Ｌ−アミノ酸の生産方法
腸内細菌科に属するＬ−アミノ酸生産細菌であって、ｐｇｌ遺伝子（ｙｂｈＥ ＯＲＦ）によりコードされる６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性を増強することによりＬ−アミノ酸生産能を増大させた細菌を使用して、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンなどのＬ−アミノ酸を生産する方法を開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を使用した発酵によりＬ−アミノ酸を生産する方法に関する。具体的には、本発明は、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンのような芳香族アミノ酸を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）は、大部分の生物体の中央代謝の重要な一部である。ＰＰＰの酸化的経路ではＮＡＤＰＨの合成が行われ、ＰＰＰの非酸化的経路のリン酸化炭水化物は、ヌクレオチド生合成のための前駆体（リボース−５−リン酸）、芳香族アミノ酸及びビタミンのための前駆体（エリスロース−５−リン酸）となる。エリスロース−４−リン酸（Ｅ４ｐ）は、芳香族Ｌ−アミノ酸に共通の生合成経路の必須前駆体である。したがって、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）及びＥ４ｐ生合成の特定の経路を最適化することにより芳香族Ｌ−アミノ酸の生産を向上させることができる。
【０００３】
ＰＰＰの酸化的経路は３つの反応を包含する。第１及び第３の反応は、それぞれｚｗｆ遺伝子及びｇｎｄ遺伝子によりコードされる既知の酵素であるグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４９）並びにグルコン酸−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４４）により触媒される。第２の反応は、６−ホスホノグルコノラクトンの６−ホスホグルコン酸への加水分解である(Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C.,
1996)。この反応を触媒する酵素は、例えばヒト(Collard, F., et al., FEBS Lett., 459:2, 223-6(1999))、トリパノソーマ・ブルセイ(Duffieux, F., et al., J. Biol. Chem.,275:36, 27559-65(2000))、プラスモジウム・ベルグヘイ(Clarke, J.L., et al, Eur. J. Biochem., 268:7, 2013-9 (2001))、シュードモナス・アエロギノサ(Harger P.W. et al., J. Bacteriol., 182:14, 3934-41 (2000))、シュードモナス・プチダ(Petruschka, L., et al., FEMS Microbiol. Lett., 215:1. 89-95 (2002))を含むいくつかの生物体で検出されているが、反応が自発的に進むことも知られている。
【０００４】
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼにより触媒される反応の生成物の１つであるδ−６−ホスホグルコノラクトンは、分子間転位の過程でγ−６−ホスホグルコノラクトンへ異性化することが可能である。δ−６−ホスホグルコノラクトンのみが、自発的に６−ホスホグルコン酸へ加水分解されることが可能であり、正確には該反応は、既知の６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＥＣ ３．１．１．３１）により触媒される(Miclet E. et al., J Biol Chem., 276:37, 34840-46 (2001))。推定上の６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードするエシェリヒア・コリ由来のｐｇｌ遺伝子は、エシェリヒア・コリの染色体上のａｔｔ−λとｃｈｌＤ遺伝子（最新のデータベースではｍｏｄＣ遺伝子）との間にマッピングされた。エシェリヒア・コリ（ｐｇｌ-）の突然変異体は、マルトデキストリンを蓄積する株の顕著な特徴である「マルトースブルー」表現型(Kupor, S.R. and Fraenkel, D.G., J. Bacteriol., 100:3, 1296-1301 (1969))を示す(Adhya S. and Schwartz
M., J Bacteriol, 108:2, 621-626 (1971))。
【０００５】
しかし現時点では、エシェリヒア・コリの染色体上におけるｐｇｌ遺伝子の配列も正確な位置も未知である。エシェリヒア・コリ由来の６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性を有する酵素は単離されておらず、Ｌ−アミノ酸生産細菌の細胞中での６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性の増強をＬ−アミノ酸生産の増大と関連させる報告は存在しない。
【発明の開示】
【０００６】
本発明の目的は、エシェリヒア・コリ由来の６−ホスホグルコノラクトナーゼを提供すること、Ｌ−アミノ酸生産株の生産性を増強すること、及び該株を使用してＬ−アミノ酸を生産する方法を提供することである。
【０００７】
この目的は、エシェリヒア・コリ Ｋ−１２株のｙｂｈＥオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードし、またｙｂｈＥ ＯＲＦ（ｐｇｌ遺伝子）の発現の増強が、各々のＬ−アミノ酸生産株によるＬ−アミノ酸生産を増強することができるという事実を明らかにすることにより達成された。このようにして、本発明は完成された。
【０００８】
本発明の目的は、６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性が増強するように改変されたＬ−アミノ酸生産細菌を提供することである。
【０００９】
本発明のさらなる目的は、腸内細菌科に属し、エシェリヒア属、エルビニア属、プロビデンシア属及びセラチア属から成る群から選択される上記細菌を提供することである。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、遺伝子の発現が増強されるように、細菌の染色体上の６−ホスホグルコノラクトナーゼ遺伝子の発現制御配列を改変させることにより、６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性が増強された、上記細菌を提供することである。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、上記遺伝子の野生型のプロモーターがより強力なプロモーターで置換された、上記細菌を提供することである。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、６−ホスホグルコノラクトナーゼ遺伝子がエシェリヒア属細菌に由来する、上記細菌を提供することである。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、６−ホスホグルコノラクトナーゼ遺伝子が、
（ａ）配列番号１におけるヌクレオチド１〜９９３の塩基配列を含むＤＮＡ、及び
（ｂ）配列番号１におけるヌクレオチド１〜９９３の塩基配列又は、該塩基配列から調製することができるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、且つ６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
から成る群から選択される上記細菌を提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、ストリンジェントな条件が１×ＳＳＣに相当する塩濃度及び０．１％ＳＤＳで６０℃で１５分間洗浄することを含む、上記細菌を提供することである。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、ｙｂｈＥオープンリーディングフレームの発現が増強するように更に改変された上記細菌を提供することである。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンから成る群から選択される芳香族Ｌ−アミノ酸である上記細菌を提供することである。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、培地中で上記細菌を培養すること、及び培地から上記Ｌ−アミノ酸を回収することを含む芳香族Ｌ−アミノ酸を生産する方法を提供することである。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンから成る群から選択される芳香族アミノ酸である上記方法を提供することである。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、上記細菌の芳香族アミノ酸生合成に関する遺伝子の発現が増強された上述の方法を提供することである。
【００２０】
Ｌ−アミノ酸を生産する方法は、本発明のタンパク質の活性が増強されたＬ−トリプトファン生産細菌を使用したＬ−トリプトファンの生産を包含する。Ｌ−アミノ酸を生産する方法はまた、本発明のタンパク質の活性が増強されたＬ−フェニルアラニン生産細菌を使用したＬ−フェニルアラニンの生産を包含する。Ｌ−アミノ酸を生産する方法は更に、本発明のタンパク質の活性が増強されたＬ−チロシン生産細菌を使用したＬ−チロシンの生産を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性を増強するように改変されたＬ−アミノ酸生産細菌について記載されている。「６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性」という用語は、６−ホスホグルコノラクトンの６−ホスホグルコン酸への加水分解反応を触媒する活性を意味する。６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性は、例えばKupor, S.R.及びFraenkel, D.G. (J. Bacteriol., 100:3, 1296-1301 (1969))に記載される方法により測定される。６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする遺伝子は、エシェリヒア・コリのｙｂｈＥ遺伝子又はその相同体である。
【００２２】
エシェリヒア・コリの６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＥＣ番号３．１．１．３１）をコードする遺伝子として、ｙｂｈＥ ＯＲＦを含むｐｇｌ遺伝子が公表されている（GenBankアクセッション番号ＮＣ＿０００９１３．１，ｇｉ：１６１２８７３５の配列中のヌクレオチド番号７９７８０９〜７９８８０４）。ｙｂｈＥ ＯＲＦは、エシェリヒア・コリ Ｋ−１２株の染色体上でｙｂｈＡ ＯＲＦとｙｂｈＤ ＯＲＦとの間に位置する。したがって、ｐｇｌ遺伝子は、上記遺伝子の塩基配列に基づいて調製されたプライマーを利用したＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応；White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)を参照）により得ることができる。
【００２３】
エシェリヒア・コリ由来のｐｇｌ遺伝子は、以下のＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）：
（ａ）配列番号１におけるヌクレオチド１〜９９３の塩基配列を含むＤＮＡ、又は
（ｂ）配列番号１におけるヌクレオチド１〜９９３の塩基配列又は、該塩基配列から調製することができるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、且つ６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
により例示される。
【００２４】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡとしては、タンパク質の活性を損失しない範囲で、タンパク質（Ａ）の１つ又はそれ以上の位置における１又は数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入或いは付加を含むタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。「数個の」アミノ酸の数は、タンパク質の三次元構造におけるアミノ酸残基の位置、又はアミノ酸残基のタイプに応じて異なるが、タンパク質（Ａ）に関して２〜３０個、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個であり得る。
【００２５】
上記の１又は数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入或いは付加を有する本発明のタンパク質は、配列番号２のタンパク質に対して少なくとも７０％相同である。タンパク質の相同性の割合は、配列全長にわたって、変異配列を配列番号２の配列と比較すること、及び等しい残基の数を割り出すことにより決定される。本発明のタンパク質は、配列番号２のタンパク質に対して少なくとも７０％相同であり、より好ましくは少なくとも８０％相同、更に好ましくは少なくとも９０％相同、最も好ましくは配列番号２のタンパク質に対して少なくとも９５％相同である。タンパク質又はＤＮＡの相同性の割合はまた、ＢＬＡＳＴ
検索及びＣｒｕｓｔａｌＷのような既知の算出方法により評価することができる。ＢＬＡＳＴ(Basic Local Alignment Search Tool)は、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｍｅｇａｂｌａｓｔ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘといったプログラムにより使用される発見的検索アルゴリズムであり、これらのプログラムは、Karlin、Samuel及びStephen F. Altschulの統計学的方法を使用して、それらの所見に有意性を帰する（「一般的なスコアリングスキームを使用することにより分子配列の特徴の統計学的有意性を評価する方法」Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-68; 「分子配列における多数の高スコアリングセグメントに関する用途及び統計学」Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90: 5873-7）。ＦＡＳＴＡ検索法は、W.R. Pearsonにより記載されている（「ＦＡＳＴＰ及びＦＡＳＴＡによる迅速且つ高感度配列比較」Methods in Enzymology, 1990 183:63-98）。ＣｌｕｓｔａｌＷ法は、Thompson J.D., Higgins D.G.及びGibson T.J.により記載されている（「ＣＬＵＳＴＡＬＷ：配列重み付け、位置特異的ギャップペナルティ及び重み行列選択による進行性多数配列アラインメントの感度の改善」Nucleic Acids Res. 1994, 22: 4673-4680）。
【００２６】
上記のような（Ａ）で定義されるタンパク質へ導入される変化は通常、タンパク質の活性を維持するような保存的変化である。置換変化としては、アミノ酸配列中の少なくとも１つの残基が取り除かれ、且つ異なる残基がその場所に挿入されたものが挙げられる。上記タンパク質において元のアミノ酸を代替することができ、且つ保存的置換とみなされるアミノ酸の例としては、ａｌａのｓｅｒ又はｔｈｒへの置換；ａｒｇのｇｌｎ、ｈｉｓ又はｌｙｓへの置換；ａｓｎのｇｌｕ、ｇｌｎ、ｌｙｓ、ｈｉｓ、ａｓｐへの置換；ａｓｐのａｓｎ、ｇｌｕ又はｇｌｎへの置換；ｃｙｓのｓｅｒ又はａｌａへの置換；ｇｌｎのａｓｎ、ｇｌｕ、ｌｙｓ、ｈｉｓ、ａｓｐ又はａｒｇへの置換；ｇｌｕのａｓｎ、ｇｌｎ、ｌｙｓ又はａｓｐへの置換；ｇｌｙのｐｒｏへの置換；ｈｉｓのａｓｎ、ｌｙｓ、ｇｌｎ、ａｒｇ、ｔｙｒへの置換；ｉｌｅのｌｅｕ、ｍｅｔ、ｖａｌ、ｐｈｅへの置換；ｌｅｕのｉｌｅ、ｍｅｔ、ｖａｌ、ｐｈｅへの置換；ｌｙｓのａｓｎ、ｇｌｕ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ａｒｇへの置換；ｍｅｔのｉｌｅ、ｌｅｕ、ｖａｌ、ｐｈｅへの置換；ｐｈｅのｔｒｐ、ｔｙｒ、ｍｅｔ、ｉｌｅ又はｌｅｕへの置換；ｓｅｒのｔｈｒ、ａｌａへの置換；ｔｈｒのｓｅｒ又はａｌａへの置換；ｔｒｐのｐｈｅ、ｔｙｒへの置換；ｔｙｒのｈｉｓ、ｐｈｅ又はｔｒｐへの置換；及びｖａｌのｍｅｔ、ｉｌｅ、ｌｅｕへの置換が挙げられる。
【００２７】
（Ａ）で定義されるタンパク質と実質的に同じタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が、欠失、置換、挿入又は付加されるように、部位特異的突然変異誘発を用いて（Ａ）で定義されるタンパク質をコードする塩基配列を改変することにより得られる。このような改変されるＤＮＡは、突然変異を発生させる試薬及び条件で処理を行う従来の方法により得ることができる。このような処理としては、ヒドロキシルアミンによる本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの処理、或いはＵＶ照射又はＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン若しくは亜硝酸のような試薬によるＤＮＡを含有する細菌の処理が挙げられる。
【００２８】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡには、異なる株で見出すことができる変異体、及び自然多様性に従うエシェリヒア属細菌の変異体も含まれる。このような変異体をコードするＤＮＡは、ストリンジェントな条件下でｐｇｌ遺伝子又はその遺伝子の一部とハイブリダイズし、且つ６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することにより得ることができる。本明細書中で言及される「ストリンジェントな条件」は、いわゆる特異的ハイブリッドが形成され、且つ非特異的ハイブリッドが形成されない条件である。例えば、ストリンジェントな条件としては、高い相同性を有するＤＮＡ、例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡが互いにハイブリダイズする条件が挙げられる。あるいは、ストリンジェントな条件は、サザンハイブリダイゼーションにお
ける慣例の洗浄条件、例えば、およそ１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ及び６０℃を含む条件により例示される。洗浄の持続期間は、ブロッティングに使用される膜のタイプに依存し、一般的には製造業者により推奨される。例えば、ストリンジェントな条件下でのＨｙｂｏｎｄTMＮ＋ナイロン膜(Amersham)の洗浄の推奨持続期間は１５分である。好ましくは、洗浄は２〜３回実施される。
【００２９】
変異体をコードし、且つｐｇｌ遺伝子とハイブリダイズするＤＮＡに対するプローブとして、配列番号１の塩基配列の部分配列もまた使用することができる。このようなプローブは、プライマーとして配列番号１の塩基配列に基づくオリゴヌクレオチド、及び鋳型として配列番号１の塩基配列を含有するＤＮＡフラグメントを使用するＰＣＲにより調製できる。約３００ｂｐの長さを有するＤＮＡフラグメントをプローブとして使用する場合、ハイブリダイゼーションのための洗浄条件は、例えば５０℃、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳから成る。
【００３０】
タンパク質をコードするＤＮＡによる細菌の形質転換は、例えば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を増強し、及び細菌細胞においてそのタンパク質の活性を増強するための従来の方法による、ＤＮＡの細菌細胞への導入を意味する。
【００３１】
本発明の細菌は、目的Ｌ−アミノ酸の生産性を増強するタンパク質の活性が増強された腸内細菌科に属するＬ−アミノ酸生産細菌である。好ましくは、本発明の細菌は、本発明のタンパク質の活性が増強された、具体的にはエシェリヒア属に属する芳香族Ｌ−アミノ酸生産細菌である。より好ましくは、本発明の細菌は、具体的には６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性が増強するように改変されたエシェリヒア属に属する芳香族Ｌ−アミノ酸生産細菌、例えばＬ−トリプトファン生産細菌である。より好ましくは、本発明の細菌は、細菌の染色体上で改変された発現制御配列を有するｐｇｌ遺伝子（ｙｂｈＥ ＯＲＦ）から成るＤＮＡを保有し、且つＬ−トリプトファンの生産能力が増強されている。
【００３２】
「Ｌ−アミノ酸生産細菌」とは、本発明の細菌を培地で培養する時、培地中にＬ−アミノ酸の蓄積を引き起こすことができる細菌を意味する。Ｌ−アミノ酸生産能は、育種によって付与され、又は増強される。本明細書中で使われる「Ｌ−アミノ酸生産細菌」という用語は培養培地で野生型株や親株よりも大量にＬ−アミノ酸を蓄積させ、生産することの出来る細菌を意味し、好ましくは微生物が培地で０．５ｇ／Ｌ以上、更に好ましくは１．０以上の目的Ｌ−アミノ酸を蓄積させ、生産することが出来ることを意味する。Ｌ−アミノ酸には、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリンが含まれ、好ましくはＬ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン等の芳香族Ｌ−アミノ酸が含まれる。
【００３３】
腸内細菌科細菌としては、エシェリヒア属、エンテロバクター属、エルビニア属、クレブシエラ属、パントエア属、プロビデンシア属、サルモネラ属、セラチア属、赤痢菌属及びモルガネラ属細菌が挙げられる。エンテロバクター属、エルビニア属、エシェリヒア属、クレブシエラ属、プロビデンシア属、サルモネラ属、セラチア属、赤痢菌属等。具体的には、ＮＣＢＩ(National Center for Biotechnology Information)データベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/hybinpost/Taxonomy/wget.org?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock)で使用される分類学に従って腸内細菌科に類別されるものを使用することができる。この中ではエシェリヒア属細菌が好ましい。
【００３４】
「エシェリヒア属細菌」という語句は、細菌が、微生物学の当業者に既知の分類に従っ
てエシェリヒア属として類別されることを意味する。本発明で使用されるエシェリヒア属微生物の例としては、エシェリヒア・コリが挙げられるが、これに限定されない。
【００３５】
本発明で使用することができるエシェリヒア属細菌は、特に限定されないが、例えばNeidhardt, F.C.等により記載される細菌(Escherichia coli and Salmonella typhimurium,
American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Table 1)が本発明に包含される。エシェリヒア・コリの野生型株の例としては、Ｋ−１２株及びその誘導体、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ第４７０７６）及びＷ３１１０株（ＡＴＣＣ第２７３２５）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの株は、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ、住所：12301 Parklawn Drive, Rckville Maryland 20852, United States of America）から入手可能である。
