ＨＩＦ−１ａ発現阻害のための強力なＬＮＡオリゴヌクレオチド
【課題】ＨＩＦ−１ａの発現調節のための組成物と方法の提供。
【解決手段】大文字がβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログ、小文字が２−デオキシヌクレオチド、下線がβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログ又は２−デオキシヌクレオチド、下付き文字「ｓ」が隣接するヌクレオチドとＬＮＡヌクレオチドアナログ又は２−デオキシヌクレオチド間のホスホロチオエート結合、下付き文字「ｘ」が隣接するヌクレオチドとＬＮＡヌクレオチドアナログ又は２−デオキシヌクレオチド間のホスホロチオエート結合又はホスホロジエステル結合を指定し、配列が任意で２−デオキシヌクレオチドの５ユニットまで延長される、５’−（Ｔｘ）ＧｘＧｘｃｓａｓａｓｇｓｃｓａｓｔｓｃｓｃｓＴｘＧｘＴ−３’と５’−（Ｇｘ）ＴｘＴｘａｓｃｓｔｓｇｓｃｓｃｓｔｓｔｓｃｓＴｘＴｘＡ−３’からなる群から選択される配列からなるＬＮＡオリゴヌクレオチドに関する。
【解決手段】大文字がβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログ、小文字が２−デオキシヌクレオチド、下線がβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログ又は２−デオキシヌクレオチド、下付き文字「ｓ」が隣接するヌクレオチドとＬＮＡヌクレオチドアナログ又は２−デオキシヌクレオチド間のホスホロチオエート結合、下付き文字「ｘ」が隣接するヌクレオチドとＬＮＡヌクレオチドアナログ又は２−デオキシヌクレオチド間のホスホロチオエート結合又はホスホロジエステル結合を指定し、配列が任意で２−デオキシヌクレオチドの５ユニットまで延長される、５’−（Ｔｘ）ＧｘＧｘｃｓａｓａｓｇｓｃｓａｓｔｓｃｓｃｓＴｘＧｘＴ−３’と５’−（Ｇｘ）ＴｘＴｘａｓｃｓｔｓｇｓｃｓｃｓｔｓｔｓｃｓＴｘＴｘＡ−３’からなる群から選択される配列からなるＬＮＡオリゴヌクレオチドに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ＨＩＦ−１ａの発現調節のための組成物と方法を提供する。特に本発明は、ＨＩＦ−１ａをコードする核酸に特異的にハイブリダイズ可能なＬＮＡオリゴヌクレオチドに関する。ＬＮＡオリゴヌクレオチドはＨＩＦ−１ａの発現を調節することが示されており、その医薬的な製剤と癌疾患、炎症性疾患、および眼疾患の治療としての使用を開示する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
固形腫瘍は数ミリメートル以上に成長するために、血液供給を確立し、グルコース代謝を増強していなければならない。固形腫瘍がどのように低酸素を感知し、低酸素誘導性遺伝子の活性化と血液系を確立するために血管新生因子の分泌に反応するかは、癌生物学の中心を成している。多くの腫瘍は、悪性化、転移、放射線療法と化学療法への耐性に関与した低酸素微小環境を含んでいる。
【０００３】
低酸素誘導性因子−１（ＨＩＦ−１）の発見は、低酸素誘導性遺伝子の調節に関する識見をもたらした（特許文献１、ならびに、特許文献２および特許文献３）。ＨＩＦ−１は二つのサブユニット、ＨＩＦ−１ａ（ＨＩＦ−１アルファ、ここでは「ＨＩＦ−１ａ」と称する）とＨＩＦ−１βからなり、ＶＥＧＥなどの血管新生因子ならびに解糖酵素およびグルコース輸送体１、グルコース輸送体３（ＧＬＵ−１と３）などの解糖関連タンパク質をコードする遺伝子のエンハンサー中の−１低酸素反応配列（ＨＲＥ）と結合する。
【０００４】
ＨＩＦ−１ａアンチセンスプラスミドの腫瘍内遺伝子導入によるＨＩＦ−１ａの遺伝子組み換えによる下方調節は、ＶＥＧＡの下方調節と腫瘍微小血管密度の減少を引き起こすことが示されている（特許文献４、非特許文献１）。そのプラスミドは、ＨＩＦ−１ａの５’−末端をコードする３２０ｂｐのｃＤＮＡ断片を含んでいた（ヌクレオチド１５２〜４５４、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＡＦ００３６９８）。
【０００５】
特許文献５は、ヒトＨＩＦ−１ａの発現を下方調節するＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを示している。一つの化合物は、ＣＵＲ８１３（配列番号１１）と名付けられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，８８２，９１４号明細書
【特許文献２】国際公開第９６／３９４２６号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９９／４８９１６号パンフレット
【特許文献４】国際公開第００／７６４９７号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００３／０８５１１０号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｕｎ Ｘ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００１）８，６３８−６４５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ＣＵＲ８１３（配列番号１１）よりもさらに強力なＬＮＡオリゴヌクレオチドを開示した。また、本発明によると、特異的なＬＮＡオリゴヌクレオチドはアポトーシスを誘導し、増殖を阻害する。さらに、マウスＨＩＦ−１ａと１００％同一な配列を有するＬＮＡオリゴヌクレオチドは、マウスにおいて肝臓、結腸、腎臓でＨＩＦ−１ａの発現を下方調節する。
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、ＨＩＦ−１ａの発現調節のための組成物と方法を提供する。特に本発明は、二つ以上の特異的なモチーフがＨＩＦ−１ａを標的としているＬＮＡオリゴヌクレオチドに関する。これらのモチーフは、配列番号３と４として開示される。特に好ましいＬＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１と配列番号２である。本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチドは、ＨＩＦ−１αｍＲＮＡの発現とタンパク質レベルの強力な阻害剤である。
【００１０】
より具体的には、本発明は
５’−（Ｔｘ）ＧｘＧｘｃｓａｓａｓｇｓｃｓａｓｔｓｃｓｃｓＴｘＧｘＴ−３’（配列番号３）
および
５’−（Ｇｘ）ＴｘＴｘａｓｃｓｔｓｇｓｃｓｃｓｔｓｔｓｃｓＴｘＴｘＡ−３’（配列番号４）
からなる群から選択される配列からなるＬＮＡオリゴヌクレオチドを提供し、
ここで、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログを示し、小文字は２−デオキシヌクレオチドを示し、下線はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログまたは２−デオキシヌクレオチドのいずれかを示し、下付き文字「ｓ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、下付き文字「ｘ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合のいずれかを示し、括弧内のヌクレオチドユニット、（Ｔｘ）、（Ｔ）、または（Ｇｘ）、（Ａ）はそれぞれ任意のユニットを表し、また、
ここで、配列は任意で２−デオキシヌクレオチド５ユニットまで延長される。
【００１１】
本発明のＬＮＡヌクレオチドを含む薬学的組成物も提供される。さらに提供されるのは、細胞または組織と一つ以上のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは本発明の組成物との接触を包含する、細胞内または組織内のＨＩＦ−１ａの発現調節の方法である。また、開示されるのは、医薬的または予防的な有効量の一つ以上のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは発明の組成物の投与によるＨＩＦ−１ａの発現と関連した疾患または状態の傾向を経験している、またはその傾向にあると疑われる動物またはヒトの治療方法である。さらに、ＨＩＦ−１ａの発現阻害のための、およびＨＩＦ−１ａの活性と関連した疾患治療のためのＬＮＡオリゴヌクレオチドの使用方法を提供する。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
ＬＮＡオリゴヌクレオチドであって、
５’−（Ｔｘ）ＧｘＧｘｃｓａｓａｓｇｓｃｓａｓｔｓｃｓｃｓＴｘＧｘ（Ｔ）−３’（配列番号３）および
５’−（Ｇｘ）ＴｘＴｘａｓｃｓｔｓｇｓｃｓｃｓｔｓｔｓｃｓＴｘＴｘ（Ａ）−３’（配列番号４）
からなる群から選択される配列からなり、
ここで、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログを示し、小文字は２−デオキシヌクレオチドを示し、下線はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログまたは２−デオキシヌクレオチドのいずれかを示し、下付き文字「ｓ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、下付き文字「ｘ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合のいずれかを示し、括弧内のヌクレオチドユニットは、任意のユニットを表し、ここで、該配列は、５個の２−デオキシヌクレオチドユニットまで必要に応じて延長される、ＬＮＡオリゴヌクレオチド。
（項目２）
前記括弧内のヌクレオチドユニット（Ｔｘ）または（Ｇｘ）がそれぞれ存在する、項目１に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチド。
（項目３）
前記下線のヌクレオチドユニットが、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログを示す、項目１および２のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチド。
（項目４）
前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドが、２−デオキシヌクレオチドおよびβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログから選択される１５、１６、１７、１８、１９または２０個のヌクレオチドユニットからなる、項目１〜３のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチド。
（項目５）
前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドが、２−デオキシヌクレオチドおよびβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログから選択される１６個のヌクレオチドユニットからなる、項目４に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチド。
（項目６）
前記配列が、３’末端において、１個の２−デオキシヌクレオチドユニットにより延長されている、項目１〜５のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチド。
（項目７）
前記配列における全てのヌクレオチドユニットが、ホスホロチオエート基によって結合されている、項目１〜６のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチド。
（項目８）
項目１に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドであって、
５’−ＴｓＧｓＧｓｃｓａｓａｓｇｓｃｓａｓｔｓｃｓｃｓＴｓＧｓＴｓａ−３’（配列番号１）
５’−ＴｓＧｓＧｓｃｓａｓａｓｇｓｃｓａｓｔｓｃｓｃｓＴｓＧｓＴ−３’（配列番号１５）、および
５’−ＧｓＧｓｃｓａｓａｓｇｓｃｓａｓｔｓｃｓｃｓＴｓＧｓｔ−３’（配列番号１６）
からなる群から選択される、ＬＮＡオリゴヌクレオチド。
（項目９）
項目８に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドであって、
５’−ＴｓＧｓＧｓｃｓａｓａｓｇｓｃｓａｓｔｓｃｓｃｓＴｓＧｓＴｓａ−３’（配列番号１）である、ＬＮＡオリゴヌクレオチド。
（項目１０）
項目１に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドであって、
５’−ＧｓＴｓＴｓａｓｃｓｔｓｇｓｃｓｃｓｔｓｔｓｃｓＴｓＴｓＡｓｃ−３’（配列番号２）
５’−ＧｓＴｓＴｓａｓｃｓｔｓｇｓｃｓｃｓｔｓｔｓｃｓＴｓＴｓＡ−３’（配列番号１７）、および
５’−ＴｓＴｓａｓｃｓｔｓｇｓｃｓｃｓｔｓｔｓｃｓＴｓＴｓａ−３’（配列番号１８）
からなる群から選択される、ＬＮＡオリゴヌクレオチド。
（項目１１）
項目１０に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドであって、
５’−ＧｓＴｓＴｓａｓｃｓｔｓｇｓｃｓｃｓｔｓｔｓｃｓＴｓＴｓＡｓｃ−３’（配列番号２）である、ＬＮＡオリゴヌクレオチド。
（項目１２）
結合体であって、項目１〜１１のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチド、および該ＬＮＡオリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも一つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分を含む、結合体。
（項目１３）
項目１〜１１のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは項目１２に記載の結合体と、薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはアジュバントとを含む、薬学的組成物。
（項目１４）
水性キャリアを含む、項目１３に記載の薬学的組成物であって、該キャリアが、ｐＨを４．０〜８．５の範囲に維持するための緩衝液を含み、かつ２０〜２０００ｍＭのイオン強度を有する、薬学的組成物。
（項目１５）
眼内投与に適合した、項目１３〜１４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
（項目１６）
少なくとも一つの化学療法剤をさらに含む、項目１３〜１５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
（項目１７）
医薬として使用するための、項目１〜１１のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは項目１２に記載の結合体。
（項目１８）
癌の処置のための医薬の製造のための、項目１〜１１のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは項目１２に記載の結合体の使用。
（項目１９）
前記癌が固形腫瘍の形態にある、項目１８に記載の使用。
（項目２０）
前記癌が、多発性骨髄腫、腎臓癌、子宮頸癌、結腸癌、脳の癌、および乳癌からなる群から選択される、項目１８に記載の使用。
（項目２１）
癌を処置するための方法であって、項目１〜１１のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは項目１２に記載の結合体または項目１３〜１６のいずれか一項に記載の薬学的組成物を、それを必要とする患者へと投与する工程を包含する、方法。
（項目２２）
前記癌が、多発性骨髄腫、腎臓癌、子宮頸癌、結腸癌、脳の癌、および乳癌からなる群から選択される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
アテローム性動脈硬化症、乾癬、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、関節リウマチ、ぜんそく、炎症性腸疾患、いぼ、アレルギー性皮膚炎、炎症、および皮膚炎からなる群から選択される疾患を処置するための医薬の製造のための、項目１〜１１のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは項目１２に記載の結合体の使用。
（項目２４）
前記疾患が、炎症性腸疾患、乾癬および関節リウマチからなる群から選択される、項目２３に記載の使用。
（項目２５）
アテローム性動脈硬化症、乾癬、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、関節リウマチ、ぜんそく、炎症性腸疾患、いぼ、アレルギー性皮膚炎、炎症、および皮膚炎からなる群から選択される疾患を処置するための方法であって、項目１〜１１のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは項目１２に記載の結合体または項目１３〜１６のいずれか一項に記載の薬学的組成物をそれを必要とする患者へと投与する工程を包含する、方法。
（項目２６）
前記疾患が、炎症性腸疾患、乾癬および関節リウマチから選択される、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
異常な新脈管形成によって引き起こされる疾患を患っているかまたは該疾患に罹患しやすい哺乳動物を処置するための方法であって、治療有効量の項目１〜１１のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは項目１２に記載の結合体を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目２８）
新脈管形成を阻害する方法であって、項目１〜１１のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは項目１２に記載の結合体または項目１３〜１６のいずれか一項に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目２９）
細胞のアポトーシスを誘導する方法であって、項目１〜１１のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは項目１２に記載の結合体または項目１３〜１６のいずれか一項に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目３０）
細胞増殖を予防する方法であって、項目１〜１１のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは項目１２に記載の結合体または項目１３〜１６のいずれか一項に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目３１）
新脈管形成疾患の処置方法であって、新脈管形成疾患に関連した新脈管形成が阻害されるように、項目１〜１１のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは項目１２に記載の結合体または項目１３〜１６のいずれか一項に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目３２）
前記新脈管形成疾患が、糖尿病性網膜症、黄斑変性症および炎症性疾患からなる群から選択される、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記新脈管形成疾患が、炎症性腸疾患、乾癬および関節リウマチから選択される炎症性疾患である、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記新脈管形成疾患が、黄斑変性症および糖尿病性網膜症である、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
キットであって、
（ａ）固形形態の項目１〜１１のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは項目１２に記載の結合体を含む第一の構成要素、および
（ｂ）該ＬＮＡオリゴヌクレオチドの再構成に適した食塩水または緩衝液を含む第二の構成要素
を備える、キット。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】図１Ａは、ラットの血漿（ＮｔａｃＳＤオス、ヘパリンリチウム（Ｔａｃｏｎｉｃ，Ｍ＆Ｂ））における、配列番号６と比較して上昇した配列番号１と配列番号５の安定性を示す。オリゴヌクレオチドを２０μＭの濃度で、３７℃で０、４、または２４時間インキュベートした。配列番号１の分解断片は２４時間消化後でさえも検出されなかった。
【図１Ｂ】図１Ｂは、全長の配列番号１とホスホロチオエートで配列番号１と同じ配列の配列番号１３のラットとヒトの血清中の安定性を示す。オリゴヌクレオチドを、終濃度２０μＭでヒトまたはラットの血清に加えた。図は、ヒトとラット血清それぞれにおける３７℃でのＬＮＡオリゴヌクレオチドの１−９６時間までの安定性を示す。ラットの血清では、図１Ｂの最後から二つめのパネルは、４８時間後と９６時間後でもなお持続的な酵素活性を示している。最後のパネルは、血漿を添加せずに３７℃でインキュベートした際に、配列番号１と配列番号１３が分解していないことを示すネガティブコントロールである。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ヒトとラットの血漿における配列番号１の極めて長い安定性を示す。オリゴヌクレオチドをヒトまたはラットの血漿中で１〜９６時間インキュベートし、変性ゲルで泳動した。ＳｙＢｒゴールドで染色後、全長の産物量をホスホイメージャーで測定し、時間に対してプロットした。
【図２Ａ】図２Ａは、ＬＮＡオリゴヌクレオチドを導入したＵ３７３細胞におけるＨＩＦ−１ａタンパク質の下方調節を示す。２ｎＭまたは１０ｎＭの化合物を導入したＵ３７３細胞または偽導入細胞を低酸素でインキュベートし、ＨＩＦ−１ａタンパク質の下方調節をウェスタンブロットで解析した。均等なローディングのコントロールとしてチューブリンの発現を解析した。
【図２Ｂ】図２Ｂは、Ｕ３７３グリア芽細胞腫癌細胞株における配列番号１で処理した後のＨＩＦ−１αタンパク質の下方調節を示す。均等なローディングのコントロールとして汎アクチンの発現を解析した。細胞を０．２、１、および１０ｎＭの配列番号１、または配列番号１０に対して２ｂｐ ｍｍである配列番号１を導入した。下段のパネルは、ゲルの定量結果である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、Ｕ３７３細胞におけるＨＩＦ−１ａを標的とするＬＮＡオリゴヌクレオチド、配列番号１、およびスクランブルしたコントロールオリゴヌクレオチドを含むＬＮＡ、配列番号８で処理した２４時間後のＨＩＦ−１ａタンパク質の下方調節を示す。ＨＩＦの発現は、ＧＡＰＤＨかβ−アクチンと関連づけられ、また非形質導入のコントロール（模擬物）と関連した。ＲＮＡ精製の後、ｍＲＮＡ発現はＱＰＣＲで定量された。
【図３Ａ】図３Ａは、グリア芽細胞腫細胞株Ｕ３７３の正常酸素圧と低酸素圧においてＬＮＡオリゴヌクレオチドで処理した２４〜７２時間後に誘導されたカスパーゼ３／７活性の動態特性として測定したアポトーシスの誘導を示す。配列番号１は、早期アポトーシスの強力な誘導因子であることが示されている。
【図３Ｂ】図３Ｂは、グリア芽細胞腫細胞株Ｕ３７３の正常酸素圧と低酸素圧においてＬＮＡオリゴヌクレオチドで処理した２４〜７２時間後に誘導されたカスパーゼ３／７活性の動態特性として測定したアポトーシスの誘導を示す。配列番号１は、早期アポトーシスの強力な誘導因子であることが示されている。
【図４Ａ】図４Ａ：早期アポトーシス細胞段階の誘導を、４８時間後にアネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびＰＩフローサイトメトリー解析で測定した。ＬＮＡオリゴヌクレオチド配列番号１で処理したＵ３７３細胞は、模擬物と配列番号１２で処理した細胞と比較して、より「早期アポトーシス的」であると分類された。
【図４Ｂ】図４Ｂ：Ｕ３７３細胞における配列番号１で処理した後の早期アポトーシス誘導の定量。様々なステージにおける配列番号１で処理した４８時間後早期アポトーシスが誘導された細胞のパーセンテージ。配列番号１、または二つの異なるスクランブルコントロールオリゴヌクレオチド、配列番号８と配列番号１２をＵ３７３細胞に導入した。細胞を回収し、アネキシンＶ抗体とＰＩでインキュベーション後、早期アポトーシスの細胞数をフローサイトメトリーで計数した。
【図５Ａ】図５Ａは、化合物を導入したグリア芽細胞腫細胞株Ｕ３７３の導入と低酸素圧または正常酸素圧でのインキュベーション２４〜７２時間後を示す。ＭＴＳアッセイで測定した場合に配列番号１が増殖の強力な阻害因子であることが示されている。
【図５Ｂ】図５Ｂは、化合物を導入したグリア芽細胞腫細胞株Ｕ３７３の導入と低酸素圧または正常酸素圧でのインキュベーション２４〜７２時間後を示す。ＭＴＳアッセイで測定した場合に配列番号１が増殖の強力な阻害因子であることが示されている。
【図６Ａ】図６Ａは、配列番号１を用いた二つの投与計画のインビボでの内因性の肝臓標的の下方調節を示す。下流標的のＶＥＧＦだけでなくＨＩＦ−１αのｍＲＮＡレベルの測定は配列番号１が上記標的の効果的な阻害因子であることを示している。図６Ａ：有毛マウス腹腔内への１４日間連日注入。
【図６Ｂ】図６Ｂは、配列番号１を用いた二つの投与計画のインビボでの内因性の肝臓標的の下方調節を示す。下流標的のＶＥＧＦだけでなくＨＩＦ−１αのｍＲＮＡレベルの測定は配列番号１が上記標的の効果的な阻害因子であることを示している。図６Ｂ：有毛マウス腹腔内への１４日間週二日注入。
【図６Ｃ】図６Ｃは、配列番号１を有毛マウス腹腔内への１４日間連日注入後のインビボでの内因性の腎臓ＨＩＦ−１αの下方調節を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、配列番号１投与後の肝臓におけるインビボでのＨＩＦ−１ａ発現の下方調節で測定した場合、配列番号１が有力な阻害因子であることを示す。チオール化した様々な種類の配列番号１（配列番号５と配列番号６）および配列番号１をそれぞれ有毛マウスに１８または３．６ｍｇ／ｋｇで１４日間毎日投与し、屠殺した。ＨＩＦ−１ａの発現は、ＱＰＣＲを用いてｍＲＮＡレベルで測定し、材料および方法に記載の通りにβ−アクチンに対して正規化した。
【図７Ｂ】図７Ｂは、配列番号１投与後にインビボでの肝臓におけるＨＩＦ−１ａの下方調節で測定した場合、配列番号１が有力な阻害因子であることを示す。配列番号１の種々のチオール化物（配列番号５および配列番号６）および配列番号１をそれぞれ有毛マウスに５０、１０または２ｍｇ／ｋｇで１４日間週２回投与し、屠殺した。ＨＩＦ−１ａの発現は、ＱＰＣＲを用いてｍＲＮＡレベルで測定し、β−アクチンに対して正規化した。
【図７Ｃ】図７Ｃは配列番号１投与後の腎臓におけるＨＩＦ−１ａのインビボ発現の下方調節を示す。チオール化した様々な種類の配列番号１（配列番号５と配列番号６）および配列番号１をそれぞれ有毛マウスに１８または３．６ｍｇ／ｋｇで１４日間毎日投与し、屠殺した。ＨＩＦ−１ａの発現は、ＱＰＣＲを用いてｍＲＮＡレベルで測定し、β−アクチンに対して正規化した。
【図８Ａ】図８Ａは、異種移植片由来のＵ３７３腫瘍の腫瘍重量で測定した場合、配列番号１１と配列番号１２（スクランブルコントロール）と比較して配列番号１を用いた際のインビボ有効性の優位性を示す。子宮にＵ３７３異種移植片を移植したマウスに配列番号１、配列番号１１および配列番号１２を５０ｍｇ／ｋｇで週２回、１週間投与した。最後の投与から２日後に動物を屠殺した。屠殺時に腫瘍の重量を測り、個別の腫瘍重量と平均腫瘍重量（赤）を計算してプロットした。コントロール群（スクランブルコントロール、配列番号１２）と配列番号１で処置したマウス間に統計的に有意な差（Ｐ＝０．００５）が見いだされた。
【図８Ｂ】図８Ｂは、配列番号１で処置した異種移植片由来のＵ３７３腫瘍の血管密度を示す。子宮にＵ３７３異種移植片を移植したマウスに配列番号１を５０ｍｇ／ｋｇで週２回、１週間投与した。最後の投与から２日後に動物を屠殺した。血管密度は、ＣＤ３１染色後に算出され、全体面積に関連していた。生理食塩水群とスクランブルコントロール（配列番号１２）で処置したマウス間に統計的に有意な差（Ｐ＝０．００５）が見いだされた。
【図８Ｃ】図８Ｃは、図８Ｂで記載の子宮に移植し、配列番号１で処置したＵ３７３腫瘍の切片のＣＤ３１染色を示す。
【図８Ｄ】図８Ｄは、図８Ｂで記載の子宮に移植し、配列番号１、配列番号１１、配列番号１２およびＰＢＤで処置したＵ３７３腫瘍における、リアルタイムＰＣＲで定量しＧＡＰＤＨで正規化したＨＩＦ１−ａ発現を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、有毛マウスでの２５ｍｇ／ｋｇの配列番号１の１回の静脈内投与後のインビボでの取り込み（組織グラム当たりμｇ）と標的の下方調節（β−アクチンの発現に対して修正したＨＩＦ−１ａ ｍＲＮＡ発現の阻害％）を示す。配列番号１の半減期は、腎臓で約４６時間、肝臓で６６時間である。
【図９Ｂ】図９Ｂの上段のパネルは、有毛マウスでの５０ｍｇ／ｋｇで１回の静脈内投与した配列番号１を示す。動物５匹を５０ｍｇ／ｋｇの配列番号１で処置し、処置した１、３、４、５、８日後に屠殺し、ＨＩＦ−１ａの発現を解析してβ−アクチンに対して正規化した。ＨＩＦ−１ａの発現は、ＱＰＣＲを用いてｍＲＮＡレベルで測定し、実施例の８で記載のβ−アクチンに対して正規化した。下段のパネルでは、配列番号１を２５または５０ｍｇ／ｋｇで有毛マウスに１回静脈内投与した。２５または５０ｍｇ／ｋｇの配列番号１で処置した動物５匹を処置の１、２、３、４、５、８日後に屠殺し、実施例１３で記載のＨＰＬＣ法で全長配列番号１を解析した。データは、μｇ 配列番号１／ｇ組織で表現している。
【図９Ｃ】図９Ｃは、リアルタイムＰＣＲで定量しＧＡＰＤＨで正規化した、５０ｍｇ／ｋｇの配列番号１と配列番号１６を腹腔内に１回投与し、１日目と１０日目に屠殺したマウスのマウス肝臓におけるＨＩＦ−１ａ発現を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、２５ｍｇ／ｋｇを７日間投与し、最後の投与の１日後または５日後に屠殺した異種移植マウスにおける配列番号１のＨＩＦ−１ａ発現阻害作用の期間を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ｆａｍでラベルした配列番号１（配列番号７）２５ｍｇ／ｋｇ／日を７日間の肝臓、皮膚腫瘍および腎臓のインビボにおける取り込みを示し、最後の処置の５日後に屠殺した。
【図１０Ｃ−１】図１０Ｃ（図１０Ｃ−１および図１０Ｃ−２）は、実施例１７で記載の、移植の７、１０、１３、１７日後に５ｍｇ／ｋｇ／日の配列番号７、スクランブルコントロールの配列番号２０、または生理食塩水で腹腔内処理した異種移植マウスの肝臓における標的の下方調節（ＧＡＰＤＨの発現と関連づけたＨＩＦ−１ａ ｍＲＮＡ発現の阻害％）と配列番号７のインビボでの取り込み（組織グラム当たりμｇ）を示す。
【図１０Ｃ−２】図１０Ｃ（図１０Ｃ−１および図１０Ｃ−２）は、実施例１７で記載の、移植の７、１０、１３、１７日後に５ｍｇ／ｋｇ／日の配列番号７、スクランブルコントロールの配列番号２０、または生理食塩水で腹腔内処理した異種移植マウスの肝臓における標的の下方調節（ＧＡＰＤＨの発現と関連づけたＨＩＦ−１ａ ｍＲＮＡ発現の阻害％）と配列番号７のインビボでの取り込み（組織グラム当たりμｇ）を示す。
【図１０Ｄ−１】図１０Ｄ（図１０Ｄ−１および図１０Ｄ−２）は、実施例１７で記載の処置したマウスの結腸における、配列番号７、スクランブルコントロールの配列番号２０で処置した後の標的の下方調節（β−アクチンの発現と関連づけたＨＩＦ−１ａ ｍＲＮＡ発現の阻害％）と配列番号７のインビボでの取り込み（組織グラム当たりμｇ）を示す。
【図１０Ｄ−２】図１０Ｄ（図１０Ｄ−１および図１０Ｄ−２）は、実施例１７で記載の処置したマウスの結腸における、配列番号７、スクランブルコントロールの配列番号２０で処置した後の標的の下方調節（β−アクチンの発現と関連づけたＨＩＦ−１ａ ｍＲＮＡ発現の阻害％）と配列番号７のインビボでの取り込み（組織グラム当たりμｇ）を示す。
【図１０Ｅ】図１０Ｅは、実施例１７で記載の処置したＨＴ２９とＰＣ３異種移植腫瘍における配列番号７のインビボでの取り込み（組織グラム当たりμｇ）を示す。
【図１１】図１１は、配列番号１を３０ｍｇ／ｋｇ、３日毎に５回投与した後のＨＩＦ−１ａとＶＥＧＦのｍＲＮＡのインビボの内因性肝臓標的下方調節をミスマッチが１箇所あるコントロールの配列番号９と比較して示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、Ｕ３７３細胞においてＨＩＦ−１ａを標的としたＬＮＡオリゴヌクレオチド、配列番号１と配列番号８で処理した後のＶＥＧＦＡの発現を示す。Ｕ３７３細胞において、配列番号１またはスクランブルコントロール（配列番号８）で処理した４８時間後にＶＥＧＦＡとＭＭＰ−２の発現（分泌）の用量依存性の下方調節が観察される。ＶＥＧＦＡ（図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ）とＭＭＰ−２（図１２Ｄ、１２Ｅ）の発現は細胞数と関連づけ、模擬物に対して正規化する。図１２Ａ、１２Ｃ、１２ＤのＶＥＧＦＡとＭＭＰ−２の発現は、処理した４８時間後に測定し、図１２Ｂと１２ＥのＶＥＧＦＡとＭＭＰ−２の分泌は、導入後２４−１２０時間後に定量した。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、Ｕ３７３細胞においてＨＩＦ−１ａを標的としたＬＮＡオリゴヌクレオチド、配列番号１と配列番号８で処理した後のＶＥＧＦＡの発現を示す。Ｕ３７３細胞において、配列番号１またはスクランブルコントロール（配列番号８）で処理した４８時間後にＶＥＧＦＡとＭＭＰ−２の発現（分泌）の用量依存性の下方調節が観察される。ＶＥＧＦＡ（図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ）とＭＭＰ−２（図１２Ｄ、１２Ｅ）の発現は細胞数と関連づけ、模擬物に対して正規化する。図１２Ａ、１２Ｃ、１２ＤのＶＥＧＦＡとＭＭＰ−２の発現は、処理した４８時間後に測定し、図１２Ｂと１２ＥのＶＥＧＦＡとＭＭＰ−２の分泌は、導入後２４−１２０時間後に定量した。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、Ｕ３７３細胞においてＨＩＦ−１ａを標的としたＬＮＡオリゴヌクレオチド、配列番号１と配列番号８で処理した後のＶＥＧＦＡの発現を示す。Ｕ３７３細胞において、配列番号１またはスクランブルコントロール（配列番号８）で処理した４８時間後にＶＥＧＦＡとＭＭＰ−２の発現（分泌）の用量依存性の下方調節が観察される。ＶＥＧＦＡ（図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ）とＭＭＰ−２（図１２Ｄ、１２Ｅ）の発現は細胞数と関連づけ、模擬物に対して正規化する。図１２Ａ、１２Ｃ、１２ＤのＶＥＧＦＡとＭＭＰ−２の発現は、処理した４８時間後に測定し、図１２Ｂと１２ＥのＶＥＧＦＡとＭＭＰ−２の分泌は、導入後２４−１２０時間後に定量した。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、Ｕ３７３細胞においてＨＩＦ−１ａを標的としたＬＮＡオリゴヌクレオチド、配列番号１と配列番号８で処理した後のＭＭＰ−２の発現を示す。Ｕ３７３細胞において、配列番号１またはスクランブルコントロール（配列番号８）で処理した４８時間後にＶＥＧＦＡとＭＭＰ−２の発現（分泌）の用量依存性の下方調節が観察される。ＶＥＧＦＡ（図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ）とＭＭＰ−２（図１２Ｄ、１２Ｅ）の発現は細胞数と関連づけ、模擬物に対して正規化する。図１２Ａ、１２Ｃ、１２ＤのＶＥＧＦＡとＭＭＰ−２の発現は、処理した４８時間後に測定し、図１２Ｂと１２ＥのＶＥＧＦＡとＭＭＰ−２の分泌は、導入後２４−１２０時間後に定量した。
【図１２Ｅ】図１２Ｅは、Ｕ３７３細胞においてＨＩＦ−１ａを標的としたＬＮＡオリゴヌクレオチド、配列番号１と配列番号８で処理した後のＭＭＰ−２の発現を示す。Ｕ３７３細胞において、配列番号１またはスクランブルコントロール（配列番号８）で処理した４８時間後にＶＥＧＦＡとＭＭＰ−２の発現（分泌）の用量依存性の下方調節が観察される。ＶＥＧＦＡ（図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ）とＭＭＰ−２（図１２Ｄ、１２Ｅ）の発現は細胞数と関連づけ、模擬物に対して正規化する。図１２Ａ、１２Ｃ、１２ＤのＶＥＧＦＡとＭＭＰ−２の発現は、処理した４８時間後に測定し、図１２Ｂと１２ＥのＶＥＧＦＡとＭＭＰ−２の分泌は、導入後２４−１２０時間後に定量した。
【図１３】図１３は、１および５ｎＭで配列番号１で処理したＨＵＶＥＣ細胞のウェスタンブロットにより測定したＨＩＦ−１ａタンパク質の下方調節とチューブ構造の崩壊を配列番号８と無処理細胞と比較して示す。
【図１４Ａ】図１４Ａ。メスの有色素マウスにおける３Ｈラベルした配列番号１の単回静脈内投与の５分（ａ）、４時間（ｂ）、２４時間（ｃ）、１８日（ｄ）後の放射性活性の分布を示す全身ラジオルミノグラム。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは５分間および７日間の時点での放射性活性の分布を示し、７日後に３Ｈラベルした配列番号１化合物の非常に強い保持が骨髄、腎臓、肺、皮膚、脾臓、尿、胃粘膜、リンパ節、目のブドウ膜および子宮に観察されたことを示している。
【図１５】図１５は、ＦＡＣＳ解析で測定した配列番号７化合物投与の１時間後骨髄、脾臓、末梢血中の様々な種類の細胞におけるＦＡＭラベルした配列番号１（配列番号７）の取り込みを無処理細胞と比較して示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、リアルタイムＰＣＲで測定し１８Ｓ ＲＮＡで正規化した、４０、１０、６ｍｇ／ｋｇの配列番号１で週に２回４週間処置したカニクイザルの肝臓と腎臓におけるＨＩＦ−１ａ発現を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、上述のとおり処置した最後の投与の１日後または最後の投与の４週間後（回復動物）のカニクイザルの肝臓と腎臓における配列番号１の取り込みを、処置終了後４週間無処置のままにした回復動物（Ｒ）でのデータと共に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（発明の説明）
本発明は、特定のＬＮＡオリゴヌクレオチド、すなわち、ＨＩＦ−１ａをコードする核酸分子の機能調節に用いる配列番号３と配列番号４の配列を含むＬＮＡオリゴヌクレオチドを採用する。その調節は、最終的にＨＩＦ−１ａ産物の量の変化である。ある実施形態では、ＨＩＦ−１ａをコードする核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンスＬＮＡオリゴヌクレオチドを提供することでこれは達成される。調節は、好ましくは生成される機能的なＨＩＦ−１ａタンパク質の数の減少を引き起こすＨＩＦ−１ａの発現阻害である。
【００１４】
（ＬＮＡオリゴヌクレオチド）
より具体的には、本発明は
５’−（Ｔｘ）ＧｘＧｘＣｓａｓａｓｇｓｃｓａｓｔｓｃｓｃｓＴｘＧｘ（Ｔ）−３’（配列番号３）
および
５’−（Ｇｘ）ＴｘＴｘａｓｃｓｔｓｇｓｃｓｃｓｔｓｔｓｃｓＴｘＴｘ（Ａ）−３’（配列番号４）
からなる群から選択される配列からなるＬＮＡオリゴヌクレオチドを提供し、
ここで、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログを示し、小文字は２−デオキシヌクレオチドを示し、下線はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログまたは２−デオキシヌクレオチドのいずれかを示し、下付き文字「ｓ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、下付き文字「ｘ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合のいずれかを示し、括弧内のヌクレオチドユニット、（Ｔｘ）、（Ｔ）、または（Ｇｘ）、（Ａ）はそれぞれ任意のユニットを表し、また、
ここで、配列は任意で２−デオキシヌクレオチド５ユニットまで延長される。
【００１５】
「本明細書に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチド」、「発明によるＬＮＡオリゴヌクレオチド」などの語は、以下に規定される実施形態、変形、塩、プロドラッグなどに加えて前述に記載の「ＬＮＡオリゴヌクレオチド」を意味する。
【００１６】
配列番号３と配列番号４に基づく前述に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドは、１３〜２０ヌクレオチドユニットの長さを有する。最低配列長は、括弧内のヌクレオチドユニット、（Ｔｘ）、（Ｔ）または（Ｇｘ）、（Ａ）がそれぞれ欠けている場合に１３ヌクレオチドであり、最大配列長は、括弧内のヌクレオチドユニット、（Ｔｘ）、（Ｔ）または（Ｇｘ）、（Ａ）がそれぞれ存在し、かつ配列番号３または配列番号４が２−デオキシヌクレオチド５ユニットまで延長される場合に２０ヌクレオチドである。
【００１７】
ある実施形態では、括弧内のヌクレオチドユニット、（Ｔｘ）、（Ｔ）または（Ｇｘ）、（Ａ）がそれぞれ欠けており、また現在のところより望ましい別の実施形態では、括弧内のヌクレオチドユニット、（Ｔｘ）、（Ｔ）または（Ｇｘ）、（Ａ）がそれぞれ存在している。また興味深いのは、５’末端の任意のユニット、（Ｔｘ）または（Ｇｘ）がそれぞれ存在し、かつ３’末端の任意のユニット、（Ｔ）または（Ａ）がそれぞれ欠けている実施形態であり、また５’末端の任意のユニット（Ｔｘ）または（Ｇｘ）がそれぞれ欠けており、かつ３’末端の任意のユニット、（Ｔ）または（Ａ）がそれぞれ存在している実施形態である。
【００１８】
上記の配列番号３と配列番号４における、下線のヌクレオチドユニットでのβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログまたは２−デオキシヌクレオチドの選択は、比較的重要でないようである。しかし、ある実施形態では、両方の下線のヌクレオチドユニットが２−デオキシヌクレオチドを示す。現在のところより望ましい別の実施形態では、一つまたは両方の下線のヌクレオチドユニットがβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログを示す。
【００１９】
ある改変例では、括弧内の５’末端のヌクレオチドユニット、（Ｔｘ）または（Ｇｘ）がそれぞれ欠けており、かつ３’末端の別の下線のヌクレオチドユニット、（Ｔ）または（Ａ）がそれぞれ２−デオキシヌクレオチドか、またはより好ましくは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログを示す。
【００２０】
別の改変例では、括弧内の５’末端のヌクレオチドユニット、（Ｔｘ）または（Ｇｘ）がそれぞれ２−デオキシヌクレオチドか、またはより好ましくは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログを指定し、かつ３’末端の別の下線のヌクレオチドユニット、（Ｔ）または（Ａ）がそれぞれ欠けている。
【００２１】
別の改変例では、括弧内のヌクレオチドユニットが存在し、また下線のヌクレオチドユニットの一つあるいは両方がβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログを示す。即ち、（ｉ）５’末端の下線のヌクレオチドがβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログを指定し、かつ３’末端の下線のヌクレオチドが２−デオキシヌクレオチドを示す、または、（ｉｉ）３’末端の下線のヌクレオチドがβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログを指定し、かつ５’末端の下線のヌクレオチドユニットが２−デオキシヌクレオチドを示す、または、（ｉｉｉ）５’末端だけでなく３’末端の下線のヌクレオチドがβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログを示す。
【００２２】
さらなる改変例では、括弧内のヌクレオチドユニット、（Ｔｘ）または（Ｇｘ）がそれぞれ存在し、また下線のヌクレオチドユニットの両方が２−デオキシヌクレオチドを示す。
【００２３】
配列番号３と配列番号４と呼ばれる配列（また、より具体的には、配列番号１と配列番号２と呼ばれる配列（さらには下記参照））は、定義されたＬＮＡオリゴヌクレオチドの全ての機能性を実質的に表すと考えられているが、配列番号３と配列番号４の２−デオキシヌクレオチド５ユニットまでの延長は、たとえば１ユニット、２ユニット、３ユニット、４ユニット、または５ユニットでさえ、基本配列である配列番号３と配列番号４の有益な特性に対する有害な作用がない可能性があると考えられている。配列が３’末端、５’末端、または５’末端だけでなく３’末端で延長することができる当該存在は、総計５以下の２−デオキシヌクレオチドユニットをもたらした。
【００２４】
従って、（前述と組合せ可能な）ある実施形態ではＬＮＡオリゴヌクレオチドは、２−デオキシヌクレオチドおよびβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログから選択される１５、１６、１７、１８、１９または２０個のヌクレオチドユニットからなり、具体的には、２−デオキシヌクレオチドおよびβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログから選択される１６個のヌクレオチドユニットからなるＬＮＡオリゴヌクレオチドである。（前述と組合せ可能な）別の実施形態では、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、２−デオキシヌクレオチドおよびβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログから選択される１３、１４、１５または１６個のヌクレオチドユニットからなり、具体的には、２−デオキシヌクレオチドおよびβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログから選択される１４または１５個のヌクレオチドユニットからなるＬＮＡオリゴヌクレオチドである。
【００２５】
少なくともＬＮＡオリゴヌクレオチド調製の利便性のために、３’末端の２−デオキシヌクレオチド１ユニットでの配列延長がしばしば行われる（参考：例えば、下記の配列番号１と配列番号２）。最も好ましくは、配列番号３が３’末端のアデノシン２−デオキシヌクレオチドユニットで延長され、配列番号４が３’末端のシトシン２−デオキシヌクレオチドユニットで延長される。
