ＩＬ−１８様ペプチド、その融合ペプチド、製造方法および用途
【課題】ＩＬ−１８に対する活性阻害作用を有し、各種炎症性疾患の治療可能なペプチトドを提供する。
【解決手段】アトピー性皮膚炎などの炎症または免疫異常性疾患に関与しているＩＬ−１８の、その受容体との相互作用を制御・調節することが可能なＩＬ−１８様ペプチド、当該ペプチドを有効成分とする医薬組成物、生理活性阻害剤。ヒト抗ＩＬ−１８抗体を用いてファージランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることを含む当該ＩＬ−１８様ペプチドの製造方法。本発明のＩＬ−１８様ペプチドは アトピー性皮膚炎などの免疫異常性疾患に関与していると考えられるＩＬ−１８と、その受容体との相互作用を制御・調節することが可能であってＩＬ−１８活性阻害剤として有用であり、各種炎症性疾患へ提供が期待できる。
【解決手段】アトピー性皮膚炎などの炎症または免疫異常性疾患に関与しているＩＬ−１８の、その受容体との相互作用を制御・調節することが可能なＩＬ−１８様ペプチド、当該ペプチドを有効成分とする医薬組成物、生理活性阻害剤。ヒト抗ＩＬ−１８抗体を用いてファージランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることを含む当該ＩＬ−１８様ペプチドの製造方法。本発明のＩＬ−１８様ペプチドは アトピー性皮膚炎などの免疫異常性疾患に関与していると考えられるＩＬ−１８と、その受容体との相互作用を制御・調節することが可能であってＩＬ−１８活性阻害剤として有用であり、各種炎症性疾患へ提供が期待できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＩＬ−１８シグナルを阻害する抗ＩＬ-１８抗体と結合し得るＩＬ−１８様ペプチド、その製造方法ならびにその用途に関する。このペプチドは、ＩＬ−１８が原因となって惹起される炎症、免疫異常性疾患の治療薬として期待される。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインＩＬ−１８（インターロイキン１８）はインターフェロン−ガンマ（IFN-γ）誘導因子として発見されたが、その後ＩｇＥ抗体が介在するアレルギー反応や、ＩｇＥが介在しないアトピー性皮膚炎や気管支喘息の悪性化の原因であること、またこの過剰産生が肝臓や腸管で重篤な臓器障害が起こることが明らかとなっている。また、このような疾患以外にも、様々な疾患において、ＩＬ−１８の病態への指摘されている（非特許文献１）。
【０００３】
最近、受容体−リガンド系における相互作用部位を同定する手段として、ファージランダムペプチドライブラリーを用いたスクリーニング法が注目されている。これはファージの構成蛋白質であるｐ３分子をコードする遺伝子（ジーン３）にランダムなアミノ酸配列を有するペプチド分子をコードする遺伝子を挿入することにより、当該ペプチド分子を含んだ形のｐ３分子（ジーン３蛋白質とランダムなアミノ酸配列を有するペプチド分子との融合体。以下、Ｇ３Ｐ体とも呼ぶ）をＭ１３ファージ（繊維状一本鎖ＤＮＡのファージ）上に発現させ、ファージランダムペプチドライブラリーを作成し、パンニング等で目的とするペプチド分子を発現しているファージをスクリーニングし、当該ファージのジーン３遺伝子部分の塩基配列解析を行って、相互作用部位を決定する方法である。
【０００４】
この方法を用いて、抗ｐ５３モノクローナル抗体によるｐ５３分子上のエピトープの決定（ただし、ｐ５３と相同性が高い）、抗ｂＥＧＦ抗体によりスクリーニングされたｂＥＧＦ類似体がｂＦＧＦとその受容体ＦＧＦＲ−１の結合を阻害したこと、あるいは抗アセチルコリン受容体エピトープ抗体と結合するペプチド配列の発見（当該受容体とは相同性がないが、アセチルコリンと結合するか否かは言及せず）等が報告されている。
【０００５】
また、本発明者らはこの手法をさらに発展させて、ＣＴＬＡ−４に関して、抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体を用いて、当該抗体が結合する標的分子の立体構造をアミノ酸の一次配列に依存せずに模倣する分子であり、且つ受容体−リガンドの相互作用を制御できるような分子を得る方法を開発した（非特許文献２、３）。
【非特許文献１】J. Exp. Med. 1994(4), 535-545, 2004
【非特許文献２】Nature biotech. 16, 267-270, 1998
【非特許文献３】J. Immunol. 161: 6622-6628, 1998
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
以上のように、ＩＬ−１８の産生あるいは活性の制御は、このようなＩＬ−１８依存性のアトピー性皮膚炎の治療法として、あるいはＩＬ−１８の過剰産生が原因となり疾患の発症が誘導あるいは憎悪するＴｈ１病の治療法として、極めて重要である。それゆえ、ＩＬ−１８の生理活性を阻害するＩＬ−１８様ペプチドを開発することができれば、ＩＬ−１８の関与する多くの疾患の有効な治療手段になることが期待される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、生体反応を制御するレセプターとリガンドの結合によるシグナルの伝達を阻害し、かつ当該分子の立体構造を認識するモノクローナル抗体を用いて、ファージペプチドライブラリーより得られる、目的タンパク分子の３次構造を模倣したペプチド配列をもつ免疫制御分子が単離できるという本発明者らの知見（非特許文献２および３）に基づき、上述の課題を解決するために、より低分子のＩＬ−１８阻害剤としてＭ１３ファージライブラリー（PhD-12およびPhD-C7, Biolabs. USA）を用いたペプチド開発を試み、数種の抗ＩＬ−１８抗体結合ファージクローンを得ることに成功し、次いでそれらファージクローンに挿入されたペプチドは共通のアミノ酸配列部位を有することを見いだし、それらの知見に基づいて本発明を完成したものである。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の１）〜９）の通りである。
１）ＩＬ−１８シグナルを阻害する抗ＩＬ−１８抗体と結合し得るＩＬ−１８様ペプチド。
２）ＩＬ−１８のアミノ酸配列と相同性のある上記１）記載のＩＬ−１８様ペプチド。
３）ＩＬ−１８と立体構造が類似している、および／またはＩＬ−１８とその受容体との相互作用を制御・調節する上記１）または２）記載のＩＬ−１８様ペプチド。
【０００９】
４）９残基もしくは１２残基のアミノ酸配列、または両端にシステインを有する７残基のアミノ酸配列を有するポリペプチドである上記１）記載のＩＬ−１８様ペプチド。
５）配列表配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドである上記１）記載のＩＬ−１８様ペプチド。
６）上記１）〜５）のいずれかに記載のＩＬ−１８様ペプチドとジーン３蛋白質との融合体。
【００１０】
７）上記１）〜５）のいずれかに記載のＩＬ−１８様ペプチド、あるいは上記６）記載のＩＬ−１８様ペプチドとジーン３蛋白質との融合体を有効成分として含有してなる医薬組成物。
８）上記１）〜５）のいずれかに記載のＩＬ−１８様ペプチド、あるいは上記６）記載のＩＬ−１８様ペプチドとジーン３蛋白質との融合体を有効成分として含有してなる免疫疾患治療剤。
【００１１】
