ＩＬ−１５抗原アレイとその使用法
本発明は、分子生物学、ウイルス学、免疫学及び医学の分野に関連する。本発明は、規則的に反復した抗原アレイを含有してなる組成物を提供する。このときの抗原はＩＬ-１５タンパク質、ＩＬ-１５変異タンパク質ないしＩＬ-１５断片である。より具体的には、本発明は、ウイルス様粒子と、それに結合する少なくとも一のＩＬ-１５タンパク質、ＩＬ-１５変異タンパク質ないし少なくとも一のＩＬ-１５断片を含有してなる組成物を提供する。また、本発明は、該組成物の産生方法を提供する。本発明の組成物は、炎症性疾患及び慢性自己免疫性疾患の治療のためのワクチンの産生に有用である。本発明の組成物は、免疫応答、特に抗体応答を効率よく誘導する際に有用である。さらに、本発明の組成物は、示した範囲内の自己特異的な免疫応答を効率よく誘導する際に特に有用である。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
(発明の背景)
発明の分野
本発明は、医学、公衆衛生学、免疫学、分子生物学及びウイルス学の分野に関連する。本発明は、ウイルス様粒子(ＶＬＰ)と少なくとも一の抗原を含有してなる組成物であって、該抗原がそれぞれＶＬＰに結合されたＩＬ-１５タンパク質、ＩＬ-１５変異タンパク質ないしはＩＬ-１５断片である組成物を提供する。
また、本発明は、前述の組成物の産生方法を提供する。本発明の組成物は、特にＩＬ-１５が症状を媒介する又は症状の一因となる疾患の治療のため、特に炎症性疾患及び／又は慢性自己免疫性疾患の治療のためのワクチンの産生に有用である。さらに、本発明の組成物は、有効な免疫応答、特に抗体応答を誘導する。さらに、本発明の組成物は、示した範囲内の自己特異的な免疫応答を効率よく誘発するために特に有用である。
【０００２】
関連技術
背景
インターロイキン１５(ＩＬ-１５)は、ＩＬ-２に構造的及び機能的に関係する１４〜１５ｋＤの糖タンパク質である、炎症誘発性サイトカインである (Tagaya 等, Immunity, 1996、 4:329-336)。ＩＬ-１５は結合して、γ鎖(γｃ)、ＩＬ-２Ｒβ及びＩＬ-１５Ｒαからなるヘテロトリマーレセプターを介してシグナル伝達する。ＩＬ-２、ＩＬ-４、ＩＬ-７、ＩＬ-９、ＩＬ-１５及びＩＬ-２１のすべてが、γ鎖を含有するレセプターを利用する一方、ＩＬ-２及びＩＬ-１５レセプターもＩＬ-２Ｒβを共有する。ＩＬ-１５は、ＩＬ-１５Ｒαと結合する唯一のサイトカインであることが現在明らかにされている。ＩＬ-１５は、高い親和性(Ｋａ＝１×１０１１Ｍ−１)でＩＬ-１５Ｒα単独と結合して、中程度の親和性(Ｋａ＝１×１０９Ｍ−１)でＩＬ-２Ｒβとγ鎖との複合体と結合する。
【０００３】
単球、マクロファージ、線維芽細胞、ケラチン合成細胞及び樹状細胞を含む様々な細胞及び組織において、ＩＬ-１５の恒常的発現が報告されている(Waldmann及びTagaya, Annu Rev Immunol. 1999、 17:19-49、Fehniger及びCaligiuri, Blood. 2001、 97:14-32)。ＩＦＮ-γ及びＬＰＳによって、又はウイルス、細菌ないしは原生動物による感染により刺激される単球について報告されるように、炎症性条件下において、その発現が上方制御される(Kirman 等, Inflamm Res. 1998、 47:285-9、Waldmann 等, Int Rev Immunol. 1998、 16:205-26、Waldmann及びTagaya, Annu Rev Immunol. 1999、 17:19-49、Fehniger及びCaligiuri, Blood. 2001、 97:14-32)。さらに、関節リウマチなどの慢性炎症性疾患では、局所的に産生されたＩＬ-１５は、滑液Ｔ細胞の動員及び活性化によって、炎症を増幅するようである。このＩＬ-１５-誘導効果は、疾患発病学において、役割を果たすことが示唆されている(Kirman 等, Inflamm Res. 1998、 47:285-9.、McInnes 等, Nat. Med. 1996、 2:175-82.、McInnes 等, Nat. Med. 1997、 3:189-95、McInnes及びLiew, Immunol Today. 1998、 19:75-9.、Fehniger及びCaligiuri, Blood. 2001、 97:14-32.)。
【０００４】
ＩＬ-１５に対して特異的なモノクローナル抗体は、多くの慢性炎症性疾患及び／又は自己免疫性疾患を治療する場合に提唱されている。国際公開公報0002582は、炎症性腸疾患を治療するためにＩＬ-１５モノクローナル抗体を用いることを開示している。国際公開公報03017935は、ＩＬ-１５炎症誘導性効果を阻害するため、特に乾癬及び関節炎を治療するためにＩＬ-１５モノクローナル抗体を使用することを開示している。
モノクローナル抗体の半減期が人体において、およそ２〜４週間のみであるので、モノクローナル抗体治療には、大量の抗体を繰り返し投与する必要があるという欠点がある(Kaplan, Curr Opin Invest. Drugs. 2002、 3:1017-23.)。高用量の抗体は、注入疾患などの副作用を引き起こしうる。また、ヒト抗体又はヒト化抗体が用いられる場合であっても、アロタイプ応答の患者において、抗抗体が生成され、治療効果が減少するか原因と思われる副作用を引き起こしうる。さらに、ヒト化モノクローナル抗体の高い生産コストによる出費と、常習的な病院訪問者に伴う出費のために、この抗体治療が必要とする多くの患者に利用できなくなる。
【０００５】
(発明の概要)
我々は、驚くべきことに、少なくとも一のＩＬ-１５タンパク質、ＩＬ-１５変異タンパク質ないしはＩＬ-１５断片を含有してなる本発明の組成物及びワクチンのそれぞれが、強力な免疫応答、特に強力な抗体応答を誘導し、自己抗原ＩＬ-１５に対する抗体力価を高めることができることを発見した。さらに、我々は、驚くべきことに、本発明の組成物及びワクチンのそれぞれが、関節リウマチなどのＩＬ-１５が重大な役割を果たす自己免疫性疾患及び／又は炎症性疾患の誘導及び進行に対して予防的効果及び／又は治療的効果を有する、強力な免疫応答、特に強力な抗体応答を誘導することができることを発見した。さらに、我々は、驚くべきことに、本発明の組成物及びワクチンのそれぞれが、アテローム性動脈硬化の誘導及び進行に対して予防的効果及び／又は治療的効果を有する、強力な免疫応答、特に強力な抗体応答を誘導することができることを発見した。したがって、このことから、免疫応答、特に本発明の組成物及びワクチンのそれぞれによって産生される抗体が、インビボでＩＬ-１５を特異的に認識することができ、その機能を阻害しうることが示唆される。
【０００６】
したがって、第一の態様では、本発明は、(a) 少なくとも一の第一付着部位を有するウイルス様粒子(ＶＬＰ)；と(b) 少なくとも一の第二付着部位を有する少なくとも一の抗原；を含んでなり、該少なくとも一の抗原がＩＬ-１５タンパク質、ＩＬ-１５変異タンパク質ないしＩＬ-１５断片であり、(a)と(b)が該少なくとも一の第一付着部位と該少なくとも一の第二付着部位を介して結合して、好ましくは規則的に反復した抗原アレイを形成する組成物を提供する。本発明の好適な実施態様では、本発明の使用に好適なウイルス様粒子は、ウイルス、好ましくはＲＮＡバクテリオファージの組み換えタンパク質、好ましくは組み換えコートタンパク質、その変異体ないしはその断片を含有する。
【０００７】
ある好適な実施態様では、本発明の組成物は少なくとも一のＩＬ-１５変異タンパク質を含有する。ＩＬ-１５変異タンパク質はＩＬ-１５の生物学的活性を持たないが、ＩＬ-１５とほぼ同じタンパク質構造を保持するのが好ましい。ＩＬ-１５は強力なＴ細胞刺激性サイトカインである。したがって、本発明のＩＬ-１５変異タンパク質を含んでなる組成物は治療的に有効な医薬を提供する一方、典型的には、体内に生物学的に活性なＩＬ-１５が誘導されない。
ある好適な実施態様では、本発明の組成物は少なくとも一のＩＬ-１５断片を含有しており、該断片はＩＬ-１５の少なくとも一の抗原部位を含むものである。強力で保護的な免疫応答、特に抗体応答が確保される一方で、本発明のＩＬ-１５断片の使用により、自己特異的な細胞障害性Ｔ細胞応答が誘導される可能性が減少しうる。
【０００８】
他の態様では、本発明はワクチン組成物を提供する。さらに、本発明は、ヒト又は動物、好ましくは哺乳動物へのワクチン組成物の投与方法を提供する。本発明のワクチン組成物は、少なくとも一のアジュバントなしで強力な免疫応答、特に抗体応答を誘導することができる。したがって、ある好適な実施態様では、ワクチンはアジュバントを欠いている。アジュバントの使用を避けることによって、望ましくない炎症性Ｔ細胞応答が生じる可能性が減少しうる。
ある好適な実施態様では、組成物及びワクチン組成物のそれぞれに含まれる本発明のＶＬＰは、宿主内で組み換えて産生されるものであり、ＲＮＡファージのＶＬＰは基本的に宿主のＲＮＡ又は宿主のＤＮＡ、好ましくは宿主の核酸を含まない。これは、宿主のＲＮＡないしは宿主のＤＮＡ、好ましくは宿主の核酸を減少する、好ましくは除去して、望ましくないＴ細胞応答並びに発熱などの他の望ましくない副作用を避けるという利点がある。
【０００９】
ある態様では、本発明は、アテローム性動脈硬化、喘息又は、ＩＬ-１５タンパク質がその症状を媒介するかその症状の一因となっている、炎症性疾患及び／又は自己免疫性疾患の治療方法であり、本発明の組成物ないしは本発明のワクチン組成物のそれぞれが動物又はヒトに投与されることを含む方法を提供する。ＩＬ-１５タンパク質がその症状を媒介するかその症状の一因となっている、炎症性疾患及び／又は自己免疫性疾患には、例えば限定するものではないが、関節リウマチ、乾癬性関節炎、若年性突発性関節炎、乾癬、クローン病がある。
更なる態様では、本発明は、本発明の組成物と受容可能な薬剤的担体を含有してなる薬剤組成物を提供する。
【００１０】
より更なる態様では、本発明は、(a) 少なくとも一の第一付着部位を有するＶＬＰを供給する；(b) 少なくとも一の第二付着部位を有するＩＬ-１５タンパク質、ＩＬ-１５変異タンパク質ないしはＩＬ-１５断片である、少なくとも一の抗原を供給する；そして(c) 該ＶＬＰと該少なくとも一の抗原を組み合わせて、該少なくとも一の第一付着部位と該少なくとも一の第二付着部位を介して少なくとも一の抗原と該ＶＬＰが結合している、組成物を産生する、ことを含む、本発明の組成物の産生方法を提供する。
【００１１】
(発明の詳細な説明)
定義：
抗原：本明細書で使用するように、「抗原」という用語は、ＭＨＣ分子によって提示される場合、抗体又はＴ細胞レセプター(ＴＣＲ)に結合されうる分子を指す。「抗原」という用語は、本明細書で使用するように、Ｔ細胞エピトープも含む。さらに抗原は、免疫系に認識されることができ、及び／又は、Ｂ及び／又はＴリンパ球の活性化がもたらされる体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を誘導することができる。しかしながら、このことは、少なくともいくつかの場合において、抗原がＴｈ細胞エピトープを含むかあるいはこれと連結し、アジュバント中に存在することが必要でありうる。抗原は、１つ又は複数のエピトープ(Ｂ及びＴエピトープ)を有しうる。上記の特異的な反応とは、抗原が、好ましくは典型的には非常に選択的な方式で、その対応する抗体又はＴＣＲと反応し、他の抗原によって誘発される可能性がある多数の他の抗体又はＴＣＲとは反応しないことを示すことを意図する。また、ここで用いた抗原はいくつかの別々の抗原の混合でもよい。
【００１２】
抗原性部位：本明細書中において相互に交換可能に用いられる「抗原性部位」なる用語及び「抗原性エピトープ」なる用語は、ＭＨＣ分子の環境におけるＴ細胞レセプター又は抗体によって免疫特異的に結合されるポリペプチドの連続的な又は非連続的な部位を意味する。免疫特異的な結合は、非特異的な結合が除外されるが必ずしも交差反応が除外されない。典型的に、抗原性部位は、抗原性部位に特有の空間的な立体構造内に５−１０アミノ酸を含有する。
結合(会合) (associated)：本明細書中で用いられる「結合(会合) (associated)」なる用語は、２つの分子がともに結合するすべての可能な方法、好ましくは化学的な相互作用を指す。化学的な相互作用には共有的相互作用及び非共有的相互作用が含まれる。非共有的相互作用の典型的な例は、イオン性相互作用、疎水性相互作用、又は水素結合であり、一方、共有的相互作用は、例として共有結合、例えばエステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、炭素−リン結合、炭素−イオウ結合、例えばチオエーテル、又はイミド結合ベースである。
【００１３】
第一付着部位：ここで用いる「第一付着部位」なる用語は、ＶＬＰに天然に生じる又はＶＬＰに人工的に付加される成分であり、第二付着部位が結合する部位を指す。第一付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成ポリマー、二次的代謝産物又は化合物(ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド)、又は化学反応基、例えばアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、グアニジル基、ヒスチジル基、又はこれらの組合せであってよい。第一付着部位である化学反応基の好適な実施態様は、リジンなどのアミノ酸のアミノ基である。第一付着部位は、典型的にはＶＬＰの表面上、好ましくはＶＬＰの外表面上に位置する。多数の第一付着部位が、典型的には反復形状で、ウイルス様粒子の表面上、好ましくは外表面上に存在する。好適な実施態様では、第一付着部位は、少なくとも一の共有結合を介して、好ましくは少なくとも一のペプチド結合を介してＶＬＰと会合(結合)する。
【００１４】
第二付着部位：ここで用いる「第二付着部位」なる用語は、本発明のＩＬ-１５に天然に生じる又は本発明のＩＬ-１５に人工的に付加される成分であり、第一付着部位が結合する部位を指す。本発明のＩＬ-１５の第二付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成ポリマー、二次的代謝産物又は化合物(ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド)、又は化学反応基、例えばアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、グアニジル基、ヒスチジル基、又はこれらの組合せであってよい。第二付着部位である化学反応基の好適な実施態様は、好ましくはシステインなどのアミノ酸のスルフヒドリル基である。したがって、「少なくとも一の第二付着部位を有するＩＬ-１５タンパク質」、「少なくとも一の第二付着部位を有するＩＬ-１５変異タンパク質」、「少なくとも一の第二付着部位を有するＩＬ-１５断片」又は「少なくとも一の第二付着部位を有する本発明のＩＬ-１５」なる用語は、本発明のＩＬ-１５と少なくとも一の第二付着部位を含むコンストラクトを指す。しかしながら、特に、ＩＬ-１５タンパク質、ＩＬ-１５変異タンパク質ないしはＩＬ-１５断片に天然に生じない第二付着部位の場合、典型的かつ好ましくは、そのようなコンストラクトはさらに「リンカー」を含む。他の好適な実施態様では、第二付着部位は、少なくとも一の共有結合を介して、好ましくは少なくとも一のペプチド結合を介して本発明のＩＬ-１５と会合(結合)する。さらに他の好適な実施態様では、第二付着部位は、好ましくはシステインを含むリンカーを介して本発明のＩＬ-１５に人工的に付加される。好ましくは、リンカーはペプチドにより本発明のＩＬ-１５に融合される。
【００１５】
コートタンパク質：本出願において、「コートタンパク質」なる用語と交換可能に用いられる「キャプシドタンパク質」なる用語は、ウイルスキャプシド又はＶＬＰ内に内包されうるウイルスタンパク質、好ましくはウイルス、好ましくはＲＮＡファージの天然のキャプシドのサブユニットを指す。典型的かつ好ましくは、「コートタンパク質」なる用語は、ウイルス、好ましくはＲＮＡバクテリオファージのゲノム、又はウイルス、好ましくはＲＮＡバクテリオファージの変異体のゲノムによってコードされるコートタンパク質を指す。より好ましくは、例として、「ＡＰ２０５のコートタンパク質」なる用語は、配列番号１４又は、第一メチオニンが配列番号１４から切断されているアミノ酸配列を指す。より好ましくは、例として、「Ｑβのコートタンパク質」はＮ末端のメチオニンの有無にかかわらず、配列番号１(「Ｑβ ＣＰ」)と配列番号２(Ａ１)を指す。バクテリオファージＱβのキャプシドは主にＱβ ＣＰと少量のＡ１タンパク質からなる。
【００１６】
本発明のＩＬ-１５：本明細書中で用いる「本発明のＩＬ-１５」なる用語は、本明細書中で定義する少なくとも一のＩＬ-１５タンパク質、少なくとも一のＩＬ-１５変異タンパク質ないしは少なくとも一のＩＬ-１５断片、又はその組合せを指す。
ＩＬ-１５タンパク質：本明細書中で用いる「ＩＬ-１５タンパク質」なる用語は、配列番号：２３のヒトＩＬ-１５、配列番号：２４のマウスＩＬ-１５、配列番号：２５のラットＩＬ-１５、又は任意の他の動物由来の対応するオルソログを含む、あるいは好ましくはそれからなるポリペプチドを包含する。さらにまた、本明細書中で用いる「ＩＬ-１５タンパク質」なる用語は、配列番号：２３のヒトＩＬ-１５、配列番号：２４のマウスＩＬ-１５、配列番号：２５のラットＩＬ-１５、又は任意の他の動物由来の対応するオルソログと、７０％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上及び最も好ましくは９７％以上のアミノ酸配列相同性を有する任意の遺伝的に操作した変異体又は天然の変異体を含むか、ないしは好ましくはそれからなる任意のポリペプチドを包含する。本明細書中で用いる「ＩＬ-１５タンパク質」なる用語は、限定するものではないが、上記に定義するＩＬ-１５タンパク質のリン酸化、アセチル化、グリコシル化を含む翻訳後修飾をさらに包含する。好ましくは、本明細書中で定義するＩＬ-１５タンパク質は、最大５００アミノ酸長、さらにより好ましくは最大３００アミノ酸長、さらにより好ましくは最大２００アミノ酸長、及びさらにより好ましくは最大１５０、さらにより好ましくは最大１３０アミノ酸長からなる。典型的かつ好ましくは、ＩＬ-１５タンパク質は、例えばＥＬＩＳＡにより検査されるような、ＩＬ-１５に特異的に結合する抗体の産生をインビボで誘導できる。
【００１７】
ＩＬ-１５変異タンパク質：本明細書中の「ＩＬ-１５変異タンパク質」なる用語は、ＩＬ-１５タンパク質である任意のポリペプチドであり、ＩＬ-１５生物学的活性を有さないポリペプチドを包含する。より好ましくは、「ＩＬ-１５変異タンパク質」なる用語は、配列番号：２３のヒトＩＬ-１５、配列番号：２４のマウスＩＬ-１５、配列番号：２５のラットＩＬ-１５、又は任意の他の動物由来の対応するオルソログと、少なくとも１つ及び最大６つ、好ましくは最大５つ、より好ましくは最大４つ、より好ましくは最大３つ、さらにより好ましくは最大２つ、最も好ましくは１つのアミノ酸が異なる任意のポリペプチドであり、ＩＬ-１５の生物学活性を有さないポリペプチドを指す。典型的及び好ましくは、ＩＬ-１５変異タンパク質を含有する本発明の組成物は、ＩＬ-１５に特異的に結合する抗体の産生をインビボで誘導することができる。本明細書中で用いる「ＩＬ-１５の生物学活性」なる用語は、Ｔリンパ球増殖及び／又は分化を刺激することができることを指す。
【００１８】
ＩＬ-１５の生物学活性を測定するための典型的かつ好適なアッセイは欧州特許第0772624号の実施例２に開示されており、出典明記によって本明細書中に組み込まれる。ＩＬ-１５タンパク質は、ポジティブコントロールとして用いる対応する野生型ＩＬ-１５を用いた同じ実験において試験される。対応する野生型ＩＬ-１５は、ＩＬ-１５タンパク質と同じ種のＩＬ-１５を指す。タンパク質濃度アッセイ、例えばブラッドフォード(Bradford)アッセイを行って、化学量論的に等しい量のＩＬ-１５タンパク質の変異体と、ポジティブコントロールとして用いたそれに対応する野生型ＩＬ-１５が同じ実験で試験されることを確認する。試験したＩＬ-１５の量とポジティブコントロールとして用いた対応する野生型ＩＬ-１５が互いに３％以上、好ましくは１％以上異ならない場合に等しい量とみなす。
ＩＬ-１５タンパク質が等量のポジティブコントロールとして用いた対応する野生型ＩＬ-１５のＩＬ-１５生物学的活性の最大２０％、好ましくは１０％、より好ましくは５％、さらにより好ましくは１％、さらにより好ましくは０．２％を有する場合、特定のＩＬ-１５タンパク質はＩＬ-１５の生物学活性を有さない。
【００１９】
ＩＬ-１５断片：本明細書中で用いる「ＩＬ-１５断片」なる用語は、本明細書中で定義するようなＩＬ-１５タンパク質ないしＩＬ-１５変異タンパク質の少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１７、１８、１９、２０、２５、３０の連続するアミノ酸を含有するか、あるいは好ましくはこれらからなる任意のポリペプチド、並びにそれに対して６５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上及びさらにより好ましくは９５％以上のアミノ酸配列相同性を有する任意のポリペプチドを包含する。好ましくは、本明細書中で用いる「ＩＬ-１５断片」なる用語は、本明細書中で定義するようなＩＬ-１５タンパク質ないしＩＬ-１５変異タンパク質の少なくとも６の連続するアミノ酸を含有するか、あるいは好ましくはこれらからなる任意のポリペプチド、並びにそれに対して８０％以上、８５％以上、好ましくは９０％以上及びさらにより好ましくは９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する任意のポリペプチドを包含する。ＩＬ-１５断片の好適な実施態様は、ＩＬ-１５タンパク質ないしＩＬ-１５変異タンパク質の内部欠損型又は切断型である。典型的かつ好ましくは、ＩＬ-１５断片は、ＩＬ-１５に特異的に結合できる抗体のインビボでの産生を誘導できる。
【００２０】
ポリペプチドのアミノ酸相同性は、ベストフィット(Bestfit)などの公知のコンピュータプログラムを用いて慣習的に測定することができる。ベストフィットないしは任意の他の配列アラインメントプログラムを用いて、好ましくはベストフィットを用いて、特定の配列が例えば参照するアミノ酸配列に対して９５％の相同性があるかどうかを決定するために、参照アミノ酸配列の完全長に対する相同性の割合が算出され、参照配列中のアミノ酸残基の合計数の５％以下の相同性にギャップが挿入されるようにパラメータを設定する。ポリペプチド間の相同性の割合を測定する前述の方法は、本発明に開示するすべてのタンパク質、ポリペプチドないしはその断片に適するものである。
結合(linked)：ここで用いられる場合、「結合(連結)」なる用語は、可能であれば、好ましくは少なくとも第一付着部位と少なくとも一の第二付着部位がともに連結する化学的な相互作用を意味する。化学的な相互作用には共有的相互作用や非共有的相互作用が含まれる。非共有的相互作用の典型的な例は、イオン性相互作用、疎水性相互作用又は水素結合であるのに対して、共有的相互作用は、共有結合、例えばエステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、炭素-リン結合、炭素-イオウ結合、例えばチオエーテル又はイミド結合ベースのものである。ある好適な実施態様では、第一付着部位と第二付着部位は、少なくとも一の共有結合、好ましくは少なくとも一の非ペプチド結合、よりさらに好ましくは、非ペプチド結合のみを介して結合される。しかしながら、ここで用いられる「結合」なる用語は、少なくとも一の第一付着部位と少なくとも一の第二付着部位の直接結合を包含するだけでなく、選択的に好ましくは、中間分子、及びこれによって典型的かつ好ましくは、少なくとも一の、好ましくは一のヘテロ二官能性架橋剤を介して、少なくとも一の第一付着部位と少なくとも一の第二付着部位との間接的な結合も包含する。
【００２１】
リンカー：本明細書で使用する「リンカー」は、第二付着部位と本発明のＩＬ-１５を結合させるか、第二付着部位を既に含むか、基本的に第二付着部位からなるか第二付着部位からなる。好ましくは、本明細書中で用いる「リンカー」は第二付着部位を、典型的かつ好ましくは、限定するものではないが、一アミノ酸残基として、好ましくはシステイン残基として既に含む。また、本明細書中で用いる「リンカー」は、特に本発明のリンカーが少なくとも一のアミノ酸残基を含有する場合、「アミノ酸リンカー」と称する。したがって、「リンカー」と「アミノ酸リンカー」なる用語は、本明細書中において相互に交換可能に用いられる。しかしながら、この用語は、アミノ酸残基からなるアミノ酸リンカーが本発明の好ましい実施態様である場合でも、このようなアミノ酸リンカーがアミノ酸残基のみからなることを示すことを意味するものではない。リンカーのアミノ酸残基は、当分野で知られている天然に存在するアミノ酸又は非天然アミノ酸、すべてのＬ型又はすべてのＤ型、あるいはこれらの混合物から構成されることが好ましい。したがって、スルフヒドリル基又はシステイン残基を含有する分子は本発明のリンカーの好適な実施態様であり、このような分子も本発明内に含まれる。さらに、本発明に有用なリンカーは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−、シクロアルキル、例えばシクロペンチル又はシクロヘキシル、シクロアルケニル、アリール又はヘテロアリール分子を含有する分子である。さらに好ましくは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−、シクロアルキル(Ｃ５、Ｃ６)、アリール、又はヘテロアリール部分と付加的なアミノ酸を含んでなるリンカーも本発明のためのリンカーとして使用可能であり、本発明の範囲内である。本発明のＩＬ-１５とリンカーの間の会合(結合)は、少なくとも１つの共有結合によるものであることが好ましく、少なくとも１つのペプチド結合によるものであることがより好ましい。
【００２２】
規則的で反復性の抗原アレイ：本明細書で用いる「規則的で反復性の抗原アレイ」なる用語は、一般的に、それぞれウイルス様粒子との関係で抗原中に、典型的に好ましくは非常に規則的に均一に空間的に配置していることに特徴がある、抗原の反復パターンを指す。本発明の一実施態様では、反復パターンは幾何学的パターンである。ＲＮＡファージのＶＬＰなどの本発明の特定の実施態様では、好ましくは１から３０ナノメーターの間隔、好ましくは２から１５ナノメーターの間隔、より好ましくは２から１０ナノメーターの間隔、さらにより好ましくは２から８ナノメーターの間隔、さらにより好ましくは１．６から７ナノメーターの間隔を有する、抗原の準結晶性の、厳密に反復的な順序配列を持つ、好適に規則的で反復性の抗原の典型的かつ好ましい例である。
パッケージ化(packaged)：本明細書で使用するように、「パッケージ化」という用語は、ＶＬＰとの関係でのポリ陰イオン性高分子の状態を指す。本明細書中で用いる「パッケージ化」という用語は、共有、たとえば化学的カップリング、又は非共有、たとえばイオン性相互作用、疎水性相互作用、水素結合などでありうる結合を含む。また、この用語にはポリ陰イオン性高分子の封入ないしは部分的な封入が含まれる。したがって、ポリ陰イオン性高分子を、実際に結合、特に共有結合しなくても、ＶＬＰによって封入することができる。好適な実施態様では、少なくとも一のポリ陰イオン性高分子はＶＬＰ内に、最も好ましくは非共有的様式にてパッケージ化される。
【００２３】
ポリペプチド：本願明細書中で用いられる「ポリペプチド」なる用語は、アミド結合(ペプチド結合ともいう)によって、線形に連結される単量体(アミノ酸)から成る分子を指す。これはアミノ酸の分子鎖を示し、特定の長さの産物を指すわけではない。ゆえに、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質は、ポリペプチドの定義の中に含まれる。たとえば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ポリペプチドの翻訳後修飾も包含する。
ウイルス粒子：本明細書中で用いられる「ウイルス粒子」なる用語は、ウイルスの形態学的形状を意味する。いくつかのウイルス型には、タンパク質キャプシドに囲まれるゲノムを含む；他のものは付加的な構造(例えばエンベロープ、テイルなど)を有する。
【００２４】
ここで用いられるウイルス様粒子(ＶＬＰ)は、非複製性又は非感染性、好ましくは非複製性かつ非感染性のウイルス粒子を指し、又はウイルス粒子、好ましくはウイルスのキャプシドに類似する非複製性又は非感染性、好ましくは非複製性かつ非感染性の構造を指す。本明細書中で用いる「非複製性」なる用語は、ＶＬＰに含まれるゲノムを複製することができないことを意味する。本明細書中で用いる「非感染性」なる用語は、宿主細胞に侵入できないことを意味する。好ましくは、本発明のウイルス様粒子は、ウイルスゲノムないしはウイルスゲノム機能の全て又は一部を欠いているため、非複製性及び／又は非感染性である。一実施態様では、ウイルス様粒子はウイルス粒子であり、このウイルスゲノムは物理的又は科学的に不活性化されている。典型的かつより好ましくは、ウイルス様粒子はウイルスゲノムの複製性及び感染性の相等物のすべて又は一部を欠いている。本発明のウイルス様粒子は、それらのゲノムと異なる核酸を含みうる。本発明のウイルス様粒子の典型的かつ好ましい実施態様では、対応するウイルス、バクテリオファージ、好ましくはＲＮＡファージのウイルスキャプシド等の、ウイルスキャプシドである。「ウイルスキャプシド」又は「キャプシド」なる用語は、ウイルスタンパク質のサブユニットから構成される巨大分子の集合体を指す。典型的には、６０、１２０、１８０、２４０、３００、３６０及び３６０以上のウイルスタンパク質サブユニットである。典型的かつ好ましくは、これらのサブユニットの相互作用により、固有の反復して組織化される、ウイルスキャプシド又はウイルスキャプシド様構造が形成される。前記構造は典型的には球状又は管状である。
【００２５】
ＲＮＡファージのウイルス様粒子：本明細書中で用いる「ＲＮＡファージのウイルス様粒子」なる用語は、ＲＮＡファージのコートタンパク質、その変異体ないしは断片を含んでなる、好ましくは基本的にこれからなる、あるいはこれからなるウイルス様粒子を指す。さらに、ＲＮＡファージの構造に類似するＲＮＡファージのウイルス様粒子は非複製性及び／又は非感染性であり、ＲＮＡファージの複製機構をコードする少なくとも一の遺伝子、好ましくは複数の遺伝子を欠損しており、及び典型的には、宿主にウイルスが接着するか侵入するためのタンパク質又はそれに関与するタンパク質をコードする一又は複数の遺伝子を欠損する。しかしながらまた、この定義には、前述の遺伝子又は遺伝子群が存在するが不活性であるため、ＲＮＡファージのウイルス様粒子が非複製性及び／又は非感染性となる、ＲＮＡファージのウイルス様粒子が包含される。本開示の範囲内で、「サブユニット」及び「単量体」なる用語は、この文脈において、相互に交換可能に、同等に用いられる。本出願では、「ＲＮＡファージ」なる用語及び「ＲＮＡ-バクテリオファージ」なる用語は、相互に交換可能に使われる。
【００２６】
Ｏｎｅ、ａ、又はａｎ：用語「ｏｎｅ」、「ａ」、又は「ａｎ」を本開示中で使用するとき、それらは、特に示さない限りは、「少なくとも一」、又は「一又は複数」を意味する。
この出願において、抗体は、１０６Ｍ−１又はそれ以上、好ましくは１０７Ｍ−１又はそれ以上、より好ましくは１０８Ｍ−１又はそれ以上、最も好ましくは１０９Ｍ−１又はそれ以上の結合親和性(Ｋａ)で、抗原と結合するならば、特異的に結合するものと定義される。抗体の親和性は、(例えばスキャッチャード分析により)通常の当業者によって容易に測定され得る。
【００２７】
