Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄｐｒｏｔｅｉｎの遺伝子領域、抗癌剤耐性判別キット、抗癌剤感受性回復方法、抗癌剤組成物、ｓｉＲＮＡ、アポトーシス回復組成物
【課題】抗癌剤耐性の判定マーカーの遺伝子領域を提供する。
【解決手段】
抗癌剤耐性判定方法を提供する。Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子の新規機能を同定した。このＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子は、プロモーター領域がメチル化されており、このメチル化によりＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの発現が少なくなると、カスパーゼのカスケードによるアポトーシスが抑制される。このため、本発明は、癌細胞のＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子領域のメチル化を検出し、該メチル化されている場合に抗癌剤耐性があると判定することを特徴とする。
【解決手段】
抗癌剤耐性判定方法を提供する。Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子の新規機能を同定した。このＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子は、プロモーター領域がメチル化されており、このメチル化によりＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの発現が少なくなると、カスパーゼのカスケードによるアポトーシスが抑制される。このため、本発明は、癌細胞のＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子領域のメチル化を検出し、該メチル化されている場合に抗癌剤耐性があると判定することを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの遺伝子領域、抗癌剤耐性判別キット、抗癌剤感受性回復方法、抗癌剤組成物、ｓｉＲＮＡ、アポトーシス回復組成物に係り、抗癌剤治療におけるメチル化を介した薬剤耐性獲得の指標に係るＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの遺伝子領域、抗癌剤耐性判別キット、抗癌剤感受性回復方法、抗癌剤組成物、ｓｉＲＮＡ、アポトーシス回復組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、大腸癌の化学療法は、進行癌の手術後に再発予防を目的とした補助化学療法と、根治目的の手術が不可能な進行癌または再発癌に対する生存期間の延長及びＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ）の向上を目的とした化学療法とが存在する。
このうち、進行・再発大腸癌の化学療法においては、１９８０年代より５ＦＵ（フルオロウラシル、Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、１９９０年代よりオキサリブラチン（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ、Ｌ−ＯＨＰ）、イリノテ力ン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）のような抗癌剤が開発され、臨床応用されている。
【０００３】
このような大腸癌の化学療法に用いる従来の抗癌剤としては、特許文献１を参照すると、癌細胞の増殖を抑制できるのみならず、浸潤や転移をも抑制でき、且つ血管新生の阻害作用をも有する上に、副作用の少ない抗癌剤とジフェニレンヨードニウム化合物のように、新しい抗癌剤も開発されてきている（以下、従来技術１とする。）。
【０００４】
さらに、これらの抗癌剤を併用して使用する療法が開発され、治療成績が向上してきた。
近年、大腸癌の化学療法の標準治療方法として、２種類の薬剤を用いるＦＯＬＦＯＸ（５ＦＵ＋オキサリプラチン）、ＦＯＬＦＩＬＩ（５ＦＵ＋イリノテカン）という併用療法が考案されていた。
この併用療法により、腫瘍の縮小が確認できる割合である「奏効率」が改善され、患者の生存期間も延長した。
【０００５】
しかしながら、大腸癌を始めとする癌の化学療法においては、その治療過程において癌細胞が薬剤耐性（抵抗性）を備えるようになるという問題があった。
進行・再発大腸癌の抗癌剤治療において、薬剤に抵抗性を有する場合、薬剤の変更による二次治療を行っても、その効果は薬剤を変更する前の一次治療に比べて格段に下がるという問題があった。
【０００６】
ここで図１３を参照して、進行・再発した大腸癌の標準抗癌剤治療の効果と予後の観察例について説明する。
奏功率は、治療により腫瘍の縮小が認められた割合を示す。
肝切除率は、各群において肝臓に転移した大腸癌を再手術した割合を示す。
ＰＦＳは無増悪生存期間のことであり、その患者の癌が再び増大するか、患者が癌によって死亡するまでの期間（月）を示す。
ＯＳは、無作為割り付けの時点から理由を問わず死亡するまでの期間（月）を示す。
このように、一次治療でＦＯＬＦＯＸ、ＦＯＬＦＯＬＩのいずれかを使用しても、奏功率は５５％程度であるが、二次治療における奏功率は、４％、１５％と大きく低下する。同様に、ＰＦＳも低下する。
このように、進行・再発した大腸癌においては、ＦＯＬＦＯＸ、ＦＯＬＦＯＬＩのいずれも、１０ヶ月程度で治療効果がなくなってくることが知られていた。
【０００７】
次に、図１４を参照して、抗癌剤の耐性のモデルについて説明する。
元々、癌細胞は、細胞の遺伝物質であるＤＮＡ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）の損傷により、患者本人の体細胞が変異して発生する。癌細胞は、ＤＮＡの損傷により、通常の細胞が備えるべき細胞周期／増殖の制御、細胞死（アポトーシス）、ＤＮＡ修復機構といった細胞の正常性を保つために必要な機構が働かない状態になっていることが多い。このため、癌細胞のなかには、ＤＮＡの損傷が修復されないまま生き残るものが存在し、癌の進行とともに、性質の変化した癌細胞が現れるという特徴がある。このため、癌細胞が抗癌剤に対する耐性を獲得する。
この抗癌剤に対する癌細胞の耐性機能としては、１次耐性と２次耐性があると考えられる。１次耐性は、癌細胞が生来有する耐性機能で、２次耐性は、治療の過程で癌細胞の性質が変化することにより獲得した耐性機能と考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００９−５７３３０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したように、従来の抗癌剤や従来技術１の抗癌剤を用いて併用療法を行っても、二次治療の奏功率は低いという問題点があった。
このため、進行・再発大腸癌の標準抗癌剤治療において、癌が耐性を獲得した場合でも、現状では薬を換えることで対処するしかなかった。
【００１０】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、上述の課題を解消することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明のＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの遺伝子領域は、メチル化を抗癌剤耐性マーカーとして用いる癌細胞のＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの遺伝子領域であることを特徴とする。
本発明のＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの遺伝子領域は、前記癌細胞は、大腸癌の細胞又は胃癌の細胞であることを特徴とする。
本発明の抗癌剤耐性判別キットは、癌細胞のＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの遺伝子領域のメチル化により抗癌剤耐性が判別されることを特徴とする。
本発明の抗癌剤感受性回復方法は、癌細胞のＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの遺伝子領域のメチル化を検出し、メチル化されている場合には脱メチル化することを特徴とする。
本発明の抗癌剤組成物は、癌細胞のＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの遺伝子領域のメチル化を検出し、メチル化されている場合に、脱メチル化剤と抗癌剤とを用いることを特徴とする。
本発明の抗癌剤組成物は、前記癌細胞は、大腸癌の細胞又は胃癌の細胞であることを特徴とする。
本発明のｓｉＲＮＡは、癌細胞のＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの発現量を低下させることを特徴とする。
本発明のｓｉＲＮＡは、配列（９）に記載された配列を用いて合成することを特徴とする。
本発明のアポトーシス回復組成物Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの遺伝子産物を用いたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子の異常メチル化の有無を判定して、メチル化がされていれば、脱メチル化剤と抗癌剤とを併用する組成物を用いることで、より長く抗癌剤の効果を持続することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の実施の形態に係るメチル化が遺伝子の転写阻害を起こすメカニズムを示す概念図である。
【図２】本発明の実施の形態に係るＤＥＸ遺伝子による大腸癌の治療戦略を示す概念図である。
【図３】本発明の実施の形態に係る（Ａ）ＭＳＰで検出したメチレーション、（Ｂ−１）バイサルファイト・シーケンシングによりメチル化していたＣｐＧ、（Ｂ−２）バイサルファイト・シーケンシングの結果を示す図である。
【図４】本発明の実施の形態に係るメチル化とＤＥＸ遺伝子の発現の減少を示すグラフである。
【図５】本発明の実施の形態に係るｓｉＲＮＡ添加によるＤＥＸ遺伝子の発現の現象を示すグラフである。
【図６】本発明の実施の形態に係る（Ａ）ＤＥＸ遺伝子のｓｉＲＮＡとカンプトテシンを加えたヘキスト染色の観察例を示す図、（Ｂ）ＤＥＸ遺伝子のメチル化異常による耐性獲得のモデルを示す図である。
【図７】本発明の実施の形態に係るＤＥＸ遺伝子のｓｉＲＮＡとカンプトテシンを加えると、カンプトテシンに耐性を備えることを示すグラフである。
【図８】本発明の実施の形態に係るＤＥＸ遺伝子のｓｉＲＮＡを投与して４８時間低酸素ストレスを与えた際のカスパーゼの発現を示す写真である。
【図９】本発明の実施の形態に係る脱メチル化剤のモデルを示す概念図である。
【図１０】本発明の実施の形態に係る脱メチル化剤を加えた前後でのＤＥＸ遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図１１】本発明の実施の形態に係る（Ａ）脱メチル化剤とカンプトテシンを加えたヘキスト染色の観察例を示す図、（Ｂ）ＤＥＸ遺伝子が脱メチル化剤により抗癌剤への感受性を回復するモデルを示す図である。
【図１２】本発明の実施の形態に係るＤＥＸ遺伝子と脱メチル化剤を加えると抗癌剤への感受性を回復することを示すグラフである。
【図１３】従来の抗癌剤の併用療法に係る一次治療と二次治療の治療効果を示す図である。
【図１４】従来の抗癌剤の耐性獲得のモデルを示す概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜実施の形態＞
抗癌剤治療の問題点の１つとして薬剤耐性があげられる。切除不能の大腸癌の抗癌剤治療において、薬剤に抵抗性を有する場合の対処方法は薬剤の変更であるが、その奏功率は一次治療に比べ下がる。
本発明の発明者らは、こうした耐性に関わる遺伝子を検索するため鋭意検討と実験を行った。
ここで、本発明の発明者らは、性質の変化した癌細胞では、ＤＮＡのメチル化の異常がしばしば起こることに着目した。メチル化は、ＤＮＡの修飾の一種であり、脊椎動物のゲノムではＣｐＧ（ＣＧ）配列がメチル化により修飾されることがある。このＣｐＧ配列は、遺伝子がｍＲＮＡ（Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）に転写される際の発現制御に大きく関わっている。
【００１５】
本発明の発明者らは、このメチル化が癌を悪性化させる遺伝子の発現制御にも関わっている可能性を考え、癌細胞のゲノム（染色体）全体からメチル化の異常に関する遺伝子を検出した。このメチル化異常を検出するために、本発明の発明者らは、ゲノムＤＮＡなどを制限酵素で断片化し、特定の塩基配列を持つものだけを取得するメチレーション・センシティブＡＦＬＰ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、以下ＭＳ−ＡＦＬＰと呼ぶ。）法を用いた。しかし、これに限られず、メチル化アレイといった手法も用いることができる。