９）抗ＩＬ−１８抗体を用いて、ファージランダムペプチドライブラリーをスクリーニングし、当該抗ＩＬ−１８抗体と結合し得るＩＬ−１８様ペプチドを発現しているファージクローンを単離することを特徴とする、抗ＩＬ−１８抗体と結合し得るＩＬ−１８様ペプチドの製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のＩＬ−１８様ペプチドは、アトピー性皮膚炎などに密接に関与しているＩＬ−１８の、受容体との相互作用を制御・調節することが可能であり、生理活性阻害剤として有用である。免疫異常性疾患におけるＩＬ−１８の作用を考えると、本発明のＩＬ−１８様ペプチドは、各種炎症性の疾患に適用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明において抗ＩＬ−１８抗体と結合するＩＬ−１８様ペプチドとは、抗ＩＬ−１８抗体と結合する、ＩＬ−１８と立体構造が非常によく類似している、ＩＬ−１８のアミノ酸配列とは相同性がある、ＩＬ−１８とその受容体との相互作用を制御・調節する、等の特徴を有するものである。９個もしくは１２個のアミノ酸のアミノ酸からなるペプチドが例示される。
【００１４】
本発明のＩＬ−１８様ペプチドの具体例としては、配列表配列番号１（以下、当該アミノ酸配列からなるペプチドを、後述する由来ファージクローンに基づいて１０８−２ともいう）、配列表配列番号２（以下、当該アミノ酸配列からなるペプチドを、後述する由来ファージクローンに基づいて１０８−４ともいう）、配列表配列番号３（以下、当該アミノ酸配列からなるペプチドを、後述する由来ファージクローンに基づいて１０８−５ともいう）、配列表配列番号４（以下、当該アミノ酸配列からなるペプチドを、後述する由来ファージクローンに基づいて１０８−１３ともいう）、配列表配列番号５（以下、当該アミノ酸配列からなるペプチドを、後述する由来ファージクローンに基づいて１０８−Ｃ７ともいう）、配列表配列番号６（以下、当該アミノ酸配列からなるペプチドを、後述する由来ファージクローンに基づいて１０８−Ｃ２５ともいう）、配列表配列番号７（以下、当該アミノ酸配列からなるペプチドを、後述する由来ファージクローンに基づいて１０８−Ｃ２７ともいう）、等のアミノ酸配列からなるペプチド分子等が挙げられる。尚、各アミノ酸配列中の各記号は前述の定義のとおりである。
【００１５】
本発明のＩＬ−１８様ペプチドは抗ＩＬ−１８抗体と結合する為に必要な立体構造を保持した状態であればその使用形態は特に限定されず、何らかのキャリヤー上か、あるいは何らかの蛋白質に組み込まれた形態であるか、またはペプチド合成等により作成し得るペプチド単独の形態でも使用可能である。より具体的には前述の１０８−２、１０８−４、１０８−５、１０８−１３、１０８−Ｃ７、１０８−Ｃ２５、１０８−Ｃ２７ならびにこれらのペプチドがジーン３蛋白質に組み込まれている態様であるＧ３Ｐ体（それぞれ１０８−２−Ｇ３Ｐ、１０８−４−Ｇ３Ｐ、１０８−５−Ｇ３Ｐ、１０８−１３−Ｇ３Ｐ、１０８−Ｃ７−Ｇ３Ｐ、１０８−Ｃ２５−Ｇ３Ｐ、１０８−Ｃ２７−Ｇ３Ｐともいう。）等があげられる。当該ペプチドは、それぞれのアミノ酸配列情報に基づきその立体構造を保持した状態で使用し、当該立体構造が保持された範囲であれば当該アミノ酸配列を欠失、置換、付加または修飾させてもよい。
【００１６】
本発明のＩＬ−１８様ペプチドは、例えば、ＩＬ−１８−受容体系に関与した分子間の結合を阻止し、且つＩＬ−１８の立体構造を認識することができる抗体（好ましくはモノクローナル抗体）を用いて、１０8種類以上のランダムに並んだ少なくとも９個以上のアミノ酸を有するペプチド分子を提示する、ファージランダムペプチドライブラリーのスクリーニング、ファージクローンの選択、選択したファージクローンの回収、当該ファージからの精製といった一連の工程を行うことによって得ることができる。本発明のＩＬ−１８様ペプチドは、精製した状態のものの他、ペプチドがその表面に提示されたファージとしても使用可能である。
【００１７】
本発明において使用される抗ＩＬ−１８抗体は、ＩＬ−１８−受容体系に関与した分子間の結合を阻害する能力のある抗体であればどのような動物種の抗体でもよく、サブクラスやアイソタイプは限定されない。
ここで、コンフォメーショナルエピトープを認識する抗体とは、エピトープの立体構造を認識する抗体、すなわち、その抗体の抗原結合領域がカウンターパートの立体構造の鋳型となるような抗体をいう。具体的には免疫沈降反応等抗原がネイティブな状態であれば結合できるが、抗原が変性状態にある場合に結合できない抗体のことであり、例えば還元状態下でのウエスタンブロッティング法では抗原と結合できない抗体、またはエピトープの構成アミノ酸配列をもとに合成されたリニアなペプチドには結合できないような抗体等が挙げられる。
【００１８】
本発明において使用される抗ＩＬ−１８抗体の具体例としては、ヒト抗ヒトＩＬ−１８モノクローナル抗体（ｈ１８−１０８）が挙げられる（特願２００３−１２５９４８号）。
当該ｈ１８−１０８はＩＬ−１８とその受容体との結合阻害活性を有する中和抗体であり、ヒト由来の抗体のＦｖドメインをリンカーペプチドでつないだ単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体（特願２００３−１２５９４８号）のことである。
【００１９】
ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体および該抗体フラグメントは、例えば特願２００３−１２５９４８号に記載の方法に従って以下の方法よって作製することができる。
健常人の末梢血Ｂリンパ球よりｍＲＮＡを抽出し、免疫グロブリン遺伝子のＶＨ鎖、ＶＬ鎖を、その両端を規定するプライマー対を用いてＲＴ−ＰＣＲ法により増幅し、多様な配列を有するＨ鎖、Ｌ鎖のＶ領域集団を得る。次に更にペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端を各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅して、Ｈ鎖、Ｌ鎖のＶ領域のランダムな組み合わせによる多様なｓｃＦｖ ＤＮＡ集団を調製する。得られたｓｃＦｖＤＮＡをファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅに組み込み、ｓｃＦｖディスプレイファージライブラリーを作製する。このライブラリーをプラスチックチューブに固相化したＩＬ−１８と反応させ、洗浄により未反応のｓｃＦｖディスプレイファージを除去した後に、ＩＬ−１８と結合しているｓｃＦｖファージクローンを酸で溶出する。分離したファージクローンからｓｃＦｖ ＤＮＡを調製し、これを発現ベクターに組み込み、該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って培養して目的のｓｃＦｖ蛋白のみを得ることができる。
【００２０】
ｓｃＦｖ ＤＮＡの発現方法としては、例えば、大腸菌で発現させることができる。大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列等、発現させるｓｃＦｖを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーターとしては、ｌａｃＺプロモーター、ａｒａＢプロモーター等を挙げることができる。ｓｃＦｖの分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに発現させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Lei, SP., et al. J. Bacteriol., 1987, 169: 4379-4383）を用いるとよい。培養上清中に分泌させるにはＭ１３ファージのｇ３蛋白のシグナル配列を用いることもできる。
【００２１】
前記のように発現させたｓｃＦｖは細胞内外、宿主から分離し均一にまで精製することができる。ここで発現されるｓｃＦｖは、そのＣ末端にＥ tag配列が付加されているので、抗Ｅ tag抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて、容易に短時間で精製することができる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を組み合わせて精製することも可能である。例えば、限外濾過、塩析、ゲル濾過／イオン交換／疎水クロマト等のカラムクロマトグラフィーを組み合わせれば抗体を分離・精製することができる。
