Ｍｄｍ２タンパク質の腫瘍原活性のアンタゴニスト及び癌治療におけるその使用
【課題】過増殖症（癌、再発性狭窄症等）の新規治療方法及び対応する医薬組成物の提供。
【解決手段】無ｐ５３コンテキストの癌の治療用医薬組成物の製造のための、Ｍｄｍ２タンパク質の腫瘍原活性を少なくとも部分的に阻害することが可能な化合物、例えば、Ｍｄｍ２タンパク質の１〜１３４ドメインに対する細胞内抗体、または細胞内抗体をコードする核酸配列、更には、Ｍｄｍ２タンパク質の腫瘍原活性を少なくとも部分的に阻害することが可能な化合物をコードする核酸配列を含むウイルスベクター及び対応する医薬組成物。
【解決手段】無ｐ５３コンテキストの癌の治療用医薬組成物の製造のための、Ｍｄｍ２タンパク質の腫瘍原活性を少なくとも部分的に阻害することが可能な化合物、例えば、Ｍｄｍ２タンパク質の１〜１３４ドメインに対する細胞内抗体、または細胞内抗体をコードする核酸配列、更には、Ｍｄｍ２タンパク質の腫瘍原活性を少なくとも部分的に阻害することが可能な化合物をコードする核酸配列を含むウイルスベクター及び対応する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は過増殖症（癌、再発性狭窄症等）の新規治療方法及び対応する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
大半の癌は１個以上の遺伝子の過剰発現及び／又は１個以上の突然変異もしくは異常遺伝子の発現により出現する遺伝子異常が少なくとも一因であることが現在周知である。例えば、癌遺伝子が発現すると、殆どの場合に癌が発生する。癌遺伝子とは、遺伝的に障害のある遺伝子を意味し、その発現産物は細胞の正常な生物学的機能を妨げ、腫瘍状態を開始する。多数の癌遺伝子がこれまでに同定され、部分的に特性決定されており、特にｒａｓ、ｍｙｃ、ｆｏｓ、ｅｒｂ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｓｒｃ、ｆｍｓ、ｊｕｎ及びａｂｌ遺伝子の突然変異形態は細胞増殖障害の原因であると思われる。
【発明の概要】
【０００３】
正常細胞コンテキストでは、これらの癌遺伝子の増殖はｐ５３やＲｂ等の所謂腫瘍抑制遺伝子の形成により少なくとも部分的に抑制されると思われる。しかし、何らかの現象がこの細胞自己調節メカニズムを乱し、腫瘍状態の発生を助長する場合がある。これらの現象の１つは腫瘍抑制遺伝子レベルの突然変異である。例えば、ｐ５３遺伝子の欠失及び／又は突然変異による突然変異形態はヒト癌の大部分の発生に関与し（Ｂａｋｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４（１９８９）２１７）、Ｒｂ遺伝子の不活化形態は種々の腫瘍、特に網膜芽腫や骨肉腫等の間葉癌の原因に挙げられている。
【０００４】
ｐ５３タンパク質は正常組織の大部分で発現される５３ｋＤの核リンタンパク質である。該タンパク質は細胞周期の制御（Ｍｅｒｃｅｒら， Ｃｒｉｔｉｃ Ｒｅｖ． Ｅｕｃａｒ．Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ，２，２５１，１９９２）、転写調節（Ｆｉｅｌｄｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）２４９，１０４６）、ＤＮＡの複製（ＷｉｌｃｏｑとＬａｎｅ，（１９９１），Ｎａｔｕｒｅ ３４９，４２９０及びＢａｒｇｏｎｎｅｔｔｉら，（１９９２） Ｃｅｌｌ ６５ １０８３）及びアポトーシスの誘導（Ｓｈａｗら，（１９９２）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ ８９，４４９５）に関与する。従って、細胞を例えばそのＤＮＡを損傷することが可能な物質に暴露すると、細胞シグナル伝達カスケードが開始し、ｐ５３タンパク質が転写後修飾され、ｇａｄｄ４５（成長停止及びＤＮＡ損傷）（Ｋａｓｔａｎら，Ｃｅｌｌ，７１，５８７−５９７，１９９２）、ｐ２１ ＷＡＦ／ＣＩＰ（ＥｌＤｅｉｒｙら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５４，１１６９−１１７４，１９９４）又はｍｄｍ２（マウスＤＭ）（Ｂａｒａｋら，ＥＭＢＯ Ｊ．，１２，４６１−４６８，１９９３）等の多数の遺伝子がｐ５３により転写活性化される。
【０００５】
従って、癌発生を理解し、癌に有効な治療方法を開発するためには、特にこの細胞シグナル伝達経路に関与する全タンパク質の種々の生物学的機能、その作用方法及びその特性を解明することが明らかに重要である。
【０００６】
本発明は厳密にはこのコンテキストに該当し、Ｍｄｍ２タンパク質の新規機能を報告する。
【０００７】
Ｍｄｍ２タンパク質はｍｄｍ２（マウスＤＭ２）遺伝子から発現される分子量９０ｋＤのリンタンパク質である。このｍｄｍ２遺伝子は自然腫瘍細胞ＢＡＬＢ／ｃ ３Ｔ３で最初にクローニングされ、過剰発現すると腫瘍原能を著しく増すことが確認されている（Ｃａｈｉｌｌｙ−Ｓｎｙｄｅｒら，Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１３，２３５−２４４，１９８７； Ｆａｋｈａｒｚａｄｅｈら，ＥＭＢＯ Ｊ．１０，１５６５−１５６９，１９９１）。野生型ｐ５３及び突然変異ｐ５３タンパク質を含む複数の細胞系で複合体Ｍｄｍ２／ｐ５３が同定されている（Ｍａｒｔｉｎｅｚら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，５，１５１−１５９，１９９１）。更に、Ｍｄｍ２は筋クレアチンキナーゼのプロモーター等のプロモーター上でｐ５３の転写活性を阻害することが示されており、Ｍｄｍ２はｐ５３の活性を調節するらしい（Ｍｏｍａｎｄら，Ｃｅｌｌ，６９，１２３７−１２４５，１９９２； Ｏｌｉｎｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３６２，８５７−８６０，１９９３）。
【０００８】
以上の結果をまとめると、Ｍｄｍ２タンパク質はこれまで主にｐ５３の活性のモジュレーターとして認められている。Ｍｄｍ２タンパク質は野生型又は突然変異ｐ５３タンパク質と結合することにより、それらの転写活性を阻害し、細胞増殖の抑制を解除する。従って、これらの情報の治療面での応用は、主にＭｄｍ２によるｐ５３タンパク質のこの阻害に対抗する手段を求めることである。
【０００９】
予想外にも、本願出願人はこのＭｄｍ２タンパク質が固有の腫瘍原性、即ちｐ５３タンパク質との複合形態に関連する腫瘍原性とは全く異なる腫瘍原性をもつことを立証した。より詳細には、Ｍｄｍ２タンパク質は無ｐ５３コンテキストで腫瘍原性を発現する。Ｍｄｍ２の腫瘍原性がｐ５３から独立しており、特に野生型ｐ５３のトランス作用活性の阻害に起因しないというこの発見を裏付けるために、本願出願人はそのトランス作用性を維持しながらＭｄｍ２ともはや相互作用しないｐ５３の突然変異体（ｐ５３（１４−１９）； Ｌｉｎら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１９９４，８，１２３５−１２４６）がＭｄｍ２の腫瘍原性を阻害できないことを立証した。更に、Ｍｄｍ２、特にＭｄｍ２の１〜１３４ドメインがｐ１０７の過剰発現により誘導されるＧ１細胞周期の停止を解除できることも判明した。従って、Ｍｄｍ２はｐ５３以外に細胞周期の制御に関与する因子の重要なレギュレーターであることが判明した。
【００１０】
本発明は、配列番号１に示すＭｄｍ２タンパク質の配列のタンパク質配列１〜１３４がこのタンパク質の腫瘍原能を発現するために十分であるという事実の解明の結果でもある。
【００１１】
本発明は更に、Ｍｄｍ２タンパク質と相互作用することが可能な化合物を使用することにより、このタンパク質のこの腫瘍原性を改変できるという事実の解明の結果でもある。本発明は前記化合物を腫瘍に直接ｉｎ ｖｉｖｏ送達し、従って、癌の発生を抑制し得る特に有効なシステムにも関する。従って、本発明は結腸腺癌、甲状腺癌、肺癌腫、骨髄性白血病、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、Ｂリンパ腫、卵巣癌、膀胱癌、グリオブラストーマ等の特に無ｐ５３コンテキストの腫瘍の治療に特に有効な新規アプローチを提供する。
【００１２】
従って、本発明の第１の目的は、無ｐ５３コンテキストの癌の治療用医薬組成物の製造のための、Ｍｄｍ２タンパク質の腫瘍原活性を少なくとも部分的に阻害することが可能な化合物の使用である。
【００１３】
Ｍｄｍ２がｐ５３に固定すると、ｐ５３はその腫瘍抑制機能を発揮できなくなり、細胞はｐ５３で調節されずに成長できるようになるが、本発明の意味では、無ｐ５３コンテキスト癌とはこのような固定以外の任意修飾又は任意メカニズムによりｐ５３がその腫瘍抑制遺伝子機能を発揮できないような癌を意味する。ｐ５３の腫瘍抑制活性を阻害するこれらの修飾又はメカニズムの非限定的な例としては、例えばｐ５３遺伝子の遺伝子改変（点突然変異、欠失等）、Ｍｄｍ２以外のタンパク質との相互作用、ＨＰＶ−１６やＨＰＶ−１８等の危険度の高いヒトパピローマウイルスのＥ６タンパク質の存在に結び付けられるｐ５３タンパク質の非常に迅速なタンパク分解等を挙げることができる。
【００１４】
本発明の意味では、Ｍｄｍ２タンパク質の腫瘍原活性の阻害は２つの方法により達成することができる。
【００１５】
このタンパク質の１〜１３４ドメインのレベルに直接介入することにより阻害を行うのが好ましい。こうすると、このドメインに結合することが可能な任意のタンパク質はＭｄｍ２の腫瘍原性に対して拮抗機能を発揮する。
【００１６】
また、例えば配列番号１の配列に示すＭｄｍ２の１３５〜４９１ドメインや配列番号１の配列に示すそのＣ末端配列等の隣接ドメインと化合物の相互作用によってもこの阻害効果を達成することができる。従って、本発明はこのドメインと直接相互作用しないものであっても、その腫瘍原性を改変できるものであれば、任意の化合物の使用を包含する。
【００１７】
