本発明は、治療に使用することができる改変されたＨＰＶ粒子に関する。改変されたＨＰＶ粒子は、ｓｉＲＮＡ分子を含む治療薬を送達するために使用することもできる。改変されたＨＰＶ粒子は、ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）感染およびＨＰＶ関連腫瘍を含む、粘膜組織の疾患または状態の治療のために使用することもできる。いくつかの実施形態において、本発明の態様は、治療薬を粘膜組織に送達できる（例えば局所的に）改変されたＨＰＶに基づく粒子に関する。いくつかの実施形態において、治療薬は、抗ウイルス剤であり得る。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下、２００９年４月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／１６８，９１４号への優先権を主張し、この米国仮特許出願は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ヒトパピローマウイルス様粒子（ＶＬＰ）および治療薬としてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
子宮頚がんは、世界中の女性におけるがんによる死亡の主要な原因の１つであり、毎年２３３，０００人を超える女性がそれにより死亡している。子宮頚がんは、２０世紀より前には女性のうちで発生率および死亡率の両方において最も一般的な悪性病変であった。子宮頚がんの発生率の低減は、先進国家における主要な公衆衛生の功績の１つであり、これは、侵襲前疾患についての全住民ベースのスクリーニング、検出および治療プログラムを行ったことが大きな原因である。しかし、先進国家における子宮頚がんの発生率は減少しているが、この疾患は、継続して、世界中の女性における２番目に最も一般的ながんである。
【０００４】
パパニコロウ（Ｐａｐ）スメアは、子宮頚がん、またはその多くがＨＰＶと関連する子宮頚部における前癌性の変化を検出できる。これらのＰａｐスメアは、広範囲のスクリーニング処置が行われた先進国における子宮頚がんの発生率および死亡率を大きく低減させている。スクリーニング処置がまだ限定されている発展途上国において、子宮頚がんは、女性において最も頻繁に報告されるがんであり、発生率は上昇し続けている。
【０００５】
寒冷療法、レーザ焼灼法、円錐切除法、ループ式電気焼灼切除法（ＬＥＥＰ）を含む子宮頚部上皮内異常の全ての現在の治療は、流産、頚管完全性の喪失および妊娠不能性を導き得る過剰排泄物、感染、出血、痙攣ならびに頚管無力症を含む著しい副作用をしばしば導く侵襲性の外科処置である。さらに、これらの処置は、外来施設で行われるにちがいないので、治療費用を増加させる。
【０００６】
子宮頚部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）とは、侵襲前の病理的な経過から子宮頚がんまでのことである。子宮頚部の細胞学的スメアまたは組織生検において観察される異常は、子宮頚部の上皮細胞の分化の程度の変更を表す。この細胞異形成は、重篤度が異なる３つの群に分類される。ＣＩＮ Ｉは、上皮の基底の３分の１に限定された軽度異形成のことであり、ＣＩＮ ＩＩは、上皮の基底の３分の２に限定された病変のことであり、ＣＩＮ ＩＩＩは、上皮の厚さの３分の２より多くを包含する細胞異形成のことである。
【０００７】
米国においておよそ３５０万人の女性が、毎年、Ｐａｐスメア試験で異常とされる。これらの女性のうちのおよそ１２０万人は、扁平上皮内病変（ＳＩＬ）であり、このうち２００，０００〜３００，０００人は、高度に分類される。ラテンアメリカにおける高度ＣＩＮの発生率は、ＵＳでみられるものの３倍を超える。表１は、世界中でのＨＰＶ感染の有病率およびＣＩＮのまとめを示す。
【０００８】
表１：ＨＰＶの世界的な有病率およびＣＩＮ
【０００９】
【表１】

ＨＰＶ感染は、性的に活動的な個体間に固有のものである。複数の性的パートナーを有する女性は、ＨＰＶを獲得する機会がより高く、その結果、ＨＰＶ関連子宮頚部感染の機会がより高い。高リスクＨＰＶ型への感染は、その女性において子宮頚がんが発達する確率を増加させる。前癌性の子宮頚部の状態をスクリーニングし、その後治療することは、ＨＰＶに感染した女性において子宮頚がんを防ぐために非常に効果的である。しかし、現在の治療は、しばしば、外科的介入を必要とし、代替の治療選択肢が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の態様は、疾患を治療し、かつ／または治療薬を送達するための、ＨＰＶに基づく粒子およびその使用に関する。いくつかの実施形態において、本発明の組成物および方法は、粘膜の状態（例えば、粘膜組織、例えば粘膜上皮細胞の疾患および／または感染）を治療するために有用である。
【００１１】
いくつかの実施形態において、本発明の態様は、治療薬を粘膜組織に送達できる（例えば局所的に）改変されたＨＰＶに基づく粒子に関する。いくつかの実施形態において、治療薬は、抗ウイルス剤であり得る。抗ウイルス剤は、例えばヒトパピローマウイルス、ヘルペスウイルスまたは粘膜組織を標的にするその他のウイルスによるウイルス感染を治療するために使用することもできる。いくつかの実施形態において、治療薬は、抗がん剤であり得る。抗がん剤は、例えば子宮頚がんまたは粘膜組織の任意のその他のがんを治療するために使用することもできる。いくつかの実施形態において、本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染を治療する方法、および被験体におけるそれらに限定されないが子宮頚がんを含むＨＰＶ関連疾患を治療する方法を提供する。しかし、本発明の改変されたウイルス粒子を、その他の型の治療薬および／または医療用薬剤（例えば撮像剤または造影剤）を送達するために使用できることが認識される。
【００１２】
いくつかの実施形態において、本発明の粒子は、任意の粘膜組織（例えば子宮頚部、鼻、口腔またはその他の粘膜組織）に局所送達することができる（例えばクリーム、フォーム、スプレー、エアロゾルまたは局所送達のために適切なその他の製剤の形態で）。しかし、本発明の態様は、局所送達に限定されず、改変された粒子は、皮下、静脈内、非経口および／または任意のその他の適切な送達経路により送達することができる。
【００１３】
本明細書に示す方法は、被験体に、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に基づく送達系により送達される１つ以上の治療薬を投与する工程を含む。あるいくつかの実施形態において、ＶＬＰに基づく送達系は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）様ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態において、ＨＰＶナノ粒子は、ウイルスＬ１タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ＨＰＶナノ粒子は、ウイルスＬ１タンパク質とウイルスＬ２タンパク質とを含む。Ｌ１および／またはＬ２タンパク質は、いくつかの実施形態において、野生型ウイルスタンパク質であってよい。いくつかの実施形態において、Ｌ１および／またはＬ２タンパク質は、変異および／または挿入／欠失により変更することもできる。あるいくつかの実施形態において、Ｌ１および／またはＬ２を含むＨＰＶナノ粒子の表面露出ループ中のアミノ酸は、変異、挿入および／または欠失される。あるいくつかの実施形態において、表面露出ループ中のアミノ酸の変異、欠失および／または挿入は、ＨＰＶナノ粒子の免疫原性の変化を導く。あるいくつかの実施形態において、免疫原性は、ある血清型のＨＰＶナノ粒子が、この血清型に対して産生された抗体によりもはや認識されないような方式で変更できる。これらの実施形態において、変更されたＨＰＶナノ粒子は、血清型特異的抗体を持つ宿主においてイムノサイレントである。
【００１４】
よって、いくつかの実施形態において、本発明のＨＰＶに基づく粒子は、免疫原性が低減または変更されるように改変することもできる。このような粒子は、中和抗ＨＰＶ応答を有する患者への送達のために選択することもできる。いくつかの実施形態において、異なる血清型を有するＨＰＶに基づく粒子の連続物を、被験体に治療目的のために投与して、いずれか１つの血清型に対する中和免疫応答の効果を低減させる。例えば、第１血清型を、被験体への１回目の一連の投与（例えば１、２、３、４、５、５〜１０またはそれより多く）のために使用することもできる。その後、第２血清型を、２回目の一連の投与（例えば１、２、３、４、５、５〜１０またはそれより多く）のために用いて、第１血清型に対して被験体が発生する中和免疫応答の影響を低減する。さらなる一連の投与が、第３、第４、第５などの血清型を含むことができることが認識される。異なる血清型は、天然に存在する血清型、キメラ血清型、その他の変異血清型、またはそれらの任意の組み合わせであってよい。このような連続的または逐次的な施与を、数ヶ月および／または数年の期間にわたる特定の化合物（例えば異なる血清型のそれぞれにおける同じもの）または異なる化合物の連続物の慢性的な投与（例えば治療）のために使用できることが認識される。
【００１５】
いくつかの実施形態において、アミノ酸の変異、欠失および／または挿入は、ウイルスカプシドタンパク質Ｌ１および／またはＬ２に、得られるＨＰＶナノ粒子が、治療薬を標的細胞に送達する能力を失わないような方式で導入される。いくつかの実施形態において、ＨＰＶナノ粒子は、核酸（例えばｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）を標的細胞に移入する能力を喪失しない。
【００１６】
いくつかの実施形態において、免疫原性は、ある血清型のＨＰＶナノ粒子が、交差特異的中和抗体を生成する免疫応答を誘導するような方式で変更できる。これらの実施形態において、ＨＰＶナノ粒子は、それがその表面上で複数の血清特異的エピトープを示す（例えば表面露出ループへのエピトープの挿入により）か、または血清型間でより保存されたエピトープを示す（例えば、表面露出ループへのＬ２タンパク質の部分の挿入によるか、またはＨＰＶナノ粒子の表面への保存エピトープの連結により）ような方式で変更される。いくつかの実施形態において、交差特異的中和抗体の生成は、ＨＰＶ感染細胞数を消去または低減するための治療を受けたＨＰＶ感染個体において誘導される。いくつかの実施形態において、ＨＰＶ感染個体は、ＨＰＶ関連腫瘍のサイズを消去または低減するための治療を受けている。これらの実施形態において、交差特異的中和抗体の生成は、治療後に残り得るＨＰＶ感染細胞の免疫監視のために十分な免疫応答を生じるために誘導することもできる。もたらされる免疫監視は、いくつかの実施形態において、ＨＰＶの新しい感染またはＨＰＶ感染細胞の再増殖またはＨＰＶ感染腫瘍の再発を防ぐために十分である。いくつかの実施形態において、交差特異的中和抗体は、１つ以上のＨＰＶ血清型に対して効果的である。
【００１７】
あるいくつかの実施形態において、ＶＬＰに基づく送達系により送達される治療薬は、核酸である。核酸である治療薬は、例えば、ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ分子またはそれらをコードするプラスミドであり得る。その他の治療薬は、例えば、抗ウイルスまたは抗がん活性を有する小分子などの小分子であり得る。
【００１８】
あるいくつかの実施形態において、ＨＰＶ感染または子宮頚がんなどのＨＰＶ関連がんまたは病変を有する被験体に、ＶＬＰに基づく送達系により送達される１つ以上の治療薬を投与することにより、ＨＰＶ感染細胞の死滅および／または排除が導かれる。ＨＰＶ感染形質転換細胞は、ＨＰＶ関連がんまたは病変の原因であると考えられる。いくつかの実施形態において、ＨＰＶ感染細胞の死滅および／または排除は、ＨＰＶ関連がんの部分的または完全な寛解を導く。
【００１９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される治療方法は、治療薬を含むＨＰＶナノ粒子での治療の前、同時または後のいずれかに、その他の治療薬（例えば抗がん剤および／または抗ウイルス剤）および／または免疫調節剤および／または放射線療法もしくは免疫療法の投与と組み合わせることができる。いくつかの実施形態において、抗がん剤および／または抗ウイルス剤は、ＨＰＶナノ粒子により送達できる。いくつかの実施形態において、抗がん剤および／または抗ウイルス剤は、ＨＰＶナノ粒子と一緒に投与できるか、または別々に、例えば異なる時間にもしくは異なる投与部位にもしくは異なる投与経路により投与できる。
【００２０】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法に従って治療される被験体におけるほとんどまたは全てのＨＰＶ感染細胞は、死滅し、排除され、ＨＰＶは、ＨＰＶ感染被験体においてもはや検出できない。その他の実施形態において、被験体におけるいくつかのＨＰＶ感染細胞は、死滅するかまたは排除され、ＨＰＶは、ＨＰＶ感染被験体においてまだ検出できる。いくつかの実施形態において、ＨＰＶ関連病変またはがんを有する被験体は、がんもしくは病変の部分的または完全な寛解を経験し得る。いくつかの実施形態において、被験体は、病変またはがんまたはウイルス感染の再発を経験しない。その他の実施形態において、被験体は、病変またはがんまたはウイルス感染の再発を経験する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される治療方法は、治療薬を含むＨＰＶナノ粒子での治療中および／またはその後の抗ウイルス治療とさらに組み合わせる。抗ウイルス治療は、例えばＨＰＶ複製、ウイルス蔓延および／または最初の治療を生き延びたかもしくは新しい感染として被験体の体内に侵入したＨＰＶを有する細胞の再増殖を防ぐために行うこともできる。
【００２１】
その他の実施形態において、変更されたＨＰＶナノ粒子は、最初の治療計画の最後に投与される。ＨＰＶナノ粒子は、それらが、それらの表面上で複数の血清特異的エピトープを示すか、またはそれらが、血清型間でより保存されたエピトープを示すような方式で変更される。いくつかの実施形態において、このような変更されたＨＰＶナノ粒子の投与は、投与されたエピトープを指向する局部免疫応答を誘導でき、例えば交差特異的中和抗体の増加を誘導するが、これは、新しくＨＰＶに感染した細胞を検出して死滅させることができる免疫監視のために十分である。いくつかの実施形態において、新しいウイルス感染ならびに／または蔓延および再増殖の防止は、ＨＰＶ関連がんまたは病変の再発を阻害するために十分である。
【００２２】
あるいくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、１つ以上の治療薬を含むＨＰＶナノ粒子を異なる経路により投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、ＨＰＶナノ粒子は、局所施与により投与される。いくつかの実施形態において、局部施与は、粘膜を標的にする。例えば、１つ以上の治療薬を含むＨＰＶナノ粒子は、子宮頚部上皮などの上皮に局所的にもしくはその近接部に、または子宮頚部もしくは肛門の上皮癌などの上皮病変に局所的にもしくはその近接部に施与できる。
【００２３】
あるいくつかの実施形態において、変更されたウイルスカプシドタンパク質を含むＨＰＶナノ粒子であって、該ウイルスカプシドタンパク質が、本明細書に記載されるような野生型アミノ酸の変異、さらなるアミノ酸の挿入および／または野生型アミノ酸の欠失により変更されているナノ粒子が提供される。あるいくつかの実施形態において、変更されたＨＰＶナノ粒子は、被験体において多少免疫原性であるか、または変更された免疫原性を有する。いくつかの実施形態において、変更されたＨＰＶナノ粒子は、治療薬を標的細胞に送達または移入する能力を維持する。
【００２４】
よって、本発明の態様は、１つ以上の化合物を被験体に送達するための方法および組成物に関する。いくつかの実施形態において、改変されたヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）様粒子が用いられ、該粒子は、免疫原性が変更された表面タンパク質を含むＨＰＶ様粒子にパッケージングされた１つ以上の異種化合物を含む。異種化合物は、非ＨＰＶ分子である（例えば、ＨＰＶゲノムでない、ＨＰＶ核酸でない、かつ／またはその他のＨＰＶ分子でない化合物）。このような化合物は、治療化合物またはその他の医療用化合物であってよい。いくつかの実施形態において、化合物は、治療薬もしくは医療用薬剤、核酸もしくは小分子、または撮像剤もしくは造影剤の１つ以上であってよい。いくつかの実施形態において、治療薬は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス核酸またはｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡもしくはアンチセンス核酸をコードする核酸である。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンス核酸は、ＨＰＶ−Ｅ６および／またはＨＰＶ−Ｅ７を標的にする。いくつかの実施形態において、小分子は、抗ウイルス剤である。いくつかの実施形態において、小分子は抗がん剤（例えばゲムシタビン）である。
【００２５】
本発明の方法および組成物は、１つ以上のその他の薬剤（例えば抗ウイルス剤、抗がん剤、例えばゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｉｎｅ）またはそれらの任意の組み合わせ）とともに提供してよいことが認識される。
【００２６】
本発明の方法および組成物のいくつかの実施形態において、ＨＰＶ様粒子は、Ｌ１タンパク質またはＬ１タンパク質およびＬ２タンパク質を含む。本発明の方法および組成物のいくつかの実施形態において、表面タンパク質は、改変されたＦＧループ配列を有する改変されたＬ１タンパク質である。いくつかの実施形態において、Ｌ１タンパク質は、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３４、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ７３またはＨＰＶ９１血清型の配列を有し、Ｌ１タンパク質のＦＧループは、ヒト被験体中での、該タンパク質の免疫原性を変える１つ以上のアミノ酸変化を有する。いくつかの実施形態において、１つ以上のアミノ酸変化は、配列番号１１のＸ_１位〜Ｘ_１７位の１つ以上に存在する。いくつかの実施形態において、Ｘ_１６位のアミノ酸は、変更されない。いくつかの実施形態において、配列番号１１のＸ_１位、Ｘ_２位、Ｘ_３位、Ｘ_５位、Ｘ_６位、Ｘ_１１位およびＸ_１４位の１つ以上が改変される。いくつかの実施形態において、配列番号１１のＸ_１位、Ｘ_２位、Ｘ_３位、Ｘ_５位、Ｘ_６位、Ｘ_１１位およびＸ_１４位の２〜３つが改変される。いくつかの実施形態において、配列番号１１のＸ_１位、Ｘ_２位、Ｘ_３位、Ｘ_５位、Ｘ_６位、Ｘ_１１位およびＸ_１４位の４〜７つが改変される。いくつかの実施形態において、配列番号１１のＸ_１位、Ｘ_２位、Ｘ_３位、Ｘ_５位、Ｘ_６位、Ｘ_１１位およびＸ_１４位の３つが改変される。いくつかの実施形態において、配列番号１１のＸ_６位、Ｘ_１１位およびＸ_１４位が改変される。いくつかの実施形態において、配列番号１１のＸ_１位、Ｘ_２位、Ｘ_３位、Ｘ_５位、Ｘ_６位、Ｘ_１１位およびＸ_１４位の全てが改変される。いくつかの実施形態において、Ｌ１タンパク質は、配列番号１１のＸ_６位、Ｘ_１１位およびＸ_１４位にそれぞれＴ、ＴおよびＮへの変化を有し、配列番号１１の残りの位置においてはＨＰＶ１６血清型に特徴的なアミノ酸を有する、ＨＰＶ１６血清型の配列を有する。いくつかの実施形態において、Ｌ１タンパク質は、Ｘ_１位、Ｘ_２位、Ｘ_３位、Ｘ_５位、Ｘ_６位、Ｘ_１１位およびＸ_１４位がそれぞれＦ、Ｓ、Ｔ、Ｓ、Ｔ、ＴおよびＮに変化し、配列番号１１の残りの位置がＨＰＶ１６血清型に特徴的なアミノ酸を有するＨＰＶ１６血清型の配列を有する。
【００２７】
いくつかの実施形態において、ＨＰＶ様粒子は、表面タンパク質の血清型に対する中和免疫応答を有さない被験体（例えば、被験体が表面タンパク質の血清型に対して免疫されていないか、または被験体がＨＰＶ様粒子における表面タンパク質の血清型と同じ血清型を有するＨＰＶに感染していない場合）に投与されることが認識される。いくつかの実施形態において、被験体の免疫応答は、投与のためのＨＰＶ様粒子を選択する前に評価される。
【００２８】
いくつかの実施形態において、ＨＰＶ様粒子は、粘膜組織に投与される。粘膜組織は、本明細書に記載されるいずれの部位であってもよい（例えば子宮頚部、泌尿生殖器、口腔など）。さらに、いくつかの実施形態において、ＨＰＶ様粒子は、表皮部に投与される（例えば表皮もしくは皮膚のがんまたは感染を治療するため）。
【００２９】
本発明の組成物は、局所的に、および／または任意のその他の適切な経路（例えば注射、エアロゾル、スプレーまたはその他の投与の形態）で投与できることが認識される。
【００３０】
本発明の組成物は、ウイルス、細菌および／またはその他の微生物もしくは寄生生物に感染した組織に投与することができる。いくつかの実施形態において、感染部位は、いくつかの異なる生物に感染した部位であってもよい（例えば複数のウイルスおよび／またはその他の微生物、例えばＨＰＶおよびヘルペスウイルス、例えばＨＳＶ）。よって、本発明の組成物は、いくつかの異なる生物を広く標的にする化合物、もしくはそれぞれが異なる生物を標的にするいくつかの異なる化合物、またはそれらの組み合わせを含むこともできる。いくつかの実施形態において、同じＨＰＶ様粒子は、異なる治療化合物を含することもできる。いくつかの実施形態において、組成物または治療計画は、特定の感染を標的にする化合物をそれぞれが含有する２以上の異なるＨＰＶ様粒子を含むこともできる。
【００３１】
本発明の組成物は、がん（例えば投与部位でのまたは投与部位付近での）を治療するために被験体に投与することができる。いくつかの実施形態において、がんは、感染（例えばＨＰＶまたはＨＳＶ感染）と関連するものであってもよい。いくつかの実施形態において、がんは、感染と関連しないものであってもよい。よって、本発明の態様は、皮膚がん（例えば非黒色腫皮膚がん）を治療するために使用することもできる。
【００３２】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、免疫系不全を有する被験体に、該免疫系不全に関連する状態（例えば感染、がんまたはその他の状態）を治療するために投与することもできる。免疫系不全は、感染（例えばＨＩＶ感染、ＡＩＤＳ）またはその他の状態（例えばがん）を原因とするものでもよい。
【００３３】
いくつかの実施形態において、本発明のＨＰＶ様粒子は、非特異的免疫応答（例えば投与部位でのまたは投与部位付近での）を促進する組成物とともに投与することもできる。非特異的免疫応答は、感染および／もしくはがんまたはその他の状態を治療するために役に立ち得る。いくつかの実施形態において、異なる血清型を有するいくつかのＨＰＶ様粒子の投与に応答した免疫応答の増加が、有益であり得る。よって、本発明のいくつかの組成物は、いくつかの異なる血清型を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態において、組成物の慢性投与は、化合物を含む第１ＨＰＶ様粒子を被験体に第１期間投与し、該化合物を含む第２ＨＰＶ様粒子を該被験体に第２期間投与することにより達成することもでき、ここで、第１および第２ＨＰＶ様粒子は、異なる血清型を有する。さらなる投与を、さらなる血清型を用いて行うこともできる。いくつかの実施形態において、第１および第２ＨＰＶ様粒子の血清型は、独立して、天然に存在するかまたは変更された血清型である。いくつかの実施形態において、第１および／または第２ＨＰＶ様粒子の血清型は、キメラ血清型である。
【００３５】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物または方法は、Ｌ１ループに融合されたＬ２配列を含むことによりキメラ血清型を有するＨＰＶ様粒子を投与することを含むこともできる。いくつかの実施形態において、Ｌ２配列は、Ｌ１粒子の表面に結合する。いくつかの実施形態において、Ｌ２配列は、ＨＰＶ３１ Ｌ２タンパク質の残基１３〜８８からなる。
【００３６】
本発明のこれらおよびその他の態様を、以下の限定しない実施例および発明の記載においてより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、ＨＰＶ−１６のＥ６およびＥ７遺伝子上のｓｉＲＮＡの位置を示す。
【図２】図２は、ルシフェラーゼをコードする偽ビリオンの生成におけるＺｎＣｌ_２の役割を示す棒グラフを示す。ルシフェラーゼ遺伝子発現は、ＺｎＣｌ_２なしで再集合させた偽ビリオンをトランスフェクトした２９３ＦＴ細胞、ならびにＺｎＣｌ_２の存在下で作製した偽ビリオンによりトランスフェクトした２９３ＦＴ、ＴＣ１、Ｃ３３およびＣａＳｋｉ細胞において評価した。
【図３】図３は、Ａ）ＬａｃＺ、Ｅ６−１、Ｅ６−２、Ｅ７−１およびＥ７−２ ｓｈＲＮＡをトランスフェクトしたＣａＳｋｉ細胞から抽出した逆転写ｍＲＮＡの写真を示す。ｃＤＮＡを、Ｅ６およびＥ７遺伝子特異的プライマー、ならびに対照としてグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）プライマーを用いてＰＣＲ増幅した。Ｂ）ＬａｃＺ、Ｅ６−２、Ｅ６−１、Ｅ７−２およびＥ７−１ ｓｈＲＮＡをトランスフェクトしたＣａＳｋｉ細胞（モック（Ｍｏｃｋ））からの細胞抽出物のウェスタンブロットの写真を示す。抽出物は、ｐ５３およびβ−アクチン抗体を用いて分析した。
【図４】図４は、Ｃ３３（灰色の柱）、ＣａＳｋｉ（黒色の柱）およびＴＣ１（白色の柱）細胞増殖に対するＥ６およびＥ７ ｓｈＲＮＡの効果を示す棒グラフを示す。細胞（Ｃ）に、ＬａｃＺ、Ｅ６−１、Ｅ６−２、Ｅ７−１およびＥ７−２ ｓｈＲＮＡをトランスフェクトした。
【図５】図５は、Ｃ５７ ＢＬ６マウスにおけるＴＣ１腫瘍成長の阻害を示す写真を示す。ＴＣ１細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスフェクトした。Ａ）ＶＬＰ単独（下）およびＥ７−１偽ビリオン（上）で処理したＴＣ１細胞の注射の後に得られた腫瘍の比較。Ｂ）ｓｈＲＮＡ偽ビリオンおよびｓｈＲＮＡレンチウイルスでの異なる処理の後の腫瘍の重量の比較についての棒グラフ定量。
【図６】図６は、対照ｓｈＲＮＡおよびＥ７−１ ｓｈＲＮＡ偽ビリオン（Ｐｖ）の腫瘍内注射後のＣ５７ ＢＬ６マウスにおけるＴＣ１腫瘍成長の阻害を示すグラフを示す。Ａ）対照ｓｈＲＮＡまたはＥ７−１ ｓｈＲＮＡ偽ビリオンの１回目の注射後の腫瘍サイズ（平均直径）の進展。Ｂ）対照ｓｈＲＮＡおよびＥ７−１ ｓｈＲＮＡ偽ビリオンで処置したマウスにおける３週間での腫瘍の重量。
【図７】図７（ａ）は、代表的な表面プラズモン共鳴データのグラフを示す。（ｂ）は、ＳＰＲによる立体構造エピトープを認識する１５のＨＰＶ３１ ＭＡｂ間の相互作用研究から構築したエピトープマップを示す。内部移行を中和する抗体は黒色であり、細胞結合を中和したものに下線を付す。Ｈ３１．Ｄ２４抗体は、非中和性であった（箱で囲む）。（ｃ）ヘパリンとのＶＬＰの結合を阻害したＡＱ５抗体に下線を付す。
【図８】図８は、細菌ディスプレイ法を用いた、非中和ＭＡｂ（Ｈ３１．Ｄ２４）と、４つの中和ＭＡｂ（Ｈ３１．Ｂ１、Ｈ３１．Ｆ７、Ｈ３１．Ｆ１６およびＨ３１．Ｈ１２）により認識されるＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質エピトープのマッピングを示す。
【図９】図９は、結合前後の偽ビリオンのＭＡｂ中和を示す。（ａ）ＨＰＶ３１ ＭＡｂによるＨＰＶ３１偽ビリオン侵入の阻害。ＨＰＶ３１偽ビリオンを、ＨＰＶ３１ ＭＡｂとプレインキュベートし、次いで細胞に加えた。（ｂ）ＨＰＶ３１ ＭＡｂによるＨＰＶ３１偽ビリオン内部移行の阻害。ＨＰＶ３１偽ビリオンを細胞に予め結合させ、次いでＨＰＶ３１ ＭＡｂを加えた。細菌ディスプレイ法を用いて調査した５つのＭＡｂを、図の右側にグループ化する。灰色の柱、型特異的中和ＭＡｂ；黒色の柱、交差中和Ｆ７ ＭＡｂ。
【図１０】図１０は、ＨＳおよびＥＣＭとのＶＬＰの結合：ＨＰＶ３１ ＭＡｂおよびＬ１ Ｃ末端欠失の効果を示す。（ａ）ＭＡｂとのＶＬＰのプレインキュベーション後のヘパリン結合の阻害。（ｂ）ＭＡｂとのＶＬＰのプレインキュベーション後のＥＣＭ結合の阻害。細菌ディスプレイ法を用いて調査した５つのＭＡｂを、図の右側にグループ化する。灰色の柱：型特異的中和ＭＡｂ；黒色の柱：Ｆ７交差中和ＭＡｂ；塗りつぶしていない柱：Ｄ２４非中和ＭＡｂ。値は、ＳＤでの阻害のパーセンテージである。５０％より大きい阻害を陽性とみなした。
【図１１】図１１は、Ｃ末端欠失（Ｄ９およびＤ３１）を有するかまたは有さない１６型および３１型についての天然ＶＬＰ（黒色の柱）ならびに変性ＶＬＰ（灰色の柱）のヘパリン結合を示す。
【図１２】図１２は、ＨＰＶ３１のＦＧループ上の５つのモノクローナル抗体により認識されるエピトープの局在性を示す。ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質のＦＧループ上の４つのＭＡｂにより認識されるエピトープの位置。
【図１３】図１３は、それぞれＨＰＶ１６およびＨＰＶ３１のＦＧループの配列アラインメントと、キメラ（ＸおよびＹ）を作製するためにＨＰＶ１６ ＦＧループ野生型配列に挿入した変異とを示す。
【図１４】図１４は、ｗｔ ＨＰＶ１６ならびにキメラＨＰＶ ＸおよびＨＰＶ ＹをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞からの抽出物のルシフェラーゼ活性（計数毎分、ＣＰＭ）を示すグラフを示す。
【図１５】図１５は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定した、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ ＸまたはＨＰＶ Ｙで免疫したマウスからのＨＰＶ１６、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ ＸおよびＨＰＶ Ｙ特異的抗体の力価（幾何平均力価、ＧＭＴ）を示す表を示す。
【図１６】図１６は、キメラＶＬＰであるＬ１ＳＴＩＩ（Ａ）および３１Ｌ１−１６Ｌ２（１３−８８）（Ｂ）の電子顕微鏡写真（バー＝２００ｎｍ）を示す。
【図１７】図１７は、ＥＬＩＳＡによる、キメラＨＰＶ１６ Ｌ１−ＳＴＩＩ、ＨＰＶ１６ Ｌ１ＳＴＩＩＬ２ＳＡおよびＨＰＶ３１ Ｌ１−１６ Ｌ２１３−８８ ＶＬＰ粒子の抗原性の分析を示す棒グラフを示す。結果は、ＣａｍＶｉｒ−１ Ｍａｂを用いるＬ１反応性に対して調整した。結果は、相対活性、すなわち、考慮する抗原を用いて得られたＯＤと、参照抗原（＊）を用いて得られたＯＤとの比率として表す。粒子は、未変性条件下で、立体構造（Ｃ）エピトープおよびＳｔｒｅｐＴａｇＩＩまたはＬ２露出を指向するモノクローナル抗体を用いて分析した。ＨＰＶ１６ Ｌ１ ＳＴＩＩおよびＨＰＶ１６ Ｌ１ＳＴＩＩ Ｌ２ＳＡを、ＳｔｒｅｐＴａｇＩＩ配列を指向するモノクローナル抗体であるＨ１６．Ｖ５（Ｃ）、およびポリクローナルＨＰＶ １６ Ｌ２抗血清を用いて分析した。ＨＰＶ１６ Ｌ１ ＶＬＰおよびＬ１Ｌ２ ３１ ＶＬＰを対照として用いた。ＨＰＶ３１ Ｌ１−１６ Ｌ２１３−８８ＶＬＰを、Ｈ３１．Ｆ１６（Ｃ）およびポリクローナルＨＰＶ１６ Ｌ２抗血清を用いて分析した。結果は、２重の平均である。
【図１８】図１８は、Ｌ２タンパク質の発現のウェスタンブロット分析の写真を示す。１）精製Ｌ２ＳＡ融合タンパク質、２）Ｌ１ＳＴＩＩ ＶＬＰとの相互作用後、３）Ｌ１ ＶＬＰとの相互作用後、４）ＧＦＰをコードするＨＰＶ５８偽ビリオンを形質導入したＣｏｓ−７細胞において、および５）Ｌ２をコードするＨＰＶ５８偽ビリオンを形質導入したＣｏｓ−７細胞において。
【図１９】図１９は、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ５８およびＨＰＶ１８中和抗体の検出を示すグラフを示す。個別のマウス中和力価は、ルシフェラーゼ発現の５０％を超える阻害を示す最後の希釈度の逆数の平均である。幾何平均力価をバーにより示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明の態様は、ＨＰＶ粒子に基づく方法および組成物と、医療および／または治療上の用途のためのそれらの使用とに関する。いくつかの実施形態において、ＨＰＶに基づく粒子は、１つ以上の薬剤（例えば治療薬、撮像剤および／またはその他の医療用薬剤）を標的細胞または組織（例えば粘膜組織、例えば粘膜組織表面）に送達するために使用することができる。
【００３９】
