Ｄ−エリスロ−フェニルセリンの製造方法
【課 題】 本発明は、ラセミ−エリスロ−フェニルセリンからＤ−エリスロ−フェニルセリンを製造又は光学分割することのできる技術を提供することを目的とする。
【解決手段】 フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌を、ラセミ−エリスロ−フェニルセリンに作用させ、Ｌ−エリスロ−フェニルセリンを分解し、残存するＤ−エリスロ−フェニルセリンを採取することを特徴とするＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造方法。
【解決手段】 フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌を、ラセミ−エリスロ−フェニルセリンに作用させ、Ｌ−エリスロ−フェニルセリンを分解し、残存するＤ−エリスロ−フェニルセリンを採取することを特徴とするＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬や農薬又は他の有用な化学物質（例えばチアンフェニコールやフロロフェニコール、クロラムフェニコール等）などの中間体として有用なことが知られているＤ−エリスロ−フェニルセリンを製造する方法に関する。さらに詳しくは、ラセミ−エリスロ−フェニルセリンのＬ−エリスロ−フェニルセリンのみを特異的にグリシンとベンズアルデヒドに分解する能力を有する酵素を産生する微生物あるいはその菌体調製物により、Ｄ−エリスロ−フェニルセリンを選択的に製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、Ｄ−エリスロ−フェニルセリンの合成は、以下の方法により行われていた。即ち、ベンズアルデヒドとグリシンを強アルカリ存在下で縮合させることによりラセミ−スレオ／エリスロ−フェニルセリンを得た後、スレオ／エリスロ体の相互分離処理を行い、得られたラセミ−エリスロ−フェニルセリンのアミノ基部分に置換基（例えばＮ−アシル基等）を導入した後、キニン、ブルシン等の光学分割剤を用いて光学分割を行い、最後にアミノ基部分の置換基を除去する方法である（化学合成法；特許文献１〜４）。
しかし、上記ベンズアルデヒドとグリシンからの化学合成法では、高立体選択的な合成が困難なため、スレオ／エリスロ体、Ｄ／Ｌ体の４種類の異性体が生成し、目的のＤ−エリスロ−フェニルセリンを得るためには繁雑な分離工程が必要となるばかりでなく、Ｄ／Ｌ体の光学分割にはキニン、ブルシン等の非常に高価な光学分割剤を用いなければならない等の問題点がある。
【０００３】
また、キサントモナス属等より得られるＬ−アロスレオニンアルドラーゼの合成に関与する遺伝子を担うＤＮＡで形質転換されたキサントモナス属等の形質転換体に、ラセミ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸を作用させて、Ｌ−体のみを特異的にグリシンと対応するアルデヒド誘導体に分解させ、Ｄ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸を得る方法が知られている（特許文献５参照）。しかし、ラセミ−エリスロ−フェニルセリンからのＬ−アロスレオニンアルドラーゼを用いた酵素反応による光学分割法は、用いる酵素がラセミ−エリスロ−フェニルセリンに対して活性がそれほど高くなく、この点に関しても技術的解決が求められている。
【０００４】
酵素反応法自体に関しては、目的酵素を産生する菌体微生物より酵素を単離・精製し、使用する方法や菌体内酵素を菌体のまま使用する方法も広く周知の事となっている。しかし、酵素反応自体に関しては、菌体内酵素を菌体のまま使用する方法は、目的酵素を産生する菌体微生物より単離・精製した酵素を用いる方法における、酵素産生菌体培養液を遠心分離して菌体を収集し、これを超音波処理等の機械的粉砕後、再度遠心分離により無細胞抽出液を得、硫安分別や有機溶媒分別とイオン交換クロマト分別を適宜組み合わせて酵素を単離・精製する等の、多段階の工程操作を必要としない方法なのでより簡便な方法となる。しかし、この菌体内酵素反応では菌体と反応生成物の分離が膜ろ過分離法等の簡単な方法で可能なものの、菌体自体が強固であって、かつ、分離・回収して繰り返し利用が出来なければ効率的な菌体内酵素反応が実施できないという問題があった。
【特許文献１】特開昭５１−３２５４０号公報
【特許文献２】特開昭５８−２１６１４６号公報
【特許文献３】特開昭５９−２２２４６５号公報
【特許文献４】特開昭５９−２１６８５８号公報
【特許文献５】特開平６−１６５６９３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記問題を解決し、ラセミ−エリスロ−フェニルセリンからＤ−エリスロ−フェニルセリンを製造又は光学分割することのできる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、Ｄ−エリスロ−フェニルセリンの合成方法に関し鋭意検討を行った結果、フェニルセリンに対して活性の高いフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡを、強固な細胞壁を有するコリネ型細菌で高発現させた形質転換コリネ菌を創製し、該菌体をラセミ−エリスロ−フェニルセリンに作用させると、効率良くＬ−エリスロ−フェニルセリンのみを分解して、Ｄ−エリスロ−フェニルセリンが高選択的に製造できることを見出し、本発明に到達した。
【０００７】
即ち、本発明は、
（１） フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌を、ラセミ−エリスロ−フェニルセリンに作用させ、Ｌ−エリスロ−フェニルセリンを分解し、残存するＤ−エリスロ−フェニルセリンを採取することを特徴とするＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造方法、
（２） フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡが、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡであることを特徴とする前記（１）記載の方法；
（ａ）配列番号１における６４５−１６８２番目の塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフェニルセリンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつフェニルセリンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（３） フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡがＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＰＳ−１５株（独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５１８７）由来ＤＮＡであることを特徴とする前記（２）記載の方法、
（４） フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌が、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌およびアースロバクター属菌から選択される１種の菌であることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法、
（５） フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌が、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０２５２又は受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０２３３として寄託されたものであることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法、
（６） フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌を繰り返し再使用することを特徴とする前記（１）記載の方法、
（７） 以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡを含有する遺伝子；
（ａ）配列番号１における６４５−１６８２番目の塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフェニルセリンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつフェニルセリンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（８） 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質；
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつフェニルセリンアルドラーゼ活性を有するタンパク質、
（９） 前記（７）に記載の遺伝子を含有するベクター、
（１０） 前記（９）に記載の遺伝子を含有するベクターを含む形質転換体、
（１１） 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０２５２であるコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／ｐＣＲＢ ｐａｌｌ株、
（１２） 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０２３３であるコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／ｐＣＲＢ ｔａｃＰ ｐａｌｌ株、
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により形質転換されたコリネ型細菌は、その菌体中でフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡを含む遺伝子を大量に発現させることが可能となった。フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡを含む遺伝子を高発現させるように形質転換されたコリネ型細菌を用いると、ラセミ−エリスロ−フェニルセリンからＤ−エリスロ−フェニルセリンを工業的に容易に且つ高収率で製造し得る。しかも、前記形質転換されたコリネ型細菌は組換え大腸菌等とは異なり繰り返し再利用が可能なため、非常に効率良くＤ−エリスロ−フェニルセリンを製造できる。この結果、医薬、農薬（例えばチアンフェニコールやフロロフェニコール、クロラムフェニコール等）などの中間体として有用なＤ−エリスロ−フェニルセリン製造がコストダウンを含めて工業的に有利に実施することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
フェニルセリンアルドラーゼは主としてＬ−エリスロ−フェニルセリンからグリシンとベンズアルデヒドを生成する反応を触媒する酵素である。また、フェニルセリンアルドラーゼは、前記の逆反応でグリシンとベンズアルデヒドからＬ−エリスロ−フェニルセリンを生成する反応も触媒する酵素である。フェニルセリンアルドラーゼが細胞内で著量蓄積できれば、Ｄ−エリスロ−フェニルセリンの生産に有効に使用できると考えられる。
【００１０】
フェニルセリンアルドラーゼとしては、例えば配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。またフェニルセリンアルドラーゼには、前記配列番号２において１若しくは複数個〔例えば、数個（例えば１〜８個；以下同様である。）〕のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつフェニルセリンアルドラーゼ活性を有するタンパク質等も含まれる。
前記置換又は付加によって導入されるアミノ酸は、遺伝子によりコードされる２０種類のアミノ酸以外の非天然アミノ酸であってもよい。非天然アミノ酸は、アミノ基とカルボキシル基を有する限りどのような化合物でもよいが、例えばγ−アミノ酪酸等が挙げられる。
【００１１】
上記フェニルセリンアルドラーゼは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）又はエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチル等のＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル等のＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチル等のＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチル等のフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチル等のα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基等のＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基等が用いられる。フェニルセリンアルドラーゼが、Ｃ末端以外にカルボキシル基（又はカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化又はエステル化されているものも本発明におけるフェニルセリンアルドラーゼに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステル等が用いられる。さらに、フェニルセリンアルドラーゼには、上記したタンパク質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル等のＣ２−６アルカノイル基等のＣ１−６アシル基等）で保護されているもの、Ｎ末端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基等）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル等のＣ２−６アルカノイル基等のＣ１−６アシル基等）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質等の複合蛋白質等も含まれる。
【００１２】
本発明で用いられる上記フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡとしては、フェニルセリンアルドラーゼを有する動物、植物、又は、微生物由来のいずれのＤＮＡでも使用できるが、工業的な利用には微生物由来のものが好ましい。前記微生物としては、例えばバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）を好ましく挙げることができる。
【００１３】
本発明で用いられるフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡは、好ましくは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する微生物由来のＤＮＡ、さらに好ましくは、バチルス・スピーシーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）由来のＤＮＡ、とりわけ好ましくはバチルス・スピーシーズ ＰＳ−１５株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＰＳ−１５；ＦＥＲＭ Ｐ−１５１８７、特開平９−２３８６８０号公報）由来のＤＮＡが挙げられる。バチルス・スピーシーズ ＰＳ−１５株は、耐熱性のフェニルセリンアルドラーゼを生産する微生物として自然界から分離され、バチルス属に属する菌株として同定されたものである。
【００１４】
バチルス・スピーシーズ ＰＳ−１５株由来のフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡとしては、上記したフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡ、あるいは例えば配列番号１に示される塩基配列の６４５番目から１６８２番目に相当する塩基配列を含むＤＮＡ、又は前記ＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフェニルセリンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、あるいはフェニルセリンアルドラーゼ活性を有するタンパク質、例えば配列番号２で示されアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡもしくは前記アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつフェニルセリンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ等が挙げられる。なお、前記ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば前記ＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、約０．７〜１．０Ｍ程度の塩化ナトリウム存在下、約６５℃程度でハイブリダイゼーションを行った後、約０．１〜２倍程度の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムよりなる。）を用い、約６５℃程度の条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。
【００１５】
また、上記ＤＮＡには、例えば配列番号１に示される塩基配列の６４５番目から１６８２番目に相当する塩基配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を有し、かつフェニルセリンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ等も含まれる。ハイブリダイゼーションは、公知の方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）：以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す。）に記載の方法等に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
また、フェニルセリンアルドラーゼの発現をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に対してアンチセンスであるｍＲＮＡの転写をコードするＤＮＡも、上記したフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡに含まれる。
【００１６】
本発明に使用されるコリネ型細菌は、バージーズ・マニュアル・デターミネイティブ・バクテリオロジー〔（Ｂａｒｇｅｙｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，第８巻，ｐ．５９９、１９７４年）〕に定義されている一群の微生物であり、好気性、グラム陽性、非抗酸性、胞子形成能を有さない桿菌を意味し、例えば、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌そしてマイクロコッカス属菌等が挙げられる。
【００１７】
具体的には、コリネバクテリウム属菌としては、コリネバクテリウム グルタミカムＲ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ）独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８９７６，ＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１３０５８、ＡＴＣＣ１３０５９、ＡＴＣＣ１３０６０、ＡＴＣＣ１３２３２、ＡＴＣＣ１３２８６、ＡＴＣＣ１３２８７、ＡＴＣＣ１３６５５、ＡＴＣＣ１３７４５、ＡＴＣＣ１３７４６、ＡＴＣＣ１３７６１、ＡＴＣＣ１４０２０及びＡＴＣＣ３１８３１等が挙げられる。
【００１８】
ブレビバクテリウム属菌としては、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウム フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）及びＭＪ−２３３ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６８７２等があげられる。アースロバクター属菌としては、アースロバクター グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ８０１０、ＡＴＣＣ４３３６，ＡＴＣＣ２１０５６，ＡＴＣＣ３１２５０，ＡＴＣＣ３１７３８及びＡＴＣＣ３５６９８等が挙げられる。