特定態様によると、本発明は無ｐ５３コンテキストの癌の治療用医薬組成物を製造するための、配列番号１に示すＭｄｍ２タンパク質の配列の１〜１３４ドメインのレベルに結合することが可能な化合物の使用に関する。
【００１８】
Ｍｄｍ２タンパク質の１〜１３４ドメインのレベルに直接相互作用することが可能な化合物としては、特にこのドメインに特異的なｓｃＦＶが挙げられる。
【００１９】
ｓｃＦＶは抗体と同等の結合性をもつ細胞内活性分子である。より詳細には、抗体のＨ鎖の可変領域の結合部位に対応するペプチドにペプチドリンカーを介して結合した抗体のＬ鎖の可変領域の結合部位に対応するペプチドから構成される分子である。このようなｓｃＦＶは遺伝子導入によりｉｎ ｖｉｖｏ生産できることが本願出願人により示されている（国際出願公開第ＷＯ９４／２９４４６号参照）。
【００２０】
前記化合物としては、Ｍｄｍ２の１〜１３４ドメインと特異的に結合できることが既に知られているペプチド又はタンパク質も利用でき、例えば配列番号１とのｐ５３タンパク質の結合ドメインの全部又は一部、より詳細には配列番号２（Ｏｌｉｎｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，１９９３，３６２，８５７−８６０）に示すｐ５３の配列のペプチド１〜５２、１〜４１及び６〜４１の１種の全部又は一部、より単純なものでは、厳密にマッピングされたペプチド１６〜２５の全部又は一部（Ｌａｎｅら，Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ Ｂ．，１９９５，３４７，８３−８７）、ヒト又はマウスｐ５３のペプチド１８〜２３、更にはＭｄｍ２との相互作用に必須の残基を保存した上記ペプチドの近傍の誘導ペプチド（Ｐｉｃｋｓｌｅｙら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９４，９，２５２３−２５２９）である。
【００２１】
本発明によると、配列番号１に示すＭｄｍ２の１〜１３４ドメインの近傍のドメインに結合することが可能であり、この結合によりＭｄｍ２タンパク質の腫瘍原活性を改変する化合物も利用できる。このような化合物としては、例えば転写因子ＴＦＩＩ、ＴＢＰ及びＴａＦ２５０のように前記タンパク質のＣ末端ドメインのレベルに相互作用する化合物や、例えばタンパク質Ｌ５（リボソームタンパク質）及びＲｂ（網膜芽腫タンパク質）や転写因子Ｅ２Ｆ（Ｒｂにより調節される）のように配列番号１に示すＭｄｍ２の１３５〜４９１ドメインのレベルに相互作用するタンパク質を挙げることができる。
【００２２】
本発明の別の目的は、癌治療用医薬組成物を製造するための、配列番号１に示すＭｄｍ２タンパク質の配列のこの１〜１３４ドメインに特異的なｓｃＦＶの使用にも関する。
【００２３】
本発明の意味では、上記相互作用全体が結果的にＭｄｍ２の腫瘍原性を改変するとみなす。更に、Ｍｄｍ２タンパク質との結合ドメインの１つに対して活性な部分を利用し且つこの相互作用が該タンパク質の腫瘍原性の改変をもたらすものであれば、これらのタンパク質の全体又は一部を使用してもよい。
【００２４】
本発明の範囲では、これらの化合物はそのまま使用してもよいが、ｉｎ ｖｉｖｏ発現を可能にする遺伝子構築物の形態で使用すると有利である。
【００２５】
本発明の特に有利な実施態様は、無ｐ５３コンテキストの癌の治療用医薬組成物を製造するために、Ｍｄｍ２タンパク質の腫瘍原活性を少なくとも部分的に阻害することが可能な化合物をコードする核酸配列を利用する。
【００２６】
この観点では、本発明の範囲で使用される核酸は種々の型のものを利用できる。好ましい例としては、アンチセンス核酸、Ｍｄｍ２タンパク質のドメインの１つに直接固定し、その腫瘍原活性を阻害することが可能なオリゴリボヌクレオチド（リガンドオリゴヌクレオチド）、Ｍｄｍ２のドメインの１つとオリゴマーを形成し、その腫瘍原活性を阻害することが可能なペプチド又はタンパク質の全部又は一部をコードする核酸、Ｍｄｍ２タンパク質の配列番号１の配列の１〜１３４ドメインに対する細胞内抗体をコードする核酸（例えば抗体に由来する可変フラグメント単一鎖）が挙げられる。
【００２７】
本発明の特定態様によると、核酸はアンチセンス核酸である。このアンチセンスは、Ｍｄｍ２タンパク質をコードする核酸に相補的であって、その転写及び／又はその翻訳を阻害することが可能なＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ）又はリボザイムをコードするＤＮＡである。
【００２８】
最近になって、標的遺伝子の発現を調節することが可能な新規種の核酸が報告された。これらの核酸は細胞ｍＲＮＡとハイブリダイズせずに、２本鎖ゲノムＤＮＡと直接ハイブリダイズする。この新規アプローチは、所定の核酸がＤＮＡの二重螺旋の大きい溝で特異的に相互作用して局所的に三重螺旋を形成することが可能であり、その結果、標的遺伝子の転写を阻害するという事実の解明に基づく。これらの核酸はオリゴプリン−オリゴピリミジン配列のレベル、即ち一方の鎖上にオリゴプリン配列をもち、相補鎖上にオリゴピリミジン配列をもつ領域のレベルでＤＮＡの二重螺旋を選択的に認識し、このレベルで局所的に三重螺旋を形成する。第３の鎖（オリゴヌクレオチド）の塩基はワトソン・クリック塩基対のプリンと水素結合（フーグスティーン又は逆フーグスティーン結合）を形成する。このような核酸は特にＰｒ．ＨｅｌｅｎｅによりＡｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇ ｄｅｓｉｇｎ ６（１９９１）５６９に記載されている。
【００２９】
本発明によるアンチセンス核酸はアンチセンスＲＮＡ又はリボザイムをコードするＤＮＡ配列であり得る。こうして生産されるアンチセンスＲＮＡはｍＲＮＡ又は標的ゲノムＤＮＡと相互作用し、二重又は三重螺旋を形成することができる。前記アンチセンス核酸は、標的遺伝子又はＲＮＡと直接相互作用することが可能な、場合により化学的に修飾されたアンチセンス配列（オリゴヌクレオチド）でもよい。
【００３０】
同様に本発明の好適実施態様によると、核酸は場合により化学的に修飾された上記のようなアンチセンスオリゴヌクレオチドである。特に、ホスホジエステル骨格が化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドを挙げることができ、例えばオリゴヌクレオチドホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート及びホスホロチオエートであり、このような化合物は例えば国際出願公開第ＷＯ９４／０８００３号に記載されている。αオリゴヌクレオチドや、アクリル化合物等の物質に結合したオリゴヌクレオチドでもよい。
【００３１】
本発明の意味では、リガンドオリゴヌクレオチドとは、その腫瘍原機能を阻害するためにＭｄｍ２タンパク質に特異的に固定することが可能なオリゴリボヌクレオチド又はオリゴデオキシリボヌクレオチドを意味する。このようなヌクレオチドは例えばＳＥＬＥＸ法（Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９２，１０，１３７−１４０；米国特許第５，２７０，１６３号及び国際出願公開第ＷＯ９１／１９８１３号）等の「ｉｎ ｖｉｔｒｏ進化」技術により得られる。
【００３２】
より一般には、これらの核酸はヒト、動物、植物、細菌、ウイルス、合成等の起源であり得る。これらの核酸は当業者に公知の任意技術により得られ、特にライブラリーのスクリーニング、化学的合成、又はライブラリーのスクリーニングにより得られた配列の化学的もしくは酵素修飾を含む混合法により得られる。
【００３３】
後述するように、核酸はプラスミド、ウイルス又は化学的ベクター等のベクターに組み込むことができる。また、国際出願公開第ＷＯ９０／１１０９２号に記載の技術に従って裸のＤＮＡ形態でそのまま投与してもよいし、例えばＤＥＡＥ−デキストラン（Ｐａｇａｎｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１（１９６７）８９１）、核タンパク質（Ｋａｎｅｄａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３（１９８９）３７５）、カチオン脂質もしくはポリマー（Ｆｅｌｇｎｅｒら，ＰＮＡＳ ８４（１９８７）７４１３）との複合形態で投与してもよいし、リポソーム形態（Ｆｒａｌｅｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（１９８０）１０４３１）で投与してもよい。
【００３４】
本発明の範囲で使用される配列はベクターの一部を構成することが好ましい。このようなベクターを使用すると、治療しようとする細胞への核酸の投与を実際に改善できると共に、前記細胞におけるその安定性を増し、持続的治療効果が得られる。更に、同一ベクターに複数の核酸配列を導入し、同様に治療効果を増すことも可能である。
【００３５】
使用するベクターは動物細胞、好ましくはヒト癌細胞を形質転換できるものであれば、種々の起源のものでよい。本発明の好適実施態様によると、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はヘルペスウイルスから選択され得るウイルスベクターを使用する。
【００３６】
この点で、本発明はＭｄｍ２タンパク質の腫瘍原性を少なくとも部分的に阻害することが可能な化合物をコードする核酸をそのゲノムに挿入してなる任意ウイルスベクターにも関する。
【００３７】
より詳細には、本発明はその腫瘍原能を改変するようにＭｄｍ２タンパク質と結合することが可能な化合物をコードする核酸配列を含む任意組換えウイルスに関する。このコンテキストでは、核酸配列は上記ペプチド、タンパク質又は転写因子をコードすることができる。
【００３８】
より好ましくは、この核酸配列はｓｃＦＶ又はペプチド（Ｍｄｍ２タンパク質の１〜１３４ドメイン（配列番号１）のレベルに相互作用することが可能な）をコードする。
【００３９】