【００１６】
本発明の発明者らは、ヒトの胃癌、大腸癌で高頻度に異常メチル化されているＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ（デキサメサゾン誘導タンパク質）の遺伝子であり、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， Ｖｏｌ．２５， Ｎｏ．１，ｐｐ１１９−２４ （２００１）で報告され、ＮＣＢＩのデータベースに登録された公知のＬＯＣ６４２７５５遺伝子（以下ＤＥＸ遺伝子とよぶ。）に注目した。
【００１７】
ＬＯＣ６４２７５５のｍＲＮＡ及びＰｒｏｔｅｉｎの番号は下記の通りである：
Ｇｅｎｅ Ｎａｍｅ： ＬＯＣ６４２７５５
Ｇｅｎｅ ＩＤ ： ６４２７５５
Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｌｏｃａｔｉｏｎ： １５ｑ１１．２
Ｉｓｏｆｏｒｍ （ｍＲＮＡ） Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃： ＸＭ＿９２６３８２
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃： ＸＰ＿９３１４７５
【００１８】
ゲノム上のこのＤＥＸ遺伝子は、オープン・リーディング・フレームを基に、ローカル・アラインメントにより推定上のタンパク質の配列として特定され、まだ未確定の状態であるものの、上述の文献と以下のＩＤ（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によりゲノム配列を特定可能である：
ＧｅｎｅＩＤ：６４２７５５（ＬＯＣ６４２７５５）
なお、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅにおいて、２００９年６月２６日のｕｐｄａｔｅにて遺伝子番号の変更が行われ、ＧｅｎｅＩＤ：１００１３３１６５に変更された。しかしながら、本発明の実施の形態においては、上述のＬＯＣ６４２７５５を用いて説明する。
（ＬＯＣ１００１３３１６５ ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＬＯＣ１００１３３１６５）
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｇｅｎｅ＆ｃｍｄ＝Ｒｅｔｒｉｅｖｅ＆ｄｏｐｔ＝ｆｕｌｌ＿ｒｅｐｏｒｔ＆ｌｉｓｔ＿ｕｉｄｓ＝６４２７５５）
【００１９】
このＤＥＸ遺伝子は、ヒト１５番染色体ｑ１１．２領域のインプリント遺伝子の近傍に存在し、肺胞上皮細胞株でストレス下でステロイドを投与すると発現量が増えることが分かっている。また、ＤＥＸ遺伝子が翻訳されたタンパク質は、膜貫通型ドメインとしてロイシン・ジッパー（Ｌｅｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒ）モチーフを備えると推測されていた。
しかしながら、このＤＥＸ遺伝子の具体的な機能は知られていなかった。
そこで、本発明の発明者らは、ＤＥＸ遺伝子が、どのようにメチル化されて大腸癌に関わるのかの機構を解明し、本発明の実施の形態に係る抗癌剤治療における異常メチル化を介した薬剤耐性獲得の指標の判別方法、及び治療戦略方法の発明に至った。
【００２０】
まず、図１を参照して、ゲノムＤＮＡのメチル化と、発現の制御の関係について説明する。
ヒトを始めとする脊椎動物の核内のゲノムのＤＮＡには、ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される遺伝子領域と、この遺伝子の発現を制御するプロモーター領域が存在する。このプロモーター領域には、転写因子（転写制御因子）と呼ばれるＤＮＡ結合タンパク質が結合し、この刺激によりｍＲＮＡへの転写が行われる。
ここで、プロモーター領域のＤＮＡの転写制御に関わる部位のＣｐＧ配列がメチル化されると、転写因子が結合しにくくなり、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写が阻害されることが考えられる。この場合、このＤＮＡ配列の後流の遺伝子が発現しにくくなる。
本発明の発明者らは、ＤＥＸ遺伝子においても、胃癌、大腸癌で高頻度にプロモーター領域の異常メチル化が起こり、この異常メチル化によりＤＥＸ遺伝子のｍＲＮＡの発現が抑制されている事を明らかにした。この異常メチル化の検出は、配列番号（１）〜（４）のプライマーを用いたバイサルファイト・シーケンシング（Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）法により行うことが可能である。
バイサルファイト・シーケンシング法は、バイサルファイト処理を行なったゲノムＤＮＡにおいては、メチル化シトシンは変換されず、非メチル化シトシンのみがウラシルに変換されるという反応を利用したＤＮＡシーケンシングを用いた公知の検出方法である。バイサルファイト処理の前後では、シトシンとチミン（ウラシル）の差異が配列データとして得られるため、これによりプロモーター領域でメチル化されているＣｐＧ配列を特定することができる。
なお、このバイサルファイト・シーケンシング法以外にも、メチル化センシティブな制限酵素を用いる等の方法にて、プロモーター領域の異常メチル化を検知可能である。
【００２１】
本発明の発明者らは、さらにｓｉＲＮＡを用いて遺伝子発現を抑制し機能解析を行ったところ、ＤＥＸ遺伝子は、カンプトテシン（抗癌剤）の細胞死の耐性誘導に関わる事を明らかにした。
そこで耐性の誘導された大腸癌細胞株に対し、脱メチル化剤を投与しＤＥＸ遺伝子のプロモーター領域の異常メチル化を改善させ、遺伝子発現を回復させた。その後、再度、細胞株にカンプ卜テシンを投与したところ、細胞死の誘導が回復した。
このように、本発明の実施の形態に係る癌細胞判定方法は、ＤＥＸ遺伝子のプロモーター領域に異常メチル化があるかを判定する。そして、異常メチル化により耐性を獲得したと考えられる癌細胞に対して、脱メチル化剤により抗癌剤に対する感受性を回復させる治療戦略を用いることができる。
なお、本発明のＤＥＸ遺伝子領域とは、このＤＥＸ遺伝子の上流のプロモーター領域に限られず、ヒト又は動物の染色体のＤＮＡにおいてＤＥＸ遺伝子の発現制御に関わる領域を全て含んでおり、ＤＥＸ遺伝子のエキソン、イントロン、上流領域、下流領域等の数十〜数千ｋｂａｓｅ単位の近傍の領域を含む。また、ＤＥＸ遺伝子の偽遺伝子や、発現調整を行っている、離れた領域のＤＮＡ配列等も含むものである。
また、ＤＥＸ遺伝子は、いくつかのオルタナティブフォームが存在することが考えられる。それによりＤＥＸ遺伝子のプロモーター領域は異なるものの、これらのプロモーター領域もすべて含むものである。
【００２２】
図２を参照して、ＤＥＸ遺伝子を指標として、進行・再発大腸癌における抗癌剤抵抗性腫蕩に対する治療戦略について説明する。
ＤＥＸ遺伝子のプロモーター領域の異常メチル化の有無を評価することにより耐性誘導の経路を特定できれば、一次治療を継続しながら脱メチル化剤を併用する事により腫瘍の抗癌剤耐性を克服することが可能になると考えられる。
また、ＤＥＸ遺伝子がメチル化をしていない形質をもつ大腸癌の場合には、一次治療で耐性が生じた場合には、ただちに別の抗癌剤を投与したり、別の治療法に切り換えて、患者のＱＯＬを向上させることができる。
このように、ＤＥＸ遺伝子のプロモーター領域のメチル化を判定するメチル化判定方法により、大腸癌の化学治療に対する方針を得ることができるという効果が得られる。
また、本発明の発明者らは、ＤＥＸ遺伝子は、カスパーゼのカスケードの上流に関わっていることを明らかにしている。よって、ＤＥＸ遺伝子を欠失した大腸癌においても、このＤＥＸ遺伝子やＤＥＸタンパク質を導入することで、正常な細胞死を誘導することができると考えられる。
【００２３】
以上のように、本発明の実施の形態に係るＤＥＸ遺伝子を用いて、抗癌剤耐性マーカーを実現することができる。すなわち、本発明の実施の形態において、ＤＥＸ遺伝子のプロモーター領域を、大腸癌においてＤＮＡメチル化異常を介した薬剤耐性の獲得に関わる新規の抗癌剤耐性マーカーとして用いることができる。
また、本発明の実施の形態に係る抗癌剤耐性マーカーを用いたメチル化判定方法により、抗癌剤抵抗性腫蕩に対する治療戦略を得ることができる。
これにより、有効な薬剤が少ない、進行、再発した大腸癌や胃癌等において、耐性の克服を目指した治療戦略を確立することができる。
【００２４】
また、ＤＥＸ遺伝子は、大腸癌においてＤＮＡメチル化異常を介した薬剤耐性の獲得に関わっており、脱メチル化剤使用時期の判定を行うことができる。
すなわち、ＤＥＸ遺伝子のメチル化異常の有無を判定し、メチル化異常がある場合、脱メチル化剤と化学療法剤との組み合わせた療法を行うことができる。
これにより、ＦＯＬＦＯＸ（５ＦＵ＋オキサリプラチン）あるいはＦＯＬＦＩＬＩ（５ＦＵ＋イリノテカン）使用にあたり、２次治療の奏功率が低下する問題を解消する方法を提供することができる。
【００２５】
本発明の組成物は、他の組成物等と併用することも可能である。また、他の組成物と同時に本発明の組成物を投与してもよく、また間隔を空けて投与してもよいが、その投与順序は特に問わない。
【００２６】
また、本発明の実施の形態において、疾患が改善または軽減される期間は特に限定されないが、一時的な改善または軽減であってもよいし、一定期間の改善または軽減であってもよい。
【実施例】
【００２７】
〔本発明の実施の形態に係る治療用組成物の実施例〕
以下で、本発明の実施の形態に係る治療用組成物について、具体的な実験を基にして、実施例としてさらに具体的に説明する。
【００２８】
〔実験の方法と手順〕
（細胞系統（セル・ライン）と細胞培養）
ヒトの皮膚繊維芽細胞細胞の細胞株として、ＮＨＤＦ（ＡＤ、クラボウ、倉敷紡績株式会社製、大阪、日本）を使用した。
ヒトの大腸癌細胞株（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）として、ＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ、マナッサス、バージニア州、米国）から得た。
さらに、ヒトの結腸・大腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞株として、ＣＯＬＯ３２０ＤＭ（ＪＣＲＢ、大阪、日本）を使用した。
ＮＨＤＦは、低血清増殖添加剤（ＬＳＧＳ）を加えた培養液１０６Ｓ（倉敷紡績株式会社製）で培養された。
ＨＣＴ１１６とＣＯＬＯ３２０ＤＭは、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）であるＣｅｌｌｅｃｔ Ｇｏｌｄ（ＭＰバイオメディカル社製、オーロラ、オハイオ州、アメリカ）、１０，０００ユニット／ｍｌのペニシリンＧ、安定化した抗生剤・抗真菌剤である１０ｍｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシン、及び２５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ（ＳＩＧＭＡ社製、ミズーリ州、アメリカ）を加えたＤｕｌｂｅｃｃｏ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）により培養された。
【００２９】
（核酸抽出）
ＤＮＡ抽出には、ＤＮｅａｓｙＲ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ、東京、日本）を用いた。抽出は、メーカーの説明書に従って行った。
ＲＮＡはＴＲＩｚｏｌＲ Ｐｌｕｓ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州、アメリカ）を用いた。抽出は、メーカーの説明書に従って行った。
【００３０】
（ＭＳ−ＡＦＬＰ）
ＭＳ−ＡＦＬＰは、網羅的にゲノム全域のメチル化の異常を検知するための非常に有効な方法である。
ＭＳ−ＡＦＬＰは、ＭＳ−ＡＦＬＰは、ｓｕｚｕｋｉらによって既に報告されている方法（Ｋｏｉｃｈｉ Ｓｕｚｕｋｉ， Ｇｌｏｂａｌ ＤＮＡ ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃａｎｃｅｒ ｉｓ ａｇｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｅｃｅｄｅｓ ｇｅｎｏｍｉｃ ｄａｍａｇｅ， ＣＡＮＣＥＲ ＣＥＬＬ ９， １９９−２０７， ＭＡＲＣＨ ２００６）に従って行った。
ＰＣＲ産物はゲルから溶出され、ＭＳ−ＡＦＬＰに対して使用されたのと同じプライマーにより増幅された。
再増幅されたＤＮＡは、ＱＩＡクイックＰＣＲ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社製、ヒルデン、ドイツ）により抽出され、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭダイ・ターミネーター・サイクル・シーケンシング・キット（パーキン・エルマー）により配列が決定された。