【００１９】
本発明で用いられるコリネ型細菌は自然界に存する野生株の変異株（例えば、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８９７７，受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８９７８株等）であってもよい。これらの変異株は特開２００４−８９０２９に記載された方法に従って作成できる。
上記コリネ型細菌の中でも、コリネバクテリウム属菌やブレビバクテリウム属菌が好ましく、とりわけ独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８９７６として寄託されているコリネバクテリウム グルタミカムＲ株が好ましい。
【００２０】
以下、［Ｉ］ フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡが増幅発現されたコリネ型細菌形質転換体、及び、［ＩＩ］ Ｄ−エリスロ−フェニルセリンの製造方法について詳細に説明する。
【００２１】
［Ｉ］ フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡが増幅発現されたコリネ型細菌形質転換体の製造方法
バチルス・スピーシーズ ＰＳ−１５株の生産するフェニルセリンアルドラーゼはＬ−エリスロ−フェニルセリンからグリシンとベンズアルデヒドを生成する反応を触媒するほか、その逆反応でグリシンとベンズアルデヒドからＬ−エリスロ−フェニルセリンを生成する反応も触媒する。フェニルセリンアルドラーゼが細胞内で著量蓄積できれば、Ｄ−エリスロ−フェニルセリンの生産（光学分割）に有効に使用できると考えられる。
【００２２】
本発明においては、ラセミ−エリスロ−フェニルセリンの光学分割反応に必要な酵素量を確保するために、Ｌ−エリスロ−フェニルセリンに作用するフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡの発現量を上昇させる形質転換体を創製する。
フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡの発現量を上昇させるためには通常、例えば強力なプロモーターを挿入したり、リプレッサータンパク質の発現量を制御したりする等して、フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡの発現調節機構の改良を行えばよい。また、多コピー型のベクターに接続して組換えＤＮＡを作製し、微生物に保持させることが好ましい。
フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡの発現量を上昇させる微生物の創製にあたっては、バチルス属由来のフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡをＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を用いて必要なＤＮＡ領域を増幅取得し、プラスミド等のベクターに挿入して宿主細胞であるコリネ型細菌を形質転換するのが好ましい。
【００２３】
ここで、組換えＤＮＡ技術によってフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡが増幅発現された形質転換体を創製する方法について、下記の順に説明する。
（１）フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡの調製
（２）組換えＤＮＡの調製
（３）形質転換体の創製
（４）フェニルセリンアルドラーゼの生成蓄積
【００２４】
（１）フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡの調製
フェニルセリンアルドラーゼのアミノ酸配列は知られていないため、フェニルセリンアルドラーゼと類似の作用を示し、かつアミノ酸配列が公知の酵素との相同性を示すアミノ酸配列を指標にフェニルセリンアルドラーゼのアミノ酸配列をまず決定した。フェニルセリンアルドラーゼと類似の作用を示す酵素として、Ｌ−スレオニンアルドラーゼが挙げられる。Ｌ−スレオニンアルドラーゼは、フェニルセリンアルドラーゼ同様、Ｌ−スレオニンからグリシンとアセトアルデヒドへ分解する反応を触媒する酵素である。従って、フェニルセリンアルドラーゼのアミノ酸配列はＬ−スレオニンアルドラーゼのアミノ酸配列と高い相同性を示すことが考えられる。
【００２５】
Ｌ−スレオニンアルドラーゼはＥ．ｃｏｌｉをはじめとするエシェリヒア属、アエロモナス属、シュードモナス属等の細菌〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第２５５巻，ｐ．２２０−２２６（１９９８年）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，第６４巻，ｐ．５４９−５５４（１９９８年）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，第１７９巻，ｐ．３５５５−３５６０（１９９７年）〕やサッカロマイセス属等の酵母〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第２４５巻，ｐ．２８９−２９３（１９９７年）〕より取得されており、そのＤＮＡ配列も知られている。
【００２６】
本発明においては、まずバチルス属微生物、例えば、前記のバチルス・スピーシーズ ＰＳ１５株を常法、具体的には特開平９−２３８６８０号公報記載の方法に従い培養し、培養物から菌体を集め、該菌体から染色体ＤＮＡを抽出する。染色体ＤＮＡの抽出は常法、例えばＧｅｎｏｍｅ Ｐｒｅｐ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アマシャム製）を用いて簡便に行うことができる。
【００２７】
次に、上記の細菌又は酵母由来Ｌ−スレオニンアルドラーゼの数種〔少なくとも２種以上、好ましくは数種（約３〜５種）〕のアミノ酸配列を対比し、共通の配列又は相同性の高い配列部位を選択する。選択したアミノ酸配列（例えば、配列番号３〜５で示されるアミノ酸配列等）をもとにオリゴヌクレオチドを設計する。設計したオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡの部分断片を得る。このようなプライマーとしては、例えば配列番号３〜５に示されるアミノ酸配列に相当する塩基配列（配列番号６又は７）が挙げられる。ＰＣＲ反応は公知のＰＣＲ増幅装置、例えばサーマルサイクラー等を利用し得る。ＰＣＲのサイクルは、デナチュレーション→アニーリング→エクステンションを１サイクルとして、約１０〜１００サイクル、好ましくは約２０〜５０サイクル程度が好ましい。
【００２８】
ＰＣＲにて得られたＤＮＡ断片は適当なクローニングベクター、例えばｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）へサブクローニングする。次いで、前記ベクターを、例えばＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９菌株等に導入し、該菌株を形質転換する。この形質転換された菌株を適当な抗生物質（例．アンピシリン、クロラムフェニコール等）を含む培地で培養し、培養物から菌体を回収する。
回収された菌体から常法、例えばＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）等を用いてプラスミドＤＮＡを抽出する。この抽出されたプラスミドＤＮＡの塩基配列を決定することにより、本発明のフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡの部分配列を含むＤＮＡ断片を取得することができる。
得られたＤＮＡ断片の塩基配列は、例えばジデオキシヌクレオチド酵素法等、公知の方法により決定することができる。また、キャピラリ電気泳動システムを用い、検出には多色蛍光技術を使用する例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドシステムズ社製）等を使用して自動的に分析することもできる。
【００２９】
上記のようにして、フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡの部分配列を含むＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、例えば、配列番号１に示す７２６番目から１１７１番目に相当する塩基配列と決定し得る。次いで該塩基配列をアミノ酸配列に翻訳して解析する。その結果、翻訳されたアミノ酸配列は、配列番号２に示すアミノ酸配列の２８番目から１７６番目までに相当し、またその部分配列をコードするＤＮＡは配列番号１に示す塩基配列の７２６番目から１１７１番目に相当し得る。
【００３０】
フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡ全体を含むＤＮＡ断片を得るにはバチルス属微生物、例えば前記バチルス・スピーシーズ ＰＳ１５株の染色体ＤＮＡライブラリーを作製し、上記フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡの部分断片（例えば配列番号１に示す７２６番目から１１７１番目に相当する塩基配列；以下同様である。）をプローブとするサザンハイブリダイゼーションにより、フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡを含む染色体ＤＮＡを単離する方法が挙げられる。
【００３１】
上記バチルス・スピーシーズ ＰＳ１５株より抽出した染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばＰｓｔＩ等を用いて部分分解し、アガロースゲルによる電気泳動後、この断片をナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋、アマシャム社製）に移し取り、前記のフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡの部分断片をプローブとして用いたサザンハイブリダイゼーションを行う。
【００３２】
上記操作によって、フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡの部分断片を含むバチルス属菌、例えばバチルス・スピーシーズ ＰＳ１５株の染色体ＤＮＡ制限酵素断片が７ｋｂ以内であれば、この制限酵素断片のセルフライゲーションを行う。かくしてフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡの部分断片を含む環状ＤＮＡを取得することができる。
【００３３】
次に、上記にて取得した環状ＤＮＡを鋳型とし、前記にて決定されたフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡの部分断片をもとに設計されたプライマーを用いてインバースＰＣＲを行う。このようなプライマーとして、例えば配列番号１の７５０〜７７０番目及び１１２２〜１１４５番目に示される塩基配列に相当する部位を選び、その塩基配列又はその相補配列（例えば配列番号８及び９）を設計することができる。
【００３４】
上記インバースＰＣＲにて得られたＤＮＡ断片はフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡの両末端側を含む断片である。この断片を適当なクローニングベクター、例えばｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）へサブクローニングし、エシェリヒア・コリＪＭ１０９株を形質転換する。このプラスミドにより挿入されたＤＮＡの塩基配列を決定することにより、本発明のフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡを決定することができる。
【００３５】
このようにして得られるフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ制限酵素切断断片としては、バチルス属微生物、例えばバチルススピーシーズ ＰＳ１５株染色体ＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで切断して得られる、大きさ約２．４ｋｂの例えば配列番号１で示されるＤＮＡ断片を挙げることができる。このＤＮＡ断片の塩基配列を決定したところ、オープンリーディングフレームの存在が確認され、その構造遺伝子領域は後記配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列中のアミノ酸番号１〜３４５の３４５個のアミノ酸配列をコードする１０３８塩基対から構成されることがわかった。
【００３６】
（２）組換えＤＮＡの調製
本発明における組換えＤＮＡとは、上述のフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡを含むＤＮＡをプラスミドベクターに接続したものをいう。ここでベクターとしてはｐＵＣ系のプラスミドベクター及びその誘導体等が挙げられる。その際、フェニルセリンアルドラーゼを効率的に発現させるために、例えばｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、その他微生物内で機能するプロモーターを用いるのが好ましい。また、形質転換体を選別するために、ベクターは例えばクロラムフェニコール等の抗生物質耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。本発明に用いるｐＵＣ系プラスミドベクターとしては、例えばシャトルベクターｐＣＲＢ１（ＡＣＳ ＳＹＭＰＯＳＩＵＭ ＳＥＲＩＥＳ ８６２，“ＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”Ｃｈａｐｔｅｒ１１，ｐ１７５−ｐ１９１，Ｅｄ．ｂｙＢ．Ｄ．Ｓａｈａ，ＡＣＳ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ 参照）、ｐＵＳ１８又はＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドベクター等を好ましく挙げることができる。中でもｐＣＲＢ１は、クローニングベクターであるｐＨＳＧ３９８（タカラバイオ社製）より調製されたベクターで、大腸菌とコリネ型細菌内で該有用遺伝子を発現させるシャトルベクターとして本発明において好ましく用いることができる。
【００３７】
フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡを取得するために、フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡのオープンリーディングフレームよりも上流部位及び下流部位の塩基配列をもとにプライマーを設計し、これを用いてＰＣＲ法によりフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡを増幅させる。この断片をｐＣＲＢ１のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子内に存在するマルチクローニングサイト内に挿入することで、組換えＤＮＡを調製する。
なお、プライマーは、配列番号１に示す塩基配列の５８７番目から６０６番目に相当する部位及び１８４６番目から１８６５番目に相当する部位を選択し、その塩基配列又はその相補配列に制限酵素（例えばＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩ等）切断部位を連結するのが好ましい。このようなプライマーとしては、例えば配列番号１０及び１１に示すものが好ましく挙げられる。
【００３８】
（３）形質転換体の創製
フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡの発現量を上昇させる形質転換体の創製については、上記にて作製した組換えＤＮＡを宿主細胞に導入して形質転換する。形質転換される宿主細胞は、前述のコリネ型細菌であるが、その内でもコリネバクテリウム属菌が好ましく、中でもコリネバクテリウム・グルタミカムＲ株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８９７６）が好ましい。
組換えＤＮＡの宿主細胞への導入は、電気パルス法等の常法により行うことができる。
【００３９】
（４）フェニルセリンアルドラーゼの生成蓄積
上記の方法で取得されるフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡにて形質転換されたコリネ型細菌を培養し、目的のフェニルセリンアルドラーゼを生成蓄積せしめる。形質転換された、例えばコリネバクテリウム・グルタミカムＲ株の形質転換体の培養は、グルコース等の炭素源、硫酸アンモニウム等の窒素源、リン酸水素二カリウムや硫酸マグネシウム等の無機物、その他カザミノ酸等の有機成分を含む培地を用いるのがよい。
【００４０】
培養は好気条件下で約１２〜４８時間程度実施するのが好ましい。また培養温度はコリネバクテリウム・グルタミカムＲ株形質転換体の場合、好ましくは約２０℃〜４０℃、より好ましくは約３０℃〜３５℃である。
【００４１】
このようにしてフェニルセリンアルドラーゼを生成蓄積したコリネ型細菌形質転換体は培養液中に存在する状態や培養液から形質転換体を分離・濃縮等して使用することも出来る。また、本発明で用いられる形質転換されたコリネ型細菌の菌体には、例えば、アクリルアミドやカラギーナン等の担体上に固定化した固定化菌体、あるいは、凍結乾燥等による乾燥菌体等の菌体調製物も包含される。
【００４２】
又、本発明で用いられるフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌は、紫外線、エックス線又は薬品等を用いる人工的な変異手段で容易に変異しうるものである。このように得られるどのような変異株であっても本発明の対象とするフェニルセリンアルドラーゼ生産能を有するものは、本発明に用いられる形質転換されたコリネ型細菌の菌体に包含される。
【００４３】
［ＩＩ］ Ｄ−エリスロ−フェニルセリンの製造方法
本発明のＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造方法においては、フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌を用いて、ラセミ−エリスロ−フェニルセリンのうちＬ−エリスロ−フェニルセリンを特異的にグリシンとベンズアルデヒドに分解し、Ｄ−エリスロ−フェニルセリンを残存させる。
ラセミ−エリスロ−フェニルセリンにフェニルセリンアルドラーゼを作用させる方法は特に限定されない。例えば、フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌を培養後、該菌体が培養液中に存在する状態で、あるいは、培養液から分離された菌体、又は、該菌体を凍結後に融解させたものを用いても良い。
【００４４】
フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌を用いたフェニルセリンアルドラーゼ反応を行う場合、該菌体とラセミ−エリスロ−フェニルセリンを含む反応液とを、反応温度を約２０℃〜５０℃、好ましくは約３０℃〜４０℃の範囲で、反応ｐＨを約７〜９、好ましくはｐＨを約８〜８．５の範囲に制御して反応させる。反応はバッチ方式又は連続方式等、いずれの方法も用いることができる。また、反応液と菌体をフィルター等により分離し、菌体を連続的に回収し、繰り返し再使用することも出来る。本発明の方法においては、酵素が反応液から逸散しない限り菌体の生死にかかわらずＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造反応を実施することができる。なお、反応液には補酵素であるピリドキサールリン酸を添加しておくのが好ましい。
【００４５】
なお、本発明で用いられるフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０２３３又は受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０２５２として寄託されている。
【００４６】
以下、実施例を示して本発明の耐熱性フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡを含む遺伝子で形質転換されたコリネ型細菌によるＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造法を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。％は、特に記載のない場合は質量％を示す。
