ＩｇＧ結合領域が融合したカルシウム結合型発光蛋白質を用いたリン酸化酵素阻害物質のスクリーニング方法
【課題】測定レンジが広く、汎用性の高いリン酸化酵素阻害物質のスクリーニング方法を提供すること
【解決手段】ＩｇＧのＦｃ領域に結合できる機能を有するＺＺドメインと、カルシウム結合型発光蛋白質であるイクオリンとの融合蛋白質を利用することで、測定レンジが広く、汎用性の高いリン酸化酵素阻害物質のスクリーニングを提供することができる。
【解決手段】ＩｇＧのＦｃ領域に結合できる機能を有するＺＺドメインと、カルシウム結合型発光蛋白質であるイクオリンとの融合蛋白質を利用することで、測定レンジが広く、汎用性の高いリン酸化酵素阻害物質のスクリーニングを提供することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテインＡのＩｇＧ結合領域（ＺＺドメイン）が融合したカルシウム結合型発光蛋白質（以降本発明のホロ蛋白質と略記）を用いたリン酸化酵素阻害物質のスクリーニング方法、及びリン酸化酵素阻害物質のスクリーニングにおいて使用するための本発明のホロ蛋白質に関する。
【背景技術】
【０００２】
カルシウム結合型発光蛋白質はカルシウムイオンと特異的に反応し、瞬間発光する蛋白質である。具体的には、イクオリン、オベリン、クライチン、マイトロコミン、ミネオプシン及びベルボイン等が知られている。これらのカルシウム結合型発光蛋白質のカルシウムイオンに対する感受性は非常に高く（１０−７〜１０−５Ｍ カルシウムイオン濃度）、その発光感度もまた、市販の検出装置における検出限界が１ピコグラム以下と非常に高いものである。そのため、カルシウム結合型発光蛋白質は、前述のような特徴を活かし、細胞内カルシウムや血液中の微量カルシウムイオンの検出、定量に用いられている。
【０００３】
カルシウム結合型発光蛋白質の代表例は、発光オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ ａｅｑｕｏｒｅａ）などから得られるイクオリン（Ａｅｑｕｏｒｉｎ）である。イクオリンは、アポ蛋白質であるアポイクオリン(Ａｐｏａｅｑｕｏｒｉｎ)と、発光基質に相当するセレンテラジン（Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ）と、分子状酸素とが複合体を形成した状態で存在している。イクオリン分子にカルシウムイオンが結合すると、青色（極大波長４６０ｎｍ）の光を瞬間発光し、セレンテラジンの酸化物であるセレンテラミド（Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｍｉｄｅ）と二酸化炭素を生成する。
【０００４】
ヒトをはじめとする生物では、その外的環境の変化により、細胞レベルで様々な応答反応が引き起こされる。これらの応答としては、細胞運動、細胞死、生理活性物質の産生などが挙げられ、場合により、産生された生理活性物質の刺激によって他の細胞がさらなる応答反応を示す。このような応答反応には、タンパク質リン酸化を介した細胞内情報伝達が深く関わっている。遺伝子転写、タンパク質翻訳、分子輸送、タンパク質間相互作用、その他の様々な現象がタンパク質リン酸化を介した情報伝達によって制御されていることは広く知られている。また、ある種のリン酸化酵素が疾患時に活性化されること、及び遺伝子変異等によりリン酸化酵素が制御不能となることが疾患の原因となり得ることも示唆されている（非特許文献１）。
【０００５】
このように、蛋白質リン酸化反応は細胞の活動にとって重要な働きを担っている。上記の通り、ある種のリン酸化酵素は疾患に関連する場合もあるため、特定のリン酸化治療薬・予防薬を開発することが可能になる。したがって、そのような阻害物質のスクリーニングを正確、迅速且つ低コストで行う方法が必要とされている。
【０００６】
リン酸化酵素阻害物質のスクリーニング方法は、例えば以下の手法が挙げられる。
（１）リン酸化された特定のペプチド又は蛋白質に特異的に結合するが、リン酸化されていない同一のペプチド又は蛋白質には実質的に結合しない抗体（以下、抗リン酸化抗体と略記）を用い、該ペプチド又は蛋白質をリン酸化酵素阻害候補物質と共にリン酸化酵素と作用させた後、抗リン酸化抗体を作用させ、該ペプチド又は蛋白質がどの程度リン酸化されたかを、西洋わさびペルオキシダーゼ標識した二次抗体を用いて発色、定量する手法や、抗リン酸化抗体を用いてウェスタンブロッティングやイムノブロッティングでリン酸化を定性する手法（特許文献１、２、３、４、５）。
（２）該ペプチド又は蛋白質をリン酸化酵素阻害候補物質と共にリン酸化酵素と作用させる際、放射ラベルされたＡＴＰをリン酸供与体として用い、放射線量を計数して該ペプチド又は蛋白質のリン酸化を定量する方法（特許文献２、６）。
（３）該ペプチド又は蛋白質のリン酸化酵素によるリン酸化の際、又は後に金属コロイドを混合して、リン酸化の程度を金属コロイドの凝集によって定量する方法等が提案されている（特許文献７）。
【０００７】
また、(４)カルシウム結合型発光蛋白質「イクオリン」で標識した抗リン酸化抗体を用いて基質ペプチドのリン酸化を定量する手法（特許文献８）などが挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第４２７０５４８号公報
【特許文献２】国際公開第０１／０１１３６７号
【特許文献３】特開２０００−３２５０８６号公報
【特許文献４】特表２００８−５０４０２２号公報
【特許文献５】特開２００５−１１２８１２号公報
【特許文献６】特表平１１−５１２５２３号公報
【特許文献７】特開２００８−７９６１０号公報
【特許文献８】特開２００９−２３６９０５号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｋｉｙｏｉ，Ｈ．、外６名、Ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｓｅｐ．１９９８、１２（９）、ｐ．１３３３〜１３３７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
（１）の抗リン酸化抗体を用いて発色定性する手法は、どの程度リン酸化されたのかを定量的に把握する点で必ずしも十分ではなかった。また発色により定量する手法は、測定できるレンジ及び検出感度に改善の余地があった。
【００１１】
（２）の放射ラベルを使用する手法は、放射性物質を取り扱うため、その取り扱いに細心の注意を払う必要があり、また特別な施設を必要とすることから、汎用性が十分ではなかった。
【００１２】
また、（３）の金属コロイドの凝集を利用する手法は、測定できるレンジが狭く、検出感度に改善の余地があった。
【００１３】
一方、（４）の方法であれば、測定できるレンジも広く、高い検出感度が得られる有効な手法であるが、抗リン酸化抗体とイクオリンを予め標識する工程が必要である上、標識工程で貴重な抗体をロスする可能性がある。更にある特定の基質ペプチドに対するリン酸化検出だけの使用に限定され、汎用性が十分ではなかった。
【００１４】
このような状況において、測定が容易であり、測定レンジが広く、汎用性の高いリン酸化酵素阻害物質のスクリーニング方法の提供が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記の課題を解決するために、リン酸化反応を効果的に検出する手段を開発し、そのような手段を用いたリン酸化酵素阻害物質のスクリーニング方法を完成させた。
【００１６】
より詳細には、本発明は、以下の特徴を有する：
［１］リン酸化酵素阻害物質のスクリーニング方法であって、当該方法が阻害候補物質を用いた時の発光強度Ｘと阻害候補物質を用いない時の発光強度Ｙとを比較して、発光強度Ｘが発光強度Ｙより低い場合に該阻害候補物質が該リン酸化酵素の活性を阻害する物質であることを確認する方法であり、かつ以下の（ａ）〜（ｅ）のステップ：
（ａ）阻害候補物質の存在下で、基質である蛋白質又はペプチドのリン酸化が可能な条件において、該基質にリン酸化酵素を作用させるステップ、
（ｂ）抗リン酸化抗体を、ステップ（ａ）でリン酸化酵素を作用させた基質と接触させるステップ、
（ｃ）免疫グロブリン（以降ＩｇＧと略記）のＦｃ領域に結合できる機能を有する領域及びカルシウム結合型発光蛋白質の領域が融合したホロ蛋白質を、ステップ（ｂ）で作用させた抗リン酸化抗体−基質複合体と接触させるステップ、
（ｄ）カルシウムを添加し、ＩｇＧのＦｃ領域に結合できる機能を有する領域及びカルシウム結合型発光蛋白質の領域が融合したホロ蛋白質−抗リン酸化抗体−基質複合体から生じる、発光強度Ｘを検出するステップ、
（ｅ）ステップ（ａ）において阻害候補物質を用いない以外は、ステップ（ａ）〜（ｄ）と同様に操作を行い、発光強度Ｙを検出するステップ、
を含み、ここで該抗リン酸化抗体は、該リン酸化酵素によりリン酸化された基質に特異的に結合可能なものである、上記方法。
［２］前記基質が固体支持体に固相化されている、［１］に記載の方法。
［３］前記ＩｇＧのＦｃ領域に結合できる機能を有する領域及びカルシウム結合型発光蛋白質の領域が融合したホロ蛋白質が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される第１の領域及び（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択される第２の領域を含有する融合蛋白質並びにセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドとを含むホロ蛋白質である、［１］又は［２］に記載の方法。
（１）第１の領域：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、及び
（ｄ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域。
（２）第２の領域：
（ｅ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域、
（ｆ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、及び
（ｈ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域。
［４］前記ＩｇＧのＦｃ領域に結合できる機能を有する領域及びカルシウム結合型発光蛋白質の領域が融合したホロ蛋白質が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される第１の領域と（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択される第２の領域を含有する融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドとを含むホロ蛋白質である、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の方法。
（１）第１の領域：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、及び
（ｄ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域。
（２）第２の領域：
（ｅ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域、
（ｆ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、及び
（ｈ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域。
［５］前記ＩｇＧのＦｃ領域に結合できる機能を有する領域及びカルシウム結合型発光蛋白質の領域が融合したホロ蛋白質が、
（１）配列番号：１で表される第１のアミノ酸配列からなる領域及び、
（２）配列番号：３で表される第２のアミノ酸配列からなる領域
を含有する融合蛋白質並びにセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドとを含むホロ蛋白質である、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の方法。
［６］前記ＩｇＧのＦｃ領域に結合できる機能を有する領域及びカルシウム結合型発光蛋白質の領域が融合したホロ蛋白質が、配列番号：５のアミノ酸配列からなる融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドとを含むホロ蛋白質である、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記リン酸化酵素が、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ２ 、ＪＮＫ、ｐ３８、Ａｋｔ、Ａｕｒｏｒａ Ａ、Ａｕｒｏｒａ Ｂ 、Ａｕｒｏｒａ Ｃ、ＰＫＡ 、ＭＳＫ１ 、ＰＫＣ ε、ＣＲＩＫ 、ＮＤＲ１ 、ＤＹＲＫ１Ａ 、Ｒｓｋ２ 、ＰＩＭ１ 、ＰＡＫ１ 、ＩＫＫ α、ＪＩＬ −１ 、ＶＲＫ１ 、Ｓｎｆ１ 、ＰＢＫ ／ＴＯＰＫ 、ＭＮＫ１ 、ＭＮＫ２ 、ＭＲＣＫ α、ＰＡＫ２ 、ＷＮＫ２ 、ＷＮＫ３、ＡＫ、ＣＫ２、ＭＢＰＫ、ｃＰＫ、及びｃｄＫである、［１］〜［６］のいずれか１項に記載の方法。
［８］前記抗リン酸化抗体が、リン酸化されたミエリン塩基性蛋白質を認識できるものである、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］前記基質が、ミエリン塩基性蛋白質である、［１］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］［３］〜［６］のいずれかに記載の融合蛋白質、及び対象となるリン酸化酵素の基質を含む、リン酸化酵素阻害物質のスクリーニングのためのキット。
［１１］前記基質がミエリン塩基性蛋白質である、［１０］に記載のキット。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、疾患の治療薬・予防薬として応用可能なリン酸化酵素阻害物質をより簡便に見出すことができる。
【００１８】
以下に、本発明の実施の形態において実施例を挙げながら具体的かつ詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、本発明のホロ蛋白質（ＺＺ−イクオリン）を用いて検出したスタウロスポリンによるＭＡＰＫ１のリン酸化活性阻害を表すプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明において、「リン酸化酵素」とは、細胞内で標的蛋白質をリン酸化する活性を有することが知られている蛋白質である。本発明におけるリン酸化酵素は、セリン／スレオニン特異的なものでもよいし、チロシン特異的なものでもよい。具体的なリン酸化酵素としては、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ２ 、ＪＮＫ、ｐ３８、Ａｋｔ、Ａｕｒｏｒａ Ａ、Ａｕｒｏｒａ Ｂ 、Ａｕｒｏｒａ Ｃ、ＰＫＡ 、ＭＳＫ１ 、ＰＫＣ、ＣＲＩＫ 、ＮＤＲ１ 、ＤＹＲＫ１Ａ 、Ｒｓｋ２ 、ＰＩＭ１ 、ＰＡＫ１ 、ＩＫＫ α、ＪＩＬ −１ 、ＶＲＫ１ 、Ｓｎｆ１ 、ＰＢＫ ／ＴＯＰＫ 、ＭＮＫ１ 、ＭＮＫ２ 、ＭＲＣＫ α、ＰＡＫ２ 、ＷＮＫ２ 、ＷＮＫ３、ＡＫ、ＣＫ２、ＭＢＰＫ、ｃＰＫ、及びｃｄＫなどが挙げられ、特に好適なリン酸化酵素は、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ２、ＪＮＫ、ｐ３８、Ａｋｔ、ＭＢＰＫ、及びＰＫＣ等が挙げられる。
【００２１】
本発明の方法で用いるリン酸化酵素は、生物組織から抽出・精製したものでもよいし、大腸菌又は哺乳動物細胞などの宿主細胞により組換え的に発現させた後、適宜精製したものでもよい。
【００２２】
本発明において「候補物質」とは、リン酸化酵素を阻害する活性を有することが予想されるいずれかの物質であり、例えば、動物・植物組織の抽出物若しくは微生物培養物等の複数の化合物を含む混合物、又はそれらから単離された標品；天然に生じる分子（例えば、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、蛋白質、核酸、脂質、ステロイド、糖タンパク質、プロテオグリカンなど）；天然に生じる物質の合成アナログ又は誘導体（例えば、ペプチドミメティクスなど）；天然に生じない分子（例えば、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製した低分子有機化合物）；並びにそれらの混合物を挙げることができる。本発明において「リン酸化酵素阻害物質」とは、対象となるリン酸化酵素の活性を阻害することが可能な物質である。
【００２３】
本発明の融合蛋白質は、発光基質であるセレンテラジンと接触させることによって、容易に本発明の融合蛋白質とセレンテラジンのペルオキシドを含有するホロ蛋白質を形成することができる。本発明のホロ蛋白質は、セレンテラジンと酸素の存在下において、本発明の融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシドとが複合体を形成した状態で存在する。前記複合体にカルシウムイオンが結合すると、瞬間的な発光を示す。したがって、本発明の融合蛋白質、本発明のホロ蛋白質などは、カルシウムイオンの検出又は測定に好適に利用することができる。
また、本発明の融合蛋白質は、ＩｇＧとの高い結合能力を有している。そして、上述のように、本発明の融合蛋白質と発光基質であるセレンテラジンのペルオキシドとを含むホロ蛋白質は、カルシウムイオンによって発光させることができる。したがって、本発明の融合蛋白質は、ＩｇＧの検出に好適に利用することができる。
【００２４】
本発明の融合蛋白質とは、配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域及び配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性又は機能を有する領域から選択される第１の領域と、配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域及び配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性又は機能を有する領域から選択される第２の領域とを含有する融合蛋白質を意味する。
【００２５】
本発明中、配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域及び配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性又は機能を有する領域から選択される第１の領域を、「ＺＺドメイン」と称することがある。配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域及び配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性又は機能を有する領域から選択される第２の領域を、「アポイクオリン」又は「アポＡＱ」と称することがある。