【００２２】
次に、本発明のＩＬ−１８様ペプチドの作製で使用するファージランダムペプチドライブラリーは、ファージ表面にランダムなアミノ酸配列を有するペプチド分子が提示されているものであれば、いかなる種類のファージベクターで構築されたものでも使用可能であり、具体的には公知の方法（サイエンス、２４９巻、３８６〜３９０頁、１９９０年発行。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４８，ｐ５８〜７８，１９９５年発行。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１０６３８〜４２および１０６４３〜４７，１９９３年発行。ネイチャー・バイオテクノロジー、１６巻、２７８〜２７０頁、１９９８年発行等）によって作製され得る。ファージ表面に提示されるべく挿入される遺伝子は、９個もしくは１２個のアミノ酸または両端にシステインを有する７個のアミノ酸からなるペプチド分子をコードするものが例示される。さらにランダムなアミノ酸配列を有するペプチド分子はファージの表面に提示されていれば、いかなるファージの構成蛋白質に挿入されていてもよい。例えば、ジーン３蛋白質（例えば、特２０００−２９７０９８参照）あるいはジーン８蛋白質などに挿入されたものが好ましい。ジーン３蛋白質の場合、そのＮ末端のＡｌａとスペイサーであるＧｌｙ-Ｇｌｙ-Ｇｌｙ-Ｓｅｒの間に９個もしくは１２個のランダムに並んだアミノ酸からなるペプチド分子が挿入されているものならば当該挿入されたペプチド分子の両端に延びるアミノ酸配列が、その挿入ペプチド分子の三次構造に及ぼす影響を最小限に抑えることができる。
【００２３】
本発明のＩＬ−１８様ペプチドの製造方法は、前述の抗ＩＬ−１８抗体を用いて、ファージランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることから開始する。スクリーニング法としては抗体をプレート上に固定化して使用する一般的なパンニング方法や、抗体を固定化したアフィニティーカラム法等を使用することができる。また、パンニング-ファージ回収-ファージの増殖-パンニングの工程を２回以上繰り返すことによって、目的のファージクローンを濃縮することができる。このようなスクリーニング法によって抗ＩＬ−１８抗体に結合するペプチドをその表面に提示しているファージクローンを濃縮することができる。通常、このようにして得られたファージクローンは、抗体との結合力の差や保持されているアミノ酸配列の種類によって、いくつかのクローン集団に分類することができる。得られたファージクローンの遺伝子の塩基配列解析はジデオキシ法等の常法により簡単に行うことができる。
【００２４】
本発明のＩＬ−１８様ペプチドは、ＩＬ−１８に対して負の制御を行うことができる。故にＩＬ−１８活性阻害剤として、また、アトピー性皮膚炎などの炎症、免疫異常性疾患等の予防および治療に対して有用である。
本発明の医薬組成物ならびにＩＬ−１８活性阻害剤は、有効成分である本発明のＩＬ−１８様ペプチドを、必要に応じて適宜の医薬的に許容される添加剤（例えば、担体、賦形剤、希釈剤等）等の製薬上必要な成分と混合し、軟膏として皮膚に塗布、または粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤等の態様にて経口的に、あるいは注射剤等の態様にて非経口的に投与することができる。投与量は有効成分の種類（ペプチドの種類）、投与ルート、患者の病状および疾患の種類、体重、年齢、性別等に応じて適宜増減できるが、一般的には成人１日当たりペプチドの量で０．００１〜１０００ｍｇを、1日1回乃至数回に分けて塗布、あるいは投与するのが望ましい。
【実施例】
【００２５】
本発明をより詳細に説明するために、参考例、実施例および実験例を以下に挙げるが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
参考例１
（健常者からのファージライブラリーの構築）
ファージライブラリーの構築は、J. D. Marksら(J. Mol. Biol., 222: 581-597, 1991)により報告されている方法を参考に、健常者２０名由来末梢血由来リンパ球を出発材料に、構築した。構築したＶＨ（γ）−Ｖκ、ＶＨ（γ）−Ｖλ、ＶＨ（μ）−Ｖκ、ＶＨ（μ）−Ｖλの各サブライブラリーはそれぞれ１．１×１０6、２．１×１０8、８．４×１０7、５．３×１０7クローンの多様性を有すると評価された。
【００２６】
参考例２
（パンニング）
ヒトＩＬ―１８は０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 １ｍＬに溶解し、３５ｍｍのディシュ（岩城）に４℃で一晩反応させて固定化した。０．５％ゼラチン／ＰＢＳを用いて２０℃で２時間ブロッキングした後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０ ＰＢＳで６回洗浄した。これに健常人由来の抗体ファージライブラリー（一本鎖抗体提示ファージ液）を０．９ｍＬ（1x1012tu/mL）加え、反応させた。
【００２７】
０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで１０回洗浄した後、１．０ｍＬのグリシン緩衝液（ｐＨ２．２）を加え、ＩＬ−１８と結合する一本鎖抗体提示ファージを溶出させた。溶出したファージは１Ｍ Tris (hydroxymethyl)aminomethane-HCL、ｐＨ９．１を加えてｐＨを調整した後、対数増殖期の大腸菌ＴＧ１に感染させた。感染後のＴＧ１は３０００×ｇ、１０分で遠心分離して、上清を除き、２００μＬの２×ＹＴ培地で懸濁し、ＳＯＢＡＧプレート（２％グルコース、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン含有ＳＯＢプレート）に播き、３０℃のふ卵器中で一晩培養した。生じたコロニーは適量の２×ＹＴ培地を加えスクレイバー（Costar）を使って懸濁、回収した。
【００２８】
このＴＧ１液５０μＬを、３０ｍＬの２×ＹＴＡＧ培地に植え、ヘルパーファージを用いてレスキューし、スクリーニング後のファージライブラリーを調製した。健常人由来ファージライブラリーＶＨ（γ）−Ｖκ、ＶＨ（γ）−Ｖλ、ＶＨ（μ）−Ｖκ、ＶＨ（μ）−Ｖλ、それぞれについて前述のＩＬ−１８固定化プレートを用いてパンニングを計４回行った。４回目のパンニング後に、ＳＯＢＡＧプレートから任意にクローンを抽出し、ｓｃＦｖの発現の確認およびＩＬ−１８ＥＬＩＳＡによる特異性の確認と塩基配列の解析を行った、
参考例３
（スクリーニングＩＬ−１８ ＥＬＩＳＡ）
分離したクローンのスクリーニングのためのＥＬＩＳＡは以下のように行った。ヒトＩＬ−１８およびヒトＭＩＰ−１αをＥＬＩＳＡプレートに固定化してスクリーニングに用いた。２μｇ／ｍＬのヒトＩＬ−１８あるいはヒトＭＩＰ−１α ２．５μｇ／ｍＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を４０μＬ／ｗｅｌｌ ＥＬＩＳＡプレート（Nune）に入れ、４℃で１６時間静置し、固定化した。固定化プレートは、０．５％ＢＳＡ、０．５％ゼラチンおよび５℃スキムミルクを含むＰＢＳ４００μＬ／ｗｅｌｌをＥＬＩＳＡプレートに入れ、４℃で２時間静置し、ブロッキングを行った。
【００２９】