いくつかの実施形態において、本発明の態様は、１つ以上の天然に存在するＨＰＶ表面タンパク質（例えばＬ１および／またはＬ２タンパク質）を含有し、かつ１もしくは複数の医療用薬剤および／または治療薬が充填されたＨＰＶ粒子、あるいはそれらの２以上の組み合わせに関する。いくつかの実施形態において、本発明の態様は、被験体における免疫原性が低減もしくは改変された１つ以上のバリアント表面タンパク質（例えばバリアントＬ１および／またはＬ２タンパク質）を含有する改変されたＨＰＶに基づく粒子に関する。改変は、被験体の免疫系による中和を低減または回避するアミノ酸配列の変化であってよい。いくつかの実施形態において、改変されたＨＰＶに基づく粒子は、被験体（例えばヒト被験体）におけるタンパク質の免疫原性を変更する１つ以上のアミノ酸変化を含む組換えＨＰＶタンパク質（例えば組換えＬ１および／またはＬ２タンパク質）を含有する粒子である。いくつかの実施形態において、改変されたＨＰＶに基づく粒子は、免疫原性が変更されているが、分子をパッケージングして被験体に送達する能力を保持している。よって、本発明の改変されたＨＰＶ粒子には、１つ以上の薬剤（例えばＨＰＶ核酸の代わりに）を充填することもできる。このような粒子は、天然に存在するＨＰＶ粒子により誘導され得る免疫応答を誘導することなく、被験体に送達できる。
【００４０】
本発明のあるいくつかの実施形態は、１つ以上の治療薬を、患部組織（例えば患部粘膜組織）に送達するために有用である。いくつかの実施形態において、患部組織（例えば粘膜組織、上皮組織または内皮組織）は、感染組織であってもよい（例えば、ＨＰＶまたはＨＳＶなどのウイルスに感染した）。いくつかの実施形態において、粘膜組織は、子宮頚部組織であり、疾患は、異形成またはがんである（例えば子宮頚部異形成、子宮頚がん、例えば持続性ＨＰＶ感染に関連するもの）。しかし、いくつかの実施形態において、ＨＰＶに基づく粒子は組成物をその他の組織（例えば表皮）に送達するために使用することもできる。いくつかの実施形態において、ＨＰＶに基づく粒子は、ＨＰＶを治療するために使用することもできる。しかし、いくつかの実施形態において、ＨＰＶに基づく粒子は、その他の疾患または状態を治療するために治療薬を送達するために使用することもできる。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態は、１もしくは複数の撮像剤または造影剤を被験体に送達するために有用である。例えば、量子ドット、金属および／またはその他の撮像剤を送達できる。いくつかの実施形態において、薬剤は、早期段階の疾患（例えば早期段階の転移）を追跡するために使用することもできる。いくつかの実施形態において、放射線増感剤を用いて放射線療法の効果を増進してよい。いくつかの実施形態において、薬剤は、腫瘍細胞がそれらの膜上で異なる受容体または糖を発現することを誘導するために送達することもできる。例えば、本発明の態様は、腫瘍細胞において、腫瘍の免疫系認識を増進し得るシグナルの発現を促進する薬剤を送達するために使用することもできる（例えば腫瘍細胞を細胞またはウイルスに似せるようにし得る薬剤）。いくつかの実施形態において、薬剤は、腫瘍細胞による糖の取り込みを遮断するために送達することもできる。しかし、任意の適切な治療薬および／またはその他の医療用薬剤を、本発明の態様に従って送達できることが認識される。
【００４２】
いくつかの実施形態において、本発明の態様は、２以上の異なる天然に存在するＨＰＶバリアントからのエピトープを提示するように改変されたＨＰＶに基づく粒子に関する。このような改変された粒子は、２以上の天然に存在するＨＰＶバリアントのいずれかによる感染に対する免疫を提供するために使用することもできる。
【００４３】
いくつかの実施形態において、本発明の態様は、治療上の用途のための１つ以上の異なるＨＰＶ粒子を投与するためのプロトコールに関する。異なるＨＰＶ粒子は、異なるＨＰＶバリアント、異なる薬剤を含有するＨＰＶに基づく粒子、および免疫原性が改変されたＨＰＶ粒子の任意の組み合わせであってよい。
【００４４】
あるいくつかの実施形態において、ＨＰＶナノ粒子は、１つ以上の治療薬を粘膜細胞（例えばＨＰＶ感染細胞）に送達するために使用することもできる。その他の実施形態において、改変されたＨＰＶナノ粒子は、１つ以上の治療薬を標的細胞に送達するために使用することもできる。あるいくつかの実施形態において、改変されたＨＰＶナノ粒子は、血清型特異的抗体を持つ宿主においてイムノサイレントである。例えば、第１のＨＰＶ血清型（例えばＨＰＶ−１６）に感染した被験体において、この血清型に対する抗体が発生する。このような被験体において、第１血清型を有するウイルス粒子（例えば野生型ＨＰＶ１６に基づくＶＬＰ）は、ＶＬＰに基づく薬物送達の効力を低減する免疫応答を誘導し得る。
【００４５】
別の例において、被験体は、ＨＰＶ（例えばＧＡＲＤＡＳＩＬおよびＣＥＲＶＡＲＩＸ）に対して免疫されてよく、第１および／または第２の血清型（例えばＨＰＶ−１６およびＨＰＶ１８）に対する中和抗体が発生している。このような被験体において、第１および／または血清型を有するウイルス粒子（例えば野生型ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８に基づくＶＬＰ）は、ＶＬＰに基づく薬物送達の効力を劇的に低減させる免疫応答を誘導し得る。
【００４６】
しかし、宿主中の第１血清型特異的抗体（例えば宿主中のＨＰＶ−１６血清型特異的抗体）および／または宿主中の第２血清型特異的抗体（例えば宿主中のＨＰＶ−１８血清型特異的抗体）により、改変されたＨＰＶナノ粒子が認識されないように、本明細書に記載される方法によりＨＰＶナノ粒子を変更できる。異なる血清型からのＬ１および／またはＬ２タンパク質を含むこのような改変されたＨＰＶまたはＨＰＶナノ粒子を治療のために使用することもできる。例えば、血清型特異的免疫応答を誘導することなく、および／または宿主応答により中和されることなく、効力を喪失することなく１つ以上の治療薬をＨＰＶで免疫されたかまたはＨＰＶに感染した宿主に送達するために、異なる血清型に基づくこのような改変されたＨＰＶナノ粒子またはＶＬＰを使用することもできる。異なる血清型に基づくこのような改変されたＨＰＶナノ粒子またはＶＬＰを、繰り返し用いて（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上の投与）治療薬を送達することもできる。あるいくつかの実施形態において、被験体において、異なる血清型に基づく改変されたＨＰＶナノ粒子またはＶＬＰを認識する新しい抗体が発生する。また、ＨＰＶに感染していない被験体において、治療目的のために被験体に投与されるＨＰＶに基づく粒子の血清型に対する免疫応答が発生することがある。これらの場合、異なって変更された第２のＨＰＶナノ粒子またはさらに異なる血清型からのＬ１および／もしくはＬ２タンパク質を含む第２のＨＰＶナノ粒子を、元のＨＰＶ血清型および第２の変更されたＨＰＶナノ粒子に特異的な免疫応答（例えば中和免疫応答）を誘導することのない、被験体へ（例えばＨＰＶ感染細胞またはＨＰＶに対して免疫されたかもしくは本発明のＨＰＶに基づく組成物で治療された被験体内の細胞へ）の治療薬の継続した送達のために使用することもできる。被験体において、第２の変更されたＨＰＶナノ粒子または第２のＬ１および／もしくはＬ２タンパク質を含有する第２のＶＬＰに対する免疫応答が発生した場合（または免疫応答の発生を防ぐために）、第３の変更されたＨＰＶナノ粒子または第３のＬ１および／もしくはＬ２タンパク質を含有する第３のＶＬＰを使用することもできる。このプロセスは、異なる改変されたＨＰＶナノ粒子の連続物を用いて数回繰り返してよく、かつ／または異なるＬ１および／もしくはＬ２タンパク質の連続物を含有する異なるＶＬＰを使用することもできる。いくつかの実施形態において、第１組が被験体において効力を失った場合、被験体において第１組に対する免疫応答が検出された場合、または治療を開始した後の所定の時間（例えば所定の投与回数の後または第１組の投与の所定の期間の後）に、粒子の第１組から別の組に切り替えてよい。
【００４７】
あるいくつかの実施形態において、異なる血清型に基づくＶＬＰは、ＨＰＶの遺伝子型および／または血清型の類似性に基づいて選択される。いくつかの実施形態において、異なる血清型に基づくＶＬＰは、抗体の中和交差反応性に基づいて選択される。いくつかの実施形態において、被験体においてそれに対する中和抗体が発生した第１および／または第２血清型との関係が最も遠い異なる血清型に基づくＶＬＰが選択される。例えば、ＨＰＶ１８およびＨＰＶ４５は、密接に関連し、中和抗体の交差保護の程度が高い。ＨＰＶ１６およびＨＰＶ３１は、密接に関連し、中和抗体の交差保護の程度が高い。ＨＰＶ５８は、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８との関係がより遠く、中和抗体による交差保護はほとんどまたは全く観察されない。
【００４８】
よって、治療の連続は、本発明のＶＬＰ組成物の連続物（例えば１つ以上の治療薬を含有する）を投与する工程を含むことができ、ここで、それぞれの継続的ＶＬＰ組成物は、異なるＨＰＶ血清型、例えば関係が離れた血清型からのＶＬＰに基づく。例えば、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８に対して免疫された被験体において、異なる血清型に基づく適切なＶＬＰは、野生型ＨＰＶ５８からのＬ１および／またはＬ２タンパク質を含む粒子であり得る。
【００４９】
別の実施形態において、被験体においてそれに対する中和抗体が発生した第１および／または第２血清型との関係が遠いＶＬＰは、ＨＰＶでないパピローマウイルスから選択することができる。いくつかの実施形態において、ＶＬＰは、ヒトでない哺乳動物に感染するパピローマウイルス、例えばウシパピローマウイルス（ＢＶＰ）またはワタウサギパピローマウイルス（ＣＲＶＰ）またはショープパピローマウイルスからのカプシドタンパク質を含むことができる。治療の連続は、異なるＨＰＶ血清型および／またはその他の非ヒト宿主に感染する異なるパピローマウイルスに基づくＶＬＰの連続物を含むことができることが認識される。
【００５０】
異なって変更されたＨＰＶナノ粒子または異なる血清型のＨＰＶナノ粒子は、異なって変更されたＨＰＶナノ粒子または異なる血清型のＨＰＶナノ粒子に対する抗体が被験体において発生するまでの治療薬の送達のために使用することができる。上記の方法を用いて、血清型の違いおよび／または免疫応答を変更するる変異に基づいてＶＬＰを変更するあるいくつかの実施形態において、被験体は、被験体の免疫応答による送達系の効力を失うことなく、複数回にわたって治療薬で処置できる。いくつかの実施形態において、このような計画は、全てのＨＰＶ感染細胞が実質的に消去され、かつ／またはがんもしくは病変の寛解（部分的または完全）が生じるまでの、ＨＰＶ感染および／またはＨＰＶ関連がんの繰り返しまたは継続した治療を可能にする。しかし、このような計画は、本発明の態様に従うその他の状態の繰り返しまたは継続した治療のために使用できることが認識される。
【００５１】
いくつかの実施形態において、被験体は、ＨＰＶワクチン（例えば市販で入手可能なもの、例えばＧＡＲＤＡＳＩＬおよびＣＥＲＶＡＲＩＸ）を用いてワクチン接種される。これらの実施形態において、免疫は、ワクチンが標的にするウイルスに感染するようになること（例えばワクチン接種により被験体が免疫応答を産生したウイルス）、およびこれらのワクチン特異的ウイルスにより引き起こされるＨＰＶ関連疾患が発達することから被験体を保護する。しかし、現在入手可能なワクチンは、全てのＨＰＶ遺伝子型および／または血清型の感染に対して保護しない。いくつかの実施形態において、ＨＰＶをワクチン接種された被験体は、ワクチンが標的にしない、例えばワクチン接種された被験体においてそれに対する免疫応答が発生していないＨＰＶ（例えば高リスクＨＰＶ）に感染するようになる。いくつかの実施形態において、ワクチン接種された被験体は、異なるＨＰＶ型への感染の複数の発生に遭遇する。いくつかの実施形態において、被験体は、被験体において異なる細胞に感染して、それに保持される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の異なるＨＰＶ型に感染するようになることがある。いくつかの実施形態において、ワクチン接種された被験体においてそれに対する免疫応答が発生していない高リスクＨＰＶに感染するようになるワクチン接種された被験体において、ワクチン接種された被験体においてそれに対する免疫応答が発生していない高リスクＨＰＶにより引き起こされるＨＰＶ関連疾患、例えばＨＰＶ関連異形成またはがんが発達することがある。これらの実施形態において、被験体は、本明細書に記載される方法を用いて本明細書に記載されるＶＬＰを用いて治療してよい。
【００５２】
例えば、市販で入手可能なワクチンの１つで免疫した被験体は、ＨＰＶ１６および１８に対する中和抗体を発生し、ＨＰＶ６および１１に対する中和抗体も発生することがある。免疫された被験体は、これらのＨＰＶ型（ＨＰＶ１６、１８（がん）およびＨＰＶ６、１１（疣贅））により引き起こされる子宮頚部前癌および／または性器疣贅の発生から保護される。免疫によりＨＰＶ１６および１８に対する中和抗体が発生した被験体では、その他のＨＰＶ型（例えばＨＰＶ１６に対して産生された中和抗体についてＨＰＶ３１、およびＨＰＶ１８に対して産生された中和抗体についてＨＰＶ４５）と交差反応性を示すいくつかの中和抗体が発生することがある。しかし、免疫された被験体は、被験体においてそれに対する交差中和抗体が発生していないその他の高リスクＨＰＶ型（例えばＨＰＶ５８、または他のものなど）への感染に対して、まだ感受性である。免疫された被験体が感染し得るさらなる高リスクＨＰＶ型は、例えばＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３５、ＨＰＶ−３９、ＨＰＶ−５１、ＨＰＶ−５２、ＨＰＶ−５６、ＨＰＶ−５９、ＨＰＶ−６８およびＨＰＶ−６９であり得る。免疫された被験体において交差中和抗体が発生していないか、または十分に特異的な交差中和抗体が発生していないか、または十分な力価の交差中和抗体が発生していないならば、免疫された被験体は、被験体においてそれに対する十分な保護が発生してない高リスクＨＰＶ型の１つ以上に感染した場合に、異形成またはがんなどのＨＰＶ関連疾患が発達する危険性がまだある。
【００５３】
このような被験体において、１もしくは複数の治療薬（例えばＥ７ ｓｉＲＮＡ）を含む本明細書に記載される改変ＶＬＰまたは異なる（関係がより遠い）血清型のウイルス粒子（例えば野生型ＨＰＶ５８に基づくＶＬＰ）を、被験体において十分な保護が発生しなかった高リスクＨＰＶにより引き起こされる、被験体の持続性高リスクＨＰＶ感染により発達する早期段階疾患を治療するために被験体に投与することができる。この例において、治療は、早期異形成の消去を可能にし、さらに、その他のさらなるＨＰＶ型へのさらなる感染に対するより広い交差保護を被験体に提供し得る。
【００５４】
いくつかの実施形態において、ＨＰＶナノ粒子は、ウイルスＬ１タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ＨＰＶナノ粒子は、ウイルスＬ１タンパク質およびウイルスＬ２タンパク質を含む。Ｌ１および／またはＬ２タンパク質は、いくつかの実施形態において、野生型ウイルスタンパク質であってよい。いくつかの実施形態において、Ｌ１および／またはＬ２タンパク質を、得られるＬ１および／またはＬ２タンパク質がナノ粒子の集合に必須の「最小」ドメインのみを含むように変異および／または欠失により変更することもできる。いくつかの実施形態において、Ｌ１および／またはＬ２タンパク質は、さらなる機能性を提供するその他のタンパク質および／またはペプチドと融合することもできる。これらのその他のタンパク質は、ウイルス性または非ウイルス性であってよく、いくつかの実施形態において、例えば宿主特異的または細胞型特異的であり得る。ＶＬＰは、１つ以上の組換えタンパク質またはその断片（例えば１つ以上のＨＰＶ膜および／もしくは表面タンパク質またはその断片）を含有する粒子に基づくものでもよい。いくつかの実施形態において、ＶＬＰは、本明細書に記載されるように１つ以上の薬剤を組み込むように加工された天然に存在する粒子に基づくものでもよい。なぜなら、本発明の態様は、この点に限定されないからである。あるいくつかの実施形態において、１つ以上の標的ペプチドを含む粒子を使用することもできる。ＨＰＶタンパク質またはペプチドのその他の組み合わせを使用することもできる。なぜなら、本発明の態様は、この点に限定されないからである。
【００５５】
いくつかの実施形態において、ウイルス野生型カプシドタンパク質は、変異、挿入および欠失により変更される。今日までに同定されている全ての立体構造依存性型特異的エピトープは、ＢＣ、ＤＥ、ＥＦ、ＦＧおよびＨＩループとよばれる、アミノ酸配列がＨＰＶ型間で非常に相違する超可変ループ内のＨＰＶ−ＶＬＰ表面上で見出されている。ほとんどの中和抗体は、これらの可変ループ内のエピトープに対して作製され、交差反応性、交差中和性および交差保護が限定されて型特異的である。異なるＨＰＶ血清型は、異なる型特異的エピトープおよび／または異なるループを指向する抗体を誘導する。
【００５６】
特定のＨＰＶ血清型に対して作製された抗体の制限された交差反応性を治療のために活用する方法が、本明細書において提供される。あるいくつかの実施形態において、ウイルスカプシドタンパク質、ＨＰＶ Ｌ１および／またはＬ２は、１つ以上の超可変および／または表面露出ループにある１つ以上のアミノ酸の位置で変異される。変異は、ＨＰＶ血清型間で保存されていないループ内のアミノ酸の位置で行われる。これらの位置は、完全に非保存的であってもよく、すなわち、任意のアミノ酸がこの位置に存在できるか、またはこの位置は、保存的アミノ酸変化だけを行い得るように保存できる。
【００５７】
保存的アミノ酸変化は、機能的、化学的または構造的な考察に従って行うことができる。例えば、保存的アミノ酸変化は、化学的類似性：酸性（Ｄ／Ｅ）、脂肪族（Ａ／Ｇ／Ｉ／Ｌ／Ｖ）、アミド（Ｎ／Ｑ）、芳香族（Ｆ／Ｗ／Ｙ）、塩基性（Ｒ／Ｈ／Ｋ）、ヒドロキシル（Ｓ／Ｔ）、イミノ（Ｐ）、硫黄（Ｃ／Ｍ）；または機能的類似性：酸性（Ｄ／Ｅ）、塩基性（Ｒ／Ｈ／Ｋ）、疎水性（Ａ／Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｆ／Ｐ／Ｗ／Ｖ）、極性（Ｎ／Ｃ／Ｑ／Ｇ／Ｓ／Ｔ／Ｙ）；または電荷の類似性：酸性、塩基性、中性；または構造的類似性：両価性（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ）、外側（Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｑ／Ｅ／Ｈ／Ｋ）、内側（Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｆ／Ｖ）に従って行うことができ、ここで、括弧内のアミノ酸の群の任意のアミノ酸を、その群の中の別のものに変化でき、このような変化は、例えば構造的、機能的または化学的といったあてはめる考察に従って保存的変化と考えることができる。いくつかの実施形態において、１つ以上の因子を考慮してよい。
【００５８】
あるいくつかの実施形態において、アミノ酸変化を、１つ以上のループ中に、１つ以上のアミノ酸の位置および１つ以上のループ中の、ある血清型の野生型アミノ酸配列を変更する１もしくは複数の位置に導入して、別のＨＰＶ血清型において見出されるアミノ酸配列にする。例えば、あるループにおいて、血清型Ｘについてのアミノ酸配列がＡＢＣＤＥＦＧであり、異なる血清型Ｙの同じループにおいてアミノ酸配列がＡＢＨＩＪＧであるならば（ＡＢＣＤＥＦＧとＡＢＨＩＪＦＧは異なるアミノ酸配列である）、ＡＢおよびＦＧを保存して、ＣＤＥを変異してよい。変異は、血清型Ｙにおいて、ＣもしくはＤもしくはＥに導入してよく、またはＣＤもしくはＤＥもしくはＣＥに導入してよく、またはＣＤＥに導入してよい。これらの実施形態において、ＣはＨに変異でき、ＤはＩに変異でき、ＥはＪに変異できる。これらの実施形態において、１つ以上のループは、ある血清型（例えばＹ）のアミノ酸配列を有してよく、タンパク質の残りの部分および（未変更ループ）の残りの部分は、異なる血清型（例えばＸ）のものである。これらの実施形態において、ウイルスカプシドタンパク質の小さい部分だけが変異される。
【００５９】
表２は、異なるＨＰＶ型のＦＧループのアラインメントの例を示す。
【００６０】
【表２−１】

【００６１】
【表２−２】

表２における例は、変異を任意の「Ｘ」位に導入してよく、保存的変異を括弧内に示す任意の位置に導入してよいが、保存されたアミノ酸（太字）は同じに保つことを示す。表２の例に基づいて、当業者は、任意の表面露出超可変ループについて任意の数のＨＰＶウイルスのＨＰＶ配列を整列させて、保存されたアミノ酸および保存されていないアミノ酸を、周知のアラインメントプログラムを用いて過度の実験を行うことなく導くことができる。
【００６２】
あるいくつかの実施形態において、ある血清型の保存されていない野生型アミノ酸を、別の血清型の等価な野生型アミノ酸に変化させる１つ以上のアミノ酸変化を、１つ以上のループにおいて行ってよい。例えば、表２の例によると、ＨＰＶ１６のＦＧループの２６０位の野生型アミノ酸（Ｌ）を、ＨＰＶ３１の２６１位の等価な野生型アミノ酸である（Ｆ）に変更してよい。さらに、ＨＰＶ１６のＦＧループの２６４位の野生型アミノ酸（Ａ）を、ＨＰＶ３１のの２６５位の等価な野生型アミノ酸である（Ｓ）に変更してよい、などである。この様式により、ある血清型のウイルスカプシドタンパク質の１つ以上のループ（例えばＨＰＶ１６のＬ１のＦＧループ）を、カプシドタンパク質の全てのその他のアミノ酸を野生型（例えばＨＰＶ１６のＬ１）に保ちながら、別の血清型の同じウイルスカプシドタンパク質のループ（例えばＨＰＶ３１のＬ１のＦＧループ）のアミノ酸配列を多少密に模倣するように変更してよい。いくつかの実施形態において、特定の血清型の主要なエピトープを持つ１つ以上のループのアミノ酸を、異なる血清型における同じループの等価な位置にあるアミノ酸に、本明細書に記載される方式で変更することにより、ＨＰＶ感染個体の免疫系のＨＰＶ特異的抗体によるウイルス粒子の認識が低減する。いくつかの実施形態において、変更されたＨＰＶナノ粒子は、イムノサイレントであり、ＨＰＶに対してＨＰＶ感染被験体において発生したＨＰＶ特異的抗体により認識されない。例えば、ＨＰＶ１６で免疫したかまたはそれに感染した被験体において、ＨＰＶ１６特異的抗体が発生する。免疫系が、ＨＰＶ１６に由来する野生型Ｌ１タンパク質を含むＶＬＰに遭遇すると、免疫応答が生じる。しかし、免疫系が、本明細書に記載される方式で変更されたＨＰＶ１６に由来するＬ１タンパク質を含むＶＬＰに遭遇すると、ＨＰＶ１６特異的免疫応答は（最初は）生じない。変更されたＶＬＰでの繰り返しの攻撃の後に、変更されたＶＬＰを受けた被験体において、その粒子を指向する新しい免疫応答が発生する。この場合、異なって変更されたＶＬＰおよび／または別の血清型からのＶＬＰを、本明細書に記載される治療方法について用いることができる。
【００６３】
驚くべきことに、ある血清型のウイルスカプシドタンパク質の１つ以上のループが、別の血清型のウイルスカプシドタンパク質のループのエピトープ構造を模倣するように変更されているいくつかの実施形態において、この変更されたカプシドタンパク質を含むＶＬＰは、どちらの血清型を指向する中和抗体によっても認識されない。本発明の態様によると、ループ（例えばＦＧループ）がメジャーエピトープを含有していても、血清型は、ウイルスカプシドタンパク質の残りの部分の関係におけるそのエピトープにより決定される。ウイルスカプシドタンパク質の残りの部分の配列を変化させずにループだけを改変する場合、元の血清型（またはループ配列が第１血清型の配列から第２血清型の配列に変化している場合は、複数の血清型）に対する抗体により驚くべきことに認識されない新規な血清型が得られる。いくつかの実施形態において、１つ以上の位置は、薬剤（例えば核酸、例えばＲＮＡまたはＤＮＡ、例えば組換え核酸、例えば本明細書に記載される治療用核酸）をパッケージングして送達する能力を保持しながら、新しい血清型を作製するために変化できる。
【００６４】
いくつかの実施形態において、ＦＧループのＸ_１位、Ｘ_２位、Ｘ_３位、Ｘ_５位、Ｘ_６位、Ｘ_１１位およびＸ_１４位の１つ以上を変更して、薬剤（例えばＨＰＶ核酸とは異なる異種核酸（例えば核酸、例えばＲＮＡまたはＤＮＡ、例えば組換え核酸、例えば本明細書に記載される治療用核酸））をまだパッケージングして送達できる新しい血清型を作製してよい。いくつかの実施形態において、第１のＬ１タンパク質中のこれらの位置の１つ以上は、第１血清型のアミノ酸から、第２血清型のアミノ酸に変化させる。例えば、いくつかの実施形態において、Ｘ_１位、Ｘ_２位、Ｘ_３位、Ｘ_５位、Ｘ_６位、Ｘ_１１位およびＸ_１４位の全てを、第１のＨＰＶ血清型配列（例えばＨＰＶ１６血清型配列）から、第２のＨＰＶ血清型配列（例えばＨＰＶ３１血清型配列）に、第１の（例えばＨＰＶ１６）Ｌ１配列の関係において変化させてよい。いくつかの実施形態において、Ｘ_６、Ｘ_１１およびＸ_１４だけを、第１のＨＰＶ血清型配列（例えばＨＰＶ１６血清型配列）のアミノ酸から、第２のＨＰＶ血清型配列（例えばＨＰＶ３１血清型配列）に、第１の（例えばＨＰＶ１６）Ｌ１配列の関係において変化させる。いくつかの実施形態において、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_１１およびＸ_１４の任意の組み合わせ（例えば、これらの位置の任意の１、２、３、４、５、６または７）を、第１血清型のアミノ酸から第２血清型のアミノ酸に、Ｌ１配列の残りの部分を変化させずに変更してよい。第１および第２の血清型は、任意の適切な血清型（例えばＨＰＶ１６、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３４、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ７３、ＨＰＶ９１、または特定のＦＧループ配列を有する任意のその他の血清型）であってよいことが認識される。いくつかの実施形態において、これらの位置のいずれの１つ以上も、任意の保存的または非保存的アミノ酸（変化が、別の天然に存在する血清型からのアミノ酸に相当するかどうかにかかわらず）に、薬剤（例えば天然ＨＰＶ核酸とは異なる核酸または本明細書に記載される任意のその他の薬剤）をパッケージングして送達する能力を保持する、それ以外は変化しないＬ１配列またはその部分の関係において変化してよいことも認識される。
【００６５】
いくつかの実施形態において、薬剤をまだパッケージングして送達できる改変ＨＰＶ粒子は、Ｌ１タンパク質のＸ_１６位に改変を有さない。例えば、改変ＨＰＶ１６は、その他の位置に１つ以上の変化を有し得るが、Ｘ_１６位にアスパラギン（Ｎ）を保持する。
【００６６】
中和ＭＡｂについての主要なエピトープは、ＨＰＶ血清型間で異なる１つ以上のループ上で同定されていることが認識される。例えば、ＨＰＶ１１についてＤＥループ中、ＨＰＶ６についてＢＣおよびＥＦループ中、ならびにＨＰＶ３３についてＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ中、ＨＰＶ１６についてＦＧループ中、ならびにＨＰＶ３１についてＥＦループ中である（例えばＦｌｅｕｒｙら、Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．２００９年に記載されるように）。本明細書に記載される方策を用いて、当業者は、メジャーエピトープを含むことが示されているその他のループの配列を整列させて、さらなる改変ＶＬＰを作製できる。
【００６７】
変更されたカプシドタンパク質がＶＬＰを形成する能力を維持し、標的細胞へ治療薬（複数可）を移入する、得られるＶＬＰの能力を維持しながら、免疫原性を改変もしくは変更するかまたは任意のその他の理由のため（例えば、立体構造変化を誘導もしくは防止するため、荷電アミノ酸基を増加もしくは低減させるため、標的化を変更するため、バイオアベイラビリティーを増加させるため、特定の投与経路による取り込みを増加させるために特定の改変を誘導するため）に、任意の数のアミノ酸変化（変異、欠失、付加）を、ウイルスカプシドタンパク質内の任意のアミノ酸の位置で（表面ループの１つ以上において、内側に面する基を有するアミノ酸を含む部位で、またはカプシドタンパク質中の任意のその他の位置で）行うことができることも認識される。
【００６８】
アミノ酸改変は、本明細書で教示されることおよびループ内に配置された直鎖状および立体構造エピトープに関して当該技術において公知であることに従って導入できることがさらに認識される。例えば中和抗体の認識部位であり得るか、または細胞標的化のために重要な位置であり得るか、またはＶＬＰによる細胞侵入を支援し得る立体構造エピトープが同定されている（例えばＦｌｅｕｒｙら、Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．２００９年およびＳａｄｅｙｅｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００２年、３０９巻：３２〜４０頁（これらの内容は、本明細書に参照によりその全体が組み込まれる）に記載されるように）。ループ内の１つ以上のアミノ酸の改変は、立体構造エピトープに従って設計してよく、保存されていないものに加えて、保存されている１つ以上のアミノ酸の改変を含んでよい。
【００６９】
いくつかの実施形態において、アミノ酸配列をループ内に挿入してよい。例えば、短いアミノ酸配列を、１つ以上の表面露出ループに挿入してよい。短いアミノ酸配列挿入は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００もしくは２５０アミノ酸の長さ、または４アミノ酸と２５０アミノ酸との間の任意の長さであり得る。あるいくつかの実施形態において、挿入断片は、４と５０、５と２５または５と１５アミノ酸の間の長さである。挿入断片は、ループ内のあらゆる場所に挿入できる。いくつかの実施形態において、挿入断片は、ループのほぼ中央に挿入される。あるモチーフがあるループにより示されることが公知であり、そのモチーフを維持することが望まれるならば、挿入断片は、そのモチーフのＮ末端またはＣ末端のいずれかのモチーフの外側に作製される。一方、あるループ内に示されるあるモチーフを破壊することが望まれるならば、挿入断片は、そのモチーフ内に作製される。モチーフは直鎖状または構造的であることができ、すなわち、これは、１次アミノ酸配列またはその２次（もしくは３次）構造に基づいてよい。モチーフは、ＶＬＰ取り込みおよび／もしくは標的細胞認識を容易にし得る細胞認識モチーフであることができるか、またはこれは、ある抗体により認識されるかもしくは抗原性であることが公知のエピトープであってよい。いくつかの実施形態において、挿入断片が、標的化または細胞取り込みを促進するために用いられる場合、挿入断片は、例えばウイルス標的化ドメインを含んでよい。これらのドメインがＨＰＶに限定されないことが認識される。ウイルス標的化ドメインは、所望の任意の細胞を標的にする任意のウイルスに由来してよい。挿入断片は、例えば、受容体認識モチーフなどの宿主特異的細胞認識モチーフも含んでよい。いくつかの実施形態において、挿入断片は、例えばＳｔｒｅｐ Ｔａｇ（商標）（ＳＴＩＩ、ＷＳＨＰＱＦＥＫ、配列番号１２）などのアフィニティータグのためのエピトープを含むアミノ酸配列を含んでよい。
【００７０】
いくつかの実施形態において、挿入は、免疫応答を刺激するために用いられる。これらの実施形態において、挿入断片は、ウイルス起源（例えば種々のＨＰＶ血清型から）の１つ以上のエピトープ（例えばポリトープ）を含んでよい。例えば、ポリトープは、種々のＨＰＶ血清型、例えばＨＰＶ１６、１８、３１、３３および４５のＬ１タンパク質の抗原性領域（エピトープ）を含んで構築してよい。いくつかの実施形態において、Ｌ２タンパク質の領域を挿入してよい。
【００７１】
いくつかの実施形態において、１つ以上のエピトープの挿入により、１つ以上のエピトープに対する免疫応答が被験体において生じる。いくつかの実施形態において、免疫応答は、ウイルス（例えばＨＰＶ）への再感染および／またはウイルス（例えば抗ウイルス治療の後の残りのウイルスを起源とする）の再増殖および／またはウイルス関連がん（例えば抗がん治療の後の残りのウイルス形質転換がん細胞を起源とする）の再発に対する保護を与える。
【００７２】
いくつかの実施形態において、ペプチドをＶＬＰ表面に結合させて、免疫応答の変更もしくは増幅（例えば該ペプチドが１つ以上のエピトープを含むならば）、あるいはＶＬＰの標的化および／もしくは細胞取り込みの変更または増幅（例えば該ペプチドが１つ以上の細胞受容体を含むならば）を誘導してよい。例えば、ＶＬＰは、アルブミン結合ドメインを有して、血管または経細胞輸送を増進するペプチド（例えば、基底から頂端への経細胞輸送を増進するインテグリン結合（ＲＧＤ）モチーフ、ヘパラン硫酸部分またはその他の部分）、ならびに／または標的細胞によるそれらの取り込みを増進する受容体特異的結合ドメイン（例えばＥＧＦＲ結合ドメイン）、ならびに／またはエンドソームおよび／もしくは核輸送を増進するペプチドによるそれらの輸送を増進できる。
【００７３】
いくつかの実施形態において、ペプチドは、適切なリンカー、例えばグルタルアルデヒド、イミドエステルならびにＢＳ（ＰＥＧ）９、ＢＳ（ＰＥＧ）５、ＤＴＳＳＰ、ＥＤＣ、ＳＭ（ＰＥＧ）２、ＳＭＣＣおよびスルホＳＭＣＣ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて化学的架橋により結合できる。
【００７４】
いくつかの実施形態において、ペプチドは、ＳｔｒｅｐＴａｇ（商標）などのアフィニティータグにより結合できる。
【００７５】
いくつかの実施形態において、ペプチドは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００アミノ酸の長さである。