【００３６】
「パントエア属細菌」という用語は、細菌が、微生物学の当業者に既知の分類に従ってパントエア属として類別されることを意味する。エンテロバクター・アグロメランスの数種は最近、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列分析等に基づいて、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、パントエア・ステワルティ等に再類別されている。
【００３７】
「６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性が増強するように改変される」という語句は、１細胞当たりの活性が、非改変株、例えば、野生型株の活性よりも高くなっていることを意味する。６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性は、Collardの方法(FEBS Letters 459 (1999) 223-226)を使用することにより測定することができる。例としては、１細胞当たりの６−ホスホグルコノラクトナーゼ分子の数が増大すること、６−ホスホグルコノラクトナーゼ１分子当たりの比活性が増大すること、などである。更に、比較用の対象として用いられる野生型株として、例えばエシェリヒア・コリ Ｋ−１２が包含される。６−ホスホグルコノラクトナーゼの細胞内活性が増強された結果として、培地中に蓄積するＬ−トリプトファンなどのＬ−アミノ酸の量が増大する。
【００３８】
細菌細胞における６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性の増強は、６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする遺伝子（ｐｇｌ遺伝子）の発現を増大させることにより達成される。６−ホスホグルコノラクトナーゼ遺伝子として、腸内細菌科細菌に由来する遺伝子が包含される。ｐｇｌ遺伝子の発現は、例えば、遺伝子組換え技法を使用して、細胞中のｐｇｌ遺伝子のコピー数を増大させることにより増強することができる。例えば、組換えＤＮＡは、ｐｇｌ遺伝子を含有する遺伝子フラグメントを、宿主微生物の細胞で操作可能であるベクター、好ましくは多コピーベクターに連結させること、及び得られたベクターを宿主微生物の細胞へ導入することにより調製することができる。
【００３９】
エシェリヒア・コリのｐｇｌ遺伝子が使用される場合、ｐｇｌ遺伝子（ｙｂｈＥ）は、配列番号１の塩基配列に基づいて設計されるプライマーを使用し、鋳型としてエシェリヒア・コリの染色体ＤＮＡを使用するＰＣＲ法（ポリメラーゼ連鎖反応、White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)を参照）により得られる。他の微生物由来のｐｇｌ遺伝子もまた使用でき、それらのｐｇｌ遺伝子の配列若しくはｐｇｌ遺伝子のその相同配列又は種の異なる微生物由来の６−ホスホグルコノラクトナーゼタンパク質に基づいて設計されるオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲにより、或いはこのような配列情報に基づいて調製されるオリゴヌクレオチドプローブを使用したハイブリダイゼーションにより、それらの染色体ＤＮＡ又は染色体ＤＮＡライブラリーから得ることができる。染色体ＤＮＡは、例えばSaito及びMiuraの方法により、ＤＮＡドナーとして用いられる微生物から調製することができる（H. Saito and K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), 「生物工学実験書」、日本実験工学会編、培風館、pp. 97-98、1992を参照）。
【００４０】
続いて、ｐｇｌ遺伝子を、宿主微生物の細胞において操作可能なベクターＤＮＡへ連結されて、組換えＤＮＡが調製される。好ましくは、宿主微生物の細胞において自己複製可能なベクターが使用される。
【００４１】
エシェリヒア・コリにおいて自己複製可能なベクターの例としては、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ｐＡＣＹＣ１８４（ｐＨＳＧ及びｐＡＣＹＣは、Takara Bioから入手可能）、ＲＳＦ１０１０、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ２１９（ｐＭＷは、Nippon Geneから入手可能）等が挙げられる。
【００４２】
ｐｇｌ遺伝子及び上述のベクターのいずれかを連結して組換えＤＮＡを調製するために、ベクター、及びｐｇｌ遺伝子を含有するフラグメントを制限酵素で消化して、通常Ｔ４
ＤＮＡリガーゼなどのリガーゼを使用することにより連結させる。
【００４３】
上記のように調製された組換えＤＮＡを微生物へ導入するために、これまでに報告されている任意の既知の形質転換方法を使用することができる。例えば、エシェリヒア・コリに関して報告されている、ＤＮＡの透過性を増大するようにレシピエント細胞を塩化カルシウムで処理する方法(Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970))、及びバチルスにおいて報告されている、ＤＮＡを導入するために増殖細胞から作製されたコンピテント細胞を使用する方法(Duncan, C.H., Wilson, G.A. and Young, F.E., Gene, 1, 153 (1977))を使用することができる。これらの方法のほかに、バチルス・ズブチリス、放線菌及び酵母に適用可能であると報告されている、組換えＤＮＡをプロトプラスト又はスフェロプラスト様レシピエント細胞へ導入する方法(Chang, S. and Choen, S.N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M.J., Ward, J.M. and Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J.B. and Fink, G.R., Proc. Natl. Sci., USA, 75, 1929 (1978))を使用することができる。
【００４４】
ｐｇｌ遺伝子のコピー数はまた、微生物の染色体ＤＮＡ上にｐｇｌ遺伝子を多コピー組み込むことによって増大させることができる。微生物の染色体ＤＮＡ上にｐｇｌ遺伝子を多コピー組み込むために、相同組換えは、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的とすることにより実施することができる。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、トランスポゾンの末端に存在する反復ＤＮＡ及びインバーテッドリピートを使用することができる。あるいは、特開平２−１０９９８５Ａ号に開示されるように、ｐｇｌ遺伝子をトランスポゾンへ組み込み、遺伝子の多コピーが染色体ＤＮＡへ組み込まれるようにそれを転移させることも可能である。染色体へのｐｇｌ遺伝子の組込みは、ｐｇｌ遺伝子の部分配列を有するプローブを使用するサザンハイブリダイゼーションにより確認することができる。
【００４５】
本発明の細菌は、本発明のタンパク質の活性が、細菌の染色体上での（Ａ）又は（Ｂ）で定義されるようなタンパク質をコードするＤＮＡの発現制御配列の改変により増強されるものを包含する（ＷＯ００／１８９３５号）。遺伝子発現の増強は、本発明のＤＮＡを、野生型のプロモーターの代わりにより強力なプロモーターの制御下に置くことにより達成することができる。例えば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＰＲプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。「野生型のプロモーター」という用語は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流に位置し、且つ遺伝子の転写を促進する機能を有する野生型生物体中に存在するＤＮＡ領域を意味する。プロモーターの強度は、ＲＮＡ合成開始の反応の頻度により定義される。プロモーターの強度を評価する方法は、例えば、Deuschle U., Kammerer W., Gentz R., Bujard H.により記載されている（エシェリヒア・コリにおけるプロモーター：ｉｎ ｖｉｖｏ強度の階層は、代替構造を示す EMBO J., 5, 2987-2994 (1986)）。プロモーターの作用強度を評価する方法及び強力なプロモーターの例は、Goldstein
等 (バイオテクノロジーにおける原核生物プロモーター Biotechnol. Annu. Rev., 1995,
1, 105-128）に開示されている。
【００４６】
翻訳の増強は、本発明のＤＮＡへ、より効率的なリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を野生型のＲＢＳ配列の代わりに導入することにより達成できる。ＲＢＳ配列は、リボソームの１６Ｓ ＲＮＡと相互作用するｍＲＮＡの開始コドンの上流にある領域である(Shine J. and Dalgarno L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1974, 71, 4, 1342-6)。「野生型のＲＢＳ配列」という用語は、野生型生物体に存在するＲＢＳ配列を意味する。ファージＴ７由来の遺伝子１０のＲＢＳ配列は、効率的なＲＢＳ配列として例示することができる(Olins P.O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235)。
【００４７】
本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を本来的に有する細菌への上述のＤＮＡの導入により得ることができる。あるいは、本発明の細菌は、上述のＤＮＡをすでに保有する細菌に、Ｌ−アミノ酸生産能を付与することにより得ることができる。
【００４８】
本発明のタンパク質の活性が増強されるべき親株としては、エシェリヒア属に属するＬ−トリプトファン生産細菌である突然変異ｔｒｐＳ遺伝子によりコードされるトリプトファニル−ｔＲＮＡシンテターゼが欠損したエシェリヒア・コリＪＰ４７３５／ｐＭＵ３０２８（ＤＳＭ１０１２２）株及びＪＰ６０１５／ｐＭＵ９１（ＤＳＭ１０１２３）株（米国特許第５，７５６，３４５号）、セリンによるフィードバック阻害のないｓｅｒＡ対立遺伝子を有するエシェリヒア・コリＳＶ１６４（ｐＧＨ５）株（米国特許第６，１８０，３７３号）、酵素トリプトファナーゼが欠損したエシェリヒア・コリＡＧＸ１７（ｐＧＸ４４）（ＮＲＲＬ Ｂ−１２２６３）株及びＡＧＸ６（ｐＧＸ５０）ａｒｏＰ（ＮＲＲＬ
Ｂ−１２２６４）株（米国特許第４，３７１，６１４号）、ホスホエノールピルビン酸生産能が増強されたエシェリヒア・コリＡＧＸ１７／ｐＧＸ５０株，ｐＡＣＫＧ４−ｐｐｓ株（ＷＯ９７／０８３３３号、米国特許第６，３１９，６９６号）等が使用される。任意のＬ−アミノ酸の生合成経路に関与しない膜タンパク質をコードしているｙｄｄＧ遺伝子は、該遺伝子の野生型対立遺伝子が微生物中の多コピーベクター上で増幅される場合に、Ｌ−フェニルアラニン及びいくつかのアミノ酸類縁体に対する耐性を微生物に付与することを本発明者は過去に明らかにした。更に、ｙｄｄＧ遺伝子は、さらなるコピーが各々の生産株の細胞へ導入される場合に、Ｌ−フェニルアラニン又はＬ−トリプトファンの生産を増強できる（ロシア共和国特許出願第２００２１２１６７０号、ＷＯ０３／０４４１９２号）。したがって、Ｌ−トリプトファン生産細菌は、ｙｄｄＧオープンリーティングフレームの発現を増強するように更に改変されることが望ましい。
【００４９】
Ｌ−トリプトファン生合成に効果的に働く遺伝子として、ｔｒｐＥＤＣＢＡオペロン遺伝子及びａｒｏＦ遺伝子、ａｒｏＧ遺伝子、ａｒｏＨ遺伝子、ａｒｏＢ遺伝子、ａｒｏＤ遺伝子、ａｒｏＥ遺伝子、ａｒｏＫ遺伝子、ａｒｏＬ遺伝子、ａｒｏＡ遺伝子、ａｒｏＣ遺伝子等の芳香族酸共通の合成過程における遺伝子及びｓｅｒＡ遺伝子、ｓｅｒＢ遺伝子、ｓｅｒＣ遺伝子等のＬ−セリン生合成遺伝子等が含まれる。
【００５０】
本発明におけるタンパク質活性が増強されるべきは親株として、エシェリヒア属に属するフェニルアラニン生産細菌、例えばエシェリヒア・コリＡＪ１２７３９（ｔｙｒＡ：：Ｔｎ１０、ｔｙｒＲ）株、ｐｈｅＡ３４遺伝子を保有するＨＷ１０８９株（ＡＴＣＣ アクセッション番号５５３７１）（ＵＳ５，３５４，６７２）、ＭＷＥＣ１０１−ｂ変異株（ＫＲ８９０３６８１）、ＮＲＲＬ Ｂ−１２１４１株、ＮＲＲＬ Ｂ−１２１４５株、ＮＲＲＬ Ｂ−１２１４６株、ＮＲＲＬ Ｂ−１２１４７株（ＵＳ４，４０７，９５２）等が利用される。エシェリヒア属に属するフェニルアラニン生産細菌は更に、ＡＪ１２６０４と名付けられたエシェリヒア・コリ Ｋ−１２［Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＰＨＡＢ］株、エシェリヒア・コリ Ｋ−１２［Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＰＨＡＤ］株、エ
シェリヒア・コリ Ｋ−１２［Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＰＨＡＴｅｒｍ］株、エシェリヒア・コリ Ｋ−１２［Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＢＲ−ａｒｏＧ４、ｐＡＣＭＡＢ］株等を含む（欧州特許ＥＰ４８８４２４Ｂ１）。
【００５１】
本発明のタンパク質の活性が増強されるべき親株としては、エシェリヒア属に属するＬ−チロシン生産細菌であるホスホエノールピルビン酸生産能を有し又は一般的な芳香族経路の酵素が増強されるエシェリヒア・コリ株等もまた使用される（ＥＰ０８７７０９０Ａ号）。
【００５２】
本発明の方法は、培地中で本発明の細菌を培養してＬ−アミノ酸を該培地中で生産及び蓄積させる工程、並びに該培地からＬ−アミノ酸を回収する工程を含む、Ｌ−アミノ酸の生産方法を包含する。また、本発明の方法は、培地中で本発明の細菌を培養してＬ−トリプトファンを該培地中で生産及び蓄積させる工程、並びに該培地からＬ−トリプトファンを回収する工程を含む、Ｌ−トリプトファンの生産方法を包含する。本発明の方法は、培地中で本発明の細菌を培養してＬ−フェニルアラニンを該培地中で生産及び蓄積させる工程、並びに該培地からＬ−フェニルアラニンを回収する工程を含む、Ｌ−フェニルアラニンの生産方法を包含する。本発明の方法は更に、培地中で本発明の細菌を培養してＬ−チロシンを該培地中で生産及び蓄積させる工程、並びに該培地からＬ−チロシンを回収する工程を含む、Ｌ−チロシンの生産方法を包含する。
【００５３】
本発明では、培養、Ｌ−アミノ酸、好ましくはＬ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンなどの芳香族アミノ酸の培地からの回収及び精製等は、アミノ酸が微生物を使用して生産される従来の発酵方法に類似した様式で実施される。
【００５４】
培養に使用される培地は、培地が炭素源及び窒素源及びミネラル、並びに必要であれば微生物が生育に要する適切な量の栄養分を包含する限り、合成培地であってもよく、或いは天然培地であってもよい。
【００５５】
炭素源としては、グルコース及びシュークロースのような様々な炭水化物、並びに様々な有機酸が挙げられる。選択した微生物の同化の様式に応じて、エタノール及びグリセロールを含むアルコールを使用してもよい。
【００５６】
窒素供給源としては、アンモニア及び硫酸アンモニウムのような様々なアンモニウム塩、アミンのような他の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解産物及び発酵性微生物の消化物のような天然窒素源が使用される。
【００５７】
ミネラルとしては、一リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウム等が使用される。
【００５８】
さらなる栄養分は、必要であれば培地へ添加することができる。例えば、微生物が生育にチロシンを要する場合（チロシン栄養要求性）、十分量のチロシンを培養用の培地へ添加することができる。
【００５９】
培養は、好ましくは振とう培養のような好気性条件下及び通気を伴う攪拌培養で、２０〜４２℃、好ましくは３７〜４０℃の温度で実施される。培養のｐＨは、通常５〜９、好ましくは６．５〜７．２である。培養のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウム、各種酸、各種塩基及び緩衝液で調節することができる。通常、１〜５日の培養により、液体培地中に目的Ｌ−アミノ酸が蓄積する。
【００６０】
培養後、細胞などの固形分は、遠心分離又は膜濾過により液体培地から除去することが
でき、続いて、目的Ｌ−アミノ酸は、イオン交換、濃縮及び結晶化方法により回収及び精製することができる。
【実施例】
【００６１】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照し、以下、より具体的に説明される。
【００６２】
実施例１：エシェリヒア・コリ由来のｐｇｌ遺伝子の同定及び塩基配列比較
Kupor及びFraenkelは、エシェリヒア・コリの染色体上のｃｈｌＤ（現在ｍｏｄＣとして知られている）とｂｉｏＡ遺伝子との間にｐｇｌ突然変異をマッピングした(Kupor, S.R. and Fraenkel, D.G., J. Bacteriol., 100:3, 1296-1301 (1969))。これは、エシェリヒア・コリ遺伝子地図の１７．１８分及び１７．４０分に相当する。この領域では、未知の機能を有するタンパク質をコードする８個のオープンリーディングフレームが存在する。更に、エシェリヒア・コリ ストックセンターデータベースは、１７．２０分と１７．２２分との間にｐｇｌ突然変異を位置付ける。これらの座標は、ｙｂｈＡ ＯＲＦとｙｂｈＤ ＯＲＦとの間に位置するｙｂｈＥオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の座標にほぼ正確に適合する（図１）。
【００６３】
ｙｂｈＥによりコードされるＹｂｈＥタンパク質を用いて実施されるＢＬＡＳＴ検索は、シゲラ・フレキシネリ（９８．８％相同性）、サルモネラ・チフィ（９２．８％相同性）、エスシニア・ペスティス（６８．４％相同性）などの種々の生物体において未知の機能を有する多くの相同体、バチルス・アンスラシス由来のチトクロムＤ１ヘムドメイン、自動コンピュータ分析により予測されるシュードモナス・フルオレッセンス由来の３−カルボキシムコネートシクラーゼ（２８％相同性）、トリコスポロン・ベイゲリ由来のムコネートシクロイソメラーゼ（２６％相同性）などの既知の機能を有するいくつかの相同体、及びアクセッション番号ＮＰ＿８３３１０７号でデータバンクにおいて６−ホスホグルコノラクトナーゼとして言及されるが、公表済の実験例に参照がないバチルス・セレウス由来のものが存在することを示した。
【００６４】
また、３つの重なった保存タンパク質ドメインが、NCBI Conserved Domain Searchを使用して見出された。それらのうちの２つは、特徴付けられていない機能を有する保存タンパク質ファミリーに属し、１つは、３−カルボキシムコネートシクラーゼファミリーに属する。
【００６５】
エシェリヒア・コリプロテオームのＢＬＡＳＴ検索は、例えばシュードモナス・プチダ由来の上述の６−ホスホグルコノラクトナーゼの相同体を明らかにしなかった。
【００６６】
エシェリヒア・コリ染色体においてｙｂｈＥとされるＯＲＦが、６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードするｐｇｌ遺伝子であるかどうかを同定するために、ｙｂｈＡ、ｙｂｈＥ及びｙｂｈＤ ＯＲＦの破壊を実施して、得られた突然変異体を「マルトースブルー」表現型に関して確認した（以下を参照）。
【００６７】
実施例２．ｙｂｈＥ ＯＲＦの破壊。クロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣｍR）を保有するＤＮＡフラグメントによるｙｂｈＥ ＯＲＦの置換。
ｙｂｈＥ ＯＲＦを破壊するために、ｃａｔ遺伝子によりコードされるクロラムフェニコール耐性マーカー（ＣｍR）を保有するＤＮＡフラグメントを、「Ｒｅｄ媒介性組込み」及び／又は「Ｒｅｄ駆動型組込み」とも呼ばれるDatsenko K.A.及びWanner B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645)により記載される方法を用いて、野生型のｙｂｈＥ ＯＲＦの代わりにエシェリヒア・コリＢＷ２５１１３［ｐＫＤ４６］株の染色体へ置換した。ｙｂｈＥ ＯＲＦの野生型の領域が置換された塩基配列及び該ＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列を配列表に示す（それぞれ、配列番号１及び２）。組換え
プラスミドｐＫＤ４６を含有するエシェリヒア・コリＢＷ２５１１３株は、E. Coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, USAから入手することができ、そのアクセッション番号は、ＣＧＳＣ７６３０である。
【００６８】
ＣｍRマーカーを含有するＤＮＡフラグメントは、市販のプラスミドｐＡＣＹＣ１８４（GenBank/EMBL アクセッション番号Ｘ０６４０３、Fermentas, Lithuania）鋳型として、プライマーＰ１（配列番号３）及びＰ２（配列番号４）を使用するＰＣＲにより得られた。プライマーＰ１は、ｙｂｈＥ ＯＲＦの５’末端に相同的な３６個のヌクレオチドを含有し、プライマーＰ２は、ｙｂｈＥ ＯＲＦの３’末端に相同的な３６個のヌクレオチドを含有する。ｙｂｈＥ遺伝子のこれらの配列は、細菌染色体へのさらなる組込みのためにプライマーＰ１及びＰ２に導入された。
【００６９】
ＰＣＲは、「ＴｅｒｍｏＨｙｂａｉｄ ＰＣＲ Ｅｘｐｒｅｓｓ」増幅器を使用して行った。反応混合物（総容量５０μｌ）は、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2を有する１０×ＰＣＲ緩衝液（Fermentas, Lithuania）５μｌ、ｄＮＴＰそれぞれ２００μＭ、使用するプライマーそれぞれ２５ｐｍｏｌ及びＴａｑ−ポリメラーゼ１Ｕ（Fermentas, Lithuania」）から構成された。プラスミドＤＮＡおよそ５ｎｇを、ＰＣＲ増幅用の鋳型ＤＮＡとして反応混合物中に添加した。温度プロフィールは、以下の通りであった：９５℃で５分間の初期ＤＮＡ変性、続く９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長を２５サイクル、及び７２℃で７分間の最終的な伸長。
【００７０】
続いて、増幅されたＤＮＡフラグメントは、アガロースゲル電気泳動により精製して、「ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｕｎｓ」（「Sigma」、ＵＳＡ）を使用して抽出して、エタノールにより沈殿させた。構築されたＤＮＡフラグメントの塩基配列を配列番号５に提示する。
【００７１】
上述のように精製し得られたＤＮＡフラグメントは、エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３［ｐＫＤ４６］株の細菌染色体へのエレクトロポレーション及びＲｅｄ媒介性組込みに使用した。熱感受性レプリコンを有する組換えプラスミドｐＫＤ４６(Datsenka, K.A., Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645)は、Ｒｅｄ媒介性組換え系で機能関与するλファージ由来遺伝子をドナーとして使用した。