ｓｃＦｖ提示ファージを含む試料液を４０μＬ／ｗｅｌｌを入れて反応させた後、試料液を捨て洗浄液で５回洗った。ビオチン標識した抗Ｍ１３モノクローナル抗体（Pharmacia biotech）と反応させ、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）標識した抗マウスＩｇＧ抗体と反応させた。洗浄液で５回洗った後、発色基質液［（1g/mL p-nitrophenyl phoophato）(Wako)、１０％ジエタノールアミン(Wako)を含むPBS溶液］を５０μＬ／ｗｅｌｌ入れ、遮光し、室温〜３７℃で、５〜１０分発色させた。マルチプレートオートリーダーＮｊ−２００１(Inter Med)で４０５ｎｍの吸光度を測定した結果、評価したクローン全てが、ＩＬ−１８に特異的であることが確認できた。
【００３０】
参考例４
（ヒト由来抗ＩＬ−１８ ｓｃＦｖの発現と精製）
前記参考例２、３で単離したヒトＩＬ−１８に反応するｓｃＦｖクローン＃１０からプラスミドＤＮＡを回収して、常法に従って大腸菌ＨＢ１２５１を形質転換した。２％グルコースを含む２×ＹＴ培地でこれらの大腸菌を一夜前培養後、グルコースフリーの２×ＹＴ培地に一部移植し、終濃度１ｍＬ ＩＰＴＧを加えて更に一夜培養してｓｃＦｖの発現誘導を行った。培養終了後菌体を遠心回収し、１ｍＬ ＥＤＴＡを含むＰＢＳに懸濁して氷中に３０分菌体を放置した。次いで８，９００×ｇで３０分間遠心し、上清を回収して０．４５μｍフィルター濾過後、ペリプラズム画分からのｓｃＦｖの精製出発材料とした。
【００３１】
このようにして調製した精製の出発材料を、抗Ｅｔａｇ抗体を用いたアフニィーティークロマトグラフィーで常法に従って精製した。ＰＢＳで透析後、エンドトキシン除去カラム Ｄｏｔｏｘｉ−ｇｅｌ（PIERCE社）で添付のプロトコルに従いエンドトキンを除去した。分子量カット１０，０００のCentricon (Amicon 社)で濃縮後、０．４５μｍフィルター濾過して精製標品とした。
【００３２】
実施例１
（１）ファージ・デイスプレイ・ライブラリーは市販のものを使用した（ＮＥＢ社；Ｐｈ．Ｄ．-Ｃ７ＣおよびＰｈ．Ｄ．-１２）。マイクロパンニングは福本らの報告（ネイチャー・バイオテクノロジー、１６巻、２７８〜２７０頁、１９９８年発行）に準じて行った。
【００３３】
続いて、上記の参考例に従って得た抗ヒトＩＬ−１８モノクローナル抗体（ｈ１８−１０８）を用いて、ファージランダムペプチドライブラリーのパンニングを行った。当該抗ＩＬ−１８抗体はファージを選択するための鋳型として使用した。ライブラリーをスクリーニングして、抗ＩＬ−１８抗体に結合するファージクローンを単離した。
抗ＩＬ−１８抗体をイムノチューブ（ヌンク社製）に１０μｇコーテイングしたものに、先で調製したファージライブラリー〔５×１０12Transducing Unit（以下、ＴＵ）〕を室温で１時間反応させた（パンニング）。未結合のファージを、０．５％トゥイーン２０を含むトリス塩酸緩衝生理食塩液（ＴＢＳ；５０ｍＭトリス塩酸、０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有、ｐＨ７．５）で洗浄後に、０．１Ｎ塩酸−グリシン緩衝液（ｐＨ２．２）を用いて、各種抗ＩＬ−１８抗体と結合したファージを溶出した。回収後に１Ｍトリス塩酸（ｐＨ９．１）で中和した。得られたファージを大腸菌ＥＲ２７３８に感染・増殖させた。パンニングに用いる各種抗ＩＬ−１８抗体量を５μｇに減し同じ操作を繰り返し、より強く特異的に抗ＩＬ−１８抗体と結合するファージクローンを選別した。パンニングは前述の２種類のライブラリーを用いて別々に行った。
【００３４】
それぞれのパンニングで得られたファージクローンについてＥＬＩＳＡ法による一次スクリーニングを行った。抗Ｅ−ｔａｇ抗体８０ｎｇ／４０μｌ／穴をコートしたＥＬＩＳＡ用プレート（ヌンク社製）を０．５％ＢＳＡでコートした後、抗ＩＬ−１８抗体 １００ｎｇ／８０μｌ／穴を反応させた。０．１％トウイーン２０を含むＰＢＳでプレートを洗浄し、各種ファージクローン８×１０10ビリオン／４０μｌ／穴およびビオチン化抗Ｍ１３モノクローナル抗体（ファルマシア社製）を添加した。１００００分の１に希釈したアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）標識ストレプトアビジン（ベクターラボ社製）を室温で１時間反応させ、洗浄後に基質であるｐ-ニトロフェニルリン酸ナトリウム６水和物（和光純薬）を添加し、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。７個のクローンが抗ＩＬ−１８抗体と特異的に結合した。
【００３５】
（２） パンニングにより選択したファージに挿入されているＤＮＡの配列解析ジーン３蛋白質に組み込まれた各種ペプチドのＤＮＡ配列をＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystems社）を用いて解析した。プライマーとして、配列表配列番号８の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた。
その結果、ジーン３蛋白質のアミノ酸配列のＮ末端のＡｌａとスペイサーであるＧｌｙ-Ｇｌｙ-Ｇｌｙ-Ｓｅｒの間に挿入されているペプチドは、すべて異なったアミノ酸配列を有しており、配列表配列番号１、配列表配列番号２、配列表配列番号３、配列表配列番号４、配列表配列番号５、配列表配列番号６、配列表配列番号７で示される７種類に分類できた。
【００３６】
同定された７種類のペプチドのアミノ酸配列には明確な共通配列が保存されていた。さらにCLUSTAL W ver. 3.1によりこれらのペプチドとＩＬ−１８とのホモロジー検索を行った結果、一次配列に顕著な類似性を示した。
実験例１
抗ＩＬ−１８抗体（h18-108）、および抗原特異性が未知の抗体（ｓｃＦｖ：m18-92）を標品として用いて、実施例１で得られたファージクローンとの反応性を確認した。分析は実施例１のＥＬＩＳＡ法によった。その結果、いずれのクローンとも抗ＩＬ−１８抗体と特異的に結合し、m18-92抗体とは反応しなかった。結果を図１に示す。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明のＩＬ−１８様ペプチドは、ＩＬ−１８活性阻害剤として、またアトピー性皮膚炎などの炎症性疾患、免疫異常疾患等の予防および治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図中（１）および（２）は、ＩＬ−１８抗体（h18-108）、および抗原特異性が未知の抗体（ｓｃＦｖ：m18-92）を標準品として用いて、実施例１で得られたファージクローンとの反応性を確認した結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明はＩＬ−１８シグナルを阻害する抗ＩＬ-１８抗体と結合し得るＩＬ−１８様ペプチド、その製造方法ならびにその用途に関する。このペプチドは、ＩＬ−１８が原因となって惹起される炎症、免疫異常性疾患の治療薬として期待される。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインＩＬ−１８（インターロイキン１８）はインターフェロン−ガンマ（IFN-γ）誘導因子として発見されたが、その後ＩｇＥ抗体が介在するアレルギー反応や、ＩｇＥが介在しないアトピー性皮膚炎や気管支喘息の悪性化の原因であること、またこの過剰産生が肝臓や腸管で重篤な臓器障害が起こることが明らかとなっている。また、このような疾患以外にも、様々な疾患において、ＩＬ−１８の病態への指摘されている（非特許文献１）。
【０００３】
最近、受容体−リガンド系における相互作用部位を同定する手段として、ファージランダムペプチドライブラリーを用いたスクリーニング法が注目されている。これはファージの構成蛋白質であるｐ３分子をコードする遺伝子（ジーン３）にランダムなアミノ酸配列を有するペプチド分子をコードする遺伝子を挿入することにより、当該ペプチド分子を含んだ形のｐ３分子（ジーン３蛋白質とランダムなアミノ酸配列を有するペプチド分子との融合体。以下、Ｇ３Ｐ体とも呼ぶ）をＭ１３ファージ（繊維状一本鎖ＤＮＡのファージ）上に発現させ、ファージランダムペプチドライブラリーを作成し、パンニング等で目的とするペプチド分子を発現しているファージをスクリーニングし、当該ファージのジーン３遺伝子部分の塩基配列解析を行って、相互作用部位を決定する方法である。