【実施例１】
【００４７】
フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡが増幅発現された形質転換体の作製と該ＤＮＡ高発現の確認
（Ａ）バチルス・スピーシーズ ＰＳ１５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１５１８７）の全ＤＮＡの抽出
肉エキス１％、ポリペプトン１％、塩化ナトリウム０．５％（ｐＨ７．２）からなるブイヨン培地１０ｍＬにバチルス属ＰＳ１５を接種して３７℃にて１２時間培養し、種培養液を得る。次にグリシン０．３％、グルコース１．０％、硫酸アンモニウム０．３％、酵母エキス１．０％（ｐＨ７．０）からなる培地１０ｍＬに上記の種培養液の一部を接種し、３７℃にて２４時間培養し、菌体を集めた。なお上記の方法は特開平９−２３８６８０号公報に記載の方法を参照に行った。
得られた菌体を２ｍｇ／ｍＬの濃度にリゾチウム溶液を含むＴＥバッファー（トリス緩衝液（ｐＨ８．０）−１０ｍＭ、ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液−１ｍＭ）に懸濁し、Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐｒｅｐ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アマシャム社製）を用いて全ＤＮＡを抽出した。
【００４８】
（Ｂ）プライマーの選択
前述したように、フェニルセリンアルドラーゼと同じ作用を示すアルドラーゼとしてＬ−スレオニンアルドラーゼがある。Ｌ−スレオニンアルドラーゼ遺伝子は、原核生物ではエシェリヒア・コリ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第２５５巻，ｐ．２２０−２２６（１９９８年））、アエロモナス・ジャンダイ（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，第６４巻，ｐ．５４９−５５４（１９９８年））、シュードモナス（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，第１７９巻，ｐ．３５５５−３５６０（１９９７年））等のものが、酵母ではサッカロマイセス・セレビシエ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第２４５巻，ｐ．２８９−２９３（１９９７年））等のものが知られている。これら４種のＬ−スレオニンアルドラーゼのアミノ酸配列において保存されている領域、すなわち前記アミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する領域を検討し、プライマー部位として共通配列と思われる配列番号３〜５のアミノ酸配列をもとに、配列番号６又は７に示す塩基配列を設計した。
【００４９】
（Ｃ）ＰＣＲ反応
配列番号６又は７に示すプライマーを用いて上記（Ａ）にて調製した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応にあたってはパーキンエルマー社製もしくはアプライドバイオシステムズ社製のサーマルサイクラーを用いて下記の条件で行った。
反応液：ＫＣｌ ５０ｍＭ、トリス緩衝液（ｐＨ８．４）１０ｍＭ、ＭｇＣｌ２ ２ｍＭ、
鋳型ＤＮＡ １μｇ、プライマー 各０．５μＭ、ｄＮＴＰｓ ２００μＭ、
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）２．５ｕｎｉｔｓ
ＰＣＲサイクル：デナチュレーション：９４℃、６０秒
アニーリング：５０℃、６０秒
エクステンション：７２℃、９０秒
以上を１サイクルとし、計３０サイクル行った。本反応により生成したＤＮＡ断片を１％のアガロースゲルを用いた電気泳動を行って検出したところ、約４５０ｂｐの断片を確認することができた。
【００５０】
（Ｄ）増幅断片のクローン化
上記にて得られたＤＮＡ断片を含む反応液１μＬにクローニングベクターｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）１μＬ及び５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭのジチオトレイトール、１ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｕｎｉｔのＴ４ＤＮＡリガーゼを添加し、４℃にて１５時間反応させた。
得られたプラスミド混合液を用い、塩化カルシウム法によりＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、濃度が５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（Ｔｒｙｐｔｏｎ ｐｅｐｔｏｎｅ １％、Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ０．５％、ＮａＣｌ １％、寒天 １．５％）に塗布した。
【００５１】
（Ｅ）増幅断片の塩基配列の決定
上記にて培地上に生育した株を常法により液体培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてプラスミドを抽出し、適当な制限酵素により切断した後、電気泳動を行ったところ、約４５０ｂｐのＤＮＡ断片の挿入が確認できた。この約４５０ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドより、挿入断片の塩基配列の決定を行った。その結果、配列番号１に示す塩基配列の７２６番目から１１７１番目に相当する配列となることが分かり、これに相当するアミノ酸配列は配列番号２に示すアミノ酸配列の２８番目から１７６番目までに相当する部分となることが明らかとなった。なお塩基配列の決定にはアプライドシステムズ社製のＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して行った。
【００５２】
（Ｆ）ゲノミック・サザンハイブリダイゼーション
上記（Ａ）にて得られた染色体ＤＮＡ２μｇに制限酵素ＰｓｔＩを４５ｕｎｉｔｓ加え、３７℃にて１５時間反応させ完全分解し、アガロースゲル電気泳動に供した後、アガロースゲルをナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋、アマシャム社製）に移しとった。前記にて取得したフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡの部分断片をアマシャム社製のＧｅｎｅ Ｉｍａｇｅｓ ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅキットを用いてフルオレセイン標識化し、これをプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った。検出についてはアマシャム社製のＣＤＰ−Ｓｔａｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅを用いた化学発光検出を行った。
その結果、染色体ＤＮＡをＰｓｔＩ処理した場合、約２．４ｋｂの位置に上記プローブが強くハイブリダイズした。
【００５３】
（Ｇ）インバースＰＣＲ
上記（Ｆ）にて得られた０．８μｇのＰｓｔＩ断片に６６ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭのジチオトレイトール、０．１ｍＭのＡＴＰ、６．６ｍＭのＭｇＣｌ２、１，０００ｕｎｉｔｓのＴ４ＤＮＡリガーゼを添加し、１６℃にて６時間反応（セルフライゲーション）させ、環状ＤＮＡを取得した。この環状ＤＮＡを鋳型として、配列番号８及び９に示すプライマーを用いてＰＣＲを行った。プライマーの設計は上記（Ｅ）にて決定されたＤＮＡ断片の塩基配列をもとに行った。ＰＣＲ反応にあたってはアプライドバイオシステムズ社製のサーマルサイクラーを用いて下記の条件で行った。
反応液：ＫＣｌ ５０ｍＭ、トリス緩衝液（ｐＨ８．４）１０ｍＭ、ＭｇＣｌ２ ２．５ｍＭ、
鋳型ＤＮＡ ０．２μｇ、プライマー各０．５μＭ、ｄＮＴＰｓ ３００μＭ、
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製） ２．５ｕｎｉｔｓ
ＰＣＲサイクル：デナチュレーション：９６℃、０秒
アニーリング：５５℃、３０秒
エクステンション：７２℃、２４０秒
以上を１サイクルとし、計３０サイクル行った。本反応により生成したＤＮＡ断片を１％のアガロースゲルを用いた電気泳動を行って検出したところ、約１，８００ｂｐの断片を確認することができた。
【００５４】
（Ｈ）フェニルセリンアルドラーゼ全塩基配列の決定
上記（Ｇ）にて得られたＤＮＡ断片を上記（Ｄ）と同様の操作でｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、得られたプラスミド混合液を用い、塩化カルシウム法によりＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、濃度が５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した。この培地上に生育した株を常法により液体培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてプラスミドを抽出し、適当な制限酵素により切断した後、電気泳動を行ったところ、約１，８００ｂｐのＤＮＡ断片の挿入が確認できた。この約１，８００ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドより、上記（Ｅ）にて記載の方法により、塩基配列の決定を行った。
その結果、ＰｓｔＩにて処理されたフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片の塩基配列は配列番号１に示す塩基配列の１番目から２４３０番目に相当する配列となることが分かり、このうちフェニルセリンアルドラーゼをコードする遺伝子配列は配列番号１に示す塩基配列の６４５番目から１６８２番目に相当する配列となることが分かった。また、フェニルセリンアルドラーゼのアミノ酸配列は配列番号２に示すアミノ酸配列の１番目から３４５番目までに相当する部分となることが明らかとなった。
フェニルセリンアルドラーゼのアミノ酸配列について、相同性を検索したところ、アエロモナス・ジャンダイ由来のＬ−スレオニンアルドラーゼで４６％、エシェリヒア・コリ由来のＬ−スレオニンアルドラーゼで４４％であり、相同性を有することがＢＣＢＩ Ｐｒｏｔｅｉｎ データベースより確認することができた。
【００５５】
（Ｉ）組換えプラスミドＤＮＡの調製
上記（Ｈ）にて確認された１，０３８ｂｐのフェニルセリンアルドラーゼ遺伝子を大腸菌内で発現させるために、該ＤＮＡ遺伝子をクローニングベクターｐＨＳＧ３９８より調製されたベクターで、大腸菌とコリネ型細菌を宿主とするシャトルベクターｐＣＲＢ１へサブクローニングした。
まずフェニルセリンアルドラーゼ遺伝子のオープンリーディングフレームを含む約１，３００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅させるために、配列番号１０に示す制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位を連結したプライマーと配列番号１１に示す制限酵素ＢａｍＨＩ切断部位を連結したプライマーを用いてＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡ断片を、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにて切断し脱リン酸化処理されたシャトルベクターｐＣＲＢ１と混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ ２．０（タカラバイオ社製）を用いてＤＮＡ断片とベクターを連結した。
【００５６】
（Ｊ）コリネ型細菌への組換えＤＮＡの導入
上記（Ｉ）にて連結した組換えプラスミドＤＮＡ反応液を用いて、電気パルス法によりコリネバクテリウム・グルタミカムＲ株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８９７６）を形質転換し、クロラムフェニコール５０μｇ／ｍＬを含むＡ培地（尿素０．２％、硫酸アンモニウム０．７％、リン酸水素２カリウム０．０５％、リン酸２水素カリウム０．０５％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５％、硫酸鉄・７水和物０．０００６％、硫酸マンガン・７水和物０．０００４２％、ビオチン０．００００２％、チアミン塩酸塩０．００００２％、酵母エキス０．２％、カザミノ酸０．７％、グルコース４％、寒天１．５％）に塗布した。この培地上に生育した株についてコロニーＰＣＲによって確認したところ組換えプラスミド中に目的とする断片が挿入されていることが確認できた。
なお、上記（Ｉ）にて単離されたフェニルセリンアルドラーゼ遺伝子をｐａｌ１と命名し、作製した組換えプラスミドをｐＣＲＢｐａｌ１と命名し、このプラスミドによって形質転換されたコリネバクテリウム・グルタミカムＲ株をＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ／ｐＣＲＢｐａｌ１（独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター 受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２０２５２）と命名した。
【００５７】
（Ｋ）フェニルセリンアルドラーゼのコリネ型細菌内での高発現の確認
上記（Ｊ）にて作製したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ／ｐＣＲＢｐａｌ１をクロラムフェニコール５μｇ／ｍＬを含むＡ培地（尿素０．２％、硫酸アンモニウム０．７％、リン酸水素２カリウム０．０５％、リン酸２水素カリウム０．０５％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５％、硫酸鉄・７水和物０．０００６％、硫酸マンガン・７水和物０．０００４２％、ビオチン０．００００２％、チアミン塩酸塩０．００００２％、酵母エキス０．２％、カザミノ酸０．７％、グルコース４％、）に植菌し、３３℃にて１５時間振とう培養した。得られた菌体を遠心分離（６，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）して菌体をいったん回収し、２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）にて洗浄した。この菌体０．５ｇを０．５ｍＭのジチオスレイトール及び０．０１ｍＭのピリドキサールリン酸を含む２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）１．５ｍＬに懸濁した。
【００５８】
この菌体懸濁液を氷冷下でガラスビーズを用いた超音波破砕により破砕し、これを遠心分離（１４，５００ｒｐｍ、１０分間）し、上清を粗酵素液として得た。また、コリネバクテリウム・グルタミカムＲ株の粗酵素液も同様の手法で得た。一方、ＰＳ１５株の粗酵素液については、菌体懸濁液を氷冷下で超音波破砕にかけて破砕し、これを遠心分離（１４，５００ｒｐｍ、１０分間）することにより、上清を粗酵素液として得た。
得られた粗酵素液を用いてフェニルセリンアルドラーゼ活性の確認を行った。基質としてラセミ−スレオ−フェニルセリンを使用した。反応は１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、４０ｍＭのラセミ−スレオ−フェニルセリン、０．０３ｍＭのピリドキサールリン酸、０．４ｍｇ／ｍＬの粗酵素液存在下（いずれも終濃度）、３７℃にて１０分間行った。その結果、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ／ｐＣＲＢｐａｌ１のアルドラーゼ活性は０．６４８ｕｎｉｔ／ｍｇであることが判った。一方、コリネバクテリウム・グルタミカムＲ株のアルドラーゼ活性は０．０２７２ｕｎｉｔ／ｍｇ、ＰＳ１５株のアルドラーゼ活性は０．０７１３ｕｎｉｔ／ｍｇであったことから、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ／ｐＣＲＢｐａｌ１のアルドラーゼ活性はコリネバクテリウム・グルタミカムＲ株の約２４倍、ＰＳ１５株の約９倍、活性が高いことが判明した。
【００５９】
活性確認にあたっては高速液体クロマトグラフィーシステム（東ソー製）を使用し、反応液中に生成するベンズアルデヒドを以下の条件にて分析することにより活性確認を行った。
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ；東ソー製）
カラム温度：３５℃
溶出液：リン酸アンモニウム溶液２０ｍＭ（ｐＨ３．０）／アセトニトリル９０％（８０：２０；Ｖ／Ｖ）
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出：紫外吸光光度計（２５４ｎｍ）
分析容量：２０μＬ
なお、配列番号１に示すフェニルセリンアルドラーゼとは別の遺伝子も上記（Ａ）〜（Ｈ）の手法にて取得することができ、このアミノ酸配列についてもアエロモナス・ジャンダイ及びエシェリヒア・コリ由来のＬ−スレオニンアルドラーゼと高い相同性を示した。しかし、上記（Ｉ）・（Ｊ）の手法にて組換えプラスミドを作製しコリネ型細菌に導入したものの、アルドラーゼ活性の確認はできなかった。
【００６０】
（Ｌ）新たな組換えＤＮＡの調製とコリネ型細菌への導入
上記（Ｊ）にて作製したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ／ｐＣＲＢ ｐａｌ１は、ｌａｃプロモーターのみを有するためと推定されるが、フェニルセリンアルドラーゼ遺伝子ｐａｌ１の高発現によるＬ−エリスロ−フェニルセリンの分解に対する活性をさらに向上せしめることを目的として、ｌａｃプロモーターとｔａｃプロモーターの二つのプロモーターにてフェニルセリンアルドラーゼを発現させる新たなプラスミドの構築を行った。
【００６１】
図１に示すとおり、まずフェニルセリンアルドラーゼ遺伝子ｐａｌ１のオープンリーディングフレームを含む約１，３００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅させるために、配列番号１０に示す制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位を連結したプライマーと配列番号１２に示す制限酵素ＰｓｔＩ切断部位を連結したプライマーを用いて、上記（Ａ）にて調製した染色体ＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡ断片を、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩにて切断し脱リン酸化処理された大腸菌内発現用プラスミドベクターｐＫＫ２２３−３（アマシャム社製）と混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ ２．０（タカラバイオ社製）を用いてＤＮＡ断片とベクターを連結した。これにより構築されたプラスミドをｐＫＫｐａｌ１と命名した。
【００６２】
次に構築されたプラスミドｐＫＫｐａｌ１のうちｔａｃプロモーターとフェニルセリンアルドラーゼ遺伝子ｐａｌ１のオープンリーディングフレームを含む約１，５００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅させるために、配列番号１３に示す制限酵素ＢｇｌＩＩ切断部位を連結したプライマーと配列番号１４に示す制限酵素ＰｓｔＩ切断部位を連結したプライマーを用いて、上記にて作製したプラスミドｐＫＫｐａｌ１を鋳型とし、ＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡ断片を、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩにて切断し脱リン酸化処理されたシャトルベクターｐＣＲＢ１と混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ ２．０（タカラバイオ社製）を用いてＤＮＡ断片とベクターを連結した。この新たに作製したプラスミドを上記（Ｊ）と同様の手法でコリネバクテリウム・グルタミカムＲ株に導入した。
【００６３】
上記にて作製した組換えプラスミドをｐＣＲＢｔａｃＰｐａｌ１と命名し、このプラスミドによって形質転換されたコリネバクテリウム・グルタミカムＲ株をＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ／ｐＣＲＢ ｔａｃＰ ｐａｌ１（独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター 受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２０２３３）と命名した。
