ＤＩＧ−５殺虫性ＣＲＹ毒素
ＤＩＧ−５Ｃｒｙ毒素、かかる毒素をコードするポリヌクレオチド、有害生物を防除するためのかかる毒素の使用、及びかかる毒素を産生する遺伝子組換え植物が開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年６月１６日に出願された米国仮出願第６１/１８７，４５５号の利益を主張するものであり、同号を本明細書において参照により明示的に援用する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、新規殺虫性のＣｒｙ毒素及び昆虫を防除する（control）ためのその使用に関連する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）（Ｂ．ｔ．）は、デルタエンドトキシン又はＣｒｙタンパク質として公知の殺有害生物性の結晶タンパク質を産生する土壌伝播性のバクテリアである。Ｃｒｙタンパク質は、感受性を有する昆虫の中腸細胞に作用することにより機能する経口中毒物質である。いくつかのＣｒｙ毒素が線虫に対して活性を有することが明らかにされている。デルタエンドトキシンの広範なリストが、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｉｆｅｓｃｉ．ｓｕｓｓｅｘ．ａｃ．ｕｋ／ｈｏｍｅ／Ｎｅｉｌ＿Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ／Ｂｔ／ｉｎｔｒｏ．ｈｔｍｌ．で維持され、定期的に更新されている。
【０００４】
ウエスタンコーンルートワーム（ＷＣＲ）、Diabrotica virgifera virgifera LeConteは、経済的に重要なトウモロコシ有害生物であり、同生物は、穀物収穫量の損失及び昆虫管理費用に起因して、北米で毎年推定＄１０億もの歳入喪失を引き起こす（Metcalfの文献、1986年）。ＷＣＲ管理の実践として、大豆による輪作、化学殺虫剤、及びより最近ではＢ．ｔ．のＣｒｙタンパク質を発現する遺伝子組換え作物が挙げられる。しかし、今日までにＣｒｙ３４Ａｂ１／Ｃｒｙ３５Ａｂ１（Ellisらの文献、2002年）、改変されたＣｒｙ３Ａａ１（Waltersらの文献、2008年）、及び改変されたＣｒｙ３Ｂｂ１（Vaughnらの文献、2005年）を含む数例のＢ．ｔ．Ｃｒｙタンパク質が、ＷＣＲに対して商業レベルの有効性を実現するに過ぎない。これらのＢ．ｔ．タンパク質は、遺伝子組換えトウモロコシの根で産生されると、ＷＣＲによるトウモロコシの根の損傷を防止する上で極めて効果的である（Moellenbeckらの文献、2001年、Vaughnらの文献、2005年、米国特許第７３６１８１３号）。
【０００５】
ＷＣＲ抵抗性の遺伝子組換えトウモロコシで成功を収めたにも関わらず、いくつかの要因により、ＷＣＲを防除するための新しいＣｒｙタンパク質を発見し、開発する必要性が生じている。第１に、現在展開されているＣｒｙタンパク質が遺伝子組換えトウモロコシ植物中で産生されると、ＷＣＲによる根の損傷から強固に保護されることとなり、これによって穀粒収量が確保されるが、人工的な寄生試験において、いくらかのＷＣＲ成虫が出現し、不完全な幼虫防除を示唆している。２番目に、抵抗性の昆虫個体群が発生し、ルートワームの防除においてＣｒｙタンパク質の長期耐久性が脅かされている。Ｃｒｙタンパク質に対して抵抗性を有する鱗翅目の昆虫が、コナガ（Plutella xylostella）（Tabashnikの文献、1994年）、キンウワバ（Trichoplusia ni）（Janmaat及びMyersの文献、2003年、2005年）、及びアメリカタバコガ（Helicoverpa zeae）（Tabashnikらの文献、2008年）の領域において発生した。Ｂ．ｔ．Ｃｒｙタンパク質に対して抵抗性を有する昆虫は、いくつかの機構を通じて発生し得る（Heckelらの文献（2007年）、Pigott及びEllarの文献、2007年）。Ｃｒｙタンパク質に関する複数の受容体タンパク質クラスが昆虫内に同定され、及び各受容体クラス内に複数の例が存在する。特定のＣｒｙタンパク質に対する抵抗性は、例えば、受容体タンパク質のカドヘリンドメインの毒素結合部分内の突然変異により発生し得る。更なる抵抗手段は、プロトキシン処理プロテアーゼ（protoxin-processing protease）により媒介され得る。鱗翅目の種に認められるＣｒｙ毒素抵抗性は、少なくとも４つの異なる主要な抵抗遺伝子を伴う複雑な遺伝学的基礎を有する。同様に、甲虫目の種においてＣｒｙ毒素抵抗性を制御するための複数の遺伝子が推測される。新規の高い効力を有するＣｒｙタンパク質が開発されれば、ＷＣＲを管理するための更なるツールがもたらされるであろう。ＷＣＲ昆虫における抵抗性発生の防止、及びルートワームを防除するためのＢ．ｔ．技術の長期的有用性の確保を、遺伝子組換えトウモロコシ内で組み合わせることにより、異なる作用機序を有するＣｒｙタンパク質を生み出すことができる。
【発明の概要】
【０００６】
発明の要旨
本発明は、本明細書でＤＩＧ−５と呼ぶ毒素並びにＤＩＧ−５の変異体を含む殺虫性のＣｒｙ毒素、これらの毒素をコードする核酸、当該毒素を用いて有害生物を防除する方法、遺伝子組換え（transgenic）宿主細胞内で当該毒素を産生する方法、及び当該毒素を発現する遺伝子組換え（transgenic）植物を提供する。野生型ＤＩＧ−５毒素の予測されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【０００７】
実施例１に記載するように、ＤＩＧ−５タンパク質をコードする核酸は、Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ ＬＬＣが社内的にＰＳ１９８Ｑ７と呼ぶＢ．ｔ．系統から単離された。完全長コーディング領域に関する核酸配列は決定され、及び完全長タンパク質配列が当該核酸配列から推定された。ＤＩＧ−５毒素は、Ｃｒｙ７Ｂａ１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢＢ７０８１７．１）、及びその他のＢ．チューリンゲンシス（thuringiensis）のＣｒｙ７タイプタンパク質とある程度の類似性を有する（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｉｆｅｓｃｉ．ｓｕｓｓｅｘ．ａｃ．ｕｋ／ｈｏｍｅ／Ｎｅｉｌ＿Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ／Ｂｔ／ｉｎｔｒｏ．ｈｔｍｌ）。
【０００８】
殺虫剤として活性なＤＩＧ−５毒素変異体も本明細書において記載され、まとめてＤＩＧ−５毒素と呼ぶ。この毒素は、抵抗性甲虫目昆虫個体群の発生を制御するために、単独で又はその他のＣｒｙ毒素、例えばＣｒｙ３４Ａｂ１／Ｃｒｙ３５Ａｂ１（ＤＡＳ−５９１２２−７）、Ｃｒｙ３Ｂｂ１（ＭＯＮ８８０１７）、Ｃｒｙ３Ａ（ＭＩＲ６０４）、キメラＣｒｙ１Ａｂ／Ｃｒｙ３Ａａ（ＦＲ８Ａ、国際公開第２００８／１２１６３３Ａ１号）、ＣｒｙＥＴ３３とＣｒｙＥＴ３４、Ｖｉｐ１Ａ、Ｃｒｙ１Ｉａ、ＣｒｙＥＴ８４、ＣｒｙＥＴ８０、ＣｒｙＥＴ７６、ＣｒｙＥＴ７１、ＣｒｙＥＴ６９、ＣｒｙＥＴ７５、ＣｒｙＥＴ３９、ＣｒｙＥＴ７９、及びＣｒｙＥＴ７４と組み合わせて使用可能である。
【０００９】
ＤＩＧ−５毒素は、その他の害虫（insect pest）を防除するためにＲＮＡｉ法と組み合わせて用いることもできる。例えば、ＤＩＧ−５は、コーンルートワーム内の必須遺伝子又は害虫内の必須遺伝子を抑制するｄｓＲＮＡと組み合わせて遺伝子組換え植物で利用可能である。かかる標的遺伝子として、例えば液胞型ＡＴＰアーゼ（vacuolar ATPase）、ＡＲＦ−１、Ａｃｔ４２Ａ、ＣＨＤ３、ＥＦ−１α、及びＴＦＩＩＢが含まれる。適する標的遺伝子の例として、国際公開第２００７／０３５６５０号で開示するように液胞型ＡＴＰアーゼが挙げられる。
【００１０】
１つの実施形態では、本発明は、
（ａ）配列番号２の残基１１４〜６５５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｂ）配列番号２の残基１１４〜６５５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｃ）配列番号２によりコードされる毒素の発現又は活性に悪影響を及ぼさない最大２０個のアミノ酸の置換、欠損、又は修飾を含む、配列番号２の残基１１４〜６５５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
から構成される群より選択されるコア毒素セグメントを含む単離されたＤＩＧ−５毒素ポリペプチド又はその殺虫剤として（insecticidally）活性な断片を提供する。
【００１１】
本発明の別の実施形態では、本発明は、
（ａ）配列番号２の残基１〜６５５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｂ）配列番号２の残基１〜６５５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｃ）配列番号２によりコードされる毒素の発現又は活性に悪影響を及ぼさない最大２０個のアミノ酸の置換、欠損、又は修飾を含む、配列番号２の残基１〜６５５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
から構成される群より選択されるＤＩＧ−５コア毒素セグメントを含む単離されたＤＩＧ−５毒素ポリペプチド又はその殺虫剤として活性な断片を提供する。
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、
（ａ）配列番号２の残基１１４〜１１４９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｂ）配列番号２の残基１１４〜１１４９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｃ）配列番号２によりコードされる毒素の発現又は活性に悪影響を及ぼさない最大２０個のアミノ酸の置換、欠損、又は修飾を含む、配列番号２の残基１１４〜１１４９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
から構成される群より選択されるＤＩＧ−５コア毒素セグメントを含む単離されたＤＩＧ−５毒素ポリペプチド又はその殺虫剤として活性な断片を提供する。
【００１３】
別の実施形態では、本発明は、
（ａ）配列番号２の残基１〜１１４９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｂ）配列番号２の残基１〜１１４９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｃ）配列番号２によりコードされる毒素の発現又は活性に悪影響を及ぼさない最大２０個のアミノ酸の置換、欠損、又は修飾を含む、配列番号２の残基１〜１１４９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
から構成される群より選択されるＤＩＧ−５コア毒素セグメントを含む単離されたＤＩＧ−５毒素ポリペプチド又はその殺虫剤として活性な断片を提供する。
【００１４】
別の実施形態では、本発明はＤＩＧ−５毒素を含む植物を提供する。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、有害生物個体群（pest population）を防除する方法であって、前記個体群を、殺有害生物剤として（pesticidally）有効な量のＤＩＧ−５毒素と接触させるステップを含む方法を提供する。
【００１６】
別の実施形態では、本発明は、ＤＩＧ−５毒素をコードする単離された核酸を提供する。
【００１７】
別の実施形態では、本発明は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）由来でないプロモーターであって、植物内で発現を推進する能力を有するプロモーターに作動可能に連結した、ＤＩＧ−５毒素をコードする核酸配列を含むＤＮＡ構築物を提供する。本発明は、ゲノムに安定的に組み込まれたＤＮＡ構築物を含む遺伝子組換え植物、及び有害生物から植物を保護する方法であって、前記構築物を前記植物に導入するステップを含む方法も提供する。
【００１８】
配列の簡単な説明
配列番号１：完全長ＤＩＧ−５毒素をコードするＤＮＡ配列；３４４７ｎｔ。
配列番号２：完全長ＤＩＧ−５タンパク質配列；１１４９ａａ。
配列番号３：トウモロコシ最適化ＤＩＧ−５コア毒素コーディング領域；１９６５ｎｔ。
配列番号４：Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメント；５４５ａａ。
配列番号５：キメラ毒素：ＤＩＧ−５コア／Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメント；１２００ａａ。
配列番号６：Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントをコードする双子葉植物最適化ＤＮＡ配列;１６３５ｎｔ
配列番号７：Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントをコードするトウモロコシ最適化ＤＮＡ配列；１６３５ｎｔ
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
ＤＩＧ−５毒素、及び殺虫剤として活性な変異体。配列番号２の完全長ＤＩＧ−５毒素に加えて、本発明は、殺虫剤として活性な変異体を含む。用語「変異体」と呼ぶとき、本出願者らは、断片、しかるべき欠損及び挿入突然変異体、及びしかるべき融合タンパク質を含むように意図する。ＤＩＧ−５は、古典的な３ドメインＣｒｙ毒素である。本発明に含まれるＤＩＧ−５毒素の変異体を記載するに当たり、その前置きとして一般的な３ドメインＣｒｙ毒素の構造、及び具体的なＤＩＧ−５タンパク質毒素の構造を簡潔に総説することが有用であろう。
【００２０】
大部分のバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のデルタエンドトキシン結晶タンパク質分子は、２つの機能的セグメントから構成されている。プロテアーゼ抵抗性コア毒素は第１のセグメントであり、及びタンパク質分子のほぼ前半部分に対応する。完全な約１３０ｋＤａプロトキシン分子は、昆虫腸内のプロテアーゼにより速やかに処理されて抵抗性のコアセグメントになる。この処理により除去されるセグメントは、本明細書では「プロトキシンセグメント」と呼ぶ。プロトキシンセグメントは、毒素の結晶形成に関与していると考えられている（Arvidsonらの文献（1989年））。従って、プロトキシンセグメントは、毒素分子がプロテアーゼにより処理されるのを抑制し（Haiderらの文献、1986年）、又は毒素の溶解度を低下させ（Aronsonらの文献、1991年）、こうして昆虫へのコアのアクセス性を制限することにより、昆虫に偏よった特異性を毒素に付与することができる。Ｂ．ｔ．毒素は特定のクラスに含まれるといっても、長さ及びコア毒素部分からプロトキシン部分に移行する正確な場所についてある程度変化する。コア毒素部分からプロトキシン部分への移行は、一般的に完全長毒素の約５０％〜約６０％の間で生ずる。配列番号２では、完全長ＤＩＧ−５ポリペプチドの１１４９個のアミノ酸からなる配列が開示されており、そのうちのＮ末端側６５５個のアミノ酸は、ＤＩＧ−５コア毒素を含む。配列番号１の５’末端部１９６５個のヌクレオチドはコア毒素のコーディング領域を含む。
【００２１】
３次元結晶構造が、Ｃｒｙ１Ａａ１、Ｃｒｙ２Ａａ１、Ｃｒｙ３Ａａ１、Ｃｒｙ３Ｂｂ１、Ｃｒｙ４Ａａ、Ｃｒｙ４Ｂａ、及びＣｒｙ８Ｅａ１について決定された。コア毒素に関するこれらの構造は極めて類似しており、及び下記の特徴を有する３つの異なるドメインから構成される（de Maagdらの文献、2003年でレビューされている）。
【００２２】
ドメインＩは、７つのαへリックスからなる１つの束であり、へリックス５が６つの両親媒性へリックスに取り囲まれている。このドメインからはポア形成が示唆されており、ヘモリジンやコリシンを含むその他のポア形成タンパク質と構造的類似性を共有している。ＤＩＧ−５タンパク質のドメインＩは、配列番号２のアミノ酸残基５５〜２８１を含む。
【００２３】
ドメインＩＩは、βプリズム内に共にパックされた３つの逆平行βシートから形成されている。このドメインのループは、昆虫の中腸受容体に結合する際に重要な役割を演じている。Ｃｒｙ１Ａタンパク質では、ドメインＩＩβシートの頂点部で表面に露出したループは、鱗翅目のカドヘリン受容体との結合に関与している。Ｃｒｙ３ＡａドメインＩＩループは、コロラドハムシ（Leptinotarsa decemlineata）（Say）（Colorado potato beetle）の膜結合性メタロプロテアーゼに類似の様式で結合する（Ochoa-Campuzanoらの文献、2007年）。ドメインＩＩは、ビテリンやジャカリンを含むある種の炭水化物結合タンパク質と構造的類似性を有する。ＤＩＧ−５タンパク質のドメインＩＩは配列番号２のアミノ酸残基２８６〜４９９を含む。
【００２４】
ドメインＩＩＩは２つの逆平行βシートからなるβサンドイッチである。このドメインは、グルカナーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、シアリダーゼ等のタンパク質の炭水化物結合ドメインと構造的に関連する。ドメインＩＩＩは、受容体タンパク質のある種のクラスと結合し、おそらく受容体の第２のクラス、その例として、Ｃｒｙ１Ａタンパク質の場合では、アミノペプチダーゼやアルカリホスファターゼが挙げられるが、これらと相互作用するオリゴマー型毒素プレポア（pre-pore）の挿入に関与している（Honeeらの文献（1991年）、Pigott及びEllarの文献、（2007年））。甲虫目では類似するＣｒｙドメインＩＩＩ受容体はまだ見つかっていない。保存性のＢ．ｔ．配列ブロック２及び３は、ドメイン２のＮ末端及びＣ末端近傍にそれぞれマップする。従って、これらの保存性の配列ブロック２及び３は、ほぼ上記３つの機能性ドメイン間に位置する境界領域に該当する。保存性のＤＮＡ及びタンパク質のこれらの領域の相同性は、組換えＢ．ｔ．毒素を工学的に作り出すのに利用されてきた（米国特許第６，０９０，９３１号、国際公開第９１／０１０８７号、同第９５／０６７３０号、同第１９９８０２２５９５号）。ＤＩＧ−５タンパク質のドメインＩＩＩは、配列番号２のアミノ酸残基５０９〜６５３を含む。
【００２５】
受容体が結合した後、ドメインＩのαへリックス１は除去されることが報告されている。Aronsonらの文献（1999年）では、ＢＢＭＶに結合したＣｒｙ１Ａｃは、αへリックス１直後の残基５９で始まるプロテイナーゼＫの切断から保護されることが実証された。同様の結果がＣｒｙ１Ａｂについて例証された。Gomezらの文献（2002年）では、ＢＢＭＶ受容体が結合して形成されたＣｒｙ１Ａｂオリゴマーは、ドメインＩのαへリックス１の部分を欠いていることが見出された。また、Soberonらの文献（2007年）では、３次元Ｃｒｙ構造におけるαへリックス１を含む約６０個のアミノ酸を欠損するＣｒｙ１Ａｂ及びＣｒｙ１ＡｃのＮ末端欠損突然変異体は、カドヘリンが結合しなくても分子量約６０ｋＤａのモノマーをプレポアに会合させることができることも明らかにされた。これらのＮ末端欠損突然変異体は、Ｃｒｙ抵抗性の幼虫に対して活性を有することが報告された。更に、Diaz-Mendozaらの文献（2007年）では、地中海マツマダラメイガ（corn borer）（Sesamia nonagrioides）に対して活性を維持する４３ｋＤａ及び４６ｋＤａのＣｒｙ１Ａｂ断片について記載された。これらの断片は、アミノ酸残基１１６〜４２３を含むことが実証された。但し、正確なアミノ酸配列は明らかにされておらず、及びこれらのタンパク質分解性断片の活性機構は不明である。Gomezら（2002年）、Soberonら2007年、及びDiaz-Mendozaら（2007年）の文献の結果は、Hofteらの文献（1986年）の結果とは対照的であり、Ｈｏｆｔｅらは、Ｃｒｙ１ＡｂのＮ末端から３６個のアミノ酸が欠損すると殺虫活性が喪失することを報告した。
【００２６】
本発明者らは、ＤＩＧ−５のタンパク質配列を、構造が公知のＣｒｙ８Ｅａ１に関するタンパク質配列と比較することにより、へリックス１、２Ａ、２Ｂ、及び３の始まりと終わり、及びＤＩＧ−５毒素のドメインＩ内の前記ヘリックス間に位置するスペーサー領域の場所を推測した。これらの場所を表１に記載する。
【００２７】
【表１】
【００２８】
ＤＩＧ−５のアミノ末端欠損変異体。本発明の１つの態様では、本発明は、殺虫活性が改善し、及び昆虫が抵抗性を発生するのを防ぐように、ヘリックス１、２Ａ、及び２Ｂの全て又は一部が欠損しているＤＩＧ−５変異体を提供する。これらの改変体は、改善した標的有害生物スペクトル、効力、及び昆虫抵抗性管理等の、改善した特性をＤＩＧ−５変異体に付与するように作製される。本願発明のいくつかの実施形態では、本願改変体はプロトキシン活性化、及びポア形成効率に影響を及ぼす可能性があり、以って昆虫に中毒を引き起こす。より具体的には、ＤＩＧ−５変異体に改善した特性を付与するために、Ｎ末端をコードする遺伝子部分を除去する段階的な欠損が記載される。当該欠損では、ドメインＩ内のαへリックス１の全て、及びαへリックス２の全て又は一部が除去され、一方αへリックス３〜７の構造的完全性は維持される。従って、本願発明はＣｒｙタンパク質の有効性に対する改善に一部関連し、同改善は、より有効にポア形成するようにドメインＩのαへリックス成分を工学的に作り出すことにより生み出される。より具体的には、本願発明は、Ｃｒｙ１タンパク質のドメインＩ内にあるαへリックス１及び２に対して相同性を有する推定二次構造を備えた領域内で、Ｎ末端欠損を有するように設計される改善したＤＩＧ−５タンパク質に一部関連する。
【００２９】
ＤＩＧ−５毒素の殺虫特性を改善する欠損は、推定されたαへリックス２Ａが開始する前で始まり、αへリックス２Ｂ末端の後で終了し得るが、αへリックス３内まで及ばないのが好ましい。
【００３０】
Ｎ末端欠損変異体のコーディング配列を設計する際には、メチオニンをコードするＡＴＧ開始コドンが、欠損変異体を発現するように設計されたヌクレオチド配列の５’末端に挿入される。遺伝子組換え植物で使用するように設計される配列の場合、Varshavsky（1997年）の文献の「Ｎ末端規則」に従うのが有利となり得る。いくつかのアミノ酸がタンパク質のＮ末端残基として表現されると、真核細胞ではタンパク質が不安定化し、及び分解する原因となり得ることが教示される。例えば、酵母菌及び哺乳動物の細胞の観察から収集されたデータから、Ｎ末端の不安定化アミノ酸は、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｙ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｉ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、及びおそらくはＰであることが示唆される。タンパク質分解機構の詳細は生物間で若干異なる可能性があるが、上記で認められようなＮ末端不安定化アミノ酸の同一性は保存的であることから、同様の機構は植物細胞においても機能し得ることが示唆される。例えば、Worleyらの文献（1998年）では、植物の場合、Ｎ末端規則には塩基性及び芳香族性残基が含まれることを見出した。可能性として、本願Ｂ．ｔ．殺虫性タンパク質のαへリックス３の開始部近傍で植物プロテアーゼによるタンパク質分解切断が生ずると、不安定化Ｎ末端アミノ酸が露出し得ることが挙げられる。かかる処理は、切断されたタンパク質を速やかに分解するようにこれを標的とし得るが、またＢ．ｔ．の殺虫性タンパク質の蓄積を、昆虫を有効に防除するには不十分なレベルに制限し得る。従って、不安定化アミノ酸のうちの１つのアミノ酸で始まるＮ末端欠損変異体の場合、本出願者らは、翻訳開始メチオニンと不安定化アミノ酸との間にＧ（グリシン）アミノ酸を規定するコドンを付加することが好ましいと考える。
【００３１】
実施例２では、本発明に基づくＤＩＧ−５のアミノ末端欠損変異体の具体的な例が記載されている。
【００３２】
キメラ毒素。別のＣｒｙ毒素のプロトキシンセグメントと融合した、１つのＣｒｙ毒素のコア毒素ドメインを利用するキメラタンパク質が、これまでに報告されている。ＤＩＧ−５変異体には、コア毒素部分の末端部を通り過ぎたある点で異種性の（heterologous）プロトキシンセグメントと融合した、ＤＩＧ−５毒素のＮ末端毒素コア部分（完全長又は上記Ｎ末端欠損を有し得る）を含む毒素が含まれる。異種性のプロトキシンセグメントへの移行は、ほぼコア毒素／プロトキシン接合部において生じ得るが、又は別の方法では、天然のプロトキシンの一部分（コア毒素部分を過ぎて延長する）を、下流で生ずる異種性のプロトキシンへの移行と共に保持し得る。例として、本願発明のキメラ毒素は、ＤＩＧ−５の全毒素部分（アミノ酸１〜６５５）及び異種性のプロトキシン（アミノ酸６５５〜Ｃ末端）を有する。好ましい実施形態では、プロトキシンの異種性部分は、配列番号５に示すようにＣｒｙ１Ａｂデルタエンドトキシンに由来する。
【００３３】
配列番号４は、本発明のＤＩＧ−５変異体で有用なＣｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントの５４５個のアミノ酸配列を開示する。本願発明のキメラ毒素に含めるのに最も重要な、本プロトキシンセグメントの最後の約１００〜１５０個のアミノ酸に注目されたい。
【００３４】
プロテアーゼ感受性変異体。昆虫の腸内プロテアーゼは、一般的に食物タンパク質から必要とされるアミノ酸を摂取する際に昆虫を支援するように機能する。最も良く理解されている昆虫消化プロテアーゼはセリンプロテアーゼであり、特に鱗翅目の種で最も一般的なタイプとして出現する（Englemann及びGeraertsの文献（1980年））。甲虫目の昆虫は、鱗翅目の腸よりも中性から酸性の腸を有する。甲虫目の幼虫及び成虫の大部分、例えばコロラドハムシ（Colorado potato beetle）は、わずかに酸性の中腸を有し、及びシステインプロテアーゼが主要なタンパク質分解活性をもたらす（Wolfson及びMurdockの文献（1990年））。より正確には、Thie及びHousemanの文献（1990年）では、コロラドハムシ中のカテプシンＢ様及びカテプシンＨ様システインプロテアーゼ、及びカテプシンＤ様アスパルチルプロテアーゼを同定し、及び特徴付けを行った。Gillikinらの文献（1992年）では、ウエスタンコーンルートワームの幼虫の腸内タンパク質分解活性について特徴付けを行い、及び主にシステインプロテアーゼであることを見出した。米国特許第７２３０１６７号は、ウエスタンコーンルートワーム内にセリンプロテアーゼであるカテプシンＧが存在することを開示した。昆虫の腸内プロテアーゼは多様であり、及びその活性レベルは異なるが、これらは特定のＢ．ｔ．毒素に対する昆虫の感受性に影響を及ぼす可能性がある。
【００３５】
本発明の別の実施形態では、ある種の害虫の感受性を有する幼虫の中腸内におけるタンパク質処理に影響を及ぼすように、プロテアーゼ切断部位を所望の場所に工学的に作り出すことができる。そのようなプロテアーゼ切断部位は、化学的遺伝子合成法又はスプライスオーバーラップＰＣＲ法（splice overlap PCR）（Hortonらの文献、1989年）等の方法により導入され得る。例えば、感受性を有する幼虫の中腸内における、所望の欠損ポイントにおけるタンパク質処理に影響を及ぼすように、セリンプロテアーゼ認識配列を任意選択的にＣｒｙタンパク質構造内の特異的部位に挿入可能である。そのような方法で利用可能なセリンプロテアーゼには、鱗翅目の中腸セリンプロテアーゼ、例えばトリプシン、又はトリプシン様酵素、キモトリプシン、エラスターゼ等が含まれる（Christellerらの文献、1992年）。更に、未分画の幼虫中腸内プロテアーゼ調製物により生成されるＣｒｙタンパク質消化生成物を配列決定することにより、又は刷子縁膜小胞（brush border membrane vesicles）に結合することにより経験的に同定される欠損部位は、タンパク質の活性化に影響を及ぼすように工学的に作り出すことができる。遺伝子の欠損、又はプロテアーゼ切断部位の導入のいずれかによって生み出される改変されたＣｒｙタンパク質は、鱗翅目の有害生物、例えばアワノメイガ（Ostrinia nubilalis）、ナンセイアワノメイガ（Diatraea grandiosella）、アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）、タマナヤガ（Agrotis ipsilon）、ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）、シロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）、サトウキビメイガ（Diatraea saccharalis）、ロクサグロティス・アルビコスタ（Loxagrotis albicosta）、甲虫目の有害生物、例えばウエスタンコーンルートワーム、サザンコーンルートワーム、ノーザンコーンルートワーム（すなわち、Diabrotica種）及びその他の標的有害生物に対して改善した活性を有する。
【００３６】
甲虫目のセリンプロテアーゼ、例えばトリプシン、キモトリプシン、及びカテプシンＧ様プロテアーゼ、甲虫目のシステインプロテアーゼ、例えばカテプシン（Ｂ様、Ｌ様、Ｏ様、及びＫ様プロテアーゼ）（Koiwaらの文献（2000年）、及びBownらの文献（2004年））、甲虫目のメタロプロテアーゼ、例えばＡＤＡＭ１０（Ochoa-Campuzanoらの文献（2007年））、及び甲虫目のアスパラギン酸プロテアーゼ、例えばカテプシンＤ様及びＥ様、ペプシン、プラスメプシン、及びキモシンは、所望の処理部位に適切な認識配列を工学的に作り出すことにより、ある種の害虫の感受性を有する幼虫の中腸内で生じるＣｒｙタンパク質処理に影響を及ぼすように更に利用可能である。
【００３７】
かかるプロテアーゼ切断部位を導入するのに好ましい場所は、αへリックス２Ｂ及びαへリックス３の間のスペーサー領域内、例えば完全長ＤＩＧ−５タンパク質のアミノ酸１０９〜１１３の中にあり得る（配列番号２及び表１）。プロテアーゼ切断部位を導入するのに２番目に好ましい場所は、αへリックス３及びαへリックス４の間のスペーサー領域内（表１）、例えば、配列番号２の完全長ＤＩＧ−５タンパク質のアミノ酸１４４〜１４７の中にあり得る。遺伝子欠損、又はプロテアーゼ切断部位の導入のいずれかにより生み出される改変されたＣｒｙタンパク質は、ウエスタンコーンルートワーム、サザンコーンルートワーム、ノーザンコーンルートワーム等を含む、但し、これらに限定されない害虫に対して改善した活性を有する。
【００３８】
ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端残基を含むアミノ酸配列の決定を可能にする様々な技術が存在する。例えば、自動化エドマン分解法が、連続した方式で、１残基当たり９８％の正確性を有して最大３０個のアミノ酸残基のＮ末端アミノ酸配列について決定するのに利用可能である。更に、ポリペプチドのカルボキシ末端を含むアミノ酸の配列決定も可能である（Baileyらの文献（1992年）;米国特許第６０４６０５３号）。従って、いくつかの実施形態では、タンパク質分解処理により、例えば昆虫の腸から調製されたプロテアーゼにより活性化されたＢ．ｔ．Ｃｒｙタンパク質について特徴付けが可能であり、及び活性化された毒素断片のＮ末端又はＣ末端アミノ酸の同定が可能である。ＤＩＧ−５変異体は、昆虫、植物、又は微生物のプロテアーゼによるより大型の変異体タンパク質のタンパク質分解切断を可能にし、又は阻止するように、コーディング配列内の適切な位置でプロテアーゼ処理部位を導入又は除去することにより生み出されるが、同変異体は本発明の範囲に含まれる。かかる操作の最終的な結果として、インタクトな（完全長）毒素タンパク質と同等の、又はそれを凌駕する活性を有する毒素断片分子が生み出されると理解される。
【００３９】
ＤＩＧ−５毒素のドメイン。ＤＩＧ−５毒素の個別のドメイン（及びかかるドメインと９０、９５、又は９７％の同一性を有する変異体）は、その他のＣｒｙ毒素に由来するドメインと結合体（combinations）を形成するのに有用であり、新規毒素に有害生物毒性スペクトルの拡大、効力の改善、又はタンパク質の安定性の向上を付与すると期待される。ＤＩＧ−５タンパク質のドメインＩは、配列番号２のアミノ酸残基５５〜２８１を含む。ＤＩＧ−５タンパク質のドメインＩＩは、配列番号２のアミノ酸残基２８６〜４９９を含む。ＤＩＧ−５タンパク質のドメインＩＩＩは、配列番号２のアミノ酸残基５０９〜６５３を含む。ドメインスワッピング又はシャッフリングは、変更されたデルタエンドトキシンタンパク質を生み出す別の機構である。ドメインＩＩ及びＩＩＩは、デルタエンドトシンタンパク質間でスワッピングすることができ、その結果、殺有害生物活性又は標的スペクトルが改善したハイブリッド又はキメラ毒素が得られる。ドメインＩＩは受容体結合に関与しており、及びドメインＩＩＩは受容体タンパク質の特定のクラスと結合し、及びおそらくはオリゴマー型毒素プレポアの挿入に関与している。その他の毒素においていくつかのドメインＩＩＩ置換体が、シロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）に対して優れた毒性を発揮することが明らかにされ（de Maagdらの文献（1996年））、及びＣｒｙ毒素ドメインスワップの設計に関するガイダンスが存在する（Knightらの文献（2004年））。
【００４０】
組換えタンパク質作製方法、及びその殺有害生物活性試験法は当技術分野において周知されている（例えば、Naimovらの文献（2001年）、de Maagdらの文献（1996年）、Geらの文献（1991年）、Schnepfらの文献（1990年）、Rangらの文献（1999年）を参照）。Ｃｒｙ１Ａ及びＣｒｙ３Ａタンパク質に由来するドメインＩでは、膜中にポアを挿入し、形成する能力について研究されている。ドメインＩのαへリックス４及び５は膜挿入及びポア形成で重要な役割を演じており（Waltersらの文献、1993年、Gazitらの文献、1998年；Nunez-Valdezらの文献、2001年）、これ以外のその他のへリックスについては、傘の骨のように膜表面に接触することが提案された（Bravoらの文献（2007年）；Gazitらの文献（1998年））。
【００４１】
限られた数のアミノ酸について欠損、置換、又は付加を施すことにより構築されるＤＩＧ−５変異体。配列番号２のアミノ酸配列に対するアミノ酸の欠損、置換、及び付加は、連続した方式で容易に実施することができ、及びかかる変化が殺虫活性に及ぼす効果はバイオアッセイにより試験可能である。いくつかの変更が数において限定的であれば、かかる試験は理不尽な実験法を伴うことはない。本発明には、殺虫剤として活性なコア毒素変異体が含まれ（配列番号２のアミノ酸１〜６５５又は配列番号２のアミノ酸１１４〜６５５）、同変異体では最大１０個、最大１５個、又は最大２０個のアミノ酸の付加、欠損、又は置換が施された。
【００４２】
本発明には、配列番号２のアミノ酸の１〜６５５、又は配列番号２のアミノ酸の１１４〜６５５に対して、９０％、９５％、又は９７％同一であるコア毒素セグメントを有するＤＩＧ−５変異体が含まれる。
【００４３】
変異体は、ランダムな突然変異を起こさせることにより作製可能であり、又は変異体は設計可能である。設計による突然変異体の場合、生物学的活性を説明する、又は最終的に生物学的活性に関わる３次元構造の決定に関係する毒素の重要な領域においてアミノ酸の同一性が維持されるとき、天然毒素と類似した活性を有する変異体が生成する確率が高い。置換が保存的な場合にも、活性を維持する確率は高くなる。アミノ酸は下記のクラスに分類される：非極性、無電荷極性、塩基性、及び酸性。あるクラスのアミノ酸が同一タイプの別のアミノ酸に置き換わるような保存的な置換では、変異体の生物学的活性が実質的に変化する可能性はほとんどない。表２には各クラスに属するアミノ酸の例が記載されている。
【００４４】
【表２】
【００４５】
いくつかの事例では、非保存的置換も実施可能である。重要な要因として、これらの置換は毒素の生物学的活性を顕著に減じてはならないことが挙げられる。変異体には突然変異原性に起因してアミノ酸配列が異なるポリペプチドが含まれる。本発明に含まれる変異体タンパク質は生物学的に活性であり、すなわち天然タンパク質が持つ所望の生物学的活性を継続して有する、すなわち殺有害生物活性を維持する。
【００４６】
配列レベルで異なるが、同一の又は同様の全体的必須３次元構造、表面電荷分布等を維持する変異体タンパク質も設計可能である。例えば、米国特許第７０５８５１５号；Larsonらの文献（2002年）；Stemmerの文献（1994a、1994b、1995）；及びCrameriらの文献（1996a、1996b、1997）を参照されたい。
【００４７】
核酸。ＤＩＧ−５毒素をコードする単離された核酸は本発明の１つの態様である。これには、配列番号２及び配列番号５をコードする核酸、及びその相補体、並びに配列番号２の殺虫性変異体をコードするその他の核酸が含まれる。「単離された」とは、本出願者は、核酸分子が、人の手によってそれが存在する天然の環境から取り出され、及び異なる環境に配置されることを意味する。遺伝子コードの冗長性から、種々の異なるＤＮＡ配列が、本明細書に開示されるアミノ酸配列をコードすることができる。同一の又は本質的に同一の毒素をコードするそのような別のＤＮＡ配列を構築することは、当業者において周知されている。
【００４８】
遺伝子合成。本明細書に記載する、改善したＣｒｙタンパク質をコードする遺伝子は、当技術分野において周知の様々な方法により作製可能である。例えば、亜リン酸トリエステル及びホスホラミダイト化学（Caruthersらの文献、1987年）により、合成遺伝子セグメント及び合成遺伝子を作製することができ、及び商業的ベンダーが、オンデマンドで遺伝子合成を実施するのに利用可能である。完全長遺伝子は、例えば、制限断片のライゲーション、又は重複したオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ連鎖反応アッセンブリ（Stewart及びBurginの文献、2005年）による方法を含む様々な方法で構築可能である。更に、部位−特異的な末端オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅法により、末端遺伝子欠損体を作製することが可能である。
【００４９】
ＤＩＧ−５毒素をコードする核酸は、例えば、いくつかの商業的な供給業者のいずれかが現在実践している方法に基づく合成構築法により作製可能である（例えば、米国特許第７４８２１１９号Ｂ２を参照）。これらの遺伝子、又はその一部分若しくは変異体も、例えば遺伝子シンセサイザー、及び例えば米国特許第５３８０８３１号の設計法を使用することにより、合成的に構築可能である。或いは、合成遺伝子又は天然遺伝子の変形体は、点突然変異を作り出す標準的な分子生物学的技法を用いて容易に構築可能である。これらの遺伝子の断片も、標準的な手法に基づき、市販のエキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼを用いて作製可能である。例えば、Ｂａｌ３１等の酵素又は特定部位の突然変異誘発が、これらの遺伝子の末端部からヌクレオチドを計画的に切り取るのに利用可能である。また、様々な制限酵素を用いて、活性な毒素断片をコードする遺伝子断片も取得可能である。
【００５０】
ＤＩＧ−５毒素のアミノ酸配列を前提とした場合、コーディング配列は、意図した宿主が好むコドンを用いてコーディング配列を逆翻訳し、次に問題を引き起こす可能性のある配列を取り除くように、及び定期的な停止コドンを設定して非コーディングリーディングフレーム内の長いオープンコーディング配列を除去するように代替コドンを用いて配列を洗練させることにより、設計可能である。
