ＤＮＡ検出センサおよびＤＮＡ検出方法
【課題】ＳＮＰｓ検出の際、ミスマッチ塩基がターゲットＤＮＡのどこにあっても、常温で検出可能なＤＮＡ検出センサおよびＤＮＡ検出方法を提供すること。
【解決手段】本発明の一実施形態に係るＤＮＡ検出センサは、金微粒子が分散した金コロイド溶液４３と、プローブＤＮＡと、ターゲットＤＮＡとが付与され、上記金コロイド溶液４３を保持可能な容器４１と、該容器４１に保持された金コロイド溶液４３に所定量の変性剤４５を付与するビュレット４４とを備える。
【解決手段】本発明の一実施形態に係るＤＮＡ検出センサは、金微粒子が分散した金コロイド溶液４３と、プローブＤＮＡと、ターゲットＤＮＡとが付与され、上記金コロイド溶液４３を保持可能な容器４１と、該容器４１に保持された金コロイド溶液４３に所定量の変性剤４５を付与するビュレット４４とを備える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ検出センサおよびＤＮＡ検出方法に関し、より詳細には、ＤＮＡの１塩基多形（ＳＮＰｓ）の検出を行うＤＮＡ検出センサおよびＤＮＡ検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の塩基配列は人によってわずかに異なる部分があり、その異なる部分により、病気のかかりやすさ、薬物代謝などの個人の体質が決まる。よって、ＤＮＡの塩基配列を特異的に検出することは、将来的には遺伝病などの診断に応用される重要な技術である。また、遺伝子の個人差は一塩基対の相違が最も多く、これを迅速かつ微量で調べることが重要となってくる。
【０００３】
現在、上述のような一塩基が異なる状態であるＤＮＡの1塩基多型(ＳＮＰｓ、スニップス)は、ガン遺伝子や薬品感受性関連遺伝子の検出のように、医療における臨床検査などで重要になっている。ＳＮＰｓ検出に用いられる方法で有名なのはＤＮＡチップである（特許文献１参照）。最近、金微粒子の凝集を利用する系も報告されている（非特許文献１参照）。いずれも、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション(会合反応)を利用している。
【０００４】
また、金コロイド溶液を用いたＤＮＡ検出法が報告されている。図１は、従来の、金コロイド溶液を用いたＤＮＡ検出法を説明するための図である。
図１において、光３を透過する材料からなる容器１中に、金コロイド溶液２が入れられている。この金コロイド溶液２は、金コロイド溶液に一本鎖ＤＮＡ（プローブＤＮＡ）を滴下して金微粒子にプローブＤＮＡを固定し、次いで、ターゲットとする一本鎖ＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ）を金コロイド溶液に滴下して生成される。
【０００５】
このとき、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとが相補的である場合、ハイブリダイゼーション反応が起こり、金微粒子の凝集が起こる。金微粒子が分散した金コロイドは赤色であるが、上記凝集が起こると吸収スペクトルが長波長側にシフトして、溶液の色が赤色から紫色へと変化する。
【０００６】
従来では、この色の変化を利用してＤＮＡセンシングを行っている。すなわち、図１において、容器１において、光３の入射側と対向する側にフォトダイオード等の受光素子４を配置し、金コロイド溶液２に対して光３を照射し、その透過光５を受光素子４にて受光している。受光素子４にて受光した透過光５の吸収スペクトルを調べることにより、ＤＮＡセンシングを行っている。
【０００７】
【特許文献１】特表２００７−５０３０００号公報
【非特許文献１】三浦佳子、米澤徹、“金ナノ粒子の調整とそれを利用したバイオセンシング”Ｄｏｊｉｎ Ｎｅｗｓ Ｎｏ．１１３（２００５）、ｐ．１−７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
さて、一本鎖ＤＮＡのプローブに、一本鎖ＤＮＡのターゲットが会合するとき、フルマッチのときと、ミスマッチがあるときとでは、会合・解離の平衡温度(解離温度Ｔｍ)が異なる。また、会合したときにも、その強さが異なる。従って、ある条件(特定の温度など)では、フルマッチでは会合し、ミスマッチでは会合しないということが起きる。これでミスマッチの存在の判定ができる。
【０００９】
一方、ＳＮＰｓでは、１塩基しか違いがない(１塩基ミスマッチ)ので、Ｔｍの差が少なくなり、ＳＮＰｓを持つＤＮＡも会合が起きてしまうことが生じる。この問題を避けるため、ＤＮＡチップの場合には、反応後に蒸留水等で洗浄することにより、弱い結合をしているＤＮＡを除去して、ＳＮＰｓの検出感度を上げる。
しかしながら、ＤＮＡチップを用いる場合、ＤＮＡの外側（末端近傍）に位置する一塩基がミスマッチの検出は良好に行えるが、それ以外に位置する一塩基ミスマッチを良好に検出するのが困難であった。また、上記洗浄の際に、イオン調整などによる洗浄液の調整が複雑であり、ＤＮＡセンシングを容易に行うことが困難であった。
【００１０】
これに対して、金微粒子凝集系の場合には、反応が三次元的に起きるので、ＤＮＡチップに比較して低温(常温でも可)でかつ短時間で反応が進むのが利点である。しかしながら、ＤＮＡチップのように洗浄ができないので、ＳＮＰｓ検出が可能なのはＳＮＰｓがターゲットＤＮＡの端部付近にある場合に限られてしまう。すなわち、金微粒子を用いてＳＮＰｓを検出する方法は、低温でのセンシングが可能であるが、ＤＮＡの外側（末端近傍）に位置する一塩基がミスマッチの時のみ有用であり、それ以外の位置の一塩基ミスマッチを精確にフルマッチと区別することができないという問題点がある。よって、上記区別が行えるようにプローブＤＮＡおよびターゲットＤＮＡを設計する必要があり、金微粒子凝集系では、一塩基ミスマッチの検出には大きな限界があった。
【００１１】
本発明は、このような課題に鑑みてなされたもので、その目的とするところは、ＳＮＰｓ検出の際、ミスマッチ塩基がターゲットＤＮＡのどこにあっても、常温で検出可能なＤＮＡ検出センサおよびＤＮＡ検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
このような目的を達成するために、請求項１に記載の発明は、ＤＮＡ検出センサであって、ＤＮＡを固定可能である材料が分散した溶液と、プローブＤＮＡと、ターゲットＤＮＡとが付与され、前記溶液を保持可能な保持手段と、前記保持手段に保持された前記溶液に所定量の変性剤を付与する変性剤付与手段とを備えることを特徴とする。
【００１３】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の発明において、前記材料は金微粒子であり、前記溶液は金コロイド溶液であることを特徴とする。
【００１４】
請求項３に記載の発明は、請求項１または２に記載の発明において、前記変性剤付与手段は、所定量ずつ所定回数、前記変性剤を付与することを特徴とする。
【００１５】
請求項４に記載の発明は、請求項１または２に記載の発明において、前記溶液を保持可能な第２の保持手段と、前記第２の保持手段に保持された前記溶液に前記変性剤を付与する第２の変性剤付与手段とをさらに備え、前記保持手段には、前記溶液と、測定対象のプローブＤＮＡと、測定対象のターゲットＤＮＡとが付与され、前記第２の保持手段には、前記溶液と、前記測定対象のプローブＤＮＡと、該測定対象のプローブＤＮＡとフルマッチするターゲットＤＮＡとが付与され、前記変性剤付与手段および前記第２の変性剤付与手段はそれぞれ、等量の変性剤を付与することを特徴とする。
【００１６】
請求項５に記載の発明は、請求項４に記載の発明において、前記変性剤付与手段および前記第２の変性剤付与手段はそれぞれ、所定量ずつ所定回数、前記変性剤を付与することを特徴とする。
【００１７】
請求項６に記載の発明は、請求項１乃至３のいずれかに記載の発明において、前記保持手段が形成された光導波路と、前記光導波路に光を結合するための光結合手段とをさらに備え、前記光導波路を導波する光が横切るように前記保持手段が前記光導波路に形成されていることを特徴とする。
【００１８】
請求項７に記載の発明は、請求項１乃至３のいずれかに記載の発明において、前記保持手段が複数形成された部材をさらに備えることを特徴とする。
【００１９】
請求項８に記載の発明は、ＤＮＡ検出方法であって、ＤＮＡを固定可能である材料が分散した溶液に、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとを付与するＤＮＡ付与工程と、前記プローブＤＮＡおよびターゲットＤＮＡが付与された溶液に対して、所定量の変性剤を付与する変性剤付与工程と、前記変性剤が付与された溶液の所定の特性を測定する特性取得工程とを有することを特徴とする。
【００２０】
請求項９に記載の発明は、請求項８に記載の発明において、前記材料は金微粒子であり、前記溶液は金コロイド溶液であることを特徴とする。
【００２１】
請求項１０に記載の発明は、請求項８または９に記載の発明において、前記変性剤付与工程では、所定量ずつ所定回数、前記変性剤を付与することを特徴とする。
【００２２】
請求項１１に記載の発明は、請求項８乃至１０のいずれかに記載の発明において、前記特性取得工程の後に、前記ＤＮＡ付与工程にて付与されるプローブＤＮＡとフルマッチするターゲットＤＮＡと前記プローブＤＮＡとを付与して前記所定量の変性剤を付与した溶液について予め測定された特性と、前記特性取得工程にて測定された特性とを比較する工程をさらに有することを特徴とする。
【００２３】
請求項１２に記載の発明は、請求項８乃至１０のいずれかに記載の発明において、前記ＤＮＡ付与工程は、測定用の前記溶液と、リファレンス用の前記溶液とを用意する工程と、前記測定用の前記溶液に対して、前記プローブＤＮＡおよび前記ターゲットＤＮＡを付与し、前記リファレンス用の前記溶液に対して、前記プローブＤＮＡとフルマッチするターゲットＤＮＡと前記プローブＤＮＡとを付与する工程を有し、前記変性剤付与工程では、前記測定用の前記溶液および前記リファレンス用の前記溶液のそれぞれに、前記変性剤を等量付与することを特徴とする。
【００２４】
請求項１３に記載の発明は、請求項８乃至１２のいずれかに記載の発明において、前記ＤＮＡ付与工程と前記変性剤付与工程との間に、前記プローブＤＮＡおよびターゲットＤＮＡが付与された溶液の前記所定の特性を測定する工程をさらに有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、変性剤を用いることによって、ＳＮＰｓ検出の際、ミスマッチ塩基がターゲットＤＮＡのどこにあっても、常温で検出可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、図面を参照して本発明の実施形態を詳細に説明する。なお、以下で説明する図面で、同一機能を有するものは同一符号を付け、その繰り返しの説明は省略する。
【００２７】
本発明の一実施形態では、反応が速いために常温で操作できるという金微粒子などのＤＮＡを固定可能な材料を用いる形態の利点と、フルマッチＤＮＡとＳＮＰｓとの差が付け易いというＤＮＡチップの利点の両方を持つＤＮＡ検出を実現する。すなわち、１塩基ミスマッチがターゲットＤＮＡのどこにあっても、常温でＳＮＰｓ検出ができるような方式である。
【００２８】
このために、本発明の一実施形態では、金微粒子などのＤＮＡを固定可能な材料が分散した溶液に一本鎖プローブＤＮＡを付与して、上記材料にプローブＤＮＡを固定し、かつ該溶液に一本鎖ターゲットＤＮＡを付与するＤＮＡ検出において、ＳＮＰｓの検出効率を向上させるために変性剤を加えている。
【００２９】
すなわち、本発明の一実施形態では、金微粒子などのＤＮＡを固定可能な材料を用いた遺伝子診断の手法に加えて、変性剤を用いて濃度を調整することによって、水素結合を切断して二本鎖から一本鎖の状態にする量を、一塩基ミスマッチの場合について多くする。従って、一塩基の違いを明瞭に区別することができる。
【００３０】
図２を用いて、上記変性剤を用いる作用をさらに説明する。
図２において、符号２１は、プローブＤＮＡであり、該プローブＤＮＡ２１を金コロイド溶液２２に付与する。このとき、金コロイド溶液２２は赤色を示している。
ところで、粒子径１５ｎｍ程度の金微粒子が分散した金コロイド溶液は、赤色である。この金コロイド溶液において、金微粒子が凝集すると、吸収スペクトルが長波長側にシフトして、溶液の色は赤色から青に変化する。この金微粒子の凝集は、金微粒子に固定されたプローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとがハイブリダイゼーション反応することによって起こるものである。
【００３１】
従って、プローブＤＮＡをチオール化などにより固定した金コロイド溶液に、上記プローブＤＮＡと完全に相補的なターゲットＤＮＡを加えると金微粒子は速やかに凝集し、溶液の色が赤色から青色に変化するが、わずか一塩基でも異なるＤＮＡを加えると、上述のような反応は起こらない。しかしながら、上述したように、これはＤＮＡの末端、あるいはその近傍に位置する一塩基がミスマッチの時のみに起こる現象である。すなわち、ＤＮＡの末端、またはその近傍以外の位置の一塩基がミスマッチの場合、ターゲットＤＮＡに一塩基ミスマッチがある場合でも、凝集が起こることがある。
【００３２】
本発明の一実施形態は、ハイブリダイゼーション反応により凝集が起こった場合において、その凝集が、上述のように一塩基ミスマッチがターゲットＤＮＡの末端、あるいはその近傍に位置する一塩基のミスマッチによるものなのか、それとも、フルマッチによるものなのかを識別するために、変性剤を加えている。
【００３３】
さて、図２において、ターゲットＤＮＡ２３は、プローブＤＮＡ２１と相補的であるが、末端、あるいはその近傍以外の位置に一塩基ミスマッチを有するものである。よって、ターゲットＤＮＡ２３を金コロイド溶液２２に付与すると、プローブＤＮＡ２１とターゲットＤＮＡ２３とはフルマッチではないが、金微粒子が凝集して溶液２４の色は青色になる。そして、プローブＤＮＡ２１とターゲットＤＮＡ２３とは二本鎖になる。
【００３４】
このとき、溶液２４における金微粒子の凝集が、フルマッチによるものなのか、あるいは一塩基ミスマッチによるものなのかを、ユーザは判断できない。そこで、溶液２４に変性剤を加える。
【００３５】
一本鎖のプローブＤＮＡに、一本鎖のターゲットＤＮＡが会合する際、フルマッチの時とミスマッチがある時とでは、会合・解離の平衡温度（解離温度Ｔｍ）が異なる。そして、この解離温度Ｔｍは、変性剤によって下がる。本発明の一実施形態では、この性質を利用して、フルマッチの時の特性とミスマッチがある時の特性との区別を図るのである。すなわち、変性剤を加えると、一塩基ミスマッチがある場合に、解離温度Ｔｍが下がることになり、変性剤を加える前において会合している場合であっても、上記解離温度Ｔｍが下がることにより会合しているプローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとが解離することになり、再分散が起こる。よって、溶液２５においては金微粒子が凝集状態から分散状態になり、溶液の色も青色から赤色に変化する。