【００７２】
ＢＷ２５１１３［ｐＫＤ４６］細胞は、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した液体ＬＢ培地中において３０℃で一晩生育させた後、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びＬ−アラビノース（１０ｍＭ）（アラビノースは、Ｒｅｄ系の遺伝子をコードするプラスミドを誘導するのに使用される）を添加したＳＯＢ培地（イーストエキストラクト、５ｇ／ｌ；ＮａＣｌ、０．５ｇ／ｌ；トリプトン、２０ｇ／ｌ；ＫＣｌ、２．５ｍＭ；ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ）で１：１００に希釈して、細菌培養物の光学密度がＯＤ600＝０．４〜０．７に到達するように３０℃で生育させた。細菌培養物１０ｍｌからの生育細胞を氷冷脱イオン水で３回洗浄して、続いて水１００μｌ中に懸濁させた。脱イオン水中に溶解させたＤＮＡフラグメント（１００ｎｇ）１０μｌを細胞懸濁液へ添加した。エレクトロポレーションは、「Bio-Rad」エレクトロポレータ（ＵＳＡ）（Ｎｏ．１６５−２０９８、バージョン２−８９）により、製造業者の指示書に従って実施された。電気を通した細胞を、ＳＯＣ培地(Sambrook et al, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))１ｍｌへ添加して、３７℃で２時間インキュベートし、続いてクロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを含有するＬ−寒天培地上へ広げた。２４時間以内に生育したコロニーを、プライマーＰ３（配列番号６）及びＰ４（配列番号７）を使用するＰＣＲにより、野生型のｙｂｈＥ ＯＲＦに代わるＣｍRマーカーの存在を試験した。この目的で、単離したコロニーを水２０μｌ中に懸濁させた後、得られた懸濁液１μｌをＰＣＲに使用した。温度プロフィールは、以下の通りであ
った：９５℃で１０分間の初期ＤＮＡ変性、続く９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長を３０サイクル、及び７２℃で７分間の最終的な伸長。試験したいくつかのＣｍRコロニーが、目的の１２７９ｂｐ ＤＮＡフラグメントを含有し、野生型のｙｂｈＥ ＯＲＦに代わるＣｍRマーカーＤＮＡの存在を確認した。得られた株の１つは、３７℃で培養することにより、熱感受性プラスミドｐＫＤ４６を除去して、得られた株をエシェリヒア・コリＢＷ２５１１３−ΔｙｂｈＥ株と命名した。
【００７３】
ｙｂｈＥ ＯＲＦが崩壊された細菌ＤＮＡ領域の構造を図２に示す。
【００７４】
実施例３．ｙｂｈＡ ＯＲＦ及びｙｂｈＤ ＯＲＦの破壊。クロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣｍR）を保有するＤＮＡフラグメントによるｙｂｈＡ ＯＲＦ及びｙｂｈＤ ＯＲＦの置換。
ｙｂｈＡ ＯＲＦ及びｙｂｈＤ ＯＲＦを破壊するために、ｃａｔ遺伝子によりコードされるクロラムフェニコール耐性マーカー（ＣｍR）を保有するＤＮＡフラグメントを、実施例２に記載される方法により、野生型のｙｂｈＡ ＯＲＦ及びｙｂｈＤ ＯＲＦの代わりにエシェリヒア・コリＢＷ２５１１３［ｐＫＤ４６］株の染色体中へ個々に組み込んだ。
【００７５】
エレクトロポレーション並びにｙｂｈＡ ＯＲＦ及びｙｂｈＤ ＯＲＦの破壊用のフラグメントを得るために、それぞれプライマーＰ５（配列番号８）とＰ６（配列番号９）、及びＰ７（配列番号１０）とＰ８（配列番号１１）の２対を合成し、ＰＣＲに使用した。プライマーＰ５は、ｙｂｈＡ ＯＲＦの３’末端に相同的な３６個のヌクレオチドを含有する。プライマーＰ６は、ｙｂｈＡ ＯＲＦの５’末端に相同的な３６個のヌクレオチドを含有する。プライマーＰ７は、ｙｂｈＤ ＯＲＦの３’末端に相補的な３６個のヌクレオチドを含有する。また、プライマー８は、ｙｂｈＤ ＯＲＦの５’末端に相補的な３６個のヌクレオチドを含有する。これらの配列は、細菌染色体へのさらなる組込みのためにプライマーＰ５、Ｐ６、Ｐ７及びＰ８に導入された。
【００７６】
構築されたＤＮＡフラグメントの塩基配列を、それぞれ配列番号１２及び配列番号１３に示す。ｙｂｈＡ ＯＲＦ及びｙｂｈ ＯＲＦの、置換される野生型の領域の塩基配列は、アクセッション番号ＮＣ＿０００９１３．１（それぞれ、ヌクレオチド番号７９６８３６〜７９７６５４及び７９８８４５〜７９９７７７、ｇｉ：１６１２８７３４及びｇｉ：３３３４７４８１）でGenBankに示される。ｙｂｈＡ ＯＲＦ及びｙｂｈ ＯＲＦが破壊された細菌ＤＮＡ領域の構造を、それぞれ図３及び図４に示す。
【００７７】
エレクトロポレーション後、相当するコロニーを、ｙｂｈＡ ＯＲＦの破壊に関してはプライマーＰ９（配列番号１４）及びＰ１０（配列番号１５）を、並びにｙｂｈＤ ＯＲＦの崩壊に関してはプライマー１１（配列番号１６）及びＰ１２（配列番号１７）を使用するＰＣＲにより、ＣｍRマーカーの存在を試験した。
【００７８】
第１に、試験したいくつかのＣｍRコロニーが、目的の１４２４ｂｐ ＤＮＡフラグメントを含有し、野生型のｙｂｈＡ ＯＲＦに代わるＣｍR遺伝子の存在を確認した。第２に、試験したいくつかのＣｍRコロニーが、目的の１３８６ｂｐ ＤＮＡフラグメントを含有し、野生型のｙｂｈＤ ＯＲＦに代わるＣｍR遺伝子の存在を確認した。それぞれの場合で、得られた株の１つは、３７℃で培養することにより、熱感受性プラスミドｐＫＤ４６が除去され、その結果得られた株を、それぞれエシェリヒア・コリＢＷ２５１１３−ΔｙｂｈＡ株及びＢＷ２５１１３−ΔｙｂｈＤ株と命名した。
【００７９】
実施例４：「マルトースブルー」表現型に関するｙｂｈＥ-、ｙｂｈＡ-及びｙｂｈＤ-突
然変異体の確認
３つの得られた突然変異株はそれぞれ、Kupor, S.R.及びFraenkel, D.G. (J. Bacteriol., 100:3, 1296-1301(1969))により記載される方法により「マルトースブルー」表現型に関して試験した。培養物を、マルトース０．８％を含有するＭ９最小培地を有するプレート上にまいた。６時間後、インキュベーションプレートを、０．０１Ｍ Ｉ2及び０．０３Ｍ ＫＩを含有する溶液５ｍｌで満たして、パッチカラーを視覚的に「ブルー」又は「非ブルー」とスコア付けした。
【００８０】
得られたＢＷ２５１１３−ΔｙｂｈＥ株は、「ブルー」とスコア付けされたのに対して、ＢＷ２５１１３−ΔｙｂｈＡ、ＢＷ２５１１３−ΔｙｂｈＤ及びＢＷ２５１１３（対照株として）は「非ブルー」であった。
【００８１】
実施例５．ｐｇｉ、及びｙｂｈＥ又はｙｂｈＤ欠失を保有する二重突然変異株の構築。種々の炭素源上でのこのような株の生育比較。
ホスホグルコースイソメラーゼを欠損する突然変異株（ｐｇｉ-）を単独で、ペントースリン酸経路の酸化的経路を使用してグルコース上で徐々に生育させた。この経路の第２工程を触媒するホスホグルコノラクトナーゼ（ｐｇｌ）も欠く二次突然変異体は、６−ホスホグルコノラクトンのグルコン酸−６−リン酸への自発的加水分解のみに起因して、よりゆっくりと生育する。従って、ｙｂｈＥ ＯＲＦが実際にｐｇｌ遺伝子である場合、ｐｇｉ，ｙｂｈＥ二重突然変異体は、野生型株及びｐｇｉ突然変異体よりもゆっくりと生育するであろう。この示唆を支持するために、ｐｇｉ，ｙｂｈＥ二重突然変異体を調製した。
【００８２】
ｐｇｉ遺伝子における突然変異は、実施例２に記載される方法により、カナマイシン耐性遺伝子（ＫｍR）を保有するＤＮＡフラグメントによる、エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３［ｐＫＤ４６］株中の野生型細菌染色体領域の置換により実施された。ｐｇｉ遺伝子の置換された野生型領域の塩基配列は、アクセッション番号ＮＣ＿０００９１３．１（ヌクレオチド番号４２３１３３７〜４２３２９８６、ｇｉ：１６１３１８５１）でGenBankに示される。
【００８３】
ＫｍR遺伝子を保有するＤＮＡフラグメントは、市販のプラスミドｐＵＣ４ＫＡＮ（GenBank/EMBLアクセッション番号Ｘ０６４０４、Fermentas, Lithuania）を鋳型として、プライマーＰ１３（配列番号１８）及びＰ１４（配列番号１９）を使用するＰＣＲにより得られた。プライマーＰ１３は、ｐｇｉ遺伝子の３’末端に相同的な３６個のヌクレオチドを含有し、プライマーＰ１４は、ｐｇｉ遺伝子の５’末端に相同的な３６個のヌクレオチドを含有する。ｐｇｉ遺伝子に由来するこれらの配列は、細菌染色体へのさらなる組込みのためにプライマーＰ１３及びＰ１４に導入された。
【００８４】
ＰＣＲは、実施例２に記載するように実施された。
【００８５】
続いて、増幅されたＤＮＡフラグメントは、アガロースゲル電気泳動により濃縮して、「ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｕｎｓ」（「Sigma」、ＵＳＡ）による遠心分離によりゲルから抽出して、エタノールにより沈殿させた。構築されたＤＮＡ領域の塩基配列を配列番号２０に示す。
【００８６】
上述のように精製し得られたＤＮＡフラグメントは、実施例２に記載されるようにエシェリヒア・コリＢＷ２５１１３［ｐＫＤ４６］株の細菌染色体へのエレクトロポレーション及びＲｅｄ媒介性組込みに使用したが、但し、細胞は、エレクトロポレーション後にカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含有するＬ−寒天培地上へ延展した。
【００８７】
２４時間以内に生育したコロニーを、プライマー１５（配列番号２１）及びＰ１６（配列番号２２）を使用するＰＣＲにより、ｐｇｉ遺伝子の代わりにＫｍRマーカーの存在を試験した。この目的で、単離したコロニーを水２０μｌ中に懸濁させた後、得られた懸濁液１μｌをＰＣＲに使用した。ＰＣＲ条件は、実施例２に記載する通りである。試験したいくつかのＫｍRコロニーが、目的の１２８６ｂｐ ＤＮＡフラグメントを含有し、ｐｇｉ遺伝子に代わるＫｍRマーカーの存在を確認した。得られた株の１つは、３７℃で培養することにより、熱感受性プラスミドｐＫＤ４６が除去され、得られた株をエシェリヒア・コリＢＷ２５１１３−Δｐｇｉ株と命名した。
【００８８】
ｐｇｉ遺伝子が欠失した細菌ＤＮＡ領域の構造を図５に示す。
【００８９】
ｐｇｉ欠失は、Fraenkel(J. Bacteriol. 93(1967), 1582-1587)の方法により、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株へ形質導入され、続いてカナマイシンを含有するプレート上で選択した。得られた株をＭＧ−Δｐｇｉと命名した。続いて、ｙｂｈＥ ＯＲＦ及びｙｂｈＤ ＯＲＦにおける突然変異は、実施例２及び実施例３に記載されるＢＷ２５１１３−ΔｙｂｈＥ株及びＢＷ２５１１３−ΔｙｂｈＤ株から、上記の得られた株へ形質導入されて、続いてクロラムフェニコールを含有するプレート上で選択した。得られた株を、それぞれＭＧ−Δｐｇｉ−ΔｙｂｈＥ及びＭＧ−Δｐｇｉ−ΔｙｂｈＤと命名した。
【００９０】
これらの２つの株をＭＧ１６５５及びＭＧ１６５５−Δｐｇｉと一緒に、炭素源としてグルコース又はグルコン酸を有するＭ９最小プレート上へまいた。２４時間のインキュベーション後に、株の生育を視覚的に試験した。ＭＧ−Δｐｇｉ−ΔｙｂｈＥの生育は、グルコースを有するプレート上で他のすべての株よりも悪く、グルコン酸を有するプレート上では識別不可能であった。
【００９１】
実施例６．シュードモナス・プチダ由来のｐｇｌ遺伝子を保有するプラスミドの構築及びｙｂｈＥ突然変異の相補
いくつかの生物体由来のｐｇｌ遺伝子が記載されている。それらの中には、エシェリヒア・コリにかなり密接な関係にあるシュードモナス・プチダ由来の６−ホスホグルコノラクトナーゼが存在する。他のいくつかの遺伝子を、シュードモナス・プチダからエシェリヒア・コリへクローニングして、エシェリヒア・コリに存在する突然変異と一致をすることが報告された(Ramos-Gonzalez, M.I.and Molin, S., J. Bacteriol., v180, 13, p.3421, 1998)。
【００９２】
シュードモナス・プチダ由来のｐｇｌ遺伝子は、プライマー１７（配列番号２３）及び１８（配列番号２４）を使用してクローニングした。プライマー１７は、シュードモナス・プチダ由来のｐｇｌ遺伝子の１〜１９ｂｐの配列と同一である配列を含有する。このプライマーはまた、上流に位置するエシェリヒア・コリ由来のｌａｃＺ遺伝子のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）、及びその５’末端に導入される制限酵素ＳａｃＩの認識部位を含有する。プライマーＰ１８は、シュードモナス・プチダ由来のｐｇｌ遺伝子の７０９〜７２９ｂｐの配列に相補的な配列、及びその５’末端に導入される制限酵素ＥｃｏＲＩの認識部位を含有する。
【００９３】
シュードモナス・プチダＫＴ２４４０株ＴＧ１(Bagdasarian, M. & Timmis, K.N., In Current Topics of Microbiology and Immunology, eds. Goebel, W. & Hofschneider, P.H. (Springer, Berlin), pp. 47-67 (1981))の染色体ＤＮＡは、典型的な方法により調製された。ＰＣＲは、「Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００」で、以下の条件下で実施した：９５℃で４０秒、５３℃で４０秒、７２℃で４０秒、Ｔａｑポリメラーゼ(Fermentas)を用いて２５サイクル。ｌａｃＺ遺伝子のＲＢＳを有するシュードモナス・プチダ由来のｐｇｌ遺伝子を含有している得られたＰＣＲ
フラグメントを、ＳａｃＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素で処理して、同じ酵素で予め処理した多コピーベクターｐＵＣ１９へ挿入した。このようにして、プラスミドｐＵＣ１９−ｐｇｌが得られた。
【００９４】
ＢＷ２５１１３−ΔｙｂｈＥ株を、得られたプラスミドｐＵＣ１９−ｐｇｌにより形質転換した。アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有する最小マルトースプレート上に培養物をパッチして、上述のように処理して、「マルトースブルー」表現型を確認した。対照株ＢＷ２５１１３−ΔｙｂｈＥと対比して、形質転換体は「マルトースブルー」表現型を示さなかった。
【００９５】
したがって、シュードモナス・プチダ由来のｐｇｌ遺伝子のクローニングされたコピーは、エシェリヒア・コリにおけるｙｂｈＥ突然変異を補完し、これはｙｂｈＥ ＯＲＦが、ｐｇｌ遺伝子のコード領域であるという仮説を再度支持した。
【００９６】
実施例７．ｙｂｈＥ突然変異体における６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性の測定
一晩培養したＢＷ２５１１３株及びＢＷ２５１１３−ΔｙｂｈＥ株の培養液を、グルコースを含有する最小Ｍ９培地で５０倍に希釈した。培養液の光学密度が、ＯＤ540＝１に到達するまで、細胞を生育させた。抽出物は、培養液３ｍｌから調製した。細胞を生理食塩溶液で洗浄して、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）４００μｌ中に再懸濁させて、超音波処理した。続いて、遠心分離後に得られた上清分画を、更に希釈することなくアッセイに使用した。
【００９７】
６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性の測定に関しては、Collard, F等(FEBE Letters 459 (1999) 223-226)により記載される方法を使用した。ラクトンは、０．２ｍＭ ＮＡＤＰ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）、２ｍＭ ＭｇＣｌ2及び１．７５Ｕ 酵母グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ(Sigma, USA)の存在下３０℃で５０μＭ グルコース−６−リン酸(Sigma,USA)（総容量−１ｍｌ）をインキュベートすることにより即座に調製された。反応混合物のＡ340での光学密度がプラトーに達したら、先立って得られたアッセイされるべき上清分画と一緒に０．５Ｕ／ｍｌの６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(Sigma, USA)を添加して、Ａ340での光学密度を約１０分間更に測定した。タンパク質の量は、Bradford, M.M. (Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976))の方法に従って測定した。得られたデータを表１に示す。活性は、総タンパク質１ｍｇ当たりの相対単位で示される。
【００９８】
【表１】
【００９９】
表からわかるように、ｙｂｈＥ突然変異体における６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性は、「野生型」株における場合よりも少なくとも一オーダー分低く、自発的加水分解の割合に匹敵する。
【０１００】
実施例８．ｚｗｆ−ｅｄｄ−ｅｄａオペロンの欠失。カナマイシン耐性遺伝子（ＫｍR）を保有するＤＮＡフラグメントによるｚｗｆ−ｅｄｄ−ｅｄａ遺伝子領域の置換
ＹｂｈＥ発現が増大された株を得るために、本発明者は、Ｒｅｄ媒介性組込みを使用したｙｂｈＥ ＲＢＳとその野生型のプロモーターとの間のＰtacに由来する構成的プロモーターの組込みを計画した（実施例９を参照）。
【０１０１】
しかし、本発明者は、「野生型」ＭＧ１６５５株におけるこのような染色体改変を提供することができなかった。本発明者は、ｐｇｌ（ｙｂｈＥ）の発現増強による毒性効果を説明することができないが、それが、ペントース−リン酸経路（ＰＰＰ）の不均衡や幾つかの毒性中間体の蓄積（又は細胞生存の必須物の飢餓）の可能性を招く６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性の増大に関与することを本発明者は提唱した。したがって、本発明者は、この経路の第１の酵素をコードするｚｗｆ遺伝子の欠失によりＰＰＰを完全に遮断することを試みた。
【０１０２】
ｚｗｆ−ｅｄｄ−ｅｄａオペロンの欠失は、ｐｇｉ遺伝子に関して実施例５に記載される方法により実施された。ｚｗｆ−ｅｄｄ−ｅｄａオペロンの置換された野生型の領域の塩基配列は、アクセッション番号ＮＣ＿０００９１３．１（ｚｗｆ、ｅｄｄ及びｅｄａ遺伝子に関してそれぞれ、ヌクレオチド番号１９３２８６３〜１９３４３３８、ｇｉ：１６１２９８０５；１９３０８１７〜１９３２６２８、ｇｉ：１６１２９８０４、及び１９３０１３９〜１９３０７８０、ｇｉ：１６１２９８０３）でGenBankに示される。ＫｍR遺伝子を保有するＤＮＡフラグメントは、プライマーＰ１９（配列番号２５）及びＰ２０（配列番号２６）を使用するＰＣＲにより得られた。プライマー１９は、ｅｄａ遺伝子の３’末端に相補的な３６個のヌクレオチドを含有する。プライマーＰ２０は、ｚｗｆ遺伝子の５’末端に相補的な３６個のヌクレオチドを含有する。構築されたＤＮＡフラグメントの塩基配列を配列番号２７に示す。
【０１０３】
２４時間以内に生育したコロニーを、プライマーＰ２１（配列番号２８）及びＰ２２（配列番号２９）を使用するＰＣＲにより、ｚｗｆ−ｅｄｄ−ｅｄａオペロンに代わるＫｍRマーカーの存在を試験した。試験したいくつかのＫｍRコロニーが、目的の１２８７ｂｐ
ＤＮＡフラグメントを含有し、ｚｗｆ−ｅｄｄ−ｅｄａオペロンに代わるＫｍR遺伝子の存在を確認した。得られた株の１つは、３７℃で培養することにより、熱感受性プラスミドｐＫＤ４６が除去されて、得られた株をエシェリヒア・コリＢＷ２５１１３−Δｚｗｆ−ｅｄｄ−ｅｄａ株と命名した。ｚｗｆ−ｅｄｄ−ｅｄａオペロンが欠失された細菌ＤＮＡ領域の構造を図６に示す。
【０１０４】
実施例９．合成Ｐtac*−プロモーターを保有する新規調節エレメントによるエシェリヒア・コリ染色体上に位置するｙｂｈＥ遺伝子の野生型の上流領域の置換
ｐｇｌ（ｙｂｈＥ）遺伝子の上流への様々な強度を有する人工Ｐtac*プロモーターのさらなる組込みのために、ｐＫＤ４６プラスミドによるエシェリヒア・コリＢＷ２５１１３−Δｚｗｆ−ｅｄｄ−ｅｄａ株の再形質転換を実施した。得られたカナマイシン且つアンピシリン耐性株をエシェリヒア・コリＢＷ２５１１３−Δｚｗｆ−ｅｄｄ−ｅｄａ［ｐＫＤ４６］株と命名した。ｐＫＤ４６プラスミドは熱感受性であるため、形質転換体のさらなる選択は、３０℃で実施した。
【０１０５】
σ70とエシェリヒア・コリＲＮＡポリメラーゼの複合体により認識されるプロモーターの「−３５」領域を持つ突然変異体は、有意に変じた転写開始能を保有する（ＷＯ００／１８９３５）。したがって、初期ランダムプロモーター様配列で創出され、得られたプロモーターの中でも、種々の強度を有するプロモーターが得られる。したがって、この一般的なアプローチは、目的の遺伝子の発現レベルの微調整に利用することができる。本発明の発明者等は、種々の強度を有する改変Ｐtacプロモーターのライブラリーを予め得た（
これ以降、このような改変Ｐtacプロモーターはアスタリスクで標識する）。これらのプロモーターは、「−３５」領域の４つの中心的なヌクレオチドが異なる。本研究では、異なる強度を有する２つのＰtac*プロモーターを使用した。相当するプロモーターの制御下で発現されるβ−ガラクトシダーゼ活性の値に基づいて、それらをＰtac-10000（通常のＰtac）及びＰtac-3900（中心に元のＴＧＡＣの代わりにＴＴＧＣのヌクレオチドを有する）と命名した。
【０１０６】
続いて、これらの人工Ｐtac*プロモーターのそれぞれが、上記の方法により、エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３−Δｚｗｆ−ｅｄｄ−ｅｄａ［ｐＫＤ４６］株の染色体のｐｇｌ遺伝子コード領域の上流に組み込まれた（実施例２を参照）。更に、プロモーター領域の上流にクロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣｍR）を有する人工ＤＮＡフラグメントを組み込んだ（実施例７を参照）。
【０１０７】
細菌染色体の相当する領域へ組み込んだ上述の人工ＤＮＡフラグメントの構築は、数工程で完了した。第１の工程に関しては、上流領域にＢｇｌＩＩ制限部位及びＰtac*プロモーターに相当する部位を保有するＤＮＡフラグメントが、ＰＣＲにより得られた。
【０１０８】
染色体へ組み込まれた人工Ｐtac-3900プロモーター及びＰtac-10000プロモーターを有するエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株由来の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲに使用した。ＰＣＲは、Ｐtac-3900及びＰtac-10000の場合では、それぞれプライマーＰ２３（配列番号３０）及びＰ２４（配列番号３１）を、並びに両方の場合においてプライマーＰ２５（配列番号３２）を使用して行った。プライマーＰ２３及びＰ２４は、それらの５’末端に導入されるＢｇｌＩＩ制限部位を含有する。Ｐ２５は、ｐｇｌ遺伝子の上流の１１個のヌクレオチド（ＲＢＳを含む）及びｐｇｌコード領域の最初２５個のヌクレオチドを含有する。上述の配列は、細菌染色体へのさらなる組込みのためにプライマーＰ２５に導入された。
【０１０９】
ＰＣＲは、増幅器「ＴｅｒｍｏＨｙｂａｉｄ ＰＣＲ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ」を使用して行った。反応混合物（総容量５０μｌ）は、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2を含有する１０×ＰＣＲ緩衝液（Fermentas, Lithuania）５μｌ、ｄＮＴＰそれぞれ２００μＭ、利用するプライマーそれぞれ２５ｐｍｏｌ及び１ｕ Ｔａｑ−ポリメラーゼ（Fermentas, Lithuania）から構成された。染色体ＤＮＡおよそ０．５μｇを、さらなるＰＣＲ増幅用の鋳型ＤＮＡとして反応混合物中に添加した。温度ＰＣＲ条件は、以下の通りであった：９５℃で５分間の初期ＤＮＡ変性、続く９５℃で３０秒間の変性、５３℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長を２５サイクル、及び７２℃で７分間の最終的な重合。