【００２６】
本発明の融合蛋白質はさらに翻訳促進のためのアミノ酸配列及び／又は精製のためのアミノ酸配列を含んでいてもよい。翻訳促進のためのアミノ酸配列としては、当技術分野において用いられているアミノ酸配列を使用することができる。翻訳促進のためのアミノ酸配列としては、例えば、ＴＥＥ配列などが挙げられる。精製のためのアミノ酸配列としては、当技術分野において用いられているアミノ酸配列を使用することができる。精製のためのアミノ酸配列としては、例えば、ヒスチジン残基が４残基以上、好ましくは６残基以上連続したアミノ酸配列を有するヒスチジンタグ配列、グルタチオン Ｓ−トランストランスフェラーゼのグルタチオンへの結合ドメインのアミノ酸配列などが挙げられる。
【００２７】
本発明の融合蛋白質として、例えば配列番号：５のアミノ酸配列からなる融合蛋白質などが挙げられる。
【００２８】
本発明の融合蛋白質の取得方法については特に制限はない。本発明の融合蛋白質としては、化学合成により合成した融合蛋白質でもよいし、遺伝子組換え技術により作製した組換え融合蛋白質であってもよい。本発明の融合蛋白質を化学合成する場合には、例えば、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等により合成することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。本発明の融合蛋白質を遺伝子組換え技術により作製する場合には、通常の遺伝子組換え手法により作製することができる。より具体的には、本発明の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を適当な発現系に導入することにより、本発明の融合蛋白質を作製することができる。本発明の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド、本発明の融合蛋白質の発現系での発現などについては、後記する。本発明中、本発明の融合蛋白質を、「ＺＺ−アポイクオリン」と称することもある。
【００２９】
本発明の融合蛋白質を、発光基質であるセレンテラジン又はその誘導体（例えば、h-セレンテラジン、e-セレンテラジン、cl-セレンテラジン、ch-セレンテラジン、hcp-セレンテラジンなど）と、酸素存在下に接触させることにより、本発明の融合蛋白質とセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドとを含むホロ蛋白質を得ることができる。本発明中、「セレンテラジン又はその誘導体」を、単に「セレンテラジン」と称することがある。本発明中、本発明の融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドとを含むホロ蛋白質を、「本発明のホロ蛋白質」と略記するが、「ＺＺ−イクオリン」、「ＺＺ−ＡＱ」、又は「本発明の発光蛋白質」と称することもある。
【００３０】
本発明のホロ蛋白質としては、（１）本発明の融合蛋白質とセレンテラジンのペルオキシドとを含むホロ蛋白質、（２）本発明の融合蛋白質とセレンテラジン誘導体のペルオキシドとを含むホロ蛋白質などが挙げられる。本発明の融合蛋白質とセレンテラジン誘導体のペルオキシドとを含むホロ蛋白質としては、例えば、本発明の融合蛋白質とh-セレンテラジンのペルオキシドとを含むホロ蛋白質、本発明の融合蛋白質とe-セレンテラジンのペルオキシドとを含むホロ蛋白質、本発明の融合蛋白質とcl-セレンテラジンのペルオキシドとを含むホロ蛋白質、本発明の融合蛋白質とch-セレンテラジンのペルオキシドとを含むホロ蛋白質、本発明の融合蛋白質とhcp-セレンテラジンのペルオキシドとを含むホロ蛋白質などが挙げられる。本発明のホロ蛋白質は、本発明の融合蛋白質とセレンテラジンとから、公知のカルシウム結合発光蛋白質（例えば、イクオリンなど）と同様にして製造することができる。より具体的には、本発明のホロ蛋白質は、例えば、Biochem. J. 261, 913-920 (1989)などに記載の製造方法に準じる方法によって製造することができる。本発明のホロ蛋白質は、本発明の融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシドとが複合体（本発明の発光蛋白質）を形成した状態で存在する。前記複合体（本発明の発光蛋白質）にカルシウムイオンが結合すると、瞬間的な発光を示し、セレンテラジンの酸化物であるセレンテラミドと二酸化炭素を生成する。
（第１の領域）
【００３１】
第１の領域とは、配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域又は配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性又は機能を有する領域を意味する。
配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性又は機能とは、例えば、ＩｇＧのＦｃ領域に結合することができる活性又は機能を意味する。ＩｇＧのＦｃ領域に結合することができる活性又は機能は、例えば、ウエスタンブロティング法などに従って測定することができる。
【００３２】
第１の領域としては、より具体的には、例えば（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域；（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性又は機能を有する領域などが挙げられる。
本明細書において、「１〜複数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列」における「１〜複数個」の範囲は、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個（１〜数個）、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、１個である。欠失、置換、挿入、及び／又は付加したアミノ酸の数は、一般的に少ないほど好ましい。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入、及び付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。このような領域は、「モレキュラークローニング第３版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、又は“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
【００３３】
また、第１の領域としては、例えば、（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列と約７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性又は機能を有する領域も挙げられる。さらに、第１の領域としては、より具体的には、例えば、配列番号：１のアミノ酸配列と約７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる活性又は機能を有する領域が挙げられる。上記同一性の数値は、一般的に大きいほど好ましい。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ（例えば、Altzshul S. F. et al., J. Mol. Biol. 215, 403 (1990)、など参照）やＦＡＳＴＡ（Pearson W. R., Methods in Enzymology 183, 63 (1990)、など参照）等の解析プログラムを用いて決定できる。ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００３４】
さらに、第１の領域には、（ｄ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性又は機能を有する領域も含まれる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドについては、後記する。
（第２の領域）
【００３５】
第２の領域とは、配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域又は配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性又は機能を有する領域を意味する。
配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性又は機能とは、例えば、（i）前記領域がセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合することができる機能、（ii）前記領域がセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合して、カルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を意味する。なお、発光の測定は、例えば、Shimomura 0.et al (1988) Biochem. J.251,405-410 及びShimomura 0.et al. Biochem. J. (1989)261, 913-920などに記載の方法によって測定することができる。 具体的には、例えば、酸素存在下、前記領域にセレンテラジン又はセレンテラジン誘導体を結合させ、カルシウム溶液を加えることにより発光反応を開始させることができる。さらに、発光測定装置を用いて発光活性又は発光パターンを測定することができる。発光測定装置としては、市販されている装置、例えば、AB-2200（アトー社製）、Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０（ベルトールド社製）などを使用することができる。
【００３６】
第２の領域としては、より具体的には、例えば（ｅ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域；（ｆ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性又は機能を有する領域などが挙げられる。ここで、「１〜複数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列」における「１〜複数個」の範囲は、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個（１〜数個）、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、１個である。欠失、置換、挿入、及び／又は付加したアミノ酸の数は、一般的に少ないほど好ましい。
【００３７】
また、第２の領域としては、例えば、（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列と約７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性又は機能を有する領域も挙げられる。さらに、第２の領域としては、より具体的には、例えば、配列番号：３のアミノ酸配列と約７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ（i）セレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合することができる機能、又は（ii）セレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合して、カルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域が挙げられる。上記同一性の数値は、一般的に大きいほど好ましい。
【００３８】
さらに、第２の領域には、（ｈ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性又は機能を有する領域も含まれる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドについては、後記する。
【００３９】
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）」とは、配列番号：２又は４の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド又は配列番号：１又は３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）をいう。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（Saline-sodium citrate）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドをあげることができる。
【００４０】
ハイブリダイゼーションは、Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、Ausbel F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley and Sons (1987-1997)、Glover D. M. and Hames B. D., DNA Cloning 1: Core Techniques, A practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００４１】
本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％(w/v)SDS、50％(v/v)ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％(w/v)SDS、50％(v/v)ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5(w/v)％SDS、50％(v/v)ホルムアミド、50℃の条件である。条件を厳しくするほど、二本鎖形成に必要とする相補性が高くなる。具体的には、例えば、これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００４２】
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコールにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたＤＮＡを検出することができる。
【００４３】
本発明においてカルシウム結合型発光蛋白質を用いる利点としては、カルシウムの添加という簡便な処理により発光が生じること、発光・検出の際に、検体中の分子全体としての発光がカルシウムの結合から短時間に、例えば数秒以内にピークに達することなどが挙げられる。発光は、好適にはカルシウムの結合から１秒以内にピークに達する。カルシウムの結合から短時間で発光がピークに達することは、分子間での発光のタイミングのばらつきが少ないこと、すなわち、ほぼすべての分子が同時に発光することを表す。これにより、検出感度が上昇する。
【００４４】
カルシウム結合型発光蛋白質を用いることの他の利点は、（１）検出を発光により行うため、蛍光色素を用いる場合に問題となる検出の際の励起光の漏れがないこと、（２）その発光がカルシウムとの結合に依存するため、アルカリホスファターゼや西洋ワサビペルオキシダーゼを用いる化学発光の場合に問題となるバックグラウンドがないこと、（３）その発光がカルシウムとの結合に依存し、検出の時点でのみ発光させることができるため、検出前の処理中の基質の分解を考慮する必要がないこと、（４）放射性同位体や発癌性色素などの危険物質を用いないことなどである。
【００４５】
本発明において「抗リン酸化抗体」とは、リン酸化された特定のペプチド又は蛋白質に特異的に結合するが、リン酸化されていない同一のペプチド又は蛋白質には実質的に結合しない抗体を意味する。そのような抗体では、標的ポリペプチドやアミノ酸がリン酸化されている場合の結合強度が、リン酸化されていない場合と比較して、例えば１０倍以上、５０倍以上、１００倍以上、１，０００倍以上、又は１０，０００倍以上である。上記結合強度は、一般的に高いほど好ましい。抗リン酸化抗体は、様々な標的に対するものが市販されている。例えば、抗リン酸化ＣＲＥＢ（セリン）ウサギ抗体、抗リン酸化Ｊａｋ２（チロシン）ウサギ抗体、抗リン酸化セリン/スレオニンマウス抗体などが挙げられる。
【００４６】
本発明における抗リン酸化抗体は、特に限定されるものではないが、ポリクローナル抗体（例えば、ＩｇＧ 、ＩｇＭ 、ＩｇＡ 、ＩｇＤ 、又はＩｇＥ ）、モノクローナル抗体、又は抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ 、Ｆ （ａｂ ’）２ 、Ｆｖ 、又はｓｃＦｖ ）のいずれであってもよい。抗リン酸化抗体は、市販されているものを購入してもよいし、新たに作製してもよい。本発明の融合蛋白質に含まれるＩｇＧ結合領域のＩｇＧへの結合能の強さを考慮すると、好ましくは、ヒト由来ＩｇＧ若しくはＩｇＥ、又はマウス、ラット、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ブタ、イヌ、ハムスター、ロバ、ネコ、若しくはサル由来のＩｇＧ等が挙げられ、より好ましくは、ヒト由来ＩｇＧとしてのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、若しくはＩｇＧ４、マウス由来ＩｇＧとしてのＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、若しくはＩｇＧ３、ラット由来ＩｇＧとしてのＩｇＧ２ｃ、ウシ由来ＩｇＧとしてのＩｇＧ２、ヤギ由来ＩｇＧとしてのＩｇＧ２、ヒツジ由来ＩｇＧとしてのＩｇＧ２、ウサギ由来ＩｇＧ、ブタ由来ＩｇＧ、イヌ由来ＩｇＧ、ネコ由来ＩｇＧ、又はサル由来ＩｇＧ等を用いることができる。各抗体タイプの抗体の作製方法は当業者に公知である。特に、モノクローナル抗体の作製方法は当業者に公知であり、適切な免疫原でのマウスの免疫化、免疫されたマウス由来の脾臓細胞と、同系のマウス骨髄腫細胞とのハイブリドーマの作製、抗体産生ハイブリドーマのクローニング、及びクローニングされたハイブリドーマからの抗体の精製を含む。
【００４７】
タンパク質のリン酸化状態を検出する方法としては、放射性同位体である３２Ｐを用いる方法がよく知られているが、放射性同位体を用いる方法を実施するには、特別な施設が必要であり、また試薬を厳重に管理しなければならない。本発明の方法では、抗リン酸化抗体を用いて蛋白質のリン酸化状態を検出することにより、そのような問題を回避することができる。
【００４８】
本発明の方法において、「基質蛋白質又はペプチドのリン酸化が可能な条件」とは、対象となるリン酸化酵素による基質蛋白質又はペプチドのリン酸化が可能な条件である。例えば、グリセロリン酸、オルトバナジン酸等のリン酸化アッセイで通常用いられる試薬を含有する緩衝液に、対象となるリン酸化酵素及びＡＴＰを添加し、この緩衝液を基質蛋白質又はペプチドに作用させて室温〜３７℃でインキュベートする条件が挙げられる。