【００３６】
図３は、ターゲットＤＮＡに一塩基ミスマッチがある場合の金コロイド溶液に対する変性剤の滴下量と吸光度のピーク位置の変化を示す図である。図３の測定結果は、金コロイド溶液にプローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとを付与し、ハイブリダイゼーション反応により金微粒子が凝集することによって青色を示す溶液に、変性剤を１μｌずつ添加し、該添加毎に吸光度を測定したものである。
【００３７】
図３の測定では、ターゲットＤＮＡに一塩基ミスマッチが存在するが、末端、またはその近傍以外に位置しているので、変性剤を加える前の段階では、溶液の色は青色を示している。しかしながら、図３から分かるように、変性剤を加えることによって、吸収スペクトルは変化し、吸光度のピーク位置は短波長側にシフトしている。特に、５μｌ付近で吸光度のピーク位置に変化が見られ、長波長側から短波長側にピーク位置がシフトしていることが分かる。このとき、吸収スペクトルの変化に伴って、溶液の色も青から赤に変化している。従って、変性剤を加えることによって、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとの水素結合が切断され、金微粒子が再分散していることが分かる。
【００３８】
このとき、フルマッチの場合も変性剤の付与によって水素結合が切断され、金微粒子が再分散することになる。しかしながら、フルマッチの場合の解離温度Ｔｍは、ミスマッチの場合の解離温度Ｔｍよりも高いので、変性剤のある付与量において、フルマッチに比べてミスマッチがある場合の方が、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡの、変性剤による解離の量が多くなる。
【００３９】
よって、変性剤を所定の滴下量で連続的に所定回数付与する場合に目視により色変化を観察すると、変性剤を加える際の再分散に関する色変化（青色→赤色）は、ミスマッチがある方が早く観測される。
【００４０】
このように、フルマッチの場合に、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとが会合して金微粒子が凝集した金コロイド溶液に変性剤を加える場合と、一塩基ミスマッチがある場合に、上記金コロイド溶液に変性剤を加える場合とでは、ある変性剤の付与量における解離の量に差が生じる。よって、諸特性（溶液の色、吸収スペクトル、透過スペクトル、屈折率、表面プラズモン共鳴など）にそれぞれ差が生じる。本発明では、フルマッチの場合と一塩基ミスマッチがある場合とにおいて上記特性差を生じさせることが重要であり、そのために変性剤を用いているのである。実際のセンシングの際は、上記差を検出するような形態を用いれば良い。
【００４１】
上記特性差を明確にするために、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとがフルマッチしている金コロイド溶液をリファレンス（参照用）として予め用意しておき、該リファレンス金コロイド溶液にも同様の条件で変性剤を付与することが有効である。すなわち、ある変性剤の付与量における特性と、リファレンス金コロイド溶液における特性とを比較することによって、特性差が生じているか否かを判断することができるので、一塩基ミスマッチがあるか否かを判断することができる。
【００４２】
このように、変性剤を付与することにより一塩基ミスマッチがある場合の解離温度Ｔｍが下がり、二本鎖になっているプローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとの水素結合が切断される量がフルマッチの場合よりも多くなるので、金微粒子の再分散に差を生じさせることができる。よって、この差を観察、測定をすることによって、一塩基ミスマッチがターゲットＤＮＡの何処にあってもＳＮＰｓ検出を行うことができる。また、金微粒子を用いることによって、常温で検出することができる。
【００４３】
なお、本発明の一実施形態では、上述のように、金微粒子などのＤＮＡを固定可能な材料が分散した溶液に、プローブＤＮＡおよびターゲットＤＮＡを付与した後に変性剤を加えることによって、解離温度Ｔｍの低下により、フルマッチの場合と一塩基ミスマッチの場合とにおいて、解離の状況に差が生じ、上記特性差を生じさせることができ、該特性差をその特性に応じた方法で検知できる。ここで、変性剤の付与の方法として、変性剤濃度を変えるために所定の滴下量で連続的に所定回数付与するようにしても良い。このように連続的に滴下することによって、目視によって検知を行う場合、色の変化する様子を容易に認識することができ、リファレンス金コロイド溶液と比較することによって、容易に一塩基ミスマッチの検出を行うことができる。
【００４４】
また、本発明の一実施形態では、変性剤の添加による、一塩基ミスマッチがある場合における解離温度の低下を利用しているので、本ＤＮＡ検出動作を、フルマッチの場合における解離温度よりも高い温度で行うことが望ましい。よって、恒温槽や温度コントローラなど、センサの動作温度を一定に保つことが可能な装置を用いることは有効である。
【００４５】
なお、本明細書において、「変性剤」とは、例えば、ホルムアミドや尿素など、水素結合を弱める、あるいは切断することができるものを指す。
【００４６】
また、本発明の一実施形態では、プローブＤＮＡを固定するために用いる材料として金微粒子を用いているが、これに限らず、例えば、酸化シリコン（ＳｉＯ2）等、ＤＮＡを固定可能であり、一方の符号の電荷を有する官能基に取り囲まれる等して、上記符号の電荷で帯電して溶液中で分散される材料であればいずれの材料であっても良い。このような材料としては、コロイド溶液の際の色と、凝集した時の色とが異なる材料であることが好ましい。
【００４７】
（第１の実施形態）
図４は、本実施形態に係るＤＮＡ検出センサを示す図である。
図４において、光４２に対して透明である容器４１には、金微粒子が分散した金コロイド溶液４３が入れられている。該金コロイド溶液４３は、ビュレット等の金コロイド付与手段によって付与される。上記容器４１は、例えば、マイクロチューブ等、液体を保持できるものであればいずれを用いても良い。
【００４８】
上記金コロイド溶液４３に対して、プローブＤＮＡおよびターゲットＤＮＡが付与される。符号４４は、変性剤付与手段としてのビュレットであり、該ビュレット４４により、金コロイド溶液４３に対して変性剤４５が付与される。符号４６は、光４２を照射するための光源であり、金コロイド溶液の吸収波長帯域と少なくとも一部で重なっている光４２を金コロイド溶液４３に入射するように配置されている。符号４７は受光素子であり、金コロイド溶液４３から出射される光４２を受光するように配置されている。
図４では、受光素子４７はＣＰＵを備える演算装置４８に電気的に接続されており、該演算装置４８は、受光素子４７から送られる受光信号に基づいて吸収スペクトルを取得する。演算装置４８は、メモリ等の記憶部を有しており、上記取得された吸収スペクトルを記憶することができ、演算装置が有するディスプレイ等の表示部に上記取得された吸収スペクトルを表示することができる。
【００４９】
本実施形態では、変性剤付与手段としてビュレットを用いているが、これに限定されず、例えば、メスピペット、スポイト、ノズルを有する付与機構等、変性剤を付与可能な手段であればいずれのものを用いても良い。
【００５０】
次に、本実施形態に係るＤＮＡ検出方法について説明する。
図４において、ＤＮＡ付与手段としてのビュレット等（不図示）を用いて、赤色の金コロイド溶液４３に対して、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとを付与する。該付与後に、以下に示すスペクトル測定工程（吸光度測定）を行う。
すなわち、金コロイド溶液４３に対して、光源４６から光４２を照射し、金コロイド溶液４３を透過した光４２を受光素子４７にて受光する。受光素子４７にて取得された受光信号は演算装置４８に送信される。演算装置４８は、送信された受光信号に基づいて、吸収スペクトルを取得する。これらの工程を本明細書では、スペクトル測定工程（特性測定工程）と呼ぶ。
【００５１】
なお、図４では吸収スペクトルを測定する系であるので特性測定工程にてスペクトル測定を行っているが、透過スペクトル、屈折率変化、表面プラズモン共鳴等を測定する場合は、上記特性測定工程にて、求めたい特性に適した装置によって、該特性を求める。
【００５２】
このとき、ターゲットＤＮＡの末端、またはその近傍に一塩基ミスマッチがある場合は、金微粒子の凝集が起こらず、赤色→青色の変化が起こらない。従って、受光素子４７にて取得される吸収スペクトルは、プローブＤＮＡおよびターゲットＤＮＡの付与前後で変化が生じない。従って、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡの付与前後でスペクトルに変化が無い場合は、一塩基ミスマッチがターゲットＤＮＡの末端、またはその近傍に位置していることが検出される。
【００５３】
一方、ターゲットＤＮＡの末端、またはその近傍以外に一塩基ミスマッチがある場合は、フルマッチと同様に、金微粒子の凝集が起こる場合がある。よって、プローブＤＮＡおよびターゲットＤＮＡを付与した後に、金コロイド溶液４３の色が赤色→青色に変化する場合、すなわち、プローブＤＮＡおよびターゲットＤＮＡの付与前後で、受光素子４７にて測定された吸収スペクトル（ピーク位置など）に変化がある場合は、フルマッチなのか、一塩基ミスマッチがある場合なのか判別がつかない。
【００５４】
そこで、本実施形態では、ビュレット４４により、所定量の変性剤４５を金コロイド溶液４３に付与する。すなわち、変性剤４５を付与する毎に、上記スペクトル測定工程を行う（変性剤吸収スペクトル取得工程）。
【００５５】
本実施形態では、ＤＮＡ検出に用いるプローブＤＮＡとフルマッチする場合について、上記所定量の変性剤を付与した際の吸収スペクトルを予め測定しておく。すなわち、測定対象のプローブＤＮＡとフルマッチするターゲットＤＮＡおよび上記測定対象のプローブＤＮＡとを付与して、次いで所定量の変性剤を付与した金コロイド溶液について予め吸収スペクトル（フルマッチ吸収スペクトルとも呼ぶ）を測定しておく。そして、上記変性剤吸収スペクトル取得工程において取得された吸収スペクトルと、予め測定されたフルマッチ吸収スペクトルとを比較し、スペクトルのピーク位置が異なるか否かを判断する。この判断方法は、例えば、演算装置４８に予め測定したフルマッチ吸収スペクトルを保持させておき、演算装置４８が、変性剤吸収スペクトル取得工程にて取得された吸収スペクトルのピーク位置を算出して、上記２つの吸収スペクトルのピーク位置が一致しているか否かを判断するようにすれば良い。
【００５６】
上記ピーク位置がほぼ一致する場合はフルマッチであると判断され、異なる場合は一塩基ミスマッチが存在すると判断される。
【００５７】
すなわち、演算装置４８は、予め測定された特性に関する情報と、特性測定工程にて取得された特性に関する情報とに基づいて、上記特性にずれがあるか否かを判断し、ずれがある場合に一塩基ミスマッチが存在すると判断するのである。
【００５８】
なお、図４において、ビュレット４４により、変性剤４５を所定の量ずつ付与し、該付与毎にスペクトル測定を行うことによって、変性剤による吸収スペクトルのピーク位置の変化を精確に知ることができるので、より精確なＳＮＰｓ検出を行うことができる。
【００５９】
なお、上記ＤＮＡ付与手段は、ビュレットに限らず、例えば、メスピペット、スポイト、ノズルを有する付与機構等、プローブＤＮＡおよびターゲットＤＮＡを付与可能な手段であればいずれのものを用いても良い。
【００６０】
以下、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明は、下記実施例に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において、種々変更可能であることは言うまでもない。
【００６１】
（第１の実施例）
本実施例にて用いるプローブＤＮＡ、該プローブＤＮＡとフルマッチするターゲットＤＮＡ、および一塩基ミスマッチを有するターゲットＤＮＡの塩基配列（５’末端→３’末端）を表１に示す。
【００６２】
【表１】
【００６３】
表１において、「プローブ」とは、プローブＤＮＡであり、「フルマッチ」とは、プローブＤＮＡとフルマッチするターゲットＤＮＡ（以下、フルマッチターゲットＤＮＡと呼ぶ）である。「Ｎｏ．Ｎ（Ｎ；自然数）」とは、ターゲットＤＮＡの３’末端から数えたミスマッチの位置を示す。例えば、Ｎｏ．１７とは、ターゲットＤＮＡの３’末端から１７番目の塩基がミスマッチであることを示す。さらに、ターゲットＤＮＡＮｏ．Ｎとは、ターゲットＤＮＡの３’末端からＮ番目の位置にミスマッチがあるターゲットＤＮＡを指す。よって例えば、ターゲットＤＮＡＮｏ．１７とは、ターゲットＤＮＡの３’末端から１７番目の塩基にミスマッチがあるターゲットＤＮＡを指す。
なお、表１の各Ｎｏ．における下線部が、ミスマッチである。
【００６４】
＜本実施例にて用いた溶液の各濃度＞
プローブＤＮＡ １０μＭ １０μｌ
ターゲットＤＮＡ １０μＭ １０μｌ
ＮａＣｌ溶液 ３．２Ｍ １０μｌ
金コロイド溶液（粒径１５ｎｍ） ０．００７４ｗｔ％ １０μｌ
【００６５】
本実施例では、図４の金コロイド溶液４３中の金微粒子にプローブＤＮＡを、Ａｕ−Ｓ結合により固定化した。次に、ＮａＣｌ濃度を調整したＮａＣｌ溶液を金コロイド溶液４３に付与した後、ターゲットＤＮＡを金コロイド溶液４３に付与して、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとを反応させた。次いで、反応後の金コロイド溶液４３の色が赤色から青色に変化するのを目視によって観察し、その後吸光度測定（スペクトル測定工程）を行った。
【００６６】
変性剤を用いない場合の結果（従来の方法）
変性剤を用いない場合の、ターゲットＤＮＡの５’末端（プローブＤＮＡの３’末端）から３番目までの位置にミスマッチがある場合、およびターゲットＤＮＡの５’末端から３番目までの位置以外の位置にミスマッチがある場合における吸収スペクトルを図５に示す。
【００６７】
図５において、スペクトル５１は、５’末端から３番目までの位置にミスマッチがあるターゲットＤＮＡとプローブＤＮＡとを反応させた場合の吸収スペクトルである。スペクトル５１から分かるように、ターゲットＤＮＡの５’末端から３番目までの位置にミスマッチがある場合は、ターゲットＤＮＡとプローブＤＮＡとを反応させると、金コロイド溶液４３の色は分散（赤色）のままだった。すなわち、スペクトル５１のピーク位置は約５２０〜５３０ｎｍであり、反応前（ターゲットＤＮＡ付与前）の金コロイド溶液４３のピーク位置とほとんど変わらなかった。
