ＧＰＲ２２およびそれに関連する方法
発現を増強されたＧＰＲ２２核酸、ならびにコードされたＧＰＲ２２ポリペプチドの発現を増強する置換されたＧＰＲ２２核酸を産生する方法が提供される。これらの方法を実行する場合は、核酸コード哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチド（例えば、野生型核酸）ＧＰＲ２２アミノ酸配列のコード領域の種々のコドンを同定し、コードされたＧＰＲ２２ポリペプチドのアミノ酸配列を変更せずに発現を増強するようにヌクレオチドを置換することにより、核酸コード哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチド（例えば、野生型核酸）が発現を増強される。ＧＰＲ２２の調節剤を選別するために、方法、組成物および同じ方法、組成物を用いたキットも提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
コードされた哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現を真核宿主細胞において増強するために哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列をコードしている第１核酸を改変する方法であって、前記方法は、
（ａ）標的ヌクレオチドを含む前記第１核酸の前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体コード領域におけるコドンを同定するステップであって、前記標的ヌクレオチドは前記コドンによりコードされたアミノ酸を変更せずにグアニン、シトシンまたはチミンにより置換されうるアデニンであり、あるいは前記標的ヌクレオチドはコドンによりコードされたアミノ酸を変更せずにグアニン、シトシンまたはアデニンにより置換されうるチミンであるステップと、
（ｂ）前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列をコードする置換された非内因性の核酸を産生するために、アデニンである前記標的ヌクレオチドをグアニン、シトシンまたはチミンにより、またはチミンである前記標的ヌクレオチドをグアニン、シトシンまたはアデニンにより置換するステップとを含み、
前記置換された非内因性核酸の前記産生は前記真核宿主細胞における前記コードされた哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現を増強し、前記増強された発現とは前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドをコードしている前記第１核酸または野生型核酸との比較した上でのものである方法。
【請求項２】
アデニンである前記標的ヌクレオチド、チミンである前記標的ヌクレオチド、アデニンまたはチミンである前記標的ヌクレオチドが、グアニンまたはシトシンで置換される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列が、野生型哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記野生型哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列が、野生型ヒトＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記野生型哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列が、野生型ヒトＧＰＲ２２ Ｒ４２５またはＧＰＲ２２ Ｃ４２５アミノ酸配列である請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記野生型哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列が、配列番号２または配列番号６である請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記第１核酸が、野生型哺乳類ＧＰＲ２２受容体核酸である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１核酸が、野生型ヒトＧＰＲ２２受容体核酸である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第１核酸が、野生型ヒトＧＰＲ２２ Ｒ４２５またはＧＰＲ２２ Ｃ４２５核酸である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１核酸が、配列番号１または配列番号５である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記置換された非内因性核酸が、配列番号３または配列番号７である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドをコードしている前記野生型核酸が、野生型ヒトＧＰＲ２２受容体核酸である請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドをコードしている前記野生型核酸が、野生型ヒトＧＰＲ２２ Ｒ４２５またはＧＰＲ２２ Ｃ４２５核酸である請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドをコードしている前記野生型核酸が、配列番号１または配列番号５である請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記真核宿主細胞が、哺乳類の細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記真核宿主細胞が、メラノフォア細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記真核宿主細胞が、酵母細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｂ）が、同定されたコドンを含むあらゆる標的ヌクレオチドについて反復される請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ａ）〜（ｂ）が、一度反復される請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ａ）〜（ｂ）が、標的ヌクレオチドを含む前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列の前記コード領域のあらゆるコドンに至るまで反復される請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ａ）〜（ｂ）が反復され、これによって前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列の前記コード領域におけるすべてのコドンの少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％またはそれ以上が、置換された少なくとも１つの標的ヌクレオチドを有する請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ａ）〜（ｂ）が反復され、これによって標的ヌクレオチドを含む前記コード領域のコドンの少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％のアデニンまたはチミンがグアニンまたはシトシンで置換される請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ａ）〜（ｂ）が反復され、これによって前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列をコードする置換された非内因性核酸コード領域のＧＣ含有量が、前記哺乳類ＧＰＲ２２アミノ酸配列をコードする前記第１核酸のコード領域と比較すると、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、またはそれ以上増加する請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（ａ）〜（ｂ）が反復され、これによって前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列をコードする置換された非内因性核酸のコード領域のＧＣ含有量が、少なくとも約３５％、少なくとも約３６％、少なくとも約３７％、少なくとも約３８％、少なくとも約３９％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、または少なくとも約６０％である請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記標的ヌクレオチドが、前記コード領域内の３つ以上の連続したアデニンまたはチミンの１つである請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
コードされた哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現を真核宿主細胞において増強するように哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列をコードする第１核酸を改変する方法であって、請求項１から２５までのいずれか１つに記載の方法の前記ステップ群を含み、前記方法はさらに、
（ｃ）前記置換された非内因性核酸によりコードされた前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現の第１レベルを、前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドをコードする前記第１核酸または前記野生型核酸によりコードされた前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現の第２レベルと前記真核宿主細胞において比較するステップを含み、
前記第１核酸の前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現の前記第２レベルまたは前記野生型核酸の前記哺乳類受容体ポリペプチドの発現の前記第２レベルよりも、前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現の前記第１レベルが大きければ、それは、前記置換された非内因性核酸が、前記真核宿主細胞において前記コードされた哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現を増強することを示す方法。
【請求項２７】
前記比較が、受容体の機能性のレベルを測定することを含むプロセスによる請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記プロセスが、第２メッセンジャーのレベルの測定を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記プロセスが、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、環状ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）、イノシトール・トリホスフェート（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、Ｃａ２＋およびＭＡＰキナーゼ活性からなる群から選択された第２メッセンジャーのレベルの測定を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記プロセスが、細胞内ＩＰ３の蓄積のレベルの測定を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記プロセスが、細胞内ＩＰ３の蓄積の増加の測定を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記置換された非内因性核酸の細胞内ＩＰ３の蓄積の前記増加が、前記野生型核酸の細胞内ＩＰ３の蓄積の前記増加の、少なくとも約１３０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５００％、少なくとも約５５０％、少なくとも約６００％、少なくとも約６５０％、少なくとも約７００％、少なくとも約７５０％、少なくとも約８００％、少なくとも約８５０％、少なくとも約９００％、少なくとも約９５０％、または少なくとも約１０００％である請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記置換された非内因性核酸の細胞内ＩＰ３の蓄積の増加が、前記野生型核酸の細胞内ＩＰ３の蓄積の前記増加の、少なくとも約１３０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５００％、少なくとも約５５０％、少なくとも約６００％、少なくとも約６５０％、少なくとも約７００％、少なくとも約７５０％、少なくとも約８００％、少なくとも約８５０％、少なくとも約９００％、少なくとも約９５０％、または少なくとも約１０００％であれば、それは、前記置換された非内因性核酸が、前記コードされた哺乳類ＧＰＲ２２受容体の発現を増強していることを示す請求項３０〜３２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３４】
前記プロセスが、Ｇｑ（ｄｅｌ）/ＧｉキメラＧタンパク質を含む細胞における細胞内ＩＰ３蓄積の測定を含む請求項３０〜３３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３５】
