと組み合わせるとき、その特定の薬物及び薬物のクラスのいずれかに基づく本発明に係る免疫複合体のエフェクタに言及する。
【００６３】
マイタンシンは、元々エチオピアの灌木であるＭａｙｔｅｎｕｓ ｓｅｒｒａｔａに由来する天然物である（Ｒｅｍｉｌｌａｒｄ，１９７５；米国特許第３，８９６，１１１号明細書）。この薬物は、チューブリン重合を阻害し、その結果有糸分裂の遮断、及び細胞死が生じる（Ｒｅｍｉｌｌａｒｄ，１９７５；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ，１９７７；Ｋｕｐｃｈａｎ，１９７８）。マイタンシンの細胞傷害性は、ビンカアルカノイド及びタキソールのいずれか等の、チューブリン重合に影響を与える、臨床的に用いられている抗癌剤より２００〜１０００倍高い。しかしながら、マイタンシンの臨床試験により、その高い全身毒性のために治療域を欠くことが示された。マイタンシン及びマイタンシノイドは、細胞傷害性は高いが、それを癌治療において臨床的に使用することは、主に腫瘍に対する選択性が不十分であることに起因する、重篤な全身性副作用により非常に限定されている。マイタンシンを用いた臨床試験は、中枢神経系及び消化器系に重大な副作用を示した。
【００６４】
マイタンシノイドは、Ｔｒｅｗｉａ ｎｕｄｉｆｌｏｒａの種子組織を含む、他の植物からも単離されている（米国特許第４，４１８，０６４号明細書）。
【００６５】
ある微生物もまた、マイタンシノール、及びＣ−３マイタンシノールエステルのような、マイタンシノイドを産生する（米国特許第４，１５１，０４２号明細書）。
【００６６】
本発明は、例えば、米国特許第４，１３７，２３０号明細書；同第４，２４８，８７０号明細書；同第４，２５６，７４６号明細書；同第４，２６０，６０８号明細書；同第４，２６５，８１４号明細書；同第４，２９４，７５７号明細書；同第４，３０７，０１６号明細書；同第４，３０８，２６８号明細書；同第４，３０８，２６９号明細書；同第４，３０９，４２８号明細書；同第４，３１３，９４６号明細書；同第４，３１５，９２９号明細書；同第４，３１７，８２１号明細書；同第４，３２２，３４８号明細書；同第４，３３１，５９８号明細書；同第４，３６１，６５０号明細書；同第４，３６２，６６３号明細書；同第４，３６４，８６６号明細書；同第４，３７１，５３３号明細書；同第４，４２４，２１９号明細書、及び同第４，１５１，０４２号明細書に開示されている、合成マイタンシノール及びマイタンシノール類似体を含む、任意の起源のマイタンシノイドに関する。
【００６７】
好ましい実施形態では、マイタンシノイドは、チオールを含有するマイタンシノイドであり、より好ましくは米国特許第６，３３３，４１０号明細書（Ｃｈａｒｉら）及びＣｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．（Ｃｈａｒｉ，１９９２）のいずれかに開示されているプロセスに従って製造される。
【００６８】
ＤＭ−１（Ｎ２−デアセチル−Ｎ２−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン）は、本発明の状況において好ましいエフェクタ分子である。ＤＭ１は、マイタンシンの３倍〜１０倍細胞傷害性が高く、腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体へ、ジスルフィド結合（１及び複数のいずれか）を介して、結合することにより、プロドラックに変換されている。あるこれらの複合体（時に「腫瘍活性化プロドラッグ」（ＴＡＰ）と呼ばれる）は、血液コンパートメントにおいて細胞傷害性ではない。その理由は、それらは標的細胞に結合して活性化され、内在化し、それにより薬物を放出するためである（Ｂｌａｅｔｔｌｅｒ，２００１）。幾つかの抗体−ＤＭ１複合体が開発されており（Ｐａｙｎｅ，２００３）、臨床試験で評価されている。例えば、結腸直腸癌患者のｈｕＣ２４２−ＤＭ１治療は、耐容性良好であり、検出可能な免疫反応を全く誘導せず、循環時間が長かった（Ｔｏｌｃｈｅｒ，２００３）。
【００６９】
マイタンシノイドＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシン（「ＤＭ３」とも呼ばれる）、及びＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシン（「ＤＭ４」とも呼ばれる）等であるが、これらに限定されない、他の特に好ましいマイタンシノイドは、立体障害のあるチオール結合を含む側鎖を含む。ＤＭ４の合成を図３及び図４に示し、本明細書の他の箇所に記載する。ＤＭ４は、そのαＣにメチル基を有する点でＤＭ１及びＤＭ３とは異なる。これにより、ＤＭ４が、リンカー、具体的にはこれに限定されないがジスルフィド結合を含むリンガーを介して、ｎＢＴ０６２のような標的剤に結合するとき、立体障害が生じる。立体障害のあるチオール基を有する広範なマイタンシノイド（１つ及び２つのいずれかの置換基、具体的には、ＤＭ４のメチル置換基のような、アルキル置換基を有する）が、２００４年１１月２５日公開の米国特許出願公開第２００４／０２３５８４０号明細書に開示されており、この全体を参照することにより本願に援用する。
【００７０】
米国特許出願公開第２００６／０２３３８１４号明細書で、Ｇｏｌｄｍａｈｋｅｒらにより報告されているように、いったん薬物がその標的で放出されると、このような障害は遊離薬物のアルキル化（例えば、メチル化）を誘導する。アルキル化は、薬物の安定性を増し、いわゆるバイスタンダー（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）効果を可能にすることができる。しかしながら、当業者が認識しているように、エフェクタがリンカーを介して標的剤に結合するとき、立体障害が生じる位置にアルキル基等の置換基を含む他のエフェクタ分子も、本発明の一部である。好ましくは、この障害は、遊離薬物のアルキル化等の化学修飾を誘導して、その全体の安定性を高め、これによって薬物が、ＣＤ１３８発現腫瘍細胞における細胞死及び連続細胞周期停止のいずれかを誘導するだけでなく、任意的に、例えば腫瘍、具体的には腫瘍間質及び腫瘍脈管構造の細胞を支持し或いは薬物から保護し、一般にＣＤ１３８を発現しない補助細胞に影響を与え、その支持機能及び保護機能のいずれかを低下させるか、或いは失わせることも可能にする。
【００７１】
ＤＮＡアルキル化剤はまた、エフェクタ分子として特に好ましく、ＣＣ−１０６５類似体及び誘導体のいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。ＣＣ−１０６５は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｚｅｌｅｎｓｉｓの培養物から単離された強力な抗腫瘍抗生物質であり、インビトロで極めて細胞傷害性が高いことが示されている（米国特許第４，１６９，８８８号明細書）。例えば、米国特許第５，４７５，０９２号明細書、同第５，５８５，４９９号明細書、及び同第５，７３９，３５０号に記載されているＣＣ−１０６５類似体及び誘導体のいずれかも、本発明の範囲内である。当業者であれば容易に理解されるように、米国特許第５，８４６，５４５号明細書に記載されているような修飾されたＣＣ−１０６５類似体及び誘導体のいずれか、並びに例えば米国特許第６，７５６，３９７号明細書に記載されているようなＣＣ−１０６５類似体及び誘導体のいずれかのプロドラッグも、本発明の範囲内である。本発明のある実施形態では、ＣＣ−１０６５類似体及び誘導体のいずれかは、例えば、米国特許第６，５３４，６６０号明細書に記載されているように合成することができる。
【００７２】
好ましいエフェクタ分子を作製する化合物の別の群は、特に非常に強力で、チオール及びジスルフィド基のいずれかを含むタキサンである。タキサンは、チューブリンの脱重合を阻害する紡錘体毒であり、結果として微小管の組み立て及び細胞死の速度を上昇させる。本発明の範囲内であるタキサンは、例えば、米国特許第６，４３６，９３１号明細書、同第６，３４０，７０１号明細書、同第６，７０６，７０８号明細書、並びに米国特許出願公開第２００４／００８７６４９号明細書、同第２００４／００２４０４９号明細書、及び同第２００３／０００４２１０号明細書に開示されている。他のタキサンは、例えば、米国特許第６，００２，０２３号明細書、米国特許第５，９９８，６５６号明細書、米国特許第５，８９２，０６３号明細書、米国特許第５，７６３，４７７号明細書、米国特許第５，７０５，５０８号明細書、米国特許第５，７０３，２４７号明細書、及び米国特許第５，３６７，０８６号明細書に開示されている。当業者であれば、米国特許第６，５９６，７５７号明細書に記載されているもの等の、ＰＥＧ化タキサンもまた本発明の範囲内であることが理解されよう。
【００７３】
本発明に係るカリチアマイシンエフェクタ分子としては、ガンマ１ｌ、Ｎ−アセチルカリチアマイシン、及び他のカリチアマイシン誘導体が挙げられる。カリチアマイシンは、配列特異的な方式で、ＤＮＡの副溝に結合し、再編成され、フリーラジカルに曝されるため、二本鎖ＤＮＡの破壊を導き、細胞のアポトーシス及び細胞死をもたらす。本発明の状況で用いることができるカリチアマイシンエフェクタ分子の１例は、米国特許第５，０５３，３９４号明細書に記載されている。
【００７４】
本発明に係る免疫複合体は、少なくとも１種の標的剤、具体的には、改変された標的抗体等の標的抗体と、１種のエフェクタ分子とを含む。免疫複合体は、例えば安定化のために更に分子を含んでいてもよい。免疫複合体について、用語「複合体」は、一般に、標的剤と１以上のエフェクタ分子との機能的結合を定義するために用いられ、機能的結合のいずれかの種類のみを指すことを意図せず、特に化学的「複合体化」に限定されるものではない。標的剤が標的部位に結合することができ、結合したエフェクタが、特に標的部位に送達されたときに、意図した通りに十分に機能する限り、どのような結合様式も好適である。本発明に係る複合体化法としては、エフェクタ分子、及び標的抗体の少なくともいずれかを予め修飾して、或いは修飾せずに、標的抗体にエフェクタ分子を直接結合させること、及びリンカーを介して結合させることのいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。リンカーは、例えば、酸に不安定なリンカー、感光性リンカー、ペプチダーゼにより切断できるリンカー等の酵素で切断可能なリンカーに、機能的に分類することができる。切断可能なリンカーが、本発明の多くの実施形態で好ましい。このような切断可能なリンカーは、細胞環境、特に細胞内環境に存在し、切断時に放出される薬物に対して有害な作用を有しない条件下で切断され得る。リンカーが細胞内のある部分に存在するとき、ｐＨ４〜５のような低ｐＨによって、酸に不安定なリンカーが切断され、一方感光性リンカーは、例えば赤外光により切断され得る。しかしながら、大部分の細胞内に存在する生理学的条件により／生理学的条件下で切断されるリンカーが好ましく、本明細書では生理学的に切断可能なリンカーと称する。従って、ジスルフィドリンカーが、本発明の多くの実施形態で好ましい。これらのリンカーは、ジスルフィド交換を通して切断可能であり、これは生理学的条件下で生じ得る。好ましいヘテロ二官能性ジスルフィドリンカーとしては、Ｎ−スクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（例えば、Ｃａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９７８）を参照）、Ｎ−スクシニミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）（例えば、米国特許第４，５６３，３０４号明細書を参照）、Ｎ−スクシニミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）（例えば、ＣＡＳ登録番号３４１４９８−０８−６）、Ｎ−スクシニミジル４−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）（例えば、Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，（１９７９）を参照）、及びＮ−スクシニミジル４−メチル−４−［２−（５−ニトロ−ピリジル）−ジチオ］ペンタノエート（ＳＭＮＰ）（例えば、米国特許第４，５６３，３０４号明細書を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の組成物で使用するのに最も好ましいリンカー分子は、ＳＰＰ、ＳＭＣＣ、及びＳＰＤＢである。
【００７５】
他の好適なリンカーとしては、スルホスクシニミジルマレイミドメチルシクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）（これは化合物をＳＨ−含有化合物と結合することができるヘテロ二官能性リンカーである）等であるが、これらに限定されない「切断不可能な」結合を含んでいてもよい。Ｓ−（２−チオピリジル）−Ｌ−システインヒドラジド（ＴＰＣＨ）等の、炭水化物指向性ヘテロ二官能性リンカー分子等の、二官能性及びヘテロ二官能性リンカー分子もまた、本発明の範囲内である（Ｖｏｇｅｌ，２００４）。マイタンシノイドのようなエフェクタ分子は、２段階反応プロセスを介して標的抗体と複合体化することができ、第１の工程として、Ｎ−スクシニミジルピリジルジチオプロピオネート（ＳＰＤＰ）のような架橋試薬によって、標的抗体を修飾して、標的抗体にジチオピリジル基を導入する工程を含む。第２の工程では、ＤＭ１のような、チオール基を有する反応性マイタンシノイドを、修飾された抗体に添加して、修飾された抗体におけるチオピリジル基の置換、及びジスルフィド結合した細胞傷害性マイタンシノイド／抗体複合体の産生を生じさせる（米国特許第５，２０８，０２０号明細書）。しかしながら、米国特許出願公開第２００３００５５２２６号明細書（Ｃｈａｒｉら）に開示されているもののような１段階複合体化プロセスもまた、本発明の範囲内である。本発明の１つの実施形態では、同一種類及び異なる種類のいずれかの複数のエフェクタ分子が、標的抗体に結合する。
【００７６】
ＣＣ−１０６５類似体及び誘導体のいずれかは、例えば、米国特許第６，７１６，８２１号明細書に記載されているようなＰＥＧ結合基を介して、標的剤と複合体化することができる。カリチアマイシンは、リンカー（米国特許第５，８７７，２９６号明細書、及び米国特許第５，７７３，００１号明細書）を介して、或いは米国特許第５，７１２，３７４号、及び米国特許第５，７１４，５８６号明細書に開示されている複合体化方法に従って、標的抗体と複合体化することができる。カリチアマイシン複合体を調製するための別の好ましい方法は、米国特許出願公開第２００４００８２７６４号明細書に開示されている。本発明の免疫複合体は、組み換え融合タンパク質の形態をとってもよい。
【００７７】
用語配列同一性は、ヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列のいずれかの同一性の程度を指す。一般に、最も高い水準の一致が得られるように、配列を整列させる。「同一性」は、それ自体、当該技術分野で認識されている意味を有し、公開されている技術を用いて判定することができる（例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１を参照）。２つのポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のいずれかの間の同一性を測定するための、多くの方法が存在するが、用語「同一性」は当業者に周知である（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．＆Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３（１９８８））。
【００７８】
特定の核酸分子のいずれかが、例えば、ｎＢＴ０６２核酸配列、及びその一部のいずれかに対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％のいずれか同一であるがどうかは、従来法で、初期配列整列用のＤＮＡｓｉｓソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ Ｂｒｕｎｏ，Ｃａｌｉｆ．）、続いて複数の配列整列用のＥＳＥＥバージョン３．０ ＤＮＡ／タンパク質配列ソフトウェア（ｃａｂｏｔ＠ｔｒｏｇ．ｍｂｂ．ｓｆｕ．ｃａ）等の、既知のコンピュータプログラムを用いて決定することができる。
【００７９】
アミノ酸配列が、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列及び配列番号２で表されるアミノ酸配列のいずれか、並びにその一部のいずれかに対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％のいずれか同一であるかどうかは、従来法で、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７１１）等の、既知のコンピュータプログラムを用いて決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９ （１９８１）のローカルホモロジーアルゴリズムを用いて、２つの配列間で最良の相同セグメントを見つける。
【００８０】
ＤＮＡｓｉｓ、ＥＳＥＥ、ＢＥＳＴＦＩＴ、及び他の配列整列プログラムのいずれかを用いて、特定の配列が、例えば、本発明に係る参照配列に対して９５％同一であるかどうかを決定するとき、同一性の割合が参照核酸及びアミノ酸配列のいずれかの完全長に対して計算され、相同性において、参照配列中のヌクレオチドの合計数の最大５％のギャップが許容されるように、パラメータを設定する。
【００８１】
本発明の状況において、特定の配列の残基の組み合わせと共に、ある配列同一性について言及する場合、この配列同一性は特定された全ての残基の合計に関連する。
【００８２】
基本的な抗体分子は、可変領域が抗原に結合し、一方残りの定常領域が抗原非依存性反応を誘発することができる、二機能性構造である。抗体の主なクラスである、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭは、定常領域により決定される。これらのクラスは、サブクラス（アイソタイプ）に更に分類することができる。例えば、ＩｇＧクラスは、定常領域により決定される、４つのアイソタイプ、即ちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を有する。種々のヒト抗体のクラスのうち、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＭのみが、補体系を有効に活性化することが知られている。定常領域は、抗原結合部位を形成しないが、定常領域、及びヒンジ領域の配置は、分子に、それが抗原と結合することを可能にする、セグメンタルフレキシビリティ（ｓｅｇｍｅｎｔａｌ ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）を付与することができる。
【００８３】