この発明は、動物又はヒトにおいてＩＬ-１５に対する免疫応答を亢進するための組成物及び方法を提供する。本発明の組成物は、(a) 少なくとも一の第一付着部位を有するウイルス様粒子(ＶＬＰ)；と(b) 少なくとも一の第二付着部位を有する少なくとも一の抗原を含んでなり、該少なくとも一の抗原がＩＬ-１５タンパク質、ＩＬ-１５変異タンパク質ないしはＩＬ-１５断片であり、(a)と(b)が該少なくとも一の第一付着部位と該少なくとも一の第二付着部位を介して結合しているものである。好ましくは、ＩＬ-１５タンパク質、ＩＬ-１５変異タンパク質ないしはＩＬ-１５断片はＶＬＰに結合しており、規則的で反復性の抗原-ＶＬＰアレイを形成する。本発明の好適な実施態様では、本発明の少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、より好ましくは少なくとも６０、さらにより好ましくは少なくとも１２０及びさらにより好ましくは少なくとも１８０の本発明のＩＬ-１５がＶＬＰに結合する。
規則的で反復性の構造を有する当分野で公知の任意のウイルスは、本発明のＶＬＰとして選択してもよい。ＶＬＰの調整のために使用されうる具体的なＤＮＡないしＲＮＡウイルスのコート又はキャプシドタンパク質は、国際公開公報2004/009124の２５頁の１０−２１行目、２６頁の１１−２８行目及び２８頁の４行目から３１頁の４行目に開示されている。これらの開示内容は出典明記により本明細書中に組み込まれる。
【００２８】
ウイルスないしウイルス様粒子は産生され、ウイルス感染細胞培養物から精製することができる。ワクチンのためには、結果として生じるウイルスないしウイルス様粒子は病原性を欠失させる必要がある。病原性のウイルスないしウイルス様粒子は、ＵＶ照射、ホルムアルデヒド処理等の物理的又は化学的な不活性化によって生成してもよい。あるいは、ウイルスが複製できなくなるように、ウイルスのゲノムを変異ないしは欠損によって遺伝的に操作してもよい。
好適な一実施態様では、ＶＬＰは組み換えＶＬＰである。ほとんどすべての一般的に公知のウイルスは配列決定されており、容易に入手可能である。コートタンパク質をコードする遺伝子は当業者に容易に同定されうる。宿主内でコートタンパク質を組み換え発現させることによるＶＬＰの調整は、当業者の共通の知識内である。
【００２９】
好適な一実施態様では、ウイルス様粒子は、a) ＲＮＡファージ；b) バクテリオファージ；c) Ｂ型肝炎ウイルス、好ましくはそのキャプシドタンパク質(Ulrich, 等, Virus Res. 50: 141-182 (1998))又はその表面タンパク質(国際公開公報92/11291)；d) はしかウイルス(Warnes, 等, Gene 160:173-178 (1995))；e) シンドビスウイルス；f) ロタウイルス(米国特許第5,071,651号及び米国特許第5,374,426号)；g) 口蹄疫ウイルス(Twomey, 等, Vaccine 13:1603 1610, (1995))；h) ノーウォークウイルス(Jiang, X., 等, Science 250:1580 1583 (1990)；Matsui, S.M., 等, J. Clin. Invest. 87:1456 1461 (1991))；i) アルファウイルス属；j) レトロウイルス、好ましくはそのＧＡＧタンパク質(国際公開公報96/30523)；k) レトロトランスポゾンＴｙ、好ましくはタンパク質ｐ１；l) ヒトパピローマウイルス(国際公開公報98/15631)；m) ポリオーマウイルス；n) タバコモザイク病ウイルス；及びo) Ｆｌｏｃｋハウスウイルスからなる群から選択されるウイルスの組み換えタンパク質、その変異体ないしはその断片を含むか、あるいはこれからなる。
好適な一実施態様では、ＶＬＰは、その組み換えタンパク質、その変異体ないしはその断片の一以上のアミノ酸配列、好ましくは２つのアミノ酸配列を含むか、これらからなる。一以上のアミノ酸配列を含むかそれらからなるＶＬＰを、本出願ではモザイクＶＬＰと称する。
【００３０】
ここで使用される「組み換えタンパク質の断片」なる用語又は「コートタンパク質の断片」なる用語は、野生型組み換えタンパク質又はコートタンパク質それぞれの長さの少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％であり、好ましくはＶＬＰを形成する能力を保持するポリペプチドとして定義される。好ましくは、該断片は、少なくとも一の内部欠失、少なくとも一の切断、又はそれらの少なくとも一の組合せから得られる。「組み換えタンパク質の断片」又は「コートタンパク質の断片」なる用語は、上で定義した「組み換えタンパク質の断片」又は「コートタンパク質の断片」のそれぞれと、少なくとも８０％、好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％のアミノ酸配列同一性を有し、好ましくはウイルス様粒子内に集合化することができるポリペプチドをさらに包含する。
本発明で交換可能に使用される「変異体組み換えタンパク質」なる用語又は「組み換えタンパク質の変異体」なる用語、本発明で交換可能に使用される「変異体コートタンパク質」なる用語又は「コートタンパク質の変異体」なる用語は、野生型組み換えタンパク質又はコートタンパク質それぞれに由来するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指し、該アミノ酸配列は野生型配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の同一性であり、好ましくは集合してＶＬＰを形成する能力を保持している。
【００３１】
ＶＬＰ内へのコートタンパク質又は組み換えタンパク質の変異体又は断片の集合化(アセンブリ)は、当業者には理解されるように、大腸菌中でタンパク質を発現させ、場合によっては細胞可溶化物をゲル濾過することによりキャプシドを精製し、免疫拡散アッセイ(オークタロニーテスト)又は電子顕微鏡法(ＥＭ)(Kozlovska, T. M.等, Gene 137：133-37(1993))によりキャプシド形成を分析することにより、試験してもよい。免疫拡散アッセイ及びＥＭは、細胞可溶化物で直接実施してもよい。
好適な一実施態様では、本発明のウイルス様粒子はＢ型肝炎ウイルスである。Ｂ型肝炎ウイルス様粒子の調整は、特に国際公開公報00/32227、同01/85208及び同01/056905に開示されている。これら３つすべての文書は出典明記によって本明細書中に特別に組み込まれる。本発明の実施における使用に好適なＨＢｃＡｇの他の変異体は国際公開公報01/056905の３４−３９頁に開示されている。
【００３２】
本発明の更なる好適な一実施態様では、リジン残基はＨＢｃＡｇポリペプチドに導入され、本発明のＩＬ-１５のＨＢｃＡｇのＶＬＰへの結合を媒介する。好適な実施態様では、本発明の組成物及びＶＬＰは、配列番号２０のアミノ酸１−１４４又は１−１４９、１−１８５を含むか、あるいはこれからなるＨＢｃＡｇを用いて調整される。このアミノ酸は修飾されており、７９番目と８０番目のアミノ酸がGly-Gly-Lys-Gly-Glyのアミノ酸配列を有するペプチドに置き換わっている。この修飾により配列番号２０から配列番号２１に変化する。更なる好適な実施態様では、配列番号２１の４８番目と１１０番目のシステイン残基、又はその対応する断片、好ましくは１−１４４又は１−１４９がセリンに変異される。さらに、本発明は、上記の対応するアミノ酸変異を有するＢ型肝炎コアタンパク質変異を含有する組成物を包含する。さらに、本発明は、配列番号２１に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の同一性であるアミノ酸配列を含むか、あるいはこれからなるＨＢｃＡｇポリペプチドを含有する組成物及びワクチンのそれぞれを包含する。
本発明の他の実施態様では、ウイルス様粒子は、組み換えアルファウイルス、より具体的には組み換えシンドビスウイルスである。アルファウイルスは、ＤＮＡ中間生成物のない感染細胞の細胞質で完全にゲノムＲＮＡを複製する陽性の鎖ＲＮＡウイルスである(Strauss, J.及びStrauss, E., Microbiol. Rev. 58: 491-562 (1994))。アルファウイルスファミリのメンバーである、シンドビス(Schlesinger, S., Trends Biotechnol. 11:18-22 (1993))、セムリキ森林ウイルス(ＳＦＶ) (Liljestrom, P. & Garoff, H., Bio/Technology 9:1356-1361 (1991))及びその他(Davis, N.L. 等, Virology 171:189-204 (1989))は、ワクチン開発の候補として、及び様々な異なるタンパク質のウイルスベースの発現ベクター(Lundstrom, K., Curr. Opin. Biotechnol. 8:578-582 (1997))としての使用についてかなり注目されている。
【００３３】
本発明のある実施態様では、本発明のウイルス様粒子は、ＲＮＡ-ファージの組み換えコートタンパク質、その変異体ないしはその断片を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。好ましくは、ＲＮＡ-ファージは、ａ)バクテリオファージＱβ；ｂ)バクテリオファージＲ１７；ｃ)バクテリオファージｆｒ；ｄ)バクテリオファージＧＡ；ｅ)バクテリオファージＳＰ；ｆ)バクテリオファージＭＳ２；ｇ)バクテリオファージＭ１１；ｈ)バクテリオファージＭＸ１；ｉ)バクテリオファージＮＬ９５；ｋ)バクテリオファージｆ２；ｌ)バクテリオファージＰＰ７、及びｍ)バクテリオファージＡＰ２０５からなる群から選択される。
本発明の好適な一実施態様では、組成物は、ＲＮＡファージのコートタンパク質、その変異体ないしはその断片を含有し、該コートタンパク質は、(a) 配列番号：１(Ｑβ ＣＰを指す)；(b) 配列番号：１と配列番号：２の混合物(Ｑβ Ａ１タンパク質を指す)；(c) 配列番号：３；(d) 配列番号：４；(e) 配列番号：５；(f) 配列番号：６、(g) 配列番号：６と配列番号：７の混合物；(h) 配列番号：８；(i) 配列番号：９；(j) 配列番号：１０；(k) 配列番号：１１；(l) 配列番号：１２；(m) 配列番号：１３；及び(n) 配列番号：１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。一般的に、上記のコートタンパク質はＮ末端のメチオニンの有無にかかわらずＶＬＰ内に集合化することができる。
【００３４】
本発明の好適な一実施態様では、ＶＬＰは、ＲＮＡファージのコートタンパク質、その変異体ないしはその断片の一以上のアミノ酸配列、好ましくは２つのアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなるモザイクＶＬＰである。
とても好適な一実施態様では、ＶＬＰはＲＮＡファージの２つの異なるコートタンパク質を含むか、あるいはそれらからなるものであり、該２つのコートタンパク質は配列番号１と配列番号２、又は配列番号６と配列番号７のアミノ酸配列を有する。
本発明の好適な実施態様では、本発明のウイルス様粒子は、ＲＮＡ-バクテリオファージＱβ、ｆｒ、ＡＰ２０５又はＧＡの組み換えコートタンパク質、その変異体ないしはその断片を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。
好適な一実施態様では、本発明のＶＬＰはＲＮＡファージＱβである。Ｑβのキャプシド又はウイルス様粒子は、直径２５ｎｍで、Ｔ＝３の疑似対称体の、正二十面体ファージ様キャプシド構造を示す。キャプシドは、ジスルフィド架橋により共有結合性の五量体及び六量体で結合して(Golmohammadi, R等, Structure 4：543-5554(1996))、際だって安定したＱβキャプシドとなる、コートタンパク質の１８０のコピーを含む。しかしながら、組換えＱβコートタンパク質から作製されるキャプシド又はＶＬＰは、キャプシド内の他のサブユニットへ、ジスルフィド結合を介して結合していないか、又は不完全に結合するサブユニットを含んでいてもよい。Ｑβのキャプシド又はＶＬＰは、有機溶媒及び変性剤に対し、普通ではない耐性を示す。驚くべきことに、我々は、１Ｍの高さの濃度のグアニジウム、３０％の高さの濃度のアセトニトリル及びＤＭＳＯがキャプシドの安定性に影響しないことを発見した。Ｑβのキャプシド又はＶＬＰの高い安定性は、本発明の哺乳動物及びヒトの免疫化及びワクチン接種における使用に特に有用な性質である。
【００３５】
さらに好適な本発明のＲＮＡファージ、特にＱβ及びｆｒのウイルス様粒子は国際公開公報02/056905に開示されており、この開示内容は出典明記により本明細書中に組み込まれる。特に、国際公開公報02/056905の実施例１８にＱβのＶＬＰ粒子の調整について詳しく記載されている。
他の好適な実施態様では、本発明のＶＬＰは、ＲＮＡファージＡＰ２０５のＶＬＰである。また、アミノ酸５のプロリンがスレオニンに置換しているＡＰ２０５コートタンパク質を含む、ＡＰ２０５ ＶＬＰの集合体コンピテント変異体型を本発明の実施に使用してもよく、本発明の他の好適な実施態様となる。国際公開公報2004/007538の特に実施例１及び実施例２には、ＡＰ２０５コートタンパク質を含有するＶＬＰの入手方法、とりわけその発現と精製について記載されている。国際公開公報2004/007538は出典明記によって本明細書中に組み込まれる。ＡＰ２０５ ＶＬＰは高い免疫原性があり、本発明のＩＬ-１５と結合して、典型的かつ好ましくは、反復様式で配位する本発明のＩＬ-１５を表出するワクチンコンストラクトを生成することができる。表出された本発明のＩＬ-１５に対して高い抗体力価が誘発されることから、結合した本発明のＩＬ-１５が抗体分子との相互作用のためにアクセス可能であり、免疫原性であることが示される。
【００３６】
好適な一実施態様では、本発明のＶＬＰは、ウイルス、好ましくはＲＮＡファージの変異体コートタンパク質を含むかあるいはこれからなるものであり、該変異体コートタンパク質は置換及び／又は欠失によって少なくとも一のリジン残基が除去されて修飾されている。他の好適な実施態様では、本発明のＶＬＰは、ウイルス、好ましくはＲＮＡファージの変異体コートタンパク質を含むかあるいはこれからなるものであり、該変異体コートタンパク質は置換及び／又は挿入によって少なくとも一のリジン残基が付加されて修飾されている。あるとても好適な実施態様では、変異体コートタンパク質はＲＮＡファージＱβであり、少なくとも１、あるいは少なくとも２のリジン残基が置換又は欠失によって除去されている。またとても好適な実施態様では、変異体コートタンパク質はＲＮＡファージＱβのものであり、少なくとも１、あるいは少なくとも２のリジン残基が置換又は挿入によって付加されている。更なる好適な一実施態様では、ＲＮＡファージＱβの変異体コートタンパク質は、配列番号１５−１９の何れか一から選択されるアミノ酸配列を有する。特にワクチンの必要性に合わせて調整するために、少なくとも一のリジン残基の欠失、置換又は付加によって、カップリングの程度、すなわち、ウイルス、好ましくはＲＮＡファージのＶＬＰのサブユニット当たりの本発明のＩＬ-１５の量を変えることができる。
【００３７】
好適な一実施態様では、本発明の組成物及びワクチンは、０．５〜４．０の抗原密度を有する。ここで使用される「抗原密度」なる用語は、サブユニット当たり、好ましくはＶＬＰのコートタンパク質当たり、好ましくはＲＮＡファージのＶＬＰのコートタンパク質当たりに結合する本発明のＩＬ-１５の平均数を意味するものである。よって、この値は、本発明の組成物又はワクチン中での、ＶＬＰ、好ましくはＲＮＡファージのＶＬＰのモノマー又はサブユニット全体の平均として算出される。
本発明の他の好適な実施態様では、ウイルス様粒子は、Ｑβの変異体コートタンパク質、又はその変異体ないしはその断片、及び対応するＡ１タンパク質を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。更なる好適な実施態様では、ウイルス様粒子は、アミノ酸配列 配列番号１５、１６、１７、１８又は１９を有する変異体コートタンパク質及び対応するＡ１タンパク質を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。
【００３８】
また、アミノ酸５のプロリンがスレオニンに、アミノ酸１４のアスパラギンがアスパラギン酸に置換しているＡＰ２０５コートタンパク質を含む、ＡＰ２０５ ＶＬＰの集合体化コンピテント変異体型を本発明の実施に用いてもよく、本発明の他の好適な実施態様となる。ＡＰ２０５Ｐｒｏ-５-ＴｈｒのクローニングとＶＬＰの精製は国際公開公報2004/007538の特に実施例１及び実施例２に開示されており、出典明記によって本明細書中に組み込まれる。
さらにまた、ＲＮＡファージコートタンパク質は、細菌宿主内で発現すると自己集合体化することが示されている(Kastelein, RA. 等, Gene 23:245-254 (1983)、Kozlovskaya, TM. 等, Dokl. Akad. Nauk SSSR 287:452-455 (1986)、Adhin, MR. 等, Virology 170:238-242 (1989)、Priano, C. 等, J. Mol. Biol. 249:283-297 (1995))。特に、ＧＡ (Ni, CZ., 等, Protein Sci. 5: 2485-2493 (1996)、Tars, K 等, J. Mol.Biol. 271:759-773(1997))及び、ｆｒ (Pushko P. 等, Prot. Eng. 6: 883-891 (1993)、Liljas, L 等 J Mol. Biol. 244:279-290, (1994))の生物学的及び生化学的性質は開示されている。いくつかのＲＮＡバクテリオファージの結晶構造が決定されている(Golmohammadi, R. 等, Structure 4:543-554 (1996))。そのような情報を用いて、表面に曝された残基を同定して、ＲＮＡファージコートタンパク質を修飾して、一又は複数の反応性のアミノ酸残基を挿入又は置換によって挿入することができる。ＲＮＡファージ由来のＶＬＰの他の利点は、安価で大量の物質を産生することが可能となる細菌での発現回収率が高いことである。
【００３９】
好適な一実施態様では、本発明の組成物は少なくとも一の抗原を含有するものであり、該少なくとも一の抗原はＩＬ-１５タンパク質、ＩＬ-１５変異タンパク質ないしはＩＬ-１５断片である。好適な一実施態様では、ＩＬ-１５タンパク質、ＩＬ-１５変異タンパク質ないしはＩＬ-１５断片は、(a) ヒト起源；(b) ウシ起源；(c) ヒツジ起源；(d) イヌ起源；(e) ネコ起源；(f) マウス起源；(g) ブタ起源；(h) ニワトリ起源；(i) ウマ起源；及び(g) ラット起源からなる群から選択される起源から選択される。
好適な一実施態様では、少なくとも一の抗原はＩＬ-１５タンパク質である。更なる好適な実施態様では、ＩＬ-１５タンパク質は、(a) 配列番号22；(b) 配列番号23；(c) 配列番号24；(d) 配列番号25；及び(e) 配列番号２２−２５の何れかと少なくとも８０％、又は好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、又は最も好ましくは少なくとも９５％の相同性であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからそれらからなる。
【００４０】
他の好適な実施態様では、少なくとも一の抗原はＩＬ-１５変異タンパク質である。ＩＬ-１５変異タンパク質は、ＩＬ-１５生物活性を有さないが、ＩＬ-１５に対して特異的な抗体応答を誘導できる。したがって、本発明の抗原としてＩＬ-１５変異タンパク質を使用することによって、本発明のＶＬＰに結合したＩＬ-１５を導入したことによる予想外で望まれない副作用を確実に回避する。米国特許第6013480号では、ＩＬ-１５Ｒα-サブユニットへの結合が可能で、ＩＬ-１５レセプター複合体のβ-又はγ-サブユニットによるシグナルを変換することができない２つの変異タンパク質が開示されている。また、生物学的な活性がなく、α-サブユニットに結合ができない変異タンパク質が開示されている(Bernard J. 等 J Biol Chem. (2004)、279(23): 24313-22)であった。したがって、ある好適な実施態様では、ＩＬ-１５変異タンパク質は、(a) 配列番号２３、この位置４６がＥでない、(b) 配列番号２３、この位置５０がＩでない、(c) 配列番号２３、この位置４６がＥでなく、位置５０がＩでない、(d) 配列番号３１、(e) 配列番号３２、(f) 配列番号３３、及び(g) 配列番号２３に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、又は最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列であり、このとき、配列番号２３の位置４６に一致する位置がＥでない、又は配列番号２３の位置５０に一致する位置がＩでない、又は配列番号２３の位置４６に一致する位置がＥでなくかつ配列番号２３の位置５０に一致する位置がＩでないアミノ酸配列、(h) 配列番号２３、このアミノ酸残基Ａｓｐ８とＧｌｎ１０８の何れか又はその両方が欠失しているか異なる天然に生じるアミノ酸に置換している、(i) 配列番号２３、このアミノ酸残基Ｇｌｎ１０１とＧｌｎ１０８の何れか又はその両方が欠失しているか異なる天然に生じるアミノ酸に置換している、(j) 配列番号４２、(j) 配列番号２３、この位置８がＡｓｐでなく、好ましくはＡｓｐ又はＧｌｕでない、(k) 配列番号２３、このＡｓｐ８とＧｌｎ１０８の何れか又はその両方がセリン又はシステインによって、各々置換される、(l) 配列番号２３、位置８、１０１および１０８の中の少なくとも一つのアミノ酸が欠失しているか好ましくは置換している、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、それからなる。
【００４１】
更なるある好適な実施態様では、ＩＬ-１５変異タンパク質は、位置４６はＧｌｕでなく、Ａｓｐ、Ｇｌｎ又はＡｓｎでない、配列番号２３のアミノ酸配列を含むか、それからなる。なお更なる好適な実施態様では、ＩＬ-１５変異タンパク質は、配列番号３１のアミノ酸配列を含むか、それからなる。
更なるある好適な実施態様では、ＩＬ-１５変異タンパク質は、位置５０がＩｌｅ又はＬｅｕでない、配列番号２３のアミノ酸配列を含むか、それからなる。更なる好適な実施態様では、ＩＬ-１５は、位置５０がＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ又はＶａｌでない、アミノ酸配列を有する。なお更なる好適な実施態様では、ＩＬ-１５変異タンパク質は、配列番号３２のアミノ酸配列を含むか、それからなる。
更なるある好適な実施態様では、ＩＬ-１５変異タンパク質は、位置４６がＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ又はＡｓｎでなく、位置５０がＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ又はＶａｌでない、配列番号２３のアミノ酸配列を含むか、それからなる。なお更なる好適な実施態様では、ＩＬ-１５変異タンパク質は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むか、それからなる。
更なる他の好適な実施態様では、少なくとも一の抗原はＩＬ-１５断片であり、該ＩＬ-１５断片は少なくとも一の抗原性部位を含むか、あるいはそれからなる。
【００４２】
免疫原性の保持には通常タンパク質の完全長を必要としないことと、通常、タンパク質は複数の抗原エピトープ、すなわち抗原性部位を含有することが知られている。断片又は短いペプチドは、免疫特異的に抗体又は、ＭＨＣ分子との関係でＴ細胞レセプターに結合されうる少なくとも一つの抗原性部位を含有するために十分であるかもしれない。抗原性部位又は複数の部位は、当分野の技術者に一般に公知の多くの技術で決定されうる。それは、配列アラインメントや構造予測によって、なされうる。例えば、Rasmolなどのプログラムを用いて、可能性のあるα-ヘリックス、ターン、鎖間及び鎖内ジスルフィド結合などを予測するものがある。さらに、分子の表面に露出する分子又は配列内に埋没される配列を予測するものもある。分子の表面に露出する配列は、おそらく、天然の抗原性部位(一又は複数)を含んでなるため、治療的抗体を誘導する際に有用である。表面ペプチド配列を決定した後、例えば網羅的な突然変異誘発方法によって、この配列の範囲内の抗原性部位を更に決定してもよい(アラニンスキャニング突然変異誘発など、Cunningham BC, Wells JA. Science 1989 Jun 2、 244(4908): 1081-5)。一時的にこの配列内のアミノ酸を順次アラニンに変異し、アラニン突然変異が抗体に対する結合の低減(野生型配列に対して上昇)を示すアミノ酸又は全く結合を失うアミノ酸がおそらく抗原性部位の成分である。
【００４３】
抗原性部位(一又は複数)を決定する他の方法は、ＩＬ-１５ (Geysen, PNAS Vol 81: 3998-4002, (1984) and Slootstra, J. W. 等, (1996) Mol. Divers. 1, 87-96)の完全長配列を包含するオーバーラッピングペプチドを生成することである。通常、最初のスクリーニングとして、５〜１０のアミノ酸オーバーラップを有する２０〜３０のアミノ酸長のペプチドを化学的に合成してもよい。マウスを各々別々のペプチドで免疫化して、それらのマウスからポリクローナル血清を採取する。ポリクローナル血清が天然のＩＬ-１５タンパク質を認識するかどうかを、様々な方法、例えばＥＬＩＳＡ又は免疫沈降法を用いて試験できる。ＩＬ-１５タンパク質を認識する対応血清のペプチドが最も天然の抗原性部位を含有するもののようである。
抗原として単独で使われるか又は担体に結合されるペプチドは、完全長タンパク質の関係において、ある場合の立体構造と異なる立体構造に変わりうる。したがって、ＩＬ-１５で免疫化したマウスから得たポリクローナル血清へのペプチドの結合はクロスチェックするべきである。
【００４４】
あるいは、齧歯動物を完全長ＩＬ-１５タンパク質にて免疫化する。各々異なる部分的にオーバーラップしたペプチドとの結果として生じたポリクローナル血清の交差反応性を、多くの方法、例えばＥＬＩＳＡ、免疫沈降法又は質量分析によって、試験する。(Parker及びTomer, Mol. Biotechnol. 2002, 20, 49-62)。これらのペプチドは合成するか又は組換え体由来のものでありうる。
上述した手順を簡略化して、容易にする技術は有用である。例えば、ペプチドは、ランダムに生成され、ファージの表面にディスプレイすることができる。(Nilsson, Methods Enzymol. 2000、326:480-505、Winter Annu Rev Immunol. 1994、12:433-55、peptide phage display, Smith, Methods Enzymol. 1993、217:228-57)。必要とされる部分的にオーバーラップするペプチドの量は、ＳＰＯＴ技術を用いて有意に減らすことができる(Jerini S technology、 Sigma-Genosys)。
本発明の更なる好適な実施態様では、ＩＬ-１５断片は、本明細書で定義されるＩＬ-１５タンパク質ないしＩＬ-１５変異タンパク質の少なくとも５〜１２の隣接するアミノを含むか、あるいは好ましくはそれらからなる。
【００４５】
ある好適な実施態様では、ＩＬ-１５断片は、６０未満、好ましくは５０未満、好ましくは４０未満、さらにより好ましくは３０未満、さらにより好ましくは２０未満のアミノ酸長からなる。
更なる好適な実施態様では、ＩＬ-１５断片は、配列番号２３のアミノ酸４４−５２、好ましくはアミノ酸４４−５４、好ましくはアミノ酸４３−５５を含んでなる。更なるある好適な実施態様では、ＩＬ-１５断片は、配列番号２３の位置４６がＧｌｕでない、好ましくはＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ又はＡｓｎでない、アミノ酸配列を有する。あるいはなお更なる好適な実施態様では、ＩＬ-１５断片は、配列番号２３の位置５０がＩｌｅでない、好ましくはＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ又はＶａｌでないアミノ酸配列を有する。
更なる好適な実施態様では、ＩＬ-１５断片は、配列番号２３のアミノ酸６４−６８、好ましくは６２−７０、好ましくは６１−７３を含んでなる。
【００４６】
好ましい実施態様では、ＩＬ-１５断片は、(a) 配列番号３４、(b) 配列番号３５、(c) 配列番号３６、(d) 配列番号３７、(e) 配列番号３８、(f) 配列番号３９、(g) 配列番号４０、及び(h) 配列番号３４−４０の何れかに少なくとも６５％、好ましくは少なくとも８０％、又は好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、又は最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるか、それからなる。
本発明は、(a) 少なくとも一の第一付着部位を有するＶＬＰを供給する、(b) 少なくとも一の第二付着部位を有するＩＬ-１５タンパク質、ＩＬ-１５変異タンパク質ないしはＩＬ-１５断片である、少なくとも一の抗原を供給する、そして(c) 該ＶＬＰと該少なくとも一の抗原を組み合わせて、該第一付着部位と該第二付着部位を介して少なくとも一の抗原と該ＶＬＰが結合している、組成物を産生する、ことを含む本発明の組成物の産生方法を提供する。好適な実施態様では、少なくとも一の第二付着部位を有する少なくとも一の抗原、すなわちＩＬ-１５タンパク質、ＩＬ-１５変異タンパク質ないしＩＬ-１５断片の供給は、発現による、好ましくは細菌系、好ましくは大腸菌内での発現によるものである。通常、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグなどのタグは精製工程を容易にするために加えられる。他の方法では、特に５０以下のアミノ酸を有するＩＬ-１５断片は化学的に合成できる。
【００４７】
本発明の好適な一実施態様では、少なくとも一の第一付着部位を有するＶＬＰは、少なくとも一のペプチド結合を介して少なくとも一の第二付着部位を有する本発明のＩＬ-１５に結合する。本発明のＩＬ-１５、好ましくはＩＬ-１５断片、より好ましくは５０アミノ酸以下、さらにより好ましくは３０アミノ酸よりも少ない断片をコードする遺伝子が、ＶＬＰのコートタンパク質をコードする遺伝子の内部に又は好ましくはＮないしＣ末端の何れかにインフレーム結合する。また、融合は、一部が欠損しているコートタンパク質の変異体内へＩＬ-１５断片の配列を挿入することに影響を受けうる、これはさらに切断変異体と称される。切断変異体は、コートタンパク質の配列のＮ末端ないしＣ末端、又はその一部の内部が欠損していてもよい。例えば特定のＶＬＰ ＨＢｃＡｇについて、アミノ酸７９−８０外来のエピトープに置換される。好ましくは、融合タンパク質は発現の際にＶＬＰ内に集合体化する能力を保持しており、その集合体化は電子顕微鏡で調べることができる。
隣接するアミノ酸残基を付加して、コートタンパク質と外来性のエピトープの間の間隙を増やしてもよい。隣接配列に用いるためにはグリシン残基及びセリン残基が特に好ましい。このような隣接配列によってフレキシビリティが付加される。このフレキシビリティの付加により、ＶＬＰサブユニットの配列内へ外来性の配列を融合する際に生じうる不安定性作用が軽減され、外来性のエピトープの存在による集合体化の阻害が軽減される。
【００４８】
