ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防・治療剤およびアポトーシス促進剤
【課題】ＨＴＬＶ−Ｉに感染した細胞を標的とし、ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の根本的な予防および治療に有用なＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防または治療剤、ならびにＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤を提供するものである。
【解決手段】本発明のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防または治療剤は、アリシンまたはその類縁体を有効成分として含有する。本発明のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤は、アリシンまたはその類縁体を有効成分として含有し、ＨＴＬＶ−Ｉに感染した細胞に対して選択的にアポトーシスを誘引させる。
【解決手段】本発明のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防または治療剤は、アリシンまたはその類縁体を有効成分として含有する。本発明のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤は、アリシンまたはその類縁体を有効成分として含有し、ＨＴＬＶ−Ｉに感染した細胞に対して選択的にアポトーシスを誘引させる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防または治療剤、および、ＨＴＬＶ−Ｉに感染した細胞のアポトーシス促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症（以下、「ＨＡＭ」とも呼ぶ）は、末梢血ＨＴＬＶ−Ｉ感染ＣＤ４陽性Ｔ細胞が脊髄の中に浸潤することによって惹起される慢性脊髄炎の病理像を呈する難治性神経疾患である。この疾患の原因となるウイルスは、ＨＴＬＶ−Ｉというレトロウイルスであり、垂直感染（特に、授乳感染）、血液感染、性感染などによって感染する。ＨＡＭの症状は、胸髄の側索を走行する錐体路が侵されることによる、歩行障害、排尿障害などである。
【０００３】
従来、ＨＡＭの治療法としては、プレドニゾロンやインターフェロン−αの投与、血液浄化方法などが利用されてきた（非特許文献１〜３参照）。しかしながら、これらの治療法はいずれも免疫修飾療法を中心とした対症療法であり、本疾患の原因であるＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞の排除を行うものではない。それゆえ、これらの治療法は、ＨＡＭの根本的な治療方法ではなく、一時的には効果を発揮しても、病状の進行を止めることはできない。
【０００４】
ＨＡＭの患者は、カリブ海諸国、西アフリカ、東南アジアなどに多く、日本では特に九州地区に多い。現在、その患者数は日本で１５００人程度、世界で５０００人程度と考えられているが、ＨＴＬＶ−Ｉのキャリアは、世界で１０００万人〜２０００万人といわれている。そのため、ＨＡＭに対する根治療法の開発が望まれている。
【非特許文献１】Osame M. et al., Chronic progressive myelopathy associated with elevated antibodies to human T-lymphotropic virus type I and adult T-cell leukemia-like cells. Ann Neurol 1987;21:117-122.
【非特許文献２】Shibayama K. et al., Interferon-alpha treatment in HTLV-I-associated myelopathy: Studies of clinical and immunological aspects. J Neurol Sci 1991;106:186-192.
【非特許文献３】Matsuo H. et al., Plasmapheresis in treatment of human T-lymphotropic virus type-I associated myelopathy. Lancet 1988;ii:1109-1113.
【非特許文献４】西浦義博ら、臨床神経学、日本神経学会発行、2005;45:1041
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記の課題に基づいてなされたものであり、ＨＴＬＶ−Ｉに感染した細胞を標的とし、ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の根本的な予防および治療に有用なＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防または治療剤（以下、予防・治療剤ともいう）、ならびにＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討した。
先ず、本願発明者らは、ニンニク（Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖａｍ）から抽出されるアリシン（ｄｉａｌｌｙｌ−ｔｈｉｏｓｕｌｆｉｎａｔｅ）に着目した。アリシンは、下記の式（３）で表される有機硫黄化合物であるが、抗腫瘍効果、抗細菌・抗真菌効果、抗血栓効果などの多彩な生理学的作用を有することが知られている。
【０００７】
【化１】
【０００８】
本願発明者らは、比較的低濃度のアリシンまたはその類縁体処理によって、ＨＡＭ患者由来ＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞株が傷害を受けることを確認し、かかる知見に基づき、さらに検討を進めた結果、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、以下の通りである。
〔１〕アリシンまたはその類縁体を有効成分として含有する、ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防または治療剤。
〔２〕アリシン類縁体が、その構造中に下記一般式（１）
【００１０】
【化２】
【００１１】
（式中、Ｒは、置換されていてもよい飽和または不飽和の鎖状炭化水素基）で表される基を有するアリシン以外の化合物である、上記〔１〕に記載のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防または治療剤。
〔３〕アリシン類縁体が、アリシンを原料として製造される物質である、上記〔１〕に記載のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防または治療剤。
〔４〕アリシン類縁体が、下記一般式（２）
【００１２】
【化３】
【００１３】
（式中、Ｒは、置換されていてもよい飽和または不飽和の鎖状炭化水素基）で表されるチアミン化合物、または、その製薬上許容されうる塩である、上記〔１〕に記載のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防または治療剤。
〔５〕アリシン類縁体がプロスルチアミンである、上記〔１〕に記載のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防または治療剤。
〔６〕アリシンまたはその類縁体を有効成分として含有する、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤。
〔７〕アリシン類縁体が、その構造中に下記一般式（１）
【００１４】
【化４】
【００１５】
（式中、Ｒは、置換されていてもよい飽和または不飽和の鎖状炭化水素基）で表される基を有するアリシン以外の化合物である、上記〔６〕に記載のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤。
〔８〕アリシン類縁体が、アリシンを原料として製造される物質である、上記〔６〕に記載のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤。
〔９〕アリシン類縁体が、下記一般式（２）
【００１６】
【化５】
【００１７】
（式中、Ｒは、置換されていてもよい飽和または不飽和の鎖状炭化水素基）で表されるチアミン化合物、または、その製薬上許容されうる塩である、上記〔６〕に記載のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤。
〔１０〕アリシン類縁体がプロスルチアミンである、上記〔６〕に記載のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防・治療剤は、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシスを誘引するアリシンまたはその類縁体を有効成分として含有する。そのため、本発明のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防・治療剤をＨＡＭ患者あるいはＨＴＬＶ−Ｉのキャリアに投与すれば、投与対象の末梢血からＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞を安全な方法によって選択的に除去することができる。
したがって、本発明のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防・治療剤によれば、従来、有効な治療方法が見出されていなかったＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の根本治療を行うことができると考えられる。さらには、全世界において約１０００万人〜約２０００万人存在しているといわれるＨＴＬＶ−ＩキャリアからのＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞の排除にも貢献できると考えられるため、ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の発症予防にも有効である。
【００１９】
また、本発明のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤は、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞特異的にアポトーシスを誘引させることができる。そのため、本発明のアポトーシス促進剤をＨＡＭ患者あるいはＨＴＬＶ−Ｉのキャリアに投与すれば、投与対象の末梢血からＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞を安全な方法によって選択的に除去することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の内容を詳細に説明する。
（１）ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防または治療剤
本発明のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防または治療剤は、アリシンまたはその類縁体を有効成分として含有する。
本発明にかかる予防・治療剤に有効成分として含まれるアリシンは、ニンニク、ニラ、ラッキョウ、ギョウジャニンニクなどに含まれる有機硫黄化合物であり、下記式（３）で表される構造を有する。
【００２１】
【化６】
【００２２】
本発明の予防・治療剤に用いられるアリシンは、ニンニク、ニラ、ラッキョウ、ギョウジャニンニクなどから、自体公知の方法により、抽出・精製することによって取得することができる。また、試薬として販売されているアリシン（ＬＴＫ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ（発売元：和光純薬））を使用することもできる。
【００２３】
また、本発明の予防・治療剤に含まれる有効成分は、アリシン類縁体であってもよい。本発明において、アリシン類縁体とは、その骨格中にアリシンと類似する構造を有するもののことをいう。上記アリシン類縁体としては、その構造中に下記一般式（１）
【００２４】
【化７】
【００２５】
（式中、Ｒは、置換されていてもよい飽和または不飽和の鎖状炭化水素基）で表される基を有するもの（但し、アリシンを除く）を挙げることができる。このようなアリシン類縁体の中でも特に、図１（ａ）に示すアリシンの構造中破線で囲んだ領域を有するもの、あるいは、アリシンを原料として製造される物質であることが好ましい。