【００６４】
新たに形質転換されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ／ｐＣＲＢ ｔａｃ Ｐｐａｌ１について、上記（Ｋ）と同様の手法により粗酵素液を取得し、フェニルセリンアルドラーゼ活性の確認を行った。その結果、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ／ｐＣＲＢ ｔａｃ Ｐｐａｌ１のアルドラーゼ活性は１．４３ ｕｎｉｔ／ｍｇとなり、上記（Ｋ）にて測定したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ／ｐＣＲＢ ｐａｌ１のアルドラーゼ活性の約２．２倍、活性が高いことが分かった。
なお、活性確認にあたっては高速液体クロマトグラフィーシステムを用いて、上記（Ｋ）と同様の手法で行った。
【実施例２】
【００６５】
形質転換されたコリネ型細菌を用いたＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造法（１）
上記実施例１の（Ｌ）にて作成したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ／ｐＣＲＢ ｔａｃＰ ｐａｌ１を用いてラセミ−エリスロ−フェニルセリンからのＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造を行った。まず、実施例１の（Ｋ）と同様の手法によりＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ／ｐＣＲＢ ｔａｃＰ ｐａｌ１を培養し、集菌及び洗浄後、菌体０．２ｇを０．５ｍＭのジチオスレイトール及び０．０１ｍＭのピリドキサールリン酸を含む２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍＬに懸濁した。この菌体懸濁液に界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ナカライテスク社製）を終濃度が０．５％となるよう加え、３３℃にて１５時間振とうした。
【００６６】
上記にて界面活性剤処理されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ／ｐＣＲＢ ｔａｃＰ ｐａｌ１をＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造に用いた。４０ｍＭのラセミ−エリスロ−フェニルセリン溶液（ｐＨ３．０）、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、０．０３ｍＭのピリドキサールリン酸（いずれも終濃度）を含む反応液に界面活性剤処理されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ／ｐＣＲＢ ｔａｃＰ ｐａｌ１菌体懸濁液を反応液の２０％を占めるよう添加して反応液容量を１ｍＬとし、３７℃にて反応を行った。その結果、反応から１０分後のフェニルセリン濃度を分析したところ、Ｄ−エリスロ−フェニルセリンの濃度が１９．３ｍＭであるのに対し、Ｌ−エリスロ−フェニルセリンの濃度は１．７４ｍＭであった。以上から、ラセミ−エリスロ−フェニルセリンのうち、Ｌ体のみが分解され、Ｄ体はほぼ残存されることがわかった。
【００６７】
なお、フェニルセリンの分析にあたっては高速液体クロマトグラフィーシステム（東ソー製）を使用し、反応液中のフェニルセリンを以下の条件にて分析した。
カラム：ＣＲＯＷＮＰＡＫ ＣＲ（＋）（４．０ｍｍ×１５０ｍｍ；ダイセル化学製）
カラム温度：５℃
溶出液：過塩素酸水溶液（ｐＨ１．０）
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
検出：紫外吸光光度計（２５４ｎｍ）
分析容量：１０μＬ
【実施例３】
【００６８】
形質転換されたコリネ型細菌を用いたＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造（２）
形質転換されたコリネ型細菌を用いたラセミ−エリスロ−フェニルセリンからのＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造を、反応液組成：４０ｇ／Ｌのラセミ−エリスロ−フェニルセリン溶液（ｐＨ８．０）、４ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、０．０３ｍＭのピリドキサールリン酸からなる反応液に実施例２と同様の条件、方法にて界面活性剤処理されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ／ｐＣＲＢ ｔａｃＰ ｐａｌ１菌体懸濁液を反応液の２％を占めるよう添加し、反応液容量を１ｍＬとして３７℃にて反応を行った。
【００６９】
その結果、図２に示すとおり、反応から９時間後のＤ−エリスロ−フェニルセリンの濃度が１８．７ｇ／Ｌであるのに対し、Ｌ−エリスロ−フェニルセリンの濃度は２．５８ｇ／Ｌであった。以上から、基質濃度を高濃度にし、また菌体量が少なくても、８０％以上のＬ−エリスロ−フェニルセリンが効率よく分解されてＤ−エリスロ−フェニルセリンが反応液中にほぼ残存されることが分かった。なお、フェニルセリンの分析にあたっては、上記実施例２と同様の手法により分析した。
【実施例４】
【００７０】
形質転換されたコリネ型細菌の繰り返し利用によるＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造法（１）
ラセミ−エリスロ−フェニルセリンからのＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造において、形質転換されたコリネ型細菌をＬ−エリスロ−フェニルセリンの分解反応後、この菌体を回収し再度分解反応に使用する方法、いわゆる繰り返し反応を試みた。
反応液組成：４０ｇ／Ｌのラセミ−エリスロ−フェニルセリン溶液（ｐＨ８．０）、４ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、０．０３ｍＭのピリドキサールリン酸、からなる反応液に実施例２と同様の条件、方法にて界面活性剤処理されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ／ｐＣＲＢ ｔａｃＰ ｐａｌ１菌体懸濁液を反応液の１５％を占めるよう添加して反応液容量を１ｍＬとし、３７℃にて１時間反応を行った。反応後、遠心分離により菌体を回収し、この菌体を０．５ｍＭのジチオスレイトール及び０．０１ｍＭのピリドキサールリン酸を含む２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して実施例２と同様の方法にて界面活性剤処理を行った後（但し、二回目以降の界面活性剤処理に於いては処理浸とう時間は各々０．５時間とした。）、再度４０ｇ／Ｌのラセミ−エリスロ−フェニルセリン溶液（ｐＨ８．０）、４ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、０．０３ｍＭのピリドキサールリン酸、からなる処理菌体を含む反応液を調製し反応液容量を１ｍＬとして３７℃にて１時間反応を行った。この操作を５回繰り返し、合計６時間反応を行った。
【００７１】
１時間おきに反応液の上清をサンプリングし、フェニルセリン濃度の分析を行った。その結果、［図３］に示すとおりとなった。１回目の反応、すなわち１時間後の反応ではＤ−エリスロ−フェニルセリンの濃度が１９．９ｇ／Ｌであるのに対し、Ｌ−エリスロ−フェニルセリンの濃度は１．６１ｇ／Ｌとなり、４回目の反応後 (反応使用履歴時間の総和：４時間) では、Ｄ−エリスロ−フェニルセリンの濃度が２０．０ｇ／Ｌであるのに対し、Ｌ−エリスロ−フェニルセリンの濃度は５．３２ｇ／Ｌとなり、６回目の反応後 (反応使用履歴時間の総和：６時間) では、Ｄ−エリスロ−フェニルセリンの濃度が２０．２ｇ／Ｌであるのに対し、Ｌ−エリスロ−フェニルセリンの濃度は６．９６ｇ／Ｌとなった。このことから、形質転換されたコリネ型細菌の繰り返し利用によりＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造が可能であることが示された。なお、フェニルセリンの分析にあたっては、上記実施例２と同様の手法により分析した。
【実施例５】
【００７２】
形質転換されたコリネ型細菌の繰り返し利用によるＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造法（２）
上記実施例４にて行った繰り返し反応について、反応液中に加えるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ／ｐＣＲＢ ｔａｃＰ ｐａｌ１菌体懸濁液の濃度を高くして反応を行った。即ち
反応液組成：４０ｇ／Ｌのラセミ−エリスロ−フェニルセリン溶液（ｐＨ８．０）、４ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、０．０３ｍＭのピリドキサールリン酸、からなる反応液に界面活性剤処理されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ／ｐＣＲＢ ｔａｃＰ ｐａｌ１菌体懸濁液を反応液の２０％を占めるよう添加して反応液容量を１ｍＬとし、３７℃にて１時間反応を行った。反応後、遠心分離により菌体を回収し、この菌体を０．５ｍＭのジチオスレイトール及び０．０１ｍＭのピリドキサールリン酸を含む２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して実施例４と同様の方法にて界面活性剤処理を行った後(但し、二回目以降の界面活性剤処理に於いては処理浸とう時間は各々０．５時間とした。)、再度４０ｇ／Ｌのラセミ−エリスロ−フェニルセリン溶液（ｐＨ８．０）、４ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、０．０３ｍＭのピリドキサールリン酸からなる処理菌体を含む反応液を調製し反応液容量を１ｍＬとして３７℃にて１時間反応を行った。この操作を実施例４と同様に５回繰り返し、合計６時間反応を行った。
【００７３】
１時間おきに反応液の上清をサンプリングし、フェニルセリン濃度の分析を行った。その結果、［図４］に示すとおりとなった。１回目の反応、すなわち１時間後の反応ではＤ−エリスロ−フェニルセリンの濃度が１９．１ｇ／Ｌであるのに対し、Ｌ−エリスロ−フェニルセリンの濃度は１．３９ｇ／Ｌとなり、４回目の反応後（反応使用履歴時間の総和：４時間）では、Ｄ−エリスロ−フェニルセリンの濃度が２０．１ｇ／Ｌであるのに対し、Ｌ−エリスロ−フェニルセリンの濃度は２．５８ｇ／Ｌとなり、６回目の反応後（反応使用履歴時間の総和：６時間）では、Ｄ−エリスロ−フェニルセリンの濃度が２０．２ｇ／Ｌであるのに対し、Ｌ−エリスロ−フェニルセリンの濃度は３．１５ｇ／Ｌとなった。このことから、形質転換されたコリネ型細菌の量を増やすことにより、繰り返しの回数が多くても、都度の界面活性剤処理は必要とするものの、Ｌ−エリスロ−フェニルセリン分解反応の反応性がほぼ維持されることが示された。なお、フェニルセリンの分析にあたっては、上記実施例２と同様の手法により分析した。
【００７４】
［比較例］
形質転換された大腸菌の繰り返し利用によるＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造法
上記実施例４及び実施例５にて、ラセミ−エリスロ−フェニルセリンからのＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造法に形質転換されたコリネ型細菌の繰り返し利用が可能であることを示した。形質転換されたコリネ型細菌同様に形質転換された大腸菌もまた繰り返し利用が有効であるかを調べるために、形質転換された大腸菌の繰り返し利用によるＤ−エリスロ−フェニルセリン生成反応を行った。
使用した形質転換された大腸菌は以下のようにして構築した。すなわち、上記実施例１にて作製した組換えプラスミドｐＣＲＢｔａｃＰｐａｌ１溶液を用いて塩化カルシウム法によりＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、形質転換された大腸菌を作製した。この形質転換された大腸菌をｐＣＲＢｔａｃＰｐａｌ１／ＪＭ１０９と命名した。
【００７５】
形質転換された大腸菌ｐＣＲＢｔａｃＰｐａｌ１／ＪＭ１０９を用いた反応は次のようにして行った。まず、クロラムフェニコール５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地（Ｔｒｙｐｔｏｎ ｐｅｐｔｏｎｅ １％、Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ０．５％、ＮａＣｌ １％）に植菌し、３７℃にて１５時間培養し、集菌及び洗浄後、菌体０．２ｇを０．５ｍＭのジチオスレイトール及び０．０１ｍＭのピリドキサールリン酸を含む２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍＬに懸濁し、ｐＣＲＢｔａｃＰｐａｌ１／ＪＭ１０９の菌体懸濁液を作成した。この菌体懸濁液に実施例２と同様に界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ナカライテスク社製）を終濃度が０．５％となるように加え、３３℃にて１５時間浸とうした。そして４０ｇ／Ｌのラセミ−エリスロ−フェニルセリン溶液（ｐＨ８．０）、４ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、０．０３ｍＭのピリドキサールリン酸、からなる反応液にこの界面活性剤処理した菌体懸濁液を反応液の２０％を占めるよう添加して反応液容量を１ｍＬとし、３７℃にて１時間反応を行った。反応後、遠心分離により菌体を回収し、この菌体を０．５ｍＭのジチオスレイトール及び０．０１ｍＭのピリドキサールリン酸を含む２０ ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して実施例２と同様の方法にて界面活性剤処理を行った後(但し、二回目以降の界面活性剤処理に於いては処理浸とう時間は各々０．５時間とした。)、再度４０ｇ／Ｌのラセミ−エリスロ−フェニルセリン溶液（ｐＨ８．０）、４ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、０．０３ｍＭのピリドキサールリン酸からなる処理菌体を含む反応液を調製し反応液容量を１ｍＬとして３７℃にて１時間反応を行った。この操作を５回繰り返し、合計６時間反応を行った。
１時間おきに反応液の上清をサンプリングし、フェニルセリン濃度の分析を行った結果を［図５］に示す。１回目及び２回目の反応、すなわち１時間後及び２時間後の反応ではＬ−エリスロ−フェニルセリンの濃度は２．００ｇ／Ｌ以下であったものの、３回目の反応、すなわち３時間後の反応（反応使用履歴時間の総和：３時間）ではＬ−エリスロ−フェニルセリンの濃度は９．８６ｇ／Ｌとなり、反応性が急激に悪くなった。その後繰り返し反応を続けた結果、６回目の反応、すなわち６時間後の反応（反応使用履歴時間の総和：６時間）ではＬ−エリスロ−フェニルセリンの濃度は１２．８ｇ／Ｌとなった。このことから、形質転換された大腸菌は形質転換されたコリネ型細菌と異なり、繰り返し反応には適さないことが示された。なお、フェニルセリンの分析にあたっては、上記実施例２と同様の手法により分析した。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明は医薬や農薬（例えばチアンフェニコールやフロロフェニコール、クロラムフェニコール等）などの中間体として有用なＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造方法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１は、組換えプラスミドｐＣＲＢｔａｃＰｐａｌ１の構築過程を示すフローチャートである。
【図２】図２は、形質転換されたコリネ型細菌を用いたラセミ−エリスロ−フェニルセリン分解反応を表すグラフである。
【図３】図３は、形質転換されたコリネ型細菌の繰り返し利用によるラセミ−エリスロ−フェニルセリン分解反応を表すグラフである（反応液中の菌体の割合は１５％）。
【図４】図４は、形質転換されたコリネ型細菌の繰り返し利用によるラセミ−エリスロ−フェニルセリン分解反応を表すグラフである（反応液中の菌体の割合は２０％）。
【図５】図５は、形質転換された大腸菌の繰り返し利用によるラセミ−エリスロ−フェニルセリン分解反応を表すグラフである（反応液中の菌体の割合は２０％）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬や農薬又は他の有用な化学物質（例えばチアンフェニコールやフロロフェニコール、クロラムフェニコール等）などの中間体として有用なことが知られているＤ−エリスロ−フェニルセリンを製造する方法に関する。さらに詳しくは、ラセミ−エリスロ−フェニルセリンのＬ−エリスロ−フェニルセリンのみを特異的にグリシンとベンズアルデヒドに分解する能力を有する酵素を産生する微生物あるいはその菌体調製物により、Ｄ−エリスロ−フェニルセリンを選択的に製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、Ｄ−エリスロ−フェニルセリンの合成は、以下の方法により行われていた。即ち、ベンズアルデヒドとグリシンを強アルカリ存在下で縮合させることによりラセミ−スレオ／エリスロ−フェニルセリンを得た後、スレオ／エリスロ体の相互分離処理を行い、得られたラセミ−エリスロ−フェニルセリンのアミノ基部分に置換基（例えばＮ−アシル基等）を導入した後、キニン、ブルシン等の光学分割剤を用いて光学分割を行い、最後にアミノ基部分の置換基を除去する方法である（化学合成法；特許文献１〜４）。
しかし、上記ベンズアルデヒドとグリシンからの化学合成法では、高立体選択的な合成が困難なため、スレオ／エリスロ体、Ｄ／Ｌ体の４種類の異性体が生成し、目的のＤ−エリスロ−フェニルセリンを得るためには繁雑な分離工程が必要となるばかりでなく、Ｄ／Ｌ体の光学分割にはキニン、ブルシン等の非常に高価な光学分割剤を用いなければならない等の問題点がある。
【０００３】
また、キサントモナス属等より得られるＬ−アロスレオニンアルドラーゼの合成に関与する遺伝子を担うＤＮＡで形質転換されたキサントモナス属等の形質転換体に、ラセミ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸を作用させて、Ｌ−体のみを特異的にグリシンと対応するアルデヒド誘導体に分解させ、Ｄ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸を得る方法が知られている（特許文献５参照）。しかし、ラセミ−エリスロ−フェニルセリンからのＬ−アロスレオニンアルドラーゼを用いた酵素反応による光学分割法は、用いる酵素がラセミ−エリスロ−フェニルセリンに対して活性がそれほど高くなく、この点に関しても技術的解決が求められている。
【０００４】
酵素反応法自体に関しては、目的酵素を産生する菌体微生物より酵素を単離・精製し、使用する方法や菌体内酵素を菌体のまま使用する方法も広く周知の事となっている。しかし、酵素反応自体に関しては、菌体内酵素を菌体のまま使用する方法は、目的酵素を産生する菌体微生物より単離・精製した酵素を用いる方法における、酵素産生菌体培養液を遠心分離して菌体を収集し、これを超音波処理等の機械的粉砕後、再度遠心分離により無細胞抽出液を得、硫安分別や有機溶媒分別とイオン交換クロマト分別を適宜組み合わせて酵素を単離・精製する等の、多段階の工程操作を必要としない方法なのでより簡便な方法となる。しかし、この菌体内酵素反応では菌体と反応生成物の分離が膜ろ過分離法等の簡単な方法で可能なものの、菌体自体が強固であって、かつ、分離・回収して繰り返し利用が出来なければ効率的な菌体内酵素反応が実施できないという問題があった。
【特許文献１】特開昭５１−３２５４０号公報
【特許文献２】特開昭５８−２１６１４６号公報
【特許文献３】特開昭５９−２２２４６５号公報
【特許文献４】特開昭５９−２１６８５８号公報
【特許文献５】特開平６−１６５６９３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記問題を解決し、ラセミ−エリスロ−フェニルセリンからＤ−エリスロ−フェニルセリンを製造又は光学分割することのできる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、Ｄ−エリスロ−フェニルセリンの合成方法に関し鋭意検討を行った結果、フェニルセリンに対して活性の高いフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡを、強固な細胞壁を有するコリネ型細菌で高発現させた形質転換コリネ菌を創製し、該菌体をラセミ−エリスロ−フェニルセリンに作用させると、効率良くＬ−エリスロ−フェニルセリンのみを分解して、Ｄ−エリスロ−フェニルセリンが高選択的に製造できることを見出し、本発明に到達した。