様々なＩｇＧアイソタイプが、単球、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞のような細胞上のＦｃ受容体に結合し、それにより細胞を活性化して、サイトカインを放出させることができる。様々なアイソタイプはまた、補体を活性化して、局所及び全身炎症のいずれかを引き起こす恐れがある。具体的には、様々なＩｇＧアイソタイプが、ＦｃγＲに、様々な程度結合することができる。ＦｃγＲは、Ｉｇスーパーファミリーに属する表面糖タンパク質の群であり、大部分は白血球上で発現する。ＦｃγＲ糖タンパク質は、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）と名付けられた３つのクラスに分類される。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ３は、様々なこれらのクラスのＦｃγＲ糖タンパク質に強く結合するが、ＩｇＧ４は非常に弱い結合を示す。具体的には、ＩｇＧ４は、ＦｃγＲＩの中間結合剤であり、これは比較的低いＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）を生じさせるか、或いは全くＡＤＣＣを生じさせず、ＦｃγＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＡのいずれにも結合しない。ＩｇＧ４はまた、阻害性受容体であるＦｃγＲＩＩＢの弱い結合剤でもある。更に、ＩｇＧ４は、補体結合を僅かにしか媒介しないか、或いは全く媒介せず、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を僅かにしか媒介しないか、或いは全く媒介しない。本発明の状況では、ＩｇＧ４がＬＳＥＣ（肝類洞内皮細胞）上のＦｃＲγＩＩと全く相互作用を示さず、クッパー細胞（マクロファージ）上のＦｃＲγＩ−ＩＩＩと全く相互作用を示さない、及び弱い相互作用しか示さない、のいずれかであり、肝ＮＫ細胞上のＦｃＲγＩＩＩと全く相互作用を示さないとき、ＩｇＧ４を特異的に使用して、肝臓のＦｃＲのＦｃ媒介性標的を防ぐことができる。いずれかのＣＤＣを更に減少させる特定の突然変異もまた、本発明の一部である。例えば、位置３２７、３３０、及び３３１におけるＩｇＧ４残基は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）、及びＣＤＣを減少させることが示されている（Ａｍｏｕｒ，１９９９；Ｓｈｉｅｌｄｓ，２００１）。抗体を安定化する突然変異の中の１つもまた、本発明の一部である（本明細書では、「安定化突然変異」とも称される）。これらの突然変異は、具体的には、ＩｇＧ４のＣＨ２領域におけるロイシンからグルタミン酸への突然変異、及びＩｇＧ４のヒンジコアにおけるセリンからプロリンへの交換を含む。これらの突然変異は、本発明のある実施形態では、半分子（ｈａｌｆ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の量を、１０％未満、５％未満、好ましくは２％及び１％未満のいずれかに減少させる。更に、このように安定化した抗体のインビボ半減期は、１、２、３、４、及び５日超のいずれかを含む、数日間増加する場合がある（Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ，１９９９）。
【００８４】
本明細書に開示する標的抗体、具体的には改変された標的抗体を含む標的剤はまた、抗原、具体的にはＣＤ１３８に対するその結合親和性の観点で説明或いは特定することができる。標的抗体、具体的には改変された標的抗体等の標的剤の好ましい結合親和性は、１．６未満、１．５未満、並びに約１．４及びそれ未満のいずれかの解離定数ＫＤ（ｎＭ）を特徴とする。標的抗体等の標的剤を含む免疫複合体では、１．６未満、１．５未満、或いは２．５未満、２．４未満、２．３未満、２．２未満、２．１未満、２．０未満、１．９未満、及び約１．９のいずれかの解離定数ＫＤ（ｎＭ）が好ましい。
【００８５】
本発明に係る抗原結合領域（ＡＢＲ）は、使用される標的抗体及び改変された標的抗体のいずれかの種類に基づいて変化する。天然に存在する抗体、並びに大部分のキメラ及びヒト化抗体では、抗原結合領域は、軽鎖、及び重鎖の最初の２つのドメインで構成される。しかしながら、軽鎖を有しない重鎖抗体では、抗原結合領域は、例えば重鎖の最初の２つのドメインのみで構成され、一方単鎖抗体（ＳｃＦｖ）（抗体分子の軽鎖及び重鎖可変ドメインを１つのポリペプチド鎖に結合させた）では、ＡＢＲは、１つのポリペプチド分子のみによって提供される。ＦＡＢ断片は、通常、パパイン消化により得られ、１本の軽鎖及び重鎖の一部を有し、よって抗原結合部位を１つだけ有するＡＢＲを含む。他方、二重特異性抗体は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗原断片である。しかしながら、本発明の状況では、標的抗体及び改変された標的抗体のいずれかの抗原結合領域は、標的抗体及び改変された標的抗体のいずれかの結合親和性を主に決定するいずれかの領域である。
【００８６】
ＡＢＲ及び別の標的抗体領域のいずれかが「ある抗体のもの」である、例えばヒト抗体及び非ヒト抗体のいずれかのものであると言う場合、これは、本発明の状況では、ＡＢＲが対応する天然に存在するＡＢＲと同一である、及びそれに基づいている、のいずれかであることを意味する。ＡＢＲは、天然に存在するＡＢＲの結合特異性を有するとき、天然に存在するＡＢＲに基づく。しかしながら、このようなＡＢＲは、例えば、点変異、付加、欠失、及びグリコシル化のいずれかのような翻訳後修飾を含んでいてもよい。このようなＡＢＲは、具体的には、天然に存在するＡＢＲの配列と、７０％超、８０％超、９０％超、好ましくは９５％超、９８％超、及び９９％超のいずれかの配列同一性を有してもよい。
【００８７】
標的抗体などの標的剤の、特にそれを含む免疫複合体の均一なターゲティングは、本発明の状況では、標的剤による前記標的の所望の結果を得ることに関連する分散の尺度である。本発明のある実施形態では、所望の結果は、標的への単純な結合により得られる。これは、例えば、ある標的剤がその後の結合を遮断する実施形態の場合である。しかしながら、標的剤の均一性は、例えば、前記標的剤を含む免疫複合体の有効性を介して、容易に評価することができる。例えば、腫瘍細胞の破壊、及び腫瘍の増殖停止の少なくともいずれかに関するエフェクタを含む、ＣＤ１３８のような腫瘍抗原に対する前記免疫複合体の有効性は、ＣＤ１３８抗原を発現している細胞を含む腫瘍の増殖抑制の程度により決定することができる。該免疫複合体は、その有効性が大きく変動する場合がある。例えば、その免疫複合体は時に、高い有効性によって腫瘍増殖を停止することができるが、他の時には、対照の効力を殆ど上回らない有効性しか有しない。他方、免疫複合体の有効性における変動が少ないことは、免疫複合体及び標的剤の少なくともいずれかが、それぞれ、一貫して所望の結果を提供することを示す。ターゲティングの均一性を定量化する１つの方法は、ターゲティング変動を計算することである。ある標的剤を含む免疫複合体により腫瘍増殖が停止される状況では、ターゲティング変動は、先ず腫瘍が、所定の体積、例えば３００ｍｍ３に達する時間を決定することにより計算できる。好ましくは、所定の体積は、前記所定の体積に達する前、及び達した後の任意の腫瘍増殖が、ほぼ同一速度で着実に増加するように選択される。このような時間を被験体の群について決定した後、被験体（例えば、ＳＣＩＤマウス、及び均一な腫瘍増殖を示す別の好適なモデルのいずれか）の群におけるこれらの時間の平均（Ｔｍ）を計算する。次いで、以下の式に従って、所定の体積についてのターゲティング変動を計算することにより、ターゲティング効率が最低であり、よって前記所定の体積に達するのに必要な時間が最も短い（Ｔｆ）腫瘍に関連する群の被験体と、他方、ターゲティング効率が最高であり、よって前記所定の体積に達するのに必要な時間が最も長い（Ｔｓ）腫瘍に関連する群の被験体とにおいて得られた知見とＴｍを相互に関連づける。
ターゲティング変動［％］＝Ｔｓ−Ｔｆ／Ｔｍ×１００
【００８８】
好ましい実施形態では、本発明の改変された標的抗体のターゲティング変動は、１５０％未満、１４０％未満、１３０％未満、１２０％未満、１１０％未満、１００％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、及び５０％未満のいずれかであり、ある実施形態では、４５％未満でさえある。好ましくは、ターゲティング変動は、約１０％〜約１５０％であり、好ましくは約１０％〜約１００％、約１０％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約１０％〜約６０％、約１０％〜約５０％である。
【００８９】
標的の均一性（本明細書では特定の抗原に対する結合性の均一性とも称される）はまた、腫瘍増殖の遅延の測定のような他の手段により定量化することもできる。また、当業者は、特定の大きさの腫瘍体積が、基準のターゲティング変動を決定することができるただ１つのパラメータであることを、容易に理解する。所望の結果に応じて、時間（例えば、腫瘍増殖の遅延を測定するための）、及び結合の割合（％）のいずれかを含む他のパラメータを使用してもよい。当業者は、このような他のパラメータを容易に決定することができる。
【００９０】
ｎＢＴ０６２（図１を参照）は、Ｂ−Ｂ４のキメラ化バージョンである、マウスヒトキメラＩｇＧ４ｍＡｂである。このＢ−Ｂ４のキメラ化バージョンは、ＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）反応は低下するが、ＣＤ１３８に対するＢ−Ｂ４の抗体結合領域の機能性は維持するよう作製した。驚くべきことに、このキメラ抗体は、Ｂ−Ｂ４に対して改善された結合親和性を示すことが見出された。また驚くべきことに、キメラ抗体は、均一なターゲティングに関連し、この均一なターゲティングにより、該抗体及びそれを含む免疫複合体のいずれかを用いたときに得られる結果より分散が減少する。ｎＢＴ０６２を産生するためのプロトコルを、以下に記す。ｎＢＴ０６２を発現しているチャイニーズハムスター卵巣細胞は、２００７年１２月１１日に、ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ，Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １，Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇに寄託されている。識別番号は、ＤＳＭ ＡＣＣ２８７５である。Ｂ−Ｂ４に基づくＣＤ１３８特異的キメラ抗体を、一般に、本明細書ではｃＢ−Ｂ４と称する。
【００９１】
重鎖及び軽鎖の両方のアミノ酸配列は、ｎＢＲ０６２のヌクレオチド配列の翻訳から予測されている。重鎖及び軽鎖について予測されるアミノ酸配列を、表１に示す。予測される可変領域を太字で表し、予測されるＣＤＲに下線を引く。
【００９２】
表１は、ｎＢＴ０６２の予測されるアミノ酸配列である。
【表１】
Ｃ末端のリジンは、クリッピングする傾向があり、ある程度不完全なクリッピングのために存在する場合があり、配列番号１で表されるアミノ酸配列の一部ではない。
【００９３】
表２は、Ｋｒａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの一般的なＣＤＲの定義と、ＢＴ０６２についての予測ＣＤＲとの比較を示す。
【表２】
【００９４】
ＢＴ０６２は、細胞分裂停止性マイタンシノイド誘導体ＤＭ４に、リンカー、ここではＳＰＤＢを介して結合した、ＣＤ１３８標的キメラ抗体ｎＢＴ０６２を含む、免疫複合体である。ＢＴ０６２の化学的表現を図１及び図２に提供する。ｎＢＴ０６２及びマイタンシノイドエフェクタ分子を含む免疫複合体は、そのリンカー、及びマイタンシノイドエフェクタの観点で特徴付けられることが多く、例えばｎＢＴ０６２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１は、ｎＢＴ０６２、ＳＭＣＣ（チオエステル結合を含む「切断不可能な」リンカー）、及びエフェクタとしてＤＭ１を含む免疫複合体である。より一般的に、ｎＢＴ０６２及びエフェクタ分子を含む免疫複合体はまた、ｎＢＴ０６２−リンカー−エフェクタ、及びただｎＢＴ０６２−エフェクタ（ｎＢＴ０６２Ｎ）（Ｎは本明細書に記載するエフェクタのいずれかである）のいずれかとして記載することもある。
【００９５】
本明細書では、切断可能なリンカー（ＣＬ）を介してエフェクタ分子に結合している、ＣＤ１３８に対する改変された標的抗体を含む免疫複合体の立体障害のない相当物（ＵＩ：立体障害のない免疫複合体）（本明細書では、ＵＩＣＬと記載する）について言及し、これを前記エフェクタ分子に対する立体障害があるが、切断可能なリンカーを含む免疫複合体（ＨＩＣＬ）と対比させる。ＵＩＣＬは、改変された標的抗体を含むが、エフェクタ分子に対する立体障害のないＨＩＣＬに相当する免疫複合体である。ＨＩＣＬ／ＵＩＣＬ対の例は、ＢＴ０６２及びｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１である。切断不可能なリンカーを含むこのような免疫複合体の立体障害のない相当物（ＵＩＮＣＬ）は、エフェクタ分子の立体障害がなく、切断不可能なリンカーを含む、改変された標的抗体を含む同等の免疫複合体を指す。ＢＴ０６２では、ｎＢＴ０６２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１は、このような切断不可能なリンカーを含む立体障害のない相当物の例を構成する。
【００９６】
免疫複合体の腫瘍の増殖を阻害する活性（＝腫瘍増殖阻害活性）は、相対的な測定値である。腫瘍増殖阻害活性は、最高の性能の免疫複合体（この活性を１００％として設定する）の活性に対する、複合体の腫瘍増殖阻害活性を表す。例えば、最高の性能の免疫複合体、例えば、ＢＴ０６２の活性（３２日の腫瘍増殖の遅延（ＴＧＤ）を引き起こす）を１００％として設定した場合、例えば、１８日の腫瘍増殖の遅延（ＴＧＤ）を示す、ｎＢＴ０６２−ＤＭ１の活性は、以下のように計算される。
腫瘍増殖阻害活性＝１００×（ＴＧＤｎＢＴ０６２−ＤＭ１／ＴＧＤＢＴ０６２）、
より一般的には、
腫瘍増殖阻害活性＝１００×（ＴＧＤサンプル／ＴＧＤリファレンス）。
【００９７】
表３は、図１１Ｂに示した結果から好適な例を提供する。
【表３】
表３：４５０μｇ／ｋｇの用量を投与された処理群に基づく、ＳＣＩＤマウスのＭＯＬＰ−８腫瘍異種移植片に対する、ｎＢＴ０６２−ＤＭｘの腫瘍増殖の遅延（ＴＧＤ）及び活性（％）
（＊）処理群が所定の大きさ（１６０ｍｍ３）に達する平均時間（日）から、対照群がこの所定の大きさに達する平均時間を引いたときの、腫瘍増殖遅延（ＴＧＤ）（日）
（＊＊）腫瘍増殖阻害活性＝１００×（ＴＧＤサンプル／ＴＧＤＢＴ０６２）。ＢＴ０６２の活性を１００％であると定義する。
【００９８】
表２に提供した例では、ＢＴ０６２は、その立体障害のない相当物（ｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１）を６０％上回る腫瘍増殖阻害活性、及び切断不可能なリンカーを含む、立体障害のない相当物の免疫複合体（ｎＢＴ０６２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）を４４％上回る腫瘍増殖阻害活性を提供する。
【００９９】
免疫複合体における切断可能なリンカーは、いわゆるバイスタンダー効果を提供することが、既に報告されている。Ｇｏｌｄｍａｈｋｅｒら（米国特許出願公開第２００６／０２３３８１４号明細書）はまた、標的剤から切断されて、エフェクタ分子が更なる修飾、具体的にはアルキル化を受けるとき、バイスタンダー効果が特に顕著であることも開示している。Ｇｏｌｄｍａｈｋｅｒらはまた、ＵＩＣＬが、それぞれのＵＩＮＣＬより良好なＴＧＤを示すことを示し、この事実もまたバイスタンダー効果と称されるものに起因していた（例えば、米国特許出願公開第２００６／０２３３８１４号明細書の図６を参照）。
ここで、驚くべきことに、高単回用量レジメン（２５０μｇ／ｋｇ）におけるＵＩＣＬは、実際ＵＩＮＣＬより良い結果を全く示さないことが見出された。要するに、このようなレジメンにおけるＵＩＣＬで観察されたＴＧＤの日数は、実際ＵＩＮＣＬより短かった。この観察は、用量の増加につれて（４５０μｇ／ｋｇ）より顕著になった。即ち、単回投与実験において、予想以上に、ＨＩＣＬはＵＩＣＬより優れていた。加えて、ＵＩＮＣＬは、高用量において、予想外にＵＩＣＬより優れていた。
【０１００】
本明細書に開示する、標的剤、具体的には、標的抗体、及び免疫複合体の少なくともいずれかは、静脈内に、非経口的に、経口的に、筋肉内に、髄腔内に、及びエアゾールとしてのいずれかを含む、いずれの経路で投与してもよい。送達方式は、所望の効果に応じて決定される。当業者は、本発明に従って、特定の処理についての最良の投与経路を容易に知る。適切な用量は、投与経路、及び指示された処理に応じて決定され、現在の治療プロトコルを考慮して当業者が容易に決定することができる。
【０１０１】
活性成分として、本発明の複合体化していない標的剤、及び免疫複合体を含有する医薬組成物は、従来の医薬品調合技術に従って調製することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ Ｅｄ．（１９８５，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）を参照。典型的には、有効量の活性成分を、薬学的に許容される担体と混合する。担体は、例えば、静脈内、経口、非経口、髄腔内、経皮、及びエアゾールのいずれかとして等、投与にとって望ましい製剤形態に応じて、広範な形態をとることができる。
【０１０２】
経口投与では、標的剤及び免疫複合体の少なくともいずれかを、カプセル、丸剤、錠剤、ロゼンジ剤、溶解物（ｍｅｌｔ）、粉剤、懸濁液、及びエマルションのいずれか等の、固体製剤及び液体製剤のいずれかに配合することができる。経口剤形の組成物の調製では、経口液体製剤（例えば、懸濁液、エリキシル剤、及び溶液）の場合、例えば、水、グリコール、油、アルコール、着香剤、防腐剤、着色剤、懸濁剤等、或いは経口固体製剤（例えば、粉剤、カプセル、及び錠剤）の場合、デンプン、砂糖、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤等の、通常の医薬媒質のいずれを使用してもよい。投与が容易であるため、錠剤及びカプセルが最も有利な経口単位剤形を表し、この場合無論固体医薬担体が使用される。必要に応じて、錠剤は、標準的な技術により糖コーティングしてもよく、腸溶性コーティングを施してもよい。活性剤は、消化管を通過するために安定でなければならない。必要な場合、安定な通過に好適な薬剤を用いてもよく、文献に記載されているリン脂質及びレシチン誘導体のいずれか、並びにリポソーム、微粒子（ミクロスフィア及びマクロスフィアを含む）を含んでいてもよい。
【０１０３】
非経口投与では、標的剤及び免疫複合体の少なくともいずれかを、医薬担体に溶解させ、溶液及び懸濁液のいずれかとして投与してもよい。好適な担体の例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）、デキストロース溶液、フラクトース溶液、エタノール、並びに動物油、植物油、及び合成起源の油の少なくともいずれかである。担体はまた、他の成分、例えば、防腐剤、懸濁剤、可溶化剤、緩衝剤等を含有していてもよい。複合体化していない標的剤、及び免疫複合体の少なくともいずれかを、脳室内、及び髄腔内のいずれかに投与するとき、それらはまた脳脊髄液に溶解する場合もある。
【０１０４】
