ＨＩＶＶＰＲ−特異的Ｔ細胞受容体
本発明は、ＨＩＶタンパク質ｖｐｒのＡＬ９エピトープ（ＡＩＩＲＩＬＱＱＱＬ）に結合する、1つ又はそれ以上のアミノ酸置換を有しているＴＣＲｓを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００９年３月２５日出願の、米国仮特許出願第６１／１６３，４２１号の優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に取り込まれている。
【背景技術】
【０００２】
ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウィルス）感染を治療するための現在の取り組みは、主にウィルスの複製又は感染性を制限することを目的としているが、潜伏ウィルス又はウィルス感染細胞を標的にしていない。ＨＩＶの早い突然変異速度の結果、潜伏ウィルス保有宿主から現れる薬剤耐性変異株が治療患者に疾患の進展及び他の個体への感染を引き起こしている。通常、感染経過の間に生じるＣＴＬ（Cytotoxic T Lymphocyte:細胞傷害性Ｔリンパ球）応答からウィルスがエスケープすることを幾つかの研究が示している。エスケープ変異株は、ＭＨＣ(Major Histocompatibility Complex:主要組織適合遺伝子複合体)に結合するために重要な位置、又はＴＣＲ（T Cell Receptor:Ｔ細胞受容体）とペプチド−ＭＨＣ複合体との相互作用に関与する位置における配列変異の選択を通して生じ得る。これらウィルスのＣＴＬエスケープ変異を避けることは、有効なＣＴＬ応答を誘発するために、そしてＨＩＶ−１に対するワクチンを開発するために重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
従って、広範なＨＩＶばかりでなく感染経過の間に進展する変異株も効果的に標的にする治療薬が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
(発明の概要)
本発明者らは、それらの同族ＭＨＣ複合体中に存在しているときに、ＨＩＶのｖｐｒ（viral protein R:ウィルスタンパク質Ｒ）タンパク質に由来するペプチドと結合するＴＣＲ分子を見出した。特に本発明者らは、得られたＰＣＲ分子が、コンセンサスｖｐｒペプチドエピトープとはなおも結合している一方で、ｖｐｒペプチドエピトープの変異株と結合できるように、これらのＴＣＲ内に変異を行った。
特定の実施態様では、本発明者らは、ｖｐｒのＡＬ９コンセンサスエピトープ（ＡＩＩＲＩＬＱＱＱＬ、アミノ酸５９〜６７）に向上した結合親和性で結合する一方、このエピトープの通常の変異体とも結合する突然変異体ＴＣＲｓを作成した。
【０００５】
従って、一態様では、本発明は、図１に記載の野生型ＴＣＲＶα又はＶβ配列内に少なくとも１つの突然変異を含有している、ＨＩＶ−１ ｖｐｒ由来のＨＩＶエピトープと特異的に結合する単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供する。
一実施態様では、この突然変異は、ＴＣＲの生産性、安定性、特異的結合活性、或いは機能的な活性を増大する。
別の実施態様では、突然変異は、野生型のＴＣＲと比較してＴＣＲ突然変異体の非特異的結合を減少する。
特定な実施態様では、ＴＣＲは単鎖ＴＣＲ又はヘテロ二量体ＴＣＲである。
一実施態様では、ＴＣＲは１つ以上のＴＣＲ結合ドメインを含有している。
【０００６】
一実施態様では、本発明のＴＣＲｓはｖｐｒのＡＬ９ペプチド（ＡＩＩＲＩＬＱＱＬ）を認識する。
別の実施態様では、ＡＬ９ペプチドはＨＬＡ（Human Leukocyte Antigen：ヒト白血球抗原）−Ａ２と関連して存在している。
【０００７】
一実施態様では、ＴＣＲのＴＣＲＶα鎖のアミノ酸残基３９に突然変異がある。
別の実施態様では、ＴＣＲＶα鎖のアミノ酸残基９３に突然変異がある。
特定の実施多様では、アミノ酸残基３９の突然変異は、ＳｅｒからＰｒｏへである。
別の特定の実施多様では、アミノ酸残基９３の突然変異は、ＴｙｒからＨｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ，Ｇｌｎ、又はＡｌａへである。
【０００８】
別の実施態様では、本発明のＴＣＲｓは１つ又はそれ以上のＨＩＶ−１ｖｐｒ ＡＬ９ペプチド変異体と特異的に結合する。
一実施態様では、本発明のＴＣＲｓはＨＩＬＡ−Ａ２に関連してＡＬ９ペプチド変異体を結合する。
関連する実施態様では、ＡＬ９ペプチド変異体は、ＡＬ９ペプチド配列内に１つ又はそれ以上のアミノ酸変化を含有している。
【０００９】
別の実施態様では、本発明のＴＣＲｓは、野生型ＴＣＲと比べて高温における優れた安定性を有している。
本発明の好ましい実施態様では、ＴＣＲは可溶性である。
【００１０】
特定の実施態様では、本発明は、ＨＩＶ−１ ｖｐｒ由来のＡＬ９ペプチドに特異的に結合する単離された単鎖のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供する。
一実施態様では、ｓｃＴＣＲはＡＬ９エピトープを認識する。
一実施態様では、ｓｃＴＣＲは、図１に記載の野生型配列と比較してＶα鎖に１つ又はそれ以上の突然変異を有している。
【００１１】
別の実施態様では、ＴＣＲは更に、機能的ポリペプチドドメイン、診断用／画像化試薬、薬剤含有ナノ粒子、治療薬、細胞毒性薬又は抗ウィルス剤を含有している。
典型的な実施態様では、機能的ポリペプチドドメインは、サイトカイン、免疫グロブリンドメイン、受容体ドメイン又はポリペプチドタグ配列を含有している。
別の典型的な実施態様では、サイトカインはＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロンを含有し、免疫グロブリンドメインはＩｇＧ１定常領域又はＩｇＦｃドメイン、又はこれらの断片を含有している。
別の典型的な実施態様では、ポリペプチドタグはｂｉｒＡ配列を含有している。
【００１２】
別の実施態様では、ＴＣＲは更に、ＴＣＲの細胞表面発現を可能にする膜貫通ドメインを含有している。
一実施態様では、ＴＣＲは更に、細胞質ドメインを含有していて、ここで細胞質ドメインはＴＣＲ突然変異体とＨＩＶエピトープの間の相互作用に応答する細胞内シグナル伝達を許容する。
一実施態様では、ＴＣＲは、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ８、４−１ＢＢ、Ｏｘ−４０、ＩＣＯＳ及び／又はＬｃｋタンパク質に由来する膜貫通及び／又は細胞質シグナル伝達ドメインを含有している。
或いは、ＴＣＲは、ＴＣＲ膜貫通及び／又はＴＣＲ細胞質シグナル伝達ドメインを含有してもよい。
多種の可溶性及び膜結合性融合タンパク質が既に開示されている（Card et al. 2004 Cancer Immunol Immunother. 53:345; Mosquera et al. 2005 J. Immunol. 174:4781; Zhu X et al. 2006 J. Immunol. 176:3223; Belmont et al. 2006 Clin. Immunol. 121:29; Finney et al. 2004. J. Immunol. 172: 104; Brentjens et al. 2007 Clin Cancer Res. 13, 5426; Zhang et al. 2004. Cancer Gene Therapy 11, 487）。
【００１３】
別の実施態様では、突然変異は更に、野生型のＴＣＲと比較して、ＨＩＶエピトープ提示細胞を検出するＴＣＲの活性を増大する。
別の実施態様では、突然変異は、野生型のＴＣＲと比較して、ＨＩＶエピトープ提示細胞に対するＴＣＲの細胞傷害機能活性を増大する。
【００１４】
別の実施態様では、本発明は、本発明のＴＣＲｓ、例えば図２に示されているようなものをコードする核酸分子を提供する。
一実施態様では、本発明は、本発明の核酸分子を含有している発現ベクターを提供する。
更に別の関連する実施態様では、本発明は、本発明の発現ベクターを含有している宿主細胞を提供する。
一実施態様では、宿主細胞は哺乳動物の宿主細胞、例えば、ヒトの細胞である。
【００１５】
一態様では、本発明は、細胞を本発明のＴＣＲと接触させること及びＴＣＲが細胞と結合するか否かを確認すること（ここで、細胞と結合するＴＣＲはＨＩＶ感染を示唆する）によって、ＨＩＶに感染している細胞を検出する方法を提供する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、細胞を本発明のＴＣＲと接触させて、それによってＨＩＶに感染している細胞を死滅することによって、ＨＩＶに感染している細胞を死滅する方法を提供する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、個体から生体サンプルを得ること、及び生体サンプルを本発明のＴＣＲと接触させること（ここでＴＣＲが生体サンプルと結合することは対象がＨＩＶに感染していることを示唆する）によって、対象がＨＩＶに感染しているか否かを確認する方法を提供する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、個体に本発明のＴＣＲ又は核酸、本発明のベクター、又は本発明の宿主細胞を投与し、それによって対象を治療することによる、ＨＩＶを有している対象を治療する方法を提供する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、個体に本発明のＴＣＲ、本発明の核酸或いはベクター、又は本発明の宿主細胞を投与し、それによって対象におけるＨＩＶ感染を阻害することによる、対象におけるＨＩＶ感染を阻害する方法を提供する。
【００２０】
関連する実施態様では、方法は更に、ＨＩＶ感染の危険性が高い対象を同定することを含有している。
【００２１】
別の態様では、本発明は、本発明のＴＣＲ及び薬学的に許容される担体を含有している医薬組成物を提供する。
【００２２】
別の態様では、本発明は、本発明のＴＣＲ及び使用説明書を含有しているキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】図１Ａは、ＡＬ９ｓｃＴＣＲ野生型タンパク質配列を示す（ＣＤＲｓはイタリック体）。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＡＬ９ｓｃＴＣＲの単一突然変異体（Ｙ９３Ｈ）タンパク質配列を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＡＬ９ｓｃＴＣＲの二重突然変異体（Ｓ３９Ｐ、Ｙ９３Ｈ）タンパク質配列を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ＡＬ９ｓｃＴＣＲ野生型の核酸配列を示す（ＣＤＲｓはイタリック体）。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＡＬ９ｓｃＴＣＲの単一突然変異体の核酸配列を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＡＬ９ｓｃＴＣＲの二重突然変異体の核酸配列を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、典型的なリーダー配列を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、各種タンパク質ドメインを示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、各種リンカー配列を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、リーダー核酸配列を表す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、融合ドメイン核酸配列を表す。
【図５】図５は、ＨＥＫ−２９３細胞内で産生したＡＬ９ｓｃＴＣＲのＹ９３及びＡ９７ ＣＤＲ３ Ｖα突然変異の特性評価である。
【図６】図６は、ＣＨＯ細胞内で産生したＹ９３Ｈ ＡＬ９ｓｃＴＣＲ ｓｍの特性評価である。
【図７】図７は、ＣＨＯ細胞内で産生したＳ３９Ｐ ＡＬ９ｓｃＴＣＲの特性評価である。
【図８】図８は、ＣＨＯ細胞内で産生したＡＬ９ｓｃＴＣＲ ｓｍ 及びｄｍ の特性評価である。
【図９】図９は、精製したＡＬ９ｓｃＴＣＲ ｓｍ 及びｄｍ タンパク質の特性評価である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、フローサイトメトリーによる、ＡＬ９負荷Ｔ２細胞に対するＡＬ９ｓｃＴＣＲ ｗｔ 及び ｓｍ タンパク質の滴定を表す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＡＬ９又はｐ５３（対照）ペプチドで負荷されたＴ２細胞へのｗｔ、ｓｍ 及び ｄｍ ＡＬ９ｓｃＴＣＲ多量体の結合を表す。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、ＡＬ９又はｐ５３（対照）ペプチドで負荷されたＴ２又はＢ細胞へのｗｔ、ｓｍ 及び ｄｍ ＡＬ９ｓｃＴＣＲ多量体の結合を表す。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、Ｔ２細胞上に負荷された非特異的ペプチドへの ｗｔ及びｓｍ ＡＬ９ｓｃＴＣＲ多量体の結合が欠如していることを表す。
【図１１】図１１は、フローサイトメトリーによる競合結合分析を表す。
【図１２】図１２は、異なった量のＡＬ９ペプチドで負荷されたＴ２細胞への ｗｔ 及びｓｍ ＡＬ９ｓｃＴＣＲ単量体の結合を表す。
【図１３】図１３は、ＡＬ９ペプチド突然変異体で負荷されたＴ２細胞への ｗｔ 及びｓｍ ＡＬ９ｓｃＴＣＲ多量体の結合を表す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、最も頻繁に生じるｖｐｒＡＬ９ペプチド変異体の公表されている分析を表す（Altfeld et al. 2005. J. Virol. 79: 5000）。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ＡＬ９コンセンサスと比較した、ＡＬ９ペプチド変異体と融合する ｗｔ、ｓｍ 及びｄｍ ＡＬ９ｓｃＴＣＲの結合のフローサイトメトリー分析を表す。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、ＡＬ９ Ｉ６３Ｍペプチド滴定を表す。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、ＡＬ９コンセンサスと比較した、ＡＬ９ペプチド変異体と融合する ｗｔ 及びｓｍ ＡＬ９ｓｃＴＣＲの相対結合の概要を表す。
【図１５】図１５は、ＨＩＶに感染したヒトＣＤ４Ｔ細胞が示すＡＬ９ペプチドへのｗｔ 及びｓｍ ＡＬ９ｓｃＴＣＲ多量体の結合を表す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ＤＭ ＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合タンパク質がＡＬ９及びＡＬ９変異体と結合することを表す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、ＤＭ ＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合タンパク質がＡＬ９ Ｉ６３Ｍ変異体と結合することを表す。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、ＷＴ、ＳＭ 及び ＤＭ ＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合タンパク質がＡＬ９及びＡＬ９変異体と結合することを表す。
【図１７Ａ】図１７Ａは、ＤＭ ＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合タンパク質がＡＬ９で負荷したＴ２細胞に対する細胞溶解活性を介在することを表す。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、ＤＭ及びＳＭ ＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合タンパク質がＡＬ９で負荷したＴ２細胞に対する細胞溶解活性を介在することを表す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（発明の詳細な説明）
本発明者らは、それらの同族ＨＭＣ複合体中に存在しているときに、ＨＩＶのｖｐｒタンパク質に由来するペプチドと結合するＴＣＲ分子を見出した。特に本発明者らは、ｖｐｒのＡＬ９エピトープ（ＡＩＩＲＩＬＱＱＱＬ、アミノ酸５９〜６７）に結合するＴＣＲを同定した。更に、本発明者らは、ウィルスによる感染の経過の間にＡＬ９エピトープ内に生じる多数の共通の変異体を認識するこれらＴＣＲｓの変異体を同定した。本明細書に開示されているデータは、診断及び治療的使用のためのＨＩＶ−１特異的ＴＣＲｓの配列を明らかにする。
【００２５】
現在、ＨＩＶ−１感染細胞を直接標的とするための、組み換えＨＩＶ−１特異抗体が入手できる。抗体による手法の１つの欠点は、ＨＩＶ−１ウィルスのエンベロープのみがＨＩＶ−１抗体にアクセス可能であるのに対して、機能的に最も重要なＨＩＶタンパク質が感染した細胞内部に隠れていて、細胞内プロセシング後及びＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子による提示後の免疫系のみにアクセス可能である。ＭＨＣ分子によって提示されると、これらのＨＩＶ遺伝子産物はＴＣＲｓによって認識されるが、抗体によっては認識されない。従って、ＨＩＶ−１抗体は、非常に限定されたＨＩＶ−１感染細胞のみを標的可能にしている。本明細書に記載されている組成物がこの問題の解決法をもたらす。
【００２６】
ＨＩＶ−１に特異的である可溶性ＴＣＲｓは、既存の手法に優る有意な利点を有している。
【００２７】
ＴＣＲ配列は、ＨＩＶ−１感染細胞を特異的に認識できる組み換え単鎖ＴＣＲの産生に有用である。これらの組み換えＴＣＲは、（ｉ）免疫治療である、細胞治療手法の遺伝子導入においてＨＩＶ−１感染細胞のインビボ標的のために、（ｉｉ）リンパ球又はプロフェッショナル抗原提示細胞でのＨＩＶ抗原発現のエクスビボ評価のために特に有用である。ＨＩＶ−１抗原発現の定量分析は、ＨＩＶ−１免疫病原性についての検討に重要であり、そして予防及び治療方法のエクスビボのスクリーニング／モニタリングに有用である。
【００２８】
現在、ＨＩＶ−１感染患者の治療は抗レトロウィルス剤の使用に基づいている。これらの薬剤は非常に有効であるが、しかし蓄積毒性を有しており、高用量ピルの負荷に関連していて、ウィルス耐性を引き起こしうる。従って、これらの患者に対する別の治療選択肢が継続して必要とされている。可溶性ＴＣＲｓによる免疫療法の治療方法が、ＨＩＶ−感染患者集団のための代替え治療選択肢を代表している。更に、ＴＣＲはＨＩＶ−１抗原発現のエクスビボ評価のために用いられる。
【００２９】
本明細書に記載されているＴＣＲｓは、ＨＩＶ感染の間に通常生じるｖｐｒ遺伝子の多くの変異体を認識して、既に同定されているＴＣＲｓと比較して、本発明の分子に対する効果の増強を可能にしている。
【００３０】
本発明は、ウィルス感染の診断及び治療のための方法及び組成物を特徴としている。方法は、ＨＩＶ−１に特異的なＴ細胞受容体の同定に基づいている。特に本発明は、ＨＩＶ由来ｖｐｒタンパク質のエピトープに特異的に結合するＴＣＲ分子を提供する。エピトープは、ｖｐｒタンパク質中に見出される短い、８〜１１ｍｅｒペプチドを含有しているか或いはこれから成っている。特に、ｖｐｒエピトープはｖｐｒタンパク質のＡＩＩＲＩＬＱＱＬ（アミノ酸５９〜６７）である。
【００３１】
本発明のＴ細胞受容体はヘテロ多量体分子であってよく、或いは単鎖ＴＣＲ分子であってもよい。ｓｃＴＣＲｓは、直接に或いは可動性リンカーを介してＶβ／Ｃβドメインと結合しているＶαドメインを含有している。本発明の特定分子は更に追加のポリペプチドを含有している。この追加ポリペプチドを含有しているある特定の実施態様では、Ｃβドメインが最後のシステインの直前で切断されている。
【００３２】
本発明は、１つ又はそれ以上のアミノ酸置換を含んでいるエピトープの認識を可能にする、可変領域内に１つ又はそれ以上の突然変異を含有しているＴＣＲを提供する。例えば、本発明は、ｖｐｒタンパク質のコンセンサスＡＬ９エピトープのみならず、ＡＬ９エピトープ内に１つ、２つ又は３つのアミノ酸置換を含んでいるエピトープにも結合するＴＣＲｓを提供する。
【００３３】
典型的な実施態様では、本発明のＴＣＲｓは、ｖｐｒタンパク質のアミノ酸番号６０、６１、６２、又は６３に対応する位置に突然変異を含有しているＡＬ９エピトープを認識する。
典型的な実施態様では、ＴＣＲのＶα鎖内の１つ又はそれ以上の突然変異は変異体ｖｐｒの配列の認識を可能にする。
【００３４】
診断方法