【００２６】
また、アリシン類縁体としては、下記の一般式（２）
【００２７】
【化８】
【００２８】
（式中、Ｒは、置換されていてもよい飽和または不飽和の鎖状炭化水素基）で表されるチアミン化合物、または、その製薬上許容されうる塩であることが好ましい。
【００２９】
ここで、上記一般式（１）および（２）におけるＲ（すなわち、置換されていてもよい飽和または不飽和の鎖状炭化水素基）は、直鎖状であっても分枝状であってもよい。該炭化水素基としては、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアルケニル基、置換されていてもよいアルキニル基が挙げられる。
【００３０】
置換されていてもよいアルキル基におけるアルキル基としては、例えば炭素数１〜１０の直鎖または分枝状のアルキル基が挙げられる。該アルキル基の具体例としては、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなどが挙げられる。この中で炭素数１〜７の直鎖または分枝状のアルキル基が好ましい。さらに炭素数１〜５の直鎖状のアルキル基がより好ましく、プロピル基が最も好ましい。
【００３１】
該アルキル基における置換基としては、例えばハロゲン、ニトロ、アミノ基（アシル基、アルキル基等を１〜２個置換基として有していてもよい。）、シアノ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミジノ基、グアニジノ基、カルバモイル基などが挙げられる。
【００３２】
置換されていてもよいアルケニル基におけるアルケニル基としては、例えば炭素数２〜１６の直鎖状あるいは分枝状アルケニル基がよい。該アルケニル基の具体例としては、例えば、ビニル、アリル（allyl）、クロチル、２−ペンテン−１−イル、３−ペンテン−１−イル、２−ヘキセン−１−イル、３−ヘキセン−１−イル、２−メチル−２−プロペン−１−イル、３−メチル−２−ブテン−１−イル等が挙げられる。この中で炭素数２〜７の直鎖状あるいは分枝状のアルケニル基が好ましい。さらに炭素数２〜５の直鎖状のアルケニル基がより好ましく、アリル基が最も好ましい。
【００３３】
該アルケニル基における置換基としては、例えばハロゲン、ニトロ、アミノ基（アルキル基、アシル基等を１〜２個置換基として有していてもよい。）、シアノ基、アミジノ基、グアニジノ基などの基が挙げられる。上記アルケニル基は二重結合に関する異性体（Ｅ、Ｚ体）を包含する。
【００３４】
置換されていてもよいアルキニル基におけるアルキニル基としては、例えば炭素数２〜１６の直鎖状あるいは分枝状アルキニル基がよい。該アルキニル基の具体例としては、炭素数２〜６のアルキニル基（例、エチニル、プロパルギル、２−ブチン−１−イル、３−ブチン−２−イル、１−ペンチン−３−イル、３−ペンチン−１−イル、４−ペンチン−２−イル、３−ヘキシン−１−イルなど）が挙げられる。
【００３５】
該アルキニル基における置換基としては、例えばハロゲン、ニトロ、アミノ基（アルキル基、アシル基等を１〜２個置換基として有していてもよい。）、シアノ基、アミジノ基、グアニジノ基などの基が挙げられる。
【００３６】
本発明で用いられる上記一般式（２）で表されるチアミン化合物は、自体公知の方法（例えば、ビタミンＢ総合研究委員会：ビタミン 6(4) 607 (1953)、特許第２６８５５１４号公報に記載の方法およびそれらに準じた方法）により、例えば、チオール型ビタミンＢ１およびアリシンなどを原料として製造される。
【００３７】
本発明で用いられるチアミン化合物の塩は、好ましくは製薬上許容されうる塩として用いられる。製薬上許容されうる塩としては、無機塩基との塩、有機塩基との塩、塩基性アミノ酸との塩などが用いられる。用いられる無機塩基としては、例えばアルカリ金属（例、ナトリウム、カリウムなど）、アルカリ土類金属（例、カルシウム、マグネシウムなど）などが、有機塩基としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、ジシクロヘキシルアミンなどが、塩基性アミノ酸としては例えばアルギニン、リジンなどが挙げられる。これらの塩は、自体公知の方法により製造することができる。
【００３８】
また、上記アリシン類縁体として、より具体的には下記式（４）で表されるプロスルチアミンが挙げられる。
【００３９】
【化９】
【００４０】
本発明のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防または治療剤は、低毒性であり安全に用いられる。特に、本発明の剤に含まれるアリシン類縁体がプロスルチアミンであれば、当該物質は既に人体に対する安全性が確認されているものであるため、安全に使用することができる。また、アリシンは非常に不安定な物質であるが、プロスルチアミンは安定した物質であるため、生体への安定した投与が可能となる。
【００４１】
本発明の剤は、温血哺乳動物（例、ヒト、サル、ウマ、ウシ、イヌ、マウス等）、好ましくはヒトに投与し、ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防や治療に用いることができる。
【００４２】
本発明の予防・治療剤の投与量は、本発明で用いられるアリシンまたはアリシン類縁体の有効量であればよい。例えば有効成分としてアリシンが含まれる場合には、成人（体重５０ｋｇ）１人にアリシンとして約０.５ｍｇ〜５００ｍｇ／日、好ましくは、約１ｍｇ〜５０ｍｇ／日、特に好ましくは、約５ｍｇ〜３０ｍｇ／日である。なお、有効成分としてプロスルチアミンが含まれる場合には、本発明の予防・治療剤の投与量は、成人（体重５０ｋｇ）１人にプロスルチアミンとして約０.５ｍｇ〜１０００ｍｇ／日、好ましくは、約１０ｍｇ〜５００ｍｇ／日、特に好ましくは、約３０ｍｇ〜１００ｍｇ／日である。
【００４３】
本発明の予防・治療剤は、種々の剤形を取り得る。該剤形としては、経口投与製剤（例、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤等）、非経口投与製剤（例、注射剤等）などが挙げられる。
【００４４】
たとえば経口投与製剤にするには、自体公知の方法に従い、上記のアリシンまたはアリシン類縁体を、たとえば賦形剤（例、乳糖、白糖、デンプンなど）、崩壊剤（例、デンプン、炭酸カルシウムなど）、結合剤（例、デンプン、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロースなど）または滑沢剤（例、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール６０００など）などを添加して圧縮成形し、次いで必要により味のマスキング、腸溶性あるいは持続性の目的のため自体公知の方法でコーティングすることにより経口投与製剤とすることができる。そのコーティング剤としては、例えば一般のフィルム形成コーティング剤（例、ヒドロキシプロピルメチルセルロース〔ＴＣ−５、信越化学工業（株）〕、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリオキシエチレングリコール等）、ツイーン８０、プルロニックＦ６８、腸溶性コーティング剤（例、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシメチルセルロースアセテートサクシネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、メチルメタクリレート・メタクリル酸共重合体〔オイドラギット（ローム社製、ドイツ）〕、メチルアクリレート・メタクリル酸共重合体等）、色素（例、酸化チタン、ベンガラ、タルク）などが用いられる。腸溶性コーティングを行う場合、活性成分を含む中心核と腸溶皮膜との間に、自体公知の方法に従い、上記フィルム形成コーティング剤で一層又は二層以上の中間層を設けることも有効である。
【００４５】
また、本発明の予防・治療剤は、注射剤として非経口的に投与することも有効である。該注射剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。
【００４６】
本発明の予防・治療剤が注射剤の剤形で投与される場合、当該剤に含まれるアリシンまたはアリシン類縁体の量は、約０.１〜５０ｍｇ、好ましくは約２〜２０ｍｇである。なお、本発明の予防・治療剤を注射剤としてヒトに投与した場合、アリシンまたはアリシン類縁体が血中濃度で０．５〜１００μＭとなるように、好ましくは５〜５０μＭとなるように、剤の濃度を調整してもよい。
【００４７】
本発明の予防・治療剤は、他の薬剤と併用してもよく、かかる薬剤としては、従来ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の対症療法として投与されてきたプレドニゾロン、ＩＦＮ−α、ビタミンＣなどが挙げられる。
【００４８】
本発明のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防・治療剤は、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシスを誘引するアリシンまたはその類縁体を有効成分として含有する。そのため、本発明のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防・治療剤をＨＡＭ患者あるいはＨＴＬＶ−Ｉのキャリアに投与すれば、投与対象の末梢血からＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞を安全な方法によって選択的に除去することができる。
【００４９】
そして、本発明のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防・治療剤によれば、従来、有効な治療方法が見出されていなかったＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の根本治療を行うことができると考えられる。さらには、全世界において約１０００万人〜約２０００万人存在しているといわれるＨＴＬＶ−ＩキャリアからのＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞の排除にも貢献できると考えられるため、ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の発症予防にも有効である。また、後述の実施例から明らかなように、本発明のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防・治療剤は、末梢血ＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス量を減少させる。従って、本発明のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防・治療剤は、抗ウイルス薬としても有用である。
【００５０】
（２）ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤
本発明のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤は、アリシンまたはその類縁体を有効成分として含有する。ここで、「ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシスの促進剤」とは、ＨＴＬＶ−Ｉに感染した細胞に特異的（選択的）にアポトーシスを誘引させる剤のことをいう。
【００５１】
本発明にかかるアポトーシス促進剤に含まれるアリシンおよびアリシン類縁体としては、上述した本発明の予防・治療剤に含まれるアリシンおよびアリシン類縁体をそれぞれ同様に使用することが可能であるため、ここではその説明を省略する。
【００５２】
本発明のアポトーシス促進剤は、温血哺乳動物（例、ヒト、サル、ウマ、ウシ、イヌ、マウス等）、好ましくはヒトに投与し、ＨＴＬＶ−Ｉに起因する感染症の予防や治療に用いることができる。また、本発明のアポトーシス促進剤は、低毒性であり安全に用いられる。特に、本発明の剤に含まれるアリシン類縁体がプロスルチアミンであれば、当該物質は既に人体に対する安全性が確認されているものであるため、安全に使用することができる。
【００５３】
また、本発明のアポトーシス促進剤は、種々の細胞を含む細胞培養系からＨＴＬＶ−Ｉに感染した細胞を選択的に除去するために使用することもできる。
【００５４】