【０００７】
即ち、本発明は、
（１） フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌を、ラセミ−エリスロ−フェニルセリンに作用させ、Ｌ−エリスロ−フェニルセリンを分解し、残存するＤ−エリスロ−フェニルセリンを採取することを特徴とするＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造方法、
（２） フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡが、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡであることを特徴とする前記（１）記載の方法；
（ａ）配列番号１における６４５−１６８２番目の塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフェニルセリンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつフェニルセリンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（３） フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡがＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＰＳ−１５株（独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５１８７）由来ＤＮＡであることを特徴とする前記（２）記載の方法、
（４） フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌が、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌およびアースロバクター属菌から選択される１種の菌であることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法、
（５） フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌が、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０２５２又は受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０２３３として寄託されたものであることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法、
（６） フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌を繰り返し再使用することを特徴とする前記（１）記載の方法、
（７） 以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡを含有する遺伝子；
（ａ）配列番号１における６４５−１６８２番目の塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフェニルセリンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつフェニルセリンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（８） 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質；
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつフェニルセリンアルドラーゼ活性を有するタンパク質、
（９） 前記（７）に記載の遺伝子を含有するベクター、
（１０） 前記（９）に記載の遺伝子を含有するベクターを含む形質転換体、
（１１） 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０２５２であるコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／ｐＣＲＢ ｐａｌｌ株、
（１２） 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０２３３であるコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／ｐＣＲＢ ｔａｃＰ ｐａｌｌ株、
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により形質転換されたコリネ型細菌は、その菌体中でフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡを含む遺伝子を大量に発現させることが可能となった。フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡを含む遺伝子を高発現させるように形質転換されたコリネ型細菌を用いると、ラセミ−エリスロ−フェニルセリンからＤ−エリスロ−フェニルセリンを工業的に容易に且つ高収率で製造し得る。しかも、前記形質転換されたコリネ型細菌は組換え大腸菌等とは異なり繰り返し再利用が可能なため、非常に効率良くＤ−エリスロ−フェニルセリンを製造できる。この結果、医薬、農薬（例えばチアンフェニコールやフロロフェニコール、クロラムフェニコール等）などの中間体として有用なＤ−エリスロ−フェニルセリン製造がコストダウンを含めて工業的に有利に実施することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
フェニルセリンアルドラーゼは主としてＬ−エリスロ−フェニルセリンからグリシンとベンズアルデヒドを生成する反応を触媒する酵素である。また、フェニルセリンアルドラーゼは、前記の逆反応でグリシンとベンズアルデヒドからＬ−エリスロ−フェニルセリンを生成する反応も触媒する酵素である。フェニルセリンアルドラーゼが細胞内で著量蓄積できれば、Ｄ−エリスロ−フェニルセリンの生産に有効に使用できると考えられる。
【００１０】
フェニルセリンアルドラーゼとしては、例えば配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。またフェニルセリンアルドラーゼには、前記配列番号２において１若しくは複数個〔例えば、数個（例えば１〜８個；以下同様である。）〕のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつフェニルセリンアルドラーゼ活性を有するタンパク質等も含まれる。
前記置換又は付加によって導入されるアミノ酸は、遺伝子によりコードされる２０種類のアミノ酸以外の非天然アミノ酸であってもよい。非天然アミノ酸は、アミノ基とカルボキシル基を有する限りどのような化合物でもよいが、例えばγ−アミノ酪酸等が挙げられる。
【００１１】
上記フェニルセリンアルドラーゼは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）又はエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチル等のＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル等のＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチル等のＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチル等のフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチル等のα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基等のＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基等が用いられる。フェニルセリンアルドラーゼが、Ｃ末端以外にカルボキシル基（又はカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化又はエステル化されているものも本発明におけるフェニルセリンアルドラーゼに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステル等が用いられる。さらに、フェニルセリンアルドラーゼには、上記したタンパク質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル等のＣ２−６アルカノイル基等のＣ１−６アシル基等）で保護されているもの、Ｎ末端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基等）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル等のＣ２−６アルカノイル基等のＣ１−６アシル基等）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質等の複合蛋白質等も含まれる。
【００１２】
本発明で用いられる上記フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡとしては、フェニルセリンアルドラーゼを有する動物、植物、又は、微生物由来のいずれのＤＮＡでも使用できるが、工業的な利用には微生物由来のものが好ましい。前記微生物としては、例えばバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）を好ましく挙げることができる。
【００１３】
本発明で用いられるフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡは、好ましくは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する微生物由来のＤＮＡ、さらに好ましくは、バチルス・スピーシーズ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）由来のＤＮＡ、とりわけ好ましくはバチルス・スピーシーズ ＰＳ−１５株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＰＳ−１５；ＦＥＲＭ Ｐ−１５１８７、特開平９−２３８６８０号公報）由来のＤＮＡが挙げられる。バチルス・スピーシーズ ＰＳ−１５株は、耐熱性のフェニルセリンアルドラーゼを生産する微生物として自然界から分離され、バチルス属に属する菌株として同定されたものである。
【００１４】
バチルス・スピーシーズ ＰＳ−１５株由来のフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡとしては、上記したフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡ、あるいは例えば配列番号１に示される塩基配列の６４５番目から１６８２番目に相当する塩基配列を含むＤＮＡ、又は前記ＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフェニルセリンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、あるいはフェニルセリンアルドラーゼ活性を有するタンパク質、例えば配列番号２で示されアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡもしくは前記アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつフェニルセリンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ等が挙げられる。なお、前記ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば前記ＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、約０．７〜１．０Ｍ程度の塩化ナトリウム存在下、約６５℃程度でハイブリダイゼーションを行った後、約０．１〜２倍程度の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムよりなる。）を用い、約６５℃程度の条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。
【００１５】
また、上記ＤＮＡには、例えば配列番号１に示される塩基配列の６４５番目から１６８２番目に相当する塩基配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を有し、かつフェニルセリンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ等も含まれる。ハイブリダイゼーションは、公知の方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）：以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す。）に記載の方法等に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
また、フェニルセリンアルドラーゼの発現をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に対してアンチセンスであるｍＲＮＡの転写をコードするＤＮＡも、上記したフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡに含まれる。
【００１６】
本発明に使用されるコリネ型細菌は、バージーズ・マニュアル・デターミネイティブ・バクテリオロジー〔（Ｂａｒｇｅｙｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，第８巻，ｐ．５９９、１９７４年）〕に定義されている一群の微生物であり、好気性、グラム陽性、非抗酸性、胞子形成能を有さない桿菌を意味し、例えば、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌そしてマイクロコッカス属菌等が挙げられる。
【００１７】
具体的には、コリネバクテリウム属菌としては、コリネバクテリウム グルタミカムＲ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ）独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８９７６，ＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１３０５８、ＡＴＣＣ１３０５９、ＡＴＣＣ１３０６０、ＡＴＣＣ１３２３２、ＡＴＣＣ１３２８６、ＡＴＣＣ１３２８７、ＡＴＣＣ１３６５５、ＡＴＣＣ１３７４５、ＡＴＣＣ１３７４６、ＡＴＣＣ１３７６１、ＡＴＣＣ１４０２０及びＡＴＣＣ３１８３１等が挙げられる。
【００１８】
ブレビバクテリウム属菌としては、ブレビバクテリウム ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウム フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）及びＭＪ−２３３ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６８７２等があげられる。アースロバクター属菌としては、アースロバクター グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ８０１０、ＡＴＣＣ４３３６，ＡＴＣＣ２１０５６，ＡＴＣＣ３１２５０，ＡＴＣＣ３１７３８及びＡＴＣＣ３５６９８等が挙げられる。
【００１９】
本発明で用いられるコリネ型細菌は自然界に存する野生株の変異株（例えば、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８９７７，受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８９７８株等）であってもよい。これらの変異株は特開２００４−８９０２９に記載された方法に従って作成できる。
上記コリネ型細菌の中でも、コリネバクテリウム属菌やブレビバクテリウム属菌が好ましく、とりわけ独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８９７６として寄託されているコリネバクテリウム グルタミカムＲ株が好ましい。
【００２０】
以下、［Ｉ］ フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡが増幅発現されたコリネ型細菌形質転換体、及び、［ＩＩ］ Ｄ−エリスロ−フェニルセリンの製造方法について詳細に説明する。
【００２１】
［Ｉ］ フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡが増幅発現されたコリネ型細菌形質転換体の製造方法
バチルス・スピーシーズ ＰＳ−１５株の生産するフェニルセリンアルドラーゼはＬ−エリスロ−フェニルセリンからグリシンとベンズアルデヒドを生成する反応を触媒するほか、その逆反応でグリシンとベンズアルデヒドからＬ−エリスロ−フェニルセリンを生成する反応も触媒する。フェニルセリンアルドラーゼが細胞内で著量蓄積できれば、Ｄ−エリスロ−フェニルセリンの生産（光学分割）に有効に使用できると考えられる。
【００２２】
本発明においては、ラセミ−エリスロ−フェニルセリンの光学分割反応に必要な酵素量を確保するために、Ｌ−エリスロ−フェニルセリンに作用するフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡの発現量を上昇させる形質転換体を創製する。
フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡの発現量を上昇させるためには通常、例えば強力なプロモーターを挿入したり、リプレッサータンパク質の発現量を制御したりする等して、フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡの発現調節機構の改良を行えばよい。また、多コピー型のベクターに接続して組換えＤＮＡを作製し、微生物に保持させることが好ましい。
フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡの発現量を上昇させる微生物の創製にあたっては、バチルス属由来のフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡをＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を用いて必要なＤＮＡ領域を増幅取得し、プラスミド等のベクターに挿入して宿主細胞であるコリネ型細菌を形質転換するのが好ましい。
【００２３】
ここで、組換えＤＮＡ技術によってフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡが増幅発現された形質転換体を創製する方法について、下記の順に説明する。
（１）フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡの調製
（２）組換えＤＮＡの調製
（３）形質転換体の創製
（４）フェニルセリンアルドラーゼの生成蓄積
【００２４】
（１）フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡの調製
フェニルセリンアルドラーゼのアミノ酸配列は知られていないため、フェニルセリンアルドラーゼと類似の作用を示し、かつアミノ酸配列が公知の酵素との相同性を示すアミノ酸配列を指標にフェニルセリンアルドラーゼのアミノ酸配列をまず決定した。フェニルセリンアルドラーゼと類似の作用を示す酵素として、Ｌ−スレオニンアルドラーゼが挙げられる。Ｌ−スレオニンアルドラーゼは、フェニルセリンアルドラーゼ同様、Ｌ−スレオニンからグリシンとアセトアルデヒドへ分解する反応を触媒する酵素である。従って、フェニルセリンアルドラーゼのアミノ酸配列はＬ−スレオニンアルドラーゼのアミノ酸配列と高い相同性を示すことが考えられる。
【００２５】
Ｌ−スレオニンアルドラーゼはＥ．ｃｏｌｉをはじめとするエシェリヒア属、アエロモナス属、シュードモナス属等の細菌〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第２５５巻，ｐ．２２０−２２６（１９９８年）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，第６４巻，ｐ．５４９−５５４（１９９８年）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，第１７９巻，ｐ．３５５５−３５６０（１９９７年）〕やサッカロマイセス属等の酵母〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第２４５巻，ｐ．２８９−２９３（１９９７年）〕より取得されており、そのＤＮＡ配列も知られている。