可溶性ＴＣＲｓは、プロフェッショナル抗原提示細胞又はＨＩＶ感染細胞上の細胞傷害性Ｔ細胞エピトープの提示についてのＨＬＡが介在する提示を分析するために用いられる。例えば、体液、例えば血液、体組織、例えばリンパ節のサンプルを対象から得る。サンプル由来の白血球を本明細書に記載されている単鎖ＴＣＲｓと接触させる。感受性を増大するために、４つの単鎖ＴＣＲ構築物を例えば、中央のストレプトアビジンと共に一緒に結合して四量体複合体を形成した。この構築物を検出可能なマーカーと結合する、例えば、これを蛍光性フルオロフォアで標識する。検出可能なマーカーは、フィコエリトリン（ＰＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＩＣ）、及びアロフィコシアニン（ＡＰＣ）のような蛍光色素を包含する。検出は、フローサイトメトリー及び／又は組織染色（蛍光顕微鏡検査法又は免疫組織化学）によって実施する。別の例では、複数のＴＣＲ構築物をマイクロアレイ、例えば、チップ又はプレートに固定して、患者由来のサンプルをこのアレイに接触させることが可能となり、アレイを洗浄して、結合した細胞を検出する。この方法では、抗原提示細胞又は患者のＨＩＶ感染細胞上で発現又は提示されるペプチドが測定される。従って、可溶性ＴＣＲは、ＨＩＶ−１エピトープ提示のエクスビボ評価及び定量のための研究ツールとしても有用である。これらは、特定のＨＩＶ−１エピトープ、例えば、ｖｐｒのＡＬ９エピトープを発現する患者を同定するための有用なツールであり、従って、本明細書に記載されている免疫治療的介入についての有望な候補である。
【００３５】
治療方法
ＨＩＶに感染している患者を治療するために、可溶性単鎖ＴＣＲ構築物の１つ又は混合物を投与する。一実施態様では、本発明のＴＣＲｓは、抗体依存性細胞が介在する細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘発する。ＡＤＣＣはＨＩＶ感染に対する効果的な免疫応答をもたらす。これは、ヒトにおいて遅れて進行するＨＩＶ感染である、マカクのサル免疫不全ウィルス疾患からの防御、静脈内投与薬剤使用者のＨＩＶ感染からの保護、及び生殖器のＨＩＶウィルス量の低減と関連付けられている。例えば、高親和性ＡＬ９ｓｃＴＣＲ ＩｇのＡＤＣＣ様活性を介在する能力は、ＨＩＶ感染細胞に対する、標的化、強力な、先天性免疫応答を刺激するために受動免疫治療法にこれらを用いることができることを明らかにする。
【００３６】
別の実施態様では、ＴＣＲｓは更に、機能的ポリペプチドドメイン、診断用／画像化試薬、薬剤含有ナノ粒子、治療薬、細胞毒性薬又は抗ウィルス剤のような、第２組成物を含有している。
典型的な実施態様では、機能的ポリペプチドドメインは、サイトカイン、免疫グロブリンドメイン、受容体ドメイン又はポリペプチドタグ配列を含有している。
典型的なサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ又はインターフェロンであり、そして典型的な免疫グロブリンドメインは、ＩｇＧ１定常領域又はＩＧ Ｆｃドメイン或いはこれらの断片を含有している。
【００３７】
このような構築物の１つの利点は、増大した半減期及びこれらの試薬の感染細胞への直接的な抗原特異的送達である。この治療的戦略は、総薬物用量、投与回数、及び治療に関連する副作用を減少する。
【００３８】
別の実施態様では、本発明のＴＣＲｓをコードする核酸又は本発明のＴＣＲｓを発現する細胞を、ＨＩＶ感染細胞を死滅するため、又はＨＩＶ感染を予防若しくは治療するための遺伝子導入又は細胞に基づいた方法に用いることができる。
一例では、本発明のＴＣＲｓをコードする遺伝子を、本発明のＴＣＲｓを直ちに細胞表面に発現するように免疫細胞へ導入できる。次いで、ＴＣＲがＨＬＡ−Ａ２複合体中に提示されたＨＩＶ Ｖｐｒペプチドと相互作用すると、これらの細胞は免疫機能を発現するように活性化される。これらの細胞は、エクスビボでＨＩＶ感染細胞を死滅するために又は、ＨＩＶ感染している患者へ注入した後、患者のＨＩＶ感染細胞を死滅するために用いることができる。
或いは、本発明のＴＣＲｓをコードする核酸を直接患者に投与することによって、患者の免疫細胞へ遺伝子を導入して、インビボでこれらの細胞上に本発明のＴＣＲｓの発現を可能にすることができる。このような細胞はＨＩＶ感染に対する予防及び治療的活性をもたらす。
【００３９】
本発明のＴＣＲは、当業者に公知の方法によって送達することができる。例えば、静脈内、皮下、筋肉内、及び腹腔内送達経路のような、非経口投与をＴＣＲｓを送達するために用いることができる。例えば、可溶性ＴＣＲ融合物は、０．０１５〜１０ｍｇ／ｋｇの用量でマウス及びヒトに静脈注射されている。患者用量の決定は当該技術分野で周知の方法を用いて行われる。
【００４０】
本発明の組成物をＨＩＶ感染を予防又は治療するため、或いはＨＩＶ感染細胞の数を減少するために投与することができる。特定の状況に対する適切な用量及び投与計画は当該技術分野の技術範囲内である。治療用タンパク質の有効量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇが好ましい。有効用量は、当業者に認識されるように、治療的処置の特性（すなわち、生物学的な、核酸又は細胞に基づく）、投与経路、賦形剤の使用、及び、他の薬剤又は治療薬の使用を包含する他の治療処置の併用によって変化する。治療計画は、標準的な方法を用いて、ウィルス性の病原菌による感染を患っている（又は発症する危険性がある）哺乳動物、例えば、ヒト患者を同定することによって実施される。医薬化合物を、当該技術分野で公知の方法を用いて、このような個体に投与する。好ましくは、化合物を経口、直腸内、経鼻、局所、又は非経口、例えば、皮下、腹腔内、髄腔内、筋肉内、及び静脈内、投与する。
【００４１】
野生型ＴＣＲ配列と比べて突然変異又は置換を含有しているポリペプチドの場合には、変異位置が同類置換であることが好ましいが、必ずしもそうではない。一般に同類置換は、以下の群内の置換を包含する：グリシン及びアラニン；バリン、イソロイシン、及びロイシン；アスパラギン酸及びグルタミン酸；アスパラギン及びグルタミン；セリン及びスレオニン；リジン及びアルギニン；並びにフェニルアラニン及びチロシン。野生型ＴＣＲ配列と比べてアミノ酸置換が行われているペプチドでは、得られるＴＣＲ分子は、１つ又はそれ以上のアミノ酸突然変異を含有している１つ又はそれ以上のＨＩＶペプチドを認識する。特定の実施態様では、ＨＩＶタンパク質はｖｐｒである。野生型ＴＣＲ配列と比べてアミノ酸置換が行われているペプチドでは、Ｔ細胞受容体のそのＨＬＡ拘束性エピトープへの結合親和性が増大している。或いは、置換を含んでいる構築物は高い安定性、例えば、培養培地又は、血液、血漿、或いは血清のような体液などの生理学的に許容される溶液における長い半減期を有している。例えば、このような誘導ペプチドの結合親和性及び／又は安定性は参照するペプチド配列のそれと比べて、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、９０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍又はそれ以上である。
【実施例】
【００４２】
当然のことながら、本発明は次に述べられる実施例に限定することを意図しておらず；むしろ、本明細書に提供されているありとあらゆる適用及び当業者の技術範囲内の全ての均等な変化を包含することを意図している。
【００４３】
実施例１：特異的突然変異を有する単鎖ＴＣＲ構築物の産生
ＨＩＶの１４ｋＤ付属タンパク質である、ＨＬＡ−Ａ２Ｖｐｒ由来のＣＴＬｓは、ウィルスの複製及び宿主の免疫応答の抑制に重要な役割を担っている。これはタンパク質の長さに対してＣＴＬによって最も高い頻度で標的にされるタンパク質の１つである。ｖｐｒに対するＣＤ８＋Ｔ細胞の応答が個体の４５％に見出された（Altfeld et al. 2001, J. Immunol. 167: 2743）。ＨＬＡ−Ａ２．１拘束性Ｖｐｒエピトープ ＡＩＩＲＩＩＱＱＬ（アミノ酸５９〜６７）（ＡＬ９エピトープ）は、ＨＬＡ−Ａ２陽性個体のサブセットにおける一次感染において、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する優れた初期標的を提示できる。それはこのエピトープ内の最も共通するカレント配列（コンセンサス配列）であって、急性感染（２１％）及び慢性感染（２４％）の個体で同様の頻度で標的になる（Altfeld et al. 2005. J. Virol. 79: 5000）。ｖｐｒ発現細胞を標的とする治療は、ＨＩＶ感染細胞の除去に有用かもしれない。しかしながら、Altfeld et alの文献 も感染の急性期にコンセンサス配列を含んでいるウィルスに感染している個体はエピトープ特異的Ｔ細胞応答を組み込むことが不可能であったことを示したが、Ｉ６０Ｌ変異体に感染している対象は全てこれらの応答を生じた。ＡＬ９エピトープの変異体は高い頻度で生じて、ウィルスを除去するために設計された治療による標的とする必要がある。
【００４４】
可溶性Ｔ細胞受容体は、治療分子を感染細胞に効果的に送達するために用いることができる。同系ペプチドＭＨＣに対するＴＣＲｓの本質的に低い親和性（１〜１００μＭ）には治療及び診断の適用に大きな限界がある。ＴＣＲとペプチド−ＭＨＣとの接触は、Ｖα ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、並びに／又はＶβ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を介して生じ、ＣＤＲ３ドメインでペプチドと最も接触を生じる。これらの領域内の残基の突然変異がＴＣＲの親和性を改善することを、幾つかの研究が示している。マウスの同種反応性ＴＣＲである、２Ｃ ＴＣＲの高い親和性変異体は、ＣＤＲ３α突然変異体のライブラリーからの選択に続く酵母提示によって同定した。ＮＹ−ＥＳＯ−１腫瘍関連抗原及びヒトＴ細胞リンパ向性ウィルス１型（ＨＴＬＶ−１）タックスペプチドに特異的なＴＣＲｓのＣＤＲ３領域の突然変異及びこれらのファージの表面への提示もＴＣＲ親和性を改善するために用いられている。
【００４５】
本実施例はｖｐｒタンパク質（ＡＬ９エピトープ）のアミノ酸５９〜６７を認識する単鎖ＴＣＲの産生及び特性化を、本文中にＨＬＡ−Ａ２を用いて、記載している。天然のＴＣＲは、殆どのＴＣＲの高い親和性範囲である、１．８μＭのＫＤでＡＬ９コンセンサスペプチドと結合する。しかしながら、これは感染経過の間に通常生じることが知られている幾つかの変異体を、優れた親和性では認識しない。この制限を打破してその親和性を更に増大するために、ＣＤＲ３αループ領域のチロシン（Ｙ）のヒスチジン（Ｈ）への置換によってタンパク質の突然変異体を作成した。この突然変異体はコンセンサスＡＩＩＲＩＬＱＱＬ配列とはるかに高い親和性で結合する一方で、高度のペプチド特異性を保持している。重要なことは、ＨＩＶ感染の間に高頻度で生じることが知られている変異体エピトープが、野生型ＴＣＲよりはるかに高い親和性で新たに改善されているＴＣＲに認識されることである。また、高親和性ＴＣＲの多量体形態はＨＩＶ−１に感染したＣＤ４＋Ｔ細胞と効率的に結合できる。ＡＬ９ｓｃＴＣＲの野生型及び高親和性突然変異体をＩｇ重鎖定常ドメインと融合してエフェクター機能を供給した。この融合タンパク質はペプチド特異的結合活性を保持し、二量体を形成し、そしてＦｃ依存性細胞毒性による標的細胞死滅を介在できる。
【００４６】
ＡＬ９ペプチド（アミノ酸５９〜６７：ＡＩＩＲＩＬＱＱＬ）／ＨＬＡ−Ａ２複合体に特異的なＣＴＬｓを既に記載されているようにして、ＨＩＶ−１感染患者から単離して（Altfeld et al. 2005. J. Virol. 79: 5000）、ＴＣＲα及びβｃＤＮＡｓを産生するための供給源として用いた。これらのＣＴＬｓから得られる最も高い頻度で生じるＴＣＲα及びβ鎖のＶ領域は、それぞれ、既に記載されているような（ＵＳＳＮ １１／７８４，２７７）、ＴＲＡＶ５／ＴＲＡＶＪ３６及びＴＲＢＶ１４／ＴＲＡＢＪ２−１であった。
【００４７】
高親和性ＴＣＲｓを産生するために、ＴＣＲ ＣＤＲ領域及び隣接アミノ酸残基を突然変異させて、得られたタンパク質をスクリーニングすることができる。ＨＬＡ−Ａ２／ＡＬ９特異的ＴＣＲ（ＡＬ９ ＴＣＲ）、Ｖα及びＶβＣＤＲ配列を図１Ａに、対応する核酸コード領域を図２Ａに示した。この実施例のために、ＣＤＲ３ Ｖα領域内の各アミノ酸を、２０の天然アミノ酸が提供する主要な側鎖化学を示すために選ばれた、９個のアミノ酸のうちの１個と系統的に置換する、突然変異戦略を用いて、ＶαＣＤＲ３領域を突然変異した。以前の研究は、ペプチドＭＨＣ境界面の中央に存在する、ＣＤＲ３αループのアミノ酸を突然変異させて高親和性ＴＣＲｓを産生することが可能であることを示している（Holler et al. 2000 PNAS 10: 5837）。従って、ＣＤＲ３Ｖαループの５つのアミノ酸（Ｙ−Ｑ−Ｔ−Ｇ−Ａ）をコードするＡＬ９ＴＣＲの遺伝子配列を主要側鎖化学を代表する９個のアミノ酸に変異させた。これらのアミノ酸はＴＣＲ Ｖα鎖のａａ９３〜９７に位置していて、９３位（ｔｙｒ）の変化がＨＬＡ−Ａ２／ＡＬ９複合体に対して改善された（高い）親和性を示した。
【００４８】
単離されたＶα遺伝子断片に、非コンセンサスセリンコドンが、第２フレームワーク領域のａａ３９位に見出された。このコドンをコンセンサスプロリンコドンに突然変異させてＴＣＲ生産性、安定性及び親和性について、この変化の効果を評価した。
【００４９】
Ｖα遺伝子に異なった突然変異をコードする配列を挿入するために、ＣＤＲ３α配列を部位特異的突然変異誘発法で改変して、固有の制限酵素部位（ＡｇｅＩ）を含有させた。この変化はコードするアミノ酸に変化をもたらさなかった。次いで、所望の配列変化をコードするオリゴヌクレオチドプライマーを用いる標準的なＰＣＲ方法によって、突然変異遺伝子、ＴＣＲＶα遺伝子断片を産生した。次いで、これらの遺伝子断片をＶα遺伝子内にクローン化して野生型配列を置き換えた。ＴＣＲα及びβ鎖を、可動性リンカーを介してＶβ／Ｃβドメインに結合しているＶαドメインから成る単鎖（ｓｃ）ＴＣＲフォーマット内にクローン化した（Card et al. 2004 Cancer Immunol Immunother. 53:345; Mosquera et al. 2005 J. Immunol. 174:4781; Zhu X et al. 2006 J. Immunol. 176:3223）。Ｃβドメインを最終システインの直前で切断した。
【００５０】
ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡ融合を作るために、ｓｃＴＣＲ遺伝子断片をｂｉｒＡタグ配列をコードする配列の上流にクローン化した。ｂｉｒＡタグは、ストレプトアビジンを用いるその後の多量体化のためのタンパク質の部位特異的ビオチン化を可能にする。ｓｃＴＣＲ ＩｇＧ１融合を作成するために、ｓｃＴＣＲ遺伝子断片をヒトＩｇＧ１定常鎖領域をコードする配列の上流にクローン化した。同様に、ｓｃＴＣＲ遺伝子断片を適切なサイトカイン又はサイトカイン受容体遺伝子配列と結合することによって、ｓｃＴＣＲ−ＩＬ２、ｓｃＴＣＲ−ＩＮＦα、ｓｃＴＣＲーＧＭＣＳＦ、ｓｃＴＣＲ−ＩＬ１５及びｓｃＴＣＲ−ＩＬ１５Ｒ融合を作成した。膜発現のために、ｓｃＴＣＲ遺伝子をＨＬＡ Ａ２膜貫通ドメイン又はＣＤ３ｚｅｔａ膜貫通ドメインをコードする上流配列にクローン化した。膜発現及び細胞内シグナル伝達のために、ｓｃＴＣＲ遺伝子をＣＤ３ｚｅｔａ、ＣＤ２８、ｃｄ８、４−１ＢＢ、Ｏｘ−４０、ＩＣＯＳ及び／又はＬｃｋドメインにリンクさせることができる。或いは、ＴＣＲを、ＴＣＲ膜貫通及び細胞質シグナル伝達ドメインを含有しているヘテロ二量体α／βＴＣＲとして、細胞表面上に発現させることができる。
多種の可溶性で膜結合性の融合タンパク質が既に開示されている（Card et al. 2004 Cancer Immunol Immunother. 53:345; Mosquera et al. 2005 J. Immunol. 174:4781; Zhu X et al. 2006 J. Immunol. 176:3223; Belmont et al. 2006 Clin. Immunol. 121:29; Finney et al. 2004. J. Immunol. 172: 104; Brentjens et al. 2007 Clin Cancer Res. 13, 5426; Zhang et al. 2004. Cancer Gene Therapy 11, 487）。
最適な産生、溶解性、生物活性、タンパク質−タンパク質相互作用、多量体化、又は立体障害を避けるための個々のドメインの位置決めをもたらすために、ｓｃＴＣＲと融合タンパク質ドメインの間及び／又は異なった融合タンパク質ドメインの間に更なるペプチドリンカーを配置することができる。
【００５１】
可溶性又は細胞膜の発現を可能にするために、ｓｃＴＣＲ融合構築物を発現ベクターのリーダー配列の下流にクローン化した。ベクターは、適切な遺伝子発現を可能にするためにプロモーター／エンハンサー調節配列及びポリＡ配列、並びに発現ベクターを含有している宿主細胞の単離を可能にするための選択可能なマーカーをコードする遺伝子を含有している。
【００５２】
ＡＬ９ｓｃＴＣＲ野生型（非変異）タンパク質配列（野生型又は「ｗｔ」と称する）を図１Ａに示す。ＴＣＲ Ｖα鎖の９３位にＴｙｒのＨｉｓへの変異を含有しているＡＬ９ｓｃＴＣＲタンパク質配列（単一変異又は「ｓｍ」と称する）を図１Ｂに示す。ＴＣＲ Ｖα鎖の９３位にＴｙｒのＨｉｓへの変異及び３９位にＳｅｒのＰｒｏへの変異を含有しているＡＬ９ｓｃＴＣＲタンパク質配列（二重変異又は「ｄｍ」と称する）を図１Ｃに示す。対応するＡＬ９ｓｃＴＣＲ ｗｔ、ｓｍ及びｄｍの核酸配列を図２Ａ〜Ｃに示す。リーダー配列、各種可溶性融合タンパク質ドメイン及びリンカー配列についてのタンパク質配列を、図３Ａ〜Ｃに、対応する核酸配列を図４Ａ〜Ｃに示す。
【００５３】
実施例２：タンパク質の産生及び精製
哺乳動物の細胞内で融合タンパク質を生成するために、ＨＥＫ−２９４又はＣＨＯ細胞に、リポフェクトアミン２０００を用いて、発現ベクターを形質導入した。Ｇ４１８（２ｍｇ／ｍｌ）を含有している培地中で、限界希釈クローニングによって単一細胞クローンを選択した。
【００５４】
ＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡの野生型及び変異体融合タンパク質を細胞培養上澄液から、Sepharose 4 Fast Flow カラム（American Bioscience）に結合させた、抗ヒトＴＣＲ抗体ＣβｍＡｂ（ＢＦ１）８Ａ３．３１を用いて、免疫親和性クロマトグラフィーで精製した。精製した融合タンパク質を、製造会社の説明書に従って、過剰なビオチンの存在下でビオチン−タンパク質リガーゼ（Avidity）でビオチニル化して、ＡＬ９ｓｍ／ｂｒｉＡ単量体を作成した。ビオチニル化ＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡタンパク質をＲ−ＰＥ共役ストレプトアビジン（Jackson Immunoresearch）を用いて、ＴＣＲ／ストレプトアビジンのモル比４：１で、４℃で少なくとも６０分かけて、多量体化した。
【００５５】
精製したＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡの野生型及び変異体融合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析してＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｇ−２５０で染色した。タンパク質の還元及び非還元条件下でのＳＤＳゲル分析は、タンパク質が単量体で、ほぼ５２ｋＤの分子量を有していることを示した。これは分子量の計算値４４．３ｋＤより大きく、これらのタンパク質がグリコシル化されていることを示唆している。
【００５６】
ＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡ融合タンパク質をビオチン タンパク質リガーゼを用いてビオチニル化した。野生型及び突然変異体タンパク質がビオチニル化された効率を、捕捉のためにＢＦＩ抗体を、そして検出のためにＳＡ−ＨＲＰを用いて、ＥＬＩＳＡで比較した。その結果は両方のタンパク質が同程度ビオチニル化されたことを示した。
【００５７】
ＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ＩｇＧ１融合はヒトＩｇＧ１鎖の定常ドメインに直接結合しているＴＣＲｓから成っている。ＩｇＧヒンジ領域のシステイン残基は、無傷の二量体形成を可能にして、これはタンパク質を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析すると観察される。
【００５８】
実施例３：ＥＬＩＳＡによるＡＬ９ｓｃＴＣＲ突然変異体融合タンパク質の濃度及びペプチド−ＨＭＣ結合活性の特性化