本発明のアポトーシス促進剤は、種々の剤形を取り得る。該剤形としては、経口投与製剤（例、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤等）、非経口投与製剤（例、注射剤等）などが挙げられる。該剤形のより具体的な例としては、上述の予防・治療剤と同様のものを挙げることができる。
【００５５】
本発明のアポトーシス促進剤の投与量は、本発明で用いられるアリシンまたはアリシン類縁体の有効量であればよい。例えば有効成分としてアリシンが含まれる場合には、成人（体重５０ｋｇ）１人にアリシンとして約０.５ｍｇ〜５００ｍｇ／日、好ましくは、約１ｍｇ〜５０ｍｇ／日、特に好ましくは、約５ｍｇ〜３０ｍｇ／日である。なお、有効成分としてプロスルチアミンが含まれる場合には、本発明のアポトーシス促進剤の投与量は、成人（体重５０ｋｇ）１人にプロスルチアミンとして約０.５ｍｇ〜１０００ｍｇ／日、好ましくは、約１０ｍｇ〜５００ｍｇ／日、特に好ましくは、約３０ｍｇ〜１００ｍｇ／日である。
【００５６】
本発明のアポトーシス促進剤が注射剤の剤形で投与される場合、当該剤に含まれるアリシンまたはアリシン類縁体の量は、約０.１〜５０ｍｇ、好ましくは約２〜２０ｍｇである。なお、本発明のアポトーシス促進剤を注射剤としてヒトに投与した場合、アリシンまたはアリシン類縁体が血中濃度で０．５〜１００μＭとなるように、好ましくは５〜５０μＭとなるように、剤の濃度を調整してもよい。
【００５７】
本発明のアポトーシス促進剤は、他の薬剤と併用してもよく、かかる薬剤としては、プレドニゾロン、ＩＦＮ−α、ビタミンＣなどが挙げられる。
【００５８】
本発明のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤は、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞特異的にアポトーシスを誘引させることができる。そのため、本発明のアポトーシス促進剤をＨＡＭ患者あるいはＨＴＬＶ−Ｉのキャリアに投与すれば、投与対象の末梢血からＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞を安全な方法によって選択的に除去することができる。従って、本発明のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤は、ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防・治療剤として有用である。また、後述の実施例から明らかなように、本発明のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤は、末梢血ＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス量を減少させる。従って、本発明のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤は、抗ウイルス薬としても有用である。
【実施例】
【００５９】
以下に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６０】
１．アリシンおよびプロスルチアミンによるＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症患者ＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞の選択的除去に向けての基礎的検討
【００６１】
〔実験の目的〕
本実施例では、ＨＡＭに対する根治療法開発へ向けた基礎的検討という観点から、アリシン（上記式（３）または図１（ａ）の化合物）、プロスルチアミン（上記式（４）または図１（ｂ）の化合物）、および、フルスルチアミン（図１（ｃ）の化合物）を使用し、以下の解析を行なった。１）ＨＡＭ患者由来ＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞株に対する傷害性を種々のＨＴＬＶ−Ｉ感染および非感染Ｔ細胞株と比較検討すると共に、そのメカニズムについて解析した。２）ＨＡＭ患者培養末梢血ＣＤ４陽性Ｔ細胞中のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞に対する除去効果について、ＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス量を目安に解析した。
【００６２】
〔対象〕
ＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞株としてＨＡＭ患者由来ＨＣＴ−１、ＨＣＴ−４、ＡＴＬ患者由来ＫＯＢ、臍帯血由来ＭＴ−１、ＭＴ−２を使用し、ＨＴＬＶ−Ｉ非感染Ｔ細胞株としてＪｕｒｋａｔ細胞を使用した。また、末梢血での検討では、ＨＡＭ患者末梢血ＣＤ４陽性Ｔ細胞を使用した。
【００６３】
〔実施例１〕アリシン、プロスルチアミン、およびフルスルチアミンの各種細胞株に対する傷害性の評価
各種細胞株を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で、種々の濃度のアリシンまたはプロスルチアミンまたはフルスルチアミン存在下で２４時間培養後、ＭＴＳａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を行なった。細胞傷害性の評価は、％ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ（アリシン処理時のＯＤ値／アリシン非処理時のＯＤ値の平均値）で行なった。
【００６４】
その結果を、図２（ａ）〜（ｃ）に示す。図２（ａ）に示すように、アリシン処理によって用量依存性に各種細胞株は傷害を受け、細胞生存率は低下した。それぞれをＬＤ５０で表した場合、それぞれのアリシン濃度はＨＣＴ−１：７．０、ＨＣＴ−４：７．５、ＫＯＢ：１１．５、ＭＴ−１：１２．５、ＭＴ−２：４４．６、Ｊｕｒｋａｔ：２２．２μＭであり、ＨＡＭ患者由来ＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞株（ＨＣＴ−１、ＨＣＴ−４）で低値を示し、両者の細胞株は２０μＭアリシン処理でほぼ完全に死滅した。
【００６５】
図２（ｂ）に示すように、ＨＣＴ−１およびＨＣＴ−４は４０μＭのプロスルチアミン処理によってもほぼ完全に死滅したが、ＭＴ−２やＪｕｒｋａｔでは細胞傷害に対してやや抵抗性を示し、これらの細胞株でみた場合、用量依存性の生存曲線はアリシン処理時とほぼ同様の傾向を示した。
一方、プロスルチアミンとフルスルチアミンによるＨＣＴ−１およびＨＣＴ−４に対する傷害効果を比較した場合、図２（ｃ）に示すように、フルスルチアミンは両者の細胞株に対してほとんど傷害を及ぼさなかった。なお、図２（ｃ）において、プロスルチアミン処理をＰ／ＨＣＴ−１、Ｐ／ＨＣＴ−４と示し、フルスルチアミン処理をＦ／ＨＣＴ−１、Ｆ／ＨＣＴ−４と示す。
【００６６】
〔実施例２〕細胞傷害の機序の解析
（１）ミトコンドリア膜電位の低下：ＨＣＴ−１およびＨＣＴ−４を２０μＭアリシンまたは溶媒存在下で２４時間培養後、電位感受性蛍光色素（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅ）ＤｉＯＣ６（３）で染色し、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で解析した。
その結果を、図３（ａ）および（ｂ）に示す。図に示すように、ＨＣＴ−１、ＨＣＴ−４ともに、２０μＭアリシン処理によってほとんどの細胞でミトコンドリア膜電位の低下がみられ、細胞傷害はアポトーシスによることが明らかにされた。
【００６７】
（２）ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ処理による細胞生存率（ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）の変化：ＨＣＴ−１をｐａｎ−ｃａｓｐａｓｅ阻害剤である１００μＭ ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋで前処理後、１０μＭアリシン存在下で２４時間培養した。培養後、ＭＴＳａｓｓａｙにおいて細胞生存率（ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）の変化を検討した。
その結果を図４に示す。図に示すように、細胞のアポトーシスがカスパーゼ依存性か非依存性かを解析するために行なったｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによる前処理によって、１０μＭアリシン処理によるＨＣＴ−１の細胞生存率（ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）が有意に上昇した。
【００６８】
〔実施例３〕ｐ３８ ＭＡＰＫおよび活性化カスパーゼ−３（ｃａｓｐａｓｅ−３）のウエスタンブロット解析
ＨＣＴ−１を、２０μＭアリシンまたは溶媒存在下に、１時間および３時間培養した。細胞抽出物（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）を作製し、ｐ３８ ＭＡＰＫのウエスタンブロット解析を行なった。また、ＨＣＴ−１を、１０μＭおよび２０μＭプロスルチアミンまたは溶媒存在下に、１時間および３時間培養した。細胞抽出物（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）を作製し、ｐ３８ ＭＡＰＫのウエスタンブロット解析を行なった。また、ＨＣＴ−１を２０μＭアリシン、２０μＭプロスルチアミン、または溶媒存在下に、６時間および１２時間培養した。細胞抽出物（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）を作製し、活性化の過程（ｐｒｏｃｅｓｓ）でｃｌｅａｖａｇｅされるカスパーゼ−３の存在の有無をウエスタンブロットにて解析した。
【００６９】
その結果を、図５〜図７に示す。図５に示すように、ＨＣＴ−１のｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ−ｐ３８ ＭＡＰＫ（図中、Ｐ−ｐ３８ ＭＡＰＫと示す）は、２０μＭアリシン処理によって顕著にｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅされた。図６に示すように、２０μＭプロスルチアミン処理によってもほぼ同様の結果が得られた。さらに、図７に示すように、２０μＭアリシンまたはプロスルチアミン処理によってｃｌｅａｖａｇｅされたカスパーゼ−３の存在が明らかにされた。
【００７０】
〔実施例４〕アリシンおよびプロスルチアミン処理によるＨＡＭ患者末梢血ＣＤ４陽性Ｔ細胞中のＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス量の変化
末梢血ＣＤ４陽性Ｔ細胞でのＭＴＳａｓｓａｙにおいて細胞傷害性が生じない５μＭおよび１０μＭアリシン存在下、または溶媒（ｖｅｈｉｃｌｅ）存在下に、末梢血ＣＤ４陽性Ｔ細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で２４時間培養した。また、５μＭプロスルチアミンまたは溶媒（ｖｅｈｉｃｌｅ）存在下に、末梢血ＣＤ４陽性Ｔ細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で４８時間培養した。細胞回収後、Annexin V MicroBead Kits(Miltenyi Biotec)を使用し、アポトーシス細胞を除去した。その後、細胞ペレット（ｃｅｌｌ ｐｅｌｌｅｔ）からＤＮＡを抽出し、ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）による定量ＰＣＲ（プライマー：ＨＴＬＶ−Ｉ ｔａｘ、β−アクチン)を施行し、スタンダードとして用いたＭＴ−２中のＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス量を１細胞あたり２．２コピーとして、ＣＤ４陽性Ｔ細胞１０４個あたりのプロウイルス量を算出した。
【００７１】