他の実施態様では、本発明の少なくとも一のＩＬ-１５、好ましくは５０未満のアミノ酸からなるＩＬ-１５断片は、多くの他のウイルスコートタンパク質、例えばＱβのＡ１タンパク質の切断型のＣ末端に融合するか (Kozlovska, T. M., 等, Intervirology 39:9-15 (1996))又は、ＣＰ伸展の位置７２と７３の間に挿入されてもよい。その他の例として、ＩＬ-１５断片がｆｒ ＣＰのアミノ酸２と３の間に挿入され、ＩＬ-１５-ｆｒ ＣＰ融合タンパク質となってもよい(Pushko P. 等, Prot. Eng. 6: 883-891 (1993))。さらに、ＩＬ-１５断片は、ＲＮＡファージＭＳ-２のコートタンパク質のＮ末端突出β-ヘアピンに融合してもよい(国際公開公報92/13081)。あるいは、ＩＬ-１５断片は、パピローマウイルスのキャプシドタンパク質、好ましくはウシパピローマウイルス１型(ＢＰＶ-１)の主要キャプシドタンパク質Ｌ１に融合しうる (Chackerian, B. 等, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 96:2373-2378 (1999)、国際公開公報00/23955)。また、ＩＬ-１５断片へのＢＰＶ-１ Ｌ１のアミノ酸１３０−１３６の置換も、本発明の実施態様である。さらに、ウイルスのコートタンパク質へのコートタンパク質、その変異体ないしはその断片に本発明の抗原を融合させる実施態様は、国際公開公報2004/009124の６２頁の第２０行目から６８頁の第１７行目に開示されており、出典明記によって、本明細書中に組み込まれる。
【００４９】
他の好適な実施態様では、本発明のＩＬ-１５、好ましくはＩＬ-１５断片、さらにより好ましくはアミノ酸配列 配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０を有するＩＬ-１５断片を、ＲＮＡファージＡＰ２０５のコートタンパク質、その変異体ないしはその断片のＮ末端又はＣ末端に融合する。更なる好適な一実施態様では、融合タンパク質は、スペーサーをさらに含有するものであり、該スペーサーはＡＰ２０５のコートタンパク質、その断片ないしはその変異体と本発明のＩＬ-１５の間に位置する。
本発明の好適な一実施態様では、組成物は、少なくとも一の共有結合を介して少なくとも一の第二付着部位を有する少なくとも一の本発明のＩＬ-１５に結合した少なくとも一の第一付着部位を有するウイルス様粒子を含有するか、あるいは本質的にこれらからなるものであり、該共有結合は非ペプチド結合である。本発明の好適な実施態様では、第一付着部位は、アミノ基、好ましくはリジン残基のアミノ基を含むか、好ましくはそのものである。本発明の他の好適な実施態様では、第二付着部位は、スルフヒドリル基、好ましくはシステインのスルフヒドリル基を含むか、好ましくはそのものである。
【００５０】
本発明のとても好ましい実施態様では、少なくとも一の第一付着部位は、アミノ基、好ましくはリジン残基のアミノ基を含むか、好ましくはそのものであり、少なくとも一の第二付着部位は、スルフヒドリル基、好ましくはシステインのスルフヒドリル基を含むか、好ましくはそのものである。
本発明の好ましい一実施態様では、本発明のＩＬ-１５は、典型的にかつ好ましくはヘテロ二官能性架橋剤を使用して、化学的架橋によりＶＬＰに結合している。好ましい実施態様では、ヘテロ二官能性架橋剤は、好ましくはアミノ基、より好ましくはＶＬＰのリジン残基(一又は複数)のアミノ基を有する好ましい第一付着部位と反応可能な官能基と、好ましい第二付着部位、すなわち本発明のＩＬ-１５に元もとある、ないしは人工的に付加され、場合によっては還元による反応に利用される、好ましくはシステイン(一又は複数)残基のスルフヒドリル基と反応可能なさらなる官能基を含む。いくつかのヘテロ二官能性架橋剤が当該分野で知られている。これらには、好ましい架橋剤であるＳＭＰＨ(Pierce)、スルホ-ＭＢＳ、スルホ-ＥＭＣＳ、スルホ-ＧＭＢＳ、スルホ-ＳＩＡＢ、スルホ-ＳＭＰＢ、スルホ-ＳＭＣＣ、ＳＶＳＢ、ＳＩＡ、及び例えばPierce Chemical Companyから入手可能な他の架橋剤が含まれ、アミノ基に対して反応可能な一官能基とスルフヒドリル基に対して反応可能な一官能基を有する。上述した全ての架橋剤により、アミノ基との反応後にアミド結合が、またスルフヒドリル基とチオエーテル結合が形成される。本発明の実施に適した他のクラスの架橋剤は、カップリング時に本発明のＩＬ-１５とＶＬＰとの間にジスルフィド結合を導入することにより特徴付けられる。このクラスに属する好ましい架橋剤には、例えばＳＰＤＰ及びスルホ-ＬＣ-ＳＰＤＰ(Pierce)が含まれる。
【００５１】
好ましい実施態様では、本発明の組成物はリンカーをさらに含有している。本発明のＩＬ-１５における第二の付着部位の操作は、この発明の開示に従い、好ましくは第二の付着部位として適切な少なくとも一のアミノ酸を含むリンカーとの結合により達成される。よって、本発明の好ましい実施態様では、リンカーは少なくとも一の共有結合、好ましくは典型的には少なくとも一のペプチド結合により、本発明のＩＬ-１５に結合している。好ましくは、リンカーは、第二の付着部位を含む又はそれからなる。さらに好ましい実施態様では、リンカーは好ましくはシステイン残基のスルフヒドリル基を含む。他の好ましい実施態様では、リンカーはシステイン残基である。
【００５２】
リンカーの選択は、本発明のＩＬ-１５の性質、その生化学的特性、例えばｐＩ、電荷分布、及びグリコシル化に依存するであろう。一般的に、フレキシブルなアミノ酸リンカーが好まれる。本発明のさらに好ましい実施態様では、リンカーはアミノ酸からなり、さらに好ましくは、リンカーは最大で２５、好ましくは最大で２０、より好ましくは最大で１５のアミノ酸からなる。本発明のさらに好適な実施態様では、アミノ酸リンカーは１０未満のアミノ酸を含有する。リンカーの好ましい実施態様は：(a) CGG又はCG/GC；(b)Ｎ-末端ガンマ１-リンカー(例えばCGDKTHTSPP、配列番号44)；(c)Ｎ-末端ガンマ３-リンカー(例えばCGGPKPSTPPGSSGGAP、配列番号55)；(d)Ｉｇヒンジ領域；(e)Ｎ-末端グリシンリンカー(例えばGCGGGG、配列番号45)；(f)n=0-12、k=0-5である(G)kC(G)n；(g)Ｎ-末端グリシン-セリンリンカー(さらに一つのシステインを有するｎ＝1-3の(GGGGS)n(例えば配列番号46、n=1の実施態様に相当))；(h)n=0-3、k=0-5、m=0-10、l=0-2である(G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n(例えば配列番号47、n=1、k=1、l=1及びm=1の実施態様に相当)；(i)GGC；(k)GGC-NH2；(l)Ｃ-末端ガンマ１-リンカー(例えばDKTHTSPPCG、配列番号48)；(m)Ｃ-末端ガンマ３-リンカー(例えばPKPSTPPGSSGGAPGGCG、配列番号49)；(n)Ｃ-末端グリシンリンカー(GGGGCG、配列番号50)；(o)n=0-12及びk=0-5である(G)nC(G)k；(p)Ｃ-末端グリシン-セリンリンカー(さらに一つのシステインを有するn=1-3の(SGGGG)n(例えば配列番号51、n=1の実施態様に相当))；(q)n=0-3、k=0-5、m=0-10、l=0-2及びo=0-8である(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k(例えば配列番号52、n=1、k=1、l=1、o=1及びm=1の実施態様に相当)からなる群から選択される。さらに好ましい実施態様では、リンカーは本発明のＩＬ-１５のＮ-末端に融合している。本発明の他の好ましい実施態様では、リンカーは本発明のＩＬ-１５のＣ-末端に融合している。
【００５３】
この発明に係る好ましいリンカーは、第２付着部位としてシステイン残基をさらに含むグリシンリンカー(Ｇ)ｎ、例えばＮ-末端グリシンリンカー(ＧＣＧＧＧＧ)及びＣ-末端グリシンリンカー(ＧＧＧＧＣＧ)である。さらに好ましい実施態様は、Ｃ-末端グリシン-リジンリンカー(ＧＧＫＫＧＣ、配列番号53)及びＮ-末端グリシン-リジンリンカー(ＣＧＫＫＧＧ、配列番号54)、ペプチドのＣ-末端のＧＧＣＧ、ＧＧＣ又はＧＧＣ-ＮＨ２(「ＮＨ２」はアミド化を表す)リンカー、又はそのＮ-末端のＣＧＧのリンカーである。一般的に、グリシン残基は、第２付着部位として使用されるシステインと大きなアミノ酸との間に挿入されて、カップリング反応中での、より大きなアミノ酸の潜在的な立体障害が回避される。
【００５４】
上記の好適な方法によるヘテロ二官能性架橋剤を用いることによるＶＬＰへの本発明のＩＬ-１５の結合により、正方向の様式でＶＬＰに本発明のＩＬ-１５をカップリングさせることができる。ＶＬＰに本発明のＩＬ-１５を連結させるための他の方法には、カルボジイミドＥＤＣ、及びＮＨＳを使用し、本発明のＩＬ-１５をＶＬＰに架橋させる方法が含まれる。本発明のＩＬ-１５は、例えばＳＡＴＡ、ＳＡＴＰ又はイミノチオランを用いた反応を介して、まずチオラート化されてもよい。次いで、必要であれば脱保護化した後に本発明のＩＬ-１５を以下のようにＶＬＰにカップリングしてもよい。過剰なチオラート化剤を分離した後、本発明のＩＬ-１５を、システイン反応基を含有し、システイン残基に対して反応可能な少なくとも一又はいくつかの官能基を表出するヘテロ二官能性架橋剤にて予め活性化させた、ＶＬＰと反応させる。このとき本発明のチオラート化ＩＬ-１５は上記に記載のように反応することができる。場合によっては、少量の還元剤が反応混合物中に含まれる。さらなる方法では、ホモ二官能性架橋剤、例えばグルタルアルデヒド、ＤＳＧ、ＢＭ[ＰＥＯ]４、ＢＳ３、(Pierce)、又はＶＬＰのアミノ基又はカルボキシル基に対して反応する官能基を有する他の既知のホモ二官能性架橋剤を使用して、本発明のＩＬ-１５をＶＬＰに結合させる。
【００５５】
本発明の他の実施態様では、組成物は、化学的な相互作用を介して本発明のＩＬ-１５に結合したウイルス様粒子を含むか、ないしは本質的にそれからなるものであり、この相互作用の少なくとも一は共有結合ではない。例えば、ＶＬＰをビオチン化してストレプトアビジン-融合タンパク質として本発明のＩＬ-１５を発現することによって本発明のＩＬ-１５へのＶＬＰの結合が起こる。また、他の結合対、例えばリガンド-レセプター、抗原-抗体も、ビオチン-アビジンと同様の形で、カップリング試薬として使用することができる。
米国特許第5698424号には、キャプシドを形成可能なバクテリオファージＭＳ-２の修飾コートタンパク質が記載されており、ここでコートタンパク質はＮ-末端ヘアピン領域にシステイン残基を挿入し、非システインアミノ酸残基により、Ｎ-末端ヘアピン領域の外側に位置する各システイン残基を置換することにより修飾される。ついで、挿入されたシステイン残基は、所望される分子種に直接結合し、エピトープ又は抗原性タンパク質等として提示される。
【００５６】
しかしながら、キャプシドに露出した遊離のシステイン残基が存在すると、ジスルフィド架橋の形成により、キャプシドのオリゴマー化に至りうることを我々は記す。さらに、ジスルフィド結合によるキャプシドと抗原性タンパク質との結合は、特にスルフヒドリル-部分含有分子に対して不安定であり、さらに、チオエーテル付着よりも血清中で安定性が低下する(Martin FJ. 及び Papahadjopoulos D.(1982) Irreversible Coupling of Immunoglobulin Fragments to Preformed Vesicles. J. Biol. Chem. 257：286-288)。
よって、さらに非常に好ましい実施態様では、ＶＬＰと少なくとも一の抗原との結合は、ジスルフィド結合を含まない。さらに好ましくは、少なくとも一の第二の付着は、スルフヒドリル基を含むか、又は該基である。さらにまた本発明の非常に好ましい実施態様では、ＶＬＰと少なくとも一の抗原との結合は、硫黄-硫黄結合を含まない。さらに非常に好ましい実施態様では、前記少なくとも一の第一の付着部位は、システインのスルフヒドリル基でないか、又は該基を含まない。またさらに非常に好ましい実施態様では、前記少なくとも一の第一の付着部位は、スルフヒドリル基ではないか、又は該基を含まない。
【００５７】
本発明の好適な一実施態様では、ＶＬＰは宿主内で組み換えて産生されるものであり、該ＶＬＰは宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸を本質的に含まないか、該ＶＬＰは宿主ＤＮＡ、好ましくは宿主核酸を本質的に含まない。好適な一実施態様では、ＲＮＡファージのＶＬＰは宿主内で組み換えて産生されるものであり、該ＲＮＡファージのＶＬＰは宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸を本質的に含まない。
更なる好適な一実施態様では、組成物は、ＶＬＰに結合した、好ましくはＶＬＰ内にパッケージ化ないしは封入された少なくとも一のポリ陰イオン性高分子を含有する。更なる好適な実施態様では、ポリ陰イオン性高分子はポリグルタミン酸及び／又はポリアスパラギン酸である。好適な一実施態様では、ＶＬＰはＲＮＡファージのものである。宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸の量を少なくするないしは排除することにより、ＩＬ-１５に特異的な強力な抗体応答を維持しながら、望ましくないＴ細胞応答、例えば炎症性Ｔ細胞応答や障害性Ｔ細胞応答、及び他の望ましくない発熱などの副作用が最小限化ないしは低減される。
【００５８】
本質的に宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主の核酸を欠く：本明細書中で用いられる「本質的に宿主ＲＮＡ(又はＤＮＡ)、好ましくは宿主の核酸を欠く」なる用語は、ＶＬＰに含有される宿主ＲＮＡ(又はＤＮＡ)、好ましくは宿主の核酸の量を意味し、その量は典型的に好ましくは、ＶＬＰｍｇ当たり３０μｇより少ない、好ましくは２０μｇより少ない、より好ましくは１０μｇより少ない、さらにより好ましくは８μｇより少ない、さらにより好ましくは６μｇより少ない、さらにより好ましくは４μｇより少ない、最も好ましくは２μｇより少ない。上記の範囲内で用いられる宿主は、ＶＬＰが組み換えて産生される宿主を意味する。ＲＮＡ(又はＤＮＡ)、好ましくは核酸の量を測定する従来の方法は当業者に周知である。本発明によって、ＲＮＡ、好ましくは核酸の量を測定する典型的で好適な方法は、同じ指定代理人により2005年10月5日に出願したPCT/EP2005/055009の実施例１７に記載される。典型的に好ましくは、Ｑβ以外のＶＬＰを含んでなる本発明の組成物についてＲＮＡ(又はＤＮＡ)、好ましくは核酸の量を測定するためには、同一、同種又は類似の条件を用いる。最終的に必要とされる条件の変更は当業者の知識の範囲内である。
【００５９】
本明細書中で用いる「ポリ陰イオン性高分子」なる用語は、陰性荷電の反復基を含有する相対的に高分子量の分子を指し、その構造は、実際ないしは概念的には、相対的に低分子量の分子に由来するユニットの複合的な反復物を本質的に含有する。
一態様では、本発明は、本発明の組成物を含有するワクチンを提供する。好適な一実施態様では、ワクチン組成物内のＶＬＰに結合した本発明のＩＬ-１５は、動物、好ましくは哺乳動物ないしはヒト起源のものでよい。好適な実施態様では、本発明のＩＬ-１５はヒト、ウシ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ブタ又はウマ起源である。
好適な一実施態様では、ワクチン組成物はさらに少なくとも一のアジュバントを含有する。少なくとも一のアジュバントの投与は、本発明の組成物の投与の前、あるいはそれと同時、あるいはその後であってもよい。本明細書中で用いられる「アジュバント」なる用語は、本発明のワクチン及び薬剤組成物のそれぞれと組み合わせると、より亢進した免疫応答を供給しうる、宿主内の貯蔵所となる物質ないしは免疫応答の非特異的刺激因子を意味する。
【００６０】
他の好ましい実施態様では、本発明のワクチン組成物はアジュバントを欠く。本発明の有利な特性は、アジュバントを含まない場合でさえ、組成物の免疫原性が高いことである。さらにアジュバントを含んでいないので、自己抗原に対するワクチン接種上の安全上の問題を呈する所望されない炎症性Ｔ細胞反応の発生が最小となる。よって、本発明のワクチンの患者への投与は、好ましくはワクチンの投与前、投与と同時、又は投与後に同じ患者に少なくとも一のアジュバントを投与することなく、なされるであろう。
さらに、本発明は、本発明のワクチンが動物又はヒトに投与されることを含む免疫化方法を開示する。動物は、好ましくはネコ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、イヌ、ラット、マウスなどの哺乳動物、特にヒトである。ワクチンは、当分野で公知の様々な方法によって動物又はヒトに投与されてもよいが、通常、注射、注入、吸入、経口投与又は他の適切な理学的方法によって投与されうる。コンジュゲートは、選択的に、筋肉内、静脈内、粘膜経由、経皮、鼻腔内、腹膜内又は皮下投与されてもよい。投与のためのコンジュゲート成分は、滅菌水(例えば、生理食塩液)又は非水溶液及び懸濁液などである。非水溶性溶媒の例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルなどがある。担体又は密封包帯を、皮膚透過性を増やして、抗原吸収を上げるために用いてもよい。
【００６１】
投与される個体に投与が合っていれば、本発明のワクチンは「製薬的に受容可能」であるといえる。さらに、本発明のワクチンは、「治療的に有効な量」(すなわち、所望の生理学的効果を示す量)で投与されうる。免疫応答の性質又は種類は本発明で開示される因子に限定するものではない。以下のメカニズムの説明によって本発明が限定されるものではなく、本発明のワクチンは、ＩＬ-１５に結合する抗体であり、その濃度を抑え、及び／又は生理学的又は病理学的な働きを阻害する抗体を誘導しうる。
他の態様では、本発明は、本発明で述べられる組成物と受容可能な製薬的担体を含有する薬剤組成物を提供する。本発明のワクチンが個体に投与される場合、コンジュゲートの有効性を改善するために望ましい他の物質、アジュバント、バッファー又は塩類を含有する形態でありうる。薬剤組成物の調整における使用に好適な材料の例は、REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Osol, A, ed., Mack Publishing Co., (1990))を含む多くの情報源に示される。
【００６２】
本発明は、本発明の組成物の産生方法であって、(a) 少なくとも一の第一付着部位を有するＶＬＰを供給し；(b) 少なくとも一の第二付着部位を有する本発明のＩＬ-１５を供給し；そして(c) 該ＶＬＰと本発明の該ＩＬ-１５を組み合わせて、該第一付着部位と該第二付着部位を介して本発明の該ＩＬ-１５と該ＶＬＰが結合している、組成物を産生する工程を含む産生方法を教示する。
更なる好適な実施態様では、少なくとも一の第一付着部位を有するＶＬＰを提供する工程は、(a) 該ウイルス様粒子を該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、その変異体ないしはその断片に分解して；(b) 該コートタンパク質、その変異体ないしはその断片を精製して；(c) 該精製された該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、その変異体ないしはその断片をウイルス様粒子に再集合体化させる工程をさらに含むものであり、このときの該ウイルス様粒子は宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸を本質的に欠いているものである。より更なる好適な実施態様では、前記の精製したコートタンパク質の再集合体化は、少なくとも一のポリ陰イオン性高分子の存在下にてなされる。
【００６３】
本発明は、ＩＬ-１５が動物又はヒトの重要な病理学的機能を発現する疾患ないし症状の治療及び／又は寛解の方法であって、該疾患ないし症状を患っている動物ないしヒトに本発明の創意に富んだ組成物が投与されることを含む方法を提供する。好適な実施態様では、ＩＬ-１５が動物又はヒトの重要な病理学的機能を発現する前記の疾患ないし症状は、アテローム性動脈硬化、喘息、移植拒絶反応及び炎症性及び／又は慢性自己免疫性の疾患、例えば限定するものではないが、関節リウマチ、乾癬性関節炎、若年性突発性関節炎、乾癬からなる群から選択されるものである。あるいは、本発明は、動物、ないし好ましくはヒトのアテローム性動脈硬化、喘息、移植拒絶反応及び炎症性及び／又は慢性自己免疫性の疾患からなる群から選択される疾患の治療のための医薬の製造のための本発明の組成物の使用を提供する。
ある態様では、本発明は、少なくとも一のＩＬ-１５アンタゴニストが動物ないしヒトに投与されることを含む、動物ないしヒトの疾患の治療方法であって、該疾患がアテローム性動脈硬化及び喘息からなる群から選択されるものである、治療方法を提供する。あるいは、本発明は、アテローム性動脈硬化及び喘息からなる群から選択される疾患の治療のための医薬の製造のための、少なくとも一のＩＬ-１５アンタゴニストの使用を提供する。
【００６４】
「ＩＬ-１５アンタゴニスト」は、様々な手段によって、例えば限定するものではないが、(i) 血中のＩＬ-１５濃度を減少する、(ii) Ｉｌ-１５のＩＬ-１５レセプター複合体への結合を阻害する、好ましくはＩＬ-１５のＩＬ-１５レセプター複合体のαサブユニットへの結合を阻害する、又は(iii) ＩＬ-１５のＩＬ-１５レセプター複合体のγサブユニット又はβサブユニットの何れかを介する細胞へのシグナル伝達を阻害する、これによってＩＬ-１５の生物学的な活性をアンタゴナイズすることによって、ＩＬ-１５の機能を阻害する。典型的及び好ましくは、ＩＬ-１５レセプター複合体、好ましくはαサブユニットへのＩＬ-１５の結合は、例えばJ. Biol Chem. 2004 Jun 4;279(23): 24313-22に記載のようなインビトロ結合アッセイによって確認することができる。典型的及び好ましくは、ＩＬ-１５の機能、典型的及び好ましくはＴ細胞増殖の刺激のためのその機能は、例えば欧州特許0772624の実施例２に記載のようなインビトロアッセイで確認することができる。
好適な実施態様では、ＩＬ-１５アンタゴニストは、ＩＬ-１５に特異的に結合する抗体である。ＩＬ-１５への抗体の結合により、形成された抗原-抗体複合体がクリアランスされ、これにより血中のＩＬ-１５濃度が減少しうる。さらに、ＩＬ-１５への抗体の結合は、ＩＬ-１５のそのレセプターへの結合を阻害することで、ＩＬ-１５がそのレセプターを介したその活性を発現するのを防ぎうる。加えて、ＩＬ-１５への抗体の結合はＩＬ-１５のそのレセプターへの結合を防がない場合でも、抗体の存在によりＩＬ-１５レセプター複合体のγ又はβサブユニットに媒介されるシグナル伝達を阻害しうる。
【００６５】
ＩＬ-１５抗体は、ポリクローナルでもモノクローナルでもよく、異なる動物種、例えばマウス、ラット、ウサギ又はヒトの免疫化によって生成することができる。モノクローナル抗体は、使用する技術に従って、マウス、キメラ、ＣＤＲ-移植、ヒト化、ヒト又は合成された抗体でもよい。したがって、「モノクローナル抗体」なる用語は、均質な抗体集団を有する抗体組成物を意味する。作成される方法又は抗体の供給源によって限定されるものではない。ある好適な実施態様では、前記のＩＬ-１５アンタゴニストは、前記抗体の機能的な断片を含むか、そのものである。ＩＬ-１５に特異的に結合するモノクローナル抗体は当分野で有用である。
好適な実施態様では、前記のＩＬ-１５アンタゴニストは、１０７Ｍ−１以上、好ましくは１０８Ｍ−１以上、より好ましくは１０９Ｍ−１以上の結合親和性(Ｋａ)を有するモノクローナル抗体である。
【００６６】
ある好適な実施態様では、前記ＩＬ-１５アンタゴニストは、典型的に好ましくは、国際公開公報03/017935の実施例８に記載のように実施される増殖阻害アッセイによって測定して、１００ｎＭ未満、好ましくは１０ｎＭ未満のＩＣ５０値でＩＬ-１５誘導性Ｔ細胞増殖を阻害するモノクローナル抗体である。
好適な実施態様では、前記ＩＬ-１５アンタゴニストは、J Clin Invest 2003, 112, 1571, Arthritis & Rheumatism. 2005, 52, 2686及び国際公開公報03/017935に記載のように、モノクローナル抗体ＨｕＭａｘ-ＩＬ-１５(１４６Ｂ７、ＡＭＧ７１４とも称される)ないしその断片である。
好適な実施態様では、前記ＩＬ-１５アンタゴニストは、(i) ＡＴＣＣ受入れ番号Ｍ１１０；(ii) ＡＴＣＣ受入れ番号Ｍ１１１；(iii) ＡＴＣＣ受入れ番号Ｍ１１２((i)−(iii)は国際公開公報9626274を参照してもよい)；(iv) １４６Ｈ５、((iv)は国際公開公報03/017935を参照してもよい)、からなる群から選択されるハイブリドーマから得たモノクローナル抗体である。
【００６７】
ある好適な実施態様では、前期ＩＬ-１５アンタゴニストはＩＬ-１５に特異的に結合する抗体であり、該抗体が本発明の創意に富んだ組成物に反応して産生されたものである。好ましくは、前記抗体は、好ましくは本発明の創意に富んだ免疫化方法に従って、本発明のワクチンないしは本発明の組成物を摂取した動物ないしヒトの体内で産生される。ある好適な実施態様では、抗体は、本発明の創意に富んだ組成物でマウスを免疫化することによって産生されるモノクローナル抗体である。好ましくは、そのように産生される抗体は、現在のところ有用な技術を用いたヒトの使用を最適化するためにさらに修飾又は操作されるであろう。
ある好適な実施態様では、前記のＩＬ-１５アンタゴニストは、ＩＬ-１５可溶性レセプター又はその断片を含むか、そのものである。ある好適な実施態様では、前記ＩＬ-１５アンタゴニストは、ＩＬ-１５可溶性レセプターαサブユニット又はその断片を含むか、そのものである。ある好適な実施態様では、前記ＩＬ-１５アンタゴニストは、ＩＬ-１５レセプターαサブユニットの細胞外ドメイン又はその断片を含むか、そのものである。更なるある好適な実施態様では、前記ＩＬ-１５アンタゴニストは、配列番号４１のアミノ酸配列、又は配列番号４１に少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、より好ましくは９７％の相同性を有するアミノ酸配列を含むか、それからなる。
【００６８】
ある好適な実施態様では、前記ＩＬ-１５アンタゴニストはＩＬ-１５変異タンパク質を含むか、そのものである。更なるある好適な実施態様では、前記ＩＬ-１５変異タンパク質は依然としてＩＬ-１５レセプターαサブユニットに結合することができ、ＩＬ-１５のβ又はγサブユニットの何れかを介する細胞へのシグナル伝達を阻害する。ある好適な実施態様では、前記ＩＬ-１５変異タンパク質は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むか、これからなり、配列番号２３のＡｓｐ８、Ｇｌｎ１０１及びＧｌｎ１０８の少なくとも１つの位置、好ましくは２つ、より好ましくは３つすべての位置が変異されている、好ましくは非保存的な置換によって好ましくは置換されているものである。ある好適な実施態様では、前記ＩＬ-１５変異タンパク質は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むか、これからなり、Ｇｌｎ１０１とＧｌｎ１０８の少なくとも一、又は両方が欠損しているか、好ましくは置換されているものである。更なるある好適な実施態様では、前記ＩＬ-１５変異タンパク質は配列番号４２のアミノ酸配列を含むか、これからなる。
【００６９】
ある好適な実施態様では、前記ＩＬ-１５変異タンパク質は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むか、これからなり、Ａｓｐ８とＧｌｎ１０８の少なくとも一、又は好ましくはこれら両方が欠損しているか、好ましくは異なる天然に生じるアミノ酸残基、さらに好ましくはセリン又はシステインに好ましくは置換されているものである。ある選択的な好適な実施態様では、Ｇｌｎ１０８はＡｓｐに置換される。ある選択的な好適な実施態様では、Ａｓｐ８はＡｒｇ又はＬｙｓに置換される。
ある好適な実施態様では、前記ＩＬ-１５変異タンパク質は、配列番号２３に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、又は最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含むか、これからなるものであり、配列番号２３のＡｓｐ８、Ｇｌｎ１０１及びＧｌｎ１０８に対応する少なくとも１つの位置、好ましくは２つ、より好ましくは３つすべての位置が変異されている、好ましくは非保存的な置換によって好ましくは置換されているものである。ある好適な実施態様では、前記ＩＬ-１５変異タンパク質は、配列番号４２に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、又は最も好ましくは少なくとも９５％の相同性であるアミノ酸配列を含むか、これからなるものであり、配列番号４２の１０１と１０８に対応する位置がＡｓｐのままであるものである。
【実施例】
【００７０】
この実施例内で用いるＱβ ＶＬＰ、ＡＰ２０５ ＶＬＰなどは、国際公開公報02/056905、国際公開公報04/007538に記載のように大腸菌から組み換えて発現させた後に精製して得たＶＬＰを指す。
【００７１】
実施例１
ｐＭ-ＩＬ-１５-ＦＬ-ＣＧの構築
プラスミドｐＭｏｄＥＣ１のＢａｍＨＩ部位からＰｍｅＩ部位の配列(国際公開公報03/040164)を、元の配列とアニールしたオリゴB-FL-L-P R (配列番号34)とB-FL-C-P F (配列番号35)に置換することによって、catatggatc cgctagccct cgagga ctac aaggatgacg acgacaaggg tggttgcggt taataagttt aaacgcggcc gc (配列番号43)に変えた。結果として生じたコンストラクトは、マルチクローニングサイト内にＮｄｅ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ、ＮｈｅＩ、ＸｈｏＩ、ＰｍｅＩ及びＮｏｔＩの制限酵素部位を有するｐＭｏｄ-ＦＬ-ＣＧとした。
マウスＩＬ-１５を、プライマー：ＩＬ-１５-Ｆ (配列番号36)とＩＬ-１５-Ｘｈｏ-Ｒ (配列番号37)を用いたＰＣＲによって活性化樹状細胞のｃＤＮＡライブラリから増幅した。ＩＬ-１５-Ｆは内部にＮｄｅＩ部位を有し、ＩＬ-１５-ＸｈｏＩは内部にＸｈｏＩ部位を有した。ＰＣＲ産物をＮｄｅＩとＸｈｏＩにて消化し、同じ酵素で消化したｐＭｏｄ-ＦＬ-ＣＧ内にライゲーションした。結果として生じたプラスミドは、マウスＩＬ-１５、フラッグタグ及びＣ末端にシステインを含有するリンカーを含んでなる融合タンパク質をコードするｐＭ-ＩＬ-１５-ＦＣ-ＣＧと称した(配列番号３０)。
【００７２】
実施例２
ｐＭ-ＩＬ-１５-ＦＬ-ＣＧの発現
コンピテント大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)細胞をプラスミドｐＭ-ＩＬ-１５-ＦＬ-ＣＧにて形質転換した。アンピシリン(Ａｍｐ)含有アガープレートからの単一コロニーを液体培地(１５０ｍＭ ＭＯＰＳ, ｐＨ７．０、１００μｇ／ｍｌのＡｍｐを含むＳＢ)中に播き、３０℃で２２０ｒｐｍで振とうしながら一晩インキュベートした。ついで、一晩の培養物を同じ培地で１：５０に希釈し、３０℃でＯＤ６００＝２．８まで生育した。１ｍＭ ＩＰＴＧにて発現を誘導した。４時間の培養の後に６０００ｒｐｍで１０分間遠心して細胞を回収した。細胞ペレットを０．８ｍｇ／ｍｌのライソザイムを含む溶解バッファ(１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、３０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．２５％ Ｔｗｅｅｎ-２０)に懸濁して、超音波処理して、ベンゾナーゼにて処理した。４８０００ＲＣＦで２０分間遠心分離した後、上清を１２％ ＰＡＧＥゲルにて分離し、１４．９ＫＤの予測分子量でランしたＩＬ-１５-ＦＬ-ＣＧの発現を明瞭に示すウェスタンブロットにて抗マウスＩＬ-１５(R&D system)によりマウスＩＬ-１５の発現を確認した。
