Ｄ−キロ−イノシトールの製造方法
【課題】高純度のＤ−キロ−イノシトールを効率よく、安価に製造する方法を提供すること。
【解決手段】Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物を、均一係数が１．０〜１．３で、球形の陰イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィー分離により分離することを特徴とする、Ｄ−キロ−イノシトールを主成分とする組成物の製造方法。
【解決手段】Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物を、均一係数が１．０〜１．３で、球形の陰イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィー分離により分離することを特徴とする、Ｄ−キロ−イノシトールを主成分とする組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物より、Ｄ−キロ−イノシトールを主成分とする組成物を製造する方法、及びＤ−キロ−イノシトールを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｄ−キロ−イノシトールは、９種類存在するイノシトールの立体異性体の一つであり、近年、インシュリン非依存性糖尿病の治療薬として公知であり（例えば、特許文献１参照）、また多嚢胞性卵巣症候群の治療薬としても知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
このＤ−キロ−イノシトールの代表的な製造方法としては次の (a) 〜 (e) の方法が知られている。
【０００４】
（ａ）抗生物質のカスガマイシンを加水分解して、その分子構成部分であるＤ−キロ−イノシトールを得る次の３つの方法、すなわち (ｉ) カスガマイシンの強酸による加水分解法（例えば、特許文献２参照）、（ii）カスガマイシンをアセチル化した後に加水分解する方法（例えば、特許文献3参照）、及び（iii）強酸性イオン交換樹脂によるカスガマイシンの加水分解法（例えば、特許文献４参照）。
（ｂ）グルクロン酸を原料として１０段階以上の化学合成ステップを経て、Ｄ−キロ−イノシトールを合成する方法（例えば、特許文献５参照）。
（ｃ）ブーゲンビリアなどの植物中に含まれるピニトールを、脱メチル化してＤ−キロ−イノシトールを調製する方法（例えば、特許文献６、特許文献７参照）。
（ｄ）微生物培養または、酵素を用いて、ミオ−イノシトールをＤ−キロ−イノシトールへ変換する方法（例えば、特許文献８参照）。
（ｅ）ミオ−イノシトールを原料として１Ｄ−２，３−ジ−Ｏ−アセタール化ミオ−イノシトールを経て、Ｄ−キロ−イノシトールを合成する方法（例えば、特許文献９参照）。
【０００５】
これらの方法の中で（ｄ）の方法は、製造工程も少なく、Ｄ−キロ−イノシトールを製造する安価な方法である。しかしながら、（ｄ）の方法によって、微生物培養または酵素を用いて、ミオ−イノシトールをＤ−キロイノシトールへ変換すると、Ｄ−キロ−イノシトールと未変換のミオ−イノシトールとの混合物としてしか得られない。
【０００６】
ミオ−イノシトールとＤ−キロ−イノシトールとを分離する方法としては、クロマトグラフィー分析用強塩基性陰イオン交換樹脂ＣＧ４００を用いて分離する方法が知られている。しかしながら、この強塩基性陰イオン交換樹脂ＣＧ４００は、分析級のイオン交換樹脂を粉砕して７５〜１５０μｍに粒度を調整し、クロマトグラフ分析用途の実験用樹脂として製造販売されているのものであって、工業的規模で使用するには、次のような問題点があり、必ずしも満足できるものではなかった。すなわち、（イ）このイオン交換樹脂は高価であり、これを用いた場合製造コストが上がる。（ロ）粒子が細かく沈降するのに時間がかかるため、大型カラムを調製するのに長時間を要する。（ハ）また、破砕型で樹脂形状が必ずしも一定でなくバラツキがあり、充填状態にムラができやすいため大型カラムに均一に充填するのが難しい。
【０００７】
【特許文献１】国際公開第９０／１０４３９号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５０９１５９６号明細書
【特許文献３】米国特許第５４６３１４２号明細書
【特許文献４】米国特許第５７１４６４３号明細書
【特許文献５】米国特許第５４０６００５号明細書
【特許文献６】米国特許第５８２７８９６号明細書
【特許文献７】特開２００１−２６１６００号公報
【特許文献８】特開平９−１４０３８８号公報
【特許文献９】特開２００１−１６３８１０号公報
【非特許文献１】「ザ・ニュウ・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」, (米国), １９９９年，第３４０巻, ｐ．１３１４−１３２０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、高純度のＤ−キロ−イノシトールを効率よく、安価に製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、前記した課題を達成するため、特にミオ−イノシトールとＤ−キロ−イノシトールとを効率よく分離するための方法について種々検討を重ねた。その結果、均一係数が１．０〜１．３で、球形の陰イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィー分離により、ミオ−イノシトールとＤ−キロ−イノシトールとを効率よく分離することができることを知見するにいたった。
【００１０】
ここで、「均一係数」とは、粒子の粒度分布の特徴を表す数値の１つで、ふるいを通過した粒子が６割のときのふるいの寸法（目開き）を、粒子が１割通過したときのふるいの寸法（目開き）で割った数値である。
【００１１】
より詳しく説明すれば、粒子の大きさをふるい分けにより測定して正規分布の状態を対数確率グラフに直線として作図し、ふるい残留百分率累計値が９０％および４０％に対するふるいの目開き（ｍｍ）を求める。９０％に対する目開き（ｍｍ）を有効径と称し、４０％に対する目開きと有効径の比を「均一係数」としている。このようにして求められる均一係数は、１．０に近いほど粒径がそろっていることになる。
【００１２】
また、粒形に関しては、球形でない場合すなわち破砕型樹脂は、一般的に粒子が小さく粒子形状が一定でないため、工業用カラムに均一に充填することが困難である。これに対し、球形の場合は粒子形状が一定しており、工業用カラムに充填したときに均一になり、工業用カラムに適している。
【００１３】
本発明を実施することにより、ミオ−イノシトールとＤ−キロ−イノシトールとの組成物から、Ｄ−キロ−イノシトールを主成分とする組成物を得る方法、及びＤ−キロ−イノシトールを得る方法が提供される。ここで本発明の「Ｄ−キロ−イノシトールを主成分とする組成物」とは、成分組成が、Ｄ−キロ−イノシトールが５１〜１００％、ミオ−イノシトールが０〜４９％およびその他の成分が０〜２％の場合の組成物をいう。
【００１４】
より具体的には、本発明は次のごとくに要約することができる。
【００１５】
第１には、Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物を、均一係数が１．０〜１．３で、球形の陰イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィー分離により分離することを特徴とする、Ｄ−キロ−イノシトールを主成分とする組成物の製造方法。
【００１６】
第２には、Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物を、均一係数が１．０〜１．３で、球形の陰イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィー分離により分離することを特徴とする、Ｄ−キロ−イノシトールの製造方法。
【００１７】
第３には、Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物を、均一係数が１．０〜１．３で、球形の強塩基性陰イオン交換樹脂の水酸基型を用いたクロマトグラフィー分離により分離することを特徴とする、Ｄ−キロ−イノシトールを主成分とする組成物の製造方法。
【００１８】