ＭＳ−ＡＦＬＰで得られた断片の塩基配列は、配列検索ツールであるＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）で検索を行い、それを基に配列を決定した。
【００３１】
（バイサルファイト処理）
ゲノムＤＮＡにバイサルファイト（亜硫酸水素ナトリウム）による処理を行うと、メチル化されていないシトシンはウラシルに変化し、一方でメチル化されたシトシンに対しては何も修飾しないという処理である。
バイサルファイト処理はＥｐｉＴｅｃｔ（登録商標）バイサルファイト・キット（ＱＩＡＧＥＮ社製、ヒルデン、ドイツ）を用いて、メーカーの説明書に従って行った。
【００３２】
（メチレーション特異的ＰＣＲ、ＭＳＰ）
メチル化の有無を識別するために、メチル化特異的ＰＣＲ法（ＭＳＰ、Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ）を行った。
ＰＣＲ増幅は、１×ＰＣＲバッファー、０．２５ｍＭ ｄＮＴＰミックス、０．０２５Ｕ／μｌ ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＱＩＡＧＥＮ社製、ヒルデン、ドイツ）、及び０．５μＭのそれぞれのプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒとＲｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）によりトータル２０μｌの反応液組成で行った。
＊
【００３３】
メチル化ＤＮＡ特異的なプライマーの配列は以下のとおりである：
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＡＴＴＣＧＧＡＧＧＡＣＧＡＣＧＴＣＧＣＧＧＴＣ−３’ …… 配列（１）
Ｒｅｖｅｒｅｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＧＣＡＡＡＡＡＣＣＴＣＧＣＡＡＡＡＣＣＧＡＣＧＡＡＡ−３’ …… 配列（２）
非メチル化ＤＮＡ特異的なプライマーの配列は以下のとおりである：
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＴＧＴＧＡＴＴＴＧＧＡＧＧＡＴＧＡＴＧＴＴＧＴＧＧＴＴ−３’ …… 配列（３）
Ｒｅｖｅｒｅｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＣＴＣＡＣＡＡＡＡＡＣＣＴＣＡＣＡＡＡＡＣＣＡＡＣＡＡＡＡ−３’ …… 配列（４）
【００３４】
ＰＣＲ反応は、初期熱変性を９５℃で５分間行った後、熱変性を９５℃で４５秒、アニーリングを５６℃で４５秒、伸長反応を７２℃で１分を１サイクルとして３８サイクル行い、最終伸長反応を７２℃で１０分間行った。ＰＣＲ産物は１０℃で保存した。
ＰＣＲ産物は１．５％のアガロースゲル電気泳動法で確認された。
【００３５】
（バイサルファイト・シーケンシング法）
バイサルファイト処理されたＤＮＡを、バイサルファイト処理により影響されない位置に設計されたプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ反応は、１×ＰＣＲバッファー、０．２５ｍＭ ｄＮＴＰミックス、０．０２５Ｕ／μｌのＨｏｔＳｔａｒＴａｑ Ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（ＱＩＡＧＥＮ社製、ヒルデン、ドイツ）、及び０．５μＭのそれぞれのプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒとＲｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）によりトータル２０μｌの反応液組成で行った。
このバイサルファイト・シーケンシング用のプライマーの配列は以下のとおりである：
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＧＡＡＧＡＧＧＧＧＡＧＧＴＧＡＴＴＴＴＧ−３’ …… 配列（５）
Ｒｅｖｅｒｅｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＣＣＴＡＣＡＡＡＣＣＣＡＡＣＡＣＣＣＡＴ−３’ …… 配列（６）
【００３６】
ＰＣＲは、初期熱変性を９５℃で５分間行った後、熱変性を９５℃で４５秒、アニーリングを５６℃で４５秒、伸長反応を７２℃で１分を１サイクルとして３８サイクル行い、最終伸長反応を７２℃で１０分間行った。ＰＣＲ産物は１０℃で保存した。
ＰＣＲ産物は、ＥＸＯＳＡＰ ＩＴ（ＵＳＢ株式会社製、クリーヴランド、オハイオ、米国）で精製後、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、メディソン、ウィスコンシン州、米国）によるＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇを行ってシーケンシングに用いた。
シーケンシングには、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１００、ジェネティック・アナライザー（アプライド・バイオシステムズ社製、フォスター・シティ、カリフォルニア、米国）を用いた。
【００３７】
（リアルタイム定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑＲＴ−ＰＣＲ）
Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑＲＴ−ＰＣＲを用いてＲＮＡの定量を行った。この定量は、ロッシュＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）（ロッシュ社製、マンハイム、ドイツ）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）ワンステップ定量ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カールスバード、カリフォルニア、米国）を用いて行った。
Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑＲＴ−ＰＣＲに用いるプライマーとしては、Ｄ−ＬＵＸ デザイナー・ソフトウェア（ｈｔｔｐｓ：／／ｏｒｆ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｌｕｘ／ｌｕｘＤｅｓｉｇｎ．ｊｓｐ）により設計されたＬＵＸ Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カールスバード、カリフォルニア、米国）を用いた。当該プライマー配列は以下のとおりである：
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＴＴＣＴＡＣＧＴＧＧＧＣＣＴＧＴＴＣＴＴ−３’ …… 配列（７）
Ｒｅｖｅｒｅｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＴＣＣＡＡＧＴＡＣＣＣＡＴＣＡＡＡＧＡＣＧ−３’ …… 配列（８）
ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌとして、ハウスキーピング遺伝子（ｈＧＡＰＤＨ）を使用した。
【００３８】
（ＲＮＡｉ、トランスフェクション）
Ｃｕｓｔｏｍ Ｓｔｅａｌｔｈ ＲＮＡｉ （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバード、カリフォルニア、米国）は、ＢＬＯＣＫ−ｉＴ ＲＮＡｉデザイナー・ソフトウェア（ｈｔｔｐｓ：／／ｒｎａｉｄｅｓｉｇｎｅｒ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｒｎａｉｅｘｐｒｅｓｓ／）により設計された。
ｓｉＲＮＡ（ＸＭ＿９２６３８２＿ｓｔｅａｌｔｈ＿５３９）の配列は以下のとおりである：
５'−ＣＣＵＣＵＡＵＧＵＵＣＵＡＣＧＵＧＧＧＣＣＵＧＵＵ−３' …… 配列（９）
ｓｉＲＮＡは、ＰｒｉｍａＰｏｒｔ ｓｉＲＮＡトランスフェクションＲｅａｇｅｎｔ（登録商標）（ＣＲＥＤＩＡ−ＪＡＰＡＮ社製、京都、日本）を用いて、ＮＨＤＦ細胞株に遺伝子導入（トランスフェクション）された。
【００３９】
トランスフェクションの１日前に、３５ｍｍディッシュ上に抗生物質を含まない培地１５００μｌに対して５×１０4の細胞を播き、３７℃、５％のＣＯ2インキュベーター内で２４時間培養した。トランスフェクション時に、約３０〜５０％のコンフルーエンスとした。
また、ＰｒｉｍａＰｏｒｔを６．０μｌ、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カールスバード、カリフォルニア、米国）７５．０μｌに混和し、ｓｉＲＮＡ２００ｐｍｏｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ７５．０μｌに混和後、これらの２つの溶液をゆっくりと混ぜ、室温で３０分インキュベートした。この混合液に培地を加え１，５００μｌとし、３７℃、５％のＣＯ2を含む環境のインキュベーター内で４８時間培養した。
【００４０】
（アポトーシス）
カンプトテシン（シグマ社製、カタログ Ｎｏ．Ｃ−９９１１）によるアポトーシスの誘導を行った。
カンプトテシンの添加は、ＳｉＲＮＡ導入４８時間後に、ＮＨＤＦに対して２０μＭ、ＨＣＴ１１６に対して１０μＭになるよう行った。添加後、３７℃、５％のＣＯ2を含む環境のインキュベーター内で２４時間培養し、アポトーシスの評価を行った。
【００４１】
（ヘキスト染色）
アポトーシスを起こした細胞は、核凝縮及びＤＮＡがフラグメント化するため、これを検出するため、ヘキスト３３３４２（ＳＩＧＭＡ社製、東京、日本）で染色し、ＵＶフィルタ（３３０−３８０ｎｍ）およびバンド・パス・フィルタ（４２０ｎｍ）を用いて蛍光顕微鏡（ニコン社製、ＢｉｏＳｔａｉｔｉｏｎ ＩＭ ＣＥＬＬ−ＳＩＰ）にて観測した。染色は、ヘキストを３μｇ／ｍｌとなるように添加し、室温で５分インキュベートした。
【００４２】
（フローサイトメトリー、ＦＡＣＳ流動細胞計測法分析）
細胞のアポトーシス誘導および細胞周期の検知については、培養細胞をかきだして集め、５分間２，０００ｒｐｍで遠心分離して取得した。
細胞はクエン酸で固定する前にＰＢＳで洗浄した。細胞を固定した後、核をｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）にて染色し、フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、ＦＡＣＳ）計測法でアポトーシスの比率および細胞周期を分析した。
【００４３】
（免疫組織化学分析）
Ｋｉ−６７の免疫組織化学分析は、ウサギモノクローナル抗体Ｋｉ６７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｎａｔｏｍｉｃａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、カリフォルニア、米国）を用いて行った。
【００４４】
（細胞老化）
細胞老化については、老化細胞染色キット（ＳＩＧＭＡ、ミズーリ、米国）を用いて行った。
【００４５】
（統計分析）
値は、少なくとも３つの別個の実験から、平均と±ＳＤを求めた。群の間の違いはスチューデントのｔ検定により評価された。
Ｐ＜０．０５の場合、違いが重要（有意）であると考えられた。
【００４６】
〔実験結果の考察〕
（癌細胞株におけるＤＥＸ遺伝子プロモーター領域のメチル化状態）
まず、図３を参照して、癌細胞株におけるＤＥＸ遺伝子である、ＤＥＸ遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態について説明する。
図３のＡ．において、上述の実験法により、メチル化を評価したところ、胃癌セルライン（Ｈ１１１、ＧＳＳ、ＨＧＣ２７、ＡＺ５２１）、大腸癌細胞株（ＣＷ２、ＣＡＣＯ２、ＨＣＴ１１６、ＣＯＬＯ３２０ＤＭ）のＤＥＸ遺伝子（ＬＯＣ６４２７５５）はメチル化（Ｍ）されていた。しかし、正常組織の繊維芽細胞のセルライン（ＮＨＤＦ）では、メチル化されていなかった（Ｕ）。また、ＣＯＬＯ３２０ＤＭは、メチル化されたプライマーと、メチル化されていないプライマー両方でＰＣＲ産物を得た。
図３のＢ１．は、ＤＥＸ遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧサイトの位置関係を示している。
図３のＢ２．は、バイサルファイト・シーケンシングを行い、各ＣｐＧサイトのメチレーションを検出した結果である。各クローンについて、ＣｐＧがメチル化された状態（メチル化）を暗い丸にて、メチル化していない状態（非メチル化）を明るい丸にて示した。この結果、ほとんどすべての癌細胞株のＣｐＧがメチル化されていた。逆に、正常組織由来のＮＨＤＦ細胞株ではＣｐＧはメチル化されなかった。そして、大腸癌細胞株であるＣＯＬＯ３２０ＤＭについては、この部位の３０％のＣｐＧがメチル化され、これはＰＣＲと同様の結果であった。