【００４９】
本発明において、基質蛋白質は、天然に存在する蛋白質を抽出、精製して取得してもよいし、遺伝子組換え技術により、該蛋白質の遺伝子が導入された大腸菌などの宿主細胞により発現させた後、適宜精製することによって取得してもよい。
【００５０】
本発明における基質蛋白質は、対象となるリン酸化酵素によって、リン酸化されうる蛋白質であれば、特に限定されないが、例えば、不活性化しているＲａｆ１、Ｂ-Ｒａｆ、Ｍｏｓ、ＴＰＬ２/ＣＯＴ、ＭＥＫＫ、ＭＬＫ、ＴＡＫ１、ＡＳＫ１、ＭＫＫ１、ＭＫＫ２、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＭＫ５、ＭＫＫ６、ＭＭＫ７、ＭＡＰＫ、ＥＲＫ５、ＪＮＫ、ｐ３８等の不活性化リン酸化酵素、Ｅｌｋ-１、Ｓａｐ−１、ＭＮＫ１／２、ｃ-Ｍｙｃ、ＭＥＦ２Ｃ、ｃ-Ｊｕｎ、ＡＴＦ-２、ＣＨＯＰ、ＭＡＰＫＡＰＫ−２／３等の転写因子、ミエリン塩基性蛋白質、ヒストン等の塩基性蛋白質やカゼインやフォスビチン等の酸性蛋白質などが挙げられる。本発明の方法においては、いずれの蛋白質を用いてもよいが、好ましくは、ミエリン塩基性蛋白質、ヒストン、カゼイン、フォスビチン等が用いられる。
【００５１】
本発明の方法において、基質ペプチドは適切なペプチド合成機を用いた化学合成により取得してもよいし、大腸菌などの宿主細胞により組換え的に発現させた後に適宜精製することによって取得してもよいし、市販されているペプチドを購入して用いることもできる。基質ペプチドは、対象となるリン酸化酵素によってリン酸化されうるペプチドであれば特に限定されないが、例えば、ＫＲＲＥＩＬＳＲＲＰＳＹＲ（ＣＲＥＢｔｉｄｅ）、ＬＲＲＡＳＬＧ（Ｋｅｍｐｔｉｄｅ）、ＲＲＲＬＳＳＬＲＡ-ＮＨ２(ＰＫＡ/ＰＫＣ/ＭＡＰＫＡＰ-Ｋ1Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＡＡＬＶＲＱＭＳＶＡＦＦＦＫ(ＰＫＣμ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＲＲＧＲＴＧＲＧＲＲＧＩＦＲ（ＰＫＣ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ５）、ＲＦＡＶＲＤＭＲＱＴＶＡＶＧＶＩＫＡＶＤＫＫ（ＰＫＣδ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＥＲＭＲＰＲＫＲＱＧＳＶＲＲＲＶ（ＰＫＣε Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＫＫＲＦＳＦＫＫＳＦＫＬ（ＭＡＲＣＫＳ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＰＬＳＲＴＬＳＶＡＡＫＫ-ＮＨ２（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ Ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＡＡＫＩＱＡＳＦＲＧＨＭＡＲＫＫ（Ｎｅｕｒｏｇｒａｎｉｎ）、ＱＫＲＰＲＲＫＤＴＰ（ＰＫＧ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ１）、ＲＫＲＳＲＡＥ（ＰＫＧ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ２）、ＲＫＩＳＡＳＥＦＤＲＰＬＲ（ＢＰＤＥｔｉｄｅ）、ＫＫＡＬＲＲＱＥＴＶＤＡＬ（Ａｕｔｏｃａｍｔｉｄｅ-２）、ＫＫＡＬＨＲＱＥＴＶＤＡＬ（Ａｕｔｏｃａｍｔｉｄｅ-３）、ＰＬＡＲＴＬＳＶＡＧＬＰＧＫＫ（Ｓｙｎｔｉｄｅ２）、ＰＬＳＲＴＬＳＶＳＳ-ＮＨ２（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ Ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＭＨＲＱＥＴＶＤＣＬＫ-ＮＨ２（ＣａＭ ＫｉｎａｓｅＩＩ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＡＲＫＲＥＲＴＹＳＦＧＨＨＡ（ＡＫＴ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧ（Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ）、ＨＡＴＰＰＫＫＫＲＫ（ＣＤＫ１ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＰＫＴＰＫＫＡＫＫＬ（ＣＤＫ５ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＡＤＡＱＨＡＴＰＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＫＤＦ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ ｐ３４ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＫＱＡＥＡＶＴＳＰＲ（ＭＡＰＫ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ３）、ＫＲＥＬＶＥＰＬＴＰＳＧＥＡＰＮＱＡＬＬＲ-ＮＨ２（ＥＧＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＧＰＨＲＳＴＰＥＳＲＡＡＶ（ＧＳＫ-３β Ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＲＲＫＤＬＨＤＤＥＥＤＥＡＭＳＩＴＡ（Ｃａｓｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｉ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＲＲＡＤＤＳＤＤＤＤＤ（Ｃａｓｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ ＩＩ Ｓｕｂｓｔａｒｔｅ２）、ＫＶＥＫＩＧＥＧＴＹＧＶＶＹＫ（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ １）、ＡＤＥＹＬＩＰＱＱ（ＥＧＦＲ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＲＲＬＩＥＤＡＥＹＡＡＲＧ（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ３）、ＹＩＹＧＳＦＫ（ｐ６０ｃ-ｓｒｃ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＴＲＤＩＹＥＴＤＹＹＲＫ（Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＲＲＫＡＳＧＰ（Ｈ１-７、ＰＫＡ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＥＰＰＬＳＱＥＡＦＡＤＬＷＫＫ（ＤＮＡ-Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＤＤＤＥＥＳＩＴＲＲ（Ｃａｓｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｉ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＲＲＲＥＥＥＴＥＥＥ（Ｃａｓｅｉｎ ＫｉｎａｓｅＩＩ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＫＲＴＬＲＲ（ＰＫＣ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＧＫＧＲＧＬＳＬＳＲＦＳＷＧ（ＭＢＰ Ｆｒａｇｍｅｎｔ）、ＱＫＲＰＳＱＲＳＫＹＬ（ＭＢＰ Ｆｒａｇｍｅｎｔ）、ＫＫＬＲＲＴＬＳＶＡ（ＰＲＡＫ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ）、及びＡＲＴＫＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＣ（Ｋ9Ｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ）などが挙げられる。なお、上記基質ペプチドの例示においては、アミノ酸１文字表記を使用した。
【００５２】
本発明の方法により、リン酸化酵素の阻害物質を、迅速かつ簡便にスクリーニングすることが可能になる。特に、本発明の方法は、カルシウム結合型発光蛋白質を用いることにより、カルシウムの添加という簡便な処理により、カルシウムイオンの結合に際して瞬時に発光が起こり、その発光は数秒以内に終了する。このため、短時間にシグナル対ノイズ比（Ｓ ／Ｎ ）の高い検出を行うことができるという利点を有する。また、その発光はカルシウムとの結合に依存することから、検出の時点でのみ発光を生じさせることが可能であり、したがって検出前の処理中の基質の分解を考慮する必要がない。そのため、簡便な操作で、短時間で感度のよい検出が可能となるので、リン酸化酵素阻害物質のハイスループットスクリーニングに適している。
【００５３】
本発明の方法では、基質蛋白質又はペプチドは好ましくは固体支持体に固相化されている。好ましい固体支持体は、限定するものではないが、プラスチック製の測定用プレートである。
【００５４】
本発明の方法では、発光の検出は、使用するカルシウム結合型発光蛋白質の発光波長を検出しうる検出器を用いて行う。カルシウム結合型発光蛋白質の発光波長は当業者には公知であり、例えばイクオリンの場合、４７０ｎｍ 付近である。そのような検出器としては、市販のプレートリーダーが挙げられる。例えば、ベルトールド社のＣｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０を用いることができる。
【００５５】
本発明には、リン酸化酵素阻害物質のスクリーニングにおける使用のための、プロテインＡのＩｇＧ結合領域（ＺＺドメイン）が融合したカルシウム結合型発光蛋白質が包含される。
【００５６】
また、本発明には、少なくともＩｇＧ結合領域融合カルシウム結合型発光蛋白質、抗リン酸化抗体及び対象となるリン酸化酵素の基質を含む、リン酸化酵素阻害物質のスクリーニングのためのキットが包含される。該キットには、さらに、固定化担体、バッファー、陽性対照試料及び陰性対照試料、本発明のスクリーニング方法を利用した該キットの使用方法を記載した指示書等を含めることができる。
【実施例】
【００５７】
以下実施例をもって本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、本実施例において「％」は、特に断りがない限り「重量％」を意味する。
本発明のホロ蛋白質（ＺＺ−イクオリン）は、以下に示した実施例１〜３の通り、特願２００６−２２４７９４に記載の方法に準じて調製した。
【００５８】
［実施例１］
本発明の融合蛋白質（ＺＺ−アポイクオリン）融合遺伝子発現ベクターの構築
大腸菌において組換えＺＺ−アポイクオリンを発現させるために、ＺＺ遺伝子及びイクオリン遺伝子を以下に記載する方法に従って調製した。ＩｇＧ結合ドメインであるＺＺドメインをコードする ＺＺ遺伝子はｐＥＺＺ１８（アマシャムバイオサイエンス社）から、ＰＣＲ法により調製した。アポイクオリンをコードするイクオリン遺伝子はｐＡＱ４４０（特開昭６１−１３５５８６号公報参照）のコーディング領域であるＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ フラグメントを含むｐＡＭ−ＨＥよりＰＣＲ法により調製した。発現ベクターとしてｐＣｏｌｄ ＩＩ ベクター（タカラバイオ社）を使用した。ＺＺ−アポイクオリン発現ベクターの構築法は以下の通りである。
【００５９】
まず、pAM-HEを鋳型として２種のＰＣＲプライマー：
AQ-EcoRI-Met（5’ CCGGAATTC-ATG-AAA-CTT-ACA-TCA-GAC-TTC-GAC-AAC 3’（配列番号：６）；ＥｃｏＲＩ制限酵素部位はアンダーライン）及び
ＡＱ−Ｃ−ＳａｌＩ（5’ CGCGTCGAC-TTA-GGG-GAC-AGC-TCC-ACC-GTA-GAG-CTT 3’（配列番号：７）；ＳＡＬＩ制限酵素部位はアンダーライン）を用いて、ＰＣＲキット（タカラバイオ社製）にてＰＣＲ（サイクル条件25サイクル；１分／９４℃、１分／５０℃、１分／７２℃）を実施して、所望のイクオリン遺伝子領域を増幅した。得られたＤＮＡ断片をＰＣＲ精製キット（キアゲン社製）で精製した。前記の精製されたＤＮＡ断片を常法により制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩにて消化した後、ｐＣｏｌｄＩＩの制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ部位に連結することによって、発現ベクターｐＣｏｌｄ−ＡＱを構築した。
【００６０】
一方、ｐＥＺＺ１８を鋳型として２種のＰＣＲプライマー：
６ＺＺ−Ｎ−ＮｄｅＩ（5’ CCG CAT ATG GCG CAA CAC GAT GAA GCC GTG 3’（配列番号：８）；NdeI制限酵素部位はアンダーライン）及び
７ＺＺ−Ｃ−ＢａｍＨＩ（5’ GGC GGA TCC CGA GCT CGA ATT TGC GTC TAC 3’（配列番号：９）；ＢａｍＨＩ制限酵素部位はアンダーライン）を用いて、ＰＣＲキット（タカラバイオ社製）にてＰＣＲ（サイクル条件２５サイクル；１分／９４℃、１分／５０℃、１分／７２℃）を実施して、所望のＤＮＡ領域を増幅した。得られたＤＮＡ断片をＰＣＲ精製キット（キアゲン社製）で精製した。前記の精製されたＤＮＡ断片を常法により制限酵素ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩにて消化した後、ｐＣｏｌｄ−ＡＱの制限酵素ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ部位に連結することによって、発現ベクターであるｐＣｏｌｄ−ＺＺ−ＡＱを構築した。本発現ベクターは、低温で誘導可能であり、発現したＺＺ−ａｐｏＡＱは、アミノ末端にヒスチジンダグを有する。
【００６１】
［実施例２］
本発明の融合蛋白質（組換えＺＺ−アポイクオリン）の調製法
組換えＺＺ−アポイクオリンの調製は、以下に記載するように、組換えＺＺ−アポイクオリンを大腸菌で発現させた後、発現された該融合蛋白質を抽出し、抽出した組換えＺＺ−アポイクオリンを各種クロマトグラフ法を用いて精製することによって行った。
なお、精製過程における組換えＺＺ−アポイクオリンの発光活性の測定は、以下のようにして行った。まず、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．６）の緩衝液１ｍｌ 中で、粗ＺＺ−アポイクオリン溶液、２−メルカプトエタノール（１μｌ）、エタノールに溶解した発光基質であるセレンテラジン（１μｇ／μｌ）を混合した後、氷上（４℃）で2時間放置することにより発光活性を持つ本発明のホロ蛋白質（ＺＺ−イクオリン）を調製した。得られたＺＺ−イクオリン溶液に５０ｍＭ ＣａＣｌ２ １００μlを加えることにより発光反応を開始させ、発光測定装置ＰＳＮ ＡＢ２２００（アトー社製）で１０秒間発光活性の測定を行った。発光活性（最大値（Imax）など）は、相対発光強度（ｒｌｕ）で評価した。
【００６２】
１） 組換えＺＺ−アポイクオリンの大腸菌での発現
実施例１で得た発現ベクターpCold-ZZ-AQをポリエチレングリコール法により大腸菌BL21株に導入し、形質転換株を得た。得られた形質転換株を３７℃で１８時間培養した。培養後、その形質転換株をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有する１０ｍｌのＬＢ液体培地（水1リットルあたり、バクトトリプトン１０ｇ、イーストエクストラクト５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、ｐＨ７．２）に植菌し、さらに３７℃で１８時間培養を行った。次いで、その培養菌体液を新たなＬＢ液体培地２リットル（４００ｍｌｘ５本）に添加して、３７℃で４．５時間培養した。培養後、その培養菌体液を氷水上で冷却して、イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、和光純薬工業社製）を最終濃度0.1mMになるように培養液に添加し、１５℃にて１７時間培養を行った。培養菌体を、冷却遠心機により５分間、５，０００ｒｐｍ（６０００×ｇ）で集菌した。
【００６３】
２） 培養菌体からのＺＺ−アポイクオリンの抽出
上記１）で集菌した菌体を２００ ｍｌ（４０ｍｌｘ５本）の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．６）で懸濁し、氷冷下で超音波破砕処理（ブランソン社製、ソニファイアーモデル２５０）を各２分間、３回行った。その菌体破砕液を１０，０００ｒｐｍ（１２，０００×ｇ）で２０分間遠心分離後、得られた溶解性画分をＺＺ−アポイクオリン精製の出発材料とした。
【００６４】
３） Ｑ−セファロースカラムクロマトグラフ法によるＺＺ−アポイクオリンの精製
上記２）で得られた溶解性画分（２００ ｍｌ）を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．６）で平衡化したＱ−セファロースカラム（アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ：直径２．５×６ｃｍ）に添加して吸着させた後、カラムを２５０ ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．６）で洗浄した。カラムに吸着した蛋白質を全量１００ｍｌで、塩化ナトリウム濃度０〜１．０Ｍの直線濃度勾配により溶出した。塩化ナトリウム濃度０．４５〜０．６５Ｍにて発光活性を有するＺＺ−アポイクオリンの溶出が確認された（２５ ｍｌ；ＺＺ−アポイクオリン活性画分）。
【００６５】
４） ニッケルキレートカラムクロマトグラフ法によるＺＺ−アポイクオリンの精製
Ｑ−セファロースカラムから溶出したＺＺ−アポイクオリン活性画分を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．６）で平衡化したニッケルキレートカラム（アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ：直径１．５×５ｃｍ）に添加してＺＺ−アポイクオリンを吸着させた。吸着したＺＺ−アポイクオリンを、全量１００ｍｌで、イミダゾール濃度０〜０．３Ｍ（和光純薬工業社製）の直線濃度勾配により溶出した。イミダゾール濃度０．０６〜０．１２Ｍにて、発光活性を有するＺＺ−アポイクオリンの溶出が確認された（２６ ｍｌ；ＺＺ−アポイクオリン活性画分）。
【００６６】
５） ＩｇＧ−セファロースカラムクロマトグラフ法によるＺＺ−アポイクオリンの精製