第４には、Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物を、均一係数が１．０〜１．３で、球形の強塩基性陰イオン交換樹脂の水酸基型を用いたクロマトグラフィー分離により分離することを特徴とする、Ｄ−キロ−イノシトールの製造方法。
【００１９】
第５には、ミオ−イノシトールに微生物または酵素を作用させることにより得られた、Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物を、均一係数が１．０〜１．３で、球形の陰イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィー分離により分離することを特徴とする、Ｄ−キロ−イノシトールを主成分とする組成物の製造方法。
【００２０】
第６には、ミオ−イノシトールに微生物または酵素を作用させることにより得られた、Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物を、均一係数が１．０〜１．３で、球形の陰イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィー分離により分離することを特徴とする、Ｄ−キロ−イノシトールの製造方法。
【００２１】
第７には、ミオ−イノシトールに微生物または酵素を作用させることにより得られた、Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物を、均一係数が１．０〜１．３で、球形の強塩基性陰イオン交換樹脂の水酸基型を用いたクロマトグラフィー分離により分離することを特徴とする、Ｄ−キロ−イノシトールを主成分とする組成物の製造方法。
【００２２】
第８には、ミオ−イノシトールに微生物または酵素を作用させることにより得られた、Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物を、均一係数が１．０〜１．３で、球形の強塩基性陰イオン交換樹脂の水酸基型を用いたクロマトグラフィー分離により分離することを特徴とする、Ｄ−キロ−イノシトールの製造方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明を実施すれば、高純度のＤ−キロ−イノシトールを効率よく安価に製造する方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は次の通りに実施される。
【００２５】
本発明に用いられるＤ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物は、天然界からの抽出物あるいはミオ−イノシトールを原料とした微生物または酵素による変換によって得られたものなど、どのような由来のものでもよい。そして、Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールの組成比もどのような比率でもよいが、好ましくは、Ｄ−キロ−イノシトールとミオ−イノシトールとの比率が５：９５〜９８：２のものがよい。さらに好ましくは、５０：５０よりもＤ−キロ−イノシトール含量の多いものがよい。また、出発材料のＤ−キロ−イノシトール含量が大きいものほど、より精製度の高いＤ−キロ−イノシトールを得やすいため、これらの観点から出発材料の組成比を決定してもよい。他の成分の存在については、陰イオン交換樹脂に吸着しないものであれば、混在しても問題はない。
【００２６】
なお、組成物は、クロマトグラフィー分離において良好な分離を保つために、脱イオン化されていることが望ましい。少々のイオン物質の混在した状態の組成物、例えばイオン交換樹脂の交換容量に対し、数パーセント程度のイオンが混入している組成物であれば、脱イオン化せずにクロマトグラフィー分離することも可能であるが、コスト面から複数回の使用が好ましいので、クロマトグラフィー用樹脂にイオンが吸着するにつれて徐々に分離能が低下することを防ぐ為に、脱イオン化することが望ましい。
【００２７】
樹脂の粒度の調整つまり均一係数が１．０〜１．３であることを特徴とする陰イオン交換樹脂の調整は、どのような方法によっても良いが、簡単な方法を例示すれば、市販イオン交換樹脂(例えば、デュオライト(登録商標)Ａ−１１３ 均一係数１．６)をふるいにかけて、粒度を揃えることによりできる。市販されている工業用イオン交換樹脂は通常球形をしているが、実験用に用いるクロマトグラフィー分析用イオン交換樹脂には破砕型もある（例えば、アンバーライト（登録商標）ＣＧ−４００）ため、球形のイオン交換樹脂を選んで使用するのがよい。
【００２８】
使用する樹脂は、Ｄ−キロ−イノシトールとミオ−イノシトールとを分離する能力の高い強塩基性樹脂が好ましく、この中でも１型の強塩基性樹脂が好ましい。
【００２９】
クロマトグラフィー分離に供するＤ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物は溶媒に溶解させておくことが好ましい。その溶媒としては、Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを溶解させることができ、樹脂にも悪影響を与えないものが好ましい。これらの条件にあう溶媒としては水を主体とする溶媒、例えばイオン交換水や水を主体とする水アルコール混液（例えば、５％エチルアルコール溶液）が挙げられる。
【００３０】
クロマトグラフィー分離に供するＤ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物の濃度は、総イノシトール濃度として10〜70％が望ましい。また、分離の条件にもよるが、クロマトグラフィー分離に供する組成物の1回の注入量は、樹脂容量に対し3〜20％が望ましい。
【００３１】
クロマトグラフィー分離の条件は、まず溶離液としては、Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを溶解させることができ、樹脂にも悪影響を与えないものとして、水を主体とする溶媒が使用できる。例えばイオン交換水や水を主体とする水アルコール混液（例えば、５％エチルアルコール溶液）が挙げられる。
【００３２】
クロマトグラフィー分離の他の条件としては、温度10〜70℃、流速、ＳＶ＝0.5〜5、が望ましい。また、樹脂の劣化を防ぐためにプレカラムを用いてもよい。
【００３３】
ここで、上記した流速を表すＳＶ（Ｓｐａｃｅ Ｖｅｌｏｃｉｔｙ）とは、空間速度のことであり、イオン交換樹脂の充填してあるカラムを１時間に通過する液量（ｍｌ）とカラムに充填している樹脂量（ｍｌ）との比として求められる。
【００３４】
上記条件で得られる溶出液を、樹脂容量の２〜１０％程度の容量で分画を行い、それぞれの画分に含まれるＤ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを分析し、高純度のＤ−キロ−イノシトール画分のみを回収すれば、高純度のＤ−キロ−イノシトールを得ることができる。
【００３５】
また、２回目以降の分画を同条件で行った場合、分離条件は再現されるので、第1回目の結果を参考に目的の画分のみを得ることも可能である。
【００３６】
さらには、クロマトグラフィー分離装置に検出器を設置すれば、目的のピークのみをクロマトグラフィー分離と同時に簡単に目的物を回収することも可能である。検出器の例としては第１にRI検出器が挙げられる。RI検出器を用いれば、液中のイノシトール濃度が測定されるため、第１ピークとしてミオ−イノシトールを、第２ピークとしてＤ−キロ−イノシトールを検出することができる。さらに旋光度を検出するためのOR検出器を付加すれば、旋光度を持つＤ−キロ−イノシトールを検出することができる。
【００３７】
以下に本発明の実施例を示してより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３８】
＜イノシトール異性体及びその他糖類の分析方法＞
以下の実施例で得られた組成物等のサンプルは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。高速液体クロマトグラフィーの分析条件は以下の通りである。
カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ ５ＮＨ２（４．６×２５０ｍｍ）
カラム温度：４０℃
検出器：ＲＩ ＤＥＴＥＣＴＥＲ ＲＩ−１５３０（日本分光株式会社）
注入量：２０μｌ
溶媒：アセトニトリル：水＝４：１