【００７３】
実施例３
ＩＬ-１５-ＦＬ-ＣＧの精製
初めに、ＩＬ-１５-ＦＬ-ＣＧを抗ＦＬＡＧ Ｍ２カラムによって精製した。簡単にいうと、ＩＬ-１５-ＦＬ-ＣＧ溶解物を抗ＦＬＡＧ Ｍ２カラムに流した。結合しなかった混合物をＴＢＳ(５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ, ｐＨ７．４)にて洗い流した。次いで、ＩＬ-１５-ＦＬ-ＣＧをＦＬＡＧペプチド(１００μｇ／ｍｌ)を用いたカラムから溶出させた。溶出物をQ Fast Flowカラムによりさらに精製した。
【００７４】
実施例４
ＩＬ-１５タンパク質、ＩＬ-１５変異タンパク質及びＩＬ-１５断片の産生
実質的に実施例１に記載したのと同じプロトコールを用いて、ヒトＩＬ-１５(配列番号２３)をＰＣＲによって活性化樹状細胞のｃＤＮＡライブラリから増幅し、ＰＣＲ産物をｐＭｏｄ-ＦＬ-ＣＧ内にライゲーションした。結果として生じたプラスミドは、ヒトＩＬ-１５、フラッグタグ及びＣ末端にシステインを含有するリンカーを含んでなる融合タンパク質をコードするｐＨ-ＩＬ-１５-ＦＣ-ＣＧと称した。
実質的に実施例１に記載したのと同じプロトコールを用いて、ヒトＩＬ-１５変異タンパク質を発現するプラスミドを構築した(配列番号３１、３２又は３３)。実質的に実施例２及び３に記載したのと同じプロトコールを適応して、ヒトＩＬ-１５タンパク質、ヒトＩＬ-１５変異タンパク質を発現させて、精製した。
標準的なプロトコールに従って、様々なＩＬ-１５断片(配列番号３４−４０)を化学的に合成した。さらに、各々のＩＬ-１５断片配列のＮ末端にシステインを融合した。
【００７５】
実施例５ 結果として再集合体化したＱβ ＶＬＰが生じる、異なるポリ陰イオン性高分子の存在下における分解／再集合体化による本発明のＱβ ＶＬＰの調整
(A) Ｑβ ＶＬＰの分解
大腸菌溶解物から精製した４５ｍｇのＱβ ＶＬＰ(２．５ｍｇ／ｍｌ、Bradford分析によって測定)を含むＰＢＳ(２０ｍＭ リン酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５)を１０ｍＭ ＤＴＴにて還元して、撹拌しながら室温に１５分間置いた。次いで、塩化マグネシウムを０．７Ｍの終濃度まで添加し、撹拌しながら室温で１５分間インキュベートを続け、カプセル化された宿主細胞ＲＮＡを沈殿させた。溶液から沈殿されたＲＮＡを取り除くために、溶液を４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心した(Eppendorf 5810 R、以下のすべての工程で固定角ローターA-4-62を用いた)。放出された二量体Ｑβコートタンパク質を含有する上清をクロマトグラフィの精製工程に用いた。
【００７６】
(B) 陽イオン交換クロマトグラフィ及びサイズ排除クロマトグラフィによるＱβコートタンパク質の精製
二量体コートタンパク質、宿主細胞タンパク質及び残渣の宿主細胞ＲＮＡを含有する分解反応の上清を水で１：１５に希釈し、１０ｍＳ／ｃｍ以下の伝導率を調整し、ＳＰ-セファロースＦＦカラム(xk16/20, 6 ml, Amersham Bioscience)に流した。カラムは、２０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファ ｐＨ７にて予め平衡化した。結合したコートタンパク質は、２０ｍＭ リン酸ナトリウム／５００ｍＭ 塩化ナトリウムの勾配法により溶出させ、タンパク質は約２５ｍｌの分画容量に回収した。室温で５ｍｌ／分の流速のクロマトグラフィを行い、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍの吸光度をモニターした。
第二工程では、単離されたＱβコートタンパク質(陽イオン交換カラムから溶出された分画)をセファクリルＳ-１００ＨＲカラム(xk26/60, 320 ml, Amersham Bioscience)に流し(２列)、２０ｍｍ リン酸ナトリウム／２５０ｍｍ 塩化ナトリウム、ｐＨ６．５にて平衡化した。室温で２．５ｍｌ／分の流速のクロマトグラフィを行い、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍの吸光度をモニターした。５ｍｌの分画を回収した。
【００７７】
(C1) 透析によるＱβ ＶＬＰの再集合体化
精製したＱβコートタンパク質(２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ６．５中に２．２ｍｇ／ｍｌ)、１のポリ陰イオン性高分子(Ｈ２Ｏ中に２ｍｇ／ｍｌ)、尿素(Ｈ２Ｏ中に７．２Ｍ)及びＤＴＴ(Ｈ２Ｏ中に０．５Ｍ)を、それぞれ終濃度１．４ｍｇ／ｍｌのコートタンパク質、０．１４ｍｇ／ｍｌのポリ陰イオン性高分子、１Ｍ 尿素及び２．５ｍＭ ＤＴＴに混合した。混合物(各々１ｍｌ)を、３．５ｋＤａのカットオフのメンブランを用いて２０ｍＭ トリスＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８にて５℃で２日間透析した。ポリ陰イオン性高分子は以下の通りであった：ポリガラクツロン酸(25000-50000, Fluka)、硫酸デキストラン(MW 5000及び10000, Sigma)、ポリ-Ｌ-アスパラギン酸(MW 11000及び33400, Sigma)、ポリ-Ｌ-グルタミン酸(MW 3000、13600及び84600, Sigma)、及びパン酵母と小麦麦芽由来のｔＲＮＡ。
(C2) 透析濾過(ダイアフィルトレーション)によるＱβ ＶＬＰの再集合体化
３３ｍｌの精製したＱβコートタンパク質(２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ６．５、２５０ｍＭ ＮａＣｌ中に１．５ｍｇ／ｍｌ)を、Ｈ２Ｏ及び尿素(Ｈ２Ｏ中に７．２Ｍ)、ＮａＣｌ(Ｈ２Ｏ中に５Ｍ)及びポリ-Ｌ-グルタミン酸(Ｈ２Ｏ中に２ｍｇ／ｍｌ、MW: 84600)と混合した。混合物の容量は５０ｍｌであり、成分の終濃度は１ｍｇ／ｍｌのコートタンパク質、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１．０Ｍ 尿素及び０．２ｍｇ／ｍｌ ポリ-Ｌ-グルタミン酸であった。次いで、混合物を室温で、５００ｍｌの２０ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８、５０ｍＭ ＮａＣｌにて透析濾過した。この透析濾過は、１０ｍｌ／分の交差流速と２．５ｍｌ／分の透過流速で、Pellicon XL薄膜カートリッジ(Biomax 5K, Millipore)を用いた正接流量濾過装置(tangential flow filtration apparatus)にて行った。
【００７８】
実施例６ ＡＰ２０５ ＶＬＰのインビトロ集合体化(アセンブリ)
(A) ＡＰ２０５コートタンパク質の精製
分解：２０ｍｌのＡＰ２０５ ＶＬＰ溶液(ＰＢＳ中に１．６ｍｇ／ｍｌ、大腸菌抽出物から精製)を、０．２ｍｌの０．５Ｍ ＤＴＴと混合し、室温で３０分間インキュベートした。５ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌを添加して、次いで混合物を６０℃で１５分間インキュベートし、ＤＴＴ還元コートタンパク質を沈殿させた。混濁した混合物を遠心分離し(ローターSorvall SS34、１００００ｇ、１０分、２０℃)、上清を廃棄し、ペレットを、２０ｍｌの１Ｍ 尿素／２０ｍＭ クエン酸ナトリウム ｐＨ３．２に播種した。室温で３０分間撹拌した後、１．５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４を加えることによって、ｐＨ６．５にばらつきを調整し、その後二量体コートタンパク質を含む上清を得るために遠心分離した(ローターSorvall SS34、１００００ｇ、１０分、２０℃)。
陽イオン交換クロマトグラフィ：上清(上記参照)を２０ｍｌの水で希釈して、約５ｍＳ／ｃｍの伝導率を調整した。結果として生じた溶液を、２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ６．５バッファにて予め平衡化した６ｍｌのＳＰセファロースＦＦ (Amersham Bioscience)のカラムに流した。流した後、カラムを４８ｍｌの２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ６．５のバッファにて洗浄し、その後、２０倍のカラム容量の１Ｍ ＮａＣｌへの比例勾配により結合したコートタンパク質を溶出した。メインピークの分画をプールし、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及びＵＶ分光法にて分析した。ＳＤＳ-ＰＡＧＥによると、単離されたコートタンパク質は本質的に他のタンパク質混入がなく純粋であった。ＵＶ分光法によると、タンパク質濃度は０．６ｍｇ／ｍｌ(総量１２ｍｇ)であり、１Ａ２８０単位はＡＰ２０５コートタンパク質の１．０１ｍｇ／ｍｌを表す。さらに、Ａ２６０(０．２９１)の値に対してＡ２８０(０．５９９９)の値は２であることから、調製物は本質的に核酸を欠いていることが示唆される。
【００７９】
(B) ＡＰ２０５ ＶＬＰの集合体化
任意のポリ陰イオン性高分子のない条件下における集合体化：上記で溶出されたタンパク質分画を透析濾過し、２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ６．５にて１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度にまでＴＦＦによって、濃縮した。その溶液の５００μｌを、５０μｌの５Ｍ ＮａＣｌ溶液と混合し、室温で４８時間インキュベートした。混合物中での再集合体化ＶＬＰの形成は、非還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及びサイズ排除ＨＰＬＣにて示された。２０ｍＭ リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２にて平衡化したTSKgel G5000 PWXLカラム(Tosoh Bioscience)をＨＰＬＣ分析に用いた。
ポリグルタミン酸存在下における集合体化：３７５μｌの精製したＡＰ２０５コートタンパク質(２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ６．５中に１ｍｇ／ｍｌ)を、５０μｌのＮａＣｌ貯蔵溶液(Ｈ２Ｏ中に５Ｍ)、５０μｌのポリグルタミン酸貯蔵溶液(Ｈ２Ｏ中に２ｍｇ／ｍｌ、MW: 86400, Sigma)及び２５μｌのＨ２Ｏと混合した。混合物を室温にて４８時間インキュベートした。混合物中における再集合体化ＶＬＰの形成は、非還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及びサイズ排除ＨＰＬＣにて示された。混合物中のコートタンパク質がＶＬＰ内にほぼ完全に組み込まれたことから、任意のポリ陰イオン性高分子がない条件下で集合体化したＡＰ２０５コートタンパク質より効率よく、多く集合体化されたことが示された。
【００８０】
実施例７
ＩＬ-１５-ＦＬ-ＣＧのＱβ ＶＬＰと集合化したＱβ ＶＬＰへのカップリング
実施例３から得た精製したマウスＩＬ-１５-ＦＬ-ＣＧ(１５３μＭ)を、等量のＴＣＥＰを含むＴＢＳ ｐＨ７．４にて１時間還元した。還元したＩＬ-１５-ＦＬ-ＣＧ(８３μＭ)を、ＳＭＰＨで誘導体化した総量５０μｌの５９μＭのＱβとともに室温で終夜インキュベートした。カップリング反応物を、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロットとＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分析した。タンパク質濃度をBradfordによって測定した。クーマシーブルー染色したＳＤＳ-ＰＡＧＥの濃度測定の分析によってカップリング効率を推測した。
実質的に同じ実験条件を適応して、ヒトＩＬ-１５-ＦＬ-ＣＧ(実施例４で得たもの)を、実施例５で得た集合体化したＱβ ＶＬＰ、又は実施例６から得た集合体化したＡＰ２０５ ＶＬＰにカップリングした。
【００８１】
実施例８
ヒトＩＬ-１５変異タンパク質のＱβ ＶＬＰと集合化したＱβ ＶＬＰへのカップリング
実施例４から得た精製したヒトＩＬ-１５変異タンパク質(１５３μＭ)を、等モルのＴＣＥＰを含むＴＢＳ ｐＨ７．４にて１時間還元した。還元したＩＬ-１５変異タンパク質(８３μＭ)を、ＳＭＰＨで誘導体化した総量５０μｌの５９μＭのＱβ ＶＬＰ又は５９μＭの再集合体化したＱβ ＶＬＰとともに室温で終夜インキュベートした。カップリング反応物を、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロットとＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分析した。タンパク質濃度をBradfordによって測定した。クーマシーブルー染色したＳＤＳ-ＰＡＧＥの濃度測定の分析によってカップリング効率を推測した。
【００８２】
実施例９
ヒトＩＬ-１５タンパク質のＨＢｃＡｇ１-１８５-Ｌｙｓへのカップリング
ＨＢｃＡｇ１-１８５-Ｌｙｓの構築、その発現及び精製は実質的に国際公開公報03/040164の実施例２−５に記載されている。２０mM Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２中の１２０μＭ ＨＢｃＡｇ１-１８５-Ｌｙｓキャプシドの溶液を、振とう器上において２５℃で、ＤＭＳＯ中の原液から希釈した２５倍モル濃度を超えるＳＭＰＨ(Pierce)の溶液と３０分間反応させた。この反応液について、その後、１Ｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２に対する２時間の透析を４℃で２回行った。次いで、この透析したＨＢｃＡｇ１-１８５-Ｌｙｓ反応混合液を実施例４で得たヒトＩＬ-１５タンパク質と反応させた。カップリング反応物中において、ヒトＩＬ-１５タンパク質は誘導体化したＨＢｃＡｇ１-１８５-Ｌｙｓキャプシドに対して２倍のモル過剰量とした。カップリング反応は振とう器上で２５℃で４時間続けた。カップリング産物は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分析した。
【００８３】
実施例１０
免疫原性
実験において、マウスのＡグループ(ｎ＝５)は、第０日目、第１４日目及び第２８日目に、アジュバントを含めないで、マウスＩＬ-１５-ＦＬ-ＣＧとカップリングした５０μｇのＱβ ＶＬＰにて皮下的に免疫化した。ネガティブコントロールとして、５匹のマウスにＰＢＳのみを接種した。
実験において、マウスのＢグループ(ｎ＝５)は、第０日目、第１４日目及び第２８日目に、アジュバントを含めないで、マウスＩＬ-１５-ＦＬ-ＣＧとカップリングした２５μｇのＱβ ＶＬＰにて皮下的に免疫化した。ネガティブコントロールとして、５匹のマウスにＱβ ＶＬＰのみを接種した。
表１は、ＥＬＩＳＡに示されるように、Ｑβ-ＩＬ-１５-ＦＬ-ＣＧによる免疫化により、すべてのマウスにおいてＩＬ-１５特異的ＩｇＧ抗体の力価が高くなったことを示す。これは、アジュバンドの添加なしで、ワクチンがＩＬ-１５に対する免疫学的な耐性を克服したことを示す。ＥＬＩＳＡ力価は４５０ｎｍの最大半減光学密度(ＯＤ５０％)となる血清の希釈物として定義した。ＥＬＩＳＡプレートは組み換えＩＬ-１５でコートした。５匹の動物の平均は標準偏差とともに求めた。
同じ実験条件を適応して、再集合体化したＱβ ＶＬＰにカップリングしたマウスＩＬ-１５-ＦＬ-ＣＧにてマウスを免疫化し、ＥＬＩＳＡにより抗体力価を測定して、Ｑβ ＶＬＰにカップリングしたＩＬ-１５-ＦＬ-ＣＧとネガティブコントロールによって誘導された抗体力価と比較した。
【００８４】
表１Ａ(実験Ａ)
表１Ｂ(実験Ｂ)
【００８５】
実施例１１
関節リウマチマウスモデルにおけるＱβ ＶＬＰ-ＩＬ-１５ワクチンの有効性
インビボの関節炎症状を低減するＱβ ＶＬＰ-ＩＬ-１５ワクチンの能力を、関節リウマチ(ＲＡ)のマウスモデルにおいて、評価した。このモデルにおいて、ＲＡは４つの異なるモノクローナル抗体の混合(関節原性モノクローナル抗体混合物(Arthrogenic Monoclonal Antibody Cocktail)、MD Biosciences)を静脈内注射することによって、誘導した２４時間後に、ＬＰＳを腹腔内投与をした(K. Terato, 等, J. Immunology, 148: 2102-2108, 1992)。このモデルでは、炎症は急速に進行して、強直及び永続的な関節破壊が２週間続いた。
【００８６】
Ａ実験では、マウスグループは、第−７０日目、第−５６日目及び第−４２日目に、５０μｇのＱβ ＶＬＰ-ＩＬ-１５で免疫化し、ＰＢＳのみを接種したマウスのグループはネガティブコントロールとした。Ｂ実験では、マウスグループは、第−４２日目、第−２８日目及び第−１４日目に、２５μｇのＱβ ＶＬＰ-ＩＬ-１５で免疫化し、Ｑβのみで免疫化したマウスのグループはネガティブコントロールとした。３回の免疫処置の後、第０日目に２ｍｇのモノクローナル抗体混合物(Arthrogenic Monoclonal Antibody Cocktail、MD Biosciences)を静脈内投与することによって、マウスにＲＡを誘導し、２４時間後に２００μｌのＬＰＳを投与した。炎症プロセスは１４〜１５日間にわたってモニターし、各肢の臨床スコアを求めた。関節炎の臨床スコアは１５日間以上測定した。以下の定義にしたがって、各肢に０から３の臨床スコアをつけた：０標準、１指／足の軽度の腫脹及び／又は紅斑、２全足／関節にわたる腫脹及び紅斑、３重度の腫脹、足／関節の変形、強直を有する。１グループにつき５匹のマウスの平均を標準偏差とともに求めた。
図１Ａは実験Ａの結果を示す。Ｑβ ＶＬＰ-ＩＬ-１５をワクチン接種したマウスはおよそ０．２５の平均臨床スコアを発症した。対照的に、ＰＢＳを注射したマウスは、同期間にわたって０．９７の平均臨床スコアを発症した。図１Ｂは実験Ｂの結果を示す。
Ｑβ ＶＬＰ-ＩＬ-１５をワクチン接種したマウスはおよそ０．１８の平均臨床スコアを発症したのに対して、コントロールマウスは０．５１の平均値であった。
【００８７】
実施例１２
アテローム性動脈硬化のマウスモデルにおけるＱβ ＶＬＰ-ＩＬ-１５ワクチンの有効性
７〜８週齢の雄Ａｐｏｅ−／−マウス(The Jackson Laboratory, Bar Harbor ME)に、５０μｇのＱβ-ＩＬ-１５ワクチン(ｎ＝６)(実施例７から得たもの)又は５０μｇのＱβ(ｎ＝６)のいずれかを第０、１４、２８、４９、６３及び１１３日目に皮下注射した。始めに、マウスに通常の固形飼料食餌を与え、第２１日目に西洋型食餌(２０％の脂肪、０．１５％のコレステロール、Provimi Kliba AG)に置き換えた。実験期間中、一定の間隔でマウスから血液を採取し、血清中のＩＬ-１５に対する抗体応答を測定した。第１５９日目に屠殺し、基本的には過去に記載のように(Tangirala R.K. 等 (1995) J. Lipd. Res. 36: 2320-2328)、大動脈を単離して調整した。心臓穿刺によって、動物から血液を採取し、コールドＰＢＳを灌流した。次いで、大動脈を露出させ、インサイツで除去した外膜と同じだけ(as much of the adventitia removed in situ)、最後に大動脈を心臓から取り除いた。大動脈は、コールドＰＢＳで満たしたガラスシャーレ上で残留する外膜を洗い流し、大動脈弓を左鎖骨下動脈の５ｍｍ下を切片化した。大動脈を縦に切り、黒色のワックス表面上にピンで留め、４％ホルマリンで一晩かけて固定した。次いでオイルレッドＯにて終夜をかけて染色した。プラークはデジタル写真上で画像処理ソフトウェア(Motic Image Plus 2.0)により定量化した。プラーク負荷(load)は、腸骨の分岐点までに得られる大動脈の総プラークの表面の合計を、腸骨の分岐点までに測定される大動脈の総表面で除して、パーセンテージで表した。Ｑβ-ＩＬ-１５とＱβグループ間のプラーク負荷の中央値又は平均の違いを分析した。
【００８８】
ＥＬＩＳＡプレート上にコートした組み換えＩＬ-１５を用いた、典型的なＥＬＩＳＡにおいて、抗体応答を測定した。特異的な抗体の結合を、ヤギ抗マウスＨＲＰコンジュゲートを用いて検出した。第０、１４、２８、５６及び１０２日目のＩＬ-１５に対する力価を、アッセイにおいて、最大半量の結合が得られる血清希釈物として算出した。
Ludewig B. 等 (2000) PNAS 97:12752-12757に記載のように、各動物のアテローム性動脈硬化の範囲は大動脈起点(aortic origin)による横断切片の組織学的分析によって、さらに評価した。すべての３の弁尖端から大動脈起点による凍結連続横断切片を採取した。オイルレッドＯで染色して、病変サイズを定量化するために、逆にヘマトキシリンで染色した。
抗体応答の測定値の結果を表２に示す。免疫前(ｄ０)血清において、検出可能な力価がほとんどなかったので、ＱβにカップリングしたマウスＩＬ-１５に対する免疫化により、ＩＬ-１５に対する強力で特異的な抗体応答が誘発されたことが明確に示された。
さらに、ＩＬ-１５に特異的な抗体応答の誘導により、Ｑβグループと比較して、Ｑβ-ＩＬ-１５グループの平均(４７％)及び中間値(４６％)のプラーク負荷が減少した。これは、ＩＬ-１５がアテローム性動脈硬化の発症に伴っており、Ｑβ-ＩＬ-１５ワクチンによる抗ＩＬ-１５抗体の誘導はアテローム性動脈硬化を有利に調整することを示唆している。
【００８９】
表２ Ｑβ-ＩＬ-１５で免疫化したＡｐｏｅ−／−マウスにおける相乗平均の抗ＩＬ-１５抗体力価
【００９０】
実施例１３
マウスＩＬ-１５断片のＱβ ＶＬＰへのカップリング
Ｑβウイルス様粒子(２ｍｇ／ｌ)を２．８ｍＭ ＳＭＰＨ(Pierce, Perbio Science)によって、２５℃で６０分間かけて誘導体化して、次いでＰＢＳにて透析した。ＩＬ-１５６１-７３(２５０μＭ)および誘導体化したＱβ ＶＬＰ(１００μＭ)を、ＰＢＳバッファ中で１５℃で、１時間インキュベートした。カップリング産物をＳＤＳ-ＰＡＧＥによって、分析した。我々は、１のＱβ単量体に対する１のＩＬ-１５６１-７３分子と１のＱβ単量体に対する２のＩＬ-１５６１-７３分子のカップリング産物を同定した。また、ＩＬ-１５４２-５５を同様の方法でＱβにカップリングした。
【００９１】
実施例１４
実験的喘息の動物モデルにおけるワクチンの有効性
インビボのＱβ-ＩＬ-１５によるワクチン接種の効果を、オバルブミン(ＯＶＡ)ベースの喘息のマウスモデルにおいて、評価した。この実験により、Ｑβ-ＩＬ-１５によるワクチン接種により生成された抗ＩＬ-１５抗体の内在性ＩＬ-１５のインビボ作用を下方制御する能力を試験した。ＢＡＬＢ／ｃマウスの１グループにつき６匹、３つのグループで分析した。マウスは、第７日目、第２１日目及び第３５日目に、５０μｇのＱβ-ＩＬ-１５(グループＣ、実施例７から得たもの)又はコントロールとしてのＱβ ＶＬＰのみ(グループＡ及びＢ)のいずれかにてワクチン接種した。２回目のワクチン接種の後に、Ｑβ又はＩＬ-１５のいずれかに対して高いＩｇＧ力価が得られた。第０日目に、グループＢ及びＣのマウスを、腹膜内に２ｍｇのＡｌ２Ｏ３に吸着された５０μｇのＯＶＡ(グレードＶ；Sigma-Aldrich)にて感作した。肺アレルギー性炎症を誘導するために、これらのマウスは、第４２日目〜第４５日目まで毎日、ＯＶＡエアゾールの吸入(２．５％のＰＢＳ溶液、Pari TurboBOY；Pariによって、３０分間噴霧)により抗体負荷した。ネガティブコントロールとして、グループＡのマウスは、第０日目にＯＶＡとＡｌ２Ｏ３で処置せず、その後ＯＶＡエアゾールによって、抗体負荷も行わなかった。第４６日目に、マウスは死亡し、気管支肺胞洗浄(ＢＡＬ)を行って、ＢＡＬ内に浸透している細胞の数を数えて、気道過敏症(ＡＨＲ)を測定した。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１Ａ】Ｑβ ＶＬＰ-ＩＬ-１５にて免疫化したマウスの関節炎の平均臨床スコアを示す。図１Ａは５０μｇのＱβ ＶＬＰ-ＩＬ-１５で免疫化したマウスとＰＢＳのみを投与したマウスの関節炎の平均臨床スコアを示す。バーは各免疫化グループの平均スコアを表す。
【図１Ｂ】Ｑβ ＶＬＰ-ＩＬ-１５にて免疫化したマウスの関節炎の平均臨床スコアを示す。図１Ｂは２５μｇのＱβ ＶＬＰ-ＩＬ-１５で免疫化したマウスとＱβのみで免疫化したマウスの関節炎の平均臨床スコアを示す。バーは各免疫化グループの平均スコアを表す。
【図２】Ａｐｏｅ−／−マウスにおけるアテローム性動脈硬化プラーク負荷の数量化及び統計学的分析を示す。バーは、Ｑβ-ＩＬ-１５(黒色バー)又はＱβ(白色バー)で免疫化したＡｐｏｅ−／−マウスの大動脈における平均アテローム性動脈硬化プラーク負荷を割合で示す。誤差バーは平均の標準偏差を示す。
【発明の開示】
【０００１】
(発明の背景)
発明の分野
本発明は、医学、公衆衛生学、免疫学、分子生物学及びウイルス学の分野に関連する。本発明は、ウイルス様粒子(ＶＬＰ)と少なくとも一の抗原を含有してなる組成物であって、該抗原がそれぞれＶＬＰに結合されたＩＬ-１５タンパク質、ＩＬ-１５変異タンパク質ないしはＩＬ-１５断片である組成物を提供する。
また、本発明は、前述の組成物の産生方法を提供する。本発明の組成物は、特にＩＬ-１５が症状を媒介する又は症状の一因となる疾患の治療のため、特に炎症性疾患及び／又は慢性自己免疫性疾患の治療のためのワクチンの産生に有用である。さらに、本発明の組成物は、有効な免疫応答、特に抗体応答を誘導する。さらに、本発明の組成物は、示した範囲内の自己特異的な免疫応答を効率よく誘発するために特に有用である。
【０００２】
関連技術
背景
インターロイキン１５(ＩＬ-１５)は、ＩＬ-２に構造的及び機能的に関係する１４〜１５ｋＤの糖タンパク質である、炎症誘発性サイトカインである (Tagaya 等, Immunity, 1996、 4:329-336)。ＩＬ-１５は結合して、γ鎖(γｃ)、ＩＬ-２Ｒβ及びＩＬ-１５Ｒαからなるヘテロトリマーレセプターを介してシグナル伝達する。ＩＬ-２、ＩＬ-４、ＩＬ-７、ＩＬ-９、ＩＬ-１５及びＩＬ-２１のすべてが、γ鎖を含有するレセプターを利用する一方、ＩＬ-２及びＩＬ-１５レセプターもＩＬ-２Ｒβを共有する。ＩＬ-１５は、ＩＬ-１５Ｒαと結合する唯一のサイトカインであることが現在明らかにされている。ＩＬ-１５は、高い親和性(Ｋａ＝１×１０１１Ｍ−１)でＩＬ-１５Ｒα単独と結合して、中程度の親和性(Ｋａ＝１×１０９Ｍ−１)でＩＬ-２Ｒβとγ鎖との複合体と結合する。
【０００３】
単球、マクロファージ、線維芽細胞、ケラチン合成細胞及び樹状細胞を含む様々な細胞及び組織において、ＩＬ-１５の恒常的発現が報告されている(Waldmann及びTagaya, Annu Rev Immunol. 1999、 17:19-49、Fehniger及びCaligiuri, Blood. 2001、 97:14-32)。ＩＦＮ-γ及びＬＰＳによって、又はウイルス、細菌ないしは原生動物による感染により刺激される単球について報告されるように、炎症性条件下において、その発現が上方制御される(Kirman 等, Inflamm Res. 1998、 47:285-9、Waldmann 等, Int Rev Immunol. 1998、 16:205-26、Waldmann及びTagaya, Annu Rev Immunol. 1999、 17:19-49、Fehniger及びCaligiuri, Blood. 2001、 97:14-32)。さらに、関節リウマチなどの慢性炎症性疾患では、局所的に産生されたＩＬ-１５は、滑液Ｔ細胞の動員及び活性化によって、炎症を増幅するようである。このＩＬ-１５-誘導効果は、疾患発病学において、役割を果たすことが示唆されている(Kirman 等, Inflamm Res. 1998、 47:285-9.、McInnes 等, Nat. Med. 1996、 2:175-82.、McInnes 等, Nat. Med. 1997、 3:189-95、McInnes及びLiew, Immunol Today. 1998、 19:75-9.、Fehniger及びCaligiuri, Blood. 2001、 97:14-32.)。
【０００４】
ＩＬ-１５に対して特異的なモノクローナル抗体は、多くの慢性炎症性疾患及び／又は自己免疫性疾患を治療する場合に提唱されている。国際公開公報0002582は、炎症性腸疾患を治療するためにＩＬ-１５モノクローナル抗体を用いることを開示している。国際公開公報03017935は、ＩＬ-１５炎症誘導性効果を阻害するため、特に乾癬及び関節炎を治療するためにＩＬ-１５モノクローナル抗体を使用することを開示している。
モノクローナル抗体の半減期が人体において、およそ２〜４週間のみであるので、モノクローナル抗体治療には、大量の抗体を繰り返し投与する必要があるという欠点がある(Kaplan, Curr Opin Invest. Drugs. 2002、 3:1017-23.)。高用量の抗体は、注入疾患などの副作用を引き起こしうる。また、ヒト抗体又はヒト化抗体が用いられる場合であっても、アロタイプ応答の患者において、抗抗体が生成され、治療効果が減少するか原因と思われる副作用を引き起こしうる。さらに、ヒト化モノクローナル抗体の高い生産コストによる出費と、常習的な病院訪問者に伴う出費のために、この抗体治療が必要とする多くの患者に利用できなくなる。
【０００５】
(発明の概要)
我々は、驚くべきことに、少なくとも一のＩＬ-１５タンパク質、ＩＬ-１５変異タンパク質ないしはＩＬ-１５断片を含有してなる本発明の組成物及びワクチンのそれぞれが、強力な免疫応答、特に強力な抗体応答を誘導し、自己抗原ＩＬ-１５に対する抗体力価を高めることができることを発見した。さらに、我々は、驚くべきことに、本発明の組成物及びワクチンのそれぞれが、関節リウマチなどのＩＬ-１５が重大な役割を果たす自己免疫性疾患及び／又は炎症性疾患の誘導及び進行に対して予防的効果及び／又は治療的効果を有する、強力な免疫応答、特に強力な抗体応答を誘導することができることを発見した。さらに、我々は、驚くべきことに、本発明の組成物及びワクチンのそれぞれが、アテローム性動脈硬化の誘導及び進行に対して予防的効果及び／又は治療的効果を有する、強力な免疫応答、特に強力な抗体応答を誘導することができることを発見した。したがって、このことから、免疫応答、特に本発明の組成物及びワクチンのそれぞれによって産生される抗体が、インビボでＩＬ-１５を特異的に認識することができ、その機能を阻害しうることが示唆される。
【０００６】
したがって、第一の態様では、本発明は、(a) 少なくとも一の第一付着部位を有するウイルス様粒子(ＶＬＰ)；と(b) 少なくとも一の第二付着部位を有する少なくとも一の抗原；を含んでなり、該少なくとも一の抗原がＩＬ-１５タンパク質、ＩＬ-１５変異タンパク質ないしＩＬ-１５断片であり、(a)と(b)が該少なくとも一の第一付着部位と該少なくとも一の第二付着部位を介して結合して、好ましくは規則的に反復した抗原アレイを形成する組成物を提供する。本発明の好適な実施態様では、本発明の使用に好適なウイルス様粒子は、ウイルス、好ましくはＲＮＡバクテリオファージの組み換えタンパク質、好ましくは組み換えコートタンパク質、その変異体ないしはその断片を含有する。
【０００７】
ある好適な実施態様では、本発明の組成物は少なくとも一のＩＬ-１５変異タンパク質を含有する。ＩＬ-１５変異タンパク質はＩＬ-１５の生物学的活性を持たないが、ＩＬ-１５とほぼ同じタンパク質構造を保持するのが好ましい。ＩＬ-１５は強力なＴ細胞刺激性サイトカインである。したがって、本発明のＩＬ-１５変異タンパク質を含んでなる組成物は治療的に有効な医薬を提供する一方、典型的には、体内に生物学的に活性なＩＬ-１５が誘導されない。