本発明の範囲で使用されるウイルスは好ましくは欠損ウイルスであり、即ち感染細胞で自律的に複製できないウイルスを使用すると有利である。従って、一般に本発明の範囲で使用される欠損ウイルスのゲノムは少なくとも感染細胞で該ウイルスの複製に必要な配列を欠失している。これらの領域は（完全に又は部分的に）除去してもよいし、非機能的にしてもよいし、他の配列、特にＭｄｍ２タンパク質の腫瘍原性に対する拮抗機能をもつ化合物をコードする配列で置換してもよい。但し、欠損ウイルスはウイルス粒子のキャプシド化に必要なそのゲノムの配列を保存していることが好ましい。
【００４０】
特にアデノウイルスについては、構造と性質が少しずつ異なる種々の血清型が特性決定されている。これらの血清型のうち、本発明の範囲内では２もしくは５型ヒトアデノウイルス（Ａｄ２又はＡｄ５）又は動物由来のアデノウイルス（仏国特許出願第９３０５９５４号参照）を使用するのが好ましい。本発明の範囲内で使用可能な動物由来のアデノウイルスのうちでは、イヌ、ウシ、マウス（例えばＭＡＶ１，Ｂｅａｒｄら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５（１９９０）８１）、ヤギ、ブタ、トリ又はサル（例えばＳＡＶ）由来のアデノウイルスを挙げることができる。好ましくは、動物由来のアデノウイルスはイヌアデノウイルス、より好ましくはアデノウイルスＣＡＶ２［例えばマンハッタン株又はＡ２６／６１（ＡＴＣＣ ＶＲ−８００）］である。好ましくは、本発明の範囲内ではヒトもしくはイヌ由来又は混合アデノウイルスを使用する。
【００４１】
好ましくは、本発明の欠損アデノウイルスは、ＩＴＲとキャプシド化のための配列とカルパインのモジュレーターをコードする配列を含む。より好ましくは、本発明のアデノウイルスのゲノムにおいて、Ｅ１遺伝子とＥ２、Ｅ４、Ｌ１〜Ｌ５遺伝子の少なくとも１個は非機能的である。該当ウイルス遺伝子は当業者に公知の任意の方法、特に完全抑制、置換、部分欠失、又は該当遺伝子に１個以上の塩基を付加することにより非機能的にすることができる。このような修飾は、例えば遺伝子工学技術又は突然変異誘発物質で処理することによりｉｎ ｖｉｔｒｏ（単離したＤＮＡで）又はｉｎ ｓｉｔｕで得られる。
【００４２】
本発明による組換え欠損アデノウイルスは当業者に公知の任意の技術により作製することができる（Ｌｅｖｒｅｒｏら，Ｇｅｎｅ １０１（１９９１）１９５，ヨーロッパ特許第１８５５７３号； Ｇｒａｈａｍ，ＥＭＢＯ Ｊ．３（１９８４）２９１７）。特に、アデノウイルスと特にＥＴＳの阻害剤をコードするＤＮＡ配列をもつプラスミドの相同組換えにより作製することができる。相同組換えは適当な細胞系に前記アデノウイルスとプラスミドを共トランスフェクション後に生じる。使用する細胞系は、（ｉ）前記エレメントにより形質転換可能であること、及び（ｉｉ）組換えの危険を避けるために好ましくは組込み形態で欠損アデノウイルスのゲノムの部分を相補することが可能な配列を含んでいることが好ましい。細胞系の例としては、特にアデノウイルスＡｄ５のゲノムの左側部分（１２％）をそのゲノムに組込んだヒト胎児腎細胞２９３系（Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９）を挙げることができる。アデノウイルスから誘導されるベクターの構築ストラテジーは、仏国特許出願第９３０５９５４号及び９３０８５９６号にも記載されている。
【００４３】
その後、増殖したアデノウイルスを実施例に記載するように慣用分子生物学技術により回収及び精製する。
【００４４】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、比較的小寸法のＤＮＡをもつウイルスであり、これに感染する細胞のゲノムに安定的且つ部位特異的に組込まれる。アデノ随伴ウイルスは細胞増殖、形態又は分化に影響することなく広範な細胞に感染することができる。また、ヒトで疾病に関与しないと思われる。ＡＡＶのゲノムは既にクローニングされ、配列及び特性を決定されている。ゲノムは約４７００塩基を含み、ウイルスの複製起点として機能する約１４５塩基の逆方向反復領域（ＩＴＲ）を各末端に含む。ゲノムの残余はキャプシド化機能をもつ２つの主領域に分けられ、ゲノムの左側部分はウイルス複製とウイルス遺伝子の発現に関与するｒｅｐ遺伝子を含み、ゲノムの右側部分はウイルスのキャプシドタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を含む。
【００４５】
ＡＡＶから誘導されるベクターを遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ導入に利用することは文献に記載されている（特に国際出願公開第ＷＯ９１／１８０８８号、ＷＯ９３／０９２３９号、米国特許第４，７９７，３６８号、５，１３９，９４１号、ヨーロッパ特許第４８８５２８号参照）。これらの文献は、ＡＡＶから誘導され、ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子を欠失し、着目遺伝子で置換された種々の構築物と、前記着目遺伝子を（培養細胞に）ｉｎ ｖｉｔｒｏ又は（生物に直接）ｉｎ ｖｉｖｏ導入するためのその使用について記載している。本発明による組換え欠損ＡＡＶは、ヒトヘルパーウイルス（例えばアデノウイルス）に感染させた細胞系に、ＡＡＶの２つの逆方向反復領域（ＩＴＲ）で挟まれたＥＴＳの阻害剤をコードする配列を含むプラスミドと、ＡＡＶのキャプシド化遺伝子（ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子）をもつプラスミドを共トランスフェクトすることにより作製することができる。生成した組換えＡＡＶをその後、慣用技術により精製する。
【００４６】
ヘルペスウイルスとレトロウイルスに関しては、組換えベクターの構築について文献に広く記載されており、特にＢｒｅａｋｆｉｅｌｄら，Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ ３（１９９１）２０３； ヨーロッパ特許第４５３２４２号及び１７８２２０号、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら，Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．７（１９８５）２３５； ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３（１９８５）６８９等を参照されたい。特に、レトロウイルスは分裂細胞に選択的に感染する組込みウイルスである。従って、癌に適用するのに有利なベクターである。レトロウイルスのゲノムは主に２つのＬＴＲと、キャプシド化配列と、３つのコーディング領域（ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ）を含む。レトロウイルスから誘導される組換えベクターでは、一般にｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子が完全又は部分的に欠失しており、着目異種核酸配列で置換されている。これらのベクターは種々の型のレトロウイルスから作製することができ、特にＭｏＭｕＬＶ（「モロニーマウス白血病ウイルス」、別称ＭｏＭＬＶ）、ＭＳＶ（「モロニーマウス肉腫ウイルス」）、ＨａＳＶ（「ハーベー肉腫ウイルス」）、ＳＮＶ（「脾壊死ウイルス」）、ＲＳＶ（「ラウス肉腫ウイルス」）又はフレンドウイルス等のレトロウイルスから得られる。
【００４７】
着目配列を含む組換えレトロウイルスを構築するためには、特にＬＴＲとキャプシド化配列と前記着目配列を含むプラスミドを構築した後、このプラスミドを使用して、欠損レトロウイルス機能をプラスミドにトランス導入することが可能な所謂キャプシド化細胞系にトランスフェクトする。従って、一般にキャプシド化系はｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を発現させることができる。このようなキャプシド化系は従来技術に記載されており、特にＰＡ３１７系（米国特許第４，８６１，７１９号）、ＰｓｉＣＲＩＰ系（ＷＯ９０／０２８０６）及びＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２系（ＷＯ８９／０７１５０）が挙げられる。更に、組換えレトロウイルスは転写活性を抑制するようにＬＴＲのレベルに修飾を含んでいてもよいし、ｇａｇ遺伝子の一部を含む拡張キャプシド化配列も含んでいてもよい（Ｂｅｎｄｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１（１９８７）１６３９）。生成した組換えレトロウイルスをその後、慣用技術により精製する。
【００４８】
本発明のベクターでは、Ｍｄｍ２の腫瘍原性に対する拮抗性をもつ化合物をコードする配列を、腫瘍細胞で発現できるようにするシグナルの制御下におくと有利である。このようなシグナルは、異種発現シグナル、即ち阻害剤の発現に天然に関与するシグナルとは異なるシグナルが好ましい。これらは、特に、他のタンパク質の発現に関与する配列又は合成配列であり得る。特に、真核生物又はウイルス遺伝子のプロモーター配列であり得る。例えば、感染させたい細胞のゲノムに由来するプロモーター配列であり得る。また、使用するウイルスも含めてウイルスのゲノムに由来するプロモーター配列でもよい。この点では、例えばプロモーターＥ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶ、ＬＴＲ−ＲＳＶ等を挙げることができる。更に、活性化配列、調節配列又は組織特異的発現を可能にする配列を加えてこれらの発現配列を修飾してもよい。実際に、ウイルスが腫瘍細胞に有効に感染したときのみにＤＮＡの配列が発現されてその効果を発揮するように、腫瘍細胞で特異的又は主に活性な発現シグナルを使用すると特に有利であり得る。
【００４９】
特定実施態様では、本発明はＭｄｍ２の腫瘍原性に対して拮抗性をもつ化合物をコードするｃＤＮＡ配列を好ましくはＬＴＲ−ＲＳＶ及びＣＭＶプロモーターから選択されるウイルスプロモーターの制御下に含む組換え欠損ウイルスに関する。