前記プロセスが、細胞内のＣａ２＋レベルの測定を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記プロセスが、細胞内のｃＡＭＰのレベルの測定を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記プロセスが、細胞内のｃＡＭＰ蓄積の低減の測定を含む請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記置換された非内因性核酸の細胞内ｃＡＭＰ蓄積の前記低下が、前記野生型核酸の細胞内ｃＡＭＰ蓄積の前記低下の、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、または少なくとも約５．０倍である請求項３７の方法。
【請求項３９】
前記置換された非内因性核酸の細胞内ｃＡＭＰ蓄積の低下が、前記野生型核酸の細胞内ｃＡＭＰ蓄積の低下の、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、または少なくとも約５．０倍であれば、それは、前記置換された非内因性核酸が、前記コードされた哺乳類ＧＰＲ２２受容体の発現を増強していることを示す請求項３６〜３８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４０】
前記プロセスが、信号エンハンサーを含む細胞における細胞内ｃＡＭＰ蓄積の測定を含む請求項３６〜３９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４１】
前記比較が、定常状態ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現のレベルの測定を含むプロセスによるものである請求項２６に記載の方法。
【請求項４２】
前記比較が、定常状態ＧＰＲ２２受容体ｍＲＮＡの発現のレベルの測定を含むプロセスによるものである請求項２６に記載の方法。
【請求項４３】
哺乳類ＧＰＲ２２受容体をコードする置換された非内因性核酸を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記置換された非内因性核酸が請求項１〜４２のいずれか１つに記載の方法により産生される単離ポリヌクレオチド。
【請求項４４】
前記置換された非内因性核酸が配列番号３または配列番号７である請求項４３に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４５】
請求項４３または４４に記載の単離ポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４６】
前記ベクターが発現ベクターであり、前記ポリヌクレオチドがプロモーターに作動可能に連結されている請求項４５に記載のベクター。
【請求項４７】
請求項４５に記載のベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項４８】
請求項４６に記載のベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項４９】
組換え宿主細胞を産生する方法であって、
（ａ）請求項４６に記載の発現ベクターを真核宿主細胞内にトランスフェクトし、これによって、トランスフェクトされた宿主細胞を産生するステップ、および
（ｂ）前記発現ベクターから前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体を発現するのに十分な条件下で、前記トランスフェクトされた宿主細胞を培養するステップ、
を含む方法。
【請求項５０】
前記宿主細胞が哺乳類の細胞である請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記宿主細胞がメラノフォア細胞である請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記宿主細胞が酵母細胞である請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記置換された非内因性核酸が配列番号３または配列番号７である請求項４９〜５２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５４】
哺乳類ＧＰＲ２２受容体の調節剤として候補化合物を同定する方法であって、前記方法は
（ａ）前記候補化合物を、請求項４９〜５３のいずれか１つの方法によって産生された組換え宿主細胞またはＧタンパク質に連結した前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体を含む該細胞の膜と接触させるステップ、および
（ｂ）前記候補化合物が前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体の機能性を阻害または刺激する能力を判断するステップ、
を含み、
前記候補化合物が前記機能性を阻害または刺激する能力があればこれは、前記候補化合物が前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体の調節剤であることを示す方法。
【請求項５５】
前記Ｇタンパク質が、Ｇｉである請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記Ｇタンパク質が、Ｇｑ（ｄｅｌ）／ＧｉキメラＧタンパク質である請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記判断が第２メッセンジャーのレベルの測定を含むプロセスによるものである請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記判断が、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、環状ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）、イノシトール・トリホスフェート（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、Ｃａ２＋およびＭＡＰキナーゼ活性からなる群から選択された第２メッセンジャーのレベルの測定を含むプロセスによるものである請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
前記プロセスが細胞内ＩＰ３の蓄積のレベルの測定を含む請求項５８の方法。
【請求項６０】
前記プロセスが細胞内Ｃａ２＋レベルの測定を含む請求項５８の方法。
【請求項６１】
前記プロセスが、細胞内ｃＡＭＰのレベルの測定を含む請求項５８の方法。
【請求項６２】
前記方法が、前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体のアゴニスト、部分アゴニスト、インバース・アゴニストまたはアンタゴニストの同定を含む請求項５４〜６１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６３】