【００７６】
あるいくつかの実施形態において、Ｌ１タンパク質およびＬ１＋Ｌ２タンパク質は、組換えにより生成してよい。あるいくつかの実施形態において、組換えにより生成されたＬ１タンパク質およびＬ１＋Ｌ２タンパク質は、自己集合してウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成してよい。組換え生成は、細菌、昆虫、酵母または哺乳類宿主系において行ってよい。Ｌ１タンパク質を発現してよいか、またはＬ１＋Ｌ２タンパク質を、宿主系において同時発現させてよい。
【００７７】
宿主系においてＬ１およびＬ２組換えウイルスタンパク質を発現させて精製する方法、ＨＰＶナノ粒子またはＶＬＰを解体および再集合する方法、ならびにＬ１およびＬ２のアミノ酸配列への改変、被験体へのＶＬＰの投与およびＶＬＰを含む医薬組成物の例は、当該技術において周知であり、本明細書に教示される。例えば、米国特許第６，４１６，９４５号、第６，９９１，７９５号および第７，２０５，１２６号は、本明細書に参照により組み込まれる。しかし、本明細書で示す方法および形態は、上記の米国特許に記載されるものに限定されないことが認識される。当業者に公知のその他の方法および形態も採用してよい。
【００７８】
あるいくつかの実施形態において、ＨＰＶナノ粒子またはＶＬＰには、１つ以上の治療薬が充填される。ＨＰＶナノ粒子には、本明細書に記載するように、Ｌ１またはＬ１およびＬ２ウイルス粒子を解体および再集合することにより充填してよい。ウイルスカプシドタンパク質をＶＬＰに解体／再集合することを支援するために有用な塩は、Ｚｎ、ＣｕおよびＮｉ、ＲｕおよびＦｅの塩を含む。その他の充填方法を使用することもできる。なぜなら、本発明は、この点に限定されないからである。いくつかの実施形態において、ＨＰＶナノ粒子には、１つ以上の治療薬を充填してよい。
【００７９】
いくつかの実施形態において、Ｌ１タンパク質またはＬ１およびＬ２タンパク質を含むＨＰＶナノ粒子は、１つ以上の治療薬をさらに含む。あるいくつかの実施形態において、治療薬は、１もしくは複数のｓｉＲＮＡ分子あるいはそれぞれが１もしくは複数のｓｉＲＮＡ分子を発現できる１つ以上の核酸（例えばプラスミドまたはその他のベクター）を含む。いくつかの実施形態において、治療薬は、１もしくは複数のアンチセンス核酸（例えば抗Ｅ６および／または抗Ｅ７）、それぞれが１もしくは複数のアンチセンス核酸を発現できる１つ以上の核酸（例えばプラスミドまたはその他のベクター）を含む。いくつかの実施形態において、ＨＰＶナノ粒子は、２以上の治療薬の組み合わせを含む。
【００８０】
いくつかの実施形態において、治療薬は、ＲＮＡ干渉の誘導物質または遺伝子サイレンシングのその他の誘導物質である。ＲＮＡ干渉の誘導物質は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、２重リボ核酸（ＲＮＡ）分子を含む第１部分と、１本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を含む第２部分とを含むハイブリッド核酸分子、より長い２本鎖ＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡもしくはより長いＲＮＡ配列を発現するためのＤＮＡ構築物であってよい。遺伝子サイレンシングのその他の誘導物質は、ＤＮＡメチル化の誘導物質またはリボザイムまたはアプタマーを含む。その他の実施形態において、治療薬は、ＰＮＡ（ペプチド核酸）などの遺伝子発現の修飾物質であり得る。
【００８１】
ＲＮＡ干渉ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、細胞への２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の導入が、配列依存的な様式で遺伝子発現を翻訳後に阻害するプロセスである。ＲＮＡｉは、短い（例えば１９〜２５ヌクレオチド）ｄｓＲＮＡまたは小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により媒介できる。ｄｓＲＮＡは細胞内で切断されてｓｉＲＮＡを創出し、これらがＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に取り込まれて、複合体が相同内因性ｍＲＮＡに導かれ、該ｍＲＮＡ転写産物を切断し、ｍＲＮＡの破壊をもたらす。
【００８２】
ＲＮＡ干渉を細胞において誘導するために、ｄｓＲＮＡを細胞に、単離核酸断片として、または導入遺伝子、プラスミドもしくはウイルスにより導入してよい。あるいくつかの実施形態において、ＶＬＰを用いて、ｄｓＲＮＡを標的細胞に送達する。
【００８３】
いくつかの実施形態において、短いヘアピンＲＮＡ分子（ｓｈＲＮＡ）を細胞において発現させる。ｓｈＲＮＡは、小型ループ配列で分けられた短い逆方向反復を含む。一方の逆方向反復は、遺伝子標的に相補的である。ｓｈＲＮＡは、次いで、ｓｉＲＮＡに加工され、これが標的遺伝子ｍＲＮＡを分解する。ｓｈＲＮＡは、ヒトＨ１または７ＳＫプロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの制御下にｓｈＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ構築物を有する細胞内で生成できる。代わりに、ｓｈＲＮＡは、外因的に合成して、細胞に直接、例えばＶＬＰ送達により導入してよい。あるいくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡ配列は、４０と１００塩基の間の長さ、または４０と７０塩基の間の長さである。ヘアピンのステムは、例えば、１９と３０塩基対の間の長さである。ステムは、Ｇ−Ｕ対を含んで、ヘアピン構造を安定化してよい。
【００８４】
ｓｉＲＮＡ配列は、標的遺伝子とのそれらの相同性に基づいて選択される。２つのヌクレオチド配列間の相同性は、ＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３〜１０頁）またはＢｅｓｔＦｉｔ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ５３７１１）を含む種々のプログラムを用いて決定してよい。配列比較は、ＦＡＳＴＡおよびＦＡＳＴＰを用いて行ってよい（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、１９８８年、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８３巻：６３〜９８頁を参照されたい）。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの設計のためのツールおよび質は、当該技術において公知である。ｓｉＲＮＡ配列およびスクランブルｓｉＲＮＡ配列の設計のためのウェブに基づくオンラインソフトウェアは、例えばｓｉＤｉｒｅｃｔ、ｓｉＳｅａｒｃｈ、ＳＥＱ２ＳＶＭ、Ｄｅｑｏｒ、ｓｉＲＮＡ Ｗｉｚａｒｄ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）である。特異性は、例えばＳｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙＳｅｒｖｅｒ、ｍｉＲａｃｌｅを用いて予想できる。標的配列は、例えばＨｕＳｉＤａ（ヒトｓｉＲＮＡデータベース）およびｓｉＲＮＡｄｂ（ｓｉＲＮＡ配列のデータベース）で研究できる。配列比較は、関連する配列の全長にわたって行ってよいか、あるいはより好ましくは、約または１０、１５、２０、２５もしくは３０塩基の隣接配列にわたってよい。あるいくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡと標的遺伝子との間の相同性の程度は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％または１００％である。ｓｉＲＮＡは、１０ｂｐと３０ｂｐの間の長さもしくは２０ｂｐと２５ｂｐの間であってよいか、またはｓｉＲＮＡは、２０、２１もしくは２２ｂｐの長さである。
【００８５】
ＲＮＡｉの発生は、培養細胞にｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、その後に対象とするｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲを行うことにより検出できる。ＲＮＡｉがｓｉＲＮＡにより誘導される場合、対象とするｍＲＮＡのレベルは、対照細胞と比較してトランスフェクトされた細胞において低減する。タンパク質生成の低減は、細胞可溶化液のウェスタンブロッティングと、その後に対象とするタンパク質と反応性の抗体を用いてプローブ付加することにより確認できる。
【００８６】
いくつかの実施形態において、サイレンシングされる遺伝子は、ＨＰＶ Ｅ６またはＥ７遺伝子である。ｓｉＲＮＡ配列は、ＲＮＡｉを誘導する、Ｅ６またはＥ７遺伝子配列のいずれか１つ、例えばＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８のものからの１０〜３０ｂｐの任意の隣接配列であってよい。代わりに、これらの配列からの隣接配列を含むより長いｄｓＲＮＡ断片を使用することもできる。なぜなら、これらは、切断されて細胞内でｓｉＲＮＡを形成するからである。
【００８７】
ｓｉＲＮＡ分子は、当該技術において公知の標準的な固相または液相合成技術を用いて合成してよい。ＨＰＶ−１６ Ｅ６およびＨＰＶ−１８ Ｅ６をそれぞれコードするｍＲＮＡに対する合成ｓｉＲＮＡは、市販で入手できる（例えばＤｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＵＳＡから）。
【００８８】
いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ヌクレアーゼによる分解に対するそれらの感受性を低減することにより細胞内でのｓｉＲＮＡの安定性を増加させるために、一方または両方の端に１つ以上のデオキシチミジン塩基の突出を有する。
【００８９】
いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、２重鎖リボ核酸（ＲＮＡ）分子を含む第１部分と、１本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を含む第２部分とを含むハイブリッド核酸分子である。
【００９０】
ヌクレオチド間の連結は、ホスホジエステル結合または代替物であってよく、例えば式Ｐ（Ｏ）Ｓ、（チオエート）；Ｐ（Ｓ）Ｓ、（ジチオエート）；Ｐ（Ｏ）ＮＲ’２；Ｐ（Ｏ）Ｒ’；Ｐ（Ｏ）ＯＲ６；ＣＯ；またはＣＯＮＲ’２（式中、ＲはＨ（もしくは塩）またはアルキル（１〜１２Ｃ）であり、Ｒ６はアルキル（１〜９Ｃ）である）の連結基が、−Ｏ−または−Ｓ−を介して近接ヌクレオチドをつなぐ。
【００９１】
改変ヌクレオチド塩基を、天然に存在する塩基に加えて用いることができる。例えば、改変塩基は、ｓｉＲＮＡ分子の安定性を増加させ、そのことにより、サイレンシングに必要な量を低減させる。改変ヌクレオチド塩基との用語は、共有結合的に改変された塩基および／または糖を有するヌクレオチドを包含する。例えば、改変ヌクレオチドは、３’位のヒドロキシル基以外で５’位のリン酸基以外の低分子量有機基に共有結合により結合した糖を有するヌクレオチドを含む。つまり、改変ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル−；２−Ｏ−アルキル；２−Ｏ−アリル；２’−Ｓ−アルキル；２’−Ｓ−アリル；２’−フルオロ−；２’−ハロまたは２；アジド−リボースなどの２’置換糖、炭素環式糖類似体、ａ−アノマー糖；アラビノース、キシロースもしくはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖およびセドヘプツロースも含んでよい。
【００９２】
改変ヌクレオチドは、当該技術において公知であり、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンおよびピリミジンならびにその他の複素環を含む。これらのクラスのピリミジンおよびプリンは、当該技術において公知であり、シュードイソシトシン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデニン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンチル−アデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル、１−メチルグアニン、２，２−ジメチルグアニン、２メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、−Ｄ−マンノシルクエオシン、５−メトキシカルボニルメチルウラシル、５メトキシウラシル、２メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、シュードウラシル（ｐｓｕｅｏｕｒａｃｉｌ）、２−チオシトシン、５−メチル−２チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル５−オキシ酢酸、クエオシン、２−チオシトシン、５−プロピルウラシル、５−プロピルシトシン、５−エチルウラシル、５エチルシトシン、５−ブチルウラシル、５−ペンチルウラシル、５−ペンチルシトシン、および２，６，ジアミノプリン、メチルシュードウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルシトシンを含む。
【００９３】
いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子またはより長いｄｓＲＮＡ分子は、例えば本明細書に記載されるベクターに含まれる核酸配列の転写により組換えにより作製してよい。ベクターは、任意のＲＮＡまたはＤＮＡベクターであってよい。
【００９４】
ベクターは、ヌクレオチド配列が、細胞に適合するプロモーターに作動可能に連結した発現ベクターであり得る。種々の脊椎動物系において用いるために適切なプロモーターは、当該技術において周知である。例えば、適切なプロモーターは、哺乳類レトロウイルスまたはＤＮＡウイルスプロモーター、例えばＭＬＶ、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＳＶ４０ ＩＥＰ（最初期プロモーター）およびアデノウイルスプロモーターなどのウイルスプロモーター、ならびにメタロチオネインプロモーターを含む。強い哺乳類プロモーターを用いてもよい。本質的に同様の転写活性を保持するこのようなプロモーターのバリアントも使用できることが認識される。
【００９５】
いくつかの実施形態において、ベクターは、１つがｄｓＲＮＡのセンス鎖の発現を駆動し、１つがアンチセンス鎖の発現を駆動する少なくとも２つのプロモーターを有してよい。その他の実施形態において、１つがセンス鎖についておよび１つがアンチセンス鎖についてである２つのベクターを使用することもできる。代わりに、ベクターは、ステム−ループ構造を形成するＲＮＡをコードしてよく、これは、その後、細胞により切断されてｄｓＲＮＡを生成する。
【００９６】
核酸構築物は、特定の細胞、ウイルスもしくはその他の遺伝子発現のプロモーターまたはリプレッサーを含有してよい。プロモーターまたはリプレッサーは、構築物が導入される細胞の関係を反映するように設計してよい。例えば、構築物は、構築物からの発現がウイルスタンパク質の存在に依存するようにウイルスプロモーターを含んでよく、そのことにより構築物は、ウイルス感染細胞においてのみ発現する。同様に、構築物は、ある細胞型もしくある発達段階に特異的なプロモーターまたはリプレッサーを有してよい。例えば、ベクターが、ＨＰＶに感染した細胞などのウイルス感染細胞における使用のためである場合、疾患原因ウイルスに一致するウイルスプロモーター、例えばＨＰＶ感染細胞についてＨＰＶプロモーター（例えばＨＰＶ１６ Ｅ６／Ｅ７の発現を引き起こすプロモーター）を用いる。このような実施形態において、ベクターは、ウイルス感染細胞においてのみ発現する。
【００９７】
あるいくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡ治療薬は、標的細胞の細胞死もしくはアポトーシスを促進または媒介する薬剤を標的にする。あるいくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡ治療薬は、ＨＰＶウイルスタンパク質を標的にする。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子が標的にするウイルスタンパク質は、ウイルスＥ６および／またはＥ７である。Ｅ６ ｓｉＲＮＡは、ウイルス癌遺伝子発現の抑制において有効であることが見出されており、Ｅ６ ｓｉＲＮＡは、有効な成長阻害活性を示す（Ｙｏｓｈｉｎｏｕｃｈｉら、２００３年）。ｓｉＲＮＡにより生じるＥ７サイレンシングは、アポトーシスによる細胞死を誘導する。いずれの特定の理論と結び付けられることも望まないが、合成小型干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、具体的には抗アポトーシス性ＨＰＶ Ｅ７癌遺伝子を指向するものが、アポトーシスおよび細胞死を導くＥ７の存在下でそうでなければ不活性なＨＰＶ陽性がん細胞において休眠腫瘍抑制因子経路を回復することが記載されている。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡによるＥ７のサイレンシングは、Ｅ６を阻害する必要なく、感染宿主細胞のアポトーシスを導くために十分であることがある（Ｍｉｌｎｅｒら）。ウイルスＥ６およびＥ７についてのｓｉＲＮＡは、例えばＢｕｔｚら（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００３年）２２巻、５９３８〜５９４５頁）およびＭｉｌｎｅｒら（特許出願第０１１７３５９．０号および第０２１６９２９．０号ならびにＷＯ２００５／０５１４３１）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載される。
【００９８】
あるいくつかの実施形態において、ＨＰＶ−１６ Ｅ６およびＨＰＶ−１８ Ｅ６は、ｓｉＲＮＡが特異的に標的にできる。あるいくつかの実施形態において、ＨＰＶ−１６ Ｅ６についてのそれぞれの標的遺伝子は、５’−ＵＡＣＡＡＣＡＡＡＣＣＧＵＵＧＵＧＵＧ（配列番号１３、ヌクレオチド３７７〜３９５）である。
【００９９】
あるいくつかの実施形態において、ＨＰＶ−１８ Ｅ６についてのそれぞれの標的配列は、５’−ＣＵＡＡＣＵＡＡＣＡＣＵＧＧＧＵＵＡＵ（配列番号１４、ヌクレオチド３８１〜３９９）である（Ｂｕｔｚらに記載されるように）。
【０１００】
その他の実施形態において、Ｅ６およびＥ７ ｓｉＲＮＡ構築物は、
Ｅ６（フォワード）：５’ＧＡＧＧＵＡＵＡＵＧＡＣＵＵＵＧＣＵＵＴＴ（配列番号１５）；
Ｅ６（リバース）：ＴＴＣＵＣＣＡＵＡＵＡＣＵＧＡＡＡＣＧＡＡ５’（配列番号１６）
および
Ｅ７（フォワード）：５’ＡＧＧＡＧＧＡＵＧＡＡＡＵＡＧＡＵＧＧＴＴ（配列番号１７）；
Ｅ７（リバース）：ＴＴＵＣＣＵＣＣＵＡＣＵＵＵＡＵＣＵＡＣＣ５’（配列番号１８）
である（Ｍｉｌｎｅｒ、ＷＯ２００５／０５１４３１に記載されるように）。
【０１０１】
その他の実施形態において、Ｅ６およびＥ７ ｓｈＲＮＡ構築物は、
表３
【０１０２】
【表３】

である（Ｂｏｕｓａｒｇｈｉｎら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ、２００９年、８巻：３５７〜３６５頁（参照により本発明に組み込まれる）に記載されるように）。
【０１０３】
あるいくつかの実施形態において、ＨＰＶナノ粒子に集合するＬ１および／またはＬ１＋Ｌ２などのウイルス野生型タンパク質のアミノ酸は、変異および／または置換および／または欠失される。あるいくつかの実施形態において、これらのアミノ酸は、ＶＬＰ内部の正電荷を増進するように改変される。あるいくつかの実施形態において、改変を導入して、ｓｉＲＮＡ分子と、ＶＬＰの内部に面するアミノ酸の１もしくは複数とのより強い静電的相互作用を可能にし、かつ／またはｓｉＲＮＡがＨＰＶナノ粒子の外に漏れることを回避する。
【０１０４】
核酸は高く荷電されており、自由拡散により細胞膜を横切らない。さらに、ｓｉＲＮＡの疎水性の特徴およびアニオン性の主鎖が、細胞によるそれらの取り込みを低減する。あるいくつかの実施形態において、治療用抗ウイルスｓｉＲＮＡを、ＨＰＶナノ粒子を投与する被験体に送達して、細胞による取り込み（ｉｎ ｖｉｖｏで生体膜バリアを横断する）および／またはｓｉＲＮＡのバイオアベイラビリティーを増加させてよい。
【０１０５】
ＨＰＶ感染細胞のみにおいてアポトーシスを促進する薬剤を含むＶＬＰ組成物が、これらがＨＰＶに感染した細胞（例えばＶＬＰ表面構成要素は、本来感染性のＨＰＶが標的にする同じ細胞型を標的にする）を標的にし、ＨＰＶ感染細胞を死滅させる薬剤を送達するので、いくつかの実施形態において特に有用であることが認識される。これらの組成物は、いくつかの実施形態においてＨＰＶ感染を治癒するために用いることができる。いくつかの実施形態において、適切な投与量（例えば単回投与量または予め決められているが慢性治療でない治療期間にわたる治療の経過）を用いてＨＰＶ感染細胞を死滅させることを条件として、慢性治療は必要でない。しかし、いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、全てのＨＰＶ感染細胞を死滅させるために十分でないことがあり、１より多い治療の経過および／または慢性治療が必要とされる。いくつかの実施形態において、抗ウイルス剤（アポトーシス促進性薬剤とは反対に）を含むＶＬＰ組成物を、慢性治療のために使用することもできる。
【０１０６】
あるいくつかの実施形態において、治療薬は、抗がん剤である。好ましい実施形態において、抗がん剤はゲムシタビンである。
【０１０７】
あるいくつかの実施形態において、治療薬は、化学療法剤、例えばメトトレキセート、ビンクリスチン、アドリアマイシン、シスプラチン、糖分非含有クロロエチルニトロソウレア、５−フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダカルバジン、タキソール、フラジリン、メグラミンＧＬＡ、バルルビシン、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔａｉｎｅ）およびプロリフェルポサン（ｐｏｌｉｆｅｒｐｏｓａｎ）、ＭＭＩ２７０、ＢＡＹ１２−９５６６、ＲＡＳファルネシル（ｆａｍｅｓｙｌ）トランスフェラーゼ阻害剤、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＭＭＰ、ＭＴＡ／ＬＹ２３１５１４、ＬＹ２６４６１８／ロメトレキソール（Ｌｏｍｅｔｅｘｏｌ）、グラモレク、ＣＩ−９９４、ＴＮＰ−４７０、ハイカムチン／トポテカン、ＰＫＣ４１２、バルスポダール／ＰＳＣ８３３、ノバントロン／ミトキサントロン（Ｍｉｔｒｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、メタレット／スラミン、バチマスタット、Ｅ７０７０、ＢＣＨ−４５５６、ＣＳ−６８２、９−ＡＣ、ＡＧ３３４０、ＡＧ３４３３、インセル／ＶＸ−７１０、ＶＸ−８５３、ＺＤ０１０１、ＩＳＩ６４１、ＯＤＮ６９８、ＴＡ２５１６／マルミスタット、ＢＢ２５１６／マルミスタット、ＣＤＰ８４５、Ｄ２１６３、ＰＤ１８３８０５、ＤＸ８９５１ｆ、レモナールＤＰ２２０２、ＦＫ３１７、ピシバニル／ＯＫ−４３２、ＡＤ３２／バルルビシン、メタストロン／ストロンチウム誘導体、テモダール／テモゾロミド、エバセット／リポソームドキソルビシン、ユータキサン／パクリタキセル、タキソール／パクリタキセル、キセロード／カペシタビン、フルツロン／ドキシフルリジン、シクロパックス／経口パクリタキセル、経口タキソイド、ＳＰＵ−０７７／シスプラチン、ＨＭＲ１２７５／フラボピリドール、ＣＰ−３５８（７７４）／ＥＧＦＲ、ＣＰ−６０９（７５４）／ＲＡＳ癌遺伝子阻害剤、ＢＭＳ−１８２７５１／経口白金、ＵＦＴ（テガフール／ウラシル）、エルガミソール／レバミソール、エニルウラシル／７７６Ｃ８５／５ＦＵエンハンサー、カンプト／レバミソール、カンプトサール／イリノテカン、ツモデックス／ラルチトレキセド（Ｒａｌｉｔｒｅｘｅｄ）、ロイスタチン／クラドリビン、パキセクス／パクリタキセル、ドキシル／リポソームドキソルビシン、カエリクス／リポソームドキソルビシン、フルダラ／フルダラビン、ファーモルビシン（Ｐｈａｒｍａｒｕｂｉｃｉｎ）／エピルビシン、ＤｅｐｏＣｙｔ、ＺＤ１８３９、ＬＵ７９５５３／ビス−ナフタルミド、ＬＵ１０３７９３／ドラスタチン（Ｄｏｌａｓｔａｉｎ）、カエリクス（Ｃａｅｔｙｘ）／リポソームドキソルビシン、ゲムザール／ゲムシタビン、ＺＤ０４７３／Ａｎｏｒｍｅｄ、ＹＭ１１６、ヨウ素（ｌｏｄｉｎｅ）シード、ＣＤＫ４およびＣＤＫ２阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、Ｄ４８０９／デキシフォサミド、イフェス／メスネクス／イホスファミド（Ｉｆｏｓａｍｉｄｅ）、バモン／テニポシド、パラプラチン／カルボプラチン、プラチノール／シスプラチン、ベペシド／エトポシド、ＺＤ９３３１、タキソテール／ドセタキセル、グアニンアラビノシドのプロドラッグ、タキサン類似体、ニトロソウレア、メルファラン（ｍｅｌｐｈｅｌａｎ）およびシクロホスファミドなどのアルキル化剤、アミノグルテチミド、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クロラムブシル（Ｃｈｌｏｒｏｍｂｕｃｉｌ）、シタラビンＨＣＩ、ダクチノマイシン、ダウノルビシンＨＣｌ、エストラムスチンリン酸エステルナトリウム、エトポシド（ＶＰ１６−２１３）、フロクスウリジン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルタミド、ヒドロキシウレア（ヒドロキシカルバミド）、イホスファミド、インターフェロンアルファ−２ａ、アルファ−２ｂ、ロイプロリド酢酸塩（ＬＨＲＨ放出因子類似体）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミンＨＣｌ（ナイトロジェンマスタード）、メルカプトプリン、メスナ、ミトタン（ｏ．ｐ’−ＤＤＤ）、ミトキサントロンＨＣｌ、オクトレオチド、プリカマイシン、プロカルバジンＨＣｌ、ストレプトゾシン、タモキシフェンクエン酸塩、チオグアニン、チオテパ、ビンブラスチン硫酸塩、アムサクリン（ｍ−ＡＭＳＡ）、アザシチジン、エリスロポエチン（Ｅｒｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、インターロイキン２、ミトグアゾン（メチル−ＧＡＧ；メチルグリオキサールビス−グアニルヒドラソン；ＭＧＢＧ）、ペントスタチン（２’デオキシコホルマイシン）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、テニポシド（ＶＭ−２６）またはビンデシン硫酸塩であるが、これらに限定されない。
【０１０８】
あるいくつかの実施形態において、治療薬は、免疫療法剤、例えばリブタキシン、ハーセプチン、クアドラメット、パノレクス、ＩＤＥＣ−Ｙ２Ｂ８、ＢＥＣ２、Ｃ２２５、オンコリム、ＳＭＡＲＴ Ｍ１９５、ＡＴＲＡＧＥＮ、オバレックス、ベキサール、ＬＤＰ−０３、ｉｏｒ ｔ６、ＭＤＸ−２１０、ＭＤＸ−１１、ＭＤＸ−２２、ＯＶ１０３、３６２２Ｗ９４、抗ＶＥＧＦ、ゼナパックス、ＭＤＸ−２２０、ＭＤＸ−４４７、ＭＥＬＩＭＭＵＮＥ−２、ＭＥＬＩＭＭＵＮＥ−１、ＣＥＡＣＩＤＥ、プレターゲット、ＮｏｖｏＭＡｂ−Ｇ２、ＴＮＴ、グリオマブ−Ｈ、ＧＮＩ−２５０、ＥＭＤ−７２０００、ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ、ＣＭＡ ６７６、モノファーム−Ｃ、４Ｂ５、ｉｏｒ ｅｇｆ．ｒ３、ｉｏｒ ｃ５、ＢＡＢＳ、抗ＦＬＫ−２、ＭＤＸ−２６０、ＡＮＡ Ａｂ、ＳＭＡＲＴ １Ｄ１０ Ａｂ、ＳＭＡＲＴ ＡＢＬ ３６４ ＡｂまたはＩｍｍｕＲＡＩＴ−ＣＥＡであるが、これらに限定されない。
【０１０９】
あるいくつかの実施形態において、治療薬は抗ウイルス剤である。抗ウイルス剤の例は、例えばＤｅ Ｃｌｅｒｃｑ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ２００１年、２９７巻：１〜１０頁（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるようなポリサルフェート類（ＰＶＡＳ）、ポリスルホネート類（ＰＶＳ）、ポリカルボン酸類、ポリオキソメタレート類、チコリ酸、ジンテビル、コサラン誘導体、ビシクラム類（すなわちＡＭＤ３１００）、Ｔ−２２、Ｔ−１３４、ＡＬＸ−４０−４Ｃ、ＣＧＰ−６４２２２、ＴＡＫ−７７９、ＡＺＴ（アジドチミジン）、ｄｄＩ、ｄｄＣ、ｄ４Ｔ（ジデヒドロジデオキシチミジン）、３ＴＣ（３’−チアジデオキシシチジン）、ＡＢＣおよびその他のｄｄＮ（２’，３’−ジデオキシヌクレオシド）類似体、ネビラピン、デラビルジン、エファビレンツ、エミビリン（ＭＫＣ−４４２）、カプラビリン、チオカルボキサニリドＵＣ−７８１、アシクロビル、バラシクロビル、ペンシクロビル、ファムシクロビル、ブロモビニルデオキシウリジン（ＢＶＤＵ、ブリブジン）、シドホビル、アデホビルジピボキシル、テノホビルジソプロキシル、リバビリン、バラシクロビル、ガンシクロビル、ホルミビルセン（ｆｏｒｍｉｖｉｒｓｅｎ）、ホスカルネット、ＥＩＣＡＲ（５−エチニル−１−β−Ｄ−リボフラノシルイミダゾール−４−カルボキサミド）、ミコフェノール酸、ネプラノシンＡ、３−デアザネプラノシンＡ、６’−Ｃ−メチルネプラノシンＡ、ＤＨＣｅＡ（９−（トランス−２’，トランス−３’−ジヒドロキシシクロペント−４’−エニル）アデニン）またはｃ^３ＤＨＣｅＡ（９−（トランス−２’，トランス−３’−ジヒドロキシシクロペント−４’−エニル）−３−デアザアデニン）であるが、これらに限定されない。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＲＮＡｉ治療は、シドホビルでの治療をさらに含む。シドホビルは、例えばＨＰＶにより誘導される喉頭乳頭腫を治療するために用いられる抗ウイルス薬である。シドホビルは、子宮頚癌細胞においても活性を有する。シドホビルは、ＶＬＰに基づくＲＮＡｉ治療（例えばＥ６もしくはＥ７特異的ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）の前、同時または後に投与してよい。いくつかの実施形態において、シドホビルは、ＲＮＡｉ分子と同時に投与され、本明細書に記載されるＶＬＰにより送達される。
【０１１１】
さらなる治療薬は、例えば、シグナル伝達阻害剤、例えばセリン−スレオニンキナーゼの阻害剤、Ｒａｓ／ＭＡＰＫの阻害剤、インスリン増殖因子受容体の阻害剤、ＥＧＦＲおよび／またはＰＤＧＦＲの阻害剤、ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲの阻害剤などの血管新生抑制剤、ＰＡＲＰ修飾物質および阻害剤、ヘッジホッグ経路の阻害剤、代謝経路の阻害に関する薬剤、ベータ−インターフェロン、ＴＤＦあるいはｃＰｒＰＭＥＤＡＰである。
【０１１２】
あるいくつかの実施形態において、１つ以上の治療薬を含むＨＰＶナノ粒子は、ＨＰＶに感染した被験体に、該被験体を治療するために十分な量で投与される。あるいくつかの実施形態において、ＨＰＶを有する被験体を、１つ以上の治療薬を含むＨＰＶナノ粒子で治療することは、抗がん剤および／または抗ウイルス剤の投与をさらに含む。これらの薬剤は、同じ時間または異なる時間、例えば１つ以上の治療薬を含むＨＰＶナノ粒子の投与の前または後に共投与してよい。
【０１１３】
あるいくつかの実施形態において、１つ以上の治療薬を含むＨＰＶナノ粒子は、ＨＰＶに感染した被験体に局所投与される。局所投与は、適切な医薬組成物または製剤の形態の、１つ以上の治療薬を含むＨＰＶナノ粒子を投与することを含んでよい。あるいくつかの実施形態において、局所投与のために適切な医薬組成物または製剤は、ゲルまたはクリームであってよい。ゲルまたはクリームは、あるいくつかの実施形態において、粘膜に施与してよい。
【０１１４】
あるいくつかの実施形態において、１つ以上の治療薬を含むＨＰＶナノ粒子は、粘膜表面を有する上皮組織に、例えば子宮頚癌または結腸直腸癌の治療のために投与される。これらの実施形態において、ＨＰＶナノ粒子を含む医薬組成物は、ポリマーなどの粘膜接着性物質をさらに含む。粘膜接着性物質は、体腔を裏打ちする粘膜表面、または胃腸上皮、結腸直腸上皮および子宮頚部の管腔表面を含む表面に接着する任意の処方である。粘膜上皮細胞層は、粘稠性分泌物（粘液）に富む。粘膜接着性ポリマーは、結腸直腸上皮または子宮頚部上皮などの湿ったまたは湿潤な粘膜組織表面に接着する能力を有する。
【０１１５】