【００２６】
本発明においては、まずバチルス属微生物、例えば、前記のバチルス・スピーシーズ ＰＳ１５株を常法、具体的には特開平９−２３８６８０号公報記載の方法に従い培養し、培養物から菌体を集め、該菌体から染色体ＤＮＡを抽出する。染色体ＤＮＡの抽出は常法、例えばＧｅｎｏｍｅ Ｐｒｅｐ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アマシャム製）を用いて簡便に行うことができる。
【００２７】
次に、上記の細菌又は酵母由来Ｌ−スレオニンアルドラーゼの数種〔少なくとも２種以上、好ましくは数種（約３〜５種）〕のアミノ酸配列を対比し、共通の配列又は相同性の高い配列部位を選択する。選択したアミノ酸配列（例えば、配列番号３〜５で示されるアミノ酸配列等）をもとにオリゴヌクレオチドを設計する。設計したオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い、フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡの部分断片を得る。このようなプライマーとしては、例えば配列番号３〜５に示されるアミノ酸配列に相当する塩基配列（配列番号６又は７）が挙げられる。ＰＣＲ反応は公知のＰＣＲ増幅装置、例えばサーマルサイクラー等を利用し得る。ＰＣＲのサイクルは、デナチュレーション→アニーリング→エクステンションを１サイクルとして、約１０〜１００サイクル、好ましくは約２０〜５０サイクル程度が好ましい。
【００２８】
ＰＣＲにて得られたＤＮＡ断片は適当なクローニングベクター、例えばｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）へサブクローニングする。次いで、前記ベクターを、例えばＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９菌株等に導入し、該菌株を形質転換する。この形質転換された菌株を適当な抗生物質（例．アンピシリン、クロラムフェニコール等）を含む培地で培養し、培養物から菌体を回収する。
回収された菌体から常法、例えばＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）等を用いてプラスミドＤＮＡを抽出する。この抽出されたプラスミドＤＮＡの塩基配列を決定することにより、本発明のフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡの部分配列を含むＤＮＡ断片を取得することができる。
得られたＤＮＡ断片の塩基配列は、例えばジデオキシヌクレオチド酵素法等、公知の方法により決定することができる。また、キャピラリ電気泳動システムを用い、検出には多色蛍光技術を使用する例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドシステムズ社製）等を使用して自動的に分析することもできる。
【００２９】
上記のようにして、フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡの部分配列を含むＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、例えば、配列番号１に示す７２６番目から１１７１番目に相当する塩基配列と決定し得る。次いで該塩基配列をアミノ酸配列に翻訳して解析する。その結果、翻訳されたアミノ酸配列は、配列番号２に示すアミノ酸配列の２８番目から１７６番目までに相当し、またその部分配列をコードするＤＮＡは配列番号１に示す塩基配列の７２６番目から１１７１番目に相当し得る。
【００３０】
フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡ全体を含むＤＮＡ断片を得るにはバチルス属微生物、例えば前記バチルス・スピーシーズ ＰＳ１５株の染色体ＤＮＡライブラリーを作製し、上記フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡの部分断片（例えば配列番号１に示す７２６番目から１１７１番目に相当する塩基配列；以下同様である。）をプローブとするサザンハイブリダイゼーションにより、フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡを含む染色体ＤＮＡを単離する方法が挙げられる。
【００３１】
上記バチルス・スピーシーズ ＰＳ１５株より抽出した染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばＰｓｔＩ等を用いて部分分解し、アガロースゲルによる電気泳動後、この断片をナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋、アマシャム社製）に移し取り、前記のフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡの部分断片をプローブとして用いたサザンハイブリダイゼーションを行う。
【００３２】
上記操作によって、フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡの部分断片を含むバチルス属菌、例えばバチルス・スピーシーズ ＰＳ１５株の染色体ＤＮＡ制限酵素断片が７ｋｂ以内であれば、この制限酵素断片のセルフライゲーションを行う。かくしてフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡの部分断片を含む環状ＤＮＡを取得することができる。
【００３３】
次に、上記にて取得した環状ＤＮＡを鋳型とし、前記にて決定されたフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡの部分断片をもとに設計されたプライマーを用いてインバースＰＣＲを行う。このようなプライマーとして、例えば配列番号１の７５０〜７７０番目及び１１２２〜１１４５番目に示される塩基配列に相当する部位を選び、その塩基配列又はその相補配列（例えば配列番号８及び９）を設計することができる。
【００３４】
上記インバースＰＣＲにて得られたＤＮＡ断片はフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡの両末端側を含む断片である。この断片を適当なクローニングベクター、例えばｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）へサブクローニングし、エシェリヒア・コリＪＭ１０９株を形質転換する。このプラスミドにより挿入されたＤＮＡの塩基配列を決定することにより、本発明のフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡを決定することができる。
【００３５】
このようにして得られるフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ制限酵素切断断片としては、バチルス属微生物、例えばバチルススピーシーズ ＰＳ１５株染色体ＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで切断して得られる、大きさ約２．４ｋｂの例えば配列番号１で示されるＤＮＡ断片を挙げることができる。このＤＮＡ断片の塩基配列を決定したところ、オープンリーディングフレームの存在が確認され、その構造遺伝子領域は後記配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列中のアミノ酸番号１〜３４５の３４５個のアミノ酸配列をコードする１０３８塩基対から構成されることがわかった。
【００３６】
（２）組換えＤＮＡの調製
本発明における組換えＤＮＡとは、上述のフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡを含むＤＮＡをプラスミドベクターに接続したものをいう。ここでベクターとしてはｐＵＣ系のプラスミドベクター及びその誘導体等が挙げられる。その際、フェニルセリンアルドラーゼを効率的に発現させるために、例えばｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、その他微生物内で機能するプロモーターを用いるのが好ましい。また、形質転換体を選別するために、ベクターは例えばクロラムフェニコール等の抗生物質耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。本発明に用いるｐＵＣ系プラスミドベクターとしては、例えばシャトルベクターｐＣＲＢ１（ＡＣＳ ＳＹＭＰＯＳＩＵＭ ＳＥＲＩＥＳ ８６２，“ＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”Ｃｈａｐｔｅｒ１１，ｐ１７５−ｐ１９１，Ｅｄ．ｂｙＢ．Ｄ．Ｓａｈａ，ＡＣＳ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ 参照）、ｐＵＳ１８又はＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドベクター等を好ましく挙げることができる。中でもｐＣＲＢ１は、クローニングベクターであるｐＨＳＧ３９８（タカラバイオ社製）より調製されたベクターで、大腸菌とコリネ型細菌内で該有用遺伝子を発現させるシャトルベクターとして本発明において好ましく用いることができる。
【００３７】
フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡを取得するために、フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡのオープンリーディングフレームよりも上流部位及び下流部位の塩基配列をもとにプライマーを設計し、これを用いてＰＣＲ法によりフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡを増幅させる。この断片をｐＣＲＢ１のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子内に存在するマルチクローニングサイト内に挿入することで、組換えＤＮＡを調製する。
なお、プライマーは、配列番号１に示す塩基配列の５８７番目から６０６番目に相当する部位及び１８４６番目から１８６５番目に相当する部位を選択し、その塩基配列又はその相補配列に制限酵素（例えばＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩ等）切断部位を連結するのが好ましい。このようなプライマーとしては、例えば配列番号１０及び１１に示すものが好ましく挙げられる。
【００３８】
（３）形質転換体の創製
フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡの発現量を上昇させる形質転換体の創製については、上記にて作製した組換えＤＮＡを宿主細胞に導入して形質転換する。形質転換される宿主細胞は、前述のコリネ型細菌であるが、その内でもコリネバクテリウム属菌が好ましく、中でもコリネバクテリウム・グルタミカムＲ株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８９７６）が好ましい。
組換えＤＮＡの宿主細胞への導入は、電気パルス法等の常法により行うことができる。
【００３９】
（４）フェニルセリンアルドラーゼの生成蓄積
上記の方法で取得されるフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡにて形質転換されたコリネ型細菌を培養し、目的のフェニルセリンアルドラーゼを生成蓄積せしめる。形質転換された、例えばコリネバクテリウム・グルタミカムＲ株の形質転換体の培養は、グルコース等の炭素源、硫酸アンモニウム等の窒素源、リン酸水素二カリウムや硫酸マグネシウム等の無機物、その他カザミノ酸等の有機成分を含む培地を用いるのがよい。
【００４０】
培養は好気条件下で約１２〜４８時間程度実施するのが好ましい。また培養温度はコリネバクテリウム・グルタミカムＲ株形質転換体の場合、好ましくは約２０℃〜４０℃、より好ましくは約３０℃〜３５℃である。
【００４１】
このようにしてフェニルセリンアルドラーゼを生成蓄積したコリネ型細菌形質転換体は培養液中に存在する状態や培養液から形質転換体を分離・濃縮等して使用することも出来る。また、本発明で用いられる形質転換されたコリネ型細菌の菌体には、例えば、アクリルアミドやカラギーナン等の担体上に固定化した固定化菌体、あるいは、凍結乾燥等による乾燥菌体等の菌体調製物も包含される。
【００４２】
又、本発明で用いられるフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌は、紫外線、エックス線又は薬品等を用いる人工的な変異手段で容易に変異しうるものである。このように得られるどのような変異株であっても本発明の対象とするフェニルセリンアルドラーゼ生産能を有するものは、本発明に用いられる形質転換されたコリネ型細菌の菌体に包含される。
【００４３】
［ＩＩ］ Ｄ−エリスロ−フェニルセリンの製造方法
本発明のＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造方法においては、フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌を用いて、ラセミ−エリスロ−フェニルセリンのうちＬ−エリスロ−フェニルセリンを特異的にグリシンとベンズアルデヒドに分解し、Ｄ−エリスロ−フェニルセリンを残存させる。
ラセミ−エリスロ−フェニルセリンにフェニルセリンアルドラーゼを作用させる方法は特に限定されない。例えば、フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌を培養後、該菌体が培養液中に存在する状態で、あるいは、培養液から分離された菌体、又は、該菌体を凍結後に融解させたものを用いても良い。
【００４４】
フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌を用いたフェニルセリンアルドラーゼ反応を行う場合、該菌体とラセミ−エリスロ−フェニルセリンを含む反応液とを、反応温度を約２０℃〜５０℃、好ましくは約３０℃〜４０℃の範囲で、反応ｐＨを約７〜９、好ましくはｐＨを約８〜８．５の範囲に制御して反応させる。反応はバッチ方式又は連続方式等、いずれの方法も用いることができる。また、反応液と菌体をフィルター等により分離し、菌体を連続的に回収し、繰り返し再使用することも出来る。本発明の方法においては、酵素が反応液から逸散しない限り菌体の生死にかかわらずＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造反応を実施することができる。なお、反応液には補酵素であるピリドキサールリン酸を添加しておくのが好ましい。
【００４５】
なお、本発明で用いられるフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０２３３又は受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０２５２として寄託されている。
【００４６】
以下、実施例を示して本発明の耐熱性フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡを含む遺伝子で形質転換されたコリネ型細菌によるＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造法を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。％は、特に記載のない場合は質量％を示す。
【実施例１】
【００４７】
フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡが増幅発現された形質転換体の作製と該ＤＮＡ高発現の確認
（Ａ）バチルス・スピーシーズ ＰＳ１５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１５１８７）の全ＤＮＡの抽出
肉エキス１％、ポリペプトン１％、塩化ナトリウム０．５％（ｐＨ７．２）からなるブイヨン培地１０ｍＬにバチルス属ＰＳ１５を接種して３７℃にて１２時間培養し、種培養液を得る。次にグリシン０．３％、グルコース１．０％、硫酸アンモニウム０．３％、酵母エキス１．０％（ｐＨ７．０）からなる培地１０ｍＬに上記の種培養液の一部を接種し、３７℃にて２４時間培養し、菌体を集めた。なお上記の方法は特開平９−２３８６８０号公報に記載の方法を参照に行った。
得られた菌体を２ｍｇ／ｍＬの濃度にリゾチウム溶液を含むＴＥバッファー（トリス緩衝液（ｐＨ８．０）−１０ｍＭ、ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液−１ｍＭ）に懸濁し、Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐｒｅｐ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アマシャム社製）を用いて全ＤＮＡを抽出した。
【００４８】
（Ｂ）プライマーの選択
前述したように、フェニルセリンアルドラーゼと同じ作用を示すアルドラーゼとしてＬ−スレオニンアルドラーゼがある。Ｌ−スレオニンアルドラーゼ遺伝子は、原核生物ではエシェリヒア・コリ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第２５５巻，ｐ．２２０−２２６（１９９８年））、アエロモナス・ジャンダイ（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，第６４巻，ｐ．５４９−５５４（１９９８年））、シュードモナス（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，第１７９巻，ｐ．３５５５−３５６０（１９９７年））等のものが、酵母ではサッカロマイセス・セレビシエ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第２４５巻，ｐ．２８９−２９３（１９９７年））等のものが知られている。これら４種のＬ−スレオニンアルドラーゼのアミノ酸配列において保存されている領域、すなわち前記アミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する領域を検討し、プライマー部位として共通配列と思われる配列番号３〜５のアミノ酸配列をもとに、配列番号６又は７に示す塩基配列を設計した。
【００４９】
（Ｃ）ＰＣＲ反応
配列番号６又は７に示すプライマーを用いて上記（Ａ）にて調製した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応にあたってはパーキンエルマー社製もしくはアプライドバイオシステムズ社製のサーマルサイクラーを用いて下記の条件で行った。
反応液：ＫＣｌ ５０ｍＭ、トリス緩衝液（ｐＨ８．４）１０ｍＭ、ＭｇＣｌ２ ２ｍＭ、
鋳型ＤＮＡ １μｇ、プライマー 各０．５μＭ、ｄＮＴＰｓ ２００μＭ、
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）２．５ｕｎｉｔｓ
ＰＣＲサイクル：デナチュレーション：９４℃、６０秒
アニーリング：５０℃、６０秒
エクステンション：７２℃、９０秒
以上を１サイクルとし、計３０サイクル行った。本反応により生成したＤＮＡ断片を１％のアガロースゲルを用いた電気泳動を行って検出したところ、約４５０ｂｐの断片を確認することができた。
【００５０】
（Ｄ）増幅断片のクローン化
上記にて得られたＤＮＡ断片を含む反応液１μＬにクローニングベクターｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）１μＬ及び５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭのジチオトレイトール、１ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｕｎｉｔのＴ４ＤＮＡリガーゼを添加し、４℃にて１５時間反応させた。
得られたプラスミド混合液を用い、塩化カルシウム法によりＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、濃度が５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（Ｔｒｙｐｔｏｎ ｐｅｐｔｏｎｅ １％、Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ０．５％、ＮａＣｌ １％、寒天 １．５％）に塗布した。
【００５１】
（Ｅ）増幅断片の塩基配列の決定
