ＤＮＡマイクロアレイ用ハイブリダイゼーション緩衝溶液
【課題】
ＤＮＡマイクロアレイ上のプローブへの蛍光標識されたターゲットのハイブリダイゼーションを促進させることで、高感度に検出することを可能にするハイブリダイゼーション緩衝溶液を提供し、特にハイブリダイゼーション操作を自動化する装置において適用することで、感度の高い検出を可能にする。
【解決手段】
ＤＮＡマイクロアレイ用に用いられるハイブリダイゼーション緩衝溶液に、５％（重量/溶液）以上１５％（重量/溶液）以下の範囲の濃度のポリエチレングリコールを含有させる。
ＤＮＡマイクロアレイ上のプローブへの蛍光標識されたターゲットのハイブリダイゼーションを促進させることで、高感度に検出することを可能にするハイブリダイゼーション緩衝溶液を提供し、特にハイブリダイゼーション操作を自動化する装置において適用することで、感度の高い検出を可能にする。
【解決手段】
ＤＮＡマイクロアレイ用に用いられるハイブリダイゼーション緩衝溶液に、５％（重量/溶液）以上１５％（重量/溶液）以下の範囲の濃度のポリエチレングリコールを含有させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡマイクロアレイにおける核酸ハイブリダイゼーション用の緩衝溶液（以下「ＤＮＡマイクロアレイ用ハイブリダイゼーション緩衝溶液」という）の試薬組成および方法に関する。本発明は、ＤＮＡマイクロアレイ上のプローブへの、蛍光標識したターゲットのハイブリダイズを促進するもので、特にＤＮＡマイクロアレイ用自動ハイブリダイゼーション装置において効果を示すものである。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡマイクロアレイとは、ガラス基盤上に整列させて配置したｃＤＮＡもしくはオリゴヌクレオチドを固定化したものをいう。ＤＮＡマイクロアレイ解析技術は、ｍＲＮＡから調整した蛍光標識したｃＤＮＡをガラス基板上のｃＤＮＡもしくはオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせて検出することで、遺伝子の発現状況を定量化することを可能とするものである。なおガラス基板上に配置したｃＤＮＡもしくはオリゴヌクレオチドをプローブとよび、蛍光標識したｃＤＮＡをターゲットとよぶ。またＤＮＡマイクロアレイでは、一度のハイブリダイゼーション操作で、ガラス基板上のプローブの数だけ発現状況を調べることが可能であり、強力な発現解析ツールとなっている。
【０００３】
従来はＤＮＡマイクロアレイのスライドガラスにハイブリダイゼーション緩衝溶液を滴下し、カバーガラスでシールしてハイブリダイゼーションが行われていたが、近年、より簡便にかつ均一にハイブリダイズさせることが可能なＤＮＡマイクロアレイ用自動ハイブリダイゼーション装置が登場し、同装置に適したハイブリダイゼーション方法が求められている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、装置を用いずにＤＮＡマイクロアレイのガラスにカバーガラスを用いてシールしてハイブリダイゼーションを行う方法（以下、「手動ハイブリダイゼーション法」）では、必要とされるハイブリダイゼーション緩衝溶液量が最も少量で行われる場合には１０から２０μｌですむのに対し、ＤＮＡマイクロアレイ用自動ハイブリダイゼーション装置では、必要とされるハイブリダイゼーション緩衝溶液量は１００から２００μｌとなる。従って、同じ量の蛍光標識したターゲットを用いた場合に、ターゲット濃度がＤＮＡマイクロアレイ用自動ハイブリダイゼーション装置を用いた場合には、手動ハイブリダイゼーション法の１／１０程度となり、結果として検出感度の大幅な低下をもたらすことになる。
【０００５】
また、蛍光標識されたターゲットの調製は非常に高価であり、ＤＮＡマイクロアレイ用自動ハイブリダイゼーション装置のためにターゲットを大量に調製することは、コストの面から大変難しい状況である。そのためにＤＮＡマイクロアレイ上のプローブへのターゲットのハイブリダイゼーションを促進させることで検出感度を向上させ、ＤＮＡマイクロアレイ用自動ハイブリダイゼーション装置を用いても手動ハイブリダイゼーション法と同等の検出が可能となるハイブリダイゼーション緩衝溶液およびその適用方法の開発が求められている。
【０００６】
そこで、本発明は上記課題を鑑み、より感度を向上させることが可能なＤＮＡマイクロアレイ用ハイブリダイゼーション緩衝溶液を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ＤＮＡマイクロアレイのハイブリダイゼーション緩衝溶液として一般に用いられている組成に５％以上１５％以下のＰＥＧ（ポリエチレングリコール：Ｐｏｌｙ Ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ）を添加することでＤＮＡマイクロアレイ上のプローブへのターゲットの結合が促進され、検出されるシグナル強度が増大することを見いだした。またナイロンメンブレンなどを用いた場合とは異り、ＰＥＧを添加してもバックグランドの明瞭な増加は認められず、Ｓ／Ｎ比が向上することを見いだした。更に、ＰＥＧには重合度の違いによってさまざまな平均分子量の種類が存在するため、平均分子量として１０００から２００００までのＰＥＧについてハイブリダイゼーション促進効果を検討し、至適分子量が平均２０００以上１００００未満であることを見出し、本発明を完成させるに至った。なお本明細書でいう「平均分子量」はＪＩＳ規格による中和滴定法によって算定される。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）５％（重量／容量）以上１５％（重量/溶量）以下の範囲の濃度でＰＥＧを含むＤＮＡマイクロアレイ用ハイブリダイゼーション緩衝溶液。
（２）ＰＥＧの平均分子量は２０００以上１００００未満の範囲である上記（１）のＤＮＡマイクロアレイ用ハイブリダイゼーション緩衝溶液。
（３）５％（重量／容量）以上１０％（重量/溶量）以下の範囲の濃度でＰＥＧを含むＤＮＡマイクロアレイ用ハイブリダイゼーション緩衝溶液。
（４）ＰＥＧの平均分子量は２０００以上１００００未満の範囲である上記（３）のＤＮＡマイクロアレイ用ハイブリダイゼーション緩衝溶液。
【発明の効果】
【０００９】
以上、ＤＮＡマイクロアレイ解析においてハイブリダイゼーション緩衝溶液にＰＥＧを添加することによりＤＮＡマイクロアレイのガラス上のプローブへのターゲットの結合が促進され、より検出感度が向上する。特に、手動ハイブリダイゼーション法に比較して、操作は簡易であるが（同量のターゲットを用いる場合に）感度が落ちるとされているＤＮＡマイクロアレイ用自動ハイブリダイゼーション装置を用いた場合であっても、検出感度を大幅に改善する効果が得られる。更に、高いコストがかかるターゲット作製においても、必要とされるターゲット量の低減を図ることができ、ＤＮＡマイクロアレイ解析のコスト削減の効果も得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を実施するための形態について説明する。
【００１１】
本ＤＮＡマイクロアレイ用のハイブリダイゼーション緩衝溶液は、ＰＥＧを５％（重量／容量）以上１５％（重量/溶量）以下の範囲の濃度でＰＥＧを含むＤＮＡマイクロアレイ用ハイブリダイゼーション緩衝溶液である。また本ＤＮＡマイクロアレイ用のハイブリダイゼーション緩衝溶液の他の成分としては特段に制限は無く、一般に使用されている組成のものを用いることができる。例えば、５×ＳＳＣ溶液（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ
ＮａＣｌ、０．３Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）や、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ溶液（ＳＤＳはラウリル硫酸ナトリウムを示す）等を使用することができる。用いるＰＥＧの濃度としては、５％以上１５％未満の範囲であることが望ましく、より望ましくは５％以上１０％以下の範囲である。ＰＥＧの添加量が５％よりも少ない場合は、ハイブリダイゼーションにおける感度向上の効果を得ることが難しくなる一方、１５％よりも多くなってしまうと、緩衝溶液の粘度が増加しすぎてターゲットをプローブに均一にハイブリダイズさせることが困難となってしまうためである。また、ＰＥＧの平均分子量としては、２０００以上１００００未満であることが好ましく、より望ましくは２０００以上８０００以下である。分子量が２０００より小さいとＰＥＧによる感度向上の効果が得にくく、分子量が１００００以上の場合も、緩衝溶液の粘度が増加し、ターゲットをプローブに均一にハイブリダイズさせることが困難となるためである。
【００１２】
本ＤＮＡマイクロアレイ用のハイブリダイゼーション緩衝溶液が有効な効果を発揮するハイブリダイゼーション装置としては様々な装置を用いることができるが、例えば、スライドガラスを基板とするＤＮＡマイクロアレイ用のハイブリダイゼーション装置が好適である。これらの装置ではハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション後のＤＮＡマイクロアレイの洗浄などが自動で行えるようになっており、熟練が必要とされる手動ハイブリダイゼーション法とは異り、簡便にＤＮＡマイクロアレイのハイブリダイゼーションを行うことができる。
【００１３】
ＤＮＡマイクロアレイ上のｃＤＮＡ若しくはオリゴヌクレオチドなどのプローブに結合させるターゲットとしては、ｍＲＮＡ若しくはｔｏｔａｌ ＲＮＡから逆転写によって蛍光標識されたｃＤＮＡを用いるのが一般的である。標識に用いる蛍光物質にはＣｙ３やＣｙ５が用いられる。なお標識には市販されているキットを用いることができ、通常、一回の標識に２５μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いて逆転写を行い、得られた蛍光標識されたｃＤＮＡをターゲットとしてハイブリダイゼーションに用いる。標識方法には蛍光標識された核酸を基質に用いる直接法と、化学修飾された核酸を基質に用い、合成されたｃＤＮＡにあとから蛍光物質を結合させる間接法があるが、どちらの方法で調製されたターゲットであっても適用可能である。
【００１４】
以上、ＤＮＡマイクロアレイのガラス上のプローブへのターゲットの結合が促進され、検出感度をより向上させることができる。特に、手動ハイブリダイゼーション法に比較して、操作は簡易であるが（同量のターゲットを用いる場合に）感度が落ちるとされているＤＮＡマイクロアレイ用自動ハイブリダイゼーション装置を用いた場合であっても、検出感度を大幅に改善する効果が得られる。更に、高いコストがかかるターゲット作製においても、必要とされるターゲット量の低減を図ることができ、ＤＮＡマイクロアレイ解析のコスト削減の効果も得られる。なお、具体的な効果の確認については以下記載の実施例により明らかとなる。
【００１５】
（実施例１）ＤＮＡマイクロアレイ用ハイブリダイゼーション緩衝溶液へのＰＥＧ添加がシグナル強度に与える影響の検討
【００１６】
本実施例のＤＮＡマイクロアレイ用のハイブリダイゼーション緩衝溶液における一例として、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、に０〜５％のＰＥＧ＃６０００（平均分子量６０００）のものを用いた。
【００１７】
（１）タバコｃＤＮＡマイクロアレイの作製
（ｉ）タバコｃＤＮＡの単離
タバコの幼植物体からｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製し、逆転写反応によりｃＤＮＡに変換した。得られたｃＤＮＡをプラスミドベクターに接続し、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。そしてこのｃＤＮＡライブラリーから任意に選んだｃＤＮＡクローンの塩基配列を決定し、１７６種の異なる塩基配列を有するクローンを選抜した。
（ｉｉ）ｃＤＮＡの増幅と精製
選ばれたｃＤＮＡクローンのインサート部分をＰＣＲにより増幅し、増幅産物であるｃＤＮＡをガラス繊維に吸着させた後、エタノールで洗浄し、蒸留水に溶出させることで精製した。この精製には日本ミリポア社のマルチスクリーンＦＢを用いた。ｃＤＮＡの濃度は吸光度を測定することで定量し、濃度を０．１μｇ／μｌに調整した。
（ｉｉｉ）ｃＤＮＡのガラス基盤へのスポッティング
上記した１７６種のｃＤＮＡを、アマシャムバイオサイエンス社のＬｕｃｉｄｅａ ＡｒｒａｙＳｐｏｔｔｅｒを用いて、タカラバイオ社のＴａＫａＲａ−Ｈｕｂｂｌｅ Ｓｌｉｄｅ Ｇｌａｓｓにスポッティングした。スポッティング用溶液は０．１μｇ／μｌのｃＤＮＡ溶液１５μｌに等量のクロスリンカー溶液（東洋鋼鈑株式会社製）を加えて調製した。スポッティングはＬｕｃｉｄｅａ Ａｒｒａｙ Ｓｐｏｔｔｅｒの取扱説明書に従いキャピラリーペンにより行った。スポッティングが済んだＴａＫａＲａ−Ｈｕｂｂｌｅ Ｓｌｉｄｅ Ｇｌａｓｓは、アルカリ溶液による洗浄と蒸留水による洗浄からなる後処理をＴａＫａＲａ−Ｈｕｂｂｌｅ Ｓｌｉｄｅ Ｇｌａｓｓの取扱説明書に従って行い、タバコｃＤＮＡマイクロアレイとした。
【００１８】
（２）ターゲットの作製
（ｉ）タバコの葉よりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、インビトロジェン社製のＦｌｕｏｒｏｓｃｒｉｐｔ（登録商標） ｃＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍキットを用いて、Ｃｙ３標識ｃＤＮＡ（ターゲット）を調製した。逆転写反応には１サンプルあたり１２．５μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いた。標識反応はキットの取扱説明書に従って行った。
（ｉｉ）ターゲットは標識後にキットに付属のカラムで精製し、真空遠心エバポレーターで乾燥させた。
（ｉｉｉ）乾燥させたそれぞれのサンプルに１３３μｌの下記（ａ）〜（ｃ）の組成の溶液を加えて溶解させた後、９５℃で３分間熱変性させた。
（ａ）５×ＳＳＣ
（ｂ）５×ＳＳＣ、５％ ＰＥＧ＃６０００（平均分子量６０００）
（ｃ）５×ＳＳＣ、１０％ ＰＥＧ＃６０００（平均分子量６０００）
（ｉｖ）変性後室温に５分間放置し、１０％ＳＤＳ溶液を７μｌ加え、終濃度を０．５％としてターゲット含有ハイブリダイゼーション緩衝溶液を調製した。その後ハイブリダイゼーション開始時まで７５℃で保温した。
【００１９】
（３）ＤＮＡマイクロアレイ用自動ハイブリダイゼーション装置によるハイブリダイゼーション
（ｉ）ゲノミックソリューションズ社製のＧｅｎｅ ＴＡＣ（登録商標） Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ＳｔａｔｉｏｎにタバコｃＤＮＡマイクロアレイをセットし、以下の条件でハイブリダイゼーションを行った。
（ａ）Ｏ−リングの馴染ませ処理：７５℃ ２分
（ｂ）ターゲット溶液の注入：７５℃
（ｃ）ハイブリダイゼーション第１ステップ：６５℃ ３時間 保温
（ｄ）ハイブリダイゼーション第２ステップ：５５℃ ３時間 保温
（ｅ）ハイブリダイゼーション第３ステップ：５０℃ １２時間 保温
（ｆ）洗浄第１ステップ ：２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ溶液にて２５℃、５分間洗浄