多くのポリマーを利用して、ゲル、クリームもしくはその他の接着性物質、例えばヒドロゲル、オルガノゲルもしくは熱可逆性ゲルなどのゲルを形成できる。その他の有用な型のポリマーは、それらに限定されないが、熱可塑性物質およびフィルムを含む。ポリマーは、例えば、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル）、ヒドロキシエチルエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースおよびキトサンならびにそれらの混合物、多糖類（寒天）またはカルボキシメチルセルロースであってよい。いくつかの実施形態において、ゲル、クリームまたはその他の接着性物質は、粘膜接着性の効果を示すその他の材料を含有してよい。このような材料は、二酸化チタン、二酸化ケイ素およびクレイを含む。
【０１１６】
医薬組成物は、例えばゲルとして直接施与してよいか、あるいはこれは、標的にする組織もしくは細胞にゲルを並置することを可能にする予め組み立てられたパッチまたはその他のデバイスに含まれてよい（例えばＭｉｌｎｅｒら、ＷＯ２００５／０５１４３１に記載されるように）。例えば、子宮頚部の表面の組織構造に密着する適切な可撓性を有する裏張り層（例えばポリ（塩化ビニル）またはヒドロキシプロピルセルロースを含む）に接着した生体接着性層または粘膜接着性層を有するパッチを、治療薬と所望によりさらなる治療薬（例えば抗がん剤および／または抗ウイルス剤）とを含むＨＰＶナノ粒子を子宮頚部組織に治療的に送達するために採用できる。パッチの物理的特性は、患者に不快感を与えることなく、そして通常の体の動きの間にパッチがずれることなく、数時間から１日以上の日数にわたって保持されることが理想的である。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、１つ以上の治療薬を含むＨＰＶナノ粒子は、プロピレングリコールメチルセルロースの調製物などのゲルの形態で、焦点を当てることが望まれる標的領域への施与のために提供できる。ゲルは、ゲルに懸濁された５０ｍｇの活性成分のように、チューブで提供してよい。これらのゲルは、皮膚またはその他の上皮表面（例えば子宮頚部または肛門生殖器領域）に塗布するために特に簡便である。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、ゲルは、長いアプリケータチューブ（例えば直腸または膣アプリケータ）から、例えばそれを直腸または膣内に施与するために一定量供給される。しかし、本発明の組成物は、ＨＰＶ感染細胞またはその他の標的細胞に到達する任意の適切な形態で投与してよいことが認識される。なぜなら、本発明は、この点に限定されないからである。例えば、本発明の組成物は、坐剤、カプセル剤、クリーム、ゲル、フォーム、スプレー、エアロゾルおよび／または標的領域（例えば口腔、咽頭、子宮頚部、膣、肛門など）と接触できる材料の表面上もしくはその中に含侵された形態あるいはそれらの２以上の任意の組み合わせで提供してよい。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、１つ以上の治療薬を含むＨＰＶナノ粒子は、１６ゲージの外套針を用いて短期間の治療のために上皮表面もしくは皮膚の上に施与またはその中に挿入できるクリームあるいは結晶単体あるいはペレットとして施与することもできる。
【０１２０】
本発明の組成物は、ＨＰＶに感染した被験体（例えば持続性高リスクＨＰＶ感染を有すると診断されたかまたはそれが判明している被験体）に、異形成もしくはがんを治療し、かつ／または異形成もしくはがんもしくはＨＰＶ感染に関連するその他の状態の発達を防ぐために投与してよいことが認識される。しかし、いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、別の血清型の高リスクＨＰＶ感染に感染している危険性が疑われる持続性高リスクＨＰＶ感染を有する被験体に（例えば予防的に）投与してよい。
【０１２１】
本明細書に記載される組成物が個体に投与される場合、投与は、「予防有効量」または「治療有効量」である。最終組成物が、必要により投与され、これは、治療される疾患および患部領域のサイズに依存する。投与は、例えば毎日、毎週または毎月であってよい。
【０１２２】
組成物の「有効量」との用語は、組成物単独またはさらなる用量と一緒に、所望の生物学的効果を実現するために必要または十分な量のことをいう。所望の応答は、もちろん、治療される特定の状態に依存する。本明細書で示す教示と組み合わせて、種々の活性化合物の中から選択し、有効性、相対的バイオアベイラビリティー、患者の体重、有害な副作用の重篤度および好ましい投与の形態などの因子を平衡させることにより、本質的な毒性を引き起こさず、それでもまだ特定の被験体を治療するために全体として効果的である、効果的な予防または治療上の処置計画を立案できる。任意の特定の施与の有効量は、治療される疾患もしくは有害状態、被験体のサイズまたは疾患もしくは有害状態の重篤度などの因子に依存して変動できる。個別の成分またはその組み合わせの最大用量、すなわち堅実な医療的判断による最高安全用量が用いられることが一般的に好ましい。しかし、患者は、医療的理由、心理的な理由または実質的に任意のその他の理由により、より低い用量または耐容量に固執してよいことが当業者により理解される。当業者は、過度の実験を必要とせずに、有効量を経験的に決定できる。
【０１２３】
本明細書に記載される任意の化合物について、治療有効量は、動物モデルから最初に決定できる。治療有効用量は、その他のナノ粒子などの、類似の薬理学的活性を示すことが公知の化合物についてのデータから決定することもできる。施与される用量は、投与される化合物の相対的バイオアベイラビリティーおよび有効性に基づいて調整できる。上記の方法および当該技術において周知のその他の方法に基づいて最大効力を達成する用量を調整することは、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１２４】
あるいくつかの実施形態において、被験体を治療する方法が提供される。被験体は、任意の哺乳動物であってよい。本明細書で用いる場合、障害または疾患、例えばがん、異形成もしくは腫瘍などの有害状態に関して用いる場合の「治療」、「治療される」または「治療する」との用語は、該有害状態の発達に対して被験体の耐性を増加するか、または言い換えると、被験体において該有害事象が発達する可能性を低減する予防的治療と、被験体において該有害状態が発達した後に該疾患と戦うためまたは該有害状態が悪化することを防ぐための治療とのことをいう。
【０１２５】
あるいくつかの実施形態において、本明細書に記載される治療方法は、いずれのＨＰＶ感染被験体についても適切である。あるいくつかの実施形態において、方法は、性器疣贅および／または尋常性疣贅の治療のために提供される。あるいくつかの実施形態において、方法は、早期段階異形成、ＣＩＮ（ＩＩ、ＩＩＩ）および／または上皮内癌の治療のために提供される。あるいくつかの実施形態において、方法は、子宮頚がんおよび例えば陰唇がん、陰茎がん、口腔扁平上皮癌、頭頚部がんまたは非黒色腫皮膚がんなどの全てのその他のＨＰＶ関連腫瘍の治療のために提供される。いくつかの実施形態において、方法は、ＨＰＶ感染に随伴する感染、例えばヘルペス単純ウイルス感染の治療のために提供される。いくつかの実施形態において、被験体は、ヒトである。あるいくつかの実施形態において、被験体は、女性である。
【０１２６】
同様に、本発明の態様は、これらの組織の１つ以上の感染（例えば陰唇、陰茎、口腔、膣、皮膚またはその他の組織感染）を治療することに関する。
【０１２７】
あるいくつかの実施形態において、Ｌ１またはＬ１およびＬ２を含み、１つ以上の治療薬をさらに含むＨＰＶナノ粒子は、ＨＰＶ感染被験体における、がん細胞になる可能性を有するＨＰＶ感染細胞を標的にしてよい。あるいくつかの実施形態において、Ｌ１またはＬ１およびＬ２を含み、１つ以上の治療薬をさらに含むＨＰＶナノ粒子は、ＨＰＶ感染被験体における、がん細胞であるＨＰＶ感染細胞を標的にしてよい。
【０１２８】
あるいくつかの実施形態において、１つ以上の治療薬を含むＨＰＶナノ粒子を、ＨＰＶに感染した被験体に投与することにより、該被験体におけるＨＰＶ感染がん細胞が死滅する。あるいくつかの実施形態において、１つ以上の治療薬を含むＨＰＶナノ粒子を、ＨＰＶに感染した被験体に投与することは、該被験体におけるＨＰＶ感染がん細胞のアポトーシスを引き起こす。
【０１２９】
子宮頚がんは、通常、長期間にわたって緩慢に発達する。子宮頚部にがんが出現する前に、子宮頚部の細胞は、異形成として公知の変化を受け、ここでは、正常でない細胞が子宮頚部組織に出現し始める。より後になって、がん細胞が成長を開始し、子宮頚部内により深くおよび周囲領域に広がる。
【０１３０】
治療を必要とする被験体を治療するための方法が提供される。治療を必要とする被験体は、好ましくは、ＨＰＶ感染を有する被験体である。いくつかの実施形態において、被験体は、感染の早期段階にある。いくつかの実施形態において、被験体は、早期段階子宮頚部異形成を示す。いくつかの実施形態において、被験体は、ＣＩＮを示す。いくつかの実施形態において、被験体は、子宮頚癌を示す。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、方法は、Ｌ１またはＬ１およびＬ２を含み、１つ以上の治療薬をさらに含むＨＰＶナノ粒子を、ＨＰＶ感染被験体に、該ＨＰＶ感染を治療するために十分な量で投与する工程を含む。あるいくつかの実施形態において、ＨＰＶナノ粒子は、粘膜に局所投与される。あるいくつかの実施形態において、方法は、抗がん剤および／または抗ウイルス剤を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の治療薬は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡをコードする分子である。あるいくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ウイルスＥ６および／またはＥ７を指向する。いくつかの実施形態において、抗がん剤は、ゲムシタビンである。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、ＶＬＰは、抗がん剤を、がんを有する被験体に送達するために使用することもできる。
【０１３３】
あるいくつかの実施形態において、１つ以上の治療薬を含むＨＰＶナノ粒子は、子宮頚部上皮などの上皮に局所的にもしくはその近接部に、または子宮頚部もしくは肛門上皮癌などの上皮病変に局所的にもしくはその近接部に施与できる。いくつかの実施形態において、１つ以上の治療薬は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡをコードする分子である。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、１つ以上の治療薬を含むＨＰＶナノ粒子は、例えば、悪性上皮、例えば泌尿生殖器腫瘍、例えば肛門、膣もしくは子宮頚部腫瘍、例えば子宮頚部ＣＩＮへの施与により、上皮表面に施与するための局所用調製物にある。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、１つ以上の治療薬を含むＨＰＶナノ粒子は、表皮への施与のため、例えば非黒色腫皮膚がんの治療のための局所用調製物として調製される。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、１つ以上の治療薬は、ｓｉＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡをコードする分子である。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、本発明の１もしくは複数のＨＰＶ組成物または方法は、ＨＰＶ感染および／または子宮頚がんのための現在の治療とともに使用することもできる。例えば、本発明の治療方法および／または組成物は、表４に概説する治療技術の１つの前および／または後に使用することもできる。
【０１３８】
表４は、ＣＩＮの治療のために現在用いられている一般的な技術を概説する。
【０１３９】
【表４】

これらの治療は、６０〜９０％の範囲で変動する効力の率を有する。しかし、これらの治療は全て、子宮頚部組織を除去または破壊する浸潤性の処置であり、しばしば、合併症と関連する。
【０１４０】
子宮頚がんの病因は、持続性ヒトパピローマウイルス感染に密に連結している（ｚｕｒ Ｈａｕｓｅｎら、２００２年において論評されている）。パピローマウイルスは、小型非エンベロープＤＮＡウイルスであり、それらの正２０面体カプシドは、Ｌ１およびＬ２タンパク質で構築され、このカプシドは、約８ｋｂｐの閉鎖環状２本鎖ＤＮＡを包む。５０〜６０ｎｍの直径のウイルスカプシドは、Ｌ１メジャータンパク質の７２ペンタマーと、Ｌ２マイナーカプシドタンパク質の１２〜７２コピーとを含有する。
【０１４１】
１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８およびＨＰＶ−６９の型を含む１５のＨＰＶのサブグループが、高リスクに指定されている。高リスクＨＰＶ遺伝子は、ほぼ１００％の子宮頚がん組織試料において見出される（Ｗａｌｂｏｏｍｅｒｓら、１９９９年）。ウイルスゲノムの組み込みと、２つの主要なウイルス癌遺伝子、Ｅ６およびＥ７のその後の発現とは、この特定のがんの発生において重要な工程であると考えられている。Ｅ６は、ｐ５３腫瘍抑制因子タンパク質と結合し、ユビキチン媒介分解のためにそれを標的にさせる（ＭｕｎｇｅｒおよびＨｏｗｌｅｙ、２００２年）。ｐ５３は、細胞応答を、種々のストレス刺激、例えば電離放射線または化学療法剤による遺伝毒性損傷に対して編成する。損傷がどの程度広範囲であるかに依存して、ｐ５３の活性化は、細胞周期停止、ＤＮＡ修復機構の活性化またはアポトーシスをもたらし得る（ＶｏｕｓｄｅｎおよびＬｕ、２００２年）。非機能的または存在しないｐ５３は、細胞分裂速度を加速し、遺伝的不安定性を促進し、悪性形質転換を容易にする（Ａｔｔａｒｄｉ、２００５年）。高リスクヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）によるＥ６およびＥ７ ｍＲＮＡの定常的な発現は、それぞれｐ５３およびｐＲｂの機能を妨げ、子宮頚がんの発生に必須である。
【０１４２】
さらに、ＨＰＶ１６は、頭頚部腫瘍、主にワルダイヤー輪の組織の小さい部分集合と関連する。低リスクＨＰＶ型を含むＨＰＶ型のスペクトルが、口腔がんを含む頭頚部のその他の部位の悪性病変、ならびに食道がんに存在することが証明されている（ｄｅ Ｖｉｌｌｅｒｓら）。
【０１４３】
非黒色腫皮膚がん（基底細胞癌および扁平上皮癌）は、世界中の白人集団のうちで断然最も頻繁ながんである。これらの癌は、日光に曝露された部位で主に生じ、この疾患の病因にＵＶ照射が主要な環境因子であることを示している。細胞遺伝子ｐ５３の変異を含むいくつかの遺伝的変化が、さらに関連している。ベータ−パピローマウイルス属におけるいくつかのＨＰＶ型は、皮膚の扁平上皮癌と関連していると考えられる。これは、ＵＶにより活性化または抑制される皮膚ＨＰＶ型（ＨＰＶ２０、ＨＰＶ３８およびＨＰＶ２７）を含む。
【０１４４】
よって、本発明の態様は、ＨＰＶ感染と関連する子宮頚がん以外の状態を治療するために使用することもできる。例えば、本発明の態様は、ＨＰＶ感染と関連する頭頚部がん（例えば口腔および／または食道がん）を治療するために使用することもできる。しかし、本発明のＨＰＶに基づく粒子が、粘膜疾患または状態（それらがＨＰＶ感染により引き起こされたかどうかにかかわらず）を治療するための一般的な送達媒体として使用することもできることが認識される。よって、本発明の方法および組成物は、ＨＳＶもしくはＨＩＶ感染、および／または例えばＧａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅなどの細菌感染、Ｃａｎｄｉｄａ Ａｌｂｉｃａｎｓ感染などの真菌感染、あるいは寄生生物Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓなどの寄生生物感染、あるいは生殖器での一般的な感染であるその他の感染などのその他の感染を治療するために使用することもできる。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、１つ以上の治療薬を含むＨＰＶナノ粒子は、持続性高リスクＨＰＶ感染、子宮頚部異形成、前癌性病変ＣＩＮ Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ（ＣＩＮ２／３、ＶＩＮ２／３）および／または上皮内癌を治療するために用いることができる。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、１つ以上の治療薬を含むＨＰＶナノ粒子は、性器疣贅、非黒色腫皮膚がん、頭頚部がん、中咽頭がん、外陰がん、膣がん、陰茎がんおよび／または肛門がんを治療するために用いることができる。
【０１４７】
本発明の組成物は、治療の部位に応じて女性または男性の被験体に投与してよい。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、ＨＰＶに基づくＶＬＰを含む組成物は、上皮細胞、例えば皮膚への治療薬の送達のために使用することもできる。いくつかの実施形態において、組成物は、例えば膿痂疹および膿瘡などの皮膚疾患を引き起こす例えばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、ＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓならびにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓを含むグラム陽性細菌により引き起こされる表皮の感染を治療するために投与してよい。いくつかの実施形態において、ＨＰＶに基づくＶＬＰを含む組成物は、非黒色腫皮膚がんを治療するために使用することもできる。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、１つ以上の治療薬を含む本明細書に記載される改変されたＨＰＶ粒子は、腫瘍、例えば卵巣がん、乳がん、口腔扁平上皮癌、頭頚部がん、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、膀胱がんまたは前立腺がんの治療のために全身投与（例えばｉ．ｖ．）してよい。いくつかの実施形態において、がん細胞は、ＨＰＶ ＶＬＰについての受容体を提示し、本明細書に記載される改変されたＨＰＶ粒子は、これらのがん細胞を標的にするために用いることができる。いくつかの実施形態において、改変ＨＰＶ粒子は、がん細胞に特異的な標的化薬剤を提示するようにさらに変更してよい。
【０１５０】
本発明の態様は、その応用において、上記の説明に記載されるかまたは実施例もしくは図面に示される構成および構成要素の配置の詳細に限定されない。本発明の態様は、その他の実施形態が可能であり、種々の方式で実施または行うことができる。また、本明細書で用いられる語法および術語は、説明の目的のためであり、限定とみなされない。「含み（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含み（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「有し」、「含み（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含み（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」および本明細書におけるそれらの語尾変化したものの使用は、その後に列挙される要素およびその等価物とさらなる要素とを包含することを意味する。
【実施例】
【０１５１】
（実施例１）ＨＰＶ癌タンパク質ｓｈＲＮＡをパッケージングしたＨＰＶ−ＶＬＰによる子宮頚がん細胞増殖の阻害
この研究の主な目的は、ＨＰＶに基づくｓｈＲＮＡ発現系を構築し、効果的なＥ６およびＥ７遺伝子サイレンシングのためのＨＰＶ媒介ＲＮＡ干渉を探索することであった。我々は、ここで、子宮頚がん細胞中のＥ６およびＥ７ ｓｈＲＮＡを発現するＨＰＶ偽ビリオンが、Ｅ６およびＥ７発現の枯渇と、がん細胞増殖の抑制とをもたらし、ＨＰＶ ＶＬＰが、ｓｈＲＮＡをコードするプラスミドを子宮頚がんの治療のために送達するために価値があることを示唆することを示す。
【０１５２】
材料および方法
株化細胞、細胞培養および細胞トランスフェクション
ヒト子宮頚癌株化細胞ＣａＳｋｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５０）およびＣ３３−Ａ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３１；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を、３７℃で５％ＣＯ_２の湿潤環境において、１０％ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１％ピルビン酸ナトリウムを補ったＤＭＥＭ中で成長させた。ＣａＳｋｉ細胞にはＨＰＶ−１６が感染し、Ｅ６およびＥ７を発現したが、Ｃ３３−Ａ細胞はＨＰＶ陰性であった。マウス株化細胞ＴＣ１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２７８５）に、ＨＰＶ−１６ Ｅ６／Ｅ７癌タンパク質およびｃ−Ｈａｓ−Ｒａｓを同時形質転換した。これらの細胞を、１０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ、１ｍｍｏｌ／Ｌのピルビン酸ナトリウムを含み、２ｍｍｏｌ／Ｌの非必須アミノ酸および１０％ＦＣＳを補ったＲＰＭＩ１６４０で増殖させた。マウス２９３ＦＴ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、２９３Ｔ株化細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１１２６８）に由来した。これらは、ＳＶ４０大型Ｔ抗原を発現し、５００μｇ／ｍＬのジェネテシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下で培養した。
【０１５３】
トランスフェクションの１日前に、細胞をトリプシン処理し、６ウェルプレートに播種した。細胞に、次いで、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｓｈＲＮＡをコードするプラスミド、ＨＰＶ−３１偽ビリオンまたはｓｈＲＮＡをコードするレンチウイルスをトランスフェクトした。細胞は、結果に記載される種々の時間で分析のために採集した。
【０１５４】
Ｅ６およびＥ７特異的ｓｈＲＮＡを発現するプラスミドの設計および生成
ｐＥＮＴＲ／Ｕ６エントリークローンを生成するために、ＢＬＯＣＫ−ｉＴ Ｕ６エントリーベクターを用いた。我々は、まず、定方向クローニングのために必要な４ヌクレオチド突出をそれぞれ含有する相補的ＤＮＡオリゴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を設計して合成した。Ｅ６およびＥ７ ｓｉＲＮＡに対応するｓｈＲＮＡの相補配列は、図１Ｂに示す。Ｅ６−２およびＥ７−２配列は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの「ｓｈＲＮＡデザイナー」ソフトウェアを用いて選択した。Ｅ６−１およびＥ７−１配列は、ＪｉａｎｇおよびＭｉｌｎｅｒにより記載されたものであった（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００２年；２１巻：６０４１〜８頁）。我々は、ＬａｃＺならびにＪｉａｎｇおよびＭｉｌｎｅｒ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００２年；２１巻：６０４１〜８頁）により記載された対照ｓｈＲＮＡ配列を対照として用いた。全ての配列は、特異性についてＢＬＡＳＴにより確認した。
【０１５５】
アニーリング緩衝液中で９５℃で４分間インキュベーションすることにより、等量のフォワードおよびリバース鎖オリゴをアニールして、２本鎖オリゴを作製した。２本鎖オリゴを作製した後に、これらをｐＥＮＴＥＲ／Ｕ６ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲーションした。プラスミドを配列決定し、増殖させ、Ｑｉａｇｅｎプラスミドｍｉｄｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて精製した。エントリークローンを、一過性ＲＮＡ干渉分析のために用いた。
【０１５６】
Ｅ６およびＥ７ ｓｈＲＮＡを発現するＨＰＶ偽ビリオンＨＰＶ−３１の生成
ＶＬＰを、コドンを最適化したＨＰＶ−３１ Ｌ１およびＬ２遺伝子をコードする組換えバキュロウイルス（Ｆｌｅｕｒｙら、Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００８年；１５巻：１７２〜５頁）に感染したＳｆ２１細胞で発現させた。細胞を２７℃で７２時間インキュベートした（Ｔｏｕｚｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９９８年；２６巻：１３１７〜２３頁；Ｂｏｕｓａｒｇｈｉｎら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２００４年；４０巻：９２６〜３２頁）。細胞を遠心分離により採集し、０．５％ＮＰ４０を含有するＰＢＳに再懸濁し、室温で３０分間放置した。細胞可溶化液を、次いで、１４，０００×ｇで１５分間、４℃で遠心分離した。核画分をＰＢＳにさらに再懸濁し、超音波処理した。画分を、次いで、予め形成した塩化セシウム勾配の先端に充填し、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ２８ローター（２４時間、２７，０００ｒｐｍ、４℃）において平衡で遠心分離した。Ｌ１陽性画分をＰＢＳ中にプールし、遠心分離した（ＳＷ２８ローター、３時間、２８，０００ｒｐｍ、４℃）。ＶＬＰを、０．１５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌに再懸濁した。
【０１５７】
偽ビリオンを、いくらかの改変を加えて以前に記載されたようにして作製した（Ｔｏｕｚｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９９８年；２６巻：１３１７〜２３頁）。簡単に述べると、１μｇのＨＰＶ−３１ ＶＬＰを、２０ｍｍｏｌ／ＬのＤＴＴおよび１ｍｍｏｌ／ＬのＥＧＴＡを含有する５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中で３０分間、室温でインキュベートした。この段階で、ｓｈＲＮＡ、ルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質をコードする発現プラスミド（１００ｎｇ）を、破壊したＶＬＰに加えた。調製物を、次いで、５ｍｍｏｌ／Ｌの最終濃度までの漸増濃度のＣａＣｌ_２で、ＺｎＣｌ_２とともに（１０ｎｍｏｌ／Ｌ）またはＺｎＣｌ_２なしで希釈した。ＶＬＰへのＨＰＶカプソマー（ｃａｐｓｏｍｅｒｓ）の集合をＺｎＣｌ_２が増進すると報告されているので、ＺｎＣｌ_２を用いた（Ｈａｎｓｌｉｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ ２００６年；２２巻：５５４〜６０頁）。偽ビリオンを、次いで、１×ＰＢＳに対して１晩透析し、使用前に４℃で貯蔵した。
【０１５８】
カプソマー、ＶＬＰおよび偽ビリオンの存在は、電子顕微鏡により分析した。この目的のために、試料を炭素被覆グリッド上に塗布し、１．５％酢酸ウラニルでネガティブ染色し、５０，０００倍の公称倍率で、ＪＥＯＬ１０１０電子顕微鏡を用いて観察した。
【０１５９】
Ｅ６およびＥ７ ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスの生成
レンチウイルスの生成は、ＢＬＯＣＫ−ｉＴレンチウイルスＲＮＡ干渉発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。簡単に述べると、Ｅ７ ｓｈＲＮＡをコードするｐＥＮＴＲ／Ｕ６プラスミドとｐｌｅｎｔｉ６／ＢＬＯＣＫ−ｉＴＤＥＳＴとの間のＬＲ組換え反応を行って、ｐｌｅｎｔｉ６／ＢＬＯＣＫ−ｉＴ−ＤＥＳＴ発現構築物を作製した。レンチウイルスは、２９３ＦＴ細胞に９μｇのＶｉｒａＰｏｗｅｒパッケージングミックスと３μｇのｐｌｅｎｔｉ６／ＢＬＯＣＫ−ｉＴ−ＤＥＳＴ発現プラスミドＤＮＡとを、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクトすることにより生成した。細胞培養物上清を、トランスフェクションの４８時間後に回収した。レンチウイルスを発現するＥ７ ｓｈＲＮＡの力価は、ＴＣ１細胞にレンチウイルスの系列希釈物を感染させることにより決定した。レンチウイルスストック力価は、１×１０^６ＴＵ／ｍＬであった。安定的に形質導入されたＴＣ１細胞を、細胞をブラストサイジン選択（１０μｇ／ｍＬ）に付すことにより選択した。
【０１６０】
逆転写ＰＣＲによるＥ６およびＥ７ｍＲＮＡレベルの分析
ｓｈＲＮＡ偽ビリオンをトランスフェクトしたＣａＳｋｉ細胞（１０^６）を１×ＰＢＳで洗浄し、ｍＲＮＡを、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ｍＲＮＡ検出キット（Ｄｙｎａｌ Ｆｒａｎｃｅ ＳＡ）を製造者の使用説明に従って用いて単離した。１本鎖ｃＤＮＡを、ｍＲＮＡから、２５０μｍｏｌ／Ｌの各デオキシヌクレオチド三リン酸、５μｍｏｌ／Ｌオリゴ（ｄＴ）２０、２５単位のＲＮアーゼ阻害剤および２０単位のトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含有する１×インキュベーション緩衝液中で４２℃で１時間の逆転写により合成した。ｃＤＮＡ試料を、ＨＰＶ−１６ Ｅ６、Ｅ７またはグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）に特異的なフォワードおよびリバースプライマーを用いるＰＣＲ増幅に供した。用いたプライマー配列は、Ｅ６フォワード、５’ＣＡＣＣＡＡＡＡＧＡＧＡＡＣＴＧＣＡＡＴＧＴ３’（配列番号３１）；およびリバース、ＴＴＧＣＴＧＴＴＣＴＡＡＴＧＴＴＧＴＴＣＣＡ（配列番号３２）；Ｅ７フォワード、５’ＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣＡＴＴＧＣＡＴＧＡ３’（配列番号３３）；およびリバース、ＧＧＧＧＣＡＣＡＣＡＡＴＴＣＣＴＡＧＴＧ（配列番号３４）；グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素フォワード、５’ＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣＴＧＣＣ３’（配列番号３５）；およびリバース、５’ＧＣＣＴＧＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴＧ３’（配列番号３６）であった。ＰＣＲは、２００μｍｏｌ／Ｌのデオキシヌクレオチド三リン酸、２μｍｏｌ／Ｌの各特異的プライマーおよび１単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、Ｅ７、Ｅ６およびＧＡＰＤＨについてそれぞれ５０℃、５５℃または６２℃で２５サイクルにプログラム設定したＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーモサイクラー（Ｐｅｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｒａｎｃｅ）中で行った。ＰＣＲ生成物は、２％アガロースゲル上で視覚化し、ＧｅｌＤｏｃシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて分析した。
ｐ５３の検出
細胞（２×１０^５）をＰＢＳ１×で洗浄し、５０μＬのＳＤＳゲルローディング緩衝液に直接溶解し、９５℃で１０分間インキュベートした。１５マイクロリットルの各試料を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。分離されたタンパク質を、抗体検出のためにニトロセルロースメンブレン上にエレクトロブロットした。ヒトｐ５３タンパク質は、モノクローナル抗体ＤＯ−１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて検出し、内因性β−アクチンは、ポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて検出した。結合した抗体を、アルカリホスファターゼコンジュゲート抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）を、基質としてのニトロブルーテトラゾリウムおよびブロモクロロインドリルリン酸塩（Ｓｉｇｍａ）とともに用いて視覚化した。
β−ガラクトシダーゼおよびルシフェラーゼ活性の検出