【００４７】
図４は、コントロールとしてＧＡＰＤＨを使用して、リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果を要約したグラフである。ＨＣＴ１１６とＣＯＬＯ３２０ＤＭのＤＥＸ遺伝子は、ＮＨＤＦよりＲＮＡの発現が抑制されている。すなわち、プロモーター領域のメチル化により、ＤＥＸ遺伝子のＲＮＡの発現が抑制されることを示している。
このように、胃癌、大腸癌の細胞において、ＬＯＣ６４２７５５のプロモーター領域が異常メチル化されることにより、ＤＥＸ遺伝子の発現が抑制される。
【００４８】
（ＤＥＸ遺伝子のｓｉＲＮＡの添加による抗癌剤由来のアポトーシスの減少）
次に、上述の方法で作成したｓｉＲＮＡを用いてＤＥＸ遺伝子の発現を減少させた。
図５を参照すると、正常細胞であるＮＨＤＦ細胞株に、ｓｉＲＮＡを遺伝子導入し、ＤＥＸ遺伝子のノックダウンを行って、ｑＲＴ−ＰＣＲにてＤＥＸ遺伝子の発現量を測定した結果である。上述のように、ＮＨＤＦのＤＥＸ遺伝子プロモーター領域は、メチル化されていない状態であり、ＤＥＸ遺伝子を発現している。これに対して、ｓｉＲＮＡを導入すると、ＤＥＸ遺伝子のＲＮＡの発現は４０％程度、抑制された。
【００４９】
図６を参照して、ＮＨＤＦ細胞株にＤＥＸ遺伝子のｓｉＲＮＡを導入した例について説明する。図６のＡ．によると、コントロールであるＮＨＤＦ細胞株にカンプトテシン（ＣＰＴ）のみを与えて、ヘキスト染色した細胞を目視により確認したところ、細胞はアポトーシスを起こして抗癌剤由来の細胞死を来した。これに対して、ＮＨＤＦ細胞株にカンプトテシンとｓｉＲＮＡを加えたところ、細胞死の割合は減少した。このように、ＤＥＸ遺伝子用のｓｉＲＮＡは、カンプトテシンに耐性を持たせることがわかる。すなわち、線維芽細胞のＤＥＸ遺伝子の発現を抑制すると抗癌剤による細胞死の誘導が抑えられ、耐性が誘導された。
図７を参照して、図６の結果のグラフについて説明する。まず、コントロールのＮＨＤＦ細胞株にｓｉＲＮＡのみを導入し、毒性のないことを確認した。すなわち、アポトーシスによる細胞死の割合は０．５％から２．７％に増えただけで有意ではなかった。カンプトテシンを加えると、４０．５％（５３／１３１例）の細胞がアポトーシスを起こした。しかしながら、ｓｉＲＮＡの遺伝子導入により、抗癌剤によるアポトーシスを起こした細胞は７．３％（１０／１３７例）に減少した。
ここで、図６のＢ．のモデルを参照すると、元々、カンプトテシンのような抗癌剤は、通常の細胞よりも増殖の盛んな癌細胞にアポトーシスを誘導する働きがある。このため、ＤＥＸ遺伝子を発現している形質をもつ癌細胞においても、アポトーシスを起こさせることができる。
逆に、ＤＥＸ遺伝子の発現量が少ない形質に変化した癌細胞は、抗癌剤に耐性となりアポトーシスが起こらなくなると考えられる。
【００５０】
図８を参照して、ＤＥＸ遺伝子用のｓｉＲＮＡが細胞死を抑制する例について説明する。図８は、低酸素状態のストレスを４８時間与えた後で、コントロール群とｓｉＲＮＡ導入群でアポトーシスのネットワークに関わるシステインプロテアーゼであるカスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）の発現量を比較したものである。
写真は、カスパーゼを免疫組織化学分析により蛍光染色したもので、コントロール群に比べて、ｓｉＲＮＡ導入群は、明らかにカスパーゼの発現が少なくなっている。また、ｓｉＲＮＡを導入しないコントロール群に比べて、ｓｉＲＮＡ導入群はコントロール群に比べ有意に細胞死が少なかった。
このように、ＤＥＸ遺伝子は、アポトーシスを誘導するカスパーゼのカスケードに関わっており、遺伝子ネットワークにおいては、カスパーゼの手前に関わると考えられる。
【００５１】
（ＤＥＸ遺伝子プロモーター領域の脱メチル化によるカンプトテシン感受性の回復）
まず、図９を参照して、脱メチル化剤について説明する。本発明の発明者らは、上述のように、ＤＥＸ遺伝子の発現を回復させると、抗癌剤への感受性は回復するかについて検証するため、脱メチル化剤を用いることを考えた。
脱メチル化剤としては、５−ａｚａ ｃｙｔｉｄｉｎｅを用いることにした。この５−ａｚａ ｃｙｔｉｄｉｎｅ（薬剤名Ｖｉｄａｚａ、Ｐｈａｒｍｉｏｎ社製）は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の抗癌剤として開発中のものである。
５−ａｚａ ｃｙｔｉｄｉｎｅは、メチル化されたＣｐＧを脱メチル化する。
【００５２】
図１０は、脱メチル化剤である５−ａｚａ ｃｙｔｉｄｉｎｅを１μＭ、２日添加してメチル化を除いて、ｑＲＴ−ＰＣＲを行ってＤＥＸ遺伝子の発現量の変化をみたグラフである。
この実験により、ＨＣＴ１１６とＣＯＬＯ３２０ＤＭは、共に、ＤＥＸ遺伝子のＲＮＡの発現量が有意に回復することが分かる。
すなわち、大腸癌細胞株を５−ａｚａ ｃｙｔｉｄｉｎｅで処理することで、ＤＥＸ遺伝子の発現量が回復する。
【００５３】
図１１を参照して、ＨＣＴ細胞株に、５−ａｚａ ｃｙｔｉｄｉｎｅを１μＭ、２日添加して異常メチル化を回復した細胞に、カンプトテシンを投与した例について説明する。
図１１のＡ．によると、コントロールである５−ａｚａ ｃｙｔｉｄｉｎｅで処理していないＨＣＴ細胞株にカンプトテシン（ＣＰＴ）を与えて、ヘキスト染色した細胞を目視により確認したところ、細胞はあまりアポトーシスを起こしていなかった。これに対して、５−ａｚａ ｃｙｔｉｄｉｎｅを添加して脱メチル化したＨＣＴ細胞株にカンプトテシンを加えたところ、多くの細胞がアポトーシスを起こしていた。
図１２は、図１１の結果をグラフ化したものである。コントロールの５−ａｚａ ｃｙｔｉｄｉｎｅのみを投与した際のアポトーシスによる細胞死は１．０％から７．３％へ増えただけであった。また、ＤＥＸ遺伝子のプロモーター領域がメチル化しているＨＣＴ細胞株にカンプトテシンを投与しても、目視により確認したところ、２０．６％（３３／１６０例）しかアポトーシスを起こしていなかった。これに対して、脱メチル化したＨＣＴ細胞株にカンプトテシンを投与した場合は、６０．４％ （５５／９１例）と有意にアポトーシスを起こしていた。
このように、脱メチル化剤の投与により抗癌剤の感受性が回復したことが分かる。すなわち、脱メチル化剤によりＤＥＸ遺伝子の発現を誘導すると、抗癌剤の感受性が回復する。
図１１のＢ．のモデルを参照すると、たまたまカンプトテシンに耐性がない形質の細胞のみが細胞死する。これに対して、脱メチル化を行うことで、これまで耐性があった癌細胞にカンプトテシンへの感受性を回復させ、この感受性を回復させた細胞を細胞死させることができる。
【００５４】
なお、上述の他の実験により、ＤＥＸ遺伝子は、細胞老化、細胞増殖、細胞周期には、ほぼ影響しないという知見を得ている。
【００５５】
以上のように、イリノテカンや５ＦＵなどの化学療法では、抗癌剤の耐性により奏功率が低下する。本発明の発明者らは、この原因を探るため、大腸癌及び胃ガン患者のメチル化異常のある遺伝子を解析したところ、双方の患者とも約半数にＤＥＸ遺伝子でメチル化異常を検出した。
そこで、当該遺伝子のメチル化異常のないヒト皮膚線維芽細胞株ＮＨＤＦ及びメチル化異常のある大腸癌由来細胞株にてＤＥＸ遺伝子のメチル化異常の有無によるアポトーシスへの影響を調べた。そして、ＤＥＸ遺伝子のメチル化異常でＤＥＸ遺伝子の発現量が減ると、アポトーシスが抑制されることを示した。
また、正常細胞株でｓｉＲＮＡにて当該遺伝子の発現を抑制したところ、カンプトテシンによるアポトーシスが見られなかった。一方、当該大腸癌由来細胞株は、カンプトテシンによるアポトーシス誘導がなく、抗癌剤耐性を示した。
このように、本発明の発明者らは、ＤＥＸ遺伝子のプロモーター領域のメチル化により、癌細胞が抗癌剤に対する耐性を獲得することを明らかにした。
さらに、大腸癌由来細胞株に脱メチル化剤を用いて処理したところ、ＤＥＸ遺伝子の発現が回復し、カンプトテシンによる細胞死を誘導することができた。
しかしながら、この実施例は一例にすぎず、これに限定されるものではない。
【００５６】
以上のように構成することで、以下のような効果を得ることができる。
まず、従来技術１のような新しい抗癌剤や従来の抗癌剤を併用した標準療法において、癌細胞が抗癌剤への耐性を獲得すると、薬剤を変更するしかなかった。しかしながら、変更可能である有効な薬剤は少なく、二次治療の治療成績は悪かった。
これに対して、本発明の実施の形態に係る抗癌剤耐性判定方法は、ＤＥＸ遺伝子のプロモータ領域のメチル化異常を指標にして、カンプトテシンやイリノテカンなどの抗癌剤に対する耐性の有無を判定することが可能になる。
【００５７】
また、５−ａｚａ ｃｙｔｉｄｉｎｅは、ゲノムＤＮＡのメチル化を解除する働きがあり、脱メチル化することにより、細胞分化や成長を調節する役割の腫瘍抑制遺伝子が正常機能を回復し、５−ａｚａ ｃｙｔｉｄｉｎｅ自体の細胞毒性により正常な成長抑制機能に反応しなくなった分裂の早い細胞を死滅させるという作用効果が期待されている。
これに対して、ＤＥＸ遺伝子のプロモーター領域がメチル化されている癌に対して、５−ａｚａ ｃｙｔｉｄｉｎｅのような脱メチル化剤を用いると、抗癌剤への感受性を回復させるという効果が得られる。このため、単純に抗癌剤を使用したり、５−ａｚａ ｃｙｔｉｄｉｎｅを使用するだけ、又は両剤を単純に併用するのに比べて、より長く効果的に同じ抗癌剤を使用した化学療法を続けられるという効果が得られる。また、５−ａｚａ ｃｙｔｉｄｉｎｅの効果が認められている癌以外の胃癌や大腸癌にも用いることができるという効果が得られる。
これにより、手術による回復の見込みのない大腸癌患者の生存期間を延ばすことが推測でき、患者の回復率やＱＯＬを向上させることができる。
すなわち、抗癌剤に対する耐性誘導の経路を特定し、一次治療を継続しながら脱メチル化剤を併用して腫瘍の抗癌剤耐性を押さえることができる。
【００５８】
また、従来、化学治療に係わる費用は高額であり、患者の家計を圧迫しているという問題があった（日経メディカル：２００７．１０．３１；第４５回日本癌治療学会会「高度化する癌化学療法が家計を圧迫、経済的理由で治療変更せざるを得ない患者も」（東北大学医療管理 濃沼信夫教授）、参照）。
これに対して、本発明においては、同じ抗癌剤を、これまでより多量に使用できるため、該抗癌剤の大量生産によるコストの削減が期待できる。
【００５９】
また、本発明の実施の形態に係る抗癌剤耐性判定方法においては、ＤＥＸ遺伝子を介したカスパーゼのカスケードについての知見が得られたため、分子標的薬を作成するために用いることもできる。
さらに、ＤＥＸ遺伝子そのものを導入することで、アポトーシスを誘導できると考えられるため、抗癌剤の開発用のターゲットとしてＤＥＸ遺伝子とＤＥＸの遺伝子産物を用いることも可能である。
【００６０】
また、本発明の実施の形態に係る配列（９）のｓｉＲＮＡは、カスパーゼのカスケードに係るアポトーシスを抑制するため、脳梗塞や潜水病のような低酸素状態に用いることで、神経細胞等への損傷を抑えることができると考えられる。
同様に、ＤＥＸ遺伝子に係るｓｉＲＮＡやＰＮＡ等を用いて、細胞死に係る疾病に適用可能である。
【００６１】
なお、上記実施の形態の構成及び動作は例であって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更して実行することができることは言うまでもない。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明は、ＤＥＸ遺伝子のプロモーター領域のメチル化異常を指標にすることで、抗癌剤に対する耐性の有無を判定することができ、薬剤の選択等に関わるオーダーメイド医療の指標の１つとして用いることができ、産業上利用可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの遺伝子領域、抗癌剤耐性判別キット、抗癌剤感受性回復方法、抗癌剤組成物、ｓｉＲＮＡ、アポトーシス回復組成物に係り、抗癌剤治療におけるメチル化を介した薬剤耐性獲得の指標に係るＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの遺伝子領域、抗癌剤耐性判別キット、抗癌剤感受性回復方法、抗癌剤組成物、ｓｉＲＮＡ、アポトーシス回復組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、大腸癌の化学療法は、進行癌の手術後に再発予防を目的とした補助化学療法と、根治目的の手術が不可能な進行癌または再発癌に対する生存期間の延長及びＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ）の向上を目的とした化学療法とが存在する。
このうち、進行・再発大腸癌の化学療法においては、１９８０年代より５ＦＵ（フルオロウラシル、Ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、１９９０年代よりオキサリブラチン（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ、Ｌ−ＯＨＰ）、イリノテ力ン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）のような抗癌剤が開発され、臨床応用されている。