【００２６】
上述の、下付き文字「ｓ」は隣接するヌクレオチドとＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合（−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−）を示し、下付き文字「ｘ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合（−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−）またはホスホロジエステル結合（−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−）のいずれかを指す。結果的に配列を延長する任意の２−デオキシヌクレオチドがホスホロチオエート結合（−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−）またはホスホロジエステル結合（−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−）のいずれかで結合され得る。
【００２７】
配列番号３のｃｓａｓａｓｇｓｃｓａｓｔｓｃｓｃｓＴのサブシークエンスと配列番号４のａｓｃｓｔｓｇｓｃｓｃｓｔｓｔｓｃｓＴのサブシーケンスは、完全にホスホロチオエート化されている、つまり下付き文字「ｓ」で示されていることに気付く。現在のところ望ましくないが、ＬＮＡオリゴヌクレオチドの安定性を著しく損なうことなく、一つか場合によっては二つのホスホロチオエート結合は他の結合、特にホスホロジエステル結合で置き換えられ得る。従って、一つまたは二つのホスホロチオエート結合が他の結合、例えばホスホロジエステル結合で置き換えられ得る当該改変体も本発明の対象範囲内に含まれる。
【００２８】
しかし、現在のところ好ましいある実施形態では、配列中の全てのヌクレオチドユニットがホスホロチオエート基によって結合されている。
【００２９】
特に関心があるＬＮＡオリゴヌクレオチドのあるサブグループは、
５’−ＴｓＧｓＧｓｃｓａｓａｓｇｓｃｓａｓｔｓｃｓｃｓＴｓＧｓＴｓａ−３’（配列番号１）
５’−ＴｓＧｓＧｓｃｓａｓａｓｇｓｃｓａｓｔｓｃｓｃｓＴｓＧｓＴ−３’（配列番号１５）、および
５’−ＧｓＧｓｃｓａｓａｓｇｓｃｓａｓｔｓｃｓｃｓＴｓＧｓｔ−３’（配列番号１６）
からなる群から選択され、これらのなかでは、
５’−ＴｓＧｓＧｓｃｓａｓａｓｇｓｃｓａｓｔｓｃｓｃｓＴｓＧｓＴｓａ−３’（配列番号１）
が現在のところ最も望ましい。
【００３０】
特に関心があるＬＮＡオリゴヌクレオチドの別のサブグループは、
５’−ＧｓＴｓＴｓａｓｃｓｔｓｇｓｃｓｃｓｔｓｔｓｃｓＴｓＴｓＡｓｃ−３’（配列番号２）
５’−ＧｓＴｓＴｓａｓｃｓｔｓｇｓｃｓｃｓｔｓｔｓｃｓＴｓＴｓＡ−３’（配列番号１７）、および
５’−ＴｓＴｓａｓｃｓｔｓｇｓｃｓｃｓｔｓｔｓｃｓＴｓＴｓａ−３’（配列番号１８）
からなる群から選択され、これらのなかでは、
５’−ＧｓＴｓＴｓａｓｃｓｔｓｇｓｃｓｃｓｔｓｔｓｃｓＴｓＴｓＡｓｃ−３’（配列番号２）
が現在のところ最も望ましい。
【００３１】
本発明の情況では、「ヌクレオシド」という用語は通常の意味、即ち１位の炭素原子を通じてアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、またはグアニン（Ｇ）の窒素含有塩基の一つと結合する２−デオキシリボースまたはリボースユニットを含む。
【００３２】
同様に、「ヌクレオチド」という用語は、１位の炭素原子を通じてアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、またはグアニン（Ｇ）の窒素含有塩基の一つと結合し、５位の炭素原子を通じてヌクレオシド間のリン酸基または末端基と結合する２−デオキシリボースまたはリボースユニットを意味する。
【００３３】
「核酸」という用語は、二つ以上のヌクレオチドの共有結合で形成される分子と定義される。「核酸」と「ポリヌクレオチド」という用語は、ここでは置き換え可能である。「核酸アナログ」という用語は、非天然の核酸結合化合物を指す。
【００３４】
「ＬＮＡモノマー」という用語は、全て文献としてここに組み込まれた国際特許出願、国際公開第９９／１４２２６号、およびそれに続く出願、国際公開第００／５６７４６号、国際公開第００／５６７４８号、国際公開第００／６６６０４号、国際公開第００／１２５２４８号、国際公開第０２／２８８７５号、国際公開第２００２／０９４２５０号および国際公開第０３／００６４７５号に記載の、一般的には二環式ヌクレオシドアナログを指す。
【００３５】
β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡが、本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチドに用いられるβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログである、およびモノマー構造（ヌクレオシド）をスキーム１に示す。
【００３６】
【化１】
（スキーム１）
スキーム１で、Ｚ＊およびＺは隣接したヌクレオチドまたは末端基（即ち、５’末端基か３’末端基のいずれか）へのヌクレオチド間結合の位置を示す。
【００３７】
β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡモノマーのある特定の実施例は、チミジンＬＮＡモノマー（ＬＮＡヌクレオシドアナログ）（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，７Ｓ）−７−ヒドロキシ−１−ヒドロキシメチル−５−メチル−３−（チミン−１イル）−２，５−ジオキサ−ビシクロ［２：２：１］ヘプタン、つまりＴ−β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである。
【００３８】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、本発明の情況では、オリゴマー（オリゴとも呼ばれる）または核酸ポリマー（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、または当業者に知られている核酸アナログ、好ましくは固定核酸（ＬＮＡ）、あるいはその混合物を指す。この用語は、自然に生じたものと同様に機能する、または特異的な機能を改善した人工的に作成した部分を有するオリゴヌクレオチドだけでなく、自然に生じた核酸塩基、糖類、およびヌクレオシド間（バックボーン）結合からなるオリゴヌクレオチドを含む。完全に、または部分的に修飾、または置換したオリゴヌクレオチドは、例えば細胞膜への浸透能、細胞外、細胞内のヌクレアーゼに対する良好な耐性、核酸標的への高い親和性と特異性などのいくつかの好ましい特性があるため、自然の形よりも多くの場合望ましい。本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチドは、上述の特性を示す。
【００３９】
「ユニット」または「ヌクレオチドユニット」は、モノマー、即ち２−デオキシヌクレオチドまたはβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログであると解釈される。
【００４０】
「１以上」という用語は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７などの、１より大きいか等しい整数を含む。
【００４１】
ヌクレオシド、ヌクレオシドアナログ、配列番号などに使われる「ａ（冠詞）」という用語は、一つかそれ以上を意味するよう意図されている。特に、「．．．．．からなる群から選択される（ヌクレオシド、ヌクレオシドアナログ、配列番号などといった）構成要素」という表現は、一つかそれ以上の、言及された構成要素が選択され得ることを意味するよう意図されている。従って、「Ａ、Ｂ、およびＣからなる群から選択される構成要素」の表現は、Ａ、ＢおよびＣの全ての組合せ、即ちＡ、Ｂ、Ｃ、Ａ＋Ｂ、Ａ＋Ｃ、Ｂ＋Ｃ、およびＡ＋Ｂ＋Ｃを含むことが意図されている。
【００４２】
本明細書を通して、「を含む」または「を含んでいる」といったそのバリエーションは、記載の要素、整数、または段階、あるいは要素、整数、または段階の群を意味すると理解されるが、その他の要素、整数、または段階の除外、あるいは要素、整数、または段階の群の除外は意味しない。
【００４３】
（ＬＮＡオリゴヌクレオチドの調製）
ＬＮＡヌクレオチドアナログ結合ブロック（β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ）は、公表された方法とそこで引用された参考文献に従って調製可能である。例えば、国際公開第０３／０９５４６７ Ａ１号、Ｄ．Ｓ．Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｃ．Ｒｏｓｅｎｂｏｈｍ，Ｔ．Ｋｏｃｈ（２００２）Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＮＡ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ６，８０２−８０８、および国際公開第２００４／０６９９９１ Ａ２号を参照。
【００４４】
ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、国際公開第９９／１４２２６号、国際公開第００／５６７４６号、国際公開第００／５６７４８号、国際公開第００／６６６０４号、国際公開第００／１２５２４８号、国際公開第０２／２８８７５号、国際公開第２００２／０９４２５０号、および国際公開第０３／００６４７５号の実施例の記載どおりに調製することが出来る。従って、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、有機化学の当該分野の通常の技量の人物によく知られた核酸化学のオリゴマー化技術を用いて作成可能である。一般的に、ホスホルアミダイト手法の標準的なオリゴマー化サイクル（Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ
Ｒ．Ｐ．Ｉｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９３，４９，６１２３；Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｒ．Ｐ．Ｉｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９２，４８，２２２３）が用いられるが、例えばＨ−ホスホン酸化学、ホスホトリエステル化学も利用され得る。
【００４５】
一部のモノマーについては、より長いカップリング時間および／また反復カップリングおよび／また、より濃縮したカップリング試薬の使用が必要、あるいは有益であり得る。
【００４６】
ホスホルアミダイトは、一般的に＞９５％の段階的収量を満たす対を使用した。亜リン酸（ＩＩＩ）から亜リン酸（Ｖ）への酸化は、通常、例えばヨウ素、ピリジン、水で行う。このことが脱保護後に、天然のホスホロジエステルヌクレオシド間結合をもたらす。ホスホロチオエートヌクレオシド間結合がチオール化段階で調製される場合は、ＡＤＴＴ試薬（キサンタンハイブリッド（アセとニトリル：ピリジン、９：１、ｖ／ｖ中の０．０１Ｍ溶液））を用いる酸化と共にホスホロジエステルヌクレオシド間結合の合成に用いられる、通常の、例えばヨウ素、ピリジン、水の酸化の交換によって行われる。その他のＢｅａｕｃａｇｅおよびＰＡＤＳなどのチオール化試薬も使用され得る。ホスホロチオエートＬＮＡオリゴヌクレオチドは、段階的カップリングで≧９８％の収量で効果的に合成される。
【００４７】
ＬＮＡオリゴヌクレオチドの精製は、ディスポーザブルの逆相精製カートリッジおよび／または逆相ＨＰＬＣおよび／またはエタノールまたはブタノール沈殿を用いて達成され得る。キャピラリーゲル電気泳動、逆相ＨＰＬＣ、ＭＡＬＤＩ−ＭＳおよびＥＳＩ−ＭＳが、合成ＬＮＡオリゴヌクレオチドの精製の検証に用いられた。
【００４８】
（塩）
ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、薬学的に受容可能な様々な塩が使用され得る。本明細書で使用される場合、その用語はＬＮＡオリゴヌクレオチドの生物学的活性を保持し、最低限の望ましくない毒性効果を示す塩を指す。当該塩の限定されない実施例は、有機アミノ酸、および、亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミ、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム、ナトリウム、カリウムなどの金属カチオンで形成された、あるいはアンモニア、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレン−ジアミン、Ｄ−グルコサミン、テトラエチルアンモニウム、またはエチレンジアミンから形成されるカチオンで形成される塩基添加塩、あるいは、例えば亜鉛タンニン酸などの組合せで形成され得る。
【００４９】
このような塩は、ホスホジエステル基および／またはホスホロチオエート基を有するＬＮＡオリゴヌクレオチドから形成され、例えば適切な塩基を有する塩でもある。これらの塩は、例えば元素周期律表のＩａ、Ｉｂ、ＩＩａ、およびＩＩｂの金属グループ由来の非毒性の金属塩を含み、特に、例えばリチウム塩、ナトリウム塩、またはカリウム塩などのアルカリ金属塩、あるいは例えばマグネシウム塩またはカルシウム塩などのアルカリ土類金属が適している。さらに、亜鉛塩、アンモニウム塩、および、置換されていない、またはヒドロキシル置換された、モノ−、ジ−、またはトリ−アルキルアミンなど、特に、モノ−、ジ−、またはトリ−アルキルアミン、などの適切な有機アミンで形成された塩、あるいは、例えばＮ−メチル−Ｎ−エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミンや、モノ−、ビス−、またはトリス−（２−ヒドロキシエチル）アミン、２−ヒドロキシ−ｔｅｒｔ−ブチルアミン、またはトリス−（ヒドロキシメチル）メチルアミンなどのモノ−、ビス−、またはトリス−（２−ヒドロキシ−低級アルキル）アミン類、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−アミンまたはトリ−（２−ヒドロキシエチル）アミン、またはＮ−メチル−Ｄ−グルコサミンなどの、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキル−Ｎ−（ヒドロキシ低級アルキル）アミン類、またはテトラブチルアンモニウム塩などの第４級アンモニウム化合物など、第４級アンモニウム化合物で形成された塩も含む。リチウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩、またはカリウム塩が望ましく、ナトリウム塩は特に好ましい。
【００５０】
（プロドラッグ）
ある実施形態では、ＬＮＡオリゴヌクレオチドはプロドラッグの形である場合がある。オリゴヌクレオチドは、陰性に荷電したイオンである。細胞膜の親油性のため、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みは、中性または親油性の相当物と比較して低くなる。この極性の「障害物」は、プロドラッグ手法（例えば、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｒ．Ｍ．（１９９８）ｉｎ
Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｖｏｌ．３１，ｐｐ．１０３−１４０を参照）の利用によって回避可能である。この手法で、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは投与した際に中性であるように保護された方法で調製される。これらの保護基はＬＮＡオリゴヌクレオチドが細胞に取り込まれた後に除去され得る方法で設計される。当該保護基の例は、Ｓ−アセチルチオエチル（ＳＡＴＥ）またはＳ−ピバロイルチオエチル（ｔ−ブチル−ＳＡＴＥ）である。これらの保護基はヌクレアーゼ耐性であり、細胞内で選択的に除去される。
【００５１】
（結合体）
本発明のさらなる局面は、少なくとも一つの非ヌクレオチド、または非ポリヌクレオチド部分が共有的に前述のＬＮＡオリゴヌクレオチドと結合している、と本明細書で定義されるＬＮＡオリゴヌクレオチドを含む結合体に関する。
【００５２】
本発明の関連する局面では、本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチドは結合体を形成するようにリガンドに結合しており、リガンドはアンチセンスオリゴヌクレオチドに対する結合体の細胞への取り込みの増加を目的としている。
【００５３】
本明細書の情況において、「結合体」という用語は本明細書に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチド（即ち、ヌクレオシド配列とＬＮＡヌクレオチドアナログを含むＬＮＡオリゴヌクレオチド）と一つ以上の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分の共有結合によって形成された外来分子を示すよう意図されている。
【００５４】
従って、ＬＮＡオリゴヌクレオチドはダイマーまたは樹状構造に配置され得ると同時に、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、タンパク質（例えば、標的タンパク質に対する抗体）、高分子、低分子量の医薬品成分、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマー（例えばポリエチレングリコール）、ミセル形成基、抗体、炭水化物、受容体結合基、コレステロールなどのステロイド、ポリペプチド、アクリジン誘導体などの挿入剤、長鎖アルコール、デンドリマー、リン脂質、およびその他の親油基、またはその組合せなどの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分と結合する、あるいはキメラを形成し得る。本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは結合体は、結合、あるいは例えばアスピリン、イブプロフェン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌剤、化学療法剤、または抗生物質といった活性医薬品成分とさらに結合され得る。
【００５５】
このようにした結合は、ＬＮＡオリゴヌクレオチドの薬物動態特性に関する有利な特性を付与し得る。特に、当該方法の結合は細胞への取り込みの増加を達成する。
【００５６】
ある実施形態では、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは結合体を形成するようにリガンドに結合され、リガンドはアンチセンスＬＮＡオリゴヌクレオチドに対する結合体の細胞への取り込み増加を目的としている。この結合は、５’／３’−ＯＨの末端位置で行われ得るが、リガンドは糖および／または塩基でも行われ得る。特に、アンチセンスＬＮＡオリゴヌクレオチドを結合し得る成長因子は、トランスフェリンまたは葉酸を含む場合がある。高濃度でトランスフェリン受容体または葉酸受容体を発現している細胞による取り込みのために、トランスフェリン−ポリリジン−オリゴヌクレオチド結合体、または葉酸−ポリリジン−オリゴヌクレオチド結合体が調製され得る。結合体／リガンドの別の実施例は、コレステロール部分、アクリジンなどの二重鎖の挿入基（ｄｕｐｌｅｘ ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）、ポリ−Ｌ−リジン、一つ以上のヌクレアーゼ耐性結合基を有するホスホロモノチオエートなどの末端キャッピングなどである。
【００５７】
オリゴヌクレオチドの細胞取り込みのためのキャリアとしてのトランスフェリン結合体の調製は、Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，３４１０−３４１４（１９９０）に記載されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドの送達を含む葉酸受容体エンドサイトーシスを介した葉酸−巨大分子結合体の細胞送達は、Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．米国特許第５，１０８，９２１号に記載されている。Ｌｅａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８，５５７２（１９９１）も参照のこと。
【００５８】
（薬学的組成物）
本発明の特に関心がある特徴は、本明細書に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の結合体、および薬学的に受容可能な希釈剤、キャリア、またはアジュバントを含む薬学的組成物を対象にしている。薬学的組成物は、好ましくは注入、局所投与、または眼内投与に適切である（下記参照）。
【００５９】
薬学的組成物の調製についての指示は、Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ著「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」および下記で入手できる。
【００６０】
薬学的に受容可能な希釈剤、キャリア、またはアジュバントは薬学的組成物の一部である。カプセル、タブレット、丸薬などは、例えば以下の化合物、微結晶性セルロース、結合剤としてゴムまたはゼラチン、賦形剤としてデンプンまたは乳糖、潤滑剤としてステアリン酸、様々な甘味料または香料を含み得る。カプセルでは、用量ユニットは脂肪油などの油脂キャリアを含む場合がある。同様に、糖または腸溶性の被覆材が用量ユニットの一部であり得る。薬学的組成物は（ＬＮＡオリゴヌクレオチドを含む）活性薬剤成分の乳液と脂質形成ミセル乳液である可能性もある。
【００６１】
ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、目的とする作用を損なわない任意の原料、あるいは目的とする作用を補う材料と混合される場合がある。これらは、他のオリゴヌクレオシド化合物を含む他薬剤を含み得る。
【００６２】
非経口投与、皮下投与、皮内投与、または局所投与のため、製剤は滅菌した希釈剤（例えば水）、緩衝液、張性調節剤またはイオン強度調整剤、および抗菌剤を含む場合がある。活性ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、取り込み、分解に対する保護、または体外への迅速な排出に対する保護を行い易くする、放出制御特性があるインプラントまたはマイクロカプセルを含むキャリアと共に調製され得る。静脈内投与のために、望ましいキャリアは生理食塩水（０．９％）、または緩衝食塩水（例えば、リン酸緩衝食塩水）である。
【００６３】
好ましい実施形態では、ＬＮＡオリゴヌクレオチドの注射または輸液は新血管形成部位またはその近くに与えられる。例えば、本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチドは、目の網膜色素上皮細胞に送達され得る。好ましくは、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは目に、例えば液体またはゲルの形で下瞼または結膜円蓋に、当業者が行っているように局所的に投与される（例えば、Ａｃｈｅａｍｐｏｎｇ ＡＡ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌ．ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ３０：４２１−４２９、本明細書に参考文献によって盛り込まれた開示全体を参照）。
【００６４】
本発明の薬学的組成物は、局所処置または全身処置のいずれが目的か、また治療する領域によって、複数の方法で投与され得る。投与は、（ａ）経口投与、（ｂ）例えば、噴霧器、気管内投与、経鼻投与による、粉末またはエアロゾルの吸入または噴霧による肺投与、（ｃ）表皮投与、経皮投与、目、および膣内投与と直腸送達などの粘膜への投与などの局所投与、または、（ｄ）静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内の注射または輸液、あるいは例えばくも膜下腔投与または脳室内投与といった頭蓋内投与などの非経口投与であり得る。ある実施形態では、活性ＬＮＡオリゴヌクレオチドは静脈内投与、腹腔内投与、経口投与、局所投与、または静脈内ボーラスとして、あるいは直接的に標的器官に投与される。
【００６５】
現在、大部分の適切な投与形態は静脈内注射または経口投与であると考えられている。
【００６６】
局所投与用の薬学的組成物と製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ジェル、点滴剤、スプレー、坐薬、液体および粉末を含み得る。従来の水性、粉末またはオイルベースの医薬的キャリア、増粘剤などが必要または所望され得る。コーティングを施したコンドーム、手袋などもまた有用である。本発明のオリゴヌクレオチドを含む望ましい局所用製剤は、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤、および界面活性剤などの局所送達剤との混合剤である。経口投与用の薬学的組成物と製剤は、粉末、または顆粒、微粒子、ナノ粒子、水または非水媒体中の懸濁液、または溶液、カプセル、ジェルカプセル、小袋、タブレット、またはミニタブレットを含むがこれに限定されない。非経口投与、くも膜下腔内投与、または脳室内投与用の薬学的組成物と製剤は、緩衝剤、希釈剤、および、浸透促進剤、キャリア化合物またその他の薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤など、しかしそれに限定されないその他の適切な添加物も含み得る滅菌した水溶液を含み得る。
【００６７】
本発明の薬学的組成物は溶液、乳液、およびリポソーム含有製剤を含むがそれに限定されない。これらの組成物は、予め生成された脂質、自己乳化固体、自己乳化半固形を含むがそれに限定されない様々な組成物から生成され得る。腫瘍組織への薬剤送達は、陽イオンリポソーム、シクロデキストリン、ポルフィリン誘導体、分岐鎖デンドリマー、ポリエチレンイミンポリマー、ナノ粒子、および微粒子を含むがそれに限定されないキャリアを介した送達により増強される場合がある（Ｄａｓｓ ＣＲ．Ｊ Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００２，５４（１）：３−２７）。
【００６８】
特に好ましい非経口投与経路は眼内投与である。本ＬＮＡオリゴヌクレオチドの眼内投与は、その投与経路によりＬＮＡオリゴヌクレオチドの目への進入が可能である限り、目への注入または直接（例えば局所的）投与により達成され得ると理解される。上述の目への局所的経路投与に加え、適切な眼内投与経路は硝子体内投与、網膜内投与、網膜下投与、テノン嚢下投与、眼窩周囲投与、眼窩後方投与、経隔膜投与、および経強膜投与を含む。
【００６９】
眼内投与用に、薬学的組成物は例えばパッチまたは目への塗布、あるいはイオン泳動によって直接局所的に投与される場合がある。軟膏、スプレー、または点滴用液体は、アプリケーターまたは点眼器などの当業者に知られた目への送達システムによって送達され得る。組成物は、目の表面または瞼の内側に直接的に投与される場合がある。当該組成物は、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはポリ（ビニルアルコール）などのムチン模倣剤、アスコルビン酸、ＥＤＴＡまたは塩化ベンジルクロニウム等の防腐剤、および通常量の希釈剤および／またはキャリアを含み得る。
【００７０】
本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチドは、例えば米国特許第５，６７２，６５９号および第５，５９５，７６０号に記載の徐放性配合で提供され得る。即時性放出配合または徐放性配合の使用は、治療される状態の性質に依存する。状態が急性疾患、または過急性疾患である場合には、即時放出型での治療が徐放性配合よりも望ましいだろう。あるいは、特定の予防または長期治療には、徐放性配合が適切であり得る。
【００７１】
ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、針またはその他の送達機器を用いて目の内部に注入可能である。
【００７２】
ある実施形態では、薬学的組成物は生理的に許容可能なキャリア媒体と混合した本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチド（例えば、重量で０．１から９０％）、またはその生理的に許容可能な塩を含む。好ましくは、生理的に許容可能なキャリア媒体は水、緩衝水溶液、生理食塩水、０．４％食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などである。
【００７３】
本発明の薬学的組成物は、従来の医薬的賦形剤および／または添加物も含み得る。適切な医薬的賦形剤は、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調節剤、緩衝剤、およびｐＨ調節剤を含む。適切な添加物は、生理的生体適合性緩衝剤（例えば、塩酸トロメタミン）、キレート剤の添加（例えば、ＤＴＰＡまたはＤＴＰＡ−ビスアマイドなど）またはカルシウムキレート錯体（例として、カルシウムＤＴＰＡ、カルシウムナトリウムＤＴＰＡ−ビスアマイド）あるいは、任意で、カルシウム塩またはナトリウム塩の添加（例えば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、または乳酸カルシウム）を含む。本発明の薬学的組成物は、液体形態用に梱包される可能性、あるいは凍結乾燥され得る。
【００７４】
固形組成物に関しては、例えば、医薬品グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどの従来の非毒性の固体キャリアが用いられ得る。
【００７５】
好ましくは、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは患者の治療において重篤な副作用を引き起こさない治療有効量を患者に送達するに十分な量の薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤などのユニット製剤中に含まれる。
【００７６】
ユニット用量の形で簡便に与えることができる本発明の医薬的製剤は、製薬業界でよく知られた従来技術に従って調製され得る。当該技術は、有効成分を医薬的キャリアまたは賦形剤と会合させる工程を含む。一般的に、製剤は均一にまた密接に有効成分を液体キャリアまたは細かく分けられた固体キャリア、あるいはその両方と会合させ、次いで、必要であれば製品を成形することで調製される。
【００７７】
本発明の組成物は、タブレット、カプセル、ジェルカプセル、液体シロップ、ソフトジェル、および坐薬などの、しかしそれに限定されない任意の多くの見込まれる剤形に製剤され得る。本発明の組成物は、水性、非水性または混合媒体中の懸濁液としても製剤され得る。水性懸濁液は、懸濁液の粘性を増す、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランなどの物質をさらに含む場合がある。懸濁液は安定剤も含む場合がある。
【００７８】
薬学的組成物の好ましい実施形態では、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは水性のキャリアで、特にｐＨを４．０〜８．５の範囲に保ち、またイオン強度が２０〜２０００ｍＭの緩衝剤を含む水性キャリアで製剤される。
【００７９】
「水性キャリア」という用語は、問題の薬学的組成物が液体形態であり、その液体キャリアは主に水を含む、つまり少なくとも８０％（ｗ／ｗ）、または少なくとも９０％（ｗ／ｗ）、またはさらに少なくとも９５％（ｗ／ｗ）のキャリアが水で構成されることを意味する。例えばエタノール、ＤＭＳＯ、エチレングリコールなどのその他の液体成分も使用され得る。
【００８０】
水性キャリアは好ましくは食塩水、またはｐＨを４．０〜８．５の範囲に保つ緩衝剤を含む。好ましくは緩衝剤は、例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）といった緩衝食塩水などであり、ｐＨ６．０〜７．５といったｐＨを５．０〜８．０の範囲に保つ。
【００８１】
薬学的組成物のイオン強度／等張性も重要である。従って、一般的には、液体薬学的組成物は５０〜１５００ｍＭの範囲、または１００〜１０００ｍＭの範囲といった２０〜２０００ｍＭの範囲のイオン強度である。
【００８２】
（併用薬剤）
本発明に従う薬学的組成物は任意でさらにアンチセンス化合物、化学療法剤、抗炎症化合物、抗ウイルス化合物、細胞増殖抑制化合物、抗血管形成化合物、抗増殖化合物、アポトーシス促進化合物、シグナル伝達調節因子、キナーゼ阻害剤および／または免疫調節化合物を含むということを理解する必要がある。現在、ＬＮＡオリゴヌクレオチドと一つ以上の化学療法剤の組合せが特に関心を引くと考えられる。
【００８３】
上述の本発明の薬学的組成物は、一つ以上の化学療法剤をさらに含み得る。化学療法化合物は一般的に、プレドニゾン、デキサメタゾンまたはデカドロン、アルトレタミン（ヘキサレン、ヘキサメチルメラニン（ＨＭＭ））、アミフォスチン（エチヨル）、アミノグルテチミド（シタドレン）、アムサクリン（Ｍ−ＡＭＳＡ）、アナストロゾール（アリミデックス）、テストステロンなどといったアンドロゲン、アスパラギナーゼ（Ｅｌｓｐａｒ）、アバスチン、バチルスカルメットゲラン菌、ビカルタミド（カソデックス）、ビスフォスフォネート、ブレオマイシン（ブレノキサン）、ボルテゾミブ、ブスルファン（ミレラン）、カルボプラチン（パラプラチン）、カルムスチン（ＢＣＮＵ、ＢｉＣＮＵ）、クロラムブシル（ロイケラン）、クロロデオキシアデノシン（２−ＣＤＡ、クラドリビン、ロイスタチン）、シスプラチン（プラチノール）、シクロホスファミド、シトシンアラビノシド（シタラビン）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン（ダクチノマイシンＤ、コスメゲン）、ダウノルビシン（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ）、ドセタキセル（タキソテール）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、エストラムスチン（ｅｍｃｙｔ）、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）などといったエストロゲン、エトポシド（ＶＰ−１６、ＶｅＰｅｓｉｄ、ｅｔｏｐｈｏｓ）、フルダラビン（フルダラ）、フルタミド（ｅｕｌｅｘｉｎ）、５−ＦＵＤＲ（フロクスウリジン）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ジェムシタビン（ジェムザール）、ゴセレリン（ｚｏｄａｌｅｘ）、ハーセプチン（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ヒドロキシウレア（ハイドレア）、イダルビシン（イダマイシン）、イホスファミド、ＩＬ−２（プロリュウキン、アルデスロイキン）、インターフェロンα（イントロンＡ、ロフェロンＡ）、イリノテカン（カンプトサール）、ロイプロリド（リュープロン）、レバミゾール（ｅｒｇａｍｉｓｏｌｅ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、Ｍｅｃｈｌｏｒａｔｈａｍｉｎｅ（マスタージェン、ナイトロジェンマスタード）、メルファラン（アルケラン）、メルカプトプリン（プリネトール、６−ＭＰ）、メトトレキサート（Ｍｅｘａｔｅ）、２−メトキシエストラジオール（２ＭＥ２、パンゼム）、マイトマイシンＣ（ｍｕｔａｍｕｃｉｎ）、ミトキサントロン（ノバントロン）、オクトレオチド（サンドスタチン）、ペントスタチン（２−デオキシコホルマイシン、Ｎｉｐｅｎｔ）、プリカマイシン（ミトラマイシン、Ｍｉｔｈｒａｃｉｎ）、プロカルバジン（Ｍａｔｕｌａｎｅ）、ストレプトゾシン、タモキシフィン（ノルバデックス）、タキソール（パクリタキセル）、テニポシド（ｖｕｍｏｎ、ＶＭ−２６）、サリドマイド、チオテパ、トポテカン（ハイカムチン）、トレチノイン（ベサノイド、オールトランス型レチノイン酸）、ビンブラスチン（ｖａｌｂａｎ）、ビンクリスチン（オンコビン）およびビノレルビン（ナベルビン）。などの副腎皮質ステロイドからなる群から選択される。
【００８４】
多発性骨髄腫の処置のためには、メルファラン、シクロホスファミド、プレドニゾン、ビンクリスチン、ドキソルビシン、カルムスチン、デキサメタゾン、サリドマイド、ボルテゾミブ、およびビスフォスフォネートなどの化学療法剤が望ましい。
【００８５】
腎臓癌の処置のためには、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−フルオロデオキシウリジン、パクリタキセル、カルボプラチン、イホスファミド、ドキソルビシン、ビンブラスチン、ＩＦＮ−α、およびＩＬ−２などの化学療法剤が望ましい。
【００８６】
ある改変例では、本発明は（ａ）一つ以上のＬＮＡオリゴヌクレオチドと（ｂ）非アンチセンス機構で機能する一つ以上の化学療法化合物を含む薬学的組成物を提供する。ＬＮＡオリゴヌクレオチドと共に使用した場合、当該化学療法化合物は独立に（例えば、ミトラマイシンとオリゴヌクレオチド）、連続的に（例えば、一定期間のミトラマイシンとオリゴヌクレオチド使用の後に続けて別の薬剤とオリゴヌクレオチド）、あるいは一つ以上の別の当該化学療法化合物との組合せまたは放射線療法との組合せで使用される場合がある。前記で明確に記載されたそれらを含む当業者に知られている全ての化学療法化合物は、本発明によるＬＮＡオリゴヌクレオチドとの複合治療として取り入れられる。
【００８７】
ある実施形態では、薬学的組成物はタキサン化合物との組合せで投与される。
【００８８】
「タキサン化合物」という用語は、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ［登録商標］）、パクリタキセル誘導体、ドセタキセル、タキソテール、修飾タキサン、およびタキソイドアナログを含むよう意図されている。パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ［登録商標］）はイチイの一種（Ｗｅｓｔｅｒｎ（ｐａｃｉｆｉｃ）ｙｅｗ）、Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｉｆｏｌｉａの樹皮から単離されたジテルペンで、タキサン環系を有する治療剤の１分野の代表である。パクリタキセルとそのアナログは、イチイの針葉と枝から得られた前駆物質、１０−デアセチルバッカチンＩＩＩから部分合成により、また完全合成により生成されてきた。Ｈｏｌｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：１５９７−１６０１（１９９４）とＮｉｃｏｌａｏｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６７：６３０（１９９４）を参照。パクリタキセルは臨床試験でいくつかのヒトの腫瘍における有効性が証明された。ＭｃＧｕｉｒｅ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．１１１：２３７−２７９（１９８９）、Ｈｏｌｍｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８３：１７９７−１８０５（１９９１）、Ｋｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８６：１８−２４（１９９４）、およびＫｏｈｎ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １２（１９９３）を参照。修飾タキサンまたはタキソイドアナログは修飾された側鎖を持つタキサン環を有する化合物である。多くのこれらのアナログは、自然に生じるパクリタキセルより高い水溶解性や安定性といった向上した特性を有する。これらのアナログは、当業者に知られており、参考文献によって本明細書中に援用される開示である例えば米国特許第５，２７８，３２４号、第５，２７２，１７１号、第５，２５４，５８０号、第５，２５０，６８３号、第５，２４８，７９６号、および第５，２７７，４００号に開示されている。パクリタキセルおよびタキソテールは、参考文献によって本明細書中に援用される開示である、国際公開第９３／１８２１０号、欧州特許第０ ２５３ ７３９号、欧州特許第０ ２５３ ７３９号、および国際公開第９２／０９５８９号の方法により調製することができる。特定の実施形態では、タキサン化合物はパクリタキセルまたはタキソテールである。
【００８９】
上述の組成物中のタキサン化合物とＬＮＡオリゴヌクレオチドの重量比は、２５：１〜１：２５の範囲、または１０：１〜１：２５の範囲、または１：１〜１：２５の範囲、または５０：１〜１：１０の範囲、または１：１〜１：５０の範囲、または２５：１〜１：１０の範囲といった、一般的には５０：１〜１：２５の範囲である。
【００９０】
さらなる実施形態では、本発明の薬学的組成物は一つ以上のＬＮＡオリゴヌクレオチドと第二の核酸標的を標的とする一つ以上の追加のアンチセンス化合物を含む場合がある。二つ以上を組み合わせた化合物が同時にまたは連続的に使用される場合がある。
【００９１】
非ステロイド抗炎症剤と副腎皮質ステロイド、抗ウイルス剤、および免疫調節剤を含む、しかしこれに限定されない抗炎症剤も、本発明の組成物に組み込まれる場合がある。二つ以上を組み合わせた化合物を同時にまたは連続的に使用される場合がある。
【００９２】
さらに、ＬＮＡオリゴヌクレオチドを含む薬学的組成物は、放射線療法などと組み合わせて使用される場合がある。
【００９３】
（医療処置）
本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載の多くの治療上の応用に有用である。一般的に、本発明の治療方法は治療有効量のＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドのほ乳類、特にヒトへの投与を含む。
【００９４】
従って、本発明は、投薬治療として使用するために本明細書に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチド、あるいは本明細書に記載の結合体とも関連する。
【００９５】
投薬は治療対象の疾患の重篤度と反応性に依存し、数日から数ヶ月、あるいは治癒するまで、または疾患状態の縮小が達成されるまで続く治療過程である。至適な投薬計画は、患者の体内の薬剤または代理マーカーの測定によっても評価可能である。
【００９６】
至適投薬量は、個別のオリゴヌクレオチドの相対的効力に依存して様々であり得る。一般的に、動物モデルでインビトロとインビボで有効であると見いだされたＥＣ５０に基づいて概算できる。一般的に、用量は体重ｋｇあたり０．０１μｇから１ｇであり、１日、週、月、年１回以上、あるいは２から１０年毎に一回投与される、または数時間から数ヶ月間まで継続的な輸液によって投与され得る。投薬の繰り返し率は測定された滞留時間と体液中または組織中の薬剤濃度に基づいて概算することができる。成功した治療後、患者は疾患状態の再発防止のための維持療法を受けるのが所望され得る。現在、当該用量の大部分は、例えば体重ｋｇあたり０．１ｍｇから４０ｍｇ、または０．５ｍｇから１０ｍｇなど、０．０１ｍｇから１００ｍｇであると考えられている。当該１回分は、１日１回であり得るが、より好ましくは、例えば週に１〜３回のより低頻度で、１〜４週の期間であり得る。維持療法は、例えば月に１〜４回、または年に１〜１０回といったさらに低頻度で継続され得る。
【００９７】
当業者は、ＬＮＡオリゴヌクレオチドが本発明の精神の範囲に含まれる様々な数多くの原理によってＨＩＦ−１ａ関連疾患と闘うのに使用可能であることを正しく理解するだろう。
【００９８】
本明細書で使用される場合「標的核酸」という用語は、ＨＩＦ−１ａをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡから転写されたＲＮＡ（ｍＲＮＡ前駆体とｍＲＮＡを含む）、および当該ＲＮＡに由来するｃＤＮＡも含む。
【００９９】
本明細書で使用される場合「遺伝子」という用語は、エキソン、イントロン、５’また３’非コーディング領域、および調節因子を含む遺伝子を意味し、現在知られているその全ての改変体と解明され得るそれ以外の改変体を意味する。
【０１００】
本明細書で使用される場合「ＬＮＡオリゴヌクレオチド」という用語は、例えば、標的遺伝子の「キメラプラスト」と「ＴＦＯ」、標的遺伝子のＲＮＡ転写物の「アンチセンス阻害因子」「ｓｉＲＮＡ」「ｍｉＲＮＡ」「リボザイム」および「オリゴザイム」、または標的遺伝子がコードするタンパク質の「アプタマー」「シュピーゲルマー」「デコイ」のいずれへの水素結合によって結合することでヒトにおいて望ましい治療効果を誘導可能なオリゴヌクレオチドを指す。
【０１０１】
本明細書で使用される場合「ｍＲＮＡ」という用語は、現在知られている標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物、および特定され得るそれ以外の転写物を意味する
本明細書で使用される場合「調節」という用語は、遺伝子発現における増加（刺激）または減少（阻害）のどちらかを意味する。本発明では阻害が遺伝子発現の調節の好ましい形態であり、ｍＲＮＡが好ましい標的である。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、アンチセンス化合物から特定の標的核酸までを「標的にする」という語は、細胞、動物、またはヒトにアンチセンス化合物がその意図された標的に結合し機能を調節出来るような方法でアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することを意味する。
【０１０３】
ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、現在のところほとんどわかっていない「アンチセンス様」の機構による特定の内因性または外因性遺伝子のサイレンスに細胞が利用する小分子の二本鎖ＲＮＡ分子であるｓｉＲＮＡとして設計される場合がある。
【０１０４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの臨床的有効性は、例えば吸収、分配、細胞による取り込み、代謝および排出などの薬物動態に大いに依存する。言い換えると、これらのパラメーターは、オリゴヌクレオチドの根本的な化学的性質とサイズ、三次元構造によって大いに左右される。
【０１０５】