β−ガラクトシダーゼプラスミドおよびＬａｃＺ ｓｈＲＮＡをトランスフェクトしたＣａＳｋｉ、Ｃ３３−ＡおよびＴＣ１細胞におけるβ−ガラクトシダーゼの検出は、ＰＢＳ１×で洗浄し、２％ホルムアルデヒドおよび０．２％グルタルアルデヒドを含有するＰＢＳで固定した細胞において行った。室温で１０分後に、細胞を洗浄し、β−ガラクトシダーゼ顕色溶液（２ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ_２、４ｍｍｏｌ／Ｌフェロシアン化カリウム、４ｍｍｏｌ／Ｌフェリシアン化カリウムおよび１ｍｇ／ｍＬ Ｘ−ｇａｌ）とインキュベートした。β−ガラクトシダーゼ活性を示す青色の細胞を計数した。ルシフェラーゼ遺伝子発現の検出は、発光アッセイにより測定した（ホタルルシフェラーゼアッセイキット；Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）。発光を、１０秒間積分し（Ｖｉｃｔｏｒ２、Ｗａｌｌａｃ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、結果を、ウェルあたりの計数毎秒（ｃｐｓ）として表した。
【０１６１】
細胞生存性アッセイ
トランスフェクトしたかまたはしていない細胞をトリプシン処理し、次いで、９６ウェルプレートに播種した。３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（０．５ｍｇ／ｍＬ）を、ＦＣＳを含まない１００μＬのＤＭＥＭ中に播種した細胞に加え、３７℃でインキュベートした。２時間後に、１００μＬのイソプロパノールおよび０．４ｍｍｏｌ／ＬのＨＣｌを加え、吸光度を５４０ｎｍで測定した。細胞生存性を、試験ウェルで得られた吸光度と未処理細胞で得られた吸光度との間の比率として決定した。
【０１６２】
アポトーシスアッセイ
アポトーシスは、抗ｓｓＤＮＡ／ＡＰＯＳＴＡＩＮ（Ａｂｃｙｓ）を用いて検出した。簡単に述べると、６ウェルプレートで増殖したＴＣ１細胞（２×１０^５）に、１μｇのＥ６−１、Ｅ６−２、Ｅ７−１、Ｅ７−２ ｓｈＲＮＡ、および対照ｓｈＲＮＡを含有する１０μｇの偽ビリオンを形質導入した。感染の２日後に、上清を採集し、細胞を氷冷却エタノールで固定した。遠心分離後に、５×１０^５の固定細胞を、２５０μＬのホルムアミドに室温で５分間再懸濁し、次いで、７５℃で１０分間インキュベートした。この工程の後に、１％脱脂粉乳を含有する２ｍＬのＰＢＳを加えた。１５分後に、細胞を遠心分離し、ペレットを、抗ｓｓＤＮＡモノクローナル抗体Ｆ７−２６を含有する１００μＬのＰＢＳに再懸濁した。１５分間のインキュベーションおよび遠心分離の後に、細胞ペレットを、蛍光コンジュゲート抗マウスＩｇＭ（ＰＢＳおよび１％脱脂粉乳中に２０μｇ／ｍＬ）を含有する１００μＬのＰＢＳに再懸濁した。１５分間のインキュベーションの後に、細胞をすすぎ、遠心分離し、１μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウムを含有する５００μＬのＰＢＳに再懸濁した。陰性対照は、特異的１次抗体の代わりにマウスＩｇＭで処理した。細胞を、次いで、Ｃｏｕｌｔｅｒ ＸＬフローサイトメータおよびＥｘｐｏ３２ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて分析した。
【０１６３】
アポトーシスは、カスパーゼ−Ｇｌｏ３／７アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いても調査した。細胞に、上記のように異なるｓｈＲＮＡを形質導入した。形質導入の２日後に、２×１０^５細胞を、白色壁９６ウェルプレート（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）の各ウェルに移し、１００μＬのカスパーゼ発光産生基質を加えた。室温で１時間のインキュベーションの後に、プレートを、Ｌｕｍｉｎｏｓｃａｎ Ａｓｃｅｎｔルミノメータ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）上で発光を読み取った。
【０１６４】
マウスモデルにおける抗腫瘍効果の評価
ＴＣ１細胞の腫瘍形成能に対するＥ６およびＥ７ ｓｈＲＮＡ偽ビリオンの効果を調査するために、６群（５匹のマウス／群）の６週齢メスＣ５７ＢＬ６マウス（ＣＥＲＪ、Ｌｅ Ｇｅｎｅｓｔ Ｓｔ Ｉｓｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）に、ＴＣ１細胞（２×１０^５）を皮下接種した。マウスへの投与の前に、ＴＣ１細胞に、偽ビリオン（１０μｇのＶＬＰ／１μｇのＥ６−１またはＥ７−１ ｓｈＲＮＡ）、Ｅ７−１ ｓｈＲＮＡをコードするレンチウイルス（感染多重度５０）または１μｇのＥ７−１ ｓｈＲＮＡを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いてトランスフェクトした。対照群は、未処理のＴＣ１細胞を受け（モック）、１つの対照群は、ＨＰＶ ＶＬＰで処理したＴＣ１細胞を受けた。３週間後に、マウスを犠牲にし、腫瘍を切開して秤量した。
【０１６５】
Ｅ７ ｓｈＲＮＡをコードする偽ビリオンの抗腫瘍効力も、ＴＣ１細胞腫瘍を有するマウスにおいて調査した。２群（１０匹のマウス／群）の６週齢メスＣ５７ＢＬ６マウスに、ＴＣ１細胞（２×１０^５）をｓ．ｃ．接種した。接種の７日後に、触知可能な腫瘍が全てのマウスにおいて形成され、ｓｈＲＮＡを含有する偽ビリオンを、２０μｇ ＶＬＰ／２μｇ Ｅ７−１または２０μｇ ＶＬＰ／２μｇ対照ｓｈＲＮＡの用量で２日毎に２週間、各腫瘍に直接注射した。３週間後に、マウスを犠牲にし、腫瘍を抽出して秤量した。全ての動物研究は、地域の動物倫理委員会（ＣＲＥＥＡ）により承認された。
【０１６６】
統計分析
データは、平均Ｆ ＳＥとして表した。統計分析は、スチューデントのｔ検定を用いて行い、Ｐ＜０．０５を有意であるとみなした。
【０１６７】
結果
ＨＰＶ−１６のＥ６およびＥ７タンパク質を指向するｓｈＲＮＡの設計
６つの配列を設計して、特異的サイレンシングを促進した。これらの配列のうちの２つ、すなわちｓｉＥ６−１（１３８〜１５９）およびｓｉＥ７−１（１０１〜１１９）は、ＪｉａｎｇおよびＭｉｌｎｅｒ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００２年；２１巻：６０４１〜８頁）によりｓｉＲＮＡとして既に記載され、それぞれＥ６およびＥ７に対応する他の２つの配列ｓｉＥ６−２（４２１〜４４１）およびｓｉＥ７−２（１４８〜１６７）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｓｈＲＮＡデザイナーソフトウェアを用いて選択し、２つの配列（ＬａｃＺ ｓｈＲＮＡおよびＪｉａｎｇの対照ｓｈＲＮＡ）は、対照として用いた（図１および表３）。これらの配列をアニールして、ｐＥＮＴＲ／Ｕ６に挿入した。
【０１６８】
ｓｈＲＮＡの送達のための偽ビリオン系の効率を調査するために、ＴＣ１、ＣａＳｋｉおよびＣ３３−Ａ細胞に、ＬａｃＺ ｓｈＲＮＡをコードするｐＥＮＴＲ／Ｕ６ ＬａｃＺとともにまたはそれなしで、ｈガラクトシダーゼをコードするプラスミドをトランスフェクトした。ＬａｃＺ ｓｈＲＮＡの存在下では、ｈ−ガラクトシダーゼ発現の減少が、調査した全ての株化細胞において観察され、ＴＣ１、ＣａＳｋｉおよびＣ３３−Ａ細胞においてそれぞれ８０％、８３％および８１％の阻害であった。
ＺｎＣｌ_２の存在下でＬ１カプソマーをＶＬＰに集合させることによる、ｓｈＲＮＡをコードする偽ビリオンの生成
ＨＰＶ ＶＬＰを用いて、Ｅ６およびＥ７ ｓｈＲＮＡをコードするプラスミドをカプシドに包んだ。これらの偽ビリオンを作製するために、我々は、再集合プロセス中にＺｎＣｌ_２を加える改変を加えて、以前に記載された解体−再集合法を用いた。簡単に述べると、精製ＶＬＰを、ＥＧＴＡおよびＤＴＴを含有する緩衝液中でインキュベートし、これらの条件において、ＶＬＰは、カプソマーに類似する構造に完全に脱凝集された。Ｅ７−１ ｓｈＲＮＡプラスミドを、次いで加え、調製物を、ＺｎＣｌ_２（１０ｎｍｏｌ／Ｌ）を含むかまたは含まずに１％ＤＭＳＯおよび５ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ_２を含有する緩衝液で希釈して、ＶＬＰを再び折り畳んだ。ＺｎＣｌ_２の存在は、偽ビリオンに類似する構造へのカプソマーの再集合を増加させた。ＺｎＣｌ_２の存在下では、カプソマーは、２４ｎｍの直径で、１２０〜２８０ｎｍで長さが変動する管状構造にも集合した。ルシフェラーゼをコードするプラスミドを含有する偽ビリオンの生成におけるＺｎＣｌ_２の役割を、ＺｎＣｌ_２を用いてまたは用いずに得られた偽ビリオン調製物が２９３ＦＴ細胞に形質導入される能力を比較することにより評価した。９，９８１ｃｐｓのルシフェラーゼ活性が、ＺｎＣｌ_２の存在下で作製された偽ビリオンを用いて得られ、ＺｎＣｌ_２を用いずに得られた偽ビリオンを用いては、これは８４５ｃｐｓだけであった。つまり、Ｌ１カプソマーをＺｎＣｌ_２の存在下でＶＬＰに集合させた場合に、１２倍のルシフェラーゼ活性の増加が観察された（図２）。さらに、このようなＨＰＶ偽ビリオンがＣａＳｋｉ、Ｃ３３−ＡおよびＴＣ１細胞に形質導入される能力を調査した。このような偽ビリオンは、調査した全ての株化細胞に形質導入された（図２）。しかし、ルシフェラーゼ活性のより高いレベルが、ＣａＳｋｉ細胞（５，２３２ｃｐｓ、計数毎秒）またはＣ３３細胞（４，０１６ ｃｐｓ）よりも、ＴＣ１細胞（７，９９０ｃｐｓ）において観察された。偽ビリオンの非存在下では、５７、８４、５１および４１ｃｐｓのルシフェラーゼ活性が、それぞれ２９３ＦＴ、ＴＣ１、ＣａＳｋｉおよびＣ３３細胞において観察された。
【０１６９】
Ｅ６およびＥ７ｓｈＲＮＡ偽ビリオンによるＣａＳｋｉ細胞の形質導入は、遺伝子サイレンシングの増加と細胞増殖の阻害とを誘導した
細胞における偽ビリオンの遺伝子移入の効率を、緑色蛍光タンパク質をコードするプラスミドを含有する偽ビリオンを用いて調査した。８０パーセントのＴＣ１細胞が、フローサイトメトリーにより検出されるように、緑色蛍光タンパク質を発現した（データは示さず）。我々は、Ｅ６およびＥ７ ｓｈＲＮＡの効力を、タンパク質発現に干渉するそれらの能力をアッセイすることにより評価した。この目的のために、我々は、まず、Ｅ６およびＥ７（ならびに対照としてのＧＡＰＤＨ）についての全長ｃＤＮＡを逆転写ＰＣＲにより得た。結果は、Ｅ７ ｍＲＮＡが、Ｅ７を指向するｓｈＲＮＡの存在下で減少し、Ｊｉａｎｇ配列を用いて高いレベルの干渉が得られたが、Ｅ７−２配列を用いてより少ない減少が観察され、対照ｓｈＲＮＡを用いて減少が観察されなかったことを示した（図３Ａ）。同様の結果が、Ｅ６ ｓｈＲＮＡで処理した細胞においてＥ６ ｍＲＮＡの検出について得られた。細胞をＥ７ ｓｈＲＮＡで処理した場合に、Ｅ６ ｍＲＮＡのわずかな減少が観察された。
【０１７０】
Ｇｕら（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００６年；１３巻：１０２３〜２７頁）およびＹａｍａｔｏら（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００８年；１５巻：１４０〜５３頁）により報告されるように、Ｅ６は、ＣａＳｋｉ細胞において、入手可能な抗体を用いるウェスタンブロッティング分析により検出するには低すぎるレベルで発現されるので、Ｅ６ ｓｈＲＮＡ活性を、ｐ５３発現を回復するその能力に基づいてスクリーニングした。我々の結果は、ウェスタンブロッティングにより検出されるｐ５３レベルが、Ｅ６−１ ｓｈＲＮＡの発現後に２４時間にわたって増加し（図３Ｂ）、時間とともに減少したことを示した。Ｅ７−１、Ｅ７−２およびＥ６−２ ｓｈＲＮＡの存在下では、ｐ５３発現の増加は、Ｅ６−１ ｓｈＲＮＡを用いて観察されたものよりも低かった。細胞をＬａｃＺ ｓｈＲＮＡで処理した場合に、ｐ５３発現は検出されなかった。これらの結果は、Ｅ６タンパク質のレベルがｓｈＲＮＡ処理により低減され、ｐ５３は、蓄積されただけでなく、機能的に活性でもあったことを示唆する。
【０１７１】
Ｅ６およびＥ７発現の阻害が、細胞生存性の低減を誘導できるどうかかを確認するために、５日間の培養後に、５４０ｎｍでの吸光度を測定する３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド試験を、ｓｈＲＮＡをトランスフェクトしたかまたはトランスフェクトしていないＣａＳｋｉおよびＴＣ１細胞において行った。我々の知見は、Ｅ６およびＥ７サイレンシングが、細胞生存性の減少を誘導したことを示した（図４）。この低減は、Ｅ７ ｓｈＲＮＡを用いると、より大きかった（７０％細胞増殖阻害）。Ｃ３３−ＡなどのＨＰＶ陰性子宮頚部細胞に同じｓｈＲＮＡをトランスフェクトした場合に、細胞増殖の阻害は観察されず、このことは、Ｅ６およびＥ７ ｓｈＲＮＡ細胞による細胞増殖阻害が特異的であることを示した。細胞増殖の低減は、Ｅ６−１とＥ６−２、Ｅ７−１とＥ７−２ ｓｈＲＮＡについて同様であった。
【０１７２】
Ｅ６およびＥ７ ｓｈＲＮＡ偽ビリオンによるＴＣ１細胞の形質導入は、アポトーシスを誘導しなかった
アポトーシス細胞におけるＤＮＡの熱変性に対する感受性が増加することに基づくアポトーシスアッセイを行って、細胞死がアポトーシスによるものであるかどうかを調査した。このアッセイにおいて、ＤＮＡを、ホルムアミドの存在下で加熱することにより変性させ、ｓｓＤＮＡに特異的なモノクローナル抗体Ｆ７−２６を用いて染色した。フローサイトメトリーにより、Ｅ６−１、Ｅ６−２、Ｅ７−１およびＥ７−２ ｓｈＲＮＡをトランスフェクトしたＴＣ１細胞を用いて、対照ｓｈＲＮＡをトランスフェクトした細胞と比較して著しく増加した数のアポトーシス細胞は明らかにならなかった。アポトーシスの存在または非存在をさらに評価するために、カスパーゼ３および７の酵素活性を測定するカスパーゼアッセイも、Ｅ６およびＥ７ ｓｈＲＮＡ偽ビリオンを形質導入したＴＣ１細胞に対して行った。Ｅ６およびＥ７ ｓｈＲＮＡをともに用いて、カスパーゼ活性の増加は観察されなかった。結果は、Ｅ６およびＥ７ ｓｈＲＮＡが、ＴＣ１細胞増殖の低減を誘導するが、アポトーシス性細胞死の誘導によってではないことを示唆した。
Ｅ６およびＥ７ ｓｈＲＮＡ偽ビリオンによるＩｎ ｖｉｔｒｏでのＴＣ１細胞のトランスフェクションは、マウスにおける腫瘍成長の低減を誘導した
Ｅ６およびＥ７ ｓｈＲＮＡ偽ビリオンの効力は、ｉｎ ｖｉｖｏで、ＴＣ１／マウスモデルを用いても調査した。Ｅ６−１およびＥ７−１ ｓｈＲＮＡをコードするＨＰＶ偽ビリオン、ＨＰＶ ＶＬＰ単独およびＥ７−１ ｓｈＲＮＡをコードするレンチウイルスを用いて、ＴＣ１細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで形質導入した。２４時間後に、トランスフェクトしていないＴＣ１細胞およびトランスフェクトしたＴＣ１細胞を、Ｃ５７ＢＬ６マウスにｓ．ｃ．注射した。
【０１７３】
マウスを２１日後に犠牲にし、腫瘍を切開して秤量した。対照マウスにおいて（モックおよびＶＬＰ単独）、腫瘍は、１．０９〜２．１２ｇの範囲の重量であった（平均、１．６４ｇ）。Ｅ７−１ ｓｈＲＮＡおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いてトランスフェクトしたＴＣ１細胞を用いて、腫瘍重量の低減は観察されなかった（平均、１．６１ｇ）。腫瘍の平均重量の４２％の低減が、Ｅ６−１ ＨＰＶ偽ビリオンを用いて観察され（Ｐ＜０．１０）、平均サイズの７０％〜８７％の低減が、それぞれＥ７−１レンチウイルスおよびＥ７−１ ＨＰＶ偽ビリオンを用いて観察された（Ｐ＜０．０５およびＰ＜０．００１；図５）。
【０１７４】
Ｅ７ ｓｈＲＮＡ偽ビリオンによるＴＣ１細胞腫瘍の腫瘍内形質導入は、マウスにおける腫瘍成長の低減を誘導した
Ｅ７ ｓｈＲＮＡをコードする偽ビリオンのｉｎ ｖｉｖｏ効力も、ＴＣ１細胞腫瘍を有するマウスにおける腫瘍成長を低減するそれらの能力について調査した。Ｅ７−１ ｓｈＲＮＡは、これらの研究のために、そのｉｎ ｖｉｔｒｏ効力に基づいて選択した。Ｅ７−１ ｓｈＲＮＡ偽ビリオンを、２日毎に２週間にわたって腫瘍に直接注射した。１週間後に、腫瘍成長の低減は、対照マウスと比較して、Ｅ７−１ ｓｈＲＮＡで処置したマウスにおいて観察されなかった（図６Ａ）。腫瘍成長の減少は、次いで、処置の第２週目の間に明確に観察され、第２週目の最後に、対照ｓｈＲＮＡで処置したマウスにおいて１．０５ｇの平均腫瘍重量、およびＥ７−１ ｓｈＲＮＡ偽ビリオンで処置したマウスにおいて０．４９ｇであった（Ｐ＝０．０４５）。
【０１７５】
（実施例２）ＨＰＶ３１メジャーカプシドタンパク質上の中和立体構造エピトープの同定および機能的意味
【０１７６】
この研究の主な目的は、ＨＰＶ３１偽ビリオンの抗原構造と中和の機構との特徴決定をすることであった。疑問の１つは、ＨＰＶ中和抗体を誘導し、ウイルスカプシドとの相互作用による感染に対する保護に寄与するエピトープの正確な位置決定である。
【０１７７】
立体構造エピトープが、中和抗体生成を担うことが現在ではよく確立されている（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９４年；２０５巻：３２９〜３５頁；Ｒｏｓｅら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ １９９４年；７５巻：２０７５〜７９頁；Ｗｈｉｔｅら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９８年；７２巻：９５９〜６４頁；ＷｈｉｔｅらＪ Ｖｉｒｏｌ １９９９年；７３巻：４８８２〜８９頁；ＧｉｒｏｇｌｏｕらＪ Ｖｉｒｏｌ ２００１年；７５巻：１５６５〜７０頁）。ＨＰＶの中和エピトープは立体構造依存性であるので、それらのアミノ酸組成および表面局在化は、完全には特徴決定されていない。
【０１７８】
これらの研究は、ワクチン設計およびウイルス−細胞相互作用の調査において有用である。さらに、ＨＰＶの抗原構造を理解することは、免疫原性が低減されたＨＰＶ由来遺伝子療法ベクターを設計するために重要である。このようなベクターを作製するためのある必要条件は、中和免疫応答を誘発するウイルス決定因子をよりよく理解し、中和抗体の生成を担う立体構造エピトープ内の欠失または変異を有する偽ビリオンベクターを設計することである。免疫原性が低減されたこれらの変異ベクターは、ベクターに対する中和抗体を誘導することによる導入遺伝子の効力の劇的な喪失なしで、これらのベクターの再投与を可能にする。
【０１７９】
材料および方法
ＨＰＶ３１モノクローナル抗体
この研究において用いたＨＰＶ３１ ＭＡｂは、以前に生成および特徴決定された（Ｆｌｅｕｒｙら、Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ ２００６年；１５１巻：１５１１〜２３頁；Ｆｌｅｕｒｙら、Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００８年；１５巻：１７２〜７５頁）。Ｈ３１．Ｄ２４ ＭＡｂは、ＦＧループ内で同定された共有直鎖状エピトープ（アミノ酸２７１〜２７９）を認識し、Ｈ３１．Ｆ７ ＭＡｂは、ＦＧループのＮ末端部分で同定された立体構造交差中和エピトープを認識する（Ｆｌｅｕｒｙら、Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ ２００６年；１５１巻：１５１１〜２３頁）。その他の１３のＭＡｂは、特異的立体構造中和エピトープを認識する。さらに、ＤＥループ上の共通直鎖状エピトープを認識するＣａｍＶｉｒ−１モノクローナル抗体（ＣＶ）（Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒら、Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ ２００５年；７７巻：５５８〜６５頁）を対照として用いた。細菌細胞表面ディスプレイ法を用いて調査したＭＡｂを、粗腹水から、硫酸アンモニウム（最終３３％）を用いる塩析により精製し、次いで、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）に対して透析した後に、プロテインＡＧ／Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ ＩｇＧ精製キット）でのアフィニティクロマトグラフィーを行った。
【０１８０】
偽ウイルス中和
各モノクローナル抗体の中和能力は、以前に決定された（Ｆｌｅｕｒｙら、Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ ２００６年；１５１巻：１５１１〜２３頁；Ｆｌｅｕｒｙら、Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００８年；１５巻：１７２〜５頁）。さらに、我々は、中和が、偽ビリオンの細胞表面結合の前または後のいずれに生じるのかを探索した。試験は、２９３ＦＴ細胞で生成したＨＰＶ３１偽ビリオンを用いて行い、中和アッセイは、９６ウェルプレートに播種し、３７℃で２４時間インキュベートした、完全ダルベッコ改変イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０％ＦＣＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補ったＤＭＥＭ）中で培養したＣｏｓ−７細胞を用いて行った。偽ビリオンの細胞表面結合前の中和を測定するアッセイは、ＭＡｂと予めプレインキュベートしたＨＰＶ３１偽ビリオンを細胞（１００μＬ）に３７℃で１時間加えることにより行った。偽ビリオンの細胞表面結合後の中和を測定するアッセイは、ＨＰＶ３１偽ビリオンをＣｏｓ−７細胞に３７℃で１時間加えることにより行った。３回洗浄して未結合の偽ビリオンを除去した後に、ＭＡｂを１００μＬのＤＭＥＭに加えた。各アッセイについて、上清を３７℃で３時間後に除去し、２００μＬ完全ＤＭＥＭを加えた。３７℃でさらに４８時間のインキュベーションの後に、トランスフェクトした細胞により発現されるルシフェラーゼを、ホタルルシフェラーゼアッセイキット（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、Ｍｏｎｔｌｕｃｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて測定することにより感染性を記録し、ルシフェラーゼ発現を、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎマイクロプレートルミノメータ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて定量した。ルシフェラーゼ活性が８０％を超えて低減された場合に、ＭＡｂは中和性であるとみなした。ＭＡｂが、偽ビリオンが細胞に結合する前に加えられた場合にのみ偽感染を中和した場合に、細胞への偽ウイルスの結合の阻害を記録した。抗体が、Ｃｏｓ−７細胞への偽ビリオンの添加の前および後に偽ビリオンを中和したならば、ＭＡｂは、細胞結合後機構により偽ビリオンを中和するとみなした。
【０１８１】
組換えＬ１タンパク質の作製およびＶＬＰの精製
Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｆｉｓｈｅｒ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）を、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｌａ（Ｓｆ２１）細胞におけるＨＰＶ Ｌ１タンパク質の発現のために用いた。ＨＰＶ１６、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ１６ ＤＣ９およびＨＰＶ１６ ＤＣ３１（それぞれ９または３１アミノ酸のＣ末端欠失）のＬ１遺伝子をコードするバキュロウイルスは、以前に作製された（Ｔｏｕｚｅら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ ２０００年；１８９巻：１２１〜７頁；Ｔｏｕｚｅら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １９９８年；３６巻：２０４６〜５１頁）。ＨＰＶ３１ ＤＣ９およびＨＰＶ３１ ＤＣ３１切断遺伝子を、ＰＣＲにより、全長ＨＰＶ３１ Ｌ１コドン最適化遺伝子６５から、フォワード（ＧＧＡＴＣＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＣＴＧＴＧＧＡＧＡＣＣＣＡＧＣ、配列番号３７）と、それぞれＤＣ９（ＧＧＡＡＧＣＴＴＡＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＧＣＴＧＧＧＧＧＣ、配列番号３８）およびＤＣ３１についてのリバースプライマー（ＧＣＡＡＧＣＴＴＡＧＧＣＣＴＧＣＡＧＣＡＧＧＡＡＣＴＴＴＣＴＧＣＣＣ、配列番号３９）とを用いて増幅した。ＰＣＲ生成物を、ｐＣＲ ＴＯＰＯ２．１にＴＡクローニングによりクローニングした。陽性クローンを配列決定して、不要な変異が存在しないことを確認した。ＨＰＶ Ｌ１遺伝子を、次いで、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで予め消化したｐＦａｓｔＢａｃ１プラスミドにクローニングした。異なるＬ１欠失遺伝子をコードする組換えバキュロウイルスは、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造者の推奨に従って用いて作製した。１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補ったグレース昆虫培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｅｒｇｙ Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）で維持したＳｆ２１細胞に、それぞれの組換えバキュロウイルスを感染させ、２７℃でインキュベートした。感染の３日後に、細胞を採集し、ＶＬＰを以前に記載されたようにして精製した２９、４０。簡単に述べると、細胞を、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０（０．５％）、ペプスタチンＡおよびロイペプチン（各１μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）を含有するＰＢＳに再懸濁し、４℃で３０分間放置した。核可溶化液を、次いで遠心分離し、ペレットを、ペプスタチンＡおよびロイペプチンを含有する氷冷却ＰＢＳに再懸濁し、次いで超音波処理した。試料を、次いで、ＣｓＣｌ勾配に充填し、平衡まで遠心分離した（ＳＷ２８ローターで２２時間、２７，０００ｒｐｍ、４℃）。ＣｓＣｌ勾配画分を、屈折率測定により密度について、そして１０％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）での電気泳動およびクーマシーブルー染色によりＬ１タンパク質の存在について調査した。陽性の画分をプールし、ＰＢＳで希釈し、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ２８ローターでペレットにした（３時間、２８，０００ｒｐｍ、４℃）。遠心分離の後に、ＶＬＰを０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌに再懸濁し、最大性能の６０％での１回の５秒間のバーストにより超音波処理した。全タンパク質含量を、ＭｉｃｒｏＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｏｚｙｍｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて決定した。
【０１８２】
ＨＰＶ３１ Ｌ１ ＨＢｃ２６３／２６４変異体ＶＬＰを、２９３ＦＴ細胞において生成した。キメラＬ１タンパク質をコードするＤＮＡを、２工程ＰＣＲプロトコールを用いるコドン最適化ＨＰＶ３１ Ｌ１遺伝子の突然変異誘発により得た。オーバーラップＰＣＲを行って、ＨＢｃタンパク質のＤＰＡＳＲＥ配列を、ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質の２６３／２６４位に得た。１回目の工程において、１つの断片を、最適化ＨＰＶ３１ Ｌ１ ＤＮＡ配列を鋳型として、そして５’Ｌ１−ＮｈｅＩ（ＣＣＧＣＴＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＣＴＧＴＧＧＡＧＡＣＣＣ、配列番号４０）および３’Ｌ１−ＤＰＡＳＲＥ（ＣＴＣＴＣＴＧＣＴＧＧＣＧＧＧＧＴＣＧＴＴＧＡＡＧＡＡＧＴＧＣＣＧＣＡＣＧＡＡ、配列番号４１）をプライマーとして用いて作製した。別の断片を、最適化ＨＰＶ３１ Ｌ１ ＤＮＡ配列を鋳型として、そして３’Ｌ１−ＥｃｏＲＩ（ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＡＴＣＡＣＴＴＣＴＴＧＧＴＴＴＴＣＴＴＣＣ、配列番号４２）および５’Ｌ１−ＤＰＡＳＲＥ（ＧＡＣＣＣＣＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＴＧＧＧＣＧＡＧ、配列番号４３）をプライマーとして用いて増幅した。これらの２つのオーバーラップ断片を、５’Ｌ１−ＮｈｅＩおよび３’Ｌ１−ＥｃｏＲＩプライマーを用いる２回目のＰＣＲ工程においてＤＮＡ鋳型として用いた。得られたＤＮＡ配列は、ＨＢｃ７８−８３コード配列をＬ１塩基２６３／２６４の間に、そしてＮｈｅＩ制限部位を５’、かつＥｃｏＲＩ制限部位を３’に有した。タンパク質発現のために、ＨＰＶ３１ Ｌ１ ＨＢｃ２６３／２６４遺伝子をｐＩＲＥＳ哺乳類発現ベクター（ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローニングした。このＤＮＡプラスミド（ＨＰＶ３１ Ｌ１ ＨＢｃ２６３／２６４−ｐＩＲＥＳ）を、伝統的なアルカリ溶解およびフェノール／クロロホルム抽出により調製し、２９３ＦＴ細胞に、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、Ｍｅｙｌａｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を製造者の使用説明に従って用いてトランスフェクトするために用いた。細胞に、合計で０．５μｇのＤＮＡおよび１μＬのＦｕｇｅｎｅ６を、培養面積１ｃｍ^２あたりにトランスフェクトした。２９３ＦＴ細胞をトランスフェクションの４４時間後に採集し、ＶＬＰを前に言及したようにして精製した。
【０１８３】
ＶＬＰにおいて発現される異なるＨＰＶ−Ｌ１タンパク質の自己集合を、電子顕微鏡観察により調査した。この目的のために、ＶＬＰ調製物を、炭素被覆グリッドに塗布し、１．５％酢酸ウラニルでネガティブ染色し、５０，０００倍の公称倍率で、ＪＥＯＬ１０１０電子顕微鏡を用いて観察した。全ての電子顕微鏡写真は、３０，０００倍または５０，０００倍で撮影した。
【０１８４】
表面プラズモン共鳴によるＨＰＶ３１ ＭＡｂのＶＬＰ結合競合の調査
分析は、ＣＭ３（カルボキシメチル化デキストラン）センサチップを備えたＢｉａｃｏｒｅ１０００（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて行った。ＣＭ３センサチップを、３５μＬの０．０５ｍｏｌ／Ｌ １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩および０．２ｍｏｌ／Ｌ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて流速５μＬ／分で処理し、次いで、ＨＰＶ３１ Ｌ１ ＶＬＰ（３５μＬのＰＢＳ緩衝液中に３２μｇ／ｍＬ）を、流速５μＬ／分で共有的にカップリングさせた。残存カルボキシル基を、その後、５０μＬの１ｍｏｌ／Ｌエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）により流速１０μＬ／分で遮断した。未結合ＶＬＰを、５μＬのＨＣｌ−グリシン（１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ２．２）を流速１０μＬ／分で注入することにより消去した。流速２０μＬ／分を、室温で行った全ての相互作用分析について用いた。結合したＨＰＶ３１ Ｌ１ ＶＬＰによる抗体飽和は、各ＭＡｂについて、ＰＢＳで１：１０に希釈した３０μＬの腹水の３回の注入により得られた。ＭＡｂ飽和は、ＰＢＳで１：４に希釈した３０μＬの同じＭＡｂのハイブリドーマ上清の注入により確認した。競合を、次いで、ＰＢＳで１：４に希釈した５つの異なるハイブリドーマ上清（各３０μＬ）を継続的に注入することにより確立した。バイオセンサを、次いで、１０μＬの３０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌの３回の注入により再生し、別のサイクルの飽和−競合を、同じＶＬＰがカップリングしたフローセルに対して行った。いくつかのその他の再生緩衝液（２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨならびに２０、２５、３０および５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌを含む）を調査した。選択した緩衝液（３０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ）は、結合した抗体を１００％除去したが、センサチップからＶＬＰを除去せず、ＶＬＰ立体構造に影響しないことが示された。なぜなら、立体構造エピトープを指向する抗体は、再生処理前と同様に効果的にＶＬＰとまだ結合していたからである。