【００５１】
配列同一性の定量。２つのアミノ酸配列、又は２つの核酸配列の同一性の割合（％）を求めるために、配列は最適比較目的で整列される。２配列間の同一性の割合（％）は、当該配列に共通する同一位置数の関数である（すなわち、同一性の割合（％）＝同一位置数／総位置数（例えば、重複した位置）×１００）。１つの実施形態では、２つの配列は長さが同一である。２配列間の同一性の割合（％）は、ギャップを許容する、又は許容しない下記の技法に類似した技法を用いて求めることができる。同一性の割合（％）を計算する際には、一般的に完全一致数が計測される。
【００５２】
２配列間の同一性の割合（％）は、数学的なアルゴリズムを用いて決定可能である。かかるアルゴリズムの非限定的な例として、Altschulらの文献（1990年）、及びKarlinとAltschulの文献（1990年）のアルゴリズム、KarlinとAltschulの文献（1993年）の改変されたアルゴリズム、及びＢＬＡＳＴＮとＢＬＡＳＴＸプログラムに組み込まれたアルゴリズムが挙げられる。ＢＬＡＳＴサーチは、核酸又はタンパク質データベース内の問い合わせ配列に対して、配列の相同性（類似性）を識別するのに好都合に用いられ得る。ＢＬＡＳＴＮサーチが、本発明において請求の対象とされる核酸分子に対して相同性を有する核酸配列を識別するために実施可能である（スコア＝１００、ワード長＝１２）。ＢＬＡＳＴＸサーチが、本発明において請求の対象とされる殺虫性タンパク質分子に対して相同性を有するアミノ酸配列を識別するために実施可能である（スコア＝５０、ワード長＝３）。
【００５３】
Altschulらの文献（1997年）のギャップ化ＢＬＡＳＴ法（Gapped BLAST）が、比較目的でギャップを有する整列を取得するのに利用可能であり、或いはＰＳＩ−Ｂｌａｓｔ法が、分子間の離れた関連性を検出する反復サーチを実施するのに利用可能である、Altschulらの文献（1997年）。ＢＬＡＳＴ、ギャップ化ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを使用する際には、各プログラムのデフォルトパラメータが利用可能である。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照されたい。
【００５４】
配列を比較するために用いられる数学的アルゴリズムの非限定的な例として、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Thompsonら、（1994年））が挙げられる。ＣｌｕｓｔａｌＷは配列を比較し、及びアミノ酸配列又はＤＮＡ配列全体を整列させ、こうしてアミノ酸配列又はヌクレオチド配列全体の配列保存性についてデータを提供することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムは、いくつかの市販ＤＮＡ／アミノ酸分析ソフトウェアパッケージ、例えばＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩプログラムスーツ（Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｓｕｉｔｅ）のＡＬＩＧＮＸモジュール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で用いられている。ＡＬＩＧＮＸを用いてアミノ酸配列を整列させる際には、２配列間のアミノ酸の類似性（コンセンサス）又は同一性の割合（％）を評価するために、ギャップオープンペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．１、及びｂｌｏｓｕｍ６３ｍｔ２比較マトリックスからなるデフォルト設定を好都合に使用することができる。ＡＬＩＧＮＸを用いてＤＮＡ配列を整列させる際には、２配列間の同一性の割合（％）を評価するために、ギャップオープンペナルティ１５、ギャップ延長ペナルティ６．６、及びｓｗｇａｐｄｎａｍｔ比較マトリックスからなるデフォルト設定を好都合に使用することができる。
【００５５】
配列を比較するために利用される数学的なアルゴリズムの別の非限定的な例として、Myers及びMillerの文献（1988年）のアルゴリズムが挙げられる。かかるアルゴリズムはｗＳＴＲＥＴＣＨＥＲプログラムに組み込まれており、同プログラムはｗＥＭＢＯＳＳ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部である（ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／より入手可能）。ｗＳＴＲＥＴＣＨＥＲは、線形空間を使用する古典的な動的プログラミングアルゴリズムの修正版を用いて２つの配列の最適グローバルアライメントを計算する。アライメントを計算するのに用いられる、置換マトリックス、ギャップ挿入ペナルティ、及びギャップ延長ペナルティが規定され得る。ヌクレオチド配列を比較するためにｗＳＴＲＥＴＣＨＥＲプログラムを利用する際には、ギャップオープンペナルティ１６及びギャップ延長ペナルティ４が、スコアリングマトリックスファイルＥＤＮＡＦＵＬＬと共に利用可能である。アミノ酸配列を比較するために利用する際には、ギャップオープンペナルティ１２及びギャップ延長ペナルティ２が、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスファイルと共に利用可能である。
【００５６】
配列を比較するために利用される数学的アルゴリズムの更なる非限定的な例として、Needleman及びWunschの文献（1970年）のアルゴリズムが挙げられ、同アルゴリズムは、配列アライメントソフトウェアパッケージ、ＧＡＰバージョン１０及びｗＮＥＥＤＬＥに組み込まれている（ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／）。ＧＡＰバージョン１０は、下記パラメータを用いて配列の同一性又は類似性を求めるのに利用可能である。核酸配列の場合、％同一性及び％類似性は、ギャップウェイト５０、及びレングスウェイト３、及びｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを用いて求められる。アミノ酸配列を比較する場合には、％同一性又は％類似性は、ギャップウェイト８、及びレングスウェイト２、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングプログラムを用いて求められる。
【００５７】
ｗＮＥＥＤＬＥは、２つのインプット配列を読み取り、配列全長にわたり最適なアライメント（ギャップを含む）を見出し、及びその最適なグローバル配列アライメントをファイルに書き出す。このアルゴリズムは、全ての可能性のあるアライメントを洗い出し、及びあらゆる可能性のある残基又はヌクレオチドのマッチに関する数値を含むa.スコアリングマトリックスを用いて最良のアライメントの選択を行う。ｗＮＥＥＤＬＥは、可能性のある最大スコアを有するアライメントを見つけ出すが、アライメントのスコアは、スコアリングマトリックスから取得されたマッチ数の合計から、整列された配列内のオープニングギャップ及び延長ギャップに起因するペナルティを差し引いたものに等しい。置換マトリックス、並びにギャップオープニング及び延長ペナルティはユーザーにより規定される。アミノ酸配列を比較する場合には、デフォルトギャップオープンペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックスが用いられる。ｗＮＥＥＤＬＥを用いてＤＮＡ配列を比較する場合には、ギャップオープンペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５、及びＥＤＮＡＦＵＬＬ比較マトリックスが用いられる。
【００５８】
同等のプログラム（Equivalent programs）も利用可能である。「同等のプログラム」とは、ＡＬＩＧＮＸ、ｗＮＥＥＤＬＥ、又はｗＳＴＲＥＴＣＨＥＲにより生成された対応するアライメントと比較したときに、対象となる任意の２つの配列について、ヌクレオチド又はアミノ酸残基のマッチ数が同一である、及び配列の同一性の割合（％）が同一であるアライメントを生成する任意の配列比較プログラムを指すように意図される。％同一性とは、報告された整列領域（長さ方向の任意のギャップを含む）全体にわたる、２つの配列間の同一マッチ（identical matches）の割合（％）であり、及び％類似性とは、報告された整列領域（長さ方向の任意のギャップを含む）全体にわたる、２つの配列間のマッチ数の割合（％）である。
【００５９】
アライメントは検証により手作業で実施することもできる。
【００６０】
組換え宿主。本願発明の毒素をコードする遺伝子は、多種多様な微生物宿主又は植物宿主に導入可能である。毒素遺伝子が発現すると、直接又は間接的に細胞内で殺有害生物性のタンパク質が産生および維持される。適当な微生物宿主、例えばシュードモナス属（Pseudomonas）を用いて、微生物を有害生物の環境に適用可能であり、その環境では、当該微生物は増殖し、及び摂取される。その結果、有害生物は防除される。或いは、毒素遺伝子の宿主となる微生物は、毒素活性を持続させる、及び細胞を安定化させる条件下で処理可能である。当該処理された細胞は毒性活性を保持し、次に標的とする有害生物の環境に適用可能である。
【００６１】
Ｂ．ｔ．毒素遺伝子が適当なベクターを介して微生物宿主内に導入され、及び前記宿主が生きた状態で環境に適用される場合には、しかるべき宿主微生物を用いることが必須である。１つ又は複数の対象作物の「フィトスフェア（phytosphere）」（葉面（phylloplane）、葉圏（phyllosphere）、根圏（rhizosphere）、及び／又は根面（rhizoplane））を占有することが公知の微生物宿主が選択される。これらの微生物は、特定の環境（作物及びその他の昆虫生息環境）において野生型土着微生物（wild-type indigenous microorganisms）と競合して打ち勝つことができ、ポリペプチド殺有害生物剤を発現する遺伝子の安定的な維持及び発現を実現し、及び望ましくは、環境的な分解及び不活性化から殺有害生物剤を保護する能力が高まるように選択される。
【００６２】
多数の微生物が、多種多様な重要作物の葉面（植物の葉の表面）及び／又は根圏（植物の根の周囲の土壌）に生息することが知られている。これらの微生物には細菌、藻類及び真菌類が含まれる。特に関心がもたれるのは細菌、例えば、シュードモナス（Pseudomonas）属、エルウィニア（Erwinia）属、セラチア（Serratia）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、キサントモナス（Xanthomonas）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、根粒菌（Rhizobium）属、シノリゾビウム（Sinorhizobium）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、メチロフィルス（Methylophilius）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アセトバクター（Acetobacter）属、乳酸桿菌（Lactobacillus）属、アルスロバクター（Arthrobacter）属、アゾトバクター（Azotobacter）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、及びアルカリゲネス（Alcaligenes）属；真菌、特に酵母菌、例えばサッカロマイセス（Saccharomyces）属、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、クリュイベロマイセス（Kluyveromyces）属、スポロボロマイセス（Sporobolomyces）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属、及びオーレオバシジウム（Aureobasidium）属などの微生物である。特に関心がもたれるのはフィトスフェア細菌種、例えばシュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）、ロドシュードモナス・スフェロイデス（Rhodopseudomonas spheroides）、キサントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）、シノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizobium meliloti）（以前はリゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti））、アルカリゲネス・ユートロファス（Alcaligenes eutrophus）、及びアゾトバクター・ヴィネランディ（Azotobacter vinelandii）；並びにフィトスフェア酵母種、例えばロードトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra）、Ｒ．グルティニス（R. glutinis）、Ｒ．マリナ（R. marina）、Ｒ．オーランティアカ（R. aurantiaca）、クリプトコッカス・アルビダス（Cryptococcus albidus）、Ｃ．ディフルエンス（C. diffluens）、Ｃ．ローレンティ（C. laurentii）、サッカロマイセス・ロゼイ（Saccharomyces rosei）、Ｓ．プレトリエンシス（S.pretoriensis）、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）、スポロボロマイセス・ロゼウス（Sporobolomyces roseus）、Ｓ．オドラス（S. odorus）、クリュイベロマイセス・ヴェロネ（Kluyveromyces veronae）、及びオーレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）である。特に関心がもたれるのは色素性微生物である。
【００６３】
害虫を防除する方法
昆虫が、遺伝子組換え植物の発現、処方化されたタンパク質組成物（複数可）、スプレー可能なタンパク質組成物（複数可）、ベイトマトリックス（bait matrix）又はその他の送達システムを介して送達される有効量の毒素に接触した場合には、その結果は一般的に昆虫の死亡であり、又は昆虫は、昆虫にとって利用可能であるが毒素を生成するような食糧源を餌とすることができない。
【００６４】
本願タンパク質毒素は、様々な方法で標的昆虫と接触するように「適用」又は提供可能である。例えば、遺伝子組換え植物（当該タンパク質は当該植物によって産生される、及び当該植物内に存在する）が利用可能であり、当技術分野において周知されている。毒素遺伝子の発現も、当該植物の特定の組織、例えば根、葉等の中で選択的に実現可能である。これは、例えば組織特異的プロモーターを使用することにより実現可能である。スプレーオンアプリケーション（Spray-on applications）は別の事例であり、及び当技術分野において公知である。対象タンパク質は、所望の最終用途用として適切に処方化することができ、次いで寄生が発見される前、標的昆虫が発見された後、前後両方等において、保護の対象となる植物上及び／又は植物周辺／植物近傍にスプレー（又はさもなければ塗布）される。例えば、ベイト顆粒（bait granules）も利用可能で、及び当技術分野において公知である。
【００６５】
遺伝子組換え植物
本願タンパク質は、実際上あらゆるタイプの植物を害虫による損傷から保護するのに利用可能である。かかる植物の例としてほんの数例を挙げれば、トウモロコシ、ヒマワリ、ダイズ、ワタ、キャノーラ、コメ、モロコシ、コムギ、オオムギ、野菜類、観賞植物、コショウ（トウガラシを含む）、サトウダイコン、果物、及び芝等が挙げられる。植物を形質転換する方法は当技術分野において周知されており、及び説明目的で形質転換方法を実施例に記載する。
【００６６】
本願発明の好ましい実施形態は、本願殺虫性タンパク質又はその変異体をコードする遺伝子を用いた植物の形質転換である。形質転換植物は、当該形質転換植物細胞内に防除量の本願殺虫性タンパク質又はその変異体が存在することにより、標的害虫による攻撃に対して抵抗性を有する。Ｂ．ｔ．殺虫性毒素の殺虫特性をコードする遺伝物質を、特定の害虫が侵蝕する植物のゲノム内に組み込むことにより、成虫又は幼虫は当該飼料植物を消費した後に絶命する。非常に多くの単子葉植物及び双子葉植物のメンバーが形質転換されている。遺伝子組換え農業作物の他、果物、及び野菜類が市販対象となっている。かかる作物には、トウモロコシ、コメ、ダイズ、キャノーラ、ヒマワリ、アルファルファ、モロコシ、コムギ、ワタ、ピーナッツ、トマト、ジャガイモ等が含まれるが、但しこれらに限定されない。外来遺伝物質を植物細胞内に導入するための、並びに導入された遺伝子を安定的に維持し及び発現する植物を得るためのいくつかの技術が存在する。かかる技術には、微粒子上にコーティングされた遺伝物質を細胞内に直接加速するステップが含まれる（米国特許第４９４５０５０号、及び同第５１４１１３１号）。植物は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属技術を用いて形質転換することができ、米国特許第５１７７０１０号、同第５１０４３１０号、欧州特許出願第０１３１６２４号Ｂ１、同第１２０５１６号、同第１５９４１８号Ｂ１、同第１７６１１２号、米国特許第５１４９６４５号、同第５４６９９７６号、同第５４６４７６３号、同第４９４０８３８号、同第４６９３９７６号、欧州特許出願第１１６７１８号、同第２９０７９９号、同第３２０５００号、同第６０４６６２号、同第６２７７５２号、同願第０２６７１５９号、同第０２９２４３５号、米国特許第５２３１０１９号、同第５４６３１７４号、同第４７６２７８５号、同第５００４８６３号、及び同第５１５９１３５号を参照されたい。その他の形質転換技術としてＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）技術が挙げられ、米国特許第５３０２５２３号及び同許第５４６４７６５号を参照されたい。エレクトロポレーション技術も、植物を形質転換するために用いられており、国際公開第８７／０６６１４号、米国特許第５４７２８６９号、同第５３８４２５３号、国際公開第９２０９６９６号、及び同第９３２１３３５号を参照されたい。全てのこれら形質転換特許及び出版物を参照により援用する。植物を形質転換させる非常に多くの技術に加えて、外来遺伝子と接触する組織のタイプもやはり変化し得る。かかる組織として胚形成組織、カルス組織タイプＩ及びＩＩ、胚軸、分裂組織等が挙げられ、但しこれらに限定されない。ほとんど全ての植物組織が、当業者の技量範囲内の適当な技術を用いて、脱分化期間中に形質転換可能である。
【００６７】
ＤＩＧ−５毒素をコードする遺伝子は、上記で開示したように、当技術分野において周知の様々な技術を用いて植物細胞に挿入可能である。例えば、形質転換された微生物細胞の選択を可能にするマーカー、及び大腸菌（Escherichia coli）内で機能する複製系を含む多数のクローニングベクターが、高等植物に挿入するための外来遺伝子を調製及び改変するのに利用可能である。かかる操作として、使用目的上の要望に応じて、例えば突然変異の挿入、トランケーション、付加、又は置換を挙げることができる。ベクターは、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣシリーズ、Ｍ１３ｍｐシリーズ、ｐＡＣＹＣ１８４等を含む。従って、Ｃｒｙタンパク質又は変異体をコードする配列は、適当な制限部位においてベクター内に挿入可能である。得られたプラスミドは大腸菌（E. coli）の形質転換に用いられ、当該大腸菌の細胞は適当な栄養培地内で培養され、次いで使用可能な量のプラスミドが回収されるように捕集、及び溶解される。配列分析、制限断片分析、電気泳動、及びその他の生化学−分子生物学的手法が、分析法として一般的に実施される。各操作後には、用いられるＤＮＡ配列は切断可能、及び次のＤＮＡ配列に結合可能である。操作済みの各ＤＮＡ配列は、同一又は別のプラスミド内にクローン化可能である。
【００６８】
植物細胞を形質転換するためのＴ−ＤＮＡ−含有ベクターの使用について、欧州特許出願第１２０５１６号；Lee及びGelvinの文献（2008年）、Fraleyらの文献（1986年）、及びAnらの文献（1985年）において集中的に研究され、及び十分に記載されており、また当該分野で十分に確立されている。
【００６９】
挿入されたＤＮＡが植物ゲノムに組み込まれる（integrated）と、後続世代を通じて比較的安定である。植物細胞を形質転換させるために用いられるベクターは、除草剤又は抗生物質、例えば、とりわけビアラホス、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、又はハイグロマイシンに対する抵抗性を形質転換植物細胞に付与するタンパク質をコードする選択マーカー遺伝子を通常含む。個々に採用された選択マーカー遺伝子は、しかるべく形質転換細胞の選択を可能にするはずであり、また一方、挿入ＤＮＡを含まない細胞の成長は選択化合物により抑制される。
【００７０】
多数の技術が宿主植物細胞内にＤＮＡを挿入するのに利用可能である。そのような技術として、形質転換剤として用いられるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）又はアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）により送達されるＴ−ＤＮＡを用いた形質転換が挙げられる。更に、植物のプロトプラストと送達対象ＤＮＡを含むリポソームとの融合、ＤＮＡの直接的な注入、バイオリスティック形質転換（微粒子銃法）、又はエレクトロポレーション、並びにその他の可能な方法が利用可能である。
【００７１】
本願発明の好ましい実施形態では、植物は、タンパク質コーディング領域のコドンの利用が植物用に最適化された遺伝子を用いて形質転換される。例えば、本明細書により参照により援用される米国特許第５３８０８３１号を参照されたい。また、トランケーションされた毒素をコードする植物も、好都合に利用される。トランケーションされた毒素は、一般的に完全長毒素の約５５％〜約８０％をコードする。植物で使用するための合成Ｂ．ｔ．遺伝子を作製する方法は、当技術分野において公知である（Stewartの文献、2007年）。
【００７２】
形質転換技術を問わず、遺伝子は、植物プロモーターをベクターに含めることにより、植物細胞内でＢ．ｔ．殺虫性毒素遺伝子及び変異体を発現するように改造された遺伝子導入ベクターに組み込まれるのが好ましい。植物プロモーターに加えて、様々な起源に由来するプロモーターが、植物細胞内で外来遺伝子を発現するのに効果的に利用可能である。例えば、オクトピン合成酵素プロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター、マンノピン合成酵素プロモーター等の細菌起源のプロモーター；カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ及び１９Ｓプロモーター等のウイルス起源のプロモーター等が利用可能である。植物プロモーターとして、リブロース−１，６−ビスリン酸（ＲＵＢＰ）カルボキシラーゼ小サブユニット（ｓｓｕ）、β−コングリシニンプロモーター、ファゼオリンプロモーター、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ヒートショックプロモーター、ＡＤＦ（アクチン解重合因子）プロモーター、及び組織特異的プロモーターが挙げられ、但し、これらに限定されない。プロモーターは、転写効率を改善し得るしかるべきエンハンサー配列要素も含むことができる。典型的なエンハンサーとして、ＡＤＨ１−イントロン１、及びＡＤＨ１−イントロン６が挙げられ、但し、これらに限定されない。構成的プロモーターが利用可能である。構成的プロモーターは、ほぼ全ての細胞型において、及びほぼ全ての時間において連続的な遺伝子発現を指令する（例えば、アクチン、ユビキチン、ＣａＭＶ ３５Ｓ）。組織特異的プロモーターは、特異的細胞、又は葉若しくは種子等の組織型における遺伝子発現に関与し（例えば、ゼイン、オレオシン、ナピン、ＡＣＰ（アシルキャリアタンパク質））、及びこれらのプロモーターも利用可能である。植物のある生育段階において活性であり、並びに特定の植物組織及び器官において活性なプロモーターも利用可能である。かかるプロモーターの例として、根特異的、花粉特異的、胚特異的、トウモロコシ絹糸特異的、ワタ繊維特異的、種子の胚乳特異的、師部特異的なプロモーター等が挙げられ、但しこれらに限定されない。
【００７３】
特定の状況下では、誘導性プロモーターを利用するのが望ましい場合がある。誘導性プロモーターは、特異的シグナル、例えば：物理的刺激（例えば、ヒートショック遺伝子）；光（例えば、ＲＵＢＰカルボキシラーゼ）；ホルモン（例えば、グルココルチコイド）；抗生物質（例えば、テトラサイクリン）；代謝産物；及びストレス（例えば、干ばつ）に反応して遺伝子の発現に関与する。植物内で機能するその他の望ましい転写及び翻訳要素、例えば５’非翻訳リーダー配列、ＲＮＡ転写終結配列、及びポリアデニレート付加シグナル配列が利用可能である。非常に多くの植物−特異的遺伝子導入ベクターが当技術分野で公知である。
【００７４】
昆虫抵抗（ＩＲ）特性を備える遺伝子組換え作物が、北米全体にわたりトウモロコシ及びワタ植物で一般化しており、及びこれらの特性の利用がグローバルに拡大している。ＩＲ及び除草剤耐性（ＨＴ）特性を組み合わせた市販の遺伝子組換え作物が複数の種苗会社によって開発された。上記作物は、Ｂ．ｔ．殺虫性タンパク質により付与されるＩＲ特性と、ＨＴ特性、例えばスルホニルウレア、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、スルフォンアニリド等のアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）阻害剤、ビアラホス、グルフォシネート等のグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）阻害剤、メソトリオン、イソキサフルトール等の４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）阻害剤、グリホサート等の５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）阻害剤、及びハロキシホップ、キザロホップ、ジクロホップ等のアセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）阻害剤に対する耐性との組み合わせを含む。その他の例が公知であり、そのような例では、遺伝子組換えにより得られるタンパク質が、いくつかの除草剤化学薬品クラス（herbicide chemical classes）、例えばフェノキシ酸系除草剤、及びピリジルオキシアセテートオーキシン系除草剤（国際公開第２００７／０５３４８２号Ａ２を参照）、又はフェノキシ酸系除草剤、及びアリルオキシフェノキシプロピオネート系除草剤（国際公開第２００５１０７４３７号Ａ２、Ａ３を参照）に対する耐性を植物に付与する。ＩＲ特性により複数の有害生物問題を制御する能力を持たせることは有益な市販製品概念であり、及び昆虫防除特性及び雑草防除特性が同一の植物内で組み合わされる場合には、かかる製品概念の利便性が強化される。更に、単一の植物においてＢ．ｔ．殺虫性タンパク質、例えば本願発明のタンパク質等により付与されるＩＲ特性と、１つ又は複数の追加のＨＴ特性、例えば上記特性等を組み合わることに加えて、１つ又は複数の追加のインプット特性（例えば、Ｂ．ｔ．誘導タンパク質又はその他の殺虫性タンパク質により付与されるその他の昆虫抵抗性、ＲＮＡｉ等の機構により付与される昆虫抵抗性、疾患抵抗性、ストレス耐性、改善した窒素利用能等）又はアウトプット特性（例えば、高油脂含有量、健康油脂組成物、栄養上の改善等）をプラスすることにより、価値が高められる可能性がある。かかる組み合わせは、従来方式の育種（育種スタック（bleeding stack））を通じて、又はこれを併用した複数遺伝子の同時導入に関係する新規形質転換事象（分子スタック（molecular stack））を通じて得ることができる。利益としては、作物における害虫管理能力及び改善した雑草防除が挙げられ、生産者及び／又は消費者には二次的な利益がもたらされる。従って、本願発明は、農学的な問題がいくらあろうとも、柔軟かつ費用効果的に制御する能力を有する改善した作物品質の完全農学パッケージ（complete agronomic package）を提供するように、その他の特性と併用して利用可能である。
【００７５】
標的有害生物
本発明のＤＩＧ−５毒素は、害虫防除で使用するのに特に適する。甲虫類（Coleopterans）は、毎年多大な損害を引き起こす農学上、植栽上、及び生活上の有害生物のうちの１つの重要な群である。この昆虫目には葉−摂食性及び根−摂食性の幼虫及び成虫が含まれ、下記のものが挙げられる：ヒゲナガゾウムシ（Anthribidae）科、マメゾウムシ（Bruchidae）科、及びゾウムシ（Curculionidae）科に由来するゾウムシ（weevil）［例えば、ワタミハナゾウムシ（Anthonomus grandis Boheman）、イネミズゾウムシ（Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel）、グラナリアコクゾウムシ（Sitophilus grananus Linnaeus）、コクゾウムシ（Sitophilus oryzae Linnaeus）、クローバリーフゾウムシ（Hypera punctata Fabricius）、及びメイズビルバグ（Sphenophorus maidis Chittenden）］；ハムシ（Chrysomelidae）科のノミトビヨロイムシ、ウリハムシ、ルートワーム、ハムシ、コロラドハムシ、及び潜葉性昆虫［例えば、コロラドハムシ（Leptinotarsa decemlineata Say）、ウエスタンコーンルートワーム（Diabrotica virgifera virgifera LeConte）、ノーザンコーンルートワーム（Diabrotica barben Smith & Lawrence）；サザンコーンルートワーム（Diabrotica undecimpunctata howardi Barber）、コーンノミトビヨロイムシ（Chaetocnema pulicara Melsheimer）、十字花科植物ノミトビヨロイムシ（crucifer flea beetle）（Phyllotreta cruciferae Goeze）、グレープコラスピス（Colaspis brunnea Fabricius）、シリアルリーフビートル（Oulema melanopus Linnaeus）、及びサンフラワービートル（Zygogramma exclamationis Fabricius）］；テントウムシ（Coccinellidae）科に由来する甲虫［例えば、インゲンテントウ（Epilachna varivestis Mulsant）］；コガネムシ科（Scarabaeidae）の甲虫（chafers）及びコガネムシ科に由来するその他の甲虫［例えば、マメコガネ（Popillia japonica Newman）、ノーザンマスクドコガネムシ（コガネムシ類幼虫（white grub）、Cyclocephala borealis Arrow）、サザンマスクドコガネムシ（コガネムシ類幼虫、Cyclocephala immaculata Olivier）、欧州のコガネムシ科の甲虫（Rhizotrogus majalis Razoumowsky）、コガネムシ類幼虫（Phyllophaga crinita Burmeister）、及びキャロットビートル（Ligyrus gibbosus De Geer）］；カツオブシムシ（Dermestidae）科に由来するカツオブシムシ（carpet beetles）；コメツキムシ科（Elateridae）に由来するハリガネムシ（wireworms）［例えば、メラノタス（Melanotus）種、コノデルス（Conoderus）種、リモニウス（Limonius）種、アグリオテス（Agriotes）種、クテニセラ（Ctenicera）種、アエオラス（Aeolus）種）];キクイムシ（Scolytidae）科に由来する樹皮下甲虫（bark beetles）、及びゴミムシダマシ（Tenebrionidae）科に由来する甲虫（例えば、エレオデス（Eleodes）種）。上記掲載の任意の属（及びその他）も、一般的に本願発明の一環として標的対象となり得る。上記属のいずれかに属する更なる昆虫も（標的として）、本発明の範囲内に含まれる。
【００７６】
鱗翅類は、毎年多大な損害を引き起こす農学上、植栽上、及び生活上の有害生物のうちの別の重要な群である。この昆虫目には葉−摂食性及び根−摂食性の幼虫及び成虫が含まれる。鱗翅類の害虫として下記のものが挙げられるが、但しこれらに限定されない：アコロイア・グリセラ（Achoroia grisella）、アクレリス・グロベラナ（Acleris gloverana）、アクレリス・バリアナ（Acleris variana）、コカクモンハマキ（Adoxophyes orana）、タマナヤガ（Agrotis ipsilon）（black cutworm）、アラバマ・アルギラセア（Alabama argillacea）、アルソフィラ・ポメタリア（Alsophila pometaria）、クルミマダラメイガ（Amyelois transitella）、スジコナマダラメイガ（Anagasta kuehniella）、モモキバガ（Anarsia lineatella）、アニソタ・セナトリア（Anisota senatoria）、サクサン（Antheraea pernyi）、大豆夜蛾（Anticarsia gemmatalis）、アルチプス（Archips）種、アルギロテニア（Argyrotaenia）種、アセティス・ミンダラ（Athetis mindara）、カイコガ（Bombyx mori）、ブッカラトリックス・スルベリエラ（Bucculatrix thurberiella）、スジマダラメイガ（Cadra cautella）、コリストネウラ（Choristoneur）種、コチルス・ホスペス（Cochylls hospes）、オオアメリカモンキチョウ（Colias eurytheme）、ガイマイツヅリガ（Corcyra cephalonica）、サイディア・ラティフェレアナス（Cydia latiferreanus）、コドリンガ（Cydia pomonella）、ダタナ・インテゲリマ（Datana integerrima）、デンドロリマス・シベリカス（Dendrolimus sibericus）、デスミア・フェネラリス（Desmia feneralis）、ディアファニア・ヒアリナタ（Diaphania hyalinata）、アメリカウリノメイガ（Diaphania nitidalis）、ナンセイアワノメイガ（Diatraea grandiosella）（southwestern corn borer））、サトウキビメイガ（Diatraea saccharalis）、ニレシャクトリムシ（Ennomos subsignaria）、エオレウマ・ロフティニ（Eoreuma loftini）、チャマダラメイガ（Esphestia elutella）、エラニス・ティラリア（Erannis tilaria）、キシタゴマダラヒトリ（Estigmene acrea）、ユーリア・サルブリコラ（Eulia salubricola）、ユーポコエリア・アンビグエラ（Eupocoellia ambiguella）、ブドウホソハマキ（Eupoecilia ambiguella）、モンシロドクガ（Euproctis chrysorrhoea）、ユーゾア・メソリア（Euxoa messoria）、ハチノスツヅリガ（Galleria mellonella）、ナシヒメシンクイ（Grapholita molesta）、アメリカブドウホソクロバ（Harrisina americana）、ヘリコベルパ・サブフレクサ（Helicoverpa subflexa）、アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）（corn earworm）、ニセアメリカタバコガ（Heliothis virescens）、ヘミロイカ・オリビアエ（Hemileuca oliviae）、ヒマワリヘッドモス（Homoeosoma electellum）、アメリカシロヒトリ（Hyphantia cunea）、ケイフェリア・リコペルシセラ（Keiferia lycopersicella）、ランブディナ・フィセラリア・フィセラリア（Lambdina fiscellaria fiscellaria）、エダシャクガ（Lambdina fiscellaria lugubrosa）、ヤナギドクガ（Leucoma salicis）、ホソバヒメハマキ（Lobesia botrana）、ロクサグロティス・アルビコスタ（Loxagrotis albicosta）（western bean cutworm）、ヘリキスジノメイガ（Loxostege sticticalis）、マイマイガ（Lymantria dispar）、マカラ・チリサリス（Macalla thyrisalis）、マラコソーマ（Malacosoma）種、ヨトウガ（Mamestra brassicae）、ベルタアワヨトウ（Mamestra configurata）、トマトスズメガ（Manduca quinquemaculata）、タバコスズメガ（Manduca sexta）、マメノメイガ（Maruca testulalis）、メランクラ・ピクタ（Melanchra picta）、ナミスジフユナミシャク（Operophtera brumata）、ドクガ（Orgyia）種、アワノメイガ（Ostrinia nubilalis）（European corn borer）、パレアクリタ・ベルナタ（Paleacrita vernata）、パピアペマ・ネブリス（Papiapema nebris）（common stalk borer）、クレスフォンテスタスキアゲハ（Papilio cresphontes）、ワタアカミムシ（Pectinophora gossypiella）、フリガニジア・カリフォルニカ（Phryganidia californica）、フィロノルクテル・ブランカルデラ（Phyllonorycter blancardella）、エゾスジグロシロチョウ（Pieris napi）、モンシロチョウ（Pieris rapae）、プラチペナ・スカブラ（Plathypena scabra）、プラチノタ・フロウエンダナ（Platynota flouendana）、プラチノタ・スタルタナ（Platynota stultana）、プラチプチリア・カルデュイダクチラ（Platyptilia carduidactyla）、ノシメマダラメイガ（Plodia interpunctella）、コナガ（Plutella xylostella）（diamondback moth）、ポンティア・プロトディス（Pontia protodice）、シューダレチア・ユニパンクタ（Pseudaletia unipuncta）（armyworm）、シュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplasia includens）、サブロデス・アエグロタタ（Sabulodes aegrotata）、シズラ・コンシナ（Schizura concinna）、バクガ（Sitotroga cerealella）、リンゴシロヒメハマキ（Spilonta ocellana）、ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）（fall armyworm）、シロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）（beet armyworm）、サウルンストポエア・ピチオカンパ（Thaurnstopoea pityocampa）、エンソラ・ビセリエラ（Ensola bisselliella）、イラクサギンウワバ（Trichoplusia hi）、ウデア・ルビガリス（Udea rubigalis）、キシロマイゲス・クリアイリス（Xylomyges curiails）、及びヨーロッパリンゴスガ（Yponomeuta padella）。