流量：２ｍｌ／ｍｉｎ
【００３９】
＜陰イオン交換樹脂（ＯＨ−型）の調製＞
以下の実施例で使用するそれぞれの陰イオン交換樹脂（ＯＨ−型）は、それぞれの陰イオン交換樹脂（Ｃｌ−型）をカラムに充填し、樹脂量の３倍量のイオン交換水で洗浄した後、２規定の水酸化ナトリウム溶液を樹脂量の３倍量通液し、さらに樹脂量の３倍量のイオン交換水で洗浄することにより調製した。
【実施例１】
【００４０】
陰イオン交換樹脂の粒度の調整
吸着用陰イオン交換樹脂（デュオライト（登録商標）Ａ−１１３（Ｃｌ−型）、均一係数：１．６、球形）を目開き０．７ｍｍ（内径７５ｍｍ内高２０ｍｍ）のふるいに乗せ、上からイオン交換水を流しながら軽くふるい、ふるいを通過した陰イオン交換樹脂をビーカーに回収した。通過するイオン交換樹脂が少なくなったところで、ふるい上の樹脂を除去し、また新たな樹脂を乗せ同様の操作を繰り返した。
【００４１】
上記操作により粒度のそろった約２００ｍｌのイオン交換樹脂を得た。以下、このイオン交換樹脂を粒度調整イオン交換樹脂と呼ぶ。粒度調整イオン交換樹脂の均一係数を計算したところ、１．３であった。
【００４２】
均一係数は以下の方法により計算した。すなわち、イオン交換樹脂の粒子の大きさをふるい分け、ふるい上に残る残留体積（ｍｌ）を測定して、イオン交換樹脂の残留体積（ｍｌ）とふるいの目開き（ｍｍ）をそれぞれ縦軸と横軸にとりグラフに作図する。グラフより、ふるい残留百分率累計値が９０％及び４０％に対応するふるいの目開き（ｍｍ）を求める。９０％に対応する目開き（ｍｍ）４０％に対応する目開き（ｍｍ）で割ることにより、均一係数を計算した。
【実施例２】
【００４３】
陰イオン交換樹脂の粒形および均一係数の違いによる分離能比較
Ｄ−キロ−イノシトール１ｇとミオ−イノシトール９ｇを混合し、イオン交換水５０ｍｌに溶解した。
上記溶液を、それぞれ異なった３種類のタイプの樹脂（（Ｂ）吸着用樹脂（デュオライト（登録商標）Ａ−１１３（ＯＨ−型） … 均一係数：１．６、球形）、（Ａ）粒度調製イオン交換樹脂（実施例１で調整した樹脂 … 均一係数：１．３、球形）、（Ｃ）クロマト分析用陰イオン交換樹脂（アンバーライト（登録商標）ＣＧ−４００（ＯＨ−型）… 破砕型））３０ｍｌを充填したカラムに１．５ｍｌ（樹脂容量に対し５％）ずつ供し、６０℃、ＳＶ＝１の条件で、イオン交換水を溶離液としたクロマトグラフィー分離を行った。溶出液は２ｍｌずつの分画として集めた。各画分を分析した結果を表１〜３に示した。クロマトグラフィー分離に供したＤ−キロ−イノシトール全量（ｇ）の内、純度１００％のＤ−キロ−イノシトール画分として得られたＤ−キロ−イノシトール量（ｇ）の割合は、（Ｂ）吸着用樹脂、（Ａ）粒度調整イオン交換樹脂、（Ｃ）クロマト分析用陰イオン交換樹脂それぞれ１６％、６５％、６４％であった。また、それぞれの純度１００％のＤ−キロ−イノシトール画分の液量は２２ｍｌ、１６ｍｌ、３２ｍｌであった。
【００４４】
上記の結果から、まず（Ｂ）吸着用樹脂の分離能は低いが、（Ａ）粒度調整イオン交換樹脂と（Ｃ）クロマトグラフィー分析用陰イオン交換樹脂は、同程度の高い分離能を示している。このことは、（Ａ）粒度調整イオン交換樹脂（均一係数：１．３）の分離能が、（Ｂ）吸着用樹脂（均一係数：１．６）の分離能より優れ、分離能のよいクロマトグラフィー分析用の（Ｃ）の場合と同程度であり、均一係数が、１．３より小さい場合に十分な分離能が得られることがわかる。
【００４５】
さらに、純度１００％のＤ−キロ−イノシトール画分の液量を比較すると、球形の（Ａ）粒度調整イオン交換樹脂が、破砕型の（Ｃ）クロマトグラフィー分析用陰イオン交換樹脂の半量であり、工業生産の際の濃縮コストを考えた場合、（Ａ）粒度調整イオン交換樹脂の方が優れた樹脂と考えられた。また、溶出ピークの対称性においても（Ａ）粒度調整イオン交換樹脂が優れていた。
【００４６】
このように工業的に高純度のＤ−キロ−イノシトールを生産するためには、（Ａ）粒度調整イオン交換樹脂が最も適しているのである。
【実施例３】
【００４７】
陰イオン交換樹脂のタイプによる分離能比較
Ｄ-キロ−イノシトールとミオ−イノシトールの分離能を容易に比較するために以下の試験を行った。
下記したそれぞれのイオン交換樹脂をカラム（内径４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）に充填し、１％Ｄ−キロ−イノシトール溶液、１％ミオ−イノシトール溶液をそれぞれ１０μｌずつ注入してイオン交換水を流速１ｍｌで通液し、それぞれのピークの保持時間を測定した。そしてＤ−キロ−イノシトールの保持時間をミオ−イノシトールの保持時間で割ることにより、Ｄ−キロ−イノシトールとミオ−イノシトールの分離能の高い樹脂のタイプを判定した。この場合、Ｄ−キロ−イノシトールの保持時間をミオ−イノシトールの保持時間で割った値が大きいほど、Ｄ−キロ−イノシトールとミオ−イノシトールの分離能がよいことになる。
【００４８】
（１）（水酸基型とＣｌ型の比較）
デュオライト（登録商標）Ａ−１１６（Ｃｌ−型）とデュオライト（登録商標）Ａ−１１６（ＯＨ−型）との比較を行った結果、Ｄ−キロ−イノシトールの保持時間をミオ−イノシトールの保持時間で割った値は、（Ｃｌ−型）１．０１、（ＯＨ−型）１．１９であり、（ＯＨ−型）の方が分離能が高かった。
【００４９】
（２）（陰イオン交換樹脂のタイプの比較）
１型の強塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）Ａ−１１３（ＯＨ−型）、２型の強塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）Ａ−１１６（ＯＨ−型）、弱塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）Ａ−７（ＯＨ−型）の比較を行った。その結果、それぞれのイオン交換樹脂で測定したＤ−キロ−イノシトールの保持時間をミオ−イノシトールの保持時間で割った値は、それぞれ、１型の強塩基性陰イオン交換樹脂 １．７８、２型の強塩基性陰イオン交換樹脂 １．１９、弱塩基性陰イオン交換樹脂 １．０１であり、３つのタイプのうち、１型の強塩基性陰イオン交換樹脂の分離能が最も高かった。
【実施例４】
【００５０】
培養変換物からのＤ−キロ−イノシトールの製造
ミオ−イノシトール ４．０％（１２０ｇ）、酵母エキス ０．１％、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．１％、 Ｋ２ＨＰＯ４ ０．７％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００２％、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．０００２５％、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．０００５％を含む液体培地 ３リットルを、１００ｍｌずつ５００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。各々の三角フラスコにアグロバクテリウム・エスピー ＡＢ１０１２１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７３８３として寄託）を接種し、３３℃で７日間振とう培養した。培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）し、得られた上清を培養上清液とした（収量 約３リットル）。この培養上清液を高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、培養上清液中にはＤ−キロ−イノシトールが３．０ｍｇ／ｍｌの濃度で生成し、ミオ−イノシトールが１２．０ｍｇ／ｍｌ残存していることがわかった。
【００５１】
上記の培養上清液に対し、まず脱イオン化のため次の操作を行った。すなわち強酸性陽イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）Ｃ−２０（Ｈ＋型）５００ｍｌを充填したカラム（内径５ｃｍ、長さ３０ｃｍ）に通過させ、その後このカラムに１０００ｍｌのイオン交換水を通過させて洗浄した。
【００５２】