短期間細胞培養で産生されたＡＬ９ｓｃＴＣＲ野生型及び突然変異体融合体を、ＴＣＲタンパク質濃度及びペプチドＨＭＣ四量体への結合活性についてＥＬＩＳＡで評価した。これらのアッセイでは、９６ウェルの Maxisorb プレート（Nunc, Rochester, N.Y.）をＢＦ１ ｍＡｂ（（１μｇ／ｍｌ）でコーティングした。融合タンパク質を含有している細胞培養上澄液を閉鎖プレートに添加して室温で２時間培養した。洗浄した後、結合活性について、ＡＬ９ペプチド−ＨＬＡ−Ａ２四量体−ＨＲＰ（０．５μｇ／ｍｌ）を用いて、又はＴＣＲタンパク質濃度についてビオチニル化抗−ヒトＴＣＲ Ｃβ抗体ｍＡｂ Ｗ４Ｆ（０．５μｇ／ｍｌ）次いでストレプトアビジン−ＨＲＰ（０．５μｇ／ｍｌ）を用いて、タンパク質を検出した。次いで、ＡＢＴＳ基質を加えて、９６ウェルプレートリーダー（Bio-Tek Instrument）を用いて４０５ｎｍで吸光度を測定した。
【００５９】
ＴＣＲ Ｖα鎖の９３及び９７位における多種の突然変異を図５に示すようにこれらのアッセイで特性化した。９３位における突然変異の大多数は、短期間細胞培養で、高い発現レベル及び／又は増大したタンパク質安定性を示す、タンパク質を高い濃度でもたらした。更に、突然変異の幾つかは、増大した結合活性を示す、ＡＬ９ペプチド−ＨＬＡ−Ａ２の四量体への結合の増大ももたらした。これに対して、９７位（図５）又はＣＤＲ３α或いはＣＤＲ３β領域の何れかの別の位置における変化は、結合活性を改善できなかった。結合活性をタンパク質濃度について正規化すると、Ｙ９３のＬ、Ｋ、Ｑ又はＨへの突然変異は、ＡＬ９ｓｃＴＣＲｗｔタンパク質と比べて、有意に高いレベルのＡＬ９−ＨＬＡ−Ａ２結合活性を示した。ＣＤＲ３αループにおけるＹ９３のＨへの置換は野生型ＴＣＲに比べてもっとも優れた親和性を有するＴＣＲをもたらしていて、これをさらに特性化した。以前の研究は、ＡＬ９ｓｃＴＣＲｗｔタンパク質は、温度に対して感受性があり、３７℃の細胞培養条件で生産した後に、培地中にタンパク質を高濃度で観察できなかったことを示した。形質転換したＣＨＯ細胞によって産生されたｓｍ（Ｙ９３Ｈ）及びｗｔＡＬ９ｓｃＴＣＲタンパク質の濃度を室温又は３７℃に保持した短期間培養において試験した。図６に示すように、ｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲは、３７℃のＣＨＯ培養において、ｗｔＡＬ９ｓｃＴＣＲタンパク質よりはるかに高い濃度の発現タンパク質を表示し、改善された産出量及び／又はタンパク質安定性を示した。再度、ｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲｓｍは、ＡＬ９ｓｃＴＣＲｗｔタンパク質よりも、ＡＬ９−ＨＬＡ−Ａ２複合体へのより良い結合を示して、タンパク質濃度について正規化すると、室温又は３７℃の何れかで産生したＹ９３Ｈ ＡＬ９ｓｃＴＣＲｓｍタンパク質はｗｔタンパク質より高い結合活性を示した。
【００６０】
同様の方法を、ＴＣＲ Ｖα鎖におけるＳ３９Ｐ突然変異の特性化に用いた。図７に示すように、短期間培養で形質転換ＣＨＯ細胞によって発現されたＡＬ９ｓｃＴＣＲ Ｓ３９Ｐは、ＡＬ９ｓｃＴＣＲｗｔタンパク質よりも、ＡＬ９−ＨＬＡ−Ａ２複合体への増大した結合活性を示した。Ｓ３９Ｐ及びＹ９３Ｈ突然変異を単一のＡＬ９ｓｃＴＣＲに組み合わせると、得られた二重突然変異体は、単一突然変異体又はｗｔＡＬ９ｓｃＴＣＲタンパク質よりも、優れた生産性、３７℃における安定性、及びＡＬ９−ＨＬＡ−Ａ２複合体への結合活性を示した（図８）。ＣＨＯ上澄液からＢＦ１ ｍＡｂ親和性クロマトグラフィーで精製したタンパク質に同様な結果が観察された。ＡＬ９ｓｃＴＣＲｓｍ及びｄｍ構築物の両方が、ＡＬ９ｓｃＴＣＲｗｔタンパク質よりも、優れた３７℃における安定性及びＡＬ９−ＨＬＡ−Ａ２複合体への増大した結合活性を示した（図９）。
【００６１】
実施例４：フローサイトメトリーによるＡＬ９ｓｃＴＣＲ突然変異体融合タンパク質の特性化
ＡＬ９ｓｃＴＣＲｗｔと突然変異体の融合タンパク質の、ＡＬ９ペプチド負荷ＨＬＡ−Ａ２陽性抗原提示細胞（Ｔ２細胞）への機能結合をフローサイトメトリーで測定した。Ｔ２細胞に５０μＭのコンセンサスＡＬ９ペプチドを、３７℃で３時間負荷した。ＳＡ−ＰＥの添加によって多量体化してあるビオチニル化ＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡタンパク質を、１〜０．００１μｇの異なった濃度で、４℃で３０分間加えた。洗浄工程に続いて、CellQuest ソフトウェア（BD Biosciences）を用いて、サンプルをＦＡＣＳスキャンフローサイトメトリーで分析した。図１０Ａに示すように、ｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡ多量体は、ＴＣＲ濃度が＜０．５μｇ／試験のときに、ｗｔＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡ多量体より２〜３倍高い、ＡＬ９ペプチド負荷細胞への結合活性を示した。
【００６２】
ｗｔ及びｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡ融合体の単量体形態も、同じ実験で、標的細胞の表面上のペプチド−ＭＨＣを検出するために用いた。Ｔ２細胞に、上記のように、５０μＭのＡＬ９ペプチドを負荷した。ＡＬ９ｗｔ及びＡＬ９ｓｍＴＣＲのビオチニル化形態は、１〜０．００１μｇ範囲の多量体形態と等モル量を加えた。洗浄工程に続いて、結合した単量体をＳＡ−ＰＥで検出した。０．５〜１μｇにおいて、野生型単量体に比べて２〜３倍高いＡＬ９ｓｃＴＣＲｓｍモノマーの結合があった。この相違は、０．２５〜０．０６μｇ濃度で４〜８倍に、そして０．０３〜０．００１μｇ濃度で２０〜３０倍に増加した。野生型及びｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲの間のこの相違は、ｓｃＴＣＲの単量体形態を用いたときに特に明白であった（図１０Ａ）。野生型又は突然変異ＴＣＲ単量体若しくは四量体の何れかのパルス処理していない細胞への結合は、高い濃度であってさえも、殆ど又は全くなかった。ｄｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｒｉＡ融合体で行った同様な検討も、このタンパク質がｗｔＡＬ９ｓｃＴＣＲと比べてＡＬ９ペプチド負荷Ｔ２細胞への増大した結合活性を示した（図１０Ｂ）。また、ｓｍ及びｄｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｒｉＡ融合体の両方は、ＨＬＡ−Ａ２＋Ｂ細胞によって提示されるＡＬ９ペプチドに結合できる（図１０Ｃ）。これらの試験で、２６４ｓｃＴＣＲ及びｐ５３ａａ２６４〜２７２ペプチドを陰性対照試薬として用い、ＴＣＲ及びペプチド特異性を評価して、期待された特異性を観察した。これらのデータは共に、ＡＬ９ｓｃＴＣＲｓが３ドメイン単鎖形態において生物学的機能性であること、及びＡＬ９ｓｃＴＣＲｓｍ及びｄｍ融合体が、ＡＬ９ペプチド負荷細胞に、野生型ＡＬ９ｓｃＴＣＲと比べてより高い親和性で、特異的に結合することを裏付けている。
【００６３】
野生型又はｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｒｉＡタンパク質と同族ペプチド−ＭＨＣとの間の特異的相互作用を、無関連の対照ペプチドのパネルへのそれらの結合を分析して確認した。Ｔ２細胞は、コンセンサスＡＬ９ペプチド又はＨＩＶ−１ｇａｇ（７７〜８５）、ｐｏｌ（４６４〜４７２）、ＣＭＶ、ＨＣＶコア、ＨＢＶｅｎｖ、ｐ５３（２６４〜２７２）、ＭＡＲＴ−１由来のペプチドで負荷するか、或いはパルス処理しないでおく。次いで、ビオチニル化野生型ＡＬ９ｓｃＴＣＲ、ｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ又は対照のＭＡＲＴ１ｓｃＴＣＲを加え、続いてストレプトアビジン−ＰＥと培養した。野生型又はｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲｓの何れかの、無関連なペプチドの何れかへの結合は観察されなかった（図１０Ｄ）。従って、ｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲのより高い親和性は、そのペプチド結合特異性を損なわない。
【００６４】
ＡＬ９ペプチド負荷Ｔ２細胞に結合するために互いに競合する野生型又はｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡ融合タンパク質の能力を分析した。ビオチニル化野生型又はｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲの結合を２〜１００倍過剰の非ビオチニル化競合体の存在下又は非存在下で測定した。図１１に示すように、高親和性単一突然変異体は野生型ＡＬ９ｓｃＴＣＲと、２倍過剰であっても非常に効果的に競合した。５〜１０倍過剰のより高い濃度では、わずかに優れていただけで、ｗｔＡＬ９ｓｃＴＣＲの２５倍過剰の突然変異体との結合は殆ど完全に破棄された。対照的に、野生型ＡＬ９ｓｃＴＣＲはｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲと効果的に競合しなかった。１０倍過剰又はそれ以下の野生型では殆ど又は全く阻害されなかった、２５〜１００倍過剰では、いくらかの阻害が観察されたが、それは大して大きな影響を与えなかった。従って、野生型ＡＬ９ｓｃＴＣＲは、たとえ高濃度であってもｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲの結合を効果的に阻止できないが、突然変異体は、たとえ２倍の過剰であってもｗｔＡＬ９ｓｃＴＣＲの非常に優れた競合体である。これらのデータは、ｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲがＡＬ９−ＨＬＡ−Ａ２複合体への高い結合活性を有していて、ｗｔＡＬ９ＴＣＲの結合を阻害できるという結論を裏付けている。
【００６５】
ｗｔとｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡ融合体の感受性を細胞表面上の各種量のペプチドを検出するそれらの能力を比較して評価した。Ｔ２細胞を１２ｎＭ〜１００μＭ範囲の濃度のＡＬ９ペプチドで負荷した。次いで、０．５μｇの単量体ｗｔ又はｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡを加えて、フローサイトメトリーで結合を評価した。細胞１個に結合したＰＥ分子の数を評価するために、ペプチドの各種濃度で得た平均蛍光強度を、ビーズ当たりのＰＥ量が公知である、ＰＥ結合検定ビーズの標準曲線と比較した。図１２に示すように、試験した全てのペプチド濃度で、ＡＬ９ペプチドで負荷したＴ２細胞を検出するｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲの能力はｗｔＡＬ９ｓｃＴＣＲと比べて有意に増大している。ｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲは、わずか１２ｎＭのＡＬ９ペプチドでＴ２負荷細胞を染色できたのに対して、野生型ＴＣＲは、Ｔ２細胞表面の１９５ｎＭペプチドを検出しただけであった。同様な結果が、ｄｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ融合体で観察された。
【００６６】
実施例５：ＡＬ９ペプチド変異体に結合しているＡＬ９ｓｃＴＣＲ突然変異体融合タンパク質の特性化
ＴＣＲ−ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２複合体の結晶構造は、９−ｍｅｒペプチドの中間にあるアミノ酸がＴＣＲのＣＤＲ３領域と接触していることを示唆している。野生型及び突然変異ＴＣＲｓ結合にどのペプチドアミノ酸が重要であるかを確認するために、ＡＬ９ペプチド（ａａ５９〜６７：ＡＩＩＲＩＬＱＱＬ）の６０、６２、６４、６５、６６及び６７位にアラニン置換を行った。ＨＬＡ−Ａ２複合体へのこれらの変異体の相対結合（ＩＣ５０）を既に記載されているように（Altfeld et al. 2005. J. Virol. 79: 5000）、競合分析によって評価して、それぞれのペプチドについて図１３に示す。これらのペプチドをＴ２細胞に負荷して、上記のように細胞をｗｔ及びｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＥ−ｂｉｒＡ多量体で染色した。フローサイトメトリー分析を実行して、ｗｔ及びｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ多量対のコンセンサスペプチド及び変異ペプチド負荷細胞に対する相対的結合親和性を評価した。２６４ｓｃＴＣＲを対照試薬とした。
【００６７】
結果は、６０、６５、６６及び６７位におけるアミノ酸の置換はｗｔ及びｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲの間の結合に何れも重要な変化をもたらさなかった（図１３）。しかしながら。６４位におけるＬｅｕのＡｌａへの置換は野生型の結合を有意に減少したが、ｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲの結合を減少しなかった。このことは、６４位は天然ＴＣＲに対して重要な接点であるが、親和性の高い突然変異体には重要ではないことを示唆している。
【００６８】
６２位におけるＡｒｇのＡｌａへの置換は、不溶性ペプチドをもたらしたのに対して、この位置のＧｌｕ置換体は可溶性だった。この置換は、単量体及び四量体形態の両方において、ｗｔ及びｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ多量体の両方の結合を完全に無効にして、野生型及び突然変異体両方のＴＣＲペプチド相互作用に対して重要な接点であることを示唆した。
【００６９】
ＨＩＶにおけるＡＬ９エピトープの種々の天然変異体は、 Los Alamos データベース（http://www.hiv.lanl.gov）で報告されている。最も頻繁に生じる変異体の分析は、６０位におけるイソロイシンのロイシン変異体への、及び６１及び６３位におけるスレオニン及びメチオニン置換を示している（図１４Ａ、Altfeld et al. 2005. J. Virol. 79: 5000）。これら及びその他の変異体に対応するペプチドを合成して、変異体ペプチドで負荷した細胞への野生型、ｓｍ又はｄｍＡＬ９ｓｃＴＣＲの結合を、図１４Ｂに示した一連の試験においてフローサイトメトリーで比較した。上記のように、Ｔ２細胞をＡＬ９コンセンサス又は変異ペプチド（それぞれ５０μＭ）で３時間３７℃で負荷して、ＰＥで標識したｗｔ、ｓｍ又はｄｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ多量体で染色した。
【００７０】
ｗｔＡＬ９ｓｃＴＣＲ多量体は６３位においてＴｈｒ及びＭｅｔ置換を有しているＡＬ９変異体への結合の減少を示した。一方、ｓｍ及びｄｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ多量体はこれらの変異体への優れた結合を示した。ＡＬ９ペプチドにおける６０及び６１位の置換は、ｗｔ又はｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲの何れの結合にも影響を与えなかった。図１４Ｃに示すように、５０μＭ〜０ｎｍ濃度でのＩ６３Ｍペプチドの滴定では、ｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲがこの変異体を確認できるが、野生型ＴＣＲ四量体はできないことを確認した。
【００７１】
６２位におけるＧｌｕへの置換が野生型及び突然変異体ＡＬ９ｓｃＴＣＲ両方の結合を無効にすることを示したので、ＡｒｇをＬｙｓで置換することがこれらのＴＣＲの結合にどのような効果をもたらすかを確認することに関心を持った。この置換はデータべース中にＨＩＶの天然変異体として報告されている。６２位におけるＬｙｓ置換は、野生型の結合を減少するが、高親和性ｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ多量体の結合は減少しない（図１４Ｂ）。
【００７２】
従って、ｓｍ及びｄｍＡＬ９ｓｃＴＣＲｓがＡＬ９コンセンサスペプチドに高い親和性で結合するばかりではなく、これらのタンパク質は６２、６３及び６４位における変異体も野生型ＡＬ９ＴＣＲよりずっと強く認識する（図１４Ｂ）。図１４Ｄは、ｗｔ及びｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ多量体の、ＡＬ９コンセンサスペプチドと比較した、一般的なＡＬ９エピトープ変異体への相対的結合活性の要約を示している。ｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲは、コンセンサスペプチドについて観察したものと比べて＞７０％でこれらの変異体への結合活性を保持していて、この突然変異ＴＣＲ融合タンパク質はこれらの変異エピトープを提示しているＨＩＶ感染細胞を認識できるはずだということを示している。
【００７３】
実施例６：ＡＬ９ｓｃＴＣＲ融合タンパク質によるＨＩＶ感染ヒトＴ細胞上のＡＬ９抗原提示の検出
上で示した結果は、ｗｔ及び突然変異体ＡＬ９ｓｃＴＣＲタンパク質がＡＬ９ペプチド−ＨＬＡ−Ａ２複合体及びＨＬＡ−Ａ２＋細胞上に提示された内因的に付加されたＡＬ９ペプチドに結合可能でであったことを明らかにしている。しかしながら、ＨＩＶ感染細胞を標的にするためには、ＴＣＲ融合タンパク質は、内部発現されたＨＩＶｖｐｒタンパク質への抗原提示経路を介して生成される細胞表面上に提示されたＡＬ９を検出するのに十分感受性で特異的でなければならない。これを試験するために、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１ドナーからＣＤ４＋Ｔ細胞を磁性ビーズ（Miltenyi Biotech）によって単離して、既に記載されているようにして（Migueles et al. 2002 Nat Immunol 3: 1061）、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３；Coulter）、抗ＣＤ２８（PharMingen）及びＩＬ−２を含有している培地で刺激した。３日目に、５×１０６個の細胞を２００μｌの培地中、３７℃で１時間、５，０００ＴＣＩＤ５０のＨＩＶＳＦ１６２で感染させて、次いで２４ウェルプレート中１０６細胞／ｍｌで培養液中で更に６日間保持した。６日目に、磁性ビーズを用いてＣＤ８＋細胞を枯渇させた。感染した細胞のパーセントを、Ｋｃ５７−ＦＩＴＣ又はＫｃ５７−ＲＤ１（Coulter）でｐ２４について細胞内染色して記録した。次いで感染した細胞をｗｔ及びｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ多量体及び抗−ＣＤ４ｍＡｂ−ＡＰＣで染色した。ＨＩＶ感染はＣＤ４の細胞表面発現の下方制御をもたらした。従って、ＡＬ９ペプチドの提示を、低レベルのＣＤ４染色した感染細胞中で評価できる。図１５に示すように、ｗｔ及びｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡ多量体はＨＩＶ感染Ｔ細胞によって提示されるＡＬ９ペプチドを検出可能であった。感染細胞を非感染細胞と比較すると、ｗｔＡＬ９ｓｃＴＣＲ陽性染色細胞のパーセントに１５倍の増大が、そしてｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ陽性染色細胞のパーセントに２７倍の増大が見られた。また、下方制御されたＣＤ４を有する細胞に増大したＡＬ９ｓｃＴＣＲ染色が観察された。この研究において、ｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡ多量体はｗｔＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｒｉＡ多量体より約２倍多いＨＩＶ感染細胞を検出して、ＴＣＲ突然変異体のＡＬ９ペプチドへの増大した結合活性と一致した。
【００７４】
実施例７：ＡＬ９ペプチド及びペプチド変異体に結合しているＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合タンパク質の特性化