【００５０】
同様に好適態様において、本発明はＭｄｍ２の腫瘍原性に対して拮抗性をもつ化合物をコードするＤＮＡ配列を腫瘍細胞で主に発現できるようにするプロモーターの制御下に含む組換え欠損ウイルスに関する。
【００５１】
本発明の意味では、他の細胞種にも残留発現が観察されるとしても、腫瘍細胞での発現レベルのほうが高い場合に主な発現とみなす。
【００５２】
本発明は、一般に癌治療用の医薬組成物の製造のための、配列番号１に示すＭｄｍ２タンパク質の配列の１〜１３４ドメインに対する細胞内抗体又はｓｃＦＶをコードする核酸の使用にも及ぶ。
【００５３】
本発明は更に、Ｍｄｍ２タンパク質の腫瘍原活性を阻害することが可能な化合物又は該化合物をコードする核酸配列を含む任意医薬組成物にも関する。本発明の特定実施態様によると、前記組成物は１種以上の上記のような組換え欠損ウイルスを含む。これらの医薬組成物は、局所、経口、非経口、鼻孔内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、経皮等の経路で投与するように調剤することができる。好ましくは、本発明の医薬組成物は、特に患者の腫瘍に直接注射するための注射用製剤に医薬的に許容可能なキャリヤーを含む。特に、滅菌等張溶液、又は場合に応じて滅菌水もしくは生理的血清を加えて注射可能な溶質を構成できる乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物が挙げられる。患者の腫瘍に直接注射すると、患部組織のレベルに治療効果を集中できるので有利である。
【００５４】
注射に使用する組換え欠損ウイルスの用量は種々のパラメーター、特に使用する投与方法、該当疾病、又は所望の治療期間に応じて適応できる。一般に、本発明による組換えアデノウイルスは１０４〜１０１４ｐｆｕ／ｍｌ、好ましくは１０６〜１０１０ｐｆｕ／ｍｌの用量で調剤及び投与される。ｐｆｕ（「プラーク形成単位」）なる用語はウイルス溶液の感染能に対応し、適当な細胞培養物の感染により測定され、一般に４８時間後の感染細胞のプラーク数を表す。ウイルス溶液のｐｆｕ力価の測定方法は文献に詳細に記載されている。レトロウイルスについては、本発明による組成物はその移植用の産生細胞を直接含むことができる。
【００５５】
本発明による医薬組成物はＭｄｍ２タンパク質の腫瘍原活性を中和し、その結果、所定の細胞種の増殖を制御するために特に有利である。
【００５６】
特に、これらの医薬組成物は例えば結腸腺癌、甲状腺癌、肺癌腫、骨髄性白血病、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、Ｂリンパ腫、卵巣癌、膀胱癌、グリオブラストーマ等の無ｐ５３癌の治療に適している。
【００５７】
本発明は過増殖（即ち異常増殖）細胞を死滅させるためにｉｎ ｖｉｖｏで有利に使用される。従って、本発明は腫瘍細胞又は血管壁の平滑筋細胞（再発性狭窄症）を死滅させるのに利用できる。
【００５８】
本発明の他の利点は、非限定的な例示とみなすべきである以下の実施例及び図面に明示される。
【００５９】
一般分子生物学技術
プラスミドＤＮＡの分取抽出、プラスミドＤＮＡの塩化セシウム勾配遠心分離、アガロース又はアクリルアミドゲル電気泳動、ＤＮＡフラグメントの電気溶離精製、タンパク質のフェノール又はフェノール−クロロホルム抽出、塩類溶媒中のＤＮＡのエタノール又はイソプロパノール沈降、大腸菌での形質転換等の分子生物学で慣用的に使用されている方法は当業者に周知であり、文献に詳細に記載されている［Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８２； Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ら（編），“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７］。
【００６０】
連結については、ＤＮＡフラグメントをアガロース又はアクリルアミドゲル電気泳動によりその寸法に応じて分離し、フェノール又はフェノール／クロロホルム混合物で抽出し、エタノール沈降させた後、製造業者の指示に従ってファージＴ４（Ｂｉｏｌａｂｓ）のＤＮＡリガーゼの存在下でインキュベートする。
【００６１】
付着５’末端の充填は製造業者の指示に従って大腸菌（Ｂｉｏｌａｂｓ）のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメントにより実施できる。付着３’末端の破壊は、ファージＴ４（Ｂｉｏｌａｂｓ）のポリメラーゼＤＮＡを製造業者の指示に従って使用することにより実施される。付着５’末端の破壊はヌクレアーゼＳ１処理により実施される。
【００６２】
合成オリゴヌクレオチドによるｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発は、Ａｍｅｒｓｈａｍから市販されているキットを使用することにより、Ｔａｙｌｏｒら［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３（１９８５）８７４９−８７６４］により開発された方法に従って実施することができる。
【００６３】
所謂ＰＣＲ法［Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０（１９８５）１３５０−１３５４； Ｍｕｌｌｉｓ Ｋ．Ｂ．とＦａｌｏｏｎａ Ｆ．Ａ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５５（１９８７）３３５−３５０］によるＤＮＡフラグメントの酵素増幅は、「ＤＮＡサーマルサイクラー」（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を製造業者の指示に従って使用することにより実施することができる。ゲノムＤＮＡの増幅はより詳細には、適当なプローブを使用して１００℃で５分間、９５℃で１分間を３０サイクル、５８℃で２分間、次いで７２℃で３分間の条件下で実施される。増幅産物はゲル電気泳動により分析する。
【００６４】
ヌクレオチド配列の確認は、Ａｍｅｒｓｈａｍにより市販されているキットを使用することにより、Ｓａｎｇｅｒら［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４（１９７７）５４６３−５４６７］により開発された方法により実施することができる。
【００６５】
材料と方法：
１．使用した構築物：
−プラスミドｐＢＫＣＭＶはＳｔｒａｔａｇｅｎｅの市販品であり、ネオマイシン耐性遺伝子を含む。
−夫々野生型ｐ５３及びｐ５３ Ｒ２７３ＨをコードするプラスミドｐＣ５３Ｃ１Ｎ３及びｐ５３−４．２．Ｎ３はＡ．Ｌｅｖｉｎｅ（Ｈｉｎｄｓら，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆ．（１９９０），１，５７１）に由来する。
−プラスミドｐＢＫｐ５３（Ｒ２７３Ｈ）はヒトミニ遺伝子ｐ５３を含む。このプラスミドはｐＣ５３−４．２．Ｎ３から得た。
−プラスミドｐＢＫＭｄｍ２はβグロビンをコードする配列の末端の非翻訳領域とそれに続くＭｄｍ２をコードする配列から構成されるコーディングカセットをｐＢＫＣＭＶにクローニングすることにより得た。
−プラスミドｐＧＫｈｙｇｒｏはハイグロマイシン耐性遺伝子の発現を可能にする（Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８，６４９−６５１）。
−プラスミドｐＣＭＶＮｅｏＢａｍはネオマイシン耐性遺伝子を発現させる（Ｈｉｎｄｓら（１９９０）Ｃｅｌｌ．Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆ．，１，５７１−５８０）。
−プラスミドｐＣＭＶｐ１０７及びｐＣＭＶＣＤ２０はｐ１０７タンパク質とＣＤ２０表面マーカーの発現を可能にする（Ｚｈｕら（１９９３）Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，７，１１１１−１１２５）。
−プラスミドｐＣＭＶＥ２Ｆ−４及びｐＣＭＶＥ２Ｆ−５はＥ２Ｆ−４及びＥ２Ｆ−５タンパク質の発現を可能にする（Ｓａｒｄｅｔら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ．，９２，２４０３−２４０７）。
−プラスミドｐＬｅｘＡ、ｐＬｅｘＡ（６−４１）、ｐＬｅＸＡ（１６−２５）は遊離又はｐ５３（６−４１）もしくはｐ５３（１６−２５）とフェーズを合せて融合したＬｅｘＡのＤＮＡ（アミノ酸１〜８７）への付着のためのドメインの発現を可能にする。ｐＬｅｘＡ（６−４１）及びｐＬｅＸＡ（１６−２５）はＬＧＭＥ（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ）で構築されたプラスミドｐＬｅｘＡｐｏｌｙＩＩから得た。
−ｐ１０７の真核生物発現プラスミド：ｐ１０７（３８５−１０６８）、ｐ１０７（１−７８１）及びｐ１０７（７８１−１０６８）（Ｚｈｕら，ＥＭＢＯ Ｊ．１４（１９９５）１９０４）。
−プラスミドｐＳＧＫ１ＨＡｐ１０７はｐ１０７のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ発現を可能にする。ｐ１０７はＫｏｚａｋ配列のコンテキストに含まれ、エピトープＨＡはｐ１０７のＣ末端に融合発現される。
−プラスミドｐＢＣ−ＭＤＭ２及びｐＢＣ−ＭＤＭ２（１−１３４）はＭＤＭ２及びＭＤＭ２（１−１３４）をｐＢＣにクローニングすることにより得た（Ｃｈａｔｔｏｎら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １８（１９９５）１４２）。
−プラスミドｐＧｅｘ−ＭＤＭ２及びｐＧｅｘ−ＭＤＭ２（１−１７７）はＭＤＭ２及びＭＤＭ２（１−１７７）をｐＧｅｘにクローニングすることにより得た。
【００６６】
２．方法：