【０１１０】
目的のＤＮＡフラグメントの構築の第２の段階を実施した。ＣｍR遺伝子は、鋳型として市販のプラスミドｐＡＣＹＣ１８４（GenBank/EMBL アクセッション番号Ｘ０６４０３、Fermentas, Lithuania）、並びにプライマーＰ２６（配列番号３３）及びＰ２７（配列番号３４）を使用するＰＣＲにより増幅された。プライマーＰ２６は、Ｐtac*プロモーターを保有する、先立って得られたＤＮＡフラグメントとのさらなる連結に使用されるＢｇｌＩＩ制限部位を含有する。プライマーＰ２７は、細菌染色体へのフラグメントのさらなる組込みのために必要であるエシェリヒア・コリ由来のｐｇｌ（ｙｂｈＥ）遺伝子開始コドンの上流に位置するヌクレオチド５８〜１２に相補的な４６個のヌクレオチドを含有する。
【０１１１】
続いて、増幅されたＤＮＡフラグメントは、アガロースゲル電気泳動により精製して、「ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｕｎｓ」（Sigma, ＵＳＡ）による遠心分離によりゲルから抽出して、エタノールにより沈殿させた。続いて、得られた２つのＤＮＡ
フラグメントを、ＢｇｌＩＩ制限酵素で処理して、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して連結させた(Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook, J.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)。
【０１１２】
連結された生成物をプライマーＰ２５及びＰ２７を使用するＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲは、１０×ＡｃｃｕＴａｑ ＬＡ緩衝液（Sigma, ＵＳＡ）５μｌ、ｄＮＴＰそれぞれ２００μＭ、利用するプライマーそれぞれ２５ｐｍｏｌ及び１ユニット ＡｃｃｕＴａｑ ＬＡポリメラーゼ（Sigma, ＵＳＡ）から構成される反応混合物（総容量５０μｌ）を用いて行った。連結されたＤＮＡ生成物およそ５０ｎｇを、鋳型として反応混合物中に添加した。ＰＣＲ温度サイクルは、以下の通りであった：９５℃で５分間の初期ＤＮＡ変性、続く９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で４分間の伸長を２５サイクル、及び７２℃で７分間の最終的な重合。
【０１１３】
構築されたＤＮＡ領域の塩基配列は、それぞれＰtac-3900及びＰtac-10000プロモーターに関して、配列番号３５及び配列番号３６に示す。
【０１１４】
上記のように精製し得られたＤＮＡフラグメントは、実施例２に記載されるように、エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３Δｚｗｆ−ｅｄｄ−ｅｄａ［ｐＫＤ４６］株の細菌染色体へのエレクトロポレーション及びＲｅｄ媒介性組込みに使用した。
【０１１５】
クロラムフェニコールを含有する培地中で２４時間以内に生育したコロニーを、プライマー２７（配列番号３４）及びＰ１０（配列番号１５）を使用するＰＣＲにより、ｐｇｌ遺伝子の上流のＣｍRマーカーの存在を明らかにするために試験した。同じコロニーはまた、Ｐtac-3900及びＰtac-10000に関して、それぞれプライマーＰ２３（配列番号３０）及びＰ２４（配列番号３１）、並びにＰ１０（配列番号１５）を使用するＰＣＲにより、ｐｇｌ遺伝子の上流のＰtac*プロモーター領域の存在を明らかにするためにも試験した。この目的で、単離したてのコロニーを水２０μｌ中に懸濁させた後、懸濁液１μｌをＰＣＲに使用した。ＰＣＲ条件は、以下の通りであった：９５℃で１０分間の初期ＤＮＡ変性、続く９５℃で３０秒間の変性、５４℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長を３０サイクル、及び７２℃で７分間の最終的な重合。試験したいくつかのＣｍRコロニーが、目的の１１９３ｂｐ及び１２４ｂｐ ＤＮＡフラグメントを含有し、それぞれエシェリヒア・コリ染色体においてＰtac*プロモーターを保有する、ｐｇｌ遺伝子上流の構築ＤＮＡ領域及びハイブリッド調節エレメントの存在を確認した。両方の場合で、得られた株の１つは、３７℃で培養することにより、熱感受性プラスミドｐＫＤ４６が除去され、得られた株を、それぞれエシェリヒア・コリＢＷ２５１１３−Ｐｔａｃ−３９００−ｙｂｈＥ株及びＢＷ２５１１３−Ｐｔａｃ−１００００−ｙｂｈＥ株と命名した。ｐｇｌ遺伝子の上流の構築ＤＮＡ領域の構造を図７に示す。
【０１１６】
実施例１０．ｐｇｌ遺伝子発現が増強された株における６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性の測定
【０１１７】
ＢＷ２５１１３−Ｐtac-3900−ｙｂｈＥ株及びＢＷ２５１１３−Ｐtac-10000−ｙｂｈＥ株由来の６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性は、実施例７に記載されるように測定した。得られたデータを表２に示す。自発的加水分解のレベルを差し引いている
【０１１８】
【表２】
【０１１９】
従って、ｐｇｌ遺伝子の発現増強は、６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性を増大させる。
【０１２０】
実施例１１．ｐｇｌ遺伝子の発現増強のトリプトファン生産に対する影響
トリプトファン生産エシェリヒア・コリＳＶ１６４［ｐＭＷ−ＰlacUV5−ｓｅｒＡ５−ｆｒｕＲ，ｐＹＤＤＧ２］株を、ｐｇｌ遺伝子の発現増強のトリプトファン生産に対する影響の評価用の親株として使用した。ＳＶ１６４株は、米国特許第６，１８０，３７３号に詳述されている。ＳＶ１６４［ｐＭＷ−ＰlacUV5−ｓｅｒＡ５−ｆｒｕＲ，ｐＹＤＤＧ２］株は、ＳＶ１６４株の誘導体であり、プラスミドｐＭＷ−ＰlacUV5−ｓｅｒＡ５−ｆｒｕＲ及びｐＹＤＤＧ２を更に含有する。プラスミドｐＭＷ−ＰlacUV5−ｓｅｒＡ５−ｆｒｕＲは、セリンによるフィードバック阻害のないタンパク質をコードする突然変異ｓｅｒＡ５を保有する（ＷＯ２００４０９０１２５Ａ２号）。ｓｅｒＡ５遺伝子の増幅は、Ｌ−トリプトファンの前駆体であるセリンの量を増大させるのに必要である（米国特許第６，１８０，３７３号）。プラスミドｐＹＤＤＧ２は、ｐＡＹＣＴＥＲ３ベクター（ＷＯ０３／０４４１９２号）に基づいて構築され、Ｌ−トリプトファン生産に有用な膜貫通タンパク質（推定上の輸送体）をコードするｙｄｄＧ遺伝子を含有する。ｐＡＹＣＴＥＲ３ベクターは、中程度のコピー数で、且つプラスミドＲＳＦ１０１０に基づいて構築される非常に安定なベクターであるｐＡＹＣ３２の誘導体であり、ストレプトマイシン耐性に関するマーカーを保有する(Christoserdov A.Y., Tsygankov Y.D, Broad-host range vectors
derived from a RSF 1010 Tnl plasmid, Plasmid, 1986, v. 16, pp. 161-167)。ｐＡＹＣＴＥＲ３ベクターは、ｐＡＹＣ３２プラスミドへのそのプロモーターに代わるｐＵＣ１９プラスミド由来のポリリンカー及び強力なターミネーターｒｒｎＢの導入により得られた。
【０１２１】
Ｐtac*プロモーターの制御下にあるｐｇｌ遺伝子の発現増強のトリプトファン生産に対する影響を試験するために、上記のエシェリヒア・コリＢＷ２５１１３−Ｐtac-3900−ｙｂｈＥ株及びＢＷ２５１１３−Ｐtac-10000−ｙｂｈＥ株の染色体由来のＤＮＡフラグメントを、トリプトファン生産エシェリヒア・コリＳＶ１６４［ｐＭＷ−ＰlacUV5−ｓｅｒＡ５−ｆｒｕＲ］株へＰ１形質導入により移入した(Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY)。続いて、プラスミドｐＹＤＤＧ２を、ＳＶ１６４［ｐＭＷ−ＰlacUV5−ｓｅｒＡ５−ｆｒｕＲ］株及び得られた形質導入体の両方に導入した。
【０１２２】
ＳＶ１６４［ｐＭＷ−ＰlacUV5−ｓｅｒＡ５−ｆｒｕＲ，ｐＹＤＤＧ２］、ＳＶ１６４−Ｐtac-3900−ｙｂｈＥ［ｐＭＷ−ＰlacUV5−ｓｅｒＡ５−ｆｒｕＲ，ｐＹＤＤＧ２］及びＳＶ１６４−Ｐtac-10000−ｙｂｈＥ［ｐＭＷ−ＰlacUV5−ｓｅｒＡ５−ｆｒｕＲ，ｐＹＤＤＧ２］株は、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ及びストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌを補充した栄養ブロス３ｍｌ中にて３７℃で振とうしながら一晩培養した。得られた培養物０．３ｍｌを、２０×２００ｍｍの試験管中で上記抗生物質を含有する発酵培地３ｍｌへ植菌して、回転振とう機により２５０ｒｐｍにて、３７℃で４０時間培養した。
【０１２３】
発酵培地の組成を表３に示す。
【０１２４】
【表３】
【０１２５】
セクションＡは、ＮＨ4ＯＨによりｐＨ７．１に調節された。セクションはそれぞれ、個々に滅菌された。
【０１２６】
培養後、培地中に蓄積したＬ−トリプトファンの量をＴＬＣにより測定した。蛍光指示薬を含有していないＳｏｒｂｆｉｌシリカゲルの０．１１ｍｍ層でコーティングされた１０×１５ｃｍのＴＬＣプレート(Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, Russia)を使用した。Ｓｏｒｂｆｉｌプレートは、移動相：プロパン−２−オール：酢酸エチル：２５％アンモニア水：水＝１６：１６：３：９（ｖ／ｖ）で展開した。アセトン中のニンヒドリンの溶液（２％）を可視化試薬として使用した。得られたデータを表４に示す。
【０１２７】
【表４】
【０１２８】
表４からわかるように、ｐｇｌ遺伝子発現の増強は、ＳＶ１６４［ｐＭＷ−ＰlacUV5−ｓｅｒＡ５−ｆｒｕＲ，ｐＹＤＤＧ２］株のトリプトファン生産性を向上させた。
【０１２９】
実施例１２．Ｈｉｓをタグ付ＹｂｈＥタンパク質の精製及びその６−ＰＧＬ（６−ホスホグルコノラクトナーゼ）活性の定量
実施例１〜７で先述した結果すべては、ｙｂｈＥ ＯＲＦが、エシェリヒア・コリにおいて機能的に活性な６−ＰＧＬをコードするｐｇｌ遺伝子であると間接的に示す。他方で、ｙｂｈＥ ＯＲＦは、例えば６−ＰＧＬを同様にコードする別の未知の遺伝子の発現を正に調節する因子をコードすることも考えられる。したがって、ｙｂｈＥ ＯＲＦの性質に関する最終的な結論は、そのタンパク質生成物の生物学的活性の直接的な定量によってのみなされる。
【０１３０】
この目的で、ｙｂｈＥ ＯＲＦは、染色体中にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を保有するレシピエント株としてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）を含み、且つＴ７後期プロモーター及びＴ７遺伝子１０の効率的なＲＢＳを有するｐＥＴ−２２ｂ（＋）ベクタープラスミドを含んだＴ７発現系を利用することにより過剰発現させた。以下のタンパク質精製の利便性のために、６ＨｉｓコドンをｙｂｈＥ ＯＲＦの５’末端に、ＡＴＧ開始コドンのすぐ後に挿入した。
【０１３１】
Ｔ７発現系においてＨｉｓ−Ｔａｇ配列を有するｙｂｈＥ ＯＲＦをクローニングするために、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株の染色体ＤＮＡを鋳型として使用して、プライマーＰ２８（配列番号３７）及びＰ２９（配列番号３８）を用いて、ＰＣＲを行った。プライマーＰ２８は、ＮｄｅＩ制限部位、及びｙｂｈＥ ＯＲＦの第２コドンの前に６個のさらなるヒスチジンコドンに連結されたＡＴＧコドンを含有する。プライマーＰ２９は、さらなるクローニングのために５’末端にＢａｍＨＩ制限部位を含有する。増幅されたＤＮＡフラグメントを単離して、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素で処理して、同じ酵素で予め処理したｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドへ連結した。得られたｐＥＴ−ＨＴ−ｙｂｈＥプラスミドの構築は、シーケンシングにより確認した。
【０１３２】
続いて、ラクトースプロモーターの制御下にあるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を染色体に保有するＢＬ２１（ＤＥ３）細胞をｐＥＴ−ＨＴ−ｙｂｈＥプラスミドで形質転換した。単一コロニーからの一晩の培養液を、ＬＢで５０倍に希釈して、ＯＤ600およそ１．０にまで生育させて、組換えプラスミドにおけるｙｂｈＥ ＯＲＦのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ駆動型発現を誘導するためにＩＰＴＧ（１ｍＭ）を添加した。インキュベーションの２時間後に、２０ｍｌから細胞を回収した。細胞抽出物は、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び２ｍＭ ＰＭＳＦを含有する緩衝液中での超音波処理により調製した。続いて、プローブを１６，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離した後、ＨｉＴｒａｐ
Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ＨＰカラム(Amersham Bioscience)を用いて製造業者により推奨されるように、上清からＨｉｓタグ付タンパク質を精製した。
【０１３３】
対数培養におけるＴ７発現系の誘導の２時間後に、Ｈｉｓをタグ付ＹｂｈＥに相当する電気泳動移動度を有するタンパク質（ＭＷ＞＞３７ｋＤａを有するタンパク質）の蓄積が観察された。タンパク質量は、総細胞ポリペプチドの約１５％であった。タンパク質は、主として可溶性相で観察された（図８Ａ参照）。
【０１３４】
得られたＨｉｓ6−ＹｂｈＥタンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを使用して精製した。組換えタンパク質合成のレベルの定量及び精製プロセスの制御は、Laemmli U.K.により記載される方法に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより提供された(Nature, 227, 680-685(1970))。図８Ｂでわかるように、得られたタンパク質の純度は、９０％を上回り、それは、標準的なラクトナーゼ試験（Collard, F. et al, FEBS Letters, 459, 223-226 (1999)、実施例７）において６−ＰＧＬ活性を示した。精製Ｈｉｓ6−ＹｂｈＥタンパク質に対して定量化された特異的な６−ＰＧＬ活性（７８０Ｕ／ｍｌ）は、同様にＨｉｓ6をタグ付けしたヒト６−ＰＧＬの、先に報告された活性（７１０Ｕ／ｍｌ）に非常に近い(Collard, F. et al, FEBS Letters, 459, 223-226 (1999))ことは興味深い。
【０１３５】
したがって、未知の機能を有するエシェリヒア・コリ由来のｙｂｈＥ ＯＲＦは、まさに６−ＰＧＬをコードするｐｇｌ遺伝子であると結論付けることができる。
【０１３６】
実施例１３．ｐｇｌ遺伝子の発現増強のフェニルアラニン生産に対する影響
フェニルアラニン生産性エシェリヒア・コリＡＪ１２７３９株を、ｐｇｌ遺伝子の発現増強のトリプトファン生産に対する影響を評価するための親株として使用した。ＡＪ１２７３９株は、２００１年１１月６日にRussian National Collection of Industrial Microorganisms（ＶＫＰＭ）(Russia, 113545 Moscow, 1st Dorozhny proezd, 1)にアクセッション番号ＶＫＰＭ Ｂ−８１９７で寄託された。
【０１３７】
ＢＷ２５１１３−Ｐtac-3900−ｙｂｈＥ及びＢＷ２５１１３−Ｐtac-10000−ｙｂｈＥ株由来の染色体ＤＮＡフラグメントを、フェニルアラニン生産性エシェリヒア・コリＡＪ１２７３９株へＰ１形質導入により移入して、それぞれＡＪ１２７３９ Ｐtac-3900−ｙｂｈＥ株及びＡＪ１２７３９ Ｐtac-10000株を得た。これらの株はそれぞれ、クロラムフェニコール２５ｍｇ／ｌを含有する栄養ブロス中で３７℃で１８時間培養して、得られた培養液０．３ｍｌを、２０×２００ｍｍの試験管中でクロラムフェニコール２５ｍｇ／ｌを含有する発酵培地３ｍｌへ植菌して、回転振とう機により、３４℃で２４時間培養した。培養後、培地中に蓄積したＬ−フェニルアラニンの量をＴＬＣにより定量した。蛍光指示薬を含有していないＳｏｒｂｆｉｌシリカゲルの０．１１ｍｍ層でコーティングされた１０×１５ｃｍのＴＬＣプレート(Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, Russia)を使用した。Ｓｏｒｂｆｉｌプレートは、移動相：プロパン−２−オール：酢酸エチル：２５％アンモニア水：水＝４０：４０：７：１６（ｖ／ｖ）で展開した。アセトン中のニンヒドリンの溶液（２％）を可視化試薬として使用した。
【０１３８】
発酵培地の組成（ｇ／ｌ）：
グルコース ４０．０
（ＮＨ4）2ＳＯ4 １６．０
Ｋ2ＨＰＯ4 ０．１
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．０
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１
ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．０１
チアミンＨＣｌ ０．０００２
イーストエキストラクト ２．０
チロシン ０．１２５
ＣａＣＯ3 ２０．０
【０１３９】
グルコース及び硫酸マグネシウムは、個々に滅菌される。ＣａＣＯ3は、１８０℃で２時間乾熱滅菌される。ｐＨは、７．０に調節される。抗生物質は、滅菌後に培地へ導入される。結果を表５に示す。
【０１４０】
【表５】
【０１４１】
表５からわかるように、ｐｇｌ遺伝子の発現増強は、ＡＪ１２７３９株のフェニルアラニン生産を向上させた。
【０１４２】
本発明は、それらの好ましい実施形態を参照して詳述してきたが、本発明の範囲を逸脱することなく、様々な変更を行うことができ、また同等物を用いることができることは、当業者に明らかであろう。本明細書中の引用参照文献はすべて、本出願の一部として参照により援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１４３】
本発明によれば、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンなどのＬ−アミノ酸の生産が増強される。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】細菌野生型のｙｂｈＥ ＯＲＦ周辺のＤＮＡ領域の構造を示す図である。
【図２】ｙｂｈＥ ＯＲＦが欠失した細菌ＤＮＡ領域の構造を示す図である。
【図３】ｙｂｈＡ ＯＲＦが欠失した細菌ＤＮＡ領域の構造を示す図である。
【図４】ｙｂｈＤ ＯＲＦが欠失した細菌ＤＮＡ領域の構造を示す図である。
【図５】ｐｇｉ遺伝子が欠失した細菌ＤＮＡ領域の構造を示す図である。
【図６】ｚｗｆ−ｅｄｄ−ｅｄａオペロンが欠失された細菌ＤＮＡ領域の構造を示す図である。
【図７】ｐｇｌ遺伝子（ｙｂｈＥ ＯＲＦ）の上流に人工プロモーター領域（Ｐtac*）を有する細菌ＤＮＡ領域の構造を示す図である。
【図８】（Ｈｉｓ）６−ＹｂｈＥタンパク質のゲル分離及び精製を示す図である（写真）。Ａ．ＢＬ２１（ＤＥ３）［ｐＥＴ−ＨＴｙｂｈＥ］株の粗製抽出物。レーン１、２、９−タンパク質分子量マーカー；レーン３、４−ＩＰＴＧ誘導無し及び有りでの株の総細胞タンパク質；レーン５、６−ＩＰＴＧ誘導無し及び有りでの株の可溶性分画；レーン７、８−ＩＰＴＧ誘導無し及び有りでの株の不溶性分画。Ｂ．レーン１−ＢＬ２１（ＤＥ３）［ｐＥＴ−ＨＴｙｂｈＥ］株の総細胞タンパク質；レーン２、３、４、６−精製された（Ｈｉｓ）６−ＹｂｈＥの濃度を増大させた；レーン５−タンパク質分子量マーカー。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を使用した発酵によりＬ−アミノ酸を生産する方法に関する。具体的には、本発明は、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンのような芳香族アミノ酸を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）は、大部分の生物体の中央代謝の重要な一部である。ＰＰＰの酸化的経路ではＮＡＤＰＨの合成が行われ、ＰＰＰの非酸化的経路のリン酸化炭水化物は、ヌクレオチド生合成のための前駆体（リボース−５−リン酸）、芳香族アミノ酸及びビタミンのための前駆体（エリスロース−５−リン酸）となる。エリスロース−４−リン酸（Ｅ４ｐ）は、芳香族Ｌ−アミノ酸に共通の生合成経路の必須前駆体である。したがって、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）及びＥ４ｐ生合成の特定の経路を最適化することにより芳香族Ｌ−アミノ酸の生産を向上させることができる。
【０００３】
ＰＰＰの酸化的経路は３つの反応を包含する。第１及び第３の反応は、それぞれｚｗｆ遺伝子及びｇｎｄ遺伝子によりコードされる既知の酵素であるグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４９）並びにグルコン酸−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．４４）により触媒される。第２の反応は、６−ホスホノグルコノラクトンの６−ホスホグルコン酸への加水分解である(Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C.,
1996)。この反応を触媒する酵素は、例えばヒト(Collard, F., et al., FEBS Lett., 459:2, 223-6(1999))、トリパノソーマ・ブルセイ(Duffieux, F., et al., J. Biol. Chem.,275:36, 27559-65(2000))、プラスモジウム・ベルグヘイ(Clarke, J.L., et al, Eur. J. Biochem., 268:7, 2013-9 (2001))、シュードモナス・アエロギノサ(Harger P.W. et al., J. Bacteriol., 182:14, 3934-41 (2000))、シュードモナス・プチダ(Petruschka, L., et al., FEMS Microbiol. Lett., 215:1. 89-95 (2002))を含むいくつかの生物体で検出されているが、反応が自発的に進むことも知られている。
【０００４】
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼにより触媒される反応の生成物の１つであるδ−６−ホスホグルコノラクトンは、分子間転位の過程でγ−６−ホスホグルコノラクトンへ異性化することが可能である。δ−６−ホスホグルコノラクトンのみが、自発的に６−ホスホグルコン酸へ加水分解されることが可能であり、正確には該反応は、既知の６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＥＣ ３．１．１．３１）により触媒される(Miclet E. et al., J Biol Chem., 276:37, 34840-46 (2001))。推定上の６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードするエシェリヒア・コリ由来のｐｇｌ遺伝子は、エシェリヒア・コリの染色体上のａｔｔ−λとｃｈｌＤ遺伝子（最新のデータベースではｍｏｄＣ遺伝子）との間にマッピングされた。エシェリヒア・コリ（ｐｇｌ-）の突然変異体は、マルトデキストリンを蓄積する株の顕著な特徴である「マルトースブルー」表現型(Kupor, S.R. and Fraenkel, D.G., J. Bacteriol., 100:3, 1296-1301 (1969))を示す(Adhya S. and Schwartz