【０００３】
このような大腸癌の化学療法に用いる従来の抗癌剤としては、特許文献１を参照すると、癌細胞の増殖を抑制できるのみならず、浸潤や転移をも抑制でき、且つ血管新生の阻害作用をも有する上に、副作用の少ない抗癌剤とジフェニレンヨードニウム化合物のように、新しい抗癌剤も開発されてきている（以下、従来技術１とする。）。
【０００４】
さらに、これらの抗癌剤を併用して使用する療法が開発され、治療成績が向上してきた。
近年、大腸癌の化学療法の標準治療方法として、２種類の薬剤を用いるＦＯＬＦＯＸ（５ＦＵ＋オキサリプラチン）、ＦＯＬＦＩＬＩ（５ＦＵ＋イリノテカン）という併用療法が考案されていた。
この併用療法により、腫瘍の縮小が確認できる割合である「奏効率」が改善され、患者の生存期間も延長した。
【０００５】
しかしながら、大腸癌を始めとする癌の化学療法においては、その治療過程において癌細胞が薬剤耐性（抵抗性）を備えるようになるという問題があった。
進行・再発大腸癌の抗癌剤治療において、薬剤に抵抗性を有する場合、薬剤の変更による二次治療を行っても、その効果は薬剤を変更する前の一次治療に比べて格段に下がるという問題があった。
【０００６】
ここで図１３を参照して、進行・再発した大腸癌の標準抗癌剤治療の効果と予後の観察例について説明する。
奏功率は、治療により腫瘍の縮小が認められた割合を示す。
肝切除率は、各群において肝臓に転移した大腸癌を再手術した割合を示す。
ＰＦＳは無増悪生存期間のことであり、その患者の癌が再び増大するか、患者が癌によって死亡するまでの期間（月）を示す。
ＯＳは、無作為割り付けの時点から理由を問わず死亡するまでの期間（月）を示す。
このように、一次治療でＦＯＬＦＯＸ、ＦＯＬＦＯＬＩのいずれかを使用しても、奏功率は５５％程度であるが、二次治療における奏功率は、４％、１５％と大きく低下する。同様に、ＰＦＳも低下する。
このように、進行・再発した大腸癌においては、ＦＯＬＦＯＸ、ＦＯＬＦＯＬＩのいずれも、１０ヶ月程度で治療効果がなくなってくることが知られていた。
【０００７】
次に、図１４を参照して、抗癌剤の耐性のモデルについて説明する。
元々、癌細胞は、細胞の遺伝物質であるＤＮＡ（Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）の損傷により、患者本人の体細胞が変異して発生する。癌細胞は、ＤＮＡの損傷により、通常の細胞が備えるべき細胞周期／増殖の制御、細胞死（アポトーシス）、ＤＮＡ修復機構といった細胞の正常性を保つために必要な機構が働かない状態になっていることが多い。このため、癌細胞のなかには、ＤＮＡの損傷が修復されないまま生き残るものが存在し、癌の進行とともに、性質の変化した癌細胞が現れるという特徴がある。このため、癌細胞が抗癌剤に対する耐性を獲得する。
この抗癌剤に対する癌細胞の耐性機能としては、１次耐性と２次耐性があると考えられる。１次耐性は、癌細胞が生来有する耐性機能で、２次耐性は、治療の過程で癌細胞の性質が変化することにより獲得した耐性機能と考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００９−５７３３０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したように、従来の抗癌剤や従来技術１の抗癌剤を用いて併用療法を行っても、二次治療の奏功率は低いという問題点があった。
このため、進行・再発大腸癌の標準抗癌剤治療において、癌が耐性を獲得した場合でも、現状では薬を換えることで対処するしかなかった。
【００１０】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、上述の課題を解消することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明のＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの遺伝子領域は、メチル化を抗癌剤耐性マーカーとして用いる癌細胞のＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの遺伝子領域であることを特徴とする。
本発明のＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの遺伝子領域は、前記癌細胞は、大腸癌の細胞又は胃癌の細胞であることを特徴とする。
本発明の抗癌剤耐性判別キットは、癌細胞のＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの遺伝子領域のメチル化により抗癌剤耐性が判別されることを特徴とする。
本発明の抗癌剤感受性回復方法は、癌細胞のＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの遺伝子領域のメチル化を検出し、メチル化されている場合には脱メチル化することを特徴とする。
本発明の抗癌剤組成物は、癌細胞のＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの遺伝子領域のメチル化を検出し、メチル化されている場合に、脱メチル化剤と抗癌剤とを用いることを特徴とする。
本発明の抗癌剤組成物は、前記癌細胞は、大腸癌の細胞又は胃癌の細胞であることを特徴とする。
本発明のｓｉＲＮＡは、癌細胞のＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの発現量を低下させることを特徴とする。
本発明のｓｉＲＮＡは、配列（９）に記載された配列を用いて合成することを特徴とする。
本発明のアポトーシス回復組成物Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの遺伝子産物を用いたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子の異常メチル化の有無を判定して、メチル化がされていれば、脱メチル化剤と抗癌剤とを併用する組成物を用いることで、より長く抗癌剤の効果を持続することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の実施の形態に係るメチル化が遺伝子の転写阻害を起こすメカニズムを示す概念図である。
【図２】本発明の実施の形態に係るＤＥＸ遺伝子による大腸癌の治療戦略を示す概念図である。
【図３】本発明の実施の形態に係る（Ａ）ＭＳＰで検出したメチレーション、（Ｂ−１）バイサルファイト・シーケンシングによりメチル化していたＣｐＧ、（Ｂ−２）バイサルファイト・シーケンシングの結果を示す図である。
【図４】本発明の実施の形態に係るメチル化とＤＥＸ遺伝子の発現の減少を示すグラフである。
【図５】本発明の実施の形態に係るｓｉＲＮＡ添加によるＤＥＸ遺伝子の発現の現象を示すグラフである。
【図６】本発明の実施の形態に係る（Ａ）ＤＥＸ遺伝子のｓｉＲＮＡとカンプトテシンを加えたヘキスト染色の観察例を示す図、（Ｂ）ＤＥＸ遺伝子のメチル化異常による耐性獲得のモデルを示す図である。
【図７】本発明の実施の形態に係るＤＥＸ遺伝子のｓｉＲＮＡとカンプトテシンを加えると、カンプトテシンに耐性を備えることを示すグラフである。
【図８】本発明の実施の形態に係るＤＥＸ遺伝子のｓｉＲＮＡを投与して４８時間低酸素ストレスを与えた際のカスパーゼの発現を示す写真である。
【図９】本発明の実施の形態に係る脱メチル化剤のモデルを示す概念図である。
【図１０】本発明の実施の形態に係る脱メチル化剤を加えた前後でのＤＥＸ遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図１１】本発明の実施の形態に係る（Ａ）脱メチル化剤とカンプトテシンを加えたヘキスト染色の観察例を示す図、（Ｂ）ＤＥＸ遺伝子が脱メチル化剤により抗癌剤への感受性を回復するモデルを示す図である。
【図１２】本発明の実施の形態に係るＤＥＸ遺伝子と脱メチル化剤を加えると抗癌剤への感受性を回復することを示すグラフである。
【図１３】従来の抗癌剤の併用療法に係る一次治療と二次治療の治療効果を示す図である。
【図１４】従来の抗癌剤の耐性獲得のモデルを示す概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜実施の形態＞
抗癌剤治療の問題点の１つとして薬剤耐性があげられる。切除不能の大腸癌の抗癌剤治療において、薬剤に抵抗性を有する場合の対処方法は薬剤の変更であるが、その奏功率は一次治療に比べ下がる。
本発明の発明者らは、こうした耐性に関わる遺伝子を検索するため鋭意検討と実験を行った。
ここで、本発明の発明者らは、性質の変化した癌細胞では、ＤＮＡのメチル化の異常がしばしば起こることに着目した。メチル化は、ＤＮＡの修飾の一種であり、脊椎動物のゲノムではＣｐＧ（ＣＧ）配列がメチル化により修飾されることがある。このＣｐＧ配列は、遺伝子がｍＲＮＡ（Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）に転写される際の発現制御に大きく関わっている。
【００１５】
本発明の発明者らは、このメチル化が癌を悪性化させる遺伝子の発現制御にも関わっている可能性を考え、癌細胞のゲノム（染色体）全体からメチル化の異常に関する遺伝子を検出した。このメチル化異常を検出するために、本発明の発明者らは、ゲノムＤＮＡなどを制限酵素で断片化し、特定の塩基配列を持つものだけを取得するメチレーション・センシティブＡＦＬＰ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、以下ＭＳ−ＡＦＬＰと呼ぶ。）法を用いた。しかし、これに限られず、メチル化アレイといった手法も用いることができる。
【００１６】
本発明の発明者らは、ヒトの胃癌、大腸癌で高頻度に異常メチル化されているＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ（デキサメサゾン誘導タンパク質）の遺伝子であり、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， Ｖｏｌ．２５， Ｎｏ．１，ｐｐ１１９−２４ （２００１）で報告され、ＮＣＢＩのデータベースに登録された公知のＬＯＣ６４２７５５遺伝子（以下ＤＥＸ遺伝子とよぶ。）に注目した。
【００１７】
ＬＯＣ６４２７５５のｍＲＮＡ及びＰｒｏｔｅｉｎの番号は下記の通りである：
Ｇｅｎｅ Ｎａｍｅ： ＬＯＣ６４２７５５
Ｇｅｎｅ ＩＤ ： ６４２７５５
Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｌｏｃａｔｉｏｎ： １５ｑ１１．２
Ｉｓｏｆｏｒｍ （ｍＲＮＡ） Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃： ＸＭ＿９２６３８２
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃： ＸＰ＿９３１４７５
【００１８】
ゲノム上のこのＤＥＸ遺伝子は、オープン・リーディング・フレームを基に、ローカル・アラインメントにより推定上のタンパク質の配列として特定され、まだ未確定の状態であるものの、上述の文献と以下のＩＤ（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によりゲノム配列を特定可能である：
ＧｅｎｅＩＤ：６４２７５５（ＬＯＣ６４２７５５）
なお、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅにおいて、２００９年６月２６日のｕｐｄａｔｅにて遺伝子番号の変更が行われ、ＧｅｎｅＩＤ：１００１３３１６５に変更された。しかしながら、本発明の実施の形態においては、上述のＬＯＣ６４２７５５を用いて説明する。
（ＬＯＣ１００１３３１６５ ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＬＯＣ１００１３３１６５）
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｇｅｎｅ＆ｃｍｄ＝Ｒｅｔｒｉｅｖｅ＆ｄｏｐｔ＝ｆｕｌｌ＿ｒｅｐｏｒｔ＆ｌｉｓｔ＿ｕｉｄｓ＝６４２７５５）
【００１９】
このＤＥＸ遺伝子は、ヒト１５番染色体ｑ１１．２領域のインプリント遺伝子の近傍に存在し、肺胞上皮細胞株でストレス下でステロイドを投与すると発現量が増えることが分かっている。また、ＤＥＸ遺伝子が翻訳されたタンパク質は、膜貫通型ドメインとしてロイシン・ジッパー（Ｌｅｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒ）モチーフを備えると推測されていた。
しかしながら、このＤＥＸ遺伝子の具体的な機能は知られていなかった。
そこで、本発明の発明者らは、ＤＥＸ遺伝子が、どのようにメチル化されて大腸癌に関わるのかの機構を解明し、本発明の実施の形態に係る抗癌剤治療における異常メチル化を介した薬剤耐性獲得の指標の判別方法、及び治療戦略方法の発明に至った。