ｐ５３の発現はモノクローナル抗体Ｄ０１を使用して全細胞抽出物でウェスタンブロッティングにより測定する。
【００６７】
Ｍｄｍ２タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現は半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより評価する。
【００６８】
ＤＮＡが汚染されていないことはＰＣＲにより確認する。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】Ｍｄｍ２タンパク質Ａ〜Ｆの模式図。
【図２】種々のＭｄｍ２タンパク質を発現するプラスミドによるＳａｏｓ−２細胞のトランスフェクションのグラフ。
【図３ａ】種々のｐ５３によるＭｄｍ２の形質転換性の阻害を示す模式図。
【図３ｂ】種々のｐ５３によるＭｄｍ２の形質転換性の阻害を示す模式図。
【図４】細胞周期に及ぼすＭｄｍ２過剰発現の効果。
【図５】細胞周期に及ぼすＭｄｍ２過剰発現の効果。
【００７０】
実施例１：Ｍｄｍ２の形質転換性の立証
Ｓａｏｓ−２細胞にプラスミドｐＢＫＭＤＭ２、対照プラスミドｐＢＫｐ５３（Ｒ２７３Ｈ）又はｐ５３−対照プラスミドｐＢＫＣＭＶをトランスフェクトした後、ゲネチシン４１８（Ｇ４１８）耐性を選択する。
【００７１】
第１の試験では、クローンを個々に選択して増殖させ、他の２つの試験ではクローンを単離せずに軟質寒天培地で培養する。
【００７２】
このために、０．３７５％軟質寒天に細胞１０４個を２回接種する。２４時間後に５０個を上回る細胞を含むコロニーの合計数と、コロニー当たりの細胞数（コロニー寸法）を測定する。各値は夫々２回ずつ実施した４回の実験の平均に対応する。得られた結果を表Ｉに示す。Ｍｄｍ２に対応する試験１のクローンをＭ１〜Ｍ６、ｐ５３（Ｒ２７３Ｈ）のクローンをｐ５３−１〜ｐ５３−６、対照クローンをＣｏ１〜Ｃｏ５として示す。
【００７３】
予想通り、Ｃｏ１とＣｏ４はトランスフェクトしたＭｄｍ２を発現せず、Ｃｏ１〜３はｐ５３タンパク質を発現しない。
【００７４】
【表１】
【００７５】
実施例２：配列番号１のＭｄｍ２のＮ末端領域（１〜１３４）はＳａｏｓ−２細胞の軟質寒天増殖を刺激するのに必要且つ十分である。
【００７６】
ｎｅｏ耐性と図１に示すＭｄｍ２タンパク質Ａ〜Ｆを同時に発現するプラスミドｐＢＫＣＭＶ又はブランク対照プラスミドｐＢＫＣＭＶをＳａｏｓ−２細胞にトランスフェクトした後、Ｇ４１８耐性を選択する。生存細胞を集めて増幅後、軟質寒天コロニー形成を試験する。図２の結果は軟質寒天で形成されたクローン数を完全Ｍｄｍ２（Ａ）のクローン数の相対値として表す。これらの結果は、構築物に応じて３〜７個の異なる細胞プールを試験した独立トランスフェクションを表す２回の実験の結果である。これらの結果から明らかなように、Ｍｄｍ２のＮ末端ドメインは腫瘍原性をもつ。最も有効な構築物は全タンパク質に対応する。
【００７７】
実施例３：野生型ｐ５３、ｐ５３突然変異体及びｐ５３フラグメントによるＭｄｍ２の腫瘍原性の復帰
Ｍｄｍ２で形質転換した１群のＳａｏｓ−２細胞にプラスミ
ドｐＧＨｈｙｇｒｏと、ｐＣ５３Ｃ１Ｎ３（ｐ５３）、ｐＣ５３−４．２．Ｎ３、ｐ５３（Ｒ２７３Ｈ）、ｐ５３（１−５２）、ｐＬｅｘＡ（６−４１）、ｐＬｅｘＡ（１６−２５）、ｐＬｅｘＡ、ｐ５３（Ｌ１４Ｑ，Ｆ１９Ｓ）、ｐ５３（Ｌ２２Ｑ，Ｗ２３Ｓ）とｐＣＭＶＮｅｏＢａｍとのどちらかとを共トランスフェクトした後、Ｇ４１８の存在下でハイグロマイシン耐性を選択する。耐性細胞の独立プール３〜５個からの細胞１０００００個を軟質寒天（０．３７５％）に２回接種する。２５日間培養後に、少なくとも５０個の細胞を含むコロニーを数える。図３は代表的実験の結果と、Ｍｄｍ２の形質転換性の阻害を試験した種々のｐ５３の模式図を示す。この実験から明らかなように、Ｍｄｍ２タンパク質に結合することが可能なタンパク質の発現を可能にする構築物しかＭｄｍ２の腫瘍原性を阻害せず、この場合にはｐ５３、ｐ５３Ｒ２７３Ｈ、ｐ５３（１−５２）、ＬｅｘＡ（６−４１）、ＬｅｘＡ（１６−２５）である。他方、Ｍｄｍ２と結合する能力を失ったことが判明した二重突然変異体（Ｌｉｎら，Ｇｅｎｅ Ｄｅｖ．，１９９４，８，１２３５−１２４６）は阻害効果をもたない。野生型ｐ５３のトランス作用性を維持した突然変異体ｐ５３（１４−１９）がＭｄｍ２による形質転換を阻害しないという事実は、Ｍｄｍ２の腫瘍原性がＭｄｍ２によるｐ５３のトランス作用性の阻害から独立していることを裏付けるものである。
【００７８】
実施例４：Ｍｄｍ２はＳａｏｓ−２細胞でｐ１０７により誘導されるＧ１細胞周期の遮断を阻害する。
【００７９】
（ｉ）ＣＤ−２０の発現用プラスミド（ＣＤ−２０細胞表面マーカーをコードするｐＣＭＶＣＤ２０ ２μｇ）、（ｉｉ）コーディング配列をもたないか、又はＭｄｍ２（ＰＢＫＣＭＶＭｄｍ２）、Ｍｄｍ２の１〜１３４ドメイン（ＰＢＫＣＭＶＭｄｍ２（１−１３４））、Ｅ２Ｆ−４（ｐＣＭＶＥ２Ｆ−４）もしくはＥ２Ｆ−５（ｐＣＭＶＥ２Ｆ−５）をコードするＣＭＶ（サイトメガロウイルスのプロモーター）型の発現プラスミド（９μｇ）、及び（ｉｉｉ）ｐ１０７の発現ベクター（ｐＣＭＶｐ１０７、９μｇ）の３種のプラスミドをＳａｏｓ−２細胞に共トランスフェクトする。その後、Ｚｈｕら，Ｇｅｎｅ Ｄｅｖ．，１９９３，７，１１１１−１１２５に記載されているようにＦＡＣＳｃａｎにより分析するために細胞を処理する。代表的実験の結果を図４に示す。同図から明らかなように、ｐ１０７の過剰発現の不在下ではＭｄｍ２又はその１〜１３４ドメインの発現は細胞周期に無効である。他方、Ｍｄｍ２と効力をもつその１〜１３４ドメインの発現はｐ１０７により誘導されるＧ１細胞周期の停止を解除することができる。本実施例から明らかなように、Ｍｄｍ２はｐ５３のトランス作用活性の阻害剤であるばかりでなく、細胞周期の制御に関与する因子を阻害することが可能な細胞周期の正のレギュレーターでもある。
【００８０】
同様の実験で、ｐ１０７（３８５−１０６８）１μｇ、ｐＣＭＶＮｅｏＢａｍ ８μｇ、ｐＸＪＭＤＭ２ １μｇ、ｐＸＪ４１ ８μｇ及びｐＣＭＶＣＤ２０ ２μｇをＳａｏｓ−２細胞にコトランスフェクトする。代表的実験の結果を図５に示す。これらの結果から明らかなように、ＭＤＭ２の発現はｐ１０７及びＭＤＭ２と相互作用することが可能な欠失突然変異体ｐ１０７（３８５−１０６８）により誘導されるＧ１遮断を解除することができる。
【００８１】
実施例５：Ｍｄｍ２はｐ１０７とｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ相互作用する。
【００８２】
本実施例はＭｄｍ２とｐ１０７がｉｎ ｖｉｖｏと同様にｉｎ ｖｉｔｒｏでも物理的相互作用することを立証する。これらの結果を細胞周期のレベルのＭｄｍ２活性（実施例４）と相関させる。
【００８３】
５．１．ｉｎ ｖｉｔｒｏ
Ｓ３５でｉｎ ｖｉｔｒｏ標識したｐ１０７をセファロースグルタチオンビーズに固定化したタンパク質ＧＳＴ−ＭＤＭ２（ベクターｐＧｅｘ−ＭＤＭ２）又はＧＳＴ−ＭＤＭ２（１−１７７）（ベクターｐＧｅｘ−ＭＤＭ２（１−１７７））と接触させる。ＭＤＭ２に結合したｐ１０７をポリアクリルアミドゲル後にオートラジオグラフィーにより検出する。得られた結果を下表ＩＩに示す。
【００８４】
５．２．ｉｎ ｖｉｖｏ
融合タンパク質ＧＳＴ−ＭＤＭ２又はＧＳＴ−ＭＤＭ２（１−１３４）を発現するプラスミドｐＢＣ−ＭＤＭ２又はｐＢＣ−ＭＤＭ２（１−１３４）と、ｐ１０７又はｐ１０７の突然変異体の発現プラスミドをＣｏｓ細胞に共トランスフェクトする。全細胞抽出物からのタンパク質複合体ＧＳＴ−ＭＤＭ２−ｐ１０７をセファロースグルタチオンビーズ上で単離し、抗ｐ１０７ポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｐ１０７−Ｃ１８）を用いてウェスタンブロットによりｐ１０７タンパク質を検出する。得られた結果を下表ＩＩに示す。
【００８５】
【表２】
【００８６】
上記結果から明らかなように、Ｍｄｍ２とｐ１０７のタンパク質−タンパク質相互作用はｉｎ ｖｉｔｒｏだけでなく細胞内でも存在する。細胞形質転換に必要なＭｄｍ２の領域（１〜１３４）はｐ１０７と相互作用する領域である。この領域はより厳密には「ポケットドメイン」、「Ａ」領域及び「スペーサー」の一部に位置するとして位置決定された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は過増殖症（癌、再発性狭窄症等）の新規治療方法及び対応する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
大半の癌は１個以上の遺伝子の過剰発現及び／又は１個以上の突然変異もしくは異常遺伝子の発現により出現する遺伝子異常が少なくとも一因であることが現在周知である。例えば、癌遺伝子が発現すると、殆どの場合に癌が発生する。癌遺伝子とは、遺伝的に障害のある遺伝子を意味し、その発現産物は細胞の正常な生物学的機能を妨げ、腫瘍状態を開始する。多数の癌遺伝子がこれまでに同定され、部分的に特性決定されており、特にｒａｓ、ｍｙｃ、ｆｏｓ、ｅｒｂ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｓｒｃ、ｆｍｓ、ｊｕｎ及びａｂｌ遺伝子の突然変異形態は細胞増殖障害の原因であると思われる。
【発明の概要】
【０００３】
正常細胞コンテキストでは、これらの癌遺伝子の増殖はｐ５３やＲｂ等の所謂腫瘍抑制遺伝子の形成により少なくとも部分的に抑制されると思われる。しかし、何らかの現象がこの細胞自己調節メカニズムを乱し、腫瘍状態の発生を助長する場合がある。これらの現象の１つは腫瘍抑制遺伝子レベルの突然変異である。例えば、ｐ５３遺伝子の欠失及び／又は突然変異による突然変異形態はヒト癌の大部分の発生に関与し（Ｂａｋｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４（１９８９）２１７）、Ｒｂ遺伝子の不活化形態は種々の腫瘍、特に網膜芽腫や骨肉腫等の間葉癌の原因に挙げられている。
【０００４】