【００７７】
作物の甲虫目有害生物を防除するために、ＤＩＧ−５毒素を使用することが検討されている。いくつかの実施形態では、Ｃｒｙタンパク質が、例えば、ジュウイチホシウリハムシ（Diabrotica undecimpunctata howardi）（southern corn rootworm）、ジアブロティカ・ロンギコルニス・バルベリ（Diabrotica longicornis barberi）（northern corn rootworm）、及びディアブロティカ・ビルジフェラ（Diabrotica virgifera）（western corn rootworm）等のルートワーム、並びにシクロセファラ・ボレアリス（Cyclocephala borealis）（northern masked chafer）、シクロセファラ・イムマキュラータ（Cyclocephala immaculate）（southern masked chafer）、及びマメコガネ（Popillia japonica）（Japanese beetle）の幼虫等の地虫を含む、但しこれらに限定されない害虫を防除するために商業的に利用可能である。
【００７８】
ネコブセンチュウ（Meloidogyne icognita）及びダイズシストセンチュウ（Heterodera glycines）を含む、但しこれらに限定されない寄生線虫類を防除するために、ＤＩＧ−５毒素を使用することも検討されている。
【００７９】
ＤＩＧ−５毒素の抗体検出
抗毒素抗体。本明細書で開示される毒素に対する、又は同等の毒素に対する、又はこれらの毒素の断片に対する抗体は、当技術分野において標準的な手法を用いて容易に調製可能である。かかる抗体は、ＤＩＧ−５毒素の有無を検出するのに有用である。
【００８０】
Ｂ．ｔ．殺虫性毒素が単離されると、毒素に特異的な抗体が、当技術分野において周知の従来法により作り出すことができる。最適な宿主に数週間又は数ヶ月の期間反復して注射すると、免疫反応が誘発され、その結果相当の抗Ｂ．ｔ．毒素血清力価が得られる。好ましい宿主は哺乳類であり、及び更に大いに好ましい種はウサギ、ヤギ、ヒツジ、及びマウスである。かかる免疫動物から採取された血液は、Ｂ．ｔ．殺虫性毒素と反応する抗血清（ポリクロナール抗体）を得るために、確立された方法により処理され得る。次に抗血清は、当技術分野において公知の技術に基づき、毒素に吸着させることによりアフィニティー精製され得る。アフィニティー精製された抗血清は、当技術分野において公知の手法を用いて、抗血清中の免疫グロブリン分画を単離することにより更に精製され得る。得られた試料は、Ｂ．ｔ．殺虫性毒素と反応する免疫グロブリンからなる不均一性の集団である。
【００８１】
抗Ｂ．ｔ．毒素抗体は、免疫原性担体に結合したＢ．ｔ．殺虫性毒素の合成ペプチド断片から構成される半−合成免疫原を調製することによっても生成可能である。ペプチド断片の作製に有用な非常に多くのスキーム及び装置が、当技術分野において周知されている。多くの適する免疫原性担体、例えばウシ血清アルブミン又はスカシガイヘモシアニンも、免疫原とキャリアタンパク質とを連結させる技法と同様に、当技術分野において周知されている。半−合成免疫原が構築されれば、Ｂ．ｔ．殺虫性毒素断片に特異的な抗体を作製する手法は、天然のＢ．ｔ．毒素と反応する抗体を作製するのに用いられる手法と同じである。
【００８２】
抗Ｂ．ｔ．毒素モノクロナール抗体（ＭＡｂｓ）は、精製Ｂ．ｔ．殺虫性毒素を用いて容易に調製される。ＭＡｂｓを作製する方法は１５年にわたり実践されており、当業者に周知されている。アジュバント中の精製Ｂ．ｔ．殺虫性毒素を反復して腹腔内又は皮下注射すると、ほとんどの動物で免疫反応が誘発される。過免疫性Ｂリンパ球が動物から取り出され、及び無期限に培養される能力を有する適当な融合パートナー細胞株と融合される。Ｂリンパ球は過免疫状態となり得、及びＭＡｂｓの産生に利用可能な好ましい動物は哺乳動物である。より好ましい動物はラット及びマウスであり、最も好ましくはＢＡＬＢ／ｃマウス系統である。
【００８３】
非常に多くの哺乳動物細胞系統が、ハイブリドーマを産生するための適する融合パートナーとなる。多くのかかる系統が、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）、及び市販供給業者から入手可能である。好ましい融合パートナー細胞系統はマウスミエローマに由来し、及びＨＬ−１（登録商標）フレンドリーミエローマ−６５３細胞系統（Ｖｅｎｔｒｅｘ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＭＥ）が最も好ましい。融合したら、得られたハイブリドーマは、１〜２週間選択的増殖培地で培養される。２つの周知された選択システムが、混合ハイブリドーマ培養物から非融合ミエローマ細胞又はミエローマ細胞間融合体を除去するのに利用可能である。選択システムを選択する場合、それは免疫対象マウス系統、及び用いられるミエローマ融合パートナーに依存する。Taggart及びSamloffの文献（1983年）が記載するＡＡＴ選択システムが利用可能である。但し、上記の好ましいマウス系統及び融合パートナーと適合性を有することから、Littlefieldの文献（1964年）が記載するＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択システムが好ましい。次に、処理済み成長培地が、免疫特異的ＭＡｂ分泌についてふるい分けされる。酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）法がこの目的に最適であるが、大容量スクリーニング用に改変されたラジオイムノアッセイ法も許容される。相当数の無関係の又はあまり望ましくない培養物を連続的に漸減するように設計された複数回のふるい分けを実施することができる。Ｂ．ｔ．殺虫性毒素と反応するＭＡｂｓを分泌する培養物について、既知のＢ．ｔ．殺虫性毒素との交差反応性に関してふるい分けすることができる。好ましいＢ．ｔ．殺虫性毒素と選択的に結合するＭＡｂｓは、商業的に入手可能な分析法を用いてアイソタイプ化され得る。好ましいＭＡｂｓはＩｇＧクラスに属するものであり、更に大いに好ましいＭＡｂｓはＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａサブアイソタイプに属するものである。
【００８４】
好ましいＭＡｂｓを分泌するハイブリドーマ培養物は、単クローン性及び安定性を確立するために数回サブ−クローン化され得る。真核性、非付着性細胞培養物をサブ−クローニングするための周知の方法として、限界希釈法、ソフトアガロース法、及び蛍光活性化細胞選別法が挙げられる。各サブクローニングの後に、得られた培養物は、安定で好ましいＭＡｂ分泌培養物が確立されたことを保証するために、好ましくは抗体分泌及びアイソタイプについて再分析される。
【００８５】
抗Ｂ．ｔ．毒素抗体は、本発明において請求の対象とされるＢ．ｔ．殺虫性毒素及びその変異体又は断片を検出する様々な方法で有用である。レポート基（reporting group）で標識された抗体が、様々な環境で抗原の有無を識別するのに利用可能であることは周知されている。放射性同位体で標識された抗体が、ラジオイムノアッセイ法において何十年も、様々な生物体液中の抗原の有無を極めて高精度、高感度で識別するのに用いられてきた。より最近では、酵素標識抗体が、放射性標識抗体に対する代用品としてＥＬＩＳＡ分析法で用いられるようになった。更に、本発明のＢ．ｔ．殺虫性毒素と免疫反応する抗体は、ポリスチレンウェル又は粒子等の固定化物質に結合することができ、及び試験サンプル中にＢ．ｔ．毒素が存在するかどうか調べるために免疫測定法で利用可能である。
【００８６】
プローブを用いた検出
本願発明の毒素及び遺伝子を同定する更なる方法は、オリゴヌクレオチドプローブの使用による。そのようなプローブは検出可能なヌクレオチド配列である。それらの配列は、適当な放射性標識により検出可能となり、又は米国特許第６２６８１３２号に記載するように本質的に蛍光性とすることができる。当技術分野において周知のように、プローブ分子及び核酸サンプルが２つの分子間で強い塩基対結合を形成することによりハイブリダイズする場合には、当該プローブ及びサンプルは本質的配列相同性を有すると合理的に仮定することができる。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、例えばKeller及びManakの文献（1993年）に記載するように、当技術分野において周知の技術によりストリンジェントな条件（stringent conditions）下で実施される。プローブ検出により、ハイブリダイゼーションが生じたかどうか公知の方式で判定する手段が提供される。かかるプローブ分析により、本願発明の毒素をコードする遺伝子を同定する迅速な方法が提供される。本発明に基づきプローブとして用いられるヌクレオチドセグメントは、ＤＮＡシンセサイザー及び標準的な手法を用いて合成可能である。これらのヌクレオチド配列は、本願発明の遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマーとしても利用可能である。
【００８７】
ハイブリダイゼーション
分子生物学の当業者にとって周知であるように、２つの核酸の類似性は、それらのハイブリダイズする傾向により特徴付けることができる。本明細書で用いる場合、用語「ストリンジェントな条件」又は「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブが、その他の配列よりも検出可能なほどに高いレベル（例えば、少なくともバックグラウンドに対して２倍）でその標的配列にハイブリダイズする（アニールする）ような条件を意味するように意図されている。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、また状況が異なれば異なる。ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件の厳密性（stringency）を制御することにより、プローブに対して１００％相補的な標的配列が識別可能である（相同プロービング）。或いは、ストリンジェントな条件は、類似性がより低くても検出されるように（非相同プロービング）、配列中にある程度のミスマッチがあってもそれを許容するように調節可能である。一般的に、プローブは、長さ約１０００ヌクレオチド未満、好ましくは長さ５００ヌクレオチド未満である。
【００８８】
一般的に、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．３で、塩濃度が約１．５Ｍ未満のＮａイオン、一般的に約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（又はその他の塩）、及び温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）の場合少なくとも約３０℃、また長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドを上回る）の場合少なくとも約６０℃の条件である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミド等の不安定化剤を添加することによっても実現可能である。厳密性の低い典型的な条件には、３７℃において３０％〜３５％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）からなるバッファー溶液を用いて行われるハイブリダイゼーション、及び５０℃〜５５℃において１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０ＭのＮａＣｌ／０．３Ｍのクエン酸三ナトリウム）中で行われる洗浄が含まれる。厳密性が中程度の典型的な条件には、３７℃において４０％〜４５％のホルムアミド、１．０ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ中で行われるハイブリダイゼーション、及び５５℃〜６０℃において０．５×〜１×ＳＳＣ中で行われる洗浄が含まれる。厳密性が高い典型的な条件には、３７℃において５０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ中で行われるハイブリダイゼーション、及び６０℃〜６５℃において０．１×ＳＳＣ中で行われる洗浄が含まれる。任意選択的に、洗浄バッファーは約０．１％〜約１％のＳＤＳを含み得る。ハイブリダイゼーション期間は、一般的に約２４時間未満、通常約４〜約１２時間である。
【００８９】
特異性は、一般的にハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、重要な要因として最終洗浄溶液のイオン強度及び温度が挙げられる。ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの場合、熱融点（Ｔｍ）とは、相補的標的配列の５０％が完全にマッチしたプローブとハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度及びｐＨにおける）である。Ｔｍはミスマッチ１％毎に約１℃低下する。従って、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション条件、及び／又は洗浄条件は、所望の同一性を有する配列のアニーリングを促進するように調節可能である。例えば、＞９０％の同一性を有する配列を得ようとする場合、Ｔｍは１０℃低下し得る。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度及びｐＨにおいて、特定の配列及びその相補体に関するＴｍよりも約５℃低くなるように選択される。しかし、厳密性が高い条件では、Ｔｍよりも１℃、２℃、３℃、又は４℃低い温度で行われるハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができる。厳密性が中程度の条件では、Ｔｍよりも６℃、７℃、８℃、９℃、又は１０℃低い温度で行われるハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができ、及び厳密性が低い条件では、Ｔｍよりも１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、又は２０℃低い温度で行われるハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができる。
【００９０】
Ｔｍ（℃単位）は、実験的に求めることができ、又は計算により近似することができる。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの場合、ＴｍはMeinkoth及びWahl（1984年）の式から近似することができる。
Ｔｍ（℃）＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ
式中、Ｍは一価のカチオンのモル濃度、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシン及びシトシンヌクレオチドの割合（％）、％ホルムアミドはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合（％）、及びＬは塩基対中のハイブリッドの長さである。
【００９１】
或いは、Ｔｍは下記の式により記載される（Beltzらの文献、1983年）。
Ｔｍ（℃）＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ホルムアミド）−６００／Ｌ
式中、［Ｎａ＋］はナトリウムイオンのモル濃度、％ＧＣは、ＤＮＡ中のグアノシン及びシトシンヌクレオチドの割合（％）、％ホルムアミドはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合（％）、及びＬは塩基対中のハイブリッドの長さである。
【００９２】
上記公式、ハイブリダイゼーション及び洗浄組成物、並びに所望のＴｍを用いることにより、当業者は、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄溶液の厳密性に生じるそれぞれの変化は自ずと説明されることを理解するであろう。所望のレベルのミスマッチにおいて、Ｔｍが４５℃（水溶液）又は３２℃（ホルムアミド溶液）未満となる場合には、より高い温度が利用可能なようにＳＳＣ濃度を高めるのが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な指針がTijssenの文献（1993年）及びAusubelらの文献（1995年）に記載されている。Sambrookらの文献（1989年）も参照されたい。
【００９３】
放射性標識された遺伝子特異的プローブを用いたサザンブロット上での固定化ＤＮＡのハイブリダイゼーションは、標準的な方法により実施可能である（Sambrookらの上記文献）。ポリヌクレオチドプローブを標識するのに用いられる放射性同位体として、３２Ｐ、３３Ｐ、１４Ｃ、又は３Ｈを挙げることができる。放射性同位体のポリヌクレオチドプローブ分子への組み込みは、分子生物学分野の当業者にとって周知の任意のいくつかの方法により実施可能である。（例えば、Sambrookらの上記文献を参照されたい）。一般的に、ハイブリダイゼーション及び後続する洗浄は、請求の対象とされる毒素をコードする遺伝子と相同性を有する標的配列の検出を可能にするストリンジェントな条件下で実施される。二本鎖ＤＮＡ遺伝子プローブの場合、ハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＰＥ、５×デンハート液、０．１％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬの変性ＤＮＡ中で、ＤＮＡハイブリッドのＴｍよりも２０〜２５℃低い温度において、オーバーナイトで実施される［２０×ＳＳＰＥは３ＭのＮａＣｌ、０．２ＭのＮａＨＰＯ４、及び０．０２ＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩）；１００×デンハート液は２０ｇｍ／Ｌのポリビニルピロリドン、２０ｇｍ／Ｌのフィコールタイプ４００及び２０ｇｍ／Ｌのウシ血清アルブミン（フラクションＶ）である］。
【００９４】
洗浄は、一般的に下記のように実施され得る。
１×ＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳ中で、室温において１５分間、２回（厳密性が低い洗浄）。
０．２×ＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳ中で、Ｔｍ−２０℃において１５分間、１回（厳密性が中程度の洗浄）。
【００９５】
オリゴヌクレオチドプローブの場合、ハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＰＥ、５×デンハート液、０．１％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬの変性ＤＮＡ中で、ハイブリッドのＴｍよりも１０〜２０℃低い温度において、オーバーナイトで実施される。オリゴヌクレオチドプローブに関するＴｍは、下記の式により求めることができる（Suggsらの文献、1981年）。
Ｔｍ（℃）＝２（Ｔ／Ａ塩基対の数）＋４（Ｇ／Ｃ塩基対の数）
【００９６】
洗浄は、一般的に下記のように実施され得る。
１×ＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳ中で、室温において１５分間、２回（厳密性が低い洗浄）。
１×ＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳ中で、ハイブリダイゼーション温度において１５分間、１回（厳密性が中程度の洗浄）。
【００９７】
ハイブリダイゼーション用のプローブ分子、及びプローブ及び標的分子間で形成されるハイブリッド分子は、放射性標識以外の手段により検出可能にすることができる。かかる代替法は、本発明の範囲内であるように意図される。
【００９８】
本明細書に記載する実施例及び実施形態は説明目的に限られること、並びにそれらに照らして様々な変形形態又は変更形態が当業者にとって示唆され、及び本出願の精神と意図、及び添付の特許請求の範囲内に含まれることと理解されるはずである。
【実施例１】
【００９９】
ＤＩＧ−５毒素をコードする遺伝子の単離
本明細書でＤＩＧ−５と呼ぶ殺虫性のＣｒｙタンパク質をコードする核酸は、Ｂ．ｔ．系統ＰＳ１９８Ｑ７から単離された。テンプレートとしてＰＳ１９８Ｑ７ゲノムＤＮＡを用いるＰＣＲ反応で、フォワード及びリバースプライマーとして用いられるデジェネレートプライマーは、Ｂ．ｔ．殺虫性毒素の各クラスの多重配列アラインメント（multiple sequence alignments）に基づき設計された。フォワードプライマーは配列番号１の塩基７６６〜７９０に対応し、及びリバースプライマーは配列番号１の塩基２２００〜２２２３の相補体に対応する。この一対のプライマーは、配列番号１のヌクレオチド７６６〜２２２３に対応する１４５８ｂｐからなる断片を増幅するのに用いられた。この配列は、ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）から改変された方法を用いてゲノム歩行法（genome walking）を開始するためにアンカーポイントとして用いられた。ＤＩＧ−５コーディング領域にまたがる断片の核酸配列が決定された。配列番号１は完全長ＤＩＧ−５タンパク質をコードする３４４７ｂｐヌクレオチド配列である。配列番号２は、配列番号１から推定された完全長ＤＩＧ−５タンパク質のアミノ酸配列である。
【実施例２】
【０１００】
ＤＩＧ−５に由来するドメインＩαへリックスの欠損
ＤＩＧ−５毒素の殺虫性特性を改善するために、連続的、段階的に欠損が作り出され、各欠損はＤＩＧ−５タンパク質のＮ末端部分を取り除く。当該欠損は、ドメインＩ内のαへリックス１の一部又は全て、及びαへリックス２の一部又は全てを取り除くが、一方、αへリックス３〜αへリックス７の構造的な完全性は維持される。
【０１０１】
欠損は下記のように設計される。この実施例では、７１個の特定の変異体を含む設計原理を説明するために、完全長ＤＩＧ−５タンパク質をコードする完全長キメラＤＮＡ配列（例えば、それぞれ配列番号２及び配列番号１）を利用する。また同実施例では、更なる７１個の特定の変異体を提供するために、配列番号５のキメラ配列（Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントと融合したＤＩＧ−５コア毒素をコードするＤＮＡ）を利用する。当業者は、ＤＩＧ−５タンパク質の全て又はＮ末端部分をコードするその他のＤＮＡ配列が所望の結果を実現するために同様に操作可能であることを認識するであろう。第１の欠損変異体コーディング配列を考案するために、αへリックス２Ａの開始部近傍のヒスチジン残基（すなわち、配列番号２の完全長ＤＩＧ−５タンパク質のＨ７１）に関するコドンを含むαへリックス１をコードする全ての塩基が除去される。従って、配列番号１の塩基１〜２１３を除去すれば、配列番号２のアミノ酸１〜７１に対応するコーディング配列が除去される。開始部（すなわち、完全長タンパク質のアミノ酸７２に関連するコドンの前）に翻訳開始ＡＴＧ（メチオニン）コドンを再導入すると、１０７９個のアミノ酸（すなわち、メチオニン＋完全長ＤＩＧ−５タンパク質のアミノ酸７２〜１１４９）を含む欠損変異体ＤＩＧ−５タンパク質をコードする３２３７塩基からなるオープンリーディングフレームを含む欠損変異体コーディング配列が得られる。配列番号２の完全長ＤＩＧ−５タンパク質の残基７２〜１１３に対応する単一のアミノ酸に関するコドンを更に除去するように連続的、段階的に欠損を生み出すと、αへリックス２Ａ及びαへリックス２Ｂの一部又は全てが欠損している変異体が得られる。従って、２番目に設計された欠損変異体コーディング配列は、配列番号１の塩基１〜２１６の除去を必要とし、これによりアミノ酸１〜７２に対応するコーディング配列が除去される。機能的オープンリーディングフレームの復元は、残りのコーディング配列の開始部分に翻訳開始メチオニンコドンを再導入することにより再び達成され、従って、１０７８個のアミノ酸を含む欠損変異体ＤＩＧ−５タンパク質をコードする３２３４塩基からなるオープンリーディングフレーム（すなわち、メチオニン＋完全長ＤＩＧ−５タンパク質のアミノ酸７３〜１１４９）を有する第２の欠損変異体コーディング配列が得られる。最後に設計された欠損変異体コーディング配列は、配列番号１の塩基１〜３３９の除去を必要とし、従ってアミノ酸１〜１１３に対応するコーディング配列を除去し、及び翻訳開始メチオニンコドンを再導入した後には、１０３７個のアミノ酸からなる欠損変異体ＤＩＧ−５タンパク質をコードする３１１１塩基からなるオープンリーディングフレーム（すなわち、メチオニン＋完全長ＤＩＧ−５タンパク質のアミノ酸１１４〜１１４９）を有する欠損変異体コーディング配列が得られる。例示するように、欠損配列を除去した後、機能的オープンリーディングフレームを復元するために、開始メチオニンコドンが残りのコーディング配列の開始部に付加される。また、やはり記載するように、欠損配列を除去すると、完全長タンパク質の残留部分のＮ末端で、上記した不安定性決定アミノ酸（instability-determining amino acid）のうちの１つが露出したままになる場合には、追加のグリシンコドンがメチオニンコドンと前記不安定性−決定アミノ酸に対応するコドンとの間に付加される。
【０１０２】
表３は上記方針に基づき設計された特定の変異体を記載する。
【０１０３】
【表３】
【０１０４】
表３に記載する毒素をコードする核酸は、上記で議論されたように植物での発現が意図された合成遺伝子に関する一般原理に基づき設計される。
【実施例３】
【０１０５】
ＤＩＧ−５Ｂ．ｔ．殺虫性タンパク質に関するコーディング配列の植物最適化バージョンの設計
植物コドンバイアスを有するＤＮＡ配列が、遺伝子組換え単子葉植物及び双子葉植物でＤＩＧ−５タンパク質を産生するために設計され、及び合成された。トウモロコシ（Zea mays L.）に関するコドン使用頻度表（codon usage table）が、ＧｅｎＢａｎｋに蓄積された配列から得られた７０６個のタンパク質コーディング配列（ＣＤ）から計算された。タバコ（Nicotiana tabacum, 1268 CDs）、キャノーラ（Brassica napus, 530 CDs）、ワタ（Gossypium hirsutum, 197 CDs）、及びダイズ（Glycine max； ca. 1000 CDs）に関するコドン使用頻度表は、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／のデータからダウンロードされた。トウモロコシ及び双子葉植物の両データセットに共通した高度利用コドンを適切な加重平均相対量で含む、バイアスを有するコドンセットが、いずれの植物タイプにおいても、対応するアミノ酸について総コドン使用量の約１０％未満しか用いられていない冗長コドンの全てを除去した後に計算された。ＤＩＧ−５タンパク質をコードする植物最適化配列を導出するために、得られたＤＮＡ配列が植物に最適化されたコドンバイアス表（codon bias table）の全体的なコドン組成を有するように、実験的に求められたＤＩＧ−５ＤＮＡ配列に対してコドン置換が実施された。更に配列の洗練化を実施して、望ましくない制限酵素認識部位、潜在的な植物イントロンスプライス部位、Ａ／Ｔ又はＣ／Ｇ残基のロングラン、及びＲＮＡの安定性、植物細胞内のコーディング領域の転写、又は翻訳を阻害し得るその他のモチーフを取り除いた。その他の変更も実施して、望ましい制限酵素認識部位を導入し、及び長い内部オープンリーディングフレーム（＋１以外のフレーム）を取り除いた。これらの変更は、全て植物バイアスコドン組成を維持する制限範囲内で実施された。設計された配列の合成は、商業的ベンダーにより実施された（ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）。
【０１０６】
合成遺伝子の作成に関する更なるガイダンスは、例えば、国際公開第９７／１３４０２号及び米国特許第５３８０８３１号に見出すことができる。
【０１０７】
ＤＩＧ−５コア毒素をコードするトウモロコシ最適化ＤＮＡ配列は、配列番号３に記載されている。Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントをコードする双子葉植物最適化ＤＮＡ配列は、配列番号６として開示されている。Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントをコードするトウモロコシ最適化ＤＮＡ配列は、配列番号７として開示されている。
【実施例４】
【０１０８】
ＤＩＧ−５殺虫性毒素をコードする発現プラスミドの構築及び細菌宿主における発現
植物最適化コーディング領域によりコードされる完全長ＤＩＧ−５タンパク質を作製するために、工学的に生み出されるシュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）（Ｐｆ）発現プラスミドを構築する際には、標準的なクローニング法が用いられる。制限エンドヌクレアーゼはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から入手し、及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が、ＤＮＡライゲーション用として用いられる。プラスミドの調製は、ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）Ｘｔｒａ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ Ｉｎｃ、Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ、ＰＡ）、又はＰｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、供給業者の説明書に従い実施される。ＤＮＡ断片は、トリス−酢酸塩アガロースゲル電気泳動後に、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ（登録商標）ＤＡカートリッジ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて精製される。
【０１０９】
基本的なクローニング法は、ＤＩＧ−５毒素コーディング配列（ＣＤＳ）をｐＤＯＷ１１６９に、例えばＳｐｅＩ及びＸｈｏＩ制限部位でサブクローニングするステップを必要とし、これにより、同配列はプラスミドｐＫＫ２２３−３（ＰＬ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）に由来するＰｔａｃプロモーター、及びｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーターの発現制御下に置かれる。ｐＤＯＷ１１６９は、ＲＳＦ１０１０複製起点、ｐｙｒＦ遺伝子、及び制限酵素認識部位に先行するリボソーム結合部位を備えたミディアムコピープラスミド（medium copy plasmid）であり、同プラスミド中にタンパク質コーディング領域を含むＤＮＡ断片が導入され得る（米国特許出願第２００８０１９３９７４号）。発現プラスミドは、ＤＣ４５４（突然変異ΔｐｙｒＦ及びｌｓｃ：：ｌａｃＩＱＩを有する野生型Ｐ．フルオレッセンス（fluorescens）系統に近い）、又はその誘導体内にエレクトロポレーションすることにより形質転換され、ＳＯＣ−Ｓｏｙ加水分解産物培地内に回収され、及び選択培地（ウラシルを欠いたＭ９グルコース寒天培地、Sambrookらの上記文献）上に播種される。微生物学的操作の詳細は、Squiresらの文献（2004年）、米国特許出願第２００６０００８８７７号、米国特許出願第２００８０１９３９７４号、及び米国特許出願第２００８００５８２６２号に記載されており、本明細書において参照により援用する。コロニーは最初にＰＣＲによりふるい分けされ、次いで陽性クローンがミニプレッププラスミドＤＮＡの制限酵素消化により分析される。挿入物を含む選択されたクローンのプラスミドＤＮＡは、供給業者（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が推奨するようにＢｉｇ Ｄｙｅ（登録商標）ターミネーター、バージョン３．１を用いて、又はＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）等の商業的配列決定ベンダーと契約することにより配列決定される。配列データは、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いて組み立てられ、及び分析される。
【０１１０】
振とうフラスコ内での増殖及び発現分析。特徴付け及び昆虫バイオアッセイを行うためのＤＩＧ−５毒素は、振とうフラスコにより増殖した発現構築物を内蔵するＰ．フルオレッセンス（fluorescens）系統（例えば、クローンＤＰ２８２６）により産生される。１％グルコース及び微量元素が補給されたＭ９培地内で増殖した種培養物が、５％のグリセロールを含む限定最少培地（Ｔｅｋｎｏｖａ Ｃａｔ．＃３Ｄ７４２６、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）、５０ｍＬに播種するのに用いられる。Ｐｔａｃプロモーターを介するＤＩＧ−５毒素遺伝子の発現は、振とうしながら３０℃で２４時間、初期のインキュベーションを行った後に、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより誘発される。培養物は誘発時及び誘発後の様々な時間においてサンプル採取される。細胞密度は６００ｎｍ（ＯＤ６００）での光学的密度により測定される。シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）の増殖に適する、例えばHuangらの文献（2007年）及び米国特許出願第２００６０００８８７７号で記載されるようなその他の培地も利用可能である。
【０１１１】
振とうフラスコサンプルの細胞分画及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。各サンプル採取時において、サンプルの細胞密度はＯＤ６００＝２０に調節され、及び１ｍＬの分量が１４０００×ｇで５分間遠心分離される。細胞ペレットは−８０℃で凍結される。凍結された振とうフラスコ細胞ペレットサンプルに由来する可溶性及び不溶性の分画が、ＥａｓｙＬｙｓｅ（商標）Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて生成される。各細胞ペレットは、ＥａｓｙＬｙｓｅ（商標）溶液、１ｍＬ中に再懸濁され、及び溶解バッファー中で１：４に更に希釈され、及び振とうしながら室温で３０分間インキュベーションされる。ライセートは、４℃、１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離され、及び上澄部は可溶性分画として回収される。次に、ペレット（不溶性分画）は、同容積のリン酸緩衝化された生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）中に再懸濁される。
【０１１２】
サンプルは、β−メルカプトエタノールを含む２×Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファーを用いて１：１に混合され（Sambrookらの上記文献）、及び５分間煮沸した後、推奨ＸＴ ＭＯＰＳバッファー中でＣｒｉｔｅｒｉｏｎ ＸＴ ビス−トリス１２％ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）電気泳動に負荷される。ゲルは、製造業者（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のプロトコールに基づき、バイオセーフクマシー染色剤（Bio-Safe Coomassie Stain）を用いて染色され、及びＡｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ Ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）を用いて画像化される。
【０１１３】
封入体調製物。Ｃｒｙタンパク質封入体（ＩＢ）の調製は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＭＡＬＤＩ−ＭＳ（Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法）による実証に基づき、不溶性Ｂ．ｔ．殺虫性タンパク質を産生したＰ．フルオレッセンス（fluorescens）発酵から得られた細胞について実施される。Ｐ．フルオレッセンス（fluorescens）発酵ペレットは３７℃の水浴中で解凍される。細胞は溶解バッファー（５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、２００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム塩（エチレンジアミン四酢酸）、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、及び５ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ））内で２５％ｗ／ｖに再懸濁される。５ｍＬ／Ｌの細菌プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐ８４６５ Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）が使用直前に添加される。細胞は最低レベルに設定されたハンドヘルドホモジナイザー（Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅａｒｏｒ、ＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ、ＯＫ）を用いて懸濁される。リゾチーム（２５ｍｇのＳｉｇｍａ Ｌ７６５１、鶏卵卵白由来）が、金属製のスパチュラで混合しながら細胞懸濁液に添加され、及び当該懸濁液は室温で１時間インキュベーションされる。当該懸濁液は氷上で１５分間冷却され、次にＢｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ２５０を用いて超音波処理される（５０％のデューティサイクル、３０％のアウトプットで１分間セッションを２回）。細胞溶解物は顕微鏡検査によりチェックされる。必要な場合には、２５ｍｇのリゾチームが更に添加され、及びインキュベーション及び超音処理が繰り返される。細胞溶解が顕微鏡検査により確認されたら、当該ライセートは、ＩＢペレットが形成されるように１１，５００×ｇで２５分間（４℃）遠心分離され、及び上澄部は廃棄される。ＩＢペレットは１００ｍＬの溶解バッファーで再懸濁され、上記のようにハンドヘルドミキサーを用いてホモジナイズされ、及び遠心分離される。ＩＢペレットは、上澄部が無色となり、及びＩＢペレットが堅く引き締まり、そしてオフ・ホワイト色になるまで、再懸濁（５０ｍＬの溶解バッファー中で）、ホモジナイゼーション、超音波処理、及び遠心分離することにより繰り返し洗浄される。最終洗浄の場合、ＩＢペレットは２ｍＭのＥＤＴＡを含む滅菌濾過された（０．２２μｍ）蒸留水中に再懸濁され、及び遠心分離される。最終ペレットは２ｍＭのＥＤＴＡを含む滅菌濾過された蒸留水中に再懸濁され、及び１ｍＬの分量で−８０℃で貯蔵される。