その結果を、図８および図９に示す。図８（ａ）に示すように、８例のＨＡＭ患者全例の末梢血ＣＤ４陽性Ｔ細胞において、５μＭアリシン処理によって、ＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス量は、溶媒処理の場合に比較して２４．６−７３．１％（平均：５４．８％）にまで減少した。また、図８（ｂ）に示すように、１０μＭのアリシン処理を行った場合にも、ＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス量は、溶媒処理の場合に比較して２８．５−９２．８％（平均：６１％）にまで減少した。一方、図９に示すように、５μＭのプロスルチアミン処理によっても、７例のＨＡＭ患者全例の末梢血ＣＤ４陽性Ｔ細胞において、ＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス量は、溶媒処理の場合に比較して２９．９−８０．２％（平均：６０．７％）にまで減少した。
【００７２】
〔結果〕
以上の実施例によって、アリシンは比較的低濃度でＨＡＭ患者由来ＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞株に対して傷害性を及ぼすことが明らかにされた。さらに、プロスルチアミンもアリシンと同様の効果をもたらしたが、フルスルチアミンにはその効果はなかった。図１の破線域に示すように、プロスルチアミンにはアリシン類似構造が存在するが、フルスルチアミンには存在しない。すなわち、この構造がＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞株に対する傷害性を規定していることを示していることがわかる。その傷害性の機序としては、アリシン処理によってミトコンドリア膜電位の低下がもたらされること、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋの前処理によって傷害性が阻止されること、アリシンおよびプロスルチアミン処理によりカスパーゼ−３がｃｌｅａｖａｇｅされた状態となること、すなわちカスパーゼ−３の活性化に起因するカスパーゼ依存性のアポトーシスが起こることが考えられる。
【００７３】
これらの現象を踏まえて、アリシンおよびプロスルチアミンが、ＨＡＭ患者末梢血ＣＤ４陽性Ｔ細胞中のＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞にもアポトーシスを惹起し得る可能性を検討した。末梢血ＣＤ４陽性Ｔ細胞をアリシンにて処理したところ、全体の細胞には傷害性を与えない濃度で、ＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス量が有意に減少した。さらに、末梢血ＣＤ４陽性Ｔ細胞をプロスルチアミンにて処理したところ、アリシン処理と同様にＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス量が有意に減少した。これらの結果は、アリシンおよびプロスルチアミンが、ＨＡＭ患者末梢血中のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞を選択的に除去し得る可能性を持っていること示すものである。
【００７４】
以上の結果より、アリシンおよびプロスルチアミンは、ＨＡＭ患者由来ＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞株に対して、カスパーゼ依存的にアポトーシスを引き起こすことが明らかにされた。さらに、アリシンおよびプロスルチアミンは、ＨＡＭ患者培養末梢血ＣＤ４陽性Ｔ細胞中のＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞に対してもアポトーシスを誘導し、選択的にＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞を除去し得ることが示された。
【００７５】
２．ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症（ＨＡＭ）患者に対するプロスルチアミン治療の臨床試験
【００７６】
〔研究目的〕
現在までに、ＨＡＭに対する治療として種々の治療法が報告されている。その中で現在、主流をなしているのが、副腎皮質ホルモン療法、インターフェロンーα療法といった免疫修飾療法である。しかし、現時点ではＨＡＭに対する根本的な治療法は未だ確立されていない。ＨＡＭに対する理想的な治療を考えた場合、ＨＴＬＶ-Ｉ感染細胞の体内からの選択的除去にあると考えられる。
本願発明者らは、ＨＡＭ患者末梢血ＨＴＬＶ-Ｉ感染細胞に対してプロスルチアミン（アリナミン（登録商標）)がin vitroにおいて、比較的選択的にアポトーシスを惹起しうることを見出した。そこで本実施例では、ＨＡＭ患者に対するプロスルチアミン治療の臨床試験を行った。
【００７７】
〔方法〕
対象：４例のＨＡＭ患者（女性２例、男性２例、年齢；５１-７３歳、罹病期間；１３-４６年）（表１）。元来投与されている併用薬剤は中止せず、用量・用法を変えずそのまま継続した（表１）。
試験方法：プロスルチアミン４０ｍｇを生理食塩水５０ｍｌで希釈し、１４日間連日点滴静注した。
検査項目：治療前、治療開始１週目、２週目、治療終了１週目で神経学的所見、運動機能障害度、歩行時間の変化などをチェックした。同時に上記ポイントでの、末梢血単核球中のＨＴＬＶ-Ｉプロウイルス量の変化を解析した。また、治療前および治療２週目でリンパ球幼若化反応の変化も検討した。
（倫理面への配慮）
本臨床試験は長崎大学倫理委員会の承認を受け、また、施行時には研究の内容を十分に説明した上で、文書によるインフォームド・コンセントを得て行なった。
【００７８】
【表１】
【００７９】
〔結果〕
表２に臨床所見の変化とリンパ球幼若化反応の変化を示す。各症例とも運動機能障害度（０：障害なし；１：急いで走る時の障害；２：走ったり歩いたりの際の障害；３：走れないが、介助なしに階段昇降可能；４：手すりにつかまって、階段昇降可能；５：介助があれば３０ｍ、なくても１０ｍ歩行可能；６：介助があれば、１０ｍ歩行可能；７：介助があっても、１０ｍ歩行不能。這うことはできる；８：車椅子のみ；９：寝たきりだが、体位変換可能；１０：体位変換不能；としてスコア化。Matsuo H. et al., Plasmapheresis in treatment of human T-lymphotropic virus type-I associated myelopathy. Lancet 1988;ii:1109-1113.参照。）は治療前後で変化はみられなかったが、個々の症例でみてみると、歩行時間の短縮、長年の車椅子生活で全く立位保持不能であった症例で数秒ではあるが支え立ちが可能となり、二本杖歩行から一本杖歩行が可能になり、痙縮の改善がみられた。リンパ球幼若化反応ではspontaneous PBL proliferationの著明な改善はみられなかった。しかし、非常に興味あることに末梢血ＨＴＬＶ-Ｉプロウイルス量は治療後の最小プロウイルス量でみた場合、治療前に比較して約３０％から５０％位にまで減少した（表３）。出現した有害事象としては点滴時の軽い血管痛のみであった。
【００８０】
【表２】
【００８１】
【表３】
【００８２】
本実施例では、ＨＡＭ患者末梢血からのＨＴＬＶ-Ｉ感染細胞の選択的除去を基盤としたＨＡＭ患者に対する根治治療を目指し、プロスルチアミンによる治療を試みた。臨床的効果としては全体的には著明な効果は得られなかったにもかかわらず、個々の症例をよく解析すると、やはり改善傾向は得られたものと考えられる。著明な効果が得られなかった理由の一つとして、本実施例はすべて比較的罹病期間の長い症例を対象としていたことが考えられる。ただ、本実施例の臨床試験で特筆すべきことは、プロスルチアミンの短期間の投与でも末梢血ＨＴＬＶ-Ｉプロウイルス量が著明に減少したことである。
【００８３】
プロスルチアミンはＨＴＬＶ-Ｉ感染細胞に対して抗ウイルス薬として作用し、今後ＨＡＭに対する治療薬と成り得る可能性を持っている。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
上述したように、本発明によれば、従来、有効な治療方法が見出されていなかったＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の根本治療を行うことができると考えられる。さらに本発明は、全世界において約１０００万人〜約２０００万人存在しているといわれるＨＴＬＶ−ＩキャリアからのＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞の排除にも貢献できると考えられるため、ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の発症予防にも有効である。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１は、アリシン、プロスルチアミン、フルスルチアミンの構造を示す図である。
【図２】図２（ａ）は、アリシンによる各種細胞株に対する傷害性を示すグラフである。図２（ｂ）は、プロスルチアミンによる各種細胞株に対する傷害性を示すグラフである。図２（ｃ）は、ＨＣＴ−１およびＨＣＴ−４に対するプロスルチアミン（図中、Ｐと示す）とフルスルチアミン（図中、Ｆと示す）による傷害性を示すグラフである。
【図３】図３（ａ）は、アリシン処理を行ったＨＣＴ−１におけるミトコンドリア膜電位の低下を示す図である。図３（ｂ）は、アリシン処理を行ったＨＣＴ−４におけるミトコンドリア膜電位の低下を示す図である。
【図４】図４は、ＨＣＴ−１に対するアリシン傷害性のｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによる阻止効果を示すグラフである。
【図５】図５は、アリシン処理ＨＣＴ−１におけるｐ３８ ＭＡＰＫのウエスタンブロット解析結果を示す図である。
【図６】図６は、プロスルチアミン処理ＨＣＴ−１におけるｐ３８ ＭＡＰＫのウエスタンブロット解析結果を示す図である。
【図７】図７は、アリシンまたはプロスルチアミン処理ＨＣＴ−１におけるカスパーゼ−３の活性化のウエスタンブロット解析結果を示す図である。
【図８】図８（ａ）は、５μＭのアリシン処理によるＨＡＭ患者培養ＣＤ４陽性Ｔ細胞中のＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス量の変化を示すグラフである。図８（ｂ）は、１０μＭのアリシン処理によるＨＡＭ患者培養ＣＤ４陽性Ｔ細胞中のＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス量の変化を示すグラフである。
【図９】図９は、プロスルチアミン処理によるＨＡＭ患者培養ＣＤ４陽性Ｔ細胞中のＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス量の変化を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防または治療剤、および、ＨＴＬＶ−Ｉに感染した細胞のアポトーシス促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症（以下、「ＨＡＭ」とも呼ぶ）は、末梢血ＨＴＬＶ−Ｉ感染ＣＤ４陽性Ｔ細胞が脊髄の中に浸潤することによって惹起される慢性脊髄炎の病理像を呈する難治性神経疾患である。この疾患の原因となるウイルスは、ＨＴＬＶ−Ｉというレトロウイルスであり、垂直感染（特に、授乳感染）、血液感染、性感染などによって感染する。ＨＡＭの症状は、胸髄の側索を走行する錐体路が侵されることによる、歩行障害、排尿障害などである。
【０００３】
従来、ＨＡＭの治療法としては、プレドニゾロンやインターフェロン−αの投与、血液浄化方法などが利用されてきた（非特許文献１〜３参照）。しかしながら、これらの治療法はいずれも免疫修飾療法を中心とした対症療法であり、本疾患の原因であるＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞の排除を行うものではない。それゆえ、これらの治療法は、ＨＡＭの根本的な治療方法ではなく、一時的には効果を発揮しても、病状の進行を止めることはできない。
【０００４】
ＨＡＭの患者は、カリブ海諸国、西アフリカ、東南アジアなどに多く、日本では特に九州地区に多い。現在、その患者数は日本で１５００人程度、世界で５０００人程度と考えられているが、ＨＴＬＶ−Ｉのキャリアは、世界で１０００万人〜２０００万人といわれている。そのため、ＨＡＭに対する根治療法の開発が望まれている。
【非特許文献１】Osame M. et al., Chronic progressive myelopathy associated with elevated antibodies to human T-lymphotropic virus type I and adult T-cell leukemia-like cells. Ann Neurol 1987;21:117-122.