【００６８】
一方、図５において、スペクトル５２は、５’末端から３番目までの位置以外の位置にミスマッチがあるターゲットＤＮＡとプローブＤＮＡとを反応させた場合の吸収スペクトルである。スペクトル５２から分かるように、ターゲットＤＮＡの５’末端から３番目までの位置以外の位置にミスマッチがある場合は、凝集（青色）してしまい、フルマッチなのか一塩基ミスマッチなのかの区別がつかなかった。すなわち、スペクトル５２のピーク位置は約５５０〜５６０ｎｍと変化し、溶液の色も凝集する場合の青色になった。
このように、変性剤を用いない方法では、全ての位置のミスマッチをフルマッチと区別することができなかった。
【００６９】
変性剤を用いた結果
そこで本実施例では、フルマッチと一塩基ミスマッチとを区別するために、上記プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとを反応させた後に、変性剤４５としてホルムアミドをビュレット４４によって金コロイド溶液４３に付与し、再度吸光度測定（変性剤吸収スペクトル取得工程）を行った。本実施例の実験は全て室温で行った。
【００７０】
＜変性剤０μｌの場合＞
図６は、ターゲットＤＮＡ添加前の金コロイド溶液の吸収スペクトル、フルマッチターゲットＤＮＡ添加後の金コロイド溶液の吸収スペクトル、およびターゲットＤＮＡＮｏ．１７添加後の金コロイド溶液の吸収スペクトルを示す図である。
【００７１】
図６において、スペクトル６１は、ターゲットＤＮＡ添加前の金コロイド溶液４３の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５３１ｎｍにあり、赤色を示していた。
スペクトル６２は、フルマッチターゲットＤＮＡを金コロイド溶液４３に添加した後の金コロイド溶液４３の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５４５ｎｍにあり、青色を示していた。
スペクトル６３は、ターゲットＤＮＡＮｏ．１７を金コロイド溶液４３に添加した後の金コロイド溶液４３の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５４７ｎｍにあり、青色を示していた。
【００７２】
図６から明らかなように、スペクトル６２およびスペクトル６３はほぼ同じスペクトルとなっており、そのピーク位置もほぼ同じであり、変性剤を加えない場合においては、図５にて説明したように、フルマッチターゲットＤＮＡとターゲットＤＮＡＮｏ．１７とは区別がつかない。
【００７３】
＜所定量の変性剤を付与した場合＞
図７（ａ）〜（ｃ）に、変性剤（ホルムアミド）を等量用いたときのフルマッチターゲットＤＮＡと、ターゲットＤＮＡＮｏ．１７との吸光度の比較を示す。
図７（ａ）は、フルマッチターゲットＤＮＡ添加後の金コロイド溶液、およびターゲットＤＮＡＮｏ．１７添加後の金コロイド溶液のそれぞれについて、変性剤としてのホルムアミドを５μｌ添加した後の吸収スペクトルを示す図である。
【００７４】
図７（ａ）において、スペクトル７１は、プローブＤＮＡおよびフルマッチターゲットＤＮＡを付与した後の金コロイド溶液４３にホルムアミドを５μｌ付与した後の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５５５ｎｍであった。一方、スペクトル７２は、プローブＤＮＡおよびターゲットＤＮＡＮｏ．１７を付与した後の金コロイド溶液４３にホルムアミドを５μｌ付与した後の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５２８ｎｍであった。
【００７５】
このように変性剤を加える前の段階ではピーク位置がほぼ同じであった、フルマッチターゲットＤＮＡ添加後の金コロイド溶液の吸収スペクトル（スペクトル６２）とターゲットＤＮＡＮｏ．１７添加後の金コロイド溶液の吸収スペクトル（スペクトル６３）とが、変性剤を付与することによって、スペクトル７１およびスペクトル７２に示すように、そのピーク位置に差が出た。
【００７６】
図７（ｂ）は、フルマッチターゲットＤＮＡ添加後の金コロイド溶液、およびターゲットＤＮＡＮｏ．１７添加後の金コロイド溶液のそれぞれについて、変性剤としてのホルムアミドを６μｌ添加した後の吸収スペクトルを示す図である。
【００７７】
図７（ｂ）において、スペクトル７３は、プローブＤＮＡおよびフルマッチターゲットＤＮＡを付与した後の金コロイド溶液４３にホルムアミドを６μｌ付与した後の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５４５ｎｍであった。一方、スペクトル７４は、プローブＤＮＡおよびターゲットＤＮＡＮｏ．１７を付与した後の金コロイド溶液４３にホルムアミドを６μｌ付与した後の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５２９ｎｍであった。
【００７８】
このように変性剤を６μｌ加えた場合であっても、変性剤を５μｌ加えた場合と同様に、変性剤の付与後のスペクトルのピーク位置に差が出た。
【００７９】
図７（ｃ）は、フルマッチターゲットＤＮＡ添加後の金コロイド溶液、およびターゲットＤＮＡＮｏ．１７添加後の金コロイド溶液のそれぞれについて、変性剤としてのホルムアミドを７μｌ添加した後の吸収スペクトルを示す図である。
【００８０】
図７（ｃ）において、スペクトル７５は、プローブＤＮＡおよびフルマッチターゲットＤＮＡを付与した後の金コロイド溶液４３にホルムアミドを７μｌ付与した後の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５２８ｎｍであった。一方、スペクトル７６は、プローブＤＮＡおよびターゲットＤＮＡＮｏ．１７を付与した後の金コロイド溶液４３にホルムアミドを７μｌ付与した後の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５２８ｎｍであった。
【００８１】
図７（ｃ）から分かるように、変性剤の付与量が７μｌ付近ではフルマッチターゲットＤＮＡ添加後の金コロイド溶液の吸収スペクトルのピーク位置と、ターゲットＤＮＡＮｏ．１７添加後の金コロイド溶液の吸収スペクトルのピーク位置との差がほとんど生じなかった。
【００８２】
このように、変性剤を５μｌ〜６μｌ付与することによって、フルマッチターゲットＤＮＡの場合と、ターゲットＤＮＡＮｏ．１７の場合とにおける吸収スペクトルのピーク位置に差を生じさせることができる。すなわち、本発明では、変性剤を適量加えることによって、上記ピーク位置の差を生じさせることができ、この差を観測することによって、一塩基ミスマッチがどこに位置していてもＳＮＰｓを検出することができる。
【００８３】
なお、本発明では、変性剤を所定量（例えば、１μｌ）ずつ付与し、その都度、所定の特性（本実施例では吸光度）を測定することによって、上記特性の差（本実施例では、ピーク位置の差）の変遷を知ることができるので、より精確なＳＮＰｓ検出を行うことができる。すなわち、図７（ａ）〜（ｃ）の例で言えば、付与量によっては図７（ｃ）のような結果が得られる可能性があるが、変性剤を所定量ずつ徐々に付与することによって、図７（ｃ）のような結果を得る前に、図７（ａ）、図７（ｂ）の結果を得ることができるので、適切な範囲内でのＳＮＰｓを行うことができる。
【００８４】
＜変性剤を５μｌ用いたときの一塩基ミスマッチ（Ｎｏ．１０、１１、１４、１５、１６）と変性剤添加前の一塩基ミスマッチの吸光度のピーク位置の比較＞
上述のように、ターゲットＤＮＡＮｏ．１７の場合、変性剤を５μｌ付与すると、フルマッチターゲットＤＮＡに対して吸光度のピーク位置に差を生じさせることができた。以下では、ターゲットＤＮＡＮｏ．１０、１１、１４、１５、１６に対して、変性剤を５μｌ付与した場合について説明する。
【００８５】
図８（ａ）〜（ｅ）は、変性剤を５μｌ付与する場合における、変性剤添加前と添加後の吸光度の比較を示す図である。
図８（ａ）は、ターゲットＤＮＡＮｏ．１０を付与した金コロイド溶液について、変性剤としてホルムアミドを５μｌ添加する前と後との吸収スペクトルを示す図である。
図８（ａ）において、スペクトル８１は、ターゲットＤＮＡＮｏ．１０を付与した金コロイド溶液に対して変性剤を５μｌ添加する前の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５６５ｎｍであった。一方、スペクトル８２は、ターゲットＤＮＡＮｏ．１０を付与した金コロイド溶液に対して変性剤を５μｌ添加した後の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５３１ｎｍであった。
【００８６】
図８（ｂ）は、ターゲットＤＮＡＮｏ．１１を付与した金コロイド溶液について、変性剤としてホルムアミドを５μｌ添加する前と後との吸収スペクトルを示す図である。
図８（ｂ）において、スペクトル８３は、ターゲットＤＮＡＮｏ．１１を付与した金コロイド溶液に対して変性剤を５μｌ添加する前の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５５６ｎｍであった。一方、スペクトル８４は、ターゲットＤＮＡＮｏ．１１を付与した金コロイド溶液に対して変性剤を５μｌ添加した後の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５３０ｎｍであった。
【００８７】
図８（ｃ）は、ターゲットＤＮＡＮｏ．１４を付与した金コロイド溶液について、変性剤としてホルムアミドを５μｌ添加する前と後との吸収スペクトルを示す図である。
図８（ｃ）において、スペクトル８５は、ターゲットＤＮＡＮｏ．１４を付与した金コロイド溶液に対して変性剤を５μｌ添加する前の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５４１ｎｍであった。一方、スペクトル８６は、ターゲットＤＮＡＮｏ．１４を付与した金コロイド溶液に対して変性剤を５μｌ添加した後の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５２９ｎｍであった。
【００８８】
図８（ｄ）は、ターゲットＤＮＡＮｏ．１５を付与した金コロイド溶液について、変性剤としてホルムアミドを５μｌ添加する前と後との吸収スペクトルを示す図である。
図８（ｄ）において、スペクトル８７は、ターゲットＤＮＡＮｏ．１５を付与した金コロイド溶液に対して変性剤を５μｌ添加する前の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５５８ｎｍであった。一方、スペクトル８８は、ターゲットＤＮＡＮｏ．１５を付与した金コロイド溶液に対して変性剤を５μｌ添加した後の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５３０ｎｍであった。
【００８９】
図８（ｅ）は、ターゲットＤＮＡＮｏ．１６を付与した金コロイド溶液について、変性剤としてホルムアミドを５μｌ添加する前と後との吸収スペクトルを示す図である。
図８（ｅ）において、スペクトル８９は、ターゲットＤＮＡＮｏ．１６を付与した金コロイド溶液に対して変性剤を５μｌ添加する前の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５３７ｎｍであった。一方、スペクトル９０は、ターゲットＤＮＡＮｏ．１６を付与した金コロイド溶液に対して変性剤を５μｌ添加した後の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５２９ｎｍであった。
【００９０】
このように、ターゲットＤＮＡＮｏ．１０、１１、１４、１５、１６のいずれの場合であっても、変性剤を５μｌ加えることによって、変性剤を加える前に比べて吸光度のピーク位置に変化が見られた。すなわち、変性剤を加えることによって、ピーク位置が短波長側にシフトしていき、変性剤添加前と添加後とにおいてピーク位置に差が生じた。また、ターゲットＤＮＡＮｏ．１０、１１、１４、１５、１６のいずれの場合においても、上記ピーク位置のシフトに伴って、金コロイド溶液の色が、青色から赤色に変化した。
【００９１】
さらに、図７（ａ）に示されるように、フルマッチターゲットＤＮＡを付与した金コロイド溶液に変性剤を５μｌ付与した場合の吸収スペクトルのピーク位置は５５５ｎｍであるので、ターゲットＤＮＡＮｏ．１０、１１、１４、１５、１６のいずれの場合についても、ターゲットＤＮＡＮｏ．１７と同様に、変性剤を加えることによって、ピーク位置に差を生じさせることができる。
【００９２】
このように、変性剤を用いることによって、ターゲットＤＮＡのどこに一塩基ミスマッチがあっても、良好にＳＮＰｓ検出を行うことができる。
【００９３】
（第２の実施形態）
本実施形態では、測定用の金コロイド溶液の他に、リファレンス用の金コロイド溶液を用意し、該２つの金コロイド溶液に同量の変性剤を加えてその特性変化（スペクトル変化等）を観察する。このようにすることによって、目視によってもＳＮＰｓ検出を行うことができる。
【００９４】
図９において、金微粒子が分散した金コロイド溶液４３が入れられた容器４１、およびリファレンスとしての、金微粒子が分散した金コロイド溶液９２が入れられた容器９１とを用意する。符号９３は、変性剤付与手段としてのビュレットであり、該ビュレット９３により、金コロイド溶液９２に対して変性剤９４が付与される。
【００９５】
図９においては、リファレンス用の金コロイド溶液９２には、測定対象のプローブＤＮＡと、該プローブＤＮＡとフルマッチするターゲットＤＮＡとがＤＮＡ付与手段により付与される。測定用の金コロイド溶液４３には、第１の実施形態と同様に、測定対象のプローブＤＮＡと、測定対象のターゲットＤＮＡとがＤＮＡ付与手段により付与される。
【００９６】
このとき、リファレンス用の金コロイド溶液９２にはフルマッチターゲットＤＮＡが付与されるので、金微粒子の凝集が起こり、溶液の色が赤色から青色に変化する。
これに対して、測定用の金コロイド溶液４３においては、ターゲットＤＮＡの付与により溶液の色が変化しない場合は、ターゲットＤＮＡの末端、またはその近傍に一塩基ミスマッチがある場合であると判断できる。一方、溶液の色が青色に変化した場合は、ターゲットＤＮＡが、フルマッチターゲットＤＮＡなのか、一塩基ミスマッチを有するターゲットＤＮＡなのかの判断がつかない。
【００９７】
そこで、測定用の金コロイド溶液４３およびリファレンス用の金コロイド溶液９２に対して、等量の変性剤を付与する。測定用の金コロイド溶液４３への変性剤の付与タイミングとリファレンス用の金コロイド溶液９２への変性剤の付与タイミングとは、同じであっても異なっていても良い。
【００９８】