【０１８５】
細菌細胞表面ディスプレイを用いるエピトープマッピング
ｐＦｌｉＴｒｘベクターを用いる細菌細胞表面ディスプレイ法は、ペプチドを拘束するためにチオレドキシンドメイン（ＴｒｘＡ）に挿入された１２マーペプチドライブラリーを用いる。このチオレドキシンドメインは、それ自体、メジャー細菌鞭毛タンパク質（ＦｌｉＣ）に挿入され、Ｅ．ｃｏｌｉの表面上に提示される（Ｌｕら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１９９５年；１３巻：３６６〜７２頁；Ｊａｍｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３年；２９９巻：１３６２〜１３６７頁）。ｐＦｌｉＴｒｘランダムペプチドディスプレイライブラリー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｅｒｇｙ Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を、１ｍＬのペプチドライブラリーストック溶液を、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有する５０ｍＬのＩＭＣ培地（６ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、３ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１ｇ／Ｌ ＮＨ_４Ｃｌ、０．２％カザミノ酸、０．５％グルコース、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ_２）に接種し、次いで２５℃で１晩振とう（２２５〜２５０ｒｐｍ）することにより得た。ペプチド発現は、１００μｇ／ｍＬのトリプトファンを、１晩培養物からの１０１０細菌に、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する５０ｍＬのＩＭＣ培地中で加え、次いで２５℃で６時間振とうすることにより誘導した。
【０１８６】
抗ＨＰＶ３１抗体に対するライブラリースクリーニングのために、１ｍＬ滅菌水中の２０μｇのＭＡｂで６０ｍｍプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ Ｄ、Ｎｕｎｃ、ＡＴＧＣ、Ｍａｒｎｅ−ｌａ−Ｖａｌｌｅ’ｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を１時間、５０ｒｐｍでオービタルシェーカー上で穏やかな振動を用いて被覆した。１０ｍＬの滅菌水で洗浄した後に、１０ｍＬのブロッキング溶液（１００μｇ／ｍＬアンピシリン、１％脱脂粉乳、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１％ ａ−メチルマンノシドを含有するＩＭＣ培地）を加え、振動（５０ｒｐｍ）の下に１時間インキュベートした。ブロッキング溶液をデカントした後に、１０ｍＬの細菌細胞培養物に、０．１ｇ粉乳、３００μＬの５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、５００μＬの２０％ ａ−メチルマンノシドを加えた（最終濃度：１％脱脂粉乳、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１％ ａ−メチルマンノシド）。５０ｒｐｍで１分の穏やかな振動および室温で１時間のインキュベーションの後に、プレートを５回（５０ｒｐｍで５分）、１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび１％ ａメチルマンノシドを含有する１０ｍＬのＩＭＣ培地で洗浄した。結合した細菌細胞を、次いで、プレートを３０秒間ボルテックスすることにより洗浄溶液の残存容量中に溶出した。これらを、５０ｍＬの培養フラスコに移し、振とうしながら（２２５〜２５０ｒｐｍ）２５℃で１晩成長させた。このパニングサイクルをさらに４回繰り返して、５回目のパニングからの１晩培養物を、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＲＭＧプレート（６ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、３ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１ｇ／Ｌ ＮＨ_４Ｃｌ、２％カザミノ酸、０．５％グルコース、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ_２、１．５％寒天）上に画線し、３０℃で１晩インキュベートした。ＲＭＧ／アンピシリンプレートからの２４〜３０コロニーを、それぞれ、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有する２ｍＬ ＲＭ培地（６ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、３ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１ｇ／Ｌ ＮＨ_４Ｃｌ、２％カザミノ酸、１％グリセロール、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ_２）に接種した。振とうしながら３０℃で１晩のインキュベーションの後に、ＤＮＡを、伝統的なアルカリ溶解フェノール／クロロホルムＤＮＡミニ調製により抽出した。ヌクレオチド配列分析は、ＦｌｉＴｒｘフォワード配列プライマーを用いて行った。配列決定は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ Ａｖａｎｔ ＤＮＡシーケンサー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、Ｆｒａｎｃｅ）で運転した。配列は、Ｄｉａｌｉｇｎ２（Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎら、Ｇｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １９９９年；１５巻：２１１〜１８頁）を用いて分析した。
【０１８７】
ＥＬＩＳＡによる野生型および変異ＶＬＰに対するＭＡｂ反応性の検出
マイクロプレートウェル（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）を、ＶＬＰで被覆した。４℃で１晩のインキュベーションおよびＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％）での２回の洗浄の後に、ウェルを、１％ＦＣＳを補ったＰＢＳで、３７℃で１時間飽和させた。２重のウェル（２つの試験および１つの対照）を、ＰＢＳ ５×−Ｔｗｅｅｎ（１％）−ＦＣＳ（１０％）で希釈したＭＡｂと３７℃で１時間インキュベートした。４回の洗浄の後に、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（１％）−ＦＣＳ（１０％）で１：１，０００に希釈したペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇ Ｆｃ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）をウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、４回の洗浄の後に、２５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムおよび５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ_２ＨＰＯ_４中の０．４ｍｇ／ｍＬのＯ−フェニレンジアミンおよび０．０３％過酸化水素を加えた。３０分後に、反応を、Ｈ_２ＳＯ_４ ４Ｎを用いて停止し、吸光度を４９０ｎｍで読み取った。データ分析のために、第１抗体の非存在下で得られた光学密度（ＯＤ）の値を、試験試料のＯＤの値から減じた。示すデータは、３〜４回の決定の平均である。
【０１８８】
ヘパリンおよびＥＣＭに基づく酵素結合免疫吸着アッセイ
ＶＬＰとヘパリンとの間の相互作用を、Ｇｉｒｏｇｌｏｕら（Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００１年；７５巻：１５６５〜７０頁）によりＨＰＶ３３ ＶＬＰについて記載されるヘパリン結合アッセイに由来するアッセイを用いて試験した。マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）を、４℃で１晩、ウェルあたり２００ｎｇのヘパリン−ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）またはＭａｔｒｉｇｅｌＶＲ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅ ｐｏｎｔ ｄｅ Ｃｌａｉｘ、Ｆｒａｎｃｅ）で被覆した。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳでの４回の洗浄の後に、非特異的結合部位を、３７℃で１時間のＰＢＳ＋１％ＦＣＳとのインキュベーションによりブロックした。洗浄の後に、ＰＢＳで希釈した２００ｎｇ／ウェルのＶＬＰを加えた。３７℃で６０分間のインキュベーションおよび４回の洗浄の後に、ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０および１０％ＦＣＳで１：１０００に希釈した抗ＨＰＶ３１ ＶＬＰ ＭＡｂを加え、３７℃で６０分間インキュベートした。３７℃で１時間のインキュベーションおよび４回の洗浄の後に、結合した抗体を、セイヨウワサビペルオキシダーゼと共有的に連結したマウス抗ＩｇＧ抗体を用いて検出した。３７℃で１時間のインキュベーションおよび４回の洗浄の後に、Ｏ−フェニレンジアミンおよびＨ_２Ｏ_２を含有する１００μＬの基質溶液を加えた。反応を、３０分後に、１００μＬの２ｍｏｌ／Ｌ Ｈ_２ＳＯ_４を加えることにより停止し、吸光度を４９２ｎｍで、自動化プレートリーダーを用いて読み取った。ＶＬＰを含まない対照ウェルの吸光度を、試験ウェルの値から減じた。同時に、第２のプレートを、ヘパリン−ＢＳＡまたはＭａｔｒｉｇｅｌＶＲで被覆した。インキュベーションおよび洗浄の後に、ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０および１０％ＦＣＳで１：１０００に希釈したＭＡｂと３７℃で１時間プレインキュベートした２００ｎｇ／ウェルのＶＬＰを加えた。結合した抗体を、前に記載したようにセイヨウワサビペルオキシダーゼと共有的に連結したマウス抗ＩｇＧ抗体を用いて検出した。ヘパリンまたはＭａｔｒｉｇｅｌとのＶＬＰ結合の阻害を、ヘパリンとＶＬＰとの相互作用の前にＭＡｂを加えた場合と後に加えた場合とで観察されるＯＤの低減として算出した。結果は、ＯＤの低減のパーセンテージとして表す。
ＨＳとのＶＬＰの結合およびＥＣＭアッセイ
マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ）を、前に記載したようにしてヘパリン−ＢＳＡで被覆した。ブロッキング工程の後に、ＰＢＳで希釈したＶＬＰを加えた。３７℃で６０分のインキュベーションおよび洗浄の後に、ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０および１０％ＦＣＳで１：５０００に希釈したＣａｎＶｉｒ１ ＭＡｂを加え、３７℃で６０分インキュベートした。結合した抗体を、４回の洗浄の後に、セイヨウワサビペルオキシダーゼと共有的に連結したマウス抗ＩｇＧ抗体を用いて検出し、次いで、試験を、ヘパリンとＭＡｂとの間の相互作用についての試験において、前に言及したようにして行った。結果は、ＯＤの値として表す。
【０１８９】
ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質の相同性モデリングによるＨＰＶ３１エピトープの視覚化
ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質についての配列（ＧｅｎｂａｎｋＩＤ、Ｐ１７３８８）を、Ｓｗｉｓｓ−Ｍｏｄｅｌモデリングツール（ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）に入力した。配列類似性に基づく鋳型検索により、ＨＰＶ１６ Ｌ１（ＰＤＢコード１ＤＺＬおよび２Ｒ５Ｈ）、ＨＰＶ−３５ Ｌ１（２Ｒ５Ｊ）、ＨＰＶ−１１ Ｌ１（２Ｒ５Ｋ）およびＨＰＶ−１８ Ｌ１（２Ｒ５Ｉ）が、可能性のある３Ｄ鋳型として同定された。ＨＰＶ３１ Ｌ１は、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ３５ Ｌ１配列とより類似するので、我々は、対応する３Ｄ鋳型（１ＤＺＬ、２Ｒ５Ｈおよび２Ｒ５Ｊ）を選択して、ＨＰＶ３１のＬ１構造をモデル化した。ＨＰＶ３１ Ｌ１のモデルを、ＡＮＡＯＬＥＡ（ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ａｎｏｌｅａ／）を用いて評価し、エピトープの位置のさらなる構造分析のために正しいことが見出された。ＨＰＶ３１のＬ１ペンタマーを、ＳｗｉｓｓＰＤＢＶｉｅｗｅｒで、ＨＰＶ３１ Ｌ１モデルおよびＨＰＶ１６ ＶＬＰ（１ＤＺＬ）の非結晶学的対称（変換行列）についての情報を用いて再構築した（Ｃｈｅｎら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２０００年；５巻：５５７〜６７頁）。ＨＰＶ３１ Ｌ１ ＶＬＰについてのペンタマーの原子座標をＰＤＢフォーマットで保存し、巨大分子構造についての分子画像視覚化ツールであるＰＹＭＯＬプログラム（ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ）を用いて表示した。
【０１９０】
結果
表面プラズモン共鳴を用いるＨＰＶ３１ Ｌ１ ＭＡｂのエピトープマッピング
エピトープマッピングを、ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質に対して産生された１５のＭＡｂを用いて行った。これらのＭＡｂ間の全ての競合を試験した。例えば［図７（ａ）］、エピトープ競合は、カップリングしたＨＰＶ３１ Ｌ１ ＶＬＰをＨ３１．Ｆ１６ ＭＡｂ（粗腹水）で飽和することにより確立され、ＭＡｂ飽和は、同じＭＡｂ（ハイブリドーマ上清）の注入により確認された。Ｈ３１．Ｆ１６ ＭＡｂを加えた後に生じた低い共鳴単位（ＲＵ）（−５２ＲＵ）は、飽和が達成されたことを証明した。飽和の後に、飽和ＭＡｂの解離によるＲＵの減少があり、このことが、負のＲＵの理由であった。ＭＡｂ結合競合が、次いで、Ｈ３１．Ｂ１８、Ｈ３１．Ｄ７、Ｈ３１．Ｅ１６、Ｈ３１．Ｅ１７およびＨ３１．Ｆ７ ＭＡｂ（ハイブリドーマ上清）を継続的に注入することにより確立された。Ｈ３１．Ｅ１６およびＨ３１．Ｆ７ ＭＡｂは、ＨＰＶ３１ Ｌ１ ＶＬＰと結合せず（それぞれ−１および−１３ＲＵ）、このことは、これらの２つのＭＡｂにより認識されるエピトープが、Ｈ３１．Ｆ１６ ＭＡｂにより認識されるエピトープと類似しているかまたは非常に近いことを示唆した。これとは対照的に、ＶＬＰとの著しい結合が、Ｈ３１．Ｂ１８、Ｈ３１．Ｄ７およびＨ３１．Ｅ１７ ＭＡｂを用いて観察され（それぞれ１７１、５２３および６９ＲＵ）、このことは、これらの抗体が、Ｈ３１．Ｆ１６ ＭＡｂが認識するものとは異なるエピトープを認識することを示唆した。バイオセンサを、次いで、３０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌの３回の注入により再生した。この方法を、その他の競合アッセイの全てについて用いた。
【０１９１】
調査した１５のＭＡｂのそれぞれが、少なくとも他の３つと競合したが、全ての他のＭＡｂと競合したＭＡｂはなかった。エピトープマップは、これらの結果を用いて確立し［図７（ｂ）］、Ｈ３１．Ｆ７ ＭＡｂにより認識されるエピトープは、このマップで中心の位置であった。このＭＡｂにより認識されるエピトープは、Ｌ１ ＦＧループ上で既に同定されていた（Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒら、Ｊ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ ２００５年；７７巻：５５８〜６５頁；Ｆｌｅｕｒｙら、Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ ２００６年；１５１１〜２３頁）。その他のＭＡｂとの競合がより低いＭＡｂ（Ｈ３１．Ｂ１８、Ｈ３１．Ｂ１およびＨ３１．Ｈ９）は、エピトープマップの周縁に位置した。
【０１９２】
ＨＰＶ３１／ＨＢｃ ＶＬＰとのＨＰＶ３１ ＭＡｂの結合
ＭＡｂの反応性を、ＨＰＶ３１ Ｌ１／ＨＢｃ２６３／２６４変異体およびＨＰＶ３１ Ｌ１ ｗｔＶＬＰを用いて分析して、中和エピトープのいくつかが、ＦＧループ上にあるかどうかを同定した。以前に生成したＨＰＶ３１ Ｌ１ ＶＬＰに加えて、我々は、ＨＰＶ３１ Ｌ１変異体を、Ｂ型肝炎コア（ＨＢｃ）モチーフＤＰＡＳＲＥを２６３〜２６４位に挿入することにより構築した。全ての型特異的ＭＡｂとのＶＬＰの結合は、２６３／２６４位でのＨＢｃモチーフの挿入により影響を受けた。２７１位〜２７９位にある直鎖エピトープ（ＳＶＰＴＤＬＹＩＫ、配列番号４４）を認識する非中和Ｈ３１．Ｄ２４ ＭＡｂの反応性は、挿入により影響を受けなかったことが注目される。ＦＧループの外側で同定された直鎖状エピトープを認識するＣａｍＶｉｒ−１ ＭＡｂの結合も、導入した変異により影響を受けなかった。交差中和ＭＡｂ Ｈ３１．Ｆ７は、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ３１ ｗｔ ＶＬＰの両方と同様に反応したが、２６３／２６４位でのＨＢｃモチーフの挿入により影響を受けた。
【０１９３】
細菌表面ディスプレイを用いる５つのＭＡｂのエピトープマッピング
ペプチドライブラリーのディスプレイのために細菌を用いるエピトープマッピングは、モノクローナルおよびポリクローナルの両方の抗体のマッピングのための新しいアプローチを提供する（Ｒｏｃｋｂｅｒｇら、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００８年；５巻：１０３９〜４５頁）。あるこのようなシステムであるｐＦｌｉＴｒｘ細菌ディスプレイシステムを用いて、Ｌ１エピトープを同定した。ｐＦｌｉＴｒｘベクターを用いる細菌細胞表面ディスプレイは、ペプチドを拘束するためにチオレドキシンドメインに挿入された１２マーのペプチドライブラリーを用いて、立体構造エピトープのディスプレイを可能にする。このチオレドキシンドメインは、それ自体、Ｅ．ｃｏｌｉのメジャー細菌鞭毛タンパク質に挿入され、細菌の表面上にディスプレイされる。腹水から精製した高力価のＭＡｂで、抗ＨＰＶ３１抗体に対するライブラリースクリーニングのためにＮｕｃｌｏｎ Ｄプレートを被覆し、複数回のｉｎ ｖｉｔｒｏ選択を、プレートと結合したＭＡｂに対して行って、ＭＡｂと相互作用するペプチドをディスプレイする細菌を選択した。各回について、細菌ライブラリーを、ポジディブ選択のために細胞培養皿に加えた。未結合の細菌を洗い流し、結合した細菌を回収した。５回のあとに、単一コロニーを選択し、配列決定のためにＤＮＡを単離した。配列を、まず、Ｄｉａｌｉｇｎ２プログラムを用いて分析した。高いスコアで一致するペプチドを選択し、次いで、Ｄｉａｌｉｇｎ２を用いて、全長ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質配列と整列させた。全ての選択したペプチドと一致するＨＰＶ３１ Ｌ１配列を保持した。我々は、まず、このシステムを、ＨＰＶ３１ Ｌ１のＦＧループ内の２７１位〜２７９位の以前に同定された直鎖状エピトープ（ＳＶＰＴＤＬＹＩＫ、配列番号４４）を認識するＨ３１．Ｄ２４ ＭＡｂとともに用いた。細菌ディスプレイ選択の後に、２４の陽性クローンを配列決定して分析した。Ｈ３１．Ｄ２４ ＭＡｂを用いて選択された２４のペプチドのうち６つが、それぞれのＦ２の他のものと一致し、ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質と一致し（図８を参照されたい）、同定されたコンセンサス配列は、２７５位〜２７９位（ＤＬＩＹＫ、配列番号４６）であった。
【０１９４】
細菌ディスプレイを、よって、ＨＰＶ１６、１８および５８と交差反応性であり、ＨＰＶ１６型および３１型について弱く中和性であるＭＡｂ Ｈ３１．Ｆ７により認識される中和立体構造エピトープを調査するために用いた。２４の陽性クローンを、細菌ディスプレイにより、Ｈ３１．Ｆ７ ＭＡｂを用いて選択した。選択した２４のペプチドのうち５つは互いに一致し、ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質配列２５９〜２６６（ＲＨＦＦＮＲＳＧ、配列番号４７）と一致した。立体構造エピトープを認識した３つの型特異的中和ＭＡｂ（Ｈ３１．Ｆ１６、Ｈ３１．Ｈ１２およびＨ３１．Ｂ１）も調査した。各ＭＡｂについて陽性クローンを選択した。Ｈ３１．Ｆ１６ ＭＡｂを用いて選択した５つのペプチド、Ｈ３１．Ｈ１２ ＭＡｂを用いて選択した５つのペプチドおよびＨ３１．Ｂ１ ＭＡｂを用いて選択した６つのペプチドは互いに一致し、Ｈ３１．Ｆ１６ ＭＡｂについてのＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質配列ＳＧＴＶＧＥＳＶＰ（２６５〜２７３）（配列番号４８）、Ｈ３１．Ｈ１２ ＭＡｂについてのＲＳＧＴＶＧ配列（２６４〜２６９）（配列番号４９）およびＨ３１．Ｂ１ ＭＡｂについてのＲＳＧＴＶＧＥＳＶ配列（２６４〜２７２）（配列番号５０）と一致した。
【０１９５】
偽ビリオンの結合前および結合後のＭＡｂ中和
ＨＰＶ１６およびＨＰＶ３３に特異的な抗体は、標的細胞への結合の前および後に中和することが示されている（Ｓｅｌｉｎｋａら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００３年；７７巻：１２９６１〜６７頁；Ｄａｙら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００７年；８１巻：８７８４〜９２頁）。抗ＨＰＶ３１ ＭＡｂによるウイルス中和の機構を、中和アッセイにより決定し、ＭＡｂを、Ｆ３偽ビリオンをＣＯＳ−７細胞に加える前［図９（ａ）］または細胞結合の１時間後［図９（ｂ）］のいずれかに加えた。６つのＭＡｂ［Ｈ３１．Ｂ１、Ｈ３１．Ｃ２４、Ｈ３１．Ｇ５、Ｈ３１．Ｅ１６、Ｈ３１．Ｆ７およびＨ３１．Ｄ７、図９（ｂ）］は、細胞結合を阻害することによりＨＰＶ３１偽ビリオンを中和した。なぜなら、これらは、ウイルス結合の前に中和するが、細胞に偽ウイルスが結合した後には中和しないからである［図９（ｂ）］。その他の８つのＭＡｂは、細胞結合後機構によりＨＰＶ３１偽ビリオンを中和した。なぜなら、これらは、細胞結合の前および後に偽ビリオンを中和したからである。表面プラズモン共鳴分析により得られたエピトープマップ［図７（ｃ）］は、ＨＰＶ３１偽ビリオンを細胞結合の阻害により中和した６つのＭＡｂのうち５つのクラスタを示唆したことが注目される。
【０１９６】
ＨＳおよびＥＣＭとのＶＬＰの結合：ＨＰＶ３１ＭＡｂおよびＬ１ Ｃ末端欠失の効果
ＨＰＶ３１ ＭＡｂによるヘパリンとのＶＬＰ結合の阻害をＥＬＩＳＡにより調査し、ここでは、ＥＬＩＳＡプレートを被覆するヘパリンとＶＬＰが結合する前にＭＡｂをＶＬＰに加えた。結果は、直鎖状エピトープを認識する非中和Ｈ３１．Ｄ２４ ＭＡｂが、ヘパリンとのＶＬＰの結合を強く阻害したことを示した。なぜなら、１４のＭＡｂのうち６つだけが立体構造Ｆ４中和エピトープを認識したからである［図１０（ａ）］。表面プラズモン共鳴分析により得られたエピトープマップは、ヘパリンとのＶＬＰの結合を阻害したＭＡｂのうちのいくつかのクラスタを示した［図７（ｃ）］。細胞への結合の前に偽ビリオンを中和したＭＡｂと、ＨＳの結合を阻害したものとの間に明確な相関関係はなかった。しかし、３つの中和抗体（Ｈ３１．Ｇ５、Ｈ３１．Ｅ１６およびＨ３１．Ｄ７）は、両方の能力を示した（図１０を参照されたい）。ＥＣＭタンパク質とのＶＬＰの結合の阻害を、ＥＬＩＳＡにより、ＭａｔｒｉｇｅｌＶＲをＥＣＭの代理として用いて調査した。結果［図１０（ｂ）］は、Ｈ３１．Ｃ２４（３７％阻害）以外の全ての中和抗体によるＥＣＭタンパク質とのＶＬＰの結合の阻害（＞５０％）を示した。非中和抗体Ｈ３１．Ｄ２４は、ＥＣＭタンパク質とのＶＬＰの結合を阻害しなかった。
【０１９７】
ＨＰＳＧとのＶＬＰの相互作用をさらに調査するために、我々は、４つのＣ末端欠失変異体を用いて、Ｌ１タンパク質とのヘパリンの結合を分析した。それぞれ９および３１アミノ酸のＣ末端欠失を有するＨＰＶ１６ Ｄ９およびＨＰＶ１６ Ｄ３１変異体は既に生成されており４４、ＨＰＶ３１Ｄ９およびＨＰＶ３１Ｄ３１ Ｌ１変異体は、この研究の目的のために同様に生成した。ＨＰＶ１６欠失変異体について以前に観察されたように４４、これらのＨＰＶ３１欠失変異体は、ＶＬＰに自己集合し（図７を参照されたい）、これらの４つのＣ末端欠失ＶＬＰは、ｗｔＶＬＰと同様の様式でヘパリンと結合した。しかし、ヘパリンとの結合は、これらのＶＬＰを変性させた場合に喪失し、このことにより、ヘパリンがＶＬＰの立体構造モチーフと結合し、このモチーフが、Ｌ１タンパク質のＣ末端部分に存在しないことが確認される（図１１を参照されたい）。ＨＰＶによる標的細胞の感染は、ＨＳＰＧ、ＥＣＭおよび未知の２次受容体が関与する多段階プロセスであるので、我々は、ＥＣＭ ＨＰＶ ＶＬＰ結合の中和に対するＨＰＶ３１ ＭＡｂの影響を調査した。
【０１９８】
Ｈ３１．Ｄ２４により認識されるエピトープは直鎖状エピトープであり、３つの中和ＭＡｂ（Ｈ３１．Ｂ１、Ｈ３１．Ｆ１６およびＨ３１．Ｈ１２）により認識されるエピトープは立体構造エピトープであるが、Ｈ３１．Ｂ１ ＭＡｂは、部分的に交差中和性および交差反応性である。
【０１９９】
交差反応性であり部分的に交差中和性のＭＡｂであるＨ３１．Ｆ７ ＭＡｂにより認識されるエピトープは、２５９位〜２６８位（ＲＨＦＦＮＲＳＧＴＶ、配列番号４５）でＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質のＦＧループのＮ末端部分で同定され［図１２、３Ｄカプソマー構造は、ＳｗｉｓｓＰＤＢＶｉｅｗｅｒで、ＨＰＶ３１ Ｌ１モデルおよびＨＰＶ１６ ＶＬＰのＡＱ６非結晶学的対称についての情報を用いて再構築した［ＰＤＢコード：１ＤＺＬ、（Ｃｈｅｎら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２０００年；５巻：５５７〜６７頁）］］、ＨＰＶ３１モデルによると、カプソマーの表面からはＦ６ほぼ近づくことができない。このことは、ＦＧループの初期領域がＨＰＶ型同士の同一の構造を証明したこと、およびＦＧループのこの領域が型同士の交差反応性を誘導できるが、抗原性に乏しく、かつ／または近づきにくいに違いないことを示唆したＬ１タンパク質の構造分析についてのＢｉｓｈｏｐら６４の仮説と一致する。
【０２００】
ＨＰＶ１６およびＨＰＶ３３について、種々のＬ１タンパク質表面露出ループが、１つのループでのみ同定されるエピトープおよびいくつかのループが結合部位に寄与するエピトープに対して中和抗体を誘導することに寄与することが示され１５、４６、４７、Ｌ１の非隣接領域が、ＭＡｂにより認識される中和エピトープに寄与し得ることが示唆されている。我々の知見は、ＨＰＶ３１中和抗体がＦＧループを主に指向し、ＦＧループが中和抗体との結合に寄与するだけであることに賛同した。Ｌ１超可変ループが互いに近傍にあるという事実は、Ｒｏｔｈら４７により観察されたようにその他のループにおける変異または挿入がＦＧ立体構造エピトープに影響するという可能性を除外しなかった。我々は、ＤＬＹＩＫ（配列番号４４）配列（２７５〜２７９）を認識した交差反応性Ｈ３１．Ｄ２４ ＭＡｂが、ヘパリンと結合するＨＰＶ３１の能力を劇的に低減したことを観察し、よって、ＨＳ結合におけるリシン２７８の役割を確認した。しかし、この抗体は、ＨＰＶ３１偽ビリオンに対して中和効果を有さず４１、６５、ＦＧループのＮ末端部分に位置する配列と結合することが公知の立体構造エピトープを認識する３つのその他の中和抗体は、ヘパリンとの結合に対して全く効果を有さないか、または限定された効果を有した。Ｈ１６．Ｖ５およびＨ１６．Ｅ７０ ＭＡｂは、細胞表面との相互作用を遮断しないことが示されている。しかし、これらの中和抗体は、ＨａＣａＴ細胞により生成されるＥＣＭとのウイルスの結合を阻害し、細胞結合後機構により偽ビリオンを中和する４３。このことと一致して、我々は、３つの型特異的中和抗体が、ＶＬＰとの結合についてＨＳと競合せず、これらのうち１つ（Ｈ３１．Ｂ１）だけが、細胞とのＶＬＰの結合の阻害により中和されたことを観察した。しかし、これらの抗体は全て、ＥＣＭとの結合について競合し、このことは、非中和性Ｈ３１．Ｄ２４ ＭＡｂと対照的である。これらの結果は、これらの抗体が、ＨＳ３５とのＨＰＶ１６ ＶＬＰの結合に関与するリシンの立体構造塩基性クラスタの付近のエピトープを認識することを示唆した。クラスタの最も重要なリシンは、Ｈ３１．Ｄ２４ ＭＡｂにより認識されるエピトープ内に存在することが注目される。さらに、ＭＡｂによるＨＰＶ３１偽ビリオンの結合前および結合後の中和の調査により、ＨＰＶ３１中和抗体の６つが、ウイルス粒子の細胞表面結合を妨げることにより作用し、その他の８つの中和ＭＡｂが、それらの内部移行を妨げることにより偽ビリオンに干渉したことが明らかになった。我々の知見は、一連のＭＡｂ全体について、中和とＨＳと結合するＭＡｂの能力との間に相関関係がないことを示す。Ｌｏｐｅｚら６６は、最近、自然感染において検出された抗ＨＰＶ抗体が、ＨＳとのＨＰＶ１６の結合を阻害することを報告し、彼らは、最高の中和力価を有するものが、ＨＳとの結合を阻害したものであったことを観察した。結論として、我々の知見は、ＨＰＶ３１中和ＭＡｂが、ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質のＦＧループ上にある立体構造エピトープを認識し、これらが、標的細胞への結合を遮断することまたは細胞結合後の中和のいずれかにより作用することを示した。細菌表面ディスプレイによる３つの型特異的中和エピトープの精密な決定により、ＦＧループの中心部分上のそれらの位置が確認され、ＦＧループの比較的保存されたＮ末端部分上の交差反応性および部分的に交差反応性の立体構造エピトープが同定された。ＦＧループの溶媒露出アミノ酸残基は、Ｐｒｏ２７３〜Ｌｅｕ２８７により規定される軸に沿って形成される溝の両側に分布していた［図１２］。我々の知見は、溝の右側部分が、Ｈ３１．Ｄ２４ ＭＡｂにより認識される直鎖状非中和性エピトープを含有することを示した。これは、ヘパラン硫酸結合のための活発な部分でもあり、よって、Ｈ３１．Ｄ２４およびＨＳがこの領域との結合についてなぜ競合するかを説明する。同定された立体構造中和エピトープは全て、ＦＧループ溝の左側にあった（図１２を参照されたい）。これらのエピトープを指向する抗体がＨＳと強く競合しなかったという事実は、ＢＰＶ Ｌ１タンパク質を指向するＭＡｂについて以前に記載されたような６７、ＭＡｂ結合の形態の差により説明されると考えられる。しかし、その他のいくつかのＨＰＶ３１中和ＭＡｂは、ＨＳ結合について競合し、このことは、これらのＭＡｂが、それらのそれぞれのエピトープと結合する場合に異なる傾きを有し、よってＨＳ結合により大きいかもしくはより小さい程度で干渉するか、またはこれらが溝の両側からのアミノ酸残基を指向するかのいずれかであることを示唆した。Ｈ３１．Ｄ２４ ＭＡｂはＶＬＰの先端と結合したが、このことは、非中和エピトープがＨＰＶ粒子の表面上にも存在するとの仮説を支持する。得られた結果は、ＨＰＶ３１のＦＧ超可変ループが、中和エピトープに密集することを示し、ＨＰＶ３１ ＭＡｂが、ＦＧループの中心部分上にある、オーバーラップするが別個のエピトープと結合することを示唆し、このことは、ＦＧループがＨＰＶ ＶＬＰの表面上に露出されることと一致し、よって、中和抗体が、カプソマーの主に先端および頂上にあることが確認される。これらの結果は、ＥＣＭへのウイルスの結合の遮断が、重要な中和機構であるが、ＨＳへのウイルスの結合の遮断はそうではないことも支持し、これらのことを確認する。
【０２０１】
（実施例３）ＨＰＶ１６／３１ Ｌ１変異体の作製