ニッケルキレートカラムから溶出したＺＺ−アポイクオリン活性画分の一部を、アミコンウルトラ−４ 遠心フィルターデバイス（分子量１０，０００カット；ミリポア社製）を用いて濃縮した。濃縮した溶液４ｍｌを、ＩｇＧーセファロース ６ＦａｓｔＦｌｏｗカラム（アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ：直径１．５×４ｃｍ）に添加して、ＺＺ−アポイクオリンを吸着させた。吸着したＺＺ−アポイクオリンを、０．５Ｍの酢酸アンモニウム（ｐＨ３．４）（和光純薬工業社製）にて溶出した。
１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法により、純度は９５％以上であることを確認した。
ＩｇＧ−セファロースクロマトグラフ法により、純度９５％以上で７．８ｍｇの精製した本発明の融合蛋白質（ＺＺ−アポイクオリン）を得た。
【００６７】
［実施例３］
本発明のホロ蛋白質（ＺＺ−イクオリン）の調製法
本発明の融合蛋白質（ＺＺ−アポイクオリン）から本発明のホロ蛋白質（ＺＺ−イクオリン）への変換は、以下の条件で行った。
実施例２で得た精製ＺＺ−アポイクオリン（１ｍｇ）を１０ｍＭ ＤＴＴ及び、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．６） ５ｍｌに溶解し、エタノールに溶解した１．２倍当量のセレンテラジン ２４μｇを加え、４℃で一昼夜放置し、ＺＺ−イクオリンへと変換した。得られたＺＺ−イクオリンは、アミコンウルトラ−４（分子量１０，０００カット）で濃縮後、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．６） ８ｍｌ（２ｍｌで４回）で洗浄し、余剰のセレンテラジンを除いた。活性の回収率９５％でＺＺ−イクオリンを得た。
【００６８】
［参考例１］
本発明のホロ蛋白質（ＺＺ-イクオリン）を検出プローブとした、脱リン酸化ミエリン塩基性タンパク質へのＭＡＰＫ１活性の評価
【００６９】
（１）脱リン酸化ミエリン塩基性タンパク質のプレートへの固相化
脱リン酸化ミエリン塩基性タンパク質（以降ＤＰ-ＭＢＰと略記、ミリポア社製）を、０．０５％アジ化ナトリウム（和光純薬工業製）を含む５０ ｍＭ 炭酸緩衝液 （ｐＨ９．６）（以降、炭酸緩衝液と表記）にて５ μｇ／ｍｌに調製し、９６穴白色マイクロプレート （サーモ社製、 ＃４３７７９６）に１００μｌ／ウェルで分注後、室温（２５℃）にて一晩静置して、固相化脱リン酸化ミエリン塩基性タンパク質プレート（以降、ＤＰ-ＭＢＰプレートと表記）を得た。
【００７０】
（２）ＤＰ−ＭＢＰ固相化プレートのブロッキング
（１）で得られたＤＰ-ＭＢＰプレートを静置後、コーティング液を除去し、１％牛血清アルブミン（フラクションＶ、シグマ社製）、２ｍＭ ＥＤＴＡ（ＥＤＴＡ・２Ｎａ、同仁化学製）、０．０５％ アジ化ナトリウムを含む１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（和光純薬工業製）、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（和光純薬工業製）（以降、ＴＢＳと表記）（以降、ポストコーティング液と表記）を２００μｌ／ウェルで分注して４℃にて一晩静置して、ブロッキングされたＤＰ-ＭＢＰプレートを得た。
【００７１】
（３）リン酸化反応
分裂促進因子活性化蛋白質キナーゼ１（ミリポア社製、以降、ＭＡＰＫ１と表記）を、０．１ｍＭ バナジン酸ナトリウム（和光純薬工業製）、０．１％牛血清アルブミン、０．１％ ２−メルカプトエタノール（和光純薬工業製）、４０ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．６）（以降、ＭＡＰＫ１希釈緩衝液と表記）で０．６ ｎｇ／μｌに調製した。
（２）で得られた、ブロッキングされたＤＰ−ＭＢＰプレートのポストコーティング液を捨て、３４０μｌの２ｍＭ ＥＤＴＡと０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（以降ＴＢＳＴ-Ｅと表記）にて３回洗浄した後、２０μＭ ＥＧＴＡ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）（以降反応緩衝液と表記）を１０μｌ、水を１５μｌ、０．６ ｎｇ／μｌのＭＡＰＫ１を５μｌ（３ ｎｇ）加え、２５ ｍＭ 酢酸マグネシウムを含む２．５ ｍＭ ＡＴＰ溶液（以降ＡＴＰ溶液と表記）を２０ μｌ加え（ＡＴＰ最終濃度１ ｍＭ）、全量５０μｌ／ウェルにて２５℃、1時間リン酸化反応を行った。
【００７２】
（４）抗体反応
（３）の反応系から反応液を捨て、ＴＢＳＴ−Ｅにてよく洗浄した後、０．４％ ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル製）、５ ｍＭ ＥＤＴＡを含むＴＢＳ（以降、抗体希釈緩衝液と表記）で６．６ ｐｍｏｌ／ｍｌに調製した抗-リン酸化セリン／スレオニン抗体（ミリポア社製）を１００μｌ／ウェル加え、２５℃にて１時間反応させた後、反応液を除去し、ＴＢＳＴ-Ｅにてよく洗浄して、「抗リン酸化抗体−基質複合体」を得た。
【００７３】
（５）本発明のホロ蛋白質（ＺＺ−イクオリン）の反応
実施例３で得られたＺＺ−イクオリンを抗体希釈緩衝液で０．３ ｐｍｏｌ／ｍｌに調製した溶液を、（４）で得られた抗リン酸化抗体−基質複合体に対して、１００μｌ／ウェル加え、２５℃にて１時間反応させた後、反応液を除去し、ＴＢＳＴ-Ｅにてよく洗浄して、「ＩｇＧのＦｃ領域に結合できる機能を有する領域及びカルシウム結合型発光蛋白質の領域が融合したホロ蛋白質−抗リン酸化抗体−基質複合体」を得た。
【００７４】
（６）発光強度の検出
（５）で得られた、ＩｇＧのＦｃ領域に結合できる機能を有する領域及びカルシウム結合型発光蛋白質の領域が融合したホロ蛋白質−抗リン酸化抗体−基質複合体に対して、Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０ （ベルトールド社製）にて、５０ ｍＭ 塩化カルシウムを含む５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ （ｐＨ７．６）（以降カルシウム溶液と表記）を１００ μｌ／ウェル注入して、発光強度を０．１秒間隔で５秒間測定し、最大発光強度値（Ｉｍａｘ） （Ｓ値）を算出した。データは４回測定の平均を表す。結果を表１に示す。
【００７５】
［参考例２］
参考例１の（３）リン酸化反応においてＭＡＰＫ１を使用しない以外は参考例１と同様の操作を行い、最大発光強度値（Ｉｍａｘ）（Ｎ値）を算出した。データは４回測定の平均を表す。結果を表１に示す。
【００７６】
【表１】
Ｓ値＝３ｎｇのＭＡＰＫ１添加区（参考例１）のＩｍａｘ
Ｎ値＝ＭＡＰＫ１無添加区（参考例２）のＩｍａｘ
Ｓ／Ｎ＝（３ｎｇのＭＡＰＫ１添加区のＩｍａｘ）／（ＭＡＰＫ１無添加区のＩｍａｘ）
表１に示された通り、参考例１の方法に基づき、本発明のホロ蛋白質（ＺＺ-イクオリン）を用いてリン酸化反応を検出できることが確認された。
【００７７】
［実施例４］
脱リン酸化ミエリン塩基性タンパク質へのＭＡＰＫ１活性阻害評価
（１）ステップａ：リン酸化反応
参考例１に記載と同様の方法にて、ＤＰ−ＭＢＰを固相化後、ポストコーティングを施した９６穴白色プレートを、ＴＢＳＴ-Ｅにてよく洗浄した後、キナーゼの阻害剤であるスタウロスポリン（カルビオケム社製）を最終濃度が０．３μＭになるように、ジメチルスルホキシド（和光純薬工業製）にて希釈系列を作製し、反応緩衝液を１０μｌ、水１０μｌ、スタウロスポリン５μｌ、ＭＡＰＫ１希釈緩衝液で０．６ ｎｇ／μｌに調製したＭＡＰＫ１を５μｌ加えて攪拌した。最後に２５μＭ ＡＴＰ溶液を２０μｌ加えて（最終濃度１０ μＭ）攪拌し、全量５０μｌ／ウェルにて２５℃、１時間リン酸化反応を行った。
【００７８】
（２）ステップｂ：抗体反応
ステップａの反応系から反応液を捨て、ＴＢＳＴ−Ｅにてよく洗浄した後、抗体希釈緩衝液で６．６ ｐｍｏｌ／ｍｌに調製した抗-リン酸化セリン／スレオニン抗体を１００μｌ／ウェル加え、２５℃にて１時間反応させた後、反応液を除去し、ＴＢＳＴ-Ｅにてよく洗浄して、抗リン酸化抗体−基質複合体を得た。
【００７９】
（３）ステップｃ：本発明のホロ蛋白質（ＺＺ−イクオリン）の反応
実施例３で得られたＺＺ−イクオリンを抗体希釈緩衝液で０．３ ｐｍｏｌ／ｍｌに調製した溶液を、ステップｂで得られた抗リン酸化抗体−基質複合体に対して、１００ μｌ／ウェル加え、２５℃にて１時間反応させた後、反応液を除去し、ＴＢＳＴ−Ｅにてよく洗浄して、ＩｇＧのＦｃ領域に結合できる機能を有する領域及びカルシウム結合型発光蛋白質の領域が融合したホロ蛋白質−抗リン酸化抗体−基質複合体、を得た。
【００８０】
（４）ステップｄ：発光強度の検出（発光強度Ｘの測定）
ステップｃで得られた、ＩｇＧのＦｃ領域に結合できる機能を有する領域及びカルシウム結合型発光蛋白質の領域が融合したホロ蛋白質−抗リン酸化抗体−基質複合体、に対して、Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０にて、カルシウム溶液を１００ μｌ／ウェル注入して、発光強度を０．１秒間隔で５秒間測定し、最大発光強度値（Ｉｍａｘ）（Ｓ値）を算出した。
【００８１】
結果を表２及び図１に示す。データは３回測定の平均を表す。
【００８２】
［実施例５〜７］
実施例４の（１）リン酸化反応においてスタウロスポリン（カルビオケム社製）の最終濃度をそれぞれ１、１０、又は１００μＭに変更した以外は実施例４と同様に操作を行い、最大発光強度値（Ｉｍａｘ）（Ｓ値）を算出した。結果を表２及び図１に示す。データは３回測定の平均を表す。
【００８３】
［参考例３］
実施例４の（１）リン酸化反応においてＭＡＰＫ１及びスタウロスポリンを添加しない以外は実施例５と同様に操作を行い、最大発光強度値（Ｉｍａｘ）（Ｎ値）を算出した。結果を表２に示す。データは３回測定の平均を表す。
【００８４】
［参考例４］
ステップｅ：阻害候補物質を用いない例（発光強度Ｙの測定）
実施例４の（１）リン酸化反応においてスタウロスポリンを添加しない以外は実施例５と同様に操作を行い、最大発光強度値（Ｉｍａｘ）（Ｓ値）を算出した。結果を表２及び図１に示す。データは３回測定の平均を表す。
【００８５】
【表２】
Ｓ値＝３ｎｇのＭＡＰＫ１添加区（参考例４、及び実施例４〜７）のＩｍａｘ
Ｎ値＝ＭＡＰＫ１無添加区（参考例３）のＩｍａｘ
Ｓ／Ｎ＝（３ｎｇのＭＡＰＫ１添加区のＩｍａｘ）／（ＭＡＰＫ１無添加区のＩｍａｘ）
リン酸化率（％）＝ＭＡＰＫ１添加＋スタウロスポリン無添加区のＩｍａｘを１００％とした時の各区のＩｍａｘを％で表した値。
【００８６】
実施例４〜７に示された通り、本発明のホロ蛋白質（ＺＺ−イクオリン）を用いて発光強度を検出した場合、スタウロスポリン濃度が上昇するにつれて、Ｉｍａｘが低下しているのが分かる。
【００８７】
以上の結果から、本発明のホロ蛋白質を用いて発光強度を検出した場合、プロテインキナーゼ阻害剤であるスタウロスポリンにおける濃度依存的な発光強度の低下が認められ、ＭＡＰＫ１のリン酸化酵素活性阻害の定量的検出ができることが確認された。すなわちこの系がリン酸化酵素阻害物質スクリーニングとして有用であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明は、リン酸化酵素の阻害物質の特定を可能にすることにより、リン酸化酵素が関与する疾患の予防薬・治療薬の開発に役立つ。
【配列表フリーテキスト】
【００８９】
［配列番号：１］ＺＺドメインのアミノ酸配列を示す。
［配列番号：２］配列番号：１で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：３］アポイクオリンのアミノ酸配列を示す。
［配列番号：４］配列番号：３で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：５］ＺＺ−アポイクオリンのアミノ酸配列を示す。
［配列番号：６］実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：７］実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：８］実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：９］実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテインＡのＩｇＧ結合領域（ＺＺドメイン）が融合したカルシウム結合型発光蛋白質（以降本発明のホロ蛋白質と略記）を用いたリン酸化酵素阻害物質のスクリーニング方法、及びリン酸化酵素阻害物質のスクリーニングにおいて使用するための本発明のホロ蛋白質に関する。
【背景技術】
【０００２】
カルシウム結合型発光蛋白質はカルシウムイオンと特異的に反応し、瞬間発光する蛋白質である。具体的には、イクオリン、オベリン、クライチン、マイトロコミン、ミネオプシン及びベルボイン等が知られている。これらのカルシウム結合型発光蛋白質のカルシウムイオンに対する感受性は非常に高く（１０−７〜１０−５Ｍ カルシウムイオン濃度）、その発光感度もまた、市販の検出装置における検出限界が１ピコグラム以下と非常に高いものである。そのため、カルシウム結合型発光蛋白質は、前述のような特徴を活かし、細胞内カルシウムや血液中の微量カルシウムイオンの検出、定量に用いられている。
【０００３】
カルシウム結合型発光蛋白質の代表例は、発光オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ ａｅｑｕｏｒｅａ）などから得られるイクオリン（Ａｅｑｕｏｒｉｎ）である。イクオリンは、アポ蛋白質であるアポイクオリン(Ａｐｏａｅｑｕｏｒｉｎ)と、発光基質に相当するセレンテラジン（Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ）と、分子状酸素とが複合体を形成した状態で存在している。イクオリン分子にカルシウムイオンが結合すると、青色（極大波長４６０ｎｍ）の光を瞬間発光し、セレンテラジンの酸化物であるセレンテラミド（Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｍｉｄｅ）と二酸化炭素を生成する。
【０００４】
ヒトをはじめとする生物では、その外的環境の変化により、細胞レベルで様々な応答反応が引き起こされる。これらの応答としては、細胞運動、細胞死、生理活性物質の産生などが挙げられ、場合により、産生された生理活性物質の刺激によって他の細胞がさらなる応答反応を示す。このような応答反応には、タンパク質リン酸化を介した細胞内情報伝達が深く関わっている。遺伝子転写、タンパク質翻訳、分子輸送、タンパク質間相互作用、その他の様々な現象がタンパク質リン酸化を介した情報伝達によって制御されていることは広く知られている。また、ある種のリン酸化酵素が疾患時に活性化されること、及び遺伝子変異等によりリン酸化酵素が制御不能となることが疾患の原因となり得ることも示唆されている（非特許文献１）。
【０００５】
このように、蛋白質リン酸化反応は細胞の活動にとって重要な働きを担っている。上記の通り、ある種のリン酸化酵素は疾患に関連する場合もあるため、特定のリン酸化治療薬・予防薬を開発することが可能になる。したがって、そのような阻害物質のスクリーニングを正確、迅速且つ低コストで行う方法が必要とされている。
【０００６】
リン酸化酵素阻害物質のスクリーニング方法は、例えば以下の手法が挙げられる。
（１）リン酸化された特定のペプチド又は蛋白質に特異的に結合するが、リン酸化されていない同一のペプチド又は蛋白質には実質的に結合しない抗体（以下、抗リン酸化抗体と略記）を用い、該ペプチド又は蛋白質をリン酸化酵素阻害候補物質と共にリン酸化酵素と作用させた後、抗リン酸化抗体を作用させ、該ペプチド又は蛋白質がどの程度リン酸化されたかを、西洋わさびペルオキシダーゼ標識した二次抗体を用いて発色、定量する手法や、抗リン酸化抗体を用いてウェスタンブロッティングやイムノブロッティングでリン酸化を定性する手法（特許文献１、２、３、４、５）。
（２）該ペプチド又は蛋白質をリン酸化酵素阻害候補物質と共にリン酸化酵素と作用させる際、放射ラベルされたＡＴＰをリン酸供与体として用い、放射線量を計数して該ペプチド又は蛋白質のリン酸化を定量する方法（特許文献２、６）。
（３）該ペプチド又は蛋白質のリン酸化酵素によるリン酸化の際、又は後に金属コロイドを混合して、リン酸化の程度を金属コロイドの凝集によって定量する方法等が提案されている（特許文献７）。
【０００７】
また、(４)カルシウム結合型発光蛋白質「イクオリン」で標識した抗リン酸化抗体を用いて基質ペプチドのリン酸化を定量する手法（特許文献８）などが挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第４２７０５４８号公報
【特許文献２】国際公開第０１／０１１３６７号
【特許文献３】特開２０００−３２５０８６号公報
【特許文献４】特表２００８−５０４０２２号公報
【特許文献５】特開２００５−１１２８１２号公報
【特許文献６】特表平１１−５１２５２３号公報
【特許文献７】特開２００８−７９６１０号公報
【特許文献８】特開２００９−２３６９０５号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｋｉｙｏｉ，Ｈ．、外６名、Ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｓｅｐ．１９９８、１２（９）、ｐ．１３３３〜１３３７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
（１）の抗リン酸化抗体を用いて発色定性する手法は、どの程度リン酸化されたのかを定量的に把握する点で必ずしも十分ではなかった。また発色により定量する手法は、測定できるレンジ及び検出感度に改善の余地があった。
【００１１】
（２）の放射ラベルを使用する手法は、放射性物質を取り扱うため、その取り扱いに細心の注意を払う必要があり、また特別な施設を必要とすることから、汎用性が十分ではなかった。
【００１２】
また、（３）の金属コロイドの凝集を利用する手法は、測定できるレンジが狭く、検出感度に改善の余地があった。
【００１３】
一方、（４）の方法であれば、測定できるレンジも広く、高い検出感度が得られる有効な手法であるが、抗リン酸化抗体とイクオリンを予め標識する工程が必要である上、標識工程で貴重な抗体をロスする可能性がある。更にある特定の基質ペプチドに対するリン酸化検出だけの使用に限定され、汎用性が十分ではなかった。
【００１４】
このような状況において、測定が容易であり、測定レンジが広く、汎用性の高いリン酸化酵素阻害物質のスクリーニング方法の提供が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記の課題を解決するために、リン酸化反応を効果的に検出する手段を開発し、そのような手段を用いたリン酸化酵素阻害物質のスクリーニング方法を完成させた。
【００１６】
より詳細には、本発明は、以下の特徴を有する：