このカラム通過液及び洗浄液を合併して、強塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）Ａ−１１３（ＯＨ−型）（均一係数１．３、球形）５００ｍｌを充填したカラム（内径５ｃｍ、長さ３０ｃｍ）に通過させた。その後このカラムに １５００ｍｌのイオン交換水を通過させて洗浄した（収量 約５リットル）。得られた脱イオン化された通過液及び洗浄液を、減圧下で約８０ｍｌまで濃縮した。濃縮液は、結晶と液体の混合液として得られた。ろ過により、結晶と液体を分離した。それぞれ高速液体クロマトグラフィーで分析した結果、固体は約２１ｇのミオ−イノシトール、液体は約９ｇのＤ−キロ−イノシトールと約１５ｇのミオ−イノシトールが含まれている組成物であることが判明した。
【００５３】
該液体成分を、強塩基性陰イオン交換樹脂ダイヤイオン（登録商標）ＭＡ０１ＳＳ（均一係数１．３）１０００ｍｌを充填したカラムに供し、２０℃、ＳＶ＝１の条件で、クロマトグラフィー分離を行った。溶媒はイオン交換水で溶出し、溶出液を５０ｍｌの分画として集めた。各画分を分析し、Ｄ−キロ−イノシトールの純度が１００％である画分を集めて、これらを濃縮した。濃縮液４０ｍｌにエタノール１６０ｍｌを添加し、水−エタノール（１：４）の混合溶媒中で結晶化した。結晶をろ別した後乾燥し、Ｄ−キロ−イノシトール７ｇを得た。
【００５４】
なお、強塩基性陰イオン交換樹脂ダイヤイオン（登録商標）ＭＡ０１ＳＳは、市販の強塩基性イオン交換樹脂の中から、均一係数が１．０〜１．３であることを特徴とする球形の陰イオン交換樹脂として選抜したものである。
【実施例５】
【００５５】
酵素変換物からのＤ−キロ−イノシトールの製造
酵母エキス ０．１％を含む１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）４０リットル（２０リットル容器２基）に、アグロバクテリウム・エスピー ＡＢ１０１２１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７３８３として寄託）よりミオ−イノシトールをＤ−キロ−イノシトールに変換する酵素を国際公開ＷＯ２００２／０５５７１５号パンフレット記載の方法により大腸菌に組み込んだＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株を植菌し、３６℃で１日培養した後、培養液を連続遠心（９，０００ｒｐｍ）にかけ、菌体を分離回収した。回収した菌体に１８００ｍｌのリゾチーム溶液（１．７ｍｇ／ｍｌ）を加え、３０分処理した後、２．４％ＴｒｉｔｏｎＸ１００を３ｍｌ加え、超音波処理により菌体を完全に破砕した。これを酵素溶液とした。
【００５６】
ミオ−イノシトール１０Ｋｇ、ＮＡＤ（＋）１０ｇ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ ５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ６ｇを、イオン交換水に溶解し、４０リットルとした。これに、上で調製した酵素溶液全量を加え、３６℃で１日間振とうした。反応液を８０℃で３０分加熱処理し、連続遠心（９，０００ｒｐｍ）した。得られた上清を、脱イオン化のため強酸性陽イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）Ｃ−２０（Ｈ＋型）５リットルを充填したカラムに通過させ、その後このカラムに１５リットルのイオン交換水を通過させて洗浄した。このカラム通過液及び洗浄液を合併して、強塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）Ａ−１１３（ＯＨ−型）５リットルを充填したカラムに通過させた。その後このカラムに １５リットルのイオン交換水を通過させて洗浄した。さらにこのカラム通過液及び洗浄液を合併して、クロマト用活性炭２００ｍｌを充填したカラムに通過させた。その後このカラムに１リットルのイオン交換水を通過させて洗浄した。
【００５７】
上記により得た通過液及び洗浄液はＤ−キロ−イノシトール９６０ｇとミオ−イノシトール９０４０ｇが含まれている組成物であった。これを、減圧下で約１５リットルまで濃縮し、イソプロピルアルコール３．３リットルを加え、結晶化を行った。ろ過により、結晶と液体を分離した。得られた液体はＤ−キロ−イノシトール９３０ｇとミオ−イノシトール４６０ｇが含まれている組成物であった。その溶液を６リットルまで濃縮し、２リットルずつ、強塩基性陰イオン交換樹脂ダイヤイオン（登録商標）ＭＡ０１ＳＳ ３０リットルを充填したカラムに供し、２５℃、ＳＶ＝１の条件で、クロマトグラフィー分離を行った。溶離液はイオン交換水とし、溶出液を２リットルの分画として集めた。各画分を分析し、Ｄ−キロ−イノシトールの純度が９７％以上である画分を集めて、これらを濃縮乾固した。その結果、９９％以上の純度のＤ−キロ−イノシトール８６０ｇを得た。
【実施例６】
【００５８】
検出器設置タイプのクロマト分離装置によるＤ−キロ−イノシトール精製
Ｄ−キロ−イノシトール１ｇとミオ−イノシトール９ｇを混合し、イオン交換水５０ｍｌに溶解した。
上記溶液のうち１．５ｍｌ（樹脂容量に対し５％）を、強塩基性陰イオン交換樹脂ダイヤイオン（登録商標）ＭＡ０１ＳＳ ３０ｍｌを充填したカラムに供し、６０℃、ＳＶ＝１の条件で、イオン交換水で溶出し、溶出液がＯＲ検出器（ＯＲ ＤＥＴＥＣＴＥＲ ＯＲ−１５９０日本分光株式会社）、ＲＩ検出器（ＲＩ ＤＥＴＥＣＴＥＲ ＲＩ−１５３０日本分光株式会社）を通過するようにし、通過液の成分をモニタリングした。モニター画面を見ながら、ミオ−イノシトールが溶出し終わり、Ｄ−キロ−イノシトールの純度が１００％となったところで、溶出液を回収し始め、Ｄ−キロ−イノシトールの溶出が終わるまで回収した。これにより、純度１００％のＤ−キロ−イノシトール１８ｍｇを得た。
【００５９】
【表１】
【００６０】
【表２】
【００６１】
【表３】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物より、Ｄ−キロ−イノシトールを主成分とする組成物を製造する方法、及びＤ−キロ−イノシトールを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｄ−キロ−イノシトールは、９種類存在するイノシトールの立体異性体の一つであり、近年、インシュリン非依存性糖尿病の治療薬として公知であり（例えば、特許文献１参照）、また多嚢胞性卵巣症候群の治療薬としても知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
このＤ−キロ−イノシトールの代表的な製造方法としては次の (a) 〜 (e) の方法が知られている。
【０００４】
（ａ）抗生物質のカスガマイシンを加水分解して、その分子構成部分であるＤ−キロ−イノシトールを得る次の３つの方法、すなわち (ｉ) カスガマイシンの強酸による加水分解法（例えば、特許文献２参照）、（ii）カスガマイシンをアセチル化した後に加水分解する方法（例えば、特許文献3参照）、及び（iii）強酸性イオン交換樹脂によるカスガマイシンの加水分解法（例えば、特許文献４参照）。
（ｂ）グルクロン酸を原料として１０段階以上の化学合成ステップを経て、Ｄ−キロ−イノシトールを合成する方法（例えば、特許文献５参照）。
（ｃ）ブーゲンビリアなどの植物中に含まれるピニトールを、脱メチル化してＤ−キロ−イノシトールを調製する方法（例えば、特許文献６、特許文献７参照）。
（ｄ）微生物培養または、酵素を用いて、ミオ−イノシトールをＤ−キロ−イノシトールへ変換する方法（例えば、特許文献８参照）。
（ｅ）ミオ−イノシトールを原料として１Ｄ−２，３−ジ−Ｏ−アセタール化ミオ−イノシトールを経て、Ｄ−キロ−イノシトールを合成する方法（例えば、特許文献９参照）。
【０００５】
これらの方法の中で（ｄ）の方法は、製造工程も少なく、Ｄ−キロ−イノシトールを製造する安価な方法である。しかしながら、（ｄ）の方法によって、微生物培養または酵素を用いて、ミオ−イノシトールをＤ−キロイノシトールへ変換すると、Ｄ−キロ−イノシトールと未変換のミオ−イノシトールとの混合物としてしか得られない。
【０００６】