パピローマウイルスは、小型非エンベロープＤＮＡウイルスであり、それらの正２０面体カプシドは、Ｌ１およびＬ２タンパク質で構築され、このカプシドは、約８ｋｂｐの閉鎖環状２本鎖ＤＮＡを包む。５０〜６０ｎｍの直径のウイルスカプシドは、Ｌ１メジャータンパク質の７２ペンタマーと、Ｌ２マイナーカプシドタンパク質の１２〜７２コピーとを含有する。ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に自己集合したＬ１タンパク質での免疫は、動物モデルにおいて示されたように（Ｂｒｅｉｔｂｕｒｄら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９５年；６９巻：３９５９〜６３頁；Ｓｕｚｉｃｈら、ＰＮＡＳ １９９５年；９２巻：１１５５３〜５７頁；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９６年；７０巻：９６０〜６５頁）、高いレベルの中和抗体の生成を誘導し、型特異的で長期にわたる保護を与える。抗体応答は、ＶＬＰ外表面上に存在するウイルスカプシドＬ１タンパク質の外側のループで見出されるエピトープに対して典型的に作製される（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００１年；２９１巻：３２４〜３４頁；Ｓａｄｅｙｅｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００３年；３０９巻：３２〜４０頁；Ｏｒｏｚｃｏら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００５年；７９巻：９５０３〜１４頁；Ｙａｅｇａｓｈｉら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９１年；６５巻：１５７８〜８３頁）。中和カプシドエピトープは、ＨＰＶに対する抗体媒介免疫保護のための重要な決定因子であり、直鎖状および立体構造の両方のエピトープが、ＨＰＶ Ｌ１ ＶＬＰおよび偽ビリオンの表面上で同定されている（Ｙａｅｇａｓｈｉら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９１年；６５巻：１５７８〜８３頁；Ｖｏｌｐｅｒｓら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ １９９５年；７６巻：２６６１〜６７頁；Ｈｅｉｎｏら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ １９９５年；７６巻：１１４１〜５３頁；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９６年；２２４巻：４７７〜８６頁）。
【０２０２】
ＨＰＶ１６ Ｌ１のＦＧループおよびＨＰＶ３１ Ｌ１のＥＦループ内のＬ１残基は、中和抗体の結合に関与することが報告されている（Ｓａｄｅｙｅｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００３年；３０９巻：３２〜４０頁；Ｗｈｉｔｅら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９９年；７３巻：４８８２〜８９頁；Ｃｏｍｂｉｔａら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００２年；７６巻：６４８０〜８６頁；Ｃａｒｔｅｒら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００３年；７７巻：１１６２５〜３２頁）。
【０２０３】
この研究の目的は、キメラＨＰＶ粒子の免疫原性を調査することであった。我々は、ＨＰＶ１６のメジャーエピトープを持つＬ１カプシドタンパク質ＦＧ外側ループにおけるアミノ酸（ａａ２５６〜２９４）を、ＨＰＶ３１のＬ１ ＦＧループの対応するアミノ酸（ａａ２５７〜２９５）で置換して、３つのＨＰＶ３１様置換（ＨＰＶ−ＶＬＰ Ｘ）または７つのＨＰＶ３１様置換（ＨＰＶ−ＶＬＰ Ｙ）だけをＦＧループ内に有する、ＨＰＶ１６ Ｌ１の全体的な野生型配列を維持したキメラＬ１ ＨＰＶナノ粒子を作製した（図１３）。
【０２０４】
キメラＬ１タンパク質を、組換えバキュロウイルスに感染したＳｆ２１昆虫細胞から生成して精製した。Ｓｆ２１昆虫細胞は、キメラＬ１タンパク質を良好な収率で生成した（２．５〜３ｍｇ／リットル）。Ｌ１ ＨＰＶ ＸおよびＬ１ ＨＰＶ Ｙキメラタンパク質は、ＨＰＶ１６野生型Ｌ１と同様に、ＶＬＰに集合した。ＨＰＶ−ＶＬＰ Ｙ に作製した７つの交換に加えて変異を持つキメラ構築物は、ＶＬＰに集合しなかった。
【０２０５】
キメラＶＬＰの感染性を試験するために、遺伝物質を細胞に移入するそれらの能力についてアッセイした。ＨＰＶ−ＶＬＰ ＸおよびＨＰＶ−ＶＬＰ Ｙならびに対照ＨＰＶ１６野生型ＶＬＰを解離させ、ルシフェラーゼレポータープラスミドを加え、再集合によりＶＬＰにパッケージングさせた。ＣＯＳ−７細胞（アフリカミドリザル腎臓細胞、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５１）を、ＶＬＰとｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させ、インキュベートした。インキュベーションの後に、培養培地を除去し、細胞を洗浄し、ルシフェラーゼ溶解緩衝液中で溶解した。図１４に示すように、キメラＨＰＶ−ＶＬＰ ＸおよびＹは、野生型ＨＰＶ−１６ ＶＬＰの感染能力を保持する。
【０２０６】
キメラＶＬＰの免疫原性を試験するために、マウス（１群あたり１０匹）をＨＰＶ１６、ＨＰＶ３１および２つのキメラＨＰＶ ＸおよびＹで免疫した。図１５に示すように、ＨＰＶ−ＶＬＰキメラの免疫反応性は、ＨＰＶ１６とＨＰＶ３１との間の交差反応性と同程度の大きさであり、これは、最小限である（実際の免疫応答よりも少なくとも２ｌｏｇ小さい）。ＨＰＶ１６で免疫したマウスにおいて、ＨＰＶ１６特異的抗体力価は、ＥＬＩＳＡにより測定して、約２０００ＧＭＴであり、これは、予測されたとおりである。驚くべきことに、ＨＰＶ−ＶＬＰ ＸおよびＹを感染させたマウスにおいて、Ｌ１ ＨＰＶ−ＶＬＰ ＸおよびＹが、ＨＰＶ１６野生型アミノ酸配列のほぼ全体を維持するという事実にもかかわらず、ＨＰＶ１６特異的抗体が実質的に見出されない。つまり、これらのキメラは、ＨＰＶ１６特異的抗体を産生しない。予測されたように、ＨＰＶ３１感染マウスにおいて、ＨＰＶ１６特異的抗体を実質的に見出すことはできない。さらにより驚くべき知見は、ＨＰＶ−ＶＬＰ ＸおよびＹ感染マウスにおいて、このキメラのＦＧループ、特にＬ１ ＨＰＶ ＹのＦＧループ（野生型ＨＰＶ３１のＦＧループとは１アミノ酸だけが異なる（ＨＰＶ３１ ２９１Ｔ−Ｎ２９０ ＨＰＶ１６））はＨＰＶ３１のものに類似するにもかかわらず、ＨＰＶ３１特異的抗体が実質的に見出されないことであった。予測されたように、ＨＰＶ１６感染マウスにおいて、ＨＰＶ３１特異的抗体を実質的に見出すことはできないが、堅実な応答がＨＰＶ３１について観察される（１９００ＧＭＴ付近）。興味深いことに、ＸおよびＹ特異的抗体もＨＰＶ１６またはＨＰＶ３１免疫マウスにおいて検出できず、このことは、実質的に交差反応性がないことを示唆する。中程度の交差反応性が、ＸおよびＹについて、ＸまたはＹ免疫マウスにおいて検出できる（それぞれＸおよびＹについて５３８対８５７ＧＭＴ）。
【０２０７】
データは、由来する種と実質的に交差反応性がない変異を有する偽ビリオンベクターを設計することが可能であることを示す。この大きさで低減された免疫原性は、ＨＰＶ感染個体におけるベクターに対する中和抗体の誘導により導入遺伝子効力を劇的に喪失することなくこれらのベクターの再投与を可能にする。
【０２０８】
（実施例４）Ｌ２遺伝子をパッケージングするＨＰＶ偽ビリオンでの免疫による、異種ＨＰＶに対する中和抗体の誘導
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に自己集合したＬ１での免疫は、高い力価の中和抗体を誘導し、動物において、相同な実験的感染に対する保護を与える［Ｂｒｅｉｔｂｕｒｄら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９５年；６９巻（６号）：３９５９〜６３頁；Ｓｕｚｉｃｈら、ＰＮＡＳ １９９５年；９２巻（２５号）：１１５５３〜７頁］。保護は、立体構造エピトープを指向する中和抗体によって媒介されることも示されている。これらの結果は、生殖器ＨＰＶ型に対するワクチンの工業的な開発を導いている。前臨床研究は、Ｌ１ ＶＬＰにより誘導される中和抗体が、優勢に型特異的であることを示している［Ｒｏｄｅｎら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９４年；６８巻（１１号）：７５７０〜４頁；Ｒｏｄｅｎら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９６年；７０巻（９号）：５８７５〜８３頁］。しかし、低いレベルの交差中和が、ＨＰＶ６と１１、およびＨＰＶ１６と３１との間［Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９４年；２０５巻（１号）：３２９〜３５頁；Ｗｈｉｔｅら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９８年；７２巻（２号）：９５９〜６４頁；Ｇｉｒｏｇｌｏｕら、Ｖａｃｃｉｎｅ ２００１年；１９巻（１３〜１４号）：１７８３〜９３頁；Ｃｏｍｂｉｔａら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００２年；７６巻（１３号）：６４８０〜６頁］で、そして高いレベルがＨＰＶ１８と４５との間［ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ−Ｄｒｕｂｉｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００３年；３１２巻（１号）：１〜７頁］で報告されている。臨床試験は、免疫応答が、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８感染ならびに関連する病変に対する保護と関連することを示している［Ａｕｌｔら、Ｌａｎｃｅｔ ２００７年；３６９巻（９８７６号）：１８６１〜８頁；Ｐａａｖｏｎｅｎら、Ｌａｎｃｅｔ ２００７年；３６９巻（９５８０号）：２１６１〜７０頁］。Ｌ１ ＶＬＰを含有する現在のＨＰＶワクチンは、強く、主に型特異的な中和抗体応答の作製を促進する。ＨＰＶ１６および１８ワクチンを用いる臨床試験も、ＨＰＶの型に対する交差保護が、密接に関係する型に限定されることを明らかにしている。ＨＰＶ３１に対する保護は、両方のワクチンについて、そしてＨＰＶ４５感染に対する保護は、１つのワクチンについてだけ明確に確立された［Ｐａａｖｏｎｅｎら、Ｌａｎｃｅｔ ２００７年；３６９巻（９５８０号）：２１６１〜７０頁；Ｂｒｏｗｎら、Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２００９年；１９９巻（７号）：９２６〜３５頁］。認可されたＨＰＶワクチンは、１５の高リスクＨＰＶ型のうち２つだけを標的にするので、その他の高リスクＨＰＶ型の感染を防ぐさらなる方策が必要とされる。
【０２０９】
Ｌ２での免疫は、パピローマウイルス感染の動物モデルにおいて、Ｌ１ ＶＬＰよりも広い保護を媒介できる交差中和抗体を誘導し［Ｒｏｄｅｎら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９４年；６８巻（１１号）：７５７０〜４頁；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９１年；１８１巻（２号）：５７２〜９頁；Ｙｉｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９２年；１８７巻（２号）：６１２〜９頁；Ｃｈａｎｄｒａｃｈｕｄら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９５年；２１１巻（１号）：２０４〜８頁；Ｇａｕｋｒｏｇｅｒら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ １９９６年；７７巻（７号）：１５７７〜８３頁；Ｃａｍｐｏら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９７年；２３４巻（２号）：２６１〜６頁；Ｒｏｄｅｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０００年；２７０巻（２号）：２５４〜７頁；Ｅｍｂｅｒｓら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００２年；７６巻（１９号）：９７９８〜８０５頁］、前臨床および臨床治験［Ｇａｍｂｈｉｒａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００６年；６６巻（２３号）：１１１２０〜４頁；Ａｌｐｈｓら、ＰＮＡＳ ２００８年；１０５巻（１５号）：５８５０〜５頁；Ｋａｒａｎａｍら、Ｖａｃｃｉｎｅ ２００９年；２７巻（７号）：１０４０〜９］により、Ｌ２ワクチンが、広いスペクトルの交差中和抗体を誘導することが確認されているので、Ｌ２タンパク質は、候補の予防ワクチンとして出現している。しかし、Ｌ２タンパク質およびＬ２ペプチドは、Ｌ１ ＶＬＰよりも免疫原性が小さく、Ｌ２タンパク質をＬ１ ＶＬＰに組み込むことは、Ｌ１の免疫優性により抗Ｌ２応答を増加しない［Ｒｏｄｅｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０００年；２７０巻（２号）：２５４〜７頁］。このことは、このようなＬ２に基づくワクチンが効果的であるならば、新しいワクチン方策が調査されなければならないことを示唆する。
【０２１０】
この研究の目的は、免疫系へのＬ２タンパク質の曝露を増加することにより、広いスペクトルのＨＰＶワクチンを作製する可能性について調査することであった。
【０２１１】
材料および方法
抗体
ＣａｍＶｉｒ−１モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅ Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｃｌａｉｘ、Ｆｒａｎｃｅ）は、ＨＰＶ−１６ Ｌ１タンパク質のアミノ酸２０３〜２０９の間にマッピングされた直鎖状エピトープと結合する［Ｆｌｅｕｒｙら、Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ ２００６年；１５１巻（８号）：１５１１〜２３頁］。Ｈ１６．Ｖ５ ＭＡｂは、ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の立体構造中和エピトープを指向する［Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９６年；２２３巻（１号）：１７４〜８４頁］。ウサギ抗ＨＰＶ１６ Ｌ２免疫血清は、Ｒｉｃｈａｒｄ Ｒｏｄｅｎから親切にも提供された。ＳｔｒｅｐＴａｇＩＩ抗体（ＨＲＰコンジュゲート）を用いて、ＨＰＶ ＶＬＰ上のＳｔｅｐＴａｇＩＩペプチド（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＶＷＲ、Ｆｏｎｔｅｎａｙ ｓｏｕｓ Ｂｏｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）の存在を検出した。
【０２１２】
株化細胞
ＣＯＳ−７細胞（アフリカミドリザル腎臓細胞、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５１）を、１０％熱不活化胎児ウシ血清（ＦＣＳ）、１００ＩＵ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンならびに１ｍｍｏｌ／Ｌピルビン酸ナトリウムを補ったダルベッコ改変イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ、Ｆｒａｎｃｅ）で成長させた。２９３ＦＴ株化細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、ＳＶ４０ ＴＡｇとｐＣＭＶＰＯＲＴ６ＡＴ．ｎｅｏプラスミドからのネオマイシン耐性遺伝子とを安定的に発現する２９３株化細胞の即成長型バリアントである。２９３ＦＴ細胞を、上記のようなダルベッコ改変イーグル培地に１％非必須アミノ酸および５００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を加えたもので成長させた。株化細胞は、３７℃で５％ＣＯ_２の湿潤環境において成長させた。
【０２１３】
昆虫細胞でのＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１およびＨＰＶ５８ ＶＬＰの生成
ＨＰＶ５８ Ｌ１／Ｌ２ ＶＬＰ、ＨＰＶ３１ Ｌ１／Ｌ２ ＶＬＰおよびＨＰＶ１８ Ｌ１／Ｌ２ ＶＬＰを、以前に記載されたようにして［Ｔｏｕｚｅら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １９９８年；３６巻（７号）：２０４６〜５１頁；Ｃｏｍｂｉｔａら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ ２００１年；２０４巻（１号）：１８３〜８頁］、Ｌ１およびＬ２遺伝子の両方をコードする組換えバキュロウイルスに感染したＳｆ２１昆虫細胞から生成して精製した。
【０２１４】
Ｌ２ストレプタクチン融合タンパク質（Ｌ２ＳＡ）の生成および精製
上流（ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ）と下流（ＨｉｎｄＩＩＩ）の制限部位を含む開始コドンを有さないストレプタクチン（ＳＡ）配列［Ｖｏｓｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １９９７年；１０巻（８号）：９７５〜８２頁］を、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａでの発現のために適合されたコドン使用を用いて合成した。ＳＡ配列を、ｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＳａｌＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間にクローニングして、ｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ ＳＡプラスミドを得た。ＨＰＶ１６ Ｌ２ ＯＲＦを、次いで、ＳＡ ＯＲＦの５’端に融合させた。この目的のために、ＨＰＶ１６ Ｌ２ΔＮＬＳ ＯＲＦ（アミノ酸１２〜４４２）を、ＰＣＲにより、野生型Ｌ２遺伝子のＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓコドン適合バージョン（ＦＮ２９７８６２）を含有するプラスミドから、ＨＰＶ１６ Ｌ２ ＦおよびＨＰＶ１６ Ｌ２ΔＲを用いて増幅させた。フォワードプライマーは、ＢａｍＨＩ部位と開始コドンの上流にコザック配列とを導入するように設計し、リバースプライマーは、ＳａｌＩ制限部位を含有した。ＰＣＲ生成物を、次いで、ＴＡクローニングによりｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。不要なＰＣＲにより誘導される突然変異誘発がないことを、次いで、配列決定により確認した。ｐＣＲ２．１−１６ Ｌ２ΔＮＬＳおよびｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ ＳＡプラスミドはともに、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩでの制限に供し、Ｌ２遺伝子をストレプタクチン遺伝子に融合させて、ｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ−１６ Ｌ２ΔＮＬＳ（Ｌ２ＳＡ）を作製した。
【０２１５】
Ｌ２ＳＡをコードする組換えバキュロウイルスは、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造者の推奨に従って用いて作製した。Ｓｆ２１昆虫細胞を２７℃で、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびアンホテリシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補ったＳＦ９００ＩＩ培地で成長させた。細胞に、１０のｍ．ｏ．ｉ．で感染させ、４日間成長させた。細胞をこすり落とし、３００×ｇで遠心分離し、次いで、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０および抗プロテアーゼカクテル（Ｒｏｃｈｅ、Ｍｅｙｌａｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を含有するＰＢＳ１×に再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。可溶化液を４℃で１０分間、１２，０００×ｇで遠心分離し、上清を細胞質画分とした。核画分であるペレットは、超音波処理に供した（３回のバースト、１５秒、Ｖｉｂｒａｃｅｌｌ、Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆｒａｎｃｅ）。Ｌ２ＳＡタンパク質の発現を、ウェスタンブロッティングにより分析した。この目的のために、タンパク質を１２．５％ ＳＤＳ ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースメンブレン（Ｐｒｏｔｒａｎ ＢＡ８３、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｍａｎｔｅｓ ｌａ Ｖｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）に移した。メンブレンを１晩４℃で、５％脱脂粉乳を含有するＴＮＴ（１５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ、１４０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）中で飽和させ、次いで、ＴＮＴ−５％乳で３回洗浄した。メンブレンを、室温で１時間、ＴＮＴ−５％乳で１／１０００に希釈したウサギポリクローナル抗Ｌ２とインキュベートし、３回洗浄し、アルカリホスファターゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）（ＴＮＴ−５％乳で１／２，５００）を加えた。室温で１時間のインキュベーションおよびＴＮＴ−５％乳での３回の洗浄とＴＮＴでの２回の洗浄の後に、イムノブロットを、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ液体基質システム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて顕出させた。Ｌ２ＳＡタンパク質を、製造者の使用説明（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｏｚｙｍｅ、Ｍｏｎｔｉｇｎｙ ｌｅ Ｂｒｅｔｏｎｎｅｕｘ、Ｆｒａｎｃｅ）に従って固定化イミノビオチンでのアフィニティーにより精製した。
【０２１６】
Ｌ１Ｌ２ＳＡ ＶＬＰの生成
Ｌ１ １６−ＳｔｅｐＴａｇＩＩ遺伝子を、以前に記載されたように［Ｓａｄｅｙｅｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００３年；３０９巻（１号）：３２〜４０頁］、ＳｔｅｐＴａｇＩＩペプチド（ＳＴＩＩ、ＷＳＨＰＱＦＥＫ、配列番号１２）［Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２００７年；２巻（６号）：１５２８〜３５頁］を野生型ＨＰＶ１６ Ｌ１カプシド遺伝子の１４０位〜１４１位に挿入することを許容するプライマーを用いる２回のＰＣＲ工程の後に構築した。１回目のＰＣＲ工程において、Ｆｏｒ Ｌ１１６ ＳＴＩＩ／リバースＳＴＩＩおよびフォワードＳＴＩＩ／ｒｅｖ Ｌ１１６ ＳＴＩＩを、鋳型としてのヒト化コドン使用を示すＨＰＶ１６ Ｌ１遺伝子とともに用いた。このようにして得られた２つのオーバーラップ断片を、２回目のＰＣＲ工程において、Ｆｏｒ Ｌ１１６ ＳＴＩＩ／ｒｅｖ Ｌ１１６ ＳＴＩＩプライマーを用いて融合させ、Ｌ１ １６ ＳｔｒｅｐＴａｇＩＩ配列（Ｌ１ＳＴＩＩ）を作製した。最終的なＰＣＲ生成物を上記のようにしてクローニングし、配列決定し、ｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌプラスミドのＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩとの間に最終的にクローニングして、組換えバキュロウイルスを作製した。
【０２１７】
ＶＬＰは、感染昆虫細胞から、ＣｓＣｌ勾配上の超遠心分離により精製した。Ｌ１ＳＴＩＩ ＶＬＰと結合するＬ２ＳＡタンパク質を、Ｌ１ＳＴＩＩ ＶＬＰをＬ２ＳＡ融合タンパク質と相互作用緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ８、１Ｍ Ｎａｃｌ、０．２５％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００）中で混合することにより得た。得られたキメラＶＬＰ（Ｌ１Ｌ２ＳＡ ＶＬＰ）を分析するために、ＶＬＰを、ＳＷ−６０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）での超遠心分離（６０，０００ｒｐｍ、１時間）によりペレットにし、次いで、上記のようなウェスタンブロッティングによりＬ２およびＳｔｒｅｐタグの存在に従って分析した。
【０２１８】
ＨＰＶ３１ Ｌ２ペプチド（１３〜８８）がＤＥループ内に挿入されたＨＰＶ３１ ＶＬＰの生成
ＨＰＶ３１ Ｌ２タンパク質の交差中和エピトープ（アミノ酸１３〜８８）を、Ｌ１タンパク質に挿入するために選択した［Ｐａｓｔｒａｎａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００５年；３３７巻（２号）：３６５〜７２頁；Ｇａｍｂｈｉｒａら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２００７年；８１巻（２１号）：１１５８５〜９２頁；Ｒｉｃｈａｒｄｓら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ２００６年；１０３巻（５号）：１５２２〜７頁］。１４０位〜１４１位の制限部位ＸｈｏＩおよびＳｍａＩを含有するＨＰＶ３１ Ｌ１遺伝子の配列は、２回のＰＣＲ工程により構築して［Ｆｌｅｕｒｙら、Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００８年；１５巻（１号）：１７２〜５頁］、ＨＰＶ３１ Ｌ２ペプチド配列１３〜８８（Ｌ２１３−８８）を、ｐＩＲＥＳ３１Ｌ１Ｌ２ｈを用いて挿入した。１回目のＰＣＲ工程において、ＨＰＶ Ｌ１ ３１の５’および３’部分を、フォワード−Ｌ１ｈ３１／リバース−Ｌ１およびリバース−Ｌ１ｈ３１／フォワード−Ｌ１をプライマーとして用いて増幅した。これらの２つの断片を鋳型として、フォワード−Ｌ１ｈ３１／リバースＬ１ｈ３１をプライマーとして用いる２回目のＰＣＲにおいて用いた。このＰＣＲ生成物を、次いで、ｐＣＲ ＴＯＰＯ ２．１にクローニングし、配列決定し、予めＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより消化したｐＦａｓｔＢａｃ１プラスミドにサブクローニングした。ＨＰＶ３１ Ｌ２遺伝子の断片１３〜８８をコードするＤＮＡを、ｐＩＲＥＳ３１Ｌ１Ｌ２ｈとＬ２１３−８８フォワードおよびリバースプライマーとから増幅し、上記のようにしてクローニングした。ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ／Ｌ２１３−８８およびｐＦａｓｔＢａｃ１／Ｌ１はともにＸｈｏＩ／ＳｍａＩにより消化して、ＨＰＶ Ｌ２ペプチドをコードする配列を挿入した。上記のようにして、Ｌ１−Ｌ２１３−８８タンパク質をコードする組換えバキュロウイルスを作製し、昆虫細胞に感染させた。
【０２１９】
表５．用いたオリゴヌクレオチドの配列
【０２２０】
【表５−１】

【０２２１】
【表５−２】

ＨＰＶ５８およびＨＰＶ３１偽ビリオンの生成
ＨＰＶ３１および５８偽ビリオンを、コドン改変ＨＰＶカプシド遺伝子とともに細胞系を用いて得た［Ｂｕｃｋｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ２００５年；１１９巻：４４５〜６２頁］。簡単に述べると、ＨＰＶ５８ Ｌ１およびＬ２遺伝子を、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓにおいて高く発現される遺伝子において見出される最も頻繁に用いられるコドンを含有するように設計した（それぞれＦＮ１７８６２６およびＦＮ１７８６２７）、Ｌ１およびＬ２遺伝子を、哺乳類バイシストロン性発現ベクターｐＩＲＥＳ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローニングした。Ｌ１遺伝子を、ＣＭＶ ＩＥプロモーターの下流のＭＣＳ ＡのＮｈｅＩとＥｃｏＲＩ制限部位との間にクローニングした。Ｌ２遺伝子を、その後、ｐＩＲＥＳ−Ｌ１のＭＣＳ ＢのＸｂａＩとＮｏｔＩ制限部位との間にクローニングした。ルシフェラーゼをコードするＤＮＡプラスミド（ｐＧＬ３ ｌｕｃ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃｈａｒｂｏｎｎｉｅｒｅｓ−ｌｅｓ−Ｂａｉｎｓ、Ｆｒａｎｃｅ）または偽ビリオンの生成に用いたｐＩＲＥＳ Ｌ２ΔＮＬＳは、伝統的なフェノール／クロロホルムＤＮＡ調製により調製した。後者のプラスミドは、ＨＰＶ３１ Ｌ２のアミノ酸１２〜４４２を、ＸｂａＩとＮｏｔＩ制限部位との間にコードするＤＮＡ配列を含有する。この配列は、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓコドン適合ＨＰＶ３１全長Ｌ２遺伝子を含有するプラスミドからＰＣＲ増幅した［Ｆｌｅｕｒｙら、Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００８年；１５巻（１号）：１７２〜５頁］。２９３ＦＴ細胞における偽ビリオンの作製のために、細胞に０．５μｇのＤＮＡ（０．２５μｇ ｐＧＬ３−ＬｕｃまたはｐＣＭＶ−ＧＦＰまたはｐＩＲＥＳ−Ｌ２プラスミド、０．２５μｇ Ｌ１Ｌ２プラスミド）と、１μｌ Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）とを、培養面積１ｃｍ^２あたりにトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクションの２日後に採集し、偽ビリオンを、以前に記載されたようにして精製し［Ｆｌｅｕｒｙら、Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００８年；１５巻（１号）：１７２〜５頁］、使用前に−８０℃で貯蔵した。偽ビリオンの量は、ＣａｍＶｉｒ−１抗体を用いるウェスタンブロッティングにより、既知の濃度の相同な型のＶＬＰと比較することにより決定した。
ＨＰＶ１６および１８偽ビリオンの生成
ＨＰＶ１６および１８偽ビリオンを、以前に発表された解体−再集合法［Ｔｏｕｚｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９９８年；２６巻（５号）：１３１７〜２３頁］にいくらかの改変を加えること［Ｂｏｕｓａｒｇｈｉｎら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ２００９年；８巻（２号）：３５７〜６５頁］により生成した。Ｌ１／Ｌ２ ＶＬＰ（１００μｇ）を、２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴおよび１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＧＴＡを含有する５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中、室温で３０分間インキュベートした。この段階で、ｐＧＬ３ ｌｕｃ（１０μｇ）を、破壊されたＶＬＰに加えた。調製物を、次いで、漸増濃度のＣａＣｌ_２（５ｍｍｏｌ／Ｌの最終濃度まで）で、１０ｎＭ ＺｎＣｌ_２の存在下に希釈した。偽ビリオンを、次いで、ＰＢＳ１×に対して１晩透析し、使用前に４℃で貯蔵した。
【０２２２】
免疫プロトコール