（ｇ）洗浄第２ステップ ：２×ＳＳＣ溶液にて２５℃、２分間洗浄
【００２０】
（４）スキャニング
洗浄が終了したスライドガラスを遠心乾燥した。プローブにハイブリダイズしたターゲットの蛍光は、Ｃｙ３の蛍光を読み取ることができるスキャナ（ゲノミックソリューションズ社製Ｇｅｎｅ ＴＡＣ（登録商標）ＵＣ−４）を用いて行った。
【００２１】
（５）得られた蛍光強度の定量化
各ｃＤＮＡにハイブリダイズしたターゲットから得られる蛍光強度は、スキャナに付属の定量化ソフトによって定量した。スポットの周囲のガラス基板の蛍光強度をバックグラウンドとして、各スポットの蛍光強度の比をＳ／Ｎ比として算出した。１７６種のｃＤＮＡスポットから得られたＳ／Ｎ比を平均した。
【００２２】
（６）結果
スキャニングによって得られた画像を図１に示す。これはターゲット溶液中のＰＥＧ＃６０００の濃度によるハイブリダイゼーション促進効果の検討を行ったものである。この結果、ＰＥＧ濃度が上昇するにつれてシグナルが増強することがわかった。また、バックグラウンドの蛍光強度に対する各ｃＤＮＡのスポット上の蛍光強度の比であるＳ／Ｎ比を計算し、１７６種のｃＤＮＡスポットに対して平均化した結果を図２に示す。ターゲット溶液中にＰＥＧを１０％添加した場合、ＰＥＧを添加しない場合に比べて２倍もＳ／Ｎ比が増加していることがわかった。この結果はＰＥＧの添加が、バックグラウンドの蛍光強度を上げることなくハイブリダイゼーションを促進する効果があることを示している。ただし１５％を越える濃度のＰＥＧをハイブリダイゼーション緩衝溶液に加えた場合には、ターゲットをプローブに均一にハイブリダイズさせることが困難であった。
【００２３】
（実施例２）重合度の異なるＰＥＧがハイブリダイゼーションに与える影響の検討
【００２４】
（１）タバコｃＤＮＡマイクロアレイの作製
上記実施例１と同様にタバコｃＤＮＡマイクロアレイを作製した。
【００２５】
（２）ターゲットの作製
（ｉ）タバコの葉よりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、インビトロジェン社のＦｌｕｏｒｏｓｃｒｉｐｔ（登録商標） ｃＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍキットを用いて、Ｃｙ３標識ｃＤＮＡ（ターゲット）を調製した。逆転写反応には１サンプルあたり１２．５μｇのｔｏｔａｌ
ＲＮＡを用いた。標識反応はキットの取扱説明書に従って行った。
（ｉｉ）ターゲットは標識後にキットに付属のカラムで精製し、真空遠心エバポレーターで乾燥させた。
（ｉｉｉ）乾燥させたそれぞれのサンプルに１３３μｌの下記（ａ）〜（ｆ）の組成の溶液を加えて溶解させた後、９５℃で３分間熱変性させた。
（ａ）５×ＳＳＣ
（ｂ）５×ＳＳＣ、５％ ＰＥＧ＃１０００（平均分子量１０００）
（ｃ）５×ＳＳＣ、５％ ＰＥＧ＃２０００（平均分子量２０００）
（ｄ）５×ＳＳＣ、５％ ＰＥＧ＃６０００（平均分子量６０００）
（ｅ）５×ＳＳＣ、５％ ＰＥＧ＃１００００（平均分子量１００００）
（ｆ）５×ＳＳＣ、５％ ＰＥＧ＃２００００（平均分子量２００００）
(ｉｖ)変性後室温に５分間放置し、１０％ＳＤＳ溶液を７μｌ加え、終濃度を０．５として、ターゲット含有ハイブリダイゼーション緩衝溶液を調製した。その後ハイブリダイゼーション開始時まで７５℃で保温した。
【００２６】
（３）ＤＮＡマイクロアレイ用自動ハイブリダイゼーション装置によるハイブリダイゼーション
ゲノミックソリューションズ社製のＧｅｎｅ ＴＡＣ（登録商標） Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ＳｔａｔｉｏｎにタバコｃＤＮＡマイクロアレイをセットし、上記実施例１と同様な操作方法によりハイブリダイゼーションおよびＤＮＡマイクロアレイの洗浄を行った。
【００２７】
（４）スキャニング
洗浄が終了したスライドガラスは、遠心乾燥させた。プローブにハイブリダイズしたターゲットの蛍光は、Ｃｙ３の蛍光を読み取ることができるスキャナ（ゲノミックソリューションズ社製のＧｅｎｅ ＴＡＣ（登録商標） ＵＣ−４）を用いて行った。
【００２８】
（５）得られた蛍光強度の定量化
各ｃＤＮＡにハイブリダイズしたターゲットから得られる蛍光強度は、スキャナに付属の定量化ソフトによって定量した。スポットの周囲のガラス基板の蛍光強度をバックグラウンドとして、各スポットの蛍光強度の比をＳ／Ｎ比として算出した。上記の１７６種のｃＤＮＡスポットから得られたＳ／Ｎ比を平均した。
【００２９】
（６）結果
バックグラウンドの蛍光強度に対する各ｃＤＮＡのスポット上の蛍光強度の比であるＳ／Ｎ比を計算し、１７６種のｃＤＮＡスポットに対して平均化した結果を図３に示す。ターゲット溶液中に各種の重合度のＰＥＧを５％添加した場合、ＰＥＧの平均分子量の違いによってハイブリダイゼーションの促進効果に大きな違いが生じることが明らかになった。ハイブリダイゼーションの促進効果は平均分子量が２０００のＰＥＧから認められ、平均分子量が６０００のものではＳ／Ｎ比がＰＥＧを添加していなサンプルと比較して２倍以上に向上した。しかし、平均分子量１００００、２００００のＰＥＧでは、ＤＮＡマイクロアレイのハイブリダイゼーションを促進する効果は認められなかった。
【００３０】
（実施例３）ハイブリダイゼーション緩衝溶液中のターゲット濃度が検出結果に与える影響の検討
【００３１】
（１）タバコｃＤＮＡマイクロアレイの作製
実施例１と同様にタバコｃＤＮＡマイクロアレイを作製した。
【００３２】
（２）ターゲットの作製
（ｉ）タバコの葉よりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、インビトロジェン社のＦｌｕｏｒｏｓｃｒｉｐｔ（登録商標） ｃＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍキットを用いて、Ｃｙ３標識ｃＤＮＡ（ターゲット）を調製した。逆転写反応には５０μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いた。標識反応はキットの取扱説明書に従って行った。
（ｉｉ）Ｃｙ３ 標識ｃＤＮＡはキットに付属のカラムで精製し、下記（ａ）から（ｃ）に記載の量にそれぞれ分割した。通常の方法では、１回のＤＮＡマイクロアレイに２５μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡから得られた蛍光標識ｃＤＮＡを用いる。したがって、１２．５μｇ及び６．２５μｇ分のｔｏｔａｌ ＲＮＡから得られた蛍光標識は、本来用いる量の１／２および１／４となる。
（ａ）２５μｇ分のｔｏｔａｌ ＲＮＡから調製されたターゲット（１／１希釈）
（ｂ）１２．５μｇ分のｔｏｔａｌ ＲＮＡから調製されたターゲット（１／２希釈）
（ｃ）６．２５μｇ分のｔｏｔａｌ ＲＮＡから調製されたターゲット（１／４希釈）
そして、この（ａ）から（ｃ）のターゲットを真空遠心エバポレーターで乾燥させた。
（ｉｉｉ）乾燥させたそれぞれのターゲットに１３３μｌの５×ＳＳＣ、５％ ＰＥＧ＃６０００溶液を加えて溶解させた後、９５℃で３分間熱変性させた。
（ｉｖ）変性後室温に５分間放置し、１０％ＳＤＳ溶液を７μｌ加え、終濃度を０．５％として、ターゲット含有ハイブリダイゼーション緩衝溶液を調製した。その後ハイブリダイゼーション開始時まで７５℃で保温した。
【００３３】
（３）ＤＮＡマイクロアレイ用自動ハイブリダイゼーション装置によるハイブリダイゼーション
