ＨＩＶ−１感染を阻害する変異体Ｖｐｒタンパク質及びＨＩＶ−１感染阻害剤のスクリーニング方法
【課題】 ＣＤ４陽性Ｔ細胞におけるＨＩＶ−１の増殖（複製）とＶｐｒタンパク質の多様な細胞増殖抑制機能の解明を通じて、ＡＩＤＳ発症予防、治療方法を提供する。さらに、ＰＩＣの核移行におけるＶｐｒタンパク質の働きを解明し、ＰＩＣの核移行の鍵となる段階を抑止することによってＨＩＶ−１による免疫細胞の感染阻害剤を提供する。
【解決手段】 ヒト免疫不全症ウイルス１型（ＨＩＶ−１）Ｖｐｒタンパク質のα−ヘリックス領域内に少なくとも１つの突然変異を有し、前記突然変異によって少なくとも１つのα-ヘリックス構造が不安定化された変異体Ｖｐｒタンパク質を含むＨＩＶ−１増殖阻害剤。また、前記Ｖｐｒタンパク質とインポーチンαとの結合を阻害するか、及び／又は前記Ｖｐｒタンパク質の核膜への局在を阻害する化合物をスクリーニングする。
なし
【解決手段】 ヒト免疫不全症ウイルス１型（ＨＩＶ−１）Ｖｐｒタンパク質のα−ヘリックス領域内に少なくとも１つの突然変異を有し、前記突然変異によって少なくとも１つのα-ヘリックス構造が不安定化された変異体Ｖｐｒタンパク質を含むＨＩＶ−１増殖阻害剤。また、前記Ｖｐｒタンパク質とインポーチンαとの結合を阻害するか、及び／又は前記Ｖｐｒタンパク質の核膜への局在を阻害する化合物をスクリーニングする。
なし
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒト免疫不全症ウイルス１型（ＨＩＶ−１）感染を阻害するタンパク質及び該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、これらを含む医薬組成物、並びにＨＩＶ−１感染阻害剤のスクリーニング方法及び該方法により得られるＨＩＶ−１感染阻害剤等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ４陽性Ｔ細胞が破壊されることにより生ずる後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因ウイルスであるＨＩＶ−１は、構造遺伝子及び調節遺伝子に加え、アクセサリー遺伝子を有するという特徴がある。アクセサリー遺伝子の一つであるｖｐｒは、９６個のアミノ酸残基からなる１５キロダルトン（ｋＤａ）の核タンパク質をコードする。ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、及びＳＩＶ等の霊長類のレンチウイルスは、何れも非常によく保存されたＶｐｒ様タンパク質を含んでいる。従って、Ｖｐｒタンパク質はこれらのウイルスの生活環において重要な役割を果たすと考えられる。Ｖｐｒタンパク質の多くの生物学的機能が報告されており、例えば、ウイルス粒子への取り込み（例えば、非特許文献１参照）、核への局在（例えば、非特許文献２参照）、細胞周期のＧ２／Ｍ期又はＧ１期での停止（例えば、非特許文献３及び４参照）、いくつかのウイルスプロモータの弱い活性化（例えば、非特許文献５参照）、ある種の細胞の最終分化の誘導（例えば、非特許文献６参照）、及び多様な細胞質因子との相互作用（例えば、非特許文献７参照）等である。
【０００３】
このような多様な生物学的機能は、Ｖｐｒタンパク質の特異的な構造と関連することが示唆されている。ＮＭＲによるＶｐｒタンパク質の立体構造解析の結果、フレキシブルなアミノ末端及びカルボキシ末端領域に囲まれて、Ｎ末端から１７〜３３番目、３８〜５０番目、及び５６〜７７番目のアミノ酸残基が３つのα−ヘリックスを形成することが報告されている（例えば、非特許文献８参照）。最もＮ末端に近いα−ヘリックスドメインはＶｐｒタンパク質の核への移行、タンパク質の発現及び安定性、並びにウイルス粒子への取り込みに重要である（例えば、非特許文献９参照）。第二のα−ヘリックスドメインもまた、Ｖｐｒのウイルス粒子への取り込みやオリゴマーを形成する性質にとって重要な意味を持つらしい（例えば、非特許文献１０参照）。第三のα−ヘリックスドメインは、核局在、特に、非分裂細胞において組込み前複合体（ＰＩＣ）の核への移行に関与する決定因子を含んでいる（例えば、非特許文献１１参照）。Ｃ末端の２０個のアミノ酸からなるアルギニンに富む領域は、潜在的な核移行シグナル（ＮＬＳ）を含み、Ｖｐｒタンパク質の核移行への主要な役割を果たしている。また、Ｖｐｒタンパク質の５２〜７８番目のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドは、培養細胞の培養液に添加するだけで細胞分裂非依存的に細胞の核内に取り込まれることも報告されている（非特許文献１２参照）。
【０００４】
一方、Ｖｐｒタンパク質を欠損したウイルスはin vitroで複製可能なことから、Ｖｐｒタンパク質はＨＩＶ−１の増殖（複製）に必須な因子ではないことが示唆されている。しかしながら、Ｖｐｒタンパク質はウイルス感染効率の上昇及びＨＩＶ潜伏感染細胞からのウイルス産生を惹起するなど、ＡＩＤＳ発症の主要因子であり、感染初期において重要な役割を果たす（例えば、非特許文献１参照）。マクロファージのような非分裂細胞では、細胞分裂時に特徴的な核膜の崩壊（消失）が起こらないことから、ＨＩＶ−１の感染が成立するためにはウイルスゲノムが細胞内の核膜を通過しなければならない。このＨＩＶ−１ゲノムの核膜通過には、組込み前複合体（ＰＩＣ）の形成とその核膜への移行が必須である。従来より、ＰＩＣの核への移行にはＰＩＣに含まれる種々のタンパク質中の核移行シグナル（ＮＬＳ）の協同的な作用によることが示唆されている。これらのタンパク質にはマトリクス抗原（ＭＡ）、インテグラーゼ（ＩＮ）及びＶｐｒタンパク質等が含まれる。ＭＡとＩＮの両者は、機能的なＮＬＳを有し、インポーチンα／βヘテロダイマーとの相互作用を含む古典的な核移行経路を利用しているが、Ｖｐｒタンパク質の核移行についての詳細な機構は未だ明らかではない。マクロファージにおけるＨＩＶ−１の複製に対するＶｐｒタンパク質の役割は比較的よく研究されているが、核移行におけるＶｐｒタンパク質の役割、特に、その細胞質因子との相互作用に基づく詳細な機構や、生体内で分裂中のＴ細胞や活性化された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における機能については必ずしも明らかではない。
【０００５】
【非特許文献１】Cohen, E.A. et al.,1990, Human immunodeficiency virus vpr product is a virion-associated regulatory protein. J. Virol. 64, 3097-3099
【非特許文献２】Gallay, P. et al., 1996, Role of the karyopherin pathway in human immunodeficiency virus type 1 nuclear import. J. Virol. 70, 1027-1032
【非特許文献３】He, J. et al., 1995, Human immunodeficiency virus type 1 viral protein R (Vpr) arrest cells in the G2 phase of the cell cycle by inhibiting p34cdc2 activity. J. Virol. 69, 6705-6711
【非特許文献４】Nishizawa, M. et al., A carboxy-terminally trancated form of the Vpr protein of human immunodeficiency virus type 1 retards cell proliferation independently of G(2) arrest of the cell cycle. Virology 263, 313-322
【非特許文献５】Cohen, E.A. et al., 1990, Identification of HIV-1 vpr product and function. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 3, 11-18
【非特許文献６】Le Rouzic E. et al., 2002, Docking of HIV-1 vpr to the nuclear envelope is mediated by the interaction with the nucleoporin hCG1. J. Biol. Chem. 277, 45091-45098
【非特許文献７】Agostini, I. et al., 1996, The human immunodeficiency virus type 1 Vpr transactivator: cooperation with promoter-bound activator domains and binding to TFIIB. J. Mol. Biol. 261, 599-606
【非特許文献８】Morellet, N. et al., 2003, NMR structure of the HIV-1 regulatory protein VPR. J. Mol. Biol. 327, 215-227
【非特許文献９】Mahalingam, S. et al., 1995, Identification of residues in the N-terminal acidic domain of HIV-1 Vpr essential for virion incorporation. Virology 207, 297-302
【非特許文献１０】Singh, S.P. et al., 2000, Functional role of residues corresponding to helical domain II(amino acids 35 to 46) of human immunodeficiency virus type 1 Vpr. J. Virol. 74, 10650-10657
【非特許文献１１】Kamata, M., and Aida, Y. 2000, Two putative alpha-helical domains of human immunodeficiency virus type 1 Vpr mediate nuclear localization by at least two mechanisms. J. Virol. 74, 7179-7186
【非特許文献１２】Taguchi, T., et al., 2004, Nuclear trafficking of macromolecules by an oligopeptide derived from Vpr of human immunodeficiency virus type-1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 320, 18-26
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明はＣＤ４陽性Ｔ細胞におけるＨＩＶ−１の増殖（複製）とＶｐｒタンパク質の多様な細胞増殖抑制機能の解明を通じて、ＡＩＤＳ発症予防、治療方法を提供することを目的とする。
【０００７】
また本発明は、ＰＩＣの核移行におけるＶｐｒタンパク質の働きを解明し、ＰＩＣの核移行の鍵となる段階を抑止することによってＨＩＶ−１による免疫細胞の感染阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題に鑑みて、本発明者らはＣＤ４陽性Ｔ細胞の初代培養細胞におけるＨＩＶ−１の感染、増殖に対し、種々の変異体Ｖｐｒタンパク質が及ぼす影響について検討した結果、核移行機能が損なわれた特定の変異体Ｖｐｒタンパク質を含むウイルスは、ＣＤ４陽性Ｔ細胞における増殖（複製）能が顕著に低下していることを見出した。そしてこれらの変異体Ｖｐｒタンパク質がＨＩＶ−１の増殖又は感染を阻害しうることを見出して本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、第一の視点において、本発明のＨＩＶ−１増殖阻害剤は、ヒト免疫不全症ウイルス１型（ＨＩＶ−１）Ｖｐｒタンパク質のα−ヘリックス領域内に少なくとも１つの突然変異を有し、前記突然変異によって少なくとも１つのα-ヘリックス構造が不安定化された変異体Ｖｐｒタンパク質を含むことを特徴とする。
【００１０】
また、本発明の他の視点において、ＨＩＶ−１のＶｐｒタンパク質のＮ末端から６０番目のイソロイシン、６７番目のロイシン、７４番目のイソロイシン、及び８１番目のイソロイシンからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸が、α-ヘリックスを不安定化するアミノ酸あるいは側鎖の性質を変化させるアミノ酸へ置換された変異体Ｖｐｒタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、及びこれらの何れかを含む医薬組成物を提供することを特徴とする。
【００１１】
さらに異なる視点において、本発明は、ヒト免疫細胞へのＨＩＶ−１感染を阻害する化合物をスクリーニングする方法を提供する。前記方法は、候補化合物の存在下においてＶｐｒタンパク質とインポーチンαとを接触させ、Ｖｐｒタンパク質がインポーチンαと結合するか否かを検出することを含み、前記Ｖｐｒタンパク質とインポーチンαとの結合を阻害する化合物がヒト免疫細胞へのＨＩＶ−１感染を阻害することを特徴とする。また、本発明のスクリーニング方法の他の実施形態として、候補化合物の存在下においてＶｐｒタンパク質を前記ヒト免疫細胞に導入し、Ｖｐｒタンパク質が核膜に局在するか否かを検出することを含み、前記Ｖｐｒタンパク質の核膜局在を阻害する化合物がヒト免疫細胞へのＨＩＶ−１感染を阻害することを特徴とする。前記Ｖｐｒタンパク質は、配列番号１に示したアミノ酸配列の１７〜７４番目のアミノ酸残基によって形成されるα−ヘリックス領域を含む部分Ｖｐｒタンパク質、又は融合Ｖｐｒタンパク質であることが好ましい。さらに好ましくは、前記インポーチンαとの結合に関与するＶｐｒタンパク質は、配列番号１に示したアミノ酸配列の１７〜３４番目のアミノ酸残基によって形成されるα−ヘリックス領域を含む部分Ｖｐｒタンパク質、又は融合Ｖｐｒタンパク質である。また、前記核膜への局在に関与するＶｐｒタンパク質は、配列番号１に示したアミノ酸配列の５６〜７７番目のアミノ酸残基によって形成されるα−ヘリックス領域を含む部分Ｖｐｒタンパク質、又は融合Ｖｐｒタンパク質である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ＡＩＤＳ発症の重要な段階であるＣＤ４陽性Ｔ細胞におけるウイルスの複製又は増殖を抑制することができるため、ＡＩＤＳの発症予防、又は治療用の薬剤として変異体Ｖｐｒタンパク質を使用することができる。また、本発明のスクリーニング方法によって得られる化合物は、免疫細胞内においてウイルスゲノムが核内へ移行することを抑止し、ＨＩＶ−１の感染を阻害することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の実施において、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡ技術等の一般的方法及び従来技術について、実施者は、特に示されなければ、当該分野の標準的な参考書籍を参照し得る。これらには、例えば、Molecular Cloning：A Laboratory Manual 第３版（Sambrook & Russell、Cold Spring Harbor Laboratory Press、2001）；Current Protocols in Molecular biology（Ausubelら編、John Wiley & Sons、1987）；Methods in Enzymologyシリーズ（Academic Press）；PCR Protocols: Methods in Molecular Biology（Bartlett & Striling編、Humana Press、2003）；Animal Cell Culture: A Practical Approach 第３版（Masters編、Oxford University Press、2000）；Antiboides：A Laboratory Manual（Harlowら＆ Lane編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1987）を参照のこと。また、本明細書において参照される細胞培養、細胞生物学実験のための試薬及びキット類はSigma社やAldrich社、Invitrogen/GIBCO社、Clontech社、Stratagene社、Amerhsam Biosciences社、TaKaRa（タカラバイオ株式会社）等の市販業者から入手可能である。
【００１４】
［変異体Ｖｐｒタンパク質］
本発明は、１つの実施形態において、ＨＩＶ−１のＶｐｒタンパク質に特定の変異を有する変異体Ｖｐｒタンパク質に関する。ＨＩＶ−１のいくつかの株について完全な塩基配列が報告されており、例えば、Adachiらによってクローン化された感染性のプロウイルスプラスミドｐＮＬ４３２はＨＩＶ−１において知られているすべてのタンパク質を発現する。ｐＮＬ４３２中のｖｐｒ遺伝子の塩基配列は、例えば、Ogawa K., et al., Journal of Virology, 1989, Vol. 63, No.9, p. 4110-4114, 及びGenBank Accession No. M28355等に公開されている（配列番号１）。特定の変異とは、Ｖｐｒタンパク質のα−ヘリックス領域内における少なくとも１つの突然変異である。この突然変異はＶｐｒタンパク質内に存在する３つのα−ヘリックス構造の少なくとも１つが不安定化されたものであればよく、例えば、Ｖｐｒタンパク質のＮ末端から６０番目のイソロイシン、６７番目のロイシン、７４番目のイソロイシン、及び８１番目のイソロイシンの少なくとも１つのアミノ酸がα-ヘリックス構造を不安定化するアミノ酸あるいは側鎖の性質を変化させるアミノ酸に置換されていることが好ましい。α-ヘリックスはポリペプチド鎖における主鎖の構造であるが、側鎖の影響も受けることが知られており、例えば、環状イミノ酸であるプロリンは主鎖の水素結合の形成を阻害してα-ヘリックスを不安定化し、一方、側鎖の解離基による静電的な反発や大きな側鎖の立体障害によってもα-ヘリックスの形成が阻害される。ここで、「α-ヘリックス構造を不安定化するアミノ酸」とは、α-ヘリックスを壊す傾向にあるアミノ酸のことであり、一般的には、チロシン、アスパラギン、プロリン、グリシン及びトリプトファン等を挙げることができる。また、「側鎖の性質を変化させるアミノ酸」とは、例えば、側鎖の疎水性を変化させることでありイソロイシンの疎水性影響を減少させるアラニン等を挙げることができる。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態において、（ａ）Ｖｐｒタンパク質のＮ末端から６７番目のロイシン、及び／又は７４番目のイソロイシンがプロリンに置換された変異体Ｖｐｒタンパク質、又は（ｂ）（ａ）の変異体Ｖｐｒタンパク質のＮ末端から６７番目及び７４番目以外の１又は数個（１〜９個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたタンパク質であって、且つＨＩＶ−１の増殖を阻害する活性を有する変異体Ｖｐｒタンパク質を挙げることができる。
【００１６】
より具体的には、配列番号３、４及び５の何れか一つに示したアミノ酸配列を有するタンパク質、又はこれらのタンパク質において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つＨＩＶ−１の増殖を阻害する活性を有する変異体Ｖｐｒタンパク質に関する。本明細書においては、上記各タンパク質を総称して「本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質」と称する。以下、本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質の構造や機能について説明する。なお、配列番号３のアミノ酸配列は６７番目のロイシンがプロリンに置換された変異体Ｖｐｒタンパク質（Ｌ６７Ｐ）のアミノ酸配列を、配列番号４のアミノ酸配列は７４番目のイソロイシンがプロリンに置換された変異体Ｖｐｒタンパク質（Ｉ７４Ｐ）のアミノ酸配列を、配列番号５のアミノ酸配列は２０、２２、２３及び２６番目のロイシンがアラニンに置換され、且つ６７番目のロイシンがプロリンに置換された変異体Ｖｐｒタンパク質（αＬＡＬ６７Ｐ）のアミノ酸配列をそれぞれ示す。