【非特許文献２】Shibayama K. et al., Interferon-alpha treatment in HTLV-I-associated myelopathy: Studies of clinical and immunological aspects. J Neurol Sci 1991;106:186-192.
【非特許文献３】Matsuo H. et al., Plasmapheresis in treatment of human T-lymphotropic virus type-I associated myelopathy. Lancet 1988;ii:1109-1113.
【非特許文献４】西浦義博ら、臨床神経学、日本神経学会発行、2005;45:1041
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記の課題に基づいてなされたものであり、ＨＴＬＶ−Ｉに感染した細胞を標的とし、ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の根本的な予防および治療に有用なＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防または治療剤（以下、予防・治療剤ともいう）、ならびにＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討した。
先ず、本願発明者らは、ニンニク（Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖａｍ）から抽出されるアリシン（ｄｉａｌｌｙｌ−ｔｈｉｏｓｕｌｆｉｎａｔｅ）に着目した。アリシンは、下記の式（３）で表される有機硫黄化合物であるが、抗腫瘍効果、抗細菌・抗真菌効果、抗血栓効果などの多彩な生理学的作用を有することが知られている。
【０００７】
【化１】
【０００８】
本願発明者らは、比較的低濃度のアリシンまたはその類縁体処理によって、ＨＡＭ患者由来ＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞株が傷害を受けることを確認し、かかる知見に基づき、さらに検討を進めた結果、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、以下の通りである。
〔１〕アリシンまたはその類縁体を有効成分として含有する、ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防または治療剤。
〔２〕アリシン類縁体が、その構造中に下記一般式（１）
【００１０】
【化２】
【００１１】
（式中、Ｒは、置換されていてもよい飽和または不飽和の鎖状炭化水素基）で表される基を有するアリシン以外の化合物である、上記〔１〕に記載のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防または治療剤。
〔３〕アリシン類縁体が、アリシンを原料として製造される物質である、上記〔１〕に記載のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防または治療剤。
〔４〕アリシン類縁体が、下記一般式（２）
【００１２】
【化３】
【００１３】
（式中、Ｒは、置換されていてもよい飽和または不飽和の鎖状炭化水素基）で表されるチアミン化合物、または、その製薬上許容されうる塩である、上記〔１〕に記載のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防または治療剤。
〔５〕アリシン類縁体がプロスルチアミンである、上記〔１〕に記載のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防または治療剤。
〔６〕アリシンまたはその類縁体を有効成分として含有する、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤。
〔７〕アリシン類縁体が、その構造中に下記一般式（１）
【００１４】
【化４】
【００１５】
（式中、Ｒは、置換されていてもよい飽和または不飽和の鎖状炭化水素基）で表される基を有するアリシン以外の化合物である、上記〔６〕に記載のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤。
〔８〕アリシン類縁体が、アリシンを原料として製造される物質である、上記〔６〕に記載のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤。
〔９〕アリシン類縁体が、下記一般式（２）
【００１６】
【化５】
【００１７】
（式中、Ｒは、置換されていてもよい飽和または不飽和の鎖状炭化水素基）で表されるチアミン化合物、または、その製薬上許容されうる塩である、上記〔６〕に記載のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤。
〔１０〕アリシン類縁体がプロスルチアミンである、上記〔６〕に記載のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防・治療剤は、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシスを誘引するアリシンまたはその類縁体を有効成分として含有する。そのため、本発明のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防・治療剤をＨＡＭ患者あるいはＨＴＬＶ−Ｉのキャリアに投与すれば、投与対象の末梢血からＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞を安全な方法によって選択的に除去することができる。
したがって、本発明のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防・治療剤によれば、従来、有効な治療方法が見出されていなかったＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の根本治療を行うことができると考えられる。さらには、全世界において約１０００万人〜約２０００万人存在しているといわれるＨＴＬＶ−ＩキャリアからのＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞の排除にも貢献できると考えられるため、ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の発症予防にも有効である。
【００１９】
また、本発明のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤は、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞特異的にアポトーシスを誘引させることができる。そのため、本発明のアポトーシス促進剤をＨＡＭ患者あるいはＨＴＬＶ−Ｉのキャリアに投与すれば、投与対象の末梢血からＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞を安全な方法によって選択的に除去することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の内容を詳細に説明する。
（１）ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防または治療剤
本発明のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防または治療剤は、アリシンまたはその類縁体を有効成分として含有する。
本発明にかかる予防・治療剤に有効成分として含まれるアリシンは、ニンニク、ニラ、ラッキョウ、ギョウジャニンニクなどに含まれる有機硫黄化合物であり、下記式（３）で表される構造を有する。
【００２１】
【化６】
【００２２】
本発明の予防・治療剤に用いられるアリシンは、ニンニク、ニラ、ラッキョウ、ギョウジャニンニクなどから、自体公知の方法により、抽出・精製することによって取得することができる。また、試薬として販売されているアリシン（ＬＴＫ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ（発売元：和光純薬））を使用することもできる。
【００２３】
また、本発明の予防・治療剤に含まれる有効成分は、アリシン類縁体であってもよい。本発明において、アリシン類縁体とは、その骨格中にアリシンと類似する構造を有するもののことをいう。上記アリシン類縁体としては、その構造中に下記一般式（１）
【００２４】
【化７】
【００２５】
（式中、Ｒは、置換されていてもよい飽和または不飽和の鎖状炭化水素基）で表される基を有するもの（但し、アリシンを除く）を挙げることができる。このようなアリシン類縁体の中でも特に、図１（ａ）に示すアリシンの構造中破線で囲んだ領域を有するもの、あるいは、アリシンを原料として製造される物質であることが好ましい。
【００２６】
また、アリシン類縁体としては、下記の一般式（２）
【００２７】
【化８】
【００２８】
（式中、Ｒは、置換されていてもよい飽和または不飽和の鎖状炭化水素基）で表されるチアミン化合物、または、その製薬上許容されうる塩であることが好ましい。
【００２９】
ここで、上記一般式（１）および（２）におけるＲ（すなわち、置換されていてもよい飽和または不飽和の鎖状炭化水素基）は、直鎖状であっても分枝状であってもよい。該炭化水素基としては、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアルケニル基、置換されていてもよいアルキニル基が挙げられる。
【００３０】
置換されていてもよいアルキル基におけるアルキル基としては、例えば炭素数１〜１０の直鎖または分枝状のアルキル基が挙げられる。該アルキル基の具体例としては、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなどが挙げられる。この中で炭素数１〜７の直鎖または分枝状のアルキル基が好ましい。さらに炭素数１〜５の直鎖状のアルキル基がより好ましく、プロピル基が最も好ましい。
【００３１】
該アルキル基における置換基としては、例えばハロゲン、ニトロ、アミノ基（アシル基、アルキル基等を１〜２個置換基として有していてもよい。）、シアノ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミジノ基、グアニジノ基、カルバモイル基などが挙げられる。
【００３２】
置換されていてもよいアルケニル基におけるアルケニル基としては、例えば炭素数２〜１６の直鎖状あるいは分枝状アルケニル基がよい。該アルケニル基の具体例としては、例えば、ビニル、アリル（allyl）、クロチル、２−ペンテン−１−イル、３−ペンテン−１−イル、２−ヘキセン−１−イル、３−ヘキセン−１−イル、２−メチル−２−プロペン−１−イル、３−メチル−２−ブテン−１−イル等が挙げられる。この中で炭素数２〜７の直鎖状あるいは分枝状のアルケニル基が好ましい。さらに炭素数２〜５の直鎖状のアルケニル基がより好ましく、アリル基が最も好ましい。
【００３３】
該アルケニル基における置換基としては、例えばハロゲン、ニトロ、アミノ基（アルキル基、アシル基等を１〜２個置換基として有していてもよい。）、シアノ基、アミジノ基、グアニジノ基などの基が挙げられる。上記アルケニル基は二重結合に関する異性体（Ｅ、Ｚ体）を包含する。
【００３４】
置換されていてもよいアルキニル基におけるアルキニル基としては、例えば炭素数２〜１６の直鎖状あるいは分枝状アルキニル基がよい。該アルキニル基の具体例としては、炭素数２〜６のアルキニル基（例、エチニル、プロパルギル、２−ブチン−１−イル、３−ブチン−２−イル、１−ペンチン−３−イル、３−ペンチン−１−イル、４−ペンチン−２−イル、３−ヘキシン−１−イルなど）が挙げられる。
【００３５】
該アルキニル基における置換基としては、例えばハロゲン、ニトロ、アミノ基（アルキル基、アシル基等を１〜２個置換基として有していてもよい。）、シアノ基、アミジノ基、グアニジノ基などの基が挙げられる。
【００３６】
本発明で用いられる上記一般式（２）で表されるチアミン化合物は、自体公知の方法（例えば、ビタミンＢ総合研究委員会：ビタミン 6(4) 607 (1953)、特許第２６８５５１４号公報に記載の方法およびそれらに準じた方法）により、例えば、チオール型ビタミンＢ１およびアリシンなどを原料として製造される。
【００３７】