上記にて培地上に生育した株を常法により液体培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてプラスミドを抽出し、適当な制限酵素により切断した後、電気泳動を行ったところ、約４５０ｂｐのＤＮＡ断片の挿入が確認できた。この約４５０ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドより、挿入断片の塩基配列の決定を行った。その結果、配列番号１に示す塩基配列の７２６番目から１１７１番目に相当する配列となることが分かり、これに相当するアミノ酸配列は配列番号２に示すアミノ酸配列の２８番目から１７６番目までに相当する部分となることが明らかとなった。なお塩基配列の決定にはアプライドシステムズ社製のＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して行った。
【００５２】
（Ｆ）ゲノミック・サザンハイブリダイゼーション
上記（Ａ）にて得られた染色体ＤＮＡ２μｇに制限酵素ＰｓｔＩを４５ｕｎｉｔｓ加え、３７℃にて１５時間反応させ完全分解し、アガロースゲル電気泳動に供した後、アガロースゲルをナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋、アマシャム社製）に移しとった。前記にて取得したフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡの部分断片をアマシャム社製のＧｅｎｅ Ｉｍａｇｅｓ ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅキットを用いてフルオレセイン標識化し、これをプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った。検出についてはアマシャム社製のＣＤＰ−Ｓｔａｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅを用いた化学発光検出を行った。
その結果、染色体ＤＮＡをＰｓｔＩ処理した場合、約２．４ｋｂの位置に上記プローブが強くハイブリダイズした。
【００５３】
（Ｇ）インバースＰＣＲ
上記（Ｆ）にて得られた０．８μｇのＰｓｔＩ断片に６６ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭのジチオトレイトール、０．１ｍＭのＡＴＰ、６．６ｍＭのＭｇＣｌ２、１，０００ｕｎｉｔｓのＴ４ＤＮＡリガーゼを添加し、１６℃にて６時間反応（セルフライゲーション）させ、環状ＤＮＡを取得した。この環状ＤＮＡを鋳型として、配列番号８及び９に示すプライマーを用いてＰＣＲを行った。プライマーの設計は上記（Ｅ）にて決定されたＤＮＡ断片の塩基配列をもとに行った。ＰＣＲ反応にあたってはアプライドバイオシステムズ社製のサーマルサイクラーを用いて下記の条件で行った。
反応液：ＫＣｌ ５０ｍＭ、トリス緩衝液（ｐＨ８．４）１０ｍＭ、ＭｇＣｌ２ ２．５ｍＭ、
鋳型ＤＮＡ ０．２μｇ、プライマー各０．５μＭ、ｄＮＴＰｓ ３００μＭ、
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製） ２．５ｕｎｉｔｓ
ＰＣＲサイクル：デナチュレーション：９６℃、０秒
アニーリング：５５℃、３０秒
エクステンション：７２℃、２４０秒
以上を１サイクルとし、計３０サイクル行った。本反応により生成したＤＮＡ断片を１％のアガロースゲルを用いた電気泳動を行って検出したところ、約１，８００ｂｐの断片を確認することができた。
【００５４】
（Ｈ）フェニルセリンアルドラーゼ全塩基配列の決定
上記（Ｇ）にて得られたＤＮＡ断片を上記（Ｄ）と同様の操作でｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、得られたプラスミド混合液を用い、塩化カルシウム法によりＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、濃度が５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した。この培地上に生育した株を常法により液体培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてプラスミドを抽出し、適当な制限酵素により切断した後、電気泳動を行ったところ、約１，８００ｂｐのＤＮＡ断片の挿入が確認できた。この約１，８００ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドより、上記（Ｅ）にて記載の方法により、塩基配列の決定を行った。
その結果、ＰｓｔＩにて処理されたフェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片の塩基配列は配列番号１に示す塩基配列の１番目から２４３０番目に相当する配列となることが分かり、このうちフェニルセリンアルドラーゼをコードする遺伝子配列は配列番号１に示す塩基配列の６４５番目から１６８２番目に相当する配列となることが分かった。また、フェニルセリンアルドラーゼのアミノ酸配列は配列番号２に示すアミノ酸配列の１番目から３４５番目までに相当する部分となることが明らかとなった。
フェニルセリンアルドラーゼのアミノ酸配列について、相同性を検索したところ、アエロモナス・ジャンダイ由来のＬ−スレオニンアルドラーゼで４６％、エシェリヒア・コリ由来のＬ−スレオニンアルドラーゼで４４％であり、相同性を有することがＢＣＢＩ Ｐｒｏｔｅｉｎ データベースより確認することができた。
【００５５】
（Ｉ）組換えプラスミドＤＮＡの調製
上記（Ｈ）にて確認された１，０３８ｂｐのフェニルセリンアルドラーゼ遺伝子を大腸菌内で発現させるために、該ＤＮＡ遺伝子をクローニングベクターｐＨＳＧ３９８より調製されたベクターで、大腸菌とコリネ型細菌を宿主とするシャトルベクターｐＣＲＢ１へサブクローニングした。
まずフェニルセリンアルドラーゼ遺伝子のオープンリーディングフレームを含む約１，３００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅させるために、配列番号１０に示す制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位を連結したプライマーと配列番号１１に示す制限酵素ＢａｍＨＩ切断部位を連結したプライマーを用いてＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡ断片を、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにて切断し脱リン酸化処理されたシャトルベクターｐＣＲＢ１と混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ ２．０（タカラバイオ社製）を用いてＤＮＡ断片とベクターを連結した。
【００５６】
（Ｊ）コリネ型細菌への組換えＤＮＡの導入
上記（Ｉ）にて連結した組換えプラスミドＤＮＡ反応液を用いて、電気パルス法によりコリネバクテリウム・グルタミカムＲ株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８９７６）を形質転換し、クロラムフェニコール５０μｇ／ｍＬを含むＡ培地（尿素０．２％、硫酸アンモニウム０．７％、リン酸水素２カリウム０．０５％、リン酸２水素カリウム０．０５％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５％、硫酸鉄・７水和物０．０００６％、硫酸マンガン・７水和物０．０００４２％、ビオチン０．００００２％、チアミン塩酸塩０．００００２％、酵母エキス０．２％、カザミノ酸０．７％、グルコース４％、寒天１．５％）に塗布した。この培地上に生育した株についてコロニーＰＣＲによって確認したところ組換えプラスミド中に目的とする断片が挿入されていることが確認できた。
なお、上記（Ｉ）にて単離されたフェニルセリンアルドラーゼ遺伝子をｐａｌ１と命名し、作製した組換えプラスミドをｐＣＲＢｐａｌ１と命名し、このプラスミドによって形質転換されたコリネバクテリウム・グルタミカムＲ株をＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ／ｐＣＲＢｐａｌ１（独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター 受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２０２５２）と命名した。
【００５７】
（Ｋ）フェニルセリンアルドラーゼのコリネ型細菌内での高発現の確認
上記（Ｊ）にて作製したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ／ｐＣＲＢｐａｌ１をクロラムフェニコール５μｇ／ｍＬを含むＡ培地（尿素０．２％、硫酸アンモニウム０．７％、リン酸水素２カリウム０．０５％、リン酸２水素カリウム０．０５％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５％、硫酸鉄・７水和物０．０００６％、硫酸マンガン・７水和物０．０００４２％、ビオチン０．００００２％、チアミン塩酸塩０．００００２％、酵母エキス０．２％、カザミノ酸０．７％、グルコース４％、）に植菌し、３３℃にて１５時間振とう培養した。得られた菌体を遠心分離（６，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）して菌体をいったん回収し、２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）にて洗浄した。この菌体０．５ｇを０．５ｍＭのジチオスレイトール及び０．０１ｍＭのピリドキサールリン酸を含む２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）１．５ｍＬに懸濁した。
【００５８】
この菌体懸濁液を氷冷下でガラスビーズを用いた超音波破砕により破砕し、これを遠心分離（１４，５００ｒｐｍ、１０分間）し、上清を粗酵素液として得た。また、コリネバクテリウム・グルタミカムＲ株の粗酵素液も同様の手法で得た。一方、ＰＳ１５株の粗酵素液については、菌体懸濁液を氷冷下で超音波破砕にかけて破砕し、これを遠心分離（１４，５００ｒｐｍ、１０分間）することにより、上清を粗酵素液として得た。
得られた粗酵素液を用いてフェニルセリンアルドラーゼ活性の確認を行った。基質としてラセミ−スレオ−フェニルセリンを使用した。反応は１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、４０ｍＭのラセミ−スレオ−フェニルセリン、０．０３ｍＭのピリドキサールリン酸、０．４ｍｇ／ｍＬの粗酵素液存在下（いずれも終濃度）、３７℃にて１０分間行った。その結果、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ／ｐＣＲＢｐａｌ１のアルドラーゼ活性は０．６４８ｕｎｉｔ／ｍｇであることが判った。一方、コリネバクテリウム・グルタミカムＲ株のアルドラーゼ活性は０．０２７２ｕｎｉｔ／ｍｇ、ＰＳ１５株のアルドラーゼ活性は０．０７１３ｕｎｉｔ／ｍｇであったことから、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ／ｐＣＲＢｐａｌ１のアルドラーゼ活性はコリネバクテリウム・グルタミカムＲ株の約２４倍、ＰＳ１５株の約９倍、活性が高いことが判明した。
【００５９】
活性確認にあたっては高速液体クロマトグラフィーシステム（東ソー製）を使用し、反応液中に生成するベンズアルデヒドを以下の条件にて分析することにより活性確認を行った。
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ；東ソー製）
カラム温度：３５℃
溶出液：リン酸アンモニウム溶液２０ｍＭ（ｐＨ３．０）／アセトニトリル９０％（８０：２０；Ｖ／Ｖ）
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出：紫外吸光光度計（２５４ｎｍ）
分析容量：２０μＬ
なお、配列番号１に示すフェニルセリンアルドラーゼとは別の遺伝子も上記（Ａ）〜（Ｈ）の手法にて取得することができ、このアミノ酸配列についてもアエロモナス・ジャンダイ及びエシェリヒア・コリ由来のＬ−スレオニンアルドラーゼと高い相同性を示した。しかし、上記（Ｉ）・（Ｊ）の手法にて組換えプラスミドを作製しコリネ型細菌に導入したものの、アルドラーゼ活性の確認はできなかった。
【００６０】
（Ｌ）新たな組換えＤＮＡの調製とコリネ型細菌への導入
上記（Ｊ）にて作製したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ／ｐＣＲＢ ｐａｌ１は、ｌａｃプロモーターのみを有するためと推定されるが、フェニルセリンアルドラーゼ遺伝子ｐａｌ１の高発現によるＬ−エリスロ−フェニルセリンの分解に対する活性をさらに向上せしめることを目的として、ｌａｃプロモーターとｔａｃプロモーターの二つのプロモーターにてフェニルセリンアルドラーゼを発現させる新たなプラスミドの構築を行った。
【００６１】
図１に示すとおり、まずフェニルセリンアルドラーゼ遺伝子ｐａｌ１のオープンリーディングフレームを含む約１，３００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅させるために、配列番号１０に示す制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位を連結したプライマーと配列番号１２に示す制限酵素ＰｓｔＩ切断部位を連結したプライマーを用いて、上記（Ａ）にて調製した染色体ＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡ断片を、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩにて切断し脱リン酸化処理された大腸菌内発現用プラスミドベクターｐＫＫ２２３−３（アマシャム社製）と混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ ２．０（タカラバイオ社製）を用いてＤＮＡ断片とベクターを連結した。これにより構築されたプラスミドをｐＫＫｐａｌ１と命名した。
【００６２】
次に構築されたプラスミドｐＫＫｐａｌ１のうちｔａｃプロモーターとフェニルセリンアルドラーゼ遺伝子ｐａｌ１のオープンリーディングフレームを含む約１，５００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅させるために、配列番号１３に示す制限酵素ＢｇｌＩＩ切断部位を連結したプライマーと配列番号１４に示す制限酵素ＰｓｔＩ切断部位を連結したプライマーを用いて、上記にて作製したプラスミドｐＫＫｐａｌ１を鋳型とし、ＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡ断片を、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩにて切断し脱リン酸化処理されたシャトルベクターｐＣＲＢ１と混合し、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ ２．０（タカラバイオ社製）を用いてＤＮＡ断片とベクターを連結した。この新たに作製したプラスミドを上記（Ｊ）と同様の手法でコリネバクテリウム・グルタミカムＲ株に導入した。
【００６３】
上記にて作製した組換えプラスミドをｐＣＲＢｔａｃＰｐａｌ１と命名し、このプラスミドによって形質転換されたコリネバクテリウム・グルタミカムＲ株をＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ／ｐＣＲＢ ｔａｃＰ ｐａｌ１（独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター 受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２０２３３）と命名した。
【００６４】
新たに形質転換されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ／ｐＣＲＢ ｔａｃ Ｐｐａｌ１について、上記（Ｋ）と同様の手法により粗酵素液を取得し、フェニルセリンアルドラーゼ活性の確認を行った。その結果、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ／ｐＣＲＢ ｔａｃ Ｐｐａｌ１のアルドラーゼ活性は１．４３ ｕｎｉｔ／ｍｇとなり、上記（Ｋ）にて測定したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ／ｐＣＲＢ ｐａｌ１のアルドラーゼ活性の約２．２倍、活性が高いことが分かった。
なお、活性確認にあたっては高速液体クロマトグラフィーシステムを用いて、上記（Ｋ）と同様の手法で行った。
【実施例２】
【００６５】
形質転換されたコリネ型細菌を用いたＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造法（１）
上記実施例１の（Ｌ）にて作成したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ／ｐＣＲＢ ｔａｃＰ ｐａｌ１を用いてラセミ−エリスロ−フェニルセリンからのＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造を行った。まず、実施例１の（Ｋ）と同様の手法によりＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ／ｐＣＲＢ ｔａｃＰ ｐａｌ１を培養し、集菌及び洗浄後、菌体０．２ｇを０．５ｍＭのジチオスレイトール及び０．０１ｍＭのピリドキサールリン酸を含む２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍＬに懸濁した。この菌体懸濁液に界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ナカライテスク社製）を終濃度が０．５％となるよう加え、３３℃にて１５時間振とうした。
【００６６】
上記にて界面活性剤処理されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ／ｐＣＲＢ ｔａｃＰ ｐａｌ１をＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造に用いた。４０ｍＭのラセミ−エリスロ−フェニルセリン溶液（ｐＨ３．０）、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、０．０３ｍＭのピリドキサールリン酸（いずれも終濃度）を含む反応液に界面活性剤処理されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ／ｐＣＲＢ ｔａｃＰ ｐａｌ１菌体懸濁液を反応液の２０％を占めるよう添加して反応液容量を１ｍＬとし、３７℃にて反応を行った。その結果、反応から１０分後のフェニルセリン濃度を分析したところ、Ｄ−エリスロ−フェニルセリンの濃度が１９．３ｍＭであるのに対し、Ｌ−エリスロ−フェニルセリンの濃度は１．７４ｍＭであった。以上から、ラセミ−エリスロ−フェニルセリンのうち、Ｌ体のみが分解され、Ｄ体はほぼ残存されることがわかった。
【００６７】
なお、フェニルセリンの分析にあたっては高速液体クロマトグラフィーシステム（東ソー製）を使用し、反応液中のフェニルセリンを以下の条件にて分析した。
カラム：ＣＲＯＷＮＰＡＫ ＣＲ（＋）（４．０ｍｍ×１５０ｍｍ；ダイセル化学製）
カラム温度：５℃
溶出液：過塩素酸水溶液（ｐＨ１．０）
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
検出：紫外吸光光度計（２５４ｎｍ）
分析容量：１０μＬ
【実施例３】
【００６８】
形質転換されたコリネ型細菌を用いたＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造（２）
形質転換されたコリネ型細菌を用いたラセミ−エリスロ−フェニルセリンからのＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造を、反応液組成：４０ｇ／Ｌのラセミ−エリスロ−フェニルセリン溶液（ｐＨ８．０）、４ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、０．０３ｍＭのピリドキサールリン酸からなる反応液に実施例２と同様の条件、方法にて界面活性剤処理されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ／ｐＣＲＢ ｔａｃＰ ｐａｌ１菌体懸濁液を反応液の２％を占めるよう添加し、反応液容量を１ｍＬとして３７℃にて反応を行った。
【００６９】