【００２０】
まず、図１を参照して、ゲノムＤＮＡのメチル化と、発現の制御の関係について説明する。
ヒトを始めとする脊椎動物の核内のゲノムのＤＮＡには、ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される遺伝子領域と、この遺伝子の発現を制御するプロモーター領域が存在する。このプロモーター領域には、転写因子（転写制御因子）と呼ばれるＤＮＡ結合タンパク質が結合し、この刺激によりｍＲＮＡへの転写が行われる。
ここで、プロモーター領域のＤＮＡの転写制御に関わる部位のＣｐＧ配列がメチル化されると、転写因子が結合しにくくなり、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写が阻害されることが考えられる。この場合、このＤＮＡ配列の後流の遺伝子が発現しにくくなる。
本発明の発明者らは、ＤＥＸ遺伝子においても、胃癌、大腸癌で高頻度にプロモーター領域の異常メチル化が起こり、この異常メチル化によりＤＥＸ遺伝子のｍＲＮＡの発現が抑制されている事を明らかにした。この異常メチル化の検出は、配列番号（１）〜（４）のプライマーを用いたバイサルファイト・シーケンシング（Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）法により行うことが可能である。
バイサルファイト・シーケンシング法は、バイサルファイト処理を行なったゲノムＤＮＡにおいては、メチル化シトシンは変換されず、非メチル化シトシンのみがウラシルに変換されるという反応を利用したＤＮＡシーケンシングを用いた公知の検出方法である。バイサルファイト処理の前後では、シトシンとチミン（ウラシル）の差異が配列データとして得られるため、これによりプロモーター領域でメチル化されているＣｐＧ配列を特定することができる。
なお、このバイサルファイト・シーケンシング法以外にも、メチル化センシティブな制限酵素を用いる等の方法にて、プロモーター領域の異常メチル化を検知可能である。
【００２１】
本発明の発明者らは、さらにｓｉＲＮＡを用いて遺伝子発現を抑制し機能解析を行ったところ、ＤＥＸ遺伝子は、カンプトテシン（抗癌剤）の細胞死の耐性誘導に関わる事を明らかにした。
そこで耐性の誘導された大腸癌細胞株に対し、脱メチル化剤を投与しＤＥＸ遺伝子のプロモーター領域の異常メチル化を改善させ、遺伝子発現を回復させた。その後、再度、細胞株にカンプ卜テシンを投与したところ、細胞死の誘導が回復した。
このように、本発明の実施の形態に係る癌細胞判定方法は、ＤＥＸ遺伝子のプロモーター領域に異常メチル化があるかを判定する。そして、異常メチル化により耐性を獲得したと考えられる癌細胞に対して、脱メチル化剤により抗癌剤に対する感受性を回復させる治療戦略を用いることができる。
なお、本発明のＤＥＸ遺伝子領域とは、このＤＥＸ遺伝子の上流のプロモーター領域に限られず、ヒト又は動物の染色体のＤＮＡにおいてＤＥＸ遺伝子の発現制御に関わる領域を全て含んでおり、ＤＥＸ遺伝子のエキソン、イントロン、上流領域、下流領域等の数十〜数千ｋｂａｓｅ単位の近傍の領域を含む。また、ＤＥＸ遺伝子の偽遺伝子や、発現調整を行っている、離れた領域のＤＮＡ配列等も含むものである。
また、ＤＥＸ遺伝子は、いくつかのオルタナティブフォームが存在することが考えられる。それによりＤＥＸ遺伝子のプロモーター領域は異なるものの、これらのプロモーター領域もすべて含むものである。
【００２２】
図２を参照して、ＤＥＸ遺伝子を指標として、進行・再発大腸癌における抗癌剤抵抗性腫蕩に対する治療戦略について説明する。
ＤＥＸ遺伝子のプロモーター領域の異常メチル化の有無を評価することにより耐性誘導の経路を特定できれば、一次治療を継続しながら脱メチル化剤を併用する事により腫瘍の抗癌剤耐性を克服することが可能になると考えられる。
また、ＤＥＸ遺伝子がメチル化をしていない形質をもつ大腸癌の場合には、一次治療で耐性が生じた場合には、ただちに別の抗癌剤を投与したり、別の治療法に切り換えて、患者のＱＯＬを向上させることができる。
このように、ＤＥＸ遺伝子のプロモーター領域のメチル化を判定するメチル化判定方法により、大腸癌の化学治療に対する方針を得ることができるという効果が得られる。
また、本発明の発明者らは、ＤＥＸ遺伝子は、カスパーゼのカスケードの上流に関わっていることを明らかにしている。よって、ＤＥＸ遺伝子を欠失した大腸癌においても、このＤＥＸ遺伝子やＤＥＸタンパク質を導入することで、正常な細胞死を誘導することができると考えられる。
【００２３】
以上のように、本発明の実施の形態に係るＤＥＸ遺伝子を用いて、抗癌剤耐性マーカーを実現することができる。すなわち、本発明の実施の形態において、ＤＥＸ遺伝子のプロモーター領域を、大腸癌においてＤＮＡメチル化異常を介した薬剤耐性の獲得に関わる新規の抗癌剤耐性マーカーとして用いることができる。
また、本発明の実施の形態に係る抗癌剤耐性マーカーを用いたメチル化判定方法により、抗癌剤抵抗性腫蕩に対する治療戦略を得ることができる。
これにより、有効な薬剤が少ない、進行、再発した大腸癌や胃癌等において、耐性の克服を目指した治療戦略を確立することができる。
【００２４】
また、ＤＥＸ遺伝子は、大腸癌においてＤＮＡメチル化異常を介した薬剤耐性の獲得に関わっており、脱メチル化剤使用時期の判定を行うことができる。
すなわち、ＤＥＸ遺伝子のメチル化異常の有無を判定し、メチル化異常がある場合、脱メチル化剤と化学療法剤との組み合わせた療法を行うことができる。
これにより、ＦＯＬＦＯＸ（５ＦＵ＋オキサリプラチン）あるいはＦＯＬＦＩＬＩ（５ＦＵ＋イリノテカン）使用にあたり、２次治療の奏功率が低下する問題を解消する方法を提供することができる。
【００２５】
本発明の組成物は、他の組成物等と併用することも可能である。また、他の組成物と同時に本発明の組成物を投与してもよく、また間隔を空けて投与してもよいが、その投与順序は特に問わない。
【００２６】
また、本発明の実施の形態において、疾患が改善または軽減される期間は特に限定されないが、一時的な改善または軽減であってもよいし、一定期間の改善または軽減であってもよい。
【実施例】
【００２７】
〔本発明の実施の形態に係る治療用組成物の実施例〕
以下で、本発明の実施の形態に係る治療用組成物について、具体的な実験を基にして、実施例としてさらに具体的に説明する。
【００２８】
〔実験の方法と手順〕
（細胞系統（セル・ライン）と細胞培養）
ヒトの皮膚繊維芽細胞細胞の細胞株として、ＮＨＤＦ（ＡＤ、クラボウ、倉敷紡績株式会社製、大阪、日本）を使用した。
ヒトの大腸癌細胞株（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）として、ＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ、マナッサス、バージニア州、米国）から得た。
さらに、ヒトの結腸・大腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞株として、ＣＯＬＯ３２０ＤＭ（ＪＣＲＢ、大阪、日本）を使用した。
ＮＨＤＦは、低血清増殖添加剤（ＬＳＧＳ）を加えた培養液１０６Ｓ（倉敷紡績株式会社製）で培養された。
ＨＣＴ１１６とＣＯＬＯ３２０ＤＭは、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）であるＣｅｌｌｅｃｔ Ｇｏｌｄ（ＭＰバイオメディカル社製、オーロラ、オハイオ州、アメリカ）、１０，０００ユニット／ｍｌのペニシリンＧ、安定化した抗生剤・抗真菌剤である１０ｍｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシン、及び２５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ（ＳＩＧＭＡ社製、ミズーリ州、アメリカ）を加えたＤｕｌｂｅｃｃｏ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）により培養された。
【００２９】
（核酸抽出）
ＤＮＡ抽出には、ＤＮｅａｓｙＲ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ、東京、日本）を用いた。抽出は、メーカーの説明書に従って行った。
ＲＮＡはＴＲＩｚｏｌＲ Ｐｌｕｓ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州、アメリカ）を用いた。抽出は、メーカーの説明書に従って行った。
【００３０】
（ＭＳ−ＡＦＬＰ）
ＭＳ−ＡＦＬＰは、網羅的にゲノム全域のメチル化の異常を検知するための非常に有効な方法である。
ＭＳ−ＡＦＬＰは、ＭＳ−ＡＦＬＰは、ｓｕｚｕｋｉらによって既に報告されている方法（Ｋｏｉｃｈｉ Ｓｕｚｕｋｉ， Ｇｌｏｂａｌ ＤＮＡ ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃａｎｃｅｒ ｉｓ ａｇｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｅｃｅｄｅｓ ｇｅｎｏｍｉｃ ｄａｍａｇｅ， ＣＡＮＣＥＲ ＣＥＬＬ ９， １９９−２０７， ＭＡＲＣＨ ２００６）に従って行った。
ＰＣＲ産物はゲルから溶出され、ＭＳ−ＡＦＬＰに対して使用されたのと同じプライマーにより増幅された。
再増幅されたＤＮＡは、ＱＩＡクイックＰＣＲ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社製、ヒルデン、ドイツ）により抽出され、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭダイ・ターミネーター・サイクル・シーケンシング・キット（パーキン・エルマー）により配列が決定された。
ＭＳ−ＡＦＬＰで得られた断片の塩基配列は、配列検索ツールであるＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）で検索を行い、それを基に配列を決定した。
【００３１】
（バイサルファイト処理）
ゲノムＤＮＡにバイサルファイト（亜硫酸水素ナトリウム）による処理を行うと、メチル化されていないシトシンはウラシルに変化し、一方でメチル化されたシトシンに対しては何も修飾しないという処理である。
バイサルファイト処理はＥｐｉＴｅｃｔ（登録商標）バイサルファイト・キット（ＱＩＡＧＥＮ社製、ヒルデン、ドイツ）を用いて、メーカーの説明書に従って行った。
【００３２】
（メチレーション特異的ＰＣＲ、ＭＳＰ）
メチル化の有無を識別するために、メチル化特異的ＰＣＲ法（ＭＳＰ、Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ）を行った。
ＰＣＲ増幅は、１×ＰＣＲバッファー、０．２５ｍＭ ｄＮＴＰミックス、０．０２５Ｕ／μｌ ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＱＩＡＧＥＮ社製、ヒルデン、ドイツ）、及び０．５μＭのそれぞれのプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒとＲｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）によりトータル２０μｌの反応液組成で行った。
＊
【００３３】
メチル化ＤＮＡ特異的なプライマーの配列は以下のとおりである：
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＡＴＴＣＧＧＡＧＧＡＣＧＡＣＧＴＣＧＣＧＧＴＣ−３’ …… 配列（１）
Ｒｅｖｅｒｅｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＧＣＡＡＡＡＡＣＣＴＣＧＣＡＡＡＡＣＣＧＡＣＧＡＡＡ−３’ …… 配列（２）
非メチル化ＤＮＡ特異的なプライマーの配列は以下のとおりである：
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＴＧＴＧＡＴＴＴＧＧＡＧＧＡＴＧＡＴＧＴＴＧＴＧＧＴＴ−３’ …… 配列（３）
Ｒｅｖｅｒｅｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＣＴＣＡＣＡＡＡＡＡＣＣＴＣＡＣＡＡＡＡＣＣＡＡＣＡＡＡＡ−３’ …… 配列（４）
【００３４】
ＰＣＲ反応は、初期熱変性を９５℃で５分間行った後、熱変性を９５℃で４５秒、アニーリングを５６℃で４５秒、伸長反応を７２℃で１分を１サイクルとして３８サイクル行い、最終伸長反応を７２℃で１０分間行った。ＰＣＲ産物は１０℃で保存した。
ＰＣＲ産物は１．５％のアガロースゲル電気泳動法で確認された。
【００３５】
（バイサルファイト・シーケンシング法）