前記方法が、医薬品として前記アゴニスト、部分アゴニスト、インバース・アゴニストまたはアンタゴニストを処方するステップをさらに含む請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記方法が、前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体のアゴニストまたは部分アゴニストを同定することを含む請求項５４〜６１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６５】
前記方法が、医薬品として前記アゴニストまたは部分アゴニストを処方するステップをさらに含む請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記置換された非内因性核酸が、配列番号３または配列番号７である請求項５４〜６５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６７】
哺乳類ＧＰＲ２２受容体のリガンドとして候補化合物を同定する方法であって、前記方法が、
（ａ）前記候補化合物を、請求項４９〜５３のいずれか１つに記載の方法により産生された組換え宿主細胞または前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体を含む該細胞の膜と接触させるステップ、および
（ｂ）前記化合物が前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体に結合する能力を測定するステップを含み、
前記結合は前記候補化合物が前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体のリガンドであることを示している方法。
【請求項６８】
前記方法が、医薬品として前記リガンドを処方するステップをさらに含む請求項６７の方法。
【請求項６９】
前記置換された非内因性核酸が配列番号３または配列番号７である請求項６７または請求項６８の方法。
【請求項７０】
請求項４３に記載のポリヌクレオチドから発現されるヒトＧＰＲ２２受容体に対してトランスジェニックされた非ヒト哺乳類。
【請求項７１】
置換された非内因性核酸が配列番号３または配列番号７である、請求項７０に記載の非ヒト哺乳類。
【請求項７２】
候補化合物が哺乳類ＧＰＲ２２受容体に関連した疾患または障害を予防または処置する効果を有するかどうか同定するために請求項７０または７１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳類を用いる方法であって、前記方法が前記候補化合物を前記トランスジェニック非ヒト哺乳類に投与するステップを含む方法。
【請求項７３】
候補化合物が哺乳類の心保護または神経保護の効果を有するかどうか同定するために請求項７０または７１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳類を用いる方法であって、前記方法が前記候補化合物を前記トランスジェニック非ヒト哺乳類に投与するステップを含む方法。
【請求項７４】
前記候補化合物が前記ヒトＧＰＲ２２受容体の調節剤またはリガンドである、請求項７２または７３に記載の方法。
【請求項１】
コードされた哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現を真核宿主細胞において増強するために哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列をコードしている第１核酸を改変する方法であって、前記方法は、
（ａ）標的ヌクレオチドを含む前記第１核酸の前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体コード領域におけるコドンを同定するステップであって、前記標的ヌクレオチドは前記コドンによりコードされたアミノ酸を変更せずにグアニン、シトシンまたはチミンにより置換されうるアデニンであり、あるいは前記標的ヌクレオチドはコドンによりコードされたアミノ酸を変更せずにグアニン、シトシンまたはアデニンにより置換されうるチミンであるステップと、
（ｂ）前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列をコードする置換された非内因性の核酸を産生するために、アデニンである前記標的ヌクレオチドをグアニン、シトシンまたはチミンにより、またはチミンである前記標的ヌクレオチドをグアニン、シトシンまたはアデニンにより置換するステップとを含み、
前記置換された非内因性核酸の前記産生は前記真核宿主細胞における前記コードされた哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現を増強し、前記増強された発現とは前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドをコードしている前記第１核酸または野生型核酸との比較した上でのものである方法。
【請求項２】
アデニンである前記標的ヌクレオチド、チミンである前記標的ヌクレオチド、アデニンまたはチミンである前記標的ヌクレオチドが、グアニンまたはシトシンで置換される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列が、野生型哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記野生型哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列が、野生型ヒトＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記野生型哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列が、野生型ヒトＧＰＲ２２ Ｒ４２５またはＧＰＲ２２ Ｃ４２５アミノ酸配列である請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記野生型哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列が、配列番号２または配列番号６である請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記第１核酸が、野生型哺乳類ＧＰＲ２２受容体核酸である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１核酸が、野生型ヒトＧＰＲ２２受容体核酸である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第１核酸が、野生型ヒトＧＰＲ２２ Ｒ４２５またはＧＰＲ２２ Ｃ４２５核酸である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１核酸が、配列番号１または配列番号５である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記置換された非内因性核酸が、配列番号３または配列番号７である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドをコードしている前記野生型核酸が、野生型ヒトＧＰＲ２２受容体核酸である請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドをコードしている前記野生型核酸が、野生型ヒトＧＰＲ２２ Ｒ４２５またはＧＰＲ２２ Ｃ４２５核酸である請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドをコードしている前記野生型核酸が、配列番号１または配列番号５である請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記真核宿主細胞が、哺乳類の細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記真核宿主細胞が、メラノフォア細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記真核宿主細胞が、酵母細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｂ）が、同定されたコドンを含むあらゆる標的ヌクレオチドについて反復される請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ａ）〜（ｂ）が、一度反復される請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ａ）〜（ｂ）が、標的ヌクレオチドを含む前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列の前記コード領域のあらゆるコドンに至るまで反復される請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ａ）〜（ｂ）が反復され、これによって前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列の前記コード領域におけるすべてのコドンの少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％またはそれ以上が、置換された少なくとも１つの標的ヌクレオチドを有する請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ａ）〜（ｂ）が反復され、これによって標的ヌクレオチドを含む前記コード領域のコドンの少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％のアデニンまたはチミンがグアニンまたはシトシンで置換される請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ａ）〜（ｂ）が反復され、これによって前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列をコードする置換された非内因性核酸コード領域のＧＣ含有量が、前記哺乳類ＧＰＲ２２アミノ酸配列をコードする前記第１核酸のコード領域と比較すると、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、またはそれ以上増加する請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（ａ）〜（ｂ）が反復され、これによって前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列をコードする置換された非内因性核酸のコード領域のＧＣ含有量が、少なくとも約３５％、少なくとも約３６％、少なくとも約３７％、少なくとも約３８％、少なくとも約３９％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、または少なくとも約６０％である請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記標的ヌクレオチドが、前記コード領域内の３つ以上の連続したアデニンまたはチミンの１つである請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
コードされた哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現を真核宿主細胞において増強するように哺乳類ＧＰＲ２２受容体アミノ酸配列をコードする第１核酸を改変する方法であって、請求項１から２５までのいずれか１つに記載の方法の前記ステップ群を含み、前記方法はさらに、
（ｃ）前記置換された非内因性核酸によりコードされた前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現の第１レベルを、前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドをコードする前記第１核酸または前記野生型核酸によりコードされた前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現の第２レベルと前記真核宿主細胞において比較するステップを含み、
前記第１核酸の前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現の前記第２レベルまたは前記野生型核酸の前記哺乳類受容体ポリペプチドの発現の前記第２レベルよりも、前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現の前記第１レベルが大きければ、それは、前記置換された非内因性核酸が、前記真核宿主細胞において前記コードされた哺乳類ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現を増強することを示す方法。
【請求項２７】