【００１７】
本発明において、Ｖｐｒタンパク質の第３のα−ヘリックス領域は、ロイシンが７アミノ酸ごとに４回繰り返しているロイシンジッパーモチーフ様構造を有し（具体的には、６０番目のイソロイシン、６７番目のロイシン、７４番目のイソロイシン、及び８１番目のイソロイシンからなる）、二量体形成や他の細胞性因子と相互作用することによってＨＩＶ−１ウイルスの複製や増殖に重要な役割を果たすと推定される。従って、この領域に突然変異を有し、且つα−ヘリックス構造が不安定化した変異体Ｖｐｒタンパク質は、本来の立体構造を維持できなくなったことにより生理的な機能が損なわれる可能性がある。
【００１８】
本明細書の実施例に示したように、本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質を細胞内で発現させると核に局在せずに細胞質全体に分散して存在することから、核移行機能が損なわれていることが理解される。また、この細胞内局在性は細胞の種類によって変化することなく、例えばＨｅＬａ細胞等の株化培養細胞だけでなく、ＣＤ４陽性活性化Ｔ細胞においても同様の結果が得られる。一般的に、タンパク質の核への移行には細胞質内の様々な因子との相互作用が必要であるから、本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質はこれらの細胞質因子との相互作用が損なわれるか、あるいは別の細胞質因子と複合体を形成して核移行能力が損なわれたものと考えられる。
【００１９】
一方、Ｇ２期で細胞周期を停止させることはＣＤ４陽性Ｔ細胞におけるＨＩＶ−１の増殖にとって重要である。特に、感染効率の低いウイルスにとって分裂中の細胞でウイルスを増殖させるためにはＶｐｒタンパク質によるＧ２停止機能が重要である。本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質は、このＧ２停止機能が低下することによってウイルスの感染、増殖能が抑制されている。
【００２０】
最も特徴的な性質として、本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質を含むウイルスはＣＤ４陽性活性化Ｔ細胞に感染、又は増殖する能力を実質的に失っている。本明細書において「感染」とは、標的細胞へ吸着、侵入することのみならず、細胞内（核内）でゲノムＤＮＡへの組込みやＲＮＡの転写を行うことによって子孫ウイルスを産生して細胞外に感染性のウイルス粒子を放出するウイルスの全生活環をも意味する。ＡＩＤＳの治療薬としてすでにＴａｔタンパク質のトランス活性化やウイルス転写産物の核から細胞質へのＲｅｖ依存性の輸送を阻害する低分子化合物が知られている。更に、Ｔａｔ、Ｒｅｖ及びＧａｇタンパク質の顕性不活性（dominant negative）変異体がウイルスの増殖を抑止することが証明されている。従って、本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質は顕性不活性（dominant negative）阻害剤としてＨＩＶ−１の感染、増殖を阻害することが期待される。
【００２１】
［変異体Ｖｐｒタンパク質をコードするポリヌクレオチド］
また、本発明は、上記本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。「ポリヌクレオチド」とは、一般に、ポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドの両方をいい、それらは修飾されていてもよい。例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、未プロセッシングＲＮＡ及びそれらの断片などが挙げられ、それらの長さは特に限定されない。「本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質をコードするポリヌクレオチド」とは、本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質をコードし得る限り、遺伝暗号の縮退に基づく任意の塩基配列を選択することができ、このようなポリヌクレオチドとしては、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドも含まれる。一旦ポリヌクレオチドの塩基配列が確定すると、その後は化学合成によってこのポリヌクレオチドを得ることができる。これらのポリヌクレオチドは当業者において公知の種々の方法で化学合成される。またはクローン化されたｖｐｒ遺伝子の全部又は一部を鋳型として部位特異的な変異の導入によって容易に得ることができる。
【００２２】
部位特異的なアミノ酸置換又は挿入によりタンパク質中のアミノ酸残基に変異を導入する方法が知られている。当業者に公知の部位特異的変異を導入する方法としては、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ法（Kunkel, T. A. et al., Methods Enzymol. 154, 367-382 (1987)）、ダブルプライマー法（Zoller, M. J. and Smith, M., Methods Enzymol. 154, 329-350 (1987)）、カセット変異法（Wells, et al., Gene 34, 315-23 (1985)）、メガプライマー法（Sarkar, G. and Sommer, S. S., Biotechniques 8, 404-407 (1990)）が挙げられる。
【００２３】
［変異体Ｖｐｒタンパク質を発現する組換えベクター］
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の変異体ｖｐｒ遺伝子を連結(挿入)することにより得ることができる。本発明の変異体ｖｐｒ遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド ＤＮＡ、ファージ ＤＮＡ等が挙げられる。
【００２４】
プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＲＳＥＴ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００２５】
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター ＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００２６】
本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを含有するものを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００２７】
［形質転換細胞］
本発明の形質転換細胞は、本発明のポリヌクレオチドを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。簡便で効率が良いことから多くの場合、ベクターを用いて形質転換が行われる。ここで、宿主としては、本発明のＤＮＡを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、エッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられる。また、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母、さらにＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞が挙げられる。あるいはＳｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞を用いることもできる。
【００２８】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明のポリヌクレオチドを導入した組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００２９】
大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)Ｋ１２、ＤＨ１などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などが挙げられる。プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。ｔａｃプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法(Cohen, S.N. et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 69, 2110-2114)、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００３０】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法(Becker, D.M. et al. (1990) Methods. Enzymol., 194,182-187)、スフェロプラスト法(Hinnen, A. et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 75, 1929-1933)、酢酸リチウム法(Itoh, H. (1983) J. Bacteriol. 153,163-168)等が挙げられる。
【００３１】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。プロモーターとしてＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００３２】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
【００３３】
［本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質の製造］
本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質は、例えば、形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。「本発明の形質転換体を培養する方法」は、宿主の培養に適用される通常の方法に従って行われる。
【００３４】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００３５】
培養は、好ましくは、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３７℃で６〜２４時間行う。培養期間中、ｐＨは７．０〜７．５に保持する。ｐＨの調整は、好ましくは無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００３６】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【００３７】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００３８】
培養後、変異体Ｖｐｒタンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより変異体Ｖｐｒタンパク質を抽出する。また、本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、ポリペプチドの単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質を単離精製することができる。この精製工程の間又は後において、プロテアーゼ処理により精製のために用いられたタグ配列を除去することができる。
【００３９】
［ＨＩＶ−１感染阻害剤のスクリーニング方法］
本発明のＨＩＶ−１感染阻害剤のスクリーニング方法は、ＨＩＶ−１ゲノムを含むＰＩＣが免疫細胞の核膜を通過するためにはＶｐｒタンパク質の核移行が重要である事実と、このＶｐｒタンパク質の核移行がインポーチンαによって媒介され、Ｖｐｒタンパク質がインポーチンαと結合できなくなることによって完全に核移行が阻害されるという知見に基づくものである。すなわち、Ｖｐｒタンパク質とインポーチンαとの結合を阻害することによりＰＩＣの核移行が抑止される。その結果、核内においてＨＩＶ−１ゲノムの複製が行われないためにＨＩＶ−１による感染が阻害されるのである。後述する実施例では、マクロファージのような非分裂細胞においてＨＩＶ−１ゲノムが複製するためにはＰＩＣの核移行が必須であり、この核移行段階を阻害することによりＨＩＶ−１の感染力が大きく低下することが示される。また、Ｖｐｒタンパク質の核移行にはインポーチンαのみが必要であり、インポーチンβのような核移行のための受容体タンパク質を必要としないことも特徴的である。
【００４０】
従って、１つの実施形態として、本発明のＨＩＶ−１感染阻害剤のスクリーニング方法は、候補化合物の存在下においてＶｐｒタンパク質とインポーチンαとを接触させ、Ｖｐｒタンパク質がインポーチンαと結合するか否かを検出することを含む。候補化合物とは、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド様物質、多糖、脂質、又はその他の有機化合物若しくは無機化合物でありうる。これらは化学合成された化合物ライブラリー又は細菌、カビ、放線菌などの培養物中の化合物からなる生物学的混合物であっても良い。
【００４１】
本実施形態において使用するＶｐｒタンパク質は、上述したＨＩＶ−１のＶｐｒタンパク質において、配列番号１に示したアミノ酸配列からなる完全長のタンパク質、及びその一部分からなる部分Ｖｐｒタンパク質の何れであってもよい。この部分Ｖｐｒタンパク質は、核移行に必要なＶｐｒの最小機能ドメインであり、３つのαヘリックス領域（αＨ１，１７〜３３；αＨ２，３８〜５０；αＨ３，５６〜７７）を形成する（図１）。このＮ末端から１７〜７４番目のアミノ酸残基によって形成されるαヘリックス領域（「Ｎ１７Ｃ７４」という。）の中でαＨ１とαＨ３は、インポーチンαと直接結合することが分かっているが、αＨ１はインポーチンαとの結合を介したＶｐｒタンパク質の核移行に必須な領域であることが、また、αＨ３はＶｐｒの核膜局在に必須であり、その核膜局在もＶｐｒの核移行に必須であることが明らかとなっている。すなわち、Ｖｐｒタンパク質の核膜局在又はインポーチンαとの結合の少なくとも１つの機能、好ましくはその両方を阻害することによりＶｐｒタンパク質の核移行を抑止し、ＨＩＶ−１の感染を阻害することができる。
【００４２】
さらに、本実施形態にけるＶｐｒタンパク質は、これらのインポーチンαとの結合領域を含み、その他のタンパク質やポリペプチドとの融合タンパク質であってもよい。好ましい実施形態において、当該融合タンパク質は、タグペプチド及び／又はレポータータンパク質等を含む。本明細書において、タグペプチドとは、部分Ｖｐｒタンパク質のＮ末端又はＣ末端に付加されたアミノ酸配列であって、該融合タンパク質をアフィニティー精製したり、ウエスタンブロッティング検出する場合の手がかりとなる配列である。例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（ＴｒｘＡ）、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）、ストレプトアビジン結合ペプチド（例えば、Streptag（商品名））、及びヒスチジンタグ等が挙げられる。
【００４３】
グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は、可溶性の酵素タンパク質であって、この遺伝子配列の下流にフレームを合わせて目的遺伝子を組み込むとＧＳＴとの融合タンパク質として発現させることができる。このための組換えベクターｐＧＥＸはアマシャムファルマシアバイオテック社から市販されている。ＧＳＴのタンパク質部分を特異的に認識する抗体や、グルタチオンと結合する性質を利用してアフィニティー精製や酵素免疫染色に利用されている。マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）は、大腸菌のマルトース結合タンパク質であり、ＭＢＰとの融合タンパク質はアミロースやアガロースゲルに吸着させた後、過剰のマルトースで遊離して精製できる。また、抗ＭＢＰ抗体を使用することもできる。チオレドキシン（ＴｒｘＡ）は、酸化還元反応を触媒する大腸菌のタンパク質であり、機能性の一対のチオール基によって金属キレートアフィニティークロマトグラフィーで精製できる。このための担体として、例えばThioBond（商品名）Resin(Invitorogen社製)等が市販されている。セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）はClostridium cellulovoransとCellulomonas fimi由来のセルロース結合ドメイン配列で、セルロースに特異的に結合する性質を有し、セルロースやキチンなどの不活性な担体に化学的な修飾を行うことなく固定させることができる。ストレプトアビジン結合ペプチドとして、例えば、Strep-tagIIと呼ばれる８個のアミノ酸からなるペプチドが知られており、StrepTactin（商品名）やStreptavidine（商品名）に選択的に結合させて精製することができる。ヒスチジンタグは、連続した又は近傍に配された少なくとも６個のヒスチジンを含むペプチドが好ましい。ヒスチジンタグは、二価の金属原子、特にニッケル原子と親和性が高い。そのためヒスチジンタグを有するタンパク質はニッケルアフィニティーマトリックスにしっかりと結合し、容易に精製することができる。
【００４４】
本発明において用いられるレポータータンパク質は、融合タンパク質として検出が容易なものであれば特に限定されるものではないが、例えば、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びエクオリン等を挙げることができる。
【００４５】
インポーチンαとは、タンパク質の核移行に関与する可溶性因子であって、インポーチンβ及びＮＬＳを有するタンパク質と結合するアダプター分子である。そして、一般的なＮＬＳを有するタンパク質は、インポーチンα−ＮＬＳ複合体と結合したインポーチンβによって細胞質からＮＰＣを介して核内へ運ばれる。ＮＬＳを有するタンパク質の核内への放出にはＧＴＰアーゼであるＲａｎ／ＴＣ４も関与している。一方、本発明において、ＨＩＶ−１のＰＩＣを核内へ輸送するＶｐｒタンパク質はインポーチンαのみによって輸送されることが示される。従って、Ｖｐｒタンパク質とインポーチンαとの結合を阻害することはＰＩＣの核移行を効果的に阻害することとなるであろう。本発明の方法に用いられるインポーチンαは、ヒトで見出されている６種類の分子（インポーチンα１（Ｒｃｈ１、ｈＳＲＰ１α）、インポーチンα３（Ｑｉｐ１）、インポーチンα４（ｈＳＲＰ１γ）、インポーチンα５（ｈＳＲＰ１、ＮＰＩ−１）、インポーチンα６、インポーチンα７）の何れでもよく、あるいはマウスや他の哺乳動物由来のインポーチンαでもよい。
【００４６】