ｐ５３タンパク質は正常組織の大部分で発現される５３ｋＤの核リンタンパク質である。該タンパク質は細胞周期の制御（Ｍｅｒｃｅｒら， Ｃｒｉｔｉｃ Ｒｅｖ． Ｅｕｃａｒ．Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ，２，２５１，１９９２）、転写調節（Ｆｉｅｌｄｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）２４９，１０４６）、ＤＮＡの複製（ＷｉｌｃｏｑとＬａｎｅ，（１９９１），Ｎａｔｕｒｅ ３４９，４２９０及びＢａｒｇｏｎｎｅｔｔｉら，（１９９２） Ｃｅｌｌ ６５ １０８３）及びアポトーシスの誘導（Ｓｈａｗら，（１９９２）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ ８９，４４９５）に関与する。従って、細胞を例えばそのＤＮＡを損傷することが可能な物質に暴露すると、細胞シグナル伝達カスケードが開始し、ｐ５３タンパク質が転写後修飾され、ｇａｄｄ４５（成長停止及びＤＮＡ損傷）（Ｋａｓｔａｎら，Ｃｅｌｌ，７１，５８７−５９７，１９９２）、ｐ２１ ＷＡＦ／ＣＩＰ（ＥｌＤｅｉｒｙら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５４，１１６９−１１７４，１９９４）又はｍｄｍ２（マウスＤＭ）（Ｂａｒａｋら，ＥＭＢＯ Ｊ．，１２，４６１−４６８，１９９３）等の多数の遺伝子がｐ５３により転写活性化される。
【０００５】
従って、癌発生を理解し、癌に有効な治療方法を開発するためには、特にこの細胞シグナル伝達経路に関与する全タンパク質の種々の生物学的機能、その作用方法及びその特性を解明することが明らかに重要である。
【０００６】
本発明は厳密にはこのコンテキストに該当し、Ｍｄｍ２タンパク質の新規機能を報告する。
【０００７】
Ｍｄｍ２タンパク質はｍｄｍ２（マウスＤＭ２）遺伝子から発現される分子量９０ｋＤのリンタンパク質である。このｍｄｍ２遺伝子は自然腫瘍細胞ＢＡＬＢ／ｃ ３Ｔ３で最初にクローニングされ、過剰発現すると腫瘍原能を著しく増すことが確認されている（Ｃａｈｉｌｌｙ−Ｓｎｙｄｅｒら，Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１３，２３５−２４４，１９８７； Ｆａｋｈａｒｚａｄｅｈら，ＥＭＢＯ Ｊ．１０，１５６５−１５６９，１９９１）。野生型ｐ５３及び突然変異ｐ５３タンパク質を含む複数の細胞系で複合体Ｍｄｍ２／ｐ５３が同定されている（Ｍａｒｔｉｎｅｚら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，５，１５１−１５９，１９９１）。更に、Ｍｄｍ２は筋クレアチンキナーゼのプロモーター等のプロモーター上でｐ５３の転写活性を阻害することが示されており、Ｍｄｍ２はｐ５３の活性を調節するらしい（Ｍｏｍａｎｄら，Ｃｅｌｌ，６９，１２３７−１２４５，１９９２； Ｏｌｉｎｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３６２，８５７−８６０，１９９３）。
【０００８】
以上の結果をまとめると、Ｍｄｍ２タンパク質はこれまで主にｐ５３の活性のモジュレーターとして認められている。Ｍｄｍ２タンパク質は野生型又は突然変異ｐ５３タンパク質と結合することにより、それらの転写活性を阻害し、細胞増殖の抑制を解除する。従って、これらの情報の治療面での応用は、主にＭｄｍ２によるｐ５３タンパク質のこの阻害に対抗する手段を求めることである。
【０００９】
予想外にも、本願出願人はこのＭｄｍ２タンパク質が固有の腫瘍原性、即ちｐ５３タンパク質との複合形態に関連する腫瘍原性とは全く異なる腫瘍原性をもつことを立証した。より詳細には、Ｍｄｍ２タンパク質は無ｐ５３コンテキストで腫瘍原性を発現する。Ｍｄｍ２の腫瘍原性がｐ５３から独立しており、特に野生型ｐ５３のトランス作用活性の阻害に起因しないというこの発見を裏付けるために、本願出願人はそのトランス作用性を維持しながらＭｄｍ２ともはや相互作用しないｐ５３の突然変異体（ｐ５３（１４−１９）； Ｌｉｎら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１９９４，８，１２３５−１２４６）がＭｄｍ２の腫瘍原性を阻害できないことを立証した。更に、Ｍｄｍ２、特にＭｄｍ２の１〜１３４ドメインがｐ１０７の過剰発現により誘導されるＧ１細胞周期の停止を解除できることも判明した。従って、Ｍｄｍ２はｐ５３以外に細胞周期の制御に関与する因子の重要なレギュレーターであることが判明した。
【００１０】
本発明は、配列番号１に示すＭｄｍ２タンパク質の配列のタンパク質配列１〜１３４がこのタンパク質の腫瘍原能を発現するために十分であるという事実の解明の結果でもある。
【００１１】
本発明は更に、Ｍｄｍ２タンパク質と相互作用することが可能な化合物を使用することにより、このタンパク質のこの腫瘍原性を改変できるという事実の解明の結果でもある。本発明は前記化合物を腫瘍に直接ｉｎ ｖｉｖｏ送達し、従って、癌の発生を抑制し得る特に有効なシステムにも関する。従って、本発明は結腸腺癌、甲状腺癌、肺癌腫、骨髄性白血病、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、Ｂリンパ腫、卵巣癌、膀胱癌、グリオブラストーマ等の特に無ｐ５３コンテキストの腫瘍の治療に特に有効な新規アプローチを提供する。
【００１２】
従って、本発明の第１の目的は、無ｐ５３コンテキストの癌の治療用医薬組成物の製造のための、Ｍｄｍ２タンパク質の腫瘍原活性を少なくとも部分的に阻害することが可能な化合物の使用である。
【００１３】
Ｍｄｍ２がｐ５３に固定すると、ｐ５３はその腫瘍抑制機能を発揮できなくなり、細胞はｐ５３で調節されずに成長できるようになるが、本発明の意味では、無ｐ５３コンテキスト癌とはこのような固定以外の任意修飾又は任意メカニズムによりｐ５３がその腫瘍抑制遺伝子機能を発揮できないような癌を意味する。ｐ５３の腫瘍抑制活性を阻害するこれらの修飾又はメカニズムの非限定的な例としては、例えばｐ５３遺伝子の遺伝子改変（点突然変異、欠失等）、Ｍｄｍ２以外のタンパク質との相互作用、ＨＰＶ−１６やＨＰＶ−１８等の危険度の高いヒトパピローマウイルスのＥ６タンパク質の存在に結び付けられるｐ５３タンパク質の非常に迅速なタンパク分解等を挙げることができる。
【００１４】
本発明の意味では、Ｍｄｍ２タンパク質の腫瘍原活性の阻害は２つの方法により達成することができる。
【００１５】
このタンパク質の１〜１３４ドメインのレベルに直接介入することにより阻害を行うのが好ましい。こうすると、このドメインに結合することが可能な任意のタンパク質はＭｄｍ２の腫瘍原性に対して拮抗機能を発揮する。
【００１６】
また、例えば配列番号１の配列に示すＭｄｍ２の１３５〜４９１ドメインや配列番号１の配列に示すそのＣ末端配列等の隣接ドメインと化合物の相互作用によってもこの阻害効果を達成することができる。従って、本発明はこのドメインと直接相互作用しないものであっても、その腫瘍原性を改変できるものであれば、任意の化合物の使用を包含する。
【００１７】
特定態様によると、本発明は無ｐ５３コンテキストの癌の治療用医薬組成物を製造するための、配列番号１に示すＭｄｍ２タンパク質の配列の１〜１３４ドメインのレベルに結合することが可能な化合物の使用に関する。
【００１８】
Ｍｄｍ２タンパク質の１〜１３４ドメインのレベルに直接相互作用することが可能な化合物としては、特にこのドメインに特異的なｓｃＦＶが挙げられる。
【００１９】
ｓｃＦＶは抗体と同等の結合性をもつ細胞内活性分子である。より詳細には、抗体のＨ鎖の可変領域の結合部位に対応するペプチドにペプチドリンカーを介して結合した抗体のＬ鎖の可変領域の結合部位に対応するペプチドから構成される分子である。このようなｓｃＦＶは遺伝子導入によりｉｎ ｖｉｖｏ生産できることが本願出願人により示されている（国際出願公開第ＷＯ９４／２９４４６号参照）。
【００２０】
前記化合物としては、Ｍｄｍ２の１〜１３４ドメインと特異的に結合できることが既に知られているペプチド又はタンパク質も利用でき、例えば配列番号１とのｐ５３タンパク質の結合ドメインの全部又は一部、より詳細には配列番号２（Ｏｌｉｎｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，１９９３，３６２，８５７−８６０）に示すｐ５３の配列のペプチド１〜５２、１〜４１及び６〜４１の１種の全部又は一部、より単純なものでは、厳密にマッピングされたペプチド１６〜２５の全部又は一部（Ｌａｎｅら，Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ Ｂ．，１９９５，３４７，８３−８７）、ヒト又はマウスｐ５３のペプチド１８〜２３、更にはＭｄｍ２との相互作用に必須の残基を保存した上記ペプチドの近傍の誘導ペプチド（Ｐｉｃｋｓｌｅｙら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９４，９，２５２３−２５２９）である。
【００２１】
本発明によると、配列番号１に示すＭｄｍ２の１〜１３４ドメインの近傍のドメインに結合することが可能であり、この結合によりＭｄｍ２タンパク質の腫瘍原活性を改変する化合物も利用できる。このような化合物としては、例えば転写因子ＴＦＩＩ、ＴＢＰ及びＴａＦ２５０のように前記タンパク質のＣ末端ドメインのレベルに相互作用する化合物や、例えばタンパク質Ｌ５（リボソームタンパク質）及びＲｂ（網膜芽腫タンパク質）や転写因子Ｅ２Ｆ（Ｒｂにより調節される）のように配列番号１に示すＭｄｍ２の１３５〜４９１ドメインのレベルに相互作用するタンパク質を挙げることができる。
【００２２】
本発明の別の目的は、癌治療用医薬組成物を製造するための、配列番号１に示すＭｄｍ２タンパク質の配列のこの１〜１３４ドメインに特異的なｓｃＦＶの使用にも関する。
【００２３】