［１］リン酸化酵素阻害物質のスクリーニング方法であって、当該方法が阻害候補物質を用いた時の発光強度Ｘと阻害候補物質を用いない時の発光強度Ｙとを比較して、発光強度Ｘが発光強度Ｙより低い場合に該阻害候補物質が該リン酸化酵素の活性を阻害する物質であることを確認する方法であり、かつ以下の（ａ）〜（ｅ）のステップ：
（ａ）阻害候補物質の存在下で、基質である蛋白質又はペプチドのリン酸化が可能な条件において、該基質にリン酸化酵素を作用させるステップ、
（ｂ）抗リン酸化抗体を、ステップ（ａ）でリン酸化酵素を作用させた基質と接触させるステップ、
（ｃ）免疫グロブリン（以降ＩｇＧと略記）のＦｃ領域に結合できる機能を有する領域及びカルシウム結合型発光蛋白質の領域が融合したホロ蛋白質を、ステップ（ｂ）で作用させた抗リン酸化抗体−基質複合体と接触させるステップ、
（ｄ）カルシウムを添加し、ＩｇＧのＦｃ領域に結合できる機能を有する領域及びカルシウム結合型発光蛋白質の領域が融合したホロ蛋白質−抗リン酸化抗体−基質複合体から生じる、発光強度Ｘを検出するステップ、
（ｅ）ステップ（ａ）において阻害候補物質を用いない以外は、ステップ（ａ）〜（ｄ）と同様に操作を行い、発光強度Ｙを検出するステップ、
を含み、ここで該抗リン酸化抗体は、該リン酸化酵素によりリン酸化された基質に特異的に結合可能なものである、上記方法。
［２］前記基質が固体支持体に固相化されている、［１］に記載の方法。
［３］前記ＩｇＧのＦｃ領域に結合できる機能を有する領域及びカルシウム結合型発光蛋白質の領域が融合したホロ蛋白質が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される第１の領域及び（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択される第２の領域を含有する融合蛋白質並びにセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドとを含むホロ蛋白質である、［１］又は［２］に記載の方法。
（１）第１の領域：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、及び
（ｄ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域。
（２）第２の領域：
（ｅ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域、
（ｆ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、及び
（ｈ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域。
［４］前記ＩｇＧのＦｃ領域に結合できる機能を有する領域及びカルシウム結合型発光蛋白質の領域が融合したホロ蛋白質が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される第１の領域と（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択される第２の領域を含有する融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドとを含むホロ蛋白質である、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の方法。
（１）第１の領域：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、及び
（ｄ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域。
（２）第２の領域：
（ｅ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域、
（ｆ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、及び
（ｈ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域。
［５］前記ＩｇＧのＦｃ領域に結合できる機能を有する領域及びカルシウム結合型発光蛋白質の領域が融合したホロ蛋白質が、
（１）配列番号：１で表される第１のアミノ酸配列からなる領域及び、
（２）配列番号：３で表される第２のアミノ酸配列からなる領域
を含有する融合蛋白質並びにセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドとを含むホロ蛋白質である、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の方法。
［６］前記ＩｇＧのＦｃ領域に結合できる機能を有する領域及びカルシウム結合型発光蛋白質の領域が融合したホロ蛋白質が、配列番号：５のアミノ酸配列からなる融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドとを含むホロ蛋白質である、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記リン酸化酵素が、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ２ 、ＪＮＫ、ｐ３８、Ａｋｔ、Ａｕｒｏｒａ Ａ、Ａｕｒｏｒａ Ｂ 、Ａｕｒｏｒａ Ｃ、ＰＫＡ 、ＭＳＫ１ 、ＰＫＣ ε、ＣＲＩＫ 、ＮＤＲ１ 、ＤＹＲＫ１Ａ 、Ｒｓｋ２ 、ＰＩＭ１ 、ＰＡＫ１ 、ＩＫＫ α、ＪＩＬ −１ 、ＶＲＫ１ 、Ｓｎｆ１ 、ＰＢＫ ／ＴＯＰＫ 、ＭＮＫ１ 、ＭＮＫ２ 、ＭＲＣＫ α、ＰＡＫ２ 、ＷＮＫ２ 、ＷＮＫ３、ＡＫ、ＣＫ２、ＭＢＰＫ、ｃＰＫ、及びｃｄＫである、［１］〜［６］のいずれか１項に記載の方法。
［８］前記抗リン酸化抗体が、リン酸化されたミエリン塩基性蛋白質を認識できるものである、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］前記基質が、ミエリン塩基性蛋白質である、［１］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］［３］〜［６］のいずれかに記載の融合蛋白質、及び対象となるリン酸化酵素の基質を含む、リン酸化酵素阻害物質のスクリーニングのためのキット。
［１１］前記基質がミエリン塩基性蛋白質である、［１０］に記載のキット。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、疾患の治療薬・予防薬として応用可能なリン酸化酵素阻害物質をより簡便に見出すことができる。
【００１８】
以下に、本発明の実施の形態において実施例を挙げながら具体的かつ詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、本発明のホロ蛋白質（ＺＺ−イクオリン）を用いて検出したスタウロスポリンによるＭＡＰＫ１のリン酸化活性阻害を表すプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明において、「リン酸化酵素」とは、細胞内で標的蛋白質をリン酸化する活性を有することが知られている蛋白質である。本発明におけるリン酸化酵素は、セリン／スレオニン特異的なものでもよいし、チロシン特異的なものでもよい。具体的なリン酸化酵素としては、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ２ 、ＪＮＫ、ｐ３８、Ａｋｔ、Ａｕｒｏｒａ Ａ、Ａｕｒｏｒａ Ｂ 、Ａｕｒｏｒａ Ｃ、ＰＫＡ 、ＭＳＫ１ 、ＰＫＣ、ＣＲＩＫ 、ＮＤＲ１ 、ＤＹＲＫ１Ａ 、Ｒｓｋ２ 、ＰＩＭ１ 、ＰＡＫ１ 、ＩＫＫ α、ＪＩＬ −１ 、ＶＲＫ１ 、Ｓｎｆ１ 、ＰＢＫ ／ＴＯＰＫ 、ＭＮＫ１ 、ＭＮＫ２ 、ＭＲＣＫ α、ＰＡＫ２ 、ＷＮＫ２ 、ＷＮＫ３、ＡＫ、ＣＫ２、ＭＢＰＫ、ｃＰＫ、及びｃｄＫなどが挙げられ、特に好適なリン酸化酵素は、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ２、ＪＮＫ、ｐ３８、Ａｋｔ、ＭＢＰＫ、及びＰＫＣ等が挙げられる。
【００２１】
本発明の方法で用いるリン酸化酵素は、生物組織から抽出・精製したものでもよいし、大腸菌又は哺乳動物細胞などの宿主細胞により組換え的に発現させた後、適宜精製したものでもよい。
【００２２】
本発明において「候補物質」とは、リン酸化酵素を阻害する活性を有することが予想されるいずれかの物質であり、例えば、動物・植物組織の抽出物若しくは微生物培養物等の複数の化合物を含む混合物、又はそれらから単離された標品；天然に生じる分子（例えば、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、蛋白質、核酸、脂質、ステロイド、糖タンパク質、プロテオグリカンなど）；天然に生じる物質の合成アナログ又は誘導体（例えば、ペプチドミメティクスなど）；天然に生じない分子（例えば、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製した低分子有機化合物）；並びにそれらの混合物を挙げることができる。本発明において「リン酸化酵素阻害物質」とは、対象となるリン酸化酵素の活性を阻害することが可能な物質である。
【００２３】
本発明の融合蛋白質は、発光基質であるセレンテラジンと接触させることによって、容易に本発明の融合蛋白質とセレンテラジンのペルオキシドを含有するホロ蛋白質を形成することができる。本発明のホロ蛋白質は、セレンテラジンと酸素の存在下において、本発明の融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシドとが複合体を形成した状態で存在する。前記複合体にカルシウムイオンが結合すると、瞬間的な発光を示す。したがって、本発明の融合蛋白質、本発明のホロ蛋白質などは、カルシウムイオンの検出又は測定に好適に利用することができる。
また、本発明の融合蛋白質は、ＩｇＧとの高い結合能力を有している。そして、上述のように、本発明の融合蛋白質と発光基質であるセレンテラジンのペルオキシドとを含むホロ蛋白質は、カルシウムイオンによって発光させることができる。したがって、本発明の融合蛋白質は、ＩｇＧの検出に好適に利用することができる。
【００２４】
本発明の融合蛋白質とは、配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域及び配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性又は機能を有する領域から選択される第１の領域と、配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域及び配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性又は機能を有する領域から選択される第２の領域とを含有する融合蛋白質を意味する。
【００２５】
本発明中、配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域及び配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性又は機能を有する領域から選択される第１の領域を、「ＺＺドメイン」と称することがある。配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域及び配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性又は機能を有する領域から選択される第２の領域を、「アポイクオリン」又は「アポＡＱ」と称することがある。
【００２６】
本発明の融合蛋白質はさらに翻訳促進のためのアミノ酸配列及び／又は精製のためのアミノ酸配列を含んでいてもよい。翻訳促進のためのアミノ酸配列としては、当技術分野において用いられているアミノ酸配列を使用することができる。翻訳促進のためのアミノ酸配列としては、例えば、ＴＥＥ配列などが挙げられる。精製のためのアミノ酸配列としては、当技術分野において用いられているアミノ酸配列を使用することができる。精製のためのアミノ酸配列としては、例えば、ヒスチジン残基が４残基以上、好ましくは６残基以上連続したアミノ酸配列を有するヒスチジンタグ配列、グルタチオン Ｓ−トランストランスフェラーゼのグルタチオンへの結合ドメインのアミノ酸配列などが挙げられる。
【００２７】
本発明の融合蛋白質として、例えば配列番号：５のアミノ酸配列からなる融合蛋白質などが挙げられる。
【００２８】
本発明の融合蛋白質の取得方法については特に制限はない。本発明の融合蛋白質としては、化学合成により合成した融合蛋白質でもよいし、遺伝子組換え技術により作製した組換え融合蛋白質であってもよい。本発明の融合蛋白質を化学合成する場合には、例えば、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等により合成することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。本発明の融合蛋白質を遺伝子組換え技術により作製する場合には、通常の遺伝子組換え手法により作製することができる。より具体的には、本発明の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を適当な発現系に導入することにより、本発明の融合蛋白質を作製することができる。本発明の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド、本発明の融合蛋白質の発現系での発現などについては、後記する。本発明中、本発明の融合蛋白質を、「ＺＺ−アポイクオリン」と称することもある。
【００２９】
本発明の融合蛋白質を、発光基質であるセレンテラジン又はその誘導体（例えば、h-セレンテラジン、e-セレンテラジン、cl-セレンテラジン、ch-セレンテラジン、hcp-セレンテラジンなど）と、酸素存在下に接触させることにより、本発明の融合蛋白質とセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドとを含むホロ蛋白質を得ることができる。本発明中、「セレンテラジン又はその誘導体」を、単に「セレンテラジン」と称することがある。本発明中、本発明の融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドとを含むホロ蛋白質を、「本発明のホロ蛋白質」と略記するが、「ＺＺ−イクオリン」、「ＺＺ−ＡＱ」、又は「本発明の発光蛋白質」と称することもある。
【００３０】
本発明のホロ蛋白質としては、（１）本発明の融合蛋白質とセレンテラジンのペルオキシドとを含むホロ蛋白質、（２）本発明の融合蛋白質とセレンテラジン誘導体のペルオキシドとを含むホロ蛋白質などが挙げられる。本発明の融合蛋白質とセレンテラジン誘導体のペルオキシドとを含むホロ蛋白質としては、例えば、本発明の融合蛋白質とh-セレンテラジンのペルオキシドとを含むホロ蛋白質、本発明の融合蛋白質とe-セレンテラジンのペルオキシドとを含むホロ蛋白質、本発明の融合蛋白質とcl-セレンテラジンのペルオキシドとを含むホロ蛋白質、本発明の融合蛋白質とch-セレンテラジンのペルオキシドとを含むホロ蛋白質、本発明の融合蛋白質とhcp-セレンテラジンのペルオキシドとを含むホロ蛋白質などが挙げられる。本発明のホロ蛋白質は、本発明の融合蛋白質とセレンテラジンとから、公知のカルシウム結合発光蛋白質（例えば、イクオリンなど）と同様にして製造することができる。より具体的には、本発明のホロ蛋白質は、例えば、Biochem. J. 261, 913-920 (1989)などに記載の製造方法に準じる方法によって製造することができる。本発明のホロ蛋白質は、本発明の融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシドとが複合体（本発明の発光蛋白質）を形成した状態で存在する。前記複合体（本発明の発光蛋白質）にカルシウムイオンが結合すると、瞬間的な発光を示し、セレンテラジンの酸化物であるセレンテラミドと二酸化炭素を生成する。
（第１の領域）
【００３１】
第１の領域とは、配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域又は配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性又は機能を有する領域を意味する。
配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性又は機能とは、例えば、ＩｇＧのＦｃ領域に結合することができる活性又は機能を意味する。ＩｇＧのＦｃ領域に結合することができる活性又は機能は、例えば、ウエスタンブロティング法などに従って測定することができる。
【００３２】
第１の領域としては、より具体的には、例えば（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域；（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性又は機能を有する領域などが挙げられる。
本明細書において、「１〜複数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列」における「１〜複数個」の範囲は、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個（１〜数個）、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、１個である。欠失、置換、挿入、及び／又は付加したアミノ酸の数は、一般的に少ないほど好ましい。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入、及び付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。このような領域は、「モレキュラークローニング第３版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、又は“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
【００３３】
また、第１の領域としては、例えば、（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列と約７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性又は機能を有する領域も挙げられる。さらに、第１の領域としては、より具体的には、例えば、配列番号：１のアミノ酸配列と約７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる活性又は機能を有する領域が挙げられる。上記同一性の数値は、一般的に大きいほど好ましい。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ（例えば、Altzshul S. F. et al., J. Mol. Biol. 215, 403 (1990)、など参照）やＦＡＳＴＡ（Pearson W. R., Methods in Enzymology 183, 63 (1990)、など参照）等の解析プログラムを用いて決定できる。ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００３４】