【０１１４】
ＩＢ調製物内のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及び定量は、１ｍＬの分量のＩＢペレットを解凍し、及び滅菌濾過蒸留水で１：２０に希釈することにより実施される。希釈サンプルは、次に４×還元サンプルバッファー［２５０ｍＭのトリス、ｐＨ６．８、４０％のグリセロール（ｖ／ｖ）、０．４％のブロモフェノールブルー（ｗ／ｖ）、８％のＳＤＳ（ｗ／ｖ）、及び８％のβ−メルカプト−エタノール（ｖ／ｖ）］で煮沸され、及び１×トリス／グリシン／ＳＤＳバッファー（ＢｉｏＲａｄ）を用いたＮｏｖｅｘ（登録商標）４〜２０％のトリス−グリシン、１２＋２ウェルゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）泳導（run）に負荷される。ゲルは、約６０分間、２００ボルトで泳導され、次にクマシーブルー（４５％のメタノール、１０％の酢酸に溶解した５０％のＧ−２５０／５０％のＲ−２５０）で染色され、及び蒸留水に溶解した７％の酢酸、５％のメタノールで脱染色される。標的バンドの定量は、標準曲線を作成するために同一ゲル上で泳導されたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）サンプルに対して、各バンドのデンシトメトリー値を比較することにより行われる。
【０１１５】
封入体の可溶化。ＰｆクローンＤＰ２８２６（３２ｍｇ／ｍＬのＤＩＧ−５タンパク質を含む）から得られた６ｍＬの封入体懸濁液が、封入体をペレット化させるように最高レベルに設定されたＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ｍｅｄｅｌ ５４１５Ｃ小型微量遠心機（約１４，０００×ｇ）上で遠心分離される。５０ｍＬコニカルチューブ内の貯蔵用バッファー上澄部は除去され、及び２５ｍＬの１００ｍＭの炭酸ナトリウムバッファー、ｐＨ１１で置換される。封入体はピペットを用いて再懸濁され、及び完全に混和するようにボルテックス処理される。当該チューブは、標的タンパク質を抽出するために、静かに揺動するプラットフォーム上に４℃、オーバーナイトで配置される。当該抽出物は、３０，０００×ｇで３０分間、４℃において遠心分離され、及び得られた上澄部は、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５再生セルロース遠心濾過器（３０，０００分子量カットオフ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、５倍に濃縮される。次に、サンプルバッファーは、使い捨てのＰＤ−１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて、１０ｍＭのＣＡＰＳ［３−（シクロヘキサミノ）１−プロパンスルホン酸］、ｐＨ１０に交換される。
【０１１６】
ゲル電気泳動。濃縮抽出物は、還元剤として５ｍＭのジチオスレイトールを含むＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳサンプルバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で１：５０に希釈することにより、電気泳動用に調製され、及び９５℃で４分間加熱される。サンプルは、４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲルのレーンに重複して、０．２〜２μｇ／レーンの範囲の５つのＢＳＡ標準品（標準曲線作成用）と並行して負荷される。ＭＯＰＳ ＳＤＳ泳動バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、追跡用色素がゲルの最下端に到達するまで、２００Ｖで電圧が印加される。ゲルは４５％のメタノール、１０％の酢酸に溶解した０．２％のクマシーブルーＧ−２５０を用いて染色され、及び最初に４５％のメタノール、１０％の酢酸を用いて短時間、次にバックグラウンドが透明になるまで７％の酢酸、５％のメタノールを用いて長時間脱染色される。脱染色後に、ゲルはＢｉｏｒａｄ Ｆｌｕｏｒ−Ｓ ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒを用いてスキャンされる。当該装置のＱｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ ｖ．４．５．２ソフトウェアが、染色されたタンパク質バンドのバックグラウンドが差し引かれた容量を得るために、及びストック溶液中のＤＩＧ−５タンパク質濃度を算出するのに用いられるＢＳＡ標準曲線を作成するために用いられる。
【実施例５】
【０１１７】
シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）内で産生された改変ＤＩＧ−５タンパク質の殺虫活性
ＤＩＧ−５Ｂ．ｔ．殺虫性毒素は、甲虫類（Colepteran）昆虫の幼虫を対象とした活性について試験され、同昆虫には、例えば、ウエスタンコーンルートワーム（ＷＣＲ、Diabrotica virgifera virgifera LeConte）、及びサザンコーンルートワーム（ＳＣＲ、Diabrotica undecimpunctata howardi）が含まれる。ＤＩＧ−５Ｂ．ｔ．殺虫性毒素は鱗翅目（Lepidopteran）昆虫の幼虫を対象とした活性について更に試験され、同昆虫には、例えば、夜蛾科のガの幼虫（ＣＥＷ；Helicoverpa zea（Boddie））、欧州のマツマダラメイガ（ＥＣＢ；Ostrinia nubilalis （Hubner））、ｃｒｙ１Ｆ抵抗性のＥＣＢ（ｒＥＣＢ）、ツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ，Spodoptera frugiperda）、Ｃｒｙ１Ｆ抵抗性のＦＡＷ（ｒＦＡＷ）、コナガ（ＤＢＭ；Plutella xylostella （Linnaeus））、ｃｒｙ１Ａ抵抗性のＤＢＭ（ｒＤＢＭ）、ニセアメリカタバコガ（ＴＢＷ；Heliothis virescens（Fabricius））、タマナヤガ（ＢＣＷ；Agrotis ipsilon （Hufnagel））、イラクサキンウワバ（ＣＬ；Trichoplusia ni （Hubner））、及びシロイチモジヨトウ（ＢＡＷ、Spodoptera exigua、beet armyworm）が含まれる。
【０１１８】
サンプル調製及びバイオアッセイ。１０ｍＭのＣＡＰＳ、ｐＨ１０中の封入体調製物は、１０ｍＭのＣＡＰＳ、ｐＨ１０中で適切に希釈され、及び全てのバイオアッセイには本バッファーから構成される対照処理が含まれるが、同処理は、死亡率又は成長阻害についてバックグラウンドチェックするように機能する。
【０１１９】
バイオアッセイバッファー中のタンパク質濃度は、ゲルデンシトメトリー用の標準曲線を作成するためにＢＳＡを用いながらゲル電気泳動により評価されるが、同ゲルデンシトメトリーは、ＢｉｏＲａｄ画像システム（Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ バージョン４．５．２を備えたＦｌｕｏｒ−Ｓ ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ）を用いて測定される。ゲルマトリックス中のタンパク質は、クマシーブルーベースの染色剤を用いて染色され、及び読み取る前に脱染色される。
【０１２０】
精製されたタンパク質は、人工的な昆虫飼料で飼育された新生幼虫を用いて実施されるバイオアッセイで、殺虫活性について試験される。幼虫、例えばＢＣＷ、ＣＥＷ、ＣＬ、ＤＢＭ、ｒＤＢＭ、ＥＣＢ、ＦＡＷ、及びＴＢＷの幼虫は、商業的な昆虫飼育業者（Ｂｅｎｚｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ、Ｃａｒｌｉｓｌｅ、ＰＡ）により維持されているコロニーから得られた卵から孵化される。ＷＣＲ及びＳＣＲの卵は、Ｃｒｏｐ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＮ）から入手される。ｒＥＣＢ及びｒＦＡＷの幼虫は、独自のコロニー（Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ ＬＬＣ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から捕集された卵から孵化される。
【０１２１】
バイオアッセイは、昆虫バイオアッセイ用に特別に設計された１２８−ウェル、プラスチック製トレイ（Ｃ−Ｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｐｉｔｍａｎ、ＮＪ）内で実施される。各ウェルは、複数種鱗翅目飼料（Ｓｏｕｔｈｌａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｌａｋｅ Ｖｉｌｌａｇｅ、ＡＲ）又は甲虫目の昆虫の増殖用に設計された独自の飼料（Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ ＬＬＣ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、１．０ｍＬを含む。４０μＬの分量のタンパク質サンプルが、ピペットにより各ウェルの１．５ｃｍ２の飼料表面上に供給される（２６．７μＬ／ｃｍ２）。飼料濃度は、ウェルの表面積１平方センチ（ｃｍ２）当たりのＤＩＧ−５タンパク質の量（ｎｇ）として計算される。処理済みのトレイは、飼料表面上の液体が蒸発し、又は飼料内に吸収されるまでドラフトチャンバー内で維持される。
【０１２２】
羽化の数時間内に、個々の幼虫は湿ったラクダの毛のブラシを用いて採取され、及び１ウェル当たり１匹の幼虫となるように処理済みの飼料上に配置される。次に、寄生されたウェルは、透明なプラスチック製の接着シートで密閉され、ガス置換が可能となるように換気される。（Ｃ−Ｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｐｉｔｍａｎ、ＮＪ）。バイオアッセイトレイは、制御された環境条件下（２８℃、相対湿度約４０％、１６：８［明：暗］）で５日間維持され、その後、各タンパク質サンプルに暴露された昆虫の総数、死亡した昆虫の数、及び生存した昆虫の重量が記録される。死亡の割合（％）及び成長阻害の割合（％）が各処理について計算される。成長阻害（ＧＩ）は下記のように計算される。
ＧＩ＝［１−（ＴＷＩＴ／ＴＮＩＴ）／（ＴＷＩＢＣ／ＴＮＩＢＣ）］
式中、ＴＷＩＴは処理群の昆虫の総重量であり、
ＴＮＩＴは処理群の昆虫の総数であり、
ＴＷＩＢＣは、バックグラウンドチェック群（バッファー対照）の昆虫の総重量であり、及び
ＴＮＩＢＣは、バックグラウンドチェック群（バッファー対照）の昆虫の総数である。
【０１２３】
ＧＩ５０は、ＧＩ値が５０％である飼料中のＤＩＧ−５タンパク質濃度として求められる。ＬＣ５０（５０％致死濃度）は、試験昆虫の５０％が絶命する飼料中のＤＩＧ−５タンパク質濃度として記録される。統計解析（一元配置ＡＮＯＶＡ）が、ＪＭＰソフトウェア（ＳＡＳ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を用いて実施される。
【実施例６】
【０１２４】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）属の形質転換
標準的なクローニング法が、バイナリー植物形質転換及び発現プラスミドの構築で用いられる。制限エンドヌクレアーゼ及びＴ４ＤＮＡリガーゼはＮＥＢより入手される。プラスミドの調製は、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎキット、又はＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）ＡＸ Ｘｔｒａ Ｍｉｄｉキット（両方共にＭａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌより入手）を用いて、製造業者の説明書に従って実施される。ＤＮＡ断片は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、又はＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（両方共にＱｉａｇｅｎより入手）を用いて、ゲル単離後に精製される。
【０１２５】
改変されたＤＩＧ−５タンパク質、又はその断片をコードする核酸配列を含むＤＮＡ断片は、商業的ベンダー（例えば、ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）により合成可能であり、及び標準的なプラスミドベクター内にクローン化された断片として供給され得るが、又は適当な核酸配列を含むその他の構築物について標準的な分子生物学的操作を行うことによって得ることもできる。各遺伝子内部の固有制限部位は識別可能であり、及び各遺伝子断片が合成可能であり、それぞれ固有の欠損又は挿入を含む。所望の完全長タンパク質、融合タンパク質、又は欠損変異体タンパク質をコードするコーディング領域を得るために、改変されたＣｒｙ断片をその他のＣｒｙ断片コーディング領域内に、適切な制限部位においてサブクローン化することができる。例えば、遺伝子の開始部に適当な制限認識部位、及び変異クローンを構築するのに利用可能な各遺伝子に固有の第２の内部制限部位を識別することができる。
【０１２６】
非限定的な事例では、基本的なクローニング法は、完全長又は改変されたＣｒｙコーディング配列（ＣＤＳ）をＮｃｏＩ及びＳａｃＩ制限部位で植物発現プラスミド内にサブクローン化することであり得る。植物発現要素（例えば、植物で発現可能なプロモーター、３’末端転写終了及びポリアデニレート付加決定因子等）の制御下に置かれたしかるべきＣｒｙコーディング領域を含む、得られた植物発現カセットは、例えばＧａｔｅｗａｙ（登録商標）技術又は標準的な制限酵素断片クローニング手法を利用して、バイナリーベクタープラスミド内にサブクローン化される。Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）技術が利用される場合には、例えばＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が、完全長及び改変された遺伝子の植物発現カセットをバイナリー植物形質転換プラスミド内に組み込むのに利用可能である。プラスミドが大腸菌（E.coli）及びアグロバクテリウム（Agrobacterium）属の細胞内に存在するとき、抗生物質スペクチノマイシンに対する抵抗性を付与する細菌遺伝子を内蔵するバイナリー植物形質転換ベクターを利用するのが便利である。所望の宿主植物内で機能する植物で発現可能な選択マーカー遺伝子を含むバイナリーベクタープラスミドを利用するのも便利である。植物で発現可能な選択マーカー遺伝子の例として、抗生物質のカナマイシン、ネオマイシン、及びＧ４１８に対する抵抗性をコードする、トランスポゾンＴｎ５（Ａｐｈ ＩＩ）のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子、並びにグリホサート；ハイグロマイシン；メトトレキサート；ホスフィノトリシン（ビアラホス）、イミダゾリノン、スルホニルウレア剤、及びトリアゾロピリミジン除草剤、例えばクロロスルフロン（ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｕｒｏｎ）、ブロモキシニル（ｂｒｏｍｏｘｙｎｉｌ）、ダラポン（ｄａｌａｐｏｎ）等に対する抵抗性又は耐性をコードする遺伝子が挙げられるが、但しこれらに限定されない。
【０１２７】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）系統Ｚ７０７Ｓのエレクトロコンピテントセル（Ｚ７０７のストレプトマイシン抵抗性誘導体；Hepburnらの文献、1985年）が、エレクトロポレーションを用いて調製され、及び形質転換される（Weigel及びGlazebrookの文献、2002年）。エレクトロポレーション後に、１ｍＬのＹＥＰブロス（ｇｍ／Ｌ：酵母菌抽出物、１０；ペプトン、１０；ＮａＣｌ、５）がキュベットに添加され、及び細胞−ＹＥＰ懸濁液が、水浴中、２８℃で、４時間、一定速度で激しく揺動させながらインキュベーションするために１５ｍＬ培養チューブに移される。細胞は、スペクチノマイシン（２００μｇ／ｍＬ）及びストレプトマイシン（２５０μｇ／ｍＬ）を含むＹＥＰ＋寒天（２５ｇｍ／Ｌ）上に播種され、及び当該播種物は２８℃で２〜４日間インキュベーションされる。十分に分離した単一コロニーが選択され、及び上記のようにスペクチノマイシン及びトレプトマイシンを含む新鮮なＹＥＰ＋アガープレート上に条痕を生じさせ（streaked）、及び２８℃で１〜３日間、インキュベーションされる。
【０１２８】
バイナリー植物形質転換ベクター内へのＤＩＧ−５遺伝子挿入の有無は、選択されたアグロバクテリウム（Agrobacterium）属コロニーから調製されたテンプレートプラスミドＤＮＡで、ベクター特異的プライマーを用いて、ＰＣＲ分析により確認される。上記のようにスペクチノマイシン及びストレプトマイシンを含むＹＥＰ中で増殖したオーバーナイト培養物１５ｍＬのうち、４ｍＬの分量から得られた細胞ペレットが、Ｑｉａｇｅｎ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐｓを用いて、製造業者の説明書に従い抽出される。アグロバクテリウム（Agrobacterium）属のエレクトロポレーション形質転換で用いられたバイナリーベクターに由来するプラスミドＤＮＡが、対照として含まれる。ＰＣＲ反応は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手したＴａｑＤＮＡポリメラーゼを、製造業者の説明書に従い０．５×濃度で用いて完結する。ＰＣＲ反応は、以下の条件でプログラムされたＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ内で実施される：ステップ１）９４℃、３分；ステップ２）９４℃、４５秒間；ステップ３）５５℃、３０秒間；ステップ４）７２℃、推定される生成物の長さ１ｋｂ当たり１分間；ステップ５）ステップ２までを２９回；ステップ６）７２℃、１０分間。サイクリング後、反応は４℃で維持される。増幅産物はアガロースゲル電気泳動（例えば、０．７％〜１％のアガロース、ｗ／ｖ）により分析され、及びエチジウムブロマイド染色により可視化される。ＰＣＲ産物がプラスミド対照と同一であるコロニーが選択される。
【０１２９】
或いは、ＤＩＧ−５遺伝子の挿入を含むバイナリー植物形質転換ベクターのプラスミド構造が、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属を操作する当業者にとって周知の標準的な分子生物学的方法により候補アグロバクテリウム（Agrobacterium）属単離物から調製されたプラスミドＤＮＡの制限消化物フィンガープリントマッピングにより確認される。
【０１３０】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）属が介在する形質転換法により形質転換植物を得る当業者は、Ｚ７０７Ｓ以外のその他のアグロバクテリウム（Agrobacterium）属の系統も有利に利用可能であり、及び系統の選択は、形質転換される宿主植物種の同一性に依存し得ることを理解するであろう。
【実施例７】
【０１３１】
双子葉植物におけるＤＩＧ−５Ｂ．ｔ．殺虫性タンパク質及び変異体の産生
シロイヌナズナ（Arabidopsis）形質転換。シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）Ｃｏｌ−０１は、花卉水浸法（floral dip method）を用いて形質転換される（Weigel及びGlazebrookの文献、2002年）。選択されたアグロバクテリウム（Agrobacterium）属コロニーが、選択用途で適切な抗生物質を含むＹＥＰブロスの培養液１ｍＬ〜１５ｍＬに播種するために用いられる。培養液は、２２０ｒｐｍの一定速度で激しく揺動させながら、２８℃、オーバーナイトでインキュベーションされる。各培養液は、選択用途で適切な抗生物質を含むＹＥＰブロスの２つの５００ｍＬ培養液に播種するのに用いられ、及び新たな培養液は、一定速度で激しく揺動させながら、２８℃、オーバーナイトでインキュベーションされる。細胞は約８７００×ｇで１０分間、室温においてペレット化され、及び得られた上澄部は廃棄される。細胞ペレットは以下の成分を含む浸潤培地、５００ｍＬ内に静かに再懸濁される：１／２×Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）／ＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミン（Ｇｏｌｄ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、１０％（ｗ／ｖ）のスクロース、０．０４４μＭのベンジルアミノプリン（１ｍｇ／ｍＬのストック液を１０μＬ／リットルで含むＤＭＳＯ溶液）及び３００μＬ／リットルのＳｉｌｗｅｔ Ｌ−７７。最も新しい花序の水没が保証されるように注意を払いながら、約１月齢の植物が培地に１５秒間浸漬される。次に、当該植物は横向きに寝かせられ、及び２４時間覆われ（透明又は不透明）、水で洗浄され、及び縦向きに配置される。当該植物を１６時間明光／８時間暗光の周期で、２２℃において成長させる。浸漬後約４週間経過して種子が採取される。
【０１３２】
シロイヌナズナ（Arabidopsis）の成長及び選択。新たに採取されたＴ１種子を乾燥剤の存在下で少なくとも７日間、室温で乾燥させる。種子は、０．１％の寒天／水（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液中で懸濁され、次に４℃で２日間重層化される。栽植目的で調製するために、１０．５インチ×２１インチの発芽トレイ（Ｔ．Ｏ．Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ、Ｃｌｅａｒｗａｔｅｒ，ＭＮ）内のＳｕｎｓｈｉｎｅ Ｍｉｘ ＬＰ５（Ｓｕｎ Ｇｒｏ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｎｃ．，Ｂｅｌｌｅｖｕｅ，ＷＡ）が微細なバーミキュライトで覆われ、濡れるまでホーグランド液でサブイリゲーションされ（Hoagland及びArnonの文献、1950年）、次に２４時間放置して水切りが行われる。重層化された種子はバーミキュライト上に播種され、及び湿度ドーム（ＫＯＲＤ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｒａｍａｌｅａ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）で７日間覆われる。種子を発芽させ、及び植物を、Ｃｏｎｖｉｒｏｎ（Ｍｏｄｅｌｓ ＣＭＰ４０３０、又はＣＭＰ３２４４；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｗｉｎｎｉｐｅｇ、Ｍａｎｉｔｏｂａ、Ｃａｎａｄａ）内で、長日条件（１６時間明光／８数時間暗光）下、１２０〜１５０μｍｏｌ／ｍ２秒の光強度、一定の温度（２２℃）及び湿度（４０〜５０％）の下で成長させる。土壌が濡れた状態ではなく湿った状態に保たれるように、植物は当初ホーグランド液で、その後脱イオン水で給水される。
【０１３３】
ドームは、播種後５〜６日間で除去され、及び植物は形質転換されない種子から発芽した植物を枯死させる化学的選択剤でスプレー噴霧される。例えば、バイナリー植物形質転換ベクターにより付与された、植物で発現可能な選択マーカー遺伝子がｐａｔ又はｂａｒ遺伝子である場合には（Wehrmannらの文献、1996年）、形質転換植物は、Ｆｉｎａｌｅ（５．７８％のグルフォシネートアンモニウム、Ｆａｒｎａｍ Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｐｈｏｅｎｉｘ、ＡＺ）の１０００×溶液でスプレー噴霧することにより選択され得る。その後スプレー噴霧は５〜７日の間隔で２回実施される。生存植物（活発に成長する植物）が、最終スプレー噴霧後７〜１０日間経過して識別され、及びＳｕｎｓｈｉｎｅ Ｍｉｘ ＬＰ５で調製されたポットに移植される。移植された植物は湿度ドームで３〜４日間覆われ、及び上記成長条件下でＣｏｎｖｉｒｏｎ内に配置される。
【０１３４】
その他の植物で発現可能な選択マーカー遺伝子（例えば、除草剤耐性遺伝子）が用いられる場合には、形質転換植物を選択するその他の方法も利用可能であることを、双子葉植物形質転換の当業者は理解するであろう。
【０１３５】
遺伝子組換えシロイヌナズナ（Arabidopsis）の昆虫バイオアッセイ。改変されたＣｒｙタンパク質を発現する遺伝子組換えシロイヌナズナ（Arabidopsis）系統が、感受性を有する昆虫種に対して活性を有することが、人工飼料オーバーレイアッセイ（artificial diet overlay assays）で実証される。遺伝子組換え及び非遺伝子組換えシロイヌナズナ系統から抽出されたタンパク質が、しかるべき方法により定量化され、及びタンパク質濃度を標準化するためにサンプル容量が調整される。バイオアッセイが上記のように人工飼料上で実施される。非遺伝子組換えのシロイヌナズナ（Arabidopsis）及び／又はバッファー及び水が、バックグラウンドチェック処理として分析法に含まれる。
【実施例８】
【０１３６】
スーパーバイナリーベクターを作製するためのアグロバクテリウム（Agrobacterium）属の形質転換
アグロバクテリウム（Agrobacterium）属スーパーバイナリーシステムは、単子葉植物の植物宿主を形質転換するのに好都合に用いられる。スーパーバイナリーベクターを構築し及び確認する方法は十分に確立されている。標準的な分子生物学的及び微生物学的方法がスーパーバイナリープラスミドを作製するのに用いられる。スーパーバイナリープラスミドの構造の検証／確認は、バイナリーベクターについて上記したものと同様の方法を用いて実施される。
【実施例９】
【０１３７】
単子葉植物におけるＤＩＧ−５Ｂ．ｔ．殺虫性タンパク質及び変異体の産生
トウモロコシのアグロバクテリウム（Agrobacterium）属が介在する形質転換。Ｈｉｇｈ ＩＩ Ｆ１ ｃｒｏｓｓ（Armstrongらの文献、1991年）に由来する種子が、９５％のＭｅｔｒｏ−Ｍｉｘ ３６０ソイルレス系成長培地（Ｓｕｎ Ｇｒｏ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ、Ｂｅｌｌｅｖｕｅ、ＷＡ）及び５％のｃｌａｙ／ｌｏａｍ土壌からなる混合物を含む５ガロンのポット内に植栽される。植物を、高圧ナトリウムランプ及びメタルハライドランプを併用する温室内で、１６：８時間の明光：暗光周期にて成長させる。形質転換用の未成熟のＦ２胚を得るために、制御された同胞受粉（sib-pollination）が実施される。胚が約１．０〜２．０ｍｍのサイズになる受粉後８〜１０日目に、未成熟の胚が単離される。
【０１３８】
感染及び同時培養。トウモロコシ雌穂（Maize ears）は、滅菌水でリンスされる前に、液体石鹸で洗浄し、７０％のエタノール中に２分間浸漬し、次に２０％の市販漂白剤（０．１％の次亜塩素酸ナトリウム）中に３０分間浸漬することにより表面滅菌処理される。スーパーバイナリーベクターを含むアグロバクテリウム（Agrobacterium）属細胞の懸濁液が、１００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン、１０ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン、及び２５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＹＥＰ固体培地上で成長した１〜２ループの細菌を、２８℃で２〜３日間、１００μＭのアセトシリンゴンを含む５ｍＬの液体感染培地（ＬＳ基本培地（Linsmaier及びSkoogの文献、1965年）、Ｎ６ビタミン（Chuらの文献、1975年）、１．５ｍｇ／Ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、６８．５ｇｍ／Ｌのスクロース、３６．０ｇｍ／Ｌのグルコース，６ｍＭのＬ−プロリン、ｐＨ５．２）に移植することにより調製される。均一な懸濁液になるまで溶液はボルテックス処理され、及び濃度は、紫色のフィルターを備えたＫｌｅｔｔ−Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎ比色計を用いて、最終密度が２００Ｋｌｅｔｔ単位となるように調整される。未成熟の胚は、２ｍＬの感染培地を含むマイクロ遠心管に直接単離される。培地は除去され、及び密度が２００Ｋｌｅｔｔ単位のアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液、１ｍＬで置換され、及びアグロバクテリウム（Agrobacterium）と胚の溶液は、室温で５分間インキュベーションされ、次いで同時培養培地（ＬＳ基本培地、Ｎ６ビタミン、１．５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、３０．０ｇｍ／Ｌのスクロース、６ｍＭのＬ−プロリン、０．８５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、１００μＭのアセトシリンゴン、３．０ｇｍ／Ｌのゲランガム（ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）、ｐＨ５．８）に、暗光条件下で、２５℃、５日間移植される。
【０１３９】
同時培養後に、胚は選択的培地に移植され、その後約８週間経過する間に形質転換された単離物が得られる。植物で発現可能なｐａｔ又はｂａｒ選択マーカー遺伝子を含むスーパーバイナリープラスミドで形質転換されたトウモロコシ組織を選択する場合、ＬＳベースの培地（ＬＳ基本培地、Ｎ６ビタミン、１．５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、０．５ｇｍ／ＬのＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸一水和物；ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌａｂｒ．）、３０．０ｇｍ／Ｌのスクロース、６ｍＭのＬ−プロリン、１．０ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、２．５ｇｍ／Ｌのゲランガム、ｐＨ５．７）が、ビアラホス（Ｂｉａｌａｐｈｏｓ）（Ｇｏｌｄ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に用いられる。胚は胚形成性単離物が得られるまで３ｍｇ／Ｌのビアラホスを含む選択培地に移植される。回収された単離物は、再生及び更なる分析用として２週間間隔で新鮮な選択培地に移植することにより蓄積される。
【０１４０】
その他の植物で発現可能な選択マーカー遺伝子（例えば、除草剤耐性遺伝子）が用いられる場合には、形質転換植物を選択するその他の方法が利用可能であることを、トウモロコシ形質転換の当業者は理解するであろう。
【０１４１】
再生及び種子の生産。再生する場合、培養物は、「２８」導入培地（ＭＳ塩及びビタミン、３０ｇｍ／Ｌのスクロース、５ｍｇ／Ｌのベンジルアミノプリン、０．２５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、３ｍｇ／Ｌのビアラホス、２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、２．５ｇｍ／Ｌのゲランガム、ｐＨ５．７）に弱光条件下（１４μＥｍ−２ｓ−１）で１週間、次に強光条件下（約８９μＥｍ−２ｓ−１）で１週移植される。その後、組織は「３６」再生培地（植物成長調節剤を含まない点を除き導入培地に同じ）に移植される。小植物が長さ３〜５ｃｍに成長したときに、それらはＳＨＧＡ培地（Schenk and Hildebrandt salts and vitamins （1972年）; PhytoTechnologies Labr.）、１．０ｇｍ／Ｌのミオイノシトール、１０ｇｍ／Ｌのスクロース、及び２．０ｇｍ／Ｌのゲランガム、ｐＨ５．８）を含むガラス製の培養チューブに移植されて、更に成長し及び徒長枝と根が発生するようにさせる。植物は本明細書にこれまでに記載したものと同一の土壌混合物に移植され、及び温室内で開花するまで育成される。種子を生産するために制御された受粉が実施される。
【実施例１０】
【０１４２】
遺伝子組換えトウモロコシのバイオアッセイ
植物細胞内で産生されるＤＩＧ−５タンパク質及び変異体の生物活性は、従来のバイオアッセイ法により（例えば、Huangらの文献、2006年を参照）実証される。有効性は、例えばＤＩＧ−５毒素を産生する植物に由来する様々な植物組織又は組織片を、制御された摂食環境で昆虫に摂食させることにより実証することができる。或いは、これまでに本明細書に記載したように、タンパク質抽出物が、ＤＩＧ−５毒素を産生する植物に由来する様々な植物組織から調製可能であり、及び当該抽出されたタンパク質を人工飼料バイオアッセイに組み込み可能である。かかる摂食分析法の結果は、ＤＩＧ−５タンパク質又は変異体を産生しない宿主植物に由来する適切な対照組織又はその他の対照サンプルを利用する、同様に実施されるバイオアッセイと比較されることとなることが理解される。
【０１４３】
本明細書で参照又は引用される全ての特許、特許出願、仮出願、及び出版物をそのまま、本明細書の明示的教示と矛盾しない範囲内で参照により援用する。特に明示又は暗示しない限り、用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、本明細書において使用される場合、「少なくとも１つの」を意味する。本明細書で用語「遺伝物質」を使用する場合、全ての遺伝子、核酸、ＤＮＡ、及びＲＮＡを含むように意図されている。
【０１４４】
ポリヌクレオチドの核酸残基、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、及びプライマーの名称、並びにタンパク質のアミノ酸残基の名称については、本明細書全体通じてＩＵＰＡＣの標準的略号が採用される。核酸配列は、標準的な５’から３’方向で提示され、及びタンパク質配列は、標準的なアミノ（Ｎ）末端からカルボキシ（Ｃ）末端方向で提示されている。用語「ｄｓＲＮＡ」は二本鎖ＲＮＡを意味する。
【０１４５】
（参考文献）
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年６月１６日に出願された米国仮出願第６１/１８７，４５５号の利益を主張するものであり、同号を本明細書において参照により明示的に援用する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、新規殺虫性のＣｒｙ毒素及び昆虫を防除する（control）ためのその使用に関連する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）（Ｂ．ｔ．）は、デルタエンドトキシン又はＣｒｙタンパク質として公知の殺有害生物性の結晶タンパク質を産生する土壌伝播性のバクテリアである。Ｃｒｙタンパク質は、感受性を有する昆虫の中腸細胞に作用することにより機能する経口中毒物質である。いくつかのＣｒｙ毒素が線虫に対して活性を有することが明らかにされている。デルタエンドトキシンの広範なリストが、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｉｆｅｓｃｉ．ｓｕｓｓｅｘ．ａｃ．ｕｋ／ｈｏｍｅ／Ｎｅｉｌ＿Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ／Ｂｔ／ｉｎｔｒｏ．ｈｔｍｌ．で維持され、定期的に更新されている。
【０００４】
ウエスタンコーンルートワーム（ＷＣＲ）、Diabrotica virgifera virgifera LeConteは、経済的に重要なトウモロコシ有害生物であり、同生物は、穀物収穫量の損失及び昆虫管理費用に起因して、北米で毎年推定＄１０億もの歳入喪失を引き起こす（Metcalfの文献、1986年）。ＷＣＲ管理の実践として、大豆による輪作、化学殺虫剤、及びより最近ではＢ．ｔ．のＣｒｙタンパク質を発現する遺伝子組換え作物が挙げられる。しかし、今日までにＣｒｙ３４Ａｂ１／Ｃｒｙ３５Ａｂ１（Ellisらの文献、2002年）、改変されたＣｒｙ３Ａａ１（Waltersらの文献、2008年）、及び改変されたＣｒｙ３Ｂｂ１（Vaughnらの文献、2005年）を含む数例のＢ．ｔ．Ｃｒｙタンパク質が、ＷＣＲに対して商業レベルの有効性を実現するに過ぎない。これらのＢ．ｔ．タンパク質は、遺伝子組換えトウモロコシの根で産生されると、ＷＣＲによるトウモロコシの根の損傷を防止する上で極めて効果的である（Moellenbeckらの文献、2001年、Vaughnらの文献、2005年、米国特許第７３６１８１３号）。
【０００５】
ＷＣＲ抵抗性の遺伝子組換えトウモロコシで成功を収めたにも関わらず、いくつかの要因により、ＷＣＲを防除するための新しいＣｒｙタンパク質を発見し、開発する必要性が生じている。第１に、現在展開されているＣｒｙタンパク質が遺伝子組換えトウモロコシ植物中で産生されると、ＷＣＲによる根の損傷から強固に保護されることとなり、これによって穀粒収量が確保されるが、人工的な寄生試験において、いくらかのＷＣＲ成虫が出現し、不完全な幼虫防除を示唆している。２番目に、抵抗性の昆虫個体群が発生し、ルートワームの防除においてＣｒｙタンパク質の長期耐久性が脅かされている。Ｃｒｙタンパク質に対して抵抗性を有する鱗翅目の昆虫が、コナガ（Plutella xylostella）（Tabashnikの文献、1994年）、キンウワバ（Trichoplusia ni）（Janmaat及びMyersの文献、2003年、2005年）、及びアメリカタバコガ（Helicoverpa zeae）（Tabashnikらの文献、2008年）の領域において発生した。Ｂ．ｔ．Ｃｒｙタンパク質に対して抵抗性を有する昆虫は、いくつかの機構を通じて発生し得る（Heckelらの文献（2007年）、Pigott及びEllarの文献、2007年）。Ｃｒｙタンパク質に関する複数の受容体タンパク質クラスが昆虫内に同定され、及び各受容体クラス内に複数の例が存在する。特定のＣｒｙタンパク質に対する抵抗性は、例えば、受容体タンパク質のカドヘリンドメインの毒素結合部分内の突然変異により発生し得る。更なる抵抗手段は、プロトキシン処理プロテアーゼ（protoxin-processing protease）により媒介され得る。鱗翅目の種に認められるＣｒｙ毒素抵抗性は、少なくとも４つの異なる主要な抵抗遺伝子を伴う複雑な遺伝学的基礎を有する。同様に、甲虫目の種においてＣｒｙ毒素抵抗性を制御するための複数の遺伝子が推測される。新規の高い効力を有するＣｒｙタンパク質が開発されれば、ＷＣＲを管理するための更なるツールがもたらされるであろう。ＷＣＲ昆虫における抵抗性発生の防止、及びルートワームを防除するためのＢ．ｔ．技術の長期的有用性の確保を、遺伝子組換えトウモロコシ内で組み合わせることにより、異なる作用機序を有するＣｒｙタンパク質を生み出すことができる。