ある好適な実施態様では、本発明の組成物は少なくとも一のＩＬ-１５断片を含有しており、該断片はＩＬ-１５の少なくとも一の抗原部位を含むものである。強力で保護的な免疫応答、特に抗体応答が確保される一方で、本発明のＩＬ-１５断片の使用により、自己特異的な細胞障害性Ｔ細胞応答が誘導される可能性が減少しうる。
【０００８】
他の態様では、本発明はワクチン組成物を提供する。さらに、本発明は、ヒト又は動物、好ましくは哺乳動物へのワクチン組成物の投与方法を提供する。本発明のワクチン組成物は、少なくとも一のアジュバントなしで強力な免疫応答、特に抗体応答を誘導することができる。したがって、ある好適な実施態様では、ワクチンはアジュバントを欠いている。アジュバントの使用を避けることによって、望ましくない炎症性Ｔ細胞応答が生じる可能性が減少しうる。
ある好適な実施態様では、組成物及びワクチン組成物のそれぞれに含まれる本発明のＶＬＰは、宿主内で組み換えて産生されるものであり、ＲＮＡファージのＶＬＰは基本的に宿主のＲＮＡ又は宿主のＤＮＡ、好ましくは宿主の核酸を含まない。これは、宿主のＲＮＡないしは宿主のＤＮＡ、好ましくは宿主の核酸を減少する、好ましくは除去して、望ましくないＴ細胞応答並びに発熱などの他の望ましくない副作用を避けるという利点がある。
【０００９】
ある態様では、本発明は、アテローム性動脈硬化、喘息又は、ＩＬ-１５タンパク質がその症状を媒介するかその症状の一因となっている、炎症性疾患及び／又は自己免疫性疾患の治療方法であり、本発明の組成物ないしは本発明のワクチン組成物のそれぞれが動物又はヒトに投与されることを含む方法を提供する。ＩＬ-１５タンパク質がその症状を媒介するかその症状の一因となっている、炎症性疾患及び／又は自己免疫性疾患には、例えば限定するものではないが、関節リウマチ、乾癬性関節炎、若年性突発性関節炎、乾癬、クローン病がある。
更なる態様では、本発明は、本発明の組成物と受容可能な薬剤的担体を含有してなる薬剤組成物を提供する。
【００１０】
より更なる態様では、本発明は、(a) 少なくとも一の第一付着部位を有するＶＬＰを供給する；(b) 少なくとも一の第二付着部位を有するＩＬ-１５タンパク質、ＩＬ-１５変異タンパク質ないしはＩＬ-１５断片である、少なくとも一の抗原を供給する；そして(c) 該ＶＬＰと該少なくとも一の抗原を組み合わせて、該少なくとも一の第一付着部位と該少なくとも一の第二付着部位を介して少なくとも一の抗原と該ＶＬＰが結合している、組成物を産生する、ことを含む、本発明の組成物の産生方法を提供する。
【００１１】
(発明の詳細な説明)
定義：
抗原：本明細書で使用するように、「抗原」という用語は、ＭＨＣ分子によって提示される場合、抗体又はＴ細胞レセプター(ＴＣＲ)に結合されうる分子を指す。「抗原」という用語は、本明細書で使用するように、Ｔ細胞エピトープも含む。さらに抗原は、免疫系に認識されることができ、及び／又は、Ｂ及び／又はＴリンパ球の活性化がもたらされる体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を誘導することができる。しかしながら、このことは、少なくともいくつかの場合において、抗原がＴｈ細胞エピトープを含むかあるいはこれと連結し、アジュバント中に存在することが必要でありうる。抗原は、１つ又は複数のエピトープ(Ｂ及びＴエピトープ)を有しうる。上記の特異的な反応とは、抗原が、好ましくは典型的には非常に選択的な方式で、その対応する抗体又はＴＣＲと反応し、他の抗原によって誘発される可能性がある多数の他の抗体又はＴＣＲとは反応しないことを示すことを意図する。また、ここで用いた抗原はいくつかの別々の抗原の混合でもよい。
【００１２】
抗原性部位：本明細書中において相互に交換可能に用いられる「抗原性部位」なる用語及び「抗原性エピトープ」なる用語は、ＭＨＣ分子の環境におけるＴ細胞レセプター又は抗体によって免疫特異的に結合されるポリペプチドの連続的な又は非連続的な部位を意味する。免疫特異的な結合は、非特異的な結合が除外されるが必ずしも交差反応が除外されない。典型的に、抗原性部位は、抗原性部位に特有の空間的な立体構造内に５−１０アミノ酸を含有する。
結合(会合) (associated)：本明細書中で用いられる「結合(会合) (associated)」なる用語は、２つの分子がともに結合するすべての可能な方法、好ましくは化学的な相互作用を指す。化学的な相互作用には共有的相互作用及び非共有的相互作用が含まれる。非共有的相互作用の典型的な例は、イオン性相互作用、疎水性相互作用、又は水素結合であり、一方、共有的相互作用は、例として共有結合、例えばエステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、炭素−リン結合、炭素−イオウ結合、例えばチオエーテル、又はイミド結合ベースである。
【００１３】
第一付着部位：ここで用いる「第一付着部位」なる用語は、ＶＬＰに天然に生じる又はＶＬＰに人工的に付加される成分であり、第二付着部位が結合する部位を指す。第一付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成ポリマー、二次的代謝産物又は化合物(ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド)、又は化学反応基、例えばアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、グアニジル基、ヒスチジル基、又はこれらの組合せであってよい。第一付着部位である化学反応基の好適な実施態様は、リジンなどのアミノ酸のアミノ基である。第一付着部位は、典型的にはＶＬＰの表面上、好ましくはＶＬＰの外表面上に位置する。多数の第一付着部位が、典型的には反復形状で、ウイルス様粒子の表面上、好ましくは外表面上に存在する。好適な実施態様では、第一付着部位は、少なくとも一の共有結合を介して、好ましくは少なくとも一のペプチド結合を介してＶＬＰと会合(結合)する。
【００１４】
第二付着部位：ここで用いる「第二付着部位」なる用語は、本発明のＩＬ-１５に天然に生じる又は本発明のＩＬ-１５に人工的に付加される成分であり、第一付着部位が結合する部位を指す。本発明のＩＬ-１５の第二付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成ポリマー、二次的代謝産物又は化合物(ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド)、又は化学反応基、例えばアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、グアニジル基、ヒスチジル基、又はこれらの組合せであってよい。第二付着部位である化学反応基の好適な実施態様は、好ましくはシステインなどのアミノ酸のスルフヒドリル基である。したがって、「少なくとも一の第二付着部位を有するＩＬ-１５タンパク質」、「少なくとも一の第二付着部位を有するＩＬ-１５変異タンパク質」、「少なくとも一の第二付着部位を有するＩＬ-１５断片」又は「少なくとも一の第二付着部位を有する本発明のＩＬ-１５」なる用語は、本発明のＩＬ-１５と少なくとも一の第二付着部位を含むコンストラクトを指す。しかしながら、特に、ＩＬ-１５タンパク質、ＩＬ-１５変異タンパク質ないしはＩＬ-１５断片に天然に生じない第二付着部位の場合、典型的かつ好ましくは、そのようなコンストラクトはさらに「リンカー」を含む。他の好適な実施態様では、第二付着部位は、少なくとも一の共有結合を介して、好ましくは少なくとも一のペプチド結合を介して本発明のＩＬ-１５と会合(結合)する。さらに他の好適な実施態様では、第二付着部位は、好ましくはシステインを含むリンカーを介して本発明のＩＬ-１５に人工的に付加される。好ましくは、リンカーはペプチドにより本発明のＩＬ-１５に融合される。
【００１５】
コートタンパク質：本出願において、「コートタンパク質」なる用語と交換可能に用いられる「キャプシドタンパク質」なる用語は、ウイルスキャプシド又はＶＬＰ内に内包されうるウイルスタンパク質、好ましくはウイルス、好ましくはＲＮＡファージの天然のキャプシドのサブユニットを指す。典型的かつ好ましくは、「コートタンパク質」なる用語は、ウイルス、好ましくはＲＮＡバクテリオファージのゲノム、又はウイルス、好ましくはＲＮＡバクテリオファージの変異体のゲノムによってコードされるコートタンパク質を指す。より好ましくは、例として、「ＡＰ２０５のコートタンパク質」なる用語は、配列番号１４又は、第一メチオニンが配列番号１４から切断されているアミノ酸配列を指す。より好ましくは、例として、「Ｑβのコートタンパク質」はＮ末端のメチオニンの有無にかかわらず、配列番号１(「Ｑβ ＣＰ」)と配列番号２(Ａ１)を指す。バクテリオファージＱβのキャプシドは主にＱβ ＣＰと少量のＡ１タンパク質からなる。
【００１６】
本発明のＩＬ-１５：本明細書中で用いる「本発明のＩＬ-１５」なる用語は、本明細書中で定義する少なくとも一のＩＬ-１５タンパク質、少なくとも一のＩＬ-１５変異タンパク質ないしは少なくとも一のＩＬ-１５断片、又はその組合せを指す。
ＩＬ-１５タンパク質：本明細書中で用いる「ＩＬ-１５タンパク質」なる用語は、配列番号：２３のヒトＩＬ-１５、配列番号：２４のマウスＩＬ-１５、配列番号：２５のラットＩＬ-１５、又は任意の他の動物由来の対応するオルソログを含む、あるいは好ましくはそれからなるポリペプチドを包含する。さらにまた、本明細書中で用いる「ＩＬ-１５タンパク質」なる用語は、配列番号：２３のヒトＩＬ-１５、配列番号：２４のマウスＩＬ-１５、配列番号：２５のラットＩＬ-１５、又は任意の他の動物由来の対応するオルソログと、７０％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上及び最も好ましくは９７％以上のアミノ酸配列相同性を有する任意の遺伝的に操作した変異体又は天然の変異体を含むか、ないしは好ましくはそれからなる任意のポリペプチドを包含する。本明細書中で用いる「ＩＬ-１５タンパク質」なる用語は、限定するものではないが、上記に定義するＩＬ-１５タンパク質のリン酸化、アセチル化、グリコシル化を含む翻訳後修飾をさらに包含する。好ましくは、本明細書中で定義するＩＬ-１５タンパク質は、最大５００アミノ酸長、さらにより好ましくは最大３００アミノ酸長、さらにより好ましくは最大２００アミノ酸長、及びさらにより好ましくは最大１５０、さらにより好ましくは最大１３０アミノ酸長からなる。典型的かつ好ましくは、ＩＬ-１５タンパク質は、例えばＥＬＩＳＡにより検査されるような、ＩＬ-１５に特異的に結合する抗体の産生をインビボで誘導できる。
【００１７】
ＩＬ-１５変異タンパク質：本明細書中の「ＩＬ-１５変異タンパク質」なる用語は、ＩＬ-１５タンパク質である任意のポリペプチドであり、ＩＬ-１５生物学的活性を有さないポリペプチドを包含する。より好ましくは、「ＩＬ-１５変異タンパク質」なる用語は、配列番号：２３のヒトＩＬ-１５、配列番号：２４のマウスＩＬ-１５、配列番号：２５のラットＩＬ-１５、又は任意の他の動物由来の対応するオルソログと、少なくとも１つ及び最大６つ、好ましくは最大５つ、より好ましくは最大４つ、より好ましくは最大３つ、さらにより好ましくは最大２つ、最も好ましくは１つのアミノ酸が異なる任意のポリペプチドであり、ＩＬ-１５の生物学活性を有さないポリペプチドを指す。典型的及び好ましくは、ＩＬ-１５変異タンパク質を含有する本発明の組成物は、ＩＬ-１５に特異的に結合する抗体の産生をインビボで誘導することができる。本明細書中で用いる「ＩＬ-１５の生物学活性」なる用語は、Ｔリンパ球増殖及び／又は分化を刺激することができることを指す。
【００１８】
ＩＬ-１５の生物学活性を測定するための典型的かつ好適なアッセイは欧州特許第0772624号の実施例２に開示されており、出典明記によって本明細書中に組み込まれる。ＩＬ-１５タンパク質は、ポジティブコントロールとして用いる対応する野生型ＩＬ-１５を用いた同じ実験において試験される。対応する野生型ＩＬ-１５は、ＩＬ-１５タンパク質と同じ種のＩＬ-１５を指す。タンパク質濃度アッセイ、例えばブラッドフォード(Bradford)アッセイを行って、化学量論的に等しい量のＩＬ-１５タンパク質の変異体と、ポジティブコントロールとして用いたそれに対応する野生型ＩＬ-１５が同じ実験で試験されることを確認する。試験したＩＬ-１５の量とポジティブコントロールとして用いた対応する野生型ＩＬ-１５が互いに３％以上、好ましくは１％以上異ならない場合に等しい量とみなす。
ＩＬ-１５タンパク質が等量のポジティブコントロールとして用いた対応する野生型ＩＬ-１５のＩＬ-１５生物学的活性の最大２０％、好ましくは１０％、より好ましくは５％、さらにより好ましくは１％、さらにより好ましくは０．２％を有する場合、特定のＩＬ-１５タンパク質はＩＬ-１５の生物学活性を有さない。
【００１９】
ＩＬ-１５断片：本明細書中で用いる「ＩＬ-１５断片」なる用語は、本明細書中で定義するようなＩＬ-１５タンパク質ないしＩＬ-１５変異タンパク質の少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１７、１８、１９、２０、２５、３０の連続するアミノ酸を含有するか、あるいは好ましくはこれらからなる任意のポリペプチド、並びにそれに対して６５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上及びさらにより好ましくは９５％以上のアミノ酸配列相同性を有する任意のポリペプチドを包含する。好ましくは、本明細書中で用いる「ＩＬ-１５断片」なる用語は、本明細書中で定義するようなＩＬ-１５タンパク質ないしＩＬ-１５変異タンパク質の少なくとも６の連続するアミノ酸を含有するか、あるいは好ましくはこれらからなる任意のポリペプチド、並びにそれに対して８０％以上、８５％以上、好ましくは９０％以上及びさらにより好ましくは９５％以上のアミノ酸配列同一性を有する任意のポリペプチドを包含する。ＩＬ-１５断片の好適な実施態様は、ＩＬ-１５タンパク質ないしＩＬ-１５変異タンパク質の内部欠損型又は切断型である。典型的かつ好ましくは、ＩＬ-１５断片は、ＩＬ-１５に特異的に結合できる抗体のインビボでの産生を誘導できる。
【００２０】
ポリペプチドのアミノ酸相同性は、ベストフィット(Bestfit)などの公知のコンピュータプログラムを用いて慣習的に測定することができる。ベストフィットないしは任意の他の配列アラインメントプログラムを用いて、好ましくはベストフィットを用いて、特定の配列が例えば参照するアミノ酸配列に対して９５％の相同性があるかどうかを決定するために、参照アミノ酸配列の完全長に対する相同性の割合が算出され、参照配列中のアミノ酸残基の合計数の５％以下の相同性にギャップが挿入されるようにパラメータを設定する。ポリペプチド間の相同性の割合を測定する前述の方法は、本発明に開示するすべてのタンパク質、ポリペプチドないしはその断片に適するものである。
結合(linked)：ここで用いられる場合、「結合(連結)」なる用語は、可能であれば、好ましくは少なくとも第一付着部位と少なくとも一の第二付着部位がともに連結する化学的な相互作用を意味する。化学的な相互作用には共有的相互作用や非共有的相互作用が含まれる。非共有的相互作用の典型的な例は、イオン性相互作用、疎水性相互作用又は水素結合であるのに対して、共有的相互作用は、共有結合、例えばエステル、エーテル、リン酸エステル、アミド、ペプチド、炭素-リン結合、炭素-イオウ結合、例えばチオエーテル又はイミド結合ベースのものである。ある好適な実施態様では、第一付着部位と第二付着部位は、少なくとも一の共有結合、好ましくは少なくとも一の非ペプチド結合、よりさらに好ましくは、非ペプチド結合のみを介して結合される。しかしながら、ここで用いられる「結合」なる用語は、少なくとも一の第一付着部位と少なくとも一の第二付着部位の直接結合を包含するだけでなく、選択的に好ましくは、中間分子、及びこれによって典型的かつ好ましくは、少なくとも一の、好ましくは一のヘテロ二官能性架橋剤を介して、少なくとも一の第一付着部位と少なくとも一の第二付着部位との間接的な結合も包含する。
【００２１】
リンカー：本明細書で使用する「リンカー」は、第二付着部位と本発明のＩＬ-１５を結合させるか、第二付着部位を既に含むか、基本的に第二付着部位からなるか第二付着部位からなる。好ましくは、本明細書中で用いる「リンカー」は第二付着部位を、典型的かつ好ましくは、限定するものではないが、一アミノ酸残基として、好ましくはシステイン残基として既に含む。また、本明細書中で用いる「リンカー」は、特に本発明のリンカーが少なくとも一のアミノ酸残基を含有する場合、「アミノ酸リンカー」と称する。したがって、「リンカー」と「アミノ酸リンカー」なる用語は、本明細書中において相互に交換可能に用いられる。しかしながら、この用語は、アミノ酸残基からなるアミノ酸リンカーが本発明の好ましい実施態様である場合でも、このようなアミノ酸リンカーがアミノ酸残基のみからなることを示すことを意味するものではない。リンカーのアミノ酸残基は、当分野で知られている天然に存在するアミノ酸又は非天然アミノ酸、すべてのＬ型又はすべてのＤ型、あるいはこれらの混合物から構成されることが好ましい。したがって、スルフヒドリル基又はシステイン残基を含有する分子は本発明のリンカーの好適な実施態様であり、このような分子も本発明内に含まれる。さらに、本発明に有用なリンカーは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−、シクロアルキル、例えばシクロペンチル又はシクロヘキシル、シクロアルケニル、アリール又はヘテロアリール分子を含有する分子である。さらに好ましくは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル−、シクロアルキル(Ｃ５、Ｃ６)、アリール、又はヘテロアリール部分と付加的なアミノ酸を含んでなるリンカーも本発明のためのリンカーとして使用可能であり、本発明の範囲内である。本発明のＩＬ-１５とリンカーの間の会合(結合)は、少なくとも１つの共有結合によるものであることが好ましく、少なくとも１つのペプチド結合によるものであることがより好ましい。
【００２２】
規則的で反復性の抗原アレイ：本明細書で用いる「規則的で反復性の抗原アレイ」なる用語は、一般的に、それぞれウイルス様粒子との関係で抗原中に、典型的に好ましくは非常に規則的に均一に空間的に配置していることに特徴がある、抗原の反復パターンを指す。本発明の一実施態様では、反復パターンは幾何学的パターンである。ＲＮＡファージのＶＬＰなどの本発明の特定の実施態様では、好ましくは１から３０ナノメーターの間隔、好ましくは２から１５ナノメーターの間隔、より好ましくは２から１０ナノメーターの間隔、さらにより好ましくは２から８ナノメーターの間隔、さらにより好ましくは１．６から７ナノメーターの間隔を有する、抗原の準結晶性の、厳密に反復的な順序配列を持つ、好適に規則的で反復性の抗原の典型的かつ好ましい例である。
パッケージ化(packaged)：本明細書で使用するように、「パッケージ化」という用語は、ＶＬＰとの関係でのポリ陰イオン性高分子の状態を指す。本明細書中で用いる「パッケージ化」という用語は、共有、たとえば化学的カップリング、又は非共有、たとえばイオン性相互作用、疎水性相互作用、水素結合などでありうる結合を含む。また、この用語にはポリ陰イオン性高分子の封入ないしは部分的な封入が含まれる。したがって、ポリ陰イオン性高分子を、実際に結合、特に共有結合しなくても、ＶＬＰによって封入することができる。好適な実施態様では、少なくとも一のポリ陰イオン性高分子はＶＬＰ内に、最も好ましくは非共有的様式にてパッケージ化される。
【００２３】
ポリペプチド：本願明細書中で用いられる「ポリペプチド」なる用語は、アミド結合(ペプチド結合ともいう)によって、線形に連結される単量体(アミノ酸)から成る分子を指す。これはアミノ酸の分子鎖を示し、特定の長さの産物を指すわけではない。ゆえに、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質は、ポリペプチドの定義の中に含まれる。たとえば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ポリペプチドの翻訳後修飾も包含する。
ウイルス粒子：本明細書中で用いられる「ウイルス粒子」なる用語は、ウイルスの形態学的形状を意味する。いくつかのウイルス型には、タンパク質キャプシドに囲まれるゲノムを含む；他のものは付加的な構造(例えばエンベロープ、テイルなど)を有する。
【００２４】
ここで用いられるウイルス様粒子(ＶＬＰ)は、非複製性又は非感染性、好ましくは非複製性かつ非感染性のウイルス粒子を指し、又はウイルス粒子、好ましくはウイルスのキャプシドに類似する非複製性又は非感染性、好ましくは非複製性かつ非感染性の構造を指す。本明細書中で用いる「非複製性」なる用語は、ＶＬＰに含まれるゲノムを複製することができないことを意味する。本明細書中で用いる「非感染性」なる用語は、宿主細胞に侵入できないことを意味する。好ましくは、本発明のウイルス様粒子は、ウイルスゲノムないしはウイルスゲノム機能の全て又は一部を欠いているため、非複製性及び／又は非感染性である。一実施態様では、ウイルス様粒子はウイルス粒子であり、このウイルスゲノムは物理的又は科学的に不活性化されている。典型的かつより好ましくは、ウイルス様粒子はウイルスゲノムの複製性及び感染性の相等物のすべて又は一部を欠いている。本発明のウイルス様粒子は、それらのゲノムと異なる核酸を含みうる。本発明のウイルス様粒子の典型的かつ好ましい実施態様では、対応するウイルス、バクテリオファージ、好ましくはＲＮＡファージのウイルスキャプシド等の、ウイルスキャプシドである。「ウイルスキャプシド」又は「キャプシド」なる用語は、ウイルスタンパク質のサブユニットから構成される巨大分子の集合体を指す。典型的には、６０、１２０、１８０、２４０、３００、３６０及び３６０以上のウイルスタンパク質サブユニットである。典型的かつ好ましくは、これらのサブユニットの相互作用により、固有の反復して組織化される、ウイルスキャプシド又はウイルスキャプシド様構造が形成される。前記構造は典型的には球状又は管状である。
【００２５】
ＲＮＡファージのウイルス様粒子：本明細書中で用いる「ＲＮＡファージのウイルス様粒子」なる用語は、ＲＮＡファージのコートタンパク質、その変異体ないしは断片を含んでなる、好ましくは基本的にこれからなる、あるいはこれからなるウイルス様粒子を指す。さらに、ＲＮＡファージの構造に類似するＲＮＡファージのウイルス様粒子は非複製性及び／又は非感染性であり、ＲＮＡファージの複製機構をコードする少なくとも一の遺伝子、好ましくは複数の遺伝子を欠損しており、及び典型的には、宿主にウイルスが接着するか侵入するためのタンパク質又はそれに関与するタンパク質をコードする一又は複数の遺伝子を欠損する。しかしながらまた、この定義には、前述の遺伝子又は遺伝子群が存在するが不活性であるため、ＲＮＡファージのウイルス様粒子が非複製性及び／又は非感染性となる、ＲＮＡファージのウイルス様粒子が包含される。本開示の範囲内で、「サブユニット」及び「単量体」なる用語は、この文脈において、相互に交換可能に、同等に用いられる。本出願では、「ＲＮＡファージ」なる用語及び「ＲＮＡ-バクテリオファージ」なる用語は、相互に交換可能に使われる。
【００２６】
Ｏｎｅ、ａ、又はａｎ：用語「ｏｎｅ」、「ａ」、又は「ａｎ」を本開示中で使用するとき、それらは、特に示さない限りは、「少なくとも一」、又は「一又は複数」を意味する。
この出願において、抗体は、１０６Ｍ−１又はそれ以上、好ましくは１０７Ｍ−１又はそれ以上、より好ましくは１０８Ｍ−１又はそれ以上、最も好ましくは１０９Ｍ−１又はそれ以上の結合親和性(Ｋａ)で、抗原と結合するならば、特異的に結合するものと定義される。抗体の親和性は、(例えばスキャッチャード分析により)通常の当業者によって容易に測定され得る。
【００２７】
この発明は、動物又はヒトにおいてＩＬ-１５に対する免疫応答を亢進するための組成物及び方法を提供する。本発明の組成物は、(a) 少なくとも一の第一付着部位を有するウイルス様粒子(ＶＬＰ)；と(b) 少なくとも一の第二付着部位を有する少なくとも一の抗原を含んでなり、該少なくとも一の抗原がＩＬ-１５タンパク質、ＩＬ-１５変異タンパク質ないしはＩＬ-１５断片であり、(a)と(b)が該少なくとも一の第一付着部位と該少なくとも一の第二付着部位を介して結合しているものである。好ましくは、ＩＬ-１５タンパク質、ＩＬ-１５変異タンパク質ないしはＩＬ-１５断片はＶＬＰに結合しており、規則的で反復性の抗原-ＶＬＰアレイを形成する。本発明の好適な実施態様では、本発明の少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、より好ましくは少なくとも６０、さらにより好ましくは少なくとも１２０及びさらにより好ましくは少なくとも１８０の本発明のＩＬ-１５がＶＬＰに結合する。
規則的で反復性の構造を有する当分野で公知の任意のウイルスは、本発明のＶＬＰとして選択してもよい。ＶＬＰの調整のために使用されうる具体的なＤＮＡないしＲＮＡウイルスのコート又はキャプシドタンパク質は、国際公開公報2004/009124の２５頁の１０−２１行目、２６頁の１１−２８行目及び２８頁の４行目から３１頁の４行目に開示されている。これらの開示内容は出典明記により本明細書中に組み込まれる。
【００２８】
ウイルスないしウイルス様粒子は産生され、ウイルス感染細胞培養物から精製することができる。ワクチンのためには、結果として生じるウイルスないしウイルス様粒子は病原性を欠失させる必要がある。病原性のウイルスないしウイルス様粒子は、ＵＶ照射、ホルムアルデヒド処理等の物理的又は化学的な不活性化によって生成してもよい。あるいは、ウイルスが複製できなくなるように、ウイルスのゲノムを変異ないしは欠損によって遺伝的に操作してもよい。
好適な一実施態様では、ＶＬＰは組み換えＶＬＰである。ほとんどすべての一般的に公知のウイルスは配列決定されており、容易に入手可能である。コートタンパク質をコードする遺伝子は当業者に容易に同定されうる。宿主内でコートタンパク質を組み換え発現させることによるＶＬＰの調整は、当業者の共通の知識内である。
【００２９】
好適な一実施態様では、ウイルス様粒子は、a) ＲＮＡファージ；b) バクテリオファージ；c) Ｂ型肝炎ウイルス、好ましくはそのキャプシドタンパク質(Ulrich, 等, Virus Res. 50: 141-182 (1998))又はその表面タンパク質(国際公開公報92/11291)；d) はしかウイルス(Warnes, 等, Gene 160:173-178 (1995))；e) シンドビスウイルス；f) ロタウイルス(米国特許第5,071,651号及び米国特許第5,374,426号)；g) 口蹄疫ウイルス(Twomey, 等, Vaccine 13:1603 1610, (1995))；h) ノーウォークウイルス(Jiang, X., 等, Science 250:1580 1583 (1990)；Matsui, S.M., 等, J. Clin. Invest. 87:1456 1461 (1991))；i) アルファウイルス属；j) レトロウイルス、好ましくはそのＧＡＧタンパク質(国際公開公報96/30523)；k) レトロトランスポゾンＴｙ、好ましくはタンパク質ｐ１；l) ヒトパピローマウイルス(国際公開公報98/15631)；m) ポリオーマウイルス；n) タバコモザイク病ウイルス；及びo) Ｆｌｏｃｋハウスウイルスからなる群から選択されるウイルスの組み換えタンパク質、その変異体ないしはその断片を含むか、あるいはこれからなる。
好適な一実施態様では、ＶＬＰは、その組み換えタンパク質、その変異体ないしはその断片の一以上のアミノ酸配列、好ましくは２つのアミノ酸配列を含むか、これらからなる。一以上のアミノ酸配列を含むかそれらからなるＶＬＰを、本出願ではモザイクＶＬＰと称する。
【００３０】
ここで使用される「組み換えタンパク質の断片」なる用語又は「コートタンパク質の断片」なる用語は、野生型組み換えタンパク質又はコートタンパク質それぞれの長さの少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％であり、好ましくはＶＬＰを形成する能力を保持するポリペプチドとして定義される。好ましくは、該断片は、少なくとも一の内部欠失、少なくとも一の切断、又はそれらの少なくとも一の組合せから得られる。「組み換えタンパク質の断片」又は「コートタンパク質の断片」なる用語は、上で定義した「組み換えタンパク質の断片」又は「コートタンパク質の断片」のそれぞれと、少なくとも８０％、好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％のアミノ酸配列同一性を有し、好ましくはウイルス様粒子内に集合化することができるポリペプチドをさらに包含する。
本発明で交換可能に使用される「変異体組み換えタンパク質」なる用語又は「組み換えタンパク質の変異体」なる用語、本発明で交換可能に使用される「変異体コートタンパク質」なる用語又は「コートタンパク質の変異体」なる用語は、野生型組み換えタンパク質又はコートタンパク質それぞれに由来するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指し、該アミノ酸配列は野生型配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の同一性であり、好ましくは集合してＶＬＰを形成する能力を保持している。
【００３１】
ＶＬＰ内へのコートタンパク質又は組み換えタンパク質の変異体又は断片の集合化(アセンブリ)は、当業者には理解されるように、大腸菌中でタンパク質を発現させ、場合によっては細胞可溶化物をゲル濾過することによりキャプシドを精製し、免疫拡散アッセイ(オークタロニーテスト)又は電子顕微鏡法(ＥＭ)(Kozlovska, T. M.等, Gene 137：133-37(1993))によりキャプシド形成を分析することにより、試験してもよい。免疫拡散アッセイ及びＥＭは、細胞可溶化物で直接実施してもよい。
好適な一実施態様では、本発明のウイルス様粒子はＢ型肝炎ウイルスである。Ｂ型肝炎ウイルス様粒子の調整は、特に国際公開公報00/32227、同01/85208及び同01/056905に開示されている。これら３つすべての文書は出典明記によって本明細書中に特別に組み込まれる。本発明の実施における使用に好適なＨＢｃＡｇの他の変異体は国際公開公報01/056905の３４−３９頁に開示されている。
【００３２】
本発明の更なる好適な一実施態様では、リジン残基はＨＢｃＡｇポリペプチドに導入され、本発明のＩＬ-１５のＨＢｃＡｇのＶＬＰへの結合を媒介する。好適な実施態様では、本発明の組成物及びＶＬＰは、配列番号２０のアミノ酸１−１４４又は１−１４９、１−１８５を含むか、あるいはこれからなるＨＢｃＡｇを用いて調整される。このアミノ酸は修飾されており、７９番目と８０番目のアミノ酸がGly-Gly-Lys-Gly-Glyのアミノ酸配列を有するペプチドに置き換わっている。この修飾により配列番号２０から配列番号２１に変化する。更なる好適な実施態様では、配列番号２１の４８番目と１１０番目のシステイン残基、又はその対応する断片、好ましくは１−１４４又は１−１４９がセリンに変異される。さらに、本発明は、上記の対応するアミノ酸変異を有するＢ型肝炎コアタンパク質変異を含有する組成物を包含する。さらに、本発明は、配列番号２１に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の同一性であるアミノ酸配列を含むか、あるいはこれからなるＨＢｃＡｇポリペプチドを含有する組成物及びワクチンのそれぞれを包含する。