被験体に投与される用量は、被験体（ヒト及び非ヒト動物を含む）の表面積当たり、定められた量であってもよい。用量は、このような被験体に、好ましくは、約５ｍｇ／ｍ２〜約３００ｍｇ／ｍ２（約２０ｍｇ／ｍ２、約５０ｍｇ／ｍ２、約１００ｍｇ／ｍ２、約１５０ｍｇ／ｍ２、約２００ｍｇ／ｍ２、及び約２５０ｍｇ／ｍ２を含む）であるが、これに限らない量投与することができる。標的剤／免疫複合体は、好適には、１回に、及び一連の処理の間のいずれかに投与される。複数回投与レジメンでは、これらの量を、１日１回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、５週間に１回、及び６週間に１回のいずれかの間隔で投与してもよい。単一高用量、及び互いの直後に、続いてより長い間隔で投与される複数回の低用量のいずれかを含む負荷用量が、本発明の好ましい実施形態を構成する。好ましい実施形態では、投薬のタイミングは、２回目の処理及び任意のその後の処理のいずれかの前に十分な時間が経過し、その結果前回の用量が実質的に代謝されているが、被験体の系に存在する免疫複合体の量が、依然として腫瘍の増殖の阻害、遅延、及び防止の少なくともいずれかを行うように、被験体に応じて調整される。代表的な「反復単回用量」レジメンは、３週間に１回、約２００ｍｇ／ｍ２の免疫複合体の初期量を投与することを含む。或いは、高初期量に続いて、１週間に２回、約１５０μｇ／ｍ２の維持量を投与してもよい。しかしながら、他の投薬レジメンが有用である場合がある。この治療の進行は、既知の技術及びアッセイにより容易にモニタされる。用量は、それが予防目的のために投与されるか治療目的のために投与されるか、任意のそれ以前の治療の過程、患者の臨床歴、及び標的剤／免疫複合体に対する反応、並びに主治医の裁量に応じて、変更してもよい。
【０１０５】
本発明に従って、例としてｎＢＴ０６２及びＢＴ０６２を用いて、ＭＭを以下のように治療する。この例は、如何なる方法によっても本発明を限定することを意図するものではなく、当業者は、本発明の範囲内である他の免疫複合体及びｎＢＴ０６２に基づく系、及びＭＭのような疾患の治療に利用することができる他の治療レジメンを容易に決定することができる。
【０１０６】
血流が接近可能な細胞上における、患者のＭＭ細胞上でのＣＤ１３８の選択的発現、血流中におけるｎＢＴ０６２の特異性、及びＢＴ０６２の安定性により、ＢＴ０６２はＤＭ４の全身毒性を除去し、ＤＭ４エフェクタ分子（１及び複数のいずれか）の送達を標的とする機会を提供する。ある用量のｎＢＴ０６２の投与は、低発現ＣＤ１３８陽性非腫瘍細胞のＢＴ０６２との結合、好ましくは破壊に対する、これらの細胞の保護に有利であり、一方本発明の免疫複合体は、エフェクタ分子が免疫複合体から放出され得る細胞部位に、エフェクタ分子を有効に投与するための手段を提供する。現在の化学療法が提供する寛解は時に不完全であるため、この標的とされる送達及び放出は、多発性骨髄腫の治療を著しく進歩させる。
【実施例】
【０１０７】
本発明は、以下の実施例を参照することにより更に説明されるが、実施例は例示目的のために提供され、如何なる方法によっても本発明を限定することを意図するものではない。当該技術分野において周知である標準的な技術、及び以下に明確に記載されている技術のいずれかが利用される。
【０１０８】
材料及び方法
キメラ抗体の構築（ｃＢ−Ｂ４：ｎＢＴ０６２）
Ｂ−Ｂ４
既に特性評価されているマウス抗体Ｂ−Ｂ４（Ｗｉｊｄｅｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．，９４（１９９６），３１８）を、これらの実験で用いた。
【０１０９】
Ｂ−Ｂ４及びｃＢ−Ｂ４／ｎＢＴ０６２のクローニング及び発現
Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；２ｎｄ Ｅｄ．（１９８９），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＵＳＡなどのテキストブックに詳述されているように、或いはキットを用いる場合は製造業者の取扱説明書により推奨されているように、標準的な組み換えＤＮＡ技術を実施した。マウス可変領域のＰＣＲ−クローニング及び修飾は、標準的なＰＣＲ法を用いて実施した。用いたプライマーはそれぞれの結果のセクションに示した。
【０１１０】
ｃＢ−Ｂ４／ｎＢＴ０６２の発現
１０％のＦＣＳ、５８０μｇ／ｍＬのＬ−グルタミン、５０ユニット／ｍＬのペニシリン、及び５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ中で培養した、対数増殖期のＣＯＳ細胞を、トリプシン処理により回収し、遠心分離して、ＰＢＳで洗浄した。最終濃度が１×１０７細胞／ｍＬになるように、細胞をＰＢＳに再懸濁した。７００μＬのＣＯＳ細胞懸濁液を、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒキュベットに移し、重鎖及びカッパ軽鎖発現ベクターＤＮＡ（それぞれ１０μｇ、及び１３μｇのいずれかのＳｕｐｅｒｖｅｃｔｏｒ）と混合した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒを用いて、１９００Ｖ、２５μＦで細胞を電気穿孔処理した。形質転換された細胞を、１０％のガンマグロブリン遊離ＦＢＳ、５８０μｇ／ｍＬのＬ−グルタミン、５０ユニット／ｍＬのペニシリン、及び５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ中で７２時間培養し、その後、抗体含有細胞培養上清を回収した。
【０１１１】
ｃＢ−Ｂ４／ｎＢＴ０６２の発現レベルを測定するためのキャプチャーＥＬＩＳＡ
９６ウェルプレートを、ＰＢＳで希釈した０．４μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体の１００μＬのアリコートでコーティングした（４℃、一晩）。プレートを、２００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄した。ウェルを、０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０−ＰＢＳ溶液でブロッキングして、その後分泌された抗体を含有する２００μＬの細胞培養上清（３７℃で１時間インキュベート）を添加した。ウェルを、洗浄バッファーで６回洗浄し、その後ヤギ抗ヒトカッパ軽鎖ペルオキシダ−ゼ複合体と結合した抗体を検出した。
【０１１２】
細胞培養上清からのｃＢ−Ｂ４／ｎＢＴ０６２の精製
製造業者の推奨に従って、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ Ｐｌｕｓ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて、形質転換されたＣＯＳ７細胞の上清から、ｃＢ−Ｂ４抗体を精製した。
【０１１３】
ｃＢ−Ｂ４結合及び競合アッセイ
Ｂ−Ｂ４及びｃＢ−Ｂ４のＣＤ１３８への結合活性の分析を、Ｄｉａｃｌｏｎｅ（Ｂｅｓａｎｃｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）ｓＣＤ１３８ ｋｉｔを用いて、製造業者の推奨に従って、結果のセクションに記載した変化を考慮して実施した。
【０１１４】
ＲＮＡ調製及びｃＤＮＡ合成
ハイブリドーマＢ−Ｂ４細胞を増殖させ、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｄｉ ｋｉｔ（Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて処理して、製造業者のプロトコルに従ってＲＮＡを単離した。約５μｇのＢ−Ｂ４ ＲＮＡを逆転写させて、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔを用いて、製造業者のプロトコルに従ってＢ−Ｂ４ ｃＤＮＡを作製した。
【０１１５】
Ｂ−Ｂ４免疫グロブリンｃＤＮＡのクローニング
免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）ｃＤＮＡを、ＩｇＨプライマーＭＨＶ７（５’−ＡＴＧＧＧＣＡＴＣＡＡＧＡＴＧＧＡＧＴＣＡＣＡＧＡＣＣＣＡＧＧ−３’）（配列番号３）、及びＩｇＧ１定常領域プライマーＭＨＣＧ１（５’−ＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧ−３’）（配列番号４）を用いて、ＰＣＲにより増幅した。同様に、免疫グロブリン軽鎖（ＩｇＬ）を、それぞれプライマーＭＫＣ（５’−ＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧ−３’）（配列番号８）と組み合わせた、３種の異なるＩｇＫプライマーＭＫＶ２（５’−ＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴＧＧＧＴＧ−３’）（配列番号５）、ＭＫＶ４（５’−ＡＴＧＡＧＧＧＣＣＣＣＴＧＣＴＣＡＧＴＴＴＴＴＴＧＧＣＴＴＣＴＴＧ−３’）（配列番号６）、及びＭＫＶ９（５’−ＡＴＧＧＴＡＴＣＣＡＣＡＣＣＴＣＡＧＴＴＣＣＴＴＧ−３’）（配列番号７）を用いて増幅した。全ての増幅産物を、製造業者の取扱説明書に従って、ＴＯＰＯ−ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターと直接ライゲーションした。
ライゲーションしたｐＣＲ２．１ベクターのコンストラクトで形質転換したＥ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０ ｂａｃｔｅｒｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ＬＢ−アンピシリン−Ｘｇａｌ寒天プレート上で選択した。少量の培養物に単一白色コロニーを接種し、一晩増殖させ、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔを用いて、製造業者の取扱説明書に従って、プラスミドを単離した。
【０１１６】
ｃＤＮＡの配列決定
ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｖ３．０ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、プラスミドの配列を決定した。選択された各プラスミドを、１２１０及び１２３３プライマーを用いて、ＧｅｎｅＡｍｐ９６００ＰＣＲ装置で増幅させ（ｃｙｃｌｅ）両方向に配列決定した。電気泳動配列分析を、ＡＢＩキャピラリシーケンサで行った。
ＲＴ−ＰＣＲの完全サイクル、クローニング、及びＤＮＡ配列分析を繰り返して、各免疫グロブリン鎖について、完全に独立な３つの配列情報のセットを得た。
【０１１７】
Ｂ−Ｂ４ ＶＫのＤＮＡ配列
１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓを３つの独立な反応で実施した。プライマーＭＫＣ及びＭＫＶ２（上記配列）を用いて作製したＲＣＰ産物を、製造業者の取扱説明書に従ってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにライゲーションした。ＲＴ−ＰＣＲ反応のそれぞれの独立なセットから得られたクローンを、両方向に配列決定した。ＭＫＶ−２プライマーを用いた産物の配列は、ＭＯＰＣ−２１、ＳＰ２、及びＡｇ８のような骨髄腫融合パートナーを起源とする無菌カッパ転写産物に非常に類似していたため（（Ｃａｒｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２５（１９８８），９９１；Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，４０（１９８５）；１５７）、無視した。
【０１１８】
ＭＫＶ４及びＭＫＶ９プライマーとともにＭＫＣを用いたＰＣＲ産物は、互いに類似しており、リーダー配列プライマー内のゆらぎ（ｗｏｂｂｌｅ）の位置のみが異なっていた。
【０１１９】
Ｂ−Ｂ４ ＶＨ ＤＮＡ配列
１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ合成を３つの独立な反応において実施し、ＰＣＲ産物を各１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ産物からクローニングおよび配列決定した。５つのクローンを各１ｓｔ ｓｔｒａｎｄから配列決定した。
【０１２０】
キメラｃＢ−Ｂ４発現ベクターの構築
キメラ発現ベクターの構築は、ＶＨ及びＶＫに、ＢａｍＨＩ制限酵素部位及びＫｏｚａｋ配列が先行する、好適なリーダー配列を付加することを必要とする。Ｋｏｚａｋ共通配列は、可変領域配列の効率的翻訳にとって極めて重要である。Ｋｏｚａｋ共通配列は、そこからリボソームが翻訳を開始することができる正確なＡＵＧコドンを規定し、１つの最も重要な塩基は、ＡＵＧ開始の上流、−３の位置にあるアデニン（或いはそれ程好ましくはないが、グアニン）である。リーダー配列は、Ｋａｂａｔデータベースにおいて最も類似する配列として選択される（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，ＮＩＨ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ，１９９１）。これらの付加は、フォワード（Ｆｏｒ）プライマー内にコードされる（両方、配列５’−ＡＧＡＧＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＴＴＧＣＣＴＣＴＧＣＴＣＡＧＴＴＣＣＴＴＧＧＴＣＴＣＣ−３’（配列番号９）を有する；制限酵素部位には下線をひき、ＧＣＣＧＣＣＡＣＣはＫｏｚａｋ配列である）。更に、キメラ発現ベクターの構築は、Ｂ−Ｂ４のＪ領域の３’末端に隣接する、天然ＡｐａＩ制限酵素部位に至るまで、ヒトガンマ１定常領域の５’断片を導入し、軽鎖には、スプライス供与部位及びＨｉｎｄＩＩＩ部位を付加することを必要とする。スプライス供与部位は、可変領域配列を、適切な定常領域へ正確にインフレームで結合させ、Ｖ：Ｃイントロンを切り出すのに重要である。カッパイントロン＋ＣＫは、Ｂ−Ｂ４のＶＫ配列の下流の発現コンストラクトにコードされる。同様に、ガンマ−４ ＣＨは、Ｂ−Ｂ４ ＶＨ配列の下流の発現コンストラクトにコードされる。
Ｂ−Ｂ４ ＶＨ及びＶＫ遺伝子を先ず注意深く分析して、不所望のスプライス供与部位、スプライス受容部位、Ｋｏｚａｋ配列、並びにその後機能的全抗体のサブクローニング及び発現の少なくともいずれかに干渉する、任意の余分なサブクローニング制限酵素部位の存在を全て同定した。アミノ酸配列を変化させることなくＰＣＲを介して部位特異的突然変異誘発により除去する必要があった、不所望なＨｉｎｄＩＩＩ部位がＶＫ配列中に見出された。この反応では、オリゴヌクレオチドプライマーＢＴ０３（５’−ＣＡＡＣＡＧＴＡＴＡＧＴＡＡＧＣＴＣＣＣＴＣＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＧ−３’）（配列番号１０）及びＢＴ０４（５’−ＣＣＡＣＣＧＡＡＣＧＴＣＣＧＡＧＧＧＡＧＣＴＴＡＣＴＡＴＡＣＴＧＴＴＧ−３’）（配列番号１１）を用いて、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔのプロトコルに従って突然変異誘発を実施した。
【０１２１】
カッパ鎖キメラ化プライマー
非多義性Ｂ−Ｂ４ ＶＫリーダー配列（ＰＣＲプライマー配列とは独立）を、Ｋａｂａｔデータベースにおけるマウスリーダー配列と整列させた。Ｂ−Ｂ４ ＶＨリーダー配列に最もよく一致していたのは、ＶＫ−１０ ＡＲＳ−Ａであった（Ｓａｎｚ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，８４（１９８７），１０８５）。このリーダー配列は、ＳｉｇｎａｌＰアルゴリズムにより正確に切断されることが予測される（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ，１０（１９９７）；１）。ｐＫＮ１００発現ベクターにクローニングするために、プライマーＣＢＢ４Ｋｆｏｒ（上記参照）及びｇ２２５８（５’−ＣＧＣＧＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＡＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＣＴＣＣ−３’（配列番号１２）；制限酵素部位に下線を引く）を設計して、この完全リーダー、Ｂ−Ｂ４ ＶＫ領域、並びにＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ末端制限酵素部位を含むＰＣＲ産物を作製した。フォワードプライマーＣＢＢ４Ｋは、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位、Ｋｏｚａｋ翻訳開始部位、及びＶＫ−１０ ＡＲＳ−Ａリーダー配列を導入する。リバースプライマーｇ２２５８は、スプライス供与部位、及びＢａｍＨＩ制限酵素部位を導入する。得られた断片を、ｐＫＮ１００のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ制限酵素部位にクローニングした。
【０１２２】
重鎖キメラ化プライマー
非多義性Ｂ−Ｂ４ ＶＨリーダー配列（ＰＣＲプライマー配列とは独立）を、Ｋａｂａｔデータベースにおけるマウスリーダー配列と整列させた。Ｂ−Ｂ４ ＶＫリーダーに最もよく一致したのは、ＶＨ１７−１Ａ（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，８４（１９８７），２１４）であった。このリーダー配列は、ＳｉｇｎａｌＰアルゴリズムにより正確に切断されことが予測される。ｐＧ４Ｄ２００発現ベクターにクローニングするために、プライマーｃＢＢ４Ｈｆｏｒ（上記参照）及びｇ２２９４９（５’−ＣＧＡＴＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧＴＴＣＣ−３’（配列番号１３）；制限酵素部位に下線を引く）を設計して、ＶＨ１７−１Ａリーダー、Ｂ−Ｂ４のＶＨ領域、並びに末端ＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａＩ制限酵素部位を含むＰＣＲ産物を作製した。フォワードプライマーＣＢＢＨＦｏｒは、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位、Ｋｏｚａｋ翻訳開始部位、及びＶＫ−１７ １Ａリーダー配列を導入する。リバースプライマーｇ２２９４９は、ガンマ４ Ｃ領域の５’末端、及び天然ＡｐａＩ制限酵素部位を導入する。得られた断片を、ｐＧ４Ｄ２００のＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｐａＩ制限酵素部位にクローニングし、ベクターｐＧ４Ｄ２００ｃＢＢ４を得た。
【０１２３】
ｃＢＢ４抗体の産生
バイアル瓶１本分のＣＯＳ７細胞を解凍し、抗生物質を含む１０％の胎児クローンＩ血清を添加したＤＭＥＭ中で増殖させた。１週間後、細胞（１０７細胞／ｍＬで０．７ｍＬ）を、ｐＧ４Ｄ２００ｃＢＢ４＋ｐＫＮ１００ｃＢＢ４（それぞれ１０μｇのＤＮＡ）を用いて、或いはＤＮＡを用いずに電気穿孔処理した。細胞を４日間８ｍＬの増殖培地にプレーティングした。電気穿孔処理を７回繰り返した。
【０１２４】
キメラ抗体の検出
サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、ＣＯＳ７上清中の抗体濃度を測定した。一過性に形質転換されたＣＯＳ７細胞は、約６，９５６ｎｇ／ｍＬの抗体を分泌した（データは示さず）。
【０１２５】
ｃＢ−Ｂ４の結合活性
ＣＯＳ７培養上清におけるｃＢ−Ｂ４の結合活性を検定するために、Ｄｉａｃｌｏｎｅ ｓＣＤ１３８キットを用いた（固相サンドイッチＥＬＩＳＡ）。ｓＣＤ１３８に特異的なモノクローナル抗体で、提供されたマイクロタイターストリップのウェルをコーティングした。最初のインキュベート中、ｓＣＤ１３８及びビオチン化Ｂ−Ｂ４（ｂｉｏ−Ｂ−Ｂ４）抗体を、非標識試験抗体（Ｂ−Ｂ４及びｃＢ−Ｂ４のいずれか）の希釈系列とともに同時にインキュベートした。