【０００４】
この方法を用いて、抗ｐ５３モノクローナル抗体によるｐ５３分子上のエピトープの決定（ただし、ｐ５３と相同性が高い）、抗ｂＥＧＦ抗体によりスクリーニングされたｂＥＧＦ類似体がｂＦＧＦとその受容体ＦＧＦＲ−１の結合を阻害したこと、あるいは抗アセチルコリン受容体エピトープ抗体と結合するペプチド配列の発見（当該受容体とは相同性がないが、アセチルコリンと結合するか否かは言及せず）等が報告されている。
【０００５】
また、本発明者らはこの手法をさらに発展させて、ＣＴＬＡ−４に関して、抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体を用いて、当該抗体が結合する標的分子の立体構造をアミノ酸の一次配列に依存せずに模倣する分子であり、且つ受容体−リガンドの相互作用を制御できるような分子を得る方法を開発した（非特許文献２、３）。
【非特許文献１】J. Exp. Med. 1994(4), 535-545, 2004
【非特許文献２】Nature biotech. 16, 267-270, 1998
【非特許文献３】J. Immunol. 161: 6622-6628, 1998
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
以上のように、ＩＬ−１８の産生あるいは活性の制御は、このようなＩＬ−１８依存性のアトピー性皮膚炎の治療法として、あるいはＩＬ−１８の過剰産生が原因となり疾患の発症が誘導あるいは憎悪するＴｈ１病の治療法として、極めて重要である。それゆえ、ＩＬ−１８の生理活性を阻害するＩＬ−１８様ペプチドを開発することができれば、ＩＬ−１８の関与する多くの疾患の有効な治療手段になることが期待される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、生体反応を制御するレセプターとリガンドの結合によるシグナルの伝達を阻害し、かつ当該分子の立体構造を認識するモノクローナル抗体を用いて、ファージペプチドライブラリーより得られる、目的タンパク分子の３次構造を模倣したペプチド配列をもつ免疫制御分子が単離できるという本発明者らの知見（非特許文献２および３）に基づき、上述の課題を解決するために、より低分子のＩＬ−１８阻害剤としてＭ１３ファージライブラリー（PhD-12およびPhD-C7, Biolabs. USA）を用いたペプチド開発を試み、数種の抗ＩＬ−１８抗体結合ファージクローンを得ることに成功し、次いでそれらファージクローンに挿入されたペプチドは共通のアミノ酸配列部位を有することを見いだし、それらの知見に基づいて本発明を完成したものである。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の１）〜９）の通りである。
１）ＩＬ−１８シグナルを阻害する抗ＩＬ−１８抗体と結合し得るＩＬ−１８様ペプチド。
２）ＩＬ−１８のアミノ酸配列と相同性のある上記１）記載のＩＬ−１８様ペプチド。
３）ＩＬ−１８と立体構造が類似している、および／またはＩＬ−１８とその受容体との相互作用を制御・調節する上記１）または２）記載のＩＬ−１８様ペプチド。
【０００９】
４）９残基もしくは１２残基のアミノ酸配列、または両端にシステインを有する７残基のアミノ酸配列を有するポリペプチドである上記１）記載のＩＬ−１８様ペプチド。
５）配列表配列番号１〜７のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドである上記１）記載のＩＬ−１８様ペプチド。
６）上記１）〜５）のいずれかに記載のＩＬ−１８様ペプチドとジーン３蛋白質との融合体。
【００１０】
７）上記１）〜５）のいずれかに記載のＩＬ−１８様ペプチド、あるいは上記６）記載のＩＬ−１８様ペプチドとジーン３蛋白質との融合体を有効成分として含有してなる医薬組成物。
８）上記１）〜５）のいずれかに記載のＩＬ−１８様ペプチド、あるいは上記６）記載のＩＬ−１８様ペプチドとジーン３蛋白質との融合体を有効成分として含有してなる免疫疾患治療剤。
【００１１】
９）抗ＩＬ−１８抗体を用いて、ファージランダムペプチドライブラリーをスクリーニングし、当該抗ＩＬ−１８抗体と結合し得るＩＬ−１８様ペプチドを発現しているファージクローンを単離することを特徴とする、抗ＩＬ−１８抗体と結合し得るＩＬ−１８様ペプチドの製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のＩＬ−１８様ペプチドは、アトピー性皮膚炎などに密接に関与しているＩＬ−１８の、受容体との相互作用を制御・調節することが可能であり、生理活性阻害剤として有用である。免疫異常性疾患におけるＩＬ−１８の作用を考えると、本発明のＩＬ−１８様ペプチドは、各種炎症性の疾患に適用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明において抗ＩＬ−１８抗体と結合するＩＬ−１８様ペプチドとは、抗ＩＬ−１８抗体と結合する、ＩＬ−１８と立体構造が非常によく類似している、ＩＬ−１８のアミノ酸配列とは相同性がある、ＩＬ−１８とその受容体との相互作用を制御・調節する、等の特徴を有するものである。９個もしくは１２個のアミノ酸のアミノ酸からなるペプチドが例示される。
【００１４】
本発明のＩＬ−１８様ペプチドの具体例としては、配列表配列番号１（以下、当該アミノ酸配列からなるペプチドを、後述する由来ファージクローンに基づいて１０８−２ともいう）、配列表配列番号２（以下、当該アミノ酸配列からなるペプチドを、後述する由来ファージクローンに基づいて１０８−４ともいう）、配列表配列番号３（以下、当該アミノ酸配列からなるペプチドを、後述する由来ファージクローンに基づいて１０８−５ともいう）、配列表配列番号４（以下、当該アミノ酸配列からなるペプチドを、後述する由来ファージクローンに基づいて１０８−１３ともいう）、配列表配列番号５（以下、当該アミノ酸配列からなるペプチドを、後述する由来ファージクローンに基づいて１０８−Ｃ７ともいう）、配列表配列番号６（以下、当該アミノ酸配列からなるペプチドを、後述する由来ファージクローンに基づいて１０８−Ｃ２５ともいう）、配列表配列番号７（以下、当該アミノ酸配列からなるペプチドを、後述する由来ファージクローンに基づいて１０８−Ｃ２７ともいう）、等のアミノ酸配列からなるペプチド分子等が挙げられる。尚、各アミノ酸配列中の各記号は前述の定義のとおりである。
【００１５】
本発明のＩＬ−１８様ペプチドは抗ＩＬ−１８抗体と結合する為に必要な立体構造を保持した状態であればその使用形態は特に限定されず、何らかのキャリヤー上か、あるいは何らかの蛋白質に組み込まれた形態であるか、またはペプチド合成等により作成し得るペプチド単独の形態でも使用可能である。より具体的には前述の１０８−２、１０８−４、１０８−５、１０８−１３、１０８−Ｃ７、１０８−Ｃ２５、１０８−Ｃ２７ならびにこれらのペプチドがジーン３蛋白質に組み込まれている態様であるＧ３Ｐ体（それぞれ１０８−２−Ｇ３Ｐ、１０８−４−Ｇ３Ｐ、１０８−５−Ｇ３Ｐ、１０８−１３−Ｇ３Ｐ、１０８−Ｃ７−Ｇ３Ｐ、１０８−Ｃ２５−Ｇ３Ｐ、１０８−Ｃ２７−Ｇ３Ｐともいう。）等があげられる。当該ペプチドは、それぞれのアミノ酸配列情報に基づきその立体構造を保持した状態で使用し、当該立体構造が保持された範囲であれば当該アミノ酸配列を欠失、置換、付加または修飾させてもよい。
【００１６】
本発明のＩＬ−１８様ペプチドは、例えば、ＩＬ−１８−受容体系に関与した分子間の結合を阻止し、且つＩＬ−１８の立体構造を認識することができる抗体（好ましくはモノクローナル抗体）を用いて、１０8種類以上のランダムに並んだ少なくとも９個以上のアミノ酸を有するペプチド分子を提示する、ファージランダムペプチドライブラリーのスクリーニング、ファージクローンの選択、選択したファージクローンの回収、当該ファージからの精製といった一連の工程を行うことによって得ることができる。本発明のＩＬ−１８様ペプチドは、精製した状態のものの他、ペプチドがその表面に提示されたファージとしても使用可能である。