前記比較が、受容体の機能性のレベルを測定することを含むプロセスによる請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記プロセスが、第２メッセンジャーのレベルの測定を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記プロセスが、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、環状ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）、イノシトール・トリホスフェート（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、Ｃａ２＋およびＭＡＰキナーゼ活性からなる群から選択された第２メッセンジャーのレベルの測定を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記プロセスが、細胞内ＩＰ３の蓄積のレベルの測定を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記プロセスが、細胞内ＩＰ３の蓄積の増加の測定を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記置換された非内因性核酸の細胞内ＩＰ３の蓄積の前記増加が、前記野生型核酸の細胞内ＩＰ３の蓄積の前記増加の、少なくとも約１３０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５００％、少なくとも約５５０％、少なくとも約６００％、少なくとも約６５０％、少なくとも約７００％、少なくとも約７５０％、少なくとも約８００％、少なくとも約８５０％、少なくとも約９００％、少なくとも約９５０％、または少なくとも約１０００％である請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記置換された非内因性核酸の細胞内ＩＰ３の蓄積の増加が、前記野生型核酸の細胞内ＩＰ３の蓄積の前記増加の、少なくとも約１３０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５００％、少なくとも約５５０％、少なくとも約６００％、少なくとも約６５０％、少なくとも約７００％、少なくとも約７５０％、少なくとも約８００％、少なくとも約８５０％、少なくとも約９００％、少なくとも約９５０％、または少なくとも約１０００％であれば、それは、前記置換された非内因性核酸が、前記コードされた哺乳類ＧＰＲ２２受容体の発現を増強していることを示す請求項３０〜３２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３４】
前記プロセスが、Ｇｑ（ｄｅｌ）/ＧｉキメラＧタンパク質を含む細胞における細胞内ＩＰ３蓄積の測定を含む請求項３０〜３３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３５】
前記プロセスが、細胞内のＣａ２＋レベルの測定を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記プロセスが、細胞内のｃＡＭＰのレベルの測定を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記プロセスが、細胞内のｃＡＭＰ蓄積の低減の測定を含む請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記置換された非内因性核酸の細胞内ｃＡＭＰ蓄積の前記低下が、前記野生型核酸の細胞内ｃＡＭＰ蓄積の前記低下の、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、または少なくとも約５．０倍である請求項３７の方法。
【請求項３９】
前記置換された非内因性核酸の細胞内ｃＡＭＰ蓄積の低下が、前記野生型核酸の細胞内ｃＡＭＰ蓄積の低下の、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、または少なくとも約５．０倍であれば、それは、前記置換された非内因性核酸が、前記コードされた哺乳類ＧＰＲ２２受容体の発現を増強していることを示す請求項３６〜３８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４０】
前記プロセスが、信号エンハンサーを含む細胞における細胞内ｃＡＭＰ蓄積の測定を含む請求項３６〜３９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４１】
前記比較が、定常状態ＧＰＲ２２受容体ポリペプチドの発現のレベルの測定を含むプロセスによるものである請求項２６に記載の方法。
【請求項４２】
前記比較が、定常状態ＧＰＲ２２受容体ｍＲＮＡの発現のレベルの測定を含むプロセスによるものである請求項２６に記載の方法。
【請求項４３】
哺乳類ＧＰＲ２２受容体をコードする置換された非内因性核酸を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記置換された非内因性核酸が請求項１〜４２のいずれか１つに記載の方法により産生される単離ポリヌクレオチド。
【請求項４４】
前記置換された非内因性核酸が配列番号３または配列番号７である請求項４３に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４５】
請求項４３または４４に記載の単離ポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４６】
前記ベクターが発現ベクターであり、前記ポリヌクレオチドがプロモーターに作動可能に連結されている請求項４５に記載のベクター。
【請求項４７】
請求項４５に記載のベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項４８】
請求項４６に記載のベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項４９】
組換え宿主細胞を産生する方法であって、
（ａ）請求項４６に記載の発現ベクターを真核宿主細胞内にトランスフェクトし、これによって、トランスフェクトされた宿主細胞を産生するステップ、および
（ｂ）前記発現ベクターから前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体を発現するのに十分な条件下で、前記トランスフェクトされた宿主細胞を培養するステップ、
を含む方法。
【請求項５０】
前記宿主細胞が哺乳類の細胞である請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記宿主細胞がメラノフォア細胞である請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記宿主細胞が酵母細胞である請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記置換された非内因性核酸が配列番号３または配列番号７である請求項４９〜５２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５４】
哺乳類ＧＰＲ２２受容体の調節剤として候補化合物を同定する方法であって、前記方法は
（ａ）前記候補化合物を、請求項４９〜５３のいずれか１つの方法によって産生された組換え宿主細胞またはＧタンパク質に連結した前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体を含む該細胞の膜と接触させるステップ、および
（ｂ）前記候補化合物が前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体の機能性を阻害または刺激する能力を判断するステップ、