本発明で用いられるチアミン化合物の塩は、好ましくは製薬上許容されうる塩として用いられる。製薬上許容されうる塩としては、無機塩基との塩、有機塩基との塩、塩基性アミノ酸との塩などが用いられる。用いられる無機塩基としては、例えばアルカリ金属（例、ナトリウム、カリウムなど）、アルカリ土類金属（例、カルシウム、マグネシウムなど）などが、有機塩基としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、ジシクロヘキシルアミンなどが、塩基性アミノ酸としては例えばアルギニン、リジンなどが挙げられる。これらの塩は、自体公知の方法により製造することができる。
【００３８】
また、上記アリシン類縁体として、より具体的には下記式（４）で表されるプロスルチアミンが挙げられる。
【００３９】
【化９】
【００４０】
本発明のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防または治療剤は、低毒性であり安全に用いられる。特に、本発明の剤に含まれるアリシン類縁体がプロスルチアミンであれば、当該物質は既に人体に対する安全性が確認されているものであるため、安全に使用することができる。また、アリシンは非常に不安定な物質であるが、プロスルチアミンは安定した物質であるため、生体への安定した投与が可能となる。
【００４１】
本発明の剤は、温血哺乳動物（例、ヒト、サル、ウマ、ウシ、イヌ、マウス等）、好ましくはヒトに投与し、ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防や治療に用いることができる。
【００４２】
本発明の予防・治療剤の投与量は、本発明で用いられるアリシンまたはアリシン類縁体の有効量であればよい。例えば有効成分としてアリシンが含まれる場合には、成人（体重５０ｋｇ）１人にアリシンとして約０.５ｍｇ〜５００ｍｇ／日、好ましくは、約１ｍｇ〜５０ｍｇ／日、特に好ましくは、約５ｍｇ〜３０ｍｇ／日である。なお、有効成分としてプロスルチアミンが含まれる場合には、本発明の予防・治療剤の投与量は、成人（体重５０ｋｇ）１人にプロスルチアミンとして約０.５ｍｇ〜１０００ｍｇ／日、好ましくは、約１０ｍｇ〜５００ｍｇ／日、特に好ましくは、約３０ｍｇ〜１００ｍｇ／日である。
【００４３】
本発明の予防・治療剤は、種々の剤形を取り得る。該剤形としては、経口投与製剤（例、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤等）、非経口投与製剤（例、注射剤等）などが挙げられる。
【００４４】
たとえば経口投与製剤にするには、自体公知の方法に従い、上記のアリシンまたはアリシン類縁体を、たとえば賦形剤（例、乳糖、白糖、デンプンなど）、崩壊剤（例、デンプン、炭酸カルシウムなど）、結合剤（例、デンプン、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロースなど）または滑沢剤（例、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール６０００など）などを添加して圧縮成形し、次いで必要により味のマスキング、腸溶性あるいは持続性の目的のため自体公知の方法でコーティングすることにより経口投与製剤とすることができる。そのコーティング剤としては、例えば一般のフィルム形成コーティング剤（例、ヒドロキシプロピルメチルセルロース〔ＴＣ−５、信越化学工業（株）〕、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリオキシエチレングリコール等）、ツイーン８０、プルロニックＦ６８、腸溶性コーティング剤（例、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシメチルセルロースアセテートサクシネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、メチルメタクリレート・メタクリル酸共重合体〔オイドラギット（ローム社製、ドイツ）〕、メチルアクリレート・メタクリル酸共重合体等）、色素（例、酸化チタン、ベンガラ、タルク）などが用いられる。腸溶性コーティングを行う場合、活性成分を含む中心核と腸溶皮膜との間に、自体公知の方法に従い、上記フィルム形成コーティング剤で一層又は二層以上の中間層を設けることも有効である。
【００４５】
また、本発明の予防・治療剤は、注射剤として非経口的に投与することも有効である。該注射剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。
【００４６】
本発明の予防・治療剤が注射剤の剤形で投与される場合、当該剤に含まれるアリシンまたはアリシン類縁体の量は、約０.１〜５０ｍｇ、好ましくは約２〜２０ｍｇである。なお、本発明の予防・治療剤を注射剤としてヒトに投与した場合、アリシンまたはアリシン類縁体が血中濃度で０．５〜１００μＭとなるように、好ましくは５〜５０μＭとなるように、剤の濃度を調整してもよい。
【００４７】
本発明の予防・治療剤は、他の薬剤と併用してもよく、かかる薬剤としては、従来ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の対症療法として投与されてきたプレドニゾロン、ＩＦＮ−α、ビタミンＣなどが挙げられる。
【００４８】
本発明のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防・治療剤は、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシスを誘引するアリシンまたはその類縁体を有効成分として含有する。そのため、本発明のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防・治療剤をＨＡＭ患者あるいはＨＴＬＶ−Ｉのキャリアに投与すれば、投与対象の末梢血からＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞を安全な方法によって選択的に除去することができる。
【００４９】
そして、本発明のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防・治療剤によれば、従来、有効な治療方法が見出されていなかったＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の根本治療を行うことができると考えられる。さらには、全世界において約１０００万人〜約２０００万人存在しているといわれるＨＴＬＶ−ＩキャリアからのＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞の排除にも貢献できると考えられるため、ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の発症予防にも有効である。また、後述の実施例から明らかなように、本発明のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防・治療剤は、末梢血ＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス量を減少させる。従って、本発明のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防・治療剤は、抗ウイルス薬としても有用である。
【００５０】
（２）ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤
本発明のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤は、アリシンまたはその類縁体を有効成分として含有する。ここで、「ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシスの促進剤」とは、ＨＴＬＶ−Ｉに感染した細胞に特異的（選択的）にアポトーシスを誘引させる剤のことをいう。
【００５１】
本発明にかかるアポトーシス促進剤に含まれるアリシンおよびアリシン類縁体としては、上述した本発明の予防・治療剤に含まれるアリシンおよびアリシン類縁体をそれぞれ同様に使用することが可能であるため、ここではその説明を省略する。
【００５２】
本発明のアポトーシス促進剤は、温血哺乳動物（例、ヒト、サル、ウマ、ウシ、イヌ、マウス等）、好ましくはヒトに投与し、ＨＴＬＶ−Ｉに起因する感染症の予防や治療に用いることができる。また、本発明のアポトーシス促進剤は、低毒性であり安全に用いられる。特に、本発明の剤に含まれるアリシン類縁体がプロスルチアミンであれば、当該物質は既に人体に対する安全性が確認されているものであるため、安全に使用することができる。
【００５３】
また、本発明のアポトーシス促進剤は、種々の細胞を含む細胞培養系からＨＴＬＶ−Ｉに感染した細胞を選択的に除去するために使用することもできる。
【００５４】
本発明のアポトーシス促進剤は、種々の剤形を取り得る。該剤形としては、経口投与製剤（例、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤等）、非経口投与製剤（例、注射剤等）などが挙げられる。該剤形のより具体的な例としては、上述の予防・治療剤と同様のものを挙げることができる。
【００５５】
本発明のアポトーシス促進剤の投与量は、本発明で用いられるアリシンまたはアリシン類縁体の有効量であればよい。例えば有効成分としてアリシンが含まれる場合には、成人（体重５０ｋｇ）１人にアリシンとして約０.５ｍｇ〜５００ｍｇ／日、好ましくは、約１ｍｇ〜５０ｍｇ／日、特に好ましくは、約５ｍｇ〜３０ｍｇ／日である。なお、有効成分としてプロスルチアミンが含まれる場合には、本発明のアポトーシス促進剤の投与量は、成人（体重５０ｋｇ）１人にプロスルチアミンとして約０.５ｍｇ〜１０００ｍｇ／日、好ましくは、約１０ｍｇ〜５００ｍｇ／日、特に好ましくは、約３０ｍｇ〜１００ｍｇ／日である。
【００５６】
本発明のアポトーシス促進剤が注射剤の剤形で投与される場合、当該剤に含まれるアリシンまたはアリシン類縁体の量は、約０.１〜５０ｍｇ、好ましくは約２〜２０ｍｇである。なお、本発明のアポトーシス促進剤を注射剤としてヒトに投与した場合、アリシンまたはアリシン類縁体が血中濃度で０．５〜１００μＭとなるように、好ましくは５〜５０μＭとなるように、剤の濃度を調整してもよい。
【００５７】
本発明のアポトーシス促進剤は、他の薬剤と併用してもよく、かかる薬剤としては、プレドニゾロン、ＩＦＮ−α、ビタミンＣなどが挙げられる。
【００５８】
本発明のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤は、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞特異的にアポトーシスを誘引させることができる。そのため、本発明のアポトーシス促進剤をＨＡＭ患者あるいはＨＴＬＶ−Ｉのキャリアに投与すれば、投与対象の末梢血からＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞を安全な方法によって選択的に除去することができる。従って、本発明のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤は、ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防・治療剤として有用である。また、後述の実施例から明らかなように、本発明のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤は、末梢血ＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス量を減少させる。従って、本発明のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤は、抗ウイルス薬としても有用である。
【実施例】
【００５９】
以下に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６０】
１．アリシンおよびプロスルチアミンによるＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症患者ＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞の選択的除去に向けての基礎的検討
【００６１】
〔実験の目的〕