ミオ−イノシトールとＤ−キロ−イノシトールとを分離する方法としては、クロマトグラフィー分析用強塩基性陰イオン交換樹脂ＣＧ４００を用いて分離する方法が知られている。しかしながら、この強塩基性陰イオン交換樹脂ＣＧ４００は、分析級のイオン交換樹脂を粉砕して７５〜１５０μｍに粒度を調整し、クロマトグラフ分析用途の実験用樹脂として製造販売されているのものであって、工業的規模で使用するには、次のような問題点があり、必ずしも満足できるものではなかった。すなわち、（イ）このイオン交換樹脂は高価であり、これを用いた場合製造コストが上がる。（ロ）粒子が細かく沈降するのに時間がかかるため、大型カラムを調製するのに長時間を要する。（ハ）また、破砕型で樹脂形状が必ずしも一定でなくバラツキがあり、充填状態にムラができやすいため大型カラムに均一に充填するのが難しい。
【０００７】
【特許文献１】国際公開第９０／１０４３９号パンフレット
【特許文献２】米国特許第５０９１５９６号明細書
【特許文献３】米国特許第５４６３１４２号明細書
【特許文献４】米国特許第５７１４６４３号明細書
【特許文献５】米国特許第５４０６００５号明細書
【特許文献６】米国特許第５８２７８９６号明細書
【特許文献７】特開２００１−２６１６００号公報
【特許文献８】特開平９−１４０３８８号公報
【特許文献９】特開２００１−１６３８１０号公報
【非特許文献１】「ザ・ニュウ・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」, (米国), １９９９年，第３４０巻, ｐ．１３１４−１３２０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、高純度のＤ−キロ−イノシトールを効率よく、安価に製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、前記した課題を達成するため、特にミオ−イノシトールとＤ−キロ−イノシトールとを効率よく分離するための方法について種々検討を重ねた。その結果、均一係数が１．０〜１．３で、球形の陰イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィー分離により、ミオ−イノシトールとＤ−キロ−イノシトールとを効率よく分離することができることを知見するにいたった。
【００１０】
ここで、「均一係数」とは、粒子の粒度分布の特徴を表す数値の１つで、ふるいを通過した粒子が６割のときのふるいの寸法（目開き）を、粒子が１割通過したときのふるいの寸法（目開き）で割った数値である。
【００１１】
より詳しく説明すれば、粒子の大きさをふるい分けにより測定して正規分布の状態を対数確率グラフに直線として作図し、ふるい残留百分率累計値が９０％および４０％に対するふるいの目開き（ｍｍ）を求める。９０％に対する目開き（ｍｍ）を有効径と称し、４０％に対する目開きと有効径の比を「均一係数」としている。このようにして求められる均一係数は、１．０に近いほど粒径がそろっていることになる。
【００１２】
また、粒形に関しては、球形でない場合すなわち破砕型樹脂は、一般的に粒子が小さく粒子形状が一定でないため、工業用カラムに均一に充填することが困難である。これに対し、球形の場合は粒子形状が一定しており、工業用カラムに充填したときに均一になり、工業用カラムに適している。
【００１３】
本発明を実施することにより、ミオ−イノシトールとＤ−キロ−イノシトールとの組成物から、Ｄ−キロ−イノシトールを主成分とする組成物を得る方法、及びＤ−キロ−イノシトールを得る方法が提供される。ここで本発明の「Ｄ−キロ−イノシトールを主成分とする組成物」とは、成分組成が、Ｄ−キロ−イノシトールが５１〜１００％、ミオ−イノシトールが０〜４９％およびその他の成分が０〜２％の場合の組成物をいう。
【００１４】
より具体的には、本発明は次のごとくに要約することができる。
【００１５】
第１には、Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物を、均一係数が１．０〜１．３で、球形の陰イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィー分離により分離することを特徴とする、Ｄ−キロ−イノシトールを主成分とする組成物の製造方法。
【００１６】
第２には、Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物を、均一係数が１．０〜１．３で、球形の陰イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィー分離により分離することを特徴とする、Ｄ−キロ−イノシトールの製造方法。
【００１７】
第３には、Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物を、均一係数が１．０〜１．３で、球形の強塩基性陰イオン交換樹脂の水酸基型を用いたクロマトグラフィー分離により分離することを特徴とする、Ｄ−キロ−イノシトールを主成分とする組成物の製造方法。
【００１８】
第４には、Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物を、均一係数が１．０〜１．３で、球形の強塩基性陰イオン交換樹脂の水酸基型を用いたクロマトグラフィー分離により分離することを特徴とする、Ｄ−キロ−イノシトールの製造方法。
【００１９】
第５には、ミオ−イノシトールに微生物または酵素を作用させることにより得られた、Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物を、均一係数が１．０〜１．３で、球形の陰イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィー分離により分離することを特徴とする、Ｄ−キロ−イノシトールを主成分とする組成物の製造方法。
【００２０】
第６には、ミオ−イノシトールに微生物または酵素を作用させることにより得られた、Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物を、均一係数が１．０〜１．３で、球形の陰イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィー分離により分離することを特徴とする、Ｄ−キロ−イノシトールの製造方法。
【００２１】
第７には、ミオ−イノシトールに微生物または酵素を作用させることにより得られた、Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物を、均一係数が１．０〜１．３で、球形の強塩基性陰イオン交換樹脂の水酸基型を用いたクロマトグラフィー分離により分離することを特徴とする、Ｄ−キロ−イノシトールを主成分とする組成物の製造方法。
【００２２】
第８には、ミオ−イノシトールに微生物または酵素を作用させることにより得られた、Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物を、均一係数が１．０〜１．３で、球形の強塩基性陰イオン交換樹脂の水酸基型を用いたクロマトグラフィー分離により分離することを特徴とする、Ｄ−キロ−イノシトールの製造方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明を実施すれば、高純度のＤ−キロ−イノシトールを効率よく安価に製造する方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は次の通りに実施される。
【００２５】
本発明に用いられるＤ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物は、天然界からの抽出物あるいはミオ−イノシトールを原料とした微生物または酵素による変換によって得られたものなど、どのような由来のものでもよい。そして、Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールの組成比もどのような比率でもよいが、好ましくは、Ｄ−キロ−イノシトールとミオ−イノシトールとの比率が５：９５〜９８：２のものがよい。さらに好ましくは、５０：５０よりもＤ−キロ−イノシトール含量の多いものがよい。また、出発材料のＤ−キロ−イノシトール含量が大きいものほど、より精製度の高いＤ−キロ−イノシトールを得やすいため、これらの観点から出発材料の組成比を決定してもよい。他の成分の存在については、陰イオン交換樹脂に吸着しないものであれば、混在しても問題はない。
【００２６】