ゲノミックソリューションズ社製のＧｅｎｅ ＴＡＣ（登録商標） Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ＳｔａｔｉｏｎにタバコｃＤＮＡマイクロアレイをセットし、実施例１と同様な操作方法によりハイブリダイゼーションおよびＤＮＡマイクロアレイの洗浄を行った。
【００３４】
（４）スキャニング
洗浄が終了したスライドガラスは、遠心乾燥させた。プローブにハイブリダイズしたターゲットの蛍光は、Ｃｙ３の蛍光を読み取ることができるスキャナ（ゲノミックソリューションズ社製のＧｅｎｅ ＴＡＣ（登録商標） ＵＣ−４）を用いて行った。
【００３５】
（５）得られた蛍光強度の定量化
各ｃＤＮＡにハイブリダイズしたターゲットから得られる蛍光強度は、スキャナに付属の定量化ソフトによって定量した。スポットの周囲のガラス基板の蛍光強度をバックグラウンドとして、各スポットの蛍光強度の比をＳ／Ｎとして算出した。１７６種のｃＤＮＡスポットから得られたＳ／Ｎ比を平均した。
【００３６】
（６）結果
ＰＥＧは水分子を周囲に引きつけるがターゲット分子は引きつけないために、水に溶けているターゲットの濃度を高めるのと同様な効果をもたらすことで、ハイブリダイゼーションの促進効果をもたらしていると考えられる。そこで、ターゲットの濃度が濃いサンプルと薄いサンプルに対する、ＰＥＧの効果を調べた。すると、ターゲットの濃度が本来用いる量の１／４になっても得られるＳ／Ｎ比は薄めていないものと同等であり、また得られる画像のパターンも基本的に同じであることが見出された。この結果は、ＰＥＧのハイブリダイゼーションの促進効果によって、ターゲット濃度がある程度異なっても、安定したハイブリダイゼーションの結果を得ることが可能であることを示している。
【００３７】
（実施例４）平均分子量２０００のＰＥＧがハイブリダイゼーションに与える影響の検討
【００３８】
（１）
タバコｃＤＮＡマイクロアレイの作製
上記実施例１と同様にタバコｃＤＮＡマイクロアレイを作製した。
【００３９】
（２）
ターゲットの作製
（ｉ）タバコの葉よりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、インビトロジェン社のＦｌｕｏｒｏｓｃｒｉｐｔ（登録商標） ｃＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍキットを用いて、Ｃｙ３標識ｃＤＮＡ（ターゲット）を調製した。逆転写反応には１サンプルあたり１２．５μｇのｔｏｔａｌ
ＲＮＡを用いた。標識反応はキットの取扱説明書に従って行った。
（ｉｉ）ターゲットは標識後にキットに付属のカラムで精製し、真空遠心エバポレーターで乾燥させた。
（ｉｉｉ）乾燥させたそれぞれのサンプルに１３３μｌの下記（ａ）〜（ｃ）の組成の溶液を加えて溶解させた後、９５℃で３分間熱変性させた。
（ａ）５×ＳＳＣ、５％ ＰＥＧ＃６０００（平均分子量６０００）
（ｂ）５×ＳＳＣ、１０％ ＰＥＧ＃２０００（平均分子量２０００）
（ｃ）５×ＳＳＣ、１５％ ＰＥＧ＃２０００（平均分子量２０００）
(ｉｖ)変性後室温に５分間放置し、１０％ＳＤＳ溶液を７μｌ加え、終濃度を０．５％として、ターゲット含有ハイブリダイゼーション緩衝溶液を調製した。その後ハイブリダイゼーション開始時まで７５℃で保温した。
【００４０】
（３）ＤＮＡマイクロアレイ用自動ハイブリダイゼーション装置によるハイブリダイゼーション
ゲノミックソリューションズ社製のＧｅｎｅ ＴＡＣ（登録商標） Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ＳｔａｔｉｏｎにタバコｃＤＮＡマイクロアレイをセットし、上記実施例１と同様な操作方法によりハイブリダイゼーションおよびＤＮＡマイクロアレイの洗浄を行った。
【００４１】
（４）スキャニング
洗浄が終了したスライドガラスは、遠心乾燥させた。プローブにハイブリダイズしたターゲットの蛍光は、Ｃｙ３の蛍光を読み取ることができるスキャナ（ゲノミックソリューションズ社製のＧｅｎｅ ＴＡＣ（登録商標） ＵＣ−４）を用いて行った。
【００４２】
（５）得られた蛍光強度の定量化
各ｃＤＮＡにハイブリダイズしたターゲットから得られる蛍光強度は、スキャナに付属の定量化ソフトによって定量した。スポットの周囲のガラス基板の蛍光強度をバックグラウンドとして、各スポットの蛍光強度の比をＳ／Ｎ比として算出した。上記の１７６種のｃＤＮＡスポットから得られたＳ／Ｎ比を平均した。
【００４３】
（６）結果
バックグラウンドの蛍光強度に対する各ｃＤＮＡのスポット上の蛍光強度の比であるＳ／Ｎ比を計算し、１７６種のｃＤＮＡスポットに対して平均化した結果を図５に示す。５％の添加では平均分子量６０００のＰＥＧが平均分子量２０００のＰＥＧよりもハイブリダイゼーションの促進効果は高い。ただし平均分子量２０００のＰＥＧ５％溶液は同じ濃度の平均分子量６０００のＰＥＧ溶液と比較して粘性が低い。そこで平均分子量２０００のＰＥＧをより高濃度に含む緩衝液によるハイブリダイゼーションの促進効果を調べた。その結果、平均分子量２０００のＰＥＧを１０％もしくは１５％含む緩衝液では、平均分子量６０００のＰＥＧを５％添加した場合と比較して、よりハイブリダイゼーションを促進する効果があった。しかしながら、１５％以上の濃度では粘性が大きくなり、均一なハイブリダイゼーションを得ることが難しいため、望ましいハイブリダイゼーション緩衝溶液としては、平均分子量２０００のＰＥＧを１５％未満、より望ましくは１０％以下含む緩衝溶液が好適である。
【００４４】
以上のように、ＤＮＡマイクロアレイ解析においてハイブリダイゼーション緩衝溶液にＰＥＧを添加することで、ＤＮＡマイクロアレイのプローブにターゲットが結合するのが促進され、検出感度が向上することが見出された。手動ハイブリダイゼーション法に比較して、操作は簡易であるが感度が落ちるとされているＤＮＡマイクロアレイ用自動ハイブリダイゼーション装置に適用することで、検出感度が大幅に改善する効果が得られる。また、高いコストがかかるターゲット作製においても、必要とされるターゲット量の低減も本発明により可能になるために、ＤＮＡマイクロアレイ解析のコスト削減の効果も得られる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ＰＥＧを添加したハイブリダイゼーション緩衝溶液と添加していない緩衝液でのタバコｃＤＮＡマイクロアレイの結果を示す図。
【図２】１７６個のプローブにハイブリダイズしたターゲットの蛍光強度とバックグラウンドとのＳ／Ｎ比に及ぼすＰＥＧの添加の効果を示す図。
【図３】１７６個のプローブにハイブリダイズしたターゲットの蛍光強度とバックグラウンドとのＳ／Ｎ比に及ぼす平均分子量の異なるＰＥＧの添加の効果を示す図。
【図４】濃度の異なるターゲットを含有するハイブリダイゼーション緩衝溶液によって得られる、１７６個のプローブにハイブリダイズしたターゲットの蛍光強度とバックグラウンドの蛍光強度のＳ／Ｎ比を示す図。
【図５】１７６個のプローブにハイブリダイズしたターゲットの蛍光強度とバックグラウンドとのＳ／Ｎ比に及ぼす平均分子量２０００のＰＥＧを１０％および１５％の濃度で添加した場合の効果を示す図。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡマイクロアレイにおける核酸ハイブリダイゼーション用の緩衝溶液（以下「ＤＮＡマイクロアレイ用ハイブリダイゼーション緩衝溶液」という）の試薬組成および方法に関する。本発明は、ＤＮＡマイクロアレイ上のプローブへの、蛍光標識したターゲットのハイブリダイズを促進するもので、特にＤＮＡマイクロアレイ用自動ハイブリダイゼーション装置において効果を示すものである。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡマイクロアレイとは、ガラス基盤上に整列させて配置したｃＤＮＡもしくはオリゴヌクレオチドを固定化したものをいう。ＤＮＡマイクロアレイ解析技術は、ｍＲＮＡから調整した蛍光標識したｃＤＮＡをガラス基板上のｃＤＮＡもしくはオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせて検出することで、遺伝子の発現状況を定量化することを可能とするものである。なおガラス基板上に配置したｃＤＮＡもしくはオリゴヌクレオチドをプローブとよび、蛍光標識したｃＤＮＡをターゲットとよぶ。またＤＮＡマイクロアレイでは、一度のハイブリダイゼーション操作で、ガラス基板上のプローブの数だけ発現状況を調べることが可能であり、強力な発現解析ツールとなっている。