Ｖｐｒタンパク質がインポーチンαと結合するか否かを検出するための１つの実施形態として、プルダウンアッセイがある。この方法は、まず、候補化合物の存在下においてＶｐｒタンパク質とインポーチンαとを接触させる工程である。これらの混合物は、通常は生体内に近い条件、例えば、２０〜４０℃で５分〜数時間、好ましくは１０分〜１時間程度インキュベートする。次に、Ｖｐｒタンパク質、及びインポーチンαの何れかを固相の担体に吸着させ、適当な洗浄液で洗浄することにより非結合成分を洗い流す。担体としては、固体または不溶性材料（例えば、ろ過、沈殿、磁性分離などによりタンパク質混合物から分離することができる材料）であって、タンパク質の非特異的な吸着が少ない物が好ましく、例としては、ビーズ（例えば、アガロース、セファロース、セファデックス、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、セルロース、テフロン（登録商標）、孔調節ガラス（ＣＰＧ））、薄膜（例えば、セルロース、ニトロセルロースポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアミド、ナイロン、ガラス繊維、及びテフロン（登録商標）製）のような平坦担体、ガラスプレート、金属プレート、シリコンウエハ、及びマイクロタイタープレート等を含む。タンパク質を固相担体に吸着させるためには種々の方法がある。例えば、Ｖｐｒタンパク質、及びインポーチンαの何れかに対する抗体を固定化したビーズなどを用いても良い。好ましくは、上述した融合Ｖｐｒタンパク質中のタグペプチド等を介して固相担体に吸着させることができる。最後に、固相担体に吸着したタンパク質を回収し、固相担体から他の一方のタンパク質を溶出するか或いは固相担体上で直接、他の一方のタンパク質を検出する。検出には特異的な抗体を用いたイムノアッセイや、上述した融合Ｖｐｒタンパク質中のレポータータンパク質の活性を測定することによる行うことができる。
【００４７】
典型的な１つの方法としてＧＳＴ−プルダウンアッセイがあり、ＧＳＴと融合したＶｐｒタンパク質及びインポーチンαの何れか一方のタンパク質をコードする遺伝子を、例えばＩＰＴＧで発現誘導が可能な発現ベクターにクローン化する。ＩＰＴＧを添加することによって、この融合タンパク質は、通常、細菌細胞内で発現され、グルタチオン−アガロースビーズ等を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製される。他の一方のタンパク質は、精製されたものでも、あるいは細胞のライセートの何れでもよく、また、放射性同位元素で標識されていてもよい。このＧＳＴ融合タンパク質と、他の一方のタンパク質とを、候補化合物の存在下、グルタチオンアガロースビーズと共にインキュベートし、ビーズから回収したタンパク質複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ウエスタンブロッティング、オートラジオグラフィー、又は上記レポータータンパク質の酵素活性等により検出する。
【００４８】
他の１つの方法としては、レポータータンパク質、例えば、ＧＦＰ類似性の蛍光タンパク質との融合タンパク質を用いるＦＲＥＴ(fluorescence resonance energy transfer)法により、候補化合物の存在下でＶｐｒタンパク質とインポーチンαの相互作用を検出することができる。ＦＲＥＴは励起されたフルオロフォア供与体から、その約６０Å以内にある受容体フルオロフォアへのエネルギー移行現象である。第一のフルオロフォアの励起後に、適当なフィルターを用いて第二のフルオロフォアからの発光を検出するか、または供与体の蛍光半減期を変えることで検出できる(Tsien RY, Annu. Rev. Biochem. 1998, 67, 509-544)。通常用いられている２つのフルオロフォアは、ＧＦＰの変異体であるシアン蛍光タンパク質（cyan fluorescent protein:ＣＦＰ）及び黄色蛍光タンパク質(yellow fluorescent protein:ＹＦＰ）である。
【００４９】
Ｖｐｒタンパク質とインポーチンαとの結合阻害に対する候補化合物の有効性は、既知量の候補化合物の存在下および不存在下でＶｐｒタンパク質がインポーチンαに結合する能力を測定することによって決定することができる。次に、候補化合物の阻止定数（Ｋi）を競合的インヒビターの式から計算することができる。
【００５０】
［ＨＩＶ−１の増殖を阻害する医薬組成物］
本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質は、上述したようにＣＤ４陽性Ｔ細胞のＨＩＶ−１感染を阻害し、及び／又は該ウイルスの増殖を阻害しうることから、ＡＩＤＳの予防及び／又は治療剤として用いることができる。また、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物は、ＨＩＶ−１感染阻害剤として用いることができる。そのような医薬組成物は、経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる。
【００５１】
本発明の医薬組成物を経口投与する場合は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等のいずれのものであってもよく、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。また、本発明の医薬を非経口投与する場合は、静脈内注射（点滴を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐剤などの製剤形態を選択することができ、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。
【００５２】
これらの各種製剤は、製剤上通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等などを適宜選択し、常法により製造することができる。
【００５３】
上記各種製剤は、医薬的に許容される担体又は添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。使用される添加物は、本発明の剤型に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択される。
【００５４】
本発明の医薬の投与量は、投与対象の年齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変えることができる。この場合、本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質の有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得る担体との組合せとして投与される有効量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲の投与量を選ぶことができ、好ましくは１日１回から数回に分けて１日以上投与される。
【００５５】
［非感染性ウイルスの製造方法］
上記医薬組成物としての利用のために、本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質を含むＨＩＶ−１を、ドミナントネガティブな形質を有する非感染性ウイルスとして使用することもできる。該ウイルスは本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質のコード領域を含むＨＩＶ−１のプロウイルスＤＮＡを培養細胞に形質転換することにより製造することができる。ＨＩＶ−１のプロウイルスＤＮＡは種々の培養細胞株、例えば、マウス、ミンク、サル、及びヒトの非Ｔ細胞株に形質転換することによってこれらの細胞内でウイルスＲＮＡ及びタンパク質を合成、集合して感染性のウイルス粒子を産生することが知られている(Adachi, A. et al., 1986, Journal of Virology, 59, 284-291参照)。該プロウイルスＤＮＡ中のｖｐｒ遺伝子に特定の変異が導入された変異体ウイルスもまたこれらの細胞を用いて製造することが可能である。あるいは、本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質のみをリポソーム等に封入してウイルス様粒子を製造してもよい。抗ＨＩＶｇｐ１２０抗体リポソームに封入して生体内に導入すればＨＩＶ感染細胞特異的な送達も可能である。
【実施例１】
【００５６】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
［種々のプラスミドの構築と変異体Ｖｐｒタンパク質の発現］
Ｖｐｒタンパク質は正規の核移行シグナル（ＮＬＳ）を含んでいないが、ＰＩＣ(preintegration complex)と相互作用して核へ移行し重要な役割を果たす。さらに、Ｖｐｒタンパク質は細胞周期のＭ期へ入るために必要なＣｄｃ２キナーゼの活性化を阻害することによって細胞周期をＧ２期で停止させる。Ｇ２期はウイルスのＬＴＲが最も活性化されるので、この時期に停止した細胞はウイルス産生が増強される。これに対し、Ｖｐｒタンパク質によるアポトーシスの誘導はＧ２期での停止とは独立して起こるものもある。このような多様なＶｐｒタンパク質の生物学的活性は、上述したようにタンパク質の立体構造と関連していることが示唆されている。
【００５７】
そこで、これらの生物学的な活性がＶｐｒタンパク質のどのような構造と関連しているかを確かめるために、以下のような種々の変異体Ｖｐｒタンパク質をコードする発現ベクターを構築した。(i)第２のα−ヘリックスドメイン内にあるヒスチジン（４５番目）とイソロイシン（４６番目）を、それぞれトリプトファンとアラニンに置換したＨＩ４５４６ＷＡ、(ii)第３のα−ヘリックスドメイン内にある、かさ高い非極性のロイシン（６７番目）を小さなアラニンに置換して疎水性の顕著な変化を導入したＬ６７Ａ、(iii)アルギニンに富む領域内にある２つのアルギニン（８７番目と８８番目）をそれぞれグルタミン酸とアラニンに置換したＲ８７８８ＥＡ、(iv) 第３のα−ヘリックスドメイン内にあるロイシン（６７番目）をプロリンに置換してヘリックス構造を破壊したＬ６７Ｐ、及び(v)第１のα−ヘリックスドメイン内にある４つのかさ高い非極性のロイシン（２０、２２、２３、及び２６番目）をそれぞれアラニンに置換し、さらに第３のα−ヘリックスドメイン内にあるロイシン（６７番目）をプロリンに置換したαＬＡＬ６７Ｐ（図１Ａ参照）。
【００５８】
発現ベクターｐＭＥ１８Ｎｅｏに基づいて作製された種々のプラスミド、即ち、Ｆｌａｇ−ｔａｇ配列と接続された野生型Ｖｐｒタンパク質；Ｌ６７Ａ、αＬＡＬ６７Ａ、及びＬ６７Ｐ等のアミノ酸置換変異体；及びコントロールプラスミドｐＭＥ１８Ｎｅｏ−Ｆｌａｇをコードする発現ベクターは既に報告されている(Kamata, M., and Aida, Y., 2000, Journal of Virology, 74, 7179-7186; Nishizawa, M. et al., 1999, Virology, 263, 313-322; Nishizawa, M. et al., 2000, Virology, 276, 16-26参照)。簡単に説明すると、以下に具体的に記載した方法と同様であり、ＰＣＲに基づく部位特異的変異導入キットExSite (Stratagene)と、上記各文献に記載されている所定のプライマーセットを用いてプラスミドｐＳＫ−Ｆｖｐｒに部位特異的な変異を導入した。
【００５９】
変異体Ｒ８７８８ＥＡと、変異体ＨＩ４５４６ＷＡを作製するために、ＰＣＲに基づく部位特異的変異導入キットExSite (Stratagene)を用いてプラスミドｐＳＫ−Ｆｖｐｒに部位特異的な変異を導入した。増幅用に設計したプライマーセットは以下の通りである。
Ｒ８７８８ＥＡ用として：5'-AGGGCAGCAAGAAATGGAGCCAG-3'（配列番号６）及び5'-CTGTCGAGTAACGCCTATTCTGC-3'（配列番号７）、ＨＩ４５４６ＷＡ用として：5'-TATGAAACTTACGGGGATACTTGGG-3'（配列番号８）及び5'-CGCCCATTGTCCTAAGTTATGG-3'（配列番号９）。ｐＳＫ−Ｆｖｐｒ内の変異したｖｐｒとＦｌａｇ配列を含むそれぞれのXhoI-NotI断片を切り出し、ｐＭＥ１８Ｎｅｏにサブクローニングした。
【００６０】
ＨＩＶ−１感染性ＤＮＡクローンｐＮＬ４３２のｖｐｒ遺伝子に種々の変異を導入した変異体分子クローンを作製するために、上述した方法と同様にＰＣＲに基づく部位特異的変異導入キットExSite (Stratagene)を用いて、ＨＩＶ−１感染性ＤＮＡクローンＮＦ４６２のNdeI-SalI断片を含むｐＵＣ１９に部位特異的な変異を導入した。増幅用に設計したプライマーセットは以下の通りである。ΔＶｐｒ用として：5'-GAACAAGCCCCAGAAGACCAAGG-3'（配列番号１０）及び5'-ACCTGTCCTCTGTCAGTTTCCT-3'（配列番号１１）、Ｌ６７Ａ用として：5'-AAGCACTGTTTATCCATTTCAGA-3'（配列番号１２）及び5'-GTTGCAGAATTCTTATTATGG-3'（配列番号１３）、ＨＩ４５４６ＷＡ用として：5'-TATGAAACTTACGGGGATACTTGGG-3'（配列番号８）及び5'-CGCCCATTGTCCTAAGTTATGG-3'（配列番号９）、Ｌ６７Ｐ用として：5'-CAACCCCTGTTTATCCATTTC-3'（配列番号１４）及び5'-TTGCAGAATTCTTATTATGGCTTCC-3'（配列番号１５）、並びにαＬＡ用として：5'-CCGAGGAAGCCAAGAGTGAAGCTGTTAGA-3'（配列番号１６）及び5'-CCGCCTCGGCTGTCCATTCATTGTATGGCTCC-3'（配列番号１７）である。さらにαＬＡＬ６７Ｐの多重置換体を作製するために、上記αＬＡ変異断片を含むｐＵＣ１９と5'-CAACCCCTGTTTATCCATTTC-3'（配列番号１４）及び5'-TTGCAGAATTCTTATTATGGCTTCC-3'（配列番号１５）のプライマーセットを用いた。ｐＵＣ１９内の変異を含むそれぞれのPflMI-SalI断片を切り出し、ｐＮＬ４３２のNdeI-SalI断片を含むｐＳＫにサブクローニングした。
【００６１】
以上作製したすべてのプラスミド構築物は、BigDyeターミネーターサイクルシーケンシングキットとＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１０（ＰＥアプライドバイオシステムズ社）を用いて塩基配列を確認した。変異体Ｖｐｒタンパク質を発現させるための種々のプラスミドの構築を、図１（Ａ）に模式的に示した。
【００６２】
このようにして作製した種々の発現ベクターを用いて種々の細胞を形質転換し、野生型及び種々の変異体Ｖｐｒタンパク質の発現を確認した。宿主細胞として用いたＨｅＬａ細胞、アフリカミドリザルＣＯＳ−１細胞及びヒトＴリンパ球細胞株Jurkatは、２〜１０％の熱処理牛胎児血清（ＦＣＳ）、ペニシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で維持した。ウエスタンブロッティング、免疫蛍光染色、並びにアポトーシス及び細胞周期の検査のために、１×１０７個のＨｅＬａ細胞を２０μｇの各種発現ベクターで形質転換した。形質転換はジーンパルサー（Bio-Rad)を用いたエレクトロポレーションにより、直径０．４ｃｍのキュベット内で３００Ｖ、９７５μＦで操作した。ＣＯＳ−１細胞はウイルス保存液の調製に用いた。
【００６３】
図１（Ａ）に示した６種類のプラスミドをＨｅＬａ細胞に形質転換しそれぞれのタンパク質のアミノ末端領域に存在するFlag-tag配列を認識するモノクローナル抗体Ｍ２を用いて形質転換後２４時間の細胞から抽出したタンパク質を電気泳動しウエスタンブロッティング法により検出した。図１Ｂに示したように、何れの変異体Ｖｐｒタンパク質も検出可能な程度に発現することが分かったが、αＬＡＬ６７Ｐは野生型及び他の変異体タンパク質に比べて多少移動度が遅く、立体構造の違いが示唆された。
【００６４】
［細胞周期の解析］
種々の発現ベクターで形質転換したＨｅＬａ細胞は、４８時間後に回収し、１％ホルムアルデヒド、７０％エタノールで固定した後Flag配列特異的なモノクローナル抗体Ｍ２（Eastman Kodak）で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、細胞をAlexa488と複合化したヤギ抗マウスＩｇＧ（Molecular Probes)と４５分間インキュベートした。その後細胞を再びＰＢＳで洗浄し、ＤＮＡ含量を解析するためのヨウ化プロピジウム（ＰＩ；５０μｇ／ｍｌ）、ＲＮａｓｅＡ（５０μｇ／ｍｌ）及びＦＳＣ（２容量％）を含むＰＢＳ中に３７℃で１５分間インキュベートした。１００００個の細胞の蛍光強度をＦＡＣＳｃａｎシステムとCell Questソフトウエア（何れもBecton-Dickinson社製)により解析した。Alexaが強い蛍光を発光しない細胞を除いてデータを整理した。Ｇ２／Ｍ期の細胞の相対数はModFit LTソフトウエア(Verity Software House)を用いて計算した。
【００６５】
［アポトーシス解析］
アポトーシスの解析のため、フローサイトメトリーを用いてカスパーゼ３活性の２色免疫蛍光染色を行った。２０μｇのＶｐｒ発現プラスミド（野生型又は変異体）で細胞を形質転換後２４時間でＨｅＬａ細胞を回収し１％ホルムアルデヒド、７０％エタノールで固定した後Flag配列特異的なモノクローナル抗体Ｍ２（Eastman Kodak）で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、細胞をAlexa488と複合化したヤギ抗マウスＩｇＧ（Molecular Probes)と４５分間インキュベートした。その後細胞を再びＰＢＳで洗浄し、フィコエリトリン（ＰＥ）と複合化したウサギ抗活性化カスパーゼ３抗体(BD Biosciences)と共に４℃で１時間インキュベートした。１００００個の細胞の蛍光強度をＦＡＣＳｃａｎシステムとCell Questソフトウエア（何れもBecton-Dickinson社製)により解析した。Alexaが強い蛍光を発光しない細胞を除いてデータを整理した。蛍光染色陽性細胞の相対数をパーセンテージで示した。
【００６６】
［細胞内局在性の解析］
種々の変異体Ｖｐｒタンパク質発現ベクターで形質転換したＨｅＬａ細胞は、４８時間以内にカバーガラス上にて１％ホルムアルデヒド−ＰＢＳで氷上１時間固定し、０．２％Triton X-100を含むＰＢＳで１０分間透過処理し、２回ＰＢＳで洗浄した。その後細胞をFlag配列特異的なモノクローナル抗体Ｍ２（Eastman Kodak）、又は通常のマウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、細胞をAlexa488と複合化したヤギ抗マウスＩｇＧ（Molecular Probes)と４５分間インキュベートした。カバーガラスをＰＢＳで洗浄した後スライドガラスの上に載せ共焦点レーザー顕微鏡(LSM510; Carl Zeiss)で観察した。
【００６７】
以上の結果を表１にまとめた。第２のαヘリックスドメイン内にアミノ酸置換を有するＨＩ４５４６ＷＡ変異体は、Ｇ２停止とアポトーシスを誘導する能力を維持していたが核への局在能力を失っていた。Ｖｐｒタンパク質のカルボキシ末端ドメインに変異を有するＲ８７８８ＥＡは核局在及びアポトーシスを誘導することはできたが細胞周期をＧ２期で停止させる活性が損なわれていた。カルボキシ末端の特徴的な塩基性アミノ酸残基は核への局在やアポトーシスにとっては必須でないかもしれない。Ｖｐｒタンパク質の第３のαヘリックスドメインに存在するロイシンをアラニンへ置換した変異体Ｌ６７ＡはＧ２停止を誘導し及び核に局在する活性は維持していたがアポトーシス誘導活性は低下していた。
【００６８】
次にこれらの変異体Ｖｐｒタンパク質を含むウイルスの複製（増殖）について、３人のドナーから採取した活性化されたＣＤ４陽性Ｔ細胞初代培養細胞を用いて比較した。３〜４日間隔で培養液上清を回収し、その中に含まれるｐ２４抗原量をＥＬＩＳＡにより定量してウイルスの増殖を調べた結果を表１に示した。野生型Ｖｐｒを含むウイルスについては、高感染力価（５ｎｇのｐ２４抗原相当量）及び低感染力価（０．５ｎｇのｐ２４抗原相当量）の何れの場合も感染性を有し、培養後２１日で最も増殖した。ｖｐｒ遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧを欠失させたΔＶｐｒ変異体ウイルスは増殖速度の低下が認められた。核局在機能を失ったＨＩ４５４６ＷＡ変異体やＧ２停止機能の低下したＲ８７８８ＥＡ変異体についてもΔＶｐｒ変異体ウイルスと同様に増殖速度が低下していた。これに対し、Ｇ２停止機能及び核局在性を共に維持しているＬ６７Ａ変異体は野生型ウイルスと同じ増殖速度を有していた。これらの結果は、アポトーシス誘導機能ではなく、核への局在性及びＧ２停止機能が、高感染力価及び低感染力価の何れの場合もＣＤ４陽性Ｔ細胞中におけるウイルスの増殖に重要なことが示唆された。