なお、組成物は、クロマトグラフィー分離において良好な分離を保つために、脱イオン化されていることが望ましい。少々のイオン物質の混在した状態の組成物、例えばイオン交換樹脂の交換容量に対し、数パーセント程度のイオンが混入している組成物であれば、脱イオン化せずにクロマトグラフィー分離することも可能であるが、コスト面から複数回の使用が好ましいので、クロマトグラフィー用樹脂にイオンが吸着するにつれて徐々に分離能が低下することを防ぐ為に、脱イオン化することが望ましい。
【００２７】
樹脂の粒度の調整つまり均一係数が１．０〜１．３であることを特徴とする陰イオン交換樹脂の調整は、どのような方法によっても良いが、簡単な方法を例示すれば、市販イオン交換樹脂(例えば、デュオライト(登録商標)Ａ−１１３ 均一係数１．６)をふるいにかけて、粒度を揃えることによりできる。市販されている工業用イオン交換樹脂は通常球形をしているが、実験用に用いるクロマトグラフィー分析用イオン交換樹脂には破砕型もある（例えば、アンバーライト（登録商標）ＣＧ−４００）ため、球形のイオン交換樹脂を選んで使用するのがよい。
【００２８】
使用する樹脂は、Ｄ−キロ−イノシトールとミオ−イノシトールとを分離する能力の高い強塩基性樹脂が好ましく、この中でも１型の強塩基性樹脂が好ましい。
【００２９】
クロマトグラフィー分離に供するＤ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物は溶媒に溶解させておくことが好ましい。その溶媒としては、Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを溶解させることができ、樹脂にも悪影響を与えないものが好ましい。これらの条件にあう溶媒としては水を主体とする溶媒、例えばイオン交換水や水を主体とする水アルコール混液（例えば、５％エチルアルコール溶液）が挙げられる。
【００３０】
クロマトグラフィー分離に供するＤ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物の濃度は、総イノシトール濃度として10〜70％が望ましい。また、分離の条件にもよるが、クロマトグラフィー分離に供する組成物の1回の注入量は、樹脂容量に対し3〜20％が望ましい。
【００３１】
クロマトグラフィー分離の条件は、まず溶離液としては、Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを溶解させることができ、樹脂にも悪影響を与えないものとして、水を主体とする溶媒が使用できる。例えばイオン交換水や水を主体とする水アルコール混液（例えば、５％エチルアルコール溶液）が挙げられる。
【００３２】
クロマトグラフィー分離の他の条件としては、温度10〜70℃、流速、ＳＶ＝0.5〜5、が望ましい。また、樹脂の劣化を防ぐためにプレカラムを用いてもよい。
【００３３】
ここで、上記した流速を表すＳＶ（Ｓｐａｃｅ Ｖｅｌｏｃｉｔｙ）とは、空間速度のことであり、イオン交換樹脂の充填してあるカラムを１時間に通過する液量（ｍｌ）とカラムに充填している樹脂量（ｍｌ）との比として求められる。
【００３４】
上記条件で得られる溶出液を、樹脂容量の２〜１０％程度の容量で分画を行い、それぞれの画分に含まれるＤ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを分析し、高純度のＤ−キロ−イノシトール画分のみを回収すれば、高純度のＤ−キロ−イノシトールを得ることができる。
【００３５】
また、２回目以降の分画を同条件で行った場合、分離条件は再現されるので、第1回目の結果を参考に目的の画分のみを得ることも可能である。
【００３６】
さらには、クロマトグラフィー分離装置に検出器を設置すれば、目的のピークのみをクロマトグラフィー分離と同時に簡単に目的物を回収することも可能である。検出器の例としては第１にRI検出器が挙げられる。RI検出器を用いれば、液中のイノシトール濃度が測定されるため、第１ピークとしてミオ−イノシトールを、第２ピークとしてＤ−キロ−イノシトールを検出することができる。さらに旋光度を検出するためのOR検出器を付加すれば、旋光度を持つＤ−キロ−イノシトールを検出することができる。
【００３７】
以下に本発明の実施例を示してより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３８】
＜イノシトール異性体及びその他糖類の分析方法＞
以下の実施例で得られた組成物等のサンプルは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。高速液体クロマトグラフィーの分析条件は以下の通りである。
カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ ５ＮＨ２（４．６×２５０ｍｍ）
カラム温度：４０℃
検出器：ＲＩ ＤＥＴＥＣＴＥＲ ＲＩ−１５３０（日本分光株式会社）
注入量：２０μｌ
溶媒：アセトニトリル：水＝４：１
流量：２ｍｌ／ｍｉｎ
【００３９】
＜陰イオン交換樹脂（ＯＨ−型）の調製＞
以下の実施例で使用するそれぞれの陰イオン交換樹脂（ＯＨ−型）は、それぞれの陰イオン交換樹脂（Ｃｌ−型）をカラムに充填し、樹脂量の３倍量のイオン交換水で洗浄した後、２規定の水酸化ナトリウム溶液を樹脂量の３倍量通液し、さらに樹脂量の３倍量のイオン交換水で洗浄することにより調製した。
【実施例１】
【００４０】
陰イオン交換樹脂の粒度の調整
吸着用陰イオン交換樹脂（デュオライト（登録商標）Ａ−１１３（Ｃｌ−型）、均一係数：１．６、球形）を目開き０．７ｍｍ（内径７５ｍｍ内高２０ｍｍ）のふるいに乗せ、上からイオン交換水を流しながら軽くふるい、ふるいを通過した陰イオン交換樹脂をビーカーに回収した。通過するイオン交換樹脂が少なくなったところで、ふるい上の樹脂を除去し、また新たな樹脂を乗せ同様の操作を繰り返した。
【００４１】
上記操作により粒度のそろった約２００ｍｌのイオン交換樹脂を得た。以下、このイオン交換樹脂を粒度調整イオン交換樹脂と呼ぶ。粒度調整イオン交換樹脂の均一係数を計算したところ、１．３であった。
【００４２】
均一係数は以下の方法により計算した。すなわち、イオン交換樹脂の粒子の大きさをふるい分け、ふるい上に残る残留体積（ｍｌ）を測定して、イオン交換樹脂の残留体積（ｍｌ）とふるいの目開き（ｍｍ）をそれぞれ縦軸と横軸にとりグラフに作図する。グラフより、ふるい残留百分率累計値が９０％及び４０％に対応するふるいの目開き（ｍｍ）を求める。９０％に対応する目開き（ｍｍ）４０％に対応する目開き（ｍｍ）で割ることにより、均一係数を計算した。
【実施例２】
【００４３】
陰イオン交換樹脂の粒形および均一係数の違いによる分離能比較
Ｄ−キロ−イノシトール１ｇとミオ−イノシトール９ｇを混合し、イオン交換水５０ｍｌに溶解した。
上記溶液を、それぞれ異なった３種類のタイプの樹脂（（Ｂ）吸着用樹脂（デュオライト（登録商標）Ａ−１１３（ＯＨ−型） … 均一係数：１．６、球形）、（Ａ）粒度調製イオン交換樹脂（実施例１で調整した樹脂 … 均一係数：１．３、球形）、（Ｃ）クロマト分析用陰イオン交換樹脂（アンバーライト（登録商標）ＣＧ−４００（ＯＨ−型）… 破砕型））３０ｍｌを充填したカラムに１．５ｍｌ（樹脂容量に対し５％）ずつ供し、６０℃、ＳＶ＝１の条件で、イオン交換水を溶離液としたクロマトグラフィー分離を行った。溶出液は２ｍｌずつの分画として集めた。各画分を分析した結果を表１〜３に示した。クロマトグラフィー分離に供したＤ−キロ−イノシトール全量（ｇ）の内、純度１００％のＤ−キロ−イノシトール画分として得られたＤ−キロ−イノシトール量（ｇ）の割合は、（Ｂ）吸着用樹脂、（Ａ）粒度調整イオン交換樹脂、（Ｃ）クロマト分析用陰イオン交換樹脂それぞれ１６％、６５％、６４％であった。また、それぞれの純度１００％のＤ−キロ−イノシトール画分の液量は２２ｍｌ、１６ｍｌ、３２ｍｌであった。
【００４４】
上記の結果から、まず（Ｂ）吸着用樹脂の分離能は低いが、（Ａ）粒度調整イオン交換樹脂と（Ｃ）クロマトグラフィー分析用陰イオン交換樹脂は、同程度の高い分離能を示している。このことは、（Ａ）粒度調整イオン交換樹脂（均一係数：１．３）の分離能が、（Ｂ）吸着用樹脂（均一係数：１．６）の分離能より優れ、分離能のよいクロマトグラフィー分析用の（Ｃ）の場合と同程度であり、均一係数が、１．３より小さい場合に十分な分離能が得られることがわかる。
【００４５】
さらに、純度１００％のＤ−キロ−イノシトール画分の液量を比較すると、球形の（Ａ）粒度調整イオン交換樹脂が、破砕型の（Ｃ）クロマトグラフィー分析用陰イオン交換樹脂の半量であり、工業生産の際の濃縮コストを考えた場合、（Ａ）粒度調整イオン交換樹脂の方が優れた樹脂と考えられた。また、溶出ピークの対称性においても（Ａ）粒度調整イオン交換樹脂が優れていた。