本発明によるＬＮＡオリゴヌクレオチドの薬物動態特性の調節は、様々な異なる部分の結合によってさらに達成され得る。例えば、オリゴヌクレオチドが細胞膜を通過する能力は、例えばコレステロール部分、チオエーテル、脂肪族鎖、リン脂質またはポリアミンなどといった脂質部分のオリゴヌクレオチドへの結合によって向上し得る。同様に、ＬＮＡオリゴヌクレオチドの細胞への取り込みは、細胞質への輸送を仲介する膜中の分子と相互作用するオリゴヌクレオチドへの部分の結合により向上し得る。
【０１０６】
本発明による薬物動態特性は、ＬＮＡオリゴヌクレオチドの取り込みを向上させ、ＬＮＡオリゴヌクレオチドの分解に対する耐性などといった生理的安定性を向上させ、および／または、オリゴヌクレオチドの例えばｍＲＮＡ配列といった標的配列とのハイブリダイゼーション特性の特異性と親和性を増加させる基で向上し得る。
【０１０７】
本発明による薬学的組成物は、多くの様々な疾患の治療に利用可能である。癌細胞の増殖のように、血管内皮細胞はＨＩＦ−１ａ発現の下方調節に感受性である。従って、本発明による薬学的組成物は、新脈管形成を引き起こす異常な疾患を特徴とする疾患の治療に利用可能である。当該疾患の例は、一般的に癌であり、アテローム性動脈硬化症、乾癬、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、関節リウマチ、ぜんそく、炎症性腸疾患、いぼ、アレルギー性皮膚炎、およびカポジ肉腫である。
【０１０８】
一般的に述べられた、本発明の一つの特徴は、治療有効量のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の結合体のほ乳動物への投与を含む、異常な新脈管形成によって引き起こされる疾患を患った、またはその疾患に罹患しやすい哺乳動物の治療方法を対象にしている。
【０１０９】
さらに、本発明は、本明細書に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の結合体または本明細書に記載の薬学的組成物の投与を包含する新脈管形成の阻害方法にも関連する。
【０１１０】
本発明の興味深い特徴は、アテローム性動脈硬化症、乾癬、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、関節リウマチ、ぜんそく、炎症性腸疾患、いぼ、アレルギー性皮膚炎、炎症および皮膚炎、またはその他の皮膚関連疾患から選択される疾患の治療のための薬剤調製への本明細書に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の結合体または本明細書に記載の薬学的組成物の使用を対象にしている。
【０１１１】
本発明による薬学的組成物は、炎症性疾患、皮膚炎または例えば乾癬や関節リウマチといったその他の皮膚疾患または障害などといった炎症の治療にも利用可能である。
【０１１２】
同様に、本発明の別の興味深い特徴は、アテローム性動脈硬化症、乾癬、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、ぜんそく、炎症性腸疾患、いぼ、アレルギー性皮膚炎、炎症および皮膚炎、からなる群から選択される疾患の治療のための方法を対象とし、上述の方法は本明細書に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の結合体または本明細書に記載の薬学的組成物のそれを必要とする患者への投与を包含する。
【０１１３】
特に興味深いのは、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、乾癬、関節リウマチ、炎症性腸疾患、およびその他の炎症性疾患を含む新脈管形成疾患である。これらの疾患は、新脈管形成領域での新しく形成された血管による正常組織の破壊に特徴づけられる。例えば、黄斑変性症では、毛細血管が脈絡膜に侵入し破壊する。黄斑変性症における新脈管形成による脈絡膜の破壊は、最終的には部分的または完全な失明を引き起こす。
【０１１４】
本発明の方法は、好ましくは癌により引き起こされる疾患に対する治療または予防、特に肺、乳房、結腸、前立腺、膵臓、肝臓、甲状腺、腎臓、脳、精巣、胃、腸、腸（管）、脊髄、副鼻洞、膀胱、尿道、卵巣癌などといった組織で生じ得る癌の治療に用いられる。
【０１１５】
さらに、本明細書に記載の本発明は、当該治療が必要なヒトへのＬＮＡオリゴヌクレオチドの高用量を含むがそれに限定されない、治療有効量のＨＩＦ−１ａ調節ＬＮＡオリゴヌクレオチドを含む癌の予防または治療の方法を含む。本発明はさらにＨＩＦ−１ａ調節ＬＮＡオリゴヌクレオチドの短期間投与の利用を含む。正常、非癌性細胞は、特定の細胞タイプの頻度の特性で分類する。細胞が癌状態に変化した場合、制御不良の細胞増殖と細胞死の減少が生じ、従って、乱雑な細胞分裂または細胞増殖は癌性細胞タイプの顕著な特徴である。
【０１１６】
癌のタイプの例は、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫などの急性白血病）、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、子宮頸癌、精巣癌、肺癌、膀胱癌、黒色腫、頭頸部癌、脳の癌、原発部位不明の癌、新生物、末梢神経の癌、中枢末梢神経系の癌、腫瘍（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、小細胞肺癌、上皮性癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽腫、および網膜芽細胞腫）、重鎖病、転移、または無制御あるいは異常な細胞増殖で特徴づけられる任意の疾患または障害を含むがそれに限定されない。
【０１１７】
「癌腫」という用語は、上皮性起源の悪性腫瘍を示すよう意図されている。上皮組織は体の内部と外部の体表面を覆う、あるいは内側を覆う。上皮組織の例は、皮膚、粘膜、および体腔と腸、膀胱、子宮などといった内臓を裏打ちする漿膜である。上皮組織は、粘液分泌腺などの腺から深部組織層にまで拡大される場合もある。
【０１１８】
「肉腫」という用語は、軟骨、脂肪、筋肉、腱および骨などといった結合組織から増殖した悪性腫瘍を示すよう意図されている。
【０１１９】
本明細書で使われた場合、「神経膠腫」という用語はグリア細胞起源の悪性腫瘍を対象とするよう意図されている。
【０１２０】
癌治療用の薬剤製造のための本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは本発明の結合体の使用では、前述の癌は適宜、固形癌のタイプである。さらに、前述の癌は適宜、癌腫でもある。癌腫は一般的に悪性黒色腫、基底細胞癌、卵巣癌、乳癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌、膀胱癌、再発性表在性膀胱癌、胃癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、子宮頸癌、子宮頸部形成異常、喉頭乳頭腫症、結腸癌、結腸直腸癌、およびカルチノイド腫瘍からなる群から選択される。より一般的には、上記の癌腫は悪性黒色腫、非小細胞肺癌、乳癌、結腸癌、および腎細胞癌からなる群から選択される。悪性黒色腫は、一般的に表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端部黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、および線維硬化性黒色腫からなる群から選択される。
【０１２１】
あるいは、癌は適宜、肉腫である場合がある。肉腫は一般的には、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、悪性線維性組織球腫、線維肉腫、およびカポジ肉腫からなる群から選択されるタイプである。
【０１２２】
あるいは、癌は神経膠腫である場合がある。
【０１２３】
本明細書に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドと結合体は、多発性骨髄腫、腎臓、子宮頸癌、脳の癌、および乳癌からなる群から選択される癌疾患の治療にも特に有用であると考えられている。
【０１２４】
本発明は、癌の治療方法も提供し、当該方法は、本明細書に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の結合体または本明細書に記載の薬学的組成物のそれを必要とする患者への投与を含む。ある改変例では、癌は固形癌タイプである。固形癌は適宜、上述などの癌腫または肉腫または神経膠腫である。
【０１２５】
従って、本発明のさらなる特徴は、癌治療のための薬剤の製造のための本明細書に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の結合体の使用を対象としており、当該薬剤はさらに、「複合薬」の項で上述された群から選択される化学療法剤を含む。適宜、追加の化学療法剤は、タキソール、パクリタキセル、またはドセタキセルなどのタキサンから選択される。
【０１２６】
代わりになるべきものとして述べられた、本発明は、さらに癌の治療方法を対象としており、当該方法は、本明細書に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の結合体または本明細書に記載の薬学的組成物のそれを必要とする患者への投与を包含し、さらに、さらなる化学療法剤の投与を包含する。さらなる当該投与は、さらなる化学療法剤が本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチドに結合されるものが薬学的組成物中に存在しているか、あるいは別の製剤中で投与される。
【０１２７】
好ましい実施形態では、本発明は（ａ）一つ以上のアンチセンス化合物と（ｂ）姉妹染色分体の動原体でのマイクロチューブの脱重合化と張力形成を阻害するが、マイクロチューブは動原体に結合しない一つ以上のその他の化学療法剤を含む薬学的組成物を提供する。当該化学療法剤は、上記に記載のタキサンを含み、特にタキソール、パクリタキセル、またはドセタキセルである。本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチドと共に使用する場合、当該化学療法剤は、腫瘍細胞と腫瘍血管系の増殖中の内皮細胞中のＨＩＦ−１ａタンパク質濃度を減少させることでその後の化学療法剤との共処理に対して標的細胞を増感させる一定期間のオリゴヌクレオチド治療と共に開始して、連続的に使用する必要がある。
【０１２８】
別の好ましい実施形態では、本発明によるＬＮＡオリゴヌクレオチドを用いる治療法は、放射線療法と組み合わされる。本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチドと共に使用された場合、放射線療法は、腫瘍細胞と腫瘍血管系の増殖中の内皮細胞中のＨＩＦ−１ａタンパク質濃度を減少させることでその後の化学療法剤との共処理に対して標的細胞を増感させる一定期間のオリゴヌクレオチド治療と共に開始して、連続的に使用する必要がある。
【０１２９】
本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチドは、診断、治療法、予防のための研究試薬として利用することも可能である。研究ではアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的の機能的解析または治療的介入のための標的として有用性の評価を行い易くする細胞内と実験動物のＨＩＦ−１ａ遺伝子の合成を特異的に阻害する為に使用され得る。診断においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ノーザンブロッティング、インサイチュハイブリダイゼーションまたは類似の手法により細胞または組織内のＨＩＦ−１ａ発現の検出と定量に利用され得る。治療法では、ＨＩＦ−１ａの発現調節で治療され得る疾患または障害を有すると疑われる動物またはヒトが、本発明によるアンチセンスＬＮＡオリゴヌクレオチド投与により治療される。さらに提供されるのは、ＨＩＦ−１ａの発現に関連する疾患または状態を有する、またはその傾向があると疑われる動物、特にマウス、ラット、およびヒトの、医薬的、または予防的な有効量の一つ以上の本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは結合体または薬学的組成物の投与による治療方法である。
【０１３０】
本発明のさらなる特徴は、本明細書に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の結合体または本明細書に記載の薬学的組成物の投与を含むアポトーシスの誘導方法を対象としている。アポトーシスの誘導は、インビトロまたはインビボである場合がある。誘導は、細胞アッセイまたは組織試料でまたは生きた哺乳動物で行われ得る。
【０１３１】
本発明に関連した特徴は、本明細書に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の結合体または本明細書に記載の薬学的組成物の投与を含む細胞増殖の予防方法を対象としている。増殖の予防は、インビトロまたはインビボである場合がある。予防は、細胞アッセイまたは組織試料でまたは生きた哺乳動物で行われ得る。
【０１３２】
一層さらに、本発明は、新脈管形成疾患と関連した新脈管形成が阻害されるように、本明細書に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の結合体または本明細書に記載の薬学的組成物の投与を含む新脈管形成疾患の治療方法とも関連する。
【０１３３】
ある実施形態においては、新脈管形成疾患は癌と関連する腫瘍を含む。上記参照。癌は好ましくは、乳癌、肺癌、頭頸部癌、脳の癌、腹腔内の癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、消化管癌、神経膠腫、肝臓癌、舌癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、多発性骨髄腫、皮膚癌、リンパ腫、および血液癌からなる群から選択される。あるいは、癌は多発性骨髄腫、腎臓癌、子宮頸癌、結腸癌、脳の癌、および乳癌からなる群から選択される。
【０１３４】
新脈管形成疾患も糖尿病性網膜症、黄斑変性症、および炎症性疾患からなる群からも選択される。特に、新脈管形成疾患は炎症性腸疾患、乾癬、および関節リウマチからなる群から選択される炎症性疾患である。
【０１３５】
黄斑変性症の治療は特に本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチドと関連していると考えられている。
【０１３６】
（キット）
薬学的組成物が液体である場合、ＬＮＡオリゴヌクレオチドの安定性を妥協する状況の対象になる危険があり、例えば凍結乾燥した原料として固形のＬＮＡオリゴヌクレオチドを含む最終製品を製造し、当該固形状態で製品を保存するのが所望され得る。製品は投与前に、食塩水中または緩衝食塩水中で再構成され（例えば溶解されるかまたは懸濁される）、使用できる状態にされ得る。
【０１３７】
従って、本発明は
（ａ）本明細書の上記に記載の、固形状態のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは結合体を含む第一の構成要素、および
（ｂ）当該ＬＮＡオリゴヌクレオチドの再構成（例えば、溶解または懸濁）に適した食塩水または緩衝液（例えば、緩衝食塩）を含む第二の構成要素、
を備えるキットも提供する。
【０１３８】
好ましくは当該食塩水または緩衝食塩水は４．０〜８．５の範囲のｐＨであり、２０〜２０００ｍＭのモル濃度である。好ましい実施形態では、食塩水または緩衝食塩水は６．０〜８．０の範囲のｐＨであり、１００〜５００ｍＭのモル濃度である。最も好ましい実施形態では、食塩水または緩衝食塩水は７．０〜８．０の範囲のｐＨであり、１２０〜２５０ｍＭのモル濃度である。
【０１３９】
このようなキットでは、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは好ましくは配列番号１、配列番号２、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１８からなる群から選択される。より具体的には、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは配列番号１と配列番号２からなる群から選択される。
【０１４０】
本発明はさらに限定されない方法で以下の実施例に例証される。
【実施例】
【０１４１】
（実験）
（実施例１：モノマー合成）
ＬＮＡモノマーの基礎ユニットとその派生物は、以下の公表された方法とそこで引用された参考文献に従って調製された。例として、国際公開第０３／０９５４６７号、およびＤ．Ｓ．Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｃ．Ｒｏｓｅｎｂｏｈｍ，Ｔ．Ｋｏｃｈ（２００２）Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＮＡ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ６，８０２−８０８を参照。
【０１４２】
（実施例２：オリゴヌクレオチド合成）
オリゴヌクレオチドは、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９００／ＭＯＳＳ合成機（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）でホスホルアミダイト手法を用いて１μｍｏｌまたは１５μｍｏｌスケール合成した。より大規模な合成には、Ａｅｋｔａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔを用いた。合成の最後（ＤＭＴ−ｏｎ）に、アンモニア水で１〜２時間室温で処理してオリゴヌクレオチドを固形支持体から解離させ、さらに６５℃で４時間脱保護を行った。オリゴヌクレオチドを逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で精製した。ＤＭＴ基の除去後、オリゴヌクレオチドは、ＡＥ−ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＣＧＥの性質を持ち、分子量をさらにＥＳＩ−ＭＳで確認した。詳細は下記参照のこと。
【０１４３】
（ＬＮＡ固形支持体の調製：）
（ＬＮＡスクシニルヘミエステルの調製）
５’−Ｏ−Ｄｍｔ−３’−ヒドロキシ−ＬＮＡモノマー（５００ｍｇ）、無水スクシニル（１．２等量）、およびＤＭＡＰ（１．２等量）をＤＣＭ（３５ｍｌ）中に溶解した。反応は、撹拌して室温で一晩行った。０．１ＭのＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ５．５（２回）とブライン（１回）で抽出後、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４でさらに乾燥させ、濾過して蒸発させた。ヘミエステル誘導体が９５％の収量で得られ、さらなる精製なしに使用した。
【０１４４】
（ＬＮＡ支持体の調製）
上記で調製されたヘミエステル誘導体（９０μｍｏｌ）を最低量のＤＭＦ中に溶解し、ＤＩＥＡ、およびｐｙＢＯＰ（９０μｍｏｌ）を添加して１分間混合した。この前活性化混合液を手動合成機中でＬＣＡＡ−ＣＰＧ（５００A、８０〜１２０メッシュサイズ、３
００ｍｇ）と混合し、撹拌した。室温で１．５時間後、支持体を濾過し、（残留物を）ＤＭＦ、ＤＣＭおよびメタノールで洗浄した。乾燥後、ローディングは５７μｍｏｌ／ｇであると測定された（Ｔｏｍ Ｂｒｏｗｎ，Ｄｏｒｃａｓ Ｊ．Ｓ．Ｂｒｏｗｎ．Ｍｏｄｅｒｎ ｍｅｃｈｉｎｅ−ａｉｄｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉｎ：Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｏｘｆｏｒｄ：ＩＲＬ ｐｒｅｓｓ，１９９１：１３−１４を参照）。
【０１４５】
（オリゴヌクレオチドの伸長）
ホスホルアミダイトのカップリング（Ａ（ｂｚ）、Ｇ（ｉｂｕ）、５−メチル−Ｃ（ｂｚ））またはＴ−β−シアノエチル−ホスホルアミダイト）を、０．１Ｍの５’−Ｏ−ＤＭＴで保護されたアミダイトのアセトニトリル溶液と活性剤としてＤＣＩ（４，５−ｄｉｃｙａｎｏｉｍｉｄａｚｏｌｅ）のアセトニトリル溶液（０．２５Ｍ）で行う。チオール化は、塩化キサンタン（アセトニトリル：ピリジン１０％の０．０１Ｍ溶液）を用いることで行われる。残りの試薬は、オリゴヌクレオチド合成に一般的に用いられるものである。供給業者が提供するプロトコルを都合良く至適化した。
【０１４６】
（ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製：）
カラム：Ｘｔｅｒｒａ ＲＰ１８
流速：３ｍｌ／分
緩衝液：０．１Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ８およびアセトニトリル。
【０１４７】
（略語）
ＤＭＴ：ジメトキシトリチル
ＤＣＩ：４，５−ジシアノイミダゾール
ＤＭＡＰ：４−ジメチルアミノピリジン
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＤＩＥＡ：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＰｙＢＯＰ：ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェイト
Ｂｚ：ベンゾイル
Ｉｂｕ：イソブチリル。
【０１４８】
（実施例３：ＬＮＡオリゴヌクレオチドの設計）
【０１４９】
【表１】
表１では、大文字がβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログ（β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ）を示し、小文字が２−デオキシヌクレオチドを示し、下線がβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログまたは２−デオキシヌクレオチドのどちらかを示し、下付き文字「ｓ」が隣接するヌクレオチドとＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、隣接するヌクレオチドとＬＮＡヌクレオチドアナログの間に下付き文字がない場合はホスホロジエステル結合を示し、下付き文字「ｘ」が隣接するヌクレオチドとＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合のいずれかを示し、括弧内のヌクレオチドユニットは、例えば（Ｔｘ）または（Ｇｘ）はそれぞれ任意のユニットを表す。全てのＬＮＡ−Ｃモノマーは５−メチル−Ｃ（ＭｅＣ）である。
【０１５０】
（化合物の融解温度（Ｔｍ）の測定）
３μＭの配列番号１の１０ｍＭリン酸ナトリウム／１００ｍＭのＮａＣｌ／０．１ｎＭのＥＤＴＡ溶液、ｐＨ７．０を、配列番号１と相補的なＤＮＡ／ＲＮＡ ３μＭの１０ｍＭリン酸ナトリウム／１００ｍＭのＮａＣｌ／０．１ｎＭのＥＤＴＡ溶液、ｐＨ７．０を、９０℃、１分で混合し、室温まで冷却させる。二本鎖のＴｍは、１℃／分の２５から９５℃までの温度上昇で測定した。配列番号１のＴｍを下の表２に示す。
【０１５１】
【表２】
（実施例４：ヒトまたはラットの血漿におけるＬＮＡオリゴヌクレオチドの安定性）
ＬＮＡオリゴヌクレオチドの安定性をヒトまたはラットの血漿（マウス、サル、またはイヌの血漿である可能性もある）で試験した。４５μｌの血漿に５μｌのＬＮＡオリゴヌクレオチドを加える（終濃度２０μＭ）。ＬＮＡオリゴヌクレオチドを血漿中で０から９６時間の範囲で３７℃でインキュベートする（血漿は、ヌクレアーゼ活性を９６時間までテストしてヌクレアーゼ開裂パターンに違いがないことが示された）。指示された時間に、試料を液体窒素中で急速凍結した。血漿中の２μｌ（４０ｐｍｏｌ相当）のＬＮＡオリゴヌクレオチドを水１５μｌと３μｌの６ｘｌｏａｄｉｎｇ ｄｙｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えることで希釈した。マーカーとして、１０ｂｐラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １０８２１−０１５）を用いる。１μｌのラダーに対して１μｌの６ｘｌｏａｄｉｎｇ ｄｙｅと４μｌの水を添加する。試料を混合し、６５℃で１０分間加熱し、プレランゲル（１６％アクリルアミド、７Ｍ尿素、１ｘＴＢＥ、５０ワットで１時間プレラン）にローディングし、５０〜６０ワットで２時間半泳動する。その後、ゲルを１ｘＴＢＥ中の１ｘＳｙＢＲ ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で１５分間染色する。バンドは、ＢｉｏＲａｄのホスホイメージャーで可視化した。（ラット血漿は図１Ａを、ヒトとラット血漿は図１Ｂを参照）。
【０１５２】
ＬＮＡオリゴヌクレオチドの安定性をヒトの血漿（ラット、マウス、サル、またはイヌの血漿である可能性もある）で試験した。終濃度２０μＭのＬＮＡオリゴヌクレオチド（１から５μｌの間）を全体量２０μｌの血漿に加え、０から２４時間の範囲でインキュベートした（７２時間までであり得る。血漿は７２時間までヌクレアーゼ活性をテストしてヌクレアーゼ開裂パターンに違いがないことが示された）。指示された時間に、試料を−８０℃で保存した。血漿中の１μｌ（２０ｐｍｏｌ相当）のＬＮＡオリゴヌクレオチドを水で１０倍に希釈し、１０ｂｐラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カタログ番号：１０８２１−０１５））と共に１６％アクリルアミド７Ｍ尿素ゲルで泳動した。１ｘＴＢＥ中の１ｘＳｙＢＲ ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で１５分間の染色前に、ゲルを約４０ワットで２〜３時間泳動した。バンドは、ＢｉｏＲａｄのホスホイメージャーで可視化した。（図１を参照）。
【０１５３】
（実施例５：インビトロモデル：細胞培養）
標的核酸の発現に対するＬＮＡオリゴヌクレオチド作用は、標的核酸が測定可能な濃度で存在するなら、様々な任意の細胞タイプで試験可能である。標的は当該核酸をコードする各線の内因的、あるいは一時的または安定な形質移入で発現させることができる。
【０１５４】
標的核酸の発現レベルは、例えば、ノーザンブロット解析や定量ＰＣＲ、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイなどを用いてごく普通に測定可能である。以下の細胞タイプを実例の目的で挙げるが、選択した細胞タイプで標的が発現されるなら、その他の細胞の種類が普通に使用され得る。
【０１５５】
細胞を以下に記載の適切な培地で培養し、３７℃、９５〜９８％の湿度と５％ＣＯ２で維持した。低酸素または酸素欠乏条件下で培養する場合、Ｏ２濃度はそれぞれ１〜２％または０〜０．５％に保った。細胞は普通に週に２〜３回継代した。
１５ＰＣ３：ヒト前立腺癌細胞株１５ＰＣ３は、オランダ、ＡＭＣ、Ｎｅｕｒｏｚｉｎｔｕｉｇｅｎ研究室のＤｒ．Ｆ．Ｂａａｓのご好意で提供され、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ Ｉ、ゲンタマイシンを加えたＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）培地中で培養した。
ＰＣ３：ヒト前立腺癌細胞株ＰＣ３をＡＴＣＣから購入し、グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）と１０％ＦＢＳ、ゲンタマイシンを加えたＦ１２ Ｃｏｏｎの培地で培養した。
５１８Ａ２：ヒトメラノーマ癌細胞株５１８Ａ２を、ウィーン大学の臨床薬学部、分子薬学、実験腫瘍学部門のＤｒ．Ｂ．Ｊａｎｓｅｎのご好意で提供され、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ Ｉ、ゲンタマイシンを加えたＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）培地中で培養した。
Ｕ３７３：膠芽腫細胞Ｕ３７３を、１０％ウシ胎仔血清とＧｌｕｔａｍａｘ Ｉ、ＮＥＡＡ、ピルビン酸ナトリウム、ゲンタマイシンを含むＥＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）培地中で、３７℃、９５％の湿度、５％ＣＯ２で培養した。
ＨｅＬａ：子宮頸癌細胞株Ｈｅｌａを、１０％ウシ胎仔血清とゲンタマイシンを含むＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）培地中で、３７℃、９５％の湿度、５％ＣＯ２で培養した。
ＭＰＣ−１１：マウス多発性骨髄腫細胞株ＭＰＣ−１１をＡＴＣＣより購入し、４ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘと１０％ウマ血清を加えたＤＭＥＭ培地で維持した。
ＤＵ−１４５：ヒト前立腺癌細胞株ＤＵ−１４５をＡＴＣＣより購入し、Ｇｌｕｔａｍａｘと１０％ＦＢＳを加えたＲＰＭＩ培地で維持した。
ＲＣＣ−４＋／−ＶＨＬ：ＶＨＬを発現するプラスミドまたは空のプラスミドで安定に形質移入したヒト腎臓癌細胞株ＲＣＣ４をＥＣＡＣＣから購入し、製造会社の取扱説明に従って維持した。
７８６−０：ヒト腎臓癌細胞株７８６−０をＡＴＣＣより購入し、製造会社の取扱説明に従って細胞を維持した。
ＨＵＶＥＣ：ヒト臍静脈内皮細胞株ＨＵＶＥＣをＣａｍｃｒｅｘから購入し、ＥＧＭ−２培地で維持した。
Ｋ５６２：ヒト慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２をＥＣＡＣＣより購入し、Ｇｌｕｔａｍａｘと１０％ＦＢＳを加えたＲＰＭＩ培地で、維持した。
Ｕ８７ＭＧ：ヒトグリア芽細胞腫細胞株Ｕ８７ＭＧをＡＴＣＣより購入し、製造会社の取扱説明に従って維持した。
Ｂ１６：マウス黒色腫細胞株Ｂ１６はＡＴＣＣより購入し、製造会社の取扱説明に従って維持した。
ＬＮＣａｐ：ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａｐはＡＴＣＣより購入し、Ｇｌｕｔａｍａｘと１０％ＦＢＳを加えたＲＰＭＩ培地で維持した。
【０１５６】
（実施例６：インビトロモデル：アンチセンスオリゴヌクレオチド処理）
細胞培養と形質移入：Ｕ３７３またはＨｅＬａ細胞を１２穴プレートに、１０％ＦＢＳとＧｌｕｔａｍａｘ Ｉ、ゲンタマイシンを添加したＤ培地中に３７℃（５％のＣＯ２）で播種した。細胞が６０〜７０％コンフルエントの時に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（２．５〜５μｇ／ｍｌ）を用いて様々な濃度のオリゴヌクレオチド（０．２〜１００ｎＭ）で二組みで形質移入した。形質移入は、基本的にＤａａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４，ＪＢＣ ２６９：１６４１６−１６４２４）に記載のとおりに行った。つまり、細胞をＯｐｔｉＭＥＭ中のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅで１０分間インキュベートし、ウェル当たり総量０．５ｍＬの形質移入混合液にオリゴヌクレオチド添加した。４時間後、形質移入混合液を除去し、細胞を洗浄し、適切な培地中で、正常酸素または低酸素のいずれかの間に３７℃で約２０時間（ｍＲＮＡ解析とタンパク質解析）増殖させた。
【０１５７】
（実施例７：インビトロモデル：ＲＮＡ抽出とｃＤＮＡ合成）
（全ＲＮＡの単離）
全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログｎｏ．７４１０４）を用いるか、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログｎｏ．１５５９６）を用いて単離した。
【０１５８】
ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で全ＲＮＡ単離する場合は、細胞をＰＢＳで洗浄し、１％メルカプトエタノールを添加したＣｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ＲＴＬ、Ｑｉａｇｅｎ）を壁に直接添加した。数分後、製造会社の取扱説明に従って試料を処理した。
【０１５９】
組織試料は、Ｒｅｔｓｃｈ ３００ＭＭホモジナイザーでホモジナイズし、全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ試薬またはＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔを用いて製造会社の記載どおりに単離した。
【０１６０】
（一本鎖合成）
一本鎖合成は、ＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ
ｋｉｔ またはＭ−ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（基本的に、製造会社（Ａｍｂｉｏｎ）の記載どおり）のいずれかを用いて、製造会社の取扱説明（Ｑｉａｇｅｎ）に従って行った。ＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを使用する場合、各試料あたり０．５μｇの全ＲＮＡを１２μｌに調節し、０．２μｌのポリ（ｄＴ）１２−１８（０．５μｇ／μｌ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２μｌのｄＮＴＰミックス（各５ｍＭ）、２μｌの１０ｘＲＴ緩衝液、０．５μｌのＲＮＡｇｕａｒｄＴＭ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（３３ｕｎｉｔ／ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）、および１μｌのＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅと混合し、次いで３７℃で６０分インキュベートし、９３℃で５分間の加熱不活性化を行った。
【０１６１】
ランダムデカマーとＭ−ＭＬＶ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（基本的に、製造会社（Ａｍｂｉｏｎ）の記載どおり）を用いて一本鎖合成を行った場合、各試料の全ＲＮＡの０．２５μｇを水で１０．８μｌに調節し、２μｌデカマーと２μｌのｄＮＴＰミックス（各２．５ｍＭ）を添加した。試料を７０℃で３分間加熱し、直ちに氷水で冷却し、２μｌの１０ｘＲＴ緩衝液、１μｌのＭ−ＭＬＶ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、０．２５μｌのＲＮａｓｅ阻害剤を含む３．２５μｌの混合物を添加した。ｃＤＮＡは、４２℃で６０分間合成し、次いで９５℃で１０分間の加熱不活性化を行い、最後に４℃に冷却した。
【０１６２】
（実施例８：インビトロおよびインビボモデル：ＨＩＦ−１ａ発現のオリゴヌクレオチド阻害のリアルタイムＰＣＲによる解析）
ＨＩＦ−１ａ発現のアンチセンス調節は、当該技術分野に周知の様々な方法でアッセイ可能である。例えば、ＨＩＦ−１ａ ｍＲＮＡ濃度は、例えば、ノーザンブロット解析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ法（ＲＰＡ）、またはリアルタイムＰＣＲで定量可能である。リアルタイム定量ＰＣＲが現在好ましい。ＲＮＡ解析は、細胞の全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを対象に行うことができる。
【０１６３】
ＲＮＡの単離方法とノーザンブロット解析などのＲＮＡの解析方法は、当該技術分野で日常的な方法であり、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓに説明されている。
【０１６４】
リアルタイム定量ＰＣＲは、ＢｉｏＲＡＤから入手可能な市販のｉＱ Ｍｕｌｔｉ−Ｃｏｌｏｒ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて簡便に行うことができる。
【０１６５】
（ＨＩＦ−１ａ ｍＲＮＡ濃度のリアルタイム定量ＰＣＲ解析）
ｍＲＮＡ濃度の定量は、ｉＱ Ｍｕｌｔｉ−Ｃｏｌｏｒ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲＡＤ）を用いたリアルタイム定量ＰＣＲで製造会社の取扱説明書に従って測定した。
【０１６６】
リアルタイム定量ＰＣＲは、当該技術分野でよく知られた技術であり、例えば、Ｈｅｉｄ ｅｔ ａｌ．Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９６），６：９８６−９９４に説明されている。
【０１６７】
Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ ＵＤＧ ２ｘ ＰＣＲマスターミックスをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログｎｏ．１１７３０から入手した。プライマーとＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブをＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｋ ＡＧ，Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙより入手した。
【０１６８】
グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、１８Ｓ ＲＮＡまたはβ−アクチンｍＲＮＡの量を試料調製の変動の正規化に内部コントロールとして用いた。
【０１６９】
試料中のヒトＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ含量は、ヒトＧＡＰＤＨ ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ Ｐｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ＴａｑＭａｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログｎｏ．４３１０８８４Ｅ）を用いて製造会社の取扱説明書に従って定量した。
【０１７０】
ヒトＨＩＦ−１ａでは、ＰＣＲプライマーはフォワードプライマー：５’−ＣＴＣＡＴＣＣＡＡＧＡＡＧＣＣＣＴＡＡＣＧＴＧＴＴ−３’（配列番号２１）（アッセイでの終濃度、０．９μＭ）、リバースプライマー：５’−ＧＣＴＴＴＣＴＣＴＧＡＧＣＡＴＴＣＴＧＣＡＡＡＧＣ−３’（配列番号２２）（アッセイでの終濃度、０．９μＭ）、およびＰＣＲプローブ：５’ＦＡＭ−ＣＣＴＣＡＧＧＡＡＣＴＧＴＡＧＴＴＣＴＴＴＧＡＣＴＣＡＡＡＧＣＧＡＣＡ−ＴＡＭＲＡ ３’（配列番号２３）（アッセイでの終濃度、０．１μＭ）だった。
【０１７１】
カニクイザルＨＩＦ−１ａでは、ＰＣＲプライマーはＩフォワードプライマー：５’−ＧＣＴＴＡＣＣＡＴＣＡＧＣＴＡＴＴＴＧＣＧＴＧＴＧ−３’（配列番号２４）（アッセイでの終濃度、０．９μＭ）、リバースプライマー：５’−ＧＡＡＣＣＡＴＡＡＣＡＡＡＡＣＣＡＴＣＣＡＡＧＧＣ−３’（配列番号２５）（アッセイでの終濃度、０．９μＭ）、およびＰＣＲプローブ：５’ＦＡＭ−ＴＣＡＴＣＴＴＣＡＡＴＡＴＣＣＡＡＡＴＣＡＣＣＡＧＣＡＴＣＣＡＧＡＡＧ−ＴＡＭＲＡ ３’（配列番号２６）（アッセイでの終濃度、０．１μＭ）だった。
【０１７２】
１８ＳリボソームＲＮＡの定量では、ＴａｑＭａｎ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ １８Ｓ ｒＲＮＡ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ試薬（ＰＡＲＴ＃ ４３１０８７５、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造会社の取扱説明書にしたがって用いた。
【０１７３】
マウスＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの定量では、以下のプライマーとプローブを設計した。
【０１７４】
センスプライマー：５’−ＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＧＣＡＡＧＧＴＣＡＴＣ−３’（配列番号２７）（アッセイでの終濃度、０．３μＭ）、
アンチセンスプライマー：５’−ＧＴＣＡＧＡＴＣＣＡＣＧＡＣＧＧＡＣＡＣＡＴＴ−３’（配列番号２８）（アッセイでの終濃度、０．６μＭ）、
ＴａｑＭａｎプローブ：５’ＦＡＭ−ＧＡＡＧＣＴＣＡＣＴＧＧＣＡＴＧＧＣＡＴＧＧＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号２９）（アッセイでの終濃度、０．２μＭ）だった。
【０１７５】
（ＴａｑＭａｎプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ）
実施例６の記載どおりに行われた一本鎖合成のｃＤＮＡは、２〜２０倍に希釈し、リアルタイム定量ＰＣＲで解析した。プライマーとプローブを２ｘ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ ＵＤＧ（カタログｎｏ．１１７３０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、３．３μｌのｃＤＮＡに最終量２５μｌになるよう添加した。各試料を３つ組で解析した。対象のＲＮＡを発現している細胞株から精製した材料で調製したｃＤＮＡの２倍希釈物のアッセイで、アッセイの標準曲線を作成した。鋳型を用いないコントロールではｃＤＮＡの代わりに滅菌水を用いた。ＰＣＲプログラム：５０℃で２分、９５℃で１０分、次いで９５℃で１５秒を４０サイクル、６０℃で１分。
【０１７６】
標的ｍＲＮＡの相対量は、ｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍソフトウェアを用いて算出された閾値サイクルから決定した（図２参照）。
【０１７７】
（ＳｙＢＲ ＧｒｅｅｎリアルタイムＰＣＲ）
マウスＨＩＦ１α ｍＲＮＡの相対レベルを決定するため、ｃＤＮＡをＢｉｏＲＡＤのｉＣｙｃｌｅｒを用いた定量ＰＣＲ解析に用いた。
【０１７８】
５倍希釈したｃＤＮＡ ８μｌに、２９．５μｌのＰｌａｔｉｎｕｍ ｑＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ−ＵＤＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、各１０３０ｎＭのプライマー、０．５７×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、および１１．４ｎＭのフルオロセイン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を含む５２μｌの混合液を添加した。
【０１７９】
２５μｌの二組をＱ−ＰＣＲに用いた。５０℃で１２０秒、９５℃で１２０秒、（９５℃で３０秒と６０℃で６０秒）を４０サイクル。
【０１８０】
ＨＩＦ１ａ ｍＲＮＡの発現は、同様にＱ−ＰＣＲで定量したマウスβ−アクチンｍＲＮＡで正規化した。
【０１８１】
プライマー：
ｍＨＩＦ１ａ：５’−ＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＴＴＴＴＡＣＣＡＴＧＣ−３’（配列番号３０）、および５’−ＧＧＡＧＴＧＴＴＴＡＣＧＴＴＴＴＣＣＴＧＡＡＧ−３’（配列番号３１）
ｍβ−アクチン：５’−ＣＣＴＴＣＣＴＴＣＴＴＧＧＧＴＡＴＧＧＡＡ−３’（配列番号３２）、および５’−ＧＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＧＣＡＡＴＧＡＴＣＴ−３’（配列番号３３）
ｍＶＥＧＦ：５’−ＣＡＣＧＡＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＴＣ−３’（配列番号３４）、および５’−ＧＴＣＧＧＧＧＴＡＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＴ−３’（配列番号３５）
ＢＣＬ−２：フォワード：５’−ｇｃｃｃｔｇｔｇｇａｔｇａｃｔｇａｇｔａ−３’（配列番号３６）、およびリバース：５’−ｃａｇｃｃａｇｇａｇａａａｔｃａａａｃａｇ−３’（配列番号３７）
無処理のマウス線維芽細胞（Ｌｔｋ細胞）（５倍に希釈され、ＨＩＦ１αとβ−アクチンの両方を発現している）から合成したｃＤＮＡの２倍希釈物を、アッセイのための標準曲線の作成に用いた。ＨＩＦ１α ｍＲＮＡの相対量は、ｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍソフトウェアを用いて算出された閾値サイクルから決定した。
【０１８２】
（実施例９：インビトロ解析：ＨＩＦ−１ａタンパク質レベルのウェスタンブロット解析）
形質移入した細胞におけるＨＩＦ−１ａ ＬＮＡオリゴヌクレオチドのＨＩＦ−１ａタンパク質レベルに対するインビトロ作用をウェスタンブロットで測定した。
【０１８３】
プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を添加した５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８、１０％グリセロール、２．５％のＳＤＳ、５ｍＭのＤＴＴおよび６Ｍ尿素中に細胞を回収し、溶解した。総タンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて測定した。２０〜１００μｇの総タンパク質をＭＯＰＳ緩衝液の１０〜１２％のビス−トリスゲル、または３〜８％のトリス酢酸ゲルで泳動し、ＰＶＤＦ膜に製造会社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の取扱説明書に従ってブロットした。ブロッキング緩衝液（５％脱脂粉乳を添加したＰＢＳ−Ｔ）中での一晩のインキュベーションの後、膜を一晩抗ＨＩＦ−１ａ抗体、Ｂｃｌ−２抗体、ＶＥＧＦ抗体、またはその他のＨＩＦ−１ａ下流を検出する抗体でインキュベートした。ローディングコントロールとして、チューブリンまたはアクチンをＮｅｏｍａｒｋｅｒのモノクローナル抗体を用いて検出した。次に、膜を２次抗体でインキュベートし、ＨＩＦ−１ａを発色免疫検出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または化学発光ＥＣＬ＋検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて可視化した。（図２Ａおよび図２Ｂ参照）
（実施例１０：インビトロ解析：アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたヒトＨＩＦ−１ａ発現のアンチセンス阻害とその下流標的のＶＥＧＦＡとＭＭＰ−２への作用）
ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、Ｕ３７３細胞由来の培地中の下流標的ＶＥＧＦＡおよびＭＭＰ−２への作用もある。Ｕ３７３細胞はＴ２５フラスコ中０．３×１０６細胞で（時間実験）またはＴ８０フラスコ中０．６×１０６細胞で（４８時間濃縮実験）播種した。Ｕ３７３細胞を１０％ＦＢＳ、Ｇｌｕｔａｍａｘ Ｉおよびゲンタマイシンを添加した増殖培地中で３７℃（５％のＣＯ２）に置く。播種の翌日、様々な濃度のオリゴヌクレオチド（０．２〜１０ｎＭ）を用い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ２０００（２．５μｇ／ｍｌ）を用いて、二組または三つ組みで細胞にＬＮＡオリゴヌクレオチドを形質移入した。形質移入は、基本的にＤｅａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４，ＪＢＣ ２６９：１６４１６−１６４２４）の記載どおりに行った。つまり、細胞をＯｐｔｉＭＥＭ中のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅで１０分間インキュベートし、次いでオリゴヌクレオチド添加した。４時間後、形質移入混合液を除去し、細胞を洗浄し、適切な培地中で、酸素欠乏または低酸素のいずれかの間に３７℃で約２０時間（ｍＲＮＡ解析とタンパク質解析）増殖させた。示された時間に細胞の上清を回収した。プロテアーゼ阻害剤の添加を、−８０℃での保存前に加えた。ＲＤ ｓｙｓｔｅｍｓのヒトＶＥＧＦＡ ＥＬＩＳＡ（カタログｎｏ．ＤＶＥ−００）およびＭＭＰ−２ ＥＬＩＳＡ（カタログｎｏ．ＤＭＰ−２００）を製造会社に従って用いた。回収時間によって、上清を測定前に５〜５０倍に希釈した。図１２Ａ−Ｅを参照。
【０１８４】
（実施例１１：ＬＮＡオリゴヌクレオチドによるアポトーシスの誘導）
（細胞培養）
膠芽細胞腫細胞株Ｕ３７３（ＡＴＣＣ）は、１０％ウシ胎仔血清、Ｇｌｕｔａｍａｘ Ｉ、ＮＥＡＡ、ピルビン酸ナトリウム、およびゲンタマイシンを添加したＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ）で、３７℃、湿度９５％、５％ＣＯ２で培養した。細胞が６０〜７０％コンフルエントに達した時、細胞をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（２．５μｇ／ｍｌ）を用いて形質移入した。
【０１８５】
子宮頸癌細胞株ＨｅＬａは、１０％ウシ胎仔血清とゲンタマイシンを添加したＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ）で、３７℃、湿度９５％、５％ＣＯ２で培養した。細胞が６０〜７０％コンフルエントに達した時、細胞をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（５μｇ／ｍｌ）を用いて形質移入した。
【０１８６】
（活性型カスパーゼ３／７活性の測定）
形質移入の前日に、９６穴プレート（Ｎｕｎｃ １３６１０１）にウェルあたり７０００細胞の密度でＭＥＭ完全培地中にＵ３７３細胞を播種した。翌日、細胞を予め温めたＯｐｔｉＭＥＭで１回洗浄し、次にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２．５μｇ／ｍｌを含む７２μｌのＯｐｔｉＭＥＭを加えた。ＯｐｔｉＭＥＭで希釈した１８μｌのオリゴヌクレオチドの添加前に、細胞を７分間インキュベートした。オリゴヌクレオチドの最終濃度は、０．２ｎＭから１００ｎＭの範囲だった。処理６時間後、細胞をＯｐｔｉＭＥＭで洗浄し、血清を含む１００μｌのＤＭＥＭを加えた。処理済みのＵ３７３細胞の同様の９６穴プレートを、回収時間までＡｎａｅｒｏｃｕｌｔバッグ（Ｍｅｒｃｋ）中に９６穴プレートを置くことで、正常酸素圧または低酸素圧／酸素欠乏下で培養した。プレートを示した時間に１５分間室温に平衡化させた。１００μｌの高感度Ｃａｓｐａｓｅ ３／７−ＧｌｏＴＭ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を直接９６穴中の細胞に添加し、プレートを１時間インキュベートし、Ｔｈｅｒｍｏ ＬａｂｓｙｓｔｅｍｓのＬｕｍｉｎｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ機でさらに１分の誘導期間後にルミネセンス（ルシフェラーゼ活性）を記録した。ルシフェラーゼ活性は、秒あたりの相対光ユニット（ＲＬＵ／ｓ）として測定する。データをＡｓｃｅｎｔ ソフトウェア２．４．２．で処理し、誘導倍率のグラフをコントロールに対する相対値としてエクセルで描いた。
【０１８７】
形質移入した細胞を活性型カスパーゼ３／７の活性を阻害するカスパーゼ３／７阻害剤でインキュベートし、アポトーシス反応の特異性を実証するために用いた。さらに、スタウロスポリン、カンプトセシンまたはタキソールで誘導される細胞は、ポジティブコントロールとして役目を果たす。（図３Ａおよび図３Ｂを参照）
（アネキシンＶ−ＦＩＴＣフローサイトメトリー解析）
１×１０６のＨｅＬａ細胞を形質移入前日にＴ７５フラスコに播種した。形質移入当日、細胞を３７℃のＯｐｔｉＭＥＭで１回洗浄し、次に２．５μｇ／ｍｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＯｐｔｉＭＥＭ ７ｍｌを加えた。細胞を７分間インキュベートし、ＯｐｔｉＭＥＭで終濃度１〜２５ｎＭに希釈した１７００μｌのオリゴヌクレオチドを添加した。模擬形質移入細胞をコントロールとした。処理４時間後、細胞をＯｐｔｉＭＥＭで洗浄し、１０ｍＬの培地を加えた。オリゴヌクレオチド処理後、細胞を２４〜７２時間回復させ、次に細胞をかき取って回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。２×１０５細胞を５μｌのアネキシンＶ−ＦＩＴＣと１０μｌのヨウ化プロピジウム（ヨウ化プロピジウム−１０ｍｇ／ｍｌ）で１５分間室温の暗所でインキュベートした。染色の特異性と選択性を示すために、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ添加前の精製した組み換えアネキシンＶ−ＦＩＴＣ（１０μｇ）での形質移入細胞のインキュベーションを用いた。さらに、ＴＲＡＩＬ（Ａｐｏ２Ｌ）を誘導したＨｅＬａ細胞（０．５μｇ／ｍｌ）をポジティブコントロールとして用いた。
【０１８８】
０．６×１０６のＵ３７３細胞を形質移入前日にＴ７５フラスコに播種した。形質移入当日、細胞を３７℃のＯｐｔｉＭＥＭで１回洗浄し、次に２．５μｇ／ｍｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＯｐｔｉＭＥＭの７ｍｌを加えた。細胞を７分間インキュベートし、ＯｐｔｉＭＥＭで終濃度１〜２５ｎＭに希釈した１７００μｌのオリゴヌクレオチドを添加した。模擬形質移入細胞をコントロールとした。処理６時間後、細胞をＯｐｔｉＭＥＭで洗浄し、１０ｍＬの培地を加えた。オリゴヌクレオチド処理後、細胞を２４〜４８時間回復させ、次に細胞をかき取って回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。２×１０５細胞を５μｌのアネキシンＶ−ＦＩＴＣと１０μｌのヨウ化プロピジウム（ヨウ化プロピジウム−１０ｍｇ／ｍｌ）で１５分間室温の暗所でインキュベートした。染色の特異性と選択性を示すために、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ添加前の精製した組み換えアネキシンＶ−ＦＩＴＣ（１０μｇ）での形質移入細胞のインキュベーションを用いた。さらに、Ｕ３７３細胞を誘導したスタウロスポリン（０．２μｇ／ｍｌ）をポジティブコントロールとして用いた。（図４Ａと図４Ｂを参照）
（実施例１２：ＬＮＡオリゴヌクレオチドによる増殖阻害）
細胞を、実施例１１に従って処理した。
【０１８９】
（増殖中の生細胞の測定（ＭＴＳアッセイ））
形質移入の前日に、透明な９６穴プレート（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｒａｎｇｅ ｎｏ．１４７２０３０１００）にウェルあたり７０００細胞の密度でＤＭＥＭ培地中にＵ３７３細胞を播種した。翌日、細胞を予め温めたＯｐｔｉＭＥＭで１回洗浄し、次にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２．５μｇ／ｍｌを含む７２μｌのＯｐｔｉＭＥＭを加えた。ＯｐｔｉＭＥＭで希釈した１８μｌのオリゴヌクレオチドの添加前に、細胞を７分間インキュベートした。オリゴヌクレオチドの最終濃度は、５ｎＭから１００ｎＭの範囲だった。処理６時間後、細胞をＯｐｔｉＭＥＭで洗浄し、血清を含む１００μｌのＤＭＥＭを加えた。処理済みのＵ３７３細胞の同様の９６穴プレートを、回収時間までＡｎａｅｒｏｃｕｌｔバッグ（Ｍｅｒｃｋ）中に９６穴プレートを置くことで、正常酸素圧または低酸素圧／酸素欠乏下で培養した。生細胞は、示された時間に２０μｌのテトラゾリウム化合物［３−（４，５−ジメチル−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内塩、ＭＴＳ］と電子結合試薬（フェナジンエトサルフェート、ＰＥＳ）（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えることで測定した。生細胞は、Ｐｏｗｅｒｗａｖｅ（Ｂｉｏｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で４９０ｎｍと６５０ｎｍで測定した。
【０１９０】
増殖率の阻害ΔＯＤ（４９０〜６５０ｎｍ）／ｈを模擬物１００％として比較してＬＮＡオリゴヌクレオチド濃度に対してプロットした。（図５Ａと図５Ｂを参照）
（実施例１３：ＬＮＡオリゴヌクレオチドのインビボでの取り込みと標的の下方調節）
有毛マウスを１４日間の期間中、毎日または週２回（５回）のいずれかで、食塩水または配列番号１またはその様々なチオール化物を腹腔内注入した。配列番号５は部分的にチオール化されており（ギャップ内）、一方、配列番号６はホスホジエステル骨格がチオール化されている。マウスを所定の毎日または毎週２回、総用量１０ｍｇ／ｋｇ／１４日、５０ｍｇ／ｋｇ／１４日、または２５０ｍｇ／ｋｇ／１４日で処置した。
【０１９１】
（組織からのＲＮＡ精製とｃＤＮＡ合成）
約１０ｍｇの組織を１％のメルカプトエタノールを添加した４００μｌのＲＴＬ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）中でホモジナイズした。全ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造会社の取扱説明書に従って単離した。
【０１９２】
ランダムデカマーとＭ−ＭＬＶ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（基本的に、製造会社（Ａｍｂｉｏｎ）の記載どおり）を用いて一本鎖合成を行った。各試料の全ＲＮＡ ０．２５μｇを１０．８μｌに水で調節し、２μｌデカマーと２μｌのｄＮＴＰミックス（各２．５ｍＭ）を添加した。試料を７０℃で３分間加熱し、直ちに氷水で冷却し、２μｌの１０ｘＲＴ緩衝液、１μｌのＭ−ＭＬＶ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、０．２５μｌのＲＮａｓｅ阻害剤を含む３．２５μｌの混合物を添加した。ｃＤＮＡは、４２℃で６０分間合成し、次いで９５℃で１０分間の加熱不活性化を行い、最後に４℃に冷却した。
【０１９３】
（定量リアルタイムＰＣＲ解析）
処置済みおよび無処置のマウスのＨＩＦ１α ｍＲＮＡの相対濃度を決定するため、ｃＤＮＡをＢｉｏＲＡＤのｉＣｙｃｌｅｒを用いた定量ＰＣＲ解析に用いた。
【０１９４】
５倍希釈したｃＤＮＡ ８μｌに、２９．５μｌのＰｌａｔｉｎｕｍ ｑＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ−ＵＤＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、各１０３０ｎＭのプライマー、０．５７×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、および１１．４ｎＭのフルオロセイン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を含む５２μｌの混合液を添加した。
【０１９５】
２５μｌの二組をＱ−ＰＣＲに用いた。５０℃で１２０秒、９５℃で１２０秒、（９５℃で３０秒と６０℃で６０秒）を４０サイクル。
【０１９６】
ＨＩＦ１ａ ｍＲＮＡの発現は、同様にＱ−ＰＣＲで定量したマウスβ−アクチンｍＲＮＡで正規化した。
【０１９７】
ｍＨＩＦ１ａ：５’−ＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＴＴＴＴＡＣＣＡＴＧＣ−３’（配列番号３０）、および５’−ＧＧＡＧＴＧＴＴＴＡＣＧＴＴＴＴＣＣＴＧＡＡＧ−３’（配列番号３１）
ｍβ−アクチン：５’−ＣＣＴＴＣＣＴＴＣＴＴＧＧＧＴＡＴＧＧＡＡ−３’（配列番号３２）、および５’−ＧＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＧＣＡＡＴＧＡＴＣＴ−３’（配列番号３３）
ｍＶＥＧＦ：５’−ＣＡＣＧＡＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＴＣ−３’（配列番号３４）、および５’−ＧＴＣＧＧＧＧＴＡＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＴ−３’（配列番号３５）
ｍＧＡＰＤＨ：５’−ＡＧＣＣＴＣＧＴＣＣＣＧＴＡＧＣＡＡＡＡＴ−３’（配列番号３８）、および５’−ＧＴＴＧＡＴＧＧＣＡＡＣＡＡＴＣＴＣＣＡＣＴＴＴ−３’（配列番号３９）
ＢＣＬ−２：フォワード：５’−ｇｃｃｃｔｇｔｇｇａｔｇａｃｔｇａｇｔａ−３’（配列番号３６）、およびリバース：５’−ｃａｇｃｃａｇｇａｇａａａｔｃａａａｃａｇ−３’（配列番号３７）。
【０１９８】
無処置のマウス線維芽細胞（Ｌｔｋ細胞）（５倍に希釈され、ＨＩＦ１αとβ−アクチンの両方を発現している）から合成したｃＤＮＡの２倍希釈物を、アッセイのための標準曲線の作成に用いた。ＨＩＦ１α ｍＲＮＡの相対量は、ｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍソフトウェアを用いて算出された閾値サイクルから決定した。
【０１９９】
（組織からのＬＮＡオリゴヌクレオチド抽出）
約１００ｍｇの組織を５００μｌの抽出緩衝液（１ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａを含む、０．５％のＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０、２５ｍＭトリスｐＨ８．０、２５ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ）中で機械的にホモジナイズし、３７℃で一晩インキュベートした。５００μｌに基準オリゴヌクレオチドを加え、フェノール−イソアミル−クロロホルム（２５：１：２４（ｖ／ｖ／ｖ））１ｍｌを加えて抽出した。水層を新しいチューブに写し、再度抽出した。必要であれば、抽出物を凍結乾燥した。
【０２００】
（抽出したＬＮＡオリゴヌクレオチドのＩＥＸ ＨＰＬＣ解析）
試料５０μｌをｇｕａｒｄ ｃｏｌｕｍｎ ＤＮＡＰａｃ ＰＡ−１００（２×２５０ｍｍ、Ｄｉｏｎｅｘ）を備えたＤＮＡＰａｃ ＰＡ−１００（２×５０ｍｍ、Ｄｉｏｎｅｘ）カラムにかけて分離した。カラムを４０℃に加熱した。流速は０．２５ｍＬ／分で、検出波長は２６０ｎｍだった。移動相の勾配は、Ａ：トリス（２０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）および過塩素酸ナトリウム（１０ｍＭ）ｐＨ７．６。Ｂ：トリス（２０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）および過塩素酸ナトリウム（１Ｍ）ｐＨ７．６。（０−１３分、Ａ：２０％、Ｂ：２０％。１４−１８分、Ａ：４０％、Ｂ：６０％。２２−２８分、Ａ：０％、Ｂ：１００％。３３−３８分、Ａ：８０％、Ｂ：２０％）。
【０２０１】
図６Ａおよび図６Ｂは、インビボの取り込み（組織ｇあたりμｇ）と標的の下方調節（（上述どおり）配列番号１の毎日または週２回、１４日間の投与後の食塩水処置マウスに対するβ−アクチンの発現と関連づけたＨＩＦ−１ａ ｍＲＮＡ発現の阻害％）を示す。
【０２０２】
図６Ｃは、配列番号１を有毛マウス腹腔内への１４日間連日注入後のインビボでの内因性の腎臓標的の下方調節を示す。
【０２０３】
図７Ａは、配列番号１が連日の投与でＨＩＦ−１ａ発現をＱ−ＰＣＲで測定した場合の肝臓における有力な阻害剤であることを示す。
【０２０４】
図７Ｂは、配列番号１が週２回の投与でＨＩＦ−１ａ発現をＱ−ＰＣＲで測定した場合の肝臓における有力な阻害剤であることを示す。
【０２０５】
図７Ｃは、配列番号１が連日の投与でＨＩＦ−１ａ発現をＱ−ＰＣＲで測定した場合の腎臓における有力な阻害剤であることを示す。
【０２０６】
（実施例１４：Ｕ３７３異種移植腫瘍を有するマウスにおける配列番号１のインビボでの有効性）
ヌードマウスにおける腫瘍異種移植片の増殖に対するオリゴヌクレオチド治療の作用は、様々な腫瘍細胞株を用いて可能である。当該細胞株の例は、ヒト腫瘍細胞株Ｕ８７（膠芽細胞腫）、Ｕ３７３（膠芽細胞腫）、１５ＰＣ３（前立腺癌）、ＰＣ３（前立腺癌）、ＤＵ１４５（前立腺癌）、ＬＮＣａｐ（前立腺癌）およびマウス腫瘍細胞株Ｂ１６（黒色腫）である。
【０２０７】
ヌードマウスにおけるＬＮＡオリゴヌクレオチドを用いた皮下腫瘍異種移植片の処置。腫瘍細胞を皮下に移植し、その後、３回の連続移植により連続的に継代した。１ｍｍの腫瘍小部分をＮＭＲＩヌードマウスに外套針で皮下に移植した。あるいは、３００μｌのＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に一般的には１０６〜１０７で懸濁した癌細胞をＮＭＲ１ヌードマウスの脇腹に皮下注射した。マウスを５ｍｇ／ｋｇ／日で腹腔内注射した。個別のマウスの処置は、腫瘍体積が５０ｍｍ３に達した時に開始した。ＰＢＳでの処置は、コントロール群（食塩水処置）の平均腫瘍体積が５０ｍｍ３に達した時に開始した。実験は、任意の群の腫瘍が最大許容サイズに達した時に収量した。全マウスの腫瘍サイズをキャリパーで毎日測定した。処置の効果は、腫瘍サイズと腫瘍成長速度として測定した。
【０２０８】
配列番号１を使った別の検討では、Ｕ３７３ドナーマウス由来の致命的な腫瘍片を、ヌードマウスの卵巣の脂肪組織上に移植する（０日目）。移植後４日目と９日目に、マウスを５０ｍｇ／ｋｇ（腹腔内）でＬＮＡオリゴヌクレオチドで処置する。マウスを最後の投与（１１日目）の２日後に屠殺し、腫瘍の重量測定とＣＤ−３１抗体による腫瘍の染色を行う（図８Ａと図８Ｃを参照）。
【０２０９】
図８Ｂおよび８Ｃは、配列番号１で処理した異種移植片由来のＵ３７３における血管密度を示す。図１０Ｄは、ＱＰＣＲで測定したＵ３７３腫瘍におけるＨＩＦ−１αｍＲＮＡ発現を示す。
【０２１０】
配列番号１を、５０ｍｇ／ｋｇで週２回、１週間、卵巣に移植されたＵ３７３異種移植マウスに投与した。最後の投与２日後、動物を屠殺した。血管密度はＣＤ３１染色後に総面積と関連づけて計算した。食塩水群とスクランブルコントロール（配列番号１２）処置したマウスとの間に統計的有意差（Ｐ＝０．００５）があった。
【０２１１】
（実施例１５：肝臓と腎臓における配列番号１の組織半減期と標的ノックダウン）
メスのＮＭＲＩマウス６０匹（約２５ｇ）を５群に分け、３０ｍｇ／ｋｇの配列番号１（１０ｍｌ／ｋｇ、２．５ｇ／ｍｌ）を０、３、７、１０および１４日目に腹腔内投与した。１４日目に群を屠殺した。コントロール群には０．９％食塩水を投与した。組織試料を採取し、後日ＲＮＡを調製した。
【０２１２】
図１１は、３０ｍｇ／ｋｇの配列番号１の腹腔内投与５回後のマウスのインビボでの取り込み（組織ｇあたりμｇ）と標的の下方調節（β−アクチンの発現と関連づけたＨＩＦ−１ａおよびＶＥＧＦ ｍＲＮＡ発現の阻害％）を示す。
【０２１３】
（実施例１６：インビボにおける作用の持続時間とＬＮＡオリゴヌクレオチドの取り込み）
作用の持続時間：メスのＢａｌｂ／ｃＡ−ｎｕマウス２０匹（約２５ｇ）、前立腺癌細胞株ＰＣ３（ＥＣＡＣＣ＃９０１１２７１４）を５群に分け、２５ｍｇ／ｋｇの配列番号７（１０ｍｌ／ｋｇ、２．５ｇ／ｍｌ）を７から１３日目まで毎日、腹腔内投与した。投与１日後と５日目に群を屠殺した。コントロール群には０．９％食塩水を投与した。組織試料を採取し、後日ＲＮＡを調製した。図１０Ａは、処置後１日目と５日目のｍＲＮＡ発現の作用持続時間を示す。
【０２１４】
ＬＮＡオリゴヌクレオチドの取り込み：ホルマリン固定後、組織をパラフィン包埋した。組織をホルト（Ｈｏｌｔ）溶液（スクロース３０ｇ、アカシアゴム１ｇ、チモール１５ｍｇ、蒸留水１００ｍｌ）中に一晩置き凍結した。４ｍｙ’ｓの凍結切片を被覆したガラス上にマウントし、ＤＡＰＩ溶液中に置いた。蛍光色素を蛍光顕微鏡で可視化した。図１０Ｂは、Ｆａｍ標識した配列番号１で２５ｍｇ／ｋｇ／日、７日間処置して最後の処置後５日目に屠殺したマウスの肝臓、腎臓および腫瘍の組織の組織学的結果を示す。皮膚の写真は同じ方法で処置したマウスのものであるが、最後の処置後、その日に屠殺し、皮膚の基底細胞の弱い染色を見るために（下の青線）露出オーバーにした。これらの結果は以下を示唆する：
肝臓：肝細胞の染色は主に細胞質に局在した。
腎臓：近位細管の非常に強い染色と遠位尿細管のより弱い染色。
腫瘍：内皮細胞、マクロファージが染色された（マウス細胞）。
皮膚：真皮（内皮細胞およびマクロファージ）、ならびに表皮の基底層の細胞質に強い染色。
【０２１５】
（実施例１７：インビボにおけるＬＮＡオリゴヌクレオチドの取り込みと有効性）
当日、０．３×１０−６細胞（ＰＣ３とＨＴ２９）を３００μｌのＭａｔｒｉｇｅｌと混合し、メスのＢａｌｂ／ｃＡ−ｎｕマウス（約２５ｇ）に移植した。７、１０、１３、１７日目、食塩水、ｆａｍ標識した配列番号１（配列番号７）、またはｆａｍ標識した配列番号８（配列番号２０）を５ｍｇ／ｋｇ／日でマウスに腹膜注射した。最後の投与の３日後（２０日目）または１０日後（２７日目）、動物を屠殺した。食塩水コントロール群には０．９％食塩水を投与した。組織試料を採取し、後日ＲＮＡを調製し、ＨＰＬＣ解析によるＬＮＡオリゴヌクレオチド含量の測定またはＨＩＦ−１ａ ｍＲＮＡの下方調節を解析した（図１０Ｃ−Ｅを参照）。
【０２１６】
ＬＮＡオリゴヌクレオチドの可視化：ホルマリン固定後、組織をパラフィン包埋した。
組織をホルト（Ｈｏｌｔ）溶液（スクロース３０ｇ、アカシアゴム１ｇ、チモール１５ｍｇ、蒸留水１００ｍｌ）中に一晩置き凍結した。４ｍｙ’ｓの凍結切片を被覆したガラス上にマウントし、ＤＡＰＩ溶液中に置いた。蛍光色素を蛍光顕微鏡で可視化した（データは図１０Ｂと同じ生体内分布を示している。データは示さず。）。
【０２１７】
（実施例１８：ＨＩＦ−１αとＶＥＧＦのインビボでのＬＮＡオリゴヌクレオチドの特異性の検討）
ミスマッチの検討：メスのＮＭＲＩマウス１５匹（約２５ｇ）を５群に分け、３０ｍｇ／ｋｇの配列番号１または配列番号９（１０ｍｌ／ｋｇ、３．０ｇ／ｍｌ）を０、３、７、１０および１４日目に３０秒にわたって腹腔内投与した。コントロール群には０．９％食塩水を投与した。最後の注入の３〜４時間後、群を屠殺した。組織試料を採取し、後日ＲＮＡを調製した。
【０２１８】
図１１は、３日毎の３０ｍｇ／ｋｇでの配列番号１の５回投与後のＨＩＦ−１ａとＶＥＧＦのインビボでの肝臓の内因性の標的下方調節を、１ミスマッチコントロールの配列番号９と比較して示す。
【０２１９】
（実施例１９：配列番号１の１４量体版のインビボでの有効性）
メスのＮＭＲＩマウス（０．０２５ｋｇ）を５ｍｇ／ｋｇ／日の配列番号１で腹腔内注射により処置した。５群に分け、食塩水動物はコントロール動物の役目を果たし、０．９％食塩水を投与した。投与１日後と１０日目に５匹を屠殺した。方法と材料の記載どおりに、組織試料を採取し、後日ＲＮＡを調製し、ＱＰＣＲによりＨＩＦ−１ａ ｍＲＮＡ発現を測定してβ−アクチンで正規化した。
【０２２０】
（実施例２０：大動脈輪の３次元培養の調製）
新脈管形成は、当初ラットの大動脈で報告された方法（Ｍａｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｂｉｏｌ Ｐｒｅｏｃｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ ４（１）ｐ．２４−３１）を改変して、マウスの大動脈の輪を３次元コラーゲンゲル中で培養することで検討した。有毛マウスを１０ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量のＬＮＡオリゴヌクレオチドで１回静脈投与した。投与後３日目に、マウスから胸大動脈を除去し、頸椎脱臼により屠殺し、直ちに、１０％ウシ胎仔血清を含む氷冷したＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を入れた培養皿に移した。精密な顕微解剖用鉗子と虹彩切除用の剪刀を用いて、大動脈壁を損傷しないよう特別の注意を払って大動脈周辺の線維脂肪組織を注意深く除去した。１ｍｍ長の大動脈の輪（大動脈あたり約１５、最大大動脈の１．５ｃｍ）を薄切し、ＦＢＳを含むＲＰＭＩの３回の連続洗浄で広範囲に洗浄した。次に、マウス大動脈のリング形の移植片を９６穴プレートのウェル内の６０μｌのｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｔｒｉｇｅｌ：３５６２３４）に埋め込んだ。大動脈を挿入後、さらに４０μｌのｍａｔｒｉｇｅｌを加え、３７℃で１０分間おいて凝固させた。成長因子を含む、また含まない１００μｌのＥＧＭ２（Ｃａｍｂｒｉｘ）をウェルに加える。コントロールとして、大動脈の輪を１０μＭのシスプラチンを含むさらにＥＧＭ２培地で覆った。培地は、２日ごとに交換した。
【０２２１】
（実施例２１：３Ｈ標識した配列番号１の単回静脈内投与後のマウスにおける定量的全身オートラジオグラフィー研究）
メスのＣ５７Ｂ１／６Ｊマウス９匹（８週、Ｔａｃｏｎｉｃ，ＤＫ）に１．５ｍＣｉ／ｋｇの３Ｈ−配列番号１を５０ｍｇ／ｋｇで各試験品目を尾静脈に静脈内投与した。
【０２２２】
３Ｈ−配列番号１は１５５μＣｉ／ｍＬの比活性を有した。
【０２２３】
各動物に投与した容量は、試験製剤１０ｍＬ／ｋｇだった。個別のマウスを、各試験品目の投与後５分、１５分、１時間、４時間、２４時間、２日、４日、７日および１８日目に屠殺した。
【０２２４】
全身オートラジオグラフィーのために、マウスをイソフルランで麻酔し、次にドライアイスで−８０℃に冷却したヘキサンに直ちに浸した（ＡＢＲ−ＳＯＰ−０１３０／０４）。凍結した死体を含水カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）ゲルに包埋し、ドライアイス（−８０℃）で冷却したエタノールで凍結し、標準的な方法に従って全身オートラジオグラフィー用に矢状に切断した（ＡＢＲ−ＳＯＰ−０１３１／０４）。約−２０℃の温度で凍結ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ ＣＭ ３６００）で、異なる水平面の２０μｍの切片を各動物から切り出した。得られた切片をテープ（Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ Ｍｉｎｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｃｏ．，Ｎｏ．８１０）で固定し、放射性のインクで連続的に番号を付けた。−２０℃で約２４時間凍結乾燥した後、選択した切片をタルク粉末の薄層で覆い、イメージングプレート（Ｆｕｊｉ，Ｊａｐａｎ）上に置いた。
【０２２５】
対象の組織と器官を最も良く示す切片をホスホイメージャー用に選択した。３Ｈの較正基準のセットと共に、切片をタルク粉末の薄層で覆い、イメージングプレート上に置いた。３Ｈが低エネルギーであるため、タルク粉末をイメージングプレートを保護するプラスチックフォイルの代わりに用いた。イメージングプレートを遮光カセットに入れ、環境放射から保護するために鉛の遮蔽箱中で３〜７日間、室温で露出した。
【０２２６】
露出後、イメージングプレートをＢＡＳ２５００（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ Ｓｖｅｒｉｇｅ ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いてピクセルサイズ５０μｍでスキャンした。対象の組織と器官をＡＩＤＡ、バージョン２．４３（Ｒａｙｔｅｓｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて定量した。
【０２２７】
３Ｈの放射活性の水溶性標準試験液を全血と混合し、較正尺度の作成に用いた。標準系列は、６５．４４から０．３０ｎＣｉ／ｍｇまでの１０希釈段階で構成される。定量の目的のため、全ての組織は全血と同様の密度とクエンチング特性を有すると見なした。組織密度は、１ｇ／ｍｌと決めた。定量限界は、バックグラウンドの８回の測定の平均濃度値とこれらの測定の標準偏差値の３倍の和と定義した。
【０２２８】
様々な組織および器官が、オートラジオグラフィー上または相当する組織切片上のいずれかで特定された。本研究で使用されるブドウ膜という用語は、構造、脈絡膜、眼の強膜を含むメラニンを示す網膜色素上皮を含む。（図１４Ａおよび１４Ｂを参照）
（実施例２２：配列番号１を形質移入したＨＵＶＥＣ細胞のウェスタンブロット）
正常なヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、Ｃａｍｂｒｉｘ−ＥＧＭ２培地中で培養し、実施例の記載どおりに２ｎＭまたは５ｎＭの配列番号１あるいは５ｎＭの配列番号８を形質移入した。形質移入後、細胞を低酸素（１％酸素）に１６時間曝した。（実施例の記載どおり）回収時に細胞をＰＢＳで洗浄し、ＳＤＳを含む溶解緩衝液中で溶解した。５０μｇをトリス−酢酸ゲルにローディングし、１５０Ｖで１時間泳動した。ウェスタンブロットを実施例の記載どおりに行い、ブロットを抗ヒトＨＩＦ−１ａ（１：５００）中でインキュベートし、高感度化学発光で可視化した。配列番号１による強力な下方調節が見られたが、一方スクランブルコントロールの配列番号８は、ＨＵＶＥＣ細胞においてＨＩＦ−１ａ発現を下方調節しなかった。
【０２２９】
（実施例２３：インビトロでの管形成／毛細管様構造形成アッセイ）
Ｍａｔｒｉｇｅｌを用いて、管形成の誘導を行った（Ｖｅｎｅｔｓａｎａｋｏｓ Ｅ，Ｍｉｒｚａ Ａ，Ｆａｎｔｏｎ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｂｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ−ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｅｄ ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ．Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２００２；２７３：２１−３３）。早過ぎる重合を防ぐためにＭａｔｒｉｇｅｌを氷上で解凍し、５０μｌの小分注を９６穴の組織培養プレート（Ｎｕｎｃ）の個別のウェルに入れ、３７℃で少なくとも３０分間重合させた。形質移入したＨＵＶＥＣ細胞をトリプシン０．０５％−ＥＤＴＡ処理で剥離した。細胞を血清を含む培地で洗浄し、次いで２−×１０５細胞／ｍｌに再懸濁した。各培養ウェルに形質移入した、または形質移入されていない１００μｌのＨＵＶＥＣ細胞懸濁液を増殖因子（ＦＢＳ（２％）と共にＶＥＧＦ、ｈＦＧＦ−Ｂ、Ｒ３−ＩＧＦ−１、ｈＥＧＦ）およびヘパリンを含む培養液に加えた（ｎ＝１０）。スクランブルコントロールオリゴ（配列番号８）で形質移入したＨＵＶＥＣ細胞だけでなく、無処理の偽形質移入細胞をコントロールとして用いた。コントロールまたは試験化合物の用量は、６〜１０の個別のウェルでアッセイし、実験は少なくとも３回行った。管形成の定量のため、ウェルの写真を撮影した。（図１３参照）
（実施例２４：脾臓、骨髄および末梢血の細胞への取り込みのＦＡＣＳ解析）
メスのＮＭＲＩマウス（０．０２５ｋｇ）をＦａｍ標識した配列番号１、配列番号７（５０ｍｇ／ｋｇ）または同等の分子数のＦａｍアミダイト（３ｍｇ／ｋｇ）で、または０．９％食塩水で処置した。細胞を注射１時間後に殺し、脾臓、末梢血（０．１％アザイドナトリウムと５０ｍｌヘパリン硫酸を含む１ｍｌのＰＢＳに１ｍｌを添加し、氷上に置く）、または骨髄由来の細胞を回収した。
【０２３０】
（脾臓）
脾臓を金属メッシュ上に置き、アザイドを含む１ｍｌのＲ１０（１０％ＦＣＳを含むＲ１０組織培養培地）で湿らせる。組織をメッシュに押しつけ、合計４ｍｌのＲ１０＋アザイドで洗い流す。０．５ｍｌの組織懸濁液を取り、残りを廃棄する。５０ｍｌの赤血球溶解緩衝液ミックスを加えて室温で１０分間放置して赤血球を溶解させる。２０００ｒｐｍで１０分遠心。必要であれば、残りの赤血球を除去するために、この工程を反復する。細胞を数え、ブロッキングする。
【０２３１】
細胞を遠心して沈殿させ、アザイドを含む１．０ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁する。ブロッキングのために脾臓当たりの細胞数を５×１０６と見なし、細胞１００万個あたり５μｌのマウスＣＤ１６／Ｄ３２を加える（２５μｌのブロッキングを添加する）。
【０２３２】
（末梢血）
５０ｍｌの赤血球溶解緩衝液ミックスを加えて赤血球を溶解させる。細胞を遠心沈殿させ、必要であれば工程を反復する。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、再懸濁して細胞数を数える。非特異的な抗体の結合は、細胞１００万個あたり５μｌの割合でマウスＣＤ１６／Ｄ３２を加えることによりブロックする。室温に１０分間放置し、次に染色を続けて行った。
【０２３３】
（骨髄）
滅菌した剪刀を用いて、できるだけ各端に近いところで骨を切断する。１ｍｌの滅菌ＰＢＳを２５ゲージの針を付けた１ｍｌシリンジに吸い上げる。針を骨の一端に挿入する。通常、膝で最も容易である。ＰＢＳを骨の中に勢いよく流し入れる。骨がきれいになるまで繰り返す。髄を粉砕するために、骨髄を針で数回吸い上げる。赤血球の数が気になる場合は、上述の様に溶解の工程を用いることが出来る。
【０２３４】
細胞を数え、上述どおりにブロッキングする。骨髄培養のために、１５０，０００細胞を氷上の滅菌したエッペンドルフチューブに入れる。
【０２３５】
（ＦＡＣＳ染色）
特異的マーカーを用いて系統染色を行う。以下に記載の通り：染色
１．ＣＤ４ＡＰＣ、ＣＤ８ ＰＥ ＦＩＴＣ、７ＡＡＤ Ｔ細胞
２．Ｇｒ−１ ＰＥ、ｆ４／８０ ＡＰＣ 好中球、マクロファージ
３．Ｇｒ−１ ＰＥ、Ｍａｃ−１ ＡＰＣ 脊髄単球
４．ＣＤ３４ ＰＥ 系統ＡＰＣ 幹細胞
５．Ｂ２２０ ＡＰＣ、ＣＤ１９ ＰＥ Ｂ細胞
６．ＣＤ１１ｂ ＰＥ、ＣＤ１１ｃ ＡＰＣ 樹状細胞
アイソタイプ
７．アメリカンハムスター ＩｇＧ１ ＡＰＣ ＣＤ１１ｃ
８．ラット ＩｇＧ２ａ ＡＰＣ ＣＤ４、Ｂ２２０
９．ラット ＩｇＧ２ａ ＰＥ ｃｄ８ａ、ＣＤ１９、ＣＤ３４
１０．ラットＩｇＧ２ｇ ＰＥ Ｇｒ−１ ＣＤ１１ｂ。
【０２３６】
染色を９６穴ウェル内で行い、１００μｌのブロッキングした細胞の総数を１００μｌ染色ミックス（アイソタイプコントロールまたは特異的系統マーカーのいずれか）で染色する。染色は氷上で行い、３０分間放置した。細胞を２０００ｒｐｍで２分間遠心する。上清を吸い取り、細胞を２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、遠心のステップを反復する。合計３回洗浄する。最後に、細胞を２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、既に２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液と５μｌの７ＡＡＤが入っているＦＡＣＳチューブに加える。
【０２３７】
Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒを用いてＦＡＣＳ解析を行った（図１５を参照）。
【０２３８】
配列番号７の投与後５日目に、内皮細胞、顆粒球、およびＣＤ４＋リンパ球および末梢血のマクロファージ、骨髄の樹状細胞と顆粒球、脾臓の顆粒球はｆａｍ標識に染色陽性であることが示された。
【０２３９】
（実施例２５：カニクイザル組織におけるＨＩＦ−１αと配列番号１の内容のオリゴヌクレオチド）
肝臓、腎臓を含むカニクイザル組織における主要な毒性研究では、試料を急速凍結し−７０℃でその後の解析のために保存した。（図１６Ａと１６Ｂを参照）サルは、０、６、１０、４０ｍｇ／ｋｇ／回で週２回４週間、静脈注射で処置された。０、１０、４０ｍｇ／ｋｇ／回の投与を受ける動物の群では、一部の動物はその後に４週間の処置なしの回復期間を設けた。
【０２４０】
実施例１３の記載の試料からＲＮＡを抽出してＨＩＦ−１ａ ｍＲＮＡ含量を実施例８の記載どおりに測定した（図１６Ａ参照）。オリゴヌクレオチド含量は、以下の記載どおりに測定した（図１６Ｂ参照）。
【０２４１】
（試料調製：肝臓と腎臓組織からの抽出）
化学薬品と試薬：
プロテイナーゼＫ（２５．１ｍｇ／ｍｌ）：Ｓｉｇｍａ Ｐ４８５０。
【０２４２】
フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（２５：２４：１（ｖ／ｖ／ｖ）、１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）：Ｓｉｇｍａ Ｐ２０６９。
【０２４３】
Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０：Ｓｉｇｍａ，Ｉ８８９６。
【０２４４】
抽出緩衝液：０．５％のＩｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０、２５ｍＭトリスｐＨ８．０、２５ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０（１ＮのＮａＯＨで調整）。
【０２４５】
１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む抽出緩衝液：毎回の抽出前に調製。
【０２４６】
組織（約１００ｍｇ）を測り取る（組織は秤量前後はドライアイス上に置く）。５００μｌのプロテイナーゼＫ含有（１ｍｇ／ｍｌ）抽出緩衝液を加える。組織を機械的にホモジナイズし、ホモジネートを３７℃で一晩インキュベートする。
【０２４７】
基準試料は、配列番号２を抽出緩衝液に溶解して調製する。無処置の動物からちょうど１００ｍｇの肝臓組織を測り取る（組織は秤量前後はドライアイス上に置く）。基準材料を含む抽出緩衝液（プロテイナーゼＫ含有、１ｍｇ／ｍｌ）を総量０．５ｍｌの組織試料に加える。組織を機械的にホモジナイズし、ホモジネートを３７℃で一晩インキュベートする。これらの試料からの配列番号２のシグナル検出は、処置した動物で認められる最低と最高の濃度に及ぶ標準曲線を作成するのに用いる。
【０２４８】
組織試料をスクリューキャップ付きの２ｍｌのマイクロチューブに移す。１ｍｌのフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（２５：２４：１（ｖ／ｖ／ｖ））を加え、５分間激しく振る。４０００ｒｐｍで１５分間の遠心で、相の分離を行う。水相（上相）を新しいチューブ（エバポレーター適合）に移し、５００μｌのミリＱ水を有機層に加える（最初の抽出の残り）。チューブを再び５分間激しく撹拌し、次に４０００ｒｐｍで１５分間遠心（１１５号室のＳＡＮ０３９）する。水相（１．抽出と洗浄からの水相）をプールし、乾燥するまで蒸発させる（８０℃、窒素下）。残留物を２００μｌのミリＱ水でもどし、次に４０００ｒｐｍで１５分間の遠心を行う。解析のために、試料をＨＰＬＣバイアルに移す。
【０２４９】
肝臓および腎臓組織中のオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ解析：抽出後、イオン交換ＨＰＬＣで配列番号２を解析した。
【０２５０】
カラム：Ｄｉｎｅｘ，ＤＮＡ ｐａｃ ＰＡ １００：２×５０ｍｍ（保護カラム），
２×２５０ｍｍ（分析カラム）
カラム温度：４２℃
注入量：５０μｌ
洗浄用溶媒：ミリＱ水
パージ用溶媒：ミリＱ水
検出ＵＶ：２６０ｎｍ。
【０２５１】
溶媒：
緩衝液Ａ：１ｍＭのＥＤＴＡ，２０ｍＭのトリス塩酸、１０ｍＭのＮａＣｌＯ４，ｐＨ７．６（１Ｎ ＮａＯＨ）
緩衝液Ｂ：１ｍＭのＥＤＴＡ，２０ｍＭのトリス塩酸、１ＭのＮａＣｌＯ４，ｐＨ７．６（１ＮのＮａＯＨ）
（実施例２６：配列番号１を用いたインビボでの処置の作用持続時間）
有毛マウスを５０ｍｇ／ｋｇの配列番号１で単回腹腔内注射で処置した。各群５匹の動物を投与後１日目と１０日目（図９Ｃ参照）、または投与後１、２、３、４、５、１０日目（図９Ｂを参照）に屠殺した。ＨＩＦ−１ａ ｍＲＮＡ発現をリアルタイムＱＰＣＲで解析し、ＧＡＰＤＨＡで正規化した。
【０２５２】
（実施例２７：目の疾患のインビボ角膜モデル）
マウスおよび麻酔：ＢＡＬＢ／ｃマウス、６〜８週齢。ケタミンとキシラジンの混合物（それぞれ、１２０ｍｇ／体重ｋｇと２０ｍｇ／体重ｋｇ）を用いてマウスを麻酔した。
【０２５３】
縫合で誘導した炎症性角膜新脈管形成のマウスモデル：過去に、Ｓｔｒｅｉｌｅｉｎ ＪＷ，Ｂｒａｄｌｅｙ Ｄ，Ｓａｎｏ Ｙ，Ｓｏｎｏｄａ Ｙ．Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｅｙｅｓ ｗｉｔｈ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ ｍａｎｉｐｕｌａｔｅｄ ｃｏｒｎｅａｓ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．１９９６；３７：４１３−４２４に記載の炎症性角膜新脈管形成（ＣＮＶ）のマウスモデルを用いた。簡単に、直径２ｍｍの角膜トレフィンを麻酔したマウスの角膜の中央に優しく置き、単に角膜中央領域に印を付ける。次に、３本の１１−０縫合糸二本を基質に侵入させ、角膜外周の１２０°に渡って基質内に置いた。縫合糸を配置する外側の点は、正規化された新脈管形成反応を得るために、縁と２ｍｍの角膜トレフィンで輪郭を描いた線の間の中間を選び、内側の点は２ｍｍの角膜トレフィンの線から同じ距離だった。７日間同じ場所に残した。マウスを安楽死させ、角膜縁を摘出し、平面マウント二重免疫組織化学分析を行った。正常な角膜中の炎症性細胞の存在と角膜への動員を縫合１週間後に、摘出後１０％パラフォルムアルデヒド中で固定し、プラスチック包埋した角膜の連続切片をヘマトキシリンとエオジン染色して定量した。また、角膜に動員された炎症性細胞の特徴をさらに解析するため、角膜ホールマウントし、マクロファージマーカーＣＤ１１ｂで凍結切片の二重免疫組織化学分析を行った。切片はさらに内皮細胞（ＣＤ３１による血管）、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲのマーカーで染色した。
【０２５４】
（実施例２８：角膜マイクロポケットアッセイ）
過去に記載の（Ｃａｏ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ｃ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９８；９５：１４３８９−１４３９４）で、角膜マイクロポケットアッセイを行った。簡潔に、角膜マイクロポケットは、改良型ｖｏｎ Ｇｒａｅｆｅナイフを用いて作成し、２００ｎｇのＶＥＧＦ−Ａ１６４（Ｒ＆Ｄ）または２００ｎｇの組み換えｂｆｇｆ（ＲＤＩ，Ｆｌａｎｄｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）を含むヒドロンポリマーで被覆したスクロースアルミニウム硫酸のマイクロペレット（０．４×０．４ｍｍ）を各ポケットに埋め込んだ。ペレットは、縁から０．６〜０．８ｍｍの場所に置き、抗生剤軟膏（エリスロマイシン）でその部位を覆い、そのままの場所で１０日間放置した（それぞれ、ｎ＞５〜１０マウス）。新脈管形成反応とリンパ管形成反応は、上述のＣＤ３１／ＬＹＶＥ−１の二重免疫染色を用いて定量した。下部の縁とペレットの間の血管対リンパ管の伸長は、両方の管のタイプに対して半定量的に４つのカテゴリーに等級付けした。０：管の伸長なし、１：下部の縁とペレットの間の距離の１／３未満の伸長、２：下部の縁とペレットの間の距離の１／３と２／３の間の伸長、３：管がペレットに達している。
【０２５５】
（実施例２９：乾癬のインビボモデル）
（インビボでのヒト皮膚／ＳＣＩＤマウスキメラ）
ヒトの皮膚の異種移植片は、以前Ｗｒｏｎｅ−Ｓｍｉｔｈ Ｔ，Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ ＢＪ：Ｄｅｒｍａｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｅｓ ｉｎｄｕｃｅｓ ｐｓｏｒｉａｓｉｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９６，９８：１８７８−１８８７で記載の方法に従って、７〜８週齢のＳＣＩＤマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ，ＤＫ）に同所的に移植した。簡潔に、１．５×１．５×０．５ｃｍサイズのヒトの皮膚異種移植片をＳＣＩＤマウスの脇腹に吸収性５−０ Ｖｉｃｒｙｌ Ｒａｐｉｄｅ縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＮＪ）で縫合し、Ｘｅｒｏｆｏｒｍ包帯剤（Ｋｅｎｄａｌｌ Ｃｏ．，Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，ＭＡ）で覆った。付帯剤は１週間後にとりのぞき、動物は研究を通じて病原体なしで維持した。マウスは移植１〜３週間後に配列番号１と配列番号７で５０ｍｇ／ｋｇで週２回、処置を行った。ヒト皮膚／ＳＣＩＤマウスキメラは、２〜３週間の処置後屠殺し、４ｍｍのパンチ生検（Ｂａｋｅｒのパンチ生検、Ｃｏｍｍｉｎｓ Ｄｅｒｍ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）を各異種移植片から得た。生検は中性に緩衝されたホルマリンで固定し、パラフィン包埋および／またはトラガカントゴム（Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）上にマウントし、液体窒素で冷却したイソペンタンで急速凍結し、−８０℃で保存した。
【０２５６】
（免疫染色）
皮膚のクリオスタット切片を、内皮細胞（ＣＤ３１／ＣＤ３４）、マクロファージ（ｃｄ１１ｂ）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲまたはＨＩＦ−１ａなどの適切なマーカーで染色した。（前述の）切片をヘマトキシリン−エオジンで逆染色した。全てのスライドを検鏡し、写真撮影を行った。
【数１】
【数２】
【数３】
【数４】
【数５】
【数６】
【数７】
【数８】
【数９】
【数１０】
【数１１】
【数１２】
【数１３】