【０００３】
従来はＤＮＡマイクロアレイのスライドガラスにハイブリダイゼーション緩衝溶液を滴下し、カバーガラスでシールしてハイブリダイゼーションが行われていたが、近年、より簡便にかつ均一にハイブリダイズさせることが可能なＤＮＡマイクロアレイ用自動ハイブリダイゼーション装置が登場し、同装置に適したハイブリダイゼーション方法が求められている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、装置を用いずにＤＮＡマイクロアレイのガラスにカバーガラスを用いてシールしてハイブリダイゼーションを行う方法（以下、「手動ハイブリダイゼーション法」）では、必要とされるハイブリダイゼーション緩衝溶液量が最も少量で行われる場合には１０から２０μｌですむのに対し、ＤＮＡマイクロアレイ用自動ハイブリダイゼーション装置では、必要とされるハイブリダイゼーション緩衝溶液量は１００から２００μｌとなる。従って、同じ量の蛍光標識したターゲットを用いた場合に、ターゲット濃度がＤＮＡマイクロアレイ用自動ハイブリダイゼーション装置を用いた場合には、手動ハイブリダイゼーション法の１／１０程度となり、結果として検出感度の大幅な低下をもたらすことになる。
【０００５】
また、蛍光標識されたターゲットの調製は非常に高価であり、ＤＮＡマイクロアレイ用自動ハイブリダイゼーション装置のためにターゲットを大量に調製することは、コストの面から大変難しい状況である。そのためにＤＮＡマイクロアレイ上のプローブへのターゲットのハイブリダイゼーションを促進させることで検出感度を向上させ、ＤＮＡマイクロアレイ用自動ハイブリダイゼーション装置を用いても手動ハイブリダイゼーション法と同等の検出が可能となるハイブリダイゼーション緩衝溶液およびその適用方法の開発が求められている。
【０００６】
そこで、本発明は上記課題を鑑み、より感度を向上させることが可能なＤＮＡマイクロアレイ用ハイブリダイゼーション緩衝溶液を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ＤＮＡマイクロアレイのハイブリダイゼーション緩衝溶液として一般に用いられている組成に５％以上１５％以下のＰＥＧ（ポリエチレングリコール：Ｐｏｌｙ Ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ）を添加することでＤＮＡマイクロアレイ上のプローブへのターゲットの結合が促進され、検出されるシグナル強度が増大することを見いだした。またナイロンメンブレンなどを用いた場合とは異り、ＰＥＧを添加してもバックグランドの明瞭な増加は認められず、Ｓ／Ｎ比が向上することを見いだした。更に、ＰＥＧには重合度の違いによってさまざまな平均分子量の種類が存在するため、平均分子量として１０００から２００００までのＰＥＧについてハイブリダイゼーション促進効果を検討し、至適分子量が平均２０００以上１００００未満であることを見出し、本発明を完成させるに至った。なお本明細書でいう「平均分子量」はＪＩＳ規格による中和滴定法によって算定される。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）５％（重量／容量）以上１５％（重量/溶量）以下の範囲の濃度でＰＥＧを含むＤＮＡマイクロアレイ用ハイブリダイゼーション緩衝溶液。
（２）ＰＥＧの平均分子量は２０００以上１００００未満の範囲である上記（１）のＤＮＡマイクロアレイ用ハイブリダイゼーション緩衝溶液。
（３）５％（重量／容量）以上１０％（重量/溶量）以下の範囲の濃度でＰＥＧを含むＤＮＡマイクロアレイ用ハイブリダイゼーション緩衝溶液。
（４）ＰＥＧの平均分子量は２０００以上１００００未満の範囲である上記（３）のＤＮＡマイクロアレイ用ハイブリダイゼーション緩衝溶液。
【発明の効果】
【０００９】
以上、ＤＮＡマイクロアレイ解析においてハイブリダイゼーション緩衝溶液にＰＥＧを添加することによりＤＮＡマイクロアレイのガラス上のプローブへのターゲットの結合が促進され、より検出感度が向上する。特に、手動ハイブリダイゼーション法に比較して、操作は簡易であるが（同量のターゲットを用いる場合に）感度が落ちるとされているＤＮＡマイクロアレイ用自動ハイブリダイゼーション装置を用いた場合であっても、検出感度を大幅に改善する効果が得られる。更に、高いコストがかかるターゲット作製においても、必要とされるターゲット量の低減を図ることができ、ＤＮＡマイクロアレイ解析のコスト削減の効果も得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を実施するための形態について説明する。
【００１１】
本ＤＮＡマイクロアレイ用のハイブリダイゼーション緩衝溶液は、ＰＥＧを５％（重量／容量）以上１５％（重量/溶量）以下の範囲の濃度でＰＥＧを含むＤＮＡマイクロアレイ用ハイブリダイゼーション緩衝溶液である。また本ＤＮＡマイクロアレイ用のハイブリダイゼーション緩衝溶液の他の成分としては特段に制限は無く、一般に使用されている組成のものを用いることができる。例えば、５×ＳＳＣ溶液（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ
ＮａＣｌ、０．３Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）や、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ溶液（ＳＤＳはラウリル硫酸ナトリウムを示す）等を使用することができる。用いるＰＥＧの濃度としては、５％以上１５％未満の範囲であることが望ましく、より望ましくは５％以上１０％以下の範囲である。ＰＥＧの添加量が５％よりも少ない場合は、ハイブリダイゼーションにおける感度向上の効果を得ることが難しくなる一方、１５％よりも多くなってしまうと、緩衝溶液の粘度が増加しすぎてターゲットをプローブに均一にハイブリダイズさせることが困難となってしまうためである。また、ＰＥＧの平均分子量としては、２０００以上１００００未満であることが好ましく、より望ましくは２０００以上８０００以下である。分子量が２０００より小さいとＰＥＧによる感度向上の効果が得にくく、分子量が１００００以上の場合も、緩衝溶液の粘度が増加し、ターゲットをプローブに均一にハイブリダイズさせることが困難となるためである。
【００１２】
本ＤＮＡマイクロアレイ用のハイブリダイゼーション緩衝溶液が有効な効果を発揮するハイブリダイゼーション装置としては様々な装置を用いることができるが、例えば、スライドガラスを基板とするＤＮＡマイクロアレイ用のハイブリダイゼーション装置が好適である。これらの装置ではハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション後のＤＮＡマイクロアレイの洗浄などが自動で行えるようになっており、熟練が必要とされる手動ハイブリダイゼーション法とは異り、簡便にＤＮＡマイクロアレイのハイブリダイゼーションを行うことができる。
【００１３】