本実施例では、ＨＡＭに対する根治療法開発へ向けた基礎的検討という観点から、アリシン（上記式（３）または図１（ａ）の化合物）、プロスルチアミン（上記式（４）または図１（ｂ）の化合物）、および、フルスルチアミン（図１（ｃ）の化合物）を使用し、以下の解析を行なった。１）ＨＡＭ患者由来ＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞株に対する傷害性を種々のＨＴＬＶ−Ｉ感染および非感染Ｔ細胞株と比較検討すると共に、そのメカニズムについて解析した。２）ＨＡＭ患者培養末梢血ＣＤ４陽性Ｔ細胞中のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞に対する除去効果について、ＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス量を目安に解析した。
【００６２】
〔対象〕
ＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞株としてＨＡＭ患者由来ＨＣＴ−１、ＨＣＴ−４、ＡＴＬ患者由来ＫＯＢ、臍帯血由来ＭＴ−１、ＭＴ−２を使用し、ＨＴＬＶ−Ｉ非感染Ｔ細胞株としてＪｕｒｋａｔ細胞を使用した。また、末梢血での検討では、ＨＡＭ患者末梢血ＣＤ４陽性Ｔ細胞を使用した。
【００６３】
〔実施例１〕アリシン、プロスルチアミン、およびフルスルチアミンの各種細胞株に対する傷害性の評価
各種細胞株を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で、種々の濃度のアリシンまたはプロスルチアミンまたはフルスルチアミン存在下で２４時間培養後、ＭＴＳａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を行なった。細胞傷害性の評価は、％ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ（アリシン処理時のＯＤ値／アリシン非処理時のＯＤ値の平均値）で行なった。
【００６４】
その結果を、図２（ａ）〜（ｃ）に示す。図２（ａ）に示すように、アリシン処理によって用量依存性に各種細胞株は傷害を受け、細胞生存率は低下した。それぞれをＬＤ５０で表した場合、それぞれのアリシン濃度はＨＣＴ−１：７．０、ＨＣＴ−４：７．５、ＫＯＢ：１１．５、ＭＴ−１：１２．５、ＭＴ−２：４４．６、Ｊｕｒｋａｔ：２２．２μＭであり、ＨＡＭ患者由来ＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞株（ＨＣＴ−１、ＨＣＴ−４）で低値を示し、両者の細胞株は２０μＭアリシン処理でほぼ完全に死滅した。
【００６５】
図２（ｂ）に示すように、ＨＣＴ−１およびＨＣＴ−４は４０μＭのプロスルチアミン処理によってもほぼ完全に死滅したが、ＭＴ−２やＪｕｒｋａｔでは細胞傷害に対してやや抵抗性を示し、これらの細胞株でみた場合、用量依存性の生存曲線はアリシン処理時とほぼ同様の傾向を示した。
一方、プロスルチアミンとフルスルチアミンによるＨＣＴ−１およびＨＣＴ−４に対する傷害効果を比較した場合、図２（ｃ）に示すように、フルスルチアミンは両者の細胞株に対してほとんど傷害を及ぼさなかった。なお、図２（ｃ）において、プロスルチアミン処理をＰ／ＨＣＴ−１、Ｐ／ＨＣＴ−４と示し、フルスルチアミン処理をＦ／ＨＣＴ−１、Ｆ／ＨＣＴ−４と示す。
【００６６】
〔実施例２〕細胞傷害の機序の解析
（１）ミトコンドリア膜電位の低下：ＨＣＴ−１およびＨＣＴ−４を２０μＭアリシンまたは溶媒存在下で２４時間培養後、電位感受性蛍光色素（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅ）ＤｉＯＣ６（３）で染色し、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で解析した。
その結果を、図３（ａ）および（ｂ）に示す。図に示すように、ＨＣＴ−１、ＨＣＴ−４ともに、２０μＭアリシン処理によってほとんどの細胞でミトコンドリア膜電位の低下がみられ、細胞傷害はアポトーシスによることが明らかにされた。
【００６７】
（２）ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ処理による細胞生存率（ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）の変化：ＨＣＴ−１をｐａｎ−ｃａｓｐａｓｅ阻害剤である１００μＭ ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋで前処理後、１０μＭアリシン存在下で２４時間培養した。培養後、ＭＴＳａｓｓａｙにおいて細胞生存率（ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）の変化を検討した。
その結果を図４に示す。図に示すように、細胞のアポトーシスがカスパーゼ依存性か非依存性かを解析するために行なったｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによる前処理によって、１０μＭアリシン処理によるＨＣＴ−１の細胞生存率（ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）が有意に上昇した。
【００６８】
〔実施例３〕ｐ３８ ＭＡＰＫおよび活性化カスパーゼ−３（ｃａｓｐａｓｅ−３）のウエスタンブロット解析
ＨＣＴ−１を、２０μＭアリシンまたは溶媒存在下に、１時間および３時間培養した。細胞抽出物（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）を作製し、ｐ３８ ＭＡＰＫのウエスタンブロット解析を行なった。また、ＨＣＴ−１を、１０μＭおよび２０μＭプロスルチアミンまたは溶媒存在下に、１時間および３時間培養した。細胞抽出物（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）を作製し、ｐ３８ ＭＡＰＫのウエスタンブロット解析を行なった。また、ＨＣＴ−１を２０μＭアリシン、２０μＭプロスルチアミン、または溶媒存在下に、６時間および１２時間培養した。細胞抽出物（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）を作製し、活性化の過程（ｐｒｏｃｅｓｓ）でｃｌｅａｖａｇｅされるカスパーゼ−３の存在の有無をウエスタンブロットにて解析した。
【００６９】
その結果を、図５〜図７に示す。図５に示すように、ＨＣＴ−１のｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ−ｐ３８ ＭＡＰＫ（図中、Ｐ−ｐ３８ ＭＡＰＫと示す）は、２０μＭアリシン処理によって顕著にｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅされた。図６に示すように、２０μＭプロスルチアミン処理によってもほぼ同様の結果が得られた。さらに、図７に示すように、２０μＭアリシンまたはプロスルチアミン処理によってｃｌｅａｖａｇｅされたカスパーゼ−３の存在が明らかにされた。
【００７０】
〔実施例４〕アリシンおよびプロスルチアミン処理によるＨＡＭ患者末梢血ＣＤ４陽性Ｔ細胞中のＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス量の変化
末梢血ＣＤ４陽性Ｔ細胞でのＭＴＳａｓｓａｙにおいて細胞傷害性が生じない５μＭおよび１０μＭアリシン存在下、または溶媒（ｖｅｈｉｃｌｅ）存在下に、末梢血ＣＤ４陽性Ｔ細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で２４時間培養した。また、５μＭプロスルチアミンまたは溶媒（ｖｅｈｉｃｌｅ）存在下に、末梢血ＣＤ４陽性Ｔ細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で４８時間培養した。細胞回収後、Annexin V MicroBead Kits(Miltenyi Biotec)を使用し、アポトーシス細胞を除去した。その後、細胞ペレット（ｃｅｌｌ ｐｅｌｌｅｔ）からＤＮＡを抽出し、ライトサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ）による定量ＰＣＲ（プライマー：ＨＴＬＶ−Ｉ ｔａｘ、β−アクチン)を施行し、スタンダードとして用いたＭＴ−２中のＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス量を１細胞あたり２．２コピーとして、ＣＤ４陽性Ｔ細胞１０４個あたりのプロウイルス量を算出した。
【００７１】
その結果を、図８および図９に示す。図８（ａ）に示すように、８例のＨＡＭ患者全例の末梢血ＣＤ４陽性Ｔ細胞において、５μＭアリシン処理によって、ＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス量は、溶媒処理の場合に比較して２４．６−７３．１％（平均：５４．８％）にまで減少した。また、図８（ｂ）に示すように、１０μＭのアリシン処理を行った場合にも、ＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス量は、溶媒処理の場合に比較して２８．５−９２．８％（平均：６１％）にまで減少した。一方、図９に示すように、５μＭのプロスルチアミン処理によっても、７例のＨＡＭ患者全例の末梢血ＣＤ４陽性Ｔ細胞において、ＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス量は、溶媒処理の場合に比較して２９．９−８０．２％（平均：６０．７％）にまで減少した。
【００７２】
〔結果〕
以上の実施例によって、アリシンは比較的低濃度でＨＡＭ患者由来ＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞株に対して傷害性を及ぼすことが明らかにされた。さらに、プロスルチアミンもアリシンと同様の効果をもたらしたが、フルスルチアミンにはその効果はなかった。図１の破線域に示すように、プロスルチアミンにはアリシン類似構造が存在するが、フルスルチアミンには存在しない。すなわち、この構造がＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞株に対する傷害性を規定していることを示していることがわかる。その傷害性の機序としては、アリシン処理によってミトコンドリア膜電位の低下がもたらされること、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋの前処理によって傷害性が阻止されること、アリシンおよびプロスルチアミン処理によりカスパーゼ−３がｃｌｅａｖａｇｅされた状態となること、すなわちカスパーゼ−３の活性化に起因するカスパーゼ依存性のアポトーシスが起こることが考えられる。
【００７３】
これらの現象を踏まえて、アリシンおよびプロスルチアミンが、ＨＡＭ患者末梢血ＣＤ４陽性Ｔ細胞中のＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞にもアポトーシスを惹起し得る可能性を検討した。末梢血ＣＤ４陽性Ｔ細胞をアリシンにて処理したところ、全体の細胞には傷害性を与えない濃度で、ＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス量が有意に減少した。さらに、末梢血ＣＤ４陽性Ｔ細胞をプロスルチアミンにて処理したところ、アリシン処理と同様にＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス量が有意に減少した。これらの結果は、アリシンおよびプロスルチアミンが、ＨＡＭ患者末梢血中のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞を選択的に除去し得る可能性を持っていること示すものである。
【００７４】
以上の結果より、アリシンおよびプロスルチアミンは、ＨＡＭ患者由来ＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞株に対して、カスパーゼ依存的にアポトーシスを引き起こすことが明らかにされた。さらに、アリシンおよびプロスルチアミンは、ＨＡＭ患者培養末梢血ＣＤ４陽性Ｔ細胞中のＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞に対してもアポトーシスを誘導し、選択的にＨＴＬＶ−Ｉ感染Ｔ細胞を除去し得ることが示された。
【００７５】
２．ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症（ＨＡＭ）患者に対するプロスルチアミン治療の臨床試験
【００７６】
〔研究目的〕
現在までに、ＨＡＭに対する治療として種々の治療法が報告されている。その中で現在、主流をなしているのが、副腎皮質ホルモン療法、インターフェロンーα療法といった免疫修飾療法である。しかし、現時点ではＨＡＭに対する根本的な治療法は未だ確立されていない。ＨＡＭに対する理想的な治療を考えた場合、ＨＴＬＶ-Ｉ感染細胞の体内からの選択的除去にあると考えられる。