【００４６】
このように工業的に高純度のＤ−キロ−イノシトールを生産するためには、（Ａ）粒度調整イオン交換樹脂が最も適しているのである。
【実施例３】
【００４７】
陰イオン交換樹脂のタイプによる分離能比較
Ｄ-キロ−イノシトールとミオ−イノシトールの分離能を容易に比較するために以下の試験を行った。
下記したそれぞれのイオン交換樹脂をカラム（内径４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）に充填し、１％Ｄ−キロ−イノシトール溶液、１％ミオ−イノシトール溶液をそれぞれ１０μｌずつ注入してイオン交換水を流速１ｍｌで通液し、それぞれのピークの保持時間を測定した。そしてＤ−キロ−イノシトールの保持時間をミオ−イノシトールの保持時間で割ることにより、Ｄ−キロ−イノシトールとミオ−イノシトールの分離能の高い樹脂のタイプを判定した。この場合、Ｄ−キロ−イノシトールの保持時間をミオ−イノシトールの保持時間で割った値が大きいほど、Ｄ−キロ−イノシトールとミオ−イノシトールの分離能がよいことになる。
【００４８】
（１）（水酸基型とＣｌ型の比較）
デュオライト（登録商標）Ａ−１１６（Ｃｌ−型）とデュオライト（登録商標）Ａ−１１６（ＯＨ−型）との比較を行った結果、Ｄ−キロ−イノシトールの保持時間をミオ−イノシトールの保持時間で割った値は、（Ｃｌ−型）１．０１、（ＯＨ−型）１．１９であり、（ＯＨ−型）の方が分離能が高かった。
【００４９】
（２）（陰イオン交換樹脂のタイプの比較）
１型の強塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）Ａ−１１３（ＯＨ−型）、２型の強塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）Ａ−１１６（ＯＨ−型）、弱塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）Ａ−７（ＯＨ−型）の比較を行った。その結果、それぞれのイオン交換樹脂で測定したＤ−キロ−イノシトールの保持時間をミオ−イノシトールの保持時間で割った値は、それぞれ、１型の強塩基性陰イオン交換樹脂 １．７８、２型の強塩基性陰イオン交換樹脂 １．１９、弱塩基性陰イオン交換樹脂 １．０１であり、３つのタイプのうち、１型の強塩基性陰イオン交換樹脂の分離能が最も高かった。
【実施例４】
【００５０】
培養変換物からのＤ−キロ−イノシトールの製造
ミオ−イノシトール ４．０％（１２０ｇ）、酵母エキス ０．１％、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．１％、 Ｋ２ＨＰＯ４ ０．７％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０１％、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００２％、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．０００２５％、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．０００５％を含む液体培地 ３リットルを、１００ｍｌずつ５００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。各々の三角フラスコにアグロバクテリウム・エスピー ＡＢ１０１２１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７３８３として寄託）を接種し、３３℃で７日間振とう培養した。培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）し、得られた上清を培養上清液とした（収量 約３リットル）。この培養上清液を高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果、培養上清液中にはＤ−キロ−イノシトールが３．０ｍｇ／ｍｌの濃度で生成し、ミオ−イノシトールが１２．０ｍｇ／ｍｌ残存していることがわかった。
【００５１】
上記の培養上清液に対し、まず脱イオン化のため次の操作を行った。すなわち強酸性陽イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）Ｃ−２０（Ｈ＋型）５００ｍｌを充填したカラム（内径５ｃｍ、長さ３０ｃｍ）に通過させ、その後このカラムに１０００ｍｌのイオン交換水を通過させて洗浄した。
【００５２】
このカラム通過液及び洗浄液を合併して、強塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）Ａ−１１３（ＯＨ−型）（均一係数１．３、球形）５００ｍｌを充填したカラム（内径５ｃｍ、長さ３０ｃｍ）に通過させた。その後このカラムに １５００ｍｌのイオン交換水を通過させて洗浄した（収量 約５リットル）。得られた脱イオン化された通過液及び洗浄液を、減圧下で約８０ｍｌまで濃縮した。濃縮液は、結晶と液体の混合液として得られた。ろ過により、結晶と液体を分離した。それぞれ高速液体クロマトグラフィーで分析した結果、固体は約２１ｇのミオ−イノシトール、液体は約９ｇのＤ−キロ−イノシトールと約１５ｇのミオ−イノシトールが含まれている組成物であることが判明した。
【００５３】
該液体成分を、強塩基性陰イオン交換樹脂ダイヤイオン（登録商標）ＭＡ０１ＳＳ（均一係数１．３）１０００ｍｌを充填したカラムに供し、２０℃、ＳＶ＝１の条件で、クロマトグラフィー分離を行った。溶媒はイオン交換水で溶出し、溶出液を５０ｍｌの分画として集めた。各画分を分析し、Ｄ−キロ−イノシトールの純度が１００％である画分を集めて、これらを濃縮した。濃縮液４０ｍｌにエタノール１６０ｍｌを添加し、水−エタノール（１：４）の混合溶媒中で結晶化した。結晶をろ別した後乾燥し、Ｄ−キロ−イノシトール７ｇを得た。
【００５４】
なお、強塩基性陰イオン交換樹脂ダイヤイオン（登録商標）ＭＡ０１ＳＳは、市販の強塩基性イオン交換樹脂の中から、均一係数が１．０〜１．３であることを特徴とする球形の陰イオン交換樹脂として選抜したものである。
【実施例５】
【００５５】
酵素変換物からのＤ−キロ−イノシトールの製造
酵母エキス ０．１％を含む１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）４０リットル（２０リットル容器２基）に、アグロバクテリウム・エスピー ＡＢ１０１２１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７３８３として寄託）よりミオ−イノシトールをＤ−キロ−イノシトールに変換する酵素を国際公開ＷＯ２００２／０５５７１５号パンフレット記載の方法により大腸菌に組み込んだＪＭ１０９−ｐＢＡ１９株を植菌し、３６℃で１日培養した後、培養液を連続遠心（９，０００ｒｐｍ）にかけ、菌体を分離回収した。回収した菌体に１８００ｍｌのリゾチーム溶液（１．７ｍｇ／ｍｌ）を加え、３０分処理した後、２．４％ＴｒｉｔｏｎＸ１００を３ｍｌ加え、超音波処理により菌体を完全に破砕した。これを酵素溶液とした。
【００５６】
ミオ−イノシトール１０Ｋｇ、ＮＡＤ（＋）１０ｇ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ ５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ６ｇを、イオン交換水に溶解し、４０リットルとした。これに、上で調製した酵素溶液全量を加え、３６℃で１日間振とうした。反応液を８０℃で３０分加熱処理し、連続遠心（９，０００ｒｐｍ）した。得られた上清を、脱イオン化のため強酸性陽イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）Ｃ−２０（Ｈ＋型）５リットルを充填したカラムに通過させ、その後このカラムに１５リットルのイオン交換水を通過させて洗浄した。このカラム通過液及び洗浄液を合併して、強塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）Ａ−１１３（ＯＨ−型）５リットルを充填したカラムに通過させた。その後このカラムに １５リットルのイオン交換水を通過させて洗浄した。さらにこのカラム通過液及び洗浄液を合併して、クロマト用活性炭２００ｍｌを充填したカラムに通過させた。その後このカラムに１リットルのイオン交換水を通過させて洗浄した。