M., J Bacteriol, 108:2, 621-626 (1971))。
【０００５】
しかし現時点では、エシェリヒア・コリの染色体上におけるｐｇｌ遺伝子の配列も正確な位置も未知である。エシェリヒア・コリ由来の６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性を有する酵素は単離されておらず、Ｌ−アミノ酸生産細菌の細胞中での６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性の増強をＬ−アミノ酸生産の増大と関連させる報告は存在しない。
【発明の開示】
【０００６】
本発明の目的は、エシェリヒア・コリ由来の６−ホスホグルコノラクトナーゼを提供すること、Ｌ−アミノ酸生産株の生産性を増強すること、及び該株を使用してＬ−アミノ酸を生産する方法を提供することである。
【０００７】
この目的は、エシェリヒア・コリ Ｋ−１２株のｙｂｈＥオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードし、またｙｂｈＥ ＯＲＦ（ｐｇｌ遺伝子）の発現の増強が、各々のＬ−アミノ酸生産株によるＬ−アミノ酸生産を増強することができるという事実を明らかにすることにより達成された。このようにして、本発明は完成された。
【０００８】
本発明の目的は、６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性が増強するように改変されたＬ−アミノ酸生産細菌を提供することである。
【０００９】
本発明のさらなる目的は、腸内細菌科に属し、エシェリヒア属、エルビニア属、プロビデンシア属及びセラチア属から成る群から選択される上記細菌を提供することである。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、遺伝子の発現が増強されるように、細菌の染色体上の６−ホスホグルコノラクトナーゼ遺伝子の発現制御配列を改変させることにより、６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性が増強された、上記細菌を提供することである。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、上記遺伝子の野生型のプロモーターがより強力なプロモーターで置換された、上記細菌を提供することである。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、６−ホスホグルコノラクトナーゼ遺伝子がエシェリヒア属細菌に由来する、上記細菌を提供することである。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、６−ホスホグルコノラクトナーゼ遺伝子が、
（ａ）配列番号１におけるヌクレオチド１〜９９３の塩基配列を含むＤＮＡ、及び
（ｂ）配列番号１におけるヌクレオチド１〜９９３の塩基配列又は、該塩基配列から調製することができるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、且つ６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
から成る群から選択される上記細菌を提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、ストリンジェントな条件が１×ＳＳＣに相当する塩濃度及び０．１％ＳＤＳで６０℃で１５分間洗浄することを含む、上記細菌を提供することである。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、ｙｂｈＥオープンリーディングフレームの発現が増強するように更に改変された上記細菌を提供することである。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンから成る群から選択される芳香族Ｌ−アミノ酸である上記細菌を提供することである。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、培地中で上記細菌を培養すること、及び培地から上記Ｌ−アミノ酸を回収することを含む芳香族Ｌ−アミノ酸を生産する方法を提供することである。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンから成る群から選択される芳香族アミノ酸である上記方法を提供することである。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、上記細菌の芳香族アミノ酸生合成に関する遺伝子の発現が増強された上述の方法を提供することである。
【００２０】
Ｌ−アミノ酸を生産する方法は、本発明のタンパク質の活性が増強されたＬ−トリプトファン生産細菌を使用したＬ−トリプトファンの生産を包含する。Ｌ−アミノ酸を生産する方法はまた、本発明のタンパク質の活性が増強されたＬ−フェニルアラニン生産細菌を使用したＬ−フェニルアラニンの生産を包含する。Ｌ−アミノ酸を生産する方法は更に、本発明のタンパク質の活性が増強されたＬ−チロシン生産細菌を使用したＬ−チロシンの生産を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性を増強するように改変されたＬ−アミノ酸生産細菌について記載されている。「６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性」という用語は、６−ホスホグルコノラクトンの６−ホスホグルコン酸への加水分解反応を触媒する活性を意味する。６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性は、例えばKupor, S.R.及びFraenkel, D.G. (J. Bacteriol., 100:3, 1296-1301 (1969))に記載される方法により測定される。６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする遺伝子は、エシェリヒア・コリのｙｂｈＥ遺伝子又はその相同体である。
【００２２】
エシェリヒア・コリの６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＥＣ番号３．１．１．３１）をコードする遺伝子として、ｙｂｈＥ ＯＲＦを含むｐｇｌ遺伝子が公表されている（GenBankアクセッション番号ＮＣ＿０００９１３．１，ｇｉ：１６１２８７３５の配列中のヌクレオチド番号７９７８０９〜７９８８０４）。ｙｂｈＥ ＯＲＦは、エシェリヒア・コリ Ｋ−１２株の染色体上でｙｂｈＡ ＯＲＦとｙｂｈＤ ＯＲＦとの間に位置する。したがって、ｐｇｌ遺伝子は、上記遺伝子の塩基配列に基づいて調製されたプライマーを利用したＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応；White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)を参照）により得ることができる。
【００２３】
エシェリヒア・コリ由来のｐｇｌ遺伝子は、以下のＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）：
（ａ）配列番号１におけるヌクレオチド１〜９９３の塩基配列を含むＤＮＡ、又は
（ｂ）配列番号１におけるヌクレオチド１〜９９３の塩基配列又は、該塩基配列から調製することができるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、且つ６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
により例示される。
【００２４】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡとしては、タンパク質の活性を損失しない範囲で、タンパク質（Ａ）の１つ又はそれ以上の位置における１又は数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入或いは付加を含むタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。「数個の」アミノ酸の数は、タンパク質の三次元構造におけるアミノ酸残基の位置、又はアミノ酸残基のタイプに応じて異なるが、タンパク質（Ａ）に関して２〜３０個、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個であり得る。
【００２５】
上記の１又は数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入或いは付加を有する本発明のタンパク質は、配列番号２のタンパク質に対して少なくとも７０％相同である。タンパク質の相同性の割合は、配列全長にわたって、変異配列を配列番号２の配列と比較すること、及び等しい残基の数を割り出すことにより決定される。本発明のタンパク質は、配列番号２のタンパク質に対して少なくとも７０％相同であり、より好ましくは少なくとも８０％相同、更に好ましくは少なくとも９０％相同、最も好ましくは配列番号２のタンパク質に対して少なくとも９５％相同である。タンパク質又はＤＮＡの相同性の割合はまた、ＢＬＡＳＴ
検索及びＣｒｕｓｔａｌＷのような既知の算出方法により評価することができる。ＢＬＡＳＴ(Basic Local Alignment Search Tool)は、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｍｅｇａｂｌａｓｔ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘといったプログラムにより使用される発見的検索アルゴリズムであり、これらのプログラムは、Karlin、Samuel及びStephen F. Altschulの統計学的方法を使用して、それらの所見に有意性を帰する（「一般的なスコアリングスキームを使用することにより分子配列の特徴の統計学的有意性を評価する方法」Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-68; 「分子配列における多数の高スコアリングセグメントに関する用途及び統計学」Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90: 5873-7）。ＦＡＳＴＡ検索法は、W.R. Pearsonにより記載されている（「ＦＡＳＴＰ及びＦＡＳＴＡによる迅速且つ高感度配列比較」Methods in Enzymology, 1990 183:63-98）。ＣｌｕｓｔａｌＷ法は、Thompson J.D., Higgins D.G.及びGibson T.J.により記載されている（「ＣＬＵＳＴＡＬＷ：配列重み付け、位置特異的ギャップペナルティ及び重み行列選択による進行性多数配列アラインメントの感度の改善」Nucleic Acids Res. 1994, 22: 4673-4680）。
【００２６】
上記のような（Ａ）で定義されるタンパク質へ導入される変化は通常、タンパク質の活性を維持するような保存的変化である。置換変化としては、アミノ酸配列中の少なくとも１つの残基が取り除かれ、且つ異なる残基がその場所に挿入されたものが挙げられる。上記タンパク質において元のアミノ酸を代替することができ、且つ保存的置換とみなされるアミノ酸の例としては、ａｌａのｓｅｒ又はｔｈｒへの置換；ａｒｇのｇｌｎ、ｈｉｓ又はｌｙｓへの置換；ａｓｎのｇｌｕ、ｇｌｎ、ｌｙｓ、ｈｉｓ、ａｓｐへの置換；ａｓｐのａｓｎ、ｇｌｕ又はｇｌｎへの置換；ｃｙｓのｓｅｒ又はａｌａへの置換；ｇｌｎのａｓｎ、ｇｌｕ、ｌｙｓ、ｈｉｓ、ａｓｐ又はａｒｇへの置換；ｇｌｕのａｓｎ、ｇｌｎ、ｌｙｓ又はａｓｐへの置換；ｇｌｙのｐｒｏへの置換；ｈｉｓのａｓｎ、ｌｙｓ、ｇｌｎ、ａｒｇ、ｔｙｒへの置換；ｉｌｅのｌｅｕ、ｍｅｔ、ｖａｌ、ｐｈｅへの置換；ｌｅｕのｉｌｅ、ｍｅｔ、ｖａｌ、ｐｈｅへの置換；ｌｙｓのａｓｎ、ｇｌｕ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ａｒｇへの置換；ｍｅｔのｉｌｅ、ｌｅｕ、ｖａｌ、ｐｈｅへの置換；ｐｈｅのｔｒｐ、ｔｙｒ、ｍｅｔ、ｉｌｅ又はｌｅｕへの置換；ｓｅｒのｔｈｒ、ａｌａへの置換；ｔｈｒのｓｅｒ又はａｌａへの置換；ｔｒｐのｐｈｅ、ｔｙｒへの置換；ｔｙｒのｈｉｓ、ｐｈｅ又はｔｒｐへの置換；及びｖａｌのｍｅｔ、ｉｌｅ、ｌｅｕへの置換が挙げられる。
【００２７】
（Ａ）で定義されるタンパク質と実質的に同じタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が、欠失、置換、挿入又は付加されるように、部位特異的突然変異誘発を用いて（Ａ）で定義されるタンパク質をコードする塩基配列を改変することにより得られる。このような改変されるＤＮＡは、突然変異を発生させる試薬及び条件で処理を行う従来の方法により得ることができる。このような処理としては、ヒドロキシルアミンによる本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの処理、或いはＵＶ照射又はＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン若しくは亜硝酸のような試薬によるＤＮＡを含有する細菌の処理が挙げられる。
【００２８】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡには、異なる株で見出すことができる変異体、及び自然多様性に従うエシェリヒア属細菌の変異体も含まれる。このような変異体をコードするＤＮＡは、ストリンジェントな条件下でｐｇｌ遺伝子又はその遺伝子の一部とハイブリダイズし、且つ６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することにより得ることができる。本明細書中で言及される「ストリンジェントな条件」は、いわゆる特異的ハイブリッドが形成され、且つ非特異的ハイブリッドが形成されない条件である。例えば、ストリンジェントな条件としては、高い相同性を有するＤＮＡ、例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡが互いにハイブリダイズする条件が挙げられる。あるいは、ストリンジェントな条件は、サザンハイブリダイゼーションにお
ける慣例の洗浄条件、例えば、およそ１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ及び６０℃を含む条件により例示される。洗浄の持続期間は、ブロッティングに使用される膜のタイプに依存し、一般的には製造業者により推奨される。例えば、ストリンジェントな条件下でのＨｙｂｏｎｄTMＮ＋ナイロン膜(Amersham)の洗浄の推奨持続期間は１５分である。好ましくは、洗浄は２〜３回実施される。
【００２９】
変異体をコードし、且つｐｇｌ遺伝子とハイブリダイズするＤＮＡに対するプローブとして、配列番号１の塩基配列の部分配列もまた使用することができる。このようなプローブは、プライマーとして配列番号１の塩基配列に基づくオリゴヌクレオチド、及び鋳型として配列番号１の塩基配列を含有するＤＮＡフラグメントを使用するＰＣＲにより調製できる。約３００ｂｐの長さを有するＤＮＡフラグメントをプローブとして使用する場合、ハイブリダイゼーションのための洗浄条件は、例えば５０℃、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳから成る。
【００３０】
タンパク質をコードするＤＮＡによる細菌の形質転換は、例えば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を増強し、及び細菌細胞においてそのタンパク質の活性を増強するための従来の方法による、ＤＮＡの細菌細胞への導入を意味する。
【００３１】
本発明の細菌は、目的Ｌ−アミノ酸の生産性を増強するタンパク質の活性が増強された腸内細菌科に属するＬ−アミノ酸生産細菌である。好ましくは、本発明の細菌は、本発明のタンパク質の活性が増強された、具体的にはエシェリヒア属に属する芳香族Ｌ−アミノ酸生産細菌である。より好ましくは、本発明の細菌は、具体的には６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性が増強するように改変されたエシェリヒア属に属する芳香族Ｌ−アミノ酸生産細菌、例えばＬ−トリプトファン生産細菌である。より好ましくは、本発明の細菌は、細菌の染色体上で改変された発現制御配列を有するｐｇｌ遺伝子（ｙｂｈＥ ＯＲＦ）から成るＤＮＡを保有し、且つＬ−トリプトファンの生産能力が増強されている。
【００３２】
「Ｌ−アミノ酸生産細菌」とは、本発明の細菌を培地で培養する時、培地中にＬ−アミノ酸の蓄積を引き起こすことができる細菌を意味する。Ｌ−アミノ酸生産能は、育種によって付与され、又は増強される。本明細書中で使われる「Ｌ−アミノ酸生産細菌」という用語は培養培地で野生型株や親株よりも大量にＬ−アミノ酸を蓄積させ、生産することの出来る細菌を意味し、好ましくは微生物が培地で０．５ｇ／Ｌ以上、更に好ましくは１．０以上の目的Ｌ−アミノ酸を蓄積させ、生産することが出来ることを意味する。Ｌ−アミノ酸には、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリンが含まれ、好ましくはＬ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン等の芳香族Ｌ−アミノ酸が含まれる。
【００３３】
腸内細菌科細菌としては、エシェリヒア属、エンテロバクター属、エルビニア属、クレブシエラ属、パントエア属、プロビデンシア属、サルモネラ属、セラチア属、赤痢菌属及びモルガネラ属細菌が挙げられる。エンテロバクター属、エルビニア属、エシェリヒア属、クレブシエラ属、プロビデンシア属、サルモネラ属、セラチア属、赤痢菌属等。具体的には、ＮＣＢＩ(National Center for Biotechnology Information)データベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/hybinpost/Taxonomy/wget.org?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock)で使用される分類学に従って腸内細菌科に類別されるものを使用することができる。この中ではエシェリヒア属細菌が好ましい。
【００３４】
「エシェリヒア属細菌」という語句は、細菌が、微生物学の当業者に既知の分類に従っ
てエシェリヒア属として類別されることを意味する。本発明で使用されるエシェリヒア属微生物の例としては、エシェリヒア・コリが挙げられるが、これに限定されない。
【００３５】
本発明で使用することができるエシェリヒア属細菌は、特に限定されないが、例えばNeidhardt, F.C.等により記載される細菌(Escherichia coli and Salmonella typhimurium,
American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Table 1)が本発明に包含される。エシェリヒア・コリの野生型株の例としては、Ｋ−１２株及びその誘導体、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ第４７０７６）及びＷ３１１０株（ＡＴＣＣ第２７３２５）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの株は、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ、住所：12301 Parklawn Drive, Rckville Maryland 20852, United States of America）から入手可能である。
【００３６】
「パントエア属細菌」という用語は、細菌が、微生物学の当業者に既知の分類に従ってパントエア属として類別されることを意味する。エンテロバクター・アグロメランスの数種は最近、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列分析等に基づいて、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、パントエア・ステワルティ等に再類別されている。
【００３７】
「６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性が増強するように改変される」という語句は、１細胞当たりの活性が、非改変株、例えば、野生型株の活性よりも高くなっていることを意味する。６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性は、Collardの方法(FEBS Letters 459 (1999) 223-226)を使用することにより測定することができる。例としては、１細胞当たりの６−ホスホグルコノラクトナーゼ分子の数が増大すること、６−ホスホグルコノラクトナーゼ１分子当たりの比活性が増大すること、などである。更に、比較用の対象として用いられる野生型株として、例えばエシェリヒア・コリ Ｋ−１２が包含される。６−ホスホグルコノラクトナーゼの細胞内活性が増強された結果として、培地中に蓄積するＬ−トリプトファンなどのＬ−アミノ酸の量が増大する。
【００３８】
細菌細胞における６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性の増強は、６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする遺伝子（ｐｇｌ遺伝子）の発現を増大させることにより達成される。６−ホスホグルコノラクトナーゼ遺伝子として、腸内細菌科細菌に由来する遺伝子が包含される。ｐｇｌ遺伝子の発現は、例えば、遺伝子組換え技法を使用して、細胞中のｐｇｌ遺伝子のコピー数を増大させることにより増強することができる。例えば、組換えＤＮＡは、ｐｇｌ遺伝子を含有する遺伝子フラグメントを、宿主微生物の細胞で操作可能であるベクター、好ましくは多コピーベクターに連結させること、及び得られたベクターを宿主微生物の細胞へ導入することにより調製することができる。
【００３９】
エシェリヒア・コリのｐｇｌ遺伝子が使用される場合、ｐｇｌ遺伝子（ｙｂｈＥ）は、配列番号１の塩基配列に基づいて設計されるプライマーを使用し、鋳型としてエシェリヒア・コリの染色体ＤＮＡを使用するＰＣＲ法（ポリメラーゼ連鎖反応、White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)を参照）により得られる。他の微生物由来のｐｇｌ遺伝子もまた使用でき、それらのｐｇｌ遺伝子の配列若しくはｐｇｌ遺伝子のその相同配列又は種の異なる微生物由来の６−ホスホグルコノラクトナーゼタンパク質に基づいて設計されるオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲにより、或いはこのような配列情報に基づいて調製されるオリゴヌクレオチドプローブを使用したハイブリダイゼーションにより、それらの染色体ＤＮＡ又は染色体ＤＮＡライブラリーから得ることができる。染色体ＤＮＡは、例えばSaito及びMiuraの方法により、ＤＮＡドナーとして用いられる微生物から調製することができる（H. Saito and K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), 「生物工学実験書」、日本実験工学会編、培風館、pp. 97-98、1992を参照）。
【００４０】