このとき、変性剤の付与量が所定量のときに、測定用の金コロイド溶液４３にのみ、溶液の色が青色から赤色に変化する場合は、一塩基ミスマッチが存在すると判断できる。一方、変性剤の付与量が所定量のときに、測定用の金コロイド溶液４３およびリファレンス用の金コロイド溶液９２において、溶液の色が青色から赤色に変化する場合は、測定対象のターゲットＤＮＡがフルマッチターゲットＤＮＡであると判断できる。
【００９９】
本実施形態によれば、一塩基ミスマッチがあるか否かを色の変化によって判断することができるので、目視によってＳＮＰｓ検出を行うことができる。また、第１の実施形態に示したように、光源、受光素子をリファレンス用の金コロイド溶液９２側にも設けて、スペクトル測定によって判断するようにしても良い。
【０１００】
このように、本実施形態では、変性剤が付与された、測定用の金コロイド溶液４３とリファレンス用の金コロイド溶液９２とのそれぞれについて、目視やスペクトル測定によって所定の特性を測定することになる。
【０１０１】
ただし、図７（ｃ）で示したように、変性剤の付与量によっては、フルマッチの場合と一塩基ミスマッチを有する場合とにおいて、ピーク位置に差が出ない場合もある。そこで、変性剤付与手段を制御して、測定用の金コロイド溶液４３およびリファレンス用の金コロイド溶液９２に対して変性剤を徐々に等量ずつ付与するのが好ましい。このように徐々に変性剤を付与する場合、先に、測定用の金コロイド溶液４３の色が青色から赤色に変化した場合、測定対象のターゲットＤＮＡには一塩基ミスマッチが含まれていると判断することができる。
【０１０２】
なお、本発明では、変性剤を加えることによって、一塩基ミスマッチが存在する場合の金コロイド溶液の吸収スペクトル、透過スペクトル、屈折率等の特性を、フルマッチの場合に対して変化させることが本質である。このように変化させることができれば、所定の方法（第１の実施形態のように吸光度を測定する方法、第２の実施形態のように目視によって測定する方法、または屈折率変化を測定する方法等）によって上記特性の変化を検出することによってＳＮＰｓを検出することができる。従って、該特性の検出方法は本質で無い。
【０１０３】
（第３の実施形態）
図１０は、本実施形態に係る光導波路型ＤＮＡセンサの側面図である。
図１０において、ガラス基板１０１の一方の面には、カリウムイオン交換ガラス光導波路(硝酸カリウム溶融塩中４００℃、１ｈイオン交換)１０２が、厚さ約２ミクロンで形成されている。光導波路１０２は、シングルモード導波路である。ガラス基板１０１の、光導波路１０２が形成された面と対向する面には、光吸収層１０３が形成されている。光導波路１０２の所定の領域には、有機ＥＬ材料であるＡｌｑ３ １０４が形成されている。Ａｌｑ３ １０４を覆うようにしてＣｙｔｏｐ１０５が形成されており、該Ｃｙｔｏｐ１０５上にはカバーガラス１０６が配置されている。
【０１０４】
光導波路１０２上において、Ｃｙｔｏｐ１０５やカバーガラス１０６から所定の距離だけ離間して、プリズム１０７が配置されている。このプリズム１０７と光導波路１０２との間には、インデックスマッチングオイル（不図示）が配置されており、光導波路１０２を導波する光はプリズム１０７へと入射される。光導波路１０２上の、Ｃｙｔｏｐ１０５やカバーガラス１０６とプリズム１０７との間の領域であって、導波光Ｓが導波する領域上に、金コロイド溶液を付与するための領域であるセンシング領域１０８が形成されている。このセンシング領域１０８は、テフロン（登録商標）シートなどから形成することができ、上記センシング領域１０８上に、金コロイド溶液が付与され、また、ＤＮＡ検体も付与される。すなわち、導波光Ｓが横切るようにセンシング領域１０８が形成されている。本実施形態では、センシング領域１０８が、金コロイド溶液やＤＮＡを保持する領域となる。
【０１０５】
また、Ａｌｑ３ １０４に光を入射するように、紫外線照射用のＬＥＤ１０９が配置されている。このＬＥＤ１０９からは、波長３６５ｎｍの紫外線が照射される。
【０１０６】
プリズム１０７からの出射光を受光するようにフィルタ１１０および光センサ１１１が配置されている。また、ガラス基板１０１の、光吸収層１０３が形成されていない領域から出射される光を受光するように、フィルタ１１２および光センサ１１３が形成されている。
【０１０７】
ところで、本実施形態において、金微粒子の吸収スペクトルに対応するために、有機ＥＬ材料であるＡｌｑ３を用いている。Ａｌｑ３の発光波長領域は、５００〜６００ｎｍの幅広い波長領域である。よって、金微粒子の吸収スペクトルとＡｌｑ３の発光スペクトルとがほぼ重なっている、すなわち、Ａｌｑ３の発光波長領域が金微粒子の吸収ピークの波長に対応しているため、感度の高い検出が可能となる。
【０１０８】
よって、本実施形態のように構成し、ＬＥＤ３０９から紫外線（波長＝３６５ｎｍ）をＡｌｑ３ １０４に照射して、Ａｌｑ３ １０４にてフォトルミネッセンス光を生成する。この生成されたフォトルミネッセンス光のうち、所定の光が光導波路１０２に結合し、導波光Ｓとなる。このようにして、シングルモード導波路である光導波路１０２中を、スペクトル幅の広い導波光Ｓが導波することになる。この導波光Ｓは、プリズム１０７から出射され、該プリズムから出射された出射光Ｕは、フィルタ１１０を介して光センサ１１１に入射する。また、上記生成されたフォトルミネッセンス光のうち光Ｔは、ガラス基板１０１の、光吸収層１０３が形成されていない領域から外に出射され、後述する、フィルタ１１２を介して、光センサ１１３に入射する。
【０１０９】
次に、本実施形態に係るＤＮＡ検出方法について説明する。
まず、図１０において、センシング領域１０８に、金コロイド溶液と、プローブＤＮＡと、ターゲットＤＮＡとをそれぞれ付与する。次いで、Ａｌｑ３ １０４に対して、ＬＥＤ１０９から紫外線を照射して、フォトルミネッセンス光を発生させる。このフォトルミネッセンス光の発光スペクトルは、波長帯域５００ｎｍ〜６００ｎｍにピークがあり、金微粒子の吸収ピークとほぼ重なっている。発生したフォトルミネッセンス光の一部は導波光Ｓとして、光導波路１０２に結合し、また、他の一部は、光Ｔとしてセンサから出射して、フィルタ１１２を介して光センサ１１３に入射する。
【０１１０】
上記導波光Ｓは、全反射しながら光導波路１０２を導波するので、エバネッセント波が発生する。このとき、上記エバネッセント波がそのセンシング領域１０８上に存在する金微粒子に作用する。すなわち、導波光Ｓは、光導波路１０２を通過してセンシング領域１０８において該金微粒子に作用して、プリズム１０７から出射されて出射光Ｕとなる。該出射光Ｕは、フィルタ１１０を介して光センサ１１１に入射する。
【０１１１】
光センサ１１３にて受光した光から得られる吸収スペクトルはリファレンスとして機能するので、光センサ１１１にて受光した光から得られる吸収スペクトルとの比を取ることによって、計算された吸収スペクトルを取得する。
【０１１２】
次いで、変性剤付与手段によって、センシング領域１０８の金コロイド溶液に対して変性剤を所定量付与する。該付与後に、上述のように、Ａｌｑ３ １０４に対して、ＬＥＤ１０９から紫外線を照射することによって、吸収スペクトルを取得し、第１の実施形態にて説明したように、ピーク位置に差が生じたか否かを判断する。
【０１１３】
なお、本実施形態では、所定の波長帯域を有する光を光導波路に入射するためにＡｌｑ３ １０４やＬＥＤ１０９を用いているが、これに限定されず、所定の波長帯域を有する光を光導波路に入射できればいずれの手段を用いても良い。例えば、光導波路１０２の所定の領域にプリズム１０７と対向するように第２のプリズムを配置し、該プリズムを介して光を光導波路１０２に入射するようにしても良い。また、所定の波長帯域の光が導波している光ファイバや光導波路の一方端を、光導波路１０２のプリズム１０７と対向する側の端面にバットジョイント法などにより接続して、上記光を光導波路１０２に入射するようにしても良い。
【０１１４】
（第４の実施形態）
本実施形態では、金コロイド溶液を保持する領域を同一基板上に複数設けるようにしている。
図１０は、本実施形態に係る複数の液室を有する基板を示す図である。
図１０において、基板１２１上には、複数の液室１２２が形成されている。この液室１２２のそれぞれに、金コロイド溶液、プローブＤＮＡ、ターゲットＤＮＡが付与される。
【０１１５】
この基板１２１を用いた１つのＤＮＡ検出方法としては、各液室１２２に対して、同一かつ等量の、金コロイド溶液、プローブＤＮＡ，およびターゲットＤＮＡを付与し、次いで、液室１２２の各々について、付与量を変えて変性剤を付与する。このようにすることによって、第１〜第３の実施形態にて述べたように、変性剤を徐々に加えなくても、一度に変性剤の量を変えた測定結果を得ることができる。
【０１１６】
また、基板１２１を用いた他のＤＮＡ検出方法としては、各液室１２２に対して、同一かつ等量の、金コロイド溶液、プローブＤＮＡを付与する。これと共に、各液室１２２に対して、サンプルを変えたターゲットＤＮＡを等量付与する。その結果、各液室１２２にはそれぞれ異なるサンプルのターゲットＤＮＡが付与されることになる。次いで、適量の変性剤（例えば、５μｌ）を加えることによって、複数のサンプルを同時に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】従来の、金コロイド溶液を用いたＤＮＡ検出法を説明するための図である。
【図２】本発明の一実施形態に係る変性剤を用いたＤＮＡ検出の方法を説明するための図である。
【図３】本発明の一実施形態に係る変性剤の濃度に対する吸光度変化を示す図である。
【図４】本発明の一実施形態に係るＤＮＡ検出センサを示す図である。
【図５】本発明の一実施形態に係るターゲットＤＮＡ添加後の吸光度変化を示す図である。
【図６】本発明の一実施形態に係る変性剤０μｌの場合の吸光度変化を示す図である。
【図７】（ａ）〜（ｃ）は、本発明の一実施形態に係る変性剤を等量用いたときのフルマッチＤＮＡと一塩基ミスマッチＤＮＡとの吸光度の比較を示す図である。
【図８】（ａ）〜（ｅ）は、本発明の一実施形態に係る変性剤を５μｌ付与する場合における、変性剤添加前と添加後の吸光度の比較を示す図である。
【図９】本発明の一実施形態に係るＤＮＡ検出センサを示す図である。
【図１０】本発明の一実施形態に係る光導波路型のＤＮＡ検出センサを示す図である。
【図１１】本発明の一実施形態に係る複数の液室を有する基板を示す図である。
【符号の説明】
【０１１８】
４１、９１ 容器
４２ 光
４３、９２ 金コロイド溶液
４４、９３ ビュレット
４５ 変性剤
４６ 光源
４７ 受光素子
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ検出センサおよびＤＮＡ検出方法に関し、より詳細には、ＤＮＡの１塩基多形（ＳＮＰｓ）の検出を行うＤＮＡ検出センサおよびＤＮＡ検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の塩基配列は人によってわずかに異なる部分があり、その異なる部分により、病気のかかりやすさ、薬物代謝などの個人の体質が決まる。よって、ＤＮＡの塩基配列を特異的に検出することは、将来的には遺伝病などの診断に応用される重要な技術である。また、遺伝子の個人差は一塩基対の相違が最も多く、これを迅速かつ微量で調べることが重要となってくる。
【０００３】
現在、上述のような一塩基が異なる状態であるＤＮＡの1塩基多型(ＳＮＰｓ、スニップス)は、ガン遺伝子や薬品感受性関連遺伝子の検出のように、医療における臨床検査などで重要になっている。ＳＮＰｓ検出に用いられる方法で有名なのはＤＮＡチップである（特許文献１参照）。最近、金微粒子の凝集を利用する系も報告されている（非特許文献１参照）。いずれも、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション(会合反応)を利用している。
【０００４】
また、金コロイド溶液を用いたＤＮＡ検出法が報告されている。図１は、従来の、金コロイド溶液を用いたＤＮＡ検出法を説明するための図である。
図１において、光３を透過する材料からなる容器１中に、金コロイド溶液２が入れられている。この金コロイド溶液２は、金コロイド溶液に一本鎖ＤＮＡ（プローブＤＮＡ）を滴下して金微粒子にプローブＤＮＡを固定し、次いで、ターゲットとする一本鎖ＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ）を金コロイド溶液に滴下して生成される。
【０００５】
このとき、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとが相補的である場合、ハイブリダイゼーション反応が起こり、金微粒子の凝集が起こる。金微粒子が分散した金コロイドは赤色であるが、上記凝集が起こると吸収スペクトルが長波長側にシフトして、溶液の色が赤色から紫色へと変化する。
【０００６】
従来では、この色の変化を利用してＤＮＡセンシングを行っている。すなわち、図１において、容器１において、光３の入射側と対向する側にフォトダイオード等の受光素子４を配置し、金コロイド溶液２に対して光３を照射し、その透過光５を受光素子４にて受光している。受光素子４にて受光した透過光５の吸収スペクトルを調べることにより、ＤＮＡセンシングを行っている。
【０００７】
【特許文献１】特表２００７−５０３０００号公報
【非特許文献１】三浦佳子、米澤徹、“金ナノ粒子の調整とそれを利用したバイオセンシング”Ｄｏｊｉｎ Ｎｅｗｓ Ｎｏ．１１３（２００５）、ｐ．１−７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
さて、一本鎖ＤＮＡのプローブに、一本鎖ＤＮＡのターゲットが会合するとき、フルマッチのときと、ミスマッチがあるときとでは、会合・解離の平衡温度(解離温度Ｔｍ)が異なる。また、会合したときにも、その強さが異なる。従って、ある条件(特定の温度など)では、フルマッチでは会合し、ミスマッチでは会合しないということが起きる。これでミスマッチの存在の判定ができる。
【０００９】
一方、ＳＮＰｓでは、１塩基しか違いがない(１塩基ミスマッチ)ので、Ｔｍの差が少なくなり、ＳＮＰｓを持つＤＮＡも会合が起きてしまうことが生じる。この問題を避けるため、ＤＮＡチップの場合には、反応後に蒸留水等で洗浄することにより、弱い結合をしているＤＮＡを除去して、ＳＮＰｓの検出感度を上げる。
しかしながら、ＤＮＡチップを用いる場合、ＤＮＡの外側（末端近傍）に位置する一塩基がミスマッチの検出は良好に行えるが、それ以外に位置する一塩基ミスマッチを良好に検出するのが困難であった。また、上記洗浄の際に、イオン調整などによる洗浄液の調整が複雑であり、ＤＮＡセンシングを容易に行うことが困難であった。
【００１０】