【００５７】
上記により得た通過液及び洗浄液はＤ−キロ−イノシトール９６０ｇとミオ−イノシトール９０４０ｇが含まれている組成物であった。これを、減圧下で約１５リットルまで濃縮し、イソプロピルアルコール３．３リットルを加え、結晶化を行った。ろ過により、結晶と液体を分離した。得られた液体はＤ−キロ−イノシトール９３０ｇとミオ−イノシトール４６０ｇが含まれている組成物であった。その溶液を６リットルまで濃縮し、２リットルずつ、強塩基性陰イオン交換樹脂ダイヤイオン（登録商標）ＭＡ０１ＳＳ ３０リットルを充填したカラムに供し、２５℃、ＳＶ＝１の条件で、クロマトグラフィー分離を行った。溶離液はイオン交換水とし、溶出液を２リットルの分画として集めた。各画分を分析し、Ｄ−キロ−イノシトールの純度が９７％以上である画分を集めて、これらを濃縮乾固した。その結果、９９％以上の純度のＤ−キロ−イノシトール８６０ｇを得た。
【実施例６】
【００５８】
検出器設置タイプのクロマト分離装置によるＤ−キロ−イノシトール精製
Ｄ−キロ−イノシトール１ｇとミオ−イノシトール９ｇを混合し、イオン交換水５０ｍｌに溶解した。
上記溶液のうち１．５ｍｌ（樹脂容量に対し５％）を、強塩基性陰イオン交換樹脂ダイヤイオン（登録商標）ＭＡ０１ＳＳ ３０ｍｌを充填したカラムに供し、６０℃、ＳＶ＝１の条件で、イオン交換水で溶出し、溶出液がＯＲ検出器（ＯＲ ＤＥＴＥＣＴＥＲ ＯＲ−１５９０日本分光株式会社）、ＲＩ検出器（ＲＩ ＤＥＴＥＣＴＥＲ ＲＩ−１５３０日本分光株式会社）を通過するようにし、通過液の成分をモニタリングした。モニター画面を見ながら、ミオ−イノシトールが溶出し終わり、Ｄ−キロ−イノシトールの純度が１００％となったところで、溶出液を回収し始め、Ｄ−キロ−イノシトールの溶出が終わるまで回収した。これにより、純度１００％のＤ−キロ−イノシトール１８ｍｇを得た。
【００５９】
【表１】
【００６０】
【表２】
【００６１】
【表３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物を、均一係数が１．０〜１．３で、球形の陰イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィー分離により分離することを特徴とする、Ｄ−キロ−イノシトールを主成分とする組成物の製造方法。
【請求項２】
Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物を、均一係数が１．０〜１．３で、球形の陰イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィー分離により分離することを特徴とする、Ｄ−キロ−イノシトールの製造方法。
【請求項３】
Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物を、均一係数が１．０〜１．３で、球形の強塩基性陰イオン交換樹脂の水酸基型を用いたクロマトグラフィー分離により分離することを特徴とする、Ｄ−キロ−イノシトールを主成分とする組成物の製造方法。
【請求項４】
Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物を、均一係数が１．０〜１．３で、球形の強塩基性陰イオン交換樹脂の水酸基型を用いたクロマトグラフィー分離により分離することを特徴とする、Ｄ−キロ−イノシトールの製造方法。
【請求項５】
Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物が、ミオ−イノシトールに微生物または酵素を作用させることにより得られた組成物であることを特徴とする、請求項１に記載のＤ−キロ−イノシトールを主成分とする組成物の製造方法。
【請求項６】
Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物が、ミオ−イノシトールに微生物または酵素を作用させることにより得られた組成物であることを特徴とする、請求項２に記載のＤ−キロ−イノシトールの製造方法。
【請求項７】
Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物が、ミオ−イノシトールに微生物または酵素を作用させることにより得られた組成物であることを特徴とする、請求項３に記載のＤ−キロ−イノシトールを主成分とする組成物の製造方法。
【請求項８】
Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物が、ミオ−イノシトールに微生物または酵素を作用させることにより得られた組成物であることを特徴とする、請求項４に記載のＤ−キロ−イノシトールの製造方法。
【請求項１】
Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物を、均一係数が１．０〜１．３で、球形の陰イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィー分離により分離することを特徴とする、Ｄ−キロ−イノシトールを主成分とする組成物の製造方法。
【請求項２】
Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物を、均一係数が１．０〜１．３で、球形の陰イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィー分離により分離することを特徴とする、Ｄ−キロ−イノシトールの製造方法。
【請求項３】
Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物を、均一係数が１．０〜１．３で、球形の強塩基性陰イオン交換樹脂の水酸基型を用いたクロマトグラフィー分離により分離することを特徴とする、Ｄ−キロ−イノシトールを主成分とする組成物の製造方法。
【請求項４】
Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物を、均一係数が１．０〜１．３で、球形の強塩基性陰イオン交換樹脂の水酸基型を用いたクロマトグラフィー分離により分離することを特徴とする、Ｄ−キロ−イノシトールの製造方法。
【請求項５】
Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物が、ミオ−イノシトールに微生物または酵素を作用させることにより得られた組成物であることを特徴とする、請求項１に記載のＤ−キロ−イノシトールを主成分とする組成物の製造方法。
【請求項６】
Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物が、ミオ−イノシトールに微生物または酵素を作用させることにより得られた組成物であることを特徴とする、請求項２に記載のＤ−キロ−イノシトールの製造方法。
【請求項７】
Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物が、ミオ−イノシトールに微生物または酵素を作用させることにより得られた組成物であることを特徴とする、請求項３に記載のＤ−キロ−イノシトールを主成分とする組成物の製造方法。
【請求項８】
Ｄ−キロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含む組成物が、ミオ−イノシトールに微生物または酵素を作用させることにより得られた組成物であることを特徴とする、請求項４に記載のＤ−キロ−イノシトールの製造方法。
【公開番号】特開２００６−３６６３９（Ｐ２００６−３６６３９Ａ）
【公開日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２１３８９８（Ｐ２００４−２１３８９８）
【出願日】平成１６年７月２２日（２００４．７．２２）
【出願人】（０００２４２００２）北興化学工業株式会社 (182)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月２２日（２００４．７．２２）
【出願人】（０００２４２００２）北興化学工業株式会社 (182)
【Ｆターム（参考）】
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