バイサルファイト処理されたＤＮＡを、バイサルファイト処理により影響されない位置に設計されたプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ反応は、１×ＰＣＲバッファー、０．２５ｍＭ ｄＮＴＰミックス、０．０２５Ｕ／μｌのＨｏｔＳｔａｒＴａｑ Ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（ＱＩＡＧＥＮ社製、ヒルデン、ドイツ）、及び０．５μＭのそれぞれのプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒとＲｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）によりトータル２０μｌの反応液組成で行った。
このバイサルファイト・シーケンシング用のプライマーの配列は以下のとおりである：
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＧＡＡＧＡＧＧＧＧＡＧＧＴＧＡＴＴＴＴＧ−３’ …… 配列（５）
Ｒｅｖｅｒｅｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＣＣＴＡＣＡＡＡＣＣＣＡＡＣＡＣＣＣＡＴ−３’ …… 配列（６）
【００３６】
ＰＣＲは、初期熱変性を９５℃で５分間行った後、熱変性を９５℃で４５秒、アニーリングを５６℃で４５秒、伸長反応を７２℃で１分を１サイクルとして３８サイクル行い、最終伸長反応を７２℃で１０分間行った。ＰＣＲ産物は１０℃で保存した。
ＰＣＲ産物は、ＥＸＯＳＡＰ ＩＴ（ＵＳＢ株式会社製、クリーヴランド、オハイオ、米国）で精製後、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、メディソン、ウィスコンシン州、米国）によるＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇを行ってシーケンシングに用いた。
シーケンシングには、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１００、ジェネティック・アナライザー（アプライド・バイオシステムズ社製、フォスター・シティ、カリフォルニア、米国）を用いた。
【００３７】
（リアルタイム定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑＲＴ−ＰＣＲ）
Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑＲＴ−ＰＣＲを用いてＲＮＡの定量を行った。この定量は、ロッシュＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）（ロッシュ社製、マンハイム、ドイツ）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）ワンステップ定量ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カールスバード、カリフォルニア、米国）を用いて行った。
Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑＲＴ−ＰＣＲに用いるプライマーとしては、Ｄ−ＬＵＸ デザイナー・ソフトウェア（ｈｔｔｐｓ：／／ｏｒｆ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｌｕｘ／ｌｕｘＤｅｓｉｇｎ．ｊｓｐ）により設計されたＬＵＸ Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カールスバード、カリフォルニア、米国）を用いた。当該プライマー配列は以下のとおりである：
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＴＴＣＴＡＣＧＴＧＧＧＣＣＴＧＴＴＣＴＴ−３’ …… 配列（７）
Ｒｅｖｅｒｅｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＴＣＣＡＡＧＴＡＣＣＣＡＴＣＡＡＡＧＡＣＧ−３’ …… 配列（８）
ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌとして、ハウスキーピング遺伝子（ｈＧＡＰＤＨ）を使用した。
【００３８】
（ＲＮＡｉ、トランスフェクション）
Ｃｕｓｔｏｍ Ｓｔｅａｌｔｈ ＲＮＡｉ （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバード、カリフォルニア、米国）は、ＢＬＯＣＫ−ｉＴ ＲＮＡｉデザイナー・ソフトウェア（ｈｔｔｐｓ：／／ｒｎａｉｄｅｓｉｇｎｅｒ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｒｎａｉｅｘｐｒｅｓｓ／）により設計された。
ｓｉＲＮＡ（ＸＭ＿９２６３８２＿ｓｔｅａｌｔｈ＿５３９）の配列は以下のとおりである：
５'−ＣＣＵＣＵＡＵＧＵＵＣＵＡＣＧＵＧＧＧＣＣＵＧＵＵ−３' …… 配列（９）
ｓｉＲＮＡは、ＰｒｉｍａＰｏｒｔ ｓｉＲＮＡトランスフェクションＲｅａｇｅｎｔ（登録商標）（ＣＲＥＤＩＡ−ＪＡＰＡＮ社製、京都、日本）を用いて、ＮＨＤＦ細胞株に遺伝子導入（トランスフェクション）された。
【００３９】
トランスフェクションの１日前に、３５ｍｍディッシュ上に抗生物質を含まない培地１５００μｌに対して５×１０4の細胞を播き、３７℃、５％のＣＯ2インキュベーター内で２４時間培養した。トランスフェクション時に、約３０〜５０％のコンフルーエンスとした。
また、ＰｒｉｍａＰｏｒｔを６．０μｌ、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カールスバード、カリフォルニア、米国）７５．０μｌに混和し、ｓｉＲＮＡ２００ｐｍｏｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ７５．０μｌに混和後、これらの２つの溶液をゆっくりと混ぜ、室温で３０分インキュベートした。この混合液に培地を加え１，５００μｌとし、３７℃、５％のＣＯ2を含む環境のインキュベーター内で４８時間培養した。
【００４０】
（アポトーシス）
カンプトテシン（シグマ社製、カタログ Ｎｏ．Ｃ−９９１１）によるアポトーシスの誘導を行った。
カンプトテシンの添加は、ＳｉＲＮＡ導入４８時間後に、ＮＨＤＦに対して２０μＭ、ＨＣＴ１１６に対して１０μＭになるよう行った。添加後、３７℃、５％のＣＯ2を含む環境のインキュベーター内で２４時間培養し、アポトーシスの評価を行った。
【００４１】
（ヘキスト染色）
アポトーシスを起こした細胞は、核凝縮及びＤＮＡがフラグメント化するため、これを検出するため、ヘキスト３３３４２（ＳＩＧＭＡ社製、東京、日本）で染色し、ＵＶフィルタ（３３０−３８０ｎｍ）およびバンド・パス・フィルタ（４２０ｎｍ）を用いて蛍光顕微鏡（ニコン社製、ＢｉｏＳｔａｉｔｉｏｎ ＩＭ ＣＥＬＬ−ＳＩＰ）にて観測した。染色は、ヘキストを３μｇ／ｍｌとなるように添加し、室温で５分インキュベートした。
【００４２】
（フローサイトメトリー、ＦＡＣＳ流動細胞計測法分析）
細胞のアポトーシス誘導および細胞周期の検知については、培養細胞をかきだして集め、５分間２，０００ｒｐｍで遠心分離して取得した。
細胞はクエン酸で固定する前にＰＢＳで洗浄した。細胞を固定した後、核をｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）にて染色し、フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、ＦＡＣＳ）計測法でアポトーシスの比率および細胞周期を分析した。
【００４３】
（免疫組織化学分析）
Ｋｉ−６７の免疫組織化学分析は、ウサギモノクローナル抗体Ｋｉ６７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｎａｔｏｍｉｃａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、カリフォルニア、米国）を用いて行った。
【００４４】
（細胞老化）
細胞老化については、老化細胞染色キット（ＳＩＧＭＡ、ミズーリ、米国）を用いて行った。
【００４５】
（統計分析）
値は、少なくとも３つの別個の実験から、平均と±ＳＤを求めた。群の間の違いはスチューデントのｔ検定により評価された。
Ｐ＜０．０５の場合、違いが重要（有意）であると考えられた。
【００４６】
〔実験結果の考察〕
（癌細胞株におけるＤＥＸ遺伝子プロモーター領域のメチル化状態）
まず、図３を参照して、癌細胞株におけるＤＥＸ遺伝子である、ＤＥＸ遺伝子のプロモーター領域のメチル化状態について説明する。
図３のＡ．において、上述の実験法により、メチル化を評価したところ、胃癌セルライン（Ｈ１１１、ＧＳＳ、ＨＧＣ２７、ＡＺ５２１）、大腸癌細胞株（ＣＷ２、ＣＡＣＯ２、ＨＣＴ１１６、ＣＯＬＯ３２０ＤＭ）のＤＥＸ遺伝子（ＬＯＣ６４２７５５）はメチル化（Ｍ）されていた。しかし、正常組織の繊維芽細胞のセルライン（ＮＨＤＦ）では、メチル化されていなかった（Ｕ）。また、ＣＯＬＯ３２０ＤＭは、メチル化されたプライマーと、メチル化されていないプライマー両方でＰＣＲ産物を得た。
図３のＢ１．は、ＤＥＸ遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧサイトの位置関係を示している。
図３のＢ２．は、バイサルファイト・シーケンシングを行い、各ＣｐＧサイトのメチレーションを検出した結果である。各クローンについて、ＣｐＧがメチル化された状態（メチル化）を暗い丸にて、メチル化していない状態（非メチル化）を明るい丸にて示した。この結果、ほとんどすべての癌細胞株のＣｐＧがメチル化されていた。逆に、正常組織由来のＮＨＤＦ細胞株ではＣｐＧはメチル化されなかった。そして、大腸癌細胞株であるＣＯＬＯ３２０ＤＭについては、この部位の３０％のＣｐＧがメチル化され、これはＰＣＲと同様の結果であった。
【００４７】
図４は、コントロールとしてＧＡＰＤＨを使用して、リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲの結果を要約したグラフである。ＨＣＴ１１６とＣＯＬＯ３２０ＤＭのＤＥＸ遺伝子は、ＮＨＤＦよりＲＮＡの発現が抑制されている。すなわち、プロモーター領域のメチル化により、ＤＥＸ遺伝子のＲＮＡの発現が抑制されることを示している。
このように、胃癌、大腸癌の細胞において、ＬＯＣ６４２７５５のプロモーター領域が異常メチル化されることにより、ＤＥＸ遺伝子の発現が抑制される。
【００４８】
（ＤＥＸ遺伝子のｓｉＲＮＡの添加による抗癌剤由来のアポトーシスの減少）
次に、上述の方法で作成したｓｉＲＮＡを用いてＤＥＸ遺伝子の発現を減少させた。
図５を参照すると、正常細胞であるＮＨＤＦ細胞株に、ｓｉＲＮＡを遺伝子導入し、ＤＥＸ遺伝子のノックダウンを行って、ｑＲＴ−ＰＣＲにてＤＥＸ遺伝子の発現量を測定した結果である。上述のように、ＮＨＤＦのＤＥＸ遺伝子プロモーター領域は、メチル化されていない状態であり、ＤＥＸ遺伝子を発現している。これに対して、ｓｉＲＮＡを導入すると、ＤＥＸ遺伝子のＲＮＡの発現は４０％程度、抑制された。
【００４９】
図６を参照して、ＮＨＤＦ細胞株にＤＥＸ遺伝子のｓｉＲＮＡを導入した例について説明する。図６のＡ．によると、コントロールであるＮＨＤＦ細胞株にカンプトテシン（ＣＰＴ）のみを与えて、ヘキスト染色した細胞を目視により確認したところ、細胞はアポトーシスを起こして抗癌剤由来の細胞死を来した。これに対して、ＮＨＤＦ細胞株にカンプトテシンとｓｉＲＮＡを加えたところ、細胞死の割合は減少した。このように、ＤＥＸ遺伝子用のｓｉＲＮＡは、カンプトテシンに耐性を持たせることがわかる。すなわち、線維芽細胞のＤＥＸ遺伝子の発現を抑制すると抗癌剤による細胞死の誘導が抑えられ、耐性が誘導された。
図７を参照して、図６の結果のグラフについて説明する。まず、コントロールのＮＨＤＦ細胞株にｓｉＲＮＡのみを導入し、毒性のないことを確認した。すなわち、アポトーシスによる細胞死の割合は０．５％から２．７％に増えただけで有意ではなかった。カンプトテシンを加えると、４０．５％（５３／１３１例）の細胞がアポトーシスを起こした。しかしながら、ｓｉＲＮＡの遺伝子導入により、抗癌剤によるアポトーシスを起こした細胞は７．３％（１０／１３７例）に減少した。
ここで、図６のＢ．のモデルを参照すると、元々、カンプトテシンのような抗癌剤は、通常の細胞よりも増殖の盛んな癌細胞にアポトーシスを誘導する働きがある。このため、ＤＥＸ遺伝子を発現している形質をもつ癌細胞においても、アポトーシスを起こさせることができる。
逆に、ＤＥＸ遺伝子の発現量が少ない形質に変化した癌細胞は、抗癌剤に耐性となりアポトーシスが起こらなくなると考えられる。
【００５０】
図８を参照して、ＤＥＸ遺伝子用のｓｉＲＮＡが細胞死を抑制する例について説明する。図８は、低酸素状態のストレスを４８時間与えた後で、コントロール群とｓｉＲＮＡ導入群でアポトーシスのネットワークに関わるシステインプロテアーゼであるカスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）の発現量を比較したものである。
写真は、カスパーゼを免疫組織化学分析により蛍光染色したもので、コントロール群に比べて、ｓｉＲＮＡ導入群は、明らかにカスパーゼの発現が少なくなっている。また、ｓｉＲＮＡを導入しないコントロール群に比べて、ｓｉＲＮＡ導入群はコントロール群に比べ有意に細胞死が少なかった。