これに対して、金微粒子凝集系の場合には、反応が三次元的に起きるので、ＤＮＡチップに比較して低温(常温でも可)でかつ短時間で反応が進むのが利点である。しかしながら、ＤＮＡチップのように洗浄ができないので、ＳＮＰｓ検出が可能なのはＳＮＰｓがターゲットＤＮＡの端部付近にある場合に限られてしまう。すなわち、金微粒子を用いてＳＮＰｓを検出する方法は、低温でのセンシングが可能であるが、ＤＮＡの外側（末端近傍）に位置する一塩基がミスマッチの時のみ有用であり、それ以外の位置の一塩基ミスマッチを精確にフルマッチと区別することができないという問題点がある。よって、上記区別が行えるようにプローブＤＮＡおよびターゲットＤＮＡを設計する必要があり、金微粒子凝集系では、一塩基ミスマッチの検出には大きな限界があった。
【００１１】
本発明は、このような課題に鑑みてなされたもので、その目的とするところは、ＳＮＰｓ検出の際、ミスマッチ塩基がターゲットＤＮＡのどこにあっても、常温で検出可能なＤＮＡ検出センサおよびＤＮＡ検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
このような目的を達成するために、請求項１に記載の発明は、ＤＮＡ検出センサであって、ＤＮＡを固定可能である材料が分散した溶液と、プローブＤＮＡと、ターゲットＤＮＡとが付与され、前記溶液を保持可能な保持手段と、前記保持手段に保持された前記溶液に所定量の変性剤を付与する変性剤付与手段とを備えることを特徴とする。
【００１３】
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の発明において、前記材料は金微粒子であり、前記溶液は金コロイド溶液であることを特徴とする。
【００１４】
請求項３に記載の発明は、請求項１または２に記載の発明において、前記変性剤付与手段は、所定量ずつ所定回数、前記変性剤を付与することを特徴とする。
【００１５】
請求項４に記載の発明は、請求項１または２に記載の発明において、前記溶液を保持可能な第２の保持手段と、前記第２の保持手段に保持された前記溶液に前記変性剤を付与する第２の変性剤付与手段とをさらに備え、前記保持手段には、前記溶液と、測定対象のプローブＤＮＡと、測定対象のターゲットＤＮＡとが付与され、前記第２の保持手段には、前記溶液と、前記測定対象のプローブＤＮＡと、該測定対象のプローブＤＮＡとフルマッチするターゲットＤＮＡとが付与され、前記変性剤付与手段および前記第２の変性剤付与手段はそれぞれ、等量の変性剤を付与することを特徴とする。
【００１６】
請求項５に記載の発明は、請求項４に記載の発明において、前記変性剤付与手段および前記第２の変性剤付与手段はそれぞれ、所定量ずつ所定回数、前記変性剤を付与することを特徴とする。
【００１７】
請求項６に記載の発明は、請求項１乃至３のいずれかに記載の発明において、前記保持手段が形成された光導波路と、前記光導波路に光を結合するための光結合手段とをさらに備え、前記光導波路を導波する光が横切るように前記保持手段が前記光導波路に形成されていることを特徴とする。
【００１８】
請求項７に記載の発明は、請求項１乃至３のいずれかに記載の発明において、前記保持手段が複数形成された部材をさらに備えることを特徴とする。
【００１９】
請求項８に記載の発明は、ＤＮＡ検出方法であって、ＤＮＡを固定可能である材料が分散した溶液に、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとを付与するＤＮＡ付与工程と、前記プローブＤＮＡおよびターゲットＤＮＡが付与された溶液に対して、所定量の変性剤を付与する変性剤付与工程と、前記変性剤が付与された溶液の所定の特性を測定する特性取得工程とを有することを特徴とする。
【００２０】
請求項９に記載の発明は、請求項８に記載の発明において、前記材料は金微粒子であり、前記溶液は金コロイド溶液であることを特徴とする。
【００２１】
請求項１０に記載の発明は、請求項８または９に記載の発明において、前記変性剤付与工程では、所定量ずつ所定回数、前記変性剤を付与することを特徴とする。
【００２２】
請求項１１に記載の発明は、請求項８乃至１０のいずれかに記載の発明において、前記特性取得工程の後に、前記ＤＮＡ付与工程にて付与されるプローブＤＮＡとフルマッチするターゲットＤＮＡと前記プローブＤＮＡとを付与して前記所定量の変性剤を付与した溶液について予め測定された特性と、前記特性取得工程にて測定された特性とを比較する工程をさらに有することを特徴とする。
【００２３】
請求項１２に記載の発明は、請求項８乃至１０のいずれかに記載の発明において、前記ＤＮＡ付与工程は、測定用の前記溶液と、リファレンス用の前記溶液とを用意する工程と、前記測定用の前記溶液に対して、前記プローブＤＮＡおよび前記ターゲットＤＮＡを付与し、前記リファレンス用の前記溶液に対して、前記プローブＤＮＡとフルマッチするターゲットＤＮＡと前記プローブＤＮＡとを付与する工程を有し、前記変性剤付与工程では、前記測定用の前記溶液および前記リファレンス用の前記溶液のそれぞれに、前記変性剤を等量付与することを特徴とする。
【００２４】
請求項１３に記載の発明は、請求項８乃至１２のいずれかに記載の発明において、前記ＤＮＡ付与工程と前記変性剤付与工程との間に、前記プローブＤＮＡおよびターゲットＤＮＡが付与された溶液の前記所定の特性を測定する工程をさらに有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、変性剤を用いることによって、ＳＮＰｓ検出の際、ミスマッチ塩基がターゲットＤＮＡのどこにあっても、常温で検出可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、図面を参照して本発明の実施形態を詳細に説明する。なお、以下で説明する図面で、同一機能を有するものは同一符号を付け、その繰り返しの説明は省略する。
【００２７】
本発明の一実施形態では、反応が速いために常温で操作できるという金微粒子などのＤＮＡを固定可能な材料を用いる形態の利点と、フルマッチＤＮＡとＳＮＰｓとの差が付け易いというＤＮＡチップの利点の両方を持つＤＮＡ検出を実現する。すなわち、１塩基ミスマッチがターゲットＤＮＡのどこにあっても、常温でＳＮＰｓ検出ができるような方式である。
【００２８】
このために、本発明の一実施形態では、金微粒子などのＤＮＡを固定可能な材料が分散した溶液に一本鎖プローブＤＮＡを付与して、上記材料にプローブＤＮＡを固定し、かつ該溶液に一本鎖ターゲットＤＮＡを付与するＤＮＡ検出において、ＳＮＰｓの検出効率を向上させるために変性剤を加えている。
【００２９】
すなわち、本発明の一実施形態では、金微粒子などのＤＮＡを固定可能な材料を用いた遺伝子診断の手法に加えて、変性剤を用いて濃度を調整することによって、水素結合を切断して二本鎖から一本鎖の状態にする量を、一塩基ミスマッチの場合について多くする。従って、一塩基の違いを明瞭に区別することができる。
【００３０】
図２を用いて、上記変性剤を用いる作用をさらに説明する。
図２において、符号２１は、プローブＤＮＡであり、該プローブＤＮＡ２１を金コロイド溶液２２に付与する。このとき、金コロイド溶液２２は赤色を示している。
ところで、粒子径１５ｎｍ程度の金微粒子が分散した金コロイド溶液は、赤色である。この金コロイド溶液において、金微粒子が凝集すると、吸収スペクトルが長波長側にシフトして、溶液の色は赤色から青に変化する。この金微粒子の凝集は、金微粒子に固定されたプローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとがハイブリダイゼーション反応することによって起こるものである。
【００３１】
従って、プローブＤＮＡをチオール化などにより固定した金コロイド溶液に、上記プローブＤＮＡと完全に相補的なターゲットＤＮＡを加えると金微粒子は速やかに凝集し、溶液の色が赤色から青色に変化するが、わずか一塩基でも異なるＤＮＡを加えると、上述のような反応は起こらない。しかしながら、上述したように、これはＤＮＡの末端、あるいはその近傍に位置する一塩基がミスマッチの時のみに起こる現象である。すなわち、ＤＮＡの末端、またはその近傍以外の位置の一塩基がミスマッチの場合、ターゲットＤＮＡに一塩基ミスマッチがある場合でも、凝集が起こることがある。
【００３２】
本発明の一実施形態は、ハイブリダイゼーション反応により凝集が起こった場合において、その凝集が、上述のように一塩基ミスマッチがターゲットＤＮＡの末端、あるいはその近傍に位置する一塩基のミスマッチによるものなのか、それとも、フルマッチによるものなのかを識別するために、変性剤を加えている。
【００３３】
さて、図２において、ターゲットＤＮＡ２３は、プローブＤＮＡ２１と相補的であるが、末端、あるいはその近傍以外の位置に一塩基ミスマッチを有するものである。よって、ターゲットＤＮＡ２３を金コロイド溶液２２に付与すると、プローブＤＮＡ２１とターゲットＤＮＡ２３とはフルマッチではないが、金微粒子が凝集して溶液２４の色は青色になる。そして、プローブＤＮＡ２１とターゲットＤＮＡ２３とは二本鎖になる。
【００３４】
このとき、溶液２４における金微粒子の凝集が、フルマッチによるものなのか、あるいは一塩基ミスマッチによるものなのかを、ユーザは判断できない。そこで、溶液２４に変性剤を加える。
【００３５】
一本鎖のプローブＤＮＡに、一本鎖のターゲットＤＮＡが会合する際、フルマッチの時とミスマッチがある時とでは、会合・解離の平衡温度（解離温度Ｔｍ）が異なる。そして、この解離温度Ｔｍは、変性剤によって下がる。本発明の一実施形態では、この性質を利用して、フルマッチの時の特性とミスマッチがある時の特性との区別を図るのである。すなわち、変性剤を加えると、一塩基ミスマッチがある場合に、解離温度Ｔｍが下がることになり、変性剤を加える前において会合している場合であっても、上記解離温度Ｔｍが下がることにより会合しているプローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとが解離することになり、再分散が起こる。よって、溶液２５においては金微粒子が凝集状態から分散状態になり、溶液の色も青色から赤色に変化する。
【００３６】
図３は、ターゲットＤＮＡに一塩基ミスマッチがある場合の金コロイド溶液に対する変性剤の滴下量と吸光度のピーク位置の変化を示す図である。図３の測定結果は、金コロイド溶液にプローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとを付与し、ハイブリダイゼーション反応により金微粒子が凝集することによって青色を示す溶液に、変性剤を１μｌずつ添加し、該添加毎に吸光度を測定したものである。
【００３７】
図３の測定では、ターゲットＤＮＡに一塩基ミスマッチが存在するが、末端、またはその近傍以外に位置しているので、変性剤を加える前の段階では、溶液の色は青色を示している。しかしながら、図３から分かるように、変性剤を加えることによって、吸収スペクトルは変化し、吸光度のピーク位置は短波長側にシフトしている。特に、５μｌ付近で吸光度のピーク位置に変化が見られ、長波長側から短波長側にピーク位置がシフトしていることが分かる。このとき、吸収スペクトルの変化に伴って、溶液の色も青から赤に変化している。従って、変性剤を加えることによって、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとの水素結合が切断され、金微粒子が再分散していることが分かる。
【００３８】
このとき、フルマッチの場合も変性剤の付与によって水素結合が切断され、金微粒子が再分散することになる。しかしながら、フルマッチの場合の解離温度Ｔｍは、ミスマッチの場合の解離温度Ｔｍよりも高いので、変性剤のある付与量において、フルマッチに比べてミスマッチがある場合の方が、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡの、変性剤による解離の量が多くなる。
【００３９】
よって、変性剤を所定の滴下量で連続的に所定回数付与する場合に目視により色変化を観察すると、変性剤を加える際の再分散に関する色変化（青色→赤色）は、ミスマッチがある方が早く観測される。
【００４０】
このように、フルマッチの場合に、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとが会合して金微粒子が凝集した金コロイド溶液に変性剤を加える場合と、一塩基ミスマッチがある場合に、上記金コロイド溶液に変性剤を加える場合とでは、ある変性剤の付与量における解離の量に差が生じる。よって、諸特性（溶液の色、吸収スペクトル、透過スペクトル、屈折率、表面プラズモン共鳴など）にそれぞれ差が生じる。本発明では、フルマッチの場合と一塩基ミスマッチがある場合とにおいて上記特性差を生じさせることが重要であり、そのために変性剤を用いているのである。実際のセンシングの際は、上記差を検出するような形態を用いれば良い。
【００４１】
上記特性差を明確にするために、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとがフルマッチしている金コロイド溶液をリファレンス（参照用）として予め用意しておき、該リファレンス金コロイド溶液にも同様の条件で変性剤を付与することが有効である。すなわち、ある変性剤の付与量における特性と、リファレンス金コロイド溶液における特性とを比較することによって、特性差が生じているか否かを判断することができるので、一塩基ミスマッチがあるか否かを判断することができる。
【００４２】
このように、変性剤を付与することにより一塩基ミスマッチがある場合の解離温度Ｔｍが下がり、二本鎖になっているプローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとの水素結合が切断される量がフルマッチの場合よりも多くなるので、金微粒子の再分散に差を生じさせることができる。よって、この差を観察、測定をすることによって、一塩基ミスマッチがターゲットＤＮＡの何処にあってもＳＮＰｓ検出を行うことができる。また、金微粒子を用いることによって、常温で検出することができる。
【００４３】
なお、本発明の一実施形態では、上述のように、金微粒子などのＤＮＡを固定可能な材料が分散した溶液に、プローブＤＮＡおよびターゲットＤＮＡを付与した後に変性剤を加えることによって、解離温度Ｔｍの低下により、フルマッチの場合と一塩基ミスマッチの場合とにおいて、解離の状況に差が生じ、上記特性差を生じさせることができ、該特性差をその特性に応じた方法で検知できる。ここで、変性剤の付与の方法として、変性剤濃度を変えるために所定の滴下量で連続的に所定回数付与するようにしても良い。このように連続的に滴下することによって、目視によって検知を行う場合、色の変化する様子を容易に認識することができ、リファレンス金コロイド溶液と比較することによって、容易に一塩基ミスマッチの検出を行うことができる。
【００４４】
また、本発明の一実施形態では、変性剤の添加による、一塩基ミスマッチがある場合における解離温度の低下を利用しているので、本ＤＮＡ検出動作を、フルマッチの場合における解離温度よりも高い温度で行うことが望ましい。よって、恒温槽や温度コントローラなど、センサの動作温度を一定に保つことが可能な装置を用いることは有効である。