【００１７】
本発明において使用される抗ＩＬ−１８抗体は、ＩＬ−１８−受容体系に関与した分子間の結合を阻害する能力のある抗体であればどのような動物種の抗体でもよく、サブクラスやアイソタイプは限定されない。
ここで、コンフォメーショナルエピトープを認識する抗体とは、エピトープの立体構造を認識する抗体、すなわち、その抗体の抗原結合領域がカウンターパートの立体構造の鋳型となるような抗体をいう。具体的には免疫沈降反応等抗原がネイティブな状態であれば結合できるが、抗原が変性状態にある場合に結合できない抗体のことであり、例えば還元状態下でのウエスタンブロッティング法では抗原と結合できない抗体、またはエピトープの構成アミノ酸配列をもとに合成されたリニアなペプチドには結合できないような抗体等が挙げられる。
【００１８】
本発明において使用される抗ＩＬ−１８抗体の具体例としては、ヒト抗ヒトＩＬ−１８モノクローナル抗体（ｈ１８−１０８）が挙げられる（特願２００３−１２５９４８号）。
当該ｈ１８−１０８はＩＬ−１８とその受容体との結合阻害活性を有する中和抗体であり、ヒト由来の抗体のＦｖドメインをリンカーペプチドでつないだ単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体（特願２００３−１２５９４８号）のことである。
【００１９】
ヒト抗ヒトＩＬ−１８抗体および該抗体フラグメントは、例えば特願２００３−１２５９４８号に記載の方法に従って以下の方法よって作製することができる。
健常人の末梢血Ｂリンパ球よりｍＲＮＡを抽出し、免疫グロブリン遺伝子のＶＨ鎖、ＶＬ鎖を、その両端を規定するプライマー対を用いてＲＴ−ＰＣＲ法により増幅し、多様な配列を有するＨ鎖、Ｌ鎖のＶ領域集団を得る。次に更にペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端を各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅して、Ｈ鎖、Ｌ鎖のＶ領域のランダムな組み合わせによる多様なｓｃＦｖ ＤＮＡ集団を調製する。得られたｓｃＦｖＤＮＡをファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅに組み込み、ｓｃＦｖディスプレイファージライブラリーを作製する。このライブラリーをプラスチックチューブに固相化したＩＬ−１８と反応させ、洗浄により未反応のｓｃＦｖディスプレイファージを除去した後に、ＩＬ−１８と結合しているｓｃＦｖファージクローンを酸で溶出する。分離したファージクローンからｓｃＦｖ ＤＮＡを調製し、これを発現ベクターに組み込み、該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って培養して目的のｓｃＦｖ蛋白のみを得ることができる。
【００２０】
ｓｃＦｖ ＤＮＡの発現方法としては、例えば、大腸菌で発現させることができる。大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列等、発現させるｓｃＦｖを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーターとしては、ｌａｃＺプロモーター、ａｒａＢプロモーター等を挙げることができる。ｓｃＦｖの分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに発現させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Lei, SP., et al. J. Bacteriol., 1987, 169: 4379-4383）を用いるとよい。培養上清中に分泌させるにはＭ１３ファージのｇ３蛋白のシグナル配列を用いることもできる。
【００２１】
前記のように発現させたｓｃＦｖは細胞内外、宿主から分離し均一にまで精製することができる。ここで発現されるｓｃＦｖは、そのＣ末端にＥ tag配列が付加されているので、抗Ｅ tag抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて、容易に短時間で精製することができる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を組み合わせて精製することも可能である。例えば、限外濾過、塩析、ゲル濾過／イオン交換／疎水クロマト等のカラムクロマトグラフィーを組み合わせれば抗体を分離・精製することができる。
【００２２】
次に、本発明のＩＬ−１８様ペプチドの作製で使用するファージランダムペプチドライブラリーは、ファージ表面にランダムなアミノ酸配列を有するペプチド分子が提示されているものであれば、いかなる種類のファージベクターで構築されたものでも使用可能であり、具体的には公知の方法（サイエンス、２４９巻、３８６〜３９０頁、１９９０年発行。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４８，ｐ５８〜７８，１９９５年発行。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，１０６３８〜４２および１０６４３〜４７，１９９３年発行。ネイチャー・バイオテクノロジー、１６巻、２７８〜２７０頁、１９９８年発行等）によって作製され得る。ファージ表面に提示されるべく挿入される遺伝子は、９個もしくは１２個のアミノ酸または両端にシステインを有する７個のアミノ酸からなるペプチド分子をコードするものが例示される。さらにランダムなアミノ酸配列を有するペプチド分子はファージの表面に提示されていれば、いかなるファージの構成蛋白質に挿入されていてもよい。例えば、ジーン３蛋白質（例えば、特２０００−２９７０９８参照）あるいはジーン８蛋白質などに挿入されたものが好ましい。ジーン３蛋白質の場合、そのＮ末端のＡｌａとスペイサーであるＧｌｙ-Ｇｌｙ-Ｇｌｙ-Ｓｅｒの間に９個もしくは１２個のランダムに並んだアミノ酸からなるペプチド分子が挿入されているものならば当該挿入されたペプチド分子の両端に延びるアミノ酸配列が、その挿入ペプチド分子の三次構造に及ぼす影響を最小限に抑えることができる。
【００２３】
本発明のＩＬ−１８様ペプチドの製造方法は、前述の抗ＩＬ−１８抗体を用いて、ファージランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることから開始する。スクリーニング法としては抗体をプレート上に固定化して使用する一般的なパンニング方法や、抗体を固定化したアフィニティーカラム法等を使用することができる。また、パンニング-ファージ回収-ファージの増殖-パンニングの工程を２回以上繰り返すことによって、目的のファージクローンを濃縮することができる。このようなスクリーニング法によって抗ＩＬ−１８抗体に結合するペプチドをその表面に提示しているファージクローンを濃縮することができる。通常、このようにして得られたファージクローンは、抗体との結合力の差や保持されているアミノ酸配列の種類によって、いくつかのクローン集団に分類することができる。得られたファージクローンの遺伝子の塩基配列解析はジデオキシ法等の常法により簡単に行うことができる。
【００２４】
本発明のＩＬ−１８様ペプチドは、ＩＬ−１８に対して負の制御を行うことができる。故にＩＬ−１８活性阻害剤として、また、アトピー性皮膚炎などの炎症、免疫異常性疾患等の予防および治療に対して有用である。