本発明の他の実施態様では、ウイルス様粒子は、組み換えアルファウイルス、より具体的には組み換えシンドビスウイルスである。アルファウイルスは、ＤＮＡ中間生成物のない感染細胞の細胞質で完全にゲノムＲＮＡを複製する陽性の鎖ＲＮＡウイルスである(Strauss, J.及びStrauss, E., Microbiol. Rev. 58: 491-562 (1994))。アルファウイルスファミリのメンバーである、シンドビス(Schlesinger, S., Trends Biotechnol. 11:18-22 (1993))、セムリキ森林ウイルス(ＳＦＶ) (Liljestrom, P. & Garoff, H., Bio/Technology 9:1356-1361 (1991))及びその他(Davis, N.L. 等, Virology 171:189-204 (1989))は、ワクチン開発の候補として、及び様々な異なるタンパク質のウイルスベースの発現ベクター(Lundstrom, K., Curr. Opin. Biotechnol. 8:578-582 (1997))としての使用についてかなり注目されている。
【００３３】
本発明のある実施態様では、本発明のウイルス様粒子は、ＲＮＡ-ファージの組み換えコートタンパク質、その変異体ないしはその断片を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。好ましくは、ＲＮＡ-ファージは、ａ)バクテリオファージＱβ；ｂ)バクテリオファージＲ１７；ｃ)バクテリオファージｆｒ；ｄ)バクテリオファージＧＡ；ｅ)バクテリオファージＳＰ；ｆ)バクテリオファージＭＳ２；ｇ)バクテリオファージＭ１１；ｈ)バクテリオファージＭＸ１；ｉ)バクテリオファージＮＬ９５；ｋ)バクテリオファージｆ２；ｌ)バクテリオファージＰＰ７、及びｍ)バクテリオファージＡＰ２０５からなる群から選択される。
本発明の好適な一実施態様では、組成物は、ＲＮＡファージのコートタンパク質、その変異体ないしはその断片を含有し、該コートタンパク質は、(a) 配列番号：１(Ｑβ ＣＰを指す)；(b) 配列番号：１と配列番号：２の混合物(Ｑβ Ａ１タンパク質を指す)；(c) 配列番号：３；(d) 配列番号：４；(e) 配列番号：５；(f) 配列番号：６、(g) 配列番号：６と配列番号：７の混合物；(h) 配列番号：８；(i) 配列番号：９；(j) 配列番号：１０；(k) 配列番号：１１；(l) 配列番号：１２；(m) 配列番号：１３；及び(n) 配列番号：１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。一般的に、上記のコートタンパク質はＮ末端のメチオニンの有無にかかわらずＶＬＰ内に集合化することができる。
【００３４】
本発明の好適な一実施態様では、ＶＬＰは、ＲＮＡファージのコートタンパク質、その変異体ないしはその断片の一以上のアミノ酸配列、好ましくは２つのアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなるモザイクＶＬＰである。
とても好適な一実施態様では、ＶＬＰはＲＮＡファージの２つの異なるコートタンパク質を含むか、あるいはそれらからなるものであり、該２つのコートタンパク質は配列番号１と配列番号２、又は配列番号６と配列番号７のアミノ酸配列を有する。
本発明の好適な実施態様では、本発明のウイルス様粒子は、ＲＮＡ-バクテリオファージＱβ、ｆｒ、ＡＰ２０５又はＧＡの組み換えコートタンパク質、その変異体ないしはその断片を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。
好適な一実施態様では、本発明のＶＬＰはＲＮＡファージＱβである。Ｑβのキャプシド又はウイルス様粒子は、直径２５ｎｍで、Ｔ＝３の疑似対称体の、正二十面体ファージ様キャプシド構造を示す。キャプシドは、ジスルフィド架橋により共有結合性の五量体及び六量体で結合して(Golmohammadi, R等, Structure 4：543-5554(1996))、際だって安定したＱβキャプシドとなる、コートタンパク質の１８０のコピーを含む。しかしながら、組換えＱβコートタンパク質から作製されるキャプシド又はＶＬＰは、キャプシド内の他のサブユニットへ、ジスルフィド結合を介して結合していないか、又は不完全に結合するサブユニットを含んでいてもよい。Ｑβのキャプシド又はＶＬＰは、有機溶媒及び変性剤に対し、普通ではない耐性を示す。驚くべきことに、我々は、１Ｍの高さの濃度のグアニジウム、３０％の高さの濃度のアセトニトリル及びＤＭＳＯがキャプシドの安定性に影響しないことを発見した。Ｑβのキャプシド又はＶＬＰの高い安定性は、本発明の哺乳動物及びヒトの免疫化及びワクチン接種における使用に特に有用な性質である。
【００３５】
さらに好適な本発明のＲＮＡファージ、特にＱβ及びｆｒのウイルス様粒子は国際公開公報02/056905に開示されており、この開示内容は出典明記により本明細書中に組み込まれる。特に、国際公開公報02/056905の実施例１８にＱβのＶＬＰ粒子の調整について詳しく記載されている。
他の好適な実施態様では、本発明のＶＬＰは、ＲＮＡファージＡＰ２０５のＶＬＰである。また、アミノ酸５のプロリンがスレオニンに置換しているＡＰ２０５コートタンパク質を含む、ＡＰ２０５ ＶＬＰの集合体コンピテント変異体型を本発明の実施に使用してもよく、本発明の他の好適な実施態様となる。国際公開公報2004/007538の特に実施例１及び実施例２には、ＡＰ２０５コートタンパク質を含有するＶＬＰの入手方法、とりわけその発現と精製について記載されている。国際公開公報2004/007538は出典明記によって本明細書中に組み込まれる。ＡＰ２０５ ＶＬＰは高い免疫原性があり、本発明のＩＬ-１５と結合して、典型的かつ好ましくは、反復様式で配位する本発明のＩＬ-１５を表出するワクチンコンストラクトを生成することができる。表出された本発明のＩＬ-１５に対して高い抗体力価が誘発されることから、結合した本発明のＩＬ-１５が抗体分子との相互作用のためにアクセス可能であり、免疫原性であることが示される。
【００３６】
好適な一実施態様では、本発明のＶＬＰは、ウイルス、好ましくはＲＮＡファージの変異体コートタンパク質を含むかあるいはこれからなるものであり、該変異体コートタンパク質は置換及び／又は欠失によって少なくとも一のリジン残基が除去されて修飾されている。他の好適な実施態様では、本発明のＶＬＰは、ウイルス、好ましくはＲＮＡファージの変異体コートタンパク質を含むかあるいはこれからなるものであり、該変異体コートタンパク質は置換及び／又は挿入によって少なくとも一のリジン残基が付加されて修飾されている。あるとても好適な実施態様では、変異体コートタンパク質はＲＮＡファージＱβであり、少なくとも１、あるいは少なくとも２のリジン残基が置換又は欠失によって除去されている。またとても好適な実施態様では、変異体コートタンパク質はＲＮＡファージＱβのものであり、少なくとも１、あるいは少なくとも２のリジン残基が置換又は挿入によって付加されている。更なる好適な一実施態様では、ＲＮＡファージＱβの変異体コートタンパク質は、配列番号１５−１９の何れか一から選択されるアミノ酸配列を有する。特にワクチンの必要性に合わせて調整するために、少なくとも一のリジン残基の欠失、置換又は付加によって、カップリングの程度、すなわち、ウイルス、好ましくはＲＮＡファージのＶＬＰのサブユニット当たりの本発明のＩＬ-１５の量を変えることができる。
【００３７】
好適な一実施態様では、本発明の組成物及びワクチンは、０．５〜４．０の抗原密度を有する。ここで使用される「抗原密度」なる用語は、サブユニット当たり、好ましくはＶＬＰのコートタンパク質当たり、好ましくはＲＮＡファージのＶＬＰのコートタンパク質当たりに結合する本発明のＩＬ-１５の平均数を意味するものである。よって、この値は、本発明の組成物又はワクチン中での、ＶＬＰ、好ましくはＲＮＡファージのＶＬＰのモノマー又はサブユニット全体の平均として算出される。
本発明の他の好適な実施態様では、ウイルス様粒子は、Ｑβの変異体コートタンパク質、又はその変異体ないしはその断片、及び対応するＡ１タンパク質を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。更なる好適な実施態様では、ウイルス様粒子は、アミノ酸配列 配列番号１５、１６、１７、１８又は１９を有する変異体コートタンパク質及び対応するＡ１タンパク質を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。
【００３８】
また、アミノ酸５のプロリンがスレオニンに、アミノ酸１４のアスパラギンがアスパラギン酸に置換しているＡＰ２０５コートタンパク質を含む、ＡＰ２０５ ＶＬＰの集合体化コンピテント変異体型を本発明の実施に用いてもよく、本発明の他の好適な実施態様となる。ＡＰ２０５Ｐｒｏ-５-ＴｈｒのクローニングとＶＬＰの精製は国際公開公報2004/007538の特に実施例１及び実施例２に開示されており、出典明記によって本明細書中に組み込まれる。
さらにまた、ＲＮＡファージコートタンパク質は、細菌宿主内で発現すると自己集合体化することが示されている(Kastelein, RA. 等, Gene 23:245-254 (1983)、Kozlovskaya, TM. 等, Dokl. Akad. Nauk SSSR 287:452-455 (1986)、Adhin, MR. 等, Virology 170:238-242 (1989)、Priano, C. 等, J. Mol. Biol. 249:283-297 (1995))。特に、ＧＡ (Ni, CZ., 等, Protein Sci. 5: 2485-2493 (1996)、Tars, K 等, J. Mol.Biol. 271:759-773(1997))及び、ｆｒ (Pushko P. 等, Prot. Eng. 6: 883-891 (1993)、Liljas, L 等 J Mol. Biol. 244:279-290, (1994))の生物学的及び生化学的性質は開示されている。いくつかのＲＮＡバクテリオファージの結晶構造が決定されている(Golmohammadi, R. 等, Structure 4:543-554 (1996))。そのような情報を用いて、表面に曝された残基を同定して、ＲＮＡファージコートタンパク質を修飾して、一又は複数の反応性のアミノ酸残基を挿入又は置換によって挿入することができる。ＲＮＡファージ由来のＶＬＰの他の利点は、安価で大量の物質を産生することが可能となる細菌での発現回収率が高いことである。
【００３９】
好適な一実施態様では、本発明の組成物は少なくとも一の抗原を含有するものであり、該少なくとも一の抗原はＩＬ-１５タンパク質、ＩＬ-１５変異タンパク質ないしはＩＬ-１５断片である。好適な一実施態様では、ＩＬ-１５タンパク質、ＩＬ-１５変異タンパク質ないしはＩＬ-１５断片は、(a) ヒト起源；(b) ウシ起源；(c) ヒツジ起源；(d) イヌ起源；(e) ネコ起源；(f) マウス起源；(g) ブタ起源；(h) ニワトリ起源；(i) ウマ起源；及び(g) ラット起源からなる群から選択される起源から選択される。
好適な一実施態様では、少なくとも一の抗原はＩＬ-１５タンパク質である。更なる好適な実施態様では、ＩＬ-１５タンパク質は、(a) 配列番号22；(b) 配列番号23；(c) 配列番号24；(d) 配列番号25；及び(e) 配列番号２２−２５の何れかと少なくとも８０％、又は好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、又は最も好ましくは少なくとも９５％の相同性であるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからそれらからなる。
【００４０】
他の好適な実施態様では、少なくとも一の抗原はＩＬ-１５変異タンパク質である。ＩＬ-１５変異タンパク質は、ＩＬ-１５生物活性を有さないが、ＩＬ-１５に対して特異的な抗体応答を誘導できる。したがって、本発明の抗原としてＩＬ-１５変異タンパク質を使用することによって、本発明のＶＬＰに結合したＩＬ-１５を導入したことによる予想外で望まれない副作用を確実に回避する。米国特許第6013480号では、ＩＬ-１５Ｒα-サブユニットへの結合が可能で、ＩＬ-１５レセプター複合体のβ-又はγ-サブユニットによるシグナルを変換することができない２つの変異タンパク質が開示されている。また、生物学的な活性がなく、α-サブユニットに結合ができない変異タンパク質が開示されている(Bernard J. 等 J Biol Chem. (2004)、279(23): 24313-22)であった。したがって、ある好適な実施態様では、ＩＬ-１５変異タンパク質は、(a) 配列番号２３、この位置４６がＥでない、(b) 配列番号２３、この位置５０がＩでない、(c) 配列番号２３、この位置４６がＥでなく、位置５０がＩでない、(d) 配列番号３１、(e) 配列番号３２、(f) 配列番号３３、及び(g) 配列番号２３に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、又は最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列であり、このとき、配列番号２３の位置４６に一致する位置がＥでない、又は配列番号２３の位置５０に一致する位置がＩでない、又は配列番号２３の位置４６に一致する位置がＥでなくかつ配列番号２３の位置５０に一致する位置がＩでないアミノ酸配列、(h) 配列番号２３、このアミノ酸残基Ａｓｐ８とＧｌｎ１０８の何れか又はその両方が欠失しているか異なる天然に生じるアミノ酸に置換している、(i) 配列番号２３、このアミノ酸残基Ｇｌｎ１０１とＧｌｎ１０８の何れか又はその両方が欠失しているか異なる天然に生じるアミノ酸に置換している、(j) 配列番号４２、(j) 配列番号２３、この位置８がＡｓｐでなく、好ましくはＡｓｐ又はＧｌｕでない、(k) 配列番号２３、このＡｓｐ８とＧｌｎ１０８の何れか又はその両方がセリン又はシステインによって、各々置換される、(l) 配列番号２３、位置８、１０１および１０８の中の少なくとも一つのアミノ酸が欠失しているか好ましくは置換している、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、それからなる。
【００４１】
更なるある好適な実施態様では、ＩＬ-１５変異タンパク質は、位置４６はＧｌｕでなく、Ａｓｐ、Ｇｌｎ又はＡｓｎでない、配列番号２３のアミノ酸配列を含むか、それからなる。なお更なる好適な実施態様では、ＩＬ-１５変異タンパク質は、配列番号３１のアミノ酸配列を含むか、それからなる。
更なるある好適な実施態様では、ＩＬ-１５変異タンパク質は、位置５０がＩｌｅ又はＬｅｕでない、配列番号２３のアミノ酸配列を含むか、それからなる。更なる好適な実施態様では、ＩＬ-１５は、位置５０がＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ又はＶａｌでない、アミノ酸配列を有する。なお更なる好適な実施態様では、ＩＬ-１５変異タンパク質は、配列番号３２のアミノ酸配列を含むか、それからなる。
更なるある好適な実施態様では、ＩＬ-１５変異タンパク質は、位置４６がＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ又はＡｓｎでなく、位置５０がＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ又はＶａｌでない、配列番号２３のアミノ酸配列を含むか、それからなる。なお更なる好適な実施態様では、ＩＬ-１５変異タンパク質は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むか、それからなる。
更なる他の好適な実施態様では、少なくとも一の抗原はＩＬ-１５断片であり、該ＩＬ-１５断片は少なくとも一の抗原性部位を含むか、あるいはそれからなる。
【００４２】
免疫原性の保持には通常タンパク質の完全長を必要としないことと、通常、タンパク質は複数の抗原エピトープ、すなわち抗原性部位を含有することが知られている。断片又は短いペプチドは、免疫特異的に抗体又は、ＭＨＣ分子との関係でＴ細胞レセプターに結合されうる少なくとも一つの抗原性部位を含有するために十分であるかもしれない。抗原性部位又は複数の部位は、当分野の技術者に一般に公知の多くの技術で決定されうる。それは、配列アラインメントや構造予測によって、なされうる。例えば、Rasmolなどのプログラムを用いて、可能性のあるα-ヘリックス、ターン、鎖間及び鎖内ジスルフィド結合などを予測するものがある。さらに、分子の表面に露出する分子又は配列内に埋没される配列を予測するものもある。分子の表面に露出する配列は、おそらく、天然の抗原性部位(一又は複数)を含んでなるため、治療的抗体を誘導する際に有用である。表面ペプチド配列を決定した後、例えば網羅的な突然変異誘発方法によって、この配列の範囲内の抗原性部位を更に決定してもよい(アラニンスキャニング突然変異誘発など、Cunningham BC, Wells JA. Science 1989 Jun 2、 244(4908): 1081-5)。一時的にこの配列内のアミノ酸を順次アラニンに変異し、アラニン突然変異が抗体に対する結合の低減(野生型配列に対して上昇)を示すアミノ酸又は全く結合を失うアミノ酸がおそらく抗原性部位の成分である。
【００４３】
抗原性部位(一又は複数)を決定する他の方法は、ＩＬ-１５ (Geysen, PNAS Vol 81: 3998-4002, (1984) and Slootstra, J. W. 等, (1996) Mol. Divers. 1, 87-96)の完全長配列を包含するオーバーラッピングペプチドを生成することである。通常、最初のスクリーニングとして、５〜１０のアミノ酸オーバーラップを有する２０〜３０のアミノ酸長のペプチドを化学的に合成してもよい。マウスを各々別々のペプチドで免疫化して、それらのマウスからポリクローナル血清を採取する。ポリクローナル血清が天然のＩＬ-１５タンパク質を認識するかどうかを、様々な方法、例えばＥＬＩＳＡ又は免疫沈降法を用いて試験できる。ＩＬ-１５タンパク質を認識する対応血清のペプチドが最も天然の抗原性部位を含有するもののようである。
抗原として単独で使われるか又は担体に結合されるペプチドは、完全長タンパク質の関係において、ある場合の立体構造と異なる立体構造に変わりうる。したがって、ＩＬ-１５で免疫化したマウスから得たポリクローナル血清へのペプチドの結合はクロスチェックするべきである。
【００４４】
あるいは、齧歯動物を完全長ＩＬ-１５タンパク質にて免疫化する。各々異なる部分的にオーバーラップしたペプチドとの結果として生じたポリクローナル血清の交差反応性を、多くの方法、例えばＥＬＩＳＡ、免疫沈降法又は質量分析によって、試験する。(Parker及びTomer, Mol. Biotechnol. 2002, 20, 49-62)。これらのペプチドは合成するか又は組換え体由来のものでありうる。
上述した手順を簡略化して、容易にする技術は有用である。例えば、ペプチドは、ランダムに生成され、ファージの表面にディスプレイすることができる。(Nilsson, Methods Enzymol. 2000、326:480-505、Winter Annu Rev Immunol. 1994、12:433-55、peptide phage display, Smith, Methods Enzymol. 1993、217:228-57)。必要とされる部分的にオーバーラップするペプチドの量は、ＳＰＯＴ技術を用いて有意に減らすことができる(Jerini S technology、 Sigma-Genosys)。
本発明の更なる好適な実施態様では、ＩＬ-１５断片は、本明細書で定義されるＩＬ-１５タンパク質ないしＩＬ-１５変異タンパク質の少なくとも５〜１２の隣接するアミノを含むか、あるいは好ましくはそれらからなる。
【００４５】
ある好適な実施態様では、ＩＬ-１５断片は、６０未満、好ましくは５０未満、好ましくは４０未満、さらにより好ましくは３０未満、さらにより好ましくは２０未満のアミノ酸長からなる。
更なる好適な実施態様では、ＩＬ-１５断片は、配列番号２３のアミノ酸４４−５２、好ましくはアミノ酸４４−５４、好ましくはアミノ酸４３−５５を含んでなる。更なるある好適な実施態様では、ＩＬ-１５断片は、配列番号２３の位置４６がＧｌｕでない、好ましくはＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ又はＡｓｎでない、アミノ酸配列を有する。あるいはなお更なる好適な実施態様では、ＩＬ-１５断片は、配列番号２３の位置５０がＩｌｅでない、好ましくはＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ又はＶａｌでないアミノ酸配列を有する。
更なる好適な実施態様では、ＩＬ-１５断片は、配列番号２３のアミノ酸６４−６８、好ましくは６２−７０、好ましくは６１−７３を含んでなる。
【００４６】
好ましい実施態様では、ＩＬ-１５断片は、(a) 配列番号３４、(b) 配列番号３５、(c) 配列番号３６、(d) 配列番号３７、(e) 配列番号３８、(f) 配列番号３９、(g) 配列番号４０、及び(h) 配列番号３４−４０の何れかに少なくとも６５％、好ましくは少なくとも８０％、又は好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、又は最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるか、それからなる。
本発明は、(a) 少なくとも一の第一付着部位を有するＶＬＰを供給する、(b) 少なくとも一の第二付着部位を有するＩＬ-１５タンパク質、ＩＬ-１５変異タンパク質ないしはＩＬ-１５断片である、少なくとも一の抗原を供給する、そして(c) 該ＶＬＰと該少なくとも一の抗原を組み合わせて、該第一付着部位と該第二付着部位を介して少なくとも一の抗原と該ＶＬＰが結合している、組成物を産生する、ことを含む本発明の組成物の産生方法を提供する。好適な実施態様では、少なくとも一の第二付着部位を有する少なくとも一の抗原、すなわちＩＬ-１５タンパク質、ＩＬ-１５変異タンパク質ないしＩＬ-１５断片の供給は、発現による、好ましくは細菌系、好ましくは大腸菌内での発現によるものである。通常、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグなどのタグは精製工程を容易にするために加えられる。他の方法では、特に５０以下のアミノ酸を有するＩＬ-１５断片は化学的に合成できる。
【００４７】
本発明の好適な一実施態様では、少なくとも一の第一付着部位を有するＶＬＰは、少なくとも一のペプチド結合を介して少なくとも一の第二付着部位を有する本発明のＩＬ-１５に結合する。本発明のＩＬ-１５、好ましくはＩＬ-１５断片、より好ましくは５０アミノ酸以下、さらにより好ましくは３０アミノ酸よりも少ない断片をコードする遺伝子が、ＶＬＰのコートタンパク質をコードする遺伝子の内部に又は好ましくはＮないしＣ末端の何れかにインフレーム結合する。また、融合は、一部が欠損しているコートタンパク質の変異体内へＩＬ-１５断片の配列を挿入することに影響を受けうる、これはさらに切断変異体と称される。切断変異体は、コートタンパク質の配列のＮ末端ないしＣ末端、又はその一部の内部が欠損していてもよい。例えば特定のＶＬＰ ＨＢｃＡｇについて、アミノ酸７９−８０外来のエピトープに置換される。好ましくは、融合タンパク質は発現の際にＶＬＰ内に集合体化する能力を保持しており、その集合体化は電子顕微鏡で調べることができる。
隣接するアミノ酸残基を付加して、コートタンパク質と外来性のエピトープの間の間隙を増やしてもよい。隣接配列に用いるためにはグリシン残基及びセリン残基が特に好ましい。このような隣接配列によってフレキシビリティが付加される。このフレキシビリティの付加により、ＶＬＰサブユニットの配列内へ外来性の配列を融合する際に生じうる不安定性作用が軽減され、外来性のエピトープの存在による集合体化の阻害が軽減される。
【００４８】
他の実施態様では、本発明の少なくとも一のＩＬ-１５、好ましくは５０未満のアミノ酸からなるＩＬ-１５断片は、多くの他のウイルスコートタンパク質、例えばＱβのＡ１タンパク質の切断型のＣ末端に融合するか (Kozlovska, T. M., 等, Intervirology 39:9-15 (1996))又は、ＣＰ伸展の位置７２と７３の間に挿入されてもよい。その他の例として、ＩＬ-１５断片がｆｒ ＣＰのアミノ酸２と３の間に挿入され、ＩＬ-１５-ｆｒ ＣＰ融合タンパク質となってもよい(Pushko P. 等, Prot. Eng. 6: 883-891 (1993))。さらに、ＩＬ-１５断片は、ＲＮＡファージＭＳ-２のコートタンパク質のＮ末端突出β-ヘアピンに融合してもよい(国際公開公報92/13081)。あるいは、ＩＬ-１５断片は、パピローマウイルスのキャプシドタンパク質、好ましくはウシパピローマウイルス１型(ＢＰＶ-１)の主要キャプシドタンパク質Ｌ１に融合しうる (Chackerian, B. 等, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 96:2373-2378 (1999)、国際公開公報00/23955)。また、ＩＬ-１５断片へのＢＰＶ-１ Ｌ１のアミノ酸１３０−１３６の置換も、本発明の実施態様である。さらに、ウイルスのコートタンパク質へのコートタンパク質、その変異体ないしはその断片に本発明の抗原を融合させる実施態様は、国際公開公報2004/009124の６２頁の第２０行目から６８頁の第１７行目に開示されており、出典明記によって、本明細書中に組み込まれる。
【００４９】
他の好適な実施態様では、本発明のＩＬ-１５、好ましくはＩＬ-１５断片、さらにより好ましくはアミノ酸配列 配列番号３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０を有するＩＬ-１５断片を、ＲＮＡファージＡＰ２０５のコートタンパク質、その変異体ないしはその断片のＮ末端又はＣ末端に融合する。更なる好適な一実施態様では、融合タンパク質は、スペーサーをさらに含有するものであり、該スペーサーはＡＰ２０５のコートタンパク質、その断片ないしはその変異体と本発明のＩＬ-１５の間に位置する。
本発明の好適な一実施態様では、組成物は、少なくとも一の共有結合を介して少なくとも一の第二付着部位を有する少なくとも一の本発明のＩＬ-１５に結合した少なくとも一の第一付着部位を有するウイルス様粒子を含有するか、あるいは本質的にこれらからなるものであり、該共有結合は非ペプチド結合である。本発明の好適な実施態様では、第一付着部位は、アミノ基、好ましくはリジン残基のアミノ基を含むか、好ましくはそのものである。本発明の他の好適な実施態様では、第二付着部位は、スルフヒドリル基、好ましくはシステインのスルフヒドリル基を含むか、好ましくはそのものである。
【００５０】
本発明のとても好ましい実施態様では、少なくとも一の第一付着部位は、アミノ基、好ましくはリジン残基のアミノ基を含むか、好ましくはそのものであり、少なくとも一の第二付着部位は、スルフヒドリル基、好ましくはシステインのスルフヒドリル基を含むか、好ましくはそのものである。
本発明の好ましい一実施態様では、本発明のＩＬ-１５は、典型的にかつ好ましくはヘテロ二官能性架橋剤を使用して、化学的架橋によりＶＬＰに結合している。好ましい実施態様では、ヘテロ二官能性架橋剤は、好ましくはアミノ基、より好ましくはＶＬＰのリジン残基(一又は複数)のアミノ基を有する好ましい第一付着部位と反応可能な官能基と、好ましい第二付着部位、すなわち本発明のＩＬ-１５に元もとある、ないしは人工的に付加され、場合によっては還元による反応に利用される、好ましくはシステイン(一又は複数)残基のスルフヒドリル基と反応可能なさらなる官能基を含む。いくつかのヘテロ二官能性架橋剤が当該分野で知られている。これらには、好ましい架橋剤であるＳＭＰＨ(Pierce)、スルホ-ＭＢＳ、スルホ-ＥＭＣＳ、スルホ-ＧＭＢＳ、スルホ-ＳＩＡＢ、スルホ-ＳＭＰＢ、スルホ-ＳＭＣＣ、ＳＶＳＢ、ＳＩＡ、及び例えばPierce Chemical Companyから入手可能な他の架橋剤が含まれ、アミノ基に対して反応可能な一官能基とスルフヒドリル基に対して反応可能な一官能基を有する。上述した全ての架橋剤により、アミノ基との反応後にアミド結合が、またスルフヒドリル基とチオエーテル結合が形成される。本発明の実施に適した他のクラスの架橋剤は、カップリング時に本発明のＩＬ-１５とＶＬＰとの間にジスルフィド結合を導入することにより特徴付けられる。このクラスに属する好ましい架橋剤には、例えばＳＰＤＰ及びスルホ-ＬＣ-ＳＰＤＰ(Pierce)が含まれる。
【００５１】
好ましい実施態様では、本発明の組成物はリンカーをさらに含有している。本発明のＩＬ-１５における第二の付着部位の操作は、この発明の開示に従い、好ましくは第二の付着部位として適切な少なくとも一のアミノ酸を含むリンカーとの結合により達成される。よって、本発明の好ましい実施態様では、リンカーは少なくとも一の共有結合、好ましくは典型的には少なくとも一のペプチド結合により、本発明のＩＬ-１５に結合している。好ましくは、リンカーは、第二の付着部位を含む又はそれからなる。さらに好ましい実施態様では、リンカーは好ましくはシステイン残基のスルフヒドリル基を含む。他の好ましい実施態様では、リンカーはシステイン残基である。
【００５２】
リンカーの選択は、本発明のＩＬ-１５の性質、その生化学的特性、例えばｐＩ、電荷分布、及びグリコシル化に依存するであろう。一般的に、フレキシブルなアミノ酸リンカーが好まれる。本発明のさらに好ましい実施態様では、リンカーはアミノ酸からなり、さらに好ましくは、リンカーは最大で２５、好ましくは最大で２０、より好ましくは最大で１５のアミノ酸からなる。本発明のさらに好適な実施態様では、アミノ酸リンカーは１０未満のアミノ酸を含有する。リンカーの好ましい実施態様は：(a) CGG又はCG/GC；(b)Ｎ-末端ガンマ１-リンカー(例えばCGDKTHTSPP、配列番号44)；(c)Ｎ-末端ガンマ３-リンカー(例えばCGGPKPSTPPGSSGGAP、配列番号55)；(d)Ｉｇヒンジ領域；(e)Ｎ-末端グリシンリンカー(例えばGCGGGG、配列番号45)；(f)n=0-12、k=0-5である(G)kC(G)n；(g)Ｎ-末端グリシン-セリンリンカー(さらに一つのシステインを有するｎ＝1-3の(GGGGS)n(例えば配列番号46、n=1の実施態様に相当))；(h)n=0-3、k=0-5、m=0-10、l=0-2である(G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n(例えば配列番号47、n=1、k=1、l=1及びm=1の実施態様に相当)；(i)GGC；(k)GGC-NH2；(l)Ｃ-末端ガンマ１-リンカー(例えばDKTHTSPPCG、配列番号48)；(m)Ｃ-末端ガンマ３-リンカー(例えばPKPSTPPGSSGGAPGGCG、配列番号49)；(n)Ｃ-末端グリシンリンカー(GGGGCG、配列番号50)；(o)n=0-12及びk=0-5である(G)nC(G)k；(p)Ｃ-末端グリシン-セリンリンカー(さらに一つのシステインを有するn=1-3の(SGGGG)n(例えば配列番号51、n=1の実施態様に相当))；(q)n=0-3、k=0-5、m=0-10、l=0-2及びo=0-8である(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k(例えば配列番号52、n=1、k=1、l=1、o=1及びm=1の実施態様に相当)からなる群から選択される。さらに好ましい実施態様では、リンカーは本発明のＩＬ-１５のＮ-末端に融合している。本発明の他の好ましい実施態様では、リンカーは本発明のＩＬ-１５のＣ-末端に融合している。
【００５３】
この発明に係る好ましいリンカーは、第２付着部位としてシステイン残基をさらに含むグリシンリンカー(Ｇ)ｎ、例えばＮ-末端グリシンリンカー(ＧＣＧＧＧＧ)及びＣ-末端グリシンリンカー(ＧＧＧＧＣＧ)である。さらに好ましい実施態様は、Ｃ-末端グリシン-リジンリンカー(ＧＧＫＫＧＣ、配列番号53)及びＮ-末端グリシン-リジンリンカー(ＣＧＫＫＧＧ、配列番号54)、ペプチドのＣ-末端のＧＧＣＧ、ＧＧＣ又はＧＧＣ-ＮＨ２(「ＮＨ２」はアミド化を表す)リンカー、又はそのＮ-末端のＣＧＧのリンカーである。一般的に、グリシン残基は、第２付着部位として使用されるシステインと大きなアミノ酸との間に挿入されて、カップリング反応中での、より大きなアミノ酸の潜在的な立体障害が回避される。