続いて、ｐｇｌ遺伝子を、宿主微生物の細胞において操作可能なベクターＤＮＡへ連結されて、組換えＤＮＡが調製される。好ましくは、宿主微生物の細胞において自己複製可能なベクターが使用される。
【００４１】
エシェリヒア・コリにおいて自己複製可能なベクターの例としては、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ｐＡＣＹＣ１８４（ｐＨＳＧ及びｐＡＣＹＣは、Takara Bioから入手可能）、ＲＳＦ１０１０、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ２１９（ｐＭＷは、Nippon Geneから入手可能）等が挙げられる。
【００４２】
ｐｇｌ遺伝子及び上述のベクターのいずれかを連結して組換えＤＮＡを調製するために、ベクター、及びｐｇｌ遺伝子を含有するフラグメントを制限酵素で消化して、通常Ｔ４
ＤＮＡリガーゼなどのリガーゼを使用することにより連結させる。
【００４３】
上記のように調製された組換えＤＮＡを微生物へ導入するために、これまでに報告されている任意の既知の形質転換方法を使用することができる。例えば、エシェリヒア・コリに関して報告されている、ＤＮＡの透過性を増大するようにレシピエント細胞を塩化カルシウムで処理する方法(Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970))、及びバチルスにおいて報告されている、ＤＮＡを導入するために増殖細胞から作製されたコンピテント細胞を使用する方法(Duncan, C.H., Wilson, G.A. and Young, F.E., Gene, 1, 153 (1977))を使用することができる。これらの方法のほかに、バチルス・ズブチリス、放線菌及び酵母に適用可能であると報告されている、組換えＤＮＡをプロトプラスト又はスフェロプラスト様レシピエント細胞へ導入する方法(Chang, S. and Choen, S.N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M.J., Ward, J.M. and Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J.B. and Fink, G.R., Proc. Natl. Sci., USA, 75, 1929 (1978))を使用することができる。
【００４４】
ｐｇｌ遺伝子のコピー数はまた、微生物の染色体ＤＮＡ上にｐｇｌ遺伝子を多コピー組み込むことによって増大させることができる。微生物の染色体ＤＮＡ上にｐｇｌ遺伝子を多コピー組み込むために、相同組換えは、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的とすることにより実施することができる。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、トランスポゾンの末端に存在する反復ＤＮＡ及びインバーテッドリピートを使用することができる。あるいは、特開平２−１０９９８５Ａ号に開示されるように、ｐｇｌ遺伝子をトランスポゾンへ組み込み、遺伝子の多コピーが染色体ＤＮＡへ組み込まれるようにそれを転移させることも可能である。染色体へのｐｇｌ遺伝子の組込みは、ｐｇｌ遺伝子の部分配列を有するプローブを使用するサザンハイブリダイゼーションにより確認することができる。
【００４５】
本発明の細菌は、本発明のタンパク質の活性が、細菌の染色体上での（Ａ）又は（Ｂ）で定義されるようなタンパク質をコードするＤＮＡの発現制御配列の改変により増強されるものを包含する（ＷＯ００／１８９３５号）。遺伝子発現の増強は、本発明のＤＮＡを、野生型のプロモーターの代わりにより強力なプロモーターの制御下に置くことにより達成することができる。例えば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＰＲプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。「野生型のプロモーター」という用語は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流に位置し、且つ遺伝子の転写を促進する機能を有する野生型生物体中に存在するＤＮＡ領域を意味する。プロモーターの強度は、ＲＮＡ合成開始の反応の頻度により定義される。プロモーターの強度を評価する方法は、例えば、Deuschle U., Kammerer W., Gentz R., Bujard H.により記載されている（エシェリヒア・コリにおけるプロモーター：ｉｎ ｖｉｖｏ強度の階層は、代替構造を示す EMBO J., 5, 2987-2994 (1986)）。プロモーターの作用強度を評価する方法及び強力なプロモーターの例は、Goldstein
等 (バイオテクノロジーにおける原核生物プロモーター Biotechnol. Annu. Rev., 1995,
1, 105-128）に開示されている。
【００４６】
翻訳の増強は、本発明のＤＮＡへ、より効率的なリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を野生型のＲＢＳ配列の代わりに導入することにより達成できる。ＲＢＳ配列は、リボソームの１６Ｓ ＲＮＡと相互作用するｍＲＮＡの開始コドンの上流にある領域である(Shine J. and Dalgarno L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1974, 71, 4, 1342-6)。「野生型のＲＢＳ配列」という用語は、野生型生物体に存在するＲＢＳ配列を意味する。ファージＴ７由来の遺伝子１０のＲＢＳ配列は、効率的なＲＢＳ配列として例示することができる(Olins P.O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235)。
【００４７】
本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を本来的に有する細菌への上述のＤＮＡの導入により得ることができる。あるいは、本発明の細菌は、上述のＤＮＡをすでに保有する細菌に、Ｌ−アミノ酸生産能を付与することにより得ることができる。
【００４８】
本発明のタンパク質の活性が増強されるべき親株としては、エシェリヒア属に属するＬ−トリプトファン生産細菌である突然変異ｔｒｐＳ遺伝子によりコードされるトリプトファニル−ｔＲＮＡシンテターゼが欠損したエシェリヒア・コリＪＰ４７３５／ｐＭＵ３０２８（ＤＳＭ１０１２２）株及びＪＰ６０１５／ｐＭＵ９１（ＤＳＭ１０１２３）株（米国特許第５，７５６，３４５号）、セリンによるフィードバック阻害のないｓｅｒＡ対立遺伝子を有するエシェリヒア・コリＳＶ１６４（ｐＧＨ５）株（米国特許第６，１８０，３７３号）、酵素トリプトファナーゼが欠損したエシェリヒア・コリＡＧＸ１７（ｐＧＸ４４）（ＮＲＲＬ Ｂ−１２２６３）株及びＡＧＸ６（ｐＧＸ５０）ａｒｏＰ（ＮＲＲＬ
Ｂ−１２２６４）株（米国特許第４，３７１，６１４号）、ホスホエノールピルビン酸生産能が増強されたエシェリヒア・コリＡＧＸ１７／ｐＧＸ５０株，ｐＡＣＫＧ４−ｐｐｓ株（ＷＯ９７／０８３３３号、米国特許第６，３１９，６９６号）等が使用される。任意のＬ−アミノ酸の生合成経路に関与しない膜タンパク質をコードしているｙｄｄＧ遺伝子は、該遺伝子の野生型対立遺伝子が微生物中の多コピーベクター上で増幅される場合に、Ｌ−フェニルアラニン及びいくつかのアミノ酸類縁体に対する耐性を微生物に付与することを本発明者は過去に明らかにした。更に、ｙｄｄＧ遺伝子は、さらなるコピーが各々の生産株の細胞へ導入される場合に、Ｌ−フェニルアラニン又はＬ−トリプトファンの生産を増強できる（ロシア共和国特許出願第２００２１２１６７０号、ＷＯ０３／０４４１９２号）。したがって、Ｌ−トリプトファン生産細菌は、ｙｄｄＧオープンリーティングフレームの発現を増強するように更に改変されることが望ましい。
【００４９】
Ｌ−トリプトファン生合成に効果的に働く遺伝子として、ｔｒｐＥＤＣＢＡオペロン遺伝子及びａｒｏＦ遺伝子、ａｒｏＧ遺伝子、ａｒｏＨ遺伝子、ａｒｏＢ遺伝子、ａｒｏＤ遺伝子、ａｒｏＥ遺伝子、ａｒｏＫ遺伝子、ａｒｏＬ遺伝子、ａｒｏＡ遺伝子、ａｒｏＣ遺伝子等の芳香族酸共通の合成過程における遺伝子及びｓｅｒＡ遺伝子、ｓｅｒＢ遺伝子、ｓｅｒＣ遺伝子等のＬ−セリン生合成遺伝子等が含まれる。
【００５０】
本発明におけるタンパク質活性が増強されるべきは親株として、エシェリヒア属に属するフェニルアラニン生産細菌、例えばエシェリヒア・コリＡＪ１２７３９（ｔｙｒＡ：：Ｔｎ１０、ｔｙｒＲ）株、ｐｈｅＡ３４遺伝子を保有するＨＷ１０８９株（ＡＴＣＣ アクセッション番号５５３７１）（ＵＳ５，３５４，６７２）、ＭＷＥＣ１０１−ｂ変異株（ＫＲ８９０３６８１）、ＮＲＲＬ Ｂ−１２１４１株、ＮＲＲＬ Ｂ−１２１４５株、ＮＲＲＬ Ｂ−１２１４６株、ＮＲＲＬ Ｂ−１２１４７株（ＵＳ４，４０７，９５２）等が利用される。エシェリヒア属に属するフェニルアラニン生産細菌は更に、ＡＪ１２６０４と名付けられたエシェリヒア・コリ Ｋ−１２［Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＰＨＡＢ］株、エシェリヒア・コリ Ｋ−１２［Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＰＨＡＤ］株、エ
シェリヒア・コリ Ｋ−１２［Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＰＨＡＴｅｒｍ］株、エシェリヒア・コリ Ｋ−１２［Ｗ３１１０（ｔｙｒＡ）／ｐＢＲ−ａｒｏＧ４、ｐＡＣＭＡＢ］株等を含む（欧州特許ＥＰ４８８４２４Ｂ１）。
【００５１】
本発明のタンパク質の活性が増強されるべき親株としては、エシェリヒア属に属するＬ−チロシン生産細菌であるホスホエノールピルビン酸生産能を有し又は一般的な芳香族経路の酵素が増強されるエシェリヒア・コリ株等もまた使用される（ＥＰ０８７７０９０Ａ号）。
【００５２】
本発明の方法は、培地中で本発明の細菌を培養してＬ−アミノ酸を該培地中で生産及び蓄積させる工程、並びに該培地からＬ−アミノ酸を回収する工程を含む、Ｌ−アミノ酸の生産方法を包含する。また、本発明の方法は、培地中で本発明の細菌を培養してＬ−トリプトファンを該培地中で生産及び蓄積させる工程、並びに該培地からＬ−トリプトファンを回収する工程を含む、Ｌ−トリプトファンの生産方法を包含する。本発明の方法は、培地中で本発明の細菌を培養してＬ−フェニルアラニンを該培地中で生産及び蓄積させる工程、並びに該培地からＬ−フェニルアラニンを回収する工程を含む、Ｌ−フェニルアラニンの生産方法を包含する。本発明の方法は更に、培地中で本発明の細菌を培養してＬ−チロシンを該培地中で生産及び蓄積させる工程、並びに該培地からＬ−チロシンを回収する工程を含む、Ｌ−チロシンの生産方法を包含する。
【００５３】
本発明では、培養、Ｌ−アミノ酸、好ましくはＬ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンなどの芳香族アミノ酸の培地からの回収及び精製等は、アミノ酸が微生物を使用して生産される従来の発酵方法に類似した様式で実施される。
【００５４】
培養に使用される培地は、培地が炭素源及び窒素源及びミネラル、並びに必要であれば微生物が生育に要する適切な量の栄養分を包含する限り、合成培地であってもよく、或いは天然培地であってもよい。
【００５５】
炭素源としては、グルコース及びシュークロースのような様々な炭水化物、並びに様々な有機酸が挙げられる。選択した微生物の同化の様式に応じて、エタノール及びグリセロールを含むアルコールを使用してもよい。
【００５６】
窒素供給源としては、アンモニア及び硫酸アンモニウムのような様々なアンモニウム塩、アミンのような他の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解産物及び発酵性微生物の消化物のような天然窒素源が使用される。
【００５７】
ミネラルとしては、一リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウム等が使用される。
【００５８】
さらなる栄養分は、必要であれば培地へ添加することができる。例えば、微生物が生育にチロシンを要する場合（チロシン栄養要求性）、十分量のチロシンを培養用の培地へ添加することができる。
【００５９】
培養は、好ましくは振とう培養のような好気性条件下及び通気を伴う攪拌培養で、２０〜４２℃、好ましくは３７〜４０℃の温度で実施される。培養のｐＨは、通常５〜９、好ましくは６．５〜７．２である。培養のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウム、各種酸、各種塩基及び緩衝液で調節することができる。通常、１〜５日の培養により、液体培地中に目的Ｌ−アミノ酸が蓄積する。
【００６０】
培養後、細胞などの固形分は、遠心分離又は膜濾過により液体培地から除去することが
でき、続いて、目的Ｌ−アミノ酸は、イオン交換、濃縮及び結晶化方法により回収及び精製することができる。
【実施例】
【００６１】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照し、以下、より具体的に説明される。
【００６２】
実施例１：エシェリヒア・コリ由来のｐｇｌ遺伝子の同定及び塩基配列比較
Kupor及びFraenkelは、エシェリヒア・コリの染色体上のｃｈｌＤ（現在ｍｏｄＣとして知られている）とｂｉｏＡ遺伝子との間にｐｇｌ突然変異をマッピングした(Kupor, S.R. and Fraenkel, D.G., J. Bacteriol., 100:3, 1296-1301 (1969))。これは、エシェリヒア・コリ遺伝子地図の１７．１８分及び１７．４０分に相当する。この領域では、未知の機能を有するタンパク質をコードする８個のオープンリーディングフレームが存在する。更に、エシェリヒア・コリ ストックセンターデータベースは、１７．２０分と１７．２２分との間にｐｇｌ突然変異を位置付ける。これらの座標は、ｙｂｈＡ ＯＲＦとｙｂｈＤ ＯＲＦとの間に位置するｙｂｈＥオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の座標にほぼ正確に適合する（図１）。
【００６３】
ｙｂｈＥによりコードされるＹｂｈＥタンパク質を用いて実施されるＢＬＡＳＴ検索は、シゲラ・フレキシネリ（９８．８％相同性）、サルモネラ・チフィ（９２．８％相同性）、エスシニア・ペスティス（６８．４％相同性）などの種々の生物体において未知の機能を有する多くの相同体、バチルス・アンスラシス由来のチトクロムＤ１ヘムドメイン、自動コンピュータ分析により予測されるシュードモナス・フルオレッセンス由来の３−カルボキシムコネートシクラーゼ（２８％相同性）、トリコスポロン・ベイゲリ由来のムコネートシクロイソメラーゼ（２６％相同性）などの既知の機能を有するいくつかの相同体、及びアクセッション番号ＮＰ＿８３３１０７号でデータバンクにおいて６−ホスホグルコノラクトナーゼとして言及されるが、公表済の実験例に参照がないバチルス・セレウス由来のものが存在することを示した。
【００６４】
また、３つの重なった保存タンパク質ドメインが、NCBI Conserved Domain Searchを使用して見出された。それらのうちの２つは、特徴付けられていない機能を有する保存タンパク質ファミリーに属し、１つは、３−カルボキシムコネートシクラーゼファミリーに属する。
【００６５】
エシェリヒア・コリプロテオームのＢＬＡＳＴ検索は、例えばシュードモナス・プチダ由来の上述の６−ホスホグルコノラクトナーゼの相同体を明らかにしなかった。
【００６６】
エシェリヒア・コリ染色体においてｙｂｈＥとされるＯＲＦが、６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードするｐｇｌ遺伝子であるかどうかを同定するために、ｙｂｈＡ、ｙｂｈＥ及びｙｂｈＤ ＯＲＦの破壊を実施して、得られた突然変異体を「マルトースブルー」表現型に関して確認した（以下を参照）。
【００６７】
実施例２．ｙｂｈＥ ＯＲＦの破壊。クロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣｍR）を保有するＤＮＡフラグメントによるｙｂｈＥ ＯＲＦの置換。
ｙｂｈＥ ＯＲＦを破壊するために、ｃａｔ遺伝子によりコードされるクロラムフェニコール耐性マーカー（ＣｍR）を保有するＤＮＡフラグメントを、「Ｒｅｄ媒介性組込み」及び／又は「Ｒｅｄ駆動型組込み」とも呼ばれるDatsenko K.A.及びWanner B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645)により記載される方法を用いて、野生型のｙｂｈＥ ＯＲＦの代わりにエシェリヒア・コリＢＷ２５１１３［ｐＫＤ４６］株の染色体へ置換した。ｙｂｈＥ ＯＲＦの野生型の領域が置換された塩基配列及び該ＯＲＦによりコードされるアミノ酸配列を配列表に示す（それぞれ、配列番号１及び２）。組換え
プラスミドｐＫＤ４６を含有するエシェリヒア・コリＢＷ２５１１３株は、E. Coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, USAから入手することができ、そのアクセッション番号は、ＣＧＳＣ７６３０である。
【００６８】
ＣｍRマーカーを含有するＤＮＡフラグメントは、市販のプラスミドｐＡＣＹＣ１８４（GenBank/EMBL アクセッション番号Ｘ０６４０３、Fermentas, Lithuania）鋳型として、プライマーＰ１（配列番号３）及びＰ２（配列番号４）を使用するＰＣＲにより得られた。プライマーＰ１は、ｙｂｈＥ ＯＲＦの５’末端に相同的な３６個のヌクレオチドを含有し、プライマーＰ２は、ｙｂｈＥ ＯＲＦの３’末端に相同的な３６個のヌクレオチドを含有する。ｙｂｈＥ遺伝子のこれらの配列は、細菌染色体へのさらなる組込みのためにプライマーＰ１及びＰ２に導入された。
【００６９】
ＰＣＲは、「ＴｅｒｍｏＨｙｂａｉｄ ＰＣＲ Ｅｘｐｒｅｓｓ」増幅器を使用して行った。反応混合物（総容量５０μｌ）は、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2を有する１０×ＰＣＲ緩衝液（Fermentas, Lithuania）５μｌ、ｄＮＴＰそれぞれ２００μＭ、使用するプライマーそれぞれ２５ｐｍｏｌ及びＴａｑ−ポリメラーゼ１Ｕ（Fermentas, Lithuania」）から構成された。プラスミドＤＮＡおよそ５ｎｇを、ＰＣＲ増幅用の鋳型ＤＮＡとして反応混合物中に添加した。温度プロフィールは、以下の通りであった：９５℃で５分間の初期ＤＮＡ変性、続く９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長を２５サイクル、及び７２℃で７分間の最終的な伸長。
【００７０】
続いて、増幅されたＤＮＡフラグメントは、アガロースゲル電気泳動により精製して、「ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｕｎｓ」（「Sigma」、ＵＳＡ）を使用して抽出して、エタノールにより沈殿させた。構築されたＤＮＡフラグメントの塩基配列を配列番号５に提示する。
【００７１】
上述のように精製し得られたＤＮＡフラグメントは、エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３［ｐＫＤ４６］株の細菌染色体へのエレクトロポレーション及びＲｅｄ媒介性組込みに使用した。熱感受性レプリコンを有する組換えプラスミドｐＫＤ４６(Datsenka, K.A., Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 6640-6645)は、Ｒｅｄ媒介性組換え系で機能関与するλファージ由来遺伝子をドナーとして使用した。
【００７２】
ＢＷ２５１１３［ｐＫＤ４６］細胞は、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した液体ＬＢ培地中において３０℃で一晩生育させた後、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びＬ−アラビノース（１０ｍＭ）（アラビノースは、Ｒｅｄ系の遺伝子をコードするプラスミドを誘導するのに使用される）を添加したＳＯＢ培地（イーストエキストラクト、５ｇ／ｌ；ＮａＣｌ、０．５ｇ／ｌ；トリプトン、２０ｇ／ｌ；ＫＣｌ、２．５ｍＭ；ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ）で１：１００に希釈して、細菌培養物の光学密度がＯＤ600＝０．４〜０．７に到達するように３０℃で生育させた。細菌培養物１０ｍｌからの生育細胞を氷冷脱イオン水で３回洗浄して、続いて水１００μｌ中に懸濁させた。脱イオン水中に溶解させたＤＮＡフラグメント（１００ｎｇ）１０μｌを細胞懸濁液へ添加した。エレクトロポレーションは、「Bio-Rad」エレクトロポレータ（ＵＳＡ）（Ｎｏ．１６５−２０９８、バージョン２−８９）により、製造業者の指示書に従って実施された。電気を通した細胞を、ＳＯＣ培地(Sambrook et al, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))１ｍｌへ添加して、３７℃で２時間インキュベートし、続いてクロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを含有するＬ−寒天培地上へ広げた。２４時間以内に生育したコロニーを、プライマーＰ３（配列番号６）及びＰ４（配列番号７）を使用するＰＣＲにより、野生型のｙｂｈＥ ＯＲＦに代わるＣｍRマーカーの存在を試験した。この目的で、単離したコロニーを水２０μｌ中に懸濁させた後、得られた懸濁液１μｌをＰＣＲに使用した。温度プロフィールは、以下の通りであ
った：９５℃で１０分間の初期ＤＮＡ変性、続く９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長を３０サイクル、及び７２℃で７分間の最終的な伸長。試験したいくつかのＣｍRコロニーが、目的の１２７９ｂｐ ＤＮＡフラグメントを含有し、野生型のｙｂｈＥ ＯＲＦに代わるＣｍRマーカーＤＮＡの存在を確認した。得られた株の１つは、３７℃で培養することにより、熱感受性プラスミドｐＫＤ４６を除去して、得られた株をエシェリヒア・コリＢＷ２５１１３−ΔｙｂｈＥ株と命名した。
【００７３】
ｙｂｈＥ ＯＲＦが崩壊された細菌ＤＮＡ領域の構造を図２に示す。
【００７４】
実施例３．ｙｂｈＡ ＯＲＦ及びｙｂｈＤ ＯＲＦの破壊。クロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣｍR）を保有するＤＮＡフラグメントによるｙｂｈＡ ＯＲＦ及びｙｂｈＤ ＯＲＦの置換。
ｙｂｈＡ ＯＲＦ及びｙｂｈＤ ＯＲＦを破壊するために、ｃａｔ遺伝子によりコードされるクロラムフェニコール耐性マーカー（ＣｍR）を保有するＤＮＡフラグメントを、実施例２に記載される方法により、野生型のｙｂｈＡ ＯＲＦ及びｙｂｈＤ ＯＲＦの代わりにエシェリヒア・コリＢＷ２５１１３［ｐＫＤ４６］株の染色体中へ個々に組み込んだ。
【００７５】
エレクトロポレーション並びにｙｂｈＡ ＯＲＦ及びｙｂｈＤ ＯＲＦの破壊用のフラグメントを得るために、それぞれプライマーＰ５（配列番号８）とＰ６（配列番号９）、及びＰ７（配列番号１０）とＰ８（配列番号１１）の２対を合成し、ＰＣＲに使用した。プライマーＰ５は、ｙｂｈＡ ＯＲＦの３’末端に相同的な３６個のヌクレオチドを含有する。プライマーＰ６は、ｙｂｈＡ ＯＲＦの５’末端に相同的な３６個のヌクレオチドを含有する。プライマーＰ７は、ｙｂｈＤ ＯＲＦの３’末端に相補的な３６個のヌクレオチドを含有する。また、プライマー８は、ｙｂｈＤ ＯＲＦの５’末端に相補的な３６個のヌクレオチドを含有する。これらの配列は、細菌染色体へのさらなる組込みのためにプライマーＰ５、Ｐ６、Ｐ７及びＰ８に導入された。
【００７６】