本発明の意味では、上記相互作用全体が結果的にＭｄｍ２の腫瘍原性を改変するとみなす。更に、Ｍｄｍ２タンパク質との結合ドメインの１つに対して活性な部分を利用し且つこの相互作用が該タンパク質の腫瘍原性の改変をもたらすものであれば、これらのタンパク質の全体又は一部を使用してもよい。
【００２４】
本発明の範囲では、これらの化合物はそのまま使用してもよいが、ｉｎ ｖｉｖｏ発現を可能にする遺伝子構築物の形態で使用すると有利である。
【００２５】
本発明の特に有利な実施態様は、無ｐ５３コンテキストの癌の治療用医薬組成物を製造するために、Ｍｄｍ２タンパク質の腫瘍原活性を少なくとも部分的に阻害することが可能な化合物をコードする核酸配列を利用する。
【００２６】
この観点では、本発明の範囲で使用される核酸は種々の型のものを利用できる。好ましい例としては、アンチセンス核酸、Ｍｄｍ２タンパク質のドメインの１つに直接固定し、その腫瘍原活性を阻害することが可能なオリゴリボヌクレオチド（リガンドオリゴヌクレオチド）、Ｍｄｍ２のドメインの１つとオリゴマーを形成し、その腫瘍原活性を阻害することが可能なペプチド又はタンパク質の全部又は一部をコードする核酸、Ｍｄｍ２タンパク質の配列番号１の配列の１〜１３４ドメインに対する細胞内抗体をコードする核酸（例えば抗体に由来する可変フラグメント単一鎖）が挙げられる。
【００２７】
本発明の特定態様によると、核酸はアンチセンス核酸である。このアンチセンスは、Ｍｄｍ２タンパク質をコードする核酸に相補的であって、その転写及び／又はその翻訳を阻害することが可能なＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ）又はリボザイムをコードするＤＮＡである。
【００２８】
最近になって、標的遺伝子の発現を調節することが可能な新規種の核酸が報告された。これらの核酸は細胞ｍＲＮＡとハイブリダイズせずに、２本鎖ゲノムＤＮＡと直接ハイブリダイズする。この新規アプローチは、所定の核酸がＤＮＡの二重螺旋の大きい溝で特異的に相互作用して局所的に三重螺旋を形成することが可能であり、その結果、標的遺伝子の転写を阻害するという事実の解明に基づく。これらの核酸はオリゴプリン−オリゴピリミジン配列のレベル、即ち一方の鎖上にオリゴプリン配列をもち、相補鎖上にオリゴピリミジン配列をもつ領域のレベルでＤＮＡの二重螺旋を選択的に認識し、このレベルで局所的に三重螺旋を形成する。第３の鎖（オリゴヌクレオチド）の塩基はワトソン・クリック塩基対のプリンと水素結合（フーグスティーン又は逆フーグスティーン結合）を形成する。このような核酸は特にＰｒ．ＨｅｌｅｎｅによりＡｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇ ｄｅｓｉｇｎ ６（１９９１）５６９に記載されている。
【００２９】
本発明によるアンチセンス核酸はアンチセンスＲＮＡ又はリボザイムをコードするＤＮＡ配列であり得る。こうして生産されるアンチセンスＲＮＡはｍＲＮＡ又は標的ゲノムＤＮＡと相互作用し、二重又は三重螺旋を形成することができる。前記アンチセンス核酸は、標的遺伝子又はＲＮＡと直接相互作用することが可能な、場合により化学的に修飾されたアンチセンス配列（オリゴヌクレオチド）でもよい。
【００３０】
同様に本発明の好適実施態様によると、核酸は場合により化学的に修飾された上記のようなアンチセンスオリゴヌクレオチドである。特に、ホスホジエステル骨格が化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドを挙げることができ、例えばオリゴヌクレオチドホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート及びホスホロチオエートであり、このような化合物は例えば国際出願公開第ＷＯ９４／０８００３号に記載されている。αオリゴヌクレオチドや、アクリル化合物等の物質に結合したオリゴヌクレオチドでもよい。
【００３１】
本発明の意味では、リガンドオリゴヌクレオチドとは、その腫瘍原機能を阻害するためにＭｄｍ２タンパク質に特異的に固定することが可能なオリゴリボヌクレオチド又はオリゴデオキシリボヌクレオチドを意味する。このようなヌクレオチドは例えばＳＥＬＥＸ法（Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９２，１０，１３７−１４０；米国特許第５，２７０，１６３号及び国際出願公開第ＷＯ９１／１９８１３号）等の「ｉｎ ｖｉｔｒｏ進化」技術により得られる。
【００３２】
より一般には、これらの核酸はヒト、動物、植物、細菌、ウイルス、合成等の起源であり得る。これらの核酸は当業者に公知の任意技術により得られ、特にライブラリーのスクリーニング、化学的合成、又はライブラリーのスクリーニングにより得られた配列の化学的もしくは酵素修飾を含む混合法により得られる。
【００３３】
後述するように、核酸はプラスミド、ウイルス又は化学的ベクター等のベクターに組み込むことができる。また、国際出願公開第ＷＯ９０／１１０９２号に記載の技術に従って裸のＤＮＡ形態でそのまま投与してもよいし、例えばＤＥＡＥ−デキストラン（Ｐａｇａｎｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１（１９６７）８９１）、核タンパク質（Ｋａｎｅｄａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３（１９８９）３７５）、カチオン脂質もしくはポリマー（Ｆｅｌｇｎｅｒら，ＰＮＡＳ ８４（１９８７）７４１３）との複合形態で投与してもよいし、リポソーム形態（Ｆｒａｌｅｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５（１９８０）１０４３１）で投与してもよい。
【００３４】
本発明の範囲で使用される配列はベクターの一部を構成することが好ましい。このようなベクターを使用すると、治療しようとする細胞への核酸の投与を実際に改善できると共に、前記細胞におけるその安定性を増し、持続的治療効果が得られる。更に、同一ベクターに複数の核酸配列を導入し、同様に治療効果を増すことも可能である。
【００３５】
使用するベクターは動物細胞、好ましくはヒト癌細胞を形質転換できるものであれば、種々の起源のものでよい。本発明の好適実施態様によると、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はヘルペスウイルスから選択され得るウイルスベクターを使用する。
【００３６】
この点で、本発明はＭｄｍ２タンパク質の腫瘍原性を少なくとも部分的に阻害することが可能な化合物をコードする核酸をそのゲノムに挿入してなる任意ウイルスベクターにも関する。
【００３７】
より詳細には、本発明はその腫瘍原能を改変するようにＭｄｍ２タンパク質と結合することが可能な化合物をコードする核酸配列を含む任意組換えウイルスに関する。このコンテキストでは、核酸配列は上記ペプチド、タンパク質又は転写因子をコードすることができる。
【００３８】
より好ましくは、この核酸配列はｓｃＦＶ又はペプチド（Ｍｄｍ２タンパク質の１〜１３４ドメイン（配列番号１）のレベルに相互作用することが可能な）をコードする。
【００３９】
本発明の範囲で使用されるウイルスは好ましくは欠損ウイルスであり、即ち感染細胞で自律的に複製できないウイルスを使用すると有利である。従って、一般に本発明の範囲で使用される欠損ウイルスのゲノムは少なくとも感染細胞で該ウイルスの複製に必要な配列を欠失している。これらの領域は（完全に又は部分的に）除去してもよいし、非機能的にしてもよいし、他の配列、特にＭｄｍ２タンパク質の腫瘍原性に対する拮抗機能をもつ化合物をコードする配列で置換してもよい。但し、欠損ウイルスはウイルス粒子のキャプシド化に必要なそのゲノムの配列を保存していることが好ましい。
【００４０】
特にアデノウイルスについては、構造と性質が少しずつ異なる種々の血清型が特性決定されている。これらの血清型のうち、本発明の範囲内では２もしくは５型ヒトアデノウイルス（Ａｄ２又はＡｄ５）又は動物由来のアデノウイルス（仏国特許出願第９３０５９５４号参照）を使用するのが好ましい。本発明の範囲内で使用可能な動物由来のアデノウイルスのうちでは、イヌ、ウシ、マウス（例えばＭＡＶ１，Ｂｅａｒｄら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５（１９９０）８１）、ヤギ、ブタ、トリ又はサル（例えばＳＡＶ）由来のアデノウイルスを挙げることができる。好ましくは、動物由来のアデノウイルスはイヌアデノウイルス、より好ましくはアデノウイルスＣＡＶ２［例えばマンハッタン株又はＡ２６／６１（ＡＴＣＣ ＶＲ−８００）］である。好ましくは、本発明の範囲内ではヒトもしくはイヌ由来又は混合アデノウイルスを使用する。
【００４１】
好ましくは、本発明の欠損アデノウイルスは、ＩＴＲとキャプシド化のための配列とカルパインのモジュレーターをコードする配列を含む。より好ましくは、本発明のアデノウイルスのゲノムにおいて、Ｅ１遺伝子とＥ２、Ｅ４、Ｌ１〜Ｌ５遺伝子の少なくとも１個は非機能的である。該当ウイルス遺伝子は当業者に公知の任意の方法、特に完全抑制、置換、部分欠失、又は該当遺伝子に１個以上の塩基を付加することにより非機能的にすることができる。このような修飾は、例えば遺伝子工学技術又は突然変異誘発物質で処理することによりｉｎ ｖｉｔｒｏ（単離したＤＮＡで）又はｉｎ ｓｉｔｕで得られる。
【００４２】
本発明による組換え欠損アデノウイルスは当業者に公知の任意の技術により作製することができる（Ｌｅｖｒｅｒｏら，Ｇｅｎｅ １０１（１９９１）１９５，ヨーロッパ特許第１８５５７３号； Ｇｒａｈａｍ，ＥＭＢＯ Ｊ．３（１９８４）２９１７）。特に、アデノウイルスと特にＥＴＳの阻害剤をコードするＤＮＡ配列をもつプラスミドの相同組換えにより作製することができる。相同組換えは適当な細胞系に前記アデノウイルスとプラスミドを共トランスフェクション後に生じる。使用する細胞系は、（ｉ）前記エレメントにより形質転換可能であること、及び（ｉｉ）組換えの危険を避けるために好ましくは組込み形態で欠損アデノウイルスのゲノムの部分を相補することが可能な配列を含んでいることが好ましい。細胞系の例としては、特にアデノウイルスＡｄ５のゲノムの左側部分（１２％）をそのゲノムに組込んだヒト胎児腎細胞２９３系（Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９）を挙げることができる。アデノウイルスから誘導されるベクターの構築ストラテジーは、仏国特許出願第９３０５９５４号及び９３０８５９６号にも記載されている。