【発明の概要】
【０００６】
発明の要旨
本発明は、本明細書でＤＩＧ−５と呼ぶ毒素並びにＤＩＧ−５の変異体を含む殺虫性のＣｒｙ毒素、これらの毒素をコードする核酸、当該毒素を用いて有害生物を防除する方法、遺伝子組換え（transgenic）宿主細胞内で当該毒素を産生する方法、及び当該毒素を発現する遺伝子組換え（transgenic）植物を提供する。野生型ＤＩＧ−５毒素の予測されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【０００７】
実施例１に記載するように、ＤＩＧ−５タンパク質をコードする核酸は、Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ ＬＬＣが社内的にＰＳ１９８Ｑ７と呼ぶＢ．ｔ．系統から単離された。完全長コーディング領域に関する核酸配列は決定され、及び完全長タンパク質配列が当該核酸配列から推定された。ＤＩＧ−５毒素は、Ｃｒｙ７Ｂａ１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＢＢ７０８１７．１）、及びその他のＢ．チューリンゲンシス（thuringiensis）のＣｒｙ７タイプタンパク質とある程度の類似性を有する（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｉｆｅｓｃｉ．ｓｕｓｓｅｘ．ａｃ．ｕｋ／ｈｏｍｅ／Ｎｅｉｌ＿Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ／Ｂｔ／ｉｎｔｒｏ．ｈｔｍｌ）。
【０００８】
殺虫剤として活性なＤＩＧ−５毒素変異体も本明細書において記載され、まとめてＤＩＧ−５毒素と呼ぶ。この毒素は、抵抗性甲虫目昆虫個体群の発生を制御するために、単独で又はその他のＣｒｙ毒素、例えばＣｒｙ３４Ａｂ１／Ｃｒｙ３５Ａｂ１（ＤＡＳ−５９１２２−７）、Ｃｒｙ３Ｂｂ１（ＭＯＮ８８０１７）、Ｃｒｙ３Ａ（ＭＩＲ６０４）、キメラＣｒｙ１Ａｂ／Ｃｒｙ３Ａａ（ＦＲ８Ａ、国際公開第２００８／１２１６３３Ａ１号）、ＣｒｙＥＴ３３とＣｒｙＥＴ３４、Ｖｉｐ１Ａ、Ｃｒｙ１Ｉａ、ＣｒｙＥＴ８４、ＣｒｙＥＴ８０、ＣｒｙＥＴ７６、ＣｒｙＥＴ７１、ＣｒｙＥＴ６９、ＣｒｙＥＴ７５、ＣｒｙＥＴ３９、ＣｒｙＥＴ７９、及びＣｒｙＥＴ７４と組み合わせて使用可能である。
【０００９】
ＤＩＧ−５毒素は、その他の害虫（insect pest）を防除するためにＲＮＡｉ法と組み合わせて用いることもできる。例えば、ＤＩＧ−５は、コーンルートワーム内の必須遺伝子又は害虫内の必須遺伝子を抑制するｄｓＲＮＡと組み合わせて遺伝子組換え植物で利用可能である。かかる標的遺伝子として、例えば液胞型ＡＴＰアーゼ（vacuolar ATPase）、ＡＲＦ−１、Ａｃｔ４２Ａ、ＣＨＤ３、ＥＦ−１α、及びＴＦＩＩＢが含まれる。適する標的遺伝子の例として、国際公開第２００７／０３５６５０号で開示するように液胞型ＡＴＰアーゼが挙げられる。
【００１０】
１つの実施形態では、本発明は、
（ａ）配列番号２の残基１１４〜６５５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｂ）配列番号２の残基１１４〜６５５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｃ）配列番号２によりコードされる毒素の発現又は活性に悪影響を及ぼさない最大２０個のアミノ酸の置換、欠損、又は修飾を含む、配列番号２の残基１１４〜６５５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
から構成される群より選択されるコア毒素セグメントを含む単離されたＤＩＧ−５毒素ポリペプチド又はその殺虫剤として（insecticidally）活性な断片を提供する。
【００１１】
本発明の別の実施形態では、本発明は、
（ａ）配列番号２の残基１〜６５５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｂ）配列番号２の残基１〜６５５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｃ）配列番号２によりコードされる毒素の発現又は活性に悪影響を及ぼさない最大２０個のアミノ酸の置換、欠損、又は修飾を含む、配列番号２の残基１〜６５５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
から構成される群より選択されるＤＩＧ−５コア毒素セグメントを含む単離されたＤＩＧ−５毒素ポリペプチド又はその殺虫剤として活性な断片を提供する。
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、
（ａ）配列番号２の残基１１４〜１１４９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｂ）配列番号２の残基１１４〜１１４９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｃ）配列番号２によりコードされる毒素の発現又は活性に悪影響を及ぼさない最大２０個のアミノ酸の置換、欠損、又は修飾を含む、配列番号２の残基１１４〜１１４９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
から構成される群より選択されるＤＩＧ−５コア毒素セグメントを含む単離されたＤＩＧ−５毒素ポリペプチド又はその殺虫剤として活性な断片を提供する。
【００１３】
別の実施形態では、本発明は、
（ａ）配列番号２の残基１〜１１４９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｂ）配列番号２の残基１〜１１４９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｃ）配列番号２によりコードされる毒素の発現又は活性に悪影響を及ぼさない最大２０個のアミノ酸の置換、欠損、又は修飾を含む、配列番号２の残基１〜１１４９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
から構成される群より選択されるＤＩＧ−５コア毒素セグメントを含む単離されたＤＩＧ−５毒素ポリペプチド又はその殺虫剤として活性な断片を提供する。
【００１４】
別の実施形態では、本発明はＤＩＧ−５毒素を含む植物を提供する。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、有害生物個体群（pest population）を防除する方法であって、前記個体群を、殺有害生物剤として（pesticidally）有効な量のＤＩＧ−５毒素と接触させるステップを含む方法を提供する。
【００１６】
別の実施形態では、本発明は、ＤＩＧ−５毒素をコードする単離された核酸を提供する。
【００１７】
別の実施形態では、本発明は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）由来でないプロモーターであって、植物内で発現を推進する能力を有するプロモーターに作動可能に連結した、ＤＩＧ−５毒素をコードする核酸配列を含むＤＮＡ構築物を提供する。本発明は、ゲノムに安定的に組み込まれたＤＮＡ構築物を含む遺伝子組換え植物、及び有害生物から植物を保護する方法であって、前記構築物を前記植物に導入するステップを含む方法も提供する。
【００１８】
配列の簡単な説明
配列番号１：完全長ＤＩＧ−５毒素をコードするＤＮＡ配列；３４４７ｎｔ。
配列番号２：完全長ＤＩＧ−５タンパク質配列；１１４９ａａ。
配列番号３：トウモロコシ最適化ＤＩＧ−５コア毒素コーディング領域；１９６５ｎｔ。
配列番号４：Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメント；５４５ａａ。
配列番号５：キメラ毒素：ＤＩＧ−５コア／Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメント；１２００ａａ。
配列番号６：Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントをコードする双子葉植物最適化ＤＮＡ配列;１６３５ｎｔ
配列番号７：Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントをコードするトウモロコシ最適化ＤＮＡ配列；１６３５ｎｔ
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
ＤＩＧ−５毒素、及び殺虫剤として活性な変異体。配列番号２の完全長ＤＩＧ−５毒素に加えて、本発明は、殺虫剤として活性な変異体を含む。用語「変異体」と呼ぶとき、本出願者らは、断片、しかるべき欠損及び挿入突然変異体、及びしかるべき融合タンパク質を含むように意図する。ＤＩＧ−５は、古典的な３ドメインＣｒｙ毒素である。本発明に含まれるＤＩＧ−５毒素の変異体を記載するに当たり、その前置きとして一般的な３ドメインＣｒｙ毒素の構造、及び具体的なＤＩＧ−５タンパク質毒素の構造を簡潔に総説することが有用であろう。
【００２０】
大部分のバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のデルタエンドトキシン結晶タンパク質分子は、２つの機能的セグメントから構成されている。プロテアーゼ抵抗性コア毒素は第１のセグメントであり、及びタンパク質分子のほぼ前半部分に対応する。完全な約１３０ｋＤａプロトキシン分子は、昆虫腸内のプロテアーゼにより速やかに処理されて抵抗性のコアセグメントになる。この処理により除去されるセグメントは、本明細書では「プロトキシンセグメント」と呼ぶ。プロトキシンセグメントは、毒素の結晶形成に関与していると考えられている（Arvidsonらの文献（1989年））。従って、プロトキシンセグメントは、毒素分子がプロテアーゼにより処理されるのを抑制し（Haiderらの文献、1986年）、又は毒素の溶解度を低下させ（Aronsonらの文献、1991年）、こうして昆虫へのコアのアクセス性を制限することにより、昆虫に偏よった特異性を毒素に付与することができる。Ｂ．ｔ．毒素は特定のクラスに含まれるといっても、長さ及びコア毒素部分からプロトキシン部分に移行する正確な場所についてある程度変化する。コア毒素部分からプロトキシン部分への移行は、一般的に完全長毒素の約５０％〜約６０％の間で生ずる。配列番号２では、完全長ＤＩＧ−５ポリペプチドの１１４９個のアミノ酸からなる配列が開示されており、そのうちのＮ末端側６５５個のアミノ酸は、ＤＩＧ−５コア毒素を含む。配列番号１の５’末端部１９６５個のヌクレオチドはコア毒素のコーディング領域を含む。
【００２１】
３次元結晶構造が、Ｃｒｙ１Ａａ１、Ｃｒｙ２Ａａ１、Ｃｒｙ３Ａａ１、Ｃｒｙ３Ｂｂ１、Ｃｒｙ４Ａａ、Ｃｒｙ４Ｂａ、及びＣｒｙ８Ｅａ１について決定された。コア毒素に関するこれらの構造は極めて類似しており、及び下記の特徴を有する３つの異なるドメインから構成される（de Maagdらの文献、2003年でレビューされている）。
【００２２】
ドメインＩは、７つのαへリックスからなる１つの束であり、へリックス５が６つの両親媒性へリックスに取り囲まれている。このドメインからはポア形成が示唆されており、ヘモリジンやコリシンを含むその他のポア形成タンパク質と構造的類似性を共有している。ＤＩＧ−５タンパク質のドメインＩは、配列番号２のアミノ酸残基５５〜２８１を含む。
【００２３】
ドメインＩＩは、βプリズム内に共にパックされた３つの逆平行βシートから形成されている。このドメインのループは、昆虫の中腸受容体に結合する際に重要な役割を演じている。Ｃｒｙ１Ａタンパク質では、ドメインＩＩβシートの頂点部で表面に露出したループは、鱗翅目のカドヘリン受容体との結合に関与している。Ｃｒｙ３ＡａドメインＩＩループは、コロラドハムシ（Leptinotarsa decemlineata）（Say）（Colorado potato beetle）の膜結合性メタロプロテアーゼに類似の様式で結合する（Ochoa-Campuzanoらの文献、2007年）。ドメインＩＩは、ビテリンやジャカリンを含むある種の炭水化物結合タンパク質と構造的類似性を有する。ＤＩＧ−５タンパク質のドメインＩＩは配列番号２のアミノ酸残基２８６〜４９９を含む。
【００２４】
ドメインＩＩＩは２つの逆平行βシートからなるβサンドイッチである。このドメインは、グルカナーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、シアリダーゼ等のタンパク質の炭水化物結合ドメインと構造的に関連する。ドメインＩＩＩは、受容体タンパク質のある種のクラスと結合し、おそらく受容体の第２のクラス、その例として、Ｃｒｙ１Ａタンパク質の場合では、アミノペプチダーゼやアルカリホスファターゼが挙げられるが、これらと相互作用するオリゴマー型毒素プレポア（pre-pore）の挿入に関与している（Honeeらの文献（1991年）、Pigott及びEllarの文献、（2007年））。甲虫目では類似するＣｒｙドメインＩＩＩ受容体はまだ見つかっていない。保存性のＢ．ｔ．配列ブロック２及び３は、ドメイン２のＮ末端及びＣ末端近傍にそれぞれマップする。従って、これらの保存性の配列ブロック２及び３は、ほぼ上記３つの機能性ドメイン間に位置する境界領域に該当する。保存性のＤＮＡ及びタンパク質のこれらの領域の相同性は、組換えＢ．ｔ．毒素を工学的に作り出すのに利用されてきた（米国特許第６，０９０，９３１号、国際公開第９１／０１０８７号、同第９５／０６７３０号、同第１９９８０２２５９５号）。ＤＩＧ−５タンパク質のドメインＩＩＩは、配列番号２のアミノ酸残基５０９〜６５３を含む。
【００２５】
受容体が結合した後、ドメインＩのαへリックス１は除去されることが報告されている。Aronsonらの文献（1999年）では、ＢＢＭＶに結合したＣｒｙ１Ａｃは、αへリックス１直後の残基５９で始まるプロテイナーゼＫの切断から保護されることが実証された。同様の結果がＣｒｙ１Ａｂについて例証された。Gomezらの文献（2002年）では、ＢＢＭＶ受容体が結合して形成されたＣｒｙ１Ａｂオリゴマーは、ドメインＩのαへリックス１の部分を欠いていることが見出された。また、Soberonらの文献（2007年）では、３次元Ｃｒｙ構造におけるαへリックス１を含む約６０個のアミノ酸を欠損するＣｒｙ１Ａｂ及びＣｒｙ１ＡｃのＮ末端欠損突然変異体は、カドヘリンが結合しなくても分子量約６０ｋＤａのモノマーをプレポアに会合させることができることも明らかにされた。これらのＮ末端欠損突然変異体は、Ｃｒｙ抵抗性の幼虫に対して活性を有することが報告された。更に、Diaz-Mendozaらの文献（2007年）では、地中海マツマダラメイガ（corn borer）（Sesamia nonagrioides）に対して活性を維持する４３ｋＤａ及び４６ｋＤａのＣｒｙ１Ａｂ断片について記載された。これらの断片は、アミノ酸残基１１６〜４２３を含むことが実証された。但し、正確なアミノ酸配列は明らかにされておらず、及びこれらのタンパク質分解性断片の活性機構は不明である。Gomezら（2002年）、Soberonら2007年、及びDiaz-Mendozaら（2007年）の文献の結果は、Hofteらの文献（1986年）の結果とは対照的であり、Ｈｏｆｔｅらは、Ｃｒｙ１ＡｂのＮ末端から３６個のアミノ酸が欠損すると殺虫活性が喪失することを報告した。
【００２６】
本発明者らは、ＤＩＧ−５のタンパク質配列を、構造が公知のＣｒｙ８Ｅａ１に関するタンパク質配列と比較することにより、へリックス１、２Ａ、２Ｂ、及び３の始まりと終わり、及びＤＩＧ−５毒素のドメインＩ内の前記ヘリックス間に位置するスペーサー領域の場所を推測した。これらの場所を表１に記載する。
【００２７】
【表１】
【００２８】
ＤＩＧ−５のアミノ末端欠損変異体。本発明の１つの態様では、本発明は、殺虫活性が改善し、及び昆虫が抵抗性を発生するのを防ぐように、ヘリックス１、２Ａ、及び２Ｂの全て又は一部が欠損しているＤＩＧ−５変異体を提供する。これらの改変体は、改善した標的有害生物スペクトル、効力、及び昆虫抵抗性管理等の、改善した特性をＤＩＧ−５変異体に付与するように作製される。本願発明のいくつかの実施形態では、本願改変体はプロトキシン活性化、及びポア形成効率に影響を及ぼす可能性があり、以って昆虫に中毒を引き起こす。より具体的には、ＤＩＧ−５変異体に改善した特性を付与するために、Ｎ末端をコードする遺伝子部分を除去する段階的な欠損が記載される。当該欠損では、ドメインＩ内のαへリックス１の全て、及びαへリックス２の全て又は一部が除去され、一方αへリックス３〜７の構造的完全性は維持される。従って、本願発明はＣｒｙタンパク質の有効性に対する改善に一部関連し、同改善は、より有効にポア形成するようにドメインＩのαへリックス成分を工学的に作り出すことにより生み出される。より具体的には、本願発明は、Ｃｒｙ１タンパク質のドメインＩ内にあるαへリックス１及び２に対して相同性を有する推定二次構造を備えた領域内で、Ｎ末端欠損を有するように設計される改善したＤＩＧ−５タンパク質に一部関連する。
【００２９】
ＤＩＧ−５毒素の殺虫特性を改善する欠損は、推定されたαへリックス２Ａが開始する前で始まり、αへリックス２Ｂ末端の後で終了し得るが、αへリックス３内まで及ばないのが好ましい。
【００３０】
Ｎ末端欠損変異体のコーディング配列を設計する際には、メチオニンをコードするＡＴＧ開始コドンが、欠損変異体を発現するように設計されたヌクレオチド配列の５’末端に挿入される。遺伝子組換え植物で使用するように設計される配列の場合、Varshavsky（1997年）の文献の「Ｎ末端規則」に従うのが有利となり得る。いくつかのアミノ酸がタンパク質のＮ末端残基として表現されると、真核細胞ではタンパク質が不安定化し、及び分解する原因となり得ることが教示される。例えば、酵母菌及び哺乳動物の細胞の観察から収集されたデータから、Ｎ末端の不安定化アミノ酸は、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｙ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｉ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、及びおそらくはＰであることが示唆される。タンパク質分解機構の詳細は生物間で若干異なる可能性があるが、上記で認められようなＮ末端不安定化アミノ酸の同一性は保存的であることから、同様の機構は植物細胞においても機能し得ることが示唆される。例えば、Worleyらの文献（1998年）では、植物の場合、Ｎ末端規則には塩基性及び芳香族性残基が含まれることを見出した。可能性として、本願Ｂ．ｔ．殺虫性タンパク質のαへリックス３の開始部近傍で植物プロテアーゼによるタンパク質分解切断が生ずると、不安定化Ｎ末端アミノ酸が露出し得ることが挙げられる。かかる処理は、切断されたタンパク質を速やかに分解するようにこれを標的とし得るが、またＢ．ｔ．の殺虫性タンパク質の蓄積を、昆虫を有効に防除するには不十分なレベルに制限し得る。従って、不安定化アミノ酸のうちの１つのアミノ酸で始まるＮ末端欠損変異体の場合、本出願者らは、翻訳開始メチオニンと不安定化アミノ酸との間にＧ（グリシン）アミノ酸を規定するコドンを付加することが好ましいと考える。
【００３１】
実施例２では、本発明に基づくＤＩＧ−５のアミノ末端欠損変異体の具体的な例が記載されている。
【００３２】
キメラ毒素。別のＣｒｙ毒素のプロトキシンセグメントと融合した、１つのＣｒｙ毒素のコア毒素ドメインを利用するキメラタンパク質が、これまでに報告されている。ＤＩＧ−５変異体には、コア毒素部分の末端部を通り過ぎたある点で異種性の（heterologous）プロトキシンセグメントと融合した、ＤＩＧ−５毒素のＮ末端毒素コア部分（完全長又は上記Ｎ末端欠損を有し得る）を含む毒素が含まれる。異種性のプロトキシンセグメントへの移行は、ほぼコア毒素／プロトキシン接合部において生じ得るが、又は別の方法では、天然のプロトキシンの一部分（コア毒素部分を過ぎて延長する）を、下流で生ずる異種性のプロトキシンへの移行と共に保持し得る。例として、本願発明のキメラ毒素は、ＤＩＧ−５の全毒素部分（アミノ酸１〜６５５）及び異種性のプロトキシン（アミノ酸６５５〜Ｃ末端）を有する。好ましい実施形態では、プロトキシンの異種性部分は、配列番号５に示すようにＣｒｙ１Ａｂデルタエンドトキシンに由来する。
【００３３】
配列番号４は、本発明のＤＩＧ−５変異体で有用なＣｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントの５４５個のアミノ酸配列を開示する。本願発明のキメラ毒素に含めるのに最も重要な、本プロトキシンセグメントの最後の約１００〜１５０個のアミノ酸に注目されたい。
【００３４】
プロテアーゼ感受性変異体。昆虫の腸内プロテアーゼは、一般的に食物タンパク質から必要とされるアミノ酸を摂取する際に昆虫を支援するように機能する。最も良く理解されている昆虫消化プロテアーゼはセリンプロテアーゼであり、特に鱗翅目の種で最も一般的なタイプとして出現する（Englemann及びGeraertsの文献（1980年））。甲虫目の昆虫は、鱗翅目の腸よりも中性から酸性の腸を有する。甲虫目の幼虫及び成虫の大部分、例えばコロラドハムシ（Colorado potato beetle）は、わずかに酸性の中腸を有し、及びシステインプロテアーゼが主要なタンパク質分解活性をもたらす（Wolfson及びMurdockの文献（1990年））。より正確には、Thie及びHousemanの文献（1990年）では、コロラドハムシ中のカテプシンＢ様及びカテプシンＨ様システインプロテアーゼ、及びカテプシンＤ様アスパルチルプロテアーゼを同定し、及び特徴付けを行った。Gillikinらの文献（1992年）では、ウエスタンコーンルートワームの幼虫の腸内タンパク質分解活性について特徴付けを行い、及び主にシステインプロテアーゼであることを見出した。米国特許第７２３０１６７号は、ウエスタンコーンルートワーム内にセリンプロテアーゼであるカテプシンＧが存在することを開示した。昆虫の腸内プロテアーゼは多様であり、及びその活性レベルは異なるが、これらは特定のＢ．ｔ．毒素に対する昆虫の感受性に影響を及ぼす可能性がある。
【００３５】
本発明の別の実施形態では、ある種の害虫の感受性を有する幼虫の中腸内におけるタンパク質処理に影響を及ぼすように、プロテアーゼ切断部位を所望の場所に工学的に作り出すことができる。そのようなプロテアーゼ切断部位は、化学的遺伝子合成法又はスプライスオーバーラップＰＣＲ法（splice overlap PCR）（Hortonらの文献、1989年）等の方法により導入され得る。例えば、感受性を有する幼虫の中腸内における、所望の欠損ポイントにおけるタンパク質処理に影響を及ぼすように、セリンプロテアーゼ認識配列を任意選択的にＣｒｙタンパク質構造内の特異的部位に挿入可能である。そのような方法で利用可能なセリンプロテアーゼには、鱗翅目の中腸セリンプロテアーゼ、例えばトリプシン、又はトリプシン様酵素、キモトリプシン、エラスターゼ等が含まれる（Christellerらの文献、1992年）。更に、未分画の幼虫中腸内プロテアーゼ調製物により生成されるＣｒｙタンパク質消化生成物を配列決定することにより、又は刷子縁膜小胞（brush border membrane vesicles）に結合することにより経験的に同定される欠損部位は、タンパク質の活性化に影響を及ぼすように工学的に作り出すことができる。遺伝子の欠損、又はプロテアーゼ切断部位の導入のいずれかによって生み出される改変されたＣｒｙタンパク質は、鱗翅目の有害生物、例えばアワノメイガ（Ostrinia nubilalis）、ナンセイアワノメイガ（Diatraea grandiosella）、アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）、タマナヤガ（Agrotis ipsilon）、ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）、シロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）、サトウキビメイガ（Diatraea saccharalis）、ロクサグロティス・アルビコスタ（Loxagrotis albicosta）、甲虫目の有害生物、例えばウエスタンコーンルートワーム、サザンコーンルートワーム、ノーザンコーンルートワーム（すなわち、Diabrotica種）及びその他の標的有害生物に対して改善した活性を有する。
【００３６】
甲虫目のセリンプロテアーゼ、例えばトリプシン、キモトリプシン、及びカテプシンＧ様プロテアーゼ、甲虫目のシステインプロテアーゼ、例えばカテプシン（Ｂ様、Ｌ様、Ｏ様、及びＫ様プロテアーゼ）（Koiwaらの文献（2000年）、及びBownらの文献（2004年））、甲虫目のメタロプロテアーゼ、例えばＡＤＡＭ１０（Ochoa-Campuzanoらの文献（2007年））、及び甲虫目のアスパラギン酸プロテアーゼ、例えばカテプシンＤ様及びＥ様、ペプシン、プラスメプシン、及びキモシンは、所望の処理部位に適切な認識配列を工学的に作り出すことにより、ある種の害虫の感受性を有する幼虫の中腸内で生じるＣｒｙタンパク質処理に影響を及ぼすように更に利用可能である。
【００３７】
かかるプロテアーゼ切断部位を導入するのに好ましい場所は、αへリックス２Ｂ及びαへリックス３の間のスペーサー領域内、例えば完全長ＤＩＧ−５タンパク質のアミノ酸１０９〜１１３の中にあり得る（配列番号２及び表１）。プロテアーゼ切断部位を導入するのに２番目に好ましい場所は、αへリックス３及びαへリックス４の間のスペーサー領域内（表１）、例えば、配列番号２の完全長ＤＩＧ−５タンパク質のアミノ酸１４４〜１４７の中にあり得る。遺伝子欠損、又はプロテアーゼ切断部位の導入のいずれかにより生み出される改変されたＣｒｙタンパク質は、ウエスタンコーンルートワーム、サザンコーンルートワーム、ノーザンコーンルートワーム等を含む、但し、これらに限定されない害虫に対して改善した活性を有する。
【００３８】
ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端残基を含むアミノ酸配列の決定を可能にする様々な技術が存在する。例えば、自動化エドマン分解法が、連続した方式で、１残基当たり９８％の正確性を有して最大３０個のアミノ酸残基のＮ末端アミノ酸配列について決定するのに利用可能である。更に、ポリペプチドのカルボキシ末端を含むアミノ酸の配列決定も可能である（Baileyらの文献（1992年）;米国特許第６０４６０５３号）。従って、いくつかの実施形態では、タンパク質分解処理により、例えば昆虫の腸から調製されたプロテアーゼにより活性化されたＢ．ｔ．Ｃｒｙタンパク質について特徴付けが可能であり、及び活性化された毒素断片のＮ末端又はＣ末端アミノ酸の同定が可能である。ＤＩＧ−５変異体は、昆虫、植物、又は微生物のプロテアーゼによるより大型の変異体タンパク質のタンパク質分解切断を可能にし、又は阻止するように、コーディング配列内の適切な位置でプロテアーゼ処理部位を導入又は除去することにより生み出されるが、同変異体は本発明の範囲に含まれる。かかる操作の最終的な結果として、インタクトな（完全長）毒素タンパク質と同等の、又はそれを凌駕する活性を有する毒素断片分子が生み出されると理解される。
【００３９】
ＤＩＧ−５毒素のドメイン。ＤＩＧ−５毒素の個別のドメイン（及びかかるドメインと９０、９５、又は９７％の同一性を有する変異体）は、その他のＣｒｙ毒素に由来するドメインと結合体（combinations）を形成するのに有用であり、新規毒素に有害生物毒性スペクトルの拡大、効力の改善、又はタンパク質の安定性の向上を付与すると期待される。ＤＩＧ−５タンパク質のドメインＩは、配列番号２のアミノ酸残基５５〜２８１を含む。ＤＩＧ−５タンパク質のドメインＩＩは、配列番号２のアミノ酸残基２８６〜４９９を含む。ＤＩＧ−５タンパク質のドメインＩＩＩは、配列番号２のアミノ酸残基５０９〜６５３を含む。ドメインスワッピング又はシャッフリングは、変更されたデルタエンドトキシンタンパク質を生み出す別の機構である。ドメインＩＩ及びＩＩＩは、デルタエンドトシンタンパク質間でスワッピングすることができ、その結果、殺有害生物活性又は標的スペクトルが改善したハイブリッド又はキメラ毒素が得られる。ドメインＩＩは受容体結合に関与しており、及びドメインＩＩＩは受容体タンパク質の特定のクラスと結合し、及びおそらくはオリゴマー型毒素プレポアの挿入に関与している。その他の毒素においていくつかのドメインＩＩＩ置換体が、シロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）に対して優れた毒性を発揮することが明らかにされ（de Maagdらの文献（1996年））、及びＣｒｙ毒素ドメインスワップの設計に関するガイダンスが存在する（Knightらの文献（2004年））。
【００４０】
組換えタンパク質作製方法、及びその殺有害生物活性試験法は当技術分野において周知されている（例えば、Naimovらの文献（2001年）、de Maagdらの文献（1996年）、Geらの文献（1991年）、Schnepfらの文献（1990年）、Rangらの文献（1999年）を参照）。Ｃｒｙ１Ａ及びＣｒｙ３Ａタンパク質に由来するドメインＩでは、膜中にポアを挿入し、形成する能力について研究されている。ドメインＩのαへリックス４及び５は膜挿入及びポア形成で重要な役割を演じており（Waltersらの文献、1993年、Gazitらの文献、1998年；Nunez-Valdezらの文献、2001年）、これ以外のその他のへリックスについては、傘の骨のように膜表面に接触することが提案された（Bravoらの文献（2007年）；Gazitらの文献（1998年））。
【００４１】
限られた数のアミノ酸について欠損、置換、又は付加を施すことにより構築されるＤＩＧ−５変異体。配列番号２のアミノ酸配列に対するアミノ酸の欠損、置換、及び付加は、連続した方式で容易に実施することができ、及びかかる変化が殺虫活性に及ぼす効果はバイオアッセイにより試験可能である。いくつかの変更が数において限定的であれば、かかる試験は理不尽な実験法を伴うことはない。本発明には、殺虫剤として活性なコア毒素変異体が含まれ（配列番号２のアミノ酸１〜６５５又は配列番号２のアミノ酸１１４〜６５５）、同変異体では最大１０個、最大１５個、又は最大２０個のアミノ酸の付加、欠損、又は置換が施された。
【００４２】
本発明には、配列番号２のアミノ酸の１〜６５５、又は配列番号２のアミノ酸の１１４〜６５５に対して、９０％、９５％、又は９７％同一であるコア毒素セグメントを有するＤＩＧ−５変異体が含まれる。
【００４３】
変異体は、ランダムな突然変異を起こさせることにより作製可能であり、又は変異体は設計可能である。設計による突然変異体の場合、生物学的活性を説明する、又は最終的に生物学的活性に関わる３次元構造の決定に関係する毒素の重要な領域においてアミノ酸の同一性が維持されるとき、天然毒素と類似した活性を有する変異体が生成する確率が高い。置換が保存的な場合にも、活性を維持する確率は高くなる。アミノ酸は下記のクラスに分類される：非極性、無電荷極性、塩基性、及び酸性。あるクラスのアミノ酸が同一タイプの別のアミノ酸に置き換わるような保存的な置換では、変異体の生物学的活性が実質的に変化する可能性はほとんどない。表２には各クラスに属するアミノ酸の例が記載されている。
【００４４】
【表２】
【００４５】
いくつかの事例では、非保存的置換も実施可能である。重要な要因として、これらの置換は毒素の生物学的活性を顕著に減じてはならないことが挙げられる。変異体には突然変異原性に起因してアミノ酸配列が異なるポリペプチドが含まれる。本発明に含まれる変異体タンパク質は生物学的に活性であり、すなわち天然タンパク質が持つ所望の生物学的活性を継続して有する、すなわち殺有害生物活性を維持する。
【００４６】
配列レベルで異なるが、同一の又は同様の全体的必須３次元構造、表面電荷分布等を維持する変異体タンパク質も設計可能である。例えば、米国特許第７０５８５１５号；Larsonらの文献（2002年）；Stemmerの文献（1994a、1994b、1995）；及びCrameriらの文献（1996a、1996b、1997）を参照されたい。
【００４７】
核酸。ＤＩＧ−５毒素をコードする単離された核酸は本発明の１つの態様である。これには、配列番号２及び配列番号５をコードする核酸、及びその相補体、並びに配列番号２の殺虫性変異体をコードするその他の核酸が含まれる。「単離された」とは、本出願者は、核酸分子が、人の手によってそれが存在する天然の環境から取り出され、及び異なる環境に配置されることを意味する。遺伝子コードの冗長性から、種々の異なるＤＮＡ配列が、本明細書に開示されるアミノ酸配列をコードすることができる。同一の又は本質的に同一の毒素をコードするそのような別のＤＮＡ配列を構築することは、当業者において周知されている。
【００４８】
遺伝子合成。本明細書に記載する、改善したＣｒｙタンパク質をコードする遺伝子は、当技術分野において周知の様々な方法により作製可能である。例えば、亜リン酸トリエステル及びホスホラミダイト化学（Caruthersらの文献、1987年）により、合成遺伝子セグメント及び合成遺伝子を作製することができ、及び商業的ベンダーが、オンデマンドで遺伝子合成を実施するのに利用可能である。完全長遺伝子は、例えば、制限断片のライゲーション、又は重複したオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ連鎖反応アッセンブリ（Stewart及びBurginの文献、2005年）による方法を含む様々な方法で構築可能である。更に、部位−特異的な末端オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅法により、末端遺伝子欠損体を作製することが可能である。
【００４９】
ＤＩＧ−５毒素をコードする核酸は、例えば、いくつかの商業的な供給業者のいずれかが現在実践している方法に基づく合成構築法により作製可能である（例えば、米国特許第７４８２１１９号Ｂ２を参照）。これらの遺伝子、又はその一部分若しくは変異体も、例えば遺伝子シンセサイザー、及び例えば米国特許第５３８０８３１号の設計法を使用することにより、合成的に構築可能である。或いは、合成遺伝子又は天然遺伝子の変形体は、点突然変異を作り出す標準的な分子生物学的技法を用いて容易に構築可能である。これらの遺伝子の断片も、標準的な手法に基づき、市販のエキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼを用いて作製可能である。例えば、Ｂａｌ３１等の酵素又は特定部位の突然変異誘発が、これらの遺伝子の末端部からヌクレオチドを計画的に切り取るのに利用可能である。また、様々な制限酵素を用いて、活性な毒素断片をコードする遺伝子断片も取得可能である。
【００５０】
ＤＩＧ−５毒素のアミノ酸配列を前提とした場合、コーディング配列は、意図した宿主が好むコドンを用いてコーディング配列を逆翻訳し、次に問題を引き起こす可能性のある配列を取り除くように、及び定期的な停止コドンを設定して非コーディングリーディングフレーム内の長いオープンコーディング配列を除去するように代替コドンを用いて配列を洗練させることにより、設計可能である。
【００５１】
配列同一性の定量。２つのアミノ酸配列、又は２つの核酸配列の同一性の割合（％）を求めるために、配列は最適比較目的で整列される。２配列間の同一性の割合（％）は、当該配列に共通する同一位置数の関数である（すなわち、同一性の割合（％）＝同一位置数／総位置数（例えば、重複した位置）×１００）。１つの実施形態では、２つの配列は長さが同一である。２配列間の同一性の割合（％）は、ギャップを許容する、又は許容しない下記の技法に類似した技法を用いて求めることができる。同一性の割合（％）を計算する際には、一般的に完全一致数が計測される。
【００５２】
２配列間の同一性の割合（％）は、数学的なアルゴリズムを用いて決定可能である。かかるアルゴリズムの非限定的な例として、Altschulらの文献（1990年）、及びKarlinとAltschulの文献（1990年）のアルゴリズム、KarlinとAltschulの文献（1993年）の改変されたアルゴリズム、及びＢＬＡＳＴＮとＢＬＡＳＴＸプログラムに組み込まれたアルゴリズムが挙げられる。ＢＬＡＳＴサーチは、核酸又はタンパク質データベース内の問い合わせ配列に対して、配列の相同性（類似性）を識別するのに好都合に用いられ得る。ＢＬＡＳＴＮサーチが、本発明において請求の対象とされる核酸分子に対して相同性を有する核酸配列を識別するために実施可能である（スコア＝１００、ワード長＝１２）。ＢＬＡＳＴＸサーチが、本発明において請求の対象とされる殺虫性タンパク質分子に対して相同性を有するアミノ酸配列を識別するために実施可能である（スコア＝５０、ワード長＝３）。
【００５３】
Altschulらの文献（1997年）のギャップ化ＢＬＡＳＴ法（Gapped BLAST）が、比較目的でギャップを有する整列を取得するのに利用可能であり、或いはＰＳＩ−Ｂｌａｓｔ法が、分子間の離れた関連性を検出する反復サーチを実施するのに利用可能である、Altschulらの文献（1997年）。ＢＬＡＳＴ、ギャップ化ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを使用する際には、各プログラムのデフォルトパラメータが利用可能である。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照されたい。
【００５４】
配列を比較するために用いられる数学的アルゴリズムの非限定的な例として、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Thompsonら、（1994年））が挙げられる。ＣｌｕｓｔａｌＷは配列を比較し、及びアミノ酸配列又はＤＮＡ配列全体を整列させ、こうしてアミノ酸配列又はヌクレオチド配列全体の配列保存性についてデータを提供することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムは、いくつかの市販ＤＮＡ／アミノ酸分析ソフトウェアパッケージ、例えばＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩプログラムスーツ（Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｓｕｉｔｅ）のＡＬＩＧＮＸモジュール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で用いられている。ＡＬＩＧＮＸを用いてアミノ酸配列を整列させる際には、２配列間のアミノ酸の類似性（コンセンサス）又は同一性の割合（％）を評価するために、ギャップオープンペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．１、及びｂｌｏｓｕｍ６３ｍｔ２比較マトリックスからなるデフォルト設定を好都合に使用することができる。ＡＬＩＧＮＸを用いてＤＮＡ配列を整列させる際には、２配列間の同一性の割合（％）を評価するために、ギャップオープンペナルティ１５、ギャップ延長ペナルティ６．６、及びｓｗｇａｐｄｎａｍｔ比較マトリックスからなるデフォルト設定を好都合に使用することができる。
【００５５】