さらに、第１の領域には、（ｄ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性又は機能を有する領域も含まれる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドについては、後記する。
（第２の領域）
【００３５】
第２の領域とは、配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域又は配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性又は機能を有する領域を意味する。
配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性又は機能とは、例えば、（i）前記領域がセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合することができる機能、（ii）前記領域がセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合して、カルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を意味する。なお、発光の測定は、例えば、Shimomura 0.et al (1988) Biochem. J.251,405-410 及びShimomura 0.et al. Biochem. J. (1989)261, 913-920などに記載の方法によって測定することができる。 具体的には、例えば、酸素存在下、前記領域にセレンテラジン又はセレンテラジン誘導体を結合させ、カルシウム溶液を加えることにより発光反応を開始させることができる。さらに、発光測定装置を用いて発光活性又は発光パターンを測定することができる。発光測定装置としては、市販されている装置、例えば、AB-2200（アトー社製）、Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０（ベルトールド社製）などを使用することができる。
【００３６】
第２の領域としては、より具体的には、例えば（ｅ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域；（ｆ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性又は機能を有する領域などが挙げられる。ここで、「１〜複数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列」における「１〜複数個」の範囲は、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個（１〜数個）、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、１個である。欠失、置換、挿入、及び／又は付加したアミノ酸の数は、一般的に少ないほど好ましい。
【００３７】
また、第２の領域としては、例えば、（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列と約７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性又は機能を有する領域も挙げられる。さらに、第２の領域としては、より具体的には、例えば、配列番号：３のアミノ酸配列と約７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ（i）セレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合することができる機能、又は（ii）セレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合して、カルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域が挙げられる。上記同一性の数値は、一般的に大きいほど好ましい。
【００３８】
さらに、第２の領域には、（ｈ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性又は機能を有する領域も含まれる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドについては、後記する。
【００３９】
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）」とは、配列番号：２又は４の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド又は配列番号：１又は３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）をいう。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（Saline-sodium citrate）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドをあげることができる。
【００４０】
ハイブリダイゼーションは、Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、Ausbel F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley and Sons (1987-1997)、Glover D. M. and Hames B. D., DNA Cloning 1: Core Techniques, A practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００４１】
本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％(w/v)SDS、50％(v/v)ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％(w/v)SDS、50％(v/v)ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5(w/v)％SDS、50％(v/v)ホルムアミド、50℃の条件である。条件を厳しくするほど、二本鎖形成に必要とする相補性が高くなる。具体的には、例えば、これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００４２】
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコールにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたＤＮＡを検出することができる。
【００４３】
本発明においてカルシウム結合型発光蛋白質を用いる利点としては、カルシウムの添加という簡便な処理により発光が生じること、発光・検出の際に、検体中の分子全体としての発光がカルシウムの結合から短時間に、例えば数秒以内にピークに達することなどが挙げられる。発光は、好適にはカルシウムの結合から１秒以内にピークに達する。カルシウムの結合から短時間で発光がピークに達することは、分子間での発光のタイミングのばらつきが少ないこと、すなわち、ほぼすべての分子が同時に発光することを表す。これにより、検出感度が上昇する。
【００４４】
カルシウム結合型発光蛋白質を用いることの他の利点は、（１）検出を発光により行うため、蛍光色素を用いる場合に問題となる検出の際の励起光の漏れがないこと、（２）その発光がカルシウムとの結合に依存するため、アルカリホスファターゼや西洋ワサビペルオキシダーゼを用いる化学発光の場合に問題となるバックグラウンドがないこと、（３）その発光がカルシウムとの結合に依存し、検出の時点でのみ発光させることができるため、検出前の処理中の基質の分解を考慮する必要がないこと、（４）放射性同位体や発癌性色素などの危険物質を用いないことなどである。
【００４５】
本発明において「抗リン酸化抗体」とは、リン酸化された特定のペプチド又は蛋白質に特異的に結合するが、リン酸化されていない同一のペプチド又は蛋白質には実質的に結合しない抗体を意味する。そのような抗体では、標的ポリペプチドやアミノ酸がリン酸化されている場合の結合強度が、リン酸化されていない場合と比較して、例えば１０倍以上、５０倍以上、１００倍以上、１，０００倍以上、又は１０，０００倍以上である。上記結合強度は、一般的に高いほど好ましい。抗リン酸化抗体は、様々な標的に対するものが市販されている。例えば、抗リン酸化ＣＲＥＢ（セリン）ウサギ抗体、抗リン酸化Ｊａｋ２（チロシン）ウサギ抗体、抗リン酸化セリン/スレオニンマウス抗体などが挙げられる。
【００４６】
本発明における抗リン酸化抗体は、特に限定されるものではないが、ポリクローナル抗体（例えば、ＩｇＧ 、ＩｇＭ 、ＩｇＡ 、ＩｇＤ 、又はＩｇＥ ）、モノクローナル抗体、又は抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ 、Ｆ （ａｂ ’）２ 、Ｆｖ 、又はｓｃＦｖ ）のいずれであってもよい。抗リン酸化抗体は、市販されているものを購入してもよいし、新たに作製してもよい。本発明の融合蛋白質に含まれるＩｇＧ結合領域のＩｇＧへの結合能の強さを考慮すると、好ましくは、ヒト由来ＩｇＧ若しくはＩｇＥ、又はマウス、ラット、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ブタ、イヌ、ハムスター、ロバ、ネコ、若しくはサル由来のＩｇＧ等が挙げられ、より好ましくは、ヒト由来ＩｇＧとしてのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、若しくはＩｇＧ４、マウス由来ＩｇＧとしてのＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、若しくはＩｇＧ３、ラット由来ＩｇＧとしてのＩｇＧ２ｃ、ウシ由来ＩｇＧとしてのＩｇＧ２、ヤギ由来ＩｇＧとしてのＩｇＧ２、ヒツジ由来ＩｇＧとしてのＩｇＧ２、ウサギ由来ＩｇＧ、ブタ由来ＩｇＧ、イヌ由来ＩｇＧ、ネコ由来ＩｇＧ、又はサル由来ＩｇＧ等を用いることができる。各抗体タイプの抗体の作製方法は当業者に公知である。特に、モノクローナル抗体の作製方法は当業者に公知であり、適切な免疫原でのマウスの免疫化、免疫されたマウス由来の脾臓細胞と、同系のマウス骨髄腫細胞とのハイブリドーマの作製、抗体産生ハイブリドーマのクローニング、及びクローニングされたハイブリドーマからの抗体の精製を含む。
【００４７】
タンパク質のリン酸化状態を検出する方法としては、放射性同位体である３２Ｐを用いる方法がよく知られているが、放射性同位体を用いる方法を実施するには、特別な施設が必要であり、また試薬を厳重に管理しなければならない。本発明の方法では、抗リン酸化抗体を用いて蛋白質のリン酸化状態を検出することにより、そのような問題を回避することができる。
【００４８】
本発明の方法において、「基質蛋白質又はペプチドのリン酸化が可能な条件」とは、対象となるリン酸化酵素による基質蛋白質又はペプチドのリン酸化が可能な条件である。例えば、グリセロリン酸、オルトバナジン酸等のリン酸化アッセイで通常用いられる試薬を含有する緩衝液に、対象となるリン酸化酵素及びＡＴＰを添加し、この緩衝液を基質蛋白質又はペプチドに作用させて室温〜３７℃でインキュベートする条件が挙げられる。
【００４９】
本発明において、基質蛋白質は、天然に存在する蛋白質を抽出、精製して取得してもよいし、遺伝子組換え技術により、該蛋白質の遺伝子が導入された大腸菌などの宿主細胞により発現させた後、適宜精製することによって取得してもよい。
【００５０】
本発明における基質蛋白質は、対象となるリン酸化酵素によって、リン酸化されうる蛋白質であれば、特に限定されないが、例えば、不活性化しているＲａｆ１、Ｂ-Ｒａｆ、Ｍｏｓ、ＴＰＬ２/ＣＯＴ、ＭＥＫＫ、ＭＬＫ、ＴＡＫ１、ＡＳＫ１、ＭＫＫ１、ＭＫＫ２、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＭＫ５、ＭＫＫ６、ＭＭＫ７、ＭＡＰＫ、ＥＲＫ５、ＪＮＫ、ｐ３８等の不活性化リン酸化酵素、Ｅｌｋ-１、Ｓａｐ−１、ＭＮＫ１／２、ｃ-Ｍｙｃ、ＭＥＦ２Ｃ、ｃ-Ｊｕｎ、ＡＴＦ-２、ＣＨＯＰ、ＭＡＰＫＡＰＫ−２／３等の転写因子、ミエリン塩基性蛋白質、ヒストン等の塩基性蛋白質やカゼインやフォスビチン等の酸性蛋白質などが挙げられる。本発明の方法においては、いずれの蛋白質を用いてもよいが、好ましくは、ミエリン塩基性蛋白質、ヒストン、カゼイン、フォスビチン等が用いられる。
【００５１】
本発明の方法において、基質ペプチドは適切なペプチド合成機を用いた化学合成により取得してもよいし、大腸菌などの宿主細胞により組換え的に発現させた後に適宜精製することによって取得してもよいし、市販されているペプチドを購入して用いることもできる。基質ペプチドは、対象となるリン酸化酵素によってリン酸化されうるペプチドであれば特に限定されないが、例えば、ＫＲＲＥＩＬＳＲＲＰＳＹＲ（ＣＲＥＢｔｉｄｅ）、ＬＲＲＡＳＬＧ（Ｋｅｍｐｔｉｄｅ）、ＲＲＲＬＳＳＬＲＡ-ＮＨ２(ＰＫＡ/ＰＫＣ/ＭＡＰＫＡＰ-Ｋ1Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＡＡＬＶＲＱＭＳＶＡＦＦＦＫ(ＰＫＣμ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＲＲＧＲＴＧＲＧＲＲＧＩＦＲ（ＰＫＣ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ５）、ＲＦＡＶＲＤＭＲＱＴＶＡＶＧＶＩＫＡＶＤＫＫ（ＰＫＣδ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＥＲＭＲＰＲＫＲＱＧＳＶＲＲＲＶ（ＰＫＣε Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＫＫＲＦＳＦＫＫＳＦＫＬ（ＭＡＲＣＫＳ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＰＬＳＲＴＬＳＶＡＡＫＫ-ＮＨ２（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ Ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＡＡＫＩＱＡＳＦＲＧＨＭＡＲＫＫ（Ｎｅｕｒｏｇｒａｎｉｎ）、ＱＫＲＰＲＲＫＤＴＰ（ＰＫＧ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ１）、ＲＫＲＳＲＡＥ（ＰＫＧ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ２）、ＲＫＩＳＡＳＥＦＤＲＰＬＲ（ＢＰＤＥｔｉｄｅ）、ＫＫＡＬＲＲＱＥＴＶＤＡＬ（Ａｕｔｏｃａｍｔｉｄｅ-２）、ＫＫＡＬＨＲＱＥＴＶＤＡＬ（Ａｕｔｏｃａｍｔｉｄｅ-３）、ＰＬＡＲＴＬＳＶＡＧＬＰＧＫＫ（Ｓｙｎｔｉｄｅ２）、ＰＬＳＲＴＬＳＶＳＳ-ＮＨ２（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ Ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＭＨＲＱＥＴＶＤＣＬＫ-ＮＨ２（ＣａＭ ＫｉｎａｓｅＩＩ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＡＲＫＲＥＲＴＹＳＦＧＨＨＡ（ＡＫＴ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧ（Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅ）、ＨＡＴＰＰＫＫＫＲＫ（ＣＤＫ１ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＰＫＴＰＫＫＡＫＫＬ（ＣＤＫ５ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＡＤＡＱＨＡＴＰＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＫＤＦ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ ｐ３４ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＫＱＡＥＡＶＴＳＰＲ（ＭＡＰＫ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ３）、ＫＲＥＬＶＥＰＬＴＰＳＧＥＡＰＮＱＡＬＬＲ-ＮＨ２（ＥＧＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＧＰＨＲＳＴＰＥＳＲＡＡＶ（ＧＳＫ-３β Ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＲＲＫＤＬＨＤＤＥＥＤＥＡＭＳＩＴＡ（Ｃａｓｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｉ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＲＲＡＤＤＳＤＤＤＤＤ（Ｃａｓｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ ＩＩ Ｓｕｂｓｔａｒｔｅ２）、ＫＶＥＫＩＧＥＧＴＹＧＶＶＹＫ（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ １）、ＡＤＥＹＬＩＰＱＱ（ＥＧＦＲ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＲＲＬＩＥＤＡＥＹＡＡＲＧ（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ３）、ＹＩＹＧＳＦＫ（ｐ６０ｃ-ｓｒｃ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＴＲＤＩＹＥＴＤＹＹＲＫ（Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＲＲＫＡＳＧＰ（Ｈ１-７、ＰＫＡ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＥＰＰＬＳＱＥＡＦＡＤＬＷＫＫ（ＤＮＡ-Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＤＤＤＥＥＳＩＴＲＲ（Ｃａｓｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｉ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＲＲＲＥＥＥＴＥＥＥ（Ｃａｓｅｉｎ ＫｉｎａｓｅＩＩ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＫＲＴＬＲＲ（ＰＫＣ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、ＧＫＧＲＧＬＳＬＳＲＦＳＷＧ（ＭＢＰ Ｆｒａｇｍｅｎｔ）、ＱＫＲＰＳＱＲＳＫＹＬ（ＭＢＰ Ｆｒａｇｍｅｎｔ）、ＫＫＬＲＲＴＬＳＶＡ（ＰＲＡＫ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ）、及びＡＲＴＫＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＣ（Ｋ9Ｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ）などが挙げられる。なお、上記基質ペプチドの例示においては、アミノ酸１文字表記を使用した。