本発明の医薬組成物ならびにＩＬ−１８活性阻害剤は、有効成分である本発明のＩＬ−１８様ペプチドを、必要に応じて適宜の医薬的に許容される添加剤（例えば、担体、賦形剤、希釈剤等）等の製薬上必要な成分と混合し、軟膏として皮膚に塗布、または粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤等の態様にて経口的に、あるいは注射剤等の態様にて非経口的に投与することができる。投与量は有効成分の種類（ペプチドの種類）、投与ルート、患者の病状および疾患の種類、体重、年齢、性別等に応じて適宜増減できるが、一般的には成人１日当たりペプチドの量で０．００１〜１０００ｍｇを、1日1回乃至数回に分けて塗布、あるいは投与するのが望ましい。
【実施例】
【００２５】
本発明をより詳細に説明するために、参考例、実施例および実験例を以下に挙げるが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
参考例１
（健常者からのファージライブラリーの構築）
ファージライブラリーの構築は、J. D. Marksら(J. Mol. Biol., 222: 581-597, 1991)により報告されている方法を参考に、健常者２０名由来末梢血由来リンパ球を出発材料に、構築した。構築したＶＨ（γ）−Ｖκ、ＶＨ（γ）−Ｖλ、ＶＨ（μ）−Ｖκ、ＶＨ（μ）−Ｖλの各サブライブラリーはそれぞれ１．１×１０6、２．１×１０8、８．４×１０7、５．３×１０7クローンの多様性を有すると評価された。
【００２６】
参考例２
（パンニング）
ヒトＩＬ―１８は０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 １ｍＬに溶解し、３５ｍｍのディシュ（岩城）に４℃で一晩反応させて固定化した。０．５％ゼラチン／ＰＢＳを用いて２０℃で２時間ブロッキングした後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０ ＰＢＳで６回洗浄した。これに健常人由来の抗体ファージライブラリー（一本鎖抗体提示ファージ液）を０．９ｍＬ（1x1012tu/mL）加え、反応させた。
【００２７】
０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳで１０回洗浄した後、１．０ｍＬのグリシン緩衝液（ｐＨ２．２）を加え、ＩＬ−１８と結合する一本鎖抗体提示ファージを溶出させた。溶出したファージは１Ｍ Tris (hydroxymethyl)aminomethane-HCL、ｐＨ９．１を加えてｐＨを調整した後、対数増殖期の大腸菌ＴＧ１に感染させた。感染後のＴＧ１は３０００×ｇ、１０分で遠心分離して、上清を除き、２００μＬの２×ＹＴ培地で懸濁し、ＳＯＢＡＧプレート（２％グルコース、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン含有ＳＯＢプレート）に播き、３０℃のふ卵器中で一晩培養した。生じたコロニーは適量の２×ＹＴ培地を加えスクレイバー（Costar）を使って懸濁、回収した。
【００２８】
このＴＧ１液５０μＬを、３０ｍＬの２×ＹＴＡＧ培地に植え、ヘルパーファージを用いてレスキューし、スクリーニング後のファージライブラリーを調製した。健常人由来ファージライブラリーＶＨ（γ）−Ｖκ、ＶＨ（γ）−Ｖλ、ＶＨ（μ）−Ｖκ、ＶＨ（μ）−Ｖλ、それぞれについて前述のＩＬ−１８固定化プレートを用いてパンニングを計４回行った。４回目のパンニング後に、ＳＯＢＡＧプレートから任意にクローンを抽出し、ｓｃＦｖの発現の確認およびＩＬ−１８ＥＬＩＳＡによる特異性の確認と塩基配列の解析を行った、
参考例３
（スクリーニングＩＬ−１８ ＥＬＩＳＡ）
分離したクローンのスクリーニングのためのＥＬＩＳＡは以下のように行った。ヒトＩＬ−１８およびヒトＭＩＰ−１αをＥＬＩＳＡプレートに固定化してスクリーニングに用いた。２μｇ／ｍＬのヒトＩＬ−１８あるいはヒトＭＩＰ−１α ２．５μｇ／ｍＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を４０μＬ／ｗｅｌｌ ＥＬＩＳＡプレート（Nune）に入れ、４℃で１６時間静置し、固定化した。固定化プレートは、０．５％ＢＳＡ、０．５％ゼラチンおよび５℃スキムミルクを含むＰＢＳ４００μＬ／ｗｅｌｌをＥＬＩＳＡプレートに入れ、４℃で２時間静置し、ブロッキングを行った。
【００２９】
ｓｃＦｖ提示ファージを含む試料液を４０μＬ／ｗｅｌｌを入れて反応させた後、試料液を捨て洗浄液で５回洗った。ビオチン標識した抗Ｍ１３モノクローナル抗体（Pharmacia biotech）と反応させ、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）標識した抗マウスＩｇＧ抗体と反応させた。洗浄液で５回洗った後、発色基質液［（1g/mL p-nitrophenyl phoophato）(Wako)、１０％ジエタノールアミン(Wako)を含むPBS溶液］を５０μＬ／ｗｅｌｌ入れ、遮光し、室温〜３７℃で、５〜１０分発色させた。マルチプレートオートリーダーＮｊ−２００１(Inter Med)で４０５ｎｍの吸光度を測定した結果、評価したクローン全てが、ＩＬ−１８に特異的であることが確認できた。
【００３０】
参考例４
（ヒト由来抗ＩＬ−１８ ｓｃＦｖの発現と精製）
前記参考例２、３で単離したヒトＩＬ−１８に反応するｓｃＦｖクローン＃１０からプラスミドＤＮＡを回収して、常法に従って大腸菌ＨＢ１２５１を形質転換した。２％グルコースを含む２×ＹＴ培地でこれらの大腸菌を一夜前培養後、グルコースフリーの２×ＹＴ培地に一部移植し、終濃度１ｍＬ ＩＰＴＧを加えて更に一夜培養してｓｃＦｖの発現誘導を行った。培養終了後菌体を遠心回収し、１ｍＬ ＥＤＴＡを含むＰＢＳに懸濁して氷中に３０分菌体を放置した。次いで８，９００×ｇで３０分間遠心し、上清を回収して０．４５μｍフィルター濾過後、ペリプラズム画分からのｓｃＦｖの精製出発材料とした。
【００３１】
このようにして調製した精製の出発材料を、抗Ｅｔａｇ抗体を用いたアフニィーティークロマトグラフィーで常法に従って精製した。ＰＢＳで透析後、エンドトキシン除去カラム Ｄｏｔｏｘｉ−ｇｅｌ（PIERCE社）で添付のプロトコルに従いエンドトキンを除去した。分子量カット１０，０００のCentricon (Amicon 社)で濃縮後、０．４５μｍフィルター濾過して精製標品とした。
【００３２】
実施例１
（１）ファージ・デイスプレイ・ライブラリーは市販のものを使用した（ＮＥＢ社；Ｐｈ．Ｄ．-Ｃ７ＣおよびＰｈ．Ｄ．-１２）。マイクロパンニングは福本らの報告（ネイチャー・バイオテクノロジー、１６巻、２７８〜２７０頁、１９９８年発行）に準じて行った。
【００３３】
続いて、上記の参考例に従って得た抗ヒトＩＬ−１８モノクローナル抗体（ｈ１８−１０８）を用いて、ファージランダムペプチドライブラリーのパンニングを行った。当該抗ＩＬ−１８抗体はファージを選択するための鋳型として使用した。ライブラリーをスクリーニングして、抗ＩＬ−１８抗体に結合するファージクローンを単離した。
抗ＩＬ−１８抗体をイムノチューブ（ヌンク社製）に１０μｇコーテイングしたものに、先で調製したファージライブラリー〔５×１０12Transducing Unit（以下、ＴＵ）〕を室温で１時間反応させた（パンニング）。未結合のファージを、０．５％トゥイーン２０を含むトリス塩酸緩衝生理食塩液（ＴＢＳ；５０ｍＭトリス塩酸、０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有、ｐＨ７．５）で洗浄後に、０．１Ｎ塩酸−グリシン緩衝液（ｐＨ２．２）を用いて、各種抗ＩＬ−１８抗体と結合したファージを溶出した。回収後に１Ｍトリス塩酸（ｐＨ９．１）で中和した。得られたファージを大腸菌ＥＲ２７３８に感染・増殖させた。パンニングに用いる各種抗ＩＬ−１８抗体量を５μｇに減し同じ操作を繰り返し、より強く特異的に抗ＩＬ−１８抗体と結合するファージクローンを選別した。パンニングは前述の２種類のライブラリーを用いて別々に行った。
【００３４】