配列を比較するために利用される数学的なアルゴリズムの別の非限定的な例として、Myers及びMillerの文献（1988年）のアルゴリズムが挙げられる。かかるアルゴリズムはｗＳＴＲＥＴＣＨＥＲプログラムに組み込まれており、同プログラムはｗＥＭＢＯＳＳ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部である（ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／より入手可能）。ｗＳＴＲＥＴＣＨＥＲは、線形空間を使用する古典的な動的プログラミングアルゴリズムの修正版を用いて２つの配列の最適グローバルアライメントを計算する。アライメントを計算するのに用いられる、置換マトリックス、ギャップ挿入ペナルティ、及びギャップ延長ペナルティが規定され得る。ヌクレオチド配列を比較するためにｗＳＴＲＥＴＣＨＥＲプログラムを利用する際には、ギャップオープンペナルティ１６及びギャップ延長ペナルティ４が、スコアリングマトリックスファイルＥＤＮＡＦＵＬＬと共に利用可能である。アミノ酸配列を比較するために利用する際には、ギャップオープンペナルティ１２及びギャップ延長ペナルティ２が、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスファイルと共に利用可能である。
【００５６】
配列を比較するために利用される数学的アルゴリズムの更なる非限定的な例として、Needleman及びWunschの文献（1970年）のアルゴリズムが挙げられ、同アルゴリズムは、配列アライメントソフトウェアパッケージ、ＧＡＰバージョン１０及びｗＮＥＥＤＬＥに組み込まれている（ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／）。ＧＡＰバージョン１０は、下記パラメータを用いて配列の同一性又は類似性を求めるのに利用可能である。核酸配列の場合、％同一性及び％類似性は、ギャップウェイト５０、及びレングスウェイト３、及びｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを用いて求められる。アミノ酸配列を比較する場合には、％同一性又は％類似性は、ギャップウェイト８、及びレングスウェイト２、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングプログラムを用いて求められる。
【００５７】
ｗＮＥＥＤＬＥは、２つのインプット配列を読み取り、配列全長にわたり最適なアライメント（ギャップを含む）を見出し、及びその最適なグローバル配列アライメントをファイルに書き出す。このアルゴリズムは、全ての可能性のあるアライメントを洗い出し、及びあらゆる可能性のある残基又はヌクレオチドのマッチに関する数値を含むa.スコアリングマトリックスを用いて最良のアライメントの選択を行う。ｗＮＥＥＤＬＥは、可能性のある最大スコアを有するアライメントを見つけ出すが、アライメントのスコアは、スコアリングマトリックスから取得されたマッチ数の合計から、整列された配列内のオープニングギャップ及び延長ギャップに起因するペナルティを差し引いたものに等しい。置換マトリックス、並びにギャップオープニング及び延長ペナルティはユーザーにより規定される。アミノ酸配列を比較する場合には、デフォルトギャップオープンペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックスが用いられる。ｗＮＥＥＤＬＥを用いてＤＮＡ配列を比較する場合には、ギャップオープンペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５、及びＥＤＮＡＦＵＬＬ比較マトリックスが用いられる。
【００５８】
同等のプログラム（Equivalent programs）も利用可能である。「同等のプログラム」とは、ＡＬＩＧＮＸ、ｗＮＥＥＤＬＥ、又はｗＳＴＲＥＴＣＨＥＲにより生成された対応するアライメントと比較したときに、対象となる任意の２つの配列について、ヌクレオチド又はアミノ酸残基のマッチ数が同一である、及び配列の同一性の割合（％）が同一であるアライメントを生成する任意の配列比較プログラムを指すように意図される。％同一性とは、報告された整列領域（長さ方向の任意のギャップを含む）全体にわたる、２つの配列間の同一マッチ（identical matches）の割合（％）であり、及び％類似性とは、報告された整列領域（長さ方向の任意のギャップを含む）全体にわたる、２つの配列間のマッチ数の割合（％）である。
【００５９】
アライメントは検証により手作業で実施することもできる。
【００６０】
組換え宿主。本願発明の毒素をコードする遺伝子は、多種多様な微生物宿主又は植物宿主に導入可能である。毒素遺伝子が発現すると、直接又は間接的に細胞内で殺有害生物性のタンパク質が産生および維持される。適当な微生物宿主、例えばシュードモナス属（Pseudomonas）を用いて、微生物を有害生物の環境に適用可能であり、その環境では、当該微生物は増殖し、及び摂取される。その結果、有害生物は防除される。或いは、毒素遺伝子の宿主となる微生物は、毒素活性を持続させる、及び細胞を安定化させる条件下で処理可能である。当該処理された細胞は毒性活性を保持し、次に標的とする有害生物の環境に適用可能である。
【００６１】
Ｂ．ｔ．毒素遺伝子が適当なベクターを介して微生物宿主内に導入され、及び前記宿主が生きた状態で環境に適用される場合には、しかるべき宿主微生物を用いることが必須である。１つ又は複数の対象作物の「フィトスフェア（phytosphere）」（葉面（phylloplane）、葉圏（phyllosphere）、根圏（rhizosphere）、及び／又は根面（rhizoplane））を占有することが公知の微生物宿主が選択される。これらの微生物は、特定の環境（作物及びその他の昆虫生息環境）において野生型土着微生物（wild-type indigenous microorganisms）と競合して打ち勝つことができ、ポリペプチド殺有害生物剤を発現する遺伝子の安定的な維持及び発現を実現し、及び望ましくは、環境的な分解及び不活性化から殺有害生物剤を保護する能力が高まるように選択される。
【００６２】
多数の微生物が、多種多様な重要作物の葉面（植物の葉の表面）及び／又は根圏（植物の根の周囲の土壌）に生息することが知られている。これらの微生物には細菌、藻類及び真菌類が含まれる。特に関心がもたれるのは細菌、例えば、シュードモナス（Pseudomonas）属、エルウィニア（Erwinia）属、セラチア（Serratia）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、キサントモナス（Xanthomonas）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、根粒菌（Rhizobium）属、シノリゾビウム（Sinorhizobium）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、メチロフィルス（Methylophilius）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アセトバクター（Acetobacter）属、乳酸桿菌（Lactobacillus）属、アルスロバクター（Arthrobacter）属、アゾトバクター（Azotobacter）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、及びアルカリゲネス（Alcaligenes）属；真菌、特に酵母菌、例えばサッカロマイセス（Saccharomyces）属、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、クリュイベロマイセス（Kluyveromyces）属、スポロボロマイセス（Sporobolomyces）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属、及びオーレオバシジウム（Aureobasidium）属などの微生物である。特に関心がもたれるのはフィトスフェア細菌種、例えばシュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）、ロドシュードモナス・スフェロイデス（Rhodopseudomonas spheroides）、キサントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）、シノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizobium meliloti）（以前はリゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti））、アルカリゲネス・ユートロファス（Alcaligenes eutrophus）、及びアゾトバクター・ヴィネランディ（Azotobacter vinelandii）；並びにフィトスフェア酵母種、例えばロードトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra）、Ｒ．グルティニス（R. glutinis）、Ｒ．マリナ（R. marina）、Ｒ．オーランティアカ（R. aurantiaca）、クリプトコッカス・アルビダス（Cryptococcus albidus）、Ｃ．ディフルエンス（C. diffluens）、Ｃ．ローレンティ（C. laurentii）、サッカロマイセス・ロゼイ（Saccharomyces rosei）、Ｓ．プレトリエンシス（S.pretoriensis）、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）、スポロボロマイセス・ロゼウス（Sporobolomyces roseus）、Ｓ．オドラス（S. odorus）、クリュイベロマイセス・ヴェロネ（Kluyveromyces veronae）、及びオーレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullulans）である。特に関心がもたれるのは色素性微生物である。
【００６３】
害虫を防除する方法
昆虫が、遺伝子組換え植物の発現、処方化されたタンパク質組成物（複数可）、スプレー可能なタンパク質組成物（複数可）、ベイトマトリックス（bait matrix）又はその他の送達システムを介して送達される有効量の毒素に接触した場合には、その結果は一般的に昆虫の死亡であり、又は昆虫は、昆虫にとって利用可能であるが毒素を生成するような食糧源を餌とすることができない。
【００６４】
本願タンパク質毒素は、様々な方法で標的昆虫と接触するように「適用」又は提供可能である。例えば、遺伝子組換え植物（当該タンパク質は当該植物によって産生される、及び当該植物内に存在する）が利用可能であり、当技術分野において周知されている。毒素遺伝子の発現も、当該植物の特定の組織、例えば根、葉等の中で選択的に実現可能である。これは、例えば組織特異的プロモーターを使用することにより実現可能である。スプレーオンアプリケーション（Spray-on applications）は別の事例であり、及び当技術分野において公知である。対象タンパク質は、所望の最終用途用として適切に処方化することができ、次いで寄生が発見される前、標的昆虫が発見された後、前後両方等において、保護の対象となる植物上及び／又は植物周辺／植物近傍にスプレー（又はさもなければ塗布）される。例えば、ベイト顆粒（bait granules）も利用可能で、及び当技術分野において公知である。
【００６５】
遺伝子組換え植物
本願タンパク質は、実際上あらゆるタイプの植物を害虫による損傷から保護するのに利用可能である。かかる植物の例としてほんの数例を挙げれば、トウモロコシ、ヒマワリ、ダイズ、ワタ、キャノーラ、コメ、モロコシ、コムギ、オオムギ、野菜類、観賞植物、コショウ（トウガラシを含む）、サトウダイコン、果物、及び芝等が挙げられる。植物を形質転換する方法は当技術分野において周知されており、及び説明目的で形質転換方法を実施例に記載する。
【００６６】
本願発明の好ましい実施形態は、本願殺虫性タンパク質又はその変異体をコードする遺伝子を用いた植物の形質転換である。形質転換植物は、当該形質転換植物細胞内に防除量の本願殺虫性タンパク質又はその変異体が存在することにより、標的害虫による攻撃に対して抵抗性を有する。Ｂ．ｔ．殺虫性毒素の殺虫特性をコードする遺伝物質を、特定の害虫が侵蝕する植物のゲノム内に組み込むことにより、成虫又は幼虫は当該飼料植物を消費した後に絶命する。非常に多くの単子葉植物及び双子葉植物のメンバーが形質転換されている。遺伝子組換え農業作物の他、果物、及び野菜類が市販対象となっている。かかる作物には、トウモロコシ、コメ、ダイズ、キャノーラ、ヒマワリ、アルファルファ、モロコシ、コムギ、ワタ、ピーナッツ、トマト、ジャガイモ等が含まれるが、但しこれらに限定されない。外来遺伝物質を植物細胞内に導入するための、並びに導入された遺伝子を安定的に維持し及び発現する植物を得るためのいくつかの技術が存在する。かかる技術には、微粒子上にコーティングされた遺伝物質を細胞内に直接加速するステップが含まれる（米国特許第４９４５０５０号、及び同第５１４１１３１号）。植物は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属技術を用いて形質転換することができ、米国特許第５１７７０１０号、同第５１０４３１０号、欧州特許出願第０１３１６２４号Ｂ１、同第１２０５１６号、同第１５９４１８号Ｂ１、同第１７６１１２号、米国特許第５１４９６４５号、同第５４６９９７６号、同第５４６４７６３号、同第４９４０８３８号、同第４６９３９７６号、欧州特許出願第１１６７１８号、同第２９０７９９号、同第３２０５００号、同第６０４６６２号、同第６２７７５２号、同願第０２６７１５９号、同第０２９２４３５号、米国特許第５２３１０１９号、同第５４６３１７４号、同第４７６２７８５号、同第５００４８６３号、及び同第５１５９１３５号を参照されたい。その他の形質転換技術としてＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）技術が挙げられ、米国特許第５３０２５２３号及び同許第５４６４７６５号を参照されたい。エレクトロポレーション技術も、植物を形質転換するために用いられており、国際公開第８７／０６６１４号、米国特許第５４７２８６９号、同第５３８４２５３号、国際公開第９２０９６９６号、及び同第９３２１３３５号を参照されたい。全てのこれら形質転換特許及び出版物を参照により援用する。植物を形質転換させる非常に多くの技術に加えて、外来遺伝子と接触する組織のタイプもやはり変化し得る。かかる組織として胚形成組織、カルス組織タイプＩ及びＩＩ、胚軸、分裂組織等が挙げられ、但しこれらに限定されない。ほとんど全ての植物組織が、当業者の技量範囲内の適当な技術を用いて、脱分化期間中に形質転換可能である。
【００６７】
ＤＩＧ−５毒素をコードする遺伝子は、上記で開示したように、当技術分野において周知の様々な技術を用いて植物細胞に挿入可能である。例えば、形質転換された微生物細胞の選択を可能にするマーカー、及び大腸菌（Escherichia coli）内で機能する複製系を含む多数のクローニングベクターが、高等植物に挿入するための外来遺伝子を調製及び改変するのに利用可能である。かかる操作として、使用目的上の要望に応じて、例えば突然変異の挿入、トランケーション、付加、又は置換を挙げることができる。ベクターは、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣシリーズ、Ｍ１３ｍｐシリーズ、ｐＡＣＹＣ１８４等を含む。従って、Ｃｒｙタンパク質又は変異体をコードする配列は、適当な制限部位においてベクター内に挿入可能である。得られたプラスミドは大腸菌（E. coli）の形質転換に用いられ、当該大腸菌の細胞は適当な栄養培地内で培養され、次いで使用可能な量のプラスミドが回収されるように捕集、及び溶解される。配列分析、制限断片分析、電気泳動、及びその他の生化学−分子生物学的手法が、分析法として一般的に実施される。各操作後には、用いられるＤＮＡ配列は切断可能、及び次のＤＮＡ配列に結合可能である。操作済みの各ＤＮＡ配列は、同一又は別のプラスミド内にクローン化可能である。
【００６８】
植物細胞を形質転換するためのＴ−ＤＮＡ−含有ベクターの使用について、欧州特許出願第１２０５１６号；Lee及びGelvinの文献（2008年）、Fraleyらの文献（1986年）、及びAnらの文献（1985年）において集中的に研究され、及び十分に記載されており、また当該分野で十分に確立されている。
【００６９】
挿入されたＤＮＡが植物ゲノムに組み込まれる（integrated）と、後続世代を通じて比較的安定である。植物細胞を形質転換させるために用いられるベクターは、除草剤又は抗生物質、例えば、とりわけビアラホス、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、又はハイグロマイシンに対する抵抗性を形質転換植物細胞に付与するタンパク質をコードする選択マーカー遺伝子を通常含む。個々に採用された選択マーカー遺伝子は、しかるべく形質転換細胞の選択を可能にするはずであり、また一方、挿入ＤＮＡを含まない細胞の成長は選択化合物により抑制される。
【００７０】
多数の技術が宿主植物細胞内にＤＮＡを挿入するのに利用可能である。そのような技術として、形質転換剤として用いられるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）又はアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）により送達されるＴ−ＤＮＡを用いた形質転換が挙げられる。更に、植物のプロトプラストと送達対象ＤＮＡを含むリポソームとの融合、ＤＮＡの直接的な注入、バイオリスティック形質転換（微粒子銃法）、又はエレクトロポレーション、並びにその他の可能な方法が利用可能である。
【００７１】
本願発明の好ましい実施形態では、植物は、タンパク質コーディング領域のコドンの利用が植物用に最適化された遺伝子を用いて形質転換される。例えば、本明細書により参照により援用される米国特許第５３８０８３１号を参照されたい。また、トランケーションされた毒素をコードする植物も、好都合に利用される。トランケーションされた毒素は、一般的に完全長毒素の約５５％〜約８０％をコードする。植物で使用するための合成Ｂ．ｔ．遺伝子を作製する方法は、当技術分野において公知である（Stewartの文献、2007年）。
【００７２】
形質転換技術を問わず、遺伝子は、植物プロモーターをベクターに含めることにより、植物細胞内でＢ．ｔ．殺虫性毒素遺伝子及び変異体を発現するように改造された遺伝子導入ベクターに組み込まれるのが好ましい。植物プロモーターに加えて、様々な起源に由来するプロモーターが、植物細胞内で外来遺伝子を発現するのに効果的に利用可能である。例えば、オクトピン合成酵素プロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター、マンノピン合成酵素プロモーター等の細菌起源のプロモーター；カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ及び１９Ｓプロモーター等のウイルス起源のプロモーター等が利用可能である。植物プロモーターとして、リブロース−１，６−ビスリン酸（ＲＵＢＰ）カルボキシラーゼ小サブユニット（ｓｓｕ）、β−コングリシニンプロモーター、ファゼオリンプロモーター、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ヒートショックプロモーター、ＡＤＦ（アクチン解重合因子）プロモーター、及び組織特異的プロモーターが挙げられ、但し、これらに限定されない。プロモーターは、転写効率を改善し得るしかるべきエンハンサー配列要素も含むことができる。典型的なエンハンサーとして、ＡＤＨ１−イントロン１、及びＡＤＨ１−イントロン６が挙げられ、但し、これらに限定されない。構成的プロモーターが利用可能である。構成的プロモーターは、ほぼ全ての細胞型において、及びほぼ全ての時間において連続的な遺伝子発現を指令する（例えば、アクチン、ユビキチン、ＣａＭＶ ３５Ｓ）。組織特異的プロモーターは、特異的細胞、又は葉若しくは種子等の組織型における遺伝子発現に関与し（例えば、ゼイン、オレオシン、ナピン、ＡＣＰ（アシルキャリアタンパク質））、及びこれらのプロモーターも利用可能である。植物のある生育段階において活性であり、並びに特定の植物組織及び器官において活性なプロモーターも利用可能である。かかるプロモーターの例として、根特異的、花粉特異的、胚特異的、トウモロコシ絹糸特異的、ワタ繊維特異的、種子の胚乳特異的、師部特異的なプロモーター等が挙げられ、但しこれらに限定されない。
【００７３】
特定の状況下では、誘導性プロモーターを利用するのが望ましい場合がある。誘導性プロモーターは、特異的シグナル、例えば：物理的刺激（例えば、ヒートショック遺伝子）；光（例えば、ＲＵＢＰカルボキシラーゼ）；ホルモン（例えば、グルココルチコイド）；抗生物質（例えば、テトラサイクリン）；代謝産物；及びストレス（例えば、干ばつ）に反応して遺伝子の発現に関与する。植物内で機能するその他の望ましい転写及び翻訳要素、例えば５’非翻訳リーダー配列、ＲＮＡ転写終結配列、及びポリアデニレート付加シグナル配列が利用可能である。非常に多くの植物−特異的遺伝子導入ベクターが当技術分野で公知である。
【００７４】
昆虫抵抗（ＩＲ）特性を備える遺伝子組換え作物が、北米全体にわたりトウモロコシ及びワタ植物で一般化しており、及びこれらの特性の利用がグローバルに拡大している。ＩＲ及び除草剤耐性（ＨＴ）特性を組み合わせた市販の遺伝子組換え作物が複数の種苗会社によって開発された。上記作物は、Ｂ．ｔ．殺虫性タンパク質により付与されるＩＲ特性と、ＨＴ特性、例えばスルホニルウレア、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、スルフォンアニリド等のアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）阻害剤、ビアラホス、グルフォシネート等のグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）阻害剤、メソトリオン、イソキサフルトール等の４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）阻害剤、グリホサート等の５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）阻害剤、及びハロキシホップ、キザロホップ、ジクロホップ等のアセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）阻害剤に対する耐性との組み合わせを含む。その他の例が公知であり、そのような例では、遺伝子組換えにより得られるタンパク質が、いくつかの除草剤化学薬品クラス（herbicide chemical classes）、例えばフェノキシ酸系除草剤、及びピリジルオキシアセテートオーキシン系除草剤（国際公開第２００７／０５３４８２号Ａ２を参照）、又はフェノキシ酸系除草剤、及びアリルオキシフェノキシプロピオネート系除草剤（国際公開第２００５１０７４３７号Ａ２、Ａ３を参照）に対する耐性を植物に付与する。ＩＲ特性により複数の有害生物問題を制御する能力を持たせることは有益な市販製品概念であり、及び昆虫防除特性及び雑草防除特性が同一の植物内で組み合わされる場合には、かかる製品概念の利便性が強化される。更に、単一の植物においてＢ．ｔ．殺虫性タンパク質、例えば本願発明のタンパク質等により付与されるＩＲ特性と、１つ又は複数の追加のＨＴ特性、例えば上記特性等を組み合わることに加えて、１つ又は複数の追加のインプット特性（例えば、Ｂ．ｔ．誘導タンパク質又はその他の殺虫性タンパク質により付与されるその他の昆虫抵抗性、ＲＮＡｉ等の機構により付与される昆虫抵抗性、疾患抵抗性、ストレス耐性、改善した窒素利用能等）又はアウトプット特性（例えば、高油脂含有量、健康油脂組成物、栄養上の改善等）をプラスすることにより、価値が高められる可能性がある。かかる組み合わせは、従来方式の育種（育種スタック（bleeding stack））を通じて、又はこれを併用した複数遺伝子の同時導入に関係する新規形質転換事象（分子スタック（molecular stack））を通じて得ることができる。利益としては、作物における害虫管理能力及び改善した雑草防除が挙げられ、生産者及び／又は消費者には二次的な利益がもたらされる。従って、本願発明は、農学的な問題がいくらあろうとも、柔軟かつ費用効果的に制御する能力を有する改善した作物品質の完全農学パッケージ（complete agronomic package）を提供するように、その他の特性と併用して利用可能である。
【００７５】
標的有害生物
本発明のＤＩＧ−５毒素は、害虫防除で使用するのに特に適する。甲虫類（Coleopterans）は、毎年多大な損害を引き起こす農学上、植栽上、及び生活上の有害生物のうちの１つの重要な群である。この昆虫目には葉−摂食性及び根−摂食性の幼虫及び成虫が含まれ、下記のものが挙げられる：ヒゲナガゾウムシ（Anthribidae）科、マメゾウムシ（Bruchidae）科、及びゾウムシ（Curculionidae）科に由来するゾウムシ（weevil）［例えば、ワタミハナゾウムシ（Anthonomus grandis Boheman）、イネミズゾウムシ（Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel）、グラナリアコクゾウムシ（Sitophilus grananus Linnaeus）、コクゾウムシ（Sitophilus oryzae Linnaeus）、クローバリーフゾウムシ（Hypera punctata Fabricius）、及びメイズビルバグ（Sphenophorus maidis Chittenden）］；ハムシ（Chrysomelidae）科のノミトビヨロイムシ、ウリハムシ、ルートワーム、ハムシ、コロラドハムシ、及び潜葉性昆虫［例えば、コロラドハムシ（Leptinotarsa decemlineata Say）、ウエスタンコーンルートワーム（Diabrotica virgifera virgifera LeConte）、ノーザンコーンルートワーム（Diabrotica barben Smith & Lawrence）；サザンコーンルートワーム（Diabrotica undecimpunctata howardi Barber）、コーンノミトビヨロイムシ（Chaetocnema pulicara Melsheimer）、十字花科植物ノミトビヨロイムシ（crucifer flea beetle）（Phyllotreta cruciferae Goeze）、グレープコラスピス（Colaspis brunnea Fabricius）、シリアルリーフビートル（Oulema melanopus Linnaeus）、及びサンフラワービートル（Zygogramma exclamationis Fabricius）］；テントウムシ（Coccinellidae）科に由来する甲虫［例えば、インゲンテントウ（Epilachna varivestis Mulsant）］；コガネムシ科（Scarabaeidae）の甲虫（chafers）及びコガネムシ科に由来するその他の甲虫［例えば、マメコガネ（Popillia japonica Newman）、ノーザンマスクドコガネムシ（コガネムシ類幼虫（white grub）、Cyclocephala borealis Arrow）、サザンマスクドコガネムシ（コガネムシ類幼虫、Cyclocephala immaculata Olivier）、欧州のコガネムシ科の甲虫（Rhizotrogus majalis Razoumowsky）、コガネムシ類幼虫（Phyllophaga crinita Burmeister）、及びキャロットビートル（Ligyrus gibbosus De Geer）］；カツオブシムシ（Dermestidae）科に由来するカツオブシムシ（carpet beetles）；コメツキムシ科（Elateridae）に由来するハリガネムシ（wireworms）［例えば、メラノタス（Melanotus）種、コノデルス（Conoderus）種、リモニウス（Limonius）種、アグリオテス（Agriotes）種、クテニセラ（Ctenicera）種、アエオラス（Aeolus）種）];キクイムシ（Scolytidae）科に由来する樹皮下甲虫（bark beetles）、及びゴミムシダマシ（Tenebrionidae）科に由来する甲虫（例えば、エレオデス（Eleodes）種）。上記掲載の任意の属（及びその他）も、一般的に本願発明の一環として標的対象となり得る。上記属のいずれかに属する更なる昆虫も（標的として）、本発明の範囲内に含まれる。
【００７６】
鱗翅類は、毎年多大な損害を引き起こす農学上、植栽上、及び生活上の有害生物のうちの別の重要な群である。この昆虫目には葉−摂食性及び根−摂食性の幼虫及び成虫が含まれる。鱗翅類の害虫として下記のものが挙げられるが、但しこれらに限定されない：アコロイア・グリセラ（Achoroia grisella）、アクレリス・グロベラナ（Acleris gloverana）、アクレリス・バリアナ（Acleris variana）、コカクモンハマキ（Adoxophyes orana）、タマナヤガ（Agrotis ipsilon）（black cutworm）、アラバマ・アルギラセア（Alabama argillacea）、アルソフィラ・ポメタリア（Alsophila pometaria）、クルミマダラメイガ（Amyelois transitella）、スジコナマダラメイガ（Anagasta kuehniella）、モモキバガ（Anarsia lineatella）、アニソタ・セナトリア（Anisota senatoria）、サクサン（Antheraea pernyi）、大豆夜蛾（Anticarsia gemmatalis）、アルチプス（Archips）種、アルギロテニア（Argyrotaenia）種、アセティス・ミンダラ（Athetis mindara）、カイコガ（Bombyx mori）、ブッカラトリックス・スルベリエラ（Bucculatrix thurberiella）、スジマダラメイガ（Cadra cautella）、コリストネウラ（Choristoneur）種、コチルス・ホスペス（Cochylls hospes）、オオアメリカモンキチョウ（Colias eurytheme）、ガイマイツヅリガ（Corcyra cephalonica）、サイディア・ラティフェレアナス（Cydia latiferreanus）、コドリンガ（Cydia pomonella）、ダタナ・インテゲリマ（Datana integerrima）、デンドロリマス・シベリカス（Dendrolimus sibericus）、デスミア・フェネラリス（Desmia feneralis）、ディアファニア・ヒアリナタ（Diaphania hyalinata）、アメリカウリノメイガ（Diaphania nitidalis）、ナンセイアワノメイガ（Diatraea grandiosella）（southwestern corn borer））、サトウキビメイガ（Diatraea saccharalis）、ニレシャクトリムシ（Ennomos subsignaria）、エオレウマ・ロフティニ（Eoreuma loftini）、チャマダラメイガ（Esphestia elutella）、エラニス・ティラリア（Erannis tilaria）、キシタゴマダラヒトリ（Estigmene acrea）、ユーリア・サルブリコラ（Eulia salubricola）、ユーポコエリア・アンビグエラ（Eupocoellia ambiguella）、ブドウホソハマキ（Eupoecilia ambiguella）、モンシロドクガ（Euproctis chrysorrhoea）、ユーゾア・メソリア（Euxoa messoria）、ハチノスツヅリガ（Galleria mellonella）、ナシヒメシンクイ（Grapholita molesta）、アメリカブドウホソクロバ（Harrisina americana）、ヘリコベルパ・サブフレクサ（Helicoverpa subflexa）、アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）（corn earworm）、ニセアメリカタバコガ（Heliothis virescens）、ヘミロイカ・オリビアエ（Hemileuca oliviae）、ヒマワリヘッドモス（Homoeosoma electellum）、アメリカシロヒトリ（Hyphantia cunea）、ケイフェリア・リコペルシセラ（Keiferia lycopersicella）、ランブディナ・フィセラリア・フィセラリア（Lambdina fiscellaria fiscellaria）、エダシャクガ（Lambdina fiscellaria lugubrosa）、ヤナギドクガ（Leucoma salicis）、ホソバヒメハマキ（Lobesia botrana）、ロクサグロティス・アルビコスタ（Loxagrotis albicosta）（western bean cutworm）、ヘリキスジノメイガ（Loxostege sticticalis）、マイマイガ（Lymantria dispar）、マカラ・チリサリス（Macalla thyrisalis）、マラコソーマ（Malacosoma）種、ヨトウガ（Mamestra brassicae）、ベルタアワヨトウ（Mamestra configurata）、トマトスズメガ（Manduca quinquemaculata）、タバコスズメガ（Manduca sexta）、マメノメイガ（Maruca testulalis）、メランクラ・ピクタ（Melanchra picta）、ナミスジフユナミシャク（Operophtera brumata）、ドクガ（Orgyia）種、アワノメイガ（Ostrinia nubilalis）（European corn borer）、パレアクリタ・ベルナタ（Paleacrita vernata）、パピアペマ・ネブリス（Papiapema nebris）（common stalk borer）、クレスフォンテスタスキアゲハ（Papilio cresphontes）、ワタアカミムシ（Pectinophora gossypiella）、フリガニジア・カリフォルニカ（Phryganidia californica）、フィロノルクテル・ブランカルデラ（Phyllonorycter blancardella）、エゾスジグロシロチョウ（Pieris napi）、モンシロチョウ（Pieris rapae）、プラチペナ・スカブラ（Plathypena scabra）、プラチノタ・フロウエンダナ（Platynota flouendana）、プラチノタ・スタルタナ（Platynota stultana）、プラチプチリア・カルデュイダクチラ（Platyptilia carduidactyla）、ノシメマダラメイガ（Plodia interpunctella）、コナガ（Plutella xylostella）（diamondback moth）、ポンティア・プロトディス（Pontia protodice）、シューダレチア・ユニパンクタ（Pseudaletia unipuncta）（armyworm）、シュードプルシア・インクルデンス（Pseudoplasia includens）、サブロデス・アエグロタタ（Sabulodes aegrotata）、シズラ・コンシナ（Schizura concinna）、バクガ（Sitotroga cerealella）、リンゴシロヒメハマキ（Spilonta ocellana）、ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）（fall armyworm）、シロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua）（beet armyworm）、サウルンストポエア・ピチオカンパ（Thaurnstopoea pityocampa）、エンソラ・ビセリエラ（Ensola bisselliella）、イラクサギンウワバ（Trichoplusia hi）、ウデア・ルビガリス（Udea rubigalis）、キシロマイゲス・クリアイリス（Xylomyges curiails）、及びヨーロッパリンゴスガ（Yponomeuta padella）。
【００７７】
作物の甲虫目有害生物を防除するために、ＤＩＧ−５毒素を使用することが検討されている。いくつかの実施形態では、Ｃｒｙタンパク質が、例えば、ジュウイチホシウリハムシ（Diabrotica undecimpunctata howardi）（southern corn rootworm）、ジアブロティカ・ロンギコルニス・バルベリ（Diabrotica longicornis barberi）（northern corn rootworm）、及びディアブロティカ・ビルジフェラ（Diabrotica virgifera）（western corn rootworm）等のルートワーム、並びにシクロセファラ・ボレアリス（Cyclocephala borealis）（northern masked chafer）、シクロセファラ・イムマキュラータ（Cyclocephala immaculate）（southern masked chafer）、及びマメコガネ（Popillia japonica）（Japanese beetle）の幼虫等の地虫を含む、但しこれらに限定されない害虫を防除するために商業的に利用可能である。
【００７８】
ネコブセンチュウ（Meloidogyne icognita）及びダイズシストセンチュウ（Heterodera glycines）を含む、但しこれらに限定されない寄生線虫類を防除するために、ＤＩＧ−５毒素を使用することも検討されている。
【００７９】
ＤＩＧ−５毒素の抗体検出
抗毒素抗体。本明細書で開示される毒素に対する、又は同等の毒素に対する、又はこれらの毒素の断片に対する抗体は、当技術分野において標準的な手法を用いて容易に調製可能である。かかる抗体は、ＤＩＧ−５毒素の有無を検出するのに有用である。
【００８０】
Ｂ．ｔ．殺虫性毒素が単離されると、毒素に特異的な抗体が、当技術分野において周知の従来法により作り出すことができる。最適な宿主に数週間又は数ヶ月の期間反復して注射すると、免疫反応が誘発され、その結果相当の抗Ｂ．ｔ．毒素血清力価が得られる。好ましい宿主は哺乳類であり、及び更に大いに好ましい種はウサギ、ヤギ、ヒツジ、及びマウスである。かかる免疫動物から採取された血液は、Ｂ．ｔ．殺虫性毒素と反応する抗血清（ポリクロナール抗体）を得るために、確立された方法により処理され得る。次に抗血清は、当技術分野において公知の技術に基づき、毒素に吸着させることによりアフィニティー精製され得る。アフィニティー精製された抗血清は、当技術分野において公知の手法を用いて、抗血清中の免疫グロブリン分画を単離することにより更に精製され得る。得られた試料は、Ｂ．ｔ．殺虫性毒素と反応する免疫グロブリンからなる不均一性の集団である。
【００８１】
抗Ｂ．ｔ．毒素抗体は、免疫原性担体に結合したＢ．ｔ．殺虫性毒素の合成ペプチド断片から構成される半−合成免疫原を調製することによっても生成可能である。ペプチド断片の作製に有用な非常に多くのスキーム及び装置が、当技術分野において周知されている。多くの適する免疫原性担体、例えばウシ血清アルブミン又はスカシガイヘモシアニンも、免疫原とキャリアタンパク質とを連結させる技法と同様に、当技術分野において周知されている。半−合成免疫原が構築されれば、Ｂ．ｔ．殺虫性毒素断片に特異的な抗体を作製する手法は、天然のＢ．ｔ．毒素と反応する抗体を作製するのに用いられる手法と同じである。
【００８２】