【００５２】
本発明の方法により、リン酸化酵素の阻害物質を、迅速かつ簡便にスクリーニングすることが可能になる。特に、本発明の方法は、カルシウム結合型発光蛋白質を用いることにより、カルシウムの添加という簡便な処理により、カルシウムイオンの結合に際して瞬時に発光が起こり、その発光は数秒以内に終了する。このため、短時間にシグナル対ノイズ比（Ｓ ／Ｎ ）の高い検出を行うことができるという利点を有する。また、その発光はカルシウムとの結合に依存することから、検出の時点でのみ発光を生じさせることが可能であり、したがって検出前の処理中の基質の分解を考慮する必要がない。そのため、簡便な操作で、短時間で感度のよい検出が可能となるので、リン酸化酵素阻害物質のハイスループットスクリーニングに適している。
【００５３】
本発明の方法では、基質蛋白質又はペプチドは好ましくは固体支持体に固相化されている。好ましい固体支持体は、限定するものではないが、プラスチック製の測定用プレートである。
【００５４】
本発明の方法では、発光の検出は、使用するカルシウム結合型発光蛋白質の発光波長を検出しうる検出器を用いて行う。カルシウム結合型発光蛋白質の発光波長は当業者には公知であり、例えばイクオリンの場合、４７０ｎｍ 付近である。そのような検出器としては、市販のプレートリーダーが挙げられる。例えば、ベルトールド社のＣｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０を用いることができる。
【００５５】
本発明には、リン酸化酵素阻害物質のスクリーニングにおける使用のための、プロテインＡのＩｇＧ結合領域（ＺＺドメイン）が融合したカルシウム結合型発光蛋白質が包含される。
【００５６】
また、本発明には、少なくともＩｇＧ結合領域融合カルシウム結合型発光蛋白質、抗リン酸化抗体及び対象となるリン酸化酵素の基質を含む、リン酸化酵素阻害物質のスクリーニングのためのキットが包含される。該キットには、さらに、固定化担体、バッファー、陽性対照試料及び陰性対照試料、本発明のスクリーニング方法を利用した該キットの使用方法を記載した指示書等を含めることができる。
【実施例】
【００５７】
以下実施例をもって本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、本実施例において「％」は、特に断りがない限り「重量％」を意味する。
本発明のホロ蛋白質（ＺＺ−イクオリン）は、以下に示した実施例１〜３の通り、特願２００６−２２４７９４に記載の方法に準じて調製した。
【００５８】
［実施例１］
本発明の融合蛋白質（ＺＺ−アポイクオリン）融合遺伝子発現ベクターの構築
大腸菌において組換えＺＺ−アポイクオリンを発現させるために、ＺＺ遺伝子及びイクオリン遺伝子を以下に記載する方法に従って調製した。ＩｇＧ結合ドメインであるＺＺドメインをコードする ＺＺ遺伝子はｐＥＺＺ１８（アマシャムバイオサイエンス社）から、ＰＣＲ法により調製した。アポイクオリンをコードするイクオリン遺伝子はｐＡＱ４４０（特開昭６１−１３５５８６号公報参照）のコーディング領域であるＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ フラグメントを含むｐＡＭ−ＨＥよりＰＣＲ法により調製した。発現ベクターとしてｐＣｏｌｄ ＩＩ ベクター（タカラバイオ社）を使用した。ＺＺ−アポイクオリン発現ベクターの構築法は以下の通りである。
【００５９】
まず、pAM-HEを鋳型として２種のＰＣＲプライマー：
AQ-EcoRI-Met（5’ CCGGAATTC-ATG-AAA-CTT-ACA-TCA-GAC-TTC-GAC-AAC 3’（配列番号：６）；ＥｃｏＲＩ制限酵素部位はアンダーライン）及び
ＡＱ−Ｃ−ＳａｌＩ（5’ CGCGTCGAC-TTA-GGG-GAC-AGC-TCC-ACC-GTA-GAG-CTT 3’（配列番号：７）；ＳＡＬＩ制限酵素部位はアンダーライン）を用いて、ＰＣＲキット（タカラバイオ社製）にてＰＣＲ（サイクル条件25サイクル；１分／９４℃、１分／５０℃、１分／７２℃）を実施して、所望のイクオリン遺伝子領域を増幅した。得られたＤＮＡ断片をＰＣＲ精製キット（キアゲン社製）で精製した。前記の精製されたＤＮＡ断片を常法により制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩにて消化した後、ｐＣｏｌｄＩＩの制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ部位に連結することによって、発現ベクターｐＣｏｌｄ−ＡＱを構築した。
【００６０】
一方、ｐＥＺＺ１８を鋳型として２種のＰＣＲプライマー：
６ＺＺ−Ｎ−ＮｄｅＩ（5’ CCG CAT ATG GCG CAA CAC GAT GAA GCC GTG 3’（配列番号：８）；NdeI制限酵素部位はアンダーライン）及び
７ＺＺ−Ｃ−ＢａｍＨＩ（5’ GGC GGA TCC CGA GCT CGA ATT TGC GTC TAC 3’（配列番号：９）；ＢａｍＨＩ制限酵素部位はアンダーライン）を用いて、ＰＣＲキット（タカラバイオ社製）にてＰＣＲ（サイクル条件２５サイクル；１分／９４℃、１分／５０℃、１分／７２℃）を実施して、所望のＤＮＡ領域を増幅した。得られたＤＮＡ断片をＰＣＲ精製キット（キアゲン社製）で精製した。前記の精製されたＤＮＡ断片を常法により制限酵素ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩにて消化した後、ｐＣｏｌｄ−ＡＱの制限酵素ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ部位に連結することによって、発現ベクターであるｐＣｏｌｄ−ＺＺ−ＡＱを構築した。本発現ベクターは、低温で誘導可能であり、発現したＺＺ−ａｐｏＡＱは、アミノ末端にヒスチジンダグを有する。
【００６１】
［実施例２］
本発明の融合蛋白質（組換えＺＺ−アポイクオリン）の調製法
組換えＺＺ−アポイクオリンの調製は、以下に記載するように、組換えＺＺ−アポイクオリンを大腸菌で発現させた後、発現された該融合蛋白質を抽出し、抽出した組換えＺＺ−アポイクオリンを各種クロマトグラフ法を用いて精製することによって行った。
なお、精製過程における組換えＺＺ−アポイクオリンの発光活性の測定は、以下のようにして行った。まず、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．６）の緩衝液１ｍｌ 中で、粗ＺＺ−アポイクオリン溶液、２−メルカプトエタノール（１μｌ）、エタノールに溶解した発光基質であるセレンテラジン（１μｇ／μｌ）を混合した後、氷上（４℃）で2時間放置することにより発光活性を持つ本発明のホロ蛋白質（ＺＺ−イクオリン）を調製した。得られたＺＺ−イクオリン溶液に５０ｍＭ ＣａＣｌ２ １００μlを加えることにより発光反応を開始させ、発光測定装置ＰＳＮ ＡＢ２２００（アトー社製）で１０秒間発光活性の測定を行った。発光活性（最大値（Imax）など）は、相対発光強度（ｒｌｕ）で評価した。
【００６２】
１） 組換えＺＺ−アポイクオリンの大腸菌での発現
実施例１で得た発現ベクターpCold-ZZ-AQをポリエチレングリコール法により大腸菌BL21株に導入し、形質転換株を得た。得られた形質転換株を３７℃で１８時間培養した。培養後、その形質転換株をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有する１０ｍｌのＬＢ液体培地（水1リットルあたり、バクトトリプトン１０ｇ、イーストエクストラクト５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、ｐＨ７．２）に植菌し、さらに３７℃で１８時間培養を行った。次いで、その培養菌体液を新たなＬＢ液体培地２リットル（４００ｍｌｘ５本）に添加して、３７℃で４．５時間培養した。培養後、その培養菌体液を氷水上で冷却して、イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、和光純薬工業社製）を最終濃度0.1mMになるように培養液に添加し、１５℃にて１７時間培養を行った。培養菌体を、冷却遠心機により５分間、５，０００ｒｐｍ（６０００×ｇ）で集菌した。
【００６３】
２） 培養菌体からのＺＺ−アポイクオリンの抽出
上記１）で集菌した菌体を２００ ｍｌ（４０ｍｌｘ５本）の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．６）で懸濁し、氷冷下で超音波破砕処理（ブランソン社製、ソニファイアーモデル２５０）を各２分間、３回行った。その菌体破砕液を１０，０００ｒｐｍ（１２，０００×ｇ）で２０分間遠心分離後、得られた溶解性画分をＺＺ−アポイクオリン精製の出発材料とした。
【００６４】
３） Ｑ−セファロースカラムクロマトグラフ法によるＺＺ−アポイクオリンの精製
上記２）で得られた溶解性画分（２００ ｍｌ）を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．６）で平衡化したＱ−セファロースカラム（アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ：直径２．５×６ｃｍ）に添加して吸着させた後、カラムを２５０ ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．６）で洗浄した。カラムに吸着した蛋白質を全量１００ｍｌで、塩化ナトリウム濃度０〜１．０Ｍの直線濃度勾配により溶出した。塩化ナトリウム濃度０．４５〜０．６５Ｍにて発光活性を有するＺＺ−アポイクオリンの溶出が確認された（２５ ｍｌ；ＺＺ−アポイクオリン活性画分）。
【００６５】
４） ニッケルキレートカラムクロマトグラフ法によるＺＺ−アポイクオリンの精製
Ｑ−セファロースカラムから溶出したＺＺ−アポイクオリン活性画分を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．６）で平衡化したニッケルキレートカラム（アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ：直径１．５×５ｃｍ）に添加してＺＺ−アポイクオリンを吸着させた。吸着したＺＺ−アポイクオリンを、全量１００ｍｌで、イミダゾール濃度０〜０．３Ｍ（和光純薬工業社製）の直線濃度勾配により溶出した。イミダゾール濃度０．０６〜０．１２Ｍにて、発光活性を有するＺＺ−アポイクオリンの溶出が確認された（２６ ｍｌ；ＺＺ−アポイクオリン活性画分）。
【００６６】
５） ＩｇＧ−セファロースカラムクロマトグラフ法によるＺＺ−アポイクオリンの精製
ニッケルキレートカラムから溶出したＺＺ−アポイクオリン活性画分の一部を、アミコンウルトラ−４ 遠心フィルターデバイス（分子量１０，０００カット；ミリポア社製）を用いて濃縮した。濃縮した溶液４ｍｌを、ＩｇＧーセファロース ６ＦａｓｔＦｌｏｗカラム（アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ：直径１．５×４ｃｍ）に添加して、ＺＺ−アポイクオリンを吸着させた。吸着したＺＺ−アポイクオリンを、０．５Ｍの酢酸アンモニウム（ｐＨ３．４）（和光純薬工業社製）にて溶出した。
１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法により、純度は９５％以上であることを確認した。
ＩｇＧ−セファロースクロマトグラフ法により、純度９５％以上で７．８ｍｇの精製した本発明の融合蛋白質（ＺＺ−アポイクオリン）を得た。
【００６７】
［実施例３］
本発明のホロ蛋白質（ＺＺ−イクオリン）の調製法
本発明の融合蛋白質（ＺＺ−アポイクオリン）から本発明のホロ蛋白質（ＺＺ−イクオリン）への変換は、以下の条件で行った。
実施例２で得た精製ＺＺ−アポイクオリン（１ｍｇ）を１０ｍＭ ＤＴＴ及び、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．６） ５ｍｌに溶解し、エタノールに溶解した１．２倍当量のセレンテラジン ２４μｇを加え、４℃で一昼夜放置し、ＺＺ−イクオリンへと変換した。得られたＺＺ−イクオリンは、アミコンウルトラ−４（分子量１０，０００カット）で濃縮後、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．６） ８ｍｌ（２ｍｌで４回）で洗浄し、余剰のセレンテラジンを除いた。活性の回収率９５％でＺＺ−イクオリンを得た。
【００６８】
［参考例１］
本発明のホロ蛋白質（ＺＺ-イクオリン）を検出プローブとした、脱リン酸化ミエリン塩基性タンパク質へのＭＡＰＫ１活性の評価
【００６９】
（１）脱リン酸化ミエリン塩基性タンパク質のプレートへの固相化
脱リン酸化ミエリン塩基性タンパク質（以降ＤＰ-ＭＢＰと略記、ミリポア社製）を、０．０５％アジ化ナトリウム（和光純薬工業製）を含む５０ ｍＭ 炭酸緩衝液 （ｐＨ９．６）（以降、炭酸緩衝液と表記）にて５ μｇ／ｍｌに調製し、９６穴白色マイクロプレート （サーモ社製、 ＃４３７７９６）に１００μｌ／ウェルで分注後、室温（２５℃）にて一晩静置して、固相化脱リン酸化ミエリン塩基性タンパク質プレート（以降、ＤＰ-ＭＢＰプレートと表記）を得た。
【００７０】
（２）ＤＰ−ＭＢＰ固相化プレートのブロッキング
（１）で得られたＤＰ-ＭＢＰプレートを静置後、コーティング液を除去し、１％牛血清アルブミン（フラクションＶ、シグマ社製）、２ｍＭ ＥＤＴＡ（ＥＤＴＡ・２Ｎａ、同仁化学製）、０．０５％ アジ化ナトリウムを含む１５０ｍＭ 塩化ナトリウム（和光純薬工業製）、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（和光純薬工業製）（以降、ＴＢＳと表記）（以降、ポストコーティング液と表記）を２００μｌ／ウェルで分注して４℃にて一晩静置して、ブロッキングされたＤＰ-ＭＢＰプレートを得た。
【００７１】
（３）リン酸化反応
分裂促進因子活性化蛋白質キナーゼ１（ミリポア社製、以降、ＭＡＰＫ１と表記）を、０．１ｍＭ バナジン酸ナトリウム（和光純薬工業製）、０．１％牛血清アルブミン、０．１％ ２−メルカプトエタノール（和光純薬工業製）、４０ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．６）（以降、ＭＡＰＫ１希釈緩衝液と表記）で０．６ ｎｇ／μｌに調製した。
（２）で得られた、ブロッキングされたＤＰ−ＭＢＰプレートのポストコーティング液を捨て、３４０μｌの２ｍＭ ＥＤＴＡと０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（以降ＴＢＳＴ-Ｅと表記）にて３回洗浄した後、２０μＭ ＥＧＴＡ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）（以降反応緩衝液と表記）を１０μｌ、水を１５μｌ、０．６ ｎｇ／μｌのＭＡＰＫ１を５μｌ（３ ｎｇ）加え、２５ ｍＭ 酢酸マグネシウムを含む２．５ ｍＭ ＡＴＰ溶液（以降ＡＴＰ溶液と表記）を２０ μｌ加え（ＡＴＰ最終濃度１ ｍＭ）、全量５０μｌ／ウェルにて２５℃、1時間リン酸化反応を行った。
【００７２】
（４）抗体反応
（３）の反応系から反応液を捨て、ＴＢＳＴ−Ｅにてよく洗浄した後、０．４％ ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル製）、５ ｍＭ ＥＤＴＡを含むＴＢＳ（以降、抗体希釈緩衝液と表記）で６．６ ｐｍｏｌ／ｍｌに調製した抗-リン酸化セリン／スレオニン抗体（ミリポア社製）を１００μｌ／ウェル加え、２５℃にて１時間反応させた後、反応液を除去し、ＴＢＳＴ-Ｅにてよく洗浄して、「抗リン酸化抗体−基質複合体」を得た。
【００７３】
（５）本発明のホロ蛋白質（ＺＺ−イクオリン）の反応
実施例３で得られたＺＺ−イクオリンを抗体希釈緩衝液で０．３ ｐｍｏｌ／ｍｌに調製した溶液を、（４）で得られた抗リン酸化抗体−基質複合体に対して、１００μｌ／ウェル加え、２５℃にて１時間反応させた後、反応液を除去し、ＴＢＳＴ-Ｅにてよく洗浄して、「ＩｇＧのＦｃ領域に結合できる機能を有する領域及びカルシウム結合型発光蛋白質の領域が融合したホロ蛋白質−抗リン酸化抗体−基質複合体」を得た。
【００７４】
（６）発光強度の検出
（５）で得られた、ＩｇＧのＦｃ領域に結合できる機能を有する領域及びカルシウム結合型発光蛋白質の領域が融合したホロ蛋白質−抗リン酸化抗体−基質複合体に対して、Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０ （ベルトールド社製）にて、５０ ｍＭ 塩化カルシウムを含む５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ （ｐＨ７．６）（以降カルシウム溶液と表記）を１００ μｌ／ウェル注入して、発光強度を０．１秒間隔で５秒間測定し、最大発光強度値（Ｉｍａｘ） （Ｓ値）を算出した。データは４回測定の平均を表す。結果を表１に示す。
【００７５】
［参考例２］
参考例１の（３）リン酸化反応においてＭＡＰＫ１を使用しない以外は参考例１と同様の操作を行い、最大発光強度値（Ｉｍａｘ）（Ｎ値）を算出した。データは４回測定の平均を表す。結果を表１に示す。
【００７６】
【表１】
Ｓ値＝３ｎｇのＭＡＰＫ１添加区（参考例１）のＩｍａｘ
Ｎ値＝ＭＡＰＫ１無添加区（参考例２）のＩｍａｘ
Ｓ／Ｎ＝（３ｎｇのＭＡＰＫ１添加区のＩｍａｘ）／（ＭＡＰＫ１無添加区のＩｍａｘ）
表１に示された通り、参考例１の方法に基づき、本発明のホロ蛋白質（ＺＺ-イクオリン）を用いてリン酸化反応を検出できることが確認された。
【００７７】
［実施例４］
脱リン酸化ミエリン塩基性タンパク質へのＭＡＰＫ１活性阻害評価
（１）ステップａ：リン酸化反応
参考例１に記載と同様の方法にて、ＤＰ−ＭＢＰを固相化後、ポストコーティングを施した９６穴白色プレートを、ＴＢＳＴ-Ｅにてよく洗浄した後、キナーゼの阻害剤であるスタウロスポリン（カルビオケム社製）を最終濃度が０．３μＭになるように、ジメチルスルホキシド（和光純薬工業製）にて希釈系列を作製し、反応緩衝液を１０μｌ、水１０μｌ、スタウロスポリン５μｌ、ＭＡＰＫ１希釈緩衝液で０．６ ｎｇ／μｌに調製したＭＡＰＫ１を５μｌ加えて攪拌した。最後に２５μＭ ＡＴＰ溶液を２０μｌ加えて（最終濃度１０ μＭ）攪拌し、全量５０μｌ／ウェルにて２５℃、１時間リン酸化反応を行った。