低濃度の非標識抗体と競合させるために、この検定におけるｂｉｏ−Ｂ−Ｂ４の濃度を低下させた（さもなければ、ＣＯＳ７細胞培養上清におけるｃＢ−Ｂ４の濃度は、十分な競合を得るには低過ぎた）。この検定の結果から、両方の抗体がＣＤ１３８に対して同一の特異性を有することが明らかになる（データは示さず）。
【０１２６】
ｃＢ−Ｂ４の精製
キメラＢ−Ｂ４を、製造業者の推奨に従って、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ Ｐｌｕｓ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、ＣＯＳ７細胞上清から精製した（データは示さず）。
【０１２７】
ＫＤ−決定：比較 ｎＢＴ０６２／ＢＢ４
可溶性ＣＤ１３８の精製
Ｕ−２６６細胞培養上清由来の可溶性ＣＤ１３８抗原を、Ｂ−Ｂ４にカップリングした１ｍＬの「ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−活性化ＨＰ」カラムを用いて、ＦＰＬＣにより精製した。細胞培養上清を、カラム上のＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）にロードし、その後ＣＤ１３８抗原を、５０ｍＭのトリエチルアミン（ｐＨ１１）で、２ｍＬの画分に溶出させた。溶出したＣＤ１３８を、３７５μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ３）で直ちに中和して、構造的損傷及び機能的損傷の少なくともいずれかを防いだ。
【０１２８】
ＣＤ１３８のビオチン化
スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、ＣＤ１３８を標識した。ＮＨＳ−活性化ビオチンは、ｐＨ７〜９の緩衝液中で、リジン残基のような一級アミノ基と効率よく反応して、安定なアミド結合を形成する。
ＣＤ１３８のビオチン化では、５０μＬのＣＤ１３８を、タンパク質脱塩スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて脱塩した。ビオチン化試薬（ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ，Ｐｉｅｒｃｅ）を、最終濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるように氷冷した脱イオン水に溶解させた。捕捉試薬に比べて、１２倍モル過剰であるビオチン化試薬を有する（５０ｐｍｏｌのＣＤ１３８に対して６００ｐｍｏｌのビオチン化試薬）、ビオチン化試薬及び捕捉試薬溶液を混合し、バイアル瓶を穏やかに振盪しながら、室温で１時間インキュベートした。非結合ビオチン化試薬を、タンパク質脱塩カラムを用いて除去した。
【０１２９】
ＣＤ１３８の固定化
ＢＩＡＣＯＲＥ検定で用いるセンサチップ（ＳＥＮＳＯＲ ＣＨＩＰ ＳＡ、ＢＩＡＣＯＲＥ ＡＢ）を、ＢＩＡＣＯＲＥシステムにおける相互作用分析のためにビオチン化分子に結合するよう設計した。表面は、ストレプトアビジンで予め固定化されたカルボキシメチル化デキストランマトリックスから成り、ビオチン化リガンドの高親和性捕捉の準備が整っている。手動注入により、１０μＬ／分の流速を用いて、ＳＥＮＳＯＲ ＣＨＩＰ ＳＡ上で、ｂＣＤ１３８の固定化を実施した。５０ｍＭのＮａＯＨ中の１ＭのＮａＣｌを、３回連続して１分間注入することにより、チップ表面を調整した。次いで、ビオチン化ＣＤ１３８を１分間注入した。
【０１３０】
ＢＩＡＣＯＲＥを用いる異なる抗体のＫＤ−決定
ＢＩＡＣＯＲＥ Ｃのソフトウェアは、異なる実験に対して、ある設計のみを変化させることができる、予め規定されたマスク、いわゆる「ウィザード」を用いる。ＢＩＡＣＯＲＥ Ｃは、元々濃度を測定するために開発されたため、親和性測定を実行するよう設計されたウィザードが存在しない。しかしながら、適切な設定を行えば、「非特異的結合」のためのウィザードを用いて、親和性速度定数を測定することができたため、ＫＤ−決定に用いた。このウィザードでは、ＢＩＡＣＯＲＥランニング緩衝液を用いて「再生（Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）１」を実施することにより、２つのフローセルを測定し、解離相を９０秒に設定した。真の再生に相当する「再生２」を、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）を用いて実施した。この工程後、リガンドＣＤ１３８は、再び結合競合状態になった。全手順の間、ＨＢＳ−ＥＰをランニング及び希釈緩衝液として用いた。様々な抗体（〜１５０ｋＤａ）のＣＤ１３８への結合を決定するために、会合及び解離を様々な濃度（１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ、及び３．１３ｎＭ）で分析した。速度定数ｋａ及びｋｄを計算することにより、解離平衡定数を決定した。その後、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアでｋｄ及びｋａの商を求めることにより、分析物のＫＤ−値を計算した。結果を表４に示す。
【表４】
表４：ｎＢＴ０６２及びＢ−Ｂ４のＫＤ値の比較分析。標準偏差は、平均ＫＤ値について得た。
【０１３１】
考察
各抗体の平均ＫＤ値を、３つの独立な実験から計算した。結果は、全ての実験において、ｎＢＴ０６２が、Ｂ−Ｂ４に比べて僅かに低いＫＤ値を呈することを示す（それぞれ、平均ＫＤ値は１．４ｎＭ及び１．６ｎＭであった）。
【０１３２】
免疫複合体の調製
ｎＢＴ０６２−ＤＭ１及びｈｕＣ２４２−ＤＭ１
チオール含有マイタンシノイドＤＭ１を、Ｃｈａｒｉ（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１（１９９２），１２７）により既に記載されているように、微生物の発酵産物であるアンサマイトシンＰ−３から合成した。ヒト化Ｃ２４２（ｈｕＣ２４２）の調製（（Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，９１（１９９４），９６９）は、既に記載されている。抗体−薬物複合体を、既に記載されているように調製した（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，９３（１９９６），８６１８）。抗体分子１つ当たり、平均３．５個のＤＭ１分子が結合した。
【０１３３】
ｎＢＴ０６２−ＤＭ４
ＢＴ０６２は、ｎＢＴ０６２キメラ化モノクローナル抗体に、リンカーを介して、ジスルフィド結合で結合した、細胞傷害性マイタンシノイド薬であるＤＭ４から構成される、抗体−薬物複合体である。マイタンシノイドは、チューブリン重合及び微小管の組み立てを阻害する有糸分裂阻害剤である（Ｒｅｍｉｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １８９（１９７７），１００２）。ＢＴ０６２（ｎＢＴ０６２−ＤＭ４）の化学的及び模式的表現を図１及び２に示す。
【０１３４】
ＤＭ４の合成
ＤＭ４は、周知の誘導体マイタンシノールから調製される（Ｋｕｐｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．，２１（１９７８），３１）。マイタンシノールは、微生物の発酵産物である、アンサマイトシンＰ３のエステル部分を、リチウムトリメトキシアルミニウム水素化物で還元的に切断することにより調製される（図３参照）。
ＤＭ４は、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）及び塩化亜鉛の存在下で、マイタンシノールを、Ｎ−メチル−Ｎ−（４−メチジチオペンタノイル）−Ｌ−アラニン（ＤＭ４側鎖）でアシル化して、ジスルフィド含有マイタンシノイドＤＭ４−ＳＭｅを得ることにより合成される。ＤＭ４−ＳＭｅは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元されて、所望のチオール含有マイタンシノイドＤＭ４になる（ＤＭ４のプロセスフロー図については図４を参照）。
【０１３５】
免疫複合体ＢＴ０６２
ｎＢＴ０６２−ＤＭ４の調製手順を図５に概説する。ｎＢＴ０６２抗体を、Ｎ−スクシニミジル−４−（２−ピリジルジチオ）ブチラート（ＳＰＤＢリンカー）で修飾して、ジチオピリジル基を導入する。ＤＭ４を、ジチオピリジル基の等量を超える濃度で、修飾された抗体と混合する。ＤＭ４のチオール基と、リンカーを介して抗体に導入されたジチオピリジル基との間のジスルフィド交換反応により、ＢＴ０６２複合体を形成する。クロマトグラフィー及び透析ろ過により精製して、低分子量反応体（ＤＭ４）及び反応産物（チオピリジン）、並びに複合体化抗体の凝集物を除去し、バルク原体を作製する。
【０１３６】
ＦＡＣＳ分析及びＷＳＴ細胞傷害性検定
ＦＡＣＳ分析
ＯＰＭ−２細胞は、ＣＤ１３８を高発現している形質細胞白血病細胞株である。ＯＰＭ−２細胞を、様々な濃度のｎＢＴ０６２、ｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、ｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１、及びｎＢＴ０６２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１のいずれかとともにインキュベートした（図６に示す）。細胞を洗浄し、ＣＤ１３８に結合した抗体及び複合体のいずれかを、ＦＡＣＳ分析において蛍光標識された二次抗体を用いて検出した。これらの実験で測定された平均蛍光を、抗体濃度に対してプロットした。
【０１３７】
細胞生存性アッセイ
ＣＤ１３８＋ＭＯＬＰ−８細胞を、３，０００細胞／ウェルで平底プレートに播種した。ＣＤ１３８−ＢＪＡＢ対照細胞を１，０００細胞／ウェルで播種した。細胞を、様々な濃度のｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、ｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１、及びｎＢＴ０６２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１のいずれか（図７Ａ〜Ｄに示す）で５日間処理した。製造業者の取扱説明書（ＲＯＣＨＥ）に従って、細胞生存性を測定するために、ＷＳＴ試薬（水溶性テトラゾリウム塩、ＲＯＣＨＥ）を添加した。試薬をＭＯＬＰ−８細胞上で７．５時間、及びＢＪＡＢ細胞上で２時間インキュベートした。標準的な手順を用いてマイクロタイターリーダープレートで測定した光学密度に基づいて、生存細胞の割合を計算した。
【０１３８】
考察
ｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、ｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１、ｎＢＴ０６２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、及びｎＢＴ０６２のいずれかの結合をＦＡＣＳにより分析した。標的細胞として、ＣＤ１３８＋ＯＰＭ−２を、ｎＢＴ０６２及び免疫複合体のいずれかとともにインキュベートし、細胞に結合した分子を、蛍光標識された二次抗体を用いて検出した。図６では、細胞に結合した抗体の量の尺度として平均蛍光を、様々な抗体及び複合体のいずれかの濃度に対してプロットした。結果は、ｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、ｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１、及びｎＢＴ０６２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１は、非常に類似する結合特性を示すことを示す。更に、結果は、複合体化していない抗体の結合特性が、複合体化した毒素により影響を受けないことを強く示唆する。
細胞生存性アッセイでは、ＣＤ１３８＋ＭＯＬＰ−８標的細胞、及びＣＤ１３８−ＢＪＡＢ Ｂ−リンパ芽球腫対照細胞に対する抗体の細胞傷害活性を分析した。両方の細胞株を平底プレートに播種し、濃度の上昇する免疫複合体とともにインキュベートした。複合体化していない抗体を対照として用いた。細胞生存性を測定するために、ＷＳＴ試薬を用いることにより、免疫複合体の添加後５日間、細胞傷害活性を分析した。図７Ａ〜Ｃでは、ビヒクル対照で処理した対照細胞に対する生存細胞の割合を、上昇する免疫複合体濃度に対してプロットした。結果は、ＭＯＬＰ−８細胞に対する、ｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、ｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１、及びｎＢＴ０６２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１の細胞傷害活性が非常に類似していることを示す。予想通り、ＣＤ１３８−ＢＪＡＢ対照細胞は、免疫複合体により死滅せず、これは全ての免疫複合体がＣＤ１３８への細胞特異的結合を介して作用することを示す。競合実験では、ＭＯＬＰ−８細胞を、モル過剰な複合体化していないｎＢＴ０６２とともにプレインキュベートした。プレインキュベートにより、ｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の細胞傷害性が実質的に遮断され、これは免疫複合体が細胞表面上のＣＤ１３８への特異的結合を介して細胞を死滅させるという更なるエビデンスを提供する（図７Ｄ）。
【０１３９】
異種移植マウス実験
Ｂ−Ｂ４抗体のヒトキメラバージョンであるｎＢＴ０６２の抗体−マイタンシノイド複合体の抗腫瘍活性に対する、ＣＤ１３８標的の重要性を評価するために、異種移植マウス実験を実施した。ジスルフィド結合の化学的安定性の異なる可能性のある、ｎＢＴ０６２−マイタンシノイド複合体の２つのバージョンを調製した（ｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１及びｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４）。これらの抗体−薬物複合体の抗腫瘍活性を、Ｂ−Ｂ４−ＳＰＰ−ＤＭ１複合体（マウス親抗体を含む）、並びに複合体化していない遊離マイタンシノイド（ＤＭ４）、ネイティブな非修飾ｎＢＴ０６２抗体、及び標的ではない（無関係な）ＩｇＧ１−マイタンシノイド複合体の活性と比較した。重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスにおいて、ヒト多発性骨髄腫のＣＤ１３８陽性異種移植モデル（ＭＯＬＰ−８）で、複合体を評価した。
これらのマウスでは、ＭＯＬＰ−８細胞懸濁液を接種することにより、皮下腫瘍を確立した（雌ＣＢ．１７ ＳＣＩＤマウス）。腫瘍体積が平均１１３ｍｍ３に達したとき、単回ボーラス静脈内注射による処理を実施した。腫瘍体積及び体重の変化を、１週間に２回モニタした。腫瘍細胞の接種後、６８日間に亘って実験を実行した。
【０１４０】
異種移植マウス実験Ａ
マウス
雌ＣＢ．１７ ＳＣＩＤマウス（５週齢）を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。
ヒト腫瘍細胞株
ＭＯＬＰ−８（ヒト多発性骨髄腫細胞株）は、ＡＴＣＣから供給された。ＭＯＬＰ−８細胞（その細胞表面上でＣＤ１３８抗原を発現し、ＳＣＩＤマウスにおいて異種移植腫瘍を発達させる）を、４ｍＭのＬ−グルタミン（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１０％のウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）、及び１％のストレプトマイシン／ペニシリンを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地で、５％のＣＯ２を含む湿気のある大気中にて、３７℃で維持した。
【０１４１】
パートＩ
マウスにおける腫瘍増殖
各マウスの右肩下の領域に、１×１０７個のＭＯＬＰ−８細胞を皮下接種した。総体積はマウス当たり０．２ｍＬであり、ここで血清を含有しない培地の、マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に対する比は１／１（ｖ／ｖ）であった。処理前に、異種移植腫瘍を毎日モニタし、確立を可能にした。腫瘍体積は、腫瘍細胞接種後約１１日で、およそ１１３ｍｍ３に達した。ＣＢ．１７ ＳＣＩＤマウスの腫瘍発現率（ｔａｋｅ ｒａｔｅ）は１００％であった。
腫瘍細胞接種の１１日後、４２匹のマウスを腫瘍体積及び体重に基づいて選択した。腫瘍体積は、６８．２ｍｍ３〜１３５．９ｍｍ３の範囲であった。４２匹のマウスを、それぞれ腫瘍体積に基づいて、無作為に６匹の動物の７群（Ａ〜Ｇ）に分けた。
Ａ群の６匹のマウスにはそれぞれ、ビヒクル対照として２００μＬのＰＢＳを投与した。Ｂ群のマウスにはそれぞれ、１３．８ｍｇ／ｋｇのｎＢＴ０６２のネイキッド（ｎａｋｅｄ）抗体を投与した。この用量は、２５０μｇ／ｋｇのマイタンシノイドが結合した抗体中のｎＢＴ０６２抗体成分の量に相当する。複合体分子中のマイタンシノイドのｎＢＴ０６２抗体に対する分子量の比は、約１／５５である。Ｃ群のマウスにはそれぞれ、２５０μｇ／ｋｇのＤＭ４を投与した。Ｄ群のマウスにはそれぞれ、２５０μｇ／ｋｇのｈｕＣ２４２−ＤＭ４を投与した。Ｅ、Ｆ、及びＧ群のマウスには、それぞれ、２５０μｇ／ｋｇのｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、Ｂ−Ｂ４−ＳＰＰ−ＤＭ１、及びｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１を投与した。
２７ゲージの、１／２インチの針を備える１ｍＬの注射器を用いて、外側尾静脈を通して、単回ボーラス注射として、全ての薬剤を静脈内投与した。投与前に、ｎＢＴ０６２抗体、ｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、及びｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１の原液を、滅菌ＰＢＳで、それぞれ２ｍｇ／ｍＬ、２８．１μｇ／ｍＬ、及び２８．１μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、その結果各マウスに注射された体積は１２０〜２２０μＬであった。
【０１４２】
パートＩＩ
第２の実験セットでは、血清を含有しない培地及びマトリゲルの５０：５０混合物に懸濁したＭＯＬＰ−８細胞（マウス当たり１．５×１０７細胞）を、右肩下の領域に１００μＬ皮下注射した。腫瘍体積は、細胞接種後１１日目に約８０ｍｍ３に達し、対照の平均は２５日目で約７５０ｍｍ３であった。腫瘍の倍加時間は、４．５８日であると推定された。対照群の各マウス（ｎ＝６）には、０．２ｍＬの滅菌ＰＢＳを、ボーラス注射で外側尾静脈に投与した（ｉ．ｖ．）。全ての処理用量は、複合体化マイタンシノイドに基づいた。それぞれ、４５０μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、及び１００μｇ／ｋｇの用量で、ｎＢＴ０６２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、及びｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１のいずれかを単回静脈内注射することにより、９群（ｎ＝６）を処理した。追加群（ｎ＝６）には、反復投与（週１回５週間）で２５０μｇ／ｋｇのｎＢＴ０６２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１を投与した。ＬａｂＣａｔプログラムを用いて、腫瘍体積により、マウスを１１群（ｎ＝６）に無作為に分けた。腫瘍体積は、４０．０ｍｍ３〜１５２．５ｍｍ３の範囲であった。マウスには、個体の体重に基づいて投薬した。