抗Ｂ．ｔ．毒素モノクロナール抗体（ＭＡｂｓ）は、精製Ｂ．ｔ．殺虫性毒素を用いて容易に調製される。ＭＡｂｓを作製する方法は１５年にわたり実践されており、当業者に周知されている。アジュバント中の精製Ｂ．ｔ．殺虫性毒素を反復して腹腔内又は皮下注射すると、ほとんどの動物で免疫反応が誘発される。過免疫性Ｂリンパ球が動物から取り出され、及び無期限に培養される能力を有する適当な融合パートナー細胞株と融合される。Ｂリンパ球は過免疫状態となり得、及びＭＡｂｓの産生に利用可能な好ましい動物は哺乳動物である。より好ましい動物はラット及びマウスであり、最も好ましくはＢＡＬＢ／ｃマウス系統である。
【００８３】
非常に多くの哺乳動物細胞系統が、ハイブリドーマを産生するための適する融合パートナーとなる。多くのかかる系統が、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）、及び市販供給業者から入手可能である。好ましい融合パートナー細胞系統はマウスミエローマに由来し、及びＨＬ−１（登録商標）フレンドリーミエローマ−６５３細胞系統（Ｖｅｎｔｒｅｘ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＭＥ）が最も好ましい。融合したら、得られたハイブリドーマは、１〜２週間選択的増殖培地で培養される。２つの周知された選択システムが、混合ハイブリドーマ培養物から非融合ミエローマ細胞又はミエローマ細胞間融合体を除去するのに利用可能である。選択システムを選択する場合、それは免疫対象マウス系統、及び用いられるミエローマ融合パートナーに依存する。Taggart及びSamloffの文献（1983年）が記載するＡＡＴ選択システムが利用可能である。但し、上記の好ましいマウス系統及び融合パートナーと適合性を有することから、Littlefieldの文献（1964年）が記載するＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択システムが好ましい。次に、処理済み成長培地が、免疫特異的ＭＡｂ分泌についてふるい分けされる。酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）法がこの目的に最適であるが、大容量スクリーニング用に改変されたラジオイムノアッセイ法も許容される。相当数の無関係の又はあまり望ましくない培養物を連続的に漸減するように設計された複数回のふるい分けを実施することができる。Ｂ．ｔ．殺虫性毒素と反応するＭＡｂｓを分泌する培養物について、既知のＢ．ｔ．殺虫性毒素との交差反応性に関してふるい分けすることができる。好ましいＢ．ｔ．殺虫性毒素と選択的に結合するＭＡｂｓは、商業的に入手可能な分析法を用いてアイソタイプ化され得る。好ましいＭＡｂｓはＩｇＧクラスに属するものであり、更に大いに好ましいＭＡｂｓはＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａサブアイソタイプに属するものである。
【００８４】
好ましいＭＡｂｓを分泌するハイブリドーマ培養物は、単クローン性及び安定性を確立するために数回サブ−クローン化され得る。真核性、非付着性細胞培養物をサブ−クローニングするための周知の方法として、限界希釈法、ソフトアガロース法、及び蛍光活性化細胞選別法が挙げられる。各サブクローニングの後に、得られた培養物は、安定で好ましいＭＡｂ分泌培養物が確立されたことを保証するために、好ましくは抗体分泌及びアイソタイプについて再分析される。
【００８５】
抗Ｂ．ｔ．毒素抗体は、本発明において請求の対象とされるＢ．ｔ．殺虫性毒素及びその変異体又は断片を検出する様々な方法で有用である。レポート基（reporting group）で標識された抗体が、様々な環境で抗原の有無を識別するのに利用可能であることは周知されている。放射性同位体で標識された抗体が、ラジオイムノアッセイ法において何十年も、様々な生物体液中の抗原の有無を極めて高精度、高感度で識別するのに用いられてきた。より最近では、酵素標識抗体が、放射性標識抗体に対する代用品としてＥＬＩＳＡ分析法で用いられるようになった。更に、本発明のＢ．ｔ．殺虫性毒素と免疫反応する抗体は、ポリスチレンウェル又は粒子等の固定化物質に結合することができ、及び試験サンプル中にＢ．ｔ．毒素が存在するかどうか調べるために免疫測定法で利用可能である。
【００８６】
プローブを用いた検出
本願発明の毒素及び遺伝子を同定する更なる方法は、オリゴヌクレオチドプローブの使用による。そのようなプローブは検出可能なヌクレオチド配列である。それらの配列は、適当な放射性標識により検出可能となり、又は米国特許第６２６８１３２号に記載するように本質的に蛍光性とすることができる。当技術分野において周知のように、プローブ分子及び核酸サンプルが２つの分子間で強い塩基対結合を形成することによりハイブリダイズする場合には、当該プローブ及びサンプルは本質的配列相同性を有すると合理的に仮定することができる。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、例えばKeller及びManakの文献（1993年）に記載するように、当技術分野において周知の技術によりストリンジェントな条件（stringent conditions）下で実施される。プローブ検出により、ハイブリダイゼーションが生じたかどうか公知の方式で判定する手段が提供される。かかるプローブ分析により、本願発明の毒素をコードする遺伝子を同定する迅速な方法が提供される。本発明に基づきプローブとして用いられるヌクレオチドセグメントは、ＤＮＡシンセサイザー及び標準的な手法を用いて合成可能である。これらのヌクレオチド配列は、本願発明の遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマーとしても利用可能である。
【００８７】
ハイブリダイゼーション
分子生物学の当業者にとって周知であるように、２つの核酸の類似性は、それらのハイブリダイズする傾向により特徴付けることができる。本明細書で用いる場合、用語「ストリンジェントな条件」又は「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブが、その他の配列よりも検出可能なほどに高いレベル（例えば、少なくともバックグラウンドに対して２倍）でその標的配列にハイブリダイズする（アニールする）ような条件を意味するように意図されている。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、また状況が異なれば異なる。ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件の厳密性（stringency）を制御することにより、プローブに対して１００％相補的な標的配列が識別可能である（相同プロービング）。或いは、ストリンジェントな条件は、類似性がより低くても検出されるように（非相同プロービング）、配列中にある程度のミスマッチがあってもそれを許容するように調節可能である。一般的に、プローブは、長さ約１０００ヌクレオチド未満、好ましくは長さ５００ヌクレオチド未満である。
【００８８】
一般的に、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．３で、塩濃度が約１．５Ｍ未満のＮａイオン、一般的に約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（又はその他の塩）、及び温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）の場合少なくとも約３０℃、また長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドを上回る）の場合少なくとも約６０℃の条件である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミド等の不安定化剤を添加することによっても実現可能である。厳密性の低い典型的な条件には、３７℃において３０％〜３５％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）からなるバッファー溶液を用いて行われるハイブリダイゼーション、及び５０℃〜５５℃において１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０ＭのＮａＣｌ／０．３Ｍのクエン酸三ナトリウム）中で行われる洗浄が含まれる。厳密性が中程度の典型的な条件には、３７℃において４０％〜４５％のホルムアミド、１．０ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ中で行われるハイブリダイゼーション、及び５５℃〜６０℃において０．５×〜１×ＳＳＣ中で行われる洗浄が含まれる。厳密性が高い典型的な条件には、３７℃において５０％ホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ中で行われるハイブリダイゼーション、及び６０℃〜６５℃において０．１×ＳＳＣ中で行われる洗浄が含まれる。任意選択的に、洗浄バッファーは約０．１％〜約１％のＳＤＳを含み得る。ハイブリダイゼーション期間は、一般的に約２４時間未満、通常約４〜約１２時間である。
【００８９】
特異性は、一般的にハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、重要な要因として最終洗浄溶液のイオン強度及び温度が挙げられる。ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの場合、熱融点（Ｔｍ）とは、相補的標的配列の５０％が完全にマッチしたプローブとハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度及びｐＨにおける）である。Ｔｍはミスマッチ１％毎に約１℃低下する。従って、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション条件、及び／又は洗浄条件は、所望の同一性を有する配列のアニーリングを促進するように調節可能である。例えば、＞９０％の同一性を有する配列を得ようとする場合、Ｔｍは１０℃低下し得る。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度及びｐＨにおいて、特定の配列及びその相補体に関するＴｍよりも約５℃低くなるように選択される。しかし、厳密性が高い条件では、Ｔｍよりも１℃、２℃、３℃、又は４℃低い温度で行われるハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができる。厳密性が中程度の条件では、Ｔｍよりも６℃、７℃、８℃、９℃、又は１０℃低い温度で行われるハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができ、及び厳密性が低い条件では、Ｔｍよりも１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、又は２０℃低い温度で行われるハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を利用することができる。
【００９０】
Ｔｍ（℃単位）は、実験的に求めることができ、又は計算により近似することができる。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの場合、ＴｍはMeinkoth及びWahl（1984年）の式から近似することができる。
Ｔｍ（℃）＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ
式中、Ｍは一価のカチオンのモル濃度、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシン及びシトシンヌクレオチドの割合（％）、％ホルムアミドはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合（％）、及びＬは塩基対中のハイブリッドの長さである。
【００９１】
或いは、Ｔｍは下記の式により記載される（Beltzらの文献、1983年）。
Ｔｍ（℃）＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ホルムアミド）−６００／Ｌ
式中、［Ｎａ＋］はナトリウムイオンのモル濃度、％ＧＣは、ＤＮＡ中のグアノシン及びシトシンヌクレオチドの割合（％）、％ホルムアミドはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合（％）、及びＬは塩基対中のハイブリッドの長さである。
【００９２】
上記公式、ハイブリダイゼーション及び洗浄組成物、並びに所望のＴｍを用いることにより、当業者は、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄溶液の厳密性に生じるそれぞれの変化は自ずと説明されることを理解するであろう。所望のレベルのミスマッチにおいて、Ｔｍが４５℃（水溶液）又は３２℃（ホルムアミド溶液）未満となる場合には、より高い温度が利用可能なようにＳＳＣ濃度を高めるのが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な指針がTijssenの文献（1993年）及びAusubelらの文献（1995年）に記載されている。Sambrookらの文献（1989年）も参照されたい。
【００９３】
放射性標識された遺伝子特異的プローブを用いたサザンブロット上での固定化ＤＮＡのハイブリダイゼーションは、標準的な方法により実施可能である（Sambrookらの上記文献）。ポリヌクレオチドプローブを標識するのに用いられる放射性同位体として、３２Ｐ、３３Ｐ、１４Ｃ、又は３Ｈを挙げることができる。放射性同位体のポリヌクレオチドプローブ分子への組み込みは、分子生物学分野の当業者にとって周知の任意のいくつかの方法により実施可能である。（例えば、Sambrookらの上記文献を参照されたい）。一般的に、ハイブリダイゼーション及び後続する洗浄は、請求の対象とされる毒素をコードする遺伝子と相同性を有する標的配列の検出を可能にするストリンジェントな条件下で実施される。二本鎖ＤＮＡ遺伝子プローブの場合、ハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＰＥ、５×デンハート液、０．１％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬの変性ＤＮＡ中で、ＤＮＡハイブリッドのＴｍよりも２０〜２５℃低い温度において、オーバーナイトで実施される［２０×ＳＳＰＥは３ＭのＮａＣｌ、０．２ＭのＮａＨＰＯ４、及び０．０２ＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩）；１００×デンハート液は２０ｇｍ／Ｌのポリビニルピロリドン、２０ｇｍ／Ｌのフィコールタイプ４００及び２０ｇｍ／Ｌのウシ血清アルブミン（フラクションＶ）である］。
【００９４】
洗浄は、一般的に下記のように実施され得る。
１×ＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳ中で、室温において１５分間、２回（厳密性が低い洗浄）。
０．２×ＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳ中で、Ｔｍ−２０℃において１５分間、１回（厳密性が中程度の洗浄）。
【００９５】
オリゴヌクレオチドプローブの場合、ハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＰＥ、５×デンハート液、０．１％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬの変性ＤＮＡ中で、ハイブリッドのＴｍよりも１０〜２０℃低い温度において、オーバーナイトで実施される。オリゴヌクレオチドプローブに関するＴｍは、下記の式により求めることができる（Suggsらの文献、1981年）。
Ｔｍ（℃）＝２（Ｔ／Ａ塩基対の数）＋４（Ｇ／Ｃ塩基対の数）
【００９６】
洗浄は、一般的に下記のように実施され得る。
１×ＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳ中で、室温において１５分間、２回（厳密性が低い洗浄）。
１×ＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳ中で、ハイブリダイゼーション温度において１５分間、１回（厳密性が中程度の洗浄）。
【００９７】
ハイブリダイゼーション用のプローブ分子、及びプローブ及び標的分子間で形成されるハイブリッド分子は、放射性標識以外の手段により検出可能にすることができる。かかる代替法は、本発明の範囲内であるように意図される。
【００９８】
本明細書に記載する実施例及び実施形態は説明目的に限られること、並びにそれらに照らして様々な変形形態又は変更形態が当業者にとって示唆され、及び本出願の精神と意図、及び添付の特許請求の範囲内に含まれることと理解されるはずである。
【実施例１】
【００９９】
ＤＩＧ−５毒素をコードする遺伝子の単離
本明細書でＤＩＧ−５と呼ぶ殺虫性のＣｒｙタンパク質をコードする核酸は、Ｂ．ｔ．系統ＰＳ１９８Ｑ７から単離された。テンプレートとしてＰＳ１９８Ｑ７ゲノムＤＮＡを用いるＰＣＲ反応で、フォワード及びリバースプライマーとして用いられるデジェネレートプライマーは、Ｂ．ｔ．殺虫性毒素の各クラスの多重配列アラインメント（multiple sequence alignments）に基づき設計された。フォワードプライマーは配列番号１の塩基７６６〜７９０に対応し、及びリバースプライマーは配列番号１の塩基２２００〜２２２３の相補体に対応する。この一対のプライマーは、配列番号１のヌクレオチド７６６〜２２２３に対応する１４５８ｂｐからなる断片を増幅するのに用いられた。この配列は、ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）から改変された方法を用いてゲノム歩行法（genome walking）を開始するためにアンカーポイントとして用いられた。ＤＩＧ−５コーディング領域にまたがる断片の核酸配列が決定された。配列番号１は完全長ＤＩＧ−５タンパク質をコードする３４４７ｂｐヌクレオチド配列である。配列番号２は、配列番号１から推定された完全長ＤＩＧ−５タンパク質のアミノ酸配列である。
【実施例２】
【０１００】
ＤＩＧ−５に由来するドメインＩαへリックスの欠損
ＤＩＧ−５毒素の殺虫性特性を改善するために、連続的、段階的に欠損が作り出され、各欠損はＤＩＧ−５タンパク質のＮ末端部分を取り除く。当該欠損は、ドメインＩ内のαへリックス１の一部又は全て、及びαへリックス２の一部又は全てを取り除くが、一方、αへリックス３〜αへリックス７の構造的な完全性は維持される。
【０１０１】
欠損は下記のように設計される。この実施例では、７１個の特定の変異体を含む設計原理を説明するために、完全長ＤＩＧ−５タンパク質をコードする完全長キメラＤＮＡ配列（例えば、それぞれ配列番号２及び配列番号１）を利用する。また同実施例では、更なる７１個の特定の変異体を提供するために、配列番号５のキメラ配列（Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントと融合したＤＩＧ−５コア毒素をコードするＤＮＡ）を利用する。当業者は、ＤＩＧ−５タンパク質の全て又はＮ末端部分をコードするその他のＤＮＡ配列が所望の結果を実現するために同様に操作可能であることを認識するであろう。第１の欠損変異体コーディング配列を考案するために、αへリックス２Ａの開始部近傍のヒスチジン残基（すなわち、配列番号２の完全長ＤＩＧ−５タンパク質のＨ７１）に関するコドンを含むαへリックス１をコードする全ての塩基が除去される。従って、配列番号１の塩基１〜２１３を除去すれば、配列番号２のアミノ酸１〜７１に対応するコーディング配列が除去される。開始部（すなわち、完全長タンパク質のアミノ酸７２に関連するコドンの前）に翻訳開始ＡＴＧ（メチオニン）コドンを再導入すると、１０７９個のアミノ酸（すなわち、メチオニン＋完全長ＤＩＧ−５タンパク質のアミノ酸７２〜１１４９）を含む欠損変異体ＤＩＧ−５タンパク質をコードする３２３７塩基からなるオープンリーディングフレームを含む欠損変異体コーディング配列が得られる。配列番号２の完全長ＤＩＧ−５タンパク質の残基７２〜１１３に対応する単一のアミノ酸に関するコドンを更に除去するように連続的、段階的に欠損を生み出すと、αへリックス２Ａ及びαへリックス２Ｂの一部又は全てが欠損している変異体が得られる。従って、２番目に設計された欠損変異体コーディング配列は、配列番号１の塩基１〜２１６の除去を必要とし、これによりアミノ酸１〜７２に対応するコーディング配列が除去される。機能的オープンリーディングフレームの復元は、残りのコーディング配列の開始部分に翻訳開始メチオニンコドンを再導入することにより再び達成され、従って、１０７８個のアミノ酸を含む欠損変異体ＤＩＧ−５タンパク質をコードする３２３４塩基からなるオープンリーディングフレーム（すなわち、メチオニン＋完全長ＤＩＧ−５タンパク質のアミノ酸７３〜１１４９）を有する第２の欠損変異体コーディング配列が得られる。最後に設計された欠損変異体コーディング配列は、配列番号１の塩基１〜３３９の除去を必要とし、従ってアミノ酸１〜１１３に対応するコーディング配列を除去し、及び翻訳開始メチオニンコドンを再導入した後には、１０３７個のアミノ酸からなる欠損変異体ＤＩＧ−５タンパク質をコードする３１１１塩基からなるオープンリーディングフレーム（すなわち、メチオニン＋完全長ＤＩＧ−５タンパク質のアミノ酸１１４〜１１４９）を有する欠損変異体コーディング配列が得られる。例示するように、欠損配列を除去した後、機能的オープンリーディングフレームを復元するために、開始メチオニンコドンが残りのコーディング配列の開始部に付加される。また、やはり記載するように、欠損配列を除去すると、完全長タンパク質の残留部分のＮ末端で、上記した不安定性決定アミノ酸（instability-determining amino acid）のうちの１つが露出したままになる場合には、追加のグリシンコドンがメチオニンコドンと前記不安定性−決定アミノ酸に対応するコドンとの間に付加される。
【０１０２】
表３は上記方針に基づき設計された特定の変異体を記載する。
【０１０３】
【表３】
【０１０４】
表３に記載する毒素をコードする核酸は、上記で議論されたように植物での発現が意図された合成遺伝子に関する一般原理に基づき設計される。
【実施例３】
【０１０５】
ＤＩＧ−５Ｂ．ｔ．殺虫性タンパク質に関するコーディング配列の植物最適化バージョンの設計
植物コドンバイアスを有するＤＮＡ配列が、遺伝子組換え単子葉植物及び双子葉植物でＤＩＧ−５タンパク質を産生するために設計され、及び合成された。トウモロコシ（Zea mays L.）に関するコドン使用頻度表（codon usage table）が、ＧｅｎＢａｎｋに蓄積された配列から得られた７０６個のタンパク質コーディング配列（ＣＤ）から計算された。タバコ（Nicotiana tabacum, 1268 CDs）、キャノーラ（Brassica napus, 530 CDs）、ワタ（Gossypium hirsutum, 197 CDs）、及びダイズ（Glycine max； ca. 1000 CDs）に関するコドン使用頻度表は、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／のデータからダウンロードされた。トウモロコシ及び双子葉植物の両データセットに共通した高度利用コドンを適切な加重平均相対量で含む、バイアスを有するコドンセットが、いずれの植物タイプにおいても、対応するアミノ酸について総コドン使用量の約１０％未満しか用いられていない冗長コドンの全てを除去した後に計算された。ＤＩＧ−５タンパク質をコードする植物最適化配列を導出するために、得られたＤＮＡ配列が植物に最適化されたコドンバイアス表（codon bias table）の全体的なコドン組成を有するように、実験的に求められたＤＩＧ−５ＤＮＡ配列に対してコドン置換が実施された。更に配列の洗練化を実施して、望ましくない制限酵素認識部位、潜在的な植物イントロンスプライス部位、Ａ／Ｔ又はＣ／Ｇ残基のロングラン、及びＲＮＡの安定性、植物細胞内のコーディング領域の転写、又は翻訳を阻害し得るその他のモチーフを取り除いた。その他の変更も実施して、望ましい制限酵素認識部位を導入し、及び長い内部オープンリーディングフレーム（＋１以外のフレーム）を取り除いた。これらの変更は、全て植物バイアスコドン組成を維持する制限範囲内で実施された。設計された配列の合成は、商業的ベンダーにより実施された（ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）。
【０１０６】
合成遺伝子の作成に関する更なるガイダンスは、例えば、国際公開第９７／１３４０２号及び米国特許第５３８０８３１号に見出すことができる。
【０１０７】
ＤＩＧ−５コア毒素をコードするトウモロコシ最適化ＤＮＡ配列は、配列番号３に記載されている。Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントをコードする双子葉植物最適化ＤＮＡ配列は、配列番号６として開示されている。Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントをコードするトウモロコシ最適化ＤＮＡ配列は、配列番号７として開示されている。
【実施例４】
【０１０８】
ＤＩＧ−５殺虫性毒素をコードする発現プラスミドの構築及び細菌宿主における発現
植物最適化コーディング領域によりコードされる完全長ＤＩＧ−５タンパク質を作製するために、工学的に生み出されるシュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）（Ｐｆ）発現プラスミドを構築する際には、標準的なクローニング法が用いられる。制限エンドヌクレアーゼはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から入手し、及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が、ＤＮＡライゲーション用として用いられる。プラスミドの調製は、ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）Ｘｔｒａ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ Ｉｎｃ、Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ、ＰＡ）、又はＰｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、供給業者の説明書に従い実施される。ＤＮＡ断片は、トリス−酢酸塩アガロースゲル電気泳動後に、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ（登録商標）ＤＡカートリッジ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて精製される。
【０１０９】
基本的なクローニング法は、ＤＩＧ−５毒素コーディング配列（ＣＤＳ）をｐＤＯＷ１１６９に、例えばＳｐｅＩ及びＸｈｏＩ制限部位でサブクローニングするステップを必要とし、これにより、同配列はプラスミドｐＫＫ２２３−３（ＰＬ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）に由来するＰｔａｃプロモーター、及びｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーターの発現制御下に置かれる。ｐＤＯＷ１１６９は、ＲＳＦ１０１０複製起点、ｐｙｒＦ遺伝子、及び制限酵素認識部位に先行するリボソーム結合部位を備えたミディアムコピープラスミド（medium copy plasmid）であり、同プラスミド中にタンパク質コーディング領域を含むＤＮＡ断片が導入され得る（米国特許出願第２００８０１９３９７４号）。発現プラスミドは、ＤＣ４５４（突然変異ΔｐｙｒＦ及びｌｓｃ：：ｌａｃＩＱＩを有する野生型Ｐ．フルオレッセンス（fluorescens）系統に近い）、又はその誘導体内にエレクトロポレーションすることにより形質転換され、ＳＯＣ−Ｓｏｙ加水分解産物培地内に回収され、及び選択培地（ウラシルを欠いたＭ９グルコース寒天培地、Sambrookらの上記文献）上に播種される。微生物学的操作の詳細は、Squiresらの文献（2004年）、米国特許出願第２００６０００８８７７号、米国特許出願第２００８０１９３９７４号、及び米国特許出願第２００８００５８２６２号に記載されており、本明細書において参照により援用する。コロニーは最初にＰＣＲによりふるい分けされ、次いで陽性クローンがミニプレッププラスミドＤＮＡの制限酵素消化により分析される。挿入物を含む選択されたクローンのプラスミドＤＮＡは、供給業者（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が推奨するようにＢｉｇ Ｄｙｅ（登録商標）ターミネーター、バージョン３．１を用いて、又はＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）等の商業的配列決定ベンダーと契約することにより配列決定される。配列データは、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いて組み立てられ、及び分析される。
【０１１０】
振とうフラスコ内での増殖及び発現分析。特徴付け及び昆虫バイオアッセイを行うためのＤＩＧ−５毒素は、振とうフラスコにより増殖した発現構築物を内蔵するＰ．フルオレッセンス（fluorescens）系統（例えば、クローンＤＰ２８２６）により産生される。１％グルコース及び微量元素が補給されたＭ９培地内で増殖した種培養物が、５％のグリセロールを含む限定最少培地（Ｔｅｋｎｏｖａ Ｃａｔ．＃３Ｄ７４２６、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、ＣＡ）、５０ｍＬに播種するのに用いられる。Ｐｔａｃプロモーターを介するＤＩＧ−５毒素遺伝子の発現は、振とうしながら３０℃で２４時間、初期のインキュベーションを行った後に、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより誘発される。培養物は誘発時及び誘発後の様々な時間においてサンプル採取される。細胞密度は６００ｎｍ（ＯＤ６００）での光学的密度により測定される。シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）の増殖に適する、例えばHuangらの文献（2007年）及び米国特許出願第２００６０００８８７７号で記載されるようなその他の培地も利用可能である。
【０１１１】
振とうフラスコサンプルの細胞分画及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。各サンプル採取時において、サンプルの細胞密度はＯＤ６００＝２０に調節され、及び１ｍＬの分量が１４０００×ｇで５分間遠心分離される。細胞ペレットは−８０℃で凍結される。凍結された振とうフラスコ細胞ペレットサンプルに由来する可溶性及び不溶性の分画が、ＥａｓｙＬｙｓｅ（商標）Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて生成される。各細胞ペレットは、ＥａｓｙＬｙｓｅ（商標）溶液、１ｍＬ中に再懸濁され、及び溶解バッファー中で１：４に更に希釈され、及び振とうしながら室温で３０分間インキュベーションされる。ライセートは、４℃、１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離され、及び上澄部は可溶性分画として回収される。次に、ペレット（不溶性分画）は、同容積のリン酸緩衝化された生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）中に再懸濁される。
【０１１２】
サンプルは、β−メルカプトエタノールを含む２×Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファーを用いて１：１に混合され（Sambrookらの上記文献）、及び５分間煮沸した後、推奨ＸＴ ＭＯＰＳバッファー中でＣｒｉｔｅｒｉｏｎ ＸＴ ビス−トリス１２％ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）電気泳動に負荷される。ゲルは、製造業者（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のプロトコールに基づき、バイオセーフクマシー染色剤（Bio-Safe Coomassie Stain）を用いて染色され、及びＡｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ Ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）を用いて画像化される。
【０１１３】
封入体調製物。Ｃｒｙタンパク質封入体（ＩＢ）の調製は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＭＡＬＤＩ−ＭＳ（Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法）による実証に基づき、不溶性Ｂ．ｔ．殺虫性タンパク質を産生したＰ．フルオレッセンス（fluorescens）発酵から得られた細胞について実施される。Ｐ．フルオレッセンス（fluorescens）発酵ペレットは３７℃の水浴中で解凍される。細胞は溶解バッファー（５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、２００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム塩（エチレンジアミン四酢酸）、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、及び５ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ））内で２５％ｗ／ｖに再懸濁される。５ｍＬ／Ｌの細菌プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐ８４６５ Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）が使用直前に添加される。細胞は最低レベルに設定されたハンドヘルドホモジナイザー（Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅａｒｏｒ、ＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ、ＯＫ）を用いて懸濁される。リゾチーム（２５ｍｇのＳｉｇｍａ Ｌ７６５１、鶏卵卵白由来）が、金属製のスパチュラで混合しながら細胞懸濁液に添加され、及び当該懸濁液は室温で１時間インキュベーションされる。当該懸濁液は氷上で１５分間冷却され、次にＢｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ２５０を用いて超音波処理される（５０％のデューティサイクル、３０％のアウトプットで１分間セッションを２回）。細胞溶解物は顕微鏡検査によりチェックされる。必要な場合には、２５ｍｇのリゾチームが更に添加され、及びインキュベーション及び超音処理が繰り返される。細胞溶解が顕微鏡検査により確認されたら、当該ライセートは、ＩＢペレットが形成されるように１１，５００×ｇで２５分間（４℃）遠心分離され、及び上澄部は廃棄される。ＩＢペレットは１００ｍＬの溶解バッファーで再懸濁され、上記のようにハンドヘルドミキサーを用いてホモジナイズされ、及び遠心分離される。ＩＢペレットは、上澄部が無色となり、及びＩＢペレットが堅く引き締まり、そしてオフ・ホワイト色になるまで、再懸濁（５０ｍＬの溶解バッファー中で）、ホモジナイゼーション、超音波処理、及び遠心分離することにより繰り返し洗浄される。最終洗浄の場合、ＩＢペレットは２ｍＭのＥＤＴＡを含む滅菌濾過された（０．２２μｍ）蒸留水中に再懸濁され、及び遠心分離される。最終ペレットは２ｍＭのＥＤＴＡを含む滅菌濾過された蒸留水中に再懸濁され、及び１ｍＬの分量で−８０℃で貯蔵される。
【０１１４】
ＩＢ調製物内のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及び定量は、１ｍＬの分量のＩＢペレットを解凍し、及び滅菌濾過蒸留水で１：２０に希釈することにより実施される。希釈サンプルは、次に４×還元サンプルバッファー［２５０ｍＭのトリス、ｐＨ６．８、４０％のグリセロール（ｖ／ｖ）、０．４％のブロモフェノールブルー（ｗ／ｖ）、８％のＳＤＳ（ｗ／ｖ）、及び８％のβ−メルカプト−エタノール（ｖ／ｖ）］で煮沸され、及び１×トリス／グリシン／ＳＤＳバッファー（ＢｉｏＲａｄ）を用いたＮｏｖｅｘ（登録商標）４〜２０％のトリス−グリシン、１２＋２ウェルゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）泳導（run）に負荷される。ゲルは、約６０分間、２００ボルトで泳導され、次にクマシーブルー（４５％のメタノール、１０％の酢酸に溶解した５０％のＧ−２５０／５０％のＲ−２５０）で染色され、及び蒸留水に溶解した７％の酢酸、５％のメタノールで脱染色される。標的バンドの定量は、標準曲線を作成するために同一ゲル上で泳導されたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）サンプルに対して、各バンドのデンシトメトリー値を比較することにより行われる。
【０１１５】
封入体の可溶化。ＰｆクローンＤＰ２８２６（３２ｍｇ／ｍＬのＤＩＧ−５タンパク質を含む）から得られた６ｍＬの封入体懸濁液が、封入体をペレット化させるように最高レベルに設定されたＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ｍｅｄｅｌ ５４１５Ｃ小型微量遠心機（約１４，０００×ｇ）上で遠心分離される。５０ｍＬコニカルチューブ内の貯蔵用バッファー上澄部は除去され、及び２５ｍＬの１００ｍＭの炭酸ナトリウムバッファー、ｐＨ１１で置換される。封入体はピペットを用いて再懸濁され、及び完全に混和するようにボルテックス処理される。当該チューブは、標的タンパク質を抽出するために、静かに揺動するプラットフォーム上に４℃、オーバーナイトで配置される。当該抽出物は、３０，０００×ｇで３０分間、４℃において遠心分離され、及び得られた上澄部は、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５再生セルロース遠心濾過器（３０，０００分子量カットオフ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、５倍に濃縮される。次に、サンプルバッファーは、使い捨てのＰＤ−１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて、１０ｍＭのＣＡＰＳ［３−（シクロヘキサミノ）１−プロパンスルホン酸］、ｐＨ１０に交換される。
【０１１６】