【数１４】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ＨＩＦ−１ａの発現調節のための組成物と方法を提供する。特に本発明は、ＨＩＦ−１ａをコードする核酸に特異的にハイブリダイズ可能なＬＮＡオリゴヌクレオチドに関する。ＬＮＡオリゴヌクレオチドはＨＩＦ−１ａの発現を調節することが示されており、その医薬的な製剤と癌疾患、炎症性疾患、および眼疾患の治療としての使用を開示する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
固形腫瘍は数ミリメートル以上に成長するために、血液供給を確立し、グルコース代謝を増強していなければならない。固形腫瘍がどのように低酸素を感知し、低酸素誘導性遺伝子の活性化と血液系を確立するために血管新生因子の分泌に反応するかは、癌生物学の中心を成している。多くの腫瘍は、悪性化、転移、放射線療法と化学療法への耐性に関与した低酸素微小環境を含んでいる。
【０００３】
低酸素誘導性因子−１（ＨＩＦ−１）の発見は、低酸素誘導性遺伝子の調節に関する識見をもたらした（特許文献１、ならびに、特許文献２および特許文献３）。ＨＩＦ−１は二つのサブユニット、ＨＩＦ−１ａ（ＨＩＦ−１アルファ、ここでは「ＨＩＦ−１ａ」と称する）とＨＩＦ−１βからなり、ＶＥＧＥなどの血管新生因子ならびに解糖酵素およびグルコース輸送体１、グルコース輸送体３（ＧＬＵ−１と３）などの解糖関連タンパク質をコードする遺伝子のエンハンサー中の−１低酸素反応配列（ＨＲＥ）と結合する。
【０００４】
ＨＩＦ−１ａアンチセンスプラスミドの腫瘍内遺伝子導入によるＨＩＦ−１ａの遺伝子組み換えによる下方調節は、ＶＥＧＡの下方調節と腫瘍微小血管密度の減少を引き起こすことが示されている（特許文献４、非特許文献１）。そのプラスミドは、ＨＩＦ−１ａの５’−末端をコードする３２０ｂｐのｃＤＮＡ断片を含んでいた（ヌクレオチド１５２〜４５４、Ｇｅｎｅｂａｎｋ ＡＦ００３６９８）。
【０００５】
特許文献５は、ヒトＨＩＦ−１ａの発現を下方調節するＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを示している。一つの化合物は、ＣＵＲ８１３（配列番号１１）と名付けられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，８８２，９１４号明細書
【特許文献２】国際公開第９６／３９４２６号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９９／４８９１６号パンフレット
【特許文献４】国際公開第００／７６４９７号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００３／０８５１１０号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｕｎ Ｘ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００１）８，６３８−６４５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ＣＵＲ８１３（配列番号１１）よりもさらに強力なＬＮＡオリゴヌクレオチドを開示した。また、本発明によると、特異的なＬＮＡオリゴヌクレオチドはアポトーシスを誘導し、増殖を阻害する。さらに、マウスＨＩＦ−１ａと１００％同一な配列を有するＬＮＡオリゴヌクレオチドは、マウスにおいて肝臓、結腸、腎臓でＨＩＦ−１ａの発現を下方調節する。
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、ＨＩＦ−１ａの発現調節のための組成物と方法を提供する。特に本発明は、二つ以上の特異的なモチーフがＨＩＦ−１ａを標的としているＬＮＡオリゴヌクレオチドに関する。これらのモチーフは、配列番号３と４として開示される。特に好ましいＬＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号１と配列番号２である。本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチドは、ＨＩＦ−１αｍＲＮＡの発現とタンパク質レベルの強力な阻害剤である。
【００１０】
より具体的には、本発明は
５’−（Ｔｘ）ＧｘＧｘｃｓａｓａｓｇｓｃｓａｓｔｓｃｓｃｓＴｘＧｘＴ−３’（配列番号３）
および
５’−（Ｇｘ）ＴｘＴｘａｓｃｓｔｓｇｓｃｓｃｓｔｓｔｓｃｓＴｘＴｘＡ−３’（配列番号４）
からなる群から選択される配列からなるＬＮＡオリゴヌクレオチドを提供し、
ここで、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログを示し、小文字は２−デオキシヌクレオチドを示し、下線はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログまたは２−デオキシヌクレオチドのいずれかを示し、下付き文字「ｓ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、下付き文字「ｘ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合のいずれかを示し、括弧内のヌクレオチドユニット、（Ｔｘ）、（Ｔ）、または（Ｇｘ）、（Ａ）はそれぞれ任意のユニットを表し、また、
ここで、配列は任意で２−デオキシヌクレオチド５ユニットまで延長される。
【００１１】
本発明のＬＮＡヌクレオチドを含む薬学的組成物も提供される。さらに提供されるのは、細胞または組織と一つ以上のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは本発明の組成物との接触を包含する、細胞内または組織内のＨＩＦ−１ａの発現調節の方法である。また、開示されるのは、医薬的または予防的な有効量の一つ以上のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは発明の組成物の投与によるＨＩＦ−１ａの発現と関連した疾患または状態の傾向を経験している、またはその傾向にあると疑われる動物またはヒトの治療方法である。さらに、ＨＩＦ−１ａの発現阻害のための、およびＨＩＦ−１ａの活性と関連した疾患治療のためのＬＮＡオリゴヌクレオチドの使用方法を提供する。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
ＬＮＡオリゴヌクレオチドであって、
５’−（Ｔｘ）ＧｘＧｘｃｓａｓａｓｇｓｃｓａｓｔｓｃｓｃｓＴｘＧｘ（Ｔ）−３’（配列番号３）および
５’−（Ｇｘ）ＴｘＴｘａｓｃｓｔｓｇｓｃｓｃｓｔｓｔｓｃｓＴｘＴｘ（Ａ）−３’（配列番号４）
からなる群から選択される配列からなり、
ここで、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログを示し、小文字は２−デオキシヌクレオチドを示し、下線はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログまたは２−デオキシヌクレオチドのいずれかを示し、下付き文字「ｓ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、下付き文字「ｘ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合のいずれかを示し、括弧内のヌクレオチドユニットは、任意のユニットを表し、ここで、該配列は、５個の２−デオキシヌクレオチドユニットまで必要に応じて延長される、ＬＮＡオリゴヌクレオチド。
（項目２）
前記括弧内のヌクレオチドユニット（Ｔｘ）または（Ｇｘ）がそれぞれ存在する、項目１に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチド。
（項目３）
前記下線のヌクレオチドユニットが、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログを示す、項目１および２のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチド。
（項目４）
前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドが、２−デオキシヌクレオチドおよびβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログから選択される１５、１６、１７、１８、１９または２０個のヌクレオチドユニットからなる、項目１〜３のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチド。
（項目５）
前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドが、２−デオキシヌクレオチドおよびβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログから選択される１６個のヌクレオチドユニットからなる、項目４に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチド。
（項目６）
前記配列が、３’末端において、１個の２−デオキシヌクレオチドユニットにより延長されている、項目１〜５のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチド。
（項目７）
前記配列における全てのヌクレオチドユニットが、ホスホロチオエート基によって結合されている、項目１〜６のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチド。
（項目８）
項目１に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドであって、
５’−ＴｓＧｓＧｓｃｓａｓａｓｇｓｃｓａｓｔｓｃｓｃｓＴｓＧｓＴｓａ−３’（配列番号１）
５’−ＴｓＧｓＧｓｃｓａｓａｓｇｓｃｓａｓｔｓｃｓｃｓＴｓＧｓＴ−３’（配列番号１５）、および
５’−ＧｓＧｓｃｓａｓａｓｇｓｃｓａｓｔｓｃｓｃｓＴｓＧｓｔ−３’（配列番号１６）
からなる群から選択される、ＬＮＡオリゴヌクレオチド。
（項目９）
項目８に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドであって、
５’−ＴｓＧｓＧｓｃｓａｓａｓｇｓｃｓａｓｔｓｃｓｃｓＴｓＧｓＴｓａ−３’（配列番号１）である、ＬＮＡオリゴヌクレオチド。
（項目１０）
項目１に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドであって、
５’−ＧｓＴｓＴｓａｓｃｓｔｓｇｓｃｓｃｓｔｓｔｓｃｓＴｓＴｓＡｓｃ−３’（配列番号２）
５’−ＧｓＴｓＴｓａｓｃｓｔｓｇｓｃｓｃｓｔｓｔｓｃｓＴｓＴｓＡ−３’（配列番号１７）、および
５’−ＴｓＴｓａｓｃｓｔｓｇｓｃｓｃｓｔｓｔｓｃｓＴｓＴｓａ−３’（配列番号１８）
からなる群から選択される、ＬＮＡオリゴヌクレオチド。
（項目１１）
項目１０に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドであって、
５’−ＧｓＴｓＴｓａｓｃｓｔｓｇｓｃｓｃｓｔｓｔｓｃｓＴｓＴｓＡｓｃ−３’（配列番号２）である、ＬＮＡオリゴヌクレオチド。
（項目１２）
結合体であって、項目１〜１１のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチド、および該ＬＮＡオリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも一つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分を含む、結合体。
（項目１３）
項目１〜１１のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは項目１２に記載の結合体と、薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはアジュバントとを含む、薬学的組成物。
（項目１４）
水性キャリアを含む、項目１３に記載の薬学的組成物であって、該キャリアが、ｐＨを４．０〜８．５の範囲に維持するための緩衝液を含み、かつ２０〜２０００ｍＭのイオン強度を有する、薬学的組成物。
（項目１５）
眼内投与に適合した、項目１３〜１４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
（項目１６）
少なくとも一つの化学療法剤をさらに含む、項目１３〜１５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
（項目１７）
医薬として使用するための、項目１〜１１のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは項目１２に記載の結合体。
（項目１８）
癌の処置のための医薬の製造のための、項目１〜１１のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは項目１２に記載の結合体の使用。
（項目１９）
前記癌が固形腫瘍の形態にある、項目１８に記載の使用。
（項目２０）
前記癌が、多発性骨髄腫、腎臓癌、子宮頸癌、結腸癌、脳の癌、および乳癌からなる群から選択される、項目１８に記載の使用。
（項目２１）
癌を処置するための方法であって、項目１〜１１のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは項目１２に記載の結合体または項目１３〜１６のいずれか一項に記載の薬学的組成物を、それを必要とする患者へと投与する工程を包含する、方法。
（項目２２）
前記癌が、多発性骨髄腫、腎臓癌、子宮頸癌、結腸癌、脳の癌、および乳癌からなる群から選択される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
アテローム性動脈硬化症、乾癬、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、関節リウマチ、ぜんそく、炎症性腸疾患、いぼ、アレルギー性皮膚炎、炎症、および皮膚炎からなる群から選択される疾患を処置するための医薬の製造のための、項目１〜１１のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは項目１２に記載の結合体の使用。
（項目２４）
前記疾患が、炎症性腸疾患、乾癬および関節リウマチからなる群から選択される、項目２３に記載の使用。
（項目２５）
アテローム性動脈硬化症、乾癬、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、関節リウマチ、ぜんそく、炎症性腸疾患、いぼ、アレルギー性皮膚炎、炎症、および皮膚炎からなる群から選択される疾患を処置するための方法であって、項目１〜１１のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは項目１２に記載の結合体または項目１３〜１６のいずれか一項に記載の薬学的組成物をそれを必要とする患者へと投与する工程を包含する、方法。
（項目２６）
前記疾患が、炎症性腸疾患、乾癬および関節リウマチから選択される、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
異常な新脈管形成によって引き起こされる疾患を患っているかまたは該疾患に罹患しやすい哺乳動物を処置するための方法であって、治療有効量の項目１〜１１のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは項目１２に記載の結合体を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目２８）
新脈管形成を阻害する方法であって、項目１〜１１のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは項目１２に記載の結合体または項目１３〜１６のいずれか一項に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目２９）
細胞のアポトーシスを誘導する方法であって、項目１〜１１のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは項目１２に記載の結合体または項目１３〜１６のいずれか一項に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目３０）
細胞増殖を予防する方法であって、項目１〜１１のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは項目１２に記載の結合体または項目１３〜１６のいずれか一項に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目３１）
新脈管形成疾患の処置方法であって、新脈管形成疾患に関連した新脈管形成が阻害されるように、項目１〜１１のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは項目１２に記載の結合体または項目１３〜１６のいずれか一項に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目３２）
前記新脈管形成疾患が、糖尿病性網膜症、黄斑変性症および炎症性疾患からなる群から選択される、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記新脈管形成疾患が、炎症性腸疾患、乾癬および関節リウマチから選択される炎症性疾患である、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記新脈管形成疾患が、黄斑変性症および糖尿病性網膜症である、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
キットであって、
（ａ）固形形態の項目１〜１１のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは項目１２に記載の結合体を含む第一の構成要素、および
（ｂ）該ＬＮＡオリゴヌクレオチドの再構成に適した食塩水または緩衝液を含む第二の構成要素
を備える、キット。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】図１Ａは、ラットの血漿（ＮｔａｃＳＤオス、ヘパリンリチウム（Ｔａｃｏｎｉｃ，Ｍ＆Ｂ））における、配列番号６と比較して上昇した配列番号１と配列番号５の安定性を示す。オリゴヌクレオチドを２０μＭの濃度で、３７℃で０、４、または２４時間インキュベートした。配列番号１の分解断片は２４時間消化後でさえも検出されなかった。
【図１Ｂ】図１Ｂは、全長の配列番号１とホスホロチオエートで配列番号１と同じ配列の配列番号１３のラットとヒトの血清中の安定性を示す。オリゴヌクレオチドを、終濃度２０μＭでヒトまたはラットの血清に加えた。図は、ヒトとラット血清それぞれにおける３７℃でのＬＮＡオリゴヌクレオチドの１−９６時間までの安定性を示す。ラットの血清では、図１Ｂの最後から二つめのパネルは、４８時間後と９６時間後でもなお持続的な酵素活性を示している。最後のパネルは、血漿を添加せずに３７℃でインキュベートした際に、配列番号１と配列番号１３が分解していないことを示すネガティブコントロールである。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ヒトとラットの血漿における配列番号１の極めて長い安定性を示す。オリゴヌクレオチドをヒトまたはラットの血漿中で１〜９６時間インキュベートし、変性ゲルで泳動した。ＳｙＢｒゴールドで染色後、全長の産物量をホスホイメージャーで測定し、時間に対してプロットした。
【図２Ａ】図２Ａは、ＬＮＡオリゴヌクレオチドを導入したＵ３７３細胞におけるＨＩＦ−１ａタンパク質の下方調節を示す。２ｎＭまたは１０ｎＭの化合物を導入したＵ３７３細胞または偽導入細胞を低酸素でインキュベートし、ＨＩＦ−１ａタンパク質の下方調節をウェスタンブロットで解析した。均等なローディングのコントロールとしてチューブリンの発現を解析した。
【図２Ｂ】図２Ｂは、Ｕ３７３グリア芽細胞腫癌細胞株における配列番号１で処理した後のＨＩＦ−１αタンパク質の下方調節を示す。均等なローディングのコントロールとして汎アクチンの発現を解析した。細胞を０．２、１、および１０ｎＭの配列番号１、または配列番号１０に対して２ｂｐ ｍｍである配列番号１を導入した。下段のパネルは、ゲルの定量結果である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、Ｕ３７３細胞におけるＨＩＦ−１ａを標的とするＬＮＡオリゴヌクレオチド、配列番号１、およびスクランブルしたコントロールオリゴヌクレオチドを含むＬＮＡ、配列番号８で処理した２４時間後のＨＩＦ−１ａタンパク質の下方調節を示す。ＨＩＦの発現は、ＧＡＰＤＨかβ−アクチンと関連づけられ、また非形質導入のコントロール（模擬物）と関連した。ＲＮＡ精製の後、ｍＲＮＡ発現はＱＰＣＲで定量された。
【図３Ａ】図３Ａは、グリア芽細胞腫細胞株Ｕ３７３の正常酸素圧と低酸素圧においてＬＮＡオリゴヌクレオチドで処理した２４〜７２時間後に誘導されたカスパーゼ３／７活性の動態特性として測定したアポトーシスの誘導を示す。配列番号１は、早期アポトーシスの強力な誘導因子であることが示されている。
【図３Ｂ】図３Ｂは、グリア芽細胞腫細胞株Ｕ３７３の正常酸素圧と低酸素圧においてＬＮＡオリゴヌクレオチドで処理した２４〜７２時間後に誘導されたカスパーゼ３／７活性の動態特性として測定したアポトーシスの誘導を示す。配列番号１は、早期アポトーシスの強力な誘導因子であることが示されている。
【図４Ａ】図４Ａ：早期アポトーシス細胞段階の誘導を、４８時間後にアネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびＰＩフローサイトメトリー解析で測定した。ＬＮＡオリゴヌクレオチド配列番号１で処理したＵ３７３細胞は、模擬物と配列番号１２で処理した細胞と比較して、より「早期アポトーシス的」であると分類された。
【図４Ｂ】図４Ｂ：Ｕ３７３細胞における配列番号１で処理した後の早期アポトーシス誘導の定量。様々なステージにおける配列番号１で処理した４８時間後早期アポトーシスが誘導された細胞のパーセンテージ。配列番号１、または二つの異なるスクランブルコントロールオリゴヌクレオチド、配列番号８と配列番号１２をＵ３７３細胞に導入した。細胞を回収し、アネキシンＶ抗体とＰＩでインキュベーション後、早期アポトーシスの細胞数をフローサイトメトリーで計数した。
【図５Ａ】図５Ａは、化合物を導入したグリア芽細胞腫細胞株Ｕ３７３の導入と低酸素圧または正常酸素圧でのインキュベーション２４〜７２時間後を示す。ＭＴＳアッセイで測定した場合に配列番号１が増殖の強力な阻害因子であることが示されている。
【図５Ｂ】図５Ｂは、化合物を導入したグリア芽細胞腫細胞株Ｕ３７３の導入と低酸素圧または正常酸素圧でのインキュベーション２４〜７２時間後を示す。ＭＴＳアッセイで測定した場合に配列番号１が増殖の強力な阻害因子であることが示されている。
【図６Ａ】図６Ａは、配列番号１を用いた二つの投与計画のインビボでの内因性の肝臓標的の下方調節を示す。下流標的のＶＥＧＦだけでなくＨＩＦ−１αのｍＲＮＡレベルの測定は配列番号１が上記標的の効果的な阻害因子であることを示している。図６Ａ：有毛マウス腹腔内への１４日間連日注入。
【図６Ｂ】図６Ｂは、配列番号１を用いた二つの投与計画のインビボでの内因性の肝臓標的の下方調節を示す。下流標的のＶＥＧＦだけでなくＨＩＦ−１αのｍＲＮＡレベルの測定は配列番号１が上記標的の効果的な阻害因子であることを示している。図６Ｂ：有毛マウス腹腔内への１４日間週二日注入。
【図６Ｃ】図６Ｃは、配列番号１を有毛マウス腹腔内への１４日間連日注入後のインビボでの内因性の腎臓ＨＩＦ−１αの下方調節を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、配列番号１投与後の肝臓におけるインビボでのＨＩＦ−１ａ発現の下方調節で測定した場合、配列番号１が有力な阻害因子であることを示す。チオール化した様々な種類の配列番号１（配列番号５と配列番号６）および配列番号１をそれぞれ有毛マウスに１８または３．６ｍｇ／ｋｇで１４日間毎日投与し、屠殺した。ＨＩＦ−１ａの発現は、ＱＰＣＲを用いてｍＲＮＡレベルで測定し、材料および方法に記載の通りにβ−アクチンに対して正規化した。
【図７Ｂ】図７Ｂは、配列番号１投与後にインビボでの肝臓におけるＨＩＦ−１ａの下方調節で測定した場合、配列番号１が有力な阻害因子であることを示す。配列番号１の種々のチオール化物（配列番号５および配列番号６）および配列番号１をそれぞれ有毛マウスに５０、１０または２ｍｇ／ｋｇで１４日間週２回投与し、屠殺した。ＨＩＦ−１ａの発現は、ＱＰＣＲを用いてｍＲＮＡレベルで測定し、β−アクチンに対して正規化した。
【図７Ｃ】図７Ｃは配列番号１投与後の腎臓におけるＨＩＦ−１ａのインビボ発現の下方調節を示す。チオール化した様々な種類の配列番号１（配列番号５と配列番号６）および配列番号１をそれぞれ有毛マウスに１８または３．６ｍｇ／ｋｇで１４日間毎日投与し、屠殺した。ＨＩＦ−１ａの発現は、ＱＰＣＲを用いてｍＲＮＡレベルで測定し、β−アクチンに対して正規化した。
【図８Ａ】図８Ａは、異種移植片由来のＵ３７３腫瘍の腫瘍重量で測定した場合、配列番号１１と配列番号１２（スクランブルコントロール）と比較して配列番号１を用いた際のインビボ有効性の優位性を示す。子宮にＵ３７３異種移植片を移植したマウスに配列番号１、配列番号１１および配列番号１２を５０ｍｇ／ｋｇで週２回、１週間投与した。最後の投与から２日後に動物を屠殺した。屠殺時に腫瘍の重量を測り、個別の腫瘍重量と平均腫瘍重量（赤）を計算してプロットした。コントロール群（スクランブルコントロール、配列番号１２）と配列番号１で処置したマウス間に統計的に有意な差（Ｐ＝０．００５）が見いだされた。
【図８Ｂ】図８Ｂは、配列番号１で処置した異種移植片由来のＵ３７３腫瘍の血管密度を示す。子宮にＵ３７３異種移植片を移植したマウスに配列番号１を５０ｍｇ／ｋｇで週２回、１週間投与した。最後の投与から２日後に動物を屠殺した。血管密度は、ＣＤ３１染色後に算出され、全体面積に関連していた。生理食塩水群とスクランブルコントロール（配列番号１２）で処置したマウス間に統計的に有意な差（Ｐ＝０．００５）が見いだされた。
【図８Ｃ】図８Ｃは、図８Ｂで記載の子宮に移植し、配列番号１で処置したＵ３７３腫瘍の切片のＣＤ３１染色を示す。
【図８Ｄ】図８Ｄは、図８Ｂで記載の子宮に移植し、配列番号１、配列番号１１、配列番号１２およびＰＢＤで処置したＵ３７３腫瘍における、リアルタイムＰＣＲで定量しＧＡＰＤＨで正規化したＨＩＦ１−ａ発現を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、有毛マウスでの２５ｍｇ／ｋｇの配列番号１の１回の静脈内投与後のインビボでの取り込み（組織グラム当たりμｇ）と標的の下方調節（β−アクチンの発現に対して修正したＨＩＦ−１ａ ｍＲＮＡ発現の阻害％）を示す。配列番号１の半減期は、腎臓で約４６時間、肝臓で６６時間である。
【図９Ｂ】図９Ｂの上段のパネルは、有毛マウスでの５０ｍｇ／ｋｇで１回の静脈内投与した配列番号１を示す。動物５匹を５０ｍｇ／ｋｇの配列番号１で処置し、処置した１、３、４、５、８日後に屠殺し、ＨＩＦ−１ａの発現を解析してβ−アクチンに対して正規化した。ＨＩＦ−１ａの発現は、ＱＰＣＲを用いてｍＲＮＡレベルで測定し、実施例の８で記載のβ−アクチンに対して正規化した。下段のパネルでは、配列番号１を２５または５０ｍｇ／ｋｇで有毛マウスに１回静脈内投与した。２５または５０ｍｇ／ｋｇの配列番号１で処置した動物５匹を処置の１、２、３、４、５、８日後に屠殺し、実施例１３で記載のＨＰＬＣ法で全長配列番号１を解析した。データは、μｇ 配列番号１／ｇ組織で表現している。
【図９Ｃ】図９Ｃは、リアルタイムＰＣＲで定量しＧＡＰＤＨで正規化した、５０ｍｇ／ｋｇの配列番号１と配列番号１６を腹腔内に１回投与し、１日目と１０日目に屠殺したマウスのマウス肝臓におけるＨＩＦ−１ａ発現を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、２５ｍｇ／ｋｇを７日間投与し、最後の投与の１日後または５日後に屠殺した異種移植マウスにおける配列番号１のＨＩＦ−１ａ発現阻害作用の期間を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ｆａｍでラベルした配列番号１（配列番号７）２５ｍｇ／ｋｇ／日を７日間の肝臓、皮膚腫瘍および腎臓のインビボにおける取り込みを示し、最後の処置の５日後に屠殺した。
【図１０Ｃ−１】図１０Ｃ（図１０Ｃ−１および図１０Ｃ−２）は、実施例１７で記載の、移植の７、１０、１３、１７日後に５ｍｇ／ｋｇ／日の配列番号７、スクランブルコントロールの配列番号２０、または生理食塩水で腹腔内処理した異種移植マウスの肝臓における標的の下方調節（ＧＡＰＤＨの発現と関連づけたＨＩＦ−１ａ ｍＲＮＡ発現の阻害％）と配列番号７のインビボでの取り込み（組織グラム当たりμｇ）を示す。
【図１０Ｃ−２】図１０Ｃ（図１０Ｃ−１および図１０Ｃ−２）は、実施例１７で記載の、移植の７、１０、１３、１７日後に５ｍｇ／ｋｇ／日の配列番号７、スクランブルコントロールの配列番号２０、または生理食塩水で腹腔内処理した異種移植マウスの肝臓における標的の下方調節（ＧＡＰＤＨの発現と関連づけたＨＩＦ−１ａ ｍＲＮＡ発現の阻害％）と配列番号７のインビボでの取り込み（組織グラム当たりμｇ）を示す。
【図１０Ｄ−１】図１０Ｄ（図１０Ｄ−１および図１０Ｄ−２）は、実施例１７で記載の処置したマウスの結腸における、配列番号７、スクランブルコントロールの配列番号２０で処置した後の標的の下方調節（β−アクチンの発現と関連づけたＨＩＦ−１ａ ｍＲＮＡ発現の阻害％）と配列番号７のインビボでの取り込み（組織グラム当たりμｇ）を示す。
【図１０Ｄ−２】図１０Ｄ（図１０Ｄ−１および図１０Ｄ−２）は、実施例１７で記載の処置したマウスの結腸における、配列番号７、スクランブルコントロールの配列番号２０で処置した後の標的の下方調節（β−アクチンの発現と関連づけたＨＩＦ−１ａ ｍＲＮＡ発現の阻害％）と配列番号７のインビボでの取り込み（組織グラム当たりμｇ）を示す。
【図１０Ｅ】図１０Ｅは、実施例１７で記載の処置したＨＴ２９とＰＣ３異種移植腫瘍における配列番号７のインビボでの取り込み（組織グラム当たりμｇ）を示す。
【図１１】図１１は、配列番号１を３０ｍｇ／ｋｇ、３日毎に５回投与した後のＨＩＦ−１ａとＶＥＧＦのｍＲＮＡのインビボの内因性肝臓標的下方調節をミスマッチが１箇所あるコントロールの配列番号９と比較して示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、Ｕ３７３細胞においてＨＩＦ−１ａを標的としたＬＮＡオリゴヌクレオチド、配列番号１と配列番号８で処理した後のＶＥＧＦＡの発現を示す。Ｕ３７３細胞において、配列番号１またはスクランブルコントロール（配列番号８）で処理した４８時間後にＶＥＧＦＡとＭＭＰ−２の発現（分泌）の用量依存性の下方調節が観察される。ＶＥＧＦＡ（図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ）とＭＭＰ−２（図１２Ｄ、１２Ｅ）の発現は細胞数と関連づけ、模擬物に対して正規化する。図１２Ａ、１２Ｃ、１２ＤのＶＥＧＦＡとＭＭＰ−２の発現は、処理した４８時間後に測定し、図１２Ｂと１２ＥのＶＥＧＦＡとＭＭＰ−２の分泌は、導入後２４−１２０時間後に定量した。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、Ｕ３７３細胞においてＨＩＦ−１ａを標的としたＬＮＡオリゴヌクレオチド、配列番号１と配列番号８で処理した後のＶＥＧＦＡの発現を示す。Ｕ３７３細胞において、配列番号１またはスクランブルコントロール（配列番号８）で処理した４８時間後にＶＥＧＦＡとＭＭＰ−２の発現（分泌）の用量依存性の下方調節が観察される。ＶＥＧＦＡ（図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ）とＭＭＰ−２（図１２Ｄ、１２Ｅ）の発現は細胞数と関連づけ、模擬物に対して正規化する。図１２Ａ、１２Ｃ、１２ＤのＶＥＧＦＡとＭＭＰ−２の発現は、処理した４８時間後に測定し、図１２Ｂと１２ＥのＶＥＧＦＡとＭＭＰ−２の分泌は、導入後２４−１２０時間後に定量した。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、Ｕ３７３細胞においてＨＩＦ−１ａを標的としたＬＮＡオリゴヌクレオチド、配列番号１と配列番号８で処理した後のＶＥＧＦＡの発現を示す。Ｕ３７３細胞において、配列番号１またはスクランブルコントロール（配列番号８）で処理した４８時間後にＶＥＧＦＡとＭＭＰ−２の発現（分泌）の用量依存性の下方調節が観察される。ＶＥＧＦＡ（図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ）とＭＭＰ−２（図１２Ｄ、１２Ｅ）の発現は細胞数と関連づけ、模擬物に対して正規化する。図１２Ａ、１２Ｃ、１２ＤのＶＥＧＦＡとＭＭＰ−２の発現は、処理した４８時間後に測定し、図１２Ｂと１２ＥのＶＥＧＦＡとＭＭＰ−２の分泌は、導入後２４−１２０時間後に定量した。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、Ｕ３７３細胞においてＨＩＦ−１ａを標的としたＬＮＡオリゴヌクレオチド、配列番号１と配列番号８で処理した後のＭＭＰ−２の発現を示す。Ｕ３７３細胞において、配列番号１またはスクランブルコントロール（配列番号８）で処理した４８時間後にＶＥＧＦＡとＭＭＰ−２の発現（分泌）の用量依存性の下方調節が観察される。ＶＥＧＦＡ（図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ）とＭＭＰ−２（図１２Ｄ、１２Ｅ）の発現は細胞数と関連づけ、模擬物に対して正規化する。図１２Ａ、１２Ｃ、１２ＤのＶＥＧＦＡとＭＭＰ−２の発現は、処理した４８時間後に測定し、図１２Ｂと１２ＥのＶＥＧＦＡとＭＭＰ−２の分泌は、導入後２４−１２０時間後に定量した。
【図１２Ｅ】図１２Ｅは、Ｕ３７３細胞においてＨＩＦ−１ａを標的としたＬＮＡオリゴヌクレオチド、配列番号１と配列番号８で処理した後のＭＭＰ−２の発現を示す。Ｕ３７３細胞において、配列番号１またはスクランブルコントロール（配列番号８）で処理した４８時間後にＶＥＧＦＡとＭＭＰ−２の発現（分泌）の用量依存性の下方調節が観察される。ＶＥＧＦＡ（図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ）とＭＭＰ−２（図１２Ｄ、１２Ｅ）の発現は細胞数と関連づけ、模擬物に対して正規化する。図１２Ａ、１２Ｃ、１２ＤのＶＥＧＦＡとＭＭＰ−２の発現は、処理した４８時間後に測定し、図１２Ｂと１２ＥのＶＥＧＦＡとＭＭＰ−２の分泌は、導入後２４−１２０時間後に定量した。
【図１３】図１３は、１および５ｎＭで配列番号１で処理したＨＵＶＥＣ細胞のウェスタンブロットにより測定したＨＩＦ−１ａタンパク質の下方調節とチューブ構造の崩壊を配列番号８と無処理細胞と比較して示す。
【図１４Ａ】図１４Ａ。メスの有色素マウスにおける３Ｈラベルした配列番号１の単回静脈内投与の５分（ａ）、４時間（ｂ）、２４時間（ｃ）、１８日（ｄ）後の放射性活性の分布を示す全身ラジオルミノグラム。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは５分間および７日間の時点での放射性活性の分布を示し、７日後に３Ｈラベルした配列番号１化合物の非常に強い保持が骨髄、腎臓、肺、皮膚、脾臓、尿、胃粘膜、リンパ節、目のブドウ膜および子宮に観察されたことを示している。
【図１５】図１５は、ＦＡＣＳ解析で測定した配列番号７化合物投与の１時間後骨髄、脾臓、末梢血中の様々な種類の細胞におけるＦＡＭラベルした配列番号１（配列番号７）の取り込みを無処理細胞と比較して示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、リアルタイムＰＣＲで測定し１８Ｓ ＲＮＡで正規化した、４０、１０、６ｍｇ／ｋｇの配列番号１で週に２回４週間処置したカニクイザルの肝臓と腎臓におけるＨＩＦ−１ａ発現を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、上述のとおり処置した最後の投与の１日後または最後の投与の４週間後（回復動物）のカニクイザルの肝臓と腎臓における配列番号１の取り込みを、処置終了後４週間無処置のままにした回復動物（Ｒ）でのデータと共に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（発明の説明）
本発明は、特定のＬＮＡオリゴヌクレオチド、すなわち、ＨＩＦ−１ａをコードする核酸分子の機能調節に用いる配列番号３と配列番号４の配列を含むＬＮＡオリゴヌクレオチドを採用する。その調節は、最終的にＨＩＦ−１ａ産物の量の変化である。ある実施形態では、ＨＩＦ−１ａをコードする核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンスＬＮＡオリゴヌクレオチドを提供することでこれは達成される。調節は、好ましくは生成される機能的なＨＩＦ−１ａタンパク質の数の減少を引き起こすＨＩＦ−１ａの発現阻害である。
【００１４】
（ＬＮＡオリゴヌクレオチド）
より具体的には、本発明は
５’−（Ｔｘ）ＧｘＧｘＣｓａｓａｓｇｓｃｓａｓｔｓｃｓｃｓＴｘＧｘ（Ｔ）−３’（配列番号３）
および
５’−（Ｇｘ）ＴｘＴｘａｓｃｓｔｓｇｓｃｓｃｓｔｓｔｓｃｓＴｘＴｘ（Ａ）−３’（配列番号４）
からなる群から選択される配列からなるＬＮＡオリゴヌクレオチドを提供し、
ここで、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログを示し、小文字は２−デオキシヌクレオチドを示し、下線はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログまたは２−デオキシヌクレオチドのいずれかを示し、下付き文字「ｓ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、下付き文字「ｘ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合のいずれかを示し、括弧内のヌクレオチドユニット、（Ｔｘ）、（Ｔ）、または（Ｇｘ）、（Ａ）はそれぞれ任意のユニットを表し、また、
ここで、配列は任意で２−デオキシヌクレオチド５ユニットまで延長される。
【００１５】
「本明細書に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチド」、「発明によるＬＮＡオリゴヌクレオチド」などの語は、以下に規定される実施形態、変形、塩、プロドラッグなどに加えて前述に記載の「ＬＮＡオリゴヌクレオチド」を意味する。
【００１６】
配列番号３と配列番号４に基づく前述に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドは、１３〜２０ヌクレオチドユニットの長さを有する。最低配列長は、括弧内のヌクレオチドユニット、（Ｔｘ）、（Ｔ）または（Ｇｘ）、（Ａ）がそれぞれ欠けている場合に１３ヌクレオチドであり、最大配列長は、括弧内のヌクレオチドユニット、（Ｔｘ）、（Ｔ）または（Ｇｘ）、（Ａ）がそれぞれ存在し、かつ配列番号３または配列番号４が２−デオキシヌクレオチド５ユニットまで延長される場合に２０ヌクレオチドである。
【００１７】
ある実施形態では、括弧内のヌクレオチドユニット、（Ｔｘ）、（Ｔ）または（Ｇｘ）、（Ａ）がそれぞれ欠けており、また現在のところより望ましい別の実施形態では、括弧内のヌクレオチドユニット、（Ｔｘ）、（Ｔ）または（Ｇｘ）、（Ａ）がそれぞれ存在している。また興味深いのは、５’末端の任意のユニット、（Ｔｘ）または（Ｇｘ）がそれぞれ存在し、かつ３’末端の任意のユニット、（Ｔ）または（Ａ）がそれぞれ欠けている実施形態であり、また５’末端の任意のユニット（Ｔｘ）または（Ｇｘ）がそれぞれ欠けており、かつ３’末端の任意のユニット、（Ｔ）または（Ａ）がそれぞれ存在している実施形態である。
【００１８】
上記の配列番号３と配列番号４における、下線のヌクレオチドユニットでのβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログまたは２−デオキシヌクレオチドの選択は、比較的重要でないようである。しかし、ある実施形態では、両方の下線のヌクレオチドユニットが２−デオキシヌクレオチドを示す。現在のところより望ましい別の実施形態では、一つまたは両方の下線のヌクレオチドユニットがβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログを示す。
【００１９】
ある改変例では、括弧内の５’末端のヌクレオチドユニット、（Ｔｘ）または（Ｇｘ）がそれぞれ欠けており、かつ３’末端の別の下線のヌクレオチドユニット、（Ｔ）または（Ａ）がそれぞれ２−デオキシヌクレオチドか、またはより好ましくは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログを示す。
【００２０】
別の改変例では、括弧内の５’末端のヌクレオチドユニット、（Ｔｘ）または（Ｇｘ）がそれぞれ２−デオキシヌクレオチドか、またはより好ましくは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログを指定し、かつ３’末端の別の下線のヌクレオチドユニット、（Ｔ）または（Ａ）がそれぞれ欠けている。
【００２１】
別の改変例では、括弧内のヌクレオチドユニットが存在し、また下線のヌクレオチドユニットの一つあるいは両方がβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログを示す。即ち、（ｉ）５’末端の下線のヌクレオチドがβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログを指定し、かつ３’末端の下線のヌクレオチドが２−デオキシヌクレオチドを示す、または、（ｉｉ）３’末端の下線のヌクレオチドがβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログを指定し、かつ５’末端の下線のヌクレオチドユニットが２−デオキシヌクレオチドを示す、または、（ｉｉｉ）５’末端だけでなく３’末端の下線のヌクレオチドがβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログを示す。
【００２２】
さらなる改変例では、括弧内のヌクレオチドユニット、（Ｔｘ）または（Ｇｘ）がそれぞれ存在し、また下線のヌクレオチドユニットの両方が２−デオキシヌクレオチドを示す。
【００２３】
配列番号３と配列番号４と呼ばれる配列（また、より具体的には、配列番号１と配列番号２と呼ばれる配列（さらには下記参照））は、定義されたＬＮＡオリゴヌクレオチドの全ての機能性を実質的に表すと考えられているが、配列番号３と配列番号４の２−デオキシヌクレオチド５ユニットまでの延長は、たとえば１ユニット、２ユニット、３ユニット、４ユニット、または５ユニットでさえ、基本配列である配列番号３と配列番号４の有益な特性に対する有害な作用がない可能性があると考えられている。配列が３’末端、５’末端、または５’末端だけでなく３’末端で延長することができる当該存在は、総計５以下の２−デオキシヌクレオチドユニットをもたらした。
【００２４】
従って、（前述と組合せ可能な）ある実施形態ではＬＮＡオリゴヌクレオチドは、２−デオキシヌクレオチドおよびβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログから選択される１５、１６、１７、１８、１９または２０個のヌクレオチドユニットからなり、具体的には、２−デオキシヌクレオチドおよびβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログから選択される１６個のヌクレオチドユニットからなるＬＮＡオリゴヌクレオチドである。（前述と組合せ可能な）別の実施形態では、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、２−デオキシヌクレオチドおよびβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログから選択される１３、１４、１５または１６個のヌクレオチドユニットからなり、具体的には、２−デオキシヌクレオチドおよびβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログから選択される１４または１５個のヌクレオチドユニットからなるＬＮＡオリゴヌクレオチドである。
【００２５】
少なくともＬＮＡオリゴヌクレオチド調製の利便性のために、３’末端の２−デオキシヌクレオチド１ユニットでの配列延長がしばしば行われる（参考：例えば、下記の配列番号１と配列番号２）。最も好ましくは、配列番号３が３’末端のアデノシン２−デオキシヌクレオチドユニットで延長され、配列番号４が３’末端のシトシン２−デオキシヌクレオチドユニットで延長される。
【００２６】
上述の、下付き文字「ｓ」は隣接するヌクレオチドとＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合（−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−）を示し、下付き文字「ｘ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合（−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−）またはホスホロジエステル結合（−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−）のいずれかを指す。結果的に配列を延長する任意の２−デオキシヌクレオチドがホスホロチオエート結合（−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−）またはホスホロジエステル結合（−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−）のいずれかで結合され得る。
【００２７】
配列番号３のｃｓａｓａｓｇｓｃｓａｓｔｓｃｓｃｓＴのサブシークエンスと配列番号４のａｓｃｓｔｓｇｓｃｓｃｓｔｓｔｓｃｓＴのサブシーケンスは、完全にホスホロチオエート化されている、つまり下付き文字「ｓ」で示されていることに気付く。現在のところ望ましくないが、ＬＮＡオリゴヌクレオチドの安定性を著しく損なうことなく、一つか場合によっては二つのホスホロチオエート結合は他の結合、特にホスホロジエステル結合で置き換えられ得る。従って、一つまたは二つのホスホロチオエート結合が他の結合、例えばホスホロジエステル結合で置き換えられ得る当該改変体も本発明の対象範囲内に含まれる。
【００２８】
しかし、現在のところ好ましいある実施形態では、配列中の全てのヌクレオチドユニットがホスホロチオエート基によって結合されている。
【００２９】
特に関心があるＬＮＡオリゴヌクレオチドのあるサブグループは、