腫瘍の大きさを、ＬａｂＣａｔシステム（Ｔｕｍｏｒ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ｔｒａｃｋｉｎｇ，Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，Ｉｎｃ．，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）を用いて、３次元で１週間に２回測定した。腫瘍体積（ｍｍ３）を、Ｔｏｍａｙｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２４（１９８９），１４８に記載の方法を用いて計算した：
体積＝長さ×幅×高さ×１／２
Ｌｏｇ１０細胞死滅（ｃｅｌｌ ｋｉｌｌ）を、Ｂｉｓｓｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５１（１９９１），４８４５に記載の式を用いて計算した：
Ｌｏｇ１０細胞死滅＝（Ｔ−Ｃ）／Ｔｄ×３．３２
式中、（Ｔ−Ｃ）、即ち腫瘍増殖遅延は、処理群（Ｔ）及び対照群（Ｃ）の腫瘍が、所定の大きさ（６００ｍｍ３）に達するのに必要な日数の中央時間である。Ｔｄは、対照マウスの中央腫瘍体積に基づいた、腫瘍倍加時間であり、３．３２は、細胞増殖の対数当たりの細胞倍加数である。
【０１４３】
結果
個々のマウスにおける腫瘍増殖を図８Ａ〜９Ｄに示す。各群の平均（＋／−ＳＤ）腫瘍増殖を図１０に示す。
ＰＢＳ処理した動物における腫瘍増殖と比べて、ｎＢＴ０６２抗体、複合体化していない遊離ＤＭ４、及び無関係の非標的複合体ｈｕＣ２４２−ＤＭ４のいずれかによる処理は、腫瘍増殖をそれ程阻害しなかった。
２５０μｇ／ｋｇの用量では、３つ全てのＣＤ１３８標的複合体、ｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、Ｂ−Ｂ４−ＳＰＰ−ＤＭ１、及びｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１が、腫瘍増殖の著しい遅延を引き起こした。処理群で測定した平均腫瘍体積に基づくと、ＤＭ４複合体ｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の活性が最も高く、一方ｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１は、そのマウス相当物Ｂ−Ｂ４−ＳＰＰ−ＤＭ１に比べて、僅かに高い活性を示した（図１０）。加えて、個々のマウスで得られた結果は、Ｂ−Ｂ４−ＳＰＰ−ＤＭ１で得られた抗腫瘍活性がより不均一であり、それ故ｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１で処理したマウスにおける測定値より予測が難しい。抗腫瘍活性の均一性の観点では、標的抗体としてｎＢＴ０６２を用いる他の複合体、ｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４はｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１に類似した挙動を示した。
いずれの処理群でも体重減少は見られず、これは処理が耐容性良好であったことを示唆する。
【０１４４】
考察
実験動物における３種のＣＤ１３８標的複合体の分析結果は、抗腫瘍活性にいとって、標的送達が重要であることを示す。ヒトキメラｎＢＴ０６２及びマウスＢ−Ｂ４抗体のマイタンシノイド複合体は、対数細胞死滅により測定したとき、非常に高い活性を示すが、複合体化していないＤＭ４、修飾されていないネイティブなｈｕＢＴ０６２抗体、及び非標的対照複合体（ｈｕＣ２４２−ＤＭ４）のいずれかによる処理は、腫瘍増殖に対してそれ程影響を与えなかった。
ヒトキメラ抗体から調製した免疫複合体、ｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１は、そのマウス相当物から調製した複合体、Ｂ−Ｂ４−ＳＰＰ−ＤＭ１より（ｔｈｅｎ）、僅かに高い抗腫瘍活性をもたらした。加えて、ｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１及びｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４で処理することにより、Ｂ−Ｂ４−ＳＰＰ−ＤＭ１による処理と比べて、個々のマウスにおいてより均一な反応が得られた。Ｂ−Ｂ４−ＳＰＰ−ＤＭ１の高結合変異は、接種後の経時的な（日）、ＣＢ．１７ ＳＣＩＤマウスにおけるＭＯＬＰ−８ヒト多発性骨髄腫異種移植片の中央腫瘍体積（＋／−ＳＤ）が、実際に、ｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１よりも、Ｂ−Ｂ４−ＳＰＰ−ＤＭ１について、比較的良好な結果をもたらしたことを説明した（データは示さず）。標的抗体としてｎＢＴ０６２を用いる免疫複合体のこの特徴は、特に複合体の治療的用途に有益であると思われる。
最後に、ＳＣＩＤマウスのＭＯＬＰ−８異種移植モデルにおいて単回ｉｖ投与した後、最も強力なマイタンシノイド複合体はｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４であった。
【０１４５】
異種移植マウス実験Ｂ
この実験セットでは、８５匹のマウスの右肩にＭＯＬＰ−８細胞（１．５×１０７細胞／マウス）を皮下接種した。腫瘍発現率は１００％であった。平均腫瘍体積が約８０ｍｍ３である、嵩高いＭＯＬＰ−８腫瘍を有する６６匹のＳＣＩＤマウスを、１１の処理群（ｎ＝６）に無作為に分けた。マウスを、３種の複合体（ｎＢＴ０６２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、ｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４、及びｎＢＴ０６２−ＳＰＰ−ＤＭ１のいずれか）のうち１種の単回用量で処理した。追加群には、週用量のｎＢＴ０６２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１を５回投与し、対照群には単回用量のＰＢＳを投与した。平均腫瘍体積を図１１Ａに示す。各複合体について、用量反応が確立された。ＰＢＳ処理した動物では、２５日目に中央腫瘍体積が７５０ｍｍ３に達した。対照腫瘍増殖の対数線形プロット上において最も適合した線形回帰曲線適合により決定された腫瘍倍加時間は、４．５８日であった。４５０μｇ／ｋｇのｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４で処理した動物が、最高の対数細胞死滅（ＬＣＫ＝２．８９）を有し、続いて、２５０μｇ／ｋｇの週用量のｎＢＴ０６２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１で処理した動物（ＬＣＫ＝２．１；表５を参照）であった。ダネットの多重比較試験を実施してＡＮＯＶＡを反復測定することによる、処理群の平均腫瘍体積曲線の比較は、ＰＢＳ対照群と、４５０μｇ／ｋｇのｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４（ｐ＜０．０１）、２５０μｇ／ｋｇのｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４（ｐ＜０．０５）、及び２５０μｇ／ｋｇの週用量５回のｎＢＴ０６２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１（ｐ＜０．０５）との間に有意な差を示した。接種後８５日目までに腫瘍が部分的に縮小した、４５０μｇ／ｋｇのｎＢＴ０６２−ＳＰＤＢ−ＤＭ４を投与した動物を除いて、いずれの処理群でも、部分的腫瘍縮小及び完全な腫瘍縮小のいずれも生じなかった。
【０１４６】
表５は、様々な投薬スキームにおける、様々なｎＢＴ０６２−ＤＭｘ複合体の抗腫瘍活性尺度としての対数細胞死滅（ＬＣＫ）値である。ＬＣＫ値の計算に関する情報については、材料及び方法の部分を参照。
【表５】
【０１４７】
参考文献
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Ｂａｔａｉｌｌｅ Ｒ， Ｊｅｇｏ Ｇ， Ｒｏｂｉｌｌａｒｄ Ｎ， Ｂａｒｉｌｌｅ−Ｎｉｏｎ Ｓ， Ｈａｒｏｕｓｓｅａｕ ＪＬ， Ｍｏｒｅａｕ Ｐ， Ａｍｉｏｔ Ｍ， Ｐｅｌｌａｔ−Ｄｅｃｅｕｎｙｎｃｋ Ｃ． Ｔｈｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ， ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌｓ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ “ｍａｎｙ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａｓ“ ａｎｄ ｏｆ ｎｅｗ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ ｍｙｅｌｏｍａ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ． ２００６ Ｓｅｐ；９１（９）：１２３４−４０． Ｒｅｖｉｅｗ．
Ｂｅｒｎｆｉｅｌｄ Ｍ， Ｋｏｋｅｎｙｅｓｉ Ｒ， Ｋａｔｏ Ｍ， Ｈｉｎｋｅｓ ＭＴ， Ｓｐｒｉｎｇ Ｊ， Ｇａｌｌｏ ＲＬ， Ｌｏｓｅ ＥＪ． Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｙｎｄｅｃａｎｓ： ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １９９２；８：３６５−３９３．
Ｂｅｓｔｅ Ｇ， Ｓｃｈｍｉｄｔ ＦＳ， Ｓｔｉｂｏｒａ Ｔ， Ｓｋｅｒｒａ Ａ． Ｓｍａｌｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｐｒｅｓｃｒｉｂｅｄ ｌｉｇａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ ｆｏｌｄ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． １９９９： ９６， １８９８−１９０３．
Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ Ｂ， Ｗｏｌｆｆ Ｊ． Ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｔｕｂｕｌｉｎ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． １９７７；７５：１５９−１６２．
Ｂｉｓｐｉｎｇ Ｇ， Ｋｒｏｐｆｆ Ｍ， Ｗｅｎｎｉｎｇ Ｄ， Ｄｒｅｙｅｒ Ｂ， Ｂｅｓｓｏｎｏｖ Ｓ， Ｈｉｌｂｅｒｇ Ｆ， Ｒｏｔｈ ＧＪ， Ｍｕｎｚｅｒｔ Ｇ， Ｓｔｅｆａｎｉｃ Ｍ， Ｓｔｅｌｌｊｅｓ Ｍ， Ｓｃｈｅｆｆｏｌｄ Ｃ， Ｍｕｌｌｅｒ−Ｔｉｄｏｗ Ｃ， Ｌｉｅｂｉｓｃｈ Ｐ， Ｌａｎｇ Ｎ， Ｔｃｈｉｎｄａ Ｊ， Ｓｅｒｖｅ ＨＬ， Ｍｅｓｔｅｒｓ ＲＭ， Ｂｅｒｄｅｌ ＷＥ， Ｋｉｅｎａｓｔ Ｊ． Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｉｎａｓｅｓ ｂｙ ａ ｎｏｖｅｌ ｉｎｄｏｌｉｎｏｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ： ａｂｒｏｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｏｍａ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ． Ｂｌｏｏｄ． ２００６ Ｍａｒ １；１０７（５）：２０７９−８９． Ｅｐｕｂ ２００５ Ｎｏｖ ８．
Ｂｌａｅｔｔｌｅｒ ＷＡ ａｎｄ Ｃｈａｒｉ ＲＶＪ． Ｄｒｕｇｓ ｔｏ Ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｓ Ｔｕｍｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ． Ｉｎ： Ｏｊｉｍａ， Ｉ．， Ｖｉｔｅ， Ｇ．Ｄ． ａｎｄ Ａｌｔｍａｎｎ， Ｋ．−Ｈ．， Ｅｄｉｔｏｒｓ， ２００１． Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔｓ−Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ， ｐｐ． ３１７−３３８．
Ｂｒｏｓｓ ＰＦ， Ｂｅｉｔｚ Ｊ， Ｃｈｅｎ Ｇ， Ｃｈｅｎ ＸＨ， Ｄｕｆｆｙ Ｅ， Ｋｉｅｆｆｅｒ Ｌ， Ｒｏｙ Ｓ， Ｓｒｉｄｈａｒａ Ｒ， Ｒａｈｍａｎ Ａ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｇ， Ｐａｚｄｕｒ Ｒ． Ａｐｐｒｏｖａｌ ｓｕｍｍａｒｙ： ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ ｉｎ ｒｅｌａｐｓｅｄ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００１；７：１４９０−１４９６．
Ｃａｒｂｏｎｅ Ａ， Ｇａｉｄａｎｏ Ｇ， Ｇｌｏｇｈｉｎｉ Ａ， Ｆｅｒｌｉｔｏ Ａ， Ｒｉｎａｌｄｏ Ａ， Ｓｔｅｉｎ Ｈ． ＡＩＤＳ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｌａｓｍａ− ｂｌａｓｔｉｃ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒａｌ ｃａｖｉｔｙ ａｎｄ ｊａｗｓ： ａ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｄｉｌｅｍｍａ．Ａｎｎ． Ｏｔｏｌ． Ｒｈｉｎｏｌ． Ｌａｒｙｎｇｏｌ． １９９９； １０８： ９５−９９．
Ｃａｒｌｓｓｏｎ Ｊ， Ｄｒｅｖｉｎ Ｈ， Ａｘｅｎ Ｒ． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈｉｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ． Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ， ａ ｎｅｗ ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅａｇｅｎｔ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ １９７８； １７３： ７２３−７３７．
Ｃａｒｔｅｒ Ｐ． Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ． ２００１；１：１１８−１２９．
Ｃｈａｒｉ ＲＶ， Ｍａｒｔｅｌｌ ＢＡ， Ｇｒｏｓｓ ＪＬ， Ｃｏｏｋ ＳＢ， Ｓｈａｈ ＳＡ， Ｂｌａｔｔｌｅｒ ＷＡ， ＭｃＫｅｎｚｉｅ ＳＪ， Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒ ＶＳ． Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｎｏｖｅｌ ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ： ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９２；５２：１２７−１３１．
Ｃｈａｒｉ ＲＶ， Ｊａｃｋｅｌ ＫＡ， Ｂｏｕｒｒｅｔ ＬＡ， Ｄｅｒｒ ＳＭ， Ｔａｄａｙｏｎｉ ＢＭ， Ｍａｔｔｏｃｋｓ ＫＭ， Ｓｈａｈ ＳＡ， Ｌｉｕ Ｃ， Ｂｌａｅｔｔｌｅｒ ＷＡ ａｎｄ Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒ ＶＳ． Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａ ＣＣ−１０６５ ａｎａｌｏｇｕｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９５； ５５： ４０７９−４０８４．
Ｃｈａｒｎａｕｘ Ｎ， Ｂｒｕｌｅ Ｓ， Ｃｈａｉｇｎｅａｕ Ｔ， Ｓａｆｆａｒ Ｌ， Ｓｕｔｔｏｎ Ａ， Ｈａｍｏｎ Ｍ， Ｐｒｏｓｔ Ｃ， Ｌｉｅｖｒｅ Ｎ， Ｖｉｔａ Ｃ， Ｇａｔｔｅｇｎｏ Ｌ． ＲＡＮＴＥＳ （ＣＣＬ５） ｉｎｄｕｃｅｓ ａ ＣＣＲ５−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｓｈｅｄｄｉｎｇ ｏｆ ｓｙｎｄｅｃａｎ−１ （ＣＤ１３８） ａｎｄ ｓｙｎｄｅｃａｎ−４ ｆｒｏｍ ＨｅＬａ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｆｏｒｍｓ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｈｅｄ ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ＣＤ４４． Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ． ２００４ Ｓｅｐ ８ ［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］
Ｃｈｅｎ ＢＰ， Ｇａｌｙ Ａ， Ｋｙｏｉｚｕｍｉ Ｓ， Ｎａｍｉｋａｗａ Ｒ， Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ Ｊ， Ｗｅｂｂ Ｓ， Ｆｏｒｄ Ｂ， Ｃｅｎ ＤＺ， Ｃｈｅｎ ＳＣ． Ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎ ＳＣＩＤ−ｈｕ ｍｉｃｅ． Ｂｌｏｏｄ． １９９４；８４：２４９７−２５０５．
Ｃｈｉｌｏｓｉ Ｍ， Ａｄａｍｉ Ｆ， Ｌｅｓｔａｎｉ Ｍ， Ｍｏｎｔａｇｎａ Ｌ， Ｃｉｍａｒｏｓｔｏ Ｌ， Ｓｅｍｅｎｚａｔｏ Ｇ， Ｐｉｚｚｏｌｏ Ｇ， Ｍｅｎｅｓｔｒｉｎａ Ｆ． ＣＤ１３８／ｓｙｎｄｅｃａｎ−１： ａ ｕｓｅｆｕｌ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌｓ ｏｎ ｒｏｕｔｉｎｅ ｔｒｅｐｈｉｎｅ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｂｉｏｐｓｉｅｓ． Ｍｏｄ Ｐａｔｈｏｌ． １９９９；１２：１１０１−１１０６．
Ｃｌｅｍｅｎｔ Ｃ， Ｖｏｏｉｊｓ， Ｗ．Ｃ．， Ｋｌｅｉｎ， Ｂ．， ａｎｄ Ｗｉｊｄｅｎｅｓ， Ｊ． Ｉｎ： ａｌ． ＳＦＳｅ， ｅｄ． Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ Ｖ． Ｏｘｆｏｒｄ： Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ； １９９５：７１４−７１５．