上で示したように、ＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合タンパク質を産生して精製した。ＡＬ９負荷Ｔ２細胞を用いて、ｄｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合体の結合活性を、ｗｔ及びｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡ融合体と比較した。このアッセイにおいて、ＴＣＲ結合をビオチニル化ＢＦ１ｍＡｂを用い、続いてＳＡ−ＰＥで検出した。図１６Ａに示すように、ｄｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合タンパク質はＡＬ９コンセンサスペプチド又はＡＬ９Ｉ６３Ｍ変異体の何れかで負荷したＴ２細胞への優れた結合を示した。実際、二量体ｄｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇは、単量体ｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡ融合体より優れたＡＬ９Ｉ６３Ｍ変異体への結合を示した。ｄｍ及びｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合体の結合活性を、ＡＬ９コンセンサス及びＡＬ９Ｉ６３Ｍ変異体で負荷したＴ２細胞を用いて、ｗｔＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｒｉＡ多量体及びｗｔＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合体と比較した（図１６Ｂ〜Ｃ）。これらの試験は、ｄｍ及びｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合体がｗｔＡＬ９ｓｃＴＣＲタンパク質よりもＡＬ９及びＡＬ９変異体へのより優れた結合を示すことを立証した。興味深いことに、ｄｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合タンパク質は、ｗｔ又はｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合体の何れより、非パルス処理Ｔ２細胞へのより低いバックグラウンド結合を示す（図１６Ｃ）。ｗｔ又はｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合体のより高いバックグラウンド染色はＴ２細胞上の受容体へのＩｇ Ｆｃドメインの結合によるものと思われる。ｄｍ及びｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲタンパク質の間のバックグラウンド結合の差異は、ｂｒｉＡ融合体多量体形態を用いては観察されず、Ｉｇ形態の二重突然変異体中のＴＣＲα ＦＲ２突然変異が、低い非特異結合活性をもたらすことを示唆している。この効果は特異的生物活性を標的とするために有利である。
【００７５】
実施例８：ＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合タンパク質はＡＬ９ペプチド特異性の細胞毒性を介在する
ＡＬ９負荷標的細胞に対するＦｃ依存性細胞傷害性を誘導する、ｗｔ、ｄｍ及びｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合体の能力を試験した。これらのアッセイでは、ＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合体はＦＣ受容体を含む免疫エフェクター細胞とペプチド−ＭＨＣ提示標的細胞を接合して、エフェクター細胞はＡＤＣＣ様メカニズムを径由して標的細胞溶解を介在する。本実施例において免疫エフェクター細胞として働く、ヒトＰＢＭＣｓをヒト血液軟膜からHistoPague（Sigma-Aldrich）を介する勾配遠心分離によって単離した。５０μｇ／ｍｌのペプチドで３７℃、２時間パルスしたＴ２細胞を標的細胞として用いた。標的細胞を５０μｇ／ｍｌの Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ で３７℃、１時間標識化し、２回洗浄して、ＲＰＭＩ−１０培地中２０００／ウェルで、９６−Ｕ−プレート中に添加した。ｄｍ、ｓｍ及びｗｔＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇを異なった濃度でウェルに添加した。次いで、エフェクター細胞を添加して（１００：１、Ｅ：Ｔ比）、培養物を３７℃で２時間培養した。細胞溶解によって上澄液に放出されたＣａｌｃｅｉｎの蛍光強度（ＦＩ）を蛍光プレートリーダーで測定した（励起波長＝４８５ｎｍ、放射波長＝５３８ｎｍ、カットオフ＝５３０ｎｍ）。次の式を用いて特異的細胞毒性を算出した：細胞毒性のパーセント＝（試験サンプルのＦＩ−培地を伴う標的細胞のＦＩ）÷（０．０４％のトリトンＸ−１００で処理した標的細胞のＦＩ−培地を伴う標的細胞のＦＩ）×１００。
【００７６】
図１７Ａに示すように、ｄｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合タンパク質はＡＬ９ペプチドでパルス処理したＴ２細胞に対するヒトＰＢＭＣ細胞溶解活性を誘導したが、Ｐ５３２６４−２７２ペプチドでパルス処理したＴ２細胞に対しては誘導しなかった。対照の２６４ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合タンパク質はＡＬ９負荷Ｔ２細胞に対して同じ効果を示さず、このアッセイの特異性を明らかにした。同様な結果がＰＢＭＣの異なった調製物で認められた。図１７Ｂは、ＡＬ９負荷Ｔ２細胞に対するｄｍ、ｓｍ及びｗｔＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合タンパク質の活性を比較している更なる細胞毒性アッセイを示す。この結果は、ｄｍ及びｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合体がＡＬ９負荷細胞に対するＡＤＣＣ様活性の介在に有効であったのに対して、ｗｔＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合体は有効ではなかったことを示した。これらの結果は、ＡＬ９ｓｃＴＣＲ突然変異体が、ｗｔＡＬ９ＴＣＲでは観察されなかった、ＨＩＶ ＡＬ９エピトープを提示する細胞に対して増大した細胞溶解性生物活性をもたらすことを示す。
【００７７】
同様に、ＨＩＶ感染細胞に対する免疫エフェクター細胞の細胞溶解活性を誘導する突然変異ＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合タンパク質の能力を評価する。ＨＩＶ感染細胞は実施例６に記載されているようにして作成して、上記のようなＣａｌｃｅｉｎ放出アッセイに標的細胞として用いられる。培養培地中に突然変異ＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合体が存在することによるＨＩＶ感染細胞の溶解における特異的な増大は、突然変異ＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合体がＨＩＶ感染細胞に対する免疫細胞溶解活性を誘導する橋渡し分子として作用できることを明らかにするだろう。
【００７８】
実施例９：突然変異ＡＬ９ｓｃＴＣＲ融合タンパク質はＡＬ９／ＨＬＡ−Ａ２複合体に対して増大した親和性を示す。
ＡＬ９ｓｃＴＣＲ融合タンパク質：ＡＬ９／ＨＬＡ−Ａ２複合体相互作用の結合親和性パラメーターを表面プラズモン共鳴法で測定した。ビオチニル化ＡＬ９又はＩ６３ＭｐＭＨＣ複合体、又は無関連な対照であるｐＭＨＣ複合体をストレプトアビジンセンサーチップの表面に結合した。可溶性ＴＣＲ−ｂｉｒＡタンパク質を関連細胞に影響を及ぼさないようにして、タンパク質−タンパク質相互作用を測定する応答を、BIAcore 技術を用いてリアルタイムで記録した。結合パラメータをBIAevaluation ソフトウエアを用いて評価した。ＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡ融合タンパク質に関するこれらの分析の結果を表１に示し、そしてＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合タンパク質に関して表２に示す。これらの結果は、ｂｒｉＡ又はＩｇ融合体としてｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲタンパク質がＡＬ９／ＨＬＡ−Ａ２及びＩ６３Ｍ ＡＬ９／ＨＬＡ−Ａ２複合体への結合親和性を増大することを明確に示している。また、二量体ｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合体は、それらの増大した親和性(avidity)に基づいて、単量体ｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡ分子よりもＡＬ９／ＨＬＡ−Ａ２複合体へのより優れた結合を示す。
【００７９】
【表１】
【００８０】
【表２】
【００８１】
実施例１０：遺伝子導入及びＨＩＶ感染細胞を死滅するための突然変異ＡＬ９ＴＣＲｓを用いる細胞に基づく手法
本発明のＴＣＲｓはＨＩＶ感染細胞を死滅するため又はＨＩＶ感染を予防又は治療するための遺伝子治療又は細胞に基づく治療手法において使用することができる。例えば、突然変異ＡＬ９ ＴＣＲ並びに膜貫通及び細胞質シグナル伝達ドメインをコードするＴＣＲ遺伝子を、免疫細胞が直ちに細胞表面に高親和性ＡＬ９ ＴＣＲを発現するように、免疫細胞に導入される。これらの細胞は、ＡＬ９ ＴＣＲがＨＬＡ−Ａ２複合体中に提示されるＨＩＶ ｖｐｒペプチドと相互作用すると、免疫機能を発現するように活性化される。これらの細胞はエクスビボでＨＩＶ感染細胞を死滅することに用いられるか、又はＨＩＶ感染患者内に注入して、続いて患者においてＨＩＶ感染細胞を死滅することに用いられる。或いは、適切なベクター中のＴＣＲ遺伝子を直接患者に投与し、それによって遺伝子を患者の免疫細胞に導入して、インビボでこれらの細胞の表面に高親和性ＡＬ９ ＴＣＲを発現できるようにする。これらの細胞はＨＩＶ感染に対する予防又は治療活性をもたらすことができる。
【００８２】
ある特定の例では、ヒトＰＢＭＣは、ＨＩＶ感染患者から単離される。突然変異ＡＬ９ ＴＣＲ、並びに膜貫通及び細胞質シグナル伝達ドメインをコードするＴＣＲ遺伝子はこれらの細胞にエクスビボで導入されて、細胞表面にＴＣＲｓの発現を可能にする。免疫細胞は患者に再導入され、そこでこれらはＨＩＶ感染細胞に対するエフェクター機能を介在する。ＨＩＶ感染細胞に対する免疫細胞の細胞毒性活性も上記のｃａｌｃｅｉｎ放出アッセイを用いてインビトロで試験できる。
【００８３】
参照による取り込み
本願を通して引用される全ての引例、特許、係属中の特許出願及び公開特許は参照により本明細書に明確に取り込まれている。
【００８４】
均等物
当業者は、本明細書に記載されている本発明の特定の実施態様との多くの均等物を認識されるだろう、又は通常の実験程度を用いて確認できるだろう。そのような均等物は以下の特許請求の範囲に包含されることが意図されている。
【図１Ａ−１】
【図１Ａ−２】
【図１Ｂ−１】
【図１Ｂ−２】
【図１Ｃ−１】
【図１Ｃ−２】
【図２Ａ−１】
【図２Ａ−２】
【図２Ａ−３】
【図２Ａ−４】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００９年３月２５日出願の、米国仮特許出願第６１／１６３，４２１号の優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に取り込まれている。
【背景技術】
【０００２】
ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウィルス）感染を治療するための現在の取り組みは、主にウィルスの複製又は感染性を制限することを目的としているが、潜伏ウィルス又はウィルス感染細胞を標的にしていない。ＨＩＶの早い突然変異速度の結果、潜伏ウィルス保有宿主から現れる薬剤耐性変異株が治療患者に疾患の進展及び他の個体への感染を引き起こしている。通常、感染経過の間に生じるＣＴＬ（Cytotoxic T Lymphocyte:細胞傷害性Ｔリンパ球）応答からウィルスがエスケープすることを幾つかの研究が示している。エスケープ変異株は、ＭＨＣ(Major Histocompatibility Complex:主要組織適合遺伝子複合体)に結合するために重要な位置、又はＴＣＲ（T Cell Receptor:Ｔ細胞受容体）とペプチド−ＭＨＣ複合体との相互作用に関与する位置における配列変異の選択を通して生じ得る。これらウィルスのＣＴＬエスケープ変異を避けることは、有効なＣＴＬ応答を誘発するために、そしてＨＩＶ−１に対するワクチンを開発するために重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
従って、広範なＨＩＶばかりでなく感染経過の間に進展する変異株も効果的に標的にする治療薬が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
(発明の概要)
本発明者らは、それらの同族ＭＨＣ複合体中に存在しているときに、ＨＩＶのｖｐｒ（viral protein R:ウィルスタンパク質Ｒ）タンパク質に由来するペプチドと結合するＴＣＲ分子を見出した。特に本発明者らは、得られたＰＣＲ分子が、コンセンサスｖｐｒペプチドエピトープとはなおも結合している一方で、ｖｐｒペプチドエピトープの変異株と結合できるように、これらのＴＣＲ内に変異を行った。
特定の実施態様では、本発明者らは、ｖｐｒのＡＬ９コンセンサスエピトープ（ＡＩＩＲＩＬＱＱＱＬ、アミノ酸５９〜６７）に向上した結合親和性で結合する一方、このエピトープの通常の変異体とも結合する突然変異体ＴＣＲｓを作成した。
【０００５】
従って、一態様では、本発明は、図１に記載の野生型ＴＣＲＶα又はＶβ配列内に少なくとも１つの突然変異を含有している、ＨＩＶ−１ ｖｐｒ由来のＨＩＶエピトープと特異的に結合する単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供する。
一実施態様では、この突然変異は、ＴＣＲの生産性、安定性、特異的結合活性、或いは機能的な活性を増大する。
別の実施態様では、突然変異は、野生型のＴＣＲと比較してＴＣＲ突然変異体の非特異的結合を減少する。
特定な実施態様では、ＴＣＲは単鎖ＴＣＲ又はヘテロ二量体ＴＣＲである。
一実施態様では、ＴＣＲは１つ以上のＴＣＲ結合ドメインを含有している。
【０００６】
一実施態様では、本発明のＴＣＲｓはｖｐｒのＡＬ９ペプチド（ＡＩＩＲＩＬＱＱＬ）を認識する。
別の実施態様では、ＡＬ９ペプチドはＨＬＡ（Human Leukocyte Antigen：ヒト白血球抗原）−Ａ２と関連して存在している。
【０００７】
一実施態様では、ＴＣＲのＴＣＲＶα鎖のアミノ酸残基３９に突然変異がある。
別の実施態様では、ＴＣＲＶα鎖のアミノ酸残基９３に突然変異がある。
特定の実施多様では、アミノ酸残基３９の突然変異は、ＳｅｒからＰｒｏへである。
別の特定の実施多様では、アミノ酸残基９３の突然変異は、ＴｙｒからＨｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ，Ｇｌｎ、又はＡｌａへである。
【０００８】
別の実施態様では、本発明のＴＣＲｓは１つ又はそれ以上のＨＩＶ−１ｖｐｒ ＡＬ９ペプチド変異体と特異的に結合する。
一実施態様では、本発明のＴＣＲｓはＨＩＬＡ−Ａ２に関連してＡＬ９ペプチド変異体を結合する。
関連する実施態様では、ＡＬ９ペプチド変異体は、ＡＬ９ペプチド配列内に１つ又はそれ以上のアミノ酸変化を含有している。
【０００９】
別の実施態様では、本発明のＴＣＲｓは、野生型ＴＣＲと比べて高温における優れた安定性を有している。
本発明の好ましい実施態様では、ＴＣＲは可溶性である。
【００１０】
特定の実施態様では、本発明は、ＨＩＶ−１ ｖｐｒ由来のＡＬ９ペプチドに特異的に結合する単離された単鎖のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供する。
一実施態様では、ｓｃＴＣＲはＡＬ９エピトープを認識する。
一実施態様では、ｓｃＴＣＲは、図１に記載の野生型配列と比較してＶα鎖に１つ又はそれ以上の突然変異を有している。
【００１１】
別の実施態様では、ＴＣＲは更に、機能的ポリペプチドドメイン、診断用／画像化試薬、薬剤含有ナノ粒子、治療薬、細胞毒性薬又は抗ウィルス剤を含有している。
典型的な実施態様では、機能的ポリペプチドドメインは、サイトカイン、免疫グロブリンドメイン、受容体ドメイン又はポリペプチドタグ配列を含有している。
別の典型的な実施態様では、サイトカインはＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロンを含有し、免疫グロブリンドメインはＩｇＧ１定常領域又はＩｇＦｃドメイン、又はこれらの断片を含有している。
別の典型的な実施態様では、ポリペプチドタグはｂｉｒＡ配列を含有している。
【００１２】
別の実施態様では、ＴＣＲは更に、ＴＣＲの細胞表面発現を可能にする膜貫通ドメインを含有している。
一実施態様では、ＴＣＲは更に、細胞質ドメインを含有していて、ここで細胞質ドメインはＴＣＲ突然変異体とＨＩＶエピトープの間の相互作用に応答する細胞内シグナル伝達を許容する。
一実施態様では、ＴＣＲは、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ８、４−１ＢＢ、Ｏｘ−４０、ＩＣＯＳ及び／又はＬｃｋタンパク質に由来する膜貫通及び／又は細胞質シグナル伝達ドメインを含有している。
或いは、ＴＣＲは、ＴＣＲ膜貫通及び／又はＴＣＲ細胞質シグナル伝達ドメインを含有してもよい。
多種の可溶性及び膜結合性融合タンパク質が既に開示されている（Card et al. 2004 Cancer Immunol Immunother. 53:345; Mosquera et al. 2005 J. Immunol. 174:4781; Zhu X et al. 2006 J. Immunol. 176:3223; Belmont et al. 2006 Clin. Immunol. 121:29; Finney et al. 2004. J. Immunol. 172: 104; Brentjens et al. 2007 Clin Cancer Res. 13, 5426; Zhang et al. 2004. Cancer Gene Therapy 11, 487）。
【００１３】
別の実施態様では、突然変異は更に、野生型のＴＣＲと比較して、ＨＩＶエピトープ提示細胞を検出するＴＣＲの活性を増大する。
別の実施態様では、突然変異は、野生型のＴＣＲと比較して、ＨＩＶエピトープ提示細胞に対するＴＣＲの細胞傷害機能活性を増大する。
【００１４】
別の実施態様では、本発明は、本発明のＴＣＲｓ、例えば図２に示されているようなものをコードする核酸分子を提供する。
一実施態様では、本発明は、本発明の核酸分子を含有している発現ベクターを提供する。
更に別の関連する実施態様では、本発明は、本発明の発現ベクターを含有している宿主細胞を提供する。
一実施態様では、宿主細胞は哺乳動物の宿主細胞、例えば、ヒトの細胞である。
【００１５】
一態様では、本発明は、細胞を本発明のＴＣＲと接触させること及びＴＣＲが細胞と結合するか否かを確認すること（ここで、細胞と結合するＴＣＲはＨＩＶ感染を示唆する）によって、ＨＩＶに感染している細胞を検出する方法を提供する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、細胞を本発明のＴＣＲと接触させて、それによってＨＩＶに感染している細胞を死滅することによって、ＨＩＶに感染している細胞を死滅する方法を提供する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、個体から生体サンプルを得ること、及び生体サンプルを本発明のＴＣＲと接触させること（ここでＴＣＲが生体サンプルと結合することは対象がＨＩＶに感染していることを示唆する）によって、対象がＨＩＶに感染しているか否かを確認する方法を提供する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、個体に本発明のＴＣＲ又は核酸、本発明のベクター、又は本発明の宿主細胞を投与し、それによって対象を治療することによる、ＨＩＶを有している対象を治療する方法を提供する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、個体に本発明のＴＣＲ、本発明の核酸或いはベクター、又は本発明の宿主細胞を投与し、それによって対象におけるＨＩＶ感染を阻害することによる、対象におけるＨＩＶ感染を阻害する方法を提供する。
【００２０】
関連する実施態様では、方法は更に、ＨＩＶ感染の危険性が高い対象を同定することを含有している。
【００２１】
別の態様では、本発明は、本発明のＴＣＲ及び薬学的に許容される担体を含有している医薬組成物を提供する。
【００２２】