【００５４】
上記の好適な方法によるヘテロ二官能性架橋剤を用いることによるＶＬＰへの本発明のＩＬ-１５の結合により、正方向の様式でＶＬＰに本発明のＩＬ-１５をカップリングさせることができる。ＶＬＰに本発明のＩＬ-１５を連結させるための他の方法には、カルボジイミドＥＤＣ、及びＮＨＳを使用し、本発明のＩＬ-１５をＶＬＰに架橋させる方法が含まれる。本発明のＩＬ-１５は、例えばＳＡＴＡ、ＳＡＴＰ又はイミノチオランを用いた反応を介して、まずチオラート化されてもよい。次いで、必要であれば脱保護化した後に本発明のＩＬ-１５を以下のようにＶＬＰにカップリングしてもよい。過剰なチオラート化剤を分離した後、本発明のＩＬ-１５を、システイン反応基を含有し、システイン残基に対して反応可能な少なくとも一又はいくつかの官能基を表出するヘテロ二官能性架橋剤にて予め活性化させた、ＶＬＰと反応させる。このとき本発明のチオラート化ＩＬ-１５は上記に記載のように反応することができる。場合によっては、少量の還元剤が反応混合物中に含まれる。さらなる方法では、ホモ二官能性架橋剤、例えばグルタルアルデヒド、ＤＳＧ、ＢＭ[ＰＥＯ]４、ＢＳ３、(Pierce)、又はＶＬＰのアミノ基又はカルボキシル基に対して反応する官能基を有する他の既知のホモ二官能性架橋剤を使用して、本発明のＩＬ-１５をＶＬＰに結合させる。
【００５５】
本発明の他の実施態様では、組成物は、化学的な相互作用を介して本発明のＩＬ-１５に結合したウイルス様粒子を含むか、ないしは本質的にそれからなるものであり、この相互作用の少なくとも一は共有結合ではない。例えば、ＶＬＰをビオチン化してストレプトアビジン-融合タンパク質として本発明のＩＬ-１５を発現することによって本発明のＩＬ-１５へのＶＬＰの結合が起こる。また、他の結合対、例えばリガンド-レセプター、抗原-抗体も、ビオチン-アビジンと同様の形で、カップリング試薬として使用することができる。
米国特許第5698424号には、キャプシドを形成可能なバクテリオファージＭＳ-２の修飾コートタンパク質が記載されており、ここでコートタンパク質はＮ-末端ヘアピン領域にシステイン残基を挿入し、非システインアミノ酸残基により、Ｎ-末端ヘアピン領域の外側に位置する各システイン残基を置換することにより修飾される。ついで、挿入されたシステイン残基は、所望される分子種に直接結合し、エピトープ又は抗原性タンパク質等として提示される。
【００５６】
しかしながら、キャプシドに露出した遊離のシステイン残基が存在すると、ジスルフィド架橋の形成により、キャプシドのオリゴマー化に至りうることを我々は記す。さらに、ジスルフィド結合によるキャプシドと抗原性タンパク質との結合は、特にスルフヒドリル-部分含有分子に対して不安定であり、さらに、チオエーテル付着よりも血清中で安定性が低下する(Martin FJ. 及び Papahadjopoulos D.(1982) Irreversible Coupling of Immunoglobulin Fragments to Preformed Vesicles. J. Biol. Chem. 257：286-288)。
よって、さらに非常に好ましい実施態様では、ＶＬＰと少なくとも一の抗原との結合は、ジスルフィド結合を含まない。さらに好ましくは、少なくとも一の第二の付着は、スルフヒドリル基を含むか、又は該基である。さらにまた本発明の非常に好ましい実施態様では、ＶＬＰと少なくとも一の抗原との結合は、硫黄-硫黄結合を含まない。さらに非常に好ましい実施態様では、前記少なくとも一の第一の付着部位は、システインのスルフヒドリル基でないか、又は該基を含まない。またさらに非常に好ましい実施態様では、前記少なくとも一の第一の付着部位は、スルフヒドリル基ではないか、又は該基を含まない。
【００５７】
本発明の好適な一実施態様では、ＶＬＰは宿主内で組み換えて産生されるものであり、該ＶＬＰは宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸を本質的に含まないか、該ＶＬＰは宿主ＤＮＡ、好ましくは宿主核酸を本質的に含まない。好適な一実施態様では、ＲＮＡファージのＶＬＰは宿主内で組み換えて産生されるものであり、該ＲＮＡファージのＶＬＰは宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸を本質的に含まない。
更なる好適な一実施態様では、組成物は、ＶＬＰに結合した、好ましくはＶＬＰ内にパッケージ化ないしは封入された少なくとも一のポリ陰イオン性高分子を含有する。更なる好適な実施態様では、ポリ陰イオン性高分子はポリグルタミン酸及び／又はポリアスパラギン酸である。好適な一実施態様では、ＶＬＰはＲＮＡファージのものである。宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸の量を少なくするないしは排除することにより、ＩＬ-１５に特異的な強力な抗体応答を維持しながら、望ましくないＴ細胞応答、例えば炎症性Ｔ細胞応答や障害性Ｔ細胞応答、及び他の望ましくない発熱などの副作用が最小限化ないしは低減される。
【００５８】
本質的に宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主の核酸を欠く：本明細書中で用いられる「本質的に宿主ＲＮＡ(又はＤＮＡ)、好ましくは宿主の核酸を欠く」なる用語は、ＶＬＰに含有される宿主ＲＮＡ(又はＤＮＡ)、好ましくは宿主の核酸の量を意味し、その量は典型的に好ましくは、ＶＬＰｍｇ当たり３０μｇより少ない、好ましくは２０μｇより少ない、より好ましくは１０μｇより少ない、さらにより好ましくは８μｇより少ない、さらにより好ましくは６μｇより少ない、さらにより好ましくは４μｇより少ない、最も好ましくは２μｇより少ない。上記の範囲内で用いられる宿主は、ＶＬＰが組み換えて産生される宿主を意味する。ＲＮＡ(又はＤＮＡ)、好ましくは核酸の量を測定する従来の方法は当業者に周知である。本発明によって、ＲＮＡ、好ましくは核酸の量を測定する典型的で好適な方法は、同じ指定代理人により2005年10月5日に出願したPCT/EP2005/055009の実施例１７に記載される。典型的に好ましくは、Ｑβ以外のＶＬＰを含んでなる本発明の組成物についてＲＮＡ(又はＤＮＡ)、好ましくは核酸の量を測定するためには、同一、同種又は類似の条件を用いる。最終的に必要とされる条件の変更は当業者の知識の範囲内である。
【００５９】
本明細書中で用いる「ポリ陰イオン性高分子」なる用語は、陰性荷電の反復基を含有する相対的に高分子量の分子を指し、その構造は、実際ないしは概念的には、相対的に低分子量の分子に由来するユニットの複合的な反復物を本質的に含有する。
一態様では、本発明は、本発明の組成物を含有するワクチンを提供する。好適な一実施態様では、ワクチン組成物内のＶＬＰに結合した本発明のＩＬ-１５は、動物、好ましくは哺乳動物ないしはヒト起源のものでよい。好適な実施態様では、本発明のＩＬ-１５はヒト、ウシ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ブタ又はウマ起源である。
好適な一実施態様では、ワクチン組成物はさらに少なくとも一のアジュバントを含有する。少なくとも一のアジュバントの投与は、本発明の組成物の投与の前、あるいはそれと同時、あるいはその後であってもよい。本明細書中で用いられる「アジュバント」なる用語は、本発明のワクチン及び薬剤組成物のそれぞれと組み合わせると、より亢進した免疫応答を供給しうる、宿主内の貯蔵所となる物質ないしは免疫応答の非特異的刺激因子を意味する。
【００６０】
他の好ましい実施態様では、本発明のワクチン組成物はアジュバントを欠く。本発明の有利な特性は、アジュバントを含まない場合でさえ、組成物の免疫原性が高いことである。さらにアジュバントを含んでいないので、自己抗原に対するワクチン接種上の安全上の問題を呈する所望されない炎症性Ｔ細胞反応の発生が最小となる。よって、本発明のワクチンの患者への投与は、好ましくはワクチンの投与前、投与と同時、又は投与後に同じ患者に少なくとも一のアジュバントを投与することなく、なされるであろう。
さらに、本発明は、本発明のワクチンが動物又はヒトに投与されることを含む免疫化方法を開示する。動物は、好ましくはネコ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、イヌ、ラット、マウスなどの哺乳動物、特にヒトである。ワクチンは、当分野で公知の様々な方法によって動物又はヒトに投与されてもよいが、通常、注射、注入、吸入、経口投与又は他の適切な理学的方法によって投与されうる。コンジュゲートは、選択的に、筋肉内、静脈内、粘膜経由、経皮、鼻腔内、腹膜内又は皮下投与されてもよい。投与のためのコンジュゲート成分は、滅菌水(例えば、生理食塩液)又は非水溶液及び懸濁液などである。非水溶性溶媒の例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルなどがある。担体又は密封包帯を、皮膚透過性を増やして、抗原吸収を上げるために用いてもよい。
【００６１】
投与される個体に投与が合っていれば、本発明のワクチンは「製薬的に受容可能」であるといえる。さらに、本発明のワクチンは、「治療的に有効な量」(すなわち、所望の生理学的効果を示す量)で投与されうる。免疫応答の性質又は種類は本発明で開示される因子に限定するものではない。以下のメカニズムの説明によって本発明が限定されるものではなく、本発明のワクチンは、ＩＬ-１５に結合する抗体であり、その濃度を抑え、及び／又は生理学的又は病理学的な働きを阻害する抗体を誘導しうる。
他の態様では、本発明は、本発明で述べられる組成物と受容可能な製薬的担体を含有する薬剤組成物を提供する。本発明のワクチンが個体に投与される場合、コンジュゲートの有効性を改善するために望ましい他の物質、アジュバント、バッファー又は塩類を含有する形態でありうる。薬剤組成物の調整における使用に好適な材料の例は、REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Osol, A, ed., Mack Publishing Co., (1990))を含む多くの情報源に示される。
【００６２】
本発明は、本発明の組成物の産生方法であって、(a) 少なくとも一の第一付着部位を有するＶＬＰを供給し；(b) 少なくとも一の第二付着部位を有する本発明のＩＬ-１５を供給し；そして(c) 該ＶＬＰと本発明の該ＩＬ-１５を組み合わせて、該第一付着部位と該第二付着部位を介して本発明の該ＩＬ-１５と該ＶＬＰが結合している、組成物を産生する工程を含む産生方法を教示する。
更なる好適な実施態様では、少なくとも一の第一付着部位を有するＶＬＰを提供する工程は、(a) 該ウイルス様粒子を該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、その変異体ないしはその断片に分解して；(b) 該コートタンパク質、その変異体ないしはその断片を精製して；(c) 該精製された該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、その変異体ないしはその断片をウイルス様粒子に再集合体化させる工程をさらに含むものであり、このときの該ウイルス様粒子は宿主ＲＮＡ、好ましくは宿主核酸を本質的に欠いているものである。より更なる好適な実施態様では、前記の精製したコートタンパク質の再集合体化は、少なくとも一のポリ陰イオン性高分子の存在下にてなされる。
【００６３】
本発明は、ＩＬ-１５が動物又はヒトの重要な病理学的機能を発現する疾患ないし症状の治療及び／又は寛解の方法であって、該疾患ないし症状を患っている動物ないしヒトに本発明の創意に富んだ組成物が投与されることを含む方法を提供する。好適な実施態様では、ＩＬ-１５が動物又はヒトの重要な病理学的機能を発現する前記の疾患ないし症状は、アテローム性動脈硬化、喘息、移植拒絶反応及び炎症性及び／又は慢性自己免疫性の疾患、例えば限定するものではないが、関節リウマチ、乾癬性関節炎、若年性突発性関節炎、乾癬からなる群から選択されるものである。あるいは、本発明は、動物、ないし好ましくはヒトのアテローム性動脈硬化、喘息、移植拒絶反応及び炎症性及び／又は慢性自己免疫性の疾患からなる群から選択される疾患の治療のための医薬の製造のための本発明の組成物の使用を提供する。
ある態様では、本発明は、少なくとも一のＩＬ-１５アンタゴニストが動物ないしヒトに投与されることを含む、動物ないしヒトの疾患の治療方法であって、該疾患がアテローム性動脈硬化及び喘息からなる群から選択されるものである、治療方法を提供する。あるいは、本発明は、アテローム性動脈硬化及び喘息からなる群から選択される疾患の治療のための医薬の製造のための、少なくとも一のＩＬ-１５アンタゴニストの使用を提供する。
【００６４】
「ＩＬ-１５アンタゴニスト」は、様々な手段によって、例えば限定するものではないが、(i) 血中のＩＬ-１５濃度を減少する、(ii) Ｉｌ-１５のＩＬ-１５レセプター複合体への結合を阻害する、好ましくはＩＬ-１５のＩＬ-１５レセプター複合体のαサブユニットへの結合を阻害する、又は(iii) ＩＬ-１５のＩＬ-１５レセプター複合体のγサブユニット又はβサブユニットの何れかを介する細胞へのシグナル伝達を阻害する、これによってＩＬ-１５の生物学的な活性をアンタゴナイズすることによって、ＩＬ-１５の機能を阻害する。典型的及び好ましくは、ＩＬ-１５レセプター複合体、好ましくはαサブユニットへのＩＬ-１５の結合は、例えばJ. Biol Chem. 2004 Jun 4;279(23): 24313-22に記載のようなインビトロ結合アッセイによって確認することができる。典型的及び好ましくは、ＩＬ-１５の機能、典型的及び好ましくはＴ細胞増殖の刺激のためのその機能は、例えば欧州特許0772624の実施例２に記載のようなインビトロアッセイで確認することができる。
好適な実施態様では、ＩＬ-１５アンタゴニストは、ＩＬ-１５に特異的に結合する抗体である。ＩＬ-１５への抗体の結合により、形成された抗原-抗体複合体がクリアランスされ、これにより血中のＩＬ-１５濃度が減少しうる。さらに、ＩＬ-１５への抗体の結合は、ＩＬ-１５のそのレセプターへの結合を阻害することで、ＩＬ-１５がそのレセプターを介したその活性を発現するのを防ぎうる。加えて、ＩＬ-１５への抗体の結合はＩＬ-１５のそのレセプターへの結合を防がない場合でも、抗体の存在によりＩＬ-１５レセプター複合体のγ又はβサブユニットに媒介されるシグナル伝達を阻害しうる。
【００６５】
ＩＬ-１５抗体は、ポリクローナルでもモノクローナルでもよく、異なる動物種、例えばマウス、ラット、ウサギ又はヒトの免疫化によって生成することができる。モノクローナル抗体は、使用する技術に従って、マウス、キメラ、ＣＤＲ-移植、ヒト化、ヒト又は合成された抗体でもよい。したがって、「モノクローナル抗体」なる用語は、均質な抗体集団を有する抗体組成物を意味する。作成される方法又は抗体の供給源によって限定されるものではない。ある好適な実施態様では、前記のＩＬ-１５アンタゴニストは、前記抗体の機能的な断片を含むか、そのものである。ＩＬ-１５に特異的に結合するモノクローナル抗体は当分野で有用である。
好適な実施態様では、前記のＩＬ-１５アンタゴニストは、１０７Ｍ−１以上、好ましくは１０８Ｍ−１以上、より好ましくは１０９Ｍ−１以上の結合親和性(Ｋａ)を有するモノクローナル抗体である。
【００６６】
ある好適な実施態様では、前記ＩＬ-１５アンタゴニストは、典型的に好ましくは、国際公開公報03/017935の実施例８に記載のように実施される増殖阻害アッセイによって測定して、１００ｎＭ未満、好ましくは１０ｎＭ未満のＩＣ５０値でＩＬ-１５誘導性Ｔ細胞増殖を阻害するモノクローナル抗体である。
好適な実施態様では、前記ＩＬ-１５アンタゴニストは、J Clin Invest 2003, 112, 1571, Arthritis & Rheumatism. 2005, 52, 2686及び国際公開公報03/017935に記載のように、モノクローナル抗体ＨｕＭａｘ-ＩＬ-１５(１４６Ｂ７、ＡＭＧ７１４とも称される)ないしその断片である。
好適な実施態様では、前記ＩＬ-１５アンタゴニストは、(i) ＡＴＣＣ受入れ番号Ｍ１１０；(ii) ＡＴＣＣ受入れ番号Ｍ１１１；(iii) ＡＴＣＣ受入れ番号Ｍ１１２((i)−(iii)は国際公開公報9626274を参照してもよい)；(iv) １４６Ｈ５、((iv)は国際公開公報03/017935を参照してもよい)、からなる群から選択されるハイブリドーマから得たモノクローナル抗体である。
【００６７】
ある好適な実施態様では、前期ＩＬ-１５アンタゴニストはＩＬ-１５に特異的に結合する抗体であり、該抗体が本発明の創意に富んだ組成物に反応して産生されたものである。好ましくは、前記抗体は、好ましくは本発明の創意に富んだ免疫化方法に従って、本発明のワクチンないしは本発明の組成物を摂取した動物ないしヒトの体内で産生される。ある好適な実施態様では、抗体は、本発明の創意に富んだ組成物でマウスを免疫化することによって産生されるモノクローナル抗体である。好ましくは、そのように産生される抗体は、現在のところ有用な技術を用いたヒトの使用を最適化するためにさらに修飾又は操作されるであろう。
ある好適な実施態様では、前記のＩＬ-１５アンタゴニストは、ＩＬ-１５可溶性レセプター又はその断片を含むか、そのものである。ある好適な実施態様では、前記ＩＬ-１５アンタゴニストは、ＩＬ-１５可溶性レセプターαサブユニット又はその断片を含むか、そのものである。ある好適な実施態様では、前記ＩＬ-１５アンタゴニストは、ＩＬ-１５レセプターαサブユニットの細胞外ドメイン又はその断片を含むか、そのものである。更なるある好適な実施態様では、前記ＩＬ-１５アンタゴニストは、配列番号４１のアミノ酸配列、又は配列番号４１に少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、より好ましくは９７％の相同性を有するアミノ酸配列を含むか、それからなる。
【００６８】
ある好適な実施態様では、前記ＩＬ-１５アンタゴニストはＩＬ-１５変異タンパク質を含むか、そのものである。更なるある好適な実施態様では、前記ＩＬ-１５変異タンパク質は依然としてＩＬ-１５レセプターαサブユニットに結合することができ、ＩＬ-１５のβ又はγサブユニットの何れかを介する細胞へのシグナル伝達を阻害する。ある好適な実施態様では、前記ＩＬ-１５変異タンパク質は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むか、これからなり、配列番号２３のＡｓｐ８、Ｇｌｎ１０１及びＧｌｎ１０８の少なくとも１つの位置、好ましくは２つ、より好ましくは３つすべての位置が変異されている、好ましくは非保存的な置換によって好ましくは置換されているものである。ある好適な実施態様では、前記ＩＬ-１５変異タンパク質は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むか、これからなり、Ｇｌｎ１０１とＧｌｎ１０８の少なくとも一、又は両方が欠損しているか、好ましくは置換されているものである。更なるある好適な実施態様では、前記ＩＬ-１５変異タンパク質は配列番号４２のアミノ酸配列を含むか、これからなる。
【００６９】
ある好適な実施態様では、前記ＩＬ-１５変異タンパク質は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むか、これからなり、Ａｓｐ８とＧｌｎ１０８の少なくとも一、又は好ましくはこれら両方が欠損しているか、好ましくは異なる天然に生じるアミノ酸残基、さらに好ましくはセリン又はシステインに好ましくは置換されているものである。ある選択的な好適な実施態様では、Ｇｌｎ１０８はＡｓｐに置換される。ある選択的な好適な実施態様では、Ａｓｐ８はＡｒｇ又はＬｙｓに置換される。
ある好適な実施態様では、前記ＩＬ-１５変異タンパク質は、配列番号２３に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、又は最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含むか、これからなるものであり、配列番号２３のＡｓｐ８、Ｇｌｎ１０１及びＧｌｎ１０８に対応する少なくとも１つの位置、好ましくは２つ、より好ましくは３つすべての位置が変異されている、好ましくは非保存的な置換によって好ましくは置換されているものである。ある好適な実施態様では、前記ＩＬ-１５変異タンパク質は、配列番号４２に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、又は最も好ましくは少なくとも９５％の相同性であるアミノ酸配列を含むか、これからなるものであり、配列番号４２の１０１と１０８に対応する位置がＡｓｐのままであるものである。
【実施例】
【００７０】
この実施例内で用いるＱβ ＶＬＰ、ＡＰ２０５ ＶＬＰなどは、国際公開公報02/056905、国際公開公報04/007538に記載のように大腸菌から組み換えて発現させた後に精製して得たＶＬＰを指す。
【００７１】
実施例１
ｐＭ-ＩＬ-１５-ＦＬ-ＣＧの構築
プラスミドｐＭｏｄＥＣ１のＢａｍＨＩ部位からＰｍｅＩ部位の配列(国際公開公報03/040164)を、元の配列とアニールしたオリゴB-FL-L-P R (配列番号34)とB-FL-C-P F (配列番号35)に置換することによって、catatggatc cgctagccct cgagga ctac aaggatgacg acgacaaggg tggttgcggt taataagttt aaacgcggcc gc (配列番号43)に変えた。結果として生じたコンストラクトは、マルチクローニングサイト内にＮｄｅ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ、ＮｈｅＩ、ＸｈｏＩ、ＰｍｅＩ及びＮｏｔＩの制限酵素部位を有するｐＭｏｄ-ＦＬ-ＣＧとした。
マウスＩＬ-１５を、プライマー：ＩＬ-１５-Ｆ (配列番号36)とＩＬ-１５-Ｘｈｏ-Ｒ (配列番号37)を用いたＰＣＲによって活性化樹状細胞のｃＤＮＡライブラリから増幅した。ＩＬ-１５-Ｆは内部にＮｄｅＩ部位を有し、ＩＬ-１５-ＸｈｏＩは内部にＸｈｏＩ部位を有した。ＰＣＲ産物をＮｄｅＩとＸｈｏＩにて消化し、同じ酵素で消化したｐＭｏｄ-ＦＬ-ＣＧ内にライゲーションした。結果として生じたプラスミドは、マウスＩＬ-１５、フラッグタグ及びＣ末端にシステインを含有するリンカーを含んでなる融合タンパク質をコードするｐＭ-ＩＬ-１５-ＦＣ-ＣＧと称した(配列番号３０)。
【００７２】
実施例２
ｐＭ-ＩＬ-１５-ＦＬ-ＣＧの発現
コンピテント大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)細胞をプラスミドｐＭ-ＩＬ-１５-ＦＬ-ＣＧにて形質転換した。アンピシリン(Ａｍｐ)含有アガープレートからの単一コロニーを液体培地(１５０ｍＭ ＭＯＰＳ, ｐＨ７．０、１００μｇ／ｍｌのＡｍｐを含むＳＢ)中に播き、３０℃で２２０ｒｐｍで振とうしながら一晩インキュベートした。ついで、一晩の培養物を同じ培地で１：５０に希釈し、３０℃でＯＤ６００＝２．８まで生育した。１ｍＭ ＩＰＴＧにて発現を誘導した。４時間の培養の後に６０００ｒｐｍで１０分間遠心して細胞を回収した。細胞ペレットを０．８ｍｇ／ｍｌのライソザイムを含む溶解バッファ(１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、３０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．２５％ Ｔｗｅｅｎ-２０)に懸濁して、超音波処理して、ベンゾナーゼにて処理した。４８０００ＲＣＦで２０分間遠心分離した後、上清を１２％ ＰＡＧＥゲルにて分離し、１４．９ＫＤの予測分子量でランしたＩＬ-１５-ＦＬ-ＣＧの発現を明瞭に示すウェスタンブロットにて抗マウスＩＬ-１５(R&D system)によりマウスＩＬ-１５の発現を確認した。
【００７３】
実施例３
ＩＬ-１５-ＦＬ-ＣＧの精製
初めに、ＩＬ-１５-ＦＬ-ＣＧを抗ＦＬＡＧ Ｍ２カラムによって精製した。簡単にいうと、ＩＬ-１５-ＦＬ-ＣＧ溶解物を抗ＦＬＡＧ Ｍ２カラムに流した。結合しなかった混合物をＴＢＳ(５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ, ｐＨ７．４)にて洗い流した。次いで、ＩＬ-１５-ＦＬ-ＣＧをＦＬＡＧペプチド(１００μｇ／ｍｌ)を用いたカラムから溶出させた。溶出物をQ Fast Flowカラムによりさらに精製した。
【００７４】
実施例４
ＩＬ-１５タンパク質、ＩＬ-１５変異タンパク質及びＩＬ-１５断片の産生
実質的に実施例１に記載したのと同じプロトコールを用いて、ヒトＩＬ-１５(配列番号２３)をＰＣＲによって活性化樹状細胞のｃＤＮＡライブラリから増幅し、ＰＣＲ産物をｐＭｏｄ-ＦＬ-ＣＧ内にライゲーションした。結果として生じたプラスミドは、ヒトＩＬ-１５、フラッグタグ及びＣ末端にシステインを含有するリンカーを含んでなる融合タンパク質をコードするｐＨ-ＩＬ-１５-ＦＣ-ＣＧと称した。
実質的に実施例１に記載したのと同じプロトコールを用いて、ヒトＩＬ-１５変異タンパク質を発現するプラスミドを構築した(配列番号３１、３２又は３３)。実質的に実施例２及び３に記載したのと同じプロトコールを適応して、ヒトＩＬ-１５タンパク質、ヒトＩＬ-１５変異タンパク質を発現させて、精製した。
標準的なプロトコールに従って、様々なＩＬ-１５断片(配列番号３４−４０)を化学的に合成した。さらに、各々のＩＬ-１５断片配列のＮ末端にシステインを融合した。
【００７５】
実施例５ 結果として再集合体化したＱβ ＶＬＰが生じる、異なるポリ陰イオン性高分子の存在下における分解／再集合体化による本発明のＱβ ＶＬＰの調整
(A) Ｑβ ＶＬＰの分解
大腸菌溶解物から精製した４５ｍｇのＱβ ＶＬＰ(２．５ｍｇ／ｍｌ、Bradford分析によって測定)を含むＰＢＳ(２０ｍＭ リン酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５)を１０ｍＭ ＤＴＴにて還元して、撹拌しながら室温に１５分間置いた。次いで、塩化マグネシウムを０．７Ｍの終濃度まで添加し、撹拌しながら室温で１５分間インキュベートを続け、カプセル化された宿主細胞ＲＮＡを沈殿させた。溶液から沈殿されたＲＮＡを取り除くために、溶液を４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心した(Eppendorf 5810 R、以下のすべての工程で固定角ローターA-4-62を用いた)。放出された二量体Ｑβコートタンパク質を含有する上清をクロマトグラフィの精製工程に用いた。
【００７６】
(B) 陽イオン交換クロマトグラフィ及びサイズ排除クロマトグラフィによるＱβコートタンパク質の精製
二量体コートタンパク質、宿主細胞タンパク質及び残渣の宿主細胞ＲＮＡを含有する分解反応の上清を水で１：１５に希釈し、１０ｍＳ／ｃｍ以下の伝導率を調整し、ＳＰ-セファロースＦＦカラム(xk16/20, 6 ml, Amersham Bioscience)に流した。カラムは、２０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファ ｐＨ７にて予め平衡化した。結合したコートタンパク質は、２０ｍＭ リン酸ナトリウム／５００ｍＭ 塩化ナトリウムの勾配法により溶出させ、タンパク質は約２５ｍｌの分画容量に回収した。室温で５ｍｌ／分の流速のクロマトグラフィを行い、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍの吸光度をモニターした。
第二工程では、単離されたＱβコートタンパク質(陽イオン交換カラムから溶出された分画)をセファクリルＳ-１００ＨＲカラム(xk26/60, 320 ml, Amersham Bioscience)に流し(２列)、２０ｍｍ リン酸ナトリウム／２５０ｍｍ 塩化ナトリウム、ｐＨ６．５にて平衡化した。室温で２．５ｍｌ／分の流速のクロマトグラフィを行い、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍの吸光度をモニターした。５ｍｌの分画を回収した。
【００７７】
(C1) 透析によるＱβ ＶＬＰの再集合体化
精製したＱβコートタンパク質(２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ６．５中に２．２ｍｇ／ｍｌ)、１のポリ陰イオン性高分子(Ｈ２Ｏ中に２ｍｇ／ｍｌ)、尿素(Ｈ２Ｏ中に７．２Ｍ)及びＤＴＴ(Ｈ２Ｏ中に０．５Ｍ)を、それぞれ終濃度１．４ｍｇ／ｍｌのコートタンパク質、０．１４ｍｇ／ｍｌのポリ陰イオン性高分子、１Ｍ 尿素及び２．５ｍＭ ＤＴＴに混合した。混合物(各々１ｍｌ)を、３．５ｋＤａのカットオフのメンブランを用いて２０ｍＭ トリスＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８にて５℃で２日間透析した。ポリ陰イオン性高分子は以下の通りであった：ポリガラクツロン酸(25000-50000, Fluka)、硫酸デキストラン(MW 5000及び10000, Sigma)、ポリ-Ｌ-アスパラギン酸(MW 11000及び33400, Sigma)、ポリ-Ｌ-グルタミン酸(MW 3000、13600及び84600, Sigma)、及びパン酵母と小麦麦芽由来のｔＲＮＡ。
(C2) 透析濾過(ダイアフィルトレーション)によるＱβ ＶＬＰの再集合体化
３３ｍｌの精製したＱβコートタンパク質(２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ６．５、２５０ｍＭ ＮａＣｌ中に１．５ｍｇ／ｍｌ)を、Ｈ２Ｏ及び尿素(Ｈ２Ｏ中に７．２Ｍ)、ＮａＣｌ(Ｈ２Ｏ中に５Ｍ)及びポリ-Ｌ-グルタミン酸(Ｈ２Ｏ中に２ｍｇ／ｍｌ、MW: 84600)と混合した。混合物の容量は５０ｍｌであり、成分の終濃度は１ｍｇ／ｍｌのコートタンパク質、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１．０Ｍ 尿素及び０．２ｍｇ／ｍｌ ポリ-Ｌ-グルタミン酸であった。次いで、混合物を室温で、５００ｍｌの２０ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ８、５０ｍＭ ＮａＣｌにて透析濾過した。この透析濾過は、１０ｍｌ／分の交差流速と２．５ｍｌ／分の透過流速で、Pellicon XL薄膜カートリッジ(Biomax 5K, Millipore)を用いた正接流量濾過装置(tangential flow filtration apparatus)にて行った。
【００７８】
実施例６ ＡＰ２０５ ＶＬＰのインビトロ集合体化(アセンブリ)
(A) ＡＰ２０５コートタンパク質の精製
分解：２０ｍｌのＡＰ２０５ ＶＬＰ溶液(ＰＢＳ中に１．６ｍｇ／ｍｌ、大腸菌抽出物から精製)を、０．２ｍｌの０．５Ｍ ＤＴＴと混合し、室温で３０分間インキュベートした。５ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌを添加して、次いで混合物を６０℃で１５分間インキュベートし、ＤＴＴ還元コートタンパク質を沈殿させた。混濁した混合物を遠心分離し(ローターSorvall SS34、１００００ｇ、１０分、２０℃)、上清を廃棄し、ペレットを、２０ｍｌの１Ｍ 尿素／２０ｍＭ クエン酸ナトリウム ｐＨ３．２に播種した。室温で３０分間撹拌した後、１．５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４を加えることによって、ｐＨ６．５にばらつきを調整し、その後二量体コートタンパク質を含む上清を得るために遠心分離した(ローターSorvall SS34、１００００ｇ、１０分、２０℃)。