本願発明者らは、ＨＡＭ患者末梢血ＨＴＬＶ-Ｉ感染細胞に対してプロスルチアミン（アリナミン（登録商標）)がin vitroにおいて、比較的選択的にアポトーシスを惹起しうることを見出した。そこで本実施例では、ＨＡＭ患者に対するプロスルチアミン治療の臨床試験を行った。
【００７７】
〔方法〕
対象：４例のＨＡＭ患者（女性２例、男性２例、年齢；５１-７３歳、罹病期間；１３-４６年）（表１）。元来投与されている併用薬剤は中止せず、用量・用法を変えずそのまま継続した（表１）。
試験方法：プロスルチアミン４０ｍｇを生理食塩水５０ｍｌで希釈し、１４日間連日点滴静注した。
検査項目：治療前、治療開始１週目、２週目、治療終了１週目で神経学的所見、運動機能障害度、歩行時間の変化などをチェックした。同時に上記ポイントでの、末梢血単核球中のＨＴＬＶ-Ｉプロウイルス量の変化を解析した。また、治療前および治療２週目でリンパ球幼若化反応の変化も検討した。
（倫理面への配慮）
本臨床試験は長崎大学倫理委員会の承認を受け、また、施行時には研究の内容を十分に説明した上で、文書によるインフォームド・コンセントを得て行なった。
【００７８】
【表１】
【００７９】
〔結果〕
表２に臨床所見の変化とリンパ球幼若化反応の変化を示す。各症例とも運動機能障害度（０：障害なし；１：急いで走る時の障害；２：走ったり歩いたりの際の障害；３：走れないが、介助なしに階段昇降可能；４：手すりにつかまって、階段昇降可能；５：介助があれば３０ｍ、なくても１０ｍ歩行可能；６：介助があれば、１０ｍ歩行可能；７：介助があっても、１０ｍ歩行不能。這うことはできる；８：車椅子のみ；９：寝たきりだが、体位変換可能；１０：体位変換不能；としてスコア化。Matsuo H. et al., Plasmapheresis in treatment of human T-lymphotropic virus type-I associated myelopathy. Lancet 1988;ii:1109-1113.参照。）は治療前後で変化はみられなかったが、個々の症例でみてみると、歩行時間の短縮、長年の車椅子生活で全く立位保持不能であった症例で数秒ではあるが支え立ちが可能となり、二本杖歩行から一本杖歩行が可能になり、痙縮の改善がみられた。リンパ球幼若化反応ではspontaneous PBL proliferationの著明な改善はみられなかった。しかし、非常に興味あることに末梢血ＨＴＬＶ-Ｉプロウイルス量は治療後の最小プロウイルス量でみた場合、治療前に比較して約３０％から５０％位にまで減少した（表３）。出現した有害事象としては点滴時の軽い血管痛のみであった。
【００８０】
【表２】
【００８１】
【表３】
【００８２】
本実施例では、ＨＡＭ患者末梢血からのＨＴＬＶ-Ｉ感染細胞の選択的除去を基盤としたＨＡＭ患者に対する根治治療を目指し、プロスルチアミンによる治療を試みた。臨床的効果としては全体的には著明な効果は得られなかったにもかかわらず、個々の症例をよく解析すると、やはり改善傾向は得られたものと考えられる。著明な効果が得られなかった理由の一つとして、本実施例はすべて比較的罹病期間の長い症例を対象としていたことが考えられる。ただ、本実施例の臨床試験で特筆すべきことは、プロスルチアミンの短期間の投与でも末梢血ＨＴＬＶ-Ｉプロウイルス量が著明に減少したことである。
【００８３】
プロスルチアミンはＨＴＬＶ-Ｉ感染細胞に対して抗ウイルス薬として作用し、今後ＨＡＭに対する治療薬と成り得る可能性を持っている。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
上述したように、本発明によれば、従来、有効な治療方法が見出されていなかったＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の根本治療を行うことができると考えられる。さらに本発明は、全世界において約１０００万人〜約２０００万人存在しているといわれるＨＴＬＶ−ＩキャリアからのＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞の排除にも貢献できると考えられるため、ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の発症予防にも有効である。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１は、アリシン、プロスルチアミン、フルスルチアミンの構造を示す図である。
【図２】図２（ａ）は、アリシンによる各種細胞株に対する傷害性を示すグラフである。図２（ｂ）は、プロスルチアミンによる各種細胞株に対する傷害性を示すグラフである。図２（ｃ）は、ＨＣＴ−１およびＨＣＴ−４に対するプロスルチアミン（図中、Ｐと示す）とフルスルチアミン（図中、Ｆと示す）による傷害性を示すグラフである。
【図３】図３（ａ）は、アリシン処理を行ったＨＣＴ−１におけるミトコンドリア膜電位の低下を示す図である。図３（ｂ）は、アリシン処理を行ったＨＣＴ−４におけるミトコンドリア膜電位の低下を示す図である。
【図４】図４は、ＨＣＴ−１に対するアリシン傷害性のｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによる阻止効果を示すグラフである。
【図５】図５は、アリシン処理ＨＣＴ−１におけるｐ３８ ＭＡＰＫのウエスタンブロット解析結果を示す図である。
【図６】図６は、プロスルチアミン処理ＨＣＴ−１におけるｐ３８ ＭＡＰＫのウエスタンブロット解析結果を示す図である。
【図７】図７は、アリシンまたはプロスルチアミン処理ＨＣＴ−１におけるカスパーゼ−３の活性化のウエスタンブロット解析結果を示す図である。
【図８】図８（ａ）は、５μＭのアリシン処理によるＨＡＭ患者培養ＣＤ４陽性Ｔ細胞中のＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス量の変化を示すグラフである。図８（ｂ）は、１０μＭのアリシン処理によるＨＡＭ患者培養ＣＤ４陽性Ｔ細胞中のＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス量の変化を示すグラフである。
【図９】図９は、プロスルチアミン処理によるＨＡＭ患者培養ＣＤ４陽性Ｔ細胞中のＨＴＬＶ−Ｉプロウイルス量の変化を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アリシンまたはその類縁体を有効成分として含有する、ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防または治療剤。
【請求項２】
アリシン類縁体が、その構造中に下記一般式（１）
【化１】
（式中、Ｒは、置換されていてもよい飽和または不飽和の鎖状炭化水素基）で表される基を有するアリシン以外の化合物である、請求項１記載のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防または治療剤。
【請求項３】
アリシン類縁体が、アリシンを原料として製造される物質である、請求項１記載のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防または治療剤。
【請求項４】
アリシン類縁体が、下記一般式（２）
【化２】
（式中、Ｒは、置換されていてもよい飽和または不飽和の鎖状炭化水素基）で表されるチアミン化合物、または、その製薬上許容されうる塩である、請求項１記載のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防または治療剤。
【請求項５】
アリシン類縁体がプロスルチアミンである、請求項１記載のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防または治療剤。
【請求項６】
アリシンまたはその類縁体を有効成分として含有する、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤。
【請求項７】
アリシン類縁体が、その構造中に下記一般式（１）
【化３】
（式中、Ｒは、置換されていてもよい飽和または不飽和の鎖状炭化水素基）で表される基を有するアリシン以外の化合物である、請求項６記載のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤。
【請求項８】
アリシン類縁体が、アリシンを原料として製造される物質である、請求項６記載のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤。
【請求項９】
アリシン類縁体が、下記一般式（２）
【化４】
（式中、Ｒは、置換されていてもよい飽和または不飽和の鎖状炭化水素基）で表されるチアミン化合物、または、その製薬上許容されうる塩である、請求項６記載のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤。
【請求項１０】
アリシン類縁体がプロスルチアミンである、請求項６記載のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤。
【請求項１】
アリシンまたはその類縁体を有効成分として含有する、ＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防または治療剤。
【請求項２】
アリシン類縁体が、その構造中に下記一般式（１）
【化１】
（式中、Ｒは、置換されていてもよい飽和または不飽和の鎖状炭化水素基）で表される基を有するアリシン以外の化合物である、請求項１記載のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防または治療剤。
【請求項３】
アリシン類縁体が、アリシンを原料として製造される物質である、請求項１記載のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防または治療剤。
【請求項４】
アリシン類縁体が、下記一般式（２）
【化２】
（式中、Ｒは、置換されていてもよい飽和または不飽和の鎖状炭化水素基）で表されるチアミン化合物、または、その製薬上許容されうる塩である、請求項１記載のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防または治療剤。
【請求項５】
アリシン類縁体がプロスルチアミンである、請求項１記載のＨＴＬＶ−Ｉ関連脊髄症の予防または治療剤。
【請求項６】
アリシンまたはその類縁体を有効成分として含有する、ＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤。
【請求項７】
アリシン類縁体が、その構造中に下記一般式（１）
【化３】
（式中、Ｒは、置換されていてもよい飽和または不飽和の鎖状炭化水素基）で表される基を有するアリシン以外の化合物である、請求項６記載のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤。
【請求項８】
アリシン類縁体が、アリシンを原料として製造される物質である、請求項６記載のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤。
【請求項９】
アリシン類縁体が、下記一般式（２）
【化４】
（式中、Ｒは、置換されていてもよい飽和または不飽和の鎖状炭化水素基）で表されるチアミン化合物、または、その製薬上許容されうる塩である、請求項６記載のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤。
【請求項１０】
アリシン類縁体がプロスルチアミンである、請求項６記載のＨＴＬＶ−Ｉ感染細胞のアポトーシス促進剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００７−２７７２２３（Ｐ２００７−２７７２２３Ａ）
【公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−６２５１１（Ｐ２００７−６２５１１）
【出願日】平成１９年３月１２日（２００７．３．１２）
【出願人】（５０４２０５５２１）国立大学法人 長崎大学 (226)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月１２日（２００７．３．１２）
【出願人】（５０４２０５５２１）国立大学法人 長崎大学 (226)
【Ｆターム（参考）】
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