ＤＮＡマイクロアレイ上のｃＤＮＡ若しくはオリゴヌクレオチドなどのプローブに結合させるターゲットとしては、ｍＲＮＡ若しくはｔｏｔａｌ ＲＮＡから逆転写によって蛍光標識されたｃＤＮＡを用いるのが一般的である。標識に用いる蛍光物質にはＣｙ３やＣｙ５が用いられる。なお標識には市販されているキットを用いることができ、通常、一回の標識に２５μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いて逆転写を行い、得られた蛍光標識されたｃＤＮＡをターゲットとしてハイブリダイゼーションに用いる。標識方法には蛍光標識された核酸を基質に用いる直接法と、化学修飾された核酸を基質に用い、合成されたｃＤＮＡにあとから蛍光物質を結合させる間接法があるが、どちらの方法で調製されたターゲットであっても適用可能である。
【００１４】
以上、ＤＮＡマイクロアレイのガラス上のプローブへのターゲットの結合が促進され、検出感度をより向上させることができる。特に、手動ハイブリダイゼーション法に比較して、操作は簡易であるが（同量のターゲットを用いる場合に）感度が落ちるとされているＤＮＡマイクロアレイ用自動ハイブリダイゼーション装置を用いた場合であっても、検出感度を大幅に改善する効果が得られる。更に、高いコストがかかるターゲット作製においても、必要とされるターゲット量の低減を図ることができ、ＤＮＡマイクロアレイ解析のコスト削減の効果も得られる。なお、具体的な効果の確認については以下記載の実施例により明らかとなる。
【００１５】
（実施例１）ＤＮＡマイクロアレイ用ハイブリダイゼーション緩衝溶液へのＰＥＧ添加がシグナル強度に与える影響の検討
【００１６】
本実施例のＤＮＡマイクロアレイ用のハイブリダイゼーション緩衝溶液における一例として、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、に０〜５％のＰＥＧ＃６０００（平均分子量６０００）のものを用いた。
【００１７】
（１）タバコｃＤＮＡマイクロアレイの作製
（ｉ）タバコｃＤＮＡの単離
タバコの幼植物体からｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製し、逆転写反応によりｃＤＮＡに変換した。得られたｃＤＮＡをプラスミドベクターに接続し、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。そしてこのｃＤＮＡライブラリーから任意に選んだｃＤＮＡクローンの塩基配列を決定し、１７６種の異なる塩基配列を有するクローンを選抜した。
（ｉｉ）ｃＤＮＡの増幅と精製
選ばれたｃＤＮＡクローンのインサート部分をＰＣＲにより増幅し、増幅産物であるｃＤＮＡをガラス繊維に吸着させた後、エタノールで洗浄し、蒸留水に溶出させることで精製した。この精製には日本ミリポア社のマルチスクリーンＦＢを用いた。ｃＤＮＡの濃度は吸光度を測定することで定量し、濃度を０．１μｇ／μｌに調整した。
（ｉｉｉ）ｃＤＮＡのガラス基盤へのスポッティング
上記した１７６種のｃＤＮＡを、アマシャムバイオサイエンス社のＬｕｃｉｄｅａ ＡｒｒａｙＳｐｏｔｔｅｒを用いて、タカラバイオ社のＴａＫａＲａ−Ｈｕｂｂｌｅ Ｓｌｉｄｅ Ｇｌａｓｓにスポッティングした。スポッティング用溶液は０．１μｇ／μｌのｃＤＮＡ溶液１５μｌに等量のクロスリンカー溶液（東洋鋼鈑株式会社製）を加えて調製した。スポッティングはＬｕｃｉｄｅａ Ａｒｒａｙ Ｓｐｏｔｔｅｒの取扱説明書に従いキャピラリーペンにより行った。スポッティングが済んだＴａＫａＲａ−Ｈｕｂｂｌｅ Ｓｌｉｄｅ Ｇｌａｓｓは、アルカリ溶液による洗浄と蒸留水による洗浄からなる後処理をＴａＫａＲａ−Ｈｕｂｂｌｅ Ｓｌｉｄｅ Ｇｌａｓｓの取扱説明書に従って行い、タバコｃＤＮＡマイクロアレイとした。
【００１８】
（２）ターゲットの作製
（ｉ）タバコの葉よりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、インビトロジェン社製のＦｌｕｏｒｏｓｃｒｉｐｔ（登録商標） ｃＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍキットを用いて、Ｃｙ３標識ｃＤＮＡ（ターゲット）を調製した。逆転写反応には１サンプルあたり１２．５μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いた。標識反応はキットの取扱説明書に従って行った。
（ｉｉ）ターゲットは標識後にキットに付属のカラムで精製し、真空遠心エバポレーターで乾燥させた。
（ｉｉｉ）乾燥させたそれぞれのサンプルに１３３μｌの下記（ａ）〜（ｃ）の組成の溶液を加えて溶解させた後、９５℃で３分間熱変性させた。
（ａ）５×ＳＳＣ
（ｂ）５×ＳＳＣ、５％ ＰＥＧ＃６０００（平均分子量６０００）
（ｃ）５×ＳＳＣ、１０％ ＰＥＧ＃６０００（平均分子量６０００）
（ｉｖ）変性後室温に５分間放置し、１０％ＳＤＳ溶液を７μｌ加え、終濃度を０．５％としてターゲット含有ハイブリダイゼーション緩衝溶液を調製した。その後ハイブリダイゼーション開始時まで７５℃で保温した。
【００１９】
（３）ＤＮＡマイクロアレイ用自動ハイブリダイゼーション装置によるハイブリダイゼーション
（ｉ）ゲノミックソリューションズ社製のＧｅｎｅ ＴＡＣ（登録商標） Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ＳｔａｔｉｏｎにタバコｃＤＮＡマイクロアレイをセットし、以下の条件でハイブリダイゼーションを行った。
（ａ）Ｏ−リングの馴染ませ処理：７５℃ ２分
（ｂ）ターゲット溶液の注入：７５℃
（ｃ）ハイブリダイゼーション第１ステップ：６５℃ ３時間 保温
（ｄ）ハイブリダイゼーション第２ステップ：５５℃ ３時間 保温
（ｅ）ハイブリダイゼーション第３ステップ：５０℃ １２時間 保温
（ｆ）洗浄第１ステップ ：２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ溶液にて２５℃、５分間洗浄
（ｇ）洗浄第２ステップ ：２×ＳＳＣ溶液にて２５℃、２分間洗浄
【００２０】
（４）スキャニング
洗浄が終了したスライドガラスを遠心乾燥した。プローブにハイブリダイズしたターゲットの蛍光は、Ｃｙ３の蛍光を読み取ることができるスキャナ（ゲノミックソリューションズ社製Ｇｅｎｅ ＴＡＣ（登録商標）ＵＣ−４）を用いて行った。
【００２１】
（５）得られた蛍光強度の定量化
各ｃＤＮＡにハイブリダイズしたターゲットから得られる蛍光強度は、スキャナに付属の定量化ソフトによって定量した。スポットの周囲のガラス基板の蛍光強度をバックグラウンドとして、各スポットの蛍光強度の比をＳ／Ｎ比として算出した。１７６種のｃＤＮＡスポットから得られたＳ／Ｎ比を平均した。
【００２２】
（６）結果
スキャニングによって得られた画像を図１に示す。これはターゲット溶液中のＰＥＧ＃６０００の濃度によるハイブリダイゼーション促進効果の検討を行ったものである。この結果、ＰＥＧ濃度が上昇するにつれてシグナルが増強することがわかった。また、バックグラウンドの蛍光強度に対する各ｃＤＮＡのスポット上の蛍光強度の比であるＳ／Ｎ比を計算し、１７６種のｃＤＮＡスポットに対して平均化した結果を図２に示す。ターゲット溶液中にＰＥＧを１０％添加した場合、ＰＥＧを添加しない場合に比べて２倍もＳ／Ｎ比が増加していることがわかった。この結果はＰＥＧの添加が、バックグラウンドの蛍光強度を上げることなくハイブリダイゼーションを促進する効果があることを示している。ただし１５％を越える濃度のＰＥＧをハイブリダイゼーション緩衝溶液に加えた場合には、ターゲットをプローブに均一にハイブリダイズさせることが困難であった。
【００２３】
（実施例２）重合度の異なるＰＥＧがハイブリダイゼーションに与える影響の検討