【００６９】
【表１】
【００７０】
［変異体Ｖｐｒタンパク質を発現するＨＩＶ−１のＣＤ４陽性Ｔ細胞への感染と増殖］
ウイルス保存液の調製は以下の２つの方法で行った。第一の方法は、ＦｕＧＥＮＥ６（ロシュダイアグノスティクス）を用いた。形質転換するＤＮＡは無血清のダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；ＧＩＢＣＯ）で１：１０（ｗ／ｖ）で希釈し、ＦｕＧＥＮＥ６試薬は２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液で１：２で希釈して室温で５分間インキュベートした。これらを混合し室温にて少なくとも１５分間インキュベートした。このＤＮＡ複合体を新鮮な培地中のＣＯＳ−１細胞に添加し、３７℃で５％ＣＯ２条件下４時間インキュベートした。培地を新鮮なものに置換した後７２時間培養を継続した。第二の方法としては、エレクトロポレーション法を用いた。ＣＯＳ−１細胞はＰＢＳで洗浄した後、１×Ｋ−ＰＢＳ（１０×Ｋ−ＰＢＳ緩衝液は３０８ｍＭのＮａＣｌ、１２０７ｍＭのＫＣｌ、８１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、及び１４６ｍＭのＫＨ２ＰＯ４を含む）中に１×１０７個／ｍｌの濃度の細胞と３０μｇ／μｌのプラスミドＤＮＡを添加して再懸濁した。細胞はジーンパルサー(gene pulsar;Bio-Rad)を用いて２６０Ｖ，９７０μＦで操作されたキュベット内にて形質転換した。その後、細胞は新鮮な培地中で３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。上記のような方法でＤＮＡを導入した後７２時間で培養上清を回収し、０．４５μｍのポアサイズのフィルターでろ過した。
【００７１】
このようにして調製したウイルス保存液の感染力価は、それぞれの培養上清中に存在するｐ２４抗原量に基づいて測定した。測定は、２種類の抗体、即ち、ｐ２４特異的モノクローナル抗体（Ｎｕ２４）とパーオキシダーゼ標識モノクローナル抗体（１０Ｂ５）の組み合わせた酵素免疫法（ＥＬＩＳＡ）により行った。
【００７２】
ＣＤ４陽性Ｔ細胞の調製は次のように行った。ＨＩＶ−１血清陰性健常人ドナーからフィコールグラジエント法により末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。回収したＰＢＭＣを２度洗浄した後、ＣＤ１４特異的モノクローナル抗体(MACS system, Militenyi Biotec)でコートしたマイクロビーズを用いて磁気細胞分離システムにより単球(monocyte)を除去した。単球を除去した後、Ｔ細胞カラムを用いてＣＤ４陽性Ｔ細胞をＣＤ１４陰性ＰＢＭＣから分離した(Tsunetsugu-Yokota et al 2003 J.Virol. 77, 10250-10259参照）。このようにして単離したＣＤ４陽性Ｔ細胞（純度９５〜９８％）をＣＤ３特異的及びＣＤ２８特異的モノクローナル抗体とＩＬ２存在下（２０Ｕ／ｍｌ；ジェンザイム社製）で３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養して活性化した。
【００７３】
ＣＤ４陽性Ｔ細胞を０．５ｎｇ又は５ｎｇのｐ２４抗原を含む種々の希釈ウイルス保存液に３７℃で２時間暴露した。細胞を３回洗浄した後、感染細胞（５×１０５個／ｍｌ）を４８ウェル組織培養用プレート（コーニング社）に植えつけ、１０％牛胎児血清と２０Ｕ／ｍｌのＩＬ２を含むＲＰＭＩ１６４０培地で維持した。３〜４日間隔で培養上清を回収し、上清中に産生されたウイルス量をＨＩＶ−１ｐ２４ｇａｇＥＬＩＳＡキット(RETRO TEC)を用いてｐ２４抗原量の経時的な定量によりモニターした。
【００７４】
図２は、野生型又は種々の変異体Ｖｐｒタンパク質をコードしたウイルス（０．５ｎｇのｐ２４抗原相当量）により感染したＣＤ４陽性活性化Ｔ細胞の増殖キネティクスを示す。感染後３週間におけるウイルス産生の様子を３〜４日ごとに培養上清に存在するｐ２４抗原量を指標としてモニターした。その結果、図２に示したように野生型又はＨＩ４５４６ＷＡ変異体では経時的にウイルス産生が認められたがＬ６７Ｐ及びαＬＡＬ６７Ｐ変異体ウイルスではほとんどウイルスの産生が認められず、ＣＤ４陽性Ｔ細胞において増殖できないことが示された。ここで重要なことは、Ｖｐｒタンパク質を欠損した変異体ウイルスにおいては感染後１０日目あたりから多少のウイルス産生が検出されたのに対し、本発明に係るＬ６７Ｐ及びαＬＡＬ６７Ｐ変異体Ｖｐｒタンパク質をコードするウイルスではほとんどウイルスの産生が検出されなかったことである。即ち、これらの変異体Ｖｐｒタンパク質は細胞内におけるウイルスの複製を阻害している可能性があり、ＨＩＶ−１の感染に対するドミナントネガティブな阻害剤となりうることが強く示唆された。
【００７５】
これらの結果を以下の表２にまとめた。ＨＩ４５４６ＷＡ変異体はＨｅＬａ細胞では細胞質全体に存在するがJurkat細胞やＣＤ４陽性Ｔ細胞では核内に移行する。従って、活性化されたＣＤ４陽性Ｔ細胞中にはＶｐｒタンパク質を核内へ移行させる何らかの細胞質因子の存在することが明らかとなった。一方、Ｌ６７Ｐ変異体やαＬＡＬ６７Ｐ変異体は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞中に存在するこれらの核移行のための細胞質因子との相互作用が阻害され、核へ移行することができないためにウイルスの感染能力が損なわれた可能性がある。あるいは、これらの変異体Ｖｐｒタンパク質はＣＤ４陽性Ｔ細胞中の別の細胞質因子と相互作用することによって細胞質に留まると共に、この細胞質因子の核への移行を阻害することによってウイルスの感染能力を抑制することも考えられる。
【００７６】
【表２】
【実施例２】
【００７７】
［組換えタンパク質の調製］
ＧＳＴタグ及びＧＦＰと融合した種々のＶｐｒタンパク質の構築方法は、基本的に以下に示した具体例と同様の方法により行った。すなわち、ＧＳＴタグと、αＬＡ変異を有する部分Ｖｐｒタンパク質Ｎ１７Ｃ７４と、ＧＦＰとの融合タンパク質は、プラスミドｐＳＫ−ＦαＬＡを鋳型として、プライマー5'-GCGGATATCCGAATGGACAGCCGA-3'（配列番号１８）及び5'-CGCGGATCCCCAATTCTGAAA-3'（配列番号１９）を用いて増幅した。増幅したＤＮＡ断片はプラスミドｐＧＥＸ−６Ｐ３のＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ部位にサブクローン化した。このようにして作製した種々のＧＳＴタグ付加変異体Ｖｐｒタンパク質の発現プラスミドは、大腸菌ＮｏｖａＢｌｕｅ株（ノバジェン社）を用いて発現した。組換え大腸菌を１６℃にて一晩培養した後、菌体を集め、回収した菌体を超音波処理にて溶菌し、上清中のＧＳＴタグ付加タンパク質をグルタチオンセファロース４Ｂ（アマシャムファルマシアバイオテック社）に吸着させた。吸着したタンパク質を１６ｍＭのグルタチオン溶液にて溶出し、核移行解析用バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ８ｐＨ７．３）、１１０ｍＭ酢酸カリウム、２ｍＭ酢酸マグネシウム、５ｍＭ酢酸ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＤＴＴ）に対して透析し、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（ザルトリウス社の商品名）を用いて遠心濃縮した。
【００７８】
組み換え型インポーチンα及びβは、Ｎ末端側にＧＳＴを持つ融合タンパク質として大腸菌ＢＬ２１コドンプラス（ＤＥ３）−ＲＩＬ株（ストラタジーン社）で発現させ、グルタチオンセファロース４Ｂに吸着した後、プロテアーゼにてＧＳＴを切断除去した。また、ＳＶ４０−ＮＬＳはＮ末端側にＧＳＴ，Ｃ末端側にＧＦＰを持つ融合タンパク質として、Ｖｐｒタンパク質と同様の方法で調製した。
【００７９】
［Ｖｐｒの核移行におけるインポーチンα及びβの役割］
In vitroでの核移行アッセイは、ジギトニン処理ＨｅＬａ細胞とＶｐｒ、ＳＶ４０−ＮＬＳの精製タンパク質と細胞由来の細胞質画分を用いて行った。ＨｅＬａ細胞を核移行解析用バッファー中、氷冷下で５分間、２５μｇ／ｍｌジギトニン（Fluka AG)で処理して透過性にした。核移行解析用バッファー中に終濃度で１μＭとなるように添加したＧＦＰ融合タンパク質を含む４０μｌの試験サンプルを用いた。この４０μｌの試験サンプル中には、組み換えインポーチンα、及びβの存在比を変えて添加した。核移行反応は３０℃で、３０分間進行させた後、氷冷した核移行解析用バッファーで細胞を２回洗浄し、１％ホルムアルデヒドを含む核移行解析用バッファー中、氷上で３０分間固定した。このようにして作成した標本を共焦点レーザースキャニング顕微鏡（ラディアンス２１００、バイオラッド）で調べた。また、Ｖｐｒ及びＳＶ４０−ＮＬＳと、インポーチンα及びβとの結合をプルダウンアッセイにより解析した。
【００８０】
Ｖｐｒの核移行能と、Ｖｐｒとインポーチンα及びβとの結合能との相関性を、典型的な核移行を示すＳＶ−４０のＮＬＳと比較した。その結果、Ｖｐｒはインポーチンβの量依存的に核移行能が抑制され、同時にインポーチンαとの結合が失われる競合阻害が認められた（図３（ａ））。この結果はＳＶ−４０のＮＬＳとは異なり、Ｖｐｒがインポーチンα単独で促進される核移行機序を有する事を示している。即ち、Ｖｐｒはインポーチンαとの結合を介して核移行するが、インポーチンβがある一定量以上存在すると、βがインポーチンαと結合してＶｐｒとの結合を奪うため、Ｖｐｒとインポーチンαとの結合が弱くなることが明らかとなった。
【００８１】
次に、インポーチンα側のインポーチンβ結合ドメイン（ＩＢＢドメイン）を欠失した変異体ΔＩＢＢインポーチンαを用いて同様の解析を行った（図３（ｂ））。ＶｐｒはΔＩＢＢインポーチンαと結合し、野生型インポーチンαで観察されたようなインポーチンβの量依存的な結合の阻害は認められなかった。核移行解析では、予想と反して、インポーチンβとは結合するはずのないΔＩＢＢインポーチンαでＶｐｒの核移行がβにより阻害された。一方、ＮＬＳの核移行は認められなかった。一つの細胞を拡大して断片の蛍光強度でＶｐｒの局在を解析すると、Ｖｐｒに特徴的な核膜局在はインポーチンβの量依存的に阻害された。この結果から、インポーチンβはＶｐｒの核膜への局在を阻害する可能性が考えられた。
【００８２】
［核移行の蛍光イメージング解析］
ＧＦＰ融合Ｎ１７Ｃ７４、あるいはその変異体の精製タンパク質を最終分化マクロファージの細胞内にマイクロインジェクションした細胞は培養液中で生きたまま使用し、蛍光タンパク質の挙動を蛍光顕微鏡、高解像度ＣＣＤカメラを用いて経時的に１５分間観察した。その結果を図４に示した。マイクロインジェクション後約１分でＮ１７Ｃ７４は生細胞内で核移行したが、インポーチンαとの結合能を失った変異体（αＺＬＡ）、核膜局在を失った変異体（Ｌ６７Ｐ）、その両方を失った変異体（αＬＡ／Ｌ６７Ｐ）は全く核移行しなかった。従って、Ｖｐｒの核移行はインポーチンαとの結合と、核膜への局在のいずれかを失うことで阻害されることが示唆された。
【００８３】
［変異体ウイルスによるマクロファージへの感染実験］
インポーチンαとの結合及び核膜局在を失った上記ｖｐｒ変異体をマクロファージ指向性感染性ＤＮＡクローンｐＮＦ４６２のｖｐｒ遺伝子に組み換えたウイルスを、ＣＯＳ−１細胞を用いて産生させた。各々のウイルス量をｐ２４値で揃えて、３名のドナー由来の最終分化マクロファージに感染させ、その感染性を培養上清中に放出されたｐ２４抗原量で測定した。その結果を図５に示した。インポーチンαとの結合性を失ったαＬＡ変異体ウイルス（◇）及び核膜局在を失ったＬ６７Ｐ変異体ウイルス（△）は、Ｖｐｒの欠失変異体と同様、３人のドナーすべてにおいて野生型ウイルスと比較してウイルスの増殖が著しく減少していた。これらの結果より、インポーチンαとの結合能を失ったＶｐｒ変異体を有するＨＩＶ−１はマクロファージへの感染効率を失うか、あるいは著しく低下することが明らかとなった。従って、ＨＩＶ−１のマクロファージへの感染は、Ｖｐｒとインポーチンαとの結合を阻害することによって、Ｖｐｒの核移行を抑止することで阻止できることが示唆された。
【００８４】
［結論及び考察］
Ｖｐｒの核移行には、インポーチンαとの結合と核膜局在が必要であることが示唆された。また、インポーチンαの結合あるいは核膜局在の片方でも失ったＶｐｒ変異ＨＩＶ−１はマクロファージ感染効率が著しく低下する事から、マクロファージへの感染はＶｐｒの核移行および核膜局在を消失するだけで、阻止できることが示唆された。これらの事実はＶｐｒとインポーチンαの結合を標的とした新規抗ＨＩＶ−１薬の開発が可能である事を示唆している。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】変体Ｖｐｒタンパク質の構築（Ａ）とＨｅＬａ細胞で発現させたタンパク質をウエスタンブロッティングにより検出した結果（Ｂ）である。
【図２】種々の変異体Ｖｐｒタンパク質を発現するＨＩＶ−１ウイルスを感染させたＣＤ４陽性Ｔ細胞におけるウイルス増殖をモニターしたグラフである。
【図３】Ｖｐｒの核移行をin vitroでの核移行アッセイにより解析した結果である。（ａ）Ｖｐｒとインポーチンαの結合を介した核移行はインポーチンβの量依存的に抑制されることを示す。（ｂ）ＶｐｒはΔＩＢＢインポーチンαと結合し核移行するが、インポーチンβはその過程だけでなくＶｐｒの核膜局在をも阻害することを示す。
【図４】最終分化マクロファージへマイクロインジェクションしたＶｐｒ及びその変異体のイメージング解析の結果である。
【図５】変異体ウイルスを用いたマクロファージへの感染実験の結果である。マクロファージへの感染はＶｐｒの核移行及び核膜局在を消失するだけで阻止される。
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒト免疫不全症ウイルス１型（ＨＩＶ−１）感染を阻害するタンパク質及び該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、これらを含む医薬組成物、並びにＨＩＶ−１感染阻害剤のスクリーニング方法及び該方法により得られるＨＩＶ−１感染阻害剤等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ４陽性Ｔ細胞が破壊されることにより生ずる後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因ウイルスであるＨＩＶ−１は、構造遺伝子及び調節遺伝子に加え、アクセサリー遺伝子を有するという特徴がある。アクセサリー遺伝子の一つであるｖｐｒは、９６個のアミノ酸残基からなる１５キロダルトン（ｋＤａ）の核タンパク質をコードする。ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、及びＳＩＶ等の霊長類のレンチウイルスは、何れも非常によく保存されたＶｐｒ様タンパク質を含んでいる。従って、Ｖｐｒタンパク質はこれらのウイルスの生活環において重要な役割を果たすと考えられる。Ｖｐｒタンパク質の多くの生物学的機能が報告されており、例えば、ウイルス粒子への取り込み（例えば、非特許文献１参照）、核への局在（例えば、非特許文献２参照）、細胞周期のＧ２／Ｍ期又はＧ１期での停止（例えば、非特許文献３及び４参照）、いくつかのウイルスプロモータの弱い活性化（例えば、非特許文献５参照）、ある種の細胞の最終分化の誘導（例えば、非特許文献６参照）、及び多様な細胞質因子との相互作用（例えば、非特許文献７参照）等である。
【０００３】
このような多様な生物学的機能は、Ｖｐｒタンパク質の特異的な構造と関連することが示唆されている。ＮＭＲによるＶｐｒタンパク質の立体構造解析の結果、フレキシブルなアミノ末端及びカルボキシ末端領域に囲まれて、Ｎ末端から１７〜３３番目、３８〜５０番目、及び５６〜７７番目のアミノ酸残基が３つのα−ヘリックスを形成することが報告されている（例えば、非特許文献８参照）。最もＮ末端に近いα−ヘリックスドメインはＶｐｒタンパク質の核への移行、タンパク質の発現及び安定性、並びにウイルス粒子への取り込みに重要である（例えば、非特許文献９参照）。第二のα−ヘリックスドメインもまた、Ｖｐｒのウイルス粒子への取り込みやオリゴマーを形成する性質にとって重要な意味を持つらしい（例えば、非特許文献１０参照）。第三のα−ヘリックスドメインは、核局在、特に、非分裂細胞において組込み前複合体（ＰＩＣ）の核への移行に関与する決定因子を含んでいる（例えば、非特許文献１１参照）。Ｃ末端の２０個のアミノ酸からなるアルギニンに富む領域は、潜在的な核移行シグナル（ＮＬＳ）を含み、Ｖｐｒタンパク質の核移行への主要な役割を果たしている。また、Ｖｐｒタンパク質の５２〜７８番目のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドは、培養細胞の培養液に添加するだけで細胞分裂非依存的に細胞の核内に取り込まれることも報告されている（非特許文献１２参照）。
【０００４】
一方、Ｖｐｒタンパク質を欠損したウイルスはin vitroで複製可能なことから、Ｖｐｒタンパク質はＨＩＶ−１の増殖（複製）に必須な因子ではないことが示唆されている。しかしながら、Ｖｐｒタンパク質はウイルス感染効率の上昇及びＨＩＶ潜伏感染細胞からのウイルス産生を惹起するなど、ＡＩＤＳ発症の主要因子であり、感染初期において重要な役割を果たす（例えば、非特許文献１参照）。マクロファージのような非分裂細胞では、細胞分裂時に特徴的な核膜の崩壊（消失）が起こらないことから、ＨＩＶ−１の感染が成立するためにはウイルスゲノムが細胞内の核膜を通過しなければならない。このＨＩＶ−１ゲノムの核膜通過には、組込み前複合体（ＰＩＣ）の形成とその核膜への移行が必須である。従来より、ＰＩＣの核への移行にはＰＩＣに含まれる種々のタンパク質中の核移行シグナル（ＮＬＳ）の協同的な作用によることが示唆されている。これらのタンパク質にはマトリクス抗原（ＭＡ）、インテグラーゼ（ＩＮ）及びＶｐｒタンパク質等が含まれる。ＭＡとＩＮの両者は、機能的なＮＬＳを有し、インポーチンα／βヘテロダイマーとの相互作用を含む古典的な核移行経路を利用しているが、Ｖｐｒタンパク質の核移行についての詳細な機構は未だ明らかではない。マクロファージにおけるＨＩＶ−１の複製に対するＶｐｒタンパク質の役割は比較的よく研究されているが、核移行におけるＶｐｒタンパク質の役割、特に、その細胞質因子との相互作用に基づく詳細な機構や、生体内で分裂中のＴ細胞や活性化された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における機能については必ずしも明らかではない。
【０００５】
【非特許文献１】Cohen, E.A. et al.,1990, Human immunodeficiency virus vpr product is a virion-associated regulatory protein. J. Virol. 64, 3097-3099
【非特許文献２】Gallay, P. et al., 1996, Role of the karyopherin pathway in human immunodeficiency virus type 1 nuclear import. J. Virol. 70, 1027-1032
【非特許文献３】He, J. et al., 1995, Human immunodeficiency virus type 1 viral protein R (Vpr) arrest cells in the G2 phase of the cell cycle by inhibiting p34cdc2 activity. J. Virol. 69, 6705-6711