【００４５】
なお、本明細書において、「変性剤」とは、例えば、ホルムアミドや尿素など、水素結合を弱める、あるいは切断することができるものを指す。
【００４６】
また、本発明の一実施形態では、プローブＤＮＡを固定するために用いる材料として金微粒子を用いているが、これに限らず、例えば、酸化シリコン（ＳｉＯ2）等、ＤＮＡを固定可能であり、一方の符号の電荷を有する官能基に取り囲まれる等して、上記符号の電荷で帯電して溶液中で分散される材料であればいずれの材料であっても良い。このような材料としては、コロイド溶液の際の色と、凝集した時の色とが異なる材料であることが好ましい。
【００４７】
（第１の実施形態）
図４は、本実施形態に係るＤＮＡ検出センサを示す図である。
図４において、光４２に対して透明である容器４１には、金微粒子が分散した金コロイド溶液４３が入れられている。該金コロイド溶液４３は、ビュレット等の金コロイド付与手段によって付与される。上記容器４１は、例えば、マイクロチューブ等、液体を保持できるものであればいずれを用いても良い。
【００４８】
上記金コロイド溶液４３に対して、プローブＤＮＡおよびターゲットＤＮＡが付与される。符号４４は、変性剤付与手段としてのビュレットであり、該ビュレット４４により、金コロイド溶液４３に対して変性剤４５が付与される。符号４６は、光４２を照射するための光源であり、金コロイド溶液の吸収波長帯域と少なくとも一部で重なっている光４２を金コロイド溶液４３に入射するように配置されている。符号４７は受光素子であり、金コロイド溶液４３から出射される光４２を受光するように配置されている。
図４では、受光素子４７はＣＰＵを備える演算装置４８に電気的に接続されており、該演算装置４８は、受光素子４７から送られる受光信号に基づいて吸収スペクトルを取得する。演算装置４８は、メモリ等の記憶部を有しており、上記取得された吸収スペクトルを記憶することができ、演算装置が有するディスプレイ等の表示部に上記取得された吸収スペクトルを表示することができる。
【００４９】
本実施形態では、変性剤付与手段としてビュレットを用いているが、これに限定されず、例えば、メスピペット、スポイト、ノズルを有する付与機構等、変性剤を付与可能な手段であればいずれのものを用いても良い。
【００５０】
次に、本実施形態に係るＤＮＡ検出方法について説明する。
図４において、ＤＮＡ付与手段としてのビュレット等（不図示）を用いて、赤色の金コロイド溶液４３に対して、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとを付与する。該付与後に、以下に示すスペクトル測定工程（吸光度測定）を行う。
すなわち、金コロイド溶液４３に対して、光源４６から光４２を照射し、金コロイド溶液４３を透過した光４２を受光素子４７にて受光する。受光素子４７にて取得された受光信号は演算装置４８に送信される。演算装置４８は、送信された受光信号に基づいて、吸収スペクトルを取得する。これらの工程を本明細書では、スペクトル測定工程（特性測定工程）と呼ぶ。
【００５１】
なお、図４では吸収スペクトルを測定する系であるので特性測定工程にてスペクトル測定を行っているが、透過スペクトル、屈折率変化、表面プラズモン共鳴等を測定する場合は、上記特性測定工程にて、求めたい特性に適した装置によって、該特性を求める。
【００５２】
このとき、ターゲットＤＮＡの末端、またはその近傍に一塩基ミスマッチがある場合は、金微粒子の凝集が起こらず、赤色→青色の変化が起こらない。従って、受光素子４７にて取得される吸収スペクトルは、プローブＤＮＡおよびターゲットＤＮＡの付与前後で変化が生じない。従って、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡの付与前後でスペクトルに変化が無い場合は、一塩基ミスマッチがターゲットＤＮＡの末端、またはその近傍に位置していることが検出される。
【００５３】
一方、ターゲットＤＮＡの末端、またはその近傍以外に一塩基ミスマッチがある場合は、フルマッチと同様に、金微粒子の凝集が起こる場合がある。よって、プローブＤＮＡおよびターゲットＤＮＡを付与した後に、金コロイド溶液４３の色が赤色→青色に変化する場合、すなわち、プローブＤＮＡおよびターゲットＤＮＡの付与前後で、受光素子４７にて測定された吸収スペクトル（ピーク位置など）に変化がある場合は、フルマッチなのか、一塩基ミスマッチがある場合なのか判別がつかない。
【００５４】
そこで、本実施形態では、ビュレット４４により、所定量の変性剤４５を金コロイド溶液４３に付与する。すなわち、変性剤４５を付与する毎に、上記スペクトル測定工程を行う（変性剤吸収スペクトル取得工程）。
【００５５】
本実施形態では、ＤＮＡ検出に用いるプローブＤＮＡとフルマッチする場合について、上記所定量の変性剤を付与した際の吸収スペクトルを予め測定しておく。すなわち、測定対象のプローブＤＮＡとフルマッチするターゲットＤＮＡおよび上記測定対象のプローブＤＮＡとを付与して、次いで所定量の変性剤を付与した金コロイド溶液について予め吸収スペクトル（フルマッチ吸収スペクトルとも呼ぶ）を測定しておく。そして、上記変性剤吸収スペクトル取得工程において取得された吸収スペクトルと、予め測定されたフルマッチ吸収スペクトルとを比較し、スペクトルのピーク位置が異なるか否かを判断する。この判断方法は、例えば、演算装置４８に予め測定したフルマッチ吸収スペクトルを保持させておき、演算装置４８が、変性剤吸収スペクトル取得工程にて取得された吸収スペクトルのピーク位置を算出して、上記２つの吸収スペクトルのピーク位置が一致しているか否かを判断するようにすれば良い。
【００５６】
上記ピーク位置がほぼ一致する場合はフルマッチであると判断され、異なる場合は一塩基ミスマッチが存在すると判断される。
【００５７】
すなわち、演算装置４８は、予め測定された特性に関する情報と、特性測定工程にて取得された特性に関する情報とに基づいて、上記特性にずれがあるか否かを判断し、ずれがある場合に一塩基ミスマッチが存在すると判断するのである。
【００５８】
なお、図４において、ビュレット４４により、変性剤４５を所定の量ずつ付与し、該付与毎にスペクトル測定を行うことによって、変性剤による吸収スペクトルのピーク位置の変化を精確に知ることができるので、より精確なＳＮＰｓ検出を行うことができる。
【００５９】
なお、上記ＤＮＡ付与手段は、ビュレットに限らず、例えば、メスピペット、スポイト、ノズルを有する付与機構等、プローブＤＮＡおよびターゲットＤＮＡを付与可能な手段であればいずれのものを用いても良い。
【００６０】
以下、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明は、下記実施例に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において、種々変更可能であることは言うまでもない。
【００６１】
（第１の実施例）
本実施例にて用いるプローブＤＮＡ、該プローブＤＮＡとフルマッチするターゲットＤＮＡ、および一塩基ミスマッチを有するターゲットＤＮＡの塩基配列（５’末端→３’末端）を表１に示す。
【００６２】
【表１】
【００６３】
表１において、「プローブ」とは、プローブＤＮＡであり、「フルマッチ」とは、プローブＤＮＡとフルマッチするターゲットＤＮＡ（以下、フルマッチターゲットＤＮＡと呼ぶ）である。「Ｎｏ．Ｎ（Ｎ；自然数）」とは、ターゲットＤＮＡの３’末端から数えたミスマッチの位置を示す。例えば、Ｎｏ．１７とは、ターゲットＤＮＡの３’末端から１７番目の塩基がミスマッチであることを示す。さらに、ターゲットＤＮＡＮｏ．Ｎとは、ターゲットＤＮＡの３’末端からＮ番目の位置にミスマッチがあるターゲットＤＮＡを指す。よって例えば、ターゲットＤＮＡＮｏ．１７とは、ターゲットＤＮＡの３’末端から１７番目の塩基にミスマッチがあるターゲットＤＮＡを指す。
なお、表１の各Ｎｏ．における下線部が、ミスマッチである。
【００６４】
＜本実施例にて用いた溶液の各濃度＞
プローブＤＮＡ １０μＭ １０μｌ
ターゲットＤＮＡ １０μＭ １０μｌ
ＮａＣｌ溶液 ３．２Ｍ １０μｌ
金コロイド溶液（粒径１５ｎｍ） ０．００７４ｗｔ％ １０μｌ
【００６５】
本実施例では、図４の金コロイド溶液４３中の金微粒子にプローブＤＮＡを、Ａｕ−Ｓ結合により固定化した。次に、ＮａＣｌ濃度を調整したＮａＣｌ溶液を金コロイド溶液４３に付与した後、ターゲットＤＮＡを金コロイド溶液４３に付与して、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとを反応させた。次いで、反応後の金コロイド溶液４３の色が赤色から青色に変化するのを目視によって観察し、その後吸光度測定（スペクトル測定工程）を行った。
【００６６】
変性剤を用いない場合の結果（従来の方法）
変性剤を用いない場合の、ターゲットＤＮＡの５’末端（プローブＤＮＡの３’末端）から３番目までの位置にミスマッチがある場合、およびターゲットＤＮＡの５’末端から３番目までの位置以外の位置にミスマッチがある場合における吸収スペクトルを図５に示す。
【００６７】
図５において、スペクトル５１は、５’末端から３番目までの位置にミスマッチがあるターゲットＤＮＡとプローブＤＮＡとを反応させた場合の吸収スペクトルである。スペクトル５１から分かるように、ターゲットＤＮＡの５’末端から３番目までの位置にミスマッチがある場合は、ターゲットＤＮＡとプローブＤＮＡとを反応させると、金コロイド溶液４３の色は分散（赤色）のままだった。すなわち、スペクトル５１のピーク位置は約５２０〜５３０ｎｍであり、反応前（ターゲットＤＮＡ付与前）の金コロイド溶液４３のピーク位置とほとんど変わらなかった。
【００６８】
一方、図５において、スペクトル５２は、５’末端から３番目までの位置以外の位置にミスマッチがあるターゲットＤＮＡとプローブＤＮＡとを反応させた場合の吸収スペクトルである。スペクトル５２から分かるように、ターゲットＤＮＡの５’末端から３番目までの位置以外の位置にミスマッチがある場合は、凝集（青色）してしまい、フルマッチなのか一塩基ミスマッチなのかの区別がつかなかった。すなわち、スペクトル５２のピーク位置は約５５０〜５６０ｎｍと変化し、溶液の色も凝集する場合の青色になった。
このように、変性剤を用いない方法では、全ての位置のミスマッチをフルマッチと区別することができなかった。
【００６９】
変性剤を用いた結果
そこで本実施例では、フルマッチと一塩基ミスマッチとを区別するために、上記プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとを反応させた後に、変性剤４５としてホルムアミドをビュレット４４によって金コロイド溶液４３に付与し、再度吸光度測定（変性剤吸収スペクトル取得工程）を行った。本実施例の実験は全て室温で行った。
【００７０】
＜変性剤０μｌの場合＞
図６は、ターゲットＤＮＡ添加前の金コロイド溶液の吸収スペクトル、フルマッチターゲットＤＮＡ添加後の金コロイド溶液の吸収スペクトル、およびターゲットＤＮＡＮｏ．１７添加後の金コロイド溶液の吸収スペクトルを示す図である。
【００７１】
図６において、スペクトル６１は、ターゲットＤＮＡ添加前の金コロイド溶液４３の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５３１ｎｍにあり、赤色を示していた。
スペクトル６２は、フルマッチターゲットＤＮＡを金コロイド溶液４３に添加した後の金コロイド溶液４３の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５４５ｎｍにあり、青色を示していた。
スペクトル６３は、ターゲットＤＮＡＮｏ．１７を金コロイド溶液４３に添加した後の金コロイド溶液４３の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５４７ｎｍにあり、青色を示していた。
【００７２】
図６から明らかなように、スペクトル６２およびスペクトル６３はほぼ同じスペクトルとなっており、そのピーク位置もほぼ同じであり、変性剤を加えない場合においては、図５にて説明したように、フルマッチターゲットＤＮＡとターゲットＤＮＡＮｏ．１７とは区別がつかない。
【００７３】
＜所定量の変性剤を付与した場合＞
図７（ａ）〜（ｃ）に、変性剤（ホルムアミド）を等量用いたときのフルマッチターゲットＤＮＡと、ターゲットＤＮＡＮｏ．１７との吸光度の比較を示す。
図７（ａ）は、フルマッチターゲットＤＮＡ添加後の金コロイド溶液、およびターゲットＤＮＡＮｏ．１７添加後の金コロイド溶液のそれぞれについて、変性剤としてのホルムアミドを５μｌ添加した後の吸収スペクトルを示す図である。
【００７４】
図７（ａ）において、スペクトル７１は、プローブＤＮＡおよびフルマッチターゲットＤＮＡを付与した後の金コロイド溶液４３にホルムアミドを５μｌ付与した後の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５５５ｎｍであった。一方、スペクトル７２は、プローブＤＮＡおよびターゲットＤＮＡＮｏ．１７を付与した後の金コロイド溶液４３にホルムアミドを５μｌ付与した後の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５２８ｎｍであった。
【００７５】
このように変性剤を加える前の段階ではピーク位置がほぼ同じであった、フルマッチターゲットＤＮＡ添加後の金コロイド溶液の吸収スペクトル（スペクトル６２）とターゲットＤＮＡＮｏ．１７添加後の金コロイド溶液の吸収スペクトル（スペクトル６３）とが、変性剤を付与することによって、スペクトル７１およびスペクトル７２に示すように、そのピーク位置に差が出た。
【００７６】
図７（ｂ）は、フルマッチターゲットＤＮＡ添加後の金コロイド溶液、およびターゲットＤＮＡＮｏ．１７添加後の金コロイド溶液のそれぞれについて、変性剤としてのホルムアミドを６μｌ添加した後の吸収スペクトルを示す図である。
【００７７】
図７（ｂ）において、スペクトル７３は、プローブＤＮＡおよびフルマッチターゲットＤＮＡを付与した後の金コロイド溶液４３にホルムアミドを６μｌ付与した後の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５４５ｎｍであった。一方、スペクトル７４は、プローブＤＮＡおよびターゲットＤＮＡＮｏ．１７を付与した後の金コロイド溶液４３にホルムアミドを６μｌ付与した後の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５２９ｎｍであった。
【００７８】
このように変性剤を６μｌ加えた場合であっても、変性剤を５μｌ加えた場合と同様に、変性剤の付与後のスペクトルのピーク位置に差が出た。
【００７９】