このように、ＤＥＸ遺伝子は、アポトーシスを誘導するカスパーゼのカスケードに関わっており、遺伝子ネットワークにおいては、カスパーゼの手前に関わると考えられる。
【００５１】
（ＤＥＸ遺伝子プロモーター領域の脱メチル化によるカンプトテシン感受性の回復）
まず、図９を参照して、脱メチル化剤について説明する。本発明の発明者らは、上述のように、ＤＥＸ遺伝子の発現を回復させると、抗癌剤への感受性は回復するかについて検証するため、脱メチル化剤を用いることを考えた。
脱メチル化剤としては、５−ａｚａ ｃｙｔｉｄｉｎｅを用いることにした。この５−ａｚａ ｃｙｔｉｄｉｎｅ（薬剤名Ｖｉｄａｚａ、Ｐｈａｒｍｉｏｎ社製）は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の抗癌剤として開発中のものである。
５−ａｚａ ｃｙｔｉｄｉｎｅは、メチル化されたＣｐＧを脱メチル化する。
【００５２】
図１０は、脱メチル化剤である５−ａｚａ ｃｙｔｉｄｉｎｅを１μＭ、２日添加してメチル化を除いて、ｑＲＴ−ＰＣＲを行ってＤＥＸ遺伝子の発現量の変化をみたグラフである。
この実験により、ＨＣＴ１１６とＣＯＬＯ３２０ＤＭは、共に、ＤＥＸ遺伝子のＲＮＡの発現量が有意に回復することが分かる。
すなわち、大腸癌細胞株を５−ａｚａ ｃｙｔｉｄｉｎｅで処理することで、ＤＥＸ遺伝子の発現量が回復する。
【００５３】
図１１を参照して、ＨＣＴ細胞株に、５−ａｚａ ｃｙｔｉｄｉｎｅを１μＭ、２日添加して異常メチル化を回復した細胞に、カンプトテシンを投与した例について説明する。
図１１のＡ．によると、コントロールである５−ａｚａ ｃｙｔｉｄｉｎｅで処理していないＨＣＴ細胞株にカンプトテシン（ＣＰＴ）を与えて、ヘキスト染色した細胞を目視により確認したところ、細胞はあまりアポトーシスを起こしていなかった。これに対して、５−ａｚａ ｃｙｔｉｄｉｎｅを添加して脱メチル化したＨＣＴ細胞株にカンプトテシンを加えたところ、多くの細胞がアポトーシスを起こしていた。
図１２は、図１１の結果をグラフ化したものである。コントロールの５−ａｚａ ｃｙｔｉｄｉｎｅのみを投与した際のアポトーシスによる細胞死は１．０％から７．３％へ増えただけであった。また、ＤＥＸ遺伝子のプロモーター領域がメチル化しているＨＣＴ細胞株にカンプトテシンを投与しても、目視により確認したところ、２０．６％（３３／１６０例）しかアポトーシスを起こしていなかった。これに対して、脱メチル化したＨＣＴ細胞株にカンプトテシンを投与した場合は、６０．４％ （５５／９１例）と有意にアポトーシスを起こしていた。
このように、脱メチル化剤の投与により抗癌剤の感受性が回復したことが分かる。すなわち、脱メチル化剤によりＤＥＸ遺伝子の発現を誘導すると、抗癌剤の感受性が回復する。
図１１のＢ．のモデルを参照すると、たまたまカンプトテシンに耐性がない形質の細胞のみが細胞死する。これに対して、脱メチル化を行うことで、これまで耐性があった癌細胞にカンプトテシンへの感受性を回復させ、この感受性を回復させた細胞を細胞死させることができる。
【００５４】
なお、上述の他の実験により、ＤＥＸ遺伝子は、細胞老化、細胞増殖、細胞周期には、ほぼ影響しないという知見を得ている。
【００５５】
以上のように、イリノテカンや５ＦＵなどの化学療法では、抗癌剤の耐性により奏功率が低下する。本発明の発明者らは、この原因を探るため、大腸癌及び胃ガン患者のメチル化異常のある遺伝子を解析したところ、双方の患者とも約半数にＤＥＸ遺伝子でメチル化異常を検出した。
そこで、当該遺伝子のメチル化異常のないヒト皮膚線維芽細胞株ＮＨＤＦ及びメチル化異常のある大腸癌由来細胞株にてＤＥＸ遺伝子のメチル化異常の有無によるアポトーシスへの影響を調べた。そして、ＤＥＸ遺伝子のメチル化異常でＤＥＸ遺伝子の発現量が減ると、アポトーシスが抑制されることを示した。
また、正常細胞株でｓｉＲＮＡにて当該遺伝子の発現を抑制したところ、カンプトテシンによるアポトーシスが見られなかった。一方、当該大腸癌由来細胞株は、カンプトテシンによるアポトーシス誘導がなく、抗癌剤耐性を示した。
このように、本発明の発明者らは、ＤＥＸ遺伝子のプロモーター領域のメチル化により、癌細胞が抗癌剤に対する耐性を獲得することを明らかにした。
さらに、大腸癌由来細胞株に脱メチル化剤を用いて処理したところ、ＤＥＸ遺伝子の発現が回復し、カンプトテシンによる細胞死を誘導することができた。
しかしながら、この実施例は一例にすぎず、これに限定されるものではない。
【００５６】
以上のように構成することで、以下のような効果を得ることができる。
まず、従来技術１のような新しい抗癌剤や従来の抗癌剤を併用した標準療法において、癌細胞が抗癌剤への耐性を獲得すると、薬剤を変更するしかなかった。しかしながら、変更可能である有効な薬剤は少なく、二次治療の治療成績は悪かった。
これに対して、本発明の実施の形態に係る抗癌剤耐性判定方法は、ＤＥＸ遺伝子のプロモータ領域のメチル化異常を指標にして、カンプトテシンやイリノテカンなどの抗癌剤に対する耐性の有無を判定することが可能になる。
【００５７】
また、５−ａｚａ ｃｙｔｉｄｉｎｅは、ゲノムＤＮＡのメチル化を解除する働きがあり、脱メチル化することにより、細胞分化や成長を調節する役割の腫瘍抑制遺伝子が正常機能を回復し、５−ａｚａ ｃｙｔｉｄｉｎｅ自体の細胞毒性により正常な成長抑制機能に反応しなくなった分裂の早い細胞を死滅させるという作用効果が期待されている。
これに対して、ＤＥＸ遺伝子のプロモーター領域がメチル化されている癌に対して、５−ａｚａ ｃｙｔｉｄｉｎｅのような脱メチル化剤を用いると、抗癌剤への感受性を回復させるという効果が得られる。このため、単純に抗癌剤を使用したり、５−ａｚａ ｃｙｔｉｄｉｎｅを使用するだけ、又は両剤を単純に併用するのに比べて、より長く効果的に同じ抗癌剤を使用した化学療法を続けられるという効果が得られる。また、５−ａｚａ ｃｙｔｉｄｉｎｅの効果が認められている癌以外の胃癌や大腸癌にも用いることができるという効果が得られる。
これにより、手術による回復の見込みのない大腸癌患者の生存期間を延ばすことが推測でき、患者の回復率やＱＯＬを向上させることができる。
すなわち、抗癌剤に対する耐性誘導の経路を特定し、一次治療を継続しながら脱メチル化剤を併用して腫瘍の抗癌剤耐性を押さえることができる。
【００５８】
また、従来、化学治療に係わる費用は高額であり、患者の家計を圧迫しているという問題があった（日経メディカル：２００７．１０．３１；第４５回日本癌治療学会会「高度化する癌化学療法が家計を圧迫、経済的理由で治療変更せざるを得ない患者も」（東北大学医療管理 濃沼信夫教授）、参照）。
これに対して、本発明においては、同じ抗癌剤を、これまでより多量に使用できるため、該抗癌剤の大量生産によるコストの削減が期待できる。
【００５９】
また、本発明の実施の形態に係る抗癌剤耐性判定方法においては、ＤＥＸ遺伝子を介したカスパーゼのカスケードについての知見が得られたため、分子標的薬を作成するために用いることもできる。
さらに、ＤＥＸ遺伝子そのものを導入することで、アポトーシスを誘導できると考えられるため、抗癌剤の開発用のターゲットとしてＤＥＸ遺伝子とＤＥＸの遺伝子産物を用いることも可能である。
【００６０】
また、本発明の実施の形態に係る配列（９）のｓｉＲＮＡは、カスパーゼのカスケードに係るアポトーシスを抑制するため、脳梗塞や潜水病のような低酸素状態に用いることで、神経細胞等への損傷を抑えることができると考えられる。
同様に、ＤＥＸ遺伝子に係るｓｉＲＮＡやＰＮＡ等を用いて、細胞死に係る疾病に適用可能である。
【００６１】
なお、上記実施の形態の構成及び動作は例であって、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更して実行することができることは言うまでもない。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明は、ＤＥＸ遺伝子のプロモーター領域のメチル化異常を指標にすることで、抗癌剤に対する耐性の有無を判定することができ、薬剤の選択等に関わるオーダーメイド医療の指標の１つとして用いることができ、産業上利用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチル化を抗癌剤耐性マーカーとして用いる癌細胞のＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの遺伝子領域。
【請求項２】
前記癌細胞は、大腸癌の細胞又は胃癌の細胞である
ことを特徴とする請求項１に記載のＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの遺伝子領域。
【請求項３】
癌細胞のＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの遺伝子領域のメチル化により抗癌剤耐性が判別される
ことを特徴とする抗癌剤耐性判別キット。
【請求項４】
癌細胞のＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの遺伝子領域のメチル化を検出し、
メチル化されている場合には脱メチル化する
ことを特徴とする抗癌剤感受性回復方法。
【請求項５】
癌細胞のＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの遺伝子領域のメチル化を検出し、
メチル化されている場合に、脱メチル化剤と抗癌剤とを用いる
ことを特徴とする抗癌剤組成物。
【請求項６】
前記癌細胞は、大腸癌の細胞又は胃癌の細胞である
ことを特徴とする請求項５に記載の抗癌剤組成物。
【請求項７】
癌細胞のＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの発現量を低下させるｓｉＲＮＡ。
【請求項８】
配列（９）に記載された配列を用いて合成することを特徴とする請求項７に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項９】
Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの遺伝子産物を用いたアポトーシス回復組成物。
【請求項１】
メチル化を抗癌剤耐性マーカーとして用いる癌細胞のＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの遺伝子領域。
【請求項２】
前記癌細胞は、大腸癌の細胞又は胃癌の細胞である
ことを特徴とする請求項１に記載のＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの遺伝子領域。
【請求項３】
癌細胞のＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの遺伝子領域のメチル化により抗癌剤耐性が判別される
ことを特徴とする抗癌剤耐性判別キット。
【請求項４】
癌細胞のＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの遺伝子領域のメチル化を検出し、
メチル化されている場合には脱メチル化する
ことを特徴とする抗癌剤感受性回復方法。
【請求項５】
癌細胞のＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの遺伝子領域のメチル化を検出し、
メチル化されている場合に、脱メチル化剤と抗癌剤とを用いる
ことを特徴とする抗癌剤組成物。
【請求項６】
前記癌細胞は、大腸癌の細胞又は胃癌の細胞である
ことを特徴とする請求項５に記載の抗癌剤組成物。
【請求項７】
癌細胞のＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの発現量を低下させるｓｉＲＮＡ。
【請求項８】
配列（９）に記載された配列を用いて合成することを特徴とする請求項７に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項９】
Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎの遺伝子産物を用いたアポトーシス回復組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２０１１−４５２９１（Ｐ２０１１−４５２９１Ａ）
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１９６７０７（Ｐ２００９−１９６７０７）
【出願日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【出願人】（５０５２４６７８９）学校法人自治医科大学 (49)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月２７日（２００９．８．２７）
【出願人】（５０５２４６７８９）学校法人自治医科大学 (49)
【Ｆターム（参考）】
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