構築されたＤＮＡフラグメントの塩基配列を、それぞれ配列番号１２及び配列番号１３に示す。ｙｂｈＡ ＯＲＦ及びｙｂｈ ＯＲＦの、置換される野生型の領域の塩基配列は、アクセッション番号ＮＣ＿０００９１３．１（それぞれ、ヌクレオチド番号７９６８３６〜７９７６５４及び７９８８４５〜７９９７７７、ｇｉ：１６１２８７３４及びｇｉ：３３３４７４８１）でGenBankに示される。ｙｂｈＡ ＯＲＦ及びｙｂｈ ＯＲＦが破壊された細菌ＤＮＡ領域の構造を、それぞれ図３及び図４に示す。
【００７７】
エレクトロポレーション後、相当するコロニーを、ｙｂｈＡ ＯＲＦの破壊に関してはプライマーＰ９（配列番号１４）及びＰ１０（配列番号１５）を、並びにｙｂｈＤ ＯＲＦの崩壊に関してはプライマー１１（配列番号１６）及びＰ１２（配列番号１７）を使用するＰＣＲにより、ＣｍRマーカーの存在を試験した。
【００７８】
第１に、試験したいくつかのＣｍRコロニーが、目的の１４２４ｂｐ ＤＮＡフラグメントを含有し、野生型のｙｂｈＡ ＯＲＦに代わるＣｍR遺伝子の存在を確認した。第２に、試験したいくつかのＣｍRコロニーが、目的の１３８６ｂｐ ＤＮＡフラグメントを含有し、野生型のｙｂｈＤ ＯＲＦに代わるＣｍR遺伝子の存在を確認した。それぞれの場合で、得られた株の１つは、３７℃で培養することにより、熱感受性プラスミドｐＫＤ４６が除去され、その結果得られた株を、それぞれエシェリヒア・コリＢＷ２５１１３−ΔｙｂｈＡ株及びＢＷ２５１１３−ΔｙｂｈＤ株と命名した。
【００７９】
実施例４：「マルトースブルー」表現型に関するｙｂｈＥ-、ｙｂｈＡ-及びｙｂｈＤ-突
然変異体の確認
３つの得られた突然変異株はそれぞれ、Kupor, S.R.及びFraenkel, D.G. (J. Bacteriol., 100:3, 1296-1301(1969))により記載される方法により「マルトースブルー」表現型に関して試験した。培養物を、マルトース０．８％を含有するＭ９最小培地を有するプレート上にまいた。６時間後、インキュベーションプレートを、０．０１Ｍ Ｉ2及び０．０３Ｍ ＫＩを含有する溶液５ｍｌで満たして、パッチカラーを視覚的に「ブルー」又は「非ブルー」とスコア付けした。
【００８０】
得られたＢＷ２５１１３−ΔｙｂｈＥ株は、「ブルー」とスコア付けされたのに対して、ＢＷ２５１１３−ΔｙｂｈＡ、ＢＷ２５１１３−ΔｙｂｈＤ及びＢＷ２５１１３（対照株として）は「非ブルー」であった。
【００８１】
実施例５．ｐｇｉ、及びｙｂｈＥ又はｙｂｈＤ欠失を保有する二重突然変異株の構築。種々の炭素源上でのこのような株の生育比較。
ホスホグルコースイソメラーゼを欠損する突然変異株（ｐｇｉ-）を単独で、ペントースリン酸経路の酸化的経路を使用してグルコース上で徐々に生育させた。この経路の第２工程を触媒するホスホグルコノラクトナーゼ（ｐｇｌ）も欠く二次突然変異体は、６−ホスホグルコノラクトンのグルコン酸−６−リン酸への自発的加水分解のみに起因して、よりゆっくりと生育する。従って、ｙｂｈＥ ＯＲＦが実際にｐｇｌ遺伝子である場合、ｐｇｉ，ｙｂｈＥ二重突然変異体は、野生型株及びｐｇｉ突然変異体よりもゆっくりと生育するであろう。この示唆を支持するために、ｐｇｉ，ｙｂｈＥ二重突然変異体を調製した。
【００８２】
ｐｇｉ遺伝子における突然変異は、実施例２に記載される方法により、カナマイシン耐性遺伝子（ＫｍR）を保有するＤＮＡフラグメントによる、エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３［ｐＫＤ４６］株中の野生型細菌染色体領域の置換により実施された。ｐｇｉ遺伝子の置換された野生型領域の塩基配列は、アクセッション番号ＮＣ＿０００９１３．１（ヌクレオチド番号４２３１３３７〜４２３２９８６、ｇｉ：１６１３１８５１）でGenBankに示される。
【００８３】
ＫｍR遺伝子を保有するＤＮＡフラグメントは、市販のプラスミドｐＵＣ４ＫＡＮ（GenBank/EMBLアクセッション番号Ｘ０６４０４、Fermentas, Lithuania）を鋳型として、プライマーＰ１３（配列番号１８）及びＰ１４（配列番号１９）を使用するＰＣＲにより得られた。プライマーＰ１３は、ｐｇｉ遺伝子の３’末端に相同的な３６個のヌクレオチドを含有し、プライマーＰ１４は、ｐｇｉ遺伝子の５’末端に相同的な３６個のヌクレオチドを含有する。ｐｇｉ遺伝子に由来するこれらの配列は、細菌染色体へのさらなる組込みのためにプライマーＰ１３及びＰ１４に導入された。
【００８４】
ＰＣＲは、実施例２に記載するように実施された。
【００８５】
続いて、増幅されたＤＮＡフラグメントは、アガロースゲル電気泳動により濃縮して、「ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｕｎｓ」（「Sigma」、ＵＳＡ）による遠心分離によりゲルから抽出して、エタノールにより沈殿させた。構築されたＤＮＡ領域の塩基配列を配列番号２０に示す。
【００８６】
上述のように精製し得られたＤＮＡフラグメントは、実施例２に記載されるようにエシェリヒア・コリＢＷ２５１１３［ｐＫＤ４６］株の細菌染色体へのエレクトロポレーション及びＲｅｄ媒介性組込みに使用したが、但し、細胞は、エレクトロポレーション後にカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含有するＬ−寒天培地上へ延展した。
【００８７】
２４時間以内に生育したコロニーを、プライマー１５（配列番号２１）及びＰ１６（配列番号２２）を使用するＰＣＲにより、ｐｇｉ遺伝子の代わりにＫｍRマーカーの存在を試験した。この目的で、単離したコロニーを水２０μｌ中に懸濁させた後、得られた懸濁液１μｌをＰＣＲに使用した。ＰＣＲ条件は、実施例２に記載する通りである。試験したいくつかのＫｍRコロニーが、目的の１２８６ｂｐ ＤＮＡフラグメントを含有し、ｐｇｉ遺伝子に代わるＫｍRマーカーの存在を確認した。得られた株の１つは、３７℃で培養することにより、熱感受性プラスミドｐＫＤ４６が除去され、得られた株をエシェリヒア・コリＢＷ２５１１３−Δｐｇｉ株と命名した。
【００８８】
ｐｇｉ遺伝子が欠失した細菌ＤＮＡ領域の構造を図５に示す。
【００８９】
ｐｇｉ欠失は、Fraenkel(J. Bacteriol. 93(1967), 1582-1587)の方法により、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株へ形質導入され、続いてカナマイシンを含有するプレート上で選択した。得られた株をＭＧ−Δｐｇｉと命名した。続いて、ｙｂｈＥ ＯＲＦ及びｙｂｈＤ ＯＲＦにおける突然変異は、実施例２及び実施例３に記載されるＢＷ２５１１３−ΔｙｂｈＥ株及びＢＷ２５１１３−ΔｙｂｈＤ株から、上記の得られた株へ形質導入されて、続いてクロラムフェニコールを含有するプレート上で選択した。得られた株を、それぞれＭＧ−Δｐｇｉ−ΔｙｂｈＥ及びＭＧ−Δｐｇｉ−ΔｙｂｈＤと命名した。
【００９０】
これらの２つの株をＭＧ１６５５及びＭＧ１６５５−Δｐｇｉと一緒に、炭素源としてグルコース又はグルコン酸を有するＭ９最小プレート上へまいた。２４時間のインキュベーション後に、株の生育を視覚的に試験した。ＭＧ−Δｐｇｉ−ΔｙｂｈＥの生育は、グルコースを有するプレート上で他のすべての株よりも悪く、グルコン酸を有するプレート上では識別不可能であった。
【００９１】
実施例６．シュードモナス・プチダ由来のｐｇｌ遺伝子を保有するプラスミドの構築及びｙｂｈＥ突然変異の相補
いくつかの生物体由来のｐｇｌ遺伝子が記載されている。それらの中には、エシェリヒア・コリにかなり密接な関係にあるシュードモナス・プチダ由来の６−ホスホグルコノラクトナーゼが存在する。他のいくつかの遺伝子を、シュードモナス・プチダからエシェリヒア・コリへクローニングして、エシェリヒア・コリに存在する突然変異と一致をすることが報告された(Ramos-Gonzalez, M.I.and Molin, S., J. Bacteriol., v180, 13, p.3421, 1998)。
【００９２】
シュードモナス・プチダ由来のｐｇｌ遺伝子は、プライマー１７（配列番号２３）及び１８（配列番号２４）を使用してクローニングした。プライマー１７は、シュードモナス・プチダ由来のｐｇｌ遺伝子の１〜１９ｂｐの配列と同一である配列を含有する。このプライマーはまた、上流に位置するエシェリヒア・コリ由来のｌａｃＺ遺伝子のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）、及びその５’末端に導入される制限酵素ＳａｃＩの認識部位を含有する。プライマーＰ１８は、シュードモナス・プチダ由来のｐｇｌ遺伝子の７０９〜７２９ｂｐの配列に相補的な配列、及びその５’末端に導入される制限酵素ＥｃｏＲＩの認識部位を含有する。
【００９３】
シュードモナス・プチダＫＴ２４４０株ＴＧ１(Bagdasarian, M. & Timmis, K.N., In Current Topics of Microbiology and Immunology, eds. Goebel, W. & Hofschneider, P.H. (Springer, Berlin), pp. 47-67 (1981))の染色体ＤＮＡは、典型的な方法により調製された。ＰＣＲは、「Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００」で、以下の条件下で実施した：９５℃で４０秒、５３℃で４０秒、７２℃で４０秒、Ｔａｑポリメラーゼ(Fermentas)を用いて２５サイクル。ｌａｃＺ遺伝子のＲＢＳを有するシュードモナス・プチダ由来のｐｇｌ遺伝子を含有している得られたＰＣＲ
フラグメントを、ＳａｃＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素で処理して、同じ酵素で予め処理した多コピーベクターｐＵＣ１９へ挿入した。このようにして、プラスミドｐＵＣ１９−ｐｇｌが得られた。
【００９４】
ＢＷ２５１１３−ΔｙｂｈＥ株を、得られたプラスミドｐＵＣ１９−ｐｇｌにより形質転換した。アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有する最小マルトースプレート上に培養物をパッチして、上述のように処理して、「マルトースブルー」表現型を確認した。対照株ＢＷ２５１１３−ΔｙｂｈＥと対比して、形質転換体は「マルトースブルー」表現型を示さなかった。
【００９５】
したがって、シュードモナス・プチダ由来のｐｇｌ遺伝子のクローニングされたコピーは、エシェリヒア・コリにおけるｙｂｈＥ突然変異を補完し、これはｙｂｈＥ ＯＲＦが、ｐｇｌ遺伝子のコード領域であるという仮説を再度支持した。
【００９６】
実施例７．ｙｂｈＥ突然変異体における６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性の測定
一晩培養したＢＷ２５１１３株及びＢＷ２５１１３−ΔｙｂｈＥ株の培養液を、グルコースを含有する最小Ｍ９培地で５０倍に希釈した。培養液の光学密度が、ＯＤ540＝１に到達するまで、細胞を生育させた。抽出物は、培養液３ｍｌから調製した。細胞を生理食塩溶液で洗浄して、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）４００μｌ中に再懸濁させて、超音波処理した。続いて、遠心分離後に得られた上清分画を、更に希釈することなくアッセイに使用した。
【００９７】
６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性の測定に関しては、Collard, F等(FEBE Letters 459 (1999) 223-226)により記載される方法を使用した。ラクトンは、０．２ｍＭ ＮＡＤＰ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）、２ｍＭ ＭｇＣｌ2及び１．７５Ｕ 酵母グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ(Sigma, USA)の存在下３０℃で５０μＭ グルコース−６−リン酸(Sigma,USA)（総容量−１ｍｌ）をインキュベートすることにより即座に調製された。反応混合物のＡ340での光学密度がプラトーに達したら、先立って得られたアッセイされるべき上清分画と一緒に０．５Ｕ／ｍｌの６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(Sigma, USA)を添加して、Ａ340での光学密度を約１０分間更に測定した。タンパク質の量は、Bradford, M.M. (Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976))の方法に従って測定した。得られたデータを表１に示す。活性は、総タンパク質１ｍｇ当たりの相対単位で示される。
【００９８】
【表１】
【００９９】
表からわかるように、ｙｂｈＥ突然変異体における６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性は、「野生型」株における場合よりも少なくとも一オーダー分低く、自発的加水分解の割合に匹敵する。
【０１００】
実施例８．ｚｗｆ−ｅｄｄ−ｅｄａオペロンの欠失。カナマイシン耐性遺伝子（ＫｍR）を保有するＤＮＡフラグメントによるｚｗｆ−ｅｄｄ−ｅｄａ遺伝子領域の置換
ＹｂｈＥ発現が増大された株を得るために、本発明者は、Ｒｅｄ媒介性組込みを使用したｙｂｈＥ ＲＢＳとその野生型のプロモーターとの間のＰtacに由来する構成的プロモーターの組込みを計画した（実施例９を参照）。
【０１０１】
しかし、本発明者は、「野生型」ＭＧ１６５５株におけるこのような染色体改変を提供することができなかった。本発明者は、ｐｇｌ（ｙｂｈＥ）の発現増強による毒性効果を説明することができないが、それが、ペントース−リン酸経路（ＰＰＰ）の不均衡や幾つかの毒性中間体の蓄積（又は細胞生存の必須物の飢餓）の可能性を招く６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性の増大に関与することを本発明者は提唱した。したがって、本発明者は、この経路の第１の酵素をコードするｚｗｆ遺伝子の欠失によりＰＰＰを完全に遮断することを試みた。
【０１０２】
ｚｗｆ−ｅｄｄ−ｅｄａオペロンの欠失は、ｐｇｉ遺伝子に関して実施例５に記載される方法により実施された。ｚｗｆ−ｅｄｄ−ｅｄａオペロンの置換された野生型の領域の塩基配列は、アクセッション番号ＮＣ＿０００９１３．１（ｚｗｆ、ｅｄｄ及びｅｄａ遺伝子に関してそれぞれ、ヌクレオチド番号１９３２８６３〜１９３４３３８、ｇｉ：１６１２９８０５；１９３０８１７〜１９３２６２８、ｇｉ：１６１２９８０４、及び１９３０１３９〜１９３０７８０、ｇｉ：１６１２９８０３）でGenBankに示される。ＫｍR遺伝子を保有するＤＮＡフラグメントは、プライマーＰ１９（配列番号２５）及びＰ２０（配列番号２６）を使用するＰＣＲにより得られた。プライマー１９は、ｅｄａ遺伝子の３’末端に相補的な３６個のヌクレオチドを含有する。プライマーＰ２０は、ｚｗｆ遺伝子の５’末端に相補的な３６個のヌクレオチドを含有する。構築されたＤＮＡフラグメントの塩基配列を配列番号２７に示す。
【０１０３】
２４時間以内に生育したコロニーを、プライマーＰ２１（配列番号２８）及びＰ２２（配列番号２９）を使用するＰＣＲにより、ｚｗｆ−ｅｄｄ−ｅｄａオペロンに代わるＫｍRマーカーの存在を試験した。試験したいくつかのＫｍRコロニーが、目的の１２８７ｂｐ
ＤＮＡフラグメントを含有し、ｚｗｆ−ｅｄｄ−ｅｄａオペロンに代わるＫｍR遺伝子の存在を確認した。得られた株の１つは、３７℃で培養することにより、熱感受性プラスミドｐＫＤ４６が除去されて、得られた株をエシェリヒア・コリＢＷ２５１１３−Δｚｗｆ−ｅｄｄ−ｅｄａ株と命名した。ｚｗｆ−ｅｄｄ−ｅｄａオペロンが欠失された細菌ＤＮＡ領域の構造を図６に示す。
【０１０４】
実施例９．合成Ｐtac*−プロモーターを保有する新規調節エレメントによるエシェリヒア・コリ染色体上に位置するｙｂｈＥ遺伝子の野生型の上流領域の置換
ｐｇｌ（ｙｂｈＥ）遺伝子の上流への様々な強度を有する人工Ｐtac*プロモーターのさらなる組込みのために、ｐＫＤ４６プラスミドによるエシェリヒア・コリＢＷ２５１１３−Δｚｗｆ−ｅｄｄ−ｅｄａ株の再形質転換を実施した。得られたカナマイシン且つアンピシリン耐性株をエシェリヒア・コリＢＷ２５１１３−Δｚｗｆ−ｅｄｄ−ｅｄａ［ｐＫＤ４６］株と命名した。ｐＫＤ４６プラスミドは熱感受性であるため、形質転換体のさらなる選択は、３０℃で実施した。
【０１０５】
σ70とエシェリヒア・コリＲＮＡポリメラーゼの複合体により認識されるプロモーターの「−３５」領域を持つ突然変異体は、有意に変じた転写開始能を保有する（ＷＯ００／１８９３５）。したがって、初期ランダムプロモーター様配列で創出され、得られたプロモーターの中でも、種々の強度を有するプロモーターが得られる。したがって、この一般的なアプローチは、目的の遺伝子の発現レベルの微調整に利用することができる。本発明の発明者等は、種々の強度を有する改変Ｐtacプロモーターのライブラリーを予め得た（
これ以降、このような改変Ｐtacプロモーターはアスタリスクで標識する）。これらのプロモーターは、「−３５」領域の４つの中心的なヌクレオチドが異なる。本研究では、異なる強度を有する２つのＰtac*プロモーターを使用した。相当するプロモーターの制御下で発現されるβ−ガラクトシダーゼ活性の値に基づいて、それらをＰtac-10000（通常のＰtac）及びＰtac-3900（中心に元のＴＧＡＣの代わりにＴＴＧＣのヌクレオチドを有する）と命名した。
【０１０６】
続いて、これらの人工Ｐtac*プロモーターのそれぞれが、上記の方法により、エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３−Δｚｗｆ−ｅｄｄ−ｅｄａ［ｐＫＤ４６］株の染色体のｐｇｌ遺伝子コード領域の上流に組み込まれた（実施例２を参照）。更に、プロモーター領域の上流にクロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣｍR）を有する人工ＤＮＡフラグメントを組み込んだ（実施例７を参照）。
【０１０７】
細菌染色体の相当する領域へ組み込んだ上述の人工ＤＮＡフラグメントの構築は、数工程で完了した。第１の工程に関しては、上流領域にＢｇｌＩＩ制限部位及びＰtac*プロモーターに相当する部位を保有するＤＮＡフラグメントが、ＰＣＲにより得られた。
【０１０８】
染色体へ組み込まれた人工Ｐtac-3900プロモーター及びＰtac-10000プロモーターを有するエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株由来の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲに使用した。ＰＣＲは、Ｐtac-3900及びＰtac-10000の場合では、それぞれプライマーＰ２３（配列番号３０）及びＰ２４（配列番号３１）を、並びに両方の場合においてプライマーＰ２５（配列番号３２）を使用して行った。プライマーＰ２３及びＰ２４は、それらの５’末端に導入されるＢｇｌＩＩ制限部位を含有する。Ｐ２５は、ｐｇｌ遺伝子の上流の１１個のヌクレオチド（ＲＢＳを含む）及びｐｇｌコード領域の最初２５個のヌクレオチドを含有する。上述の配列は、細菌染色体へのさらなる組込みのためにプライマーＰ２５に導入された。
【０１０９】
ＰＣＲは、増幅器「ＴｅｒｍｏＨｙｂａｉｄ ＰＣＲ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ」を使用して行った。反応混合物（総容量５０μｌ）は、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2を含有する１０×ＰＣＲ緩衝液（Fermentas, Lithuania）５μｌ、ｄＮＴＰそれぞれ２００μＭ、利用するプライマーそれぞれ２５ｐｍｏｌ及び１ｕ Ｔａｑ−ポリメラーゼ（Fermentas, Lithuania）から構成された。染色体ＤＮＡおよそ０．５μｇを、さらなるＰＣＲ増幅用の鋳型ＤＮＡとして反応混合物中に添加した。温度ＰＣＲ条件は、以下の通りであった：９５℃で５分間の初期ＤＮＡ変性、続く９５℃で３０秒間の変性、５３℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の伸長を２５サイクル、及び７２℃で７分間の最終的な重合。
【０１１０】
目的のＤＮＡフラグメントの構築の第２の段階を実施した。ＣｍR遺伝子は、鋳型として市販のプラスミドｐＡＣＹＣ１８４（GenBank/EMBL アクセッション番号Ｘ０６４０３、Fermentas, Lithuania）、並びにプライマーＰ２６（配列番号３３）及びＰ２７（配列番号３４）を使用するＰＣＲにより増幅された。プライマーＰ２６は、Ｐtac*プロモーターを保有する、先立って得られたＤＮＡフラグメントとのさらなる連結に使用されるＢｇｌＩＩ制限部位を含有する。プライマーＰ２７は、細菌染色体へのフラグメントのさらなる組込みのために必要であるエシェリヒア・コリ由来のｐｇｌ（ｙｂｈＥ）遺伝子開始コドンの上流に位置するヌクレオチド５８〜１２に相補的な４６個のヌクレオチドを含有する。
【０１１１】
続いて、増幅されたＤＮＡフラグメントは、アガロースゲル電気泳動により精製して、「ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｕｎｓ」（Sigma, ＵＳＡ）による遠心分離によりゲルから抽出して、エタノールにより沈殿させた。続いて、得られた２つのＤＮＡ
フラグメントを、ＢｇｌＩＩ制限酵素で処理して、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して連結させた(Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook, J.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)。
【０１１２】
連結された生成物をプライマーＰ２５及びＰ２７を使用するＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲは、１０×ＡｃｃｕＴａｑ ＬＡ緩衝液（Sigma, ＵＳＡ）５μｌ、ｄＮＴＰそれぞれ２００μＭ、利用するプライマーそれぞれ２５ｐｍｏｌ及び１ユニット ＡｃｃｕＴａｑ ＬＡポリメラーゼ（Sigma, ＵＳＡ）から構成される反応混合物（総容量５０μｌ）を用いて行った。連結されたＤＮＡ生成物およそ５０ｎｇを、鋳型として反応混合物中に添加した。ＰＣＲ温度サイクルは、以下の通りであった：９５℃で５分間の初期ＤＮＡ変性、続く９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で４分間の伸長を２５サイクル、及び７２℃で７分間の最終的な重合。
【０１１３】
構築されたＤＮＡ領域の塩基配列は、それぞれＰtac-3900及びＰtac-10000プロモーターに関して、配列番号３５及び配列番号３６に示す。
【０１１４】
上記のように精製し得られたＤＮＡフラグメントは、実施例２に記載されるように、エシェリヒア・コリＢＷ２５１１３Δｚｗｆ−ｅｄｄ−ｅｄａ［ｐＫＤ４６］株の細菌染色体へのエレクトロポレーション及びＲｅｄ媒介性組込みに使用した。
【０１１５】
クロラムフェニコールを含有する培地中で２４時間以内に生育したコロニーを、プライマー２７（配列番号３４）及びＰ１０（配列番号１５）を使用するＰＣＲにより、ｐｇｌ遺伝子の上流のＣｍRマーカーの存在を明らかにするために試験した。同じコロニーはまた、Ｐtac-3900及びＰtac-10000に関して、それぞれプライマーＰ２３（配列番号３０）及びＰ２４（配列番号３１）、並びにＰ１０（配列番号１５）を使用するＰＣＲにより、ｐｇｌ遺伝子の上流のＰtac*プロモーター領域の存在を明らかにするためにも試験した。この目的で、単離したてのコロニーを水２０μｌ中に懸濁させた後、懸濁液１μｌをＰＣＲに使用した。ＰＣＲ条件は、以下の通りであった：９５℃で１０分間の初期ＤＮＡ変性、続く９５℃で３０秒間の変性、５４℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長を３０サイクル、及び７２℃で７分間の最終的な重合。試験したいくつかのＣｍRコロニーが、目的の１１９３ｂｐ及び１２４ｂｐ ＤＮＡフラグメントを含有し、それぞれエシェリヒア・コリ染色体においてＰtac*プロモーターを保有する、ｐｇｌ遺伝子上流の構築ＤＮＡ領域及びハイブリッド調節エレメントの存在を確認した。両方の場合で、得られた株の１つは、３７℃で培養することにより、熱感受性プラスミドｐＫＤ４６が除去され、得られた株を、それぞれエシェリヒア・コリＢＷ２５１１３−Ｐｔａｃ−３９００−ｙｂｈＥ株及びＢＷ２５１１３−Ｐｔａｃ−１００００−ｙｂｈＥ株と命名した。ｐｇｌ遺伝子の上流の構築ＤＮＡ領域の構造を図７に示す。