別の態様では、本発明は、本発明のＴＣＲ及び使用説明書を含有しているキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】図１Ａは、ＡＬ９ｓｃＴＣＲ野生型タンパク質配列を示す（ＣＤＲｓはイタリック体）。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＡＬ９ｓｃＴＣＲの単一突然変異体（Ｙ９３Ｈ）タンパク質配列を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＡＬ９ｓｃＴＣＲの二重突然変異体（Ｓ３９Ｐ、Ｙ９３Ｈ）タンパク質配列を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ＡＬ９ｓｃＴＣＲ野生型の核酸配列を示す（ＣＤＲｓはイタリック体）。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＡＬ９ｓｃＴＣＲの単一突然変異体の核酸配列を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＡＬ９ｓｃＴＣＲの二重突然変異体の核酸配列を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、典型的なリーダー配列を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、各種タンパク質ドメインを示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、各種リンカー配列を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、リーダー核酸配列を表す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、融合ドメイン核酸配列を表す。
【図５】図５は、ＨＥＫ−２９３細胞内で産生したＡＬ９ｓｃＴＣＲのＹ９３及びＡ９７ ＣＤＲ３ Ｖα突然変異の特性評価である。
【図６】図６は、ＣＨＯ細胞内で産生したＹ９３Ｈ ＡＬ９ｓｃＴＣＲ ｓｍの特性評価である。
【図７】図７は、ＣＨＯ細胞内で産生したＳ３９Ｐ ＡＬ９ｓｃＴＣＲの特性評価である。
【図８】図８は、ＣＨＯ細胞内で産生したＡＬ９ｓｃＴＣＲ ｓｍ 及びｄｍ の特性評価である。
【図９】図９は、精製したＡＬ９ｓｃＴＣＲ ｓｍ 及びｄｍ タンパク質の特性評価である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、フローサイトメトリーによる、ＡＬ９負荷Ｔ２細胞に対するＡＬ９ｓｃＴＣＲ ｗｔ 及び ｓｍ タンパク質の滴定を表す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＡＬ９又はｐ５３（対照）ペプチドで負荷されたＴ２細胞へのｗｔ、ｓｍ 及び ｄｍ ＡＬ９ｓｃＴＣＲ多量体の結合を表す。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、ＡＬ９又はｐ５３（対照）ペプチドで負荷されたＴ２又はＢ細胞へのｗｔ、ｓｍ 及び ｄｍ ＡＬ９ｓｃＴＣＲ多量体の結合を表す。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、Ｔ２細胞上に負荷された非特異的ペプチドへの ｗｔ及びｓｍ ＡＬ９ｓｃＴＣＲ多量体の結合が欠如していることを表す。
【図１１】図１１は、フローサイトメトリーによる競合結合分析を表す。
【図１２】図１２は、異なった量のＡＬ９ペプチドで負荷されたＴ２細胞への ｗｔ 及びｓｍ ＡＬ９ｓｃＴＣＲ単量体の結合を表す。
【図１３】図１３は、ＡＬ９ペプチド突然変異体で負荷されたＴ２細胞への ｗｔ 及びｓｍ ＡＬ９ｓｃＴＣＲ多量体の結合を表す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、最も頻繁に生じるｖｐｒＡＬ９ペプチド変異体の公表されている分析を表す（Altfeld et al. 2005. J. Virol. 79: 5000）。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ＡＬ９コンセンサスと比較した、ＡＬ９ペプチド変異体と融合する ｗｔ、ｓｍ 及びｄｍ ＡＬ９ｓｃＴＣＲの結合のフローサイトメトリー分析を表す。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、ＡＬ９ Ｉ６３Ｍペプチド滴定を表す。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、ＡＬ９コンセンサスと比較した、ＡＬ９ペプチド変異体と融合する ｗｔ 及びｓｍ ＡＬ９ｓｃＴＣＲの相対結合の概要を表す。
【図１５】図１５は、ＨＩＶに感染したヒトＣＤ４Ｔ細胞が示すＡＬ９ペプチドへのｗｔ 及びｓｍ ＡＬ９ｓｃＴＣＲ多量体の結合を表す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ＤＭ ＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合タンパク質がＡＬ９及びＡＬ９変異体と結合することを表す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、ＤＭ ＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合タンパク質がＡＬ９ Ｉ６３Ｍ変異体と結合することを表す。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、ＷＴ、ＳＭ 及び ＤＭ ＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合タンパク質がＡＬ９及びＡＬ９変異体と結合することを表す。
【図１７Ａ】図１７Ａは、ＤＭ ＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合タンパク質がＡＬ９で負荷したＴ２細胞に対する細胞溶解活性を介在することを表す。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、ＤＭ及びＳＭ ＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合タンパク質がＡＬ９で負荷したＴ２細胞に対する細胞溶解活性を介在することを表す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（発明の詳細な説明）
本発明者らは、それらの同族ＨＭＣ複合体中に存在しているときに、ＨＩＶのｖｐｒタンパク質に由来するペプチドと結合するＴＣＲ分子を見出した。特に本発明者らは、ｖｐｒのＡＬ９エピトープ（ＡＩＩＲＩＬＱＱＱＬ、アミノ酸５９〜６７）に結合するＴＣＲを同定した。更に、本発明者らは、ウィルスによる感染の経過の間にＡＬ９エピトープ内に生じる多数の共通の変異体を認識するこれらＴＣＲｓの変異体を同定した。本明細書に開示されているデータは、診断及び治療的使用のためのＨＩＶ−１特異的ＴＣＲｓの配列を明らかにする。
【００２５】
現在、ＨＩＶ−１感染細胞を直接標的とするための、組み換えＨＩＶ−１特異抗体が入手できる。抗体による手法の１つの欠点は、ＨＩＶ−１ウィルスのエンベロープのみがＨＩＶ−１抗体にアクセス可能であるのに対して、機能的に最も重要なＨＩＶタンパク質が感染した細胞内部に隠れていて、細胞内プロセシング後及びＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子による提示後の免疫系のみにアクセス可能である。ＭＨＣ分子によって提示されると、これらのＨＩＶ遺伝子産物はＴＣＲｓによって認識されるが、抗体によっては認識されない。従って、ＨＩＶ−１抗体は、非常に限定されたＨＩＶ−１感染細胞のみを標的可能にしている。本明細書に記載されている組成物がこの問題の解決法をもたらす。
【００２６】
ＨＩＶ−１に特異的である可溶性ＴＣＲｓは、既存の手法に優る有意な利点を有している。
【００２７】
ＴＣＲ配列は、ＨＩＶ−１感染細胞を特異的に認識できる組み換え単鎖ＴＣＲの産生に有用である。これらの組み換えＴＣＲは、（ｉ）免疫治療である、細胞治療手法の遺伝子導入においてＨＩＶ−１感染細胞のインビボ標的のために、（ｉｉ）リンパ球又はプロフェッショナル抗原提示細胞でのＨＩＶ抗原発現のエクスビボ評価のために特に有用である。ＨＩＶ−１抗原発現の定量分析は、ＨＩＶ−１免疫病原性についての検討に重要であり、そして予防及び治療方法のエクスビボのスクリーニング／モニタリングに有用である。
【００２８】
現在、ＨＩＶ−１感染患者の治療は抗レトロウィルス剤の使用に基づいている。これらの薬剤は非常に有効であるが、しかし蓄積毒性を有しており、高用量ピルの負荷に関連していて、ウィルス耐性を引き起こしうる。従って、これらの患者に対する別の治療選択肢が継続して必要とされている。可溶性ＴＣＲｓによる免疫療法の治療方法が、ＨＩＶ−感染患者集団のための代替え治療選択肢を代表している。更に、ＴＣＲはＨＩＶ−１抗原発現のエクスビボ評価のために用いられる。
【００２９】
本明細書に記載されているＴＣＲｓは、ＨＩＶ感染の間に通常生じるｖｐｒ遺伝子の多くの変異体を認識して、既に同定されているＴＣＲｓと比較して、本発明の分子に対する効果の増強を可能にしている。
【００３０】
本発明は、ウィルス感染の診断及び治療のための方法及び組成物を特徴としている。方法は、ＨＩＶ−１に特異的なＴ細胞受容体の同定に基づいている。特に本発明は、ＨＩＶ由来ｖｐｒタンパク質のエピトープに特異的に結合するＴＣＲ分子を提供する。エピトープは、ｖｐｒタンパク質中に見出される短い、８〜１１ｍｅｒペプチドを含有しているか或いはこれから成っている。特に、ｖｐｒエピトープはｖｐｒタンパク質のＡＩＩＲＩＬＱＱＬ（アミノ酸５９〜６７）である。
【００３１】
本発明のＴ細胞受容体はヘテロ多量体分子であってよく、或いは単鎖ＴＣＲ分子であってもよい。ｓｃＴＣＲｓは、直接に或いは可動性リンカーを介してＶβ／Ｃβドメインと結合しているＶαドメインを含有している。本発明の特定分子は更に追加のポリペプチドを含有している。この追加ポリペプチドを含有しているある特定の実施態様では、Ｃβドメインが最後のシステインの直前で切断されている。
【００３２】
本発明は、１つ又はそれ以上のアミノ酸置換を含んでいるエピトープの認識を可能にする、可変領域内に１つ又はそれ以上の突然変異を含有しているＴＣＲを提供する。例えば、本発明は、ｖｐｒタンパク質のコンセンサスＡＬ９エピトープのみならず、ＡＬ９エピトープ内に１つ、２つ又は３つのアミノ酸置換を含んでいるエピトープにも結合するＴＣＲｓを提供する。
【００３３】
典型的な実施態様では、本発明のＴＣＲｓは、ｖｐｒタンパク質のアミノ酸番号６０、６１、６２、又は６３に対応する位置に突然変異を含有しているＡＬ９エピトープを認識する。
典型的な実施態様では、ＴＣＲのＶα鎖内の１つ又はそれ以上の突然変異は変異体ｖｐｒの配列の認識を可能にする。
【００３４】
診断方法
可溶性ＴＣＲｓは、プロフェッショナル抗原提示細胞又はＨＩＶ感染細胞上の細胞傷害性Ｔ細胞エピトープの提示についてのＨＬＡが介在する提示を分析するために用いられる。例えば、体液、例えば血液、体組織、例えばリンパ節のサンプルを対象から得る。サンプル由来の白血球を本明細書に記載されている単鎖ＴＣＲｓと接触させる。感受性を増大するために、４つの単鎖ＴＣＲ構築物を例えば、中央のストレプトアビジンと共に一緒に結合して四量体複合体を形成した。この構築物を検出可能なマーカーと結合する、例えば、これを蛍光性フルオロフォアで標識する。検出可能なマーカーは、フィコエリトリン（ＰＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＩＣ）、及びアロフィコシアニン（ＡＰＣ）のような蛍光色素を包含する。検出は、フローサイトメトリー及び／又は組織染色（蛍光顕微鏡検査法又は免疫組織化学）によって実施する。別の例では、複数のＴＣＲ構築物をマイクロアレイ、例えば、チップ又はプレートに固定して、患者由来のサンプルをこのアレイに接触させることが可能となり、アレイを洗浄して、結合した細胞を検出する。この方法では、抗原提示細胞又は患者のＨＩＶ感染細胞上で発現又は提示されるペプチドが測定される。従って、可溶性ＴＣＲは、ＨＩＶ−１エピトープ提示のエクスビボ評価及び定量のための研究ツールとしても有用である。これらは、特定のＨＩＶ−１エピトープ、例えば、ｖｐｒのＡＬ９エピトープを発現する患者を同定するための有用なツールであり、従って、本明細書に記載されている免疫治療的介入についての有望な候補である。
【００３５】
治療方法
ＨＩＶに感染している患者を治療するために、可溶性単鎖ＴＣＲ構築物の１つ又は混合物を投与する。一実施態様では、本発明のＴＣＲｓは、抗体依存性細胞が介在する細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘発する。ＡＤＣＣはＨＩＶ感染に対する効果的な免疫応答をもたらす。これは、ヒトにおいて遅れて進行するＨＩＶ感染である、マカクのサル免疫不全ウィルス疾患からの防御、静脈内投与薬剤使用者のＨＩＶ感染からの保護、及び生殖器のＨＩＶウィルス量の低減と関連付けられている。例えば、高親和性ＡＬ９ｓｃＴＣＲ ＩｇのＡＤＣＣ様活性を介在する能力は、ＨＩＶ感染細胞に対する、標的化、強力な、先天性免疫応答を刺激するために受動免疫治療法にこれらを用いることができることを明らかにする。
【００３６】
別の実施態様では、ＴＣＲｓは更に、機能的ポリペプチドドメイン、診断用／画像化試薬、薬剤含有ナノ粒子、治療薬、細胞毒性薬又は抗ウィルス剤のような、第２組成物を含有している。
典型的な実施態様では、機能的ポリペプチドドメインは、サイトカイン、免疫グロブリンドメイン、受容体ドメイン又はポリペプチドタグ配列を含有している。
典型的なサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ又はインターフェロンであり、そして典型的な免疫グロブリンドメインは、ＩｇＧ１定常領域又はＩＧ Ｆｃドメイン或いはこれらの断片を含有している。
【００３７】
このような構築物の１つの利点は、増大した半減期及びこれらの試薬の感染細胞への直接的な抗原特異的送達である。この治療的戦略は、総薬物用量、投与回数、及び治療に関連する副作用を減少する。
【００３８】
別の実施態様では、本発明のＴＣＲｓをコードする核酸又は本発明のＴＣＲｓを発現する細胞を、ＨＩＶ感染細胞を死滅するため、又はＨＩＶ感染を予防若しくは治療するための遺伝子導入又は細胞に基づいた方法に用いることができる。
一例では、本発明のＴＣＲｓをコードする遺伝子を、本発明のＴＣＲｓを直ちに細胞表面に発現するように免疫細胞へ導入できる。次いで、ＴＣＲがＨＬＡ−Ａ２複合体中に提示されたＨＩＶ Ｖｐｒペプチドと相互作用すると、これらの細胞は免疫機能を発現するように活性化される。これらの細胞は、エクスビボでＨＩＶ感染細胞を死滅するために又は、ＨＩＶ感染している患者へ注入した後、患者のＨＩＶ感染細胞を死滅するために用いることができる。
或いは、本発明のＴＣＲｓをコードする核酸を直接患者に投与することによって、患者の免疫細胞へ遺伝子を導入して、インビボでこれらの細胞上に本発明のＴＣＲｓの発現を可能にすることができる。このような細胞はＨＩＶ感染に対する予防及び治療的活性をもたらす。
【００３９】
本発明のＴＣＲは、当業者に公知の方法によって送達することができる。例えば、静脈内、皮下、筋肉内、及び腹腔内送達経路のような、非経口投与をＴＣＲｓを送達するために用いることができる。例えば、可溶性ＴＣＲ融合物は、０．０１５〜１０ｍｇ／ｋｇの用量でマウス及びヒトに静脈注射されている。患者用量の決定は当該技術分野で周知の方法を用いて行われる。
【００４０】
本発明の組成物をＨＩＶ感染を予防又は治療するため、或いはＨＩＶ感染細胞の数を減少するために投与することができる。特定の状況に対する適切な用量及び投与計画は当該技術分野の技術範囲内である。治療用タンパク質の有効量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇが好ましい。有効用量は、当業者に認識されるように、治療的処置の特性（すなわち、生物学的な、核酸又は細胞に基づく）、投与経路、賦形剤の使用、及び、他の薬剤又は治療薬の使用を包含する他の治療処置の併用によって変化する。治療計画は、標準的な方法を用いて、ウィルス性の病原菌による感染を患っている（又は発症する危険性がある）哺乳動物、例えば、ヒト患者を同定することによって実施される。医薬化合物を、当該技術分野で公知の方法を用いて、このような個体に投与する。好ましくは、化合物を経口、直腸内、経鼻、局所、又は非経口、例えば、皮下、腹腔内、髄腔内、筋肉内、及び静脈内、投与する。
【００４１】
野生型ＴＣＲ配列と比べて突然変異又は置換を含有しているポリペプチドの場合には、変異位置が同類置換であることが好ましいが、必ずしもそうではない。一般に同類置換は、以下の群内の置換を包含する：グリシン及びアラニン；バリン、イソロイシン、及びロイシン；アスパラギン酸及びグルタミン酸；アスパラギン及びグルタミン；セリン及びスレオニン；リジン及びアルギニン；並びにフェニルアラニン及びチロシン。野生型ＴＣＲ配列と比べてアミノ酸置換が行われているペプチドでは、得られるＴＣＲ分子は、１つ又はそれ以上のアミノ酸突然変異を含有している１つ又はそれ以上のＨＩＶペプチドを認識する。特定の実施態様では、ＨＩＶタンパク質はｖｐｒである。野生型ＴＣＲ配列と比べてアミノ酸置換が行われているペプチドでは、Ｔ細胞受容体のそのＨＬＡ拘束性エピトープへの結合親和性が増大している。或いは、置換を含んでいる構築物は高い安定性、例えば、培養培地又は、血液、血漿、或いは血清のような体液などの生理学的に許容される溶液における長い半減期を有している。例えば、このような誘導ペプチドの結合親和性及び／又は安定性は参照するペプチド配列のそれと比べて、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、９０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍又はそれ以上である。
【実施例】
【００４２】
当然のことながら、本発明は次に述べられる実施例に限定することを意図しておらず；むしろ、本明細書に提供されているありとあらゆる適用及び当業者の技術範囲内の全ての均等な変化を包含することを意図している。
【００４３】
実施例１：特異的突然変異を有する単鎖ＴＣＲ構築物の産生
ＨＩＶの１４ｋＤ付属タンパク質である、ＨＬＡ−Ａ２Ｖｐｒ由来のＣＴＬｓは、ウィルスの複製及び宿主の免疫応答の抑制に重要な役割を担っている。これはタンパク質の長さに対してＣＴＬによって最も高い頻度で標的にされるタンパク質の１つである。ｖｐｒに対するＣＤ８＋Ｔ細胞の応答が個体の４５％に見出された（Altfeld et al. 2001, J. Immunol. 167: 2743）。ＨＬＡ−Ａ２．１拘束性Ｖｐｒエピトープ ＡＩＩＲＩＩＱＱＬ（アミノ酸５９〜６７）（ＡＬ９エピトープ）は、ＨＬＡ−Ａ２陽性個体のサブセットにおける一次感染において、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する優れた初期標的を提示できる。それはこのエピトープ内の最も共通するカレント配列（コンセンサス配列）であって、急性感染（２１％）及び慢性感染（２４％）の個体で同様の頻度で標的になる（Altfeld et al. 2005. J. Virol. 79: 5000）。ｖｐｒ発現細胞を標的とする治療は、ＨＩＶ感染細胞の除去に有用かもしれない。しかしながら、Altfeld et alの文献 も感染の急性期にコンセンサス配列を含んでいるウィルスに感染している個体はエピトープ特異的Ｔ細胞応答を組み込むことが不可能であったことを示したが、Ｉ６０Ｌ変異体に感染している対象は全てこれらの応答を生じた。ＡＬ９エピトープの変異体は高い頻度で生じて、ウィルスを除去するために設計された治療による標的とする必要がある。
【００４４】
可溶性Ｔ細胞受容体は、治療分子を感染細胞に効果的に送達するために用いることができる。同系ペプチドＭＨＣに対するＴＣＲｓの本質的に低い親和性（１〜１００μＭ）には治療及び診断の適用に大きな限界がある。ＴＣＲとペプチド−ＭＨＣとの接触は、Ｖα ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、並びに／又はＶβ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を介して生じ、ＣＤＲ３ドメインでペプチドと最も接触を生じる。これらの領域内の残基の突然変異がＴＣＲの親和性を改善することを、幾つかの研究が示している。マウスの同種反応性ＴＣＲである、２Ｃ ＴＣＲの高い親和性変異体は、ＣＤＲ３α突然変異体のライブラリーからの選択に続く酵母提示によって同定した。ＮＹ−ＥＳＯ−１腫瘍関連抗原及びヒトＴ細胞リンパ向性ウィルス１型（ＨＴＬＶ−１）タックスペプチドに特異的なＴＣＲｓのＣＤＲ３領域の突然変異及びこれらのファージの表面への提示もＴＣＲ親和性を改善するために用いられている。
【００４５】