５’−ＴｓＧｓＧｓｃｓａｓａｓｇｓｃｓａｓｔｓｃｓｃｓＴｓＧｓＴｓａ−３’（配列番号１）
５’−ＴｓＧｓＧｓｃｓａｓａｓｇｓｃｓａｓｔｓｃｓｃｓＴｓＧｓＴ−３’（配列番号１５）、および
５’−ＧｓＧｓｃｓａｓａｓｇｓｃｓａｓｔｓｃｓｃｓＴｓＧｓｔ−３’（配列番号１６）
からなる群から選択され、これらのなかでは、
５’−ＴｓＧｓＧｓｃｓａｓａｓｇｓｃｓａｓｔｓｃｓｃｓＴｓＧｓＴｓａ−３’（配列番号１）
が現在のところ最も望ましい。
【００３０】
特に関心があるＬＮＡオリゴヌクレオチドの別のサブグループは、
５’−ＧｓＴｓＴｓａｓｃｓｔｓｇｓｃｓｃｓｔｓｔｓｃｓＴｓＴｓＡｓｃ−３’（配列番号２）
５’−ＧｓＴｓＴｓａｓｃｓｔｓｇｓｃｓｃｓｔｓｔｓｃｓＴｓＴｓＡ−３’（配列番号１７）、および
５’−ＴｓＴｓａｓｃｓｔｓｇｓｃｓｃｓｔｓｔｓｃｓＴｓＴｓａ−３’（配列番号１８）
からなる群から選択され、これらのなかでは、
５’−ＧｓＴｓＴｓａｓｃｓｔｓｇｓｃｓｃｓｔｓｔｓｃｓＴｓＴｓＡｓｃ−３’（配列番号２）
が現在のところ最も望ましい。
【００３１】
本発明の情況では、「ヌクレオシド」という用語は通常の意味、即ち１位の炭素原子を通じてアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、またはグアニン（Ｇ）の窒素含有塩基の一つと結合する２−デオキシリボースまたはリボースユニットを含む。
【００３２】
同様に、「ヌクレオチド」という用語は、１位の炭素原子を通じてアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、またはグアニン（Ｇ）の窒素含有塩基の一つと結合し、５位の炭素原子を通じてヌクレオシド間のリン酸基または末端基と結合する２−デオキシリボースまたはリボースユニットを意味する。
【００３３】
「核酸」という用語は、二つ以上のヌクレオチドの共有結合で形成される分子と定義される。「核酸」と「ポリヌクレオチド」という用語は、ここでは置き換え可能である。「核酸アナログ」という用語は、非天然の核酸結合化合物を指す。
【００３４】
「ＬＮＡモノマー」という用語は、全て文献としてここに組み込まれた国際特許出願、国際公開第９９／１４２２６号、およびそれに続く出願、国際公開第００／５６７４６号、国際公開第００／５６７４８号、国際公開第００／６６６０４号、国際公開第００／１２５２４８号、国際公開第０２／２８８７５号、国際公開第２００２／０９４２５０号および国際公開第０３／００６４７５号に記載の、一般的には二環式ヌクレオシドアナログを指す。
【００３５】
β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡが、本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチドに用いられるβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログである、およびモノマー構造（ヌクレオシド）をスキーム１に示す。
【００３６】
【化１】
（スキーム１）
スキーム１で、Ｚ＊およびＺは隣接したヌクレオチドまたは末端基（即ち、５’末端基か３’末端基のいずれか）へのヌクレオチド間結合の位置を示す。
【００３７】
β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡモノマーのある特定の実施例は、チミジンＬＮＡモノマー（ＬＮＡヌクレオシドアナログ）（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，７Ｓ）−７−ヒドロキシ−１−ヒドロキシメチル−５−メチル−３−（チミン−１イル）−２，５−ジオキサ−ビシクロ［２：２：１］ヘプタン、つまりＴ−β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである。
【００３８】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、本発明の情況では、オリゴマー（オリゴとも呼ばれる）または核酸ポリマー（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、または当業者に知られている核酸アナログ、好ましくは固定核酸（ＬＮＡ）、あるいはその混合物を指す。この用語は、自然に生じたものと同様に機能する、または特異的な機能を改善した人工的に作成した部分を有するオリゴヌクレオチドだけでなく、自然に生じた核酸塩基、糖類、およびヌクレオシド間（バックボーン）結合からなるオリゴヌクレオチドを含む。完全に、または部分的に修飾、または置換したオリゴヌクレオチドは、例えば細胞膜への浸透能、細胞外、細胞内のヌクレアーゼに対する良好な耐性、核酸標的への高い親和性と特異性などのいくつかの好ましい特性があるため、自然の形よりも多くの場合望ましい。本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチドは、上述の特性を示す。
【００３９】
「ユニット」または「ヌクレオチドユニット」は、モノマー、即ち２−デオキシヌクレオチドまたはβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログであると解釈される。
【００４０】
「１以上」という用語は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７などの、１より大きいか等しい整数を含む。
【００４１】
ヌクレオシド、ヌクレオシドアナログ、配列番号などに使われる「ａ（冠詞）」という用語は、一つかそれ以上を意味するよう意図されている。特に、「．．．．．からなる群から選択される（ヌクレオシド、ヌクレオシドアナログ、配列番号などといった）構成要素」という表現は、一つかそれ以上の、言及された構成要素が選択され得ることを意味するよう意図されている。従って、「Ａ、Ｂ、およびＣからなる群から選択される構成要素」の表現は、Ａ、ＢおよびＣの全ての組合せ、即ちＡ、Ｂ、Ｃ、Ａ＋Ｂ、Ａ＋Ｃ、Ｂ＋Ｃ、およびＡ＋Ｂ＋Ｃを含むことが意図されている。
【００４２】
本明細書を通して、「を含む」または「を含んでいる」といったそのバリエーションは、記載の要素、整数、または段階、あるいは要素、整数、または段階の群を意味すると理解されるが、その他の要素、整数、または段階の除外、あるいは要素、整数、または段階の群の除外は意味しない。
【００４３】
（ＬＮＡオリゴヌクレオチドの調製）
ＬＮＡヌクレオチドアナログ結合ブロック（β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ）は、公表された方法とそこで引用された参考文献に従って調製可能である。例えば、国際公開第０３／０９５４６７ Ａ１号、Ｄ．Ｓ．Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｃ．Ｒｏｓｅｎｂｏｈｍ，Ｔ．Ｋｏｃｈ（２００２）Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＮＡ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ６，８０２−８０８、および国際公開第２００４／０６９９９１ Ａ２号を参照。
【００４４】
ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、国際公開第９９／１４２２６号、国際公開第００／５６７４６号、国際公開第００／５６７４８号、国際公開第００／６６６０４号、国際公開第００／１２５２４８号、国際公開第０２／２８８７５号、国際公開第２００２／０９４２５０号、および国際公開第０３／００６４７５号の実施例の記載どおりに調製することが出来る。従って、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、有機化学の当該分野の通常の技量の人物によく知られた核酸化学のオリゴマー化技術を用いて作成可能である。一般的に、ホスホルアミダイト手法の標準的なオリゴマー化サイクル（Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ
Ｒ．Ｐ．Ｉｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９３，４９，６１２３；Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｒ．Ｐ．Ｉｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９２，４８，２２２３）が用いられるが、例えばＨ−ホスホン酸化学、ホスホトリエステル化学も利用され得る。
【００４５】
一部のモノマーについては、より長いカップリング時間および／また反復カップリングおよび／また、より濃縮したカップリング試薬の使用が必要、あるいは有益であり得る。
【００４６】
ホスホルアミダイトは、一般的に＞９５％の段階的収量を満たす対を使用した。亜リン酸（ＩＩＩ）から亜リン酸（Ｖ）への酸化は、通常、例えばヨウ素、ピリジン、水で行う。このことが脱保護後に、天然のホスホロジエステルヌクレオシド間結合をもたらす。ホスホロチオエートヌクレオシド間結合がチオール化段階で調製される場合は、ＡＤＴＴ試薬（キサンタンハイブリッド（アセとニトリル：ピリジン、９：１、ｖ／ｖ中の０．０１Ｍ溶液））を用いる酸化と共にホスホロジエステルヌクレオシド間結合の合成に用いられる、通常の、例えばヨウ素、ピリジン、水の酸化の交換によって行われる。その他のＢｅａｕｃａｇｅおよびＰＡＤＳなどのチオール化試薬も使用され得る。ホスホロチオエートＬＮＡオリゴヌクレオチドは、段階的カップリングで≧９８％の収量で効果的に合成される。
【００４７】
ＬＮＡオリゴヌクレオチドの精製は、ディスポーザブルの逆相精製カートリッジおよび／または逆相ＨＰＬＣおよび／またはエタノールまたはブタノール沈殿を用いて達成され得る。キャピラリーゲル電気泳動、逆相ＨＰＬＣ、ＭＡＬＤＩ−ＭＳおよびＥＳＩ−ＭＳが、合成ＬＮＡオリゴヌクレオチドの精製の検証に用いられた。
【００４８】
（塩）
ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、薬学的に受容可能な様々な塩が使用され得る。本明細書で使用される場合、その用語はＬＮＡオリゴヌクレオチドの生物学的活性を保持し、最低限の望ましくない毒性効果を示す塩を指す。当該塩の限定されない実施例は、有機アミノ酸、および、亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミ、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム、ナトリウム、カリウムなどの金属カチオンで形成された、あるいはアンモニア、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレン−ジアミン、Ｄ−グルコサミン、テトラエチルアンモニウム、またはエチレンジアミンから形成されるカチオンで形成される塩基添加塩、あるいは、例えば亜鉛タンニン酸などの組合せで形成され得る。
【００４９】
このような塩は、ホスホジエステル基および／またはホスホロチオエート基を有するＬＮＡオリゴヌクレオチドから形成され、例えば適切な塩基を有する塩でもある。これらの塩は、例えば元素周期律表のＩａ、Ｉｂ、ＩＩａ、およびＩＩｂの金属グループ由来の非毒性の金属塩を含み、特に、例えばリチウム塩、ナトリウム塩、またはカリウム塩などのアルカリ金属塩、あるいは例えばマグネシウム塩またはカルシウム塩などのアルカリ土類金属が適している。さらに、亜鉛塩、アンモニウム塩、および、置換されていない、またはヒドロキシル置換された、モノ−、ジ−、またはトリ−アルキルアミンなど、特に、モノ−、ジ−、またはトリ−アルキルアミン、などの適切な有機アミンで形成された塩、あるいは、例えばＮ−メチル−Ｎ−エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミンや、モノ−、ビス−、またはトリス−（２−ヒドロキシエチル）アミン、２−ヒドロキシ−ｔｅｒｔ−ブチルアミン、またはトリス−（ヒドロキシメチル）メチルアミンなどのモノ−、ビス−、またはトリス−（２−ヒドロキシ−低級アルキル）アミン類、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−アミンまたはトリ−（２−ヒドロキシエチル）アミン、またはＮ−メチル−Ｄ−グルコサミンなどの、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキル−Ｎ−（ヒドロキシ低級アルキル）アミン類、またはテトラブチルアンモニウム塩などの第４級アンモニウム化合物など、第４級アンモニウム化合物で形成された塩も含む。リチウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩、またはカリウム塩が望ましく、ナトリウム塩は特に好ましい。
【００５０】
（プロドラッグ）
ある実施形態では、ＬＮＡオリゴヌクレオチドはプロドラッグの形である場合がある。オリゴヌクレオチドは、陰性に荷電したイオンである。細胞膜の親油性のため、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みは、中性または親油性の相当物と比較して低くなる。この極性の「障害物」は、プロドラッグ手法（例えば、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｒ．Ｍ．（１９９８）ｉｎ
Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｖｏｌ．３１，ｐｐ．１０３−１４０を参照）の利用によって回避可能である。この手法で、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは投与した際に中性であるように保護された方法で調製される。これらの保護基はＬＮＡオリゴヌクレオチドが細胞に取り込まれた後に除去され得る方法で設計される。当該保護基の例は、Ｓ−アセチルチオエチル（ＳＡＴＥ）またはＳ−ピバロイルチオエチル（ｔ−ブチル−ＳＡＴＥ）である。これらの保護基はヌクレアーゼ耐性であり、細胞内で選択的に除去される。
【００５１】
（結合体）
本発明のさらなる局面は、少なくとも一つの非ヌクレオチド、または非ポリヌクレオチド部分が共有的に前述のＬＮＡオリゴヌクレオチドと結合している、と本明細書で定義されるＬＮＡオリゴヌクレオチドを含む結合体に関する。
【００５２】
本発明の関連する局面では、本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチドは結合体を形成するようにリガンドに結合しており、リガンドはアンチセンスオリゴヌクレオチドに対する結合体の細胞への取り込みの増加を目的としている。
【００５３】
本明細書の情況において、「結合体」という用語は本明細書に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチド（即ち、ヌクレオシド配列とＬＮＡヌクレオチドアナログを含むＬＮＡオリゴヌクレオチド）と一つ以上の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分の共有結合によって形成された外来分子を示すよう意図されている。
【００５４】
従って、ＬＮＡオリゴヌクレオチドはダイマーまたは樹状構造に配置され得ると同時に、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、タンパク質（例えば、標的タンパク質に対する抗体）、高分子、低分子量の医薬品成分、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマー（例えばポリエチレングリコール）、ミセル形成基、抗体、炭水化物、受容体結合基、コレステロールなどのステロイド、ポリペプチド、アクリジン誘導体などの挿入剤、長鎖アルコール、デンドリマー、リン脂質、およびその他の親油基、またはその組合せなどの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分と結合する、あるいはキメラを形成し得る。本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは結合体は、結合、あるいは例えばアスピリン、イブプロフェン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌剤、化学療法剤、または抗生物質といった活性医薬品成分とさらに結合され得る。
【００５５】
このようにした結合は、ＬＮＡオリゴヌクレオチドの薬物動態特性に関する有利な特性を付与し得る。特に、当該方法の結合は細胞への取り込みの増加を達成する。
【００５６】
ある実施形態では、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは結合体を形成するようにリガンドに結合され、リガンドはアンチセンスＬＮＡオリゴヌクレオチドに対する結合体の細胞への取り込み増加を目的としている。この結合は、５’／３’−ＯＨの末端位置で行われ得るが、リガンドは糖および／または塩基でも行われ得る。特に、アンチセンスＬＮＡオリゴヌクレオチドを結合し得る成長因子は、トランスフェリンまたは葉酸を含む場合がある。高濃度でトランスフェリン受容体または葉酸受容体を発現している細胞による取り込みのために、トランスフェリン−ポリリジン−オリゴヌクレオチド結合体、または葉酸−ポリリジン−オリゴヌクレオチド結合体が調製され得る。結合体／リガンドの別の実施例は、コレステロール部分、アクリジンなどの二重鎖の挿入基（ｄｕｐｌｅｘ ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）、ポリ−Ｌ−リジン、一つ以上のヌクレアーゼ耐性結合基を有するホスホロモノチオエートなどの末端キャッピングなどである。
【００５７】
オリゴヌクレオチドの細胞取り込みのためのキャリアとしてのトランスフェリン結合体の調製は、Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，３４１０−３４１４（１９９０）に記載されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドの送達を含む葉酸受容体エンドサイトーシスを介した葉酸−巨大分子結合体の細胞送達は、Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．米国特許第５，１０８，９２１号に記載されている。Ｌｅａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８，５５７２（１９９１）も参照のこと。
【００５８】
（薬学的組成物）
本発明の特に関心がある特徴は、本明細書に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の結合体、および薬学的に受容可能な希釈剤、キャリア、またはアジュバントを含む薬学的組成物を対象にしている。薬学的組成物は、好ましくは注入、局所投与、または眼内投与に適切である（下記参照）。
【００５９】
薬学的組成物の調製についての指示は、Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ著「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」および下記で入手できる。
【００６０】
薬学的に受容可能な希釈剤、キャリア、またはアジュバントは薬学的組成物の一部である。カプセル、タブレット、丸薬などは、例えば以下の化合物、微結晶性セルロース、結合剤としてゴムまたはゼラチン、賦形剤としてデンプンまたは乳糖、潤滑剤としてステアリン酸、様々な甘味料または香料を含み得る。カプセルでは、用量ユニットは脂肪油などの油脂キャリアを含む場合がある。同様に、糖または腸溶性の被覆材が用量ユニットの一部であり得る。薬学的組成物は（ＬＮＡオリゴヌクレオチドを含む）活性薬剤成分の乳液と脂質形成ミセル乳液である可能性もある。
【００６１】
ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、目的とする作用を損なわない任意の原料、あるいは目的とする作用を補う材料と混合される場合がある。これらは、他のオリゴヌクレオシド化合物を含む他薬剤を含み得る。
【００６２】
非経口投与、皮下投与、皮内投与、または局所投与のため、製剤は滅菌した希釈剤（例えば水）、緩衝液、張性調節剤またはイオン強度調整剤、および抗菌剤を含む場合がある。活性ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、取り込み、分解に対する保護、または体外への迅速な排出に対する保護を行い易くする、放出制御特性があるインプラントまたはマイクロカプセルを含むキャリアと共に調製され得る。静脈内投与のために、望ましいキャリアは生理食塩水（０．９％）、または緩衝食塩水（例えば、リン酸緩衝食塩水）である。
【００６３】
好ましい実施形態では、ＬＮＡオリゴヌクレオチドの注射または輸液は新血管形成部位またはその近くに与えられる。例えば、本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチドは、目の網膜色素上皮細胞に送達され得る。好ましくは、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは目に、例えば液体またはゲルの形で下瞼または結膜円蓋に、当業者が行っているように局所的に投与される（例えば、Ａｃｈｅａｍｐｏｎｇ ＡＡ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌ．ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ３０：４２１−４２９、本明細書に参考文献によって盛り込まれた開示全体を参照）。
【００６４】
本発明の薬学的組成物は、局所処置または全身処置のいずれが目的か、また治療する領域によって、複数の方法で投与され得る。投与は、（ａ）経口投与、（ｂ）例えば、噴霧器、気管内投与、経鼻投与による、粉末またはエアロゾルの吸入または噴霧による肺投与、（ｃ）表皮投与、経皮投与、目、および膣内投与と直腸送達などの粘膜への投与などの局所投与、または、（ｄ）静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内の注射または輸液、あるいは例えばくも膜下腔投与または脳室内投与といった頭蓋内投与などの非経口投与であり得る。ある実施形態では、活性ＬＮＡオリゴヌクレオチドは静脈内投与、腹腔内投与、経口投与、局所投与、または静脈内ボーラスとして、あるいは直接的に標的器官に投与される。
【００６５】
現在、大部分の適切な投与形態は静脈内注射または経口投与であると考えられている。
【００６６】
局所投与用の薬学的組成物と製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ジェル、点滴剤、スプレー、坐薬、液体および粉末を含み得る。従来の水性、粉末またはオイルベースの医薬的キャリア、増粘剤などが必要または所望され得る。コーティングを施したコンドーム、手袋などもまた有用である。本発明のオリゴヌクレオチドを含む望ましい局所用製剤は、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤、および界面活性剤などの局所送達剤との混合剤である。経口投与用の薬学的組成物と製剤は、粉末、または顆粒、微粒子、ナノ粒子、水または非水媒体中の懸濁液、または溶液、カプセル、ジェルカプセル、小袋、タブレット、またはミニタブレットを含むがこれに限定されない。非経口投与、くも膜下腔内投与、または脳室内投与用の薬学的組成物と製剤は、緩衝剤、希釈剤、および、浸透促進剤、キャリア化合物またその他の薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤など、しかしそれに限定されないその他の適切な添加物も含み得る滅菌した水溶液を含み得る。
【００６７】
本発明の薬学的組成物は溶液、乳液、およびリポソーム含有製剤を含むがそれに限定されない。これらの組成物は、予め生成された脂質、自己乳化固体、自己乳化半固形を含むがそれに限定されない様々な組成物から生成され得る。腫瘍組織への薬剤送達は、陽イオンリポソーム、シクロデキストリン、ポルフィリン誘導体、分岐鎖デンドリマー、ポリエチレンイミンポリマー、ナノ粒子、および微粒子を含むがそれに限定されないキャリアを介した送達により増強される場合がある（Ｄａｓｓ ＣＲ．Ｊ Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００２，５４（１）：３−２７）。
【００６８】
特に好ましい非経口投与経路は眼内投与である。本ＬＮＡオリゴヌクレオチドの眼内投与は、その投与経路によりＬＮＡオリゴヌクレオチドの目への進入が可能である限り、目への注入または直接（例えば局所的）投与により達成され得ると理解される。上述の目への局所的経路投与に加え、適切な眼内投与経路は硝子体内投与、網膜内投与、網膜下投与、テノン嚢下投与、眼窩周囲投与、眼窩後方投与、経隔膜投与、および経強膜投与を含む。
【００６９】
眼内投与用に、薬学的組成物は例えばパッチまたは目への塗布、あるいはイオン泳動によって直接局所的に投与される場合がある。軟膏、スプレー、または点滴用液体は、アプリケーターまたは点眼器などの当業者に知られた目への送達システムによって送達され得る。組成物は、目の表面または瞼の内側に直接的に投与される場合がある。当該組成物は、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはポリ（ビニルアルコール）などのムチン模倣剤、アスコルビン酸、ＥＤＴＡまたは塩化ベンジルクロニウム等の防腐剤、および通常量の希釈剤および／またはキャリアを含み得る。
【００７０】
本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチドは、例えば米国特許第５，６７２，６５９号および第５，５９５，７６０号に記載の徐放性配合で提供され得る。即時性放出配合または徐放性配合の使用は、治療される状態の性質に依存する。状態が急性疾患、または過急性疾患である場合には、即時放出型での治療が徐放性配合よりも望ましいだろう。あるいは、特定の予防または長期治療には、徐放性配合が適切であり得る。
【００７１】
ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、針またはその他の送達機器を用いて目の内部に注入可能である。
【００７２】
ある実施形態では、薬学的組成物は生理的に許容可能なキャリア媒体と混合した本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチド（例えば、重量で０．１から９０％）、またはその生理的に許容可能な塩を含む。好ましくは、生理的に許容可能なキャリア媒体は水、緩衝水溶液、生理食塩水、０．４％食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などである。
【００７３】
本発明の薬学的組成物は、従来の医薬的賦形剤および／または添加物も含み得る。適切な医薬的賦形剤は、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調節剤、緩衝剤、およびｐＨ調節剤を含む。適切な添加物は、生理的生体適合性緩衝剤（例えば、塩酸トロメタミン）、キレート剤の添加（例えば、ＤＴＰＡまたはＤＴＰＡ−ビスアマイドなど）またはカルシウムキレート錯体（例として、カルシウムＤＴＰＡ、カルシウムナトリウムＤＴＰＡ−ビスアマイド）あるいは、任意で、カルシウム塩またはナトリウム塩の添加（例えば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、または乳酸カルシウム）を含む。本発明の薬学的組成物は、液体形態用に梱包される可能性、あるいは凍結乾燥され得る。
【００７４】
固形組成物に関しては、例えば、医薬品グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどの従来の非毒性の固体キャリアが用いられ得る。
【００７５】
好ましくは、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは患者の治療において重篤な副作用を引き起こさない治療有効量を患者に送達するに十分な量の薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤などのユニット製剤中に含まれる。
【００７６】
ユニット用量の形で簡便に与えることができる本発明の医薬的製剤は、製薬業界でよく知られた従来技術に従って調製され得る。当該技術は、有効成分を医薬的キャリアまたは賦形剤と会合させる工程を含む。一般的に、製剤は均一にまた密接に有効成分を液体キャリアまたは細かく分けられた固体キャリア、あるいはその両方と会合させ、次いで、必要であれば製品を成形することで調製される。
【００７７】
本発明の組成物は、タブレット、カプセル、ジェルカプセル、液体シロップ、ソフトジェル、および坐薬などの、しかしそれに限定されない任意の多くの見込まれる剤形に製剤され得る。本発明の組成物は、水性、非水性または混合媒体中の懸濁液としても製剤され得る。水性懸濁液は、懸濁液の粘性を増す、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランなどの物質をさらに含む場合がある。懸濁液は安定剤も含む場合がある。
【００７８】
薬学的組成物の好ましい実施形態では、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは水性のキャリアで、特にｐＨを４．０〜８．５の範囲に保ち、またイオン強度が２０〜２０００ｍＭの緩衝剤を含む水性キャリアで製剤される。
【００７９】
「水性キャリア」という用語は、問題の薬学的組成物が液体形態であり、その液体キャリアは主に水を含む、つまり少なくとも８０％（ｗ／ｗ）、または少なくとも９０％（ｗ／ｗ）、またはさらに少なくとも９５％（ｗ／ｗ）のキャリアが水で構成されることを意味する。例えばエタノール、ＤＭＳＯ、エチレングリコールなどのその他の液体成分も使用され得る。
【００８０】
水性キャリアは好ましくは食塩水、またはｐＨを４．０〜８．５の範囲に保つ緩衝剤を含む。好ましくは緩衝剤は、例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）といった緩衝食塩水などであり、ｐＨ６．０〜７．５といったｐＨを５．０〜８．０の範囲に保つ。
【００８１】
薬学的組成物のイオン強度／等張性も重要である。従って、一般的には、液体薬学的組成物は５０〜１５００ｍＭの範囲、または１００〜１０００ｍＭの範囲といった２０〜２０００ｍＭの範囲のイオン強度である。
【００８２】
（併用薬剤）
本発明に従う薬学的組成物は任意でさらにアンチセンス化合物、化学療法剤、抗炎症化合物、抗ウイルス化合物、細胞増殖抑制化合物、抗血管形成化合物、抗増殖化合物、アポトーシス促進化合物、シグナル伝達調節因子、キナーゼ阻害剤および／または免疫調節化合物を含むということを理解する必要がある。現在、ＬＮＡオリゴヌクレオチドと一つ以上の化学療法剤の組合せが特に関心を引くと考えられる。
【００８３】
上述の本発明の薬学的組成物は、一つ以上の化学療法剤をさらに含み得る。化学療法化合物は一般的に、プレドニゾン、デキサメタゾンまたはデカドロン、アルトレタミン（ヘキサレン、ヘキサメチルメラニン（ＨＭＭ））、アミフォスチン（エチヨル）、アミノグルテチミド（シタドレン）、アムサクリン（Ｍ−ＡＭＳＡ）、アナストロゾール（アリミデックス）、テストステロンなどといったアンドロゲン、アスパラギナーゼ（Ｅｌｓｐａｒ）、アバスチン、バチルスカルメットゲラン菌、ビカルタミド（カソデックス）、ビスフォスフォネート、ブレオマイシン（ブレノキサン）、ボルテゾミブ、ブスルファン（ミレラン）、カルボプラチン（パラプラチン）、カルムスチン（ＢＣＮＵ、ＢｉＣＮＵ）、クロラムブシル（ロイケラン）、クロロデオキシアデノシン（２−ＣＤＡ、クラドリビン、ロイスタチン）、シスプラチン（プラチノール）、シクロホスファミド、シトシンアラビノシド（シタラビン）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン（ダクチノマイシンＤ、コスメゲン）、ダウノルビシン（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ）、ドセタキセル（タキソテール）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エピルビシン、エストラムスチン（ｅｍｃｙｔ）、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）などといったエストロゲン、エトポシド（ＶＰ−１６、ＶｅＰｅｓｉｄ、ｅｔｏｐｈｏｓ）、フルダラビン（フルダラ）、フルタミド（ｅｕｌｅｘｉｎ）、５−ＦＵＤＲ（フロクスウリジン）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ジェムシタビン（ジェムザール）、ゴセレリン（ｚｏｄａｌｅｘ）、ハーセプチン（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ヒドロキシウレア（ハイドレア）、イダルビシン（イダマイシン）、イホスファミド、ＩＬ−２（プロリュウキン、アルデスロイキン）、インターフェロンα（イントロンＡ、ロフェロンＡ）、イリノテカン（カンプトサール）、ロイプロリド（リュープロン）、レバミゾール（ｅｒｇａｍｉｓｏｌｅ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、Ｍｅｃｈｌｏｒａｔｈａｍｉｎｅ（マスタージェン、ナイトロジェンマスタード）、メルファラン（アルケラン）、メルカプトプリン（プリネトール、６−ＭＰ）、メトトレキサート（Ｍｅｘａｔｅ）、２−メトキシエストラジオール（２ＭＥ２、パンゼム）、マイトマイシンＣ（ｍｕｔａｍｕｃｉｎ）、ミトキサントロン（ノバントロン）、オクトレオチド（サンドスタチン）、ペントスタチン（２−デオキシコホルマイシン、Ｎｉｐｅｎｔ）、プリカマイシン（ミトラマイシン、Ｍｉｔｈｒａｃｉｎ）、プロカルバジン（Ｍａｔｕｌａｎｅ）、ストレプトゾシン、タモキシフィン（ノルバデックス）、タキソール（パクリタキセル）、テニポシド（ｖｕｍｏｎ、ＶＭ−２６）、サリドマイド、チオテパ、トポテカン（ハイカムチン）、トレチノイン（ベサノイド、オールトランス型レチノイン酸）、ビンブラスチン（ｖａｌｂａｎ）、ビンクリスチン（オンコビン）およびビノレルビン（ナベルビン）。などの副腎皮質ステロイドからなる群から選択される。
【００８４】
多発性骨髄腫の処置のためには、メルファラン、シクロホスファミド、プレドニゾン、ビンクリスチン、ドキソルビシン、カルムスチン、デキサメタゾン、サリドマイド、ボルテゾミブ、およびビスフォスフォネートなどの化学療法剤が望ましい。
【００８５】
腎臓癌の処置のためには、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−フルオロデオキシウリジン、パクリタキセル、カルボプラチン、イホスファミド、ドキソルビシン、ビンブラスチン、ＩＦＮ−α、およびＩＬ−２などの化学療法剤が望ましい。
【００８６】
ある改変例では、本発明は（ａ）一つ以上のＬＮＡオリゴヌクレオチドと（ｂ）非アンチセンス機構で機能する一つ以上の化学療法化合物を含む薬学的組成物を提供する。ＬＮＡオリゴヌクレオチドと共に使用した場合、当該化学療法化合物は独立に（例えば、ミトラマイシンとオリゴヌクレオチド）、連続的に（例えば、一定期間のミトラマイシンとオリゴヌクレオチド使用の後に続けて別の薬剤とオリゴヌクレオチド）、あるいは一つ以上の別の当該化学療法化合物との組合せまたは放射線療法との組合せで使用される場合がある。前記で明確に記載されたそれらを含む当業者に知られている全ての化学療法化合物は、本発明によるＬＮＡオリゴヌクレオチドとの複合治療として取り入れられる。
【００８７】
ある実施形態では、薬学的組成物はタキサン化合物との組合せで投与される。
【００８８】
「タキサン化合物」という用語は、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ［登録商標］）、パクリタキセル誘導体、ドセタキセル、タキソテール、修飾タキサン、およびタキソイドアナログを含むよう意図されている。パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ［登録商標］）はイチイの一種（Ｗｅｓｔｅｒｎ（ｐａｃｉｆｉｃ）ｙｅｗ）、Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｉｆｏｌｉａの樹皮から単離されたジテルペンで、タキサン環系を有する治療剤の１分野の代表である。パクリタキセルとそのアナログは、イチイの針葉と枝から得られた前駆物質、１０−デアセチルバッカチンＩＩＩから部分合成により、また完全合成により生成されてきた。Ｈｏｌｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：１５９７−１６０１（１９９４）とＮｉｃｏｌａｏｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６７：６３０（１９９４）を参照。パクリタキセルは臨床試験でいくつかのヒトの腫瘍における有効性が証明された。ＭｃＧｕｉｒｅ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．１１１：２３７−２７９（１９８９）、Ｈｏｌｍｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８３：１７９７−１８０５（１９９１）、Ｋｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８６：１８−２４（１９９４）、およびＫｏｈｎ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １２（１９９３）を参照。修飾タキサンまたはタキソイドアナログは修飾された側鎖を持つタキサン環を有する化合物である。多くのこれらのアナログは、自然に生じるパクリタキセルより高い水溶解性や安定性といった向上した特性を有する。これらのアナログは、当業者に知られており、参考文献によって本明細書中に援用される開示である例えば米国特許第５，２７８，３２４号、第５，２７２，１７１号、第５，２５４，５８０号、第５，２５０，６８３号、第５，２４８，７９６号、および第５，２７７，４００号に開示されている。パクリタキセルおよびタキソテールは、参考文献によって本明細書中に援用される開示である、国際公開第９３／１８２１０号、欧州特許第０ ２５３ ７３９号、欧州特許第０ ２５３ ７３９号、および国際公開第９２／０９５８９号の方法により調製することができる。特定の実施形態では、タキサン化合物はパクリタキセルまたはタキソテールである。
【００８９】
上述の組成物中のタキサン化合物とＬＮＡオリゴヌクレオチドの重量比は、２５：１〜１：２５の範囲、または１０：１〜１：２５の範囲、または１：１〜１：２５の範囲、または５０：１〜１：１０の範囲、または１：１〜１：５０の範囲、または２５：１〜１：１０の範囲といった、一般的には５０：１〜１：２５の範囲である。
【００９０】
さらなる実施形態では、本発明の薬学的組成物は一つ以上のＬＮＡオリゴヌクレオチドと第二の核酸標的を標的とする一つ以上の追加のアンチセンス化合物を含む場合がある。二つ以上を組み合わせた化合物が同時にまたは連続的に使用される場合がある。
【００９１】
非ステロイド抗炎症剤と副腎皮質ステロイド、抗ウイルス剤、および免疫調節剤を含む、しかしこれに限定されない抗炎症剤も、本発明の組成物に組み込まれる場合がある。二つ以上を組み合わせた化合物を同時にまたは連続的に使用される場合がある。
【００９２】
さらに、ＬＮＡオリゴヌクレオチドを含む薬学的組成物は、放射線療法などと組み合わせて使用される場合がある。
【００９３】
（医療処置）
本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載の多くの治療上の応用に有用である。一般的に、本発明の治療方法は治療有効量のＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドのほ乳類、特にヒトへの投与を含む。
【００９４】
従って、本発明は、投薬治療として使用するために本明細書に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチド、あるいは本明細書に記載の結合体とも関連する。
【００９５】
投薬は治療対象の疾患の重篤度と反応性に依存し、数日から数ヶ月、あるいは治癒するまで、または疾患状態の縮小が達成されるまで続く治療過程である。至適な投薬計画は、患者の体内の薬剤または代理マーカーの測定によっても評価可能である。
【００９６】
至適投薬量は、個別のオリゴヌクレオチドの相対的効力に依存して様々であり得る。一般的に、動物モデルでインビトロとインビボで有効であると見いだされたＥＣ５０に基づいて概算できる。一般的に、用量は体重ｋｇあたり０．０１μｇから１ｇであり、１日、週、月、年１回以上、あるいは２から１０年毎に一回投与される、または数時間から数ヶ月間まで継続的な輸液によって投与され得る。投薬の繰り返し率は測定された滞留時間と体液中または組織中の薬剤濃度に基づいて概算することができる。成功した治療後、患者は疾患状態の再発防止のための維持療法を受けるのが所望され得る。現在、当該用量の大部分は、例えば体重ｋｇあたり０．１ｍｇから４０ｍｇ、または０．５ｍｇから１０ｍｇなど、０．０１ｍｇから１００ｍｇであると考えられている。当該１回分は、１日１回であり得るが、より好ましくは、例えば週に１〜３回のより低頻度で、１〜４週の期間であり得る。維持療法は、例えば月に１〜４回、または年に１〜１０回といったさらに低頻度で継続され得る。
【００９７】
当業者は、ＬＮＡオリゴヌクレオチドが本発明の精神の範囲に含まれる様々な数多くの原理によってＨＩＦ−１ａ関連疾患と闘うのに使用可能であることを正しく理解するだろう。
【００９８】
本明細書で使用される場合「標的核酸」という用語は、ＨＩＦ−１ａをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡから転写されたＲＮＡ（ｍＲＮＡ前駆体とｍＲＮＡを含む）、および当該ＲＮＡに由来するｃＤＮＡも含む。
【００９９】
本明細書で使用される場合「遺伝子」という用語は、エキソン、イントロン、５’また３’非コーディング領域、および調節因子を含む遺伝子を意味し、現在知られているその全ての改変体と解明され得るそれ以外の改変体を意味する。
【０１００】
本明細書で使用される場合「ＬＮＡオリゴヌクレオチド」という用語は、例えば、標的遺伝子の「キメラプラスト」と「ＴＦＯ」、標的遺伝子のＲＮＡ転写物の「アンチセンス阻害因子」「ｓｉＲＮＡ」「ｍｉＲＮＡ」「リボザイム」および「オリゴザイム」、または標的遺伝子がコードするタンパク質の「アプタマー」「シュピーゲルマー」「デコイ」のいずれへの水素結合によって結合することでヒトにおいて望ましい治療効果を誘導可能なオリゴヌクレオチドを指す。
【０１０１】
本明細書で使用される場合「ｍＲＮＡ」という用語は、現在知られている標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物、および特定され得るそれ以外の転写物を意味する
本明細書で使用される場合「調節」という用語は、遺伝子発現における増加（刺激）または減少（阻害）のどちらかを意味する。本発明では阻害が遺伝子発現の調節の好ましい形態であり、ｍＲＮＡが好ましい標的である。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、アンチセンス化合物から特定の標的核酸までを「標的にする」という語は、細胞、動物、またはヒトにアンチセンス化合物がその意図された標的に結合し機能を調節出来るような方法でアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することを意味する。
【０１０３】
ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、現在のところほとんどわかっていない「アンチセンス様」の機構による特定の内因性または外因性遺伝子のサイレンスに細胞が利用する小分子の二本鎖ＲＮＡ分子であるｓｉＲＮＡとして設計される場合がある。
【０１０４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの臨床的有効性は、例えば吸収、分配、細胞による取り込み、代謝および排出などの薬物動態に大いに依存する。言い換えると、これらのパラメーターは、オリゴヌクレオチドの根本的な化学的性質とサイズ、三次元構造によって大いに左右される。
【０１０５】
本発明によるＬＮＡオリゴヌクレオチドの薬物動態特性の調節は、様々な異なる部分の結合によってさらに達成され得る。例えば、オリゴヌクレオチドが細胞膜を通過する能力は、例えばコレステロール部分、チオエーテル、脂肪族鎖、リン脂質またはポリアミンなどといった脂質部分のオリゴヌクレオチドへの結合によって向上し得る。同様に、ＬＮＡオリゴヌクレオチドの細胞への取り込みは、細胞質への輸送を仲介する膜中の分子と相互作用するオリゴヌクレオチドへの部分の結合により向上し得る。
【０１０６】
本発明による薬物動態特性は、ＬＮＡオリゴヌクレオチドの取り込みを向上させ、ＬＮＡオリゴヌクレオチドの分解に対する耐性などといった生理的安定性を向上させ、および／または、オリゴヌクレオチドの例えばｍＲＮＡ配列といった標的配列とのハイブリダイゼーション特性の特異性と親和性を増加させる基で向上し得る。
【０１０７】
本発明による薬学的組成物は、多くの様々な疾患の治療に利用可能である。癌細胞の増殖のように、血管内皮細胞はＨＩＦ−１ａ発現の下方調節に感受性である。従って、本発明による薬学的組成物は、新脈管形成を引き起こす異常な疾患を特徴とする疾患の治療に利用可能である。当該疾患の例は、一般的に癌であり、アテローム性動脈硬化症、乾癬、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、関節リウマチ、ぜんそく、炎症性腸疾患、いぼ、アレルギー性皮膚炎、およびカポジ肉腫である。
【０１０８】
一般的に述べられた、本発明の一つの特徴は、治療有効量のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の結合体のほ乳動物への投与を含む、異常な新脈管形成によって引き起こされる疾患を患った、またはその疾患に罹患しやすい哺乳動物の治療方法を対象にしている。
【０１０９】
さらに、本発明は、本明細書に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の結合体または本明細書に記載の薬学的組成物の投与を包含する新脈管形成の阻害方法にも関連する。
【０１１０】