図７（ｃ）は、フルマッチターゲットＤＮＡ添加後の金コロイド溶液、およびターゲットＤＮＡＮｏ．１７添加後の金コロイド溶液のそれぞれについて、変性剤としてのホルムアミドを７μｌ添加した後の吸収スペクトルを示す図である。
【００８０】
図７（ｃ）において、スペクトル７５は、プローブＤＮＡおよびフルマッチターゲットＤＮＡを付与した後の金コロイド溶液４３にホルムアミドを７μｌ付与した後の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５２８ｎｍであった。一方、スペクトル７６は、プローブＤＮＡおよびターゲットＤＮＡＮｏ．１７を付与した後の金コロイド溶液４３にホルムアミドを７μｌ付与した後の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５２８ｎｍであった。
【００８１】
図７（ｃ）から分かるように、変性剤の付与量が７μｌ付近ではフルマッチターゲットＤＮＡ添加後の金コロイド溶液の吸収スペクトルのピーク位置と、ターゲットＤＮＡＮｏ．１７添加後の金コロイド溶液の吸収スペクトルのピーク位置との差がほとんど生じなかった。
【００８２】
このように、変性剤を５μｌ〜６μｌ付与することによって、フルマッチターゲットＤＮＡの場合と、ターゲットＤＮＡＮｏ．１７の場合とにおける吸収スペクトルのピーク位置に差を生じさせることができる。すなわち、本発明では、変性剤を適量加えることによって、上記ピーク位置の差を生じさせることができ、この差を観測することによって、一塩基ミスマッチがどこに位置していてもＳＮＰｓを検出することができる。
【００８３】
なお、本発明では、変性剤を所定量（例えば、１μｌ）ずつ付与し、その都度、所定の特性（本実施例では吸光度）を測定することによって、上記特性の差（本実施例では、ピーク位置の差）の変遷を知ることができるので、より精確なＳＮＰｓ検出を行うことができる。すなわち、図７（ａ）〜（ｃ）の例で言えば、付与量によっては図７（ｃ）のような結果が得られる可能性があるが、変性剤を所定量ずつ徐々に付与することによって、図７（ｃ）のような結果を得る前に、図７（ａ）、図７（ｂ）の結果を得ることができるので、適切な範囲内でのＳＮＰｓを行うことができる。
【００８４】
＜変性剤を５μｌ用いたときの一塩基ミスマッチ（Ｎｏ．１０、１１、１４、１５、１６）と変性剤添加前の一塩基ミスマッチの吸光度のピーク位置の比較＞
上述のように、ターゲットＤＮＡＮｏ．１７の場合、変性剤を５μｌ付与すると、フルマッチターゲットＤＮＡに対して吸光度のピーク位置に差を生じさせることができた。以下では、ターゲットＤＮＡＮｏ．１０、１１、１４、１５、１６に対して、変性剤を５μｌ付与した場合について説明する。
【００８５】
図８（ａ）〜（ｅ）は、変性剤を５μｌ付与する場合における、変性剤添加前と添加後の吸光度の比較を示す図である。
図８（ａ）は、ターゲットＤＮＡＮｏ．１０を付与した金コロイド溶液について、変性剤としてホルムアミドを５μｌ添加する前と後との吸収スペクトルを示す図である。
図８（ａ）において、スペクトル８１は、ターゲットＤＮＡＮｏ．１０を付与した金コロイド溶液に対して変性剤を５μｌ添加する前の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５６５ｎｍであった。一方、スペクトル８２は、ターゲットＤＮＡＮｏ．１０を付与した金コロイド溶液に対して変性剤を５μｌ添加した後の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５３１ｎｍであった。
【００８６】
図８（ｂ）は、ターゲットＤＮＡＮｏ．１１を付与した金コロイド溶液について、変性剤としてホルムアミドを５μｌ添加する前と後との吸収スペクトルを示す図である。
図８（ｂ）において、スペクトル８３は、ターゲットＤＮＡＮｏ．１１を付与した金コロイド溶液に対して変性剤を５μｌ添加する前の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５５６ｎｍであった。一方、スペクトル８４は、ターゲットＤＮＡＮｏ．１１を付与した金コロイド溶液に対して変性剤を５μｌ添加した後の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５３０ｎｍであった。
【００８７】
図８（ｃ）は、ターゲットＤＮＡＮｏ．１４を付与した金コロイド溶液について、変性剤としてホルムアミドを５μｌ添加する前と後との吸収スペクトルを示す図である。
図８（ｃ）において、スペクトル８５は、ターゲットＤＮＡＮｏ．１４を付与した金コロイド溶液に対して変性剤を５μｌ添加する前の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５４１ｎｍであった。一方、スペクトル８６は、ターゲットＤＮＡＮｏ．１４を付与した金コロイド溶液に対して変性剤を５μｌ添加した後の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５２９ｎｍであった。
【００８８】
図８（ｄ）は、ターゲットＤＮＡＮｏ．１５を付与した金コロイド溶液について、変性剤としてホルムアミドを５μｌ添加する前と後との吸収スペクトルを示す図である。
図８（ｄ）において、スペクトル８７は、ターゲットＤＮＡＮｏ．１５を付与した金コロイド溶液に対して変性剤を５μｌ添加する前の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５５８ｎｍであった。一方、スペクトル８８は、ターゲットＤＮＡＮｏ．１５を付与した金コロイド溶液に対して変性剤を５μｌ添加した後の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５３０ｎｍであった。
【００８９】
図８（ｅ）は、ターゲットＤＮＡＮｏ．１６を付与した金コロイド溶液について、変性剤としてホルムアミドを５μｌ添加する前と後との吸収スペクトルを示す図である。
図８（ｅ）において、スペクトル８９は、ターゲットＤＮＡＮｏ．１６を付与した金コロイド溶液に対して変性剤を５μｌ添加する前の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５３７ｎｍであった。一方、スペクトル９０は、ターゲットＤＮＡＮｏ．１６を付与した金コロイド溶液に対して変性剤を５μｌ添加した後の吸収スペクトルであり、そのピーク位置は５２９ｎｍであった。
【００９０】
このように、ターゲットＤＮＡＮｏ．１０、１１、１４、１５、１６のいずれの場合であっても、変性剤を５μｌ加えることによって、変性剤を加える前に比べて吸光度のピーク位置に変化が見られた。すなわち、変性剤を加えることによって、ピーク位置が短波長側にシフトしていき、変性剤添加前と添加後とにおいてピーク位置に差が生じた。また、ターゲットＤＮＡＮｏ．１０、１１、１４、１５、１６のいずれの場合においても、上記ピーク位置のシフトに伴って、金コロイド溶液の色が、青色から赤色に変化した。
【００９１】
さらに、図７（ａ）に示されるように、フルマッチターゲットＤＮＡを付与した金コロイド溶液に変性剤を５μｌ付与した場合の吸収スペクトルのピーク位置は５５５ｎｍであるので、ターゲットＤＮＡＮｏ．１０、１１、１４、１５、１６のいずれの場合についても、ターゲットＤＮＡＮｏ．１７と同様に、変性剤を加えることによって、ピーク位置に差を生じさせることができる。
【００９２】
このように、変性剤を用いることによって、ターゲットＤＮＡのどこに一塩基ミスマッチがあっても、良好にＳＮＰｓ検出を行うことができる。
【００９３】
（第２の実施形態）
本実施形態では、測定用の金コロイド溶液の他に、リファレンス用の金コロイド溶液を用意し、該２つの金コロイド溶液に同量の変性剤を加えてその特性変化（スペクトル変化等）を観察する。このようにすることによって、目視によってもＳＮＰｓ検出を行うことができる。
【００９４】
図９において、金微粒子が分散した金コロイド溶液４３が入れられた容器４１、およびリファレンスとしての、金微粒子が分散した金コロイド溶液９２が入れられた容器９１とを用意する。符号９３は、変性剤付与手段としてのビュレットであり、該ビュレット９３により、金コロイド溶液９２に対して変性剤９４が付与される。
【００９５】
図９においては、リファレンス用の金コロイド溶液９２には、測定対象のプローブＤＮＡと、該プローブＤＮＡとフルマッチするターゲットＤＮＡとがＤＮＡ付与手段により付与される。測定用の金コロイド溶液４３には、第１の実施形態と同様に、測定対象のプローブＤＮＡと、測定対象のターゲットＤＮＡとがＤＮＡ付与手段により付与される。
【００９６】
このとき、リファレンス用の金コロイド溶液９２にはフルマッチターゲットＤＮＡが付与されるので、金微粒子の凝集が起こり、溶液の色が赤色から青色に変化する。
これに対して、測定用の金コロイド溶液４３においては、ターゲットＤＮＡの付与により溶液の色が変化しない場合は、ターゲットＤＮＡの末端、またはその近傍に一塩基ミスマッチがある場合であると判断できる。一方、溶液の色が青色に変化した場合は、ターゲットＤＮＡが、フルマッチターゲットＤＮＡなのか、一塩基ミスマッチを有するターゲットＤＮＡなのかの判断がつかない。
【００９７】
そこで、測定用の金コロイド溶液４３およびリファレンス用の金コロイド溶液９２に対して、等量の変性剤を付与する。測定用の金コロイド溶液４３への変性剤の付与タイミングとリファレンス用の金コロイド溶液９２への変性剤の付与タイミングとは、同じであっても異なっていても良い。
【００９８】
このとき、変性剤の付与量が所定量のときに、測定用の金コロイド溶液４３にのみ、溶液の色が青色から赤色に変化する場合は、一塩基ミスマッチが存在すると判断できる。一方、変性剤の付与量が所定量のときに、測定用の金コロイド溶液４３およびリファレンス用の金コロイド溶液９２において、溶液の色が青色から赤色に変化する場合は、測定対象のターゲットＤＮＡがフルマッチターゲットＤＮＡであると判断できる。
【００９９】
本実施形態によれば、一塩基ミスマッチがあるか否かを色の変化によって判断することができるので、目視によってＳＮＰｓ検出を行うことができる。また、第１の実施形態に示したように、光源、受光素子をリファレンス用の金コロイド溶液９２側にも設けて、スペクトル測定によって判断するようにしても良い。
【０１００】
このように、本実施形態では、変性剤が付与された、測定用の金コロイド溶液４３とリファレンス用の金コロイド溶液９２とのそれぞれについて、目視やスペクトル測定によって所定の特性を測定することになる。
【０１０１】
ただし、図７（ｃ）で示したように、変性剤の付与量によっては、フルマッチの場合と一塩基ミスマッチを有する場合とにおいて、ピーク位置に差が出ない場合もある。そこで、変性剤付与手段を制御して、測定用の金コロイド溶液４３およびリファレンス用の金コロイド溶液９２に対して変性剤を徐々に等量ずつ付与するのが好ましい。このように徐々に変性剤を付与する場合、先に、測定用の金コロイド溶液４３の色が青色から赤色に変化した場合、測定対象のターゲットＤＮＡには一塩基ミスマッチが含まれていると判断することができる。
【０１０２】
なお、本発明では、変性剤を加えることによって、一塩基ミスマッチが存在する場合の金コロイド溶液の吸収スペクトル、透過スペクトル、屈折率等の特性を、フルマッチの場合に対して変化させることが本質である。このように変化させることができれば、所定の方法（第１の実施形態のように吸光度を測定する方法、第２の実施形態のように目視によって測定する方法、または屈折率変化を測定する方法等）によって上記特性の変化を検出することによってＳＮＰｓを検出することができる。従って、該特性の検出方法は本質で無い。
【０１０３】
（第３の実施形態）
図１０は、本実施形態に係る光導波路型ＤＮＡセンサの側面図である。
図１０において、ガラス基板１０１の一方の面には、カリウムイオン交換ガラス光導波路(硝酸カリウム溶融塩中４００℃、１ｈイオン交換)１０２が、厚さ約２ミクロンで形成されている。光導波路１０２は、シングルモード導波路である。ガラス基板１０１の、光導波路１０２が形成された面と対向する面には、光吸収層１０３が形成されている。光導波路１０２の所定の領域には、有機ＥＬ材料であるＡｌｑ３ １０４が形成されている。Ａｌｑ３ １０４を覆うようにしてＣｙｔｏｐ１０５が形成されており、該Ｃｙｔｏｐ１０５上にはカバーガラス１０６が配置されている。
【０１０４】
光導波路１０２上において、Ｃｙｔｏｐ１０５やカバーガラス１０６から所定の距離だけ離間して、プリズム１０７が配置されている。このプリズム１０７と光導波路１０２との間には、インデックスマッチングオイル（不図示）が配置されており、光導波路１０２を導波する光はプリズム１０７へと入射される。光導波路１０２上の、Ｃｙｔｏｐ１０５やカバーガラス１０６とプリズム１０７との間の領域であって、導波光Ｓが導波する領域上に、金コロイド溶液を付与するための領域であるセンシング領域１０８が形成されている。このセンシング領域１０８は、テフロン（登録商標）シートなどから形成することができ、上記センシング領域１０８上に、金コロイド溶液が付与され、また、ＤＮＡ検体も付与される。すなわち、導波光Ｓが横切るようにセンシング領域１０８が形成されている。本実施形態では、センシング領域１０８が、金コロイド溶液やＤＮＡを保持する領域となる。
【０１０５】
また、Ａｌｑ３ １０４に光を入射するように、紫外線照射用のＬＥＤ１０９が配置されている。このＬＥＤ１０９からは、波長３６５ｎｍの紫外線が照射される。
【０１０６】
プリズム１０７からの出射光を受光するようにフィルタ１１０および光センサ１１１が配置されている。また、ガラス基板１０１の、光吸収層１０３が形成されていない領域から出射される光を受光するように、フィルタ１１２および光センサ１１３が形成されている。
【０１０７】
ところで、本実施形態において、金微粒子の吸収スペクトルに対応するために、有機ＥＬ材料であるＡｌｑ３を用いている。Ａｌｑ３の発光波長領域は、５００〜６００ｎｍの幅広い波長領域である。よって、金微粒子の吸収スペクトルとＡｌｑ３の発光スペクトルとがほぼ重なっている、すなわち、Ａｌｑ３の発光波長領域が金微粒子の吸収ピークの波長に対応しているため、感度の高い検出が可能となる。
【０１０８】
よって、本実施形態のように構成し、ＬＥＤ３０９から紫外線（波長＝３６５ｎｍ）をＡｌｑ３ １０４に照射して、Ａｌｑ３ １０４にてフォトルミネッセンス光を生成する。この生成されたフォトルミネッセンス光のうち、所定の光が光導波路１０２に結合し、導波光Ｓとなる。このようにして、シングルモード導波路である光導波路１０２中を、スペクトル幅の広い導波光Ｓが導波することになる。この導波光Ｓは、プリズム１０７から出射され、該プリズムから出射された出射光Ｕは、フィルタ１１０を介して光センサ１１１に入射する。また、上記生成されたフォトルミネッセンス光のうち光Ｔは、ガラス基板１０１の、光吸収層１０３が形成されていない領域から外に出射され、後述する、フィルタ１１２を介して、光センサ１１３に入射する。