６週齢メスＢＡＬＢ／ｃマウス（ＣＥＲＪ Ｊａｎｖｉｅｒ、Ｌｅ Ｇｅｎｅｓｔ Ｓｔ Ｉｓｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を、異なるワクチン調製物により筋肉内で免疫した。群１のマウスは食塩水を受け、群２〜５のマウスは、それぞれ、１０μｇのＨＰＶ１６ Ｌ２−ＳＡタンパク質（Ｌ２ＳＡ）、Ｌ１ＳＴＩＩ−Ｌ２ＳＡ（Ｌ１Ｌ２ＳＡ ＶＬＰ）、水酸化アルミニウムとともにまたは水酸化アルミニウムなしのＨＰＶ１６ Ｌ１Ｌ２（Ｌ１Ｌ２ ＶＬＰ）を受けた。群６および７のマウスは、それぞれ１または１０μｇのｐＩＲＥＳ−ＨＰＶ３１ Ｌ２ΔＮＬＳプラスミド（ＤＮＡ Ｌ２）を受けた。群８〜１０のマウスは、それぞれＨＰＶ３１ Ｌ１、ＨＰＶ３１ Ｌ１−３１ Ｌ２１３−８８ ＶＬＰ（Ｌ１／Ｌ２（１３−８８）ＶＬＰ）、ＨＰＶ３１ Ｌ１Ｌ２ ＶＬＰ（３１ Ｌ１Ｌ２ ＶＬＰ）を受けた。群１１のマウスは、ＨＥＶ ＯＲＦ２１０８−６６０発現プラスミド（ＨＥＶ ＰｓＶ）を含有する１０μｇのＨＰＶ３１偽ビリオンを受けた。群１２および１３のマウスは、それぞれＧＦＰ発現プラスミドを含有するＨＰＶ５８偽ビリオン（ＧＦＰ ＰｓＶ）、およびＨＰＶ３１Ｌ２ΔＮＬＳプラスミドをパッケージングしたＨＰＶ５８偽ビリオン（Ｌ２ ＰｓＶ）を受けた。Ｌ１タンパク質の量は、異なるＬ１Ｌ２ ＶＬＰと偽ビリオンとの間で、ウェスタンブロットにより調整した。マウスに、第０日、第７日および第２１日に免疫した。最後の注射の２週間後に、血清試料を回収し、−２０℃で貯蔵した。全ての動物の処置は、承認されたプロトコールに従って、実験動物の正しい使用およびケアについての推奨に従って行い、実験は、地域の動物倫理委員会により承認された（ＣＲＥＥＡ Ｃｅｎｔｒｅ Ｌｉｍｏｕｓｉｎ）。
【０２２３】
ＥＬＩＳＡによる抗ＨＰＶ血清力価の決定
２００ナノグラムのＶＬＰを、９６ウェルプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ、ＡＴＧＣ、Ｍａｒｎｅ−ｌａ−Ｖａｌｌｅｅ、Ｆｒａｎｃｅ）のウェルの半分に分配し、４℃で１晩インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％）での２回の洗浄の後に、ウェルを、１％ ＦＣＳを補ったＰＢＳで、３７℃で１時間飽和した。２重のウェル（１つの試験および１つの対照）を、希釈緩衝液（ＰＢＳ５×、１％ Ｔｗｅｅｎ、１０％ ＦＣＳ）中でのマウス血清の２倍希釈（１：２５から開始）と、４５℃で１時間インキュベートした。４回の洗浄の後に、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（１％）−ＦＣＳ（１０％）で１：１，０００に希釈したペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）をウェルに加え、４５℃で１時間インキュベートした。４回の洗浄の後に、２５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムおよび５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ_２ＨＰＯ_４中の０．４ｍｇ／ｍｌ ｏ−フェニレンジアミンおよび０．０３％過酸化水素を加えた。３０分後に、反応を、Ｈ_２ＳＯ_４ ４Ｎを用いて停止し、光学密度（ＯＤ）を４９２ｎｍで読み取った。データ分析のために、Ｌ２の非存在下で得られたＯＤの値を、試験抗原のＯＤの値から減じた。試験ウェルと対照ウェルとのＯＤの差が０．２より大きい場合に、結果を陽性とみなした。個別の力価は、０．２より大きいＯＤの差を与える最後の希釈度の逆数を表した。個別のマウスについての値は、２重の平均であった。幾何平均力価（ＧＭＴ）を、各群について算出した。検出可能な抗体力価（＜２５）を有さない動物には、ＧＭＴの算出のために１の力価を指定した。抗Ｌ２抗体の検出のために、精製Ｌ２ＳＡタンパク質をＶＬＰの代わりにＮｕｎｃプレートの各ウェルに加えたことが異なる上記と同じＥＬＩＳＡを行った。
ＥＬＩＳＡによるＬ１、Ｌ２およびＳｔｒｅｐタグモチーフの検出
キメラＶＬＰのＬ１抗原性およびＬ２またはＳｔｒｅｐタグモチーフのＶＬＰ表面上での存在を、ＥＬＩＳＡにより分析した。マイクロタイタープレートウェルを、４℃で１晩、２００ｎｇのＶＬＰで被覆した。ＶＬＰ表面上でのＳｔｒｅｐＴａｇＩＩモチーフおよびＬ２タンパク質の存在の調査のためにそれぞれ抗ＳｔｒｅｐＴａｇＩＩモノクローナル抗体またはポリクローナル抗Ｌ２抗体を、またはＨＰＶ１６およびＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質の立体構造エピトープの存在を調査するためにそれぞれＨ１６．Ｖ５およびＨ３１．Ｆ１６モノクローナル抗体を用いて、ＥＬＩＳＡを上記のようにして行った。
ＨＰＶ１６、１８、３１および５８偽ビリオン中和アッセイ
中和アッセイを、ｐＧＬ３−ｌｕｃプラスミドを含有する偽ビリオンによるＣＯＳ−７細胞の偽感染の阻害により行った。ＣＯＳ−７細胞（１０４／ウェル）を、９６ウェルプレート（ＴＰＰ、ＡＴＧＣ）に播種した。３７℃で２４時間のインキュベーションの後に、細胞を２回洗浄し、その後、偽ビリオン／希釈血清混合物を加えた。偽ビリオンの量は、０．２ＲＬＵの相対ルシフェラーゼ活性を得るように調整し（Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、Ｆｒａｎｃｅ）（ＨＰＶ１６について１：５００、ＨＰＶ１８について１：５０、ＨＰＶ３１について１：８００およびＨＰＶ５８について１：１０，０００）、５０μｌの希釈偽ビリオンを、１：２５から１：５１，２００まで不完全ＤＭＥＭ中で２倍希釈により希釈した５０μｌのマウス血清と混合した。３７℃で１時間のインキュベーションの後に、混合物をウェルに加えた。３７℃で３時間の後に、１００μｌの不完全ＤＭＥＭを加えた。
【０２２４】
３７℃で４８時間のインキュベーションの後に、ルシフェラーゼ遺伝子発現を測定した（ホタルルシフェラーゼ１ステップアッセイキット、Ｆｌｕｏｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、Ｍｏｎｔｌｕｃｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）。結果は、ルシフェラーゼ活性の阻害のパーセンテージとして表した［Ｒｉｃｈａｒｄｓら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ２００６年；１０３巻（５号）：１５２２〜７頁］。示すデータは、２重で行った２〜３回の決定の平均である。中和力価は、ルシフェラーゼ活性の少なくとも５０％の低減を誘導したマウス血清の最高希釈度の逆数として定義した。幾何平均力価を、各群について算出した。検出可能な中和抗体を有さない動物には、ＧＭＴの算出のために１の力価を指定した。ＨＰＶ１６中和抗体は、群１０、１２および１３においてのみ調査した。
【０２２５】
統計分析
個別の抗体力価および幾何平均力価を比較して、ＥＬＩＳＡおよび中和応答を評価した。群の結果（群あたり１０匹の動物）は、スチューデントのｔ検定によりＸＬＳｔａｔソフトウェア（Ａｄｄｉｎｓｏｆｔ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて比較した。
【０２２６】
結果
ＨＰＶ３１ Ｌ２およびＨＰＶ１６ Ｌ２キメラ粒子ならびにＬ２をコードするＨＰＶ５８ 偽ビリオンの生成
我々は、２つのキメラＬ１−Ｌ２粒子を生成して、広いスペクトルのＨＰＶ型に対して保護するＬ２ワクチンの可能性について調査した。カプシドの外側にＬ２を施すために、最初は、ＨＰＶ１６ Ｌ１改変ＶＬＰタンパク質と、ストレプトアビジンの工学的に操作されたバージョンであるストレプタクチンと融合したＨＰＶ１６ Ｌ２タンパク質との間の相互作用に基づいた。このことを達成するために、ビオチン結合ループを模倣する配列であるＳｔｒｅｐＴａｇＩＩペプチド（ＷＳＨＰＱＦＥＫ、配列番号１２）を、Ｌ１タンパク質の１４０／１４１位の間にＤＥループ中で挿入して、ビオチンがＬ１中和エピトープとカップリングする危険性を有するビオチンとＬ１ ＶＬＰとの化学カップリングを回避した。組換えバキュロウイルスを用いてＳｆ−２１昆虫細胞で発現させ、ＣｓＣｌ勾配上で精製した場合に、Ｌ１ＳＴＩＩ組換えタンパク質は、野生型Ｌ１タンパク質と同じ外観および同様の収率でウイルス様粒子に自己集合した（図１６）。スライドは、酢酸ウラニルでネガティブ染色し、５００００倍の倍率で走査型電子顕微鏡により観察した（バー＝２００ｎｍ）。
【０２２７】
ＨＰＶ３１ Ｌ２タンパク質（ａａ１３〜８８）を含有する第２のキメラＬ１／Ｌ２タンパク質を、ＨＰＶ３１ Ｌ１タンパク質のＤＥループ内に挿入した。組換えバキュロウイルスを用いて昆虫細胞で発現させた場合に、Ｌ１Ｌ２（１３−８８）組換えタンパク質は、良好な形状のＶＬＰの生成を許容しなかったが、タンパク質および／またはカプソマーの凝集物を主にもたらした（図１６）。
【０２２８】
これらの２つのキメラＶＬＰのＬ１抗原性を、ＥＬＩＳＡにより、立体構造エピトープおよび直鎖状エピトープを指向する抗Ｌ１ ＭＡｂを用いて調査した（図１７）。結果は、キメラＨＰＶ１６ Ｌ１ＳＴＩＩ ＶＬＰ上のＨ１６．Ｖ５により認識される立体構造Ｌ１エピトープは影響されなかったことを示した。しかし、ＨＰＶ３１ Ｌ１ ＶＬＰを用いて観察された場合と比較して、ＨＰＶ３１ Ｌ１−Ｌ２１３−８８ ＶＬＰと結合するＨ３１．Ｆ１６ ＭＡｂの明確な低減が観察された。ＶＬＰ表面上のＳｔｒｅｐＴａｇＩＩまたはＬ２ペプチド（１３〜８８）の存在も、ＥＬＩＳＡにより、ＳｔｒｅｐＴａｇＩＩ配列またはポリクローナル抗Ｌ２抗体をそれぞれ指向するＭＡｂを用いて調査した。得られた結果（図１７）は、ＳｔｒｅｐＴａｇＩＩおよびＬ２配列が、キメラＶＬＰの表面上に存在したことを示した。
【０２２９】
さらに、５μｇのＶＬＰを、１／１の質量比率（１のＬ２ＳＡタンパク質／１のＬ１タンパク質）に相当する１０μｇのＬ２ＳＡ融合タンパク質と混合することにより、Ｌ２ＳＡタンパク質と結合するＬ１ＳＴＩＩ ＶＬＰの能力を決定した。Ｌ１ＳＴＩＩ ＶＬＰとのＬ２ＳＡの結合は、複合したＶＬＰの超遠心分離と、その後のウェスタンブロッティングによるＬ２ＳＡタンパク質の検出とにより分析した。超遠心分離ペレット中のＬ２ＳＡおよびＬ１ＳＴＩＩ ＶＬＰの検出（図１８）は、Ｌ２ＳＡタンパク質が、ＶＬＰと効果的に結合したことを示した。結合は、Ｌ２ＳＡを野生型ＨＰＶ１６ ＶＬＰと混合した場合には観察されなかった。Ｌ１Ｌ２ＳＡ ＶＬＰ中のＬ２タンパク質の存在は、ＥＬＩＳＡによっても証明された（図１７）。ＨＰＶ−３１ Ｌ２ΔＮＬＳ遺伝子をコードするプラスミドをパッケージングしたＨＰＶ５８偽ビリオンを、２９３ＦＴ細胞において生成した。Ｌ２遺伝子を形質導入するこれらの能力を、ＣＯＳ−７細胞の感染により調査した。Ｌ２タンパク質発現のウェスタンブロット分析は、Ｌ２が形質導入の２日後に検出されたことを示した（図１８）。ＣＯＳ−７細胞で検出されたＬ２が、入力した偽ビリオンの存在による可能性を除外するために、ＣＯＳ−７細胞に、ＧＦＰ遺伝子をパッケージングした同様の偽ビリオンを形質導入した。Ｌ２の存在は、これらの条件下では証明されなかった（図１８）。
ＶＬＰおよび偽ビリオンで免疫したマウスにおける抗ＨＰＶ１６−Ｌ２免疫応答
抗ＨＰＶ１６ Ｌ２抗体は、非免疫マウス（群１）において検出されなかった。Ｌ２ＳＡタンパク質を受けたマウス（群２）において、３４８の抗Ｌ２のＧＭＴが観察された（表６）。抗Ｌ２抗体レベルの増加は、ＨＰＶ１６ Ｌ１Ｌ２ＳＡ ＶＬＰおよびＨＰＶ１６ Ｌ１Ｌ２ ＶＬＰで免疫されたマウスにおいて観察され（群３および４）、それぞれ１，１６０および１，０５５のＧＭＴであった（ｐ＝０．０３５およびｐ＝０．０５）。アジュバントとして水酸化アルミニウムをＨＰＶ１６ Ｌ１Ｌ２ ＶＬＰに加えること（群５）により、相同抗Ｌ２抗体のレベルが、有意でない様式でさらに増加した（ｐ＝０．２４７）。
【０２３０】
抗Ｌ２は、ＨＰＶ３１ Ｌ１ ＶＬＰで免疫したマウス（群８）では検出されなかったが、Ｌ１Ｌ２１３−８８ ＶＬＰで免疫した全てのマウス（群９）では７３０のＧＭＴで、そしてＬＩＬ２ ＶＬＰで免疫したマウス（群１０）においてはより高いレベルの１，１００のＧＭＴで検出された（ｐ＝０．１８９）。抗Ｌ２抗体は、対照偽ビリオンで免疫したマウス（群１１および１２）と同様のレベルで、８５５および１，２１２のＧＭＴで検出された（ｐ＝０．４５９）。これらの対照偽ビリオンとの比較により、抗Ｌ２ ＧＭＴ（２，６００）は、Ｌ２をコードする偽ビリオンで免疫したマウスにおいてより高かった（それぞれｐ＝０．００１およびｐ＝０．１０１）。
【０２３１】
表６：
【０２３２】
【表６】

ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１およびＨＰＶ５８に対する中和抗体の誘導
ＨＰＶ１６ Ｌ２ＳＡタンパク質またはＨＰＶ１６Ｌ１Ｌ２ ＶＬＰで免疫したマウス（群３〜５）は、異種ＨＰＶ型（ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１およびＨＰＶ５８）に対する中和抗体をいずれも発生しなかった（表６）。ＨＰＶ３１に対する低いレベルの中和抗体（ＧＭＴ８５）が、Ｌ１およびＬ２タンパク質の自己集合により得られたＨＰＶ１６ ＶＬＰに水酸化アルミニウムを加えた場合（群５）にだけ検出された。
【０２３３】
ＨＰＶ３１ Ｌ１またはＨＰＶ３１ Ｌ１Ｌ２ ＶＬＰおよびＨＰＶ３１ ＨＥＶ ＰｓＶで免疫したマウス（群８、１０および１１）において、相同ＨＰＶ３１中和抗体が検出され、それぞれ２，８００、３，４００および５，１９８のＧＭＴであった（図１９）。低い力価のＨＰＶ５８中和抗体は、ＨＰＶ３１ Ｌ１Ｌ２ ＶＬＰ（群１０）およびＨＥＶ ＯＲＦ２無関係遺伝子を含有するＨＰＶ３１偽ビリオン（群１１）を受けたマウスでのみ観察された。ＨＰＶ１８に対する中和抗体は、ＨＰＶ３１ワクチン調製物を受けた群８〜１１のマウスのいずれにおいても検出されなかった。
【０２３４】
高いレベルの相同中和抗体が、ＨＰＶ５８偽ビリオン（群１２および１３）で免疫したマウスにおいて検出され、それぞれ４，６５０および５，３８２のＧＭＴであった。低いレベルのＨＰＶ３１に対する中和抗体（ＧＭＴ＝５０）が、ＧＦＰをコードする偽ビリオンで免疫したマウスにおいて検出され、抗ＨＰＶ３１中和抗体の劇的な増加（７３３のＧＭＴで）が、ＨＰＶ３１ Ｌ２タンパク質をコードするＨＰＶ５８偽ビリオンで免疫したマウスにおいて観察された。ＨＰＶ１８に対する中和抗体は、ＨＰＶ５８ Ｌ２ ＰｓＶで免疫したマウスにおいてだけ、４００のＧＭＴで検出された。群１０、１２および１３からのマウスも、ＨＰＶ１６中和抗体について調査した。ＨＰＶ３１ Ｌ１Ｌ２ ＶＬＰで免疫したマウスは、低いレベルのＨＰＶ１６中和抗体を発生し、４０のＧＭＴであった。ＨＰＶ１６中和抗体は、ＧＦＰをコードするＨＰＶ５８ ＰｓＶで免疫したマウス（群１２）では検出されなかったが、Ｌ２をコードするＨＰＶ５８ ＰｓＶで免疫したマウス（群１３）では検出され、６０のＧＭＴであった。
【０２３５】
特許、特許出願ならびに科学出版物および参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物を被験体に送達する方法であって、該方法が、
被験体に、改変されたヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）様粒子を投与する工程であって
、該粒子が、免疫原性が変更された表面タンパク質を含むＨＰＶ様粒子にパッケージングされた１つ以上の異種化合物を含む工程、を含む方法。
【請求項２】
前記表面タンパク質が、改変されたＦＧループ配列を有する改変されたＬ１タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｌ１タンパク質が、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３４、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ７３またはＨＰＶ９１血清型の配列を有し、ここで、前記Ｌ１タンパク質の前記ＦＧループが、ヒト被験体中での、該タンパク質の免疫原性を変える１つ以上のアミノ酸変化を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記１つ以上のアミノ酸変化が、配列番号１１のＸ_１位〜Ｘ_１７位の１つ以上に存在する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｘ_１６位のアミノ酸が、変更されない、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
配列番号１１のＸ_１位、Ｘ_２位、Ｘ_３位、Ｘ_５位、Ｘ_６位、Ｘ_１１位およびＸ_１４位の１つ以上が改変される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
配列番号１１のＸ_１位、Ｘ_２位、Ｘ_３位、Ｘ_５位、Ｘ_６位、Ｘ_１１位およびＸ_１４位の２つ〜３つが改変される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
配列番号１１のＸ_１位、Ｘ_２位、Ｘ_３位、Ｘ_５位、Ｘ_６位、Ｘ_１１位およびＸ_１４位の４つ〜７つが改変される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
配列番号１１のＸ_１位、Ｘ_２位、Ｘ_３位、Ｘ_５位、Ｘ_６位、Ｘ_１１位およびＸ_１４位の３つが改変される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
配列番号１１のＸ_６位、Ｘ_１１位およびＸ_１４位が改変される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
配列番号１１のＸ_１位、Ｘ_２位、Ｘ_３位、Ｘ_５位、Ｘ_６位、Ｘ_１１位およびＸ_１４位の全てが改変される、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｌ１タンパク質が、配列番号１１のＸ_６位、Ｘ_１１位およびＸ_１４位にそれぞれＴ、ＴおよびＮへの変化を有し、配列番号１１の残りの位置においてはＨＰＶ１６血清型に特徴的なアミノ酸を有するＨＰＶ１６血清型の配列を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｌ１タンパク質が、配列番号１１のＸ_１位、Ｘ_２位、Ｘ_３位、Ｘ_５位、Ｘ_６位、Ｘ_１１位およびＸ_１４位にそれぞれＦ、Ｓ、Ｔ、Ｓ、Ｔ、ＴおよびＮへの変化を有し、配列番号１１の残りの位置においてはＨＰＶ１６血清型に特徴的なアミノ酸を有するＨＰＶ１６血清型の配列を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記１つ以上の化合物が、治療薬または医療用薬剤である、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記治療薬が、核酸または小分子である、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記治療薬が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡをコードする核酸である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、ＨＰＶ−Ｅ６および／またはＨＰＶ−Ｅ７を標的にする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記小分子が、抗ウイルス剤である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記小分子が、抗がん剤である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記小分子が、ゲムシタビンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＨＰＶ様粒子が、さらなる薬剤とともに投与される、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記さらなる薬剤が、抗ウイルス剤である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記さらなる薬剤が、抗がん剤である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記さらなる薬剤が、ゲムシタビンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
医療用化合物が、撮像剤または造影剤である、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記ＨＰＶ様粒子が、前記表面タンパク質の前記血清型に対する中和免疫応答を有さない被験体に投与される、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記被験体が、前記表面タンパク質の前記血清型に対して免疫されていない、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記被験体が、前記ＨＰＶ様粒子における前記表面タンパク質の前記血清型と同じ血清型を有するＨＰＶに感染していない、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記被験体の前記免疫応答が、投与のためのＨＰＶ様粒子を選択する前に評価される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＨＰＶ様粒子が、粘膜組織に投与される、請求項１〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記ＨＰＶ様粒子が、表皮部に投与される、請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記粘膜組織が、子宮頚部組織である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＨＰＶ様粒子が、局所投与される、請求項１〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記ＨＰＶ様粒子が、静脈内投与される、請求項１〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記ＨＰＶ様粒子が、ウイルスに感染した組織に投与される、請求項１〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記ウイルスが、ＨＰＶである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ウイルスが、ヘルペスウイルスである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記ウイルスが、ＨＳＶである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記化合物が、抗ウイルス化合物である、請求項３５から３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記化合物が、ｓｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、またはウイルスＲＮＡを標的にするアンチセンスＲＮＡである、請求項３５から３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記化合物が、ｓｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、またはウイルスＲＮＡを標的にするアンチセンスＲＮＡを発現するプラスミドである、請求項３５から３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記ＨＰＶ様粒子が、ＨＰＶ感染と関連する癌を有する被験体に投与される、請求項１〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
前記ＨＰＶ様粒子が、ＨＰＶ感染と関連するウイルス感染を有する被験体に投与される、請求項１〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記ウイルス感染が、ＨＳＶ感染である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＨＰＶ様粒子が、ＨＰＶ感染と関連する細菌感染または寄生生物感染を有する被験体に投与される、請求項１〜４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
免疫系不全を有する被験体における皮膚状態を治療する方法であって、
該方法が、請求項１〜４５のいずれかに記載の組成物を、免疫系不全を有する被験体の皮膚感染部位に投与する工程であって、
該組成物が、該皮膚感染を治療するための薬剤を含む工程、を含む方法。
【請求項４７】
前記免疫系不全が、ＨＩＶ感染と関連する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記皮膚感染が、ウイルス、細菌、微生物または寄生生物による感染である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
がんを有する被験体に、請求項１〜４８のいずれかに記載の局所用組成物を投与する工程であって、該組成物が、該がんの成長または発達を低減するために効果的な化合物を含み、該組成物が、投与部位で非特異的免疫応答を促進するための組成物とともに投与される工程、を含む方法。
【請求項５０】
がんを有する被験体に、請求項１〜４９のいずれかに記載の局所用組成物を投与する工程であって、該組成物が、該がんの成長または発達を低減するために効果的な化合物を含み、異なる血清型を有する２つ以上の異なるＨＰＶ表面タンパク質が、投与部位で免疫応答を促進するために投与される工程、を含む方法。
【請求項５１】
化合物を被験体に投与する方法であって、該方法が、
化合物を含む第１ＨＰＶ様粒子を被験体に第１期間投与する工程と、
前記化合物を含む第２ＨＰＶ様粒子を前記被験体に第２期間投与する工程と
を含み、ここで、該第１および第２ＨＰＶ様粒子が、異なる血清型を有する、方法。
【請求項５２】
前記第１および第２ＨＰＶ様粒子の前記血清型が、独立して、天然に存在する血清型であるかまたは変更された血清型である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記第１および／または第２ＨＰＶ様粒子の前記血清型が、キメラ血清型である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
被験体におけるＨＰＶ関連子宮頚がんを治療する方法であって、
ＨＰＶ関連子宮頚がんを有する被験体に、該ＨＰＶ関連子宮頚がんを治療するために十分な量で１つ以上の治療薬を含むＨＰＶ様粒子を投与する工程
を含む方法。
【請求項５５】
前記ＨＰＶ様粒子が、局所投与される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＨＰＶ様粒子が、子宮頚部上皮などの上皮にもしくはその近接部に局所的に、または子宮頚部もしくは肛門の上皮癌などの上皮病変にもしくはその近接部に局所的に投与される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
改変されたヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）様粒子を含む、化合物を被験体に送達するための組成物であって、ここで、該粒子が、免疫原性が変更された表面タンパク質を含むＨＰＶ様粒子にパッケージングされた１つ以上の異種化合物を含む、組成物。
【請求項５８】
カプシドタンパク質が、Ｌ１タンパク質である、請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
前記Ｌ１タンパク質が、改変されたＦＧループ配列を有する、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６０】
前記Ｌ１タンパク質が、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３４、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ７３またはＨＰＶ９１血清型の配列を有し、ここで、前記Ｌ１タンパク質の前記ＦＧループが、ヒト被験体中での、該タンパク質の免疫原性を変える１つ以上のアミノ酸変化を有する、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６１】
前記１つ以上のアミノ酸変化が、配列番号１１のＸ_１位〜Ｘ_１７位の１つ以上に存在する、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６２】
Ｘ_１６位のアミノ酸が、変更されない、請求項５９から６１のいずれかに記載の組成物。
【請求項６３】
配列番号１１のＸ_１位、Ｘ_２位、Ｘ_３位、Ｘ_５位、Ｘ_６位、Ｘ_１１位およびＸ_１４位の１つ以上が改変される、請求項５９から６１のいずれかに記載の組成物。
【請求項６４】
配列番号１１のＸ_１位、Ｘ_２位、Ｘ_３位、Ｘ_５位、Ｘ_６位、Ｘ_１１位およびＸ_１４位の２つ〜３つが改変される、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６５】
配列番号１１のＸ_１位、Ｘ_２位、Ｘ_３位、Ｘ_５位、Ｘ_６位、Ｘ_１１位およびＸ_１４位の４つ〜７つが改変される、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６６】
配列番号１１のＸ_１位、Ｘ_２位、Ｘ_３位、Ｘ_５位、Ｘ_６位、Ｘ_１１位およびＸ_１４位の３つが改変される、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６７】
配列番号１１のＸ_６位、Ｘ_１１位およびＸ_１４位が改変される、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６８】
配列番号１１のＸ_１位、Ｘ_２位、Ｘ_３位、Ｘ_５位、Ｘ_６位、Ｘ_１１位およびＸ_１４位の全てが改変される、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６９】
前記Ｌ１タンパク質が、配列番号１１のＸ_６位、Ｘ_１１位およびＸ_１４位にそれぞれＴ、ＴおよびＮへの変化を有し、配列番号１１の残りの位置においてはＨＰＶ１６血清型に特徴的なアミノ酸を有するＨＰＶ１６血清型の配列を有する、請求項６７に記載の組成物。
【請求項７０】
前記Ｌ１タンパク質が、配列番号１１のＸ_１位、Ｘ_２位、Ｘ_３位、Ｘ_５位、Ｘ_６位、Ｘ_１１位およびＸ_１４位にそれぞれＦ、Ｓ、Ｔ、Ｓ、Ｔ、ＴおよびＮへの変化を有し、配列番号１１の残りの位置においてはＨＰＶ１６血清型に特徴的なアミノ酸を有するＨＰＶ１６血清型の配列を有する、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７１】
前記１つ以上の化合物が、治療薬または医療用薬剤である、請求項５７に記載の組成物。
【請求項７２】
前記治療薬が、核酸または小分子である、請求項７１に記載の組成物。
【請求項７３】
前記治療薬が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡをコードする核酸である、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７４】
前記ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡが、ＨＰＶ−Ｅ６および／またはＨＰＶ−Ｅ７を標的にする、請求項７３に記載の組成物。
【請求項７５】
前記小分子が、抗ウイルス剤である、請求項７２に記載の組成物。
【請求項７６】
前記小分子が、抗がん剤である、請求項７５に記載の組成物。
【請求項７７】
前記小分子が、ゲムシタビンである、請求項７５に記載の組成物。
【請求項７８】
前記ＨＰＶ様粒子が、Ｌ１タンパク質またはＬ１タンパク質およびＬ２タンパク質を含む、請求項５７に記載の組成物。
【請求項７９】
前記表面タンパク質が、キメラであり、Ｌ１ループに融合されたＬ２配列を含む、請求項５７に記載の組成物。
【請求項８０】
Ｌ２配列が、Ｌ１粒子の表面に結合している、請求項５７に記載の組成物。
【請求項８１】
前記Ｌ２配列が、ＨＰＶ３１ Ｌ２タンパク質の残基１３〜８８である、請求項７９または８０に記載の組成物。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６Ａ】

【図１６Ｂ】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【公表番号】特表２０１２−５２３４５５（Ｐ２０１２−５２３４５５Ａ）
【公表日】平成２４年１０月４日（２０１２．１０．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０５８５８（Ｐ２０１２−５０５８５８）
【出願日】平成２１年７月２４日（２００９．７．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００４２９９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２０２６６
【国際公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り　
【出願人】（５０９３０２３６４）インサーム（インスティテュート　ナショナル　デ　ラ　セント　エ　ドゥ　ラ　ルシェルシュ　メディカル） (3)
【出願人】（５１１２４７３２３）
【Ｆターム（参考）】