Ｃｏｕｔｕｒｉｅｒ Ｏ， Ｆａｉｖｒｅ−Ｃｈａｕｖｅｔ Ａ ； Ｆｉｌｉｐｐｏｖｉｃｈ ＩＶ； Ｔｈｅｄｒｅｚ Ｐ， Ｓａｉｅ−Ｍａｕｒｅｌ Ｃ； Ｂａｒｄｉｅｓ Ｍ； Ｍｉｓｈｒａ ＡＫ； Ｇａｕｖｒｉｔ Ｍ； Ｂｌａｉｎ Ｇ；Ａｐｏｓｔｏｌｉｄｉｓ Ｃ； Ｍｏｌｉｎｅｔ Ｒ； Ａｂｂｅ ＪＣ； Ｂａｔｅｉｌｌｅ Ｒ； Ｗｉｊｄｅｎｅｓ Ｊ； Ｃｈａｔａｌ ＪＦ； Ｃｈｅｒｅｌ Ｍ； Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ２１３Ｂｉ−ａｌｐｈａ ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５（１０ Ｓｕｐｐｌ．） （Ｏｃｔ １９９９） ３１６５ｓ−３１７０ｓ．
Ｄａｖｉｅｓ ＥＪ ｅｔ ａｌ． ， Ｂｌａｃｋｈａｌｌ ＦＨ， Ｓｈａｎｋｓ ＪＨ， Ｄａｖｉｄ Ｇ， ＭｃＧｏｗｎ ＡＴ， Ｓｗｉｎｄｅｌｌ Ｒ， Ｓｌａｄｅ ＲＪ， Ｍａｒｔｉｎ−Ｈｉｒｓｃｈ Ｐ， Ｇａｌｌａｇｈｅｒ ＪＴ， Ｊａｙｓｏｎ ＧＣ． Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ Ｈｅｐａｒａｎ Ｓｕｌｆａｔｅ Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ ｉｎ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００４； １０（１５）：５１７８−８６．
Ｄｈｏｄａｐｋａｒ ＭＶ， Ａｂｅ Ｅ， Ｔｈｅｕｓ Ａ， Ｌａｃｙ Ｍ， Ｌａｎｇｆｏｒｄ ＪＫ， Ｂａｒｌｏｇｉｅ Ｂ， Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ ＲＤ． Ｓｙｎｄｅｃａｎ−１ ｉｓ ａ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｍｙｅｌｏｍａ ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ： ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ， ｇｒｏｗｔｈ， ａｎｄ ｂｏｎｅ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ． Ｂｌｏｏｄ． １９９８；９１：２６７９−２６８８．
Ｄｏｒｅ ＪＭ， Ｍｏｒａｒｄ Ｆ， Ｖｉｔａ Ｎ， Ｗｉｊｄｅｎｅｓ Ｊ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｎ ｓｙｎｄｅｃａｎ−１ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｆ Ｂ−Ｂ２ ａｎｄ Ｂ−Ｂ４ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． １９９８；４２６：６７−７０．
Ｄｏｗｅｌｌ ＪＡ， Ｋｏｒｔｈ−Ｂｒａｄｌｅｙ Ｊ， Ｌｉｕ Ｈ， Ｋｉｎｇ ＳＰ， Ｂｅｒｇｅｒ ＭＳ． Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ， ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎ ｆｉｒｓｔ ｒｅｌａｐｓｅ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２００１；４１：１２０６−１２１４．
Ｅｄｉｎｇｅｒ Ｍ， Ｓｗｅｅｎｅｙ ＴＪ， Ｔｕｃｋｅｒ ＡＡ， Ｏｌｏｍｕ ＡＢ， Ｎｅｇｒｉｎ ＲＳ， Ｃｏｎｔａｇ ＣＨ． Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ． Ｎｅｏｐｌａｓｉａ． １９９９；１：３０３−３１０．
Ｇａｔｔｅｉ Ｖ， Ｇｏｄｅａｓ Ｃ， Ｄｅｇａｎ Ｍ， Ｒｏｓｓｉ ＦＭ， Ａｌｄｉｎｕｃｃｉ Ｄ， Ｐｉｎｔｏ Ａ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉ−ＣＤ１３８ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｆ ｓｙｎｄｅｃａｎ−１ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｃｅｌｌｓ． Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ． １９９９；１０４：１５２−１６２．
Ｈａｍａｎｎ ＰＲ， Ｈｉｎｍａｎ ＬＭ， Ｂｅｙｅｒ ＣＦ， Ｌｉｎｄｈ Ｄ， Ｕｐｅｓｌａｃｉｓ Ｊ， Ｆｌｏｗｅｒｓ ＤＡ， Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ Ｉ． Ａｎ ａｎｔｉ−ＣＤ３３ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ． Ｃｈｏｉｃｅ ｏｆ ｌｉｎｋｅｒ． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ． ２００２；１３：４０−４６．
Ｈａｎ Ｉ， Ｐａｒｋ Ｈ， Ｏｈ ＥＳ． Ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｓｙｎｄｅｃａｎ−２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｍｏｕｒｉｇｅｎｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｍｏｌ Ｈｉｓｔｏｌ． ２００４： ３５（３）：３１９−２６．
Ｈｏｒｖａｔｈｏｖａ Ｍ， Ｇａｉｌｌａｒｄ， Ｊ．−Ｐ．， Ｌｉｕｔａｒｄ， Ｊ．， Ｄｕｐｅｒｒａｙ， Ｃ．， Ｌａｖａｂｒｅ−Ｂｅｒｔｒａｎｄ， Ｔ．， Ｂｏｕｒｑｕａｒｄ， Ｐ ｅｔ ａｌ． Ｉｎ： ａｌ． ＳＦＳｅ， ｅｄ． Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ Ｔｙｐｉｎｇ Ｖ． Ｏｘｆｏｒｄ： Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ； １９９５：７１３−７１４．
Ｋｒｅｂｓ Ｂ， Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ Ｒ， Ｒｅｉｆｆｅｒｔ Ｓ， Ｒｏｔｈｅ Ｃ， Ｔｅｓａｒ Ｍ， Ｔｈｏｍａｓｓｅｎ Ｅ， Ｃａｏ Ｍ， Ｄｒｅｉｅｒ Ｔ， Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｄ， Ｈｏｓｓ Ａ ｅｔ ａｌ． Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． ２００１． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５４， ｐｐ． ６７−８４．
Ｋｕｐｃｈａｎ ＳＭ， Ｓｎｅｄｅｎ ＡＴ， Ｂｒａｎｆｍａｎ ＡＲ， Ｈｏｗｉｅ ＧＡ， Ｒｅｂｈｕｎ ＬＩ， ＭｃＩｖｏｒ ＷＥ， Ｗａｎｇ ＲＷ， Ｓｃｈｎａｉｔｍａｎ ＴＣ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ａｎｔｉｌｅｕｋｅｍｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ． Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． １９７８；２１：３１−３７．
Ｋｙｏｉｚｕｍｉ Ｓ， Ｂａｕｍ ＣＭ， Ｋａｎｅｓｈｉｍａ Ｈ， ＭｃＣｕｎｅ ＪＭ， Ｙｅｅ ＥＪ， Ｎａｍｉｋａｗａ Ｒ． Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｉｎ ＳＣＩＤ−ｈｕ ｍｉｃｅ． Ｂｌｏｏｄ． １９９２；７９：１７０４−１７１１．
Ｋｙｏｉｚｕｍｉ Ｓ， Ｍｕｒｒａｙ ＬＪ， Ｎａｍｉｋａｗａ Ｒ． Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｔｈｅ ＳＣＩＤ−ｈｕ ｍｏｕｓｅ． Ｂｌｏｏｄ． １９９３；８１：１４７９−１４８８．
Ｌａｎｇｆｏｒｄ ＪＫ， Ｓｔａｎｌｅｙ ＭＪ， Ｃａｏ Ｄ， Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ ＲＤ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｃｈａｉｎｓ ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍａｌ ｓｙｎｄｅｃａｎ−１ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． １９９８ Ｎｏｖ ６；２７３（４５）：２９９６５−７１．
Ｌｉｕ Ｃ， Ｔａｄａｙｏｎｉ ＢＭ， Ｂｏｕｒｒｅｔ ＬＡ， Ｍａｔｔｏｃｋｓ ＫＭ， Ｄｅｒｒ ＳＭ， Ｗｉｄｄｉｓｏｎ ＷＣ， Ｋｅｄｅｒｓｈａ ＮＬ， Ａｒｉｎｉｅｌｌｏ ＰＤ， Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒ ＶＳ， Ｌａｍｂｅｒｔ ＪＭ， Ｂｌａｔｔｌｅｒ ＷＡ， Ｃｈａｒｉ ＲＶ． Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｃｏｌｏｎ ｔｕｍｏｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９６；９３：８６１８−８６２３．
ＭｃＣｕｎｅ ＪＭ， Ｎａｍｉｋａｗａ Ｒ， Ｋａｎｅｓｈｉｍａ Ｈ， Ｓｈｕｌｔｚ ＬＤ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ Ｍ， Ｗｅｉｓｓｍａｎ ＩＬ． Ｔｈｅ ＳＣＩＤ−ｈｕ ｍｏｕｓｅ： ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｍａｔｏｌｙｍｐｈｏｉｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９８８；２４１：１６３２−１６３９．
Ｍｅｎｎｅｒｉｃｈ Ｄ， Ｖｏｇｅｌ Ａ， Ｋｌａｍａｎ Ｉ， Ｄａｈｌ Ｅ， Ｌｉｃｈｔｎｅｒ ＲＢ， Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ Ａ， Ｐｏｈｌｅｎｚ ＨＤ， Ｔｈｉｅｒａｕｃｈ ＫＨ， Ｓｏｍｍｅｒ Ａ． Ｓｈｉｆｔ ｏｆ ｓｙｎｄｅｃａｎ−１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｒｏｍ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｔｏ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｄｕｒｉｎｇ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｕｒｓ． Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ． ２００４ Ｊｕｎ； ４０（９）：１３７３−８２．
Ｍｏｓｍａｎｎ Ｔ． Ｒａｐｉｄ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ： ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ． １９８３；６５：５５−６３．
Ｎａｍｉｋａｗａ Ｒ， Ｕｅｄａ Ｒ， Ｋｙｏｉｚｕｍｉ Ｓ． Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｍａｒｒｏｗ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｏｆ ＳＣＩＤ−ｈｕ ｍｉｃｅ． Ｂｌｏｏｄ． １９９３；８２：２５２６−２５３６．
Ｏ‘Ｃｏｎｎｅｌｌ ＦＰ， Ｐｉｎｋｕｓ ＪＬ， Ｐｉｎｋｕｓ ＧＳ． ＣＤ１３８ （Ｓｙｎｄｅｃａｎ−１）， ａ Ｐｌａｓｍａ Ｃｅｌｌ Ｍａｒｋｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｆｉｌｅ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ａｎｄ Ｎｏｎｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｎｅｏｐｌａｓｍｓ． Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ ２００４； １２１：２５４−２６３．
Ｏｊｉｍａ Ｉ， Ｇｅｎｇ Ｘ， Ｗｕ Ｘ， Ｑｕ Ｃ， Ｂｏｒｅｌｌａ ＣＰ， Ｘｉｅ Ｈ， Ｗｉｌｈｅｌｍ ＳＤ， Ｌｅｅｃｅ ＢＡ， Ｂａｒｔｌｅ ＬＭ， Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒ ＶＳ ａｎｄ Ｃｈａｒｉ ＲＶ． Ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｏｖｅｌ ｔａｘｏｉｄ−ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ． ２００２． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４５， ｐｐ． ５６２０−５６２３．
Ｏｌａｆｓｅｎ，Ｔ， Ｃｈｅｕｎｇ， ＣＣ， Ｙａｚａｋｉ， ＰＪ， Ｌｉ Ｌ， Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎ Ｇ， Ｇａｍｂｈｉｒ ＳＳ， Ｓｈｅｒｍａｎ， ＭＡ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ， ＬＥ， Ｓｈｉｖｅｌｙ， ＪＥ， Ｒａｕｂｉｔｓｃｈｅｋ， ＡＡ， ａｎｄ Ｗｕ， ＡＭ． Ｃｏｖａｌｅｎｔ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｌｉｎｋｅｄ ａｎｔｉ−ＣＥＡ ｄｉａｂｏｄｙ ａｌｌｏｗｓ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｉｎｇ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． ２００４； Ｐｒｏｔ． Ｅｎｇ． Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ １７：１： ２１−２７．
Ｏｒｏｓｚ Ｚ， Ｋｏｐｐｅｒ Ｌ． Ｓｙｎｄｅｃａｎ−１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｏｆｔ ｔｉｓｓｕｅ ｔｕｍｏｕｒｓ． Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００１： ２１（１Ｂ）：７３３−７．
Ｐａｄｌａｎ， ＥＡ． Ａ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｗｈｉｌｅ ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ ｔｈｅｉｒ ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ． Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９１； ２８： ４８９−４９８．
Ｐａｙｎｅ Ｇ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ． ２００３；３：２０７−２１２．
Ｐｅｇｒａｍ ＭＤ， Ｌｉｐｔｏｎ Ａ， Ｈａｙｅｓ ＤＦ， Ｗｅｂｅｒ ＢＬ， Ｂａｓｅｌｇａ ＪＭ， Ｔｒｉｐａｔｈｙ Ｄ， Ｂａｌｙ Ｄ， Ｂａｕｇｈｍａｎ ＳＡ， Ｔｗａｄｄｅｌｌ Ｔ， Ｇｌａｓｐｙ ＪＡ ａｎｄ Ｓｌａｍｏｎ ＤＪ． Ｐｈａｓｅ ＩＩ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉ−ｐ１８５ＨＥＲ２／ｎｅｕ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｌｕｓ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｔｏ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ． １９９８． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １６， ｐｐ． ２６５９−２６７１．
Ｒａｗｓｔｒｏｎ ＡＣ， Ｏｗｅｎ ＲＧ， Ｄａｖｉｅｓ ＦＥ， Ｊｏｈｎｓｏｎ ＲＪ， Ｊｏｎｅｓ ＲＡ， Ｒｉｃｈａｒｄｓ ＳＪ， Ｅｖａｎｓ ＰＡ， Ｃｈｉｌｄ ＪＡ， Ｓｍｉｔｈ ＧＭ， Ｊａｃｋ ＡＳ， Ｍｏｒｇａｎ ＧＪ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ： ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｔａｇｅ． Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ． １９９７；９７：４６−５５．
Ｒｅｍｉｌｌａｒｄ Ｓ， Ｒｅｂｈｕｎ ＬＩ， Ｈｏｗｉｅ ＧＡ， Ｋｕｐｃｈａｎ ＳＭ． Ａｎｔｉｍｉｔｏｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔ ｔｕｍｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９７５；１８９：１００２−１００５．
Ｒｏｇｕｓｋａ ＭＡ， Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ＪＴ， Ｋｅｄｄｙ ＣＡ， Ｈｅｎｒｙ ＡＨ， Ｓｅａｒｌｅ ＳＪ， Ｌａｍｂｅｒｔ ＪＭ， Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒ ＶＳ， Ｂｌａｔｔｌｅｒ ＷＡ， Ｒｅｅｓ ＡＲ， Ｇｕｉｌｄ ＢＣ． Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９４；９１：９６９−９７３．
Ｒｏｓｓ Ｓ， Ｓｐｅｎｃｅｒ ＳＤ， Ｈｏｌｃｏｍｂ Ｉ ， Ｔａｎ Ｃ， Ｈｏｎｇｏ Ｊ， Ｄｅｖａｕｘ Ｂ， Ｒａｎｇｅｌｌ Ｌ， Ｋｅｌｌｅｒ ＧＡ， Ｓｃｈｏｗ Ｐ， Ｓｔｅｅｖｅｓ ＲＭ， Ｌｕｔｚ ＲＪ， Ｆｒａｎｔｚ Ｇ， Ｈｉｌｌａｎ Ｋ， Ｐｅａｌｅ Ｆ， Ｔｏｂｉｎ Ｐ， Ｅｂｅｒｈａｒｄ Ｄ， Ｒｕｂｉｎ ＭＡ， Ｌａｓｋｙ ＬＡ， Ｋｏｅｐｐｅｎ Ｈ． Ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ａｓ ｔｈｅｒａｐｙ ｔａｒｇｅｔ： ｔｉｓｓｕｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａｎ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００２ Ｍａｙ １；６２（９）：２５４６−５３．
Ｒｏｓｓ ＪＳ， Ｇｒａｙ Ｋ， Ｇｒａｙ Ｇ， Ｗｏｒｌａｎｄ ＰＪ， Ｒｏｌｆｅ Ｍ． Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈ． （４／１７／２００３）．
Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ ＲＤ， Ｌａｌｏｒ Ｐ， Ｂｅｒｎｆｉｅｌｄ Ｍ． Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓ ａｎｄ ｌｏｓｅ ｓｙｎｄｅｃａｎ ａｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｔａｇｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｇｕｌ． １９８９；１：２７−３５．
Ｓａｎｄｈｕ ＪＳ， Ｃｌａｒｋ ＢＲ， Ｂｏｙｎｔｏｎ ＥＬ， Ａｔｋｉｎｓ Ｈ， Ｍｅｓｓｎｅｒ Ｈ， Ｋｅａｔｉｎｇ Ａ， Ｈｏｚｕｍｉ Ｎ． Ｈｕｍａｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ｉｎ ＳＣＩＤ ｍｉｃｅ ｉｍｐｌａｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ａｄｕｌｔ ｃａｎｃｅｌｌｏｕｓ ｂｏｎｅ． Ｂｌｏｏｄ． １９９６；８８：１９７３−１９８２．
Ｓａｓａｋｉ Ａ， Ｂｏｙｃｅ ＢＦ， Ｓｔｏｒｙ Ｂ， Ｗｒｉｇｈｔ ＫＲ， Ｃｈａｐｍａｎ Ｍ， Ｂｏｙｃｅ Ｒ， Ｍｕｎｄｙ ＧＲ， Ｙｏｎｅｄａ Ｔ． Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ ｒｉｓｅｄｒｏｎａｔｅ ｒｅｄｕｃｅｓ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｂｕｒｄｅｎ ｉｎ ｂｏｎｅ ｉｎ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９５；５５：３５５１−３５５７．
Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｕ， ｖａｎ Ｌｅｓｓｅｎ Ａ， Ｈｕｈｎ Ｄ， Ｓｅｒｋｅ Ｓ． Ｔｗｏ ｓｕｂｓｅｔｓ ｏｆ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌｓ ｄｅｆｉｎｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＤ４５ ａｎｔｉｇｅｎ． Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ． １９９７；９７：５６−６４．
Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ Ｊ， Ｖａｎ Ｒｅｅ Ｒ ， Ｇ． Ｊ． Ｐｅｒｄｏｋ ＧＪ ， Ｖａｎ Ｄｏｏｒｎ ＨＲ ， Ｔａｎ ＫＹ， Ａａｌｂｅｒｓｅ ＲＣ， Ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ４ ｉｓ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ： ｉｔ ｈａｓ ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ−ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｓｉｔｅｓ， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９９； ９７：６９３−６９８．
Ｓｅｂｅｓｔｙｅｎ Ａ， Ｂｅｒｃｚｉ Ｌ， Ｍｉｈａｌｉｋ Ｒ， Ｐａｋｕ Ｓ， Ｍａｔｏｌｃｓｙ Ａ， Ｋｏｐｐｅｒ Ｌ． Ｓｙｎｄｅｃａｎ−１ （ＣＤ１３８） ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ． Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ． １９９９； １０４（２）：４１２−９．
Ｓｅｆｔａｌｉｏｇｌｕ Ａ， Ｋａｒａｋｕｓ Ｓ． Ｓｙｎｄｅｃａｎ−１／ＣＤ１３８ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｍｙｅｌｏｉｄ， ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ａｎｄ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ． Ａｃｔａ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． ２００３；１０５：２１３−２２１．
Ｓｅｆｔａｌｉｏｇｌｕ Ａ， Ｋａｒａｋｕｓ Ｓ， Ｄｕｎｄａｒ Ｓ， Ｃａｎ Ｂ， Ｅｒｄｅｍｌｉ Ｅ， Ｉｒｍａｋ ＭＫ， Ｏｚｔａｓ Ｅ， Ｋｏｒｋｍａｚ Ｃ， Ｙａｚａｒ Ｆ， Ｃａｖｕｓｏｇｌｕ Ｉ． Ｓｙｎｄｅｃａｎ−１ （ＣＤ１３８） ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ−−ａｎ ｉｍｍｕｎｏ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ｓｔｕｄｙ． Ａｃｔａ Ｏｎｃｏｌ． ２００３；４２：７１−７４．
Ｓｅｎｔｅｒ ＰＤ， Ｄｏｒｏｎｉｎａ Ｓ， Ｃｅｒｖｅｎｙ Ｃ， Ｃｈａｃｅ Ｄ， Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ Ｊ， Ｋｌｕｓｓｍａｎ Ｋ， Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ Ｂ， Ｍｅｙｅｒ Ｄ， Ｓｉｅｇａｌｌ ＣＢ， Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｊ ｅｔ ａｌ． （２００２）． Ｃｕｒｅｓ ａｎｄ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｕｍｏｒｓ ｗｉｔｈ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ． Ａｂｓｔｒａｃｔ ＃２０６２， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． （Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ： Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）， ４１４．
Ｓｈｉｅｌｄｓ ＲＬ， Ｎａｍｅｎｕｋ ＡＫ， Ｈｏｎｇ Ｋ， Ｍｅｎｇ ＹＧ， Ｒａｅ Ｊ， Ｂｒｉｇｇｓ Ｊ， Ｘｉｅ Ｄ， Ｌａｉ Ｊ， Ｓｔａｄｌｅｎ Ａ， Ｌｉ Ｂ， Ｆｏｘ ＪＡ， Ｐｒｅｓｔａ ＬＧ．． Ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｎ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ｆｏｒ Ｆｃ ｇａｍｍａ ＲＩ， Ｆｃ ｇａｍｍａ ＲＩＩ， Ｆｃ ｇａｍｍａ ＲＩＩＩ， ａｎｄ ＦｃＲｎ ａｎｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ＩｇＧ１ ｖａｒｉａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ Ｆｃ ｇａｍｍａ Ｒ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２００１； ２７６（９）：６５９１−６０４．
Ｓｉｅｖｅｒｓ ＥＬ， Ｌａｒｓｏｎ Ｒ．Ａ．， Ｓｔａｄｔｍａｕｅｒ， Ｅ．Ａ．， Ｅｓｔｅｙ， Ｅ．， Ｌｏｗｅｎｂｅｒｇ， Ｂ．， Ｄｏｍｂｒｅｔ， Ｈ．， Ｋａｒａｎｅｓ， Ｃ．， Ｔｈｅｏｂａｌｄ， Ｍ．， Ｂｅｎｎｅｔｔ， Ｊ．Ｍ．， Ｓｈｅｒｍａｎ， Ｍ．Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＣＤ３３−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎ ｆｉｒｓｔ ｒｅｌａｐｓｅ． ２００１． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １９， ｐｐ． ３２４４−３２５４．
Ｓｉｅｖｅｒｓ ＥＬ ａｎｄ Ｌｉｎｅｎｂｅｒｇｅｒ Ｍ． Ｍｙｌｏｔａｒｇ： ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｃｏｍｅｓ ｏｆ ａｇｅ． ２００１． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １３， ｐｐ． ５２２−５２７．
Ｓｍｉｔｈ Ｒ．， Ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ；ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ 〜ｓｍｉｔｈｒ／ｓｃｉｅｎｃｅ／ｓｃｆｖ．ｈｔｍｌ（ｌａｓｔ ｕｐｄａｔｅｄ ｏｎ Ｍａｙ， ２００１）．
Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ＧＭ， Ｓｏａｒｅｓ Ｓ， Ｂｅｔｔｅｒ Ｍ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＲＥ， Ｎａｄｅｌｌ Ｒ， Ｈｏｒｗｉｔｚ ＡＨ． Ｈｕｍａｎ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｒｅｔａｉｎ ｆｕｌｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇ ｎｏｎ−ＣＤＲ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｒｅｓｉｄｕｅｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １９９４： ７（６）： ８０５−８１４．
Ｔａｓｓｏｎｅ Ｐ， Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒ ＶＳ， Ｎｅｒｉ Ｐ， Ｇｏｚｚｉｎｉ Ａ， Ｓｈａｍｍａｓ ＭＡ， Ｗｈｉｔｅｍａｎ ＫＡ， Ｈｙｌａｎｄｅｒ−Ｇａｎｓ ＬＬ， Ｃａｒｒａｓｃｏ ＤＲ， Ｈｉｄｅｓｈｉｍａ Ｔ， Ｓｈｒｉｎｇａｒｐｕｒｅ Ｒ， Ｓｈｉ Ｊ， Ａｌｌａｍ ＣＫ， Ｗｉｊｄｅｎｅｓ Ｊ， Ｖｅｎｕｔａ Ｓ， Ｍｕｎｓｈｉ ＮＣ， Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＫＣ， Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｂ−Ｂ４−ＤＭ１ ａｇａｉｎｓｔ ＣＤ１３８＋ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ， Ｂｌｏｏｄ， ２００４， １０４ （１２）， ｐｐ． ３６８８−３６９６．
Ｔｏｌｃｈｅｒ ＡＷ， Ｏｃｈｏａ Ｌ， Ｈａｍｍｏｎｄ ＬＡ， Ｐａｔｎａｉｋ Ａ， Ｅｄｗａｒｄｓ Ｔ， Ｔａｋｉｍｏｔｏ Ｃ， Ｓｍｉｔｈ Ｌ， ｄｅ Ｂｏｎｏ Ｊ， Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｇ， Ｍａｙｓ Ｔ， Ｊｏｎａｋ ＺＬ， Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｒ， ＤｅＷｉｔｔｅ Ｍ， Ｍａｒｔｉｎｏ Ｈ， Ａｕｄｅｔｔｅ Ｃ， Ｍａｅｓ Ｋ， Ｃｈａｒｉ ＲＶ， Ｌａｍｂｅｒｔ ＪＭ， Ｒｏｗｉｎｓｋｙ ＥＫ． Ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ， ａ ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ＣａｎＡｇ ａｎｔｉｇｅｎ： ａ ｐｈａｓｅ Ｉ， ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ， ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｔｕｄｙ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ． ２００３；２１：２１１−２２２．
Ｕｒａｓｈｉｍａ Ｍ， Ｃｈｅｎ ＢＰ， Ｃｈｅｎ Ｓ， Ｐｉｎｋｕｓ ＧＳ， Ｂｒｏｎｓｏｎ ＲＴ， Ｄｅｄｅｒａ ＤＡ， Ｈｏｓｈｉ Ｙ， Ｔｅｏｈ Ｇ， Ｏｇａｔａ Ａ， Ｔｒｅｏｎ ＳＰ， Ｃｈａｕｈａｎ Ｄ， Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＫＣ． Ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｏｍｉｎｇ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ． Ｂｌｏｏｄ． １９９７；９０：７５４−７６５．
Ｖｏｇｅｌ ＣＷ． Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｍｏｉｅｔｉｅｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ． ２００４；２８３：０８７−１０８．
Ｖｏｏｉｊｓ ＷＣ， Ｐｏｓｔ Ｊ， Ｗｉｊｄｅｎｅｓ Ｊ， Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ ＨＪ， Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ Ａ， Ｐｏｌｉｔｏ Ｌ， Ｓｔｉｒｐｅ Ｆ， Ｂａｓｔ ＥＪ， ｄｅ Ｇａｓｔ ＧＣ． Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｐｌａｓｍａ−ｃｅｌｌ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｂ−Ｂ２ ａｎｄ Ｂ−Ｂ４ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． １９９６；４２：３１９−３２８．
Ｗａｒｄ， Ｅ．Ｓ．， Ｄ． Ｇｕｓｓｏｗ， Ａ．Ｄ． Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ， Ｐ．Ｔ． Ｊｏｎｅｓ， ａｎｄ Ｇ． Ｗｉｎｔｅｒ． Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｎａｔｕｒｅ． １９８９． ３４１：５４４−５４６．
Ｗａｒｇａｌｌａ ＵＣ， Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ＲＡ． Ｒａｔｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． １９８９；８６：５１４６−５１５０．
Ｗｉｊｄｅｎｅｓ Ｊ， Ｖｏｏｉｊｓ ＷＣ， Ｃｌｅｍｅｎｔ Ｃ， Ｐｏｓｔ Ｊ， Ｍｏｒａｒｄ Ｆ， Ｖｉｔａ Ｎ， Ｌａｕｒｅｎｔ Ｐ， Ｓｕｎ ＲＸ， Ｋｌｅｉｎ Ｂ， Ｄｏｒｅ ＪＭ． Ａ ｐｌａｓｍｏｃｙｔｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ （Ｂ−Ｂ４） ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ ｓｙｎｄｅｃａｎ−１． Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ． １９９６；９４：３１８−３２３．
Ｗｉｊｄｅｎｅｓ Ｊ， Ｄｏｒｅ ＪＭ， Ｃｌｅｍｅｎｔ Ｃ， Ｖｅｒｍｏｔ−Ｄｅｓｒｏｃｈｅｓ Ｃ． ＣＤ１３８， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ Ｈｏｍｅｏｓｔ Ａｇｅｎｔｓ． ２００２ Ａｐｒ−Ｊｕｎ；１６（２）：１５２−５．
Ｗｉｔｚｉｇ ＴＥ， Ｋｉｍｌｉｎｇｅｒ ＴＫ， Ａｈｍａｎｎ ＧＪ， Ｋａｔｚｍａｎｎ ＪＡ， Ｇｒｅｉｐｐ ＰＲ． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ． Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ． １９９６；２６：１１３−１２０．
Ｘｉｅ Ｈ， Ａｕｄｅｔｔｅ Ｃ， Ｈｏｆｆｅｅ Ｍ， Ｌａｍｂｅｒｔ ＪＭ， Ｂｌａｅｔｔｌｅｒ Ｗ． Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ， ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ （ｈｕＣ２４２−ＤＭ１）， ａｎｄ ｉｔｓ ｔｗｏ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ． ２００４ Ｍａｒ；３０８（３）：１０７３−８２．
Ｙａｎｇ Ｍ， Ｊｉａｎｇ Ｐ， Ａｎ Ｚ， Ｂａｒａｎｏｖ Ｅ， Ｌｉ Ｌ， Ｈａｓｅｇａｗａ Ｓ， Ａｌ−Ｔｕｗａｉｊｒｉ Ｍ， Ｃｈｉｓｈｉｍａ Ｔ， Ｓｈｉｍａｄａ Ｈ， Ｍｏｏｓｓａ ＡＲ， Ｈｏｆｆｍａｎ ＲＭ． Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｍｅｌａｎｏｍａ ｂｏｎｅ ａｎｄ ｏｒｇａｎ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｍｏｄｅｌｓ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９９；５：３５４９−３５５９．
Ｙａｎｇ Ｍ， Ｂａｒａｎｏｖ Ｅ， Ｊｉａｎｇ Ｐ， Ｓｕｎ ＦＸ， Ｌｉ ＸＭ， Ｌｉ Ｌ， Ｈａｓｅｇａｗａ Ｓ， Ｂｏｕｖｅｔ Ｍ， Ａｌ−Ｔｕｗａｉｊｒｉ Ｍ， Ｃｈｉｓｈｉｍａ Ｔ， Ｓｈｉｍａｄａ Ｈ， Ｍｏｏｓｓａ ＡＲ， Ｐｅｎｍａｎ Ｓ， Ｈｏｆｆｍａｎ ＲＭ． Ｗｈｏｌｅ−ｂｏｄｙ ｏｐｔｉｃａｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｕｍｏｒｓ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２０００；９７：１２０６−１２１１．
Ｙａｎｇ Ｙ， ＭａｃＬｅｏｄ Ｖ， Ｄａｉ Ｙ， Ｋｈｏｔｓｋａｙａ−Ｓａｍｐｌｅ Ｙ， Ｓｈｒｉｖｅｒ Ｚ， Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ Ｇ， Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ Ｒ， Ｎａｇｇｉ Ａ， Ｔｏｒｒｉ Ｇ， Ｃａｓｕ Ｂ， Ｖｌｏｄａｖｓｋｙ Ｉ， Ｓｕｖａ ＬＪ， Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｊ， Ｙａｃｃｏｂｙ Ｓ， Ｓｈａｕｇｈｎｅｓｓｙ ＪＤ Ｊｒ， Ｂａｒｌｏｇｉｅ Ｂ， Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ ＲＤ． Ｔｈｅ ｓｙｎｄｅｃａｎ−１ ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ｉｓ ａ ｖｉａｂｌｅ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｍｙｅｌｏｍａ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｌｏｏｄ． ２００７ Ｓｅｐ １５；１１０（６）：２０４１−８． Ｅｐｕｂ ２００７ Ｍａｙ ２９．
Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ Ｓ， Ｙａｍａｄａ Ｙ， Ｉｓｈｉｋａｗａ Ｅ， Ｍａｓｓｅｙｅｆｆ Ｒ． Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ａｎｄ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ ｏｆ Ｎ−（４−ｃａｒｂｏｘｙｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｍｅｔｈｙｌ）−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ． Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９７９；１０１：３９５−３９９．
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ１３８に対する非ヒト抗体の抗原結合領域（ＡＢＲ）と、
少なくとも一部がヒト抗体のものである、更なる抗体領域と、
を含み、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくともいずれかであることを特徴とするＣＤ１３８を認識する改変された標的抗体、
（ａ）前記非ヒト抗体のＣＤ１３８に対する結合親和性を超える結合親和性でＣＤ１３８に結合する抗体、
（ｂ）ＣＤ１３８発現細胞のＣＤ１３８に均一に結合する抗体。
【請求項２】
更なる抗体領域が、ヒト抗体の重鎖定常領域及びその一部のいずれかを含む、少なくとも１つの定常領域であり、改変された標的抗体が、ＩｇＧ４アイソタイプのものである、請求項１に記載の改変された標的抗体。
【請求項３】
抗体が、非ヒト抗体のＣＤ１３８に対する結合親和性を超える結合親和性でＣＤ１３８に結合する、請求項２に記載の改変された標的抗体。
【請求項４】
抗体が、ＣＤ１３８発現細胞のＣＤ１３８に均一に結合する、請求項２に記載の改変された標的抗体。
【請求項５】
改変された標的抗体が、１５０％、１４０％、１３０％、１２０％、１１０％、１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、及び５０％のいずれか未満のターゲティング変動で、ＣＤ１３８に結合する、請求項４に記載の改変された標的抗体。
【請求項６】
ＡＢＲが、
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸残基９９〜１１１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３と、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸残基８９〜９７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３と、
を含む、請求項１及び２のいずれかに記載の改変された標的抗体。
【請求項７】
ＡＢＲが更に、
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸残基３１〜３５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、及び配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸残基５１〜６８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２４〜３４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸残基５０〜５６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２と、
を含む、請求項６に記載の改変された標的抗体。
【請求項８】
更なる抗体領域が、
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１２３〜４４８、及び
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１０８〜２１４、の少なくともいずれかと、
以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の少なくともいずれかの突然変異とを含む、請求項６に記載の改変された標的抗体、
（ｉ）改変された標的抗体の抗体依存性細胞傷害性及び補体依存性細胞傷害性の少なくともいずれかを、維持させる或いは低下させる突然変異、
（ｉｉ）改変された標的抗体を安定化させる突然変異。
【請求項９】
非ヒト抗体の抗原結合領域が、マウス抗体のものである、請求項１及び２のいずれかに記載の改変された標的抗体。
【請求項１０】
改変された標的抗体が、キメラ抗体であり、非ヒト抗体がＢ−Ｂ４である、請求項１及び２のいずれかに記載の改変された標的抗体。
【請求項１１】
改変された標的抗体が、少なくとも１本の重鎖及び１本の軽鎖を含み、
前記重鎖が、（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖であるか、
前記軽鎖が、（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖であるか、或いは
前記重鎖と前記軽鎖がそれぞれ、（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖である、及び（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖である、
請求項３に記載の改変された標的抗体。
【請求項１２】
（ａ）重鎖のアミノ酸配列が、配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有し、
（ｂ）軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有する、請求項８に記載の改変された標的抗体。
【請求項１３】
ＡＢＲが、本質的に非ヒト抗体のＡＢＲから成る、請求項１及び２のいずれかに記載の改変された標的抗体。
【請求項１４】
請求項１及び２のいずれかに記載の抗体と、薬学的に許容される担体と、を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１及び２のいずれかに記載の抗体を産生することを特徴とするハイブリドーマ。
【請求項１６】
抗体に基づくアッセイであって、請求項１及び２のいずれかに記載の抗体を含むことを特徴とするアッセイ。
【請求項１７】
免疫グロブリン重鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、前記免疫グロブリン重鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列が、配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、及び少なくとも９８％のいずれかの配列同一性を有し、前記免疫グロブリン重鎖及びその一部のいずれかを含む標的剤がＣＤ１３８を標的とすることを特徴とする単離ポリペプチド。
【請求項１８】
免疫グロブリン重鎖及びその一部のいずれかの定常領域が、ＩｇＧ４アイソタイプ定常領域である、請求項１７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１９】
標的剤が、マウスヒトキメラ抗体である、請求項１７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２０】
免疫グロブリン軽鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列を更に含み、前記免疫グロブリン軽鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、及び少なくとも９８％のいずれかの配列同一性を有する、請求項１７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２１】
免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列が、配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一である、請求項１７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２２】
免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一である、請求項２０及び２１のいずれかに記載の単離ポリペプチド。
【請求項２３】
ＣＤ１３８に均一に結合させる方法であって、
請求項１及び２のいずれかに記載の改変された標的抗体を提供する工程と、
前記改変された標的抗体をＣＤ１３８発現細胞に接種する工程と、
を含み、
前記改変された標的抗体が、前記ＣＤ１３８発現細胞上で発現しているＣＤ１３８に均一に結合することを特徴とする方法。
【請求項２４】
改変された標的抗体が、１５０％、１４０％、１３０％、１２０％、１１０％、１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、及び５０％のいずれか未満のターゲティング変動でＣＤ１３８に結合する、請求項２３に記載の方法。
【請求項１】
ＣＤ１３８に対する非ヒト抗体の抗原結合領域（ＡＢＲ）と、
少なくとも一部がヒト抗体のものである、更なる抗体領域と、
を含み、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくともいずれかであることを特徴とするＣＤ１３８を認識する改変された標的抗体、
（ａ）前記非ヒト抗体のＣＤ１３８に対する結合親和性を超える結合親和性でＣＤ１３８に結合する抗体、
（ｂ）ＣＤ１３８発現細胞のＣＤ１３８に均一に結合する抗体。
【請求項２】
更なる抗体領域が、ヒト抗体の重鎖定常領域及びその一部のいずれかを含む、少なくとも１つの定常領域であり、改変された標的抗体が、ＩｇＧ４アイソタイプのものである、請求項１に記載の改変された標的抗体。
【請求項３】
抗体が、非ヒト抗体のＣＤ１３８に対する結合親和性を超える結合親和性でＣＤ１３８に結合する、請求項２に記載の改変された標的抗体。
【請求項４】
抗体が、ＣＤ１３８発現細胞のＣＤ１３８に均一に結合する、請求項２に記載の改変された標的抗体。
【請求項５】
改変された標的抗体が、１５０％、１４０％、１３０％、１２０％、１１０％、１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、及び５０％のいずれか未満のターゲティング変動で、ＣＤ１３８に結合する、請求項４に記載の改変された標的抗体。
【請求項６】
ＡＢＲが、
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸残基９９〜１１１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３と、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸残基８９〜９７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３と、
を含む、請求項１及び２のいずれかに記載の改変された標的抗体。
【請求項７】
ＡＢＲが更に、
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸残基３１〜３５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、及び配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸残基５１〜６８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２と、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸残基２４〜３４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸残基５０〜５６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２と、
を含む、請求項６に記載の改変された標的抗体。
【請求項８】
更なる抗体領域が、
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１２３〜４４８、及び
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１０８〜２１４、の少なくともいずれかと、
以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の少なくともいずれかの突然変異とを含む、請求項６に記載の改変された標的抗体、
（ｉ）改変された標的抗体の抗体依存性細胞傷害性及び補体依存性細胞傷害性の少なくともいずれかを、維持させる或いは低下させる突然変異、
（ｉｉ）改変された標的抗体を安定化させる突然変異。
【請求項９】
非ヒト抗体の抗原結合領域が、マウス抗体のものである、請求項１及び２のいずれかに記載の改変された標的抗体。
【請求項１０】
改変された標的抗体が、キメラ抗体であり、非ヒト抗体がＢ−Ｂ４である、請求項１及び２のいずれかに記載の改変された標的抗体。
【請求項１１】
改変された標的抗体が、少なくとも１本の重鎖及び１本の軽鎖を含み、
前記重鎖が、（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖であるか、
前記軽鎖が、（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖であるか、或いは
前記重鎖と前記軽鎖がそれぞれ、（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖である、及び（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖である、
請求項３に記載の改変された標的抗体。
【請求項１２】
（ａ）重鎖のアミノ酸配列が、配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有し、
（ｂ）軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有する、請求項８に記載の改変された標的抗体。
【請求項１３】
ＡＢＲが、本質的に非ヒト抗体のＡＢＲから成る、請求項１及び２のいずれかに記載の改変された標的抗体。
【請求項１４】
請求項１及び２のいずれかに記載の抗体と、薬学的に許容される担体と、を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１及び２のいずれかに記載の抗体を産生することを特徴とするハイブリドーマ。
【請求項１６】
抗体に基づくアッセイであって、請求項１及び２のいずれかに記載の抗体を含むことを特徴とするアッセイ。
【請求項１７】
免疫グロブリン重鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、前記免疫グロブリン重鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列が、配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、及び少なくとも９８％のいずれかの配列同一性を有し、前記免疫グロブリン重鎖及びその一部のいずれかを含む標的剤がＣＤ１３８を標的とすることを特徴とする単離ポリペプチド。
【請求項１８】
免疫グロブリン重鎖及びその一部のいずれかの定常領域が、ＩｇＧ４アイソタイプ定常領域である、請求項１７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１９】
標的剤が、マウスヒトキメラ抗体である、請求項１７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２０】
免疫グロブリン軽鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列を更に含み、前記免疫グロブリン軽鎖及びその一部のいずれかのアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、及び少なくとも９８％のいずれかの配列同一性を有する、請求項１７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２１】
免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列が、配列番号１で表されるアミノ酸配列と同一である、請求項１７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２２】
免疫グロブリン軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一である、請求項２０及び２１のいずれかに記載の単離ポリペプチド。
【請求項２３】
ＣＤ１３８に均一に結合させる方法であって、
請求項１及び２のいずれかに記載の改変された標的抗体を提供する工程と、
前記改変された標的抗体をＣＤ１３８発現細胞に接種する工程と、
を含み、
前記改変された標的抗体が、前記ＣＤ１３８発現細胞上で発現しているＣＤ１３８に均一に結合することを特徴とする方法。
【請求項２４】
改変された標的抗体が、１５０％、１４０％、１３０％、１２０％、１１０％、１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、及び５０％のいずれか未満のターゲティング変動でＣＤ１３８に結合する、請求項２３に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【公表番号】特表２０１１−５０９２４５（Ｐ２０１１−５０９２４５Ａ）
【公表日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４０１２８（Ｐ２０１０−５４０１２８）
【出願日】平成２０年１２月２３日（２００８．１２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６８２６６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８０８２９
【国際公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【出願人】（３９００３５３７８）バイオテスト・アクチエンゲゼルシヤフト (13)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月２３日（２００８．１２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６８２６６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８０８２９
【国際公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【出願人】（３９００３５３７８）バイオテスト・アクチエンゲゼルシヤフト (13)
【Ｆターム（参考）】
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