ゲル電気泳動。濃縮抽出物は、還元剤として５ｍＭのジチオスレイトールを含むＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳサンプルバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で１：５０に希釈することにより、電気泳動用に調製され、及び９５℃で４分間加熱される。サンプルは、４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲルのレーンに重複して、０．２〜２μｇ／レーンの範囲の５つのＢＳＡ標準品（標準曲線作成用）と並行して負荷される。ＭＯＰＳ ＳＤＳ泳動バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、追跡用色素がゲルの最下端に到達するまで、２００Ｖで電圧が印加される。ゲルは４５％のメタノール、１０％の酢酸に溶解した０．２％のクマシーブルーＧ−２５０を用いて染色され、及び最初に４５％のメタノール、１０％の酢酸を用いて短時間、次にバックグラウンドが透明になるまで７％の酢酸、５％のメタノールを用いて長時間脱染色される。脱染色後に、ゲルはＢｉｏｒａｄ Ｆｌｕｏｒ−Ｓ ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒを用いてスキャンされる。当該装置のＱｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ ｖ．４．５．２ソフトウェアが、染色されたタンパク質バンドのバックグラウンドが差し引かれた容量を得るために、及びストック溶液中のＤＩＧ−５タンパク質濃度を算出するのに用いられるＢＳＡ標準曲線を作成するために用いられる。
【実施例５】
【０１１７】
シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）内で産生された改変ＤＩＧ−５タンパク質の殺虫活性
ＤＩＧ−５Ｂ．ｔ．殺虫性毒素は、甲虫類（Colepteran）昆虫の幼虫を対象とした活性について試験され、同昆虫には、例えば、ウエスタンコーンルートワーム（ＷＣＲ、Diabrotica virgifera virgifera LeConte）、及びサザンコーンルートワーム（ＳＣＲ、Diabrotica undecimpunctata howardi）が含まれる。ＤＩＧ−５Ｂ．ｔ．殺虫性毒素は鱗翅目（Lepidopteran）昆虫の幼虫を対象とした活性について更に試験され、同昆虫には、例えば、夜蛾科のガの幼虫（ＣＥＷ；Helicoverpa zea（Boddie））、欧州のマツマダラメイガ（ＥＣＢ；Ostrinia nubilalis （Hubner））、ｃｒｙ１Ｆ抵抗性のＥＣＢ（ｒＥＣＢ）、ツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ，Spodoptera frugiperda）、Ｃｒｙ１Ｆ抵抗性のＦＡＷ（ｒＦＡＷ）、コナガ（ＤＢＭ；Plutella xylostella （Linnaeus））、ｃｒｙ１Ａ抵抗性のＤＢＭ（ｒＤＢＭ）、ニセアメリカタバコガ（ＴＢＷ；Heliothis virescens（Fabricius））、タマナヤガ（ＢＣＷ；Agrotis ipsilon （Hufnagel））、イラクサキンウワバ（ＣＬ；Trichoplusia ni （Hubner））、及びシロイチモジヨトウ（ＢＡＷ、Spodoptera exigua、beet armyworm）が含まれる。
【０１１８】
サンプル調製及びバイオアッセイ。１０ｍＭのＣＡＰＳ、ｐＨ１０中の封入体調製物は、１０ｍＭのＣＡＰＳ、ｐＨ１０中で適切に希釈され、及び全てのバイオアッセイには本バッファーから構成される対照処理が含まれるが、同処理は、死亡率又は成長阻害についてバックグラウンドチェックするように機能する。
【０１１９】
バイオアッセイバッファー中のタンパク質濃度は、ゲルデンシトメトリー用の標準曲線を作成するためにＢＳＡを用いながらゲル電気泳動により評価されるが、同ゲルデンシトメトリーは、ＢｉｏＲａｄ画像システム（Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ バージョン４．５．２を備えたＦｌｕｏｒ−Ｓ ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ）を用いて測定される。ゲルマトリックス中のタンパク質は、クマシーブルーベースの染色剤を用いて染色され、及び読み取る前に脱染色される。
【０１２０】
精製されたタンパク質は、人工的な昆虫飼料で飼育された新生幼虫を用いて実施されるバイオアッセイで、殺虫活性について試験される。幼虫、例えばＢＣＷ、ＣＥＷ、ＣＬ、ＤＢＭ、ｒＤＢＭ、ＥＣＢ、ＦＡＷ、及びＴＢＷの幼虫は、商業的な昆虫飼育業者（Ｂｅｎｚｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ、Ｃａｒｌｉｓｌｅ、ＰＡ）により維持されているコロニーから得られた卵から孵化される。ＷＣＲ及びＳＣＲの卵は、Ｃｒｏｐ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＮ）から入手される。ｒＥＣＢ及びｒＦＡＷの幼虫は、独自のコロニー（Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ ＬＬＣ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から捕集された卵から孵化される。
【０１２１】
バイオアッセイは、昆虫バイオアッセイ用に特別に設計された１２８−ウェル、プラスチック製トレイ（Ｃ−Ｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｐｉｔｍａｎ、ＮＪ）内で実施される。各ウェルは、複数種鱗翅目飼料（Ｓｏｕｔｈｌａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｌａｋｅ Ｖｉｌｌａｇｅ、ＡＲ）又は甲虫目の昆虫の増殖用に設計された独自の飼料（Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ ＬＬＣ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、１．０ｍＬを含む。４０μＬの分量のタンパク質サンプルが、ピペットにより各ウェルの１．５ｃｍ２の飼料表面上に供給される（２６．７μＬ／ｃｍ２）。飼料濃度は、ウェルの表面積１平方センチ（ｃｍ２）当たりのＤＩＧ−５タンパク質の量（ｎｇ）として計算される。処理済みのトレイは、飼料表面上の液体が蒸発し、又は飼料内に吸収されるまでドラフトチャンバー内で維持される。
【０１２２】
羽化の数時間内に、個々の幼虫は湿ったラクダの毛のブラシを用いて採取され、及び１ウェル当たり１匹の幼虫となるように処理済みの飼料上に配置される。次に、寄生されたウェルは、透明なプラスチック製の接着シートで密閉され、ガス置換が可能となるように換気される。（Ｃ−Ｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｐｉｔｍａｎ、ＮＪ）。バイオアッセイトレイは、制御された環境条件下（２８℃、相対湿度約４０％、１６：８［明：暗］）で５日間維持され、その後、各タンパク質サンプルに暴露された昆虫の総数、死亡した昆虫の数、及び生存した昆虫の重量が記録される。死亡の割合（％）及び成長阻害の割合（％）が各処理について計算される。成長阻害（ＧＩ）は下記のように計算される。
ＧＩ＝［１−（ＴＷＩＴ／ＴＮＩＴ）／（ＴＷＩＢＣ／ＴＮＩＢＣ）］
式中、ＴＷＩＴは処理群の昆虫の総重量であり、
ＴＮＩＴは処理群の昆虫の総数であり、
ＴＷＩＢＣは、バックグラウンドチェック群（バッファー対照）の昆虫の総重量であり、及び
ＴＮＩＢＣは、バックグラウンドチェック群（バッファー対照）の昆虫の総数である。
【０１２３】
ＧＩ５０は、ＧＩ値が５０％である飼料中のＤＩＧ−５タンパク質濃度として求められる。ＬＣ５０（５０％致死濃度）は、試験昆虫の５０％が絶命する飼料中のＤＩＧ−５タンパク質濃度として記録される。統計解析（一元配置ＡＮＯＶＡ）が、ＪＭＰソフトウェア（ＳＡＳ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を用いて実施される。
【実施例６】
【０１２４】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）属の形質転換
標準的なクローニング法が、バイナリー植物形質転換及び発現プラスミドの構築で用いられる。制限エンドヌクレアーゼ及びＴ４ＤＮＡリガーゼはＮＥＢより入手される。プラスミドの調製は、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎキット、又はＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）ＡＸ Ｘｔｒａ Ｍｉｄｉキット（両方共にＭａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌより入手）を用いて、製造業者の説明書に従って実施される。ＤＮＡ断片は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、又はＱＩＡＥＸ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（両方共にＱｉａｇｅｎより入手）を用いて、ゲル単離後に精製される。
【０１２５】
改変されたＤＩＧ−５タンパク質、又はその断片をコードする核酸配列を含むＤＮＡ断片は、商業的ベンダー（例えば、ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）により合成可能であり、及び標準的なプラスミドベクター内にクローン化された断片として供給され得るが、又は適当な核酸配列を含むその他の構築物について標準的な分子生物学的操作を行うことによって得ることもできる。各遺伝子内部の固有制限部位は識別可能であり、及び各遺伝子断片が合成可能であり、それぞれ固有の欠損又は挿入を含む。所望の完全長タンパク質、融合タンパク質、又は欠損変異体タンパク質をコードするコーディング領域を得るために、改変されたＣｒｙ断片をその他のＣｒｙ断片コーディング領域内に、適切な制限部位においてサブクローン化することができる。例えば、遺伝子の開始部に適当な制限認識部位、及び変異クローンを構築するのに利用可能な各遺伝子に固有の第２の内部制限部位を識別することができる。
【０１２６】
非限定的な事例では、基本的なクローニング法は、完全長又は改変されたＣｒｙコーディング配列（ＣＤＳ）をＮｃｏＩ及びＳａｃＩ制限部位で植物発現プラスミド内にサブクローン化することであり得る。植物発現要素（例えば、植物で発現可能なプロモーター、３’末端転写終了及びポリアデニレート付加決定因子等）の制御下に置かれたしかるべきＣｒｙコーディング領域を含む、得られた植物発現カセットは、例えばＧａｔｅｗａｙ（登録商標）技術又は標準的な制限酵素断片クローニング手法を利用して、バイナリーベクタープラスミド内にサブクローン化される。Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）技術が利用される場合には、例えばＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が、完全長及び改変された遺伝子の植物発現カセットをバイナリー植物形質転換プラスミド内に組み込むのに利用可能である。プラスミドが大腸菌（E.coli）及びアグロバクテリウム（Agrobacterium）属の細胞内に存在するとき、抗生物質スペクチノマイシンに対する抵抗性を付与する細菌遺伝子を内蔵するバイナリー植物形質転換ベクターを利用するのが便利である。所望の宿主植物内で機能する植物で発現可能な選択マーカー遺伝子を含むバイナリーベクタープラスミドを利用するのも便利である。植物で発現可能な選択マーカー遺伝子の例として、抗生物質のカナマイシン、ネオマイシン、及びＧ４１８に対する抵抗性をコードする、トランスポゾンＴｎ５（Ａｐｈ ＩＩ）のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子、並びにグリホサート；ハイグロマイシン；メトトレキサート；ホスフィノトリシン（ビアラホス）、イミダゾリノン、スルホニルウレア剤、及びトリアゾロピリミジン除草剤、例えばクロロスルフロン（ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｕｒｏｎ）、ブロモキシニル（ｂｒｏｍｏｘｙｎｉｌ）、ダラポン（ｄａｌａｐｏｎ）等に対する抵抗性又は耐性をコードする遺伝子が挙げられるが、但しこれらに限定されない。
【０１２７】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）系統Ｚ７０７Ｓのエレクトロコンピテントセル（Ｚ７０７のストレプトマイシン抵抗性誘導体；Hepburnらの文献、1985年）が、エレクトロポレーションを用いて調製され、及び形質転換される（Weigel及びGlazebrookの文献、2002年）。エレクトロポレーション後に、１ｍＬのＹＥＰブロス（ｇｍ／Ｌ：酵母菌抽出物、１０；ペプトン、１０；ＮａＣｌ、５）がキュベットに添加され、及び細胞−ＹＥＰ懸濁液が、水浴中、２８℃で、４時間、一定速度で激しく揺動させながらインキュベーションするために１５ｍＬ培養チューブに移される。細胞は、スペクチノマイシン（２００μｇ／ｍＬ）及びストレプトマイシン（２５０μｇ／ｍＬ）を含むＹＥＰ＋寒天（２５ｇｍ／Ｌ）上に播種され、及び当該播種物は２８℃で２〜４日間インキュベーションされる。十分に分離した単一コロニーが選択され、及び上記のようにスペクチノマイシン及びトレプトマイシンを含む新鮮なＹＥＰ＋アガープレート上に条痕を生じさせ（streaked）、及び２８℃で１〜３日間、インキュベーションされる。
【０１２８】
バイナリー植物形質転換ベクター内へのＤＩＧ−５遺伝子挿入の有無は、選択されたアグロバクテリウム（Agrobacterium）属コロニーから調製されたテンプレートプラスミドＤＮＡで、ベクター特異的プライマーを用いて、ＰＣＲ分析により確認される。上記のようにスペクチノマイシン及びストレプトマイシンを含むＹＥＰ中で増殖したオーバーナイト培養物１５ｍＬのうち、４ｍＬの分量から得られた細胞ペレットが、Ｑｉａｇｅｎ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐｓを用いて、製造業者の説明書に従い抽出される。アグロバクテリウム（Agrobacterium）属のエレクトロポレーション形質転換で用いられたバイナリーベクターに由来するプラスミドＤＮＡが、対照として含まれる。ＰＣＲ反応は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手したＴａｑＤＮＡポリメラーゼを、製造業者の説明書に従い０．５×濃度で用いて完結する。ＰＣＲ反応は、以下の条件でプログラムされたＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ内で実施される：ステップ１）９４℃、３分；ステップ２）９４℃、４５秒間；ステップ３）５５℃、３０秒間；ステップ４）７２℃、推定される生成物の長さ１ｋｂ当たり１分間；ステップ５）ステップ２までを２９回；ステップ６）７２℃、１０分間。サイクリング後、反応は４℃で維持される。増幅産物はアガロースゲル電気泳動（例えば、０．７％〜１％のアガロース、ｗ／ｖ）により分析され、及びエチジウムブロマイド染色により可視化される。ＰＣＲ産物がプラスミド対照と同一であるコロニーが選択される。
【０１２９】
或いは、ＤＩＧ−５遺伝子の挿入を含むバイナリー植物形質転換ベクターのプラスミド構造が、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属を操作する当業者にとって周知の標準的な分子生物学的方法により候補アグロバクテリウム（Agrobacterium）属単離物から調製されたプラスミドＤＮＡの制限消化物フィンガープリントマッピングにより確認される。
【０１３０】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）属が介在する形質転換法により形質転換植物を得る当業者は、Ｚ７０７Ｓ以外のその他のアグロバクテリウム（Agrobacterium）属の系統も有利に利用可能であり、及び系統の選択は、形質転換される宿主植物種の同一性に依存し得ることを理解するであろう。
【実施例７】
【０１３１】
双子葉植物におけるＤＩＧ−５Ｂ．ｔ．殺虫性タンパク質及び変異体の産生
シロイヌナズナ（Arabidopsis）形質転換。シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）Ｃｏｌ−０１は、花卉水浸法（floral dip method）を用いて形質転換される（Weigel及びGlazebrookの文献、2002年）。選択されたアグロバクテリウム（Agrobacterium）属コロニーが、選択用途で適切な抗生物質を含むＹＥＰブロスの培養液１ｍＬ〜１５ｍＬに播種するために用いられる。培養液は、２２０ｒｐｍの一定速度で激しく揺動させながら、２８℃、オーバーナイトでインキュベーションされる。各培養液は、選択用途で適切な抗生物質を含むＹＥＰブロスの２つの５００ｍＬ培養液に播種するのに用いられ、及び新たな培養液は、一定速度で激しく揺動させながら、２８℃、オーバーナイトでインキュベーションされる。細胞は約８７００×ｇで１０分間、室温においてペレット化され、及び得られた上澄部は廃棄される。細胞ペレットは以下の成分を含む浸潤培地、５００ｍＬ内に静かに再懸濁される：１／２×Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）／ＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミン（Ｇｏｌｄ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、１０％（ｗ／ｖ）のスクロース、０．０４４μＭのベンジルアミノプリン（１ｍｇ／ｍＬのストック液を１０μＬ／リットルで含むＤＭＳＯ溶液）及び３００μＬ／リットルのＳｉｌｗｅｔ Ｌ−７７。最も新しい花序の水没が保証されるように注意を払いながら、約１月齢の植物が培地に１５秒間浸漬される。次に、当該植物は横向きに寝かせられ、及び２４時間覆われ（透明又は不透明）、水で洗浄され、及び縦向きに配置される。当該植物を１６時間明光／８時間暗光の周期で、２２℃において成長させる。浸漬後約４週間経過して種子が採取される。
【０１３２】
シロイヌナズナ（Arabidopsis）の成長及び選択。新たに採取されたＴ１種子を乾燥剤の存在下で少なくとも７日間、室温で乾燥させる。種子は、０．１％の寒天／水（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液中で懸濁され、次に４℃で２日間重層化される。栽植目的で調製するために、１０．５インチ×２１インチの発芽トレイ（Ｔ．Ｏ．Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ、Ｃｌｅａｒｗａｔｅｒ，ＭＮ）内のＳｕｎｓｈｉｎｅ Ｍｉｘ ＬＰ５（Ｓｕｎ Ｇｒｏ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｎｃ．，Ｂｅｌｌｅｖｕｅ，ＷＡ）が微細なバーミキュライトで覆われ、濡れるまでホーグランド液でサブイリゲーションされ（Hoagland及びArnonの文献、1950年）、次に２４時間放置して水切りが行われる。重層化された種子はバーミキュライト上に播種され、及び湿度ドーム（ＫＯＲＤ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｒａｍａｌｅａ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）で７日間覆われる。種子を発芽させ、及び植物を、Ｃｏｎｖｉｒｏｎ（Ｍｏｄｅｌｓ ＣＭＰ４０３０、又はＣＭＰ３２４４；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｗｉｎｎｉｐｅｇ、Ｍａｎｉｔｏｂａ、Ｃａｎａｄａ）内で、長日条件（１６時間明光／８数時間暗光）下、１２０〜１５０μｍｏｌ／ｍ２秒の光強度、一定の温度（２２℃）及び湿度（４０〜５０％）の下で成長させる。土壌が濡れた状態ではなく湿った状態に保たれるように、植物は当初ホーグランド液で、その後脱イオン水で給水される。
【０１３３】
ドームは、播種後５〜６日間で除去され、及び植物は形質転換されない種子から発芽した植物を枯死させる化学的選択剤でスプレー噴霧される。例えば、バイナリー植物形質転換ベクターにより付与された、植物で発現可能な選択マーカー遺伝子がｐａｔ又はｂａｒ遺伝子である場合には（Wehrmannらの文献、1996年）、形質転換植物は、Ｆｉｎａｌｅ（５．７８％のグルフォシネートアンモニウム、Ｆａｒｎａｍ Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｐｈｏｅｎｉｘ、ＡＺ）の１０００×溶液でスプレー噴霧することにより選択され得る。その後スプレー噴霧は５〜７日の間隔で２回実施される。生存植物（活発に成長する植物）が、最終スプレー噴霧後７〜１０日間経過して識別され、及びＳｕｎｓｈｉｎｅ Ｍｉｘ ＬＰ５で調製されたポットに移植される。移植された植物は湿度ドームで３〜４日間覆われ、及び上記成長条件下でＣｏｎｖｉｒｏｎ内に配置される。
【０１３４】
その他の植物で発現可能な選択マーカー遺伝子（例えば、除草剤耐性遺伝子）が用いられる場合には、形質転換植物を選択するその他の方法も利用可能であることを、双子葉植物形質転換の当業者は理解するであろう。
【０１３５】
遺伝子組換えシロイヌナズナ（Arabidopsis）の昆虫バイオアッセイ。改変されたＣｒｙタンパク質を発現する遺伝子組換えシロイヌナズナ（Arabidopsis）系統が、感受性を有する昆虫種に対して活性を有することが、人工飼料オーバーレイアッセイ（artificial diet overlay assays）で実証される。遺伝子組換え及び非遺伝子組換えシロイヌナズナ系統から抽出されたタンパク質が、しかるべき方法により定量化され、及びタンパク質濃度を標準化するためにサンプル容量が調整される。バイオアッセイが上記のように人工飼料上で実施される。非遺伝子組換えのシロイヌナズナ（Arabidopsis）及び／又はバッファー及び水が、バックグラウンドチェック処理として分析法に含まれる。
【実施例８】
【０１３６】
スーパーバイナリーベクターを作製するためのアグロバクテリウム（Agrobacterium）属の形質転換
アグロバクテリウム（Agrobacterium）属スーパーバイナリーシステムは、単子葉植物の植物宿主を形質転換するのに好都合に用いられる。スーパーバイナリーベクターを構築し及び確認する方法は十分に確立されている。標準的な分子生物学的及び微生物学的方法がスーパーバイナリープラスミドを作製するのに用いられる。スーパーバイナリープラスミドの構造の検証／確認は、バイナリーベクターについて上記したものと同様の方法を用いて実施される。
【実施例９】
【０１３７】
単子葉植物におけるＤＩＧ−５Ｂ．ｔ．殺虫性タンパク質及び変異体の産生
トウモロコシのアグロバクテリウム（Agrobacterium）属が介在する形質転換。Ｈｉｇｈ ＩＩ Ｆ１ ｃｒｏｓｓ（Armstrongらの文献、1991年）に由来する種子が、９５％のＭｅｔｒｏ−Ｍｉｘ ３６０ソイルレス系成長培地（Ｓｕｎ Ｇｒｏ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ、Ｂｅｌｌｅｖｕｅ、ＷＡ）及び５％のｃｌａｙ／ｌｏａｍ土壌からなる混合物を含む５ガロンのポット内に植栽される。植物を、高圧ナトリウムランプ及びメタルハライドランプを併用する温室内で、１６：８時間の明光：暗光周期にて成長させる。形質転換用の未成熟のＦ２胚を得るために、制御された同胞受粉（sib-pollination）が実施される。胚が約１．０〜２．０ｍｍのサイズになる受粉後８〜１０日目に、未成熟の胚が単離される。
【０１３８】
感染及び同時培養。トウモロコシ雌穂（Maize ears）は、滅菌水でリンスされる前に、液体石鹸で洗浄し、７０％のエタノール中に２分間浸漬し、次に２０％の市販漂白剤（０．１％の次亜塩素酸ナトリウム）中に３０分間浸漬することにより表面滅菌処理される。スーパーバイナリーベクターを含むアグロバクテリウム（Agrobacterium）属細胞の懸濁液が、１００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシン、１０ｍｇ／Ｌのテトラサイクリン、及び２５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＹＥＰ固体培地上で成長した１〜２ループの細菌を、２８℃で２〜３日間、１００μＭのアセトシリンゴンを含む５ｍＬの液体感染培地（ＬＳ基本培地（Linsmaier及びSkoogの文献、1965年）、Ｎ６ビタミン（Chuらの文献、1975年）、１．５ｍｇ／Ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、６８．５ｇｍ／Ｌのスクロース、３６．０ｇｍ／Ｌのグルコース，６ｍＭのＬ−プロリン、ｐＨ５．２）に移植することにより調製される。均一な懸濁液になるまで溶液はボルテックス処理され、及び濃度は、紫色のフィルターを備えたＫｌｅｔｔ−Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎ比色計を用いて、最終密度が２００Ｋｌｅｔｔ単位となるように調整される。未成熟の胚は、２ｍＬの感染培地を含むマイクロ遠心管に直接単離される。培地は除去され、及び密度が２００Ｋｌｅｔｔ単位のアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液、１ｍＬで置換され、及びアグロバクテリウム（Agrobacterium）と胚の溶液は、室温で５分間インキュベーションされ、次いで同時培養培地（ＬＳ基本培地、Ｎ６ビタミン、１．５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、３０．０ｇｍ／Ｌのスクロース、６ｍＭのＬ−プロリン、０．８５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、１００μＭのアセトシリンゴン、３．０ｇｍ／Ｌのゲランガム（ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）、ｐＨ５．８）に、暗光条件下で、２５℃、５日間移植される。
【０１３９】
同時培養後に、胚は選択的培地に移植され、その後約８週間経過する間に形質転換された単離物が得られる。植物で発現可能なｐａｔ又はｂａｒ選択マーカー遺伝子を含むスーパーバイナリープラスミドで形質転換されたトウモロコシ組織を選択する場合、ＬＳベースの培地（ＬＳ基本培地、Ｎ６ビタミン、１．５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、０．５ｇｍ／ＬのＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸一水和物；ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌａｂｒ．）、３０．０ｇｍ／Ｌのスクロース、６ｍＭのＬ−プロリン、１．０ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、２．５ｇｍ／Ｌのゲランガム、ｐＨ５．７）が、ビアラホス（Ｂｉａｌａｐｈｏｓ）（Ｇｏｌｄ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に用いられる。胚は胚形成性単離物が得られるまで３ｍｇ／Ｌのビアラホスを含む選択培地に移植される。回収された単離物は、再生及び更なる分析用として２週間間隔で新鮮な選択培地に移植することにより蓄積される。
【０１４０】
その他の植物で発現可能な選択マーカー遺伝子（例えば、除草剤耐性遺伝子）が用いられる場合には、形質転換植物を選択するその他の方法が利用可能であることを、トウモロコシ形質転換の当業者は理解するであろう。
【０１４１】
再生及び種子の生産。再生する場合、培養物は、「２８」導入培地（ＭＳ塩及びビタミン、３０ｇｍ／Ｌのスクロース、５ｍｇ／Ｌのベンジルアミノプリン、０．２５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、３ｍｇ／Ｌのビアラホス、２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、２．５ｇｍ／Ｌのゲランガム、ｐＨ５．７）に弱光条件下（１４μＥｍ−２ｓ−１）で１週間、次に強光条件下（約８９μＥｍ−２ｓ−１）で１週移植される。その後、組織は「３６」再生培地（植物成長調節剤を含まない点を除き導入培地に同じ）に移植される。小植物が長さ３〜５ｃｍに成長したときに、それらはＳＨＧＡ培地（Schenk and Hildebrandt salts and vitamins （1972年）; PhytoTechnologies Labr.）、１．０ｇｍ／Ｌのミオイノシトール、１０ｇｍ／Ｌのスクロース、及び２．０ｇｍ／Ｌのゲランガム、ｐＨ５．８）を含むガラス製の培養チューブに移植されて、更に成長し及び徒長枝と根が発生するようにさせる。植物は本明細書にこれまでに記載したものと同一の土壌混合物に移植され、及び温室内で開花するまで育成される。種子を生産するために制御された受粉が実施される。
【実施例１０】
【０１４２】
遺伝子組換えトウモロコシのバイオアッセイ
植物細胞内で産生されるＤＩＧ−５タンパク質及び変異体の生物活性は、従来のバイオアッセイ法により（例えば、Huangらの文献、2006年を参照）実証される。有効性は、例えばＤＩＧ−５毒素を産生する植物に由来する様々な植物組織又は組織片を、制御された摂食環境で昆虫に摂食させることにより実証することができる。或いは、これまでに本明細書に記載したように、タンパク質抽出物が、ＤＩＧ−５毒素を産生する植物に由来する様々な植物組織から調製可能であり、及び当該抽出されたタンパク質を人工飼料バイオアッセイに組み込み可能である。かかる摂食分析法の結果は、ＤＩＧ−５タンパク質又は変異体を産生しない宿主植物に由来する適切な対照組織又はその他の対照サンプルを利用する、同様に実施されるバイオアッセイと比較されることとなることが理解される。
【０１４３】
本明細書で参照又は引用される全ての特許、特許出願、仮出願、及び出版物をそのまま、本明細書の明示的教示と矛盾しない範囲内で参照により援用する。特に明示又は暗示しない限り、用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、本明細書において使用される場合、「少なくとも１つの」を意味する。本明細書で用語「遺伝物質」を使用する場合、全ての遺伝子、核酸、ＤＮＡ、及びＲＮＡを含むように意図されている。
【０１４４】
ポリヌクレオチドの核酸残基、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、及びプライマーの名称、並びにタンパク質のアミノ酸残基の名称については、本明細書全体通じてＩＵＰＡＣの標準的略号が採用される。核酸配列は、標準的な５’から３’方向で提示され、及びタンパク質配列は、標準的なアミノ（Ｎ）末端からカルボキシ（Ｃ）末端方向で提示されている。用語「ｄｓＲＮＡ」は二本鎖ＲＮＡを意味する。
【０１４５】
（参考文献）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２の残基１１４〜６５５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｂ）配列番号２の残基１１４〜６５５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、および
（ｃ）配列番号２によりコードされる毒素の発現又は活性に悪影響を及ぼさない最大２０個のアミノ酸の置換、欠損、又は修飾を含む、配列番号２の残基１１４〜６５５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
から構成される群より選択されるコア毒素セグメントを含む単離されたポリペプチド又はその殺虫剤として活性な断片。
【請求項２】
（ａ）配列番号２の残基１〜６５５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｂ）配列番号２の残基１〜６５５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、および
（ｃ）配列番号２によりコードされる毒素の発現又は活性に悪影響を及ぼさない最大２０個のアミノ酸の置換、欠損、又は修飾を含む、配列番号２の残基１〜６５５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
から構成される群より選択されるコア毒素セグメントを含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド又はその殺虫剤として活性な断片。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドを含む植物。
【請求項４】
請求項２に記載のポリペプチドを含む植物。
【請求項５】
有害生物個体群を防除する方法であって、前記個体群を、殺有害生物剤として有効な量の請求項１に記載のポリペプチドと接触させるステップを含む方法。
【請求項６】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項７】
請求項２に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項８】
配列番号１又は配列番号３の配列を有する、請求項６に記載の単離された核酸。
【請求項９】
配列番号２又は配列番号５の請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）由来でないプロモーターであって、植物内で発現を推進する能力を有するプロモーターに作動可能に連結した請求項６に記載のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物。
【請求項１１】
ゲノムに安定的に組み込まれた請求項１０に記載のＤＮＡ構築物を含む遺伝子組換え植物。
【請求項１２】
有害生物から植物を保護する方法であって、請求項１０に記載の構築物を前記植物に導入するステップを含む方法。
【請求項１３】
コーンルートワームに対する活性を有する、請求項１又は請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
コーンルートワームの必須遺伝子を抑制するｄｓＲＮＡを含む、請求項１１に記載の遺伝子組換え植物。
【請求項１５】
前記必須遺伝子が、液胞型ＡＴＰアーゼ、ＡＲＦ−１、Ａｃｔ４２Ａ、ＣＨＤ３、ＥＦ−１α、及びＴＦＩＩＢからなる群より選択される、請求項１４に記載の遺伝子組換え植物。
【請求項１６】
害虫の必須遺伝子を抑制するｄｓＲＮＡを含む、請求項１１に記載の遺伝子組換え植物。
【請求項１】
（ａ）配列番号２の残基１１４〜６５５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｂ）配列番号２の残基１１４〜６５５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、および
（ｃ）配列番号２によりコードされる毒素の発現又は活性に悪影響を及ぼさない最大２０個のアミノ酸の置換、欠損、又は修飾を含む、配列番号２の残基１１４〜６５５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
から構成される群より選択されるコア毒素セグメントを含む単離されたポリペプチド又はその殺虫剤として活性な断片。
【請求項２】
（ａ）配列番号２の残基１〜６５５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｂ）配列番号２の残基１〜６５５のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、および
（ｃ）配列番号２によりコードされる毒素の発現又は活性に悪影響を及ぼさない最大２０個のアミノ酸の置換、欠損、又は修飾を含む、配列番号２の残基１〜６５５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
から構成される群より選択されるコア毒素セグメントを含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド又はその殺虫剤として活性な断片。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドを含む植物。
【請求項４】
請求項２に記載のポリペプチドを含む植物。
【請求項５】
有害生物個体群を防除する方法であって、前記個体群を、殺有害生物剤として有効な量の請求項１に記載のポリペプチドと接触させるステップを含む方法。
【請求項６】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項７】
請求項２に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項８】
配列番号１又は配列番号３の配列を有する、請求項６に記載の単離された核酸。
【請求項９】
配列番号２又は配列番号５の請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）由来でないプロモーターであって、植物内で発現を推進する能力を有するプロモーターに作動可能に連結した請求項６に記載のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物。
【請求項１１】
ゲノムに安定的に組み込まれた請求項１０に記載のＤＮＡ構築物を含む遺伝子組換え植物。
【請求項１２】
有害生物から植物を保護する方法であって、請求項１０に記載の構築物を前記植物に導入するステップを含む方法。
【請求項１３】
コーンルートワームに対する活性を有する、請求項１又は請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
コーンルートワームの必須遺伝子を抑制するｄｓＲＮＡを含む、請求項１１に記載の遺伝子組換え植物。
【請求項１５】
前記必須遺伝子が、液胞型ＡＴＰアーゼ、ＡＲＦ−１、Ａｃｔ４２Ａ、ＣＨＤ３、ＥＦ−１α、及びＴＦＩＩＢからなる群より選択される、請求項１４に記載の遺伝子組換え植物。
【請求項１６】
害虫の必須遺伝子を抑制するｄｓＲＮＡを含む、請求項１１に記載の遺伝子組換え植物。
【公表番号】特表２０１２−５２９９１０（Ｐ２０１２−５２９９１０Ａ）
【公表日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１６１５５（Ｐ２０１２−５１６１５５）
【出願日】平成２２年６月１４日（２０１０．６．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３８４７３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４７８７７
【国際公開日】平成２２年１２月２３日（２０１０．１２．２３）
【出願人】（５０１０３５３０９）ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー (197)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月１４日（２０１０．６．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３８４７３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４７８７７
【国際公開日】平成２２年１２月２３日（２０１０．１２．２３）
【出願人】（５０１０３５３０９）ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー (197)
【Ｆターム（参考）】
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