【非特許文献４】Nishizawa, M. et al., A carboxy-terminally trancated form of the Vpr protein of human immunodeficiency virus type 1 retards cell proliferation independently of G(2) arrest of the cell cycle. Virology 263, 313-322
【非特許文献５】Cohen, E.A. et al., 1990, Identification of HIV-1 vpr product and function. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 3, 11-18
【非特許文献６】Le Rouzic E. et al., 2002, Docking of HIV-1 vpr to the nuclear envelope is mediated by the interaction with the nucleoporin hCG1. J. Biol. Chem. 277, 45091-45098
【非特許文献７】Agostini, I. et al., 1996, The human immunodeficiency virus type 1 Vpr transactivator: cooperation with promoter-bound activator domains and binding to TFIIB. J. Mol. Biol. 261, 599-606
【非特許文献８】Morellet, N. et al., 2003, NMR structure of the HIV-1 regulatory protein VPR. J. Mol. Biol. 327, 215-227
【非特許文献９】Mahalingam, S. et al., 1995, Identification of residues in the N-terminal acidic domain of HIV-1 Vpr essential for virion incorporation. Virology 207, 297-302
【非特許文献１０】Singh, S.P. et al., 2000, Functional role of residues corresponding to helical domain II(amino acids 35 to 46) of human immunodeficiency virus type 1 Vpr. J. Virol. 74, 10650-10657
【非特許文献１１】Kamata, M., and Aida, Y. 2000, Two putative alpha-helical domains of human immunodeficiency virus type 1 Vpr mediate nuclear localization by at least two mechanisms. J. Virol. 74, 7179-7186
【非特許文献１２】Taguchi, T., et al., 2004, Nuclear trafficking of macromolecules by an oligopeptide derived from Vpr of human immunodeficiency virus type-1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 320, 18-26
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明はＣＤ４陽性Ｔ細胞におけるＨＩＶ−１の増殖（複製）とＶｐｒタンパク質の多様な細胞増殖抑制機能の解明を通じて、ＡＩＤＳ発症予防、治療方法を提供することを目的とする。
【０００７】
また本発明は、ＰＩＣの核移行におけるＶｐｒタンパク質の働きを解明し、ＰＩＣの核移行の鍵となる段階を抑止することによってＨＩＶ−１による免疫細胞の感染阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題に鑑みて、本発明者らはＣＤ４陽性Ｔ細胞の初代培養細胞におけるＨＩＶ−１の感染、増殖に対し、種々の変異体Ｖｐｒタンパク質が及ぼす影響について検討した結果、核移行機能が損なわれた特定の変異体Ｖｐｒタンパク質を含むウイルスは、ＣＤ４陽性Ｔ細胞における増殖（複製）能が顕著に低下していることを見出した。そしてこれらの変異体Ｖｐｒタンパク質がＨＩＶ−１の増殖又は感染を阻害しうることを見出して本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、第一の視点において、本発明のＨＩＶ−１増殖阻害剤は、ヒト免疫不全症ウイルス１型（ＨＩＶ−１）Ｖｐｒタンパク質のα−ヘリックス領域内に少なくとも１つの突然変異を有し、前記突然変異によって少なくとも１つのα-ヘリックス構造が不安定化された変異体Ｖｐｒタンパク質を含むことを特徴とする。
【００１０】
また、本発明の他の視点において、ＨＩＶ−１のＶｐｒタンパク質のＮ末端から６０番目のイソロイシン、６７番目のロイシン、７４番目のイソロイシン、及び８１番目のイソロイシンからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸が、α-ヘリックスを不安定化するアミノ酸あるいは側鎖の性質を変化させるアミノ酸へ置換された変異体Ｖｐｒタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、及びこれらの何れかを含む医薬組成物を提供することを特徴とする。
【００１１】
さらに異なる視点において、本発明は、ヒト免疫細胞へのＨＩＶ−１感染を阻害する化合物をスクリーニングする方法を提供する。前記方法は、候補化合物の存在下においてＶｐｒタンパク質とインポーチンαとを接触させ、Ｖｐｒタンパク質がインポーチンαと結合するか否かを検出することを含み、前記Ｖｐｒタンパク質とインポーチンαとの結合を阻害する化合物がヒト免疫細胞へのＨＩＶ−１感染を阻害することを特徴とする。また、本発明のスクリーニング方法の他の実施形態として、候補化合物の存在下においてＶｐｒタンパク質を前記ヒト免疫細胞に導入し、Ｖｐｒタンパク質が核膜に局在するか否かを検出することを含み、前記Ｖｐｒタンパク質の核膜局在を阻害する化合物がヒト免疫細胞へのＨＩＶ−１感染を阻害することを特徴とする。前記Ｖｐｒタンパク質は、配列番号１に示したアミノ酸配列の１７〜７４番目のアミノ酸残基によって形成されるα−ヘリックス領域を含む部分Ｖｐｒタンパク質、又は融合Ｖｐｒタンパク質であることが好ましい。さらに好ましくは、前記インポーチンαとの結合に関与するＶｐｒタンパク質は、配列番号１に示したアミノ酸配列の１７〜３４番目のアミノ酸残基によって形成されるα−ヘリックス領域を含む部分Ｖｐｒタンパク質、又は融合Ｖｐｒタンパク質である。また、前記核膜への局在に関与するＶｐｒタンパク質は、配列番号１に示したアミノ酸配列の５６〜７７番目のアミノ酸残基によって形成されるα−ヘリックス領域を含む部分Ｖｐｒタンパク質、又は融合Ｖｐｒタンパク質である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ＡＩＤＳ発症の重要な段階であるＣＤ４陽性Ｔ細胞におけるウイルスの複製又は増殖を抑制することができるため、ＡＩＤＳの発症予防、又は治療用の薬剤として変異体Ｖｐｒタンパク質を使用することができる。また、本発明のスクリーニング方法によって得られる化合物は、免疫細胞内においてウイルスゲノムが核内へ移行することを抑止し、ＨＩＶ−１の感染を阻害することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の実施において、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡ技術等の一般的方法及び従来技術について、実施者は、特に示されなければ、当該分野の標準的な参考書籍を参照し得る。これらには、例えば、Molecular Cloning：A Laboratory Manual 第３版（Sambrook & Russell、Cold Spring Harbor Laboratory Press、2001）；Current Protocols in Molecular biology（Ausubelら編、John Wiley & Sons、1987）；Methods in Enzymologyシリーズ（Academic Press）；PCR Protocols: Methods in Molecular Biology（Bartlett & Striling編、Humana Press、2003）；Animal Cell Culture: A Practical Approach 第３版（Masters編、Oxford University Press、2000）；Antiboides：A Laboratory Manual（Harlowら＆ Lane編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1987）を参照のこと。また、本明細書において参照される細胞培養、細胞生物学実験のための試薬及びキット類はSigma社やAldrich社、Invitrogen/GIBCO社、Clontech社、Stratagene社、Amerhsam Biosciences社、TaKaRa（タカラバイオ株式会社）等の市販業者から入手可能である。
【００１４】
［変異体Ｖｐｒタンパク質］
本発明は、１つの実施形態において、ＨＩＶ−１のＶｐｒタンパク質に特定の変異を有する変異体Ｖｐｒタンパク質に関する。ＨＩＶ−１のいくつかの株について完全な塩基配列が報告されており、例えば、Adachiらによってクローン化された感染性のプロウイルスプラスミドｐＮＬ４３２はＨＩＶ−１において知られているすべてのタンパク質を発現する。ｐＮＬ４３２中のｖｐｒ遺伝子の塩基配列は、例えば、Ogawa K., et al., Journal of Virology, 1989, Vol. 63, No.9, p. 4110-4114, 及びGenBank Accession No. M28355等に公開されている（配列番号１）。特定の変異とは、Ｖｐｒタンパク質のα−ヘリックス領域内における少なくとも１つの突然変異である。この突然変異はＶｐｒタンパク質内に存在する３つのα−ヘリックス構造の少なくとも１つが不安定化されたものであればよく、例えば、Ｖｐｒタンパク質のＮ末端から６０番目のイソロイシン、６７番目のロイシン、７４番目のイソロイシン、及び８１番目のイソロイシンの少なくとも１つのアミノ酸がα-ヘリックス構造を不安定化するアミノ酸あるいは側鎖の性質を変化させるアミノ酸に置換されていることが好ましい。α-ヘリックスはポリペプチド鎖における主鎖の構造であるが、側鎖の影響も受けることが知られており、例えば、環状イミノ酸であるプロリンは主鎖の水素結合の形成を阻害してα-ヘリックスを不安定化し、一方、側鎖の解離基による静電的な反発や大きな側鎖の立体障害によってもα-ヘリックスの形成が阻害される。ここで、「α-ヘリックス構造を不安定化するアミノ酸」とは、α-ヘリックスを壊す傾向にあるアミノ酸のことであり、一般的には、チロシン、アスパラギン、プロリン、グリシン及びトリプトファン等を挙げることができる。また、「側鎖の性質を変化させるアミノ酸」とは、例えば、側鎖の疎水性を変化させることでありイソロイシンの疎水性影響を減少させるアラニン等を挙げることができる。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態において、（ａ）Ｖｐｒタンパク質のＮ末端から６７番目のロイシン、及び／又は７４番目のイソロイシンがプロリンに置換された変異体Ｖｐｒタンパク質、又は（ｂ）（ａ）の変異体Ｖｐｒタンパク質のＮ末端から６７番目及び７４番目以外の１又は数個（１〜９個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたタンパク質であって、且つＨＩＶ−１の増殖を阻害する活性を有する変異体Ｖｐｒタンパク質を挙げることができる。
【００１６】
より具体的には、配列番号３、４及び５の何れか一つに示したアミノ酸配列を有するタンパク質、又はこれらのタンパク質において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つＨＩＶ−１の増殖を阻害する活性を有する変異体Ｖｐｒタンパク質に関する。本明細書においては、上記各タンパク質を総称して「本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質」と称する。以下、本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質の構造や機能について説明する。なお、配列番号３のアミノ酸配列は６７番目のロイシンがプロリンに置換された変異体Ｖｐｒタンパク質（Ｌ６７Ｐ）のアミノ酸配列を、配列番号４のアミノ酸配列は７４番目のイソロイシンがプロリンに置換された変異体Ｖｐｒタンパク質（Ｉ７４Ｐ）のアミノ酸配列を、配列番号５のアミノ酸配列は２０、２２、２３及び２６番目のロイシンがアラニンに置換され、且つ６７番目のロイシンがプロリンに置換された変異体Ｖｐｒタンパク質（αＬＡＬ６７Ｐ）のアミノ酸配列をそれぞれ示す。
【００１７】
本発明において、Ｖｐｒタンパク質の第３のα−ヘリックス領域は、ロイシンが７アミノ酸ごとに４回繰り返しているロイシンジッパーモチーフ様構造を有し（具体的には、６０番目のイソロイシン、６７番目のロイシン、７４番目のイソロイシン、及び８１番目のイソロイシンからなる）、二量体形成や他の細胞性因子と相互作用することによってＨＩＶ−１ウイルスの複製や増殖に重要な役割を果たすと推定される。従って、この領域に突然変異を有し、且つα−ヘリックス構造が不安定化した変異体Ｖｐｒタンパク質は、本来の立体構造を維持できなくなったことにより生理的な機能が損なわれる可能性がある。
【００１８】
本明細書の実施例に示したように、本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質を細胞内で発現させると核に局在せずに細胞質全体に分散して存在することから、核移行機能が損なわれていることが理解される。また、この細胞内局在性は細胞の種類によって変化することなく、例えばＨｅＬａ細胞等の株化培養細胞だけでなく、ＣＤ４陽性活性化Ｔ細胞においても同様の結果が得られる。一般的に、タンパク質の核への移行には細胞質内の様々な因子との相互作用が必要であるから、本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質はこれらの細胞質因子との相互作用が損なわれるか、あるいは別の細胞質因子と複合体を形成して核移行能力が損なわれたものと考えられる。
【００１９】
一方、Ｇ２期で細胞周期を停止させることはＣＤ４陽性Ｔ細胞におけるＨＩＶ−１の増殖にとって重要である。特に、感染効率の低いウイルスにとって分裂中の細胞でウイルスを増殖させるためにはＶｐｒタンパク質によるＧ２停止機能が重要である。本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質は、このＧ２停止機能が低下することによってウイルスの感染、増殖能が抑制されている。
【００２０】
最も特徴的な性質として、本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質を含むウイルスはＣＤ４陽性活性化Ｔ細胞に感染、又は増殖する能力を実質的に失っている。本明細書において「感染」とは、標的細胞へ吸着、侵入することのみならず、細胞内（核内）でゲノムＤＮＡへの組込みやＲＮＡの転写を行うことによって子孫ウイルスを産生して細胞外に感染性のウイルス粒子を放出するウイルスの全生活環をも意味する。ＡＩＤＳの治療薬としてすでにＴａｔタンパク質のトランス活性化やウイルス転写産物の核から細胞質へのＲｅｖ依存性の輸送を阻害する低分子化合物が知られている。更に、Ｔａｔ、Ｒｅｖ及びＧａｇタンパク質の顕性不活性（dominant negative）変異体がウイルスの増殖を抑止することが証明されている。従って、本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質は顕性不活性（dominant negative）阻害剤としてＨＩＶ−１の感染、増殖を阻害することが期待される。
【００２１】
［変異体Ｖｐｒタンパク質をコードするポリヌクレオチド］
また、本発明は、上記本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。「ポリヌクレオチド」とは、一般に、ポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドの両方をいい、それらは修飾されていてもよい。例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、未プロセッシングＲＮＡ及びそれらの断片などが挙げられ、それらの長さは特に限定されない。「本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質をコードするポリヌクレオチド」とは、本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質をコードし得る限り、遺伝暗号の縮退に基づく任意の塩基配列を選択することができ、このようなポリヌクレオチドとしては、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドも含まれる。一旦ポリヌクレオチドの塩基配列が確定すると、その後は化学合成によってこのポリヌクレオチドを得ることができる。これらのポリヌクレオチドは当業者において公知の種々の方法で化学合成される。またはクローン化されたｖｐｒ遺伝子の全部又は一部を鋳型として部位特異的な変異の導入によって容易に得ることができる。
【００２２】
部位特異的なアミノ酸置換又は挿入によりタンパク質中のアミノ酸残基に変異を導入する方法が知られている。当業者に公知の部位特異的変異を導入する方法としては、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ法（Kunkel, T. A. et al., Methods Enzymol. 154, 367-382 (1987)）、ダブルプライマー法（Zoller, M. J. and Smith, M., Methods Enzymol. 154, 329-350 (1987)）、カセット変異法（Wells, et al., Gene 34, 315-23 (1985)）、メガプライマー法（Sarkar, G. and Sommer, S. S., Biotechniques 8, 404-407 (1990)）が挙げられる。
【００２３】
［変異体Ｖｐｒタンパク質を発現する組換えベクター］
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の変異体ｖｐｒ遺伝子を連結(挿入)することにより得ることができる。本発明の変異体ｖｐｒ遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド ＤＮＡ、ファージ ＤＮＡ等が挙げられる。
【００２４】
プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＲＳＥＴ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００２５】
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター ＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００２６】
本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを含有するものを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００２７】
［形質転換細胞］