陽イオン交換クロマトグラフィ：上清(上記参照)を２０ｍｌの水で希釈して、約５ｍＳ／ｃｍの伝導率を調整した。結果として生じた溶液を、２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ６．５バッファにて予め平衡化した６ｍｌのＳＰセファロースＦＦ (Amersham Bioscience)のカラムに流した。流した後、カラムを４８ｍｌの２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ６．５のバッファにて洗浄し、その後、２０倍のカラム容量の１Ｍ ＮａＣｌへの比例勾配により結合したコートタンパク質を溶出した。メインピークの分画をプールし、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及びＵＶ分光法にて分析した。ＳＤＳ-ＰＡＧＥによると、単離されたコートタンパク質は本質的に他のタンパク質混入がなく純粋であった。ＵＶ分光法によると、タンパク質濃度は０．６ｍｇ／ｍｌ(総量１２ｍｇ)であり、１Ａ２８０単位はＡＰ２０５コートタンパク質の１．０１ｍｇ／ｍｌを表す。さらに、Ａ２６０(０．２９１)の値に対してＡ２８０(０．５９９９)の値は２であることから、調製物は本質的に核酸を欠いていることが示唆される。
【００７９】
(B) ＡＰ２０５ ＶＬＰの集合体化
任意のポリ陰イオン性高分子のない条件下における集合体化：上記で溶出されたタンパク質分画を透析濾過し、２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ６．５にて１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度にまでＴＦＦによって、濃縮した。その溶液の５００μｌを、５０μｌの５Ｍ ＮａＣｌ溶液と混合し、室温で４８時間インキュベートした。混合物中での再集合体化ＶＬＰの形成は、非還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及びサイズ排除ＨＰＬＣにて示された。２０ｍＭ リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２にて平衡化したTSKgel G5000 PWXLカラム(Tosoh Bioscience)をＨＰＬＣ分析に用いた。
ポリグルタミン酸存在下における集合体化：３７５μｌの精製したＡＰ２０５コートタンパク質(２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ６．５中に１ｍｇ／ｍｌ)を、５０μｌのＮａＣｌ貯蔵溶液(Ｈ２Ｏ中に５Ｍ)、５０μｌのポリグルタミン酸貯蔵溶液(Ｈ２Ｏ中に２ｍｇ／ｍｌ、MW: 86400, Sigma)及び２５μｌのＨ２Ｏと混合した。混合物を室温にて４８時間インキュベートした。混合物中における再集合体化ＶＬＰの形成は、非還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及びサイズ排除ＨＰＬＣにて示された。混合物中のコートタンパク質がＶＬＰ内にほぼ完全に組み込まれたことから、任意のポリ陰イオン性高分子がない条件下で集合体化したＡＰ２０５コートタンパク質より効率よく、多く集合体化されたことが示された。
【００８０】
実施例７
ＩＬ-１５-ＦＬ-ＣＧのＱβ ＶＬＰと集合化したＱβ ＶＬＰへのカップリング
実施例３から得た精製したマウスＩＬ-１５-ＦＬ-ＣＧ(１５３μＭ)を、等量のＴＣＥＰを含むＴＢＳ ｐＨ７．４にて１時間還元した。還元したＩＬ-１５-ＦＬ-ＣＧ(８３μＭ)を、ＳＭＰＨで誘導体化した総量５０μｌの５９μＭのＱβとともに室温で終夜インキュベートした。カップリング反応物を、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロットとＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分析した。タンパク質濃度をBradfordによって測定した。クーマシーブルー染色したＳＤＳ-ＰＡＧＥの濃度測定の分析によってカップリング効率を推測した。
実質的に同じ実験条件を適応して、ヒトＩＬ-１５-ＦＬ-ＣＧ(実施例４で得たもの)を、実施例５で得た集合体化したＱβ ＶＬＰ、又は実施例６から得た集合体化したＡＰ２０５ ＶＬＰにカップリングした。
【００８１】
実施例８
ヒトＩＬ-１５変異タンパク質のＱβ ＶＬＰと集合化したＱβ ＶＬＰへのカップリング
実施例４から得た精製したヒトＩＬ-１５変異タンパク質(１５３μＭ)を、等モルのＴＣＥＰを含むＴＢＳ ｐＨ７．４にて１時間還元した。還元したＩＬ-１５変異タンパク質(８３μＭ)を、ＳＭＰＨで誘導体化した総量５０μｌの５９μＭのＱβ ＶＬＰ又は５９μＭの再集合体化したＱβ ＶＬＰとともに室温で終夜インキュベートした。カップリング反応物を、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロットとＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分析した。タンパク質濃度をBradfordによって測定した。クーマシーブルー染色したＳＤＳ-ＰＡＧＥの濃度測定の分析によってカップリング効率を推測した。
【００８２】
実施例９
ヒトＩＬ-１５タンパク質のＨＢｃＡｇ１-１８５-Ｌｙｓへのカップリング
ＨＢｃＡｇ１-１８５-Ｌｙｓの構築、その発現及び精製は実質的に国際公開公報03/040164の実施例２−５に記載されている。２０mM Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２中の１２０μＭ ＨＢｃＡｇ１-１８５-Ｌｙｓキャプシドの溶液を、振とう器上において２５℃で、ＤＭＳＯ中の原液から希釈した２５倍モル濃度を超えるＳＭＰＨ(Pierce)の溶液と３０分間反応させた。この反応液について、その後、１Ｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２に対する２時間の透析を４℃で２回行った。次いで、この透析したＨＢｃＡｇ１-１８５-Ｌｙｓ反応混合液を実施例４で得たヒトＩＬ-１５タンパク質と反応させた。カップリング反応物中において、ヒトＩＬ-１５タンパク質は誘導体化したＨＢｃＡｇ１-１８５-Ｌｙｓキャプシドに対して２倍のモル過剰量とした。カップリング反応は振とう器上で２５℃で４時間続けた。カップリング産物は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分析した。
【００８３】
実施例１０
免疫原性
実験において、マウスのＡグループ(ｎ＝５)は、第０日目、第１４日目及び第２８日目に、アジュバントを含めないで、マウスＩＬ-１５-ＦＬ-ＣＧとカップリングした５０μｇのＱβ ＶＬＰにて皮下的に免疫化した。ネガティブコントロールとして、５匹のマウスにＰＢＳのみを接種した。
実験において、マウスのＢグループ(ｎ＝５)は、第０日目、第１４日目及び第２８日目に、アジュバントを含めないで、マウスＩＬ-１５-ＦＬ-ＣＧとカップリングした２５μｇのＱβ ＶＬＰにて皮下的に免疫化した。ネガティブコントロールとして、５匹のマウスにＱβ ＶＬＰのみを接種した。
表１は、ＥＬＩＳＡに示されるように、Ｑβ-ＩＬ-１５-ＦＬ-ＣＧによる免疫化により、すべてのマウスにおいてＩＬ-１５特異的ＩｇＧ抗体の力価が高くなったことを示す。これは、アジュバンドの添加なしで、ワクチンがＩＬ-１５に対する免疫学的な耐性を克服したことを示す。ＥＬＩＳＡ力価は４５０ｎｍの最大半減光学密度(ＯＤ５０％)となる血清の希釈物として定義した。ＥＬＩＳＡプレートは組み換えＩＬ-１５でコートした。５匹の動物の平均は標準偏差とともに求めた。
同じ実験条件を適応して、再集合体化したＱβ ＶＬＰにカップリングしたマウスＩＬ-１５-ＦＬ-ＣＧにてマウスを免疫化し、ＥＬＩＳＡにより抗体力価を測定して、Ｑβ ＶＬＰにカップリングしたＩＬ-１５-ＦＬ-ＣＧとネガティブコントロールによって誘導された抗体力価と比較した。
【００８４】
表１Ａ(実験Ａ)
表１Ｂ(実験Ｂ)
【００８５】
実施例１１
関節リウマチマウスモデルにおけるＱβ ＶＬＰ-ＩＬ-１５ワクチンの有効性
インビボの関節炎症状を低減するＱβ ＶＬＰ-ＩＬ-１５ワクチンの能力を、関節リウマチ(ＲＡ)のマウスモデルにおいて、評価した。このモデルにおいて、ＲＡは４つの異なるモノクローナル抗体の混合(関節原性モノクローナル抗体混合物(Arthrogenic Monoclonal Antibody Cocktail)、MD Biosciences)を静脈内注射することによって、誘導した２４時間後に、ＬＰＳを腹腔内投与をした(K. Terato, 等, J. Immunology, 148: 2102-2108, 1992)。このモデルでは、炎症は急速に進行して、強直及び永続的な関節破壊が２週間続いた。
【００８６】
Ａ実験では、マウスグループは、第−７０日目、第−５６日目及び第−４２日目に、５０μｇのＱβ ＶＬＰ-ＩＬ-１５で免疫化し、ＰＢＳのみを接種したマウスのグループはネガティブコントロールとした。Ｂ実験では、マウスグループは、第−４２日目、第−２８日目及び第−１４日目に、２５μｇのＱβ ＶＬＰ-ＩＬ-１５で免疫化し、Ｑβのみで免疫化したマウスのグループはネガティブコントロールとした。３回の免疫処置の後、第０日目に２ｍｇのモノクローナル抗体混合物(Arthrogenic Monoclonal Antibody Cocktail、MD Biosciences)を静脈内投与することによって、マウスにＲＡを誘導し、２４時間後に２００μｌのＬＰＳを投与した。炎症プロセスは１４〜１５日間にわたってモニターし、各肢の臨床スコアを求めた。関節炎の臨床スコアは１５日間以上測定した。以下の定義にしたがって、各肢に０から３の臨床スコアをつけた：０標準、１指／足の軽度の腫脹及び／又は紅斑、２全足／関節にわたる腫脹及び紅斑、３重度の腫脹、足／関節の変形、強直を有する。１グループにつき５匹のマウスの平均を標準偏差とともに求めた。
図１Ａは実験Ａの結果を示す。Ｑβ ＶＬＰ-ＩＬ-１５をワクチン接種したマウスはおよそ０．２５の平均臨床スコアを発症した。対照的に、ＰＢＳを注射したマウスは、同期間にわたって０．９７の平均臨床スコアを発症した。図１Ｂは実験Ｂの結果を示す。
Ｑβ ＶＬＰ-ＩＬ-１５をワクチン接種したマウスはおよそ０．１８の平均臨床スコアを発症したのに対して、コントロールマウスは０．５１の平均値であった。
【００８７】
実施例１２
アテローム性動脈硬化のマウスモデルにおけるＱβ ＶＬＰ-ＩＬ-１５ワクチンの有効性
７〜８週齢の雄Ａｐｏｅ−／−マウス(The Jackson Laboratory, Bar Harbor ME)に、５０μｇのＱβ-ＩＬ-１５ワクチン(ｎ＝６)(実施例７から得たもの)又は５０μｇのＱβ(ｎ＝６)のいずれかを第０、１４、２８、４９、６３及び１１３日目に皮下注射した。始めに、マウスに通常の固形飼料食餌を与え、第２１日目に西洋型食餌(２０％の脂肪、０．１５％のコレステロール、Provimi Kliba AG)に置き換えた。実験期間中、一定の間隔でマウスから血液を採取し、血清中のＩＬ-１５に対する抗体応答を測定した。第１５９日目に屠殺し、基本的には過去に記載のように(Tangirala R.K. 等 (1995) J. Lipd. Res. 36: 2320-2328)、大動脈を単離して調整した。心臓穿刺によって、動物から血液を採取し、コールドＰＢＳを灌流した。次いで、大動脈を露出させ、インサイツで除去した外膜と同じだけ(as much of the adventitia removed in situ)、最後に大動脈を心臓から取り除いた。大動脈は、コールドＰＢＳで満たしたガラスシャーレ上で残留する外膜を洗い流し、大動脈弓を左鎖骨下動脈の５ｍｍ下を切片化した。大動脈を縦に切り、黒色のワックス表面上にピンで留め、４％ホルマリンで一晩かけて固定した。次いでオイルレッドＯにて終夜をかけて染色した。プラークはデジタル写真上で画像処理ソフトウェア(Motic Image Plus 2.0)により定量化した。プラーク負荷(load)は、腸骨の分岐点までに得られる大動脈の総プラークの表面の合計を、腸骨の分岐点までに測定される大動脈の総表面で除して、パーセンテージで表した。Ｑβ-ＩＬ-１５とＱβグループ間のプラーク負荷の中央値又は平均の違いを分析した。
【００８８】
ＥＬＩＳＡプレート上にコートした組み換えＩＬ-１５を用いた、典型的なＥＬＩＳＡにおいて、抗体応答を測定した。特異的な抗体の結合を、ヤギ抗マウスＨＲＰコンジュゲートを用いて検出した。第０、１４、２８、５６及び１０２日目のＩＬ-１５に対する力価を、アッセイにおいて、最大半量の結合が得られる血清希釈物として算出した。
Ludewig B. 等 (2000) PNAS 97:12752-12757に記載のように、各動物のアテローム性動脈硬化の範囲は大動脈起点(aortic origin)による横断切片の組織学的分析によって、さらに評価した。すべての３の弁尖端から大動脈起点による凍結連続横断切片を採取した。オイルレッドＯで染色して、病変サイズを定量化するために、逆にヘマトキシリンで染色した。
抗体応答の測定値の結果を表２に示す。免疫前(ｄ０)血清において、検出可能な力価がほとんどなかったので、ＱβにカップリングしたマウスＩＬ-１５に対する免疫化により、ＩＬ-１５に対する強力で特異的な抗体応答が誘発されたことが明確に示された。
さらに、ＩＬ-１５に特異的な抗体応答の誘導により、Ｑβグループと比較して、Ｑβ-ＩＬ-１５グループの平均(４７％)及び中間値(４６％)のプラーク負荷が減少した。これは、ＩＬ-１５がアテローム性動脈硬化の発症に伴っており、Ｑβ-ＩＬ-１５ワクチンによる抗ＩＬ-１５抗体の誘導はアテローム性動脈硬化を有利に調整することを示唆している。
【００８９】
表２ Ｑβ-ＩＬ-１５で免疫化したＡｐｏｅ−／−マウスにおける相乗平均の抗ＩＬ-１５抗体力価
【００９０】
実施例１３
マウスＩＬ-１５断片のＱβ ＶＬＰへのカップリング
Ｑβウイルス様粒子(２ｍｇ／ｌ)を２．８ｍＭ ＳＭＰＨ(Pierce, Perbio Science)によって、２５℃で６０分間かけて誘導体化して、次いでＰＢＳにて透析した。ＩＬ-１５６１-７３(２５０μＭ)および誘導体化したＱβ ＶＬＰ(１００μＭ)を、ＰＢＳバッファ中で１５℃で、１時間インキュベートした。カップリング産物をＳＤＳ-ＰＡＧＥによって、分析した。我々は、１のＱβ単量体に対する１のＩＬ-１５６１-７３分子と１のＱβ単量体に対する２のＩＬ-１５６１-７３分子のカップリング産物を同定した。また、ＩＬ-１５４２-５５を同様の方法でＱβにカップリングした。
【００９１】
実施例１４
実験的喘息の動物モデルにおけるワクチンの有効性
インビボのＱβ-ＩＬ-１５によるワクチン接種の効果を、オバルブミン(ＯＶＡ)ベースの喘息のマウスモデルにおいて、評価した。この実験により、Ｑβ-ＩＬ-１５によるワクチン接種により生成された抗ＩＬ-１５抗体の内在性ＩＬ-１５のインビボ作用を下方制御する能力を試験した。ＢＡＬＢ／ｃマウスの１グループにつき６匹、３つのグループで分析した。マウスは、第７日目、第２１日目及び第３５日目に、５０μｇのＱβ-ＩＬ-１５(グループＣ、実施例７から得たもの)又はコントロールとしてのＱβ ＶＬＰのみ(グループＡ及びＢ)のいずれかにてワクチン接種した。２回目のワクチン接種の後に、Ｑβ又はＩＬ-１５のいずれかに対して高いＩｇＧ力価が得られた。第０日目に、グループＢ及びＣのマウスを、腹膜内に２ｍｇのＡｌ２Ｏ３に吸着された５０μｇのＯＶＡ(グレードＶ；Sigma-Aldrich)にて感作した。肺アレルギー性炎症を誘導するために、これらのマウスは、第４２日目〜第４５日目まで毎日、ＯＶＡエアゾールの吸入(２．５％のＰＢＳ溶液、Pari TurboBOY；Pariによって、３０分間噴霧)により抗体負荷した。ネガティブコントロールとして、グループＡのマウスは、第０日目にＯＶＡとＡｌ２Ｏ３で処置せず、その後ＯＶＡエアゾールによって、抗体負荷も行わなかった。第４６日目に、マウスは死亡し、気管支肺胞洗浄(ＢＡＬ)を行って、ＢＡＬ内に浸透している細胞の数を数えて、気道過敏症(ＡＨＲ)を測定した。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１Ａ】Ｑβ ＶＬＰ-ＩＬ-１５にて免疫化したマウスの関節炎の平均臨床スコアを示す。図１Ａは５０μｇのＱβ ＶＬＰ-ＩＬ-１５で免疫化したマウスとＰＢＳのみを投与したマウスの関節炎の平均臨床スコアを示す。バーは各免疫化グループの平均スコアを表す。
【図１Ｂ】Ｑβ ＶＬＰ-ＩＬ-１５にて免疫化したマウスの関節炎の平均臨床スコアを示す。図１Ｂは２５μｇのＱβ ＶＬＰ-ＩＬ-１５で免疫化したマウスとＱβのみで免疫化したマウスの関節炎の平均臨床スコアを示す。バーは各免疫化グループの平均スコアを表す。
【図２】Ａｐｏｅ−／−マウスにおけるアテローム性動脈硬化プラーク負荷の数量化及び統計学的分析を示す。バーは、Ｑβ-ＩＬ-１５(黒色バー)又はＱβ(白色バー)で免疫化したＡｐｏｅ−／−マウスの大動脈における平均アテローム性動脈硬化プラーク負荷を割合で示す。誤差バーは平均の標準偏差を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) 少なくとも一の第一付着部位を有するウイルス様粒子(ＶＬＰ)；と
(b) 少なくとも一の第二付着部位を有する少なくとも一の抗原；
を含んでなる組成物であって、該少なくとも一の抗原がＩＬ-１５タンパク質、ＩＬ-１５変異タンパク質ないしはＩＬ-１５断片であり、(a)と(b)が該少なくとも一の第一付着部位と該少なくとも一の第二付着部位を介して結合している、組成物。
【請求項２】
前記ＩＬ-１５タンパク質が、
(a) 配列番号２２；
(b) 配列番号２３；
(c) 配列番号２４；
(d) 配列番号２５；及び
(e) 配列番号２２−２５の何れかに少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、又は最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＩＬ-１５変異タンパク質が、
(a) 配列番号２３、この位置４６がＥでない；
(b) 配列番号２３、この位置５０がＩでない；
(c) 配列番号２３、この位置４６がＥでなく、位置５０がＩでない；
(d) 配列番号３１；
(e) 配列番号３２；
(f) 配列番号３３；及び
(g) 配列番号２３に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、又は最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列であり、このとき、配列番号２３の位置４６に一致する位置がＥでない、又は配列番号２３の位置５０に一致する位置がＩでない、又は配列番号２３の位置４６に一致する位置がＥでなくかつ配列番号２３の位置５０に一致する位置がＩでないアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＩＬ-１５断片が、
(a) 配列番号３４；
(b) 配列番号３５；
(c) 配列番号３６；
(d) 配列番号３７；
(e) 配列番号３８；
(f) 配列番号３９；及び
(g) 配列番号３４−３９の何れかに少なくとも６５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、又は最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＶＬＰがＲＮＡファージの組み換えコートタンパク質、その変異タンパク質ないしはその断片を含有してなる、請求項１ないし４の何れか一に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＲＮＡファージがＲＮＡファージ Ｑβ、ｆｒ、ＧＡ又はＡＰ２０５である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記第一付着部位が、少なくとも一の共有結合を介して前記第二付着部位に結合しており、好ましくは該共有結合が非ペプチド結合である、請求項１ないし６の何れか一に記載の組成物。
【請求項８】
前記第一付着部位が、アミノ基、好ましくはリジンのアミノ基を含有する、請求項１ないし７の何れか一に記載の組成物。
【請求項９】
前記第二付着部位がスルフヒドリル基、好ましくはシステインのスルフヒドリル基を含有する、請求項１ないし８の何れか一に記載の組成物。
【請求項１０】
さらにリンカーを含有する、請求項１ないし９の何れか一に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１ないし１０の何れか一に記載の組成物を含有してなるワクチン。
【請求項１２】
前記ワクチンがさらに少なくとも一のアジュバントを含有する、請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
動物又はヒトに請求項１１又は１２に記載のワクチンが投与されることを含む、免疫化方法。
【請求項１４】
(a) 請求項１ないし１０の何れか一に記載の組成物又は請求項１１ないし１２の何れか一に記載のワクチン、と
(b) 受容可能な薬剤的担体
を含んでなる薬剤組成物。
【請求項１５】
(a) 少なくとも一の第一付着部位を有するＶＬＰを供給する、
(b) 少なくとも一の第二付着部位を有するＩＬ-１５タンパク質、ＩＬ-１５変異タンパク質ないしはＩＬ-１５断片である、少なくとも一の抗原を供給する、
(c) 該ＶＬＰと該少なくとも一の抗原を結合させて、該少なくとも一の第一付着部位と該少なくとも一の第二付着部位を介して少なくとも一の抗原と該ＶＬＰが結合している、組成物を産生する
ことを含む、請求項１ないし１０の何れか一に記載の組成物の産生方法。
【請求項１６】
動物ないし好ましくはヒトの炎症性疾患及び／又は慢性自己免疫性疾患の治療のための医薬の製造方法のための、請求項１ないし１０の何れか一に記載の組成物又は請求項１１ないし１２の何れか一に記載のワクチンの使用。
【請求項１７】
前記炎症性疾患及び／又は慢性自己免疫性疾患が関節リウマチである、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
アテローム性動脈硬化の治療のための医薬の製造のための、請求項１ないし１０の何れか一に記載の組成物又は請求項１１ないし１２の何れか一に記載のワクチンの使用。
【請求項１９】
喘息の治療のための医薬の製造のための、請求項１ないし１０の何れか一に記載の組成物又は請求項１１ないし１２の何れか一に記載のワクチンの使用。
【請求項２０】
アテローム性動脈硬化及び喘息からなる群から選択される疾患の治療のための医薬の製造のための、少なくとも一のＩＬ-１５アンタゴニストの使用。
【請求項２１】
前記ＩＬ-１５アンタゴニストがＩＬ-１５に特異的に結合するモノクローナル抗体である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記ＩＬ-１５アンタゴニストがＩＬ-１５に特異的に結合する抗体であり、好ましくは該抗体が請求項１ないし１０の何れか一に記載の組成物又は請求項１１ないし１２の何れか一に記載のワクチンに応答して産生されるものである、請求項２０又は２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記ＩＬ-１５アンタゴニストがＩＬ-１５変異タンパク質である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２４】
前記ＩＬ-１５変異タンパク質が、配列番号２３のＡｓｐ８、Ｇｌｎ１０１及びＧｌｎ１０８の少なくとも１つの位置、好ましくは２つ、より好ましくは３つすべての位置が置換されている、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含有してなる、請求項２３に記載の使用。
【請求項１】
(a) 少なくとも一の第一付着部位を有するウイルス様粒子(ＶＬＰ)；と
(b) 少なくとも一の第二付着部位を有する少なくとも一の抗原；
を含んでなる組成物であって、該少なくとも一の抗原がＩＬ-１５タンパク質、ＩＬ-１５変異タンパク質ないしはＩＬ-１５断片であり、(a)と(b)が該少なくとも一の第一付着部位と該少なくとも一の第二付着部位を介して結合している、組成物。
【請求項２】
前記ＩＬ-１５タンパク質が、
(a) 配列番号２２；
(b) 配列番号２３；
(c) 配列番号２４；
(d) 配列番号２５；及び
(e) 配列番号２２−２５の何れかに少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、又は最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＩＬ-１５変異タンパク質が、
(a) 配列番号２３、この位置４６がＥでない；
(b) 配列番号２３、この位置５０がＩでない；
(c) 配列番号２３、この位置４６がＥでなく、位置５０がＩでない；
(d) 配列番号３１；
(e) 配列番号３２；
(f) 配列番号３３；及び
(g) 配列番号２３に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、又は最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列であり、このとき、配列番号２３の位置４６に一致する位置がＥでない、又は配列番号２３の位置５０に一致する位置がＩでない、又は配列番号２３の位置４６に一致する位置がＥでなくかつ配列番号２３の位置５０に一致する位置がＩでないアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＩＬ-１５断片が、
(a) 配列番号３４；
(b) 配列番号３５；
(c) 配列番号３６；
(d) 配列番号３７；
(e) 配列番号３８；
(f) 配列番号３９；及び
(g) 配列番号３４−３９の何れかに少なくとも６５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、又は最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＶＬＰがＲＮＡファージの組み換えコートタンパク質、その変異タンパク質ないしはその断片を含有してなる、請求項１ないし４の何れか一に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＲＮＡファージがＲＮＡファージ Ｑβ、ｆｒ、ＧＡ又はＡＰ２０５である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記第一付着部位が、少なくとも一の共有結合を介して前記第二付着部位に結合しており、好ましくは該共有結合が非ペプチド結合である、請求項１ないし６の何れか一に記載の組成物。
【請求項８】
前記第一付着部位が、アミノ基、好ましくはリジンのアミノ基を含有する、請求項１ないし７の何れか一に記載の組成物。
【請求項９】
前記第二付着部位がスルフヒドリル基、好ましくはシステインのスルフヒドリル基を含有する、請求項１ないし８の何れか一に記載の組成物。
【請求項１０】
さらにリンカーを含有する、請求項１ないし９の何れか一に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１ないし１０の何れか一に記載の組成物を含有してなるワクチン。
【請求項１２】
前記ワクチンがさらに少なくとも一のアジュバントを含有する、請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
動物又はヒトに請求項１１又は１２に記載のワクチンが投与されることを含む、免疫化方法。
【請求項１４】
(a) 請求項１ないし１０の何れか一に記載の組成物又は請求項１１ないし１２の何れか一に記載のワクチン、と
(b) 受容可能な薬剤的担体
を含んでなる薬剤組成物。
【請求項１５】
(a) 少なくとも一の第一付着部位を有するＶＬＰを供給する、
(b) 少なくとも一の第二付着部位を有するＩＬ-１５タンパク質、ＩＬ-１５変異タンパク質ないしはＩＬ-１５断片である、少なくとも一の抗原を供給する、
(c) 該ＶＬＰと該少なくとも一の抗原を結合させて、該少なくとも一の第一付着部位と該少なくとも一の第二付着部位を介して少なくとも一の抗原と該ＶＬＰが結合している、組成物を産生する
ことを含む、請求項１ないし１０の何れか一に記載の組成物の産生方法。
【請求項１６】
動物ないし好ましくはヒトの炎症性疾患及び／又は慢性自己免疫性疾患の治療のための医薬の製造方法のための、請求項１ないし１０の何れか一に記載の組成物又は請求項１１ないし１２の何れか一に記載のワクチンの使用。
【請求項１７】
前記炎症性疾患及び／又は慢性自己免疫性疾患が関節リウマチである、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
アテローム性動脈硬化の治療のための医薬の製造のための、請求項１ないし１０の何れか一に記載の組成物又は請求項１１ないし１２の何れか一に記載のワクチンの使用。
【請求項１９】
喘息の治療のための医薬の製造のための、請求項１ないし１０の何れか一に記載の組成物又は請求項１１ないし１２の何れか一に記載のワクチンの使用。
【請求項２０】
アテローム性動脈硬化及び喘息からなる群から選択される疾患の治療のための医薬の製造のための、少なくとも一のＩＬ-１５アンタゴニストの使用。
【請求項２１】
前記ＩＬ-１５アンタゴニストがＩＬ-１５に特異的に結合するモノクローナル抗体である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記ＩＬ-１５アンタゴニストがＩＬ-１５に特異的に結合する抗体であり、好ましくは該抗体が請求項１ないし１０の何れか一に記載の組成物又は請求項１１ないし１２の何れか一に記載のワクチンに応答して産生されるものである、請求項２０又は２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記ＩＬ-１５アンタゴニストがＩＬ-１５変異タンパク質である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２４】
前記ＩＬ-１５変異タンパク質が、配列番号２３のＡｓｐ８、Ｇｌｎ１０１及びＧｌｎ１０８の少なくとも１つの位置、好ましくは２つ、より好ましくは３つすべての位置が置換されている、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含有してなる、請求項２３に記載の使用。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図１Ｂ】
【図２】
【公表番号】特表２００８−５２３１３２（Ｐ２００８−５２３１３２Ａ）
【公表日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４６０３３（Ｐ２００７−５４６０３３）
【出願日】平成１７年１２月１２日（２００５．１２．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０５６６８０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６３９７４
【国際公開日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【出願人】（３０４０４２３７５）サイトス バイオテクノロジー アーゲー (26)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月１２日（２００５．１２．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０５６６８０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０６３９７４
【国際公開日】平成１８年６月２２日（２００６．６．２２）
【出願人】（３０４０４２３７５）サイトス バイオテクノロジー アーゲー (26)
【Ｆターム（参考）】
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