を含み、
前記候補化合物が前記機能性を阻害または刺激する能力があればこれは、前記候補化合物が前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体の調節剤であることを示す方法。
【請求項５５】
前記Ｇタンパク質が、Ｇｉである請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記Ｇタンパク質が、Ｇｑ（ｄｅｌ）／ＧｉキメラＧタンパク質である請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記判断が第２メッセンジャーのレベルの測定を含むプロセスによるものである請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記判断が、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、環状ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）、イノシトール・トリホスフェート（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、Ｃａ２＋およびＭＡＰキナーゼ活性からなる群から選択された第２メッセンジャーのレベルの測定を含むプロセスによるものである請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
前記プロセスが細胞内ＩＰ３の蓄積のレベルの測定を含む請求項５８の方法。
【請求項６０】
前記プロセスが細胞内Ｃａ２＋レベルの測定を含む請求項５８の方法。
【請求項６１】
前記プロセスが、細胞内ｃＡＭＰのレベルの測定を含む請求項５８の方法。
【請求項６２】
前記方法が、前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体のアゴニスト、部分アゴニスト、インバース・アゴニストまたはアンタゴニストの同定を含む請求項５４〜６１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６３】
前記方法が、医薬品として前記アゴニスト、部分アゴニスト、インバース・アゴニストまたはアンタゴニストを処方するステップをさらに含む請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記方法が、前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体のアゴニストまたは部分アゴニストを同定することを含む請求項５４〜６１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６５】
前記方法が、医薬品として前記アゴニストまたは部分アゴニストを処方するステップをさらに含む請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記置換された非内因性核酸が、配列番号３または配列番号７である請求項５４〜６５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６７】
哺乳類ＧＰＲ２２受容体のリガンドとして候補化合物を同定する方法であって、前記方法が、
（ａ）前記候補化合物を、請求項４９〜５３のいずれか１つに記載の方法により産生された組換え宿主細胞または前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体を含む該細胞の膜と接触させるステップ、および
（ｂ）前記化合物が前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体に結合する能力を測定するステップを含み、
前記結合は前記候補化合物が前記哺乳類ＧＰＲ２２受容体のリガンドであることを示している方法。
【請求項６８】
前記方法が、医薬品として前記リガンドを処方するステップをさらに含む請求項６７の方法。
【請求項６９】
前記置換された非内因性核酸が配列番号３または配列番号７である請求項６７または請求項６８の方法。
【請求項７０】
請求項４３に記載のポリヌクレオチドから発現されるヒトＧＰＲ２２受容体に対してトランスジェニックされた非ヒト哺乳類。
【請求項７１】
置換された非内因性核酸が配列番号３または配列番号７である、請求項７０に記載の非ヒト哺乳類。
【請求項７２】
候補化合物が哺乳類ＧＰＲ２２受容体に関連した疾患または障害を予防または処置する効果を有するかどうか同定するために請求項７０または７１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳類を用いる方法であって、前記方法が前記候補化合物を前記トランスジェニック非ヒト哺乳類に投与するステップを含む方法。
【請求項７３】
候補化合物が哺乳類の心保護または神経保護の効果を有するかどうか同定するために請求項７０または７１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳類を用いる方法であって、前記方法が前記候補化合物を前記トランスジェニック非ヒト哺乳類に投与するステップを含む方法。
【請求項７４】
前記候補化合物が前記ヒトＧＰＲ２２受容体の調節剤またはリガンドである、請求項７２または７３に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００９−５１１０６３（Ｐ２００９−５１１０６３Ａ）
【公表日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３５７４６（Ｐ２００８−５３５７４６）
【出願日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４０２２６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０４７５２０
【国際公開日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【出願人】（５００４７８０９７）アリーナ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (97)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４０２２６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０４７５２０
【国際公開日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【出願人】（５００４７８０９７）アリーナ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (97)
【Ｆターム（参考）】
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