本発明の興味深い特徴は、アテローム性動脈硬化症、乾癬、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、関節リウマチ、ぜんそく、炎症性腸疾患、いぼ、アレルギー性皮膚炎、炎症および皮膚炎、またはその他の皮膚関連疾患から選択される疾患の治療のための薬剤調製への本明細書に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の結合体または本明細書に記載の薬学的組成物の使用を対象にしている。
【０１１１】
本発明による薬学的組成物は、炎症性疾患、皮膚炎または例えば乾癬や関節リウマチといったその他の皮膚疾患または障害などといった炎症の治療にも利用可能である。
【０１１２】
同様に、本発明の別の興味深い特徴は、アテローム性動脈硬化症、乾癬、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、ぜんそく、炎症性腸疾患、いぼ、アレルギー性皮膚炎、炎症および皮膚炎、からなる群から選択される疾患の治療のための方法を対象とし、上述の方法は本明細書に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の結合体または本明細書に記載の薬学的組成物のそれを必要とする患者への投与を包含する。
【０１１３】
特に興味深いのは、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、乾癬、関節リウマチ、炎症性腸疾患、およびその他の炎症性疾患を含む新脈管形成疾患である。これらの疾患は、新脈管形成領域での新しく形成された血管による正常組織の破壊に特徴づけられる。例えば、黄斑変性症では、毛細血管が脈絡膜に侵入し破壊する。黄斑変性症における新脈管形成による脈絡膜の破壊は、最終的には部分的または完全な失明を引き起こす。
【０１１４】
本発明の方法は、好ましくは癌により引き起こされる疾患に対する治療または予防、特に肺、乳房、結腸、前立腺、膵臓、肝臓、甲状腺、腎臓、脳、精巣、胃、腸、腸（管）、脊髄、副鼻洞、膀胱、尿道、卵巣癌などといった組織で生じ得る癌の治療に用いられる。
【０１１５】
さらに、本明細書に記載の本発明は、当該治療が必要なヒトへのＬＮＡオリゴヌクレオチドの高用量を含むがそれに限定されない、治療有効量のＨＩＦ−１ａ調節ＬＮＡオリゴヌクレオチドを含む癌の予防または治療の方法を含む。本発明はさらにＨＩＦ−１ａ調節ＬＮＡオリゴヌクレオチドの短期間投与の利用を含む。正常、非癌性細胞は、特定の細胞タイプの頻度の特性で分類する。細胞が癌状態に変化した場合、制御不良の細胞増殖と細胞死の減少が生じ、従って、乱雑な細胞分裂または細胞増殖は癌性細胞タイプの顕著な特徴である。
【０１１６】
癌のタイプの例は、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫などの急性白血病）、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、子宮頸癌、精巣癌、肺癌、膀胱癌、黒色腫、頭頸部癌、脳の癌、原発部位不明の癌、新生物、末梢神経の癌、中枢末梢神経系の癌、腫瘍（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、小細胞肺癌、上皮性癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽腫、および網膜芽細胞腫）、重鎖病、転移、または無制御あるいは異常な細胞増殖で特徴づけられる任意の疾患または障害を含むがそれに限定されない。
【０１１７】
「癌腫」という用語は、上皮性起源の悪性腫瘍を示すよう意図されている。上皮組織は体の内部と外部の体表面を覆う、あるいは内側を覆う。上皮組織の例は、皮膚、粘膜、および体腔と腸、膀胱、子宮などといった内臓を裏打ちする漿膜である。上皮組織は、粘液分泌腺などの腺から深部組織層にまで拡大される場合もある。
【０１１８】
「肉腫」という用語は、軟骨、脂肪、筋肉、腱および骨などといった結合組織から増殖した悪性腫瘍を示すよう意図されている。
【０１１９】
本明細書で使われた場合、「神経膠腫」という用語はグリア細胞起源の悪性腫瘍を対象とするよう意図されている。
【０１２０】
癌治療用の薬剤製造のための本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは本発明の結合体の使用では、前述の癌は適宜、固形癌のタイプである。さらに、前述の癌は適宜、癌腫でもある。癌腫は一般的に悪性黒色腫、基底細胞癌、卵巣癌、乳癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌、膀胱癌、再発性表在性膀胱癌、胃癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、子宮頸癌、子宮頸部形成異常、喉頭乳頭腫症、結腸癌、結腸直腸癌、およびカルチノイド腫瘍からなる群から選択される。より一般的には、上記の癌腫は悪性黒色腫、非小細胞肺癌、乳癌、結腸癌、および腎細胞癌からなる群から選択される。悪性黒色腫は、一般的に表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端部黒色腫、メラニン欠乏性黒色腫、および線維硬化性黒色腫からなる群から選択される。
【０１２１】
あるいは、癌は適宜、肉腫である場合がある。肉腫は一般的には、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、悪性線維性組織球腫、線維肉腫、およびカポジ肉腫からなる群から選択されるタイプである。
【０１２２】
あるいは、癌は神経膠腫である場合がある。
【０１２３】
本明細書に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドと結合体は、多発性骨髄腫、腎臓、子宮頸癌、脳の癌、および乳癌からなる群から選択される癌疾患の治療にも特に有用であると考えられている。
【０１２４】
本発明は、癌の治療方法も提供し、当該方法は、本明細書に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の結合体または本明細書に記載の薬学的組成物のそれを必要とする患者への投与を含む。ある改変例では、癌は固形癌タイプである。固形癌は適宜、上述などの癌腫または肉腫または神経膠腫である。
【０１２５】
従って、本発明のさらなる特徴は、癌治療のための薬剤の製造のための本明細書に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の結合体の使用を対象としており、当該薬剤はさらに、「複合薬」の項で上述された群から選択される化学療法剤を含む。適宜、追加の化学療法剤は、タキソール、パクリタキセル、またはドセタキセルなどのタキサンから選択される。
【０１２６】
代わりになるべきものとして述べられた、本発明は、さらに癌の治療方法を対象としており、当該方法は、本明細書に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の結合体または本明細書に記載の薬学的組成物のそれを必要とする患者への投与を包含し、さらに、さらなる化学療法剤の投与を包含する。さらなる当該投与は、さらなる化学療法剤が本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチドに結合されるものが薬学的組成物中に存在しているか、あるいは別の製剤中で投与される。
【０１２７】
好ましい実施形態では、本発明は（ａ）一つ以上のアンチセンス化合物と（ｂ）姉妹染色分体の動原体でのマイクロチューブの脱重合化と張力形成を阻害するが、マイクロチューブは動原体に結合しない一つ以上のその他の化学療法剤を含む薬学的組成物を提供する。当該化学療法剤は、上記に記載のタキサンを含み、特にタキソール、パクリタキセル、またはドセタキセルである。本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチドと共に使用する場合、当該化学療法剤は、腫瘍細胞と腫瘍血管系の増殖中の内皮細胞中のＨＩＦ−１ａタンパク質濃度を減少させることでその後の化学療法剤との共処理に対して標的細胞を増感させる一定期間のオリゴヌクレオチド治療と共に開始して、連続的に使用する必要がある。
【０１２８】
別の好ましい実施形態では、本発明によるＬＮＡオリゴヌクレオチドを用いる治療法は、放射線療法と組み合わされる。本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチドと共に使用された場合、放射線療法は、腫瘍細胞と腫瘍血管系の増殖中の内皮細胞中のＨＩＦ−１ａタンパク質濃度を減少させることでその後の化学療法剤との共処理に対して標的細胞を増感させる一定期間のオリゴヌクレオチド治療と共に開始して、連続的に使用する必要がある。
【０１２９】
本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチドは、診断、治療法、予防のための研究試薬として利用することも可能である。研究ではアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的の機能的解析または治療的介入のための標的として有用性の評価を行い易くする細胞内と実験動物のＨＩＦ−１ａ遺伝子の合成を特異的に阻害する為に使用され得る。診断においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ノーザンブロッティング、インサイチュハイブリダイゼーションまたは類似の手法により細胞または組織内のＨＩＦ−１ａ発現の検出と定量に利用され得る。治療法では、ＨＩＦ−１ａの発現調節で治療され得る疾患または障害を有すると疑われる動物またはヒトが、本発明によるアンチセンスＬＮＡオリゴヌクレオチド投与により治療される。さらに提供されるのは、ＨＩＦ−１ａの発現に関連する疾患または状態を有する、またはその傾向があると疑われる動物、特にマウス、ラット、およびヒトの、医薬的、または予防的な有効量の一つ以上の本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは結合体または薬学的組成物の投与による治療方法である。
【０１３０】
本発明のさらなる特徴は、本明細書に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の結合体または本明細書に記載の薬学的組成物の投与を含むアポトーシスの誘導方法を対象としている。アポトーシスの誘導は、インビトロまたはインビボである場合がある。誘導は、細胞アッセイまたは組織試料でまたは生きた哺乳動物で行われ得る。
【０１３１】
本発明に関連した特徴は、本明細書に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の結合体または本明細書に記載の薬学的組成物の投与を含む細胞増殖の予防方法を対象としている。増殖の予防は、インビトロまたはインビボである場合がある。予防は、細胞アッセイまたは組織試料でまたは生きた哺乳動物で行われ得る。
【０１３２】
一層さらに、本発明は、新脈管形成疾患と関連した新脈管形成が阻害されるように、本明細書に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは本明細書に記載の結合体または本明細書に記載の薬学的組成物の投与を含む新脈管形成疾患の治療方法とも関連する。
【０１３３】
ある実施形態においては、新脈管形成疾患は癌と関連する腫瘍を含む。上記参照。癌は好ましくは、乳癌、肺癌、頭頸部癌、脳の癌、腹腔内の癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、消化管癌、神経膠腫、肝臓癌、舌癌、神経芽細胞腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、多発性骨髄腫、皮膚癌、リンパ腫、および血液癌からなる群から選択される。あるいは、癌は多発性骨髄腫、腎臓癌、子宮頸癌、結腸癌、脳の癌、および乳癌からなる群から選択される。
【０１３４】
新脈管形成疾患も糖尿病性網膜症、黄斑変性症、および炎症性疾患からなる群からも選択される。特に、新脈管形成疾患は炎症性腸疾患、乾癬、および関節リウマチからなる群から選択される炎症性疾患である。
【０１３５】
黄斑変性症の治療は特に本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチドと関連していると考えられている。
【０１３６】
（キット）
薬学的組成物が液体である場合、ＬＮＡオリゴヌクレオチドの安定性を妥協する状況の対象になる危険があり、例えば凍結乾燥した原料として固形のＬＮＡオリゴヌクレオチドを含む最終製品を製造し、当該固形状態で製品を保存するのが所望され得る。製品は投与前に、食塩水中または緩衝食塩水中で再構成され（例えば溶解されるかまたは懸濁される）、使用できる状態にされ得る。
【０１３７】
従って、本発明は
（ａ）本明細書の上記に記載の、固形状態のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは結合体を含む第一の構成要素、および
（ｂ）当該ＬＮＡオリゴヌクレオチドの再構成（例えば、溶解または懸濁）に適した食塩水または緩衝液（例えば、緩衝食塩）を含む第二の構成要素、
を備えるキットも提供する。
【０１３８】
好ましくは当該食塩水または緩衝食塩水は４．０〜８．５の範囲のｐＨであり、２０〜２０００ｍＭのモル濃度である。好ましい実施形態では、食塩水または緩衝食塩水は６．０〜８．０の範囲のｐＨであり、１００〜５００ｍＭのモル濃度である。最も好ましい実施形態では、食塩水または緩衝食塩水は７．０〜８．０の範囲のｐＨであり、１２０〜２５０ｍＭのモル濃度である。
【０１３９】
このようなキットでは、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは好ましくは配列番号１、配列番号２、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１８からなる群から選択される。より具体的には、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは配列番号１と配列番号２からなる群から選択される。
【０１４０】
本発明はさらに限定されない方法で以下の実施例に例証される。
【実施例】
【０１４１】
（実験）
（実施例１：モノマー合成）
ＬＮＡモノマーの基礎ユニットとその派生物は、以下の公表された方法とそこで引用された参考文献に従って調製された。例として、国際公開第０３／０９５４６７号、およびＤ．Ｓ．Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｃ．Ｒｏｓｅｎｂｏｈｍ，Ｔ．Ｋｏｃｈ（２００２）Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＮＡ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ６，８０２−８０８を参照。
【０１４２】
（実施例２：オリゴヌクレオチド合成）
オリゴヌクレオチドは、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９００／ＭＯＳＳ合成機（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）でホスホルアミダイト手法を用いて１μｍｏｌまたは１５μｍｏｌスケール合成した。より大規模な合成には、Ａｅｋｔａ Ｏｌｉｇｏ Ｐｉｌｏｔを用いた。合成の最後（ＤＭＴ−ｏｎ）に、アンモニア水で１〜２時間室温で処理してオリゴヌクレオチドを固形支持体から解離させ、さらに６５℃で４時間脱保護を行った。オリゴヌクレオチドを逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で精製した。ＤＭＴ基の除去後、オリゴヌクレオチドは、ＡＥ−ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＣＧＥの性質を持ち、分子量をさらにＥＳＩ−ＭＳで確認した。詳細は下記参照のこと。
【０１４３】
（ＬＮＡ固形支持体の調製：）
（ＬＮＡスクシニルヘミエステルの調製）
５’−Ｏ−Ｄｍｔ−３’−ヒドロキシ−ＬＮＡモノマー（５００ｍｇ）、無水スクシニル（１．２等量）、およびＤＭＡＰ（１．２等量）をＤＣＭ（３５ｍｌ）中に溶解した。反応は、撹拌して室温で一晩行った。０．１ＭのＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ５．５（２回）とブライン（１回）で抽出後、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４でさらに乾燥させ、濾過して蒸発させた。ヘミエステル誘導体が９５％の収量で得られ、さらなる精製なしに使用した。
【０１４４】
（ＬＮＡ支持体の調製）
上記で調製されたヘミエステル誘導体（９０μｍｏｌ）を最低量のＤＭＦ中に溶解し、ＤＩＥＡ、およびｐｙＢＯＰ（９０μｍｏｌ）を添加して１分間混合した。この前活性化混合液を手動合成機中でＬＣＡＡ−ＣＰＧ（５００A、８０〜１２０メッシュサイズ、３
００ｍｇ）と混合し、撹拌した。室温で１．５時間後、支持体を濾過し、（残留物を）ＤＭＦ、ＤＣＭおよびメタノールで洗浄した。乾燥後、ローディングは５７μｍｏｌ／ｇであると測定された（Ｔｏｍ Ｂｒｏｗｎ，Ｄｏｒｃａｓ Ｊ．Ｓ．Ｂｒｏｗｎ．Ｍｏｄｅｒｎ ｍｅｃｈｉｎｅ−ａｉｄｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉｎ：Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｏｘｆｏｒｄ：ＩＲＬ ｐｒｅｓｓ，１９９１：１３−１４を参照）。
【０１４５】
（オリゴヌクレオチドの伸長）
ホスホルアミダイトのカップリング（Ａ（ｂｚ）、Ｇ（ｉｂｕ）、５−メチル−Ｃ（ｂｚ））またはＴ−β−シアノエチル−ホスホルアミダイト）を、０．１Ｍの５’−Ｏ−ＤＭＴで保護されたアミダイトのアセトニトリル溶液と活性剤としてＤＣＩ（４，５−ｄｉｃｙａｎｏｉｍｉｄａｚｏｌｅ）のアセトニトリル溶液（０．２５Ｍ）で行う。チオール化は、塩化キサンタン（アセトニトリル：ピリジン１０％の０．０１Ｍ溶液）を用いることで行われる。残りの試薬は、オリゴヌクレオチド合成に一般的に用いられるものである。供給業者が提供するプロトコルを都合良く至適化した。
【０１４６】
（ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製：）
カラム：Ｘｔｅｒｒａ ＲＰ１８
流速：３ｍｌ／分
緩衝液：０．１Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ８およびアセトニトリル。
【０１４７】
（略語）
ＤＭＴ：ジメトキシトリチル
ＤＣＩ：４，５−ジシアノイミダゾール
ＤＭＡＰ：４−ジメチルアミノピリジン
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＤＩＥＡ：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＰｙＢＯＰ：ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェイト
Ｂｚ：ベンゾイル
Ｉｂｕ：イソブチリル。
【０１４８】
（実施例３：ＬＮＡオリゴヌクレオチドの設計）
【０１４９】
【表１】
表１では、大文字がβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログ（β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ）を示し、小文字が２−デオキシヌクレオチドを示し、下線がβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログまたは２−デオキシヌクレオチドのどちらかを示し、下付き文字「ｓ」が隣接するヌクレオチドとＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、隣接するヌクレオチドとＬＮＡヌクレオチドアナログの間に下付き文字がない場合はホスホロジエステル結合を示し、下付き文字「ｘ」が隣接するヌクレオチドとＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合のいずれかを示し、括弧内のヌクレオチドユニットは、例えば（Ｔｘ）または（Ｇｘ）はそれぞれ任意のユニットを表す。全てのＬＮＡ−Ｃモノマーは５−メチル−Ｃ（ＭｅＣ）である。
【０１５０】
（化合物の融解温度（Ｔｍ）の測定）
３μＭの配列番号１の１０ｍＭリン酸ナトリウム／１００ｍＭのＮａＣｌ／０．１ｎＭのＥＤＴＡ溶液、ｐＨ７．０を、配列番号１と相補的なＤＮＡ／ＲＮＡ ３μＭの１０ｍＭリン酸ナトリウム／１００ｍＭのＮａＣｌ／０．１ｎＭのＥＤＴＡ溶液、ｐＨ７．０を、９０℃、１分で混合し、室温まで冷却させる。二本鎖のＴｍは、１℃／分の２５から９５℃までの温度上昇で測定した。配列番号１のＴｍを下の表２に示す。
【０１５１】
【表２】
（実施例４：ヒトまたはラットの血漿におけるＬＮＡオリゴヌクレオチドの安定性）
ＬＮＡオリゴヌクレオチドの安定性をヒトまたはラットの血漿（マウス、サル、またはイヌの血漿である可能性もある）で試験した。４５μｌの血漿に５μｌのＬＮＡオリゴヌクレオチドを加える（終濃度２０μＭ）。ＬＮＡオリゴヌクレオチドを血漿中で０から９６時間の範囲で３７℃でインキュベートする（血漿は、ヌクレアーゼ活性を９６時間までテストしてヌクレアーゼ開裂パターンに違いがないことが示された）。指示された時間に、試料を液体窒素中で急速凍結した。血漿中の２μｌ（４０ｐｍｏｌ相当）のＬＮＡオリゴヌクレオチドを水１５μｌと３μｌの６ｘｌｏａｄｉｎｇ ｄｙｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えることで希釈した。マーカーとして、１０ｂｐラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １０８２１−０１５）を用いる。１μｌのラダーに対して１μｌの６ｘｌｏａｄｉｎｇ ｄｙｅと４μｌの水を添加する。試料を混合し、６５℃で１０分間加熱し、プレランゲル（１６％アクリルアミド、７Ｍ尿素、１ｘＴＢＥ、５０ワットで１時間プレラン）にローディングし、５０〜６０ワットで２時間半泳動する。その後、ゲルを１ｘＴＢＥ中の１ｘＳｙＢＲ ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で１５分間染色する。バンドは、ＢｉｏＲａｄのホスホイメージャーで可視化した。（ラット血漿は図１Ａを、ヒトとラット血漿は図１Ｂを参照）。
【０１５２】
ＬＮＡオリゴヌクレオチドの安定性をヒトの血漿（ラット、マウス、サル、またはイヌの血漿である可能性もある）で試験した。終濃度２０μＭのＬＮＡオリゴヌクレオチド（１から５μｌの間）を全体量２０μｌの血漿に加え、０から２４時間の範囲でインキュベートした（７２時間までであり得る。血漿は７２時間までヌクレアーゼ活性をテストしてヌクレアーゼ開裂パターンに違いがないことが示された）。指示された時間に、試料を−８０℃で保存した。血漿中の１μｌ（２０ｐｍｏｌ相当）のＬＮＡオリゴヌクレオチドを水で１０倍に希釈し、１０ｂｐラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カタログ番号：１０８２１−０１５））と共に１６％アクリルアミド７Ｍ尿素ゲルで泳動した。１ｘＴＢＥ中の１ｘＳｙＢＲ ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で１５分間の染色前に、ゲルを約４０ワットで２〜３時間泳動した。バンドは、ＢｉｏＲａｄのホスホイメージャーで可視化した。（図１を参照）。
【０１５３】
（実施例５：インビトロモデル：細胞培養）
標的核酸の発現に対するＬＮＡオリゴヌクレオチド作用は、標的核酸が測定可能な濃度で存在するなら、様々な任意の細胞タイプで試験可能である。標的は当該核酸をコードする各線の内因的、あるいは一時的または安定な形質移入で発現させることができる。
【０１５４】
標的核酸の発現レベルは、例えば、ノーザンブロット解析や定量ＰＣＲ、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイなどを用いてごく普通に測定可能である。以下の細胞タイプを実例の目的で挙げるが、選択した細胞タイプで標的が発現されるなら、その他の細胞の種類が普通に使用され得る。
【０１５５】
細胞を以下に記載の適切な培地で培養し、３７℃、９５〜９８％の湿度と５％ＣＯ２で維持した。低酸素または酸素欠乏条件下で培養する場合、Ｏ２濃度はそれぞれ１〜２％または０〜０．５％に保った。細胞は普通に週に２〜３回継代した。
１５ＰＣ３：ヒト前立腺癌細胞株１５ＰＣ３は、オランダ、ＡＭＣ、Ｎｅｕｒｏｚｉｎｔｕｉｇｅｎ研究室のＤｒ．Ｆ．Ｂａａｓのご好意で提供され、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ Ｉ、ゲンタマイシンを加えたＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）培地中で培養した。
ＰＣ３：ヒト前立腺癌細胞株ＰＣ３をＡＴＣＣから購入し、グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）と１０％ＦＢＳ、ゲンタマイシンを加えたＦ１２ Ｃｏｏｎの培地で培養した。
５１８Ａ２：ヒトメラノーマ癌細胞株５１８Ａ２を、ウィーン大学の臨床薬学部、分子薬学、実験腫瘍学部門のＤｒ．Ｂ．Ｊａｎｓｅｎのご好意で提供され、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ Ｉ、ゲンタマイシンを加えたＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）培地中で培養した。
Ｕ３７３：膠芽腫細胞Ｕ３７３を、１０％ウシ胎仔血清とＧｌｕｔａｍａｘ Ｉ、ＮＥＡＡ、ピルビン酸ナトリウム、ゲンタマイシンを含むＥＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）培地中で、３７℃、９５％の湿度、５％ＣＯ２で培養した。
ＨｅＬａ：子宮頸癌細胞株Ｈｅｌａを、１０％ウシ胎仔血清とゲンタマイシンを含むＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）培地中で、３７℃、９５％の湿度、５％ＣＯ２で培養した。
ＭＰＣ−１１：マウス多発性骨髄腫細胞株ＭＰＣ−１１をＡＴＣＣより購入し、４ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘと１０％ウマ血清を加えたＤＭＥＭ培地で維持した。
ＤＵ−１４５：ヒト前立腺癌細胞株ＤＵ−１４５をＡＴＣＣより購入し、Ｇｌｕｔａｍａｘと１０％ＦＢＳを加えたＲＰＭＩ培地で維持した。
ＲＣＣ−４＋／−ＶＨＬ：ＶＨＬを発現するプラスミドまたは空のプラスミドで安定に形質移入したヒト腎臓癌細胞株ＲＣＣ４をＥＣＡＣＣから購入し、製造会社の取扱説明に従って維持した。
７８６−０：ヒト腎臓癌細胞株７８６−０をＡＴＣＣより購入し、製造会社の取扱説明に従って細胞を維持した。
ＨＵＶＥＣ：ヒト臍静脈内皮細胞株ＨＵＶＥＣをＣａｍｃｒｅｘから購入し、ＥＧＭ−２培地で維持した。
Ｋ５６２：ヒト慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２をＥＣＡＣＣより購入し、Ｇｌｕｔａｍａｘと１０％ＦＢＳを加えたＲＰＭＩ培地で、維持した。
Ｕ８７ＭＧ：ヒトグリア芽細胞腫細胞株Ｕ８７ＭＧをＡＴＣＣより購入し、製造会社の取扱説明に従って維持した。
Ｂ１６：マウス黒色腫細胞株Ｂ１６はＡＴＣＣより購入し、製造会社の取扱説明に従って維持した。
ＬＮＣａｐ：ヒト前立腺癌細胞株ＬＮＣａｐはＡＴＣＣより購入し、Ｇｌｕｔａｍａｘと１０％ＦＢＳを加えたＲＰＭＩ培地で維持した。
【０１５６】
（実施例６：インビトロモデル：アンチセンスオリゴヌクレオチド処理）
細胞培養と形質移入：Ｕ３７３またはＨｅＬａ細胞を１２穴プレートに、１０％ＦＢＳとＧｌｕｔａｍａｘ Ｉ、ゲンタマイシンを添加したＤ培地中に３７℃（５％のＣＯ２）で播種した。細胞が６０〜７０％コンフルエントの時に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（２．５〜５μｇ／ｍｌ）を用いて様々な濃度のオリゴヌクレオチド（０．２〜１００ｎＭ）で二組みで形質移入した。形質移入は、基本的にＤａａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４，ＪＢＣ ２６９：１６４１６−１６４２４）に記載のとおりに行った。つまり、細胞をＯｐｔｉＭＥＭ中のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅで１０分間インキュベートし、ウェル当たり総量０．５ｍＬの形質移入混合液にオリゴヌクレオチド添加した。４時間後、形質移入混合液を除去し、細胞を洗浄し、適切な培地中で、正常酸素または低酸素のいずれかの間に３７℃で約２０時間（ｍＲＮＡ解析とタンパク質解析）増殖させた。
【０１５７】
（実施例７：インビトロモデル：ＲＮＡ抽出とｃＤＮＡ合成）
（全ＲＮＡの単離）
全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログｎｏ．７４１０４）を用いるか、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログｎｏ．１５５９６）を用いて単離した。
【０１５８】
ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で全ＲＮＡ単離する場合は、細胞をＰＢＳで洗浄し、１％メルカプトエタノールを添加したＣｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ＲＴＬ、Ｑｉａｇｅｎ）を壁に直接添加した。数分後、製造会社の取扱説明に従って試料を処理した。
【０１５９】
組織試料は、Ｒｅｔｓｃｈ ３００ＭＭホモジナイザーでホモジナイズし、全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ試薬またはＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔを用いて製造会社の記載どおりに単離した。
【０１６０】
（一本鎖合成）
一本鎖合成は、ＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ
ｋｉｔ またはＭ−ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（基本的に、製造会社（Ａｍｂｉｏｎ）の記載どおり）のいずれかを用いて、製造会社の取扱説明（Ｑｉａｇｅｎ）に従って行った。ＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを使用する場合、各試料あたり０．５μｇの全ＲＮＡを１２μｌに調節し、０．２μｌのポリ（ｄＴ）１２−１８（０．５μｇ／μｌ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２μｌのｄＮＴＰミックス（各５ｍＭ）、２μｌの１０ｘＲＴ緩衝液、０．５μｌのＲＮＡｇｕａｒｄＴＭ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（３３ｕｎｉｔ／ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）、および１μｌのＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅと混合し、次いで３７℃で６０分インキュベートし、９３℃で５分間の加熱不活性化を行った。
【０１６１】
ランダムデカマーとＭ−ＭＬＶ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（基本的に、製造会社（Ａｍｂｉｏｎ）の記載どおり）を用いて一本鎖合成を行った場合、各試料の全ＲＮＡの０．２５μｇを水で１０．８μｌに調節し、２μｌデカマーと２μｌのｄＮＴＰミックス（各２．５ｍＭ）を添加した。試料を７０℃で３分間加熱し、直ちに氷水で冷却し、２μｌの１０ｘＲＴ緩衝液、１μｌのＭ−ＭＬＶ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、０．２５μｌのＲＮａｓｅ阻害剤を含む３．２５μｌの混合物を添加した。ｃＤＮＡは、４２℃で６０分間合成し、次いで９５℃で１０分間の加熱不活性化を行い、最後に４℃に冷却した。
【０１６２】
（実施例８：インビトロおよびインビボモデル：ＨＩＦ−１ａ発現のオリゴヌクレオチド阻害のリアルタイムＰＣＲによる解析）
ＨＩＦ−１ａ発現のアンチセンス調節は、当該技術分野に周知の様々な方法でアッセイ可能である。例えば、ＨＩＦ−１ａ ｍＲＮＡ濃度は、例えば、ノーザンブロット解析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ法（ＲＰＡ）、またはリアルタイムＰＣＲで定量可能である。リアルタイム定量ＰＣＲが現在好ましい。ＲＮＡ解析は、細胞の全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを対象に行うことができる。
【０１６３】
ＲＮＡの単離方法とノーザンブロット解析などのＲＮＡの解析方法は、当該技術分野で日常的な方法であり、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓに説明されている。
【０１６４】
リアルタイム定量ＰＣＲは、ＢｉｏＲＡＤから入手可能な市販のｉＱ Ｍｕｌｔｉ−Ｃｏｌｏｒ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて簡便に行うことができる。
【０１６５】
（ＨＩＦ−１ａ ｍＲＮＡ濃度のリアルタイム定量ＰＣＲ解析）
ｍＲＮＡ濃度の定量は、ｉＱ Ｍｕｌｔｉ−Ｃｏｌｏｒ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲＡＤ）を用いたリアルタイム定量ＰＣＲで製造会社の取扱説明書に従って測定した。
【０１６６】
リアルタイム定量ＰＣＲは、当該技術分野でよく知られた技術であり、例えば、Ｈｅｉｄ ｅｔ ａｌ．Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９６），６：９８６−９９４に説明されている。
【０１６７】
Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ ＵＤＧ ２ｘ ＰＣＲマスターミックスをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログｎｏ．１１７３０から入手した。プライマーとＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブをＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｋ ＡＧ，Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙより入手した。
【０１６８】
グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、１８Ｓ ＲＮＡまたはβ−アクチンｍＲＮＡの量を試料調製の変動の正規化に内部コントロールとして用いた。
【０１６９】
試料中のヒトＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ含量は、ヒトＧＡＰＤＨ ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ Ｐｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ＴａｑＭａｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログｎｏ．４３１０８８４Ｅ）を用いて製造会社の取扱説明書に従って定量した。
【０１７０】
ヒトＨＩＦ−１ａでは、ＰＣＲプライマーはフォワードプライマー：５’−ＣＴＣＡＴＣＣＡＡＧＡＡＧＣＣＣＴＡＡＣＧＴＧＴＴ−３’（配列番号２１）（アッセイでの終濃度、０．９μＭ）、リバースプライマー：５’−ＧＣＴＴＴＣＴＣＴＧＡＧＣＡＴＴＣＴＧＣＡＡＡＧＣ−３’（配列番号２２）（アッセイでの終濃度、０．９μＭ）、およびＰＣＲプローブ：５’ＦＡＭ−ＣＣＴＣＡＧＧＡＡＣＴＧＴＡＧＴＴＣＴＴＴＧＡＣＴＣＡＡＡＧＣＧＡＣＡ−ＴＡＭＲＡ ３’（配列番号２３）（アッセイでの終濃度、０．１μＭ）だった。
【０１７１】
カニクイザルＨＩＦ−１ａでは、ＰＣＲプライマーはＩフォワードプライマー：５’−ＧＣＴＴＡＣＣＡＴＣＡＧＣＴＡＴＴＴＧＣＧＴＧＴＧ−３’（配列番号２４）（アッセイでの終濃度、０．９μＭ）、リバースプライマー：５’−ＧＡＡＣＣＡＴＡＡＣＡＡＡＡＣＣＡＴＣＣＡＡＧＧＣ−３’（配列番号２５）（アッセイでの終濃度、０．９μＭ）、およびＰＣＲプローブ：５’ＦＡＭ−ＴＣＡＴＣＴＴＣＡＡＴＡＴＣＣＡＡＡＴＣＡＣＣＡＧＣＡＴＣＣＡＧＡＡＧ−ＴＡＭＲＡ ３’（配列番号２６）（アッセイでの終濃度、０．１μＭ）だった。
【０１７２】
１８ＳリボソームＲＮＡの定量では、ＴａｑＭａｎ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ １８Ｓ ｒＲＮＡ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ試薬（ＰＡＲＴ＃ ４３１０８７５、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造会社の取扱説明書にしたがって用いた。
【０１７３】
マウスＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの定量では、以下のプライマーとプローブを設計した。
【０１７４】
センスプライマー：５’−ＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＧＣＡＡＧＧＴＣＡＴＣ−３’（配列番号２７）（アッセイでの終濃度、０．３μＭ）、
アンチセンスプライマー：５’−ＧＴＣＡＧＡＴＣＣＡＣＧＡＣＧＧＡＣＡＣＡＴＴ−３’（配列番号２８）（アッセイでの終濃度、０．６μＭ）、
ＴａｑＭａｎプローブ：５’ＦＡＭ−ＧＡＡＧＣＴＣＡＣＴＧＧＣＡＴＧＧＣＡＴＧＧＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号２９）（アッセイでの終濃度、０．２μＭ）だった。
【０１７５】
（ＴａｑＭａｎプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ）
実施例６の記載どおりに行われた一本鎖合成のｃＤＮＡは、２〜２０倍に希釈し、リアルタイム定量ＰＣＲで解析した。プライマーとプローブを２ｘ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ ＵＤＧ（カタログｎｏ．１１７３０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、３．３μｌのｃＤＮＡに最終量２５μｌになるよう添加した。各試料を３つ組で解析した。対象のＲＮＡを発現している細胞株から精製した材料で調製したｃＤＮＡの２倍希釈物のアッセイで、アッセイの標準曲線を作成した。鋳型を用いないコントロールではｃＤＮＡの代わりに滅菌水を用いた。ＰＣＲプログラム：５０℃で２分、９５℃で１０分、次いで９５℃で１５秒を４０サイクル、６０℃で１分。
【０１７６】
標的ｍＲＮＡの相対量は、ｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍソフトウェアを用いて算出された閾値サイクルから決定した（図２参照）。
【０１７７】
（ＳｙＢＲ ＧｒｅｅｎリアルタイムＰＣＲ）
マウスＨＩＦ１α ｍＲＮＡの相対レベルを決定するため、ｃＤＮＡをＢｉｏＲＡＤのｉＣｙｃｌｅｒを用いた定量ＰＣＲ解析に用いた。
【０１７８】
５倍希釈したｃＤＮＡ ８μｌに、２９．５μｌのＰｌａｔｉｎｕｍ ｑＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ−ＵＤＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、各１０３０ｎＭのプライマー、０．５７×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、および１１．４ｎＭのフルオロセイン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を含む５２μｌの混合液を添加した。
【０１７９】
２５μｌの二組をＱ−ＰＣＲに用いた。５０℃で１２０秒、９５℃で１２０秒、（９５℃で３０秒と６０℃で６０秒）を４０サイクル。
【０１８０】
ＨＩＦ１ａ ｍＲＮＡの発現は、同様にＱ−ＰＣＲで定量したマウスβ−アクチンｍＲＮＡで正規化した。
【０１８１】
プライマー：
ｍＨＩＦ１ａ：５’−ＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＴＴＴＴＡＣＣＡＴＧＣ−３’（配列番号３０）、および５’−ＧＧＡＧＴＧＴＴＴＡＣＧＴＴＴＴＣＣＴＧＡＡＧ−３’（配列番号３１）
ｍβ−アクチン：５’−ＣＣＴＴＣＣＴＴＣＴＴＧＧＧＴＡＴＧＧＡＡ−３’（配列番号３２）、および５’−ＧＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＧＣＡＡＴＧＡＴＣＴ−３’（配列番号３３）
ｍＶＥＧＦ：５’−ＣＡＣＧＡＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＴＣ−３’（配列番号３４）、および５’−ＧＴＣＧＧＧＧＴＡＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＴ−３’（配列番号３５）
ＢＣＬ−２：フォワード：５’−ｇｃｃｃｔｇｔｇｇａｔｇａｃｔｇａｇｔａ−３’（配列番号３６）、およびリバース：５’−ｃａｇｃｃａｇｇａｇａａａｔｃａａａｃａｇ−３’（配列番号３７）
無処理のマウス線維芽細胞（Ｌｔｋ細胞）（５倍に希釈され、ＨＩＦ１αとβ−アクチンの両方を発現している）から合成したｃＤＮＡの２倍希釈物を、アッセイのための標準曲線の作成に用いた。ＨＩＦ１α ｍＲＮＡの相対量は、ｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍソフトウェアを用いて算出された閾値サイクルから決定した。
【０１８２】
（実施例９：インビトロ解析：ＨＩＦ−１ａタンパク質レベルのウェスタンブロット解析）
形質移入した細胞におけるＨＩＦ−１ａ ＬＮＡオリゴヌクレオチドのＨＩＦ−１ａタンパク質レベルに対するインビトロ作用をウェスタンブロットで測定した。
【０１８３】
プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を添加した５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８、１０％グリセロール、２．５％のＳＤＳ、５ｍＭのＤＴＴおよび６Ｍ尿素中に細胞を回収し、溶解した。総タンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて測定した。２０〜１００μｇの総タンパク質をＭＯＰＳ緩衝液の１０〜１２％のビス−トリスゲル、または３〜８％のトリス酢酸ゲルで泳動し、ＰＶＤＦ膜に製造会社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の取扱説明書に従ってブロットした。ブロッキング緩衝液（５％脱脂粉乳を添加したＰＢＳ−Ｔ）中での一晩のインキュベーションの後、膜を一晩抗ＨＩＦ−１ａ抗体、Ｂｃｌ−２抗体、ＶＥＧＦ抗体、またはその他のＨＩＦ−１ａ下流を検出する抗体でインキュベートした。ローディングコントロールとして、チューブリンまたはアクチンをＮｅｏｍａｒｋｅｒのモノクローナル抗体を用いて検出した。次に、膜を２次抗体でインキュベートし、ＨＩＦ−１ａを発色免疫検出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または化学発光ＥＣＬ＋検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて可視化した。（図２Ａおよび図２Ｂ参照）
（実施例１０：インビトロ解析：アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたヒトＨＩＦ−１ａ発現のアンチセンス阻害とその下流標的のＶＥＧＦＡとＭＭＰ−２への作用）
ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、Ｕ３７３細胞由来の培地中の下流標的ＶＥＧＦＡおよびＭＭＰ−２への作用もある。Ｕ３７３細胞はＴ２５フラスコ中０．３×１０６細胞で（時間実験）またはＴ８０フラスコ中０．６×１０６細胞で（４８時間濃縮実験）播種した。Ｕ３７３細胞を１０％ＦＢＳ、Ｇｌｕｔａｍａｘ Ｉおよびゲンタマイシンを添加した増殖培地中で３７℃（５％のＣＯ２）に置く。播種の翌日、様々な濃度のオリゴヌクレオチド（０．２〜１０ｎＭ）を用い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ２０００（２．５μｇ／ｍｌ）を用いて、二組または三つ組みで細胞にＬＮＡオリゴヌクレオチドを形質移入した。形質移入は、基本的にＤｅａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４，ＪＢＣ ２６９：１６４１６−１６４２４）の記載どおりに行った。つまり、細胞をＯｐｔｉＭＥＭ中のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅで１０分間インキュベートし、次いでオリゴヌクレオチド添加した。４時間後、形質移入混合液を除去し、細胞を洗浄し、適切な培地中で、酸素欠乏または低酸素のいずれかの間に３７℃で約２０時間（ｍＲＮＡ解析とタンパク質解析）増殖させた。示された時間に細胞の上清を回収した。プロテアーゼ阻害剤の添加を、−８０℃での保存前に加えた。ＲＤ ｓｙｓｔｅｍｓのヒトＶＥＧＦＡ ＥＬＩＳＡ（カタログｎｏ．ＤＶＥ−００）およびＭＭＰ−２ ＥＬＩＳＡ（カタログｎｏ．ＤＭＰ−２００）を製造会社に従って用いた。回収時間によって、上清を測定前に５〜５０倍に希釈した。図１２Ａ−Ｅを参照。
【０１８４】
（実施例１１：ＬＮＡオリゴヌクレオチドによるアポトーシスの誘導）
（細胞培養）
膠芽細胞腫細胞株Ｕ３７３（ＡＴＣＣ）は、１０％ウシ胎仔血清、Ｇｌｕｔａｍａｘ Ｉ、ＮＥＡＡ、ピルビン酸ナトリウム、およびゲンタマイシンを添加したＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ）で、３７℃、湿度９５％、５％ＣＯ２で培養した。細胞が６０〜７０％コンフルエントに達した時、細胞をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（２．５μｇ／ｍｌ）を用いて形質移入した。
【０１８５】