【００２４】
（１）タバコｃＤＮＡマイクロアレイの作製
上記実施例１と同様にタバコｃＤＮＡマイクロアレイを作製した。
【００２５】
（２）ターゲットの作製
（ｉ）タバコの葉よりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、インビトロジェン社のＦｌｕｏｒｏｓｃｒｉｐｔ（登録商標） ｃＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍキットを用いて、Ｃｙ３標識ｃＤＮＡ（ターゲット）を調製した。逆転写反応には１サンプルあたり１２．５μｇのｔｏｔａｌ
ＲＮＡを用いた。標識反応はキットの取扱説明書に従って行った。
（ｉｉ）ターゲットは標識後にキットに付属のカラムで精製し、真空遠心エバポレーターで乾燥させた。
（ｉｉｉ）乾燥させたそれぞれのサンプルに１３３μｌの下記（ａ）〜（ｆ）の組成の溶液を加えて溶解させた後、９５℃で３分間熱変性させた。
（ａ）５×ＳＳＣ
（ｂ）５×ＳＳＣ、５％ ＰＥＧ＃１０００（平均分子量１０００）
（ｃ）５×ＳＳＣ、５％ ＰＥＧ＃２０００（平均分子量２０００）
（ｄ）５×ＳＳＣ、５％ ＰＥＧ＃６０００（平均分子量６０００）
（ｅ）５×ＳＳＣ、５％ ＰＥＧ＃１００００（平均分子量１００００）
（ｆ）５×ＳＳＣ、５％ ＰＥＧ＃２００００（平均分子量２００００）
(ｉｖ)変性後室温に５分間放置し、１０％ＳＤＳ溶液を７μｌ加え、終濃度を０．５として、ターゲット含有ハイブリダイゼーション緩衝溶液を調製した。その後ハイブリダイゼーション開始時まで７５℃で保温した。
【００２６】
（３）ＤＮＡマイクロアレイ用自動ハイブリダイゼーション装置によるハイブリダイゼーション
ゲノミックソリューションズ社製のＧｅｎｅ ＴＡＣ（登録商標） Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ＳｔａｔｉｏｎにタバコｃＤＮＡマイクロアレイをセットし、上記実施例１と同様な操作方法によりハイブリダイゼーションおよびＤＮＡマイクロアレイの洗浄を行った。
【００２７】
（４）スキャニング
洗浄が終了したスライドガラスは、遠心乾燥させた。プローブにハイブリダイズしたターゲットの蛍光は、Ｃｙ３の蛍光を読み取ることができるスキャナ（ゲノミックソリューションズ社製のＧｅｎｅ ＴＡＣ（登録商標） ＵＣ−４）を用いて行った。
【００２８】
（５）得られた蛍光強度の定量化
各ｃＤＮＡにハイブリダイズしたターゲットから得られる蛍光強度は、スキャナに付属の定量化ソフトによって定量した。スポットの周囲のガラス基板の蛍光強度をバックグラウンドとして、各スポットの蛍光強度の比をＳ／Ｎ比として算出した。上記の１７６種のｃＤＮＡスポットから得られたＳ／Ｎ比を平均した。
【００２９】
（６）結果
バックグラウンドの蛍光強度に対する各ｃＤＮＡのスポット上の蛍光強度の比であるＳ／Ｎ比を計算し、１７６種のｃＤＮＡスポットに対して平均化した結果を図３に示す。ターゲット溶液中に各種の重合度のＰＥＧを５％添加した場合、ＰＥＧの平均分子量の違いによってハイブリダイゼーションの促進効果に大きな違いが生じることが明らかになった。ハイブリダイゼーションの促進効果は平均分子量が２０００のＰＥＧから認められ、平均分子量が６０００のものではＳ／Ｎ比がＰＥＧを添加していなサンプルと比較して２倍以上に向上した。しかし、平均分子量１００００、２００００のＰＥＧでは、ＤＮＡマイクロアレイのハイブリダイゼーションを促進する効果は認められなかった。
【００３０】
（実施例３）ハイブリダイゼーション緩衝溶液中のターゲット濃度が検出結果に与える影響の検討
【００３１】
（１）タバコｃＤＮＡマイクロアレイの作製
実施例１と同様にタバコｃＤＮＡマイクロアレイを作製した。
【００３２】
（２）ターゲットの作製
（ｉ）タバコの葉よりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、インビトロジェン社のＦｌｕｏｒｏｓｃｒｉｐｔ（登録商標） ｃＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍキットを用いて、Ｃｙ３標識ｃＤＮＡ（ターゲット）を調製した。逆転写反応には５０μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いた。標識反応はキットの取扱説明書に従って行った。
（ｉｉ）Ｃｙ３ 標識ｃＤＮＡはキットに付属のカラムで精製し、下記（ａ）から（ｃ）に記載の量にそれぞれ分割した。通常の方法では、１回のＤＮＡマイクロアレイに２５μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡから得られた蛍光標識ｃＤＮＡを用いる。したがって、１２．５μｇ及び６．２５μｇ分のｔｏｔａｌ ＲＮＡから得られた蛍光標識は、本来用いる量の１／２および１／４となる。
（ａ）２５μｇ分のｔｏｔａｌ ＲＮＡから調製されたターゲット（１／１希釈）
（ｂ）１２．５μｇ分のｔｏｔａｌ ＲＮＡから調製されたターゲット（１／２希釈）
（ｃ）６．２５μｇ分のｔｏｔａｌ ＲＮＡから調製されたターゲット（１／４希釈）
そして、この（ａ）から（ｃ）のターゲットを真空遠心エバポレーターで乾燥させた。
（ｉｉｉ）乾燥させたそれぞれのターゲットに１３３μｌの５×ＳＳＣ、５％ ＰＥＧ＃６０００溶液を加えて溶解させた後、９５℃で３分間熱変性させた。
（ｉｖ）変性後室温に５分間放置し、１０％ＳＤＳ溶液を７μｌ加え、終濃度を０．５％として、ターゲット含有ハイブリダイゼーション緩衝溶液を調製した。その後ハイブリダイゼーション開始時まで７５℃で保温した。
【００３３】
（３）ＤＮＡマイクロアレイ用自動ハイブリダイゼーション装置によるハイブリダイゼーション
ゲノミックソリューションズ社製のＧｅｎｅ ＴＡＣ（登録商標） Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ＳｔａｔｉｏｎにタバコｃＤＮＡマイクロアレイをセットし、実施例１と同様な操作方法によりハイブリダイゼーションおよびＤＮＡマイクロアレイの洗浄を行った。
【００３４】
（４）スキャニング
洗浄が終了したスライドガラスは、遠心乾燥させた。プローブにハイブリダイズしたターゲットの蛍光は、Ｃｙ３の蛍光を読み取ることができるスキャナ（ゲノミックソリューションズ社製のＧｅｎｅ ＴＡＣ（登録商標） ＵＣ−４）を用いて行った。
【００３５】
（５）得られた蛍光強度の定量化
各ｃＤＮＡにハイブリダイズしたターゲットから得られる蛍光強度は、スキャナに付属の定量化ソフトによって定量した。スポットの周囲のガラス基板の蛍光強度をバックグラウンドとして、各スポットの蛍光強度の比をＳ／Ｎとして算出した。１７６種のｃＤＮＡスポットから得られたＳ／Ｎ比を平均した。
【００３６】
（６）結果
ＰＥＧは水分子を周囲に引きつけるがターゲット分子は引きつけないために、水に溶けているターゲットの濃度を高めるのと同様な効果をもたらすことで、ハイブリダイゼーションの促進効果をもたらしていると考えられる。そこで、ターゲットの濃度が濃いサンプルと薄いサンプルに対する、ＰＥＧの効果を調べた。すると、ターゲットの濃度が本来用いる量の１／４になっても得られるＳ／Ｎ比は薄めていないものと同等であり、また得られる画像のパターンも基本的に同じであることが見出された。この結果は、ＰＥＧのハイブリダイゼーションの促進効果によって、ターゲット濃度がある程度異なっても、安定したハイブリダイゼーションの結果を得ることが可能であることを示している。
【００３７】
（実施例４）平均分子量２０００のＰＥＧがハイブリダイゼーションに与える影響の検討
【００３８】
（１）
タバコｃＤＮＡマイクロアレイの作製
上記実施例１と同様にタバコｃＤＮＡマイクロアレイを作製した。