【０１０９】
次に、本実施形態に係るＤＮＡ検出方法について説明する。
まず、図１０において、センシング領域１０８に、金コロイド溶液と、プローブＤＮＡと、ターゲットＤＮＡとをそれぞれ付与する。次いで、Ａｌｑ３ １０４に対して、ＬＥＤ１０９から紫外線を照射して、フォトルミネッセンス光を発生させる。このフォトルミネッセンス光の発光スペクトルは、波長帯域５００ｎｍ〜６００ｎｍにピークがあり、金微粒子の吸収ピークとほぼ重なっている。発生したフォトルミネッセンス光の一部は導波光Ｓとして、光導波路１０２に結合し、また、他の一部は、光Ｔとしてセンサから出射して、フィルタ１１２を介して光センサ１１３に入射する。
【０１１０】
上記導波光Ｓは、全反射しながら光導波路１０２を導波するので、エバネッセント波が発生する。このとき、上記エバネッセント波がそのセンシング領域１０８上に存在する金微粒子に作用する。すなわち、導波光Ｓは、光導波路１０２を通過してセンシング領域１０８において該金微粒子に作用して、プリズム１０７から出射されて出射光Ｕとなる。該出射光Ｕは、フィルタ１１０を介して光センサ１１１に入射する。
【０１１１】
光センサ１１３にて受光した光から得られる吸収スペクトルはリファレンスとして機能するので、光センサ１１１にて受光した光から得られる吸収スペクトルとの比を取ることによって、計算された吸収スペクトルを取得する。
【０１１２】
次いで、変性剤付与手段によって、センシング領域１０８の金コロイド溶液に対して変性剤を所定量付与する。該付与後に、上述のように、Ａｌｑ３ １０４に対して、ＬＥＤ１０９から紫外線を照射することによって、吸収スペクトルを取得し、第１の実施形態にて説明したように、ピーク位置に差が生じたか否かを判断する。
【０１１３】
なお、本実施形態では、所定の波長帯域を有する光を光導波路に入射するためにＡｌｑ３ １０４やＬＥＤ１０９を用いているが、これに限定されず、所定の波長帯域を有する光を光導波路に入射できればいずれの手段を用いても良い。例えば、光導波路１０２の所定の領域にプリズム１０７と対向するように第２のプリズムを配置し、該プリズムを介して光を光導波路１０２に入射するようにしても良い。また、所定の波長帯域の光が導波している光ファイバや光導波路の一方端を、光導波路１０２のプリズム１０７と対向する側の端面にバットジョイント法などにより接続して、上記光を光導波路１０２に入射するようにしても良い。
【０１１４】
（第４の実施形態）
本実施形態では、金コロイド溶液を保持する領域を同一基板上に複数設けるようにしている。
図１０は、本実施形態に係る複数の液室を有する基板を示す図である。
図１０において、基板１２１上には、複数の液室１２２が形成されている。この液室１２２のそれぞれに、金コロイド溶液、プローブＤＮＡ、ターゲットＤＮＡが付与される。
【０１１５】
この基板１２１を用いた１つのＤＮＡ検出方法としては、各液室１２２に対して、同一かつ等量の、金コロイド溶液、プローブＤＮＡ，およびターゲットＤＮＡを付与し、次いで、液室１２２の各々について、付与量を変えて変性剤を付与する。このようにすることによって、第１〜第３の実施形態にて述べたように、変性剤を徐々に加えなくても、一度に変性剤の量を変えた測定結果を得ることができる。
【０１１６】
また、基板１２１を用いた他のＤＮＡ検出方法としては、各液室１２２に対して、同一かつ等量の、金コロイド溶液、プローブＤＮＡを付与する。これと共に、各液室１２２に対して、サンプルを変えたターゲットＤＮＡを等量付与する。その結果、各液室１２２にはそれぞれ異なるサンプルのターゲットＤＮＡが付与されることになる。次いで、適量の変性剤（例えば、５μｌ）を加えることによって、複数のサンプルを同時に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】従来の、金コロイド溶液を用いたＤＮＡ検出法を説明するための図である。
【図２】本発明の一実施形態に係る変性剤を用いたＤＮＡ検出の方法を説明するための図である。
【図３】本発明の一実施形態に係る変性剤の濃度に対する吸光度変化を示す図である。
【図４】本発明の一実施形態に係るＤＮＡ検出センサを示す図である。
【図５】本発明の一実施形態に係るターゲットＤＮＡ添加後の吸光度変化を示す図である。
【図６】本発明の一実施形態に係る変性剤０μｌの場合の吸光度変化を示す図である。
【図７】（ａ）〜（ｃ）は、本発明の一実施形態に係る変性剤を等量用いたときのフルマッチＤＮＡと一塩基ミスマッチＤＮＡとの吸光度の比較を示す図である。
【図８】（ａ）〜（ｅ）は、本発明の一実施形態に係る変性剤を５μｌ付与する場合における、変性剤添加前と添加後の吸光度の比較を示す図である。
【図９】本発明の一実施形態に係るＤＮＡ検出センサを示す図である。
【図１０】本発明の一実施形態に係る光導波路型のＤＮＡ検出センサを示す図である。
【図１１】本発明の一実施形態に係る複数の液室を有する基板を示す図である。
【符号の説明】
【０１１８】
４１、９１ 容器
４２ 光
４３、９２ 金コロイド溶液
４４、９３ ビュレット
４５ 変性剤
４６ 光源
４７ 受光素子
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡを固定可能である材料が分散した溶液と、プローブＤＮＡと、ターゲットＤＮＡとが付与され、前記溶液を保持可能な保持手段と、
前記保持手段に保持された前記溶液に所定量の変性剤を付与する変性剤付与手段と
を備えることを特徴とするＤＮＡ検出センサ。
【請求項２】
前記材料は金微粒子であり、前記溶液は金コロイド溶液であることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ検出センサ。
【請求項３】
前記変性剤付与手段は、所定量ずつ所定回数、前記変性剤を付与することを特徴とする請求項１または２に記載のＤＮＡ検出センサ。
【請求項４】
前記溶液を保持可能な第２の保持手段と、
前記第２の保持手段に保持された前記溶液に前記変性剤を付与する第２の変性剤付与手段とをさらに備え、
前記保持手段には、前記溶液と、測定対象のプローブＤＮＡと、測定対象のターゲットＤＮＡとが付与され、
前記第２の保持手段には、前記溶液と、前記測定対象のプローブＤＮＡと、該測定対象のプローブＤＮＡとフルマッチするターゲットＤＮＡとが付与され、
前記変性剤付与手段および前記第２の変性剤付与手段はそれぞれ、等量の変性剤を付与することを特徴とする請求項１または２に記載のＤＮＡ検出センサ。
【請求項５】
前記変性剤付与手段および前記第２の変性剤付与手段はそれぞれ、所定量ずつ所定回数、前記変性剤を付与することを特徴とする請求項４に記載のＤＮＡ検出センサ。
【請求項６】
前記保持手段が形成された光導波路と、
前記光導波路に光を結合するための光結合手段とをさらに備え、
前記光導波路を導波する光が横切るように前記保持手段が前記光導波路に形成されていることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のＤＮＡ検出センサ。
【請求項７】
前記保持手段が複数形成された部材をさらに備えることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のＤＮＡ検出センサ。
【請求項８】
ＤＮＡを固定可能である材料が分散した溶液に、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとを付与するＤＮＡ付与工程と、
前記プローブＤＮＡおよびターゲットＤＮＡが付与された溶液に対して、所定量の変性剤を付与する変性剤付与工程と、
前記変性剤が付与された溶液の所定の特性を測定する特性取得工程と
を有することを特徴とするＤＮＡ検出方法。
【請求項９】
前記材料は金微粒子であり、前記溶液は金コロイド溶液であることを特徴とする請求項８に記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項１０】
前記変性剤付与工程では、所定量ずつ所定回数、前記変性剤を付与することを特徴とする請求項８または９に記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項１１】
前記特性取得工程の後に、前記ＤＮＡ付与工程にて付与されるプローブＤＮＡとフルマッチするターゲットＤＮＡと前記プローブＤＮＡとを付与して前記所定量の変性剤を付与した溶液について予め測定された特性と、前記特性取得工程にて測定された特性とを比較する工程をさらに有することを特徴とする請求項８乃至１０のいずれかに記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡ付与工程は、
測定用の前記溶液と、リファレンス用の前記溶液とを用意する工程と、
前記測定用の前記溶液に対して、前記プローブＤＮＡおよび前記ターゲットＤＮＡを付与し、前記リファレンス用の前記溶液に対して、前記プローブＤＮＡとフルマッチするターゲットＤＮＡと前記プローブＤＮＡとを付与する工程を有し、
前記変性剤付与工程では、前記測定用の前記溶液および前記リファレンス用の前記溶液のそれぞれに、前記変性剤を等量付与することを特徴とする請求項８乃至１０のいずれかに記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項１３】
前記ＤＮＡ付与工程と前記変性剤付与工程との間に、前記プローブＤＮＡおよびターゲットＤＮＡが付与された溶液の前記所定の特性を測定する工程をさらに有することを特徴とする請求項８乃至１２のいずれかに記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項１】
ＤＮＡを固定可能である材料が分散した溶液と、プローブＤＮＡと、ターゲットＤＮＡとが付与され、前記溶液を保持可能な保持手段と、
前記保持手段に保持された前記溶液に所定量の変性剤を付与する変性剤付与手段と
を備えることを特徴とするＤＮＡ検出センサ。
【請求項２】
前記材料は金微粒子であり、前記溶液は金コロイド溶液であることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ検出センサ。
【請求項３】
前記変性剤付与手段は、所定量ずつ所定回数、前記変性剤を付与することを特徴とする請求項１または２に記載のＤＮＡ検出センサ。
【請求項４】
前記溶液を保持可能な第２の保持手段と、
前記第２の保持手段に保持された前記溶液に前記変性剤を付与する第２の変性剤付与手段とをさらに備え、
前記保持手段には、前記溶液と、測定対象のプローブＤＮＡと、測定対象のターゲットＤＮＡとが付与され、
前記第２の保持手段には、前記溶液と、前記測定対象のプローブＤＮＡと、該測定対象のプローブＤＮＡとフルマッチするターゲットＤＮＡとが付与され、
前記変性剤付与手段および前記第２の変性剤付与手段はそれぞれ、等量の変性剤を付与することを特徴とする請求項１または２に記載のＤＮＡ検出センサ。
【請求項５】
前記変性剤付与手段および前記第２の変性剤付与手段はそれぞれ、所定量ずつ所定回数、前記変性剤を付与することを特徴とする請求項４に記載のＤＮＡ検出センサ。
【請求項６】
前記保持手段が形成された光導波路と、
前記光導波路に光を結合するための光結合手段とをさらに備え、
前記光導波路を導波する光が横切るように前記保持手段が前記光導波路に形成されていることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のＤＮＡ検出センサ。
【請求項７】
前記保持手段が複数形成された部材をさらに備えることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のＤＮＡ検出センサ。
【請求項８】
ＤＮＡを固定可能である材料が分散した溶液に、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとを付与するＤＮＡ付与工程と、
前記プローブＤＮＡおよびターゲットＤＮＡが付与された溶液に対して、所定量の変性剤を付与する変性剤付与工程と、
前記変性剤が付与された溶液の所定の特性を測定する特性取得工程と
を有することを特徴とするＤＮＡ検出方法。
【請求項９】
前記材料は金微粒子であり、前記溶液は金コロイド溶液であることを特徴とする請求項８に記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項１０】
前記変性剤付与工程では、所定量ずつ所定回数、前記変性剤を付与することを特徴とする請求項８または９に記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項１１】
前記特性取得工程の後に、前記ＤＮＡ付与工程にて付与されるプローブＤＮＡとフルマッチするターゲットＤＮＡと前記プローブＤＮＡとを付与して前記所定量の変性剤を付与した溶液について予め測定された特性と、前記特性取得工程にて測定された特性とを比較する工程をさらに有することを特徴とする請求項８乃至１０のいずれかに記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡ付与工程は、
測定用の前記溶液と、リファレンス用の前記溶液とを用意する工程と、
前記測定用の前記溶液に対して、前記プローブＤＮＡおよび前記ターゲットＤＮＡを付与し、前記リファレンス用の前記溶液に対して、前記プローブＤＮＡとフルマッチするターゲットＤＮＡと前記プローブＤＮＡとを付与する工程を有し、
前記変性剤付与工程では、前記測定用の前記溶液および前記リファレンス用の前記溶液のそれぞれに、前記変性剤を等量付与することを特徴とする請求項８乃至１０のいずれかに記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項１３】
前記ＤＮＡ付与工程と前記変性剤付与工程との間に、前記プローブＤＮＡおよびターゲットＤＮＡが付与された溶液の前記所定の特性を測定する工程をさらに有することを特徴とする請求項８乃至１２のいずれかに記載のＤＮＡ検出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００９−４７４８３（Ｐ２００９−４７４８３Ａ）
【公開日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２１２１５１（Ｐ２００７−２１２１５１）
【出願日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【出願人】（５０４１８２２５５）国立大学法人横浜国立大学 (429)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【出願人】（５０４１８２２５５）国立大学法人横浜国立大学 (429)
【Ｆターム（参考）】
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