子宮頸癌細胞株ＨｅＬａは、１０％ウシ胎仔血清とゲンタマイシンを添加したＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ）で、３７℃、湿度９５％、５％ＣＯ２で培養した。細胞が６０〜７０％コンフルエントに達した時、細胞をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（５μｇ／ｍｌ）を用いて形質移入した。
【０１８６】
（活性型カスパーゼ３／７活性の測定）
形質移入の前日に、９６穴プレート（Ｎｕｎｃ １３６１０１）にウェルあたり７０００細胞の密度でＭＥＭ完全培地中にＵ３７３細胞を播種した。翌日、細胞を予め温めたＯｐｔｉＭＥＭで１回洗浄し、次にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２．５μｇ／ｍｌを含む７２μｌのＯｐｔｉＭＥＭを加えた。ＯｐｔｉＭＥＭで希釈した１８μｌのオリゴヌクレオチドの添加前に、細胞を７分間インキュベートした。オリゴヌクレオチドの最終濃度は、０．２ｎＭから１００ｎＭの範囲だった。処理６時間後、細胞をＯｐｔｉＭＥＭで洗浄し、血清を含む１００μｌのＤＭＥＭを加えた。処理済みのＵ３７３細胞の同様の９６穴プレートを、回収時間までＡｎａｅｒｏｃｕｌｔバッグ（Ｍｅｒｃｋ）中に９６穴プレートを置くことで、正常酸素圧または低酸素圧／酸素欠乏下で培養した。プレートを示した時間に１５分間室温に平衡化させた。１００μｌの高感度Ｃａｓｐａｓｅ ３／７−ＧｌｏＴＭ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を直接９６穴中の細胞に添加し、プレートを１時間インキュベートし、Ｔｈｅｒｍｏ ＬａｂｓｙｓｔｅｍｓのＬｕｍｉｎｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ機でさらに１分の誘導期間後にルミネセンス（ルシフェラーゼ活性）を記録した。ルシフェラーゼ活性は、秒あたりの相対光ユニット（ＲＬＵ／ｓ）として測定する。データをＡｓｃｅｎｔ ソフトウェア２．４．２．で処理し、誘導倍率のグラフをコントロールに対する相対値としてエクセルで描いた。
【０１８７】
形質移入した細胞を活性型カスパーゼ３／７の活性を阻害するカスパーゼ３／７阻害剤でインキュベートし、アポトーシス反応の特異性を実証するために用いた。さらに、スタウロスポリン、カンプトセシンまたはタキソールで誘導される細胞は、ポジティブコントロールとして役目を果たす。（図３Ａおよび図３Ｂを参照）
（アネキシンＶ−ＦＩＴＣフローサイトメトリー解析）
１×１０６のＨｅＬａ細胞を形質移入前日にＴ７５フラスコに播種した。形質移入当日、細胞を３７℃のＯｐｔｉＭＥＭで１回洗浄し、次に２．５μｇ／ｍｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＯｐｔｉＭＥＭ ７ｍｌを加えた。細胞を７分間インキュベートし、ＯｐｔｉＭＥＭで終濃度１〜２５ｎＭに希釈した１７００μｌのオリゴヌクレオチドを添加した。模擬形質移入細胞をコントロールとした。処理４時間後、細胞をＯｐｔｉＭＥＭで洗浄し、１０ｍＬの培地を加えた。オリゴヌクレオチド処理後、細胞を２４〜７２時間回復させ、次に細胞をかき取って回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。２×１０５細胞を５μｌのアネキシンＶ−ＦＩＴＣと１０μｌのヨウ化プロピジウム（ヨウ化プロピジウム−１０ｍｇ／ｍｌ）で１５分間室温の暗所でインキュベートした。染色の特異性と選択性を示すために、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ添加前の精製した組み換えアネキシンＶ−ＦＩＴＣ（１０μｇ）での形質移入細胞のインキュベーションを用いた。さらに、ＴＲＡＩＬ（Ａｐｏ２Ｌ）を誘導したＨｅＬａ細胞（０．５μｇ／ｍｌ）をポジティブコントロールとして用いた。
【０１８８】
０．６×１０６のＵ３７３細胞を形質移入前日にＴ７５フラスコに播種した。形質移入当日、細胞を３７℃のＯｐｔｉＭＥＭで１回洗浄し、次に２．５μｇ／ｍｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＯｐｔｉＭＥＭの７ｍｌを加えた。細胞を７分間インキュベートし、ＯｐｔｉＭＥＭで終濃度１〜２５ｎＭに希釈した１７００μｌのオリゴヌクレオチドを添加した。模擬形質移入細胞をコントロールとした。処理６時間後、細胞をＯｐｔｉＭＥＭで洗浄し、１０ｍＬの培地を加えた。オリゴヌクレオチド処理後、細胞を２４〜４８時間回復させ、次に細胞をかき取って回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。２×１０５細胞を５μｌのアネキシンＶ−ＦＩＴＣと１０μｌのヨウ化プロピジウム（ヨウ化プロピジウム−１０ｍｇ／ｍｌ）で１５分間室温の暗所でインキュベートした。染色の特異性と選択性を示すために、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ添加前の精製した組み換えアネキシンＶ−ＦＩＴＣ（１０μｇ）での形質移入細胞のインキュベーションを用いた。さらに、Ｕ３７３細胞を誘導したスタウロスポリン（０．２μｇ／ｍｌ）をポジティブコントロールとして用いた。（図４Ａと図４Ｂを参照）
（実施例１２：ＬＮＡオリゴヌクレオチドによる増殖阻害）
細胞を、実施例１１に従って処理した。
【０１８９】
（増殖中の生細胞の測定（ＭＴＳアッセイ））
形質移入の前日に、透明な９６穴プレート（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｒａｎｇｅ ｎｏ．１４７２０３０１００）にウェルあたり７０００細胞の密度でＤＭＥＭ培地中にＵ３７３細胞を播種した。翌日、細胞を予め温めたＯｐｔｉＭＥＭで１回洗浄し、次にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２．５μｇ／ｍｌを含む７２μｌのＯｐｔｉＭＥＭを加えた。ＯｐｔｉＭＥＭで希釈した１８μｌのオリゴヌクレオチドの添加前に、細胞を７分間インキュベートした。オリゴヌクレオチドの最終濃度は、５ｎＭから１００ｎＭの範囲だった。処理６時間後、細胞をＯｐｔｉＭＥＭで洗浄し、血清を含む１００μｌのＤＭＥＭを加えた。処理済みのＵ３７３細胞の同様の９６穴プレートを、回収時間までＡｎａｅｒｏｃｕｌｔバッグ（Ｍｅｒｃｋ）中に９６穴プレートを置くことで、正常酸素圧または低酸素圧／酸素欠乏下で培養した。生細胞は、示された時間に２０μｌのテトラゾリウム化合物［３−（４，５−ジメチル−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内塩、ＭＴＳ］と電子結合試薬（フェナジンエトサルフェート、ＰＥＳ）（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えることで測定した。生細胞は、Ｐｏｗｅｒｗａｖｅ（Ｂｉｏｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で４９０ｎｍと６５０ｎｍで測定した。
【０１９０】
増殖率の阻害ΔＯＤ（４９０〜６５０ｎｍ）／ｈを模擬物１００％として比較してＬＮＡオリゴヌクレオチド濃度に対してプロットした。（図５Ａと図５Ｂを参照）
（実施例１３：ＬＮＡオリゴヌクレオチドのインビボでの取り込みと標的の下方調節）
有毛マウスを１４日間の期間中、毎日または週２回（５回）のいずれかで、食塩水または配列番号１またはその様々なチオール化物を腹腔内注入した。配列番号５は部分的にチオール化されており（ギャップ内）、一方、配列番号６はホスホジエステル骨格がチオール化されている。マウスを所定の毎日または毎週２回、総用量１０ｍｇ／ｋｇ／１４日、５０ｍｇ／ｋｇ／１４日、または２５０ｍｇ／ｋｇ／１４日で処置した。
【０１９１】
（組織からのＲＮＡ精製とｃＤＮＡ合成）
約１０ｍｇの組織を１％のメルカプトエタノールを添加した４００μｌのＲＴＬ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）中でホモジナイズした。全ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造会社の取扱説明書に従って単離した。
【０１９２】
ランダムデカマーとＭ−ＭＬＶ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（基本的に、製造会社（Ａｍｂｉｏｎ）の記載どおり）を用いて一本鎖合成を行った。各試料の全ＲＮＡ ０．２５μｇを１０．８μｌに水で調節し、２μｌデカマーと２μｌのｄＮＴＰミックス（各２．５ｍＭ）を添加した。試料を７０℃で３分間加熱し、直ちに氷水で冷却し、２μｌの１０ｘＲＴ緩衝液、１μｌのＭ−ＭＬＶ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、０．２５μｌのＲＮａｓｅ阻害剤を含む３．２５μｌの混合物を添加した。ｃＤＮＡは、４２℃で６０分間合成し、次いで９５℃で１０分間の加熱不活性化を行い、最後に４℃に冷却した。
【０１９３】
（定量リアルタイムＰＣＲ解析）
処置済みおよび無処置のマウスのＨＩＦ１α ｍＲＮＡの相対濃度を決定するため、ｃＤＮＡをＢｉｏＲＡＤのｉＣｙｃｌｅｒを用いた定量ＰＣＲ解析に用いた。
【０１９４】
５倍希釈したｃＤＮＡ ８μｌに、２９．５μｌのＰｌａｔｉｎｕｍ ｑＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ−ＵＤＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、各１０３０ｎＭのプライマー、０．５７×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、および１１．４ｎＭのフルオロセイン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を含む５２μｌの混合液を添加した。
【０１９５】
２５μｌの二組をＱ−ＰＣＲに用いた。５０℃で１２０秒、９５℃で１２０秒、（９５℃で３０秒と６０℃で６０秒）を４０サイクル。
【０１９６】
ＨＩＦ１ａ ｍＲＮＡの発現は、同様にＱ−ＰＣＲで定量したマウスβ−アクチンｍＲＮＡで正規化した。
【０１９７】
ｍＨＩＦ１ａ：５’−ＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＴＴＴＴＡＣＣＡＴＧＣ−３’（配列番号３０）、および５’−ＧＧＡＧＴＧＴＴＴＡＣＧＴＴＴＴＣＣＴＧＡＡＧ−３’（配列番号３１）
ｍβ−アクチン：５’−ＣＣＴＴＣＣＴＴＣＴＴＧＧＧＴＡＴＧＧＡＡ−３’（配列番号３２）、および５’−ＧＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＧＣＡＡＴＧＡＴＣＴ−３’（配列番号３３）
ｍＶＥＧＦ：５’−ＣＡＣＧＡＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＴＣ−３’（配列番号３４）、および５’−ＧＴＣＧＧＧＧＴＡＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＴ−３’（配列番号３５）
ｍＧＡＰＤＨ：５’−ＡＧＣＣＴＣＧＴＣＣＣＧＴＡＧＣＡＡＡＡＴ−３’（配列番号３８）、および５’−ＧＴＴＧＡＴＧＧＣＡＡＣＡＡＴＣＴＣＣＡＣＴＴＴ−３’（配列番号３９）
ＢＣＬ−２：フォワード：５’−ｇｃｃｃｔｇｔｇｇａｔｇａｃｔｇａｇｔａ−３’（配列番号３６）、およびリバース：５’−ｃａｇｃｃａｇｇａｇａａａｔｃａａａｃａｇ−３’（配列番号３７）。
【０１９８】
無処置のマウス線維芽細胞（Ｌｔｋ細胞）（５倍に希釈され、ＨＩＦ１αとβ−アクチンの両方を発現している）から合成したｃＤＮＡの２倍希釈物を、アッセイのための標準曲線の作成に用いた。ＨＩＦ１α ｍＲＮＡの相対量は、ｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍソフトウェアを用いて算出された閾値サイクルから決定した。
【０１９９】
（組織からのＬＮＡオリゴヌクレオチド抽出）
約１００ｍｇの組織を５００μｌの抽出緩衝液（１ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａを含む、０．５％のＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０、２５ｍＭトリスｐＨ８．０、２５ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ）中で機械的にホモジナイズし、３７℃で一晩インキュベートした。５００μｌに基準オリゴヌクレオチドを加え、フェノール−イソアミル−クロロホルム（２５：１：２４（ｖ／ｖ／ｖ））１ｍｌを加えて抽出した。水層を新しいチューブに写し、再度抽出した。必要であれば、抽出物を凍結乾燥した。
【０２００】
（抽出したＬＮＡオリゴヌクレオチドのＩＥＸ ＨＰＬＣ解析）
試料５０μｌをｇｕａｒｄ ｃｏｌｕｍｎ ＤＮＡＰａｃ ＰＡ−１００（２×２５０ｍｍ、Ｄｉｏｎｅｘ）を備えたＤＮＡＰａｃ ＰＡ−１００（２×５０ｍｍ、Ｄｉｏｎｅｘ）カラムにかけて分離した。カラムを４０℃に加熱した。流速は０．２５ｍＬ／分で、検出波長は２６０ｎｍだった。移動相の勾配は、Ａ：トリス（２０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）および過塩素酸ナトリウム（１０ｍＭ）ｐＨ７．６。Ｂ：トリス（２０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（１ｍＭ）および過塩素酸ナトリウム（１Ｍ）ｐＨ７．６。（０−１３分、Ａ：２０％、Ｂ：２０％。１４−１８分、Ａ：４０％、Ｂ：６０％。２２−２８分、Ａ：０％、Ｂ：１００％。３３−３８分、Ａ：８０％、Ｂ：２０％）。
【０２０１】
図６Ａおよび図６Ｂは、インビボの取り込み（組織ｇあたりμｇ）と標的の下方調節（（上述どおり）配列番号１の毎日または週２回、１４日間の投与後の食塩水処置マウスに対するβ−アクチンの発現と関連づけたＨＩＦ−１ａ ｍＲＮＡ発現の阻害％）を示す。
【０２０２】
図６Ｃは、配列番号１を有毛マウス腹腔内への１４日間連日注入後のインビボでの内因性の腎臓標的の下方調節を示す。
【０２０３】
図７Ａは、配列番号１が連日の投与でＨＩＦ−１ａ発現をＱ−ＰＣＲで測定した場合の肝臓における有力な阻害剤であることを示す。
【０２０４】
図７Ｂは、配列番号１が週２回の投与でＨＩＦ−１ａ発現をＱ−ＰＣＲで測定した場合の肝臓における有力な阻害剤であることを示す。
【０２０５】
図７Ｃは、配列番号１が連日の投与でＨＩＦ−１ａ発現をＱ−ＰＣＲで測定した場合の腎臓における有力な阻害剤であることを示す。
【０２０６】
（実施例１４：Ｕ３７３異種移植腫瘍を有するマウスにおける配列番号１のインビボでの有効性）
ヌードマウスにおける腫瘍異種移植片の増殖に対するオリゴヌクレオチド治療の作用は、様々な腫瘍細胞株を用いて可能である。当該細胞株の例は、ヒト腫瘍細胞株Ｕ８７（膠芽細胞腫）、Ｕ３７３（膠芽細胞腫）、１５ＰＣ３（前立腺癌）、ＰＣ３（前立腺癌）、ＤＵ１４５（前立腺癌）、ＬＮＣａｐ（前立腺癌）およびマウス腫瘍細胞株Ｂ１６（黒色腫）である。
【０２０７】
ヌードマウスにおけるＬＮＡオリゴヌクレオチドを用いた皮下腫瘍異種移植片の処置。腫瘍細胞を皮下に移植し、その後、３回の連続移植により連続的に継代した。１ｍｍの腫瘍小部分をＮＭＲＩヌードマウスに外套針で皮下に移植した。あるいは、３００μｌのＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に一般的には１０６〜１０７で懸濁した癌細胞をＮＭＲ１ヌードマウスの脇腹に皮下注射した。マウスを５ｍｇ／ｋｇ／日で腹腔内注射した。個別のマウスの処置は、腫瘍体積が５０ｍｍ３に達した時に開始した。ＰＢＳでの処置は、コントロール群（食塩水処置）の平均腫瘍体積が５０ｍｍ３に達した時に開始した。実験は、任意の群の腫瘍が最大許容サイズに達した時に収量した。全マウスの腫瘍サイズをキャリパーで毎日測定した。処置の効果は、腫瘍サイズと腫瘍成長速度として測定した。
【０２０８】
配列番号１を使った別の検討では、Ｕ３７３ドナーマウス由来の致命的な腫瘍片を、ヌードマウスの卵巣の脂肪組織上に移植する（０日目）。移植後４日目と９日目に、マウスを５０ｍｇ／ｋｇ（腹腔内）でＬＮＡオリゴヌクレオチドで処置する。マウスを最後の投与（１１日目）の２日後に屠殺し、腫瘍の重量測定とＣＤ−３１抗体による腫瘍の染色を行う（図８Ａと図８Ｃを参照）。
【０２０９】
図８Ｂおよび８Ｃは、配列番号１で処理した異種移植片由来のＵ３７３における血管密度を示す。図１０Ｄは、ＱＰＣＲで測定したＵ３７３腫瘍におけるＨＩＦ−１αｍＲＮＡ発現を示す。
【０２１０】
配列番号１を、５０ｍｇ／ｋｇで週２回、１週間、卵巣に移植されたＵ３７３異種移植マウスに投与した。最後の投与２日後、動物を屠殺した。血管密度はＣＤ３１染色後に総面積と関連づけて計算した。食塩水群とスクランブルコントロール（配列番号１２）処置したマウスとの間に統計的有意差（Ｐ＝０．００５）があった。
【０２１１】
（実施例１５：肝臓と腎臓における配列番号１の組織半減期と標的ノックダウン）
メスのＮＭＲＩマウス６０匹（約２５ｇ）を５群に分け、３０ｍｇ／ｋｇの配列番号１（１０ｍｌ／ｋｇ、２．５ｇ／ｍｌ）を０、３、７、１０および１４日目に腹腔内投与した。１４日目に群を屠殺した。コントロール群には０．９％食塩水を投与した。組織試料を採取し、後日ＲＮＡを調製した。
【０２１２】
図１１は、３０ｍｇ／ｋｇの配列番号１の腹腔内投与５回後のマウスのインビボでの取り込み（組織ｇあたりμｇ）と標的の下方調節（β−アクチンの発現と関連づけたＨＩＦ−１ａおよびＶＥＧＦ ｍＲＮＡ発現の阻害％）を示す。
【０２１３】
（実施例１６：インビボにおける作用の持続時間とＬＮＡオリゴヌクレオチドの取り込み）
作用の持続時間：メスのＢａｌｂ／ｃＡ−ｎｕマウス２０匹（約２５ｇ）、前立腺癌細胞株ＰＣ３（ＥＣＡＣＣ＃９０１１２７１４）を５群に分け、２５ｍｇ／ｋｇの配列番号７（１０ｍｌ／ｋｇ、２．５ｇ／ｍｌ）を７から１３日目まで毎日、腹腔内投与した。投与１日後と５日目に群を屠殺した。コントロール群には０．９％食塩水を投与した。組織試料を採取し、後日ＲＮＡを調製した。図１０Ａは、処置後１日目と５日目のｍＲＮＡ発現の作用持続時間を示す。
【０２１４】
ＬＮＡオリゴヌクレオチドの取り込み：ホルマリン固定後、組織をパラフィン包埋した。組織をホルト（Ｈｏｌｔ）溶液（スクロース３０ｇ、アカシアゴム１ｇ、チモール１５ｍｇ、蒸留水１００ｍｌ）中に一晩置き凍結した。４ｍｙ’ｓの凍結切片を被覆したガラス上にマウントし、ＤＡＰＩ溶液中に置いた。蛍光色素を蛍光顕微鏡で可視化した。図１０Ｂは、Ｆａｍ標識した配列番号１で２５ｍｇ／ｋｇ／日、７日間処置して最後の処置後５日目に屠殺したマウスの肝臓、腎臓および腫瘍の組織の組織学的結果を示す。皮膚の写真は同じ方法で処置したマウスのものであるが、最後の処置後、その日に屠殺し、皮膚の基底細胞の弱い染色を見るために（下の青線）露出オーバーにした。これらの結果は以下を示唆する：
肝臓：肝細胞の染色は主に細胞質に局在した。
腎臓：近位細管の非常に強い染色と遠位尿細管のより弱い染色。
腫瘍：内皮細胞、マクロファージが染色された（マウス細胞）。
皮膚：真皮（内皮細胞およびマクロファージ）、ならびに表皮の基底層の細胞質に強い染色。
【０２１５】
（実施例１７：インビボにおけるＬＮＡオリゴヌクレオチドの取り込みと有効性）
当日、０．３×１０−６細胞（ＰＣ３とＨＴ２９）を３００μｌのＭａｔｒｉｇｅｌと混合し、メスのＢａｌｂ／ｃＡ−ｎｕマウス（約２５ｇ）に移植した。７、１０、１３、１７日目、食塩水、ｆａｍ標識した配列番号１（配列番号７）、またはｆａｍ標識した配列番号８（配列番号２０）を５ｍｇ／ｋｇ／日でマウスに腹膜注射した。最後の投与の３日後（２０日目）または１０日後（２７日目）、動物を屠殺した。食塩水コントロール群には０．９％食塩水を投与した。組織試料を採取し、後日ＲＮＡを調製し、ＨＰＬＣ解析によるＬＮＡオリゴヌクレオチド含量の測定またはＨＩＦ−１ａ ｍＲＮＡの下方調節を解析した（図１０Ｃ−Ｅを参照）。
【０２１６】
ＬＮＡオリゴヌクレオチドの可視化：ホルマリン固定後、組織をパラフィン包埋した。
組織をホルト（Ｈｏｌｔ）溶液（スクロース３０ｇ、アカシアゴム１ｇ、チモール１５ｍｇ、蒸留水１００ｍｌ）中に一晩置き凍結した。４ｍｙ’ｓの凍結切片を被覆したガラス上にマウントし、ＤＡＰＩ溶液中に置いた。蛍光色素を蛍光顕微鏡で可視化した（データは図１０Ｂと同じ生体内分布を示している。データは示さず。）。
【０２１７】
（実施例１８：ＨＩＦ−１αとＶＥＧＦのインビボでのＬＮＡオリゴヌクレオチドの特異性の検討）
ミスマッチの検討：メスのＮＭＲＩマウス１５匹（約２５ｇ）を５群に分け、３０ｍｇ／ｋｇの配列番号１または配列番号９（１０ｍｌ／ｋｇ、３．０ｇ／ｍｌ）を０、３、７、１０および１４日目に３０秒にわたって腹腔内投与した。コントロール群には０．９％食塩水を投与した。最後の注入の３〜４時間後、群を屠殺した。組織試料を採取し、後日ＲＮＡを調製した。
【０２１８】
図１１は、３日毎の３０ｍｇ／ｋｇでの配列番号１の５回投与後のＨＩＦ−１ａとＶＥＧＦのインビボでの肝臓の内因性の標的下方調節を、１ミスマッチコントロールの配列番号９と比較して示す。
【０２１９】
（実施例１９：配列番号１の１４量体版のインビボでの有効性）
メスのＮＭＲＩマウス（０．０２５ｋｇ）を５ｍｇ／ｋｇ／日の配列番号１で腹腔内注射により処置した。５群に分け、食塩水動物はコントロール動物の役目を果たし、０．９％食塩水を投与した。投与１日後と１０日目に５匹を屠殺した。方法と材料の記載どおりに、組織試料を採取し、後日ＲＮＡを調製し、ＱＰＣＲによりＨＩＦ−１ａ ｍＲＮＡ発現を測定してβ−アクチンで正規化した。
【０２２０】
（実施例２０：大動脈輪の３次元培養の調製）
新脈管形成は、当初ラットの大動脈で報告された方法（Ｍａｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｂｉｏｌ Ｐｒｅｏｃｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ ４（１）ｐ．２４−３１）を改変して、マウスの大動脈の輪を３次元コラーゲンゲル中で培養することで検討した。有毛マウスを１０ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量のＬＮＡオリゴヌクレオチドで１回静脈投与した。投与後３日目に、マウスから胸大動脈を除去し、頸椎脱臼により屠殺し、直ちに、１０％ウシ胎仔血清を含む氷冷したＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を入れた培養皿に移した。精密な顕微解剖用鉗子と虹彩切除用の剪刀を用いて、大動脈壁を損傷しないよう特別の注意を払って大動脈周辺の線維脂肪組織を注意深く除去した。１ｍｍ長の大動脈の輪（大動脈あたり約１５、最大大動脈の１．５ｃｍ）を薄切し、ＦＢＳを含むＲＰＭＩの３回の連続洗浄で広範囲に洗浄した。次に、マウス大動脈のリング形の移植片を９６穴プレートのウェル内の６０μｌのｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｔｒｉｇｅｌ：３５６２３４）に埋め込んだ。大動脈を挿入後、さらに４０μｌのｍａｔｒｉｇｅｌを加え、３７℃で１０分間おいて凝固させた。成長因子を含む、また含まない１００μｌのＥＧＭ２（Ｃａｍｂｒｉｘ）をウェルに加える。コントロールとして、大動脈の輪を１０μＭのシスプラチンを含むさらにＥＧＭ２培地で覆った。培地は、２日ごとに交換した。
【０２２１】
（実施例２１：３Ｈ標識した配列番号１の単回静脈内投与後のマウスにおける定量的全身オートラジオグラフィー研究）
メスのＣ５７Ｂ１／６Ｊマウス９匹（８週、Ｔａｃｏｎｉｃ，ＤＫ）に１．５ｍＣｉ／ｋｇの３Ｈ−配列番号１を５０ｍｇ／ｋｇで各試験品目を尾静脈に静脈内投与した。
【０２２２】
３Ｈ−配列番号１は１５５μＣｉ／ｍＬの比活性を有した。
【０２２３】
各動物に投与した容量は、試験製剤１０ｍＬ／ｋｇだった。個別のマウスを、各試験品目の投与後５分、１５分、１時間、４時間、２４時間、２日、４日、７日および１８日目に屠殺した。
【０２２４】
全身オートラジオグラフィーのために、マウスをイソフルランで麻酔し、次にドライアイスで−８０℃に冷却したヘキサンに直ちに浸した（ＡＢＲ−ＳＯＰ−０１３０／０４）。凍結した死体を含水カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）ゲルに包埋し、ドライアイス（−８０℃）で冷却したエタノールで凍結し、標準的な方法に従って全身オートラジオグラフィー用に矢状に切断した（ＡＢＲ−ＳＯＰ−０１３１／０４）。約−２０℃の温度で凍結ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ ＣＭ ３６００）で、異なる水平面の２０μｍの切片を各動物から切り出した。得られた切片をテープ（Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ Ｍｉｎｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｃｏ．，Ｎｏ．８１０）で固定し、放射性のインクで連続的に番号を付けた。−２０℃で約２４時間凍結乾燥した後、選択した切片をタルク粉末の薄層で覆い、イメージングプレート（Ｆｕｊｉ，Ｊａｐａｎ）上に置いた。
【０２２５】
対象の組織と器官を最も良く示す切片をホスホイメージャー用に選択した。３Ｈの較正基準のセットと共に、切片をタルク粉末の薄層で覆い、イメージングプレート上に置いた。３Ｈが低エネルギーであるため、タルク粉末をイメージングプレートを保護するプラスチックフォイルの代わりに用いた。イメージングプレートを遮光カセットに入れ、環境放射から保護するために鉛の遮蔽箱中で３〜７日間、室温で露出した。
【０２２６】
露出後、イメージングプレートをＢＡＳ２５００（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ Ｓｖｅｒｉｇｅ ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いてピクセルサイズ５０μｍでスキャンした。対象の組織と器官をＡＩＤＡ、バージョン２．４３（Ｒａｙｔｅｓｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて定量した。
【０２２７】
３Ｈの放射活性の水溶性標準試験液を全血と混合し、較正尺度の作成に用いた。標準系列は、６５．４４から０．３０ｎＣｉ／ｍｇまでの１０希釈段階で構成される。定量の目的のため、全ての組織は全血と同様の密度とクエンチング特性を有すると見なした。組織密度は、１ｇ／ｍｌと決めた。定量限界は、バックグラウンドの８回の測定の平均濃度値とこれらの測定の標準偏差値の３倍の和と定義した。
【０２２８】
様々な組織および器官が、オートラジオグラフィー上または相当する組織切片上のいずれかで特定された。本研究で使用されるブドウ膜という用語は、構造、脈絡膜、眼の強膜を含むメラニンを示す網膜色素上皮を含む。（図１４Ａおよび１４Ｂを参照）
（実施例２２：配列番号１を形質移入したＨＵＶＥＣ細胞のウェスタンブロット）
正常なヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、Ｃａｍｂｒｉｘ−ＥＧＭ２培地中で培養し、実施例の記載どおりに２ｎＭまたは５ｎＭの配列番号１あるいは５ｎＭの配列番号８を形質移入した。形質移入後、細胞を低酸素（１％酸素）に１６時間曝した。（実施例の記載どおり）回収時に細胞をＰＢＳで洗浄し、ＳＤＳを含む溶解緩衝液中で溶解した。５０μｇをトリス−酢酸ゲルにローディングし、１５０Ｖで１時間泳動した。ウェスタンブロットを実施例の記載どおりに行い、ブロットを抗ヒトＨＩＦ−１ａ（１：５００）中でインキュベートし、高感度化学発光で可視化した。配列番号１による強力な下方調節が見られたが、一方スクランブルコントロールの配列番号８は、ＨＵＶＥＣ細胞においてＨＩＦ−１ａ発現を下方調節しなかった。
【０２２９】
（実施例２３：インビトロでの管形成／毛細管様構造形成アッセイ）
Ｍａｔｒｉｇｅｌを用いて、管形成の誘導を行った（Ｖｅｎｅｔｓａｎａｋｏｓ Ｅ，Ｍｉｒｚａ Ａ，Ｆａｎｔｏｎ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｂｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ−ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｅｄ ｈｕｍａｎ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ．Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２００２；２７３：２１−３３）。早過ぎる重合を防ぐためにＭａｔｒｉｇｅｌを氷上で解凍し、５０μｌの小分注を９６穴の組織培養プレート（Ｎｕｎｃ）の個別のウェルに入れ、３７℃で少なくとも３０分間重合させた。形質移入したＨＵＶＥＣ細胞をトリプシン０．０５％−ＥＤＴＡ処理で剥離した。細胞を血清を含む培地で洗浄し、次いで２−×１０５細胞／ｍｌに再懸濁した。各培養ウェルに形質移入した、または形質移入されていない１００μｌのＨＵＶＥＣ細胞懸濁液を増殖因子（ＦＢＳ（２％）と共にＶＥＧＦ、ｈＦＧＦ−Ｂ、Ｒ３−ＩＧＦ−１、ｈＥＧＦ）およびヘパリンを含む培養液に加えた（ｎ＝１０）。スクランブルコントロールオリゴ（配列番号８）で形質移入したＨＵＶＥＣ細胞だけでなく、無処理の偽形質移入細胞をコントロールとして用いた。コントロールまたは試験化合物の用量は、６〜１０の個別のウェルでアッセイし、実験は少なくとも３回行った。管形成の定量のため、ウェルの写真を撮影した。（図１３参照）
（実施例２４：脾臓、骨髄および末梢血の細胞への取り込みのＦＡＣＳ解析）
メスのＮＭＲＩマウス（０．０２５ｋｇ）をＦａｍ標識した配列番号１、配列番号７（５０ｍｇ／ｋｇ）または同等の分子数のＦａｍアミダイト（３ｍｇ／ｋｇ）で、または０．９％食塩水で処置した。細胞を注射１時間後に殺し、脾臓、末梢血（０．１％アザイドナトリウムと５０ｍｌヘパリン硫酸を含む１ｍｌのＰＢＳに１ｍｌを添加し、氷上に置く）、または骨髄由来の細胞を回収した。
【０２３０】
（脾臓）
脾臓を金属メッシュ上に置き、アザイドを含む１ｍｌのＲ１０（１０％ＦＣＳを含むＲ１０組織培養培地）で湿らせる。組織をメッシュに押しつけ、合計４ｍｌのＲ１０＋アザイドで洗い流す。０．５ｍｌの組織懸濁液を取り、残りを廃棄する。５０ｍｌの赤血球溶解緩衝液ミックスを加えて室温で１０分間放置して赤血球を溶解させる。２０００ｒｐｍで１０分遠心。必要であれば、残りの赤血球を除去するために、この工程を反復する。細胞を数え、ブロッキングする。
【０２３１】
細胞を遠心して沈殿させ、アザイドを含む１．０ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁する。ブロッキングのために脾臓当たりの細胞数を５×１０６と見なし、細胞１００万個あたり５μｌのマウスＣＤ１６／Ｄ３２を加える（２５μｌのブロッキングを添加する）。
【０２３２】
（末梢血）
５０ｍｌの赤血球溶解緩衝液ミックスを加えて赤血球を溶解させる。細胞を遠心沈殿させ、必要であれば工程を反復する。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、再懸濁して細胞数を数える。非特異的な抗体の結合は、細胞１００万個あたり５μｌの割合でマウスＣＤ１６／Ｄ３２を加えることによりブロックする。室温に１０分間放置し、次に染色を続けて行った。
【０２３３】
（骨髄）
滅菌した剪刀を用いて、できるだけ各端に近いところで骨を切断する。１ｍｌの滅菌ＰＢＳを２５ゲージの針を付けた１ｍｌシリンジに吸い上げる。針を骨の一端に挿入する。通常、膝で最も容易である。ＰＢＳを骨の中に勢いよく流し入れる。骨がきれいになるまで繰り返す。髄を粉砕するために、骨髄を針で数回吸い上げる。赤血球の数が気になる場合は、上述の様に溶解の工程を用いることが出来る。
【０２３４】
細胞を数え、上述どおりにブロッキングする。骨髄培養のために、１５０，０００細胞を氷上の滅菌したエッペンドルフチューブに入れる。
【０２３５】
（ＦＡＣＳ染色）
特異的マーカーを用いて系統染色を行う。以下に記載の通り：染色
１．ＣＤ４ＡＰＣ、ＣＤ８ ＰＥ ＦＩＴＣ、７ＡＡＤ Ｔ細胞
２．Ｇｒ−１ ＰＥ、ｆ４／８０ ＡＰＣ 好中球、マクロファージ
３．Ｇｒ−１ ＰＥ、Ｍａｃ−１ ＡＰＣ 脊髄単球
４．ＣＤ３４ ＰＥ 系統ＡＰＣ 幹細胞
５．Ｂ２２０ ＡＰＣ、ＣＤ１９ ＰＥ Ｂ細胞
６．ＣＤ１１ｂ ＰＥ、ＣＤ１１ｃ ＡＰＣ 樹状細胞
アイソタイプ
７．アメリカンハムスター ＩｇＧ１ ＡＰＣ ＣＤ１１ｃ
８．ラット ＩｇＧ２ａ ＡＰＣ ＣＤ４、Ｂ２２０
９．ラット ＩｇＧ２ａ ＰＥ ｃｄ８ａ、ＣＤ１９、ＣＤ３４
１０．ラットＩｇＧ２ｇ ＰＥ Ｇｒ−１ ＣＤ１１ｂ。
【０２３６】
染色を９６穴ウェル内で行い、１００μｌのブロッキングした細胞の総数を１００μｌ染色ミックス（アイソタイプコントロールまたは特異的系統マーカーのいずれか）で染色する。染色は氷上で行い、３０分間放置した。細胞を２０００ｒｐｍで２分間遠心する。上清を吸い取り、細胞を２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、遠心のステップを反復する。合計３回洗浄する。最後に、細胞を２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、既に２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液と５μｌの７ＡＡＤが入っているＦＡＣＳチューブに加える。
【０２３７】
Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒを用いてＦＡＣＳ解析を行った（図１５を参照）。
【０２３８】
配列番号７の投与後５日目に、内皮細胞、顆粒球、およびＣＤ４＋リンパ球および末梢血のマクロファージ、骨髄の樹状細胞と顆粒球、脾臓の顆粒球はｆａｍ標識に染色陽性であることが示された。
【０２３９】
（実施例２５：カニクイザル組織におけるＨＩＦ−１αと配列番号１の内容のオリゴヌクレオチド）
肝臓、腎臓を含むカニクイザル組織における主要な毒性研究では、試料を急速凍結し−７０℃でその後の解析のために保存した。（図１６Ａと１６Ｂを参照）サルは、０、６、１０、４０ｍｇ／ｋｇ／回で週２回４週間、静脈注射で処置された。０、１０、４０ｍｇ／ｋｇ／回の投与を受ける動物の群では、一部の動物はその後に４週間の処置なしの回復期間を設けた。
【０２４０】
実施例１３の記載の試料からＲＮＡを抽出してＨＩＦ−１ａ ｍＲＮＡ含量を実施例８の記載どおりに測定した（図１６Ａ参照）。オリゴヌクレオチド含量は、以下の記載どおりに測定した（図１６Ｂ参照）。
【０２４１】
（試料調製：肝臓と腎臓組織からの抽出）
化学薬品と試薬：
プロテイナーゼＫ（２５．１ｍｇ／ｍｌ）：Ｓｉｇｍａ Ｐ４８５０。
【０２４２】
フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（２５：２４：１（ｖ／ｖ／ｖ）、１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）：Ｓｉｇｍａ Ｐ２０６９。
【０２４３】
Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０：Ｓｉｇｍａ，Ｉ８８９６。
【０２４４】
抽出緩衝液：０．５％のＩｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０、２５ｍＭトリスｐＨ８．０、２５ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０（１ＮのＮａＯＨで調整）。
【０２４５】
１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む抽出緩衝液：毎回の抽出前に調製。
【０２４６】
組織（約１００ｍｇ）を測り取る（組織は秤量前後はドライアイス上に置く）。５００μｌのプロテイナーゼＫ含有（１ｍｇ／ｍｌ）抽出緩衝液を加える。組織を機械的にホモジナイズし、ホモジネートを３７℃で一晩インキュベートする。
【０２４７】
基準試料は、配列番号２を抽出緩衝液に溶解して調製する。無処置の動物からちょうど１００ｍｇの肝臓組織を測り取る（組織は秤量前後はドライアイス上に置く）。基準材料を含む抽出緩衝液（プロテイナーゼＫ含有、１ｍｇ／ｍｌ）を総量０．５ｍｌの組織試料に加える。組織を機械的にホモジナイズし、ホモジネートを３７℃で一晩インキュベートする。これらの試料からの配列番号２のシグナル検出は、処置した動物で認められる最低と最高の濃度に及ぶ標準曲線を作成するのに用いる。
【０２４８】
組織試料をスクリューキャップ付きの２ｍｌのマイクロチューブに移す。１ｍｌのフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（２５：２４：１（ｖ／ｖ／ｖ））を加え、５分間激しく振る。４０００ｒｐｍで１５分間の遠心で、相の分離を行う。水相（上相）を新しいチューブ（エバポレーター適合）に移し、５００μｌのミリＱ水を有機層に加える（最初の抽出の残り）。チューブを再び５分間激しく撹拌し、次に４０００ｒｐｍで１５分間遠心（１１５号室のＳＡＮ０３９）する。水相（１．抽出と洗浄からの水相）をプールし、乾燥するまで蒸発させる（８０℃、窒素下）。残留物を２００μｌのミリＱ水でもどし、次に４０００ｒｐｍで１５分間の遠心を行う。解析のために、試料をＨＰＬＣバイアルに移す。
【０２４９】
肝臓および腎臓組織中のオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ解析：抽出後、イオン交換ＨＰＬＣで配列番号２を解析した。
【０２５０】
カラム：Ｄｉｎｅｘ，ＤＮＡ ｐａｃ ＰＡ １００：２×５０ｍｍ（保護カラム），
２×２５０ｍｍ（分析カラム）
カラム温度：４２℃
注入量：５０μｌ
洗浄用溶媒：ミリＱ水
パージ用溶媒：ミリＱ水
検出ＵＶ：２６０ｎｍ。
【０２５１】
溶媒：
緩衝液Ａ：１ｍＭのＥＤＴＡ，２０ｍＭのトリス塩酸、１０ｍＭのＮａＣｌＯ４，ｐＨ７．６（１Ｎ ＮａＯＨ）
緩衝液Ｂ：１ｍＭのＥＤＴＡ，２０ｍＭのトリス塩酸、１ＭのＮａＣｌＯ４，ｐＨ７．６（１ＮのＮａＯＨ）
（実施例２６：配列番号１を用いたインビボでの処置の作用持続時間）
有毛マウスを５０ｍｇ／ｋｇの配列番号１で単回腹腔内注射で処置した。各群５匹の動物を投与後１日目と１０日目（図９Ｃ参照）、または投与後１、２、３、４、５、１０日目（図９Ｂを参照）に屠殺した。ＨＩＦ−１ａ ｍＲＮＡ発現をリアルタイムＱＰＣＲで解析し、ＧＡＰＤＨＡで正規化した。
【０２５２】
（実施例２７：目の疾患のインビボ角膜モデル）
マウスおよび麻酔：ＢＡＬＢ／ｃマウス、６〜８週齢。ケタミンとキシラジンの混合物（それぞれ、１２０ｍｇ／体重ｋｇと２０ｍｇ／体重ｋｇ）を用いてマウスを麻酔した。
【０２５３】
縫合で誘導した炎症性角膜新脈管形成のマウスモデル：過去に、Ｓｔｒｅｉｌｅｉｎ ＪＷ，Ｂｒａｄｌｅｙ Ｄ，Ｓａｎｏ Ｙ，Ｓｏｎｏｄａ Ｙ．Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｅｙｅｓ ｗｉｔｈ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ ｍａｎｉｐｕｌａｔｅｄ ｃｏｒｎｅａｓ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．１９９６；３７：４１３−４２４に記載の炎症性角膜新脈管形成（ＣＮＶ）のマウスモデルを用いた。簡単に、直径２ｍｍの角膜トレフィンを麻酔したマウスの角膜の中央に優しく置き、単に角膜中央領域に印を付ける。次に、３本の１１−０縫合糸二本を基質に侵入させ、角膜外周の１２０°に渡って基質内に置いた。縫合糸を配置する外側の点は、正規化された新脈管形成反応を得るために、縁と２ｍｍの角膜トレフィンで輪郭を描いた線の間の中間を選び、内側の点は２ｍｍの角膜トレフィンの線から同じ距離だった。７日間同じ場所に残した。マウスを安楽死させ、角膜縁を摘出し、平面マウント二重免疫組織化学分析を行った。正常な角膜中の炎症性細胞の存在と角膜への動員を縫合１週間後に、摘出後１０％パラフォルムアルデヒド中で固定し、プラスチック包埋した角膜の連続切片をヘマトキシリンとエオジン染色して定量した。また、角膜に動員された炎症性細胞の特徴をさらに解析するため、角膜ホールマウントし、マクロファージマーカーＣＤ１１ｂで凍結切片の二重免疫組織化学分析を行った。切片はさらに内皮細胞（ＣＤ３１による血管）、ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲのマーカーで染色した。
【０２５４】
（実施例２８：角膜マイクロポケットアッセイ）
過去に記載の（Ｃａｏ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ｃ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９８；９５：１４３８９−１４３９４）で、角膜マイクロポケットアッセイを行った。簡潔に、角膜マイクロポケットは、改良型ｖｏｎ Ｇｒａｅｆｅナイフを用いて作成し、２００ｎｇのＶＥＧＦ−Ａ１６４（Ｒ＆Ｄ）または２００ｎｇの組み換えｂｆｇｆ（ＲＤＩ，Ｆｌａｎｄｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）を含むヒドロンポリマーで被覆したスクロースアルミニウム硫酸のマイクロペレット（０．４×０．４ｍｍ）を各ポケットに埋め込んだ。ペレットは、縁から０．６〜０．８ｍｍの場所に置き、抗生剤軟膏（エリスロマイシン）でその部位を覆い、そのままの場所で１０日間放置した（それぞれ、ｎ＞５〜１０マウス）。新脈管形成反応とリンパ管形成反応は、上述のＣＤ３１／ＬＹＶＥ−１の二重免疫染色を用いて定量した。下部の縁とペレットの間の血管対リンパ管の伸長は、両方の管のタイプに対して半定量的に４つのカテゴリーに等級付けした。０：管の伸長なし、１：下部の縁とペレットの間の距離の１／３未満の伸長、２：下部の縁とペレットの間の距離の１／３と２／３の間の伸長、３：管がペレットに達している。
【０２５５】
（実施例２９：乾癬のインビボモデル）
（インビボでのヒト皮膚／ＳＣＩＤマウスキメラ）
ヒトの皮膚の異種移植片は、以前Ｗｒｏｎｅ−Ｓｍｉｔｈ Ｔ，Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ ＢＪ：Ｄｅｒｍａｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｅｓ ｉｎｄｕｃｅｓ ｐｓｏｒｉａｓｉｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９６，９８：１８７８−１８８７で記載の方法に従って、７〜８週齢のＳＣＩＤマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ，ＤＫ）に同所的に移植した。簡潔に、１．５×１．５×０．５ｃｍサイズのヒトの皮膚異種移植片をＳＣＩＤマウスの脇腹に吸収性５−０ Ｖｉｃｒｙｌ Ｒａｐｉｄｅ縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＮＪ）で縫合し、Ｘｅｒｏｆｏｒｍ包帯剤（Ｋｅｎｄａｌｌ Ｃｏ．，Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，ＭＡ）で覆った。付帯剤は１週間後にとりのぞき、動物は研究を通じて病原体なしで維持した。マウスは移植１〜３週間後に配列番号１と配列番号７で５０ｍｇ／ｋｇで週２回、処置を行った。ヒト皮膚／ＳＣＩＤマウスキメラは、２〜３週間の処置後屠殺し、４ｍｍのパンチ生検（Ｂａｋｅｒのパンチ生検、Ｃｏｍｍｉｎｓ Ｄｅｒｍ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）を各異種移植片から得た。生検は中性に緩衝されたホルマリンで固定し、パラフィン包埋および／またはトラガカントゴム（Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）上にマウントし、液体窒素で冷却したイソペンタンで急速凍結し、−８０℃で保存した。
【０２５６】
（免疫染色）
皮膚のクリオスタット切片を、内皮細胞（ＣＤ３１／ＣＤ３４）、マクロファージ（ｃｄ１１ｂ）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲまたはＨＩＦ−１ａなどの適切なマーカーで染色した。（前述の）切片をヘマトキシリン−エオジンで逆染色した。全てのスライドを検鏡し、写真撮影を行った。
【数１】
【数２】
【数３】
【数４】
【数５】
【数６】
【数７】
【数８】
【数９】
【数１０】
【数１１】
【数１２】
【数１３】
【数１４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ−１】
【図１０Ｃ−２】
【図１０Ｄ−１】
【図１０Ｄ−２】
【図１０Ｅ】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図１２Ｅ】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ−１】
【図１０Ｃ−２】
【図１０Ｄ−１】
【図１０Ｄ−２】
【図１０Ｅ】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図１２Ｅ】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【公開番号】特開２０１１−２２９５４０（Ｐ２０１１−２２９５４０Ａ）
【公開日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−１７７７３１（Ｐ２０１１−１７７７３１）
【出願日】平成２３年８月１５日（２０１１．８．１５）
【分割の表示】特願２００７−５３９４６３（Ｐ２００７−５３９４６３）の分割
【原出願日】平成１７年１１月９日（２００５．１１．９）
【出願人】（５０４０１３２６９）サンタリス ファーマ アー／エス (29)
【氏名又は名称原語表記】ＳＡＮＴＡＲＩＳ ＰＨＡＲＭＡ Ａ／Ｓ
【出願人】（５０８０１８１４１）エンゾン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (7)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１７７７３１（Ｐ２０１１−１７７７３１）
【出願日】平成２３年８月１５日（２０１１．８．１５）
【分割の表示】特願２００７−５３９４６３（Ｐ２００７−５３９４６３）の分割
【原出願日】平成１７年１１月９日（２００５．１１．９）
【出願人】（５０４０１３２６９）サンタリス ファーマ アー／エス (29)
【氏名又は名称原語表記】ＳＡＮＴＡＲＩＳ ＰＨＡＲＭＡ Ａ／Ｓ
【出願人】（５０８０１８１４１）エンゾン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (7)
【Ｆターム（参考）】
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