【００３９】
（２）
ターゲットの作製
（ｉ）タバコの葉よりｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、インビトロジェン社のＦｌｕｏｒｏｓｃｒｉｐｔ（登録商標） ｃＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍキットを用いて、Ｃｙ３標識ｃＤＮＡ（ターゲット）を調製した。逆転写反応には１サンプルあたり１２．５μｇのｔｏｔａｌ
ＲＮＡを用いた。標識反応はキットの取扱説明書に従って行った。
（ｉｉ）ターゲットは標識後にキットに付属のカラムで精製し、真空遠心エバポレーターで乾燥させた。
（ｉｉｉ）乾燥させたそれぞれのサンプルに１３３μｌの下記（ａ）〜（ｃ）の組成の溶液を加えて溶解させた後、９５℃で３分間熱変性させた。
（ａ）５×ＳＳＣ、５％ ＰＥＧ＃６０００（平均分子量６０００）
（ｂ）５×ＳＳＣ、１０％ ＰＥＧ＃２０００（平均分子量２０００）
（ｃ）５×ＳＳＣ、１５％ ＰＥＧ＃２０００（平均分子量２０００）
(ｉｖ)変性後室温に５分間放置し、１０％ＳＤＳ溶液を７μｌ加え、終濃度を０．５％として、ターゲット含有ハイブリダイゼーション緩衝溶液を調製した。その後ハイブリダイゼーション開始時まで７５℃で保温した。
【００４０】
（３）ＤＮＡマイクロアレイ用自動ハイブリダイゼーション装置によるハイブリダイゼーション
ゲノミックソリューションズ社製のＧｅｎｅ ＴＡＣ（登録商標） Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ＳｔａｔｉｏｎにタバコｃＤＮＡマイクロアレイをセットし、上記実施例１と同様な操作方法によりハイブリダイゼーションおよびＤＮＡマイクロアレイの洗浄を行った。
【００４１】
（４）スキャニング
洗浄が終了したスライドガラスは、遠心乾燥させた。プローブにハイブリダイズしたターゲットの蛍光は、Ｃｙ３の蛍光を読み取ることができるスキャナ（ゲノミックソリューションズ社製のＧｅｎｅ ＴＡＣ（登録商標） ＵＣ−４）を用いて行った。
【００４２】
（５）得られた蛍光強度の定量化
各ｃＤＮＡにハイブリダイズしたターゲットから得られる蛍光強度は、スキャナに付属の定量化ソフトによって定量した。スポットの周囲のガラス基板の蛍光強度をバックグラウンドとして、各スポットの蛍光強度の比をＳ／Ｎ比として算出した。上記の１７６種のｃＤＮＡスポットから得られたＳ／Ｎ比を平均した。
【００４３】
（６）結果
バックグラウンドの蛍光強度に対する各ｃＤＮＡのスポット上の蛍光強度の比であるＳ／Ｎ比を計算し、１７６種のｃＤＮＡスポットに対して平均化した結果を図５に示す。５％の添加では平均分子量６０００のＰＥＧが平均分子量２０００のＰＥＧよりもハイブリダイゼーションの促進効果は高い。ただし平均分子量２０００のＰＥＧ５％溶液は同じ濃度の平均分子量６０００のＰＥＧ溶液と比較して粘性が低い。そこで平均分子量２０００のＰＥＧをより高濃度に含む緩衝液によるハイブリダイゼーションの促進効果を調べた。その結果、平均分子量２０００のＰＥＧを１０％もしくは１５％含む緩衝液では、平均分子量６０００のＰＥＧを５％添加した場合と比較して、よりハイブリダイゼーションを促進する効果があった。しかしながら、１５％以上の濃度では粘性が大きくなり、均一なハイブリダイゼーションを得ることが難しいため、望ましいハイブリダイゼーション緩衝溶液としては、平均分子量２０００のＰＥＧを１５％未満、より望ましくは１０％以下含む緩衝溶液が好適である。
【００４４】
以上のように、ＤＮＡマイクロアレイ解析においてハイブリダイゼーション緩衝溶液にＰＥＧを添加することで、ＤＮＡマイクロアレイのプローブにターゲットが結合するのが促進され、検出感度が向上することが見出された。手動ハイブリダイゼーション法に比較して、操作は簡易であるが感度が落ちるとされているＤＮＡマイクロアレイ用自動ハイブリダイゼーション装置に適用することで、検出感度が大幅に改善する効果が得られる。また、高いコストがかかるターゲット作製においても、必要とされるターゲット量の低減も本発明により可能になるために、ＤＮＡマイクロアレイ解析のコスト削減の効果も得られる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ＰＥＧを添加したハイブリダイゼーション緩衝溶液と添加していない緩衝液でのタバコｃＤＮＡマイクロアレイの結果を示す図。
【図２】１７６個のプローブにハイブリダイズしたターゲットの蛍光強度とバックグラウンドとのＳ／Ｎ比に及ぼすＰＥＧの添加の効果を示す図。
【図３】１７６個のプローブにハイブリダイズしたターゲットの蛍光強度とバックグラウンドとのＳ／Ｎ比に及ぼす平均分子量の異なるＰＥＧの添加の効果を示す図。
【図４】濃度の異なるターゲットを含有するハイブリダイゼーション緩衝溶液によって得られる、１７６個のプローブにハイブリダイズしたターゲットの蛍光強度とバックグラウンドの蛍光強度のＳ／Ｎ比を示す図。
【図５】１７６個のプローブにハイブリダイズしたターゲットの蛍光強度とバックグラウンドとのＳ／Ｎ比に及ぼす平均分子量２０００のＰＥＧを１０％および１５％の濃度で添加した場合の効果を示す図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５％（重量／容量）以上１５％（重量/溶量）以下の範囲の濃度でポリエチレングリコールを含むＤＮＡマイクロアレイ用ハイブリダイゼーション緩衝溶液。
【請求項２】
前記ＰＥＧの平均分子量は２０００以上１００００未満の範囲であることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡマイクロアレイ用ハイブリダイゼーション緩衝溶液。
【請求項３】
５％（重量／容量）以上１０％（重量/溶量）以下の範囲の濃度でポリエチレングリコールを含むＤＮＡマイクロアレイ用ハイブリダイゼーション緩衝溶液。
【請求項４】
前記ＰＥＧの平均分子量は２０００以上１００００未満の範囲であることを特徴とする請求項３記載のＤＮＡマイクロアレイ用ハイブリダイゼーション緩衝溶液。
【請求項１】
５％（重量／容量）以上１５％（重量/溶量）以下の範囲の濃度でポリエチレングリコールを含むＤＮＡマイクロアレイ用ハイブリダイゼーション緩衝溶液。
【請求項２】
前記ＰＥＧの平均分子量は２０００以上１００００未満の範囲であることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡマイクロアレイ用ハイブリダイゼーション緩衝溶液。
【請求項３】
５％（重量／容量）以上１０％（重量/溶量）以下の範囲の濃度でポリエチレングリコールを含むＤＮＡマイクロアレイ用ハイブリダイゼーション緩衝溶液。
【請求項４】
前記ＰＥＧの平均分子量は２０００以上１００００未満の範囲であることを特徴とする請求項３記載のＤＮＡマイクロアレイ用ハイブリダイゼーション緩衝溶液。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００６−２５８７８４（Ｐ２００６−２５８７８４Ａ）
【公開日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１５５７０１（Ｐ２００５−１５５７０１）
【出願日】平成１７年５月２７日（２００５．５．２７）
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月２７日（２００５．５．２７）
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【Ｆターム（参考）】
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