本実施例はｖｐｒタンパク質（ＡＬ９エピトープ）のアミノ酸５９〜６７を認識する単鎖ＴＣＲの産生及び特性化を、本文中にＨＬＡ−Ａ２を用いて、記載している。天然のＴＣＲは、殆どのＴＣＲの高い親和性範囲である、１．８μＭのＫＤでＡＬ９コンセンサスペプチドと結合する。しかしながら、これは感染経過の間に通常生じることが知られている幾つかの変異体を、優れた親和性では認識しない。この制限を打破してその親和性を更に増大するために、ＣＤＲ３αループ領域のチロシン（Ｙ）のヒスチジン（Ｈ）への置換によってタンパク質の突然変異体を作成した。この突然変異体はコンセンサスＡＩＩＲＩＬＱＱＬ配列とはるかに高い親和性で結合する一方で、高度のペプチド特異性を保持している。重要なことは、ＨＩＶ感染の間に高頻度で生じることが知られている変異体エピトープが、野生型ＴＣＲよりはるかに高い親和性で新たに改善されているＴＣＲに認識されることである。また、高親和性ＴＣＲの多量体形態はＨＩＶ−１に感染したＣＤ４＋Ｔ細胞と効率的に結合できる。ＡＬ９ｓｃＴＣＲの野生型及び高親和性突然変異体をＩｇ重鎖定常ドメインと融合してエフェクター機能を供給した。この融合タンパク質はペプチド特異的結合活性を保持し、二量体を形成し、そしてＦｃ依存性細胞毒性による標的細胞死滅を介在できる。
【００４６】
ＡＬ９ペプチド（アミノ酸５９〜６７：ＡＩＩＲＩＬＱＱＬ）／ＨＬＡ−Ａ２複合体に特異的なＣＴＬｓを既に記載されているようにして、ＨＩＶ−１感染患者から単離して（Altfeld et al. 2005. J. Virol. 79: 5000）、ＴＣＲα及びβｃＤＮＡｓを産生するための供給源として用いた。これらのＣＴＬｓから得られる最も高い頻度で生じるＴＣＲα及びβ鎖のＶ領域は、それぞれ、既に記載されているような（ＵＳＳＮ １１／７８４，２７７）、ＴＲＡＶ５／ＴＲＡＶＪ３６及びＴＲＢＶ１４／ＴＲＡＢＪ２−１であった。
【００４７】
高親和性ＴＣＲｓを産生するために、ＴＣＲ ＣＤＲ領域及び隣接アミノ酸残基を突然変異させて、得られたタンパク質をスクリーニングすることができる。ＨＬＡ−Ａ２／ＡＬ９特異的ＴＣＲ（ＡＬ９ ＴＣＲ）、Ｖα及びＶβＣＤＲ配列を図１Ａに、対応する核酸コード領域を図２Ａに示した。この実施例のために、ＣＤＲ３ Ｖα領域内の各アミノ酸を、２０の天然アミノ酸が提供する主要な側鎖化学を示すために選ばれた、９個のアミノ酸のうちの１個と系統的に置換する、突然変異戦略を用いて、ＶαＣＤＲ３領域を突然変異した。以前の研究は、ペプチドＭＨＣ境界面の中央に存在する、ＣＤＲ３αループのアミノ酸を突然変異させて高親和性ＴＣＲｓを産生することが可能であることを示している（Holler et al. 2000 PNAS 10: 5837）。従って、ＣＤＲ３Ｖαループの５つのアミノ酸（Ｙ−Ｑ−Ｔ−Ｇ−Ａ）をコードするＡＬ９ＴＣＲの遺伝子配列を主要側鎖化学を代表する９個のアミノ酸に変異させた。これらのアミノ酸はＴＣＲ Ｖα鎖のａａ９３〜９７に位置していて、９３位（ｔｙｒ）の変化がＨＬＡ−Ａ２／ＡＬ９複合体に対して改善された（高い）親和性を示した。
【００４８】
単離されたＶα遺伝子断片に、非コンセンサスセリンコドンが、第２フレームワーク領域のａａ３９位に見出された。このコドンをコンセンサスプロリンコドンに突然変異させてＴＣＲ生産性、安定性及び親和性について、この変化の効果を評価した。
【００４９】
Ｖα遺伝子に異なった突然変異をコードする配列を挿入するために、ＣＤＲ３α配列を部位特異的突然変異誘発法で改変して、固有の制限酵素部位（ＡｇｅＩ）を含有させた。この変化はコードするアミノ酸に変化をもたらさなかった。次いで、所望の配列変化をコードするオリゴヌクレオチドプライマーを用いる標準的なＰＣＲ方法によって、突然変異遺伝子、ＴＣＲＶα遺伝子断片を産生した。次いで、これらの遺伝子断片をＶα遺伝子内にクローン化して野生型配列を置き換えた。ＴＣＲα及びβ鎖を、可動性リンカーを介してＶβ／Ｃβドメインに結合しているＶαドメインから成る単鎖（ｓｃ）ＴＣＲフォーマット内にクローン化した（Card et al. 2004 Cancer Immunol Immunother. 53:345; Mosquera et al. 2005 J. Immunol. 174:4781; Zhu X et al. 2006 J. Immunol. 176:3223）。Ｃβドメインを最終システインの直前で切断した。
【００５０】
ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡ融合を作るために、ｓｃＴＣＲ遺伝子断片をｂｉｒＡタグ配列をコードする配列の上流にクローン化した。ｂｉｒＡタグは、ストレプトアビジンを用いるその後の多量体化のためのタンパク質の部位特異的ビオチン化を可能にする。ｓｃＴＣＲ ＩｇＧ１融合を作成するために、ｓｃＴＣＲ遺伝子断片をヒトＩｇＧ１定常鎖領域をコードする配列の上流にクローン化した。同様に、ｓｃＴＣＲ遺伝子断片を適切なサイトカイン又はサイトカイン受容体遺伝子配列と結合することによって、ｓｃＴＣＲ−ＩＬ２、ｓｃＴＣＲ−ＩＮＦα、ｓｃＴＣＲーＧＭＣＳＦ、ｓｃＴＣＲ−ＩＬ１５及びｓｃＴＣＲ−ＩＬ１５Ｒ融合を作成した。膜発現のために、ｓｃＴＣＲ遺伝子をＨＬＡ Ａ２膜貫通ドメイン又はＣＤ３ｚｅｔａ膜貫通ドメインをコードする上流配列にクローン化した。膜発現及び細胞内シグナル伝達のために、ｓｃＴＣＲ遺伝子をＣＤ３ｚｅｔａ、ＣＤ２８、ｃｄ８、４−１ＢＢ、Ｏｘ−４０、ＩＣＯＳ及び／又はＬｃｋドメインにリンクさせることができる。或いは、ＴＣＲを、ＴＣＲ膜貫通及び細胞質シグナル伝達ドメインを含有しているヘテロ二量体α／βＴＣＲとして、細胞表面上に発現させることができる。
多種の可溶性で膜結合性の融合タンパク質が既に開示されている（Card et al. 2004 Cancer Immunol Immunother. 53:345; Mosquera et al. 2005 J. Immunol. 174:4781; Zhu X et al. 2006 J. Immunol. 176:3223; Belmont et al. 2006 Clin. Immunol. 121:29; Finney et al. 2004. J. Immunol. 172: 104; Brentjens et al. 2007 Clin Cancer Res. 13, 5426; Zhang et al. 2004. Cancer Gene Therapy 11, 487）。
最適な産生、溶解性、生物活性、タンパク質−タンパク質相互作用、多量体化、又は立体障害を避けるための個々のドメインの位置決めをもたらすために、ｓｃＴＣＲと融合タンパク質ドメインの間及び／又は異なった融合タンパク質ドメインの間に更なるペプチドリンカーを配置することができる。
【００５１】
可溶性又は細胞膜の発現を可能にするために、ｓｃＴＣＲ融合構築物を発現ベクターのリーダー配列の下流にクローン化した。ベクターは、適切な遺伝子発現を可能にするためにプロモーター／エンハンサー調節配列及びポリＡ配列、並びに発現ベクターを含有している宿主細胞の単離を可能にするための選択可能なマーカーをコードする遺伝子を含有している。
【００５２】
ＡＬ９ｓｃＴＣＲ野生型（非変異）タンパク質配列（野生型又は「ｗｔ」と称する）を図１Ａに示す。ＴＣＲ Ｖα鎖の９３位にＴｙｒのＨｉｓへの変異を含有しているＡＬ９ｓｃＴＣＲタンパク質配列（単一変異又は「ｓｍ」と称する）を図１Ｂに示す。ＴＣＲ Ｖα鎖の９３位にＴｙｒのＨｉｓへの変異及び３９位にＳｅｒのＰｒｏへの変異を含有しているＡＬ９ｓｃＴＣＲタンパク質配列（二重変異又は「ｄｍ」と称する）を図１Ｃに示す。対応するＡＬ９ｓｃＴＣＲ ｗｔ、ｓｍ及びｄｍの核酸配列を図２Ａ〜Ｃに示す。リーダー配列、各種可溶性融合タンパク質ドメイン及びリンカー配列についてのタンパク質配列を、図３Ａ〜Ｃに、対応する核酸配列を図４Ａ〜Ｃに示す。
【００５３】
実施例２：タンパク質の産生及び精製
哺乳動物の細胞内で融合タンパク質を生成するために、ＨＥＫ−２９４又はＣＨＯ細胞に、リポフェクトアミン２０００を用いて、発現ベクターを形質導入した。Ｇ４１８（２ｍｇ／ｍｌ）を含有している培地中で、限界希釈クローニングによって単一細胞クローンを選択した。
【００５４】
ＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡの野生型及び変異体融合タンパク質を細胞培養上澄液から、Sepharose 4 Fast Flow カラム（American Bioscience）に結合させた、抗ヒトＴＣＲ抗体ＣβｍＡｂ（ＢＦ１）８Ａ３．３１を用いて、免疫親和性クロマトグラフィーで精製した。精製した融合タンパク質を、製造会社の説明書に従って、過剰なビオチンの存在下でビオチン−タンパク質リガーゼ（Avidity）でビオチニル化して、ＡＬ９ｓｍ／ｂｒｉＡ単量体を作成した。ビオチニル化ＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡタンパク質をＲ−ＰＥ共役ストレプトアビジン（Jackson Immunoresearch）を用いて、ＴＣＲ／ストレプトアビジンのモル比４：１で、４℃で少なくとも６０分かけて、多量体化した。
【００５５】
精製したＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡの野生型及び変異体融合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析してＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｇ−２５０で染色した。タンパク質の還元及び非還元条件下でのＳＤＳゲル分析は、タンパク質が単量体で、ほぼ５２ｋＤの分子量を有していることを示した。これは分子量の計算値４４．３ｋＤより大きく、これらのタンパク質がグリコシル化されていることを示唆している。
【００５６】
ＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡ融合タンパク質をビオチン タンパク質リガーゼを用いてビオチニル化した。野生型及び突然変異体タンパク質がビオチニル化された効率を、捕捉のためにＢＦＩ抗体を、そして検出のためにＳＡ−ＨＲＰを用いて、ＥＬＩＳＡで比較した。その結果は両方のタンパク質が同程度ビオチニル化されたことを示した。
【００５７】
ＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ＩｇＧ１融合はヒトＩｇＧ１鎖の定常ドメインに直接結合しているＴＣＲｓから成っている。ＩｇＧヒンジ領域のシステイン残基は、無傷の二量体形成を可能にして、これはタンパク質を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析すると観察される。
【００５８】
実施例３：ＥＬＩＳＡによるＡＬ９ｓｃＴＣＲ突然変異体融合タンパク質の濃度及びペプチド−ＨＭＣ結合活性の特性化
短期間細胞培養で産生されたＡＬ９ｓｃＴＣＲ野生型及び突然変異体融合体を、ＴＣＲタンパク質濃度及びペプチドＨＭＣ四量体への結合活性についてＥＬＩＳＡで評価した。これらのアッセイでは、９６ウェルの Maxisorb プレート（Nunc, Rochester, N.Y.）をＢＦ１ ｍＡｂ（（１μｇ／ｍｌ）でコーティングした。融合タンパク質を含有している細胞培養上澄液を閉鎖プレートに添加して室温で２時間培養した。洗浄した後、結合活性について、ＡＬ９ペプチド−ＨＬＡ−Ａ２四量体−ＨＲＰ（０．５μｇ／ｍｌ）を用いて、又はＴＣＲタンパク質濃度についてビオチニル化抗−ヒトＴＣＲ Ｃβ抗体ｍＡｂ Ｗ４Ｆ（０．５μｇ／ｍｌ）次いでストレプトアビジン−ＨＲＰ（０．５μｇ／ｍｌ）を用いて、タンパク質を検出した。次いで、ＡＢＴＳ基質を加えて、９６ウェルプレートリーダー（Bio-Tek Instrument）を用いて４０５ｎｍで吸光度を測定した。
【００５９】
ＴＣＲ Ｖα鎖の９３及び９７位における多種の突然変異を図５に示すようにこれらのアッセイで特性化した。９３位における突然変異の大多数は、短期間細胞培養で、高い発現レベル及び／又は増大したタンパク質安定性を示す、タンパク質を高い濃度でもたらした。更に、突然変異の幾つかは、増大した結合活性を示す、ＡＬ９ペプチド−ＨＬＡ−Ａ２の四量体への結合の増大ももたらした。これに対して、９７位（図５）又はＣＤＲ３α或いはＣＤＲ３β領域の何れかの別の位置における変化は、結合活性を改善できなかった。結合活性をタンパク質濃度について正規化すると、Ｙ９３のＬ、Ｋ、Ｑ又はＨへの突然変異は、ＡＬ９ｓｃＴＣＲｗｔタンパク質と比べて、有意に高いレベルのＡＬ９−ＨＬＡ−Ａ２結合活性を示した。ＣＤＲ３αループにおけるＹ９３のＨへの置換は野生型ＴＣＲに比べてもっとも優れた親和性を有するＴＣＲをもたらしていて、これをさらに特性化した。以前の研究は、ＡＬ９ｓｃＴＣＲｗｔタンパク質は、温度に対して感受性があり、３７℃の細胞培養条件で生産した後に、培地中にタンパク質を高濃度で観察できなかったことを示した。形質転換したＣＨＯ細胞によって産生されたｓｍ（Ｙ９３Ｈ）及びｗｔＡＬ９ｓｃＴＣＲタンパク質の濃度を室温又は３７℃に保持した短期間培養において試験した。図６に示すように、ｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲは、３７℃のＣＨＯ培養において、ｗｔＡＬ９ｓｃＴＣＲタンパク質よりはるかに高い濃度の発現タンパク質を表示し、改善された産出量及び／又はタンパク質安定性を示した。再度、ｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲｓｍは、ＡＬ９ｓｃＴＣＲｗｔタンパク質よりも、ＡＬ９−ＨＬＡ−Ａ２複合体へのより良い結合を示して、タンパク質濃度について正規化すると、室温又は３７℃の何れかで産生したＹ９３Ｈ ＡＬ９ｓｃＴＣＲｓｍタンパク質はｗｔタンパク質より高い結合活性を示した。
【００６０】
同様の方法を、ＴＣＲ Ｖα鎖におけるＳ３９Ｐ突然変異の特性化に用いた。図７に示すように、短期間培養で形質転換ＣＨＯ細胞によって発現されたＡＬ９ｓｃＴＣＲ Ｓ３９Ｐは、ＡＬ９ｓｃＴＣＲｗｔタンパク質よりも、ＡＬ９−ＨＬＡ−Ａ２複合体への増大した結合活性を示した。Ｓ３９Ｐ及びＹ９３Ｈ突然変異を単一のＡＬ９ｓｃＴＣＲに組み合わせると、得られた二重突然変異体は、単一突然変異体又はｗｔＡＬ９ｓｃＴＣＲタンパク質よりも、優れた生産性、３７℃における安定性、及びＡＬ９−ＨＬＡ−Ａ２複合体への結合活性を示した（図８）。ＣＨＯ上澄液からＢＦ１ ｍＡｂ親和性クロマトグラフィーで精製したタンパク質に同様な結果が観察された。ＡＬ９ｓｃＴＣＲｓｍ及びｄｍ構築物の両方が、ＡＬ９ｓｃＴＣＲｗｔタンパク質よりも、優れた３７℃における安定性及びＡＬ９−ＨＬＡ−Ａ２複合体への増大した結合活性を示した（図９）。
【００６１】
実施例４：フローサイトメトリーによるＡＬ９ｓｃＴＣＲ突然変異体融合タンパク質の特性化
ＡＬ９ｓｃＴＣＲｗｔと突然変異体の融合タンパク質の、ＡＬ９ペプチド負荷ＨＬＡ−Ａ２陽性抗原提示細胞（Ｔ２細胞）への機能結合をフローサイトメトリーで測定した。Ｔ２細胞に５０μＭのコンセンサスＡＬ９ペプチドを、３７℃で３時間負荷した。ＳＡ−ＰＥの添加によって多量体化してあるビオチニル化ＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡタンパク質を、１〜０．００１μｇの異なった濃度で、４℃で３０分間加えた。洗浄工程に続いて、CellQuest ソフトウェア（BD Biosciences）を用いて、サンプルをＦＡＣＳスキャンフローサイトメトリーで分析した。図１０Ａに示すように、ｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡ多量体は、ＴＣＲ濃度が＜０．５μｇ／試験のときに、ｗｔＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡ多量体より２〜３倍高い、ＡＬ９ペプチド負荷細胞への結合活性を示した。
【００６２】
ｗｔ及びｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡ融合体の単量体形態も、同じ実験で、標的細胞の表面上のペプチド−ＭＨＣを検出するために用いた。Ｔ２細胞に、上記のように、５０μＭのＡＬ９ペプチドを負荷した。ＡＬ９ｗｔ及びＡＬ９ｓｍＴＣＲのビオチニル化形態は、１〜０．００１μｇ範囲の多量体形態と等モル量を加えた。洗浄工程に続いて、結合した単量体をＳＡ−ＰＥで検出した。０．５〜１μｇにおいて、野生型単量体に比べて２〜３倍高いＡＬ９ｓｃＴＣＲｓｍモノマーの結合があった。この相違は、０．２５〜０．０６μｇ濃度で４〜８倍に、そして０．０３〜０．００１μｇ濃度で２０〜３０倍に増加した。野生型及びｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲの間のこの相違は、ｓｃＴＣＲの単量体形態を用いたときに特に明白であった（図１０Ａ）。野生型又は突然変異ＴＣＲ単量体若しくは四量体の何れかのパルス処理していない細胞への結合は、高い濃度であってさえも、殆ど又は全くなかった。ｄｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｒｉＡ融合体で行った同様な検討も、このタンパク質がｗｔＡＬ９ｓｃＴＣＲと比べてＡＬ９ペプチド負荷Ｔ２細胞への増大した結合活性を示した（図１０Ｂ）。また、ｓｍ及びｄｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｒｉＡ融合体の両方は、ＨＬＡ−Ａ２＋Ｂ細胞によって提示されるＡＬ９ペプチドに結合できる（図１０Ｃ）。これらの試験で、２６４ｓｃＴＣＲ及びｐ５３ａａ２６４〜２７２ペプチドを陰性対照試薬として用い、ＴＣＲ及びペプチド特異性を評価して、期待された特異性を観察した。これらのデータは共に、ＡＬ９ｓｃＴＣＲｓが３ドメイン単鎖形態において生物学的機能性であること、及びＡＬ９ｓｃＴＣＲｓｍ及びｄｍ融合体が、ＡＬ９ペプチド負荷細胞に、野生型ＡＬ９ｓｃＴＣＲと比べてより高い親和性で、特異的に結合することを裏付けている。
【００６３】
野生型又はｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｒｉＡタンパク質と同族ペプチド−ＭＨＣとの間の特異的相互作用を、無関連の対照ペプチドのパネルへのそれらの結合を分析して確認した。Ｔ２細胞は、コンセンサスＡＬ９ペプチド又はＨＩＶ−１ｇａｇ（７７〜８５）、ｐｏｌ（４６４〜４７２）、ＣＭＶ、ＨＣＶコア、ＨＢＶｅｎｖ、ｐ５３（２６４〜２７２）、ＭＡＲＴ−１由来のペプチドで負荷するか、或いはパルス処理しないでおく。次いで、ビオチニル化野生型ＡＬ９ｓｃＴＣＲ、ｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ又は対照のＭＡＲＴ１ｓｃＴＣＲを加え、続いてストレプトアビジン−ＰＥと培養した。野生型又はｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲｓの何れかの、無関連なペプチドの何れかへの結合は観察されなかった（図１０Ｄ）。従って、ｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲのより高い親和性は、そのペプチド結合特異性を損なわない。
【００６４】
ＡＬ９ペプチド負荷Ｔ２細胞に結合するために互いに競合する野生型又はｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡ融合タンパク質の能力を分析した。ビオチニル化野生型又はｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲの結合を２〜１００倍過剰の非ビオチニル化競合体の存在下又は非存在下で測定した。図１１に示すように、高親和性単一突然変異体は野生型ＡＬ９ｓｃＴＣＲと、２倍過剰であっても非常に効果的に競合した。５〜１０倍過剰のより高い濃度では、わずかに優れていただけで、ｗｔＡＬ９ｓｃＴＣＲの２５倍過剰の突然変異体との結合は殆ど完全に破棄された。対照的に、野生型ＡＬ９ｓｃＴＣＲはｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲと効果的に競合しなかった。１０倍過剰又はそれ以下の野生型では殆ど又は全く阻害されなかった、２５〜１００倍過剰では、いくらかの阻害が観察されたが、それは大して大きな影響を与えなかった。従って、野生型ＡＬ９ｓｃＴＣＲは、たとえ高濃度であってもｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲの結合を効果的に阻止できないが、突然変異体は、たとえ２倍の過剰であってもｗｔＡＬ９ｓｃＴＣＲの非常に優れた競合体である。これらのデータは、ｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲがＡＬ９−ＨＬＡ−Ａ２複合体への高い結合活性を有していて、ｗｔＡＬ９ＴＣＲの結合を阻害できるという結論を裏付けている。
【００６５】
ｗｔとｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡ融合体の感受性を細胞表面上の各種量のペプチドを検出するそれらの能力を比較して評価した。Ｔ２細胞を１２ｎＭ〜１００μＭ範囲の濃度のＡＬ９ペプチドで負荷した。次いで、０．５μｇの単量体ｗｔ又はｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡを加えて、フローサイトメトリーで結合を評価した。細胞１個に結合したＰＥ分子の数を評価するために、ペプチドの各種濃度で得た平均蛍光強度を、ビーズ当たりのＰＥ量が公知である、ＰＥ結合検定ビーズの標準曲線と比較した。図１２に示すように、試験した全てのペプチド濃度で、ＡＬ９ペプチドで負荷したＴ２細胞を検出するｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲの能力はｗｔＡＬ９ｓｃＴＣＲと比べて有意に増大している。ｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲは、わずか１２ｎＭのＡＬ９ペプチドでＴ２負荷細胞を染色できたのに対して、野生型ＴＣＲは、Ｔ２細胞表面の１９５ｎＭペプチドを検出しただけであった。同様な結果が、ｄｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ融合体で観察された。
【００６６】
実施例５：ＡＬ９ペプチド変異体に結合しているＡＬ９ｓｃＴＣＲ突然変異体融合タンパク質の特性化
ＴＣＲ−ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２複合体の結晶構造は、９−ｍｅｒペプチドの中間にあるアミノ酸がＴＣＲのＣＤＲ３領域と接触していることを示唆している。野生型及び突然変異ＴＣＲｓ結合にどのペプチドアミノ酸が重要であるかを確認するために、ＡＬ９ペプチド（ａａ５９〜６７：ＡＩＩＲＩＬＱＱＬ）の６０、６２、６４、６５、６６及び６７位にアラニン置換を行った。ＨＬＡ−Ａ２複合体へのこれらの変異体の相対結合（ＩＣ５０）を既に記載されているように（Altfeld et al. 2005. J. Virol. 79: 5000）、競合分析によって評価して、それぞれのペプチドについて図１３に示す。これらのペプチドをＴ２細胞に負荷して、上記のように細胞をｗｔ及びｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＥ−ｂｉｒＡ多量体で染色した。フローサイトメトリー分析を実行して、ｗｔ及びｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ多量対のコンセンサスペプチド及び変異ペプチド負荷細胞に対する相対的結合親和性を評価した。２６４ｓｃＴＣＲを対照試薬とした。
【００６７】
結果は、６０、６５、６６及び６７位におけるアミノ酸の置換はｗｔ及びｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲの間の結合に何れも重要な変化をもたらさなかった（図１３）。しかしながら。６４位におけるＬｅｕのＡｌａへの置換は野生型の結合を有意に減少したが、ｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲの結合を減少しなかった。このことは、６４位は天然ＴＣＲに対して重要な接点であるが、親和性の高い突然変異体には重要ではないことを示唆している。
【００６８】
６２位におけるＡｒｇのＡｌａへの置換は、不溶性ペプチドをもたらしたのに対して、この位置のＧｌｕ置換体は可溶性だった。この置換は、単量体及び四量体形態の両方において、ｗｔ及びｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ多量体の両方の結合を完全に無効にして、野生型及び突然変異体両方のＴＣＲペプチド相互作用に対して重要な接点であることを示唆した。
【００６９】
ＨＩＶにおけるＡＬ９エピトープの種々の天然変異体は、 Los Alamos データベース（http://www.hiv.lanl.gov）で報告されている。最も頻繁に生じる変異体の分析は、６０位におけるイソロイシンのロイシン変異体への、及び６１及び６３位におけるスレオニン及びメチオニン置換を示している（図１４Ａ、Altfeld et al. 2005. J. Virol. 79: 5000）。これら及びその他の変異体に対応するペプチドを合成して、変異体ペプチドで負荷した細胞への野生型、ｓｍ又はｄｍＡＬ９ｓｃＴＣＲの結合を、図１４Ｂに示した一連の試験においてフローサイトメトリーで比較した。上記のように、Ｔ２細胞をＡＬ９コンセンサス又は変異ペプチド（それぞれ５０μＭ）で３時間３７℃で負荷して、ＰＥで標識したｗｔ、ｓｍ又はｄｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ多量体で染色した。
【００７０】
ｗｔＡＬ９ｓｃＴＣＲ多量体は６３位においてＴｈｒ及びＭｅｔ置換を有しているＡＬ９変異体への結合の減少を示した。一方、ｓｍ及びｄｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ多量体はこれらの変異体への優れた結合を示した。ＡＬ９ペプチドにおける６０及び６１位の置換は、ｗｔ又はｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲの何れの結合にも影響を与えなかった。図１４Ｃに示すように、５０μＭ〜０ｎｍ濃度でのＩ６３Ｍペプチドの滴定では、ｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲがこの変異体を確認できるが、野生型ＴＣＲ四量体はできないことを確認した。
【００７１】
６２位におけるＧｌｕへの置換が野生型及び突然変異体ＡＬ９ｓｃＴＣＲ両方の結合を無効にすることを示したので、ＡｒｇをＬｙｓで置換することがこれらのＴＣＲの結合にどのような効果をもたらすかを確認することに関心を持った。この置換はデータべース中にＨＩＶの天然変異体として報告されている。６２位におけるＬｙｓ置換は、野生型の結合を減少するが、高親和性ｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ多量体の結合は減少しない（図１４Ｂ）。
【００７２】
従って、ｓｍ及びｄｍＡＬ９ｓｃＴＣＲｓがＡＬ９コンセンサスペプチドに高い親和性で結合するばかりではなく、これらのタンパク質は６２、６３及び６４位における変異体も野生型ＡＬ９ＴＣＲよりずっと強く認識する（図１４Ｂ）。図１４Ｄは、ｗｔ及びｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ多量体の、ＡＬ９コンセンサスペプチドと比較した、一般的なＡＬ９エピトープ変異体への相対的結合活性の要約を示している。ｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲは、コンセンサスペプチドについて観察したものと比べて＞７０％でこれらの変異体への結合活性を保持していて、この突然変異ＴＣＲ融合タンパク質はこれらの変異エピトープを提示しているＨＩＶ感染細胞を認識できるはずだということを示している。
【００７３】
実施例６：ＡＬ９ｓｃＴＣＲ融合タンパク質によるＨＩＶ感染ヒトＴ細胞上のＡＬ９抗原提示の検出
上で示した結果は、ｗｔ及び突然変異体ＡＬ９ｓｃＴＣＲタンパク質がＡＬ９ペプチド−ＨＬＡ−Ａ２複合体及びＨＬＡ−Ａ２＋細胞上に提示された内因的に付加されたＡＬ９ペプチドに結合可能でであったことを明らかにしている。しかしながら、ＨＩＶ感染細胞を標的にするためには、ＴＣＲ融合タンパク質は、内部発現されたＨＩＶｖｐｒタンパク質への抗原提示経路を介して生成される細胞表面上に提示されたＡＬ９を検出するのに十分感受性で特異的でなければならない。これを試験するために、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１ドナーからＣＤ４＋Ｔ細胞を磁性ビーズ（Miltenyi Biotech）によって単離して、既に記載されているようにして（Migueles et al. 2002 Nat Immunol 3: 1061）、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３；Coulter）、抗ＣＤ２８（PharMingen）及びＩＬ−２を含有している培地で刺激した。３日目に、５×１０６個の細胞を２００μｌの培地中、３７℃で１時間、５，０００ＴＣＩＤ５０のＨＩＶＳＦ１６２で感染させて、次いで２４ウェルプレート中１０６細胞／ｍｌで培養液中で更に６日間保持した。６日目に、磁性ビーズを用いてＣＤ８＋細胞を枯渇させた。感染した細胞のパーセントを、Ｋｃ５７−ＦＩＴＣ又はＫｃ５７−ＲＤ１（Coulter）でｐ２４について細胞内染色して記録した。次いで感染した細胞をｗｔ及びｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ多量体及び抗−ＣＤ４ｍＡｂ−ＡＰＣで染色した。ＨＩＶ感染はＣＤ４の細胞表面発現の下方制御をもたらした。従って、ＡＬ９ペプチドの提示を、低レベルのＣＤ４染色した感染細胞中で評価できる。図１５に示すように、ｗｔ及びｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡ多量体はＨＩＶ感染Ｔ細胞によって提示されるＡＬ９ペプチドを検出可能であった。感染細胞を非感染細胞と比較すると、ｗｔＡＬ９ｓｃＴＣＲ陽性染色細胞のパーセントに１５倍の増大が、そしてｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ陽性染色細胞のパーセントに２７倍の増大が見られた。また、下方制御されたＣＤ４を有する細胞に増大したＡＬ９ｓｃＴＣＲ染色が観察された。この研究において、ｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡ多量体はｗｔＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｒｉＡ多量体より約２倍多いＨＩＶ感染細胞を検出して、ＴＣＲ突然変異体のＡＬ９ペプチドへの増大した結合活性と一致した。
【００７４】
実施例７：ＡＬ９ペプチド及びペプチド変異体に結合しているＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合タンパク質の特性化
上で示したように、ＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合タンパク質を産生して精製した。ＡＬ９負荷Ｔ２細胞を用いて、ｄｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合体の結合活性を、ｗｔ及びｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡ融合体と比較した。このアッセイにおいて、ＴＣＲ結合をビオチニル化ＢＦ１ｍＡｂを用い、続いてＳＡ−ＰＥで検出した。図１６Ａに示すように、ｄｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合タンパク質はＡＬ９コンセンサスペプチド又はＡＬ９Ｉ６３Ｍ変異体の何れかで負荷したＴ２細胞への優れた結合を示した。実際、二量体ｄｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇは、単量体ｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡ融合体より優れたＡＬ９Ｉ６３Ｍ変異体への結合を示した。ｄｍ及びｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合体の結合活性を、ＡＬ９コンセンサス及びＡＬ９Ｉ６３Ｍ変異体で負荷したＴ２細胞を用いて、ｗｔＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｒｉＡ多量体及びｗｔＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合体と比較した（図１６Ｂ〜Ｃ）。これらの試験は、ｄｍ及びｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合体がｗｔＡＬ９ｓｃＴＣＲタンパク質よりもＡＬ９及びＡＬ９変異体へのより優れた結合を示すことを立証した。興味深いことに、ｄｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合タンパク質は、ｗｔ又はｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合体の何れより、非パルス処理Ｔ２細胞へのより低いバックグラウンド結合を示す（図１６Ｃ）。ｗｔ又はｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合体のより高いバックグラウンド染色はＴ２細胞上の受容体へのＩｇ Ｆｃドメインの結合によるものと思われる。ｄｍ及びｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲタンパク質の間のバックグラウンド結合の差異は、ｂｒｉＡ融合体多量体形態を用いては観察されず、Ｉｇ形態の二重突然変異体中のＴＣＲα ＦＲ２突然変異が、低い非特異結合活性をもたらすことを示唆している。この効果は特異的生物活性を標的とするために有利である。
【００７５】
実施例８：ＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合タンパク質はＡＬ９ペプチド特異性の細胞毒性を介在する
ＡＬ９負荷標的細胞に対するＦｃ依存性細胞傷害性を誘導する、ｗｔ、ｄｍ及びｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合体の能力を試験した。これらのアッセイでは、ＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合体はＦＣ受容体を含む免疫エフェクター細胞とペプチド−ＭＨＣ提示標的細胞を接合して、エフェクター細胞はＡＤＣＣ様メカニズムを径由して標的細胞溶解を介在する。本実施例において免疫エフェクター細胞として働く、ヒトＰＢＭＣｓをヒト血液軟膜からHistoPague（Sigma-Aldrich）を介する勾配遠心分離によって単離した。５０μｇ／ｍｌのペプチドで３７℃、２時間パルスしたＴ２細胞を標的細胞として用いた。標的細胞を５０μｇ／ｍｌの Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ で３７℃、１時間標識化し、２回洗浄して、ＲＰＭＩ−１０培地中２０００／ウェルで、９６−Ｕ−プレート中に添加した。ｄｍ、ｓｍ及びｗｔＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇを異なった濃度でウェルに添加した。次いで、エフェクター細胞を添加して（１００：１、Ｅ：Ｔ比）、培養物を３７℃で２時間培養した。細胞溶解によって上澄液に放出されたＣａｌｃｅｉｎの蛍光強度（ＦＩ）を蛍光プレートリーダーで測定した（励起波長＝４８５ｎｍ、放射波長＝５３８ｎｍ、カットオフ＝５３０ｎｍ）。次の式を用いて特異的細胞毒性を算出した：細胞毒性のパーセント＝（試験サンプルのＦＩ−培地を伴う標的細胞のＦＩ）÷（０．０４％のトリトンＸ−１００で処理した標的細胞のＦＩ−培地を伴う標的細胞のＦＩ）×１００。
【００７６】
図１７Ａに示すように、ｄｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合タンパク質はＡＬ９ペプチドでパルス処理したＴ２細胞に対するヒトＰＢＭＣ細胞溶解活性を誘導したが、Ｐ５３２６４−２７２ペプチドでパルス処理したＴ２細胞に対しては誘導しなかった。対照の２６４ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合タンパク質はＡＬ９負荷Ｔ２細胞に対して同じ効果を示さず、このアッセイの特異性を明らかにした。同様な結果がＰＢＭＣの異なった調製物で認められた。図１７Ｂは、ＡＬ９負荷Ｔ２細胞に対するｄｍ、ｓｍ及びｗｔＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合タンパク質の活性を比較している更なる細胞毒性アッセイを示す。この結果は、ｄｍ及びｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合体がＡＬ９負荷細胞に対するＡＤＣＣ様活性の介在に有効であったのに対して、ｗｔＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合体は有効ではなかったことを示した。これらの結果は、ＡＬ９ｓｃＴＣＲ突然変異体が、ｗｔＡＬ９ＴＣＲでは観察されなかった、ＨＩＶ ＡＬ９エピトープを提示する細胞に対して増大した細胞溶解性生物活性をもたらすことを示す。
【００７７】
同様に、ＨＩＶ感染細胞に対する免疫エフェクター細胞の細胞溶解活性を誘導する突然変異ＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合タンパク質の能力を評価する。ＨＩＶ感染細胞は実施例６に記載されているようにして作成して、上記のようなＣａｌｃｅｉｎ放出アッセイに標的細胞として用いられる。培養培地中に突然変異ＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合体が存在することによるＨＩＶ感染細胞の溶解における特異的な増大は、突然変異ＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合体がＨＩＶ感染細胞に対する免疫細胞溶解活性を誘導する橋渡し分子として作用できることを明らかにするだろう。
【００７８】
実施例９：突然変異ＡＬ９ｓｃＴＣＲ融合タンパク質はＡＬ９／ＨＬＡ−Ａ２複合体に対して増大した親和性を示す。
ＡＬ９ｓｃＴＣＲ融合タンパク質：ＡＬ９／ＨＬＡ−Ａ２複合体相互作用の結合親和性パラメーターを表面プラズモン共鳴法で測定した。ビオチニル化ＡＬ９又はＩ６３ＭｐＭＨＣ複合体、又は無関連な対照であるｐＭＨＣ複合体をストレプトアビジンセンサーチップの表面に結合した。可溶性ＴＣＲ−ｂｉｒＡタンパク質を関連細胞に影響を及ぼさないようにして、タンパク質−タンパク質相互作用を測定する応答を、BIAcore 技術を用いてリアルタイムで記録した。結合パラメータをBIAevaluation ソフトウエアを用いて評価した。ＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡ融合タンパク質に関するこれらの分析の結果を表１に示し、そしてＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合タンパク質に関して表２に示す。これらの結果は、ｂｒｉＡ又はＩｇ融合体としてｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲタンパク質がＡＬ９／ＨＬＡ−Ａ２及びＩ６３Ｍ ＡＬ９／ＨＬＡ−Ａ２複合体への結合親和性を増大することを明確に示している。また、二量体ｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ融合体は、それらの増大した親和性(avidity)に基づいて、単量体ｓｍＡＬ９ｓｃＴＣＲ−ｂｉｒＡ分子よりもＡＬ９／ＨＬＡ−Ａ２複合体へのより優れた結合を示す。
【００７９】
【表１】
【００８０】
【表２】
【００８１】
実施例１０：遺伝子導入及びＨＩＶ感染細胞を死滅するための突然変異ＡＬ９ＴＣＲｓを用いる細胞に基づく手法
本発明のＴＣＲｓはＨＩＶ感染細胞を死滅するため又はＨＩＶ感染を予防又は治療するための遺伝子治療又は細胞に基づく治療手法において使用することができる。例えば、突然変異ＡＬ９ ＴＣＲ並びに膜貫通及び細胞質シグナル伝達ドメインをコードするＴＣＲ遺伝子を、免疫細胞が直ちに細胞表面に高親和性ＡＬ９ ＴＣＲを発現するように、免疫細胞に導入される。これらの細胞は、ＡＬ９ ＴＣＲがＨＬＡ−Ａ２複合体中に提示されるＨＩＶ ｖｐｒペプチドと相互作用すると、免疫機能を発現するように活性化される。これらの細胞はエクスビボでＨＩＶ感染細胞を死滅することに用いられるか、又はＨＩＶ感染患者内に注入して、続いて患者においてＨＩＶ感染細胞を死滅することに用いられる。或いは、適切なベクター中のＴＣＲ遺伝子を直接患者に投与し、それによって遺伝子を患者の免疫細胞に導入して、インビボでこれらの細胞の表面に高親和性ＡＬ９ ＴＣＲを発現できるようにする。これらの細胞はＨＩＶ感染に対する予防又は治療活性をもたらすことができる。
【００８２】
ある特定の例では、ヒトＰＢＭＣは、ＨＩＶ感染患者から単離される。突然変異ＡＬ９ ＴＣＲ、並びに膜貫通及び細胞質シグナル伝達ドメインをコードするＴＣＲ遺伝子はこれらの細胞にエクスビボで導入されて、細胞表面にＴＣＲｓの発現を可能にする。免疫細胞は患者に再導入され、そこでこれらはＨＩＶ感染細胞に対するエフェクター機能を介在する。ＨＩＶ感染細胞に対する免疫細胞の細胞毒性活性も上記のｃａｌｃｅｉｎ放出アッセイを用いてインビトロで試験できる。