本発明の形質転換細胞は、本発明のポリヌクレオチドを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。簡便で効率が良いことから多くの場合、ベクターを用いて形質転換が行われる。ここで、宿主としては、本発明のＤＮＡを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、エッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられる。また、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母、さらにＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞が挙げられる。あるいはＳｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞を用いることもできる。
【００２８】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明のポリヌクレオチドを導入した組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００２９】
大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)Ｋ１２、ＤＨ１などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などが挙げられる。プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。ｔａｃプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法(Cohen, S.N. et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 69, 2110-2114)、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００３０】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法(Becker, D.M. et al. (1990) Methods. Enzymol., 194,182-187)、スフェロプラスト法(Hinnen, A. et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 75, 1929-1933)、酢酸リチウム法(Itoh, H. (1983) J. Bacteriol. 153,163-168)等が挙げられる。
【００３１】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。プロモーターとしてＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００３２】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
【００３３】
［本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質の製造］
本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質は、例えば、形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。「本発明の形質転換体を培養する方法」は、宿主の培養に適用される通常の方法に従って行われる。
【００３４】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００３５】
培養は、好ましくは、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３７℃で６〜２４時間行う。培養期間中、ｐＨは７．０〜７．５に保持する。ｐＨの調整は、好ましくは無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００３６】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【００３７】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００３８】
培養後、変異体Ｖｐｒタンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより変異体Ｖｐｒタンパク質を抽出する。また、本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、ポリペプチドの単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質を単離精製することができる。この精製工程の間又は後において、プロテアーゼ処理により精製のために用いられたタグ配列を除去することができる。
【００３９】
［ＨＩＶ−１感染阻害剤のスクリーニング方法］
本発明のＨＩＶ−１感染阻害剤のスクリーニング方法は、ＨＩＶ−１ゲノムを含むＰＩＣが免疫細胞の核膜を通過するためにはＶｐｒタンパク質の核移行が重要である事実と、このＶｐｒタンパク質の核移行がインポーチンαによって媒介され、Ｖｐｒタンパク質がインポーチンαと結合できなくなることによって完全に核移行が阻害されるという知見に基づくものである。すなわち、Ｖｐｒタンパク質とインポーチンαとの結合を阻害することによりＰＩＣの核移行が抑止される。その結果、核内においてＨＩＶ−１ゲノムの複製が行われないためにＨＩＶ−１による感染が阻害されるのである。後述する実施例では、マクロファージのような非分裂細胞においてＨＩＶ−１ゲノムが複製するためにはＰＩＣの核移行が必須であり、この核移行段階を阻害することによりＨＩＶ−１の感染力が大きく低下することが示される。また、Ｖｐｒタンパク質の核移行にはインポーチンαのみが必要であり、インポーチンβのような核移行のための受容体タンパク質を必要としないことも特徴的である。
【００４０】
従って、１つの実施形態として、本発明のＨＩＶ−１感染阻害剤のスクリーニング方法は、候補化合物の存在下においてＶｐｒタンパク質とインポーチンαとを接触させ、Ｖｐｒタンパク質がインポーチンαと結合するか否かを検出することを含む。候補化合物とは、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド様物質、多糖、脂質、又はその他の有機化合物若しくは無機化合物でありうる。これらは化学合成された化合物ライブラリー又は細菌、カビ、放線菌などの培養物中の化合物からなる生物学的混合物であっても良い。
【００４１】
本実施形態において使用するＶｐｒタンパク質は、上述したＨＩＶ−１のＶｐｒタンパク質において、配列番号１に示したアミノ酸配列からなる完全長のタンパク質、及びその一部分からなる部分Ｖｐｒタンパク質の何れであってもよい。この部分Ｖｐｒタンパク質は、核移行に必要なＶｐｒの最小機能ドメインであり、３つのαヘリックス領域（αＨ１，１７〜３３；αＨ２，３８〜５０；αＨ３，５６〜７７）を形成する（図１）。このＮ末端から１７〜７４番目のアミノ酸残基によって形成されるαヘリックス領域（「Ｎ１７Ｃ７４」という。）の中でαＨ１とαＨ３は、インポーチンαと直接結合することが分かっているが、αＨ１はインポーチンαとの結合を介したＶｐｒタンパク質の核移行に必須な領域であることが、また、αＨ３はＶｐｒの核膜局在に必須であり、その核膜局在もＶｐｒの核移行に必須であることが明らかとなっている。すなわち、Ｖｐｒタンパク質の核膜局在又はインポーチンαとの結合の少なくとも１つの機能、好ましくはその両方を阻害することによりＶｐｒタンパク質の核移行を抑止し、ＨＩＶ−１の感染を阻害することができる。
【００４２】
さらに、本実施形態にけるＶｐｒタンパク質は、これらのインポーチンαとの結合領域を含み、その他のタンパク質やポリペプチドとの融合タンパク質であってもよい。好ましい実施形態において、当該融合タンパク質は、タグペプチド及び／又はレポータータンパク質等を含む。本明細書において、タグペプチドとは、部分Ｖｐｒタンパク質のＮ末端又はＣ末端に付加されたアミノ酸配列であって、該融合タンパク質をアフィニティー精製したり、ウエスタンブロッティング検出する場合の手がかりとなる配列である。例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（ＴｒｘＡ）、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）、ストレプトアビジン結合ペプチド（例えば、Streptag（商品名））、及びヒスチジンタグ等が挙げられる。
【００４３】
グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は、可溶性の酵素タンパク質であって、この遺伝子配列の下流にフレームを合わせて目的遺伝子を組み込むとＧＳＴとの融合タンパク質として発現させることができる。このための組換えベクターｐＧＥＸはアマシャムファルマシアバイオテック社から市販されている。ＧＳＴのタンパク質部分を特異的に認識する抗体や、グルタチオンと結合する性質を利用してアフィニティー精製や酵素免疫染色に利用されている。マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）は、大腸菌のマルトース結合タンパク質であり、ＭＢＰとの融合タンパク質はアミロースやアガロースゲルに吸着させた後、過剰のマルトースで遊離して精製できる。また、抗ＭＢＰ抗体を使用することもできる。チオレドキシン（ＴｒｘＡ）は、酸化還元反応を触媒する大腸菌のタンパク質であり、機能性の一対のチオール基によって金属キレートアフィニティークロマトグラフィーで精製できる。このための担体として、例えばThioBond（商品名）Resin(Invitorogen社製)等が市販されている。セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）はClostridium cellulovoransとCellulomonas fimi由来のセルロース結合ドメイン配列で、セルロースに特異的に結合する性質を有し、セルロースやキチンなどの不活性な担体に化学的な修飾を行うことなく固定させることができる。ストレプトアビジン結合ペプチドとして、例えば、Strep-tagIIと呼ばれる８個のアミノ酸からなるペプチドが知られており、StrepTactin（商品名）やStreptavidine（商品名）に選択的に結合させて精製することができる。ヒスチジンタグは、連続した又は近傍に配された少なくとも６個のヒスチジンを含むペプチドが好ましい。ヒスチジンタグは、二価の金属原子、特にニッケル原子と親和性が高い。そのためヒスチジンタグを有するタンパク質はニッケルアフィニティーマトリックスにしっかりと結合し、容易に精製することができる。
【００４４】
本発明において用いられるレポータータンパク質は、融合タンパク質として検出が容易なものであれば特に限定されるものではないが、例えば、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びエクオリン等を挙げることができる。
【００４５】
インポーチンαとは、タンパク質の核移行に関与する可溶性因子であって、インポーチンβ及びＮＬＳを有するタンパク質と結合するアダプター分子である。そして、一般的なＮＬＳを有するタンパク質は、インポーチンα−ＮＬＳ複合体と結合したインポーチンβによって細胞質からＮＰＣを介して核内へ運ばれる。ＮＬＳを有するタンパク質の核内への放出にはＧＴＰアーゼであるＲａｎ／ＴＣ４も関与している。一方、本発明において、ＨＩＶ−１のＰＩＣを核内へ輸送するＶｐｒタンパク質はインポーチンαのみによって輸送されることが示される。従って、Ｖｐｒタンパク質とインポーチンαとの結合を阻害することはＰＩＣの核移行を効果的に阻害することとなるであろう。本発明の方法に用いられるインポーチンαは、ヒトで見出されている６種類の分子（インポーチンα１（Ｒｃｈ１、ｈＳＲＰ１α）、インポーチンα３（Ｑｉｐ１）、インポーチンα４（ｈＳＲＰ１γ）、インポーチンα５（ｈＳＲＰ１、ＮＰＩ−１）、インポーチンα６、インポーチンα７）の何れでもよく、あるいはマウスや他の哺乳動物由来のインポーチンαでもよい。
【００４６】
Ｖｐｒタンパク質がインポーチンαと結合するか否かを検出するための１つの実施形態として、プルダウンアッセイがある。この方法は、まず、候補化合物の存在下においてＶｐｒタンパク質とインポーチンαとを接触させる工程である。これらの混合物は、通常は生体内に近い条件、例えば、２０〜４０℃で５分〜数時間、好ましくは１０分〜１時間程度インキュベートする。次に、Ｖｐｒタンパク質、及びインポーチンαの何れかを固相の担体に吸着させ、適当な洗浄液で洗浄することにより非結合成分を洗い流す。担体としては、固体または不溶性材料（例えば、ろ過、沈殿、磁性分離などによりタンパク質混合物から分離することができる材料）であって、タンパク質の非特異的な吸着が少ない物が好ましく、例としては、ビーズ（例えば、アガロース、セファロース、セファデックス、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、セルロース、テフロン（登録商標）、孔調節ガラス（ＣＰＧ））、薄膜（例えば、セルロース、ニトロセルロースポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアミド、ナイロン、ガラス繊維、及びテフロン（登録商標）製）のような平坦担体、ガラスプレート、金属プレート、シリコンウエハ、及びマイクロタイタープレート等を含む。タンパク質を固相担体に吸着させるためには種々の方法がある。例えば、Ｖｐｒタンパク質、及びインポーチンαの何れかに対する抗体を固定化したビーズなどを用いても良い。好ましくは、上述した融合Ｖｐｒタンパク質中のタグペプチド等を介して固相担体に吸着させることができる。最後に、固相担体に吸着したタンパク質を回収し、固相担体から他の一方のタンパク質を溶出するか或いは固相担体上で直接、他の一方のタンパク質を検出する。検出には特異的な抗体を用いたイムノアッセイや、上述した融合Ｖｐｒタンパク質中のレポータータンパク質の活性を測定することによる行うことができる。
【００４７】
典型的な１つの方法としてＧＳＴ−プルダウンアッセイがあり、ＧＳＴと融合したＶｐｒタンパク質及びインポーチンαの何れか一方のタンパク質をコードする遺伝子を、例えばＩＰＴＧで発現誘導が可能な発現ベクターにクローン化する。ＩＰＴＧを添加することによって、この融合タンパク質は、通常、細菌細胞内で発現され、グルタチオン−アガロースビーズ等を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製される。他の一方のタンパク質は、精製されたものでも、あるいは細胞のライセートの何れでもよく、また、放射性同位元素で標識されていてもよい。このＧＳＴ融合タンパク質と、他の一方のタンパク質とを、候補化合物の存在下、グルタチオンアガロースビーズと共にインキュベートし、ビーズから回収したタンパク質複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ウエスタンブロッティング、オートラジオグラフィー、又は上記レポータータンパク質の酵素活性等により検出する。
【００４８】
他の１つの方法としては、レポータータンパク質、例えば、ＧＦＰ類似性の蛍光タンパク質との融合タンパク質を用いるＦＲＥＴ(fluorescence resonance energy transfer)法により、候補化合物の存在下でＶｐｒタンパク質とインポーチンαの相互作用を検出することができる。ＦＲＥＴは励起されたフルオロフォア供与体から、その約６０Å以内にある受容体フルオロフォアへのエネルギー移行現象である。第一のフルオロフォアの励起後に、適当なフィルターを用いて第二のフルオロフォアからの発光を検出するか、または供与体の蛍光半減期を変えることで検出できる(Tsien RY, Annu. Rev. Biochem. 1998, 67, 509-544)。通常用いられている２つのフルオロフォアは、ＧＦＰの変異体であるシアン蛍光タンパク質（cyan fluorescent protein:ＣＦＰ）及び黄色蛍光タンパク質(yellow fluorescent protein:ＹＦＰ）である。
【００４９】
Ｖｐｒタンパク質とインポーチンαとの結合阻害に対する候補化合物の有効性は、既知量の候補化合物の存在下および不存在下でＶｐｒタンパク質がインポーチンαに結合する能力を測定することによって決定することができる。次に、候補化合物の阻止定数（Ｋi）を競合的インヒビターの式から計算することができる。
【００５０】
［ＨＩＶ−１の増殖を阻害する医薬組成物］
本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質は、上述したようにＣＤ４陽性Ｔ細胞のＨＩＶ−１感染を阻害し、及び／又は該ウイルスの増殖を阻害しうることから、ＡＩＤＳの予防及び／又は治療剤として用いることができる。また、本発明のスクリーニング方法により得られる化合物は、ＨＩＶ−１感染阻害剤として用いることができる。そのような医薬組成物は、経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる。
【００５１】
本発明の医薬組成物を経口投与する場合は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等のいずれのものであってもよく、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。また、本発明の医薬を非経口投与する場合は、静脈内注射（点滴を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐剤などの製剤形態を選択することができ、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。
【００５２】
これらの各種製剤は、製剤上通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等などを適宜選択し、常法により製造することができる。
【００５３】
上記各種製剤は、医薬的に許容される担体又は添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。使用される添加物は、本発明の剤型に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択される。
【００５４】
本発明の医薬の投与量は、投与対象の年齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変えることができる。この場合、本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質の有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得る担体との組合せとして投与される有効量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲の投与量を選ぶことができ、好ましくは１日１回から数回に分けて１日以上投与される。
【００５５】
［非感染性ウイルスの製造方法］
上記医薬組成物としての利用のために、本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質を含むＨＩＶ−１を、ドミナントネガティブな形質を有する非感染性ウイルスとして使用することもできる。該ウイルスは本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質のコード領域を含むＨＩＶ−１のプロウイルスＤＮＡを培養細胞に形質転換することにより製造することができる。ＨＩＶ−１のプロウイルスＤＮＡは種々の培養細胞株、例えば、マウス、ミンク、サル、及びヒトの非Ｔ細胞株に形質転換することによってこれらの細胞内でウイルスＲＮＡ及びタンパク質を合成、集合して感染性のウイルス粒子を産生することが知られている(Adachi, A. et al., 1986, Journal of Virology, 59, 284-291参照)。該プロウイルスＤＮＡ中のｖｐｒ遺伝子に特定の変異が導入された変異体ウイルスもまたこれらの細胞を用いて製造することが可能である。あるいは、本発明の変異体Ｖｐｒタンパク質のみをリポソーム等に封入してウイルス様粒子を製造してもよい。抗ＨＩＶｇｐ１２０抗体リポソームに封入して生体内に導入すればＨＩＶ感染細胞特異的な送達も可能である。