【００７８】
（２）ステップｂ：抗体反応
ステップａの反応系から反応液を捨て、ＴＢＳＴ−Ｅにてよく洗浄した後、抗体希釈緩衝液で６．６ ｐｍｏｌ／ｍｌに調製した抗-リン酸化セリン／スレオニン抗体を１００μｌ／ウェル加え、２５℃にて１時間反応させた後、反応液を除去し、ＴＢＳＴ-Ｅにてよく洗浄して、抗リン酸化抗体−基質複合体を得た。
【００７９】
（３）ステップｃ：本発明のホロ蛋白質（ＺＺ−イクオリン）の反応
実施例３で得られたＺＺ−イクオリンを抗体希釈緩衝液で０．３ ｐｍｏｌ／ｍｌに調製した溶液を、ステップｂで得られた抗リン酸化抗体−基質複合体に対して、１００ μｌ／ウェル加え、２５℃にて１時間反応させた後、反応液を除去し、ＴＢＳＴ−Ｅにてよく洗浄して、ＩｇＧのＦｃ領域に結合できる機能を有する領域及びカルシウム結合型発光蛋白質の領域が融合したホロ蛋白質−抗リン酸化抗体−基質複合体、を得た。
【００８０】
（４）ステップｄ：発光強度の検出（発光強度Ｘの測定）
ステップｃで得られた、ＩｇＧのＦｃ領域に結合できる機能を有する領域及びカルシウム結合型発光蛋白質の領域が融合したホロ蛋白質−抗リン酸化抗体−基質複合体、に対して、Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０にて、カルシウム溶液を１００ μｌ／ウェル注入して、発光強度を０．１秒間隔で５秒間測定し、最大発光強度値（Ｉｍａｘ）（Ｓ値）を算出した。
【００８１】
結果を表２及び図１に示す。データは３回測定の平均を表す。
【００８２】
［実施例５〜７］
実施例４の（１）リン酸化反応においてスタウロスポリン（カルビオケム社製）の最終濃度をそれぞれ１、１０、又は１００μＭに変更した以外は実施例４と同様に操作を行い、最大発光強度値（Ｉｍａｘ）（Ｓ値）を算出した。結果を表２及び図１に示す。データは３回測定の平均を表す。
【００８３】
［参考例３］
実施例４の（１）リン酸化反応においてＭＡＰＫ１及びスタウロスポリンを添加しない以外は実施例５と同様に操作を行い、最大発光強度値（Ｉｍａｘ）（Ｎ値）を算出した。結果を表２に示す。データは３回測定の平均を表す。
【００８４】
［参考例４］
ステップｅ：阻害候補物質を用いない例（発光強度Ｙの測定）
実施例４の（１）リン酸化反応においてスタウロスポリンを添加しない以外は実施例５と同様に操作を行い、最大発光強度値（Ｉｍａｘ）（Ｓ値）を算出した。結果を表２及び図１に示す。データは３回測定の平均を表す。
【００８５】
【表２】
Ｓ値＝３ｎｇのＭＡＰＫ１添加区（参考例４、及び実施例４〜７）のＩｍａｘ
Ｎ値＝ＭＡＰＫ１無添加区（参考例３）のＩｍａｘ
Ｓ／Ｎ＝（３ｎｇのＭＡＰＫ１添加区のＩｍａｘ）／（ＭＡＰＫ１無添加区のＩｍａｘ）
リン酸化率（％）＝ＭＡＰＫ１添加＋スタウロスポリン無添加区のＩｍａｘを１００％とした時の各区のＩｍａｘを％で表した値。
【００８６】
実施例４〜７に示された通り、本発明のホロ蛋白質（ＺＺ−イクオリン）を用いて発光強度を検出した場合、スタウロスポリン濃度が上昇するにつれて、Ｉｍａｘが低下しているのが分かる。
【００８７】
以上の結果から、本発明のホロ蛋白質を用いて発光強度を検出した場合、プロテインキナーゼ阻害剤であるスタウロスポリンにおける濃度依存的な発光強度の低下が認められ、ＭＡＰＫ１のリン酸化酵素活性阻害の定量的検出ができることが確認された。すなわちこの系がリン酸化酵素阻害物質スクリーニングとして有用であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明は、リン酸化酵素の阻害物質の特定を可能にすることにより、リン酸化酵素が関与する疾患の予防薬・治療薬の開発に役立つ。
【配列表フリーテキスト】
【００８９】
［配列番号：１］ＺＺドメインのアミノ酸配列を示す。
［配列番号：２］配列番号：１で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：３］アポイクオリンのアミノ酸配列を示す。
［配列番号：４］配列番号：３で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：５］ＺＺ−アポイクオリンのアミノ酸配列を示す。
［配列番号：６］実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：７］実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：８］実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：９］実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸化酵素阻害物質のスクリーニング方法であって、当該方法が阻害候補物質を用いた時の発光強度Ｘと阻害候補物質を用いない時の発光強度Ｙとを比較して、発光強度Ｘが発光強度Ｙより低い場合に該阻害候補物質が該リン酸化酵素の活性を阻害する物質であることを確認する方法であり、かつ以下の（ａ）〜（ｅ）のステップ：
（ａ）阻害候補物質の存在下で、基質である蛋白質又はペプチドのリン酸化が可能な条件において、該基質にリン酸化酵素を作用させるステップ、
（ｂ）抗リン酸化抗体を、ステップ（ａ）でリン酸化酵素を作用させた基質と接触させるステップ、
（ｃ）免疫グロブリン（以降ＩｇＧと略記）のＦｃ領域に結合できる機能を有する領域及びカルシウム結合型発光蛋白質の領域が融合したホロ蛋白質を、ステップ（ｂ）で作用させたリン酸化抗体−基質複合体と接触させるステップ、
（ｄ）カルシウムを添加し、ＩｇＧのＦｃ領域に結合できる機能を有する領域及びカルシウム結合型発光蛋白質の領域が融合したホロ蛋白質−抗リン酸化抗体−基質複合体から生じる、発光強度Ｘを検出するステップ、及び
（ｅ）ステップ（ａ）において阻害候補物質を用いない以外は、ステップ（ａ）〜（ｄ）と同様に操作を行い、発光強度Ｙを検出するステップ、
を含み、ここで該抗リン酸化抗体は、該リン酸化酵素によりリン酸化された基質に特異的に結合可能なものである、上記方法。
【請求項２】
前記基質が固体支持体に固相化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＩｇＧのＦｃ領域に結合できる機能を有する領域及びカルシウム結合型発光蛋白質の領域が融合したホロ蛋白質が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される第１の領域及び（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択される第２の領域を含有する融合蛋白質並びにセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドとを含むホロ蛋白質である、請求項１又は２に記載の方法。
（１）第１の領域：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、及び
（ｄ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域。
（２）第２の領域：
（ｅ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域、
（ｆ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、及び
（ｈ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域。
【請求項４】
前記ＩｇＧのＦｃ領域に結合できる機能を有する領域及びカルシウム結合型発光蛋白質の領域が融合したホロ蛋白質が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される第１の領域と（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択される第２の領域を含有する融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドとを含むホロ蛋白質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（１）第１の領域：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、及び
（ｄ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域。
（２）第２の領域：
（ｅ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域、
（ｆ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、及び
（ｈ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域。
【請求項５】
前記ＩｇＧのＦｃ領域に結合できる機能を有する領域及びカルシウム結合型発光蛋白質の領域が融合したホロ蛋白質が、
（１）配列番号：１で表される第１のアミノ酸配列からなる領域及び、
（２）配列番号：３で表される第２のアミノ酸配列からなる領域
を含有する融合蛋白質並びにセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドとを含むホロ蛋白質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＩｇＧのＦｃ領域に結合できる機能を有する領域及びカルシウム結合型発光蛋白質の領域が融合したホロ蛋白質が、配列番号：５のアミノ酸配列からなる融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドとを含むホロ蛋白質である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記リン酸化酵素が、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ２ 、ＪＮＫ、ｐ３８、Ａｋｔ、Ａｕｒｏｒａ Ａ、Ａｕｒｏｒａ Ｂ 、Ａｕｒｏｒａ Ｃ、ＰＫＡ 、ＭＳＫ１ 、ＰＫＣ ε、ＣＲＩＫ 、ＮＤＲ１ 、ＤＹＲＫ１Ａ 、Ｒｓｋ２ 、ＰＩＭ１ 、ＰＡＫ１ 、ＩＫＫ α、ＪＩＬ −１ 、ＶＲＫ１ 、Ｓｎｆ１ 、ＰＢＫ ／ＴＯＰＫ 、ＭＮＫ１ 、ＭＮＫ２ 、ＭＲＣＫ α、ＰＡＫ２ 、ＷＮＫ２ 、ＷＮＫ３、ＡＫ、ＣＫ２、ＭＢＰＫ、ｃＰＫ、及びｃｄＫである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗リン酸化抗体が、リン酸化されたミエリン塩基性蛋白質を認識できるものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記基質が、ミエリン塩基性蛋白質である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項３〜６のいずれか１項に記載の融合蛋白質、及び対象となるリン酸化酵素の基質を含む、リン酸化酵素阻害物質のスクリーニングのためのキット。
【請求項１１】
前記基質がミエリン塩基性蛋白質である、請求項１０に記載のキット。
【請求項１】
リン酸化酵素阻害物質のスクリーニング方法であって、当該方法が阻害候補物質を用いた時の発光強度Ｘと阻害候補物質を用いない時の発光強度Ｙとを比較して、発光強度Ｘが発光強度Ｙより低い場合に該阻害候補物質が該リン酸化酵素の活性を阻害する物質であることを確認する方法であり、かつ以下の（ａ）〜（ｅ）のステップ：
（ａ）阻害候補物質の存在下で、基質である蛋白質又はペプチドのリン酸化が可能な条件において、該基質にリン酸化酵素を作用させるステップ、
（ｂ）抗リン酸化抗体を、ステップ（ａ）でリン酸化酵素を作用させた基質と接触させるステップ、
（ｃ）免疫グロブリン（以降ＩｇＧと略記）のＦｃ領域に結合できる機能を有する領域及びカルシウム結合型発光蛋白質の領域が融合したホロ蛋白質を、ステップ（ｂ）で作用させたリン酸化抗体−基質複合体と接触させるステップ、
（ｄ）カルシウムを添加し、ＩｇＧのＦｃ領域に結合できる機能を有する領域及びカルシウム結合型発光蛋白質の領域が融合したホロ蛋白質−抗リン酸化抗体−基質複合体から生じる、発光強度Ｘを検出するステップ、及び
（ｅ）ステップ（ａ）において阻害候補物質を用いない以外は、ステップ（ａ）〜（ｄ）と同様に操作を行い、発光強度Ｙを検出するステップ、
を含み、ここで該抗リン酸化抗体は、該リン酸化酵素によりリン酸化された基質に特異的に結合可能なものである、上記方法。
【請求項２】
前記基質が固体支持体に固相化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＩｇＧのＦｃ領域に結合できる機能を有する領域及びカルシウム結合型発光蛋白質の領域が融合したホロ蛋白質が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される第１の領域及び（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択される第２の領域を含有する融合蛋白質並びにセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドとを含むホロ蛋白質である、請求項１又は２に記載の方法。
（１）第１の領域：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、及び
（ｄ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域。
（２）第２の領域：
（ｅ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域、
（ｆ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、及び
（ｈ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域。
【請求項４】
前記ＩｇＧのＦｃ領域に結合できる機能を有する領域及びカルシウム結合型発光蛋白質の領域が融合したホロ蛋白質が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される第１の領域と（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択される第２の領域を含有する融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドとを含むホロ蛋白質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（１）第１の領域：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、及び
（ｄ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域。
（２）第２の領域：
（ｅ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域、
（ｆ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が、欠失、置換、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、及び
（ｈ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域。
【請求項５】
前記ＩｇＧのＦｃ領域に結合できる機能を有する領域及びカルシウム結合型発光蛋白質の領域が融合したホロ蛋白質が、
（１）配列番号：１で表される第１のアミノ酸配列からなる領域及び、
（２）配列番号：３で表される第２のアミノ酸配列からなる領域
を含有する融合蛋白質並びにセレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドとを含むホロ蛋白質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＩｇＧのＦｃ領域に結合できる機能を有する領域及びカルシウム結合型発光蛋白質の領域が融合したホロ蛋白質が、配列番号：５のアミノ酸配列からなる融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシド又はセレンテラジン誘導体のペルオキシドとを含むホロ蛋白質である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記リン酸化酵素が、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ２ 、ＪＮＫ、ｐ３８、Ａｋｔ、Ａｕｒｏｒａ Ａ、Ａｕｒｏｒａ Ｂ 、Ａｕｒｏｒａ Ｃ、ＰＫＡ 、ＭＳＫ１ 、ＰＫＣ ε、ＣＲＩＫ 、ＮＤＲ１ 、ＤＹＲＫ１Ａ 、Ｒｓｋ２ 、ＰＩＭ１ 、ＰＡＫ１ 、ＩＫＫ α、ＪＩＬ −１ 、ＶＲＫ１ 、Ｓｎｆ１ 、ＰＢＫ ／ＴＯＰＫ 、ＭＮＫ１ 、ＭＮＫ２ 、ＭＲＣＫ α、ＰＡＫ２ 、ＷＮＫ２ 、ＷＮＫ３、ＡＫ、ＣＫ２、ＭＢＰＫ、ｃＰＫ、及びｃｄＫである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗リン酸化抗体が、リン酸化されたミエリン塩基性蛋白質を認識できるものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記基質が、ミエリン塩基性蛋白質である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項３〜６のいずれか１項に記載の融合蛋白質、及び対象となるリン酸化酵素の基質を含む、リン酸化酵素阻害物質のスクリーニングのためのキット。
【請求項１１】
前記基質がミエリン塩基性蛋白質である、請求項１０に記載のキット。
【図１】
【公開番号】特開２０１２−２１７３７６（Ｐ２０１２−２１７３７６Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１２日（２０１２．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−８５３６９（Ｐ２０１１−８５３６９）
【出願日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【出願人】（３１１００２０６７）ＪＮＣ株式会社 (208)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月１２日（２０１２．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【出願人】（３１１００２０６７）ＪＮＣ株式会社 (208)
【Ｆターム（参考）】
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