【００８３】
参照による取り込み
本願を通して引用される全ての引例、特許、係属中の特許出願及び公開特許は参照により本明細書に明確に取り込まれている。
【００８４】
均等物
当業者は、本明細書に記載されている本発明の特定の実施態様との多くの均等物を認識されるだろう、又は通常の実験程度を用いて確認できるだろう。そのような均等物は以下の特許請求の範囲に包含されることが意図されている。
【図１Ａ−１】
【図１Ａ−２】
【図１Ｂ−１】
【図１Ｂ−２】
【図１Ｃ−１】
【図１Ｃ−２】
【図２Ａ−１】
【図２Ａ−２】
【図２Ａ−３】
【図２Ａ−４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
図１に記載の野生型ＴＣＲ Ｖα又はＶβ配列において少なくとも１つの突然変異を含有してなる、ＨＩＶ−１ｖｐｒ由来ＨＩＶエピトープに特異的に結合する単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）。
【請求項２】
突然変異が、ＴＣＲの生産性、安定性、特異的結合活性、又は機能活性を増大する、請求項１に記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項３】
突然変異が、野生型ＴＣＲと比較して、ＴＣＲの非特異的結合を減少する、請求項１に記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項４】
ＴＣＲが単鎖ＴＣＲである、請求項１〜３の何れか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項５】
ＴＣＲがヘテロ二量体ＴＣＲである、請求項１〜３の何れか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項６】
ＴＣＲが１つ以上のＴＣＲ結合ドメインを含有している、請求項１〜３の何れか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項７】
エピトープがＡＬ９ペプチド（ＡＩＩＲＩＬＱＱＬ）である、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項８】
ＡＬ９ペプチドがＨＬＡ−Ａ２と関連して提示される、請求項７に記載のＴＣＲ。
【請求項９】
突然変異がＴＣＲ Ｖα鎖のアミノ酸残基３９に存在する、請求項１〜８の何れか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項１０】
突然変異がＴＣＲ Ｖα鎖のアミノ酸残基９３に存在する、請求項１〜９の何れか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項１１】
アミノ酸残基３９にある突然変異が、ＳｅｒをＰｒｏへである、請求項９に記載のＴＣＲ。
【請求項１２】
アミノ酸残基９３にある突然変異が、ＴｙｒをＨｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、又はＡｌａへである、請求項１０に記載のＴＣＲ。
【請求項１３】
ＴＣＲが更に、ＨＩＶ−１ ｖｐｒ ＡＬ９ペプチド変異体へ特異的結合を示す、請求項１〜１２の何れか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項１４】
ＡＬ９ペプチド変異体がＨＬＡ−Ａ２に関連して提示される、請求項１３に記載のＴＣＲ。
【請求項１５】
ＡＬ９ペプチド変異体が、ＡＬ９ペプチド配列内に１つ又はそれ以上のアミノ酸変化を含有している、請求項１３に記載のＴＣＲ。
【請求項１６】
ＴＣＲが、高温で野生型ＴＣＲより優れた安定性を有している、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項１７】
ＴＣＲが可溶性である、請求項１〜１６の何れか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項１８】
ＨＩＶ−１ ｖｐｒ由来ＡＬ９ペプチドに特異的に結合する単離された単鎖Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）。
【請求項１９】
ＴＣＲが更に、機能的ポリペプチドドメイン、診断用／画像化試薬、薬剤含有ナノ粒子、治療薬、細胞毒性薬又は抗ウィルス薬との融合を含有している、請求項１〜１８の何れか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項２０】
機能的ポリペプチドドメインが、サイトカイン、免疫グロブリンドメイン、受容体ドメイン又はポリペプチドタグ配列を含有している、請求項１９に記載のＴＣＲ。
【請求項２１】
サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、又はインターフェロンを含有していて、免疫グロブリンドメインが、ＩｇＧ１定常領域、又はＩｇ Ｆｃドメイン、或いはこれらの断片を含有している、請求項２０に記載のＴＣＲ。
【請求項２２】
ポリペプチドタグがｂｉｒＡ配列を含有している、請求項２０に記載のＴＣＲ。
【請求項２３】
ＴＣＲが更に、ＴＣＲの細胞表面発現を可能にする膜貫通ドメインを含有している、請求項１〜２２の何れか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項２４】
ＴＣＲが更に、細胞質ドメイン（ここで、細胞質ドメインがＴＣＲとＨＩＶエピトープの間の相互作用に応答する細胞内シグナル伝達を許容する）を含有している、請求項２３に記載のＴＣＲ。
【請求項２５】
突然変異が更に、野生型ＴＣＲと比較して、ＨＩＶエピトープを提示する細胞を検出するＴＣＲの活性を増大する、請求項１〜２４の何れか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項２６】
突然変異が更に、野生型ＴＣＲと比較して、ＨＩＶエピトープを提示する細胞に対するＴＣＲの細胞傷害性機能活性を増大する、請求項１〜２５の何れか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項２７】
請求項１〜２６の何れか一項に記載のＴＣＲをコードする核酸分子。
【請求項２８】
図２に記載されている核酸配列を含有してなる、核酸分子。
【請求項２９】
請求項２７又は２８の何れか一項に記載の核酸分子を含有してなる、発現ベクター。
【請求項３０】
請求項２９に記載の発現ベクターを含有してなる、宿主細胞。
【請求項３１】
宿主細胞が哺乳動物の宿主細胞である、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
哺乳動物の細胞がヒトの細胞である、請求項３１に記載の宿主細胞。
【請求項３３】
ヒトの細胞が末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３４】
宿主細胞が、細胞表面に請求項１〜２６の何れか一項に記載のＴＣＲを発現する、請求項３０〜３３の何れか一項に記載の宿主細胞。
【請求項３５】
細胞を請求項１〜２６の何れか一項に記載のＴＣＲ又は請求項３０〜３４の何れか一項に記載の宿主細胞と接触させること；及び
ＴＣＲが細胞と結合するか否かを確認すること（ここにおいて、細胞と結合するＴＣＲがＨＩＶ感染を示す）：
を含有してなる、ＨＩＶに感染している細胞を検出する方法。
【請求項３６】
細胞を請求項１〜２６の何れか一項に記載のＴＣＲ又は請求項３０〜３４の何れか一項に記載の宿主細胞と接触させること、
それによってＨＩＶに感染している細胞を死滅すること：
を含有してなる、ＨＩＶに感染している細胞を死滅する方法。
【請求項３７】
個体から生体サンプルを得ること；
生体サンプルを請求項１〜２６の何れか一項に記載のＴＣＲ又は請求項３０〜３４の何れか一項に記載の宿主細胞と接触させること（ここにおいて、生体サンプルへのＴＣＲの結合は対象がＨＩＶに感染していることを示す）：
を含有してなる、対象がＨＩＶに感染しているか否かを確認する方法。
【請求項３８】
請求項１〜２６の何れか一項に記載のＴＣＲ、又は請求項２７〜２９の何れか一項に記載の核酸若しくはベクター、又は請求項３０〜３４の何れか一項に記載の宿主細胞を個体に投与すること；
それによって対象を治療すること：
を含有してなる、ＨＩＶを有している対象を治療する方法。
【請求項３９】
請求項１〜２６の何れか一項に記載のＴＣＲ、又は請求項２７〜２９の何れか一項に記載の核酸若しくはベクター、又は請求項３０〜３４の何れか一項に記載の宿主細胞を個体に投与すること；
それによって対象におけるＨＩＶ感染を阻害すること：
を含有してなる、対象におけるＨＩＶ感染を阻害する方法。
【請求項４０】
ＨＩＶ感染の増大した危険性を有している対象を同定することを更に含有してなる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
請求項１〜２６の何れか一項に記載のＴＣＲ及び薬学的に許容される担体を含有してなる、医薬組成物。
【請求項４２】
請求項２７〜２９の何れか一項に記載の核酸或いはベクター及び薬学的に許容される担体を含有してなる、医薬組成物。
【請求項４３】
請求項３０〜３４の何れか一項に記載の宿主細胞及び薬学的に許容される担体を含有してなる、医薬組成物。
【請求項４４】
請求項１〜２６の何れか一項に記載のＴＣＲ及び使用説明書を含有してなる、キット。
【請求項４５】
請求項２７〜２９の何れか一項に記載の核酸或いはベクター及び使用説明書を含有してなる、キット。
【請求項４６】
請求項３０〜３４の何れか一項に記載の宿主細胞及び使用説明書を含有してなる、キット。
【請求項１】
図１に記載の野生型ＴＣＲ Ｖα又はＶβ配列において少なくとも１つの突然変異を含有してなる、ＨＩＶ−１ｖｐｒ由来ＨＩＶエピトープに特異的に結合する単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）。
【請求項２】
突然変異が、ＴＣＲの生産性、安定性、特異的結合活性、又は機能活性を増大する、請求項１に記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項３】
突然変異が、野生型ＴＣＲと比較して、ＴＣＲの非特異的結合を減少する、請求項１に記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項４】
ＴＣＲが単鎖ＴＣＲである、請求項１〜３の何れか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項５】
ＴＣＲがヘテロ二量体ＴＣＲである、請求項１〜３の何れか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項６】
ＴＣＲが１つ以上のＴＣＲ結合ドメインを含有している、請求項１〜３の何れか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項７】
エピトープがＡＬ９ペプチド（ＡＩＩＲＩＬＱＱＬ）である、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項８】
ＡＬ９ペプチドがＨＬＡ−Ａ２と関連して提示される、請求項７に記載のＴＣＲ。
【請求項９】
突然変異がＴＣＲ Ｖα鎖のアミノ酸残基３９に存在する、請求項１〜８の何れか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項１０】
突然変異がＴＣＲ Ｖα鎖のアミノ酸残基９３に存在する、請求項１〜９の何れか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項１１】
アミノ酸残基３９にある突然変異が、ＳｅｒをＰｒｏへである、請求項９に記載のＴＣＲ。
【請求項１２】
アミノ酸残基９３にある突然変異が、ＴｙｒをＨｉｓ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、又はＡｌａへである、請求項１０に記載のＴＣＲ。
【請求項１３】
ＴＣＲが更に、ＨＩＶ−１ ｖｐｒ ＡＬ９ペプチド変異体へ特異的結合を示す、請求項１〜１２の何れか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項１４】
ＡＬ９ペプチド変異体がＨＬＡ−Ａ２に関連して提示される、請求項１３に記載のＴＣＲ。
【請求項１５】
ＡＬ９ペプチド変異体が、ＡＬ９ペプチド配列内に１つ又はそれ以上のアミノ酸変化を含有している、請求項１３に記載のＴＣＲ。
【請求項１６】
ＴＣＲが、高温で野生型ＴＣＲより優れた安定性を有している、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項１７】
ＴＣＲが可溶性である、請求項１〜１６の何れか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項１８】
ＨＩＶ−１ ｖｐｒ由来ＡＬ９ペプチドに特異的に結合する単離された単鎖Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）。
【請求項１９】
ＴＣＲが更に、機能的ポリペプチドドメイン、診断用／画像化試薬、薬剤含有ナノ粒子、治療薬、細胞毒性薬又は抗ウィルス薬との融合を含有している、請求項１〜１８の何れか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項２０】
機能的ポリペプチドドメインが、サイトカイン、免疫グロブリンドメイン、受容体ドメイン又はポリペプチドタグ配列を含有している、請求項１９に記載のＴＣＲ。
【請求項２１】
サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、又はインターフェロンを含有していて、免疫グロブリンドメインが、ＩｇＧ１定常領域、又はＩｇ Ｆｃドメイン、或いはこれらの断片を含有している、請求項２０に記載のＴＣＲ。
【請求項２２】
ポリペプチドタグがｂｉｒＡ配列を含有している、請求項２０に記載のＴＣＲ。
【請求項２３】
ＴＣＲが更に、ＴＣＲの細胞表面発現を可能にする膜貫通ドメインを含有している、請求項１〜２２の何れか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項２４】
ＴＣＲが更に、細胞質ドメイン（ここで、細胞質ドメインがＴＣＲとＨＩＶエピトープの間の相互作用に応答する細胞内シグナル伝達を許容する）を含有している、請求項２３に記載のＴＣＲ。
【請求項２５】
突然変異が更に、野生型ＴＣＲと比較して、ＨＩＶエピトープを提示する細胞を検出するＴＣＲの活性を増大する、請求項１〜２４の何れか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項２６】
突然変異が更に、野生型ＴＣＲと比較して、ＨＩＶエピトープを提示する細胞に対するＴＣＲの細胞傷害性機能活性を増大する、請求項１〜２５の何れか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項２７】
請求項１〜２６の何れか一項に記載のＴＣＲをコードする核酸分子。
【請求項２８】
図２に記載されている核酸配列を含有してなる、核酸分子。
【請求項２９】
請求項２７又は２８の何れか一項に記載の核酸分子を含有してなる、発現ベクター。
【請求項３０】
請求項２９に記載の発現ベクターを含有してなる、宿主細胞。
【請求項３１】
宿主細胞が哺乳動物の宿主細胞である、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
哺乳動物の細胞がヒトの細胞である、請求項３１に記載の宿主細胞。
【請求項３３】
ヒトの細胞が末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３４】
宿主細胞が、細胞表面に請求項１〜２６の何れか一項に記載のＴＣＲを発現する、請求項３０〜３３の何れか一項に記載の宿主細胞。
【請求項３５】
細胞を請求項１〜２６の何れか一項に記載のＴＣＲ又は請求項３０〜３４の何れか一項に記載の宿主細胞と接触させること；及び
ＴＣＲが細胞と結合するか否かを確認すること（ここにおいて、細胞と結合するＴＣＲがＨＩＶ感染を示す）：
を含有してなる、ＨＩＶに感染している細胞を検出する方法。
【請求項３６】
細胞を請求項１〜２６の何れか一項に記載のＴＣＲ又は請求項３０〜３４の何れか一項に記載の宿主細胞と接触させること、
それによってＨＩＶに感染している細胞を死滅すること：
を含有してなる、ＨＩＶに感染している細胞を死滅する方法。
【請求項３７】
個体から生体サンプルを得ること；
生体サンプルを請求項１〜２６の何れか一項に記載のＴＣＲ又は請求項３０〜３４の何れか一項に記載の宿主細胞と接触させること（ここにおいて、生体サンプルへのＴＣＲの結合は対象がＨＩＶに感染していることを示す）：
を含有してなる、対象がＨＩＶに感染しているか否かを確認する方法。
【請求項３８】
請求項１〜２６の何れか一項に記載のＴＣＲ、又は請求項２７〜２９の何れか一項に記載の核酸若しくはベクター、又は請求項３０〜３４の何れか一項に記載の宿主細胞を個体に投与すること；
それによって対象を治療すること：
を含有してなる、ＨＩＶを有している対象を治療する方法。
【請求項３９】
請求項１〜２６の何れか一項に記載のＴＣＲ、又は請求項２７〜２９の何れか一項に記載の核酸若しくはベクター、又は請求項３０〜３４の何れか一項に記載の宿主細胞を個体に投与すること；
それによって対象におけるＨＩＶ感染を阻害すること：
を含有してなる、対象におけるＨＩＶ感染を阻害する方法。
【請求項４０】
ＨＩＶ感染の増大した危険性を有している対象を同定することを更に含有してなる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
請求項１〜２６の何れか一項に記載のＴＣＲ及び薬学的に許容される担体を含有してなる、医薬組成物。
【請求項４２】
請求項２７〜２９の何れか一項に記載の核酸或いはベクター及び薬学的に許容される担体を含有してなる、医薬組成物。
【請求項４３】
請求項３０〜３４の何れか一項に記載の宿主細胞及び薬学的に許容される担体を含有してなる、医薬組成物。
【請求項４４】
請求項１〜２６の何れか一項に記載のＴＣＲ及び使用説明書を含有してなる、キット。
【請求項４５】
請求項２７〜２９の何れか一項に記載の核酸或いはベクター及び使用説明書を含有してなる、キット。
【請求項４６】
請求項３０〜３４の何れか一項に記載の宿主細胞及び使用説明書を含有してなる、キット。
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ−１】
【図３Ｂ−２】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ−１】
【図４Ｂ−２】
【図４Ｂ−３】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ−１】
【図１４Ｂ−２】
【図１４Ｂ−３】
【図１４Ｃ】
【図１４Ｄ】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ−１】
【図３Ｂ−２】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ−１】
【図４Ｂ−２】
【図４Ｂ−３】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ−１】
【図１４Ｂ−２】
【図１４Ｂ−３】
【図１４Ｃ】
【図１４Ｄ】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【公表番号】特表２０１２−５２１７６１（Ｐ２０１２−５２１７６１Ａ）
【公表日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０２２３４（Ｐ２０１２−５０２２３４）
【出願日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２８６２６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１１４６７
【国際公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【出願人】（５０４０９０１９０）アルター・バイオサイエンス・コーポレーション (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２８６２６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１１４６７
【国際公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【出願人】（５０４０９０１９０）アルター・バイオサイエンス・コーポレーション (8)
【Ｆターム（参考）】
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