【実施例１】
【００５６】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
［種々のプラスミドの構築と変異体Ｖｐｒタンパク質の発現］
Ｖｐｒタンパク質は正規の核移行シグナル（ＮＬＳ）を含んでいないが、ＰＩＣ(preintegration complex)と相互作用して核へ移行し重要な役割を果たす。さらに、Ｖｐｒタンパク質は細胞周期のＭ期へ入るために必要なＣｄｃ２キナーゼの活性化を阻害することによって細胞周期をＧ２期で停止させる。Ｇ２期はウイルスのＬＴＲが最も活性化されるので、この時期に停止した細胞はウイルス産生が増強される。これに対し、Ｖｐｒタンパク質によるアポトーシスの誘導はＧ２期での停止とは独立して起こるものもある。このような多様なＶｐｒタンパク質の生物学的活性は、上述したようにタンパク質の立体構造と関連していることが示唆されている。
【００５７】
そこで、これらの生物学的な活性がＶｐｒタンパク質のどのような構造と関連しているかを確かめるために、以下のような種々の変異体Ｖｐｒタンパク質をコードする発現ベクターを構築した。(i)第２のα−ヘリックスドメイン内にあるヒスチジン（４５番目）とイソロイシン（４６番目）を、それぞれトリプトファンとアラニンに置換したＨＩ４５４６ＷＡ、(ii)第３のα−ヘリックスドメイン内にある、かさ高い非極性のロイシン（６７番目）を小さなアラニンに置換して疎水性の顕著な変化を導入したＬ６７Ａ、(iii)アルギニンに富む領域内にある２つのアルギニン（８７番目と８８番目）をそれぞれグルタミン酸とアラニンに置換したＲ８７８８ＥＡ、(iv) 第３のα−ヘリックスドメイン内にあるロイシン（６７番目）をプロリンに置換してヘリックス構造を破壊したＬ６７Ｐ、及び(v)第１のα−ヘリックスドメイン内にある４つのかさ高い非極性のロイシン（２０、２２、２３、及び２６番目）をそれぞれアラニンに置換し、さらに第３のα−ヘリックスドメイン内にあるロイシン（６７番目）をプロリンに置換したαＬＡＬ６７Ｐ（図１Ａ参照）。
【００５８】
発現ベクターｐＭＥ１８Ｎｅｏに基づいて作製された種々のプラスミド、即ち、Ｆｌａｇ−ｔａｇ配列と接続された野生型Ｖｐｒタンパク質；Ｌ６７Ａ、αＬＡＬ６７Ａ、及びＬ６７Ｐ等のアミノ酸置換変異体；及びコントロールプラスミドｐＭＥ１８Ｎｅｏ−Ｆｌａｇをコードする発現ベクターは既に報告されている(Kamata, M., and Aida, Y., 2000, Journal of Virology, 74, 7179-7186; Nishizawa, M. et al., 1999, Virology, 263, 313-322; Nishizawa, M. et al., 2000, Virology, 276, 16-26参照)。簡単に説明すると、以下に具体的に記載した方法と同様であり、ＰＣＲに基づく部位特異的変異導入キットExSite (Stratagene)と、上記各文献に記載されている所定のプライマーセットを用いてプラスミドｐＳＫ−Ｆｖｐｒに部位特異的な変異を導入した。
【００５９】
変異体Ｒ８７８８ＥＡと、変異体ＨＩ４５４６ＷＡを作製するために、ＰＣＲに基づく部位特異的変異導入キットExSite (Stratagene)を用いてプラスミドｐＳＫ−Ｆｖｐｒに部位特異的な変異を導入した。増幅用に設計したプライマーセットは以下の通りである。
Ｒ８７８８ＥＡ用として：5'-AGGGCAGCAAGAAATGGAGCCAG-3'（配列番号６）及び5'-CTGTCGAGTAACGCCTATTCTGC-3'（配列番号７）、ＨＩ４５４６ＷＡ用として：5'-TATGAAACTTACGGGGATACTTGGG-3'（配列番号８）及び5'-CGCCCATTGTCCTAAGTTATGG-3'（配列番号９）。ｐＳＫ−Ｆｖｐｒ内の変異したｖｐｒとＦｌａｇ配列を含むそれぞれのXhoI-NotI断片を切り出し、ｐＭＥ１８Ｎｅｏにサブクローニングした。
【００６０】
ＨＩＶ−１感染性ＤＮＡクローンｐＮＬ４３２のｖｐｒ遺伝子に種々の変異を導入した変異体分子クローンを作製するために、上述した方法と同様にＰＣＲに基づく部位特異的変異導入キットExSite (Stratagene)を用いて、ＨＩＶ−１感染性ＤＮＡクローンＮＦ４６２のNdeI-SalI断片を含むｐＵＣ１９に部位特異的な変異を導入した。増幅用に設計したプライマーセットは以下の通りである。ΔＶｐｒ用として：5'-GAACAAGCCCCAGAAGACCAAGG-3'（配列番号１０）及び5'-ACCTGTCCTCTGTCAGTTTCCT-3'（配列番号１１）、Ｌ６７Ａ用として：5'-AAGCACTGTTTATCCATTTCAGA-3'（配列番号１２）及び5'-GTTGCAGAATTCTTATTATGG-3'（配列番号１３）、ＨＩ４５４６ＷＡ用として：5'-TATGAAACTTACGGGGATACTTGGG-3'（配列番号８）及び5'-CGCCCATTGTCCTAAGTTATGG-3'（配列番号９）、Ｌ６７Ｐ用として：5'-CAACCCCTGTTTATCCATTTC-3'（配列番号１４）及び5'-TTGCAGAATTCTTATTATGGCTTCC-3'（配列番号１５）、並びにαＬＡ用として：5'-CCGAGGAAGCCAAGAGTGAAGCTGTTAGA-3'（配列番号１６）及び5'-CCGCCTCGGCTGTCCATTCATTGTATGGCTCC-3'（配列番号１７）である。さらにαＬＡＬ６７Ｐの多重置換体を作製するために、上記αＬＡ変異断片を含むｐＵＣ１９と5'-CAACCCCTGTTTATCCATTTC-3'（配列番号１４）及び5'-TTGCAGAATTCTTATTATGGCTTCC-3'（配列番号１５）のプライマーセットを用いた。ｐＵＣ１９内の変異を含むそれぞれのPflMI-SalI断片を切り出し、ｐＮＬ４３２のNdeI-SalI断片を含むｐＳＫにサブクローニングした。
【００６１】
以上作製したすべてのプラスミド構築物は、BigDyeターミネーターサイクルシーケンシングキットとＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１０（ＰＥアプライドバイオシステムズ社）を用いて塩基配列を確認した。変異体Ｖｐｒタンパク質を発現させるための種々のプラスミドの構築を、図１（Ａ）に模式的に示した。
【００６２】
このようにして作製した種々の発現ベクターを用いて種々の細胞を形質転換し、野生型及び種々の変異体Ｖｐｒタンパク質の発現を確認した。宿主細胞として用いたＨｅＬａ細胞、アフリカミドリザルＣＯＳ−１細胞及びヒトＴリンパ球細胞株Jurkatは、２〜１０％の熱処理牛胎児血清（ＦＣＳ）、ペニシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で維持した。ウエスタンブロッティング、免疫蛍光染色、並びにアポトーシス及び細胞周期の検査のために、１×１０７個のＨｅＬａ細胞を２０μｇの各種発現ベクターで形質転換した。形質転換はジーンパルサー（Bio-Rad)を用いたエレクトロポレーションにより、直径０．４ｃｍのキュベット内で３００Ｖ、９７５μＦで操作した。ＣＯＳ−１細胞はウイルス保存液の調製に用いた。
【００６３】
図１（Ａ）に示した６種類のプラスミドをＨｅＬａ細胞に形質転換しそれぞれのタンパク質のアミノ末端領域に存在するFlag-tag配列を認識するモノクローナル抗体Ｍ２を用いて形質転換後２４時間の細胞から抽出したタンパク質を電気泳動しウエスタンブロッティング法により検出した。図１Ｂに示したように、何れの変異体Ｖｐｒタンパク質も検出可能な程度に発現することが分かったが、αＬＡＬ６７Ｐは野生型及び他の変異体タンパク質に比べて多少移動度が遅く、立体構造の違いが示唆された。
【００６４】
［細胞周期の解析］
種々の発現ベクターで形質転換したＨｅＬａ細胞は、４８時間後に回収し、１％ホルムアルデヒド、７０％エタノールで固定した後Flag配列特異的なモノクローナル抗体Ｍ２（Eastman Kodak）で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、細胞をAlexa488と複合化したヤギ抗マウスＩｇＧ（Molecular Probes)と４５分間インキュベートした。その後細胞を再びＰＢＳで洗浄し、ＤＮＡ含量を解析するためのヨウ化プロピジウム（ＰＩ；５０μｇ／ｍｌ）、ＲＮａｓｅＡ（５０μｇ／ｍｌ）及びＦＳＣ（２容量％）を含むＰＢＳ中に３７℃で１５分間インキュベートした。１００００個の細胞の蛍光強度をＦＡＣＳｃａｎシステムとCell Questソフトウエア（何れもBecton-Dickinson社製)により解析した。Alexaが強い蛍光を発光しない細胞を除いてデータを整理した。Ｇ２／Ｍ期の細胞の相対数はModFit LTソフトウエア(Verity Software House)を用いて計算した。
【００６５】
［アポトーシス解析］
アポトーシスの解析のため、フローサイトメトリーを用いてカスパーゼ３活性の２色免疫蛍光染色を行った。２０μｇのＶｐｒ発現プラスミド（野生型又は変異体）で細胞を形質転換後２４時間でＨｅＬａ細胞を回収し１％ホルムアルデヒド、７０％エタノールで固定した後Flag配列特異的なモノクローナル抗体Ｍ２（Eastman Kodak）で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、細胞をAlexa488と複合化したヤギ抗マウスＩｇＧ（Molecular Probes)と４５分間インキュベートした。その後細胞を再びＰＢＳで洗浄し、フィコエリトリン（ＰＥ）と複合化したウサギ抗活性化カスパーゼ３抗体(BD Biosciences)と共に４℃で１時間インキュベートした。１００００個の細胞の蛍光強度をＦＡＣＳｃａｎシステムとCell Questソフトウエア（何れもBecton-Dickinson社製)により解析した。Alexaが強い蛍光を発光しない細胞を除いてデータを整理した。蛍光染色陽性細胞の相対数をパーセンテージで示した。
【００６６】
［細胞内局在性の解析］
種々の変異体Ｖｐｒタンパク質発現ベクターで形質転換したＨｅＬａ細胞は、４８時間以内にカバーガラス上にて１％ホルムアルデヒド−ＰＢＳで氷上１時間固定し、０．２％Triton X-100を含むＰＢＳで１０分間透過処理し、２回ＰＢＳで洗浄した。その後細胞をFlag配列特異的なモノクローナル抗体Ｍ２（Eastman Kodak）、又は通常のマウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、細胞をAlexa488と複合化したヤギ抗マウスＩｇＧ（Molecular Probes)と４５分間インキュベートした。カバーガラスをＰＢＳで洗浄した後スライドガラスの上に載せ共焦点レーザー顕微鏡(LSM510; Carl Zeiss)で観察した。
【００６７】
以上の結果を表１にまとめた。第２のαヘリックスドメイン内にアミノ酸置換を有するＨＩ４５４６ＷＡ変異体は、Ｇ２停止とアポトーシスを誘導する能力を維持していたが核への局在能力を失っていた。Ｖｐｒタンパク質のカルボキシ末端ドメインに変異を有するＲ８７８８ＥＡは核局在及びアポトーシスを誘導することはできたが細胞周期をＧ２期で停止させる活性が損なわれていた。カルボキシ末端の特徴的な塩基性アミノ酸残基は核への局在やアポトーシスにとっては必須でないかもしれない。Ｖｐｒタンパク質の第３のαヘリックスドメインに存在するロイシンをアラニンへ置換した変異体Ｌ６７ＡはＧ２停止を誘導し及び核に局在する活性は維持していたがアポトーシス誘導活性は低下していた。
【００６８】
次にこれらの変異体Ｖｐｒタンパク質を含むウイルスの複製（増殖）について、３人のドナーから採取した活性化されたＣＤ４陽性Ｔ細胞初代培養細胞を用いて比較した。３〜４日間隔で培養液上清を回収し、その中に含まれるｐ２４抗原量をＥＬＩＳＡにより定量してウイルスの増殖を調べた結果を表１に示した。野生型Ｖｐｒを含むウイルスについては、高感染力価（５ｎｇのｐ２４抗原相当量）及び低感染力価（０．５ｎｇのｐ２４抗原相当量）の何れの場合も感染性を有し、培養後２１日で最も増殖した。ｖｐｒ遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧを欠失させたΔＶｐｒ変異体ウイルスは増殖速度の低下が認められた。核局在機能を失ったＨＩ４５４６ＷＡ変異体やＧ２停止機能の低下したＲ８７８８ＥＡ変異体についてもΔＶｐｒ変異体ウイルスと同様に増殖速度が低下していた。これに対し、Ｇ２停止機能及び核局在性を共に維持しているＬ６７Ａ変異体は野生型ウイルスと同じ増殖速度を有していた。これらの結果は、アポトーシス誘導機能ではなく、核への局在性及びＧ２停止機能が、高感染力価及び低感染力価の何れの場合もＣＤ４陽性Ｔ細胞中におけるウイルスの増殖に重要なことが示唆された。
【００６９】
【表１】
【００７０】
［変異体Ｖｐｒタンパク質を発現するＨＩＶ−１のＣＤ４陽性Ｔ細胞への感染と増殖］
ウイルス保存液の調製は以下の２つの方法で行った。第一の方法は、ＦｕＧＥＮＥ６（ロシュダイアグノスティクス）を用いた。形質転換するＤＮＡは無血清のダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；ＧＩＢＣＯ）で１：１０（ｗ／ｖ）で希釈し、ＦｕＧＥＮＥ６試薬は２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液で１：２で希釈して室温で５分間インキュベートした。これらを混合し室温にて少なくとも１５分間インキュベートした。このＤＮＡ複合体を新鮮な培地中のＣＯＳ−１細胞に添加し、３７℃で５％ＣＯ２条件下４時間インキュベートした。培地を新鮮なものに置換した後７２時間培養を継続した。第二の方法としては、エレクトロポレーション法を用いた。ＣＯＳ−１細胞はＰＢＳで洗浄した後、１×Ｋ−ＰＢＳ（１０×Ｋ−ＰＢＳ緩衝液は３０８ｍＭのＮａＣｌ、１２０７ｍＭのＫＣｌ、８１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、及び１４６ｍＭのＫＨ２ＰＯ４を含む）中に１×１０７個／ｍｌの濃度の細胞と３０μｇ／μｌのプラスミドＤＮＡを添加して再懸濁した。細胞はジーンパルサー(gene pulsar;Bio-Rad)を用いて２６０Ｖ，９７０μＦで操作されたキュベット内にて形質転換した。その後、細胞は新鮮な培地中で３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。上記のような方法でＤＮＡを導入した後７２時間で培養上清を回収し、０．４５μｍのポアサイズのフィルターでろ過した。
【００７１】
このようにして調製したウイルス保存液の感染力価は、それぞれの培養上清中に存在するｐ２４抗原量に基づいて測定した。測定は、２種類の抗体、即ち、ｐ２４特異的モノクローナル抗体（Ｎｕ２４）とパーオキシダーゼ標識モノクローナル抗体（１０Ｂ５）の組み合わせた酵素免疫法（ＥＬＩＳＡ）により行った。
【００７２】
ＣＤ４陽性Ｔ細胞の調製は次のように行った。ＨＩＶ−１血清陰性健常人ドナーからフィコールグラジエント法により末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。回収したＰＢＭＣを２度洗浄した後、ＣＤ１４特異的モノクローナル抗体(MACS system, Militenyi Biotec)でコートしたマイクロビーズを用いて磁気細胞分離システムにより単球(monocyte)を除去した。単球を除去した後、Ｔ細胞カラムを用いてＣＤ４陽性Ｔ細胞をＣＤ１４陰性ＰＢＭＣから分離した(Tsunetsugu-Yokota et al 2003 J.Virol. 77, 10250-10259参照）。このようにして単離したＣＤ４陽性Ｔ細胞（純度９５〜９８％）をＣＤ３特異的及びＣＤ２８特異的モノクローナル抗体とＩＬ２存在下（２０Ｕ／ｍｌ；ジェンザイム社製）で３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養して活性化した。
【００７３】
ＣＤ４陽性Ｔ細胞を０．５ｎｇ又は５ｎｇのｐ２４抗原を含む種々の希釈ウイルス保存液に３７℃で２時間暴露した。細胞を３回洗浄した後、感染細胞（５×１０５個／ｍｌ）を４８ウェル組織培養用プレート（コーニング社）に植えつけ、１０％牛胎児血清と２０Ｕ／ｍｌのＩＬ２を含むＲＰＭＩ１６４０培地で維持した。３〜４日間隔で培養上清を回収し、上清中に産生されたウイルス量をＨＩＶ−１ｐ２４ｇａｇＥＬＩＳＡキット(RETRO TEC)を用いてｐ２４抗原量の経時的な定量によりモニターした。
【００７４】
図２は、野生型又は種々の変異体Ｖｐｒタンパク質をコードしたウイルス（０．５ｎｇのｐ２４抗原相当量）により感染したＣＤ４陽性活性化Ｔ細胞の増殖キネティクスを示す。感染後３週間におけるウイルス産生の様子を３〜４日ごとに培養上清に存在するｐ２４抗原量を指標としてモニターした。その結果、図２に示したように野生型又はＨＩ４５４６ＷＡ変異体では経時的にウイルス産生が認められたがＬ６７Ｐ及びαＬＡＬ６７Ｐ変異体ウイルスではほとんどウイルスの産生が認められず、ＣＤ４陽性Ｔ細胞において増殖できないことが示された。ここで重要なことは、Ｖｐｒタンパク質を欠損した変異体ウイルスにおいては感染後１０日目あたりから多少のウイルス産生が検出されたのに対し、本発明に係るＬ６７Ｐ及びαＬＡＬ６７Ｐ変異体Ｖｐｒタンパク質をコードするウイルスではほとんどウイルスの産生が検出されなかったことである。即ち、これらの変異体Ｖｐｒタンパク質は細胞内におけるウイルスの複製を阻害している可能性があり、ＨＩＶ−１の感染に対するドミナントネガティブな阻害剤となりうることが強く示唆された。
【００７５】
これらの結果を以下の表２にまとめた。ＨＩ４５４６ＷＡ変異体はＨｅＬａ細胞では細胞質全体に存在するがJurkat細胞やＣＤ４陽性Ｔ細胞では核内に移行する。従って、活性化されたＣＤ４陽性Ｔ細胞中にはＶｐｒタンパク質を核内へ移行させる何らかの細胞質因子の存在することが明らかとなった。一方、Ｌ６７Ｐ変異体やαＬＡＬ６７Ｐ変異体は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞中に存在するこれらの核移行のための細胞質因子との相互作用が阻害され、核へ移行することができないためにウイルスの感染能力が損なわれた可能性がある。あるいは、これらの変異体Ｖｐｒタンパク質はＣＤ４陽性Ｔ細胞中の別の細胞質因子と相互作用することによって細胞質に留まると共に、この細胞質因子の核への移行を阻害することによってウイルスの感染能力を抑制することも考えられる。
【００７６】
【表２】
【実施例２】
【００７７】
［組換えタンパク質の調製］
ＧＳＴタグ及びＧＦＰと融合した種々のＶｐｒタンパク質の構築方法は、基本的に以下に示した具体例と同様の方法により行った。すなわち、ＧＳＴタグと、αＬＡ変異を有する部分Ｖｐｒタンパク質Ｎ１７Ｃ７４と、ＧＦＰとの融合タンパク質は、プラスミドｐＳＫ−ＦαＬＡを鋳型として、プライマー5'-GCGGATATCCGAATGGACAGCCGA-3'（配列番号１８）及び5'-CGCGGATCCCCAATTCTGAAA-3'（配列番号１９）を用いて増幅した。増幅したＤＮＡ断片はプラスミドｐＧＥＸ−６Ｐ３のＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ部位にサブクローン化した。このようにして作製した種々のＧＳＴタグ付加変異体Ｖｐｒタンパク質の発現プラスミドは、大腸菌ＮｏｖａＢｌｕｅ株（ノバジェン社）を用いて発現した。組換え大腸菌を１６℃にて一晩培養した後、菌体を集め、回収した菌体を超音波処理にて溶菌し、上清中のＧＳＴタグ付加タンパク質をグルタチオンセファロース４Ｂ（アマシャムファルマシアバイオテック社）に吸着させた。吸着したタンパク質を１６ｍＭのグルタチオン溶液にて溶出し、核移行解析用バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ８ｐＨ７．３）、１１０ｍＭ酢酸カリウム、２ｍＭ酢酸マグネシウム、５ｍＭ酢酸ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＤＴＴ）に対して透析し、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（ザルトリウス社の商品名）を用いて遠心濃縮した。