それぞれのパンニングで得られたファージクローンについてＥＬＩＳＡ法による一次スクリーニングを行った。抗Ｅ−ｔａｇ抗体８０ｎｇ／４０μｌ／穴をコートしたＥＬＩＳＡ用プレート（ヌンク社製）を０．５％ＢＳＡでコートした後、抗ＩＬ−１８抗体 １００ｎｇ／８０μｌ／穴を反応させた。０．１％トウイーン２０を含むＰＢＳでプレートを洗浄し、各種ファージクローン８×１０10ビリオン／４０μｌ／穴およびビオチン化抗Ｍ１３モノクローナル抗体（ファルマシア社製）を添加した。１００００分の１に希釈したアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）標識ストレプトアビジン（ベクターラボ社製）を室温で１時間反応させ、洗浄後に基質であるｐ-ニトロフェニルリン酸ナトリウム６水和物（和光純薬）を添加し、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。７個のクローンが抗ＩＬ−１８抗体と特異的に結合した。
【００３５】
（２） パンニングにより選択したファージに挿入されているＤＮＡの配列解析ジーン３蛋白質に組み込まれた各種ペプチドのＤＮＡ配列をＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystems社）を用いて解析した。プライマーとして、配列表配列番号８の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを用いた。
その結果、ジーン３蛋白質のアミノ酸配列のＮ末端のＡｌａとスペイサーであるＧｌｙ-Ｇｌｙ-Ｇｌｙ-Ｓｅｒの間に挿入されているペプチドは、すべて異なったアミノ酸配列を有しており、配列表配列番号１、配列表配列番号２、配列表配列番号３、配列表配列番号４、配列表配列番号５、配列表配列番号６、配列表配列番号７で示される７種類に分類できた。
【００３６】
同定された７種類のペプチドのアミノ酸配列には明確な共通配列が保存されていた。さらにCLUSTAL W ver. 3.1によりこれらのペプチドとＩＬ−１８とのホモロジー検索を行った結果、一次配列に顕著な類似性を示した。
実験例１
抗ＩＬ−１８抗体（h18-108）、および抗原特異性が未知の抗体（ｓｃＦｖ：m18-92）を標品として用いて、実施例１で得られたファージクローンとの反応性を確認した。分析は実施例１のＥＬＩＳＡ法によった。その結果、いずれのクローンとも抗ＩＬ−１８抗体と特異的に結合し、m18-92抗体とは反応しなかった。結果を図１に示す。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明のＩＬ−１８様ペプチドは、ＩＬ−１８活性阻害剤として、またアトピー性皮膚炎などの炎症性疾患、免疫異常疾患等の予防および治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図中（１）および（２）は、ＩＬ−１８抗体（h18-108）、および抗原特異性が未知の抗体（ｓｃＦｖ：m18-92）を標準品として用いて、実施例１で得られたファージクローンとの反応性を確認した結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−１８シグナルを阻害する抗ＩＬ−１８抗体と結合し得るＩＬ−１８様ペプチ。
【請求項２】
ＩＬ−１８のアミノ酸配列と相同性のある請求項１記載のＩＬ−１８様ペプチド。
【請求項３】
ＩＬ−１８と立体構造が類似している、および／または、ＩＬ−１８とその受容体との相互作用を制御・調節する請求項１または２記載のＩＬ−１８様ペプチド。
【請求項４】
９残基もしくは１２残基のアミノ酸配列、または両端にシステインを有する７残基のアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項１記載のＩＬ−１８様ペプチド。
【請求項５】
配列表配列番号（１）〜（７）のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項１記載のＩＬ−１８様ペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のＩＬ−１８様ペプチドとジーン３蛋白質との融合体。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載のＩＬ−１８様ペプチド、あるいは請求項６記載のＩＬ−１８様ペプチドとジーン３蛋白質との融合体を有効成分として含有してなる医薬組成物。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載のＩＬ−１８様ペプチド、あるいは請求項６記載のＩＬ−１８様ペプチドとジーン３蛋白質との融合体を有効成分として含有する免疫疾患治療剤。
【請求項９】
抗ＩＬ−１８抗体を用いて、ファージランダムペプチドライブラリーをスクリーニングし、当該抗ＩＬ−１８抗体と結合し得るＩＬ−１８様ペプチドを発現しているファージクローンを単離することを特徴とする、抗ＩＬ−１８抗体と結合し得るＩＬ−１８様ペプチドの製造方法。
【請求項１】
ＩＬ−１８シグナルを阻害する抗ＩＬ−１８抗体と結合し得るＩＬ−１８様ペプチ。
【請求項２】
ＩＬ−１８のアミノ酸配列と相同性のある請求項１記載のＩＬ−１８様ペプチド。
【請求項３】
ＩＬ−１８と立体構造が類似している、および／または、ＩＬ−１８とその受容体との相互作用を制御・調節する請求項１または２記載のＩＬ−１８様ペプチド。
【請求項４】
９残基もしくは１２残基のアミノ酸配列、または両端にシステインを有する７残基のアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項１記載のＩＬ−１８様ペプチド。
【請求項５】
配列表配列番号（１）〜（７）のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項１記載のＩＬ−１８様ペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のＩＬ−１８様ペプチドとジーン３蛋白質との融合体。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載のＩＬ−１８様ペプチド、あるいは請求項６記載のＩＬ−１８様ペプチドとジーン３蛋白質との融合体を有効成分として含有してなる医薬組成物。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載のＩＬ−１８様ペプチド、あるいは請求項６記載のＩＬ−１８様ペプチドとジーン３蛋白質との融合体を有効成分として含有する免疫疾患治療剤。
【請求項９】
抗ＩＬ−１８抗体を用いて、ファージランダムペプチドライブラリーをスクリーニングし、当該抗ＩＬ−１８抗体と結合し得るＩＬ−１８様ペプチドを発現しているファージクローンを単離することを特徴とする、抗ＩＬ−１８抗体と結合し得るＩＬ−１８様ペプチドの製造方法。
【図１】
【公開番号】特開２００６−１２４２９７（Ｐ２００６−１２４２９７Ａ）
【公開日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３１２６９４（Ｐ２００４−３１２６９４）
【出願日】平成１６年１０月２７日（２００４．１０．２７）
【出願人】（５０１２８０９２１）インターサイト・ナノサイエンス株式会社 (3)
【出願人】（５０４２５８５２７）国立大学法人 鹿児島大学 (284)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月２７日（２００４．１０．２７）
【出願人】（５０１２８０９２１）インターサイト・ナノサイエンス株式会社 (3)
【出願人】（５０４２５８５２７）国立大学法人 鹿児島大学 (284)
【Ｆターム（参考）】
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