【０１１６】
実施例１０．ｐｇｌ遺伝子発現が増強された株における６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性の測定
【０１１７】
ＢＷ２５１１３−Ｐtac-3900−ｙｂｈＥ株及びＢＷ２５１１３−Ｐtac-10000−ｙｂｈＥ株由来の６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性は、実施例７に記載されるように測定した。得られたデータを表２に示す。自発的加水分解のレベルを差し引いている
【０１１８】
【表２】
【０１１９】
従って、ｐｇｌ遺伝子の発現増強は、６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性を増大させる。
【０１２０】
実施例１１．ｐｇｌ遺伝子の発現増強のトリプトファン生産に対する影響
トリプトファン生産エシェリヒア・コリＳＶ１６４［ｐＭＷ−ＰlacUV5−ｓｅｒＡ５−ｆｒｕＲ，ｐＹＤＤＧ２］株を、ｐｇｌ遺伝子の発現増強のトリプトファン生産に対する影響の評価用の親株として使用した。ＳＶ１６４株は、米国特許第６，１８０，３７３号に詳述されている。ＳＶ１６４［ｐＭＷ−ＰlacUV5−ｓｅｒＡ５−ｆｒｕＲ，ｐＹＤＤＧ２］株は、ＳＶ１６４株の誘導体であり、プラスミドｐＭＷ−ＰlacUV5−ｓｅｒＡ５−ｆｒｕＲ及びｐＹＤＤＧ２を更に含有する。プラスミドｐＭＷ−ＰlacUV5−ｓｅｒＡ５−ｆｒｕＲは、セリンによるフィードバック阻害のないタンパク質をコードする突然変異ｓｅｒＡ５を保有する（ＷＯ２００４０９０１２５Ａ２号）。ｓｅｒＡ５遺伝子の増幅は、Ｌ−トリプトファンの前駆体であるセリンの量を増大させるのに必要である（米国特許第６，１８０，３７３号）。プラスミドｐＹＤＤＧ２は、ｐＡＹＣＴＥＲ３ベクター（ＷＯ０３／０４４１９２号）に基づいて構築され、Ｌ−トリプトファン生産に有用な膜貫通タンパク質（推定上の輸送体）をコードするｙｄｄＧ遺伝子を含有する。ｐＡＹＣＴＥＲ３ベクターは、中程度のコピー数で、且つプラスミドＲＳＦ１０１０に基づいて構築される非常に安定なベクターであるｐＡＹＣ３２の誘導体であり、ストレプトマイシン耐性に関するマーカーを保有する(Christoserdov A.Y., Tsygankov Y.D, Broad-host range vectors
derived from a RSF 1010 Tnl plasmid, Plasmid, 1986, v. 16, pp. 161-167)。ｐＡＹＣＴＥＲ３ベクターは、ｐＡＹＣ３２プラスミドへのそのプロモーターに代わるｐＵＣ１９プラスミド由来のポリリンカー及び強力なターミネーターｒｒｎＢの導入により得られた。
【０１２１】
Ｐtac*プロモーターの制御下にあるｐｇｌ遺伝子の発現増強のトリプトファン生産に対する影響を試験するために、上記のエシェリヒア・コリＢＷ２５１１３−Ｐtac-3900−ｙｂｈＥ株及びＢＷ２５１１３−Ｐtac-10000−ｙｂｈＥ株の染色体由来のＤＮＡフラグメントを、トリプトファン生産エシェリヒア・コリＳＶ１６４［ｐＭＷ−ＰlacUV5−ｓｅｒＡ５−ｆｒｕＲ］株へＰ１形質導入により移入した(Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY)。続いて、プラスミドｐＹＤＤＧ２を、ＳＶ１６４［ｐＭＷ−ＰlacUV5−ｓｅｒＡ５−ｆｒｕＲ］株及び得られた形質導入体の両方に導入した。
【０１２２】
ＳＶ１６４［ｐＭＷ−ＰlacUV5−ｓｅｒＡ５−ｆｒｕＲ，ｐＹＤＤＧ２］、ＳＶ１６４−Ｐtac-3900−ｙｂｈＥ［ｐＭＷ−ＰlacUV5−ｓｅｒＡ５−ｆｒｕＲ，ｐＹＤＤＧ２］及びＳＶ１６４−Ｐtac-10000−ｙｂｈＥ［ｐＭＷ−ＰlacUV5−ｓｅｒＡ５−ｆｒｕＲ，ｐＹＤＤＧ２］株は、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ及びストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌを補充した栄養ブロス３ｍｌ中にて３７℃で振とうしながら一晩培養した。得られた培養物０．３ｍｌを、２０×２００ｍｍの試験管中で上記抗生物質を含有する発酵培地３ｍｌへ植菌して、回転振とう機により２５０ｒｐｍにて、３７℃で４０時間培養した。
【０１２３】
発酵培地の組成を表３に示す。
【０１２４】
【表３】
【０１２５】
セクションＡは、ＮＨ4ＯＨによりｐＨ７．１に調節された。セクションはそれぞれ、個々に滅菌された。
【０１２６】
培養後、培地中に蓄積したＬ−トリプトファンの量をＴＬＣにより測定した。蛍光指示薬を含有していないＳｏｒｂｆｉｌシリカゲルの０．１１ｍｍ層でコーティングされた１０×１５ｃｍのＴＬＣプレート(Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, Russia)を使用した。Ｓｏｒｂｆｉｌプレートは、移動相：プロパン−２−オール：酢酸エチル：２５％アンモニア水：水＝１６：１６：３：９（ｖ／ｖ）で展開した。アセトン中のニンヒドリンの溶液（２％）を可視化試薬として使用した。得られたデータを表４に示す。
【０１２７】
【表４】
【０１２８】
表４からわかるように、ｐｇｌ遺伝子発現の増強は、ＳＶ１６４［ｐＭＷ−ＰlacUV5−ｓｅｒＡ５−ｆｒｕＲ，ｐＹＤＤＧ２］株のトリプトファン生産性を向上させた。
【０１２９】
実施例１２．Ｈｉｓをタグ付ＹｂｈＥタンパク質の精製及びその６−ＰＧＬ（６−ホスホグルコノラクトナーゼ）活性の定量
実施例１〜７で先述した結果すべては、ｙｂｈＥ ＯＲＦが、エシェリヒア・コリにおいて機能的に活性な６−ＰＧＬをコードするｐｇｌ遺伝子であると間接的に示す。他方で、ｙｂｈＥ ＯＲＦは、例えば６−ＰＧＬを同様にコードする別の未知の遺伝子の発現を正に調節する因子をコードすることも考えられる。したがって、ｙｂｈＥ ＯＲＦの性質に関する最終的な結論は、そのタンパク質生成物の生物学的活性の直接的な定量によってのみなされる。
【０１３０】
この目的で、ｙｂｈＥ ＯＲＦは、染色体中にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を保有するレシピエント株としてエシェリヒア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）を含み、且つＴ７後期プロモーター及びＴ７遺伝子１０の効率的なＲＢＳを有するｐＥＴ−２２ｂ（＋）ベクタープラスミドを含んだＴ７発現系を利用することにより過剰発現させた。以下のタンパク質精製の利便性のために、６ＨｉｓコドンをｙｂｈＥ ＯＲＦの５’末端に、ＡＴＧ開始コドンのすぐ後に挿入した。
【０１３１】
Ｔ７発現系においてＨｉｓ−Ｔａｇ配列を有するｙｂｈＥ ＯＲＦをクローニングするために、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株の染色体ＤＮＡを鋳型として使用して、プライマーＰ２８（配列番号３７）及びＰ２９（配列番号３８）を用いて、ＰＣＲを行った。プライマーＰ２８は、ＮｄｅＩ制限部位、及びｙｂｈＥ ＯＲＦの第２コドンの前に６個のさらなるヒスチジンコドンに連結されたＡＴＧコドンを含有する。プライマーＰ２９は、さらなるクローニングのために５’末端にＢａｍＨＩ制限部位を含有する。増幅されたＤＮＡフラグメントを単離して、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素で処理して、同じ酵素で予め処理したｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドへ連結した。得られたｐＥＴ−ＨＴ−ｙｂｈＥプラスミドの構築は、シーケンシングにより確認した。
【０１３２】
続いて、ラクトースプロモーターの制御下にあるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を染色体に保有するＢＬ２１（ＤＥ３）細胞をｐＥＴ−ＨＴ−ｙｂｈＥプラスミドで形質転換した。単一コロニーからの一晩の培養液を、ＬＢで５０倍に希釈して、ＯＤ600およそ１．０にまで生育させて、組換えプラスミドにおけるｙｂｈＥ ＯＲＦのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ駆動型発現を誘導するためにＩＰＴＧ（１ｍＭ）を添加した。インキュベーションの２時間後に、２０ｍｌから細胞を回収した。細胞抽出物は、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び２ｍＭ ＰＭＳＦを含有する緩衝液中での超音波処理により調製した。続いて、プローブを１６，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離した後、ＨｉＴｒａｐ
Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ＨＰカラム(Amersham Bioscience)を用いて製造業者により推奨されるように、上清からＨｉｓタグ付タンパク質を精製した。
【０１３３】
対数培養におけるＴ７発現系の誘導の２時間後に、Ｈｉｓをタグ付ＹｂｈＥに相当する電気泳動移動度を有するタンパク質（ＭＷ＞＞３７ｋＤａを有するタンパク質）の蓄積が観察された。タンパク質量は、総細胞ポリペプチドの約１５％であった。タンパク質は、主として可溶性相で観察された（図８Ａ参照）。
【０１３４】
得られたＨｉｓ6−ＹｂｈＥタンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを使用して精製した。組換えタンパク質合成のレベルの定量及び精製プロセスの制御は、Laemmli U.K.により記載される方法に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより提供された(Nature, 227, 680-685(1970))。図８Ｂでわかるように、得られたタンパク質の純度は、９０％を上回り、それは、標準的なラクトナーゼ試験（Collard, F. et al, FEBS Letters, 459, 223-226 (1999)、実施例７）において６−ＰＧＬ活性を示した。精製Ｈｉｓ6−ＹｂｈＥタンパク質に対して定量化された特異的な６−ＰＧＬ活性（７８０Ｕ／ｍｌ）は、同様にＨｉｓ6をタグ付けしたヒト６−ＰＧＬの、先に報告された活性（７１０Ｕ／ｍｌ）に非常に近い(Collard, F. et al, FEBS Letters, 459, 223-226 (1999))ことは興味深い。
【０１３５】
したがって、未知の機能を有するエシェリヒア・コリ由来のｙｂｈＥ ＯＲＦは、まさに６−ＰＧＬをコードするｐｇｌ遺伝子であると結論付けることができる。
【０１３６】
実施例１３．ｐｇｌ遺伝子の発現増強のフェニルアラニン生産に対する影響
フェニルアラニン生産性エシェリヒア・コリＡＪ１２７３９株を、ｐｇｌ遺伝子の発現増強のトリプトファン生産に対する影響を評価するための親株として使用した。ＡＪ１２７３９株は、２００１年１１月６日にRussian National Collection of Industrial Microorganisms（ＶＫＰＭ）(Russia, 113545 Moscow, 1st Dorozhny proezd, 1)にアクセッション番号ＶＫＰＭ Ｂ−８１９７で寄託された。
【０１３７】
ＢＷ２５１１３−Ｐtac-3900−ｙｂｈＥ及びＢＷ２５１１３−Ｐtac-10000−ｙｂｈＥ株由来の染色体ＤＮＡフラグメントを、フェニルアラニン生産性エシェリヒア・コリＡＪ１２７３９株へＰ１形質導入により移入して、それぞれＡＪ１２７３９ Ｐtac-3900−ｙｂｈＥ株及びＡＪ１２７３９ Ｐtac-10000株を得た。これらの株はそれぞれ、クロラムフェニコール２５ｍｇ／ｌを含有する栄養ブロス中で３７℃で１８時間培養して、得られた培養液０．３ｍｌを、２０×２００ｍｍの試験管中でクロラムフェニコール２５ｍｇ／ｌを含有する発酵培地３ｍｌへ植菌して、回転振とう機により、３４℃で２４時間培養した。培養後、培地中に蓄積したＬ−フェニルアラニンの量をＴＬＣにより定量した。蛍光指示薬を含有していないＳｏｒｂｆｉｌシリカゲルの０．１１ｍｍ層でコーティングされた１０×１５ｃｍのＴＬＣプレート(Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, Russia)を使用した。Ｓｏｒｂｆｉｌプレートは、移動相：プロパン−２−オール：酢酸エチル：２５％アンモニア水：水＝４０：４０：７：１６（ｖ／ｖ）で展開した。アセトン中のニンヒドリンの溶液（２％）を可視化試薬として使用した。
【０１３８】
発酵培地の組成（ｇ／ｌ）：
グルコース ４０．０
（ＮＨ4）2ＳＯ4 １６．０
Ｋ2ＨＰＯ4 ０．１
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．０
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１
ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．０１
チアミンＨＣｌ ０．０００２
イーストエキストラクト ２．０
チロシン ０．１２５
ＣａＣＯ3 ２０．０
【０１３９】
グルコース及び硫酸マグネシウムは、個々に滅菌される。ＣａＣＯ3は、１８０℃で２時間乾熱滅菌される。ｐＨは、７．０に調節される。抗生物質は、滅菌後に培地へ導入される。結果を表５に示す。
【０１４０】
【表５】
【０１４１】
表５からわかるように、ｐｇｌ遺伝子の発現増強は、ＡＪ１２７３９株のフェニルアラニン生産を向上させた。
【０１４２】
本発明は、それらの好ましい実施形態を参照して詳述してきたが、本発明の範囲を逸脱することなく、様々な変更を行うことができ、また同等物を用いることができることは、当業者に明らかであろう。本明細書中の引用参照文献はすべて、本出願の一部として参照により援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１４３】
本発明によれば、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンなどのＬ−アミノ酸の生産が増強される。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】細菌野生型のｙｂｈＥ ＯＲＦ周辺のＤＮＡ領域の構造を示す図である。
【図２】ｙｂｈＥ ＯＲＦが欠失した細菌ＤＮＡ領域の構造を示す図である。
【図３】ｙｂｈＡ ＯＲＦが欠失した細菌ＤＮＡ領域の構造を示す図である。
【図４】ｙｂｈＤ ＯＲＦが欠失した細菌ＤＮＡ領域の構造を示す図である。
【図５】ｐｇｉ遺伝子が欠失した細菌ＤＮＡ領域の構造を示す図である。
【図６】ｚｗｆ−ｅｄｄ−ｅｄａオペロンが欠失された細菌ＤＮＡ領域の構造を示す図である。
【図７】ｐｇｌ遺伝子（ｙｂｈＥ ＯＲＦ）の上流に人工プロモーター領域（Ｐtac*）を有する細菌ＤＮＡ領域の構造を示す図である。
【図８】（Ｈｉｓ）６−ＹｂｈＥタンパク質のゲル分離及び精製を示す図である（写真）。Ａ．ＢＬ２１（ＤＥ３）［ｐＥＴ−ＨＴｙｂｈＥ］株の粗製抽出物。レーン１、２、９−タンパク質分子量マーカー；レーン３、４−ＩＰＴＧ誘導無し及び有りでの株の総細胞タンパク質；レーン５、６−ＩＰＴＧ誘導無し及び有りでの株の可溶性分画；レーン７、８−ＩＰＴＧ誘導無し及び有りでの株の不溶性分画。Ｂ．レーン１−ＢＬ２１（ＤＥ３）［ｐＥＴ−ＨＴｙｂｈＥ］株の総細胞タンパク質；レーン２、３、４、６−精製された（Ｈｉｓ）６−ＹｂｈＥの濃度を増大させた；レーン５−タンパク質分子量マーカー。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸内細菌科に属するＬ−アミノ酸生産細菌であって、６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性が増強するように改変された細菌。
【請求項２】
６−ホスホグルコノラクトナーゼ遺伝子の発現が、前記遺伝子のコピー数を増大させることにより、或いは前記遺伝子の発現調節配列を改変することにより増強された、請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
前記遺伝子の野生型のプロモーターが、より強力なプロモーターで置換された、請求項１に記載の細菌。
【請求項４】
前記遺伝子の野生型のＳＤ配列が、より効率的なＳＤ配列で置換された、請求項１に記載の細菌。
【請求項５】
エシェリヒア属、エンテロバクター属、エルビニア属、クレブシエラ属、パントエア属、プロビデンシア属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属及びモルガネラ属から成る群から選択される属に属する、請求項１に記載の細菌。
【請求項６】
前記６−ホスホグルコノラクトナーゼ遺伝子は腸内細菌科細菌に由来する、請求項１から５のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項７】
前記６−ホスホグルコノラクトナーゼ遺伝子は、
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、及び
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入或いは付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性を有するタンパク質
から成る群から選択されるタンパク質をコードする、請求項６に記載の細菌。
【請求項８】
前記６−ホスホグルコノラクトナーゼ遺伝子は、
（ａ）配列番号１におけるヌクレオチド１〜９９３の塩基配列を含むＤＮＡ、及び
（ｂ）配列番号１におけるヌクレオチド１〜９９３の塩基配列又は、該塩基配列から調製することができるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、且つ６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
から成る群から選択される、請求項６に記載の細菌。
【請求項９】
前記ストリンジェントな条件は、１×ＳＳＣに相当する塩濃度及び０．１％ＳＤＳで６０℃で１５分間洗浄することを含む、請求項８に記載の細菌。
【請求項１０】
ｙｄｄＧオープンリーディングフレームの発現が増強するように更に改変された、請求項１に記載の細菌。
【請求項１１】
前記Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンから成る群から選択される芳香族Ｌ−アミノ酸である、請求項１に記載の細菌。
【請求項１２】
培地中で請求項１〜１１のいずれか１項に記載の細菌を培養すること、及び前記培地から前記Ｌ−アミノ酸を回収することを含むＬ−アミノ酸の生産方法。
【請求項１３】
前記Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンから成る群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１】
腸内細菌科に属するＬ−アミノ酸生産細菌であって、６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性が増強するように改変された細菌。
【請求項２】
６−ホスホグルコノラクトナーゼ遺伝子の発現が、前記遺伝子のコピー数を増大させることにより、或いは前記遺伝子の発現調節配列を改変することにより増強された、請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
前記遺伝子の野生型のプロモーターが、より強力なプロモーターで置換された、請求項１に記載の細菌。
【請求項４】
前記遺伝子の野生型のＳＤ配列が、より効率的なＳＤ配列で置換された、請求項１に記載の細菌。
【請求項５】
エシェリヒア属、エンテロバクター属、エルビニア属、クレブシエラ属、パントエア属、プロビデンシア属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属及びモルガネラ属から成る群から選択される属に属する、請求項１に記載の細菌。
【請求項６】
前記６−ホスホグルコノラクトナーゼ遺伝子は腸内細菌科細菌に由来する、請求項１から５のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項７】
前記６−ホスホグルコノラクトナーゼ遺伝子は、
（Ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、及び
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入或いは付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ６−ホスホグルコノラクトナーゼ活性を有するタンパク質
から成る群から選択されるタンパク質をコードする、請求項６に記載の細菌。
【請求項８】
前記６−ホスホグルコノラクトナーゼ遺伝子は、
（ａ）配列番号１におけるヌクレオチド１〜９９３の塩基配列を含むＤＮＡ、及び
（ｂ）配列番号１におけるヌクレオチド１〜９９３の塩基配列又は、該塩基配列から調製することができるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、且つ６−ホスホグルコノラクトナーゼの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
から成る群から選択される、請求項６に記載の細菌。
【請求項９】
前記ストリンジェントな条件は、１×ＳＳＣに相当する塩濃度及び０．１％ＳＤＳで６０℃で１５分間洗浄することを含む、請求項８に記載の細菌。
【請求項１０】
ｙｄｄＧオープンリーディングフレームの発現が増強するように更に改変された、請求項１に記載の細菌。
【請求項１１】
前記Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンから成る群から選択される芳香族Ｌ−アミノ酸である、請求項１に記載の細菌。
【請求項１２】
培地中で請求項１〜１１のいずれか１項に記載の細菌を培養すること、及び前記培地から前記Ｌ−アミノ酸を回収することを含むＬ−アミノ酸の生産方法。
【請求項１３】
前記Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンから成る群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００７−５２３６２５（Ｐ２００７−５２３６２５Ａ）
【公表日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２６８８６（Ｐ２００６−５２６８８６）
【出願日】平成１７年２月２５日（２００５．２．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００３６９５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８０５８３
【国際公開日】平成１７年９月１日（２００５．９．１）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月２５日（２００５．２．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００３６９５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８０５８３
【国際公開日】平成１７年９月１日（２００５．９．１）
【出願人】（０００００００６６）味の素株式会社 (887)
【Ｆターム（参考）】
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