【００７８】
組み換え型インポーチンα及びβは、Ｎ末端側にＧＳＴを持つ融合タンパク質として大腸菌ＢＬ２１コドンプラス（ＤＥ３）−ＲＩＬ株（ストラタジーン社）で発現させ、グルタチオンセファロース４Ｂに吸着した後、プロテアーゼにてＧＳＴを切断除去した。また、ＳＶ４０−ＮＬＳはＮ末端側にＧＳＴ，Ｃ末端側にＧＦＰを持つ融合タンパク質として、Ｖｐｒタンパク質と同様の方法で調製した。
【００７９】
［Ｖｐｒの核移行におけるインポーチンα及びβの役割］
In vitroでの核移行アッセイは、ジギトニン処理ＨｅＬａ細胞とＶｐｒ、ＳＶ４０−ＮＬＳの精製タンパク質と細胞由来の細胞質画分を用いて行った。ＨｅＬａ細胞を核移行解析用バッファー中、氷冷下で５分間、２５μｇ／ｍｌジギトニン（Fluka AG)で処理して透過性にした。核移行解析用バッファー中に終濃度で１μＭとなるように添加したＧＦＰ融合タンパク質を含む４０μｌの試験サンプルを用いた。この４０μｌの試験サンプル中には、組み換えインポーチンα、及びβの存在比を変えて添加した。核移行反応は３０℃で、３０分間進行させた後、氷冷した核移行解析用バッファーで細胞を２回洗浄し、１％ホルムアルデヒドを含む核移行解析用バッファー中、氷上で３０分間固定した。このようにして作成した標本を共焦点レーザースキャニング顕微鏡（ラディアンス２１００、バイオラッド）で調べた。また、Ｖｐｒ及びＳＶ４０−ＮＬＳと、インポーチンα及びβとの結合をプルダウンアッセイにより解析した。
【００８０】
Ｖｐｒの核移行能と、Ｖｐｒとインポーチンα及びβとの結合能との相関性を、典型的な核移行を示すＳＶ−４０のＮＬＳと比較した。その結果、Ｖｐｒはインポーチンβの量依存的に核移行能が抑制され、同時にインポーチンαとの結合が失われる競合阻害が認められた（図３（ａ））。この結果はＳＶ−４０のＮＬＳとは異なり、Ｖｐｒがインポーチンα単独で促進される核移行機序を有する事を示している。即ち、Ｖｐｒはインポーチンαとの結合を介して核移行するが、インポーチンβがある一定量以上存在すると、βがインポーチンαと結合してＶｐｒとの結合を奪うため、Ｖｐｒとインポーチンαとの結合が弱くなることが明らかとなった。
【００８１】
次に、インポーチンα側のインポーチンβ結合ドメイン（ＩＢＢドメイン）を欠失した変異体ΔＩＢＢインポーチンαを用いて同様の解析を行った（図３（ｂ））。ＶｐｒはΔＩＢＢインポーチンαと結合し、野生型インポーチンαで観察されたようなインポーチンβの量依存的な結合の阻害は認められなかった。核移行解析では、予想と反して、インポーチンβとは結合するはずのないΔＩＢＢインポーチンαでＶｐｒの核移行がβにより阻害された。一方、ＮＬＳの核移行は認められなかった。一つの細胞を拡大して断片の蛍光強度でＶｐｒの局在を解析すると、Ｖｐｒに特徴的な核膜局在はインポーチンβの量依存的に阻害された。この結果から、インポーチンβはＶｐｒの核膜への局在を阻害する可能性が考えられた。
【００８２】
［核移行の蛍光イメージング解析］
ＧＦＰ融合Ｎ１７Ｃ７４、あるいはその変異体の精製タンパク質を最終分化マクロファージの細胞内にマイクロインジェクションした細胞は培養液中で生きたまま使用し、蛍光タンパク質の挙動を蛍光顕微鏡、高解像度ＣＣＤカメラを用いて経時的に１５分間観察した。その結果を図４に示した。マイクロインジェクション後約１分でＮ１７Ｃ７４は生細胞内で核移行したが、インポーチンαとの結合能を失った変異体（αＺＬＡ）、核膜局在を失った変異体（Ｌ６７Ｐ）、その両方を失った変異体（αＬＡ／Ｌ６７Ｐ）は全く核移行しなかった。従って、Ｖｐｒの核移行はインポーチンαとの結合と、核膜への局在のいずれかを失うことで阻害されることが示唆された。
【００８３】
［変異体ウイルスによるマクロファージへの感染実験］
インポーチンαとの結合及び核膜局在を失った上記ｖｐｒ変異体をマクロファージ指向性感染性ＤＮＡクローンｐＮＦ４６２のｖｐｒ遺伝子に組み換えたウイルスを、ＣＯＳ−１細胞を用いて産生させた。各々のウイルス量をｐ２４値で揃えて、３名のドナー由来の最終分化マクロファージに感染させ、その感染性を培養上清中に放出されたｐ２４抗原量で測定した。その結果を図５に示した。インポーチンαとの結合性を失ったαＬＡ変異体ウイルス（◇）及び核膜局在を失ったＬ６７Ｐ変異体ウイルス（△）は、Ｖｐｒの欠失変異体と同様、３人のドナーすべてにおいて野生型ウイルスと比較してウイルスの増殖が著しく減少していた。これらの結果より、インポーチンαとの結合能を失ったＶｐｒ変異体を有するＨＩＶ−１はマクロファージへの感染効率を失うか、あるいは著しく低下することが明らかとなった。従って、ＨＩＶ−１のマクロファージへの感染は、Ｖｐｒとインポーチンαとの結合を阻害することによって、Ｖｐｒの核移行を抑止することで阻止できることが示唆された。
【００８４】
［結論及び考察］
Ｖｐｒの核移行には、インポーチンαとの結合と核膜局在が必要であることが示唆された。また、インポーチンαの結合あるいは核膜局在の片方でも失ったＶｐｒ変異ＨＩＶ−１はマクロファージ感染効率が著しく低下する事から、マクロファージへの感染はＶｐｒの核移行および核膜局在を消失するだけで、阻止できることが示唆された。これらの事実はＶｐｒとインポーチンαの結合を標的とした新規抗ＨＩＶ−１薬の開発が可能である事を示唆している。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】変体Ｖｐｒタンパク質の構築（Ａ）とＨｅＬａ細胞で発現させたタンパク質をウエスタンブロッティングにより検出した結果（Ｂ）である。
【図２】種々の変異体Ｖｐｒタンパク質を発現するＨＩＶ−１ウイルスを感染させたＣＤ４陽性Ｔ細胞におけるウイルス増殖をモニターしたグラフである。
【図３】Ｖｐｒの核移行をin vitroでの核移行アッセイにより解析した結果である。（ａ）Ｖｐｒとインポーチンαの結合を介した核移行はインポーチンβの量依存的に抑制されることを示す。（ｂ）ＶｐｒはΔＩＢＢインポーチンαと結合し核移行するが、インポーチンβはその過程だけでなくＶｐｒの核膜局在をも阻害することを示す。
【図４】最終分化マクロファージへマイクロインジェクションしたＶｐｒ及びその変異体のイメージング解析の結果である。
【図５】変異体ウイルスを用いたマクロファージへの感染実験の結果である。マクロファージへの感染はＶｐｒの核移行及び核膜局在を消失するだけで阻止される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト免疫不全症ウイルス１型（ＨＩＶ−１）Ｖｐｒタンパク質のα−ヘリックス領域内に少なくとも１つの突然変異を有し、前記突然変異によって少なくとも１つのα-ヘリックス構造が不安定化された変異体Ｖｐｒタンパク質を含むことを特徴とするＨＩＶ−１の増殖阻害剤。
【請求項２】
前記突然変異は、Ｖｐｒタンパク質のＮ末端から６０番目のイソロイシン、６７番目のロイシン、７４番目のイソロイシン、及び８１番目のイソロイシンからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸がα-ヘリックス構造を不安定化するアミノ酸又は側鎖の性質を変化させるアミノ酸で置換されることである請求項１に記載の阻害剤。
【請求項３】
前記変異体Ｖｐｒタンパク質が以下の（ａ）又は（ｂ）からなる請求項１又は２に記載の阻害剤：
（ａ）Ｖｐｒタンパク質のＮ末端から６７番目のロイシン、及び／又は７４番目のイソロイシンがプロリンに置換された変異体Ｖｐｒタンパク質、
（ｂ）（ａ）のタンパク質のＮ末端から６７番目及び７４番目以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたタンパク質であって、且つＨＩＶ−１の増殖を阻害する活性を有する変異体Ｖｐｒタンパク質。
【請求項４】
前記変異体Ｖｐｒタンパク質が、配列番号３〜５の何れかに示したアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたタンパク質であって、且つＨＩＶ−１の増殖を阻害する活性を有する請求項１に記載の阻害剤。
【請求項５】
ＨＩＶ−１のＶｐｒタンパク質のＮ末端から６０番目のイソロイシン、６７番目のロイシン、７４番目のイソロイシン、及び８１番目のイソロイシンからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸が、α-ヘリックスを不安定化するアミノ酸又は側鎖の性質を変化させるアミノ酸へ置換されたことを特徴とする変異体Ｖｐｒタンパク質。
【請求項６】
前記α-ヘリックスを不安定化するアミノ酸がチロシン、アスパラギン、プロリン、又はグリシンである請求項５に記載の変異体Ｖｐｒタンパク質。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の変異体Ｖｐｒタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の組換えベクターを含んでなる形質転換細胞。
【請求項１０】
請求項５又は６に記載の変異体Ｖｐｒタンパク質のコード領域を含むＨＩＶ−１のプロウイルスＤＮＡを培養細胞に形質転換する工程と、前記形質転換細胞の培養上清より変異体ＨＩＶ−１を回収する工程と、を含むことを特徴とする非感染性ウイルスの製造方法。
【請求項１１】
ヒト免疫細胞へのＨＩＶ−１感染を阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、候補化合物の存在下においてＶｐｒタンパク質とインポーチンαとを接触させ、Ｖｐｒタンパク質がインポーチンαと結合するか否かを検出すること、
を含み、前記Ｖｐｒタンパク質とインポーチンαとの結合を阻害する化合物がヒト免疫細胞へのＨＩＶ−１感染を阻害することを特徴とする方法。
【請求項１２】
ヒト免疫細胞へのＨＩＶ−１感染を阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、候補化合物の存在下においてＶｐｒタンパク質を前記ヒト免疫細胞に導入し、Ｖｐｒタンパク質が核膜に局在するか否かを検出すること、
を含み、前記Ｖｐｒタンパク質の核膜局在を阻害する化合物がヒト免疫細胞へのＨＩＶ−１感染を阻害することを特徴とする方法。
【請求項１３】
前記Ｖｐｒタンパク質が、配列番号１に示したアミノ酸配列の１７〜７４番目のアミノ酸残基によって形成されるα−ヘリックス領域を含む部分Ｖｐｒタンパク質、又は融合Ｖｐｒタンパク質である請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｖｐｒタンパク質が、配列番号１に示したアミノ酸配列の１７〜３４番目のアミノ酸残基によって形成されるα−ヘリックス領域を含む部分Ｖｐｒタンパク質、又は融合Ｖｐｒタンパク質である請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｖｐｒタンパク質が、配列番号１に示したアミノ酸配列の５６〜７７番目のアミノ酸残基によって形成されるα−ヘリックス領域を含む部分Ｖｐｒタンパク質、又は融合Ｖｐｒタンパク質である請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記融合Ｖｐｒタンパク質が、タグペプチド、及び／又はレポータータンパク質を含む請求項１３〜１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記免疫細胞が、マクロファージである請求項１１〜１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１１〜１７の何れか一項に記載の方法により得られることを特徴とするＨＩＶ−１感染阻害剤。
【請求項１９】
請求項１〜４の何れか一項に記載のＨＩＶ−１の増殖阻害剤若しくは請求項８に記載の組換えベクター、又は請求項１８に記載のＨＩＶ−１感染阻害剤を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２０】
ＡＩＤＳの予防及び／又は治療用である請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項１】
ヒト免疫不全症ウイルス１型（ＨＩＶ−１）Ｖｐｒタンパク質のα−ヘリックス領域内に少なくとも１つの突然変異を有し、前記突然変異によって少なくとも１つのα-ヘリックス構造が不安定化された変異体Ｖｐｒタンパク質を含むことを特徴とするＨＩＶ−１の増殖阻害剤。
【請求項２】
前記突然変異は、Ｖｐｒタンパク質のＮ末端から６０番目のイソロイシン、６７番目のロイシン、７４番目のイソロイシン、及び８１番目のイソロイシンからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸がα-ヘリックス構造を不安定化するアミノ酸又は側鎖の性質を変化させるアミノ酸で置換されることである請求項１に記載の阻害剤。
【請求項３】
前記変異体Ｖｐｒタンパク質が以下の（ａ）又は（ｂ）からなる請求項１又は２に記載の阻害剤：
（ａ）Ｖｐｒタンパク質のＮ末端から６７番目のロイシン、及び／又は７４番目のイソロイシンがプロリンに置換された変異体Ｖｐｒタンパク質、
（ｂ）（ａ）のタンパク質のＮ末端から６７番目及び７４番目以外の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたタンパク質であって、且つＨＩＶ−１の増殖を阻害する活性を有する変異体Ｖｐｒタンパク質。
【請求項４】
前記変異体Ｖｐｒタンパク質が、配列番号３〜５の何れかに示したアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたタンパク質であって、且つＨＩＶ−１の増殖を阻害する活性を有する請求項１に記載の阻害剤。
【請求項５】
ＨＩＶ−１のＶｐｒタンパク質のＮ末端から６０番目のイソロイシン、６７番目のロイシン、７４番目のイソロイシン、及び８１番目のイソロイシンからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸が、α-ヘリックスを不安定化するアミノ酸又は側鎖の性質を変化させるアミノ酸へ置換されたことを特徴とする変異体Ｖｐｒタンパク質。
【請求項６】
前記α-ヘリックスを不安定化するアミノ酸がチロシン、アスパラギン、プロリン、又はグリシンである請求項５に記載の変異体Ｖｐｒタンパク質。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の変異体Ｖｐｒタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の組換えベクターを含んでなる形質転換細胞。
【請求項１０】
請求項５又は６に記載の変異体Ｖｐｒタンパク質のコード領域を含むＨＩＶ−１のプロウイルスＤＮＡを培養細胞に形質転換する工程と、前記形質転換細胞の培養上清より変異体ＨＩＶ−１を回収する工程と、を含むことを特徴とする非感染性ウイルスの製造方法。
【請求項１１】
ヒト免疫細胞へのＨＩＶ−１感染を阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、候補化合物の存在下においてＶｐｒタンパク質とインポーチンαとを接触させ、Ｖｐｒタンパク質がインポーチンαと結合するか否かを検出すること、
を含み、前記Ｖｐｒタンパク質とインポーチンαとの結合を阻害する化合物がヒト免疫細胞へのＨＩＶ−１感染を阻害することを特徴とする方法。
【請求項１２】
ヒト免疫細胞へのＨＩＶ−１感染を阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、候補化合物の存在下においてＶｐｒタンパク質を前記ヒト免疫細胞に導入し、Ｖｐｒタンパク質が核膜に局在するか否かを検出すること、
を含み、前記Ｖｐｒタンパク質の核膜局在を阻害する化合物がヒト免疫細胞へのＨＩＶ−１感染を阻害することを特徴とする方法。
【請求項１３】
前記Ｖｐｒタンパク質が、配列番号１に示したアミノ酸配列の１７〜７４番目のアミノ酸残基によって形成されるα−ヘリックス領域を含む部分Ｖｐｒタンパク質、又は融合Ｖｐｒタンパク質である請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｖｐｒタンパク質が、配列番号１に示したアミノ酸配列の１７〜３４番目のアミノ酸残基によって形成されるα−ヘリックス領域を含む部分Ｖｐｒタンパク質、又は融合Ｖｐｒタンパク質である請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｖｐｒタンパク質が、配列番号１に示したアミノ酸配列の５６〜７７番目のアミノ酸残基によって形成されるα−ヘリックス領域を含む部分Ｖｐｒタンパク質、又は融合Ｖｐｒタンパク質である請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記融合Ｖｐｒタンパク質が、タグペプチド、及び／又はレポータータンパク質を含む請求項１３〜１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記免疫細胞が、マクロファージである請求項１１〜１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１１〜１７の何れか一項に記載の方法により得られることを特徴とするＨＩＶ−１感染阻害剤。
【請求項１９】
請求項１〜４の何れか一項に記載のＨＩＶ−１の増殖阻害剤若しくは請求項８に記載の組換えベクター、又は請求項１８に記載のＨＩＶ−１感染阻害剤を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２０】
ＡＩＤＳの予防及び／又は治療用である請求項１９に記載の医薬組成物。
【図２】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００６−６７９９４（Ｐ２００６−６７９９４Ａ）
【公開日】平成１８年３月１６日（２００６．３．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５４１６１（Ｐ２００５−５４１６１）
【出願日】平成１７年２月２８日（２００５．２．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１６年１１月１日 第５２回日本ウイルス学会学術集会発行の「第５２回 日本ウイルス学会学術集会プログラム・抄録集」に発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００４年１１月２０日 日本エイズ学会発行の「日本エイズ学会誌（季刊）第６巻第４号」に発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００４年１２月９日から１２月１１日 日本エイズ学会主催の「第１８回 日本エイズ学会学術集会・総会」において文書をもって発表
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月１６日（２００６．３．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月２８日（２００５．２．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１６年１１月１日 第５２回日本ウイルス学会学術集会発行の「第５２回 日本ウイルス学会学術集会プログラム・抄録集」に発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００４年１１月２０日 日本エイズ学会発行の「日本エイズ学会誌（季刊）第６巻第４号」に発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００４年１２月９日から１２月１１日 日本エイズ学会主催の「第１８回 日本エイズ学会学術集会・総会」において文書をもって発表
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]