その結果、図２に示すとおり、反応から９時間後のＤ−エリスロ−フェニルセリンの濃度が１８．７ｇ／Ｌであるのに対し、Ｌ−エリスロ−フェニルセリンの濃度は２．５８ｇ／Ｌであった。以上から、基質濃度を高濃度にし、また菌体量が少なくても、８０％以上のＬ−エリスロ−フェニルセリンが効率よく分解されてＤ−エリスロ−フェニルセリンが反応液中にほぼ残存されることが分かった。なお、フェニルセリンの分析にあたっては、上記実施例２と同様の手法により分析した。
【実施例４】
【００７０】
形質転換されたコリネ型細菌の繰り返し利用によるＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造法（１）
ラセミ−エリスロ−フェニルセリンからのＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造において、形質転換されたコリネ型細菌をＬ−エリスロ−フェニルセリンの分解反応後、この菌体を回収し再度分解反応に使用する方法、いわゆる繰り返し反応を試みた。
反応液組成：４０ｇ／Ｌのラセミ−エリスロ−フェニルセリン溶液（ｐＨ８．０）、４ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、０．０３ｍＭのピリドキサールリン酸、からなる反応液に実施例２と同様の条件、方法にて界面活性剤処理されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ／ｐＣＲＢ ｔａｃＰ ｐａｌ１菌体懸濁液を反応液の１５％を占めるよう添加して反応液容量を１ｍＬとし、３７℃にて１時間反応を行った。反応後、遠心分離により菌体を回収し、この菌体を０．５ｍＭのジチオスレイトール及び０．０１ｍＭのピリドキサールリン酸を含む２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して実施例２と同様の方法にて界面活性剤処理を行った後（但し、二回目以降の界面活性剤処理に於いては処理浸とう時間は各々０．５時間とした。）、再度４０ｇ／Ｌのラセミ−エリスロ−フェニルセリン溶液（ｐＨ８．０）、４ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、０．０３ｍＭのピリドキサールリン酸、からなる処理菌体を含む反応液を調製し反応液容量を１ｍＬとして３７℃にて１時間反応を行った。この操作を５回繰り返し、合計６時間反応を行った。
【００７１】
１時間おきに反応液の上清をサンプリングし、フェニルセリン濃度の分析を行った。その結果、［図３］に示すとおりとなった。１回目の反応、すなわち１時間後の反応ではＤ−エリスロ−フェニルセリンの濃度が１９．９ｇ／Ｌであるのに対し、Ｌ−エリスロ−フェニルセリンの濃度は１．６１ｇ／Ｌとなり、４回目の反応後 (反応使用履歴時間の総和：４時間) では、Ｄ−エリスロ−フェニルセリンの濃度が２０．０ｇ／Ｌであるのに対し、Ｌ−エリスロ−フェニルセリンの濃度は５．３２ｇ／Ｌとなり、６回目の反応後 (反応使用履歴時間の総和：６時間) では、Ｄ−エリスロ−フェニルセリンの濃度が２０．２ｇ／Ｌであるのに対し、Ｌ−エリスロ−フェニルセリンの濃度は６．９６ｇ／Ｌとなった。このことから、形質転換されたコリネ型細菌の繰り返し利用によりＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造が可能であることが示された。なお、フェニルセリンの分析にあたっては、上記実施例２と同様の手法により分析した。
【実施例５】
【００７２】
形質転換されたコリネ型細菌の繰り返し利用によるＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造法（２）
上記実施例４にて行った繰り返し反応について、反応液中に加えるＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ／ｐＣＲＢ ｔａｃＰ ｐａｌ１菌体懸濁液の濃度を高くして反応を行った。即ち
反応液組成：４０ｇ／Ｌのラセミ−エリスロ−フェニルセリン溶液（ｐＨ８．０）、４ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、０．０３ｍＭのピリドキサールリン酸、からなる反応液に界面活性剤処理されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ Ｒ／ｐＣＲＢ ｔａｃＰ ｐａｌ１菌体懸濁液を反応液の２０％を占めるよう添加して反応液容量を１ｍＬとし、３７℃にて１時間反応を行った。反応後、遠心分離により菌体を回収し、この菌体を０．５ｍＭのジチオスレイトール及び０．０１ｍＭのピリドキサールリン酸を含む２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して実施例４と同様の方法にて界面活性剤処理を行った後(但し、二回目以降の界面活性剤処理に於いては処理浸とう時間は各々０．５時間とした。)、再度４０ｇ／Ｌのラセミ−エリスロ−フェニルセリン溶液（ｐＨ８．０）、４ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、０．０３ｍＭのピリドキサールリン酸からなる処理菌体を含む反応液を調製し反応液容量を１ｍＬとして３７℃にて１時間反応を行った。この操作を実施例４と同様に５回繰り返し、合計６時間反応を行った。
【００７３】
１時間おきに反応液の上清をサンプリングし、フェニルセリン濃度の分析を行った。その結果、［図４］に示すとおりとなった。１回目の反応、すなわち１時間後の反応ではＤ−エリスロ−フェニルセリンの濃度が１９．１ｇ／Ｌであるのに対し、Ｌ−エリスロ−フェニルセリンの濃度は１．３９ｇ／Ｌとなり、４回目の反応後（反応使用履歴時間の総和：４時間）では、Ｄ−エリスロ−フェニルセリンの濃度が２０．１ｇ／Ｌであるのに対し、Ｌ−エリスロ−フェニルセリンの濃度は２．５８ｇ／Ｌとなり、６回目の反応後（反応使用履歴時間の総和：６時間）では、Ｄ−エリスロ−フェニルセリンの濃度が２０．２ｇ／Ｌであるのに対し、Ｌ−エリスロ−フェニルセリンの濃度は３．１５ｇ／Ｌとなった。このことから、形質転換されたコリネ型細菌の量を増やすことにより、繰り返しの回数が多くても、都度の界面活性剤処理は必要とするものの、Ｌ−エリスロ−フェニルセリン分解反応の反応性がほぼ維持されることが示された。なお、フェニルセリンの分析にあたっては、上記実施例２と同様の手法により分析した。
【００７４】
［比較例］
形質転換された大腸菌の繰り返し利用によるＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造法
上記実施例４及び実施例５にて、ラセミ−エリスロ−フェニルセリンからのＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造法に形質転換されたコリネ型細菌の繰り返し利用が可能であることを示した。形質転換されたコリネ型細菌同様に形質転換された大腸菌もまた繰り返し利用が有効であるかを調べるために、形質転換された大腸菌の繰り返し利用によるＤ−エリスロ−フェニルセリン生成反応を行った。
使用した形質転換された大腸菌は以下のようにして構築した。すなわち、上記実施例１にて作製した組換えプラスミドｐＣＲＢｔａｃＰｐａｌ１溶液を用いて塩化カルシウム法によりＥ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換し、形質転換された大腸菌を作製した。この形質転換された大腸菌をｐＣＲＢｔａｃＰｐａｌ１／ＪＭ１０９と命名した。
【００７５】
形質転換された大腸菌ｐＣＲＢｔａｃＰｐａｌ１／ＪＭ１０９を用いた反応は次のようにして行った。まず、クロラムフェニコール５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ培地（Ｔｒｙｐｔｏｎ ｐｅｐｔｏｎｅ １％、Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ０．５％、ＮａＣｌ １％）に植菌し、３７℃にて１５時間培養し、集菌及び洗浄後、菌体０．２ｇを０．５ｍＭのジチオスレイトール及び０．０１ｍＭのピリドキサールリン酸を含む２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍＬに懸濁し、ｐＣＲＢｔａｃＰｐａｌ１／ＪＭ１０９の菌体懸濁液を作成した。この菌体懸濁液に実施例２と同様に界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ナカライテスク社製）を終濃度が０．５％となるように加え、３３℃にて１５時間浸とうした。そして４０ｇ／Ｌのラセミ−エリスロ−フェニルセリン溶液（ｐＨ８．０）、４ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、０．０３ｍＭのピリドキサールリン酸、からなる反応液にこの界面活性剤処理した菌体懸濁液を反応液の２０％を占めるよう添加して反応液容量を１ｍＬとし、３７℃にて１時間反応を行った。反応後、遠心分離により菌体を回収し、この菌体を０．５ｍＭのジチオスレイトール及び０．０１ｍＭのピリドキサールリン酸を含む２０ ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して実施例２と同様の方法にて界面活性剤処理を行った後(但し、二回目以降の界面活性剤処理に於いては処理浸とう時間は各々０．５時間とした。)、再度４０ｇ／Ｌのラセミ−エリスロ−フェニルセリン溶液（ｐＨ８．０）、４ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、０．０３ｍＭのピリドキサールリン酸からなる処理菌体を含む反応液を調製し反応液容量を１ｍＬとして３７℃にて１時間反応を行った。この操作を５回繰り返し、合計６時間反応を行った。
１時間おきに反応液の上清をサンプリングし、フェニルセリン濃度の分析を行った結果を［図５］に示す。１回目及び２回目の反応、すなわち１時間後及び２時間後の反応ではＬ−エリスロ−フェニルセリンの濃度は２．００ｇ／Ｌ以下であったものの、３回目の反応、すなわち３時間後の反応（反応使用履歴時間の総和：３時間）ではＬ−エリスロ−フェニルセリンの濃度は９．８６ｇ／Ｌとなり、反応性が急激に悪くなった。その後繰り返し反応を続けた結果、６回目の反応、すなわち６時間後の反応（反応使用履歴時間の総和：６時間）ではＬ−エリスロ−フェニルセリンの濃度は１２．８ｇ／Ｌとなった。このことから、形質転換された大腸菌は形質転換されたコリネ型細菌と異なり、繰り返し反応には適さないことが示された。なお、フェニルセリンの分析にあたっては、上記実施例２と同様の手法により分析した。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明は医薬や農薬（例えばチアンフェニコールやフロロフェニコール、クロラムフェニコール等）などの中間体として有用なＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造方法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１は、組換えプラスミドｐＣＲＢｔａｃＰｐａｌ１の構築過程を示すフローチャートである。
【図２】図２は、形質転換されたコリネ型細菌を用いたラセミ−エリスロ−フェニルセリン分解反応を表すグラフである。
【図３】図３は、形質転換されたコリネ型細菌の繰り返し利用によるラセミ−エリスロ−フェニルセリン分解反応を表すグラフである（反応液中の菌体の割合は１５％）。
【図４】図４は、形質転換されたコリネ型細菌の繰り返し利用によるラセミ−エリスロ−フェニルセリン分解反応を表すグラフである（反応液中の菌体の割合は２０％）。
【図５】図５は、形質転換された大腸菌の繰り返し利用によるラセミ−エリスロ−フェニルセリン分解反応を表すグラフである（反応液中の菌体の割合は２０％）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌を、ラセミ−エリスロ−フェニルセリンに作用させ、Ｌ−エリスロ−フェニルセリンを分解し、残存するＤ−エリスロ−フェニルセリンを採取することを特徴とするＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造方法。
【請求項２】
フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡが、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡであることを特徴とする請求項１記載の方法；
（ａ）配列番号１における６４５−１６８２番目の塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフェニルセリンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつフェニルセリンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡがＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＰＳ−１５株（独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５１８７）由来のＤＮＡであることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌が、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌およびアースロバクター属菌から選択される１種の菌であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌が、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０２３３又は受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０２５２として寄託されたものであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌を繰り返し再使用することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡを含有する遺伝子；
（ａ）配列番号１における６４５−１６８２番目の塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフェニルセリンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつフェニルセリンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質；
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつフェニルセリンアルドラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項９】
請求項７に記載の遺伝子を含有するベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の遺伝子を含有するベクターを含む形質転換体。
【請求項１１】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０２５２であるコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／ｐＣＲＢ ｐａｌｌ株。
【請求項１２】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０２３３であるコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／ｐＣＲＢ ｔａｃＰ ｐａｌｌ株。
【請求項１】
フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌を、ラセミ−エリスロ−フェニルセリンに作用させ、Ｌ−エリスロ−フェニルセリンを分解し、残存するＤ−エリスロ−フェニルセリンを採取することを特徴とするＤ−エリスロ−フェニルセリンの製造方法。
【請求項２】
フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡが、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡであることを特徴とする請求項１記載の方法；
（ａ）配列番号１における６４５−１６８２番目の塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフェニルセリンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつフェニルセリンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡがＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＰＳ−１５株（独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５１８７）由来のＤＮＡであることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌が、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌およびアースロバクター属菌から選択される１種の菌であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌が、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０２３３又は受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０２５２として寄託されたものであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
フェニルセリンアルドラーゼをコードするＤＮＡで形質転換されたコリネ型細菌を繰り返し再使用することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡを含有する遺伝子；
（ａ）配列番号１における６４５−１６８２番目の塩基配列を含むＤＮＡ；
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列を含むＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフェニルセリンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつフェニルセリンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質；
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつフェニルセリンアルドラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項９】
請求項７に記載の遺伝子を含有するベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の遺伝子を含有するベクターを含む形質転換体。
【請求項１１】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０２５２であるコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／ｐＣＲＢ ｐａｌｌ株。
【請求項１２】
独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０２３３であるコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／ｐＣＲＢ ｔａｃＰ ｐａｌｌ株。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００６−１４１２４６（Ｐ２００６−１４１２４６Ａ）
【公開日】平成１８年６月８日（２００６．６．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３３３５５９（Ｐ２００４−３３３５５９）
【出願日】平成１６年１１月１７日（２００４．１１．１７）
【出願人】（５９１１７８０１２）財団法人地球環境産業技術研究機構 (153)
【出願人】（０００００４０８６）日本化薬株式会社 (921)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月８日（２００６．６．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月１７日（２００４．１１．１７）
【出願人】（５９１１７８０１２）財団法人地球環境産業技術研究機構 (153)
【出願人】（０００００４０８６）日本化薬株式会社 (921)
【Ｆターム（参考）】
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