【００４３】
その後、増殖したアデノウイルスを実施例に記載するように慣用分子生物学技術により回収及び精製する。
【００４４】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、比較的小寸法のＤＮＡをもつウイルスであり、これに感染する細胞のゲノムに安定的且つ部位特異的に組込まれる。アデノ随伴ウイルスは細胞増殖、形態又は分化に影響することなく広範な細胞に感染することができる。また、ヒトで疾病に関与しないと思われる。ＡＡＶのゲノムは既にクローニングされ、配列及び特性を決定されている。ゲノムは約４７００塩基を含み、ウイルスの複製起点として機能する約１４５塩基の逆方向反復領域（ＩＴＲ）を各末端に含む。ゲノムの残余はキャプシド化機能をもつ２つの主領域に分けられ、ゲノムの左側部分はウイルス複製とウイルス遺伝子の発現に関与するｒｅｐ遺伝子を含み、ゲノムの右側部分はウイルスのキャプシドタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を含む。
【００４５】
ＡＡＶから誘導されるベクターを遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ導入に利用することは文献に記載されている（特に国際出願公開第ＷＯ９１／１８０８８号、ＷＯ９３／０９２３９号、米国特許第４，７９７，３６８号、５，１３９，９４１号、ヨーロッパ特許第４８８５２８号参照）。これらの文献は、ＡＡＶから誘導され、ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子を欠失し、着目遺伝子で置換された種々の構築物と、前記着目遺伝子を（培養細胞に）ｉｎ ｖｉｔｒｏ又は（生物に直接）ｉｎ ｖｉｖｏ導入するためのその使用について記載している。本発明による組換え欠損ＡＡＶは、ヒトヘルパーウイルス（例えばアデノウイルス）に感染させた細胞系に、ＡＡＶの２つの逆方向反復領域（ＩＴＲ）で挟まれたＥＴＳの阻害剤をコードする配列を含むプラスミドと、ＡＡＶのキャプシド化遺伝子（ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子）をもつプラスミドを共トランスフェクトすることにより作製することができる。生成した組換えＡＡＶをその後、慣用技術により精製する。
【００４６】
ヘルペスウイルスとレトロウイルスに関しては、組換えベクターの構築について文献に広く記載されており、特にＢｒｅａｋｆｉｅｌｄら，Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ ３（１９９１）２０３； ヨーロッパ特許第４５３２４２号及び１７８２２０号、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら，Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．７（１９８５）２３５； ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３（１９８５）６８９等を参照されたい。特に、レトロウイルスは分裂細胞に選択的に感染する組込みウイルスである。従って、癌に適用するのに有利なベクターである。レトロウイルスのゲノムは主に２つのＬＴＲと、キャプシド化配列と、３つのコーディング領域（ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ）を含む。レトロウイルスから誘導される組換えベクターでは、一般にｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子が完全又は部分的に欠失しており、着目異種核酸配列で置換されている。これらのベクターは種々の型のレトロウイルスから作製することができ、特にＭｏＭｕＬＶ（「モロニーマウス白血病ウイルス」、別称ＭｏＭＬＶ）、ＭＳＶ（「モロニーマウス肉腫ウイルス」）、ＨａＳＶ（「ハーベー肉腫ウイルス」）、ＳＮＶ（「脾壊死ウイルス」）、ＲＳＶ（「ラウス肉腫ウイルス」）又はフレンドウイルス等のレトロウイルスから得られる。
【００４７】
着目配列を含む組換えレトロウイルスを構築するためには、特にＬＴＲとキャプシド化配列と前記着目配列を含むプラスミドを構築した後、このプラスミドを使用して、欠損レトロウイルス機能をプラスミドにトランス導入することが可能な所謂キャプシド化細胞系にトランスフェクトする。従って、一般にキャプシド化系はｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を発現させることができる。このようなキャプシド化系は従来技術に記載されており、特にＰＡ３１７系（米国特許第４，８６１，７１９号）、ＰｓｉＣＲＩＰ系（ＷＯ９０／０２８０６）及びＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２系（ＷＯ８９／０７１５０）が挙げられる。更に、組換えレトロウイルスは転写活性を抑制するようにＬＴＲのレベルに修飾を含んでいてもよいし、ｇａｇ遺伝子の一部を含む拡張キャプシド化配列も含んでいてもよい（Ｂｅｎｄｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１（１９８７）１６３９）。生成した組換えレトロウイルスをその後、慣用技術により精製する。
【００４８】
本発明のベクターでは、Ｍｄｍ２の腫瘍原性に対する拮抗性をもつ化合物をコードする配列を、腫瘍細胞で発現できるようにするシグナルの制御下におくと有利である。このようなシグナルは、異種発現シグナル、即ち阻害剤の発現に天然に関与するシグナルとは異なるシグナルが好ましい。これらは、特に、他のタンパク質の発現に関与する配列又は合成配列であり得る。特に、真核生物又はウイルス遺伝子のプロモーター配列であり得る。例えば、感染させたい細胞のゲノムに由来するプロモーター配列であり得る。また、使用するウイルスも含めてウイルスのゲノムに由来するプロモーター配列でもよい。この点では、例えばプロモーターＥ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶ、ＬＴＲ−ＲＳＶ等を挙げることができる。更に、活性化配列、調節配列又は組織特異的発現を可能にする配列を加えてこれらの発現配列を修飾してもよい。実際に、ウイルスが腫瘍細胞に有効に感染したときのみにＤＮＡの配列が発現されてその効果を発揮するように、腫瘍細胞で特異的又は主に活性な発現シグナルを使用すると特に有利であり得る。
【００４９】
特定実施態様では、本発明はＭｄｍ２の腫瘍原性に対して拮抗性をもつ化合物をコードするｃＤＮＡ配列を好ましくはＬＴＲ−ＲＳＶ及びＣＭＶプロモーターから選択されるウイルスプロモーターの制御下に含む組換え欠損ウイルスに関する。
【００５０】
同様に好適態様において、本発明はＭｄｍ２の腫瘍原性に対して拮抗性をもつ化合物をコードするＤＮＡ配列を腫瘍細胞で主に発現できるようにするプロモーターの制御下に含む組換え欠損ウイルスに関する。
【００５１】
本発明の意味では、他の細胞種にも残留発現が観察されるとしても、腫瘍細胞での発現レベルのほうが高い場合に主な発現とみなす。
【００５２】
本発明は、一般に癌治療用の医薬組成物の製造のための、配列番号１に示すＭｄｍ２タンパク質の配列の１〜１３４ドメインに対する細胞内抗体又はｓｃＦＶをコードする核酸の使用にも及ぶ。
【００５３】
本発明は更に、Ｍｄｍ２タンパク質の腫瘍原活性を阻害することが可能な化合物又は該化合物をコードする核酸配列を含む任意医薬組成物にも関する。本発明の特定実施態様によると、前記組成物は１種以上の上記のような組換え欠損ウイルスを含む。これらの医薬組成物は、局所、経口、非経口、鼻孔内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、経皮等の経路で投与するように調剤することができる。好ましくは、本発明の医薬組成物は、特に患者の腫瘍に直接注射するための注射用製剤に医薬的に許容可能なキャリヤーを含む。特に、滅菌等張溶液、又は場合に応じて滅菌水もしくは生理的血清を加えて注射可能な溶質を構成できる乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物が挙げられる。患者の腫瘍に直接注射すると、患部組織のレベルに治療効果を集中できるので有利である。
【００５４】
注射に使用する組換え欠損ウイルスの用量は種々のパラメーター、特に使用する投与方法、該当疾病、又は所望の治療期間に応じて適応できる。一般に、本発明による組換えアデノウイルスは１０４〜１０１４ｐｆｕ／ｍｌ、好ましくは１０６〜１０１０ｐｆｕ／ｍｌの用量で調剤及び投与される。ｐｆｕ（「プラーク形成単位」）なる用語はウイルス溶液の感染能に対応し、適当な細胞培養物の感染により測定され、一般に４８時間後の感染細胞のプラーク数を表す。ウイルス溶液のｐｆｕ力価の測定方法は文献に詳細に記載されている。レトロウイルスについては、本発明による組成物はその移植用の産生細胞を直接含むことができる。
【００５５】
本発明による医薬組成物はＭｄｍ２タンパク質の腫瘍原活性を中和し、その結果、所定の細胞種の増殖を制御するために特に有利である。
【００５６】
特に、これらの医薬組成物は例えば結腸腺癌、甲状腺癌、肺癌腫、骨髄性白血病、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、胃癌、食道癌、Ｂリンパ腫、卵巣癌、膀胱癌、グリオブラストーマ等の無ｐ５３癌の治療に適している。
【００５７】
本発明は過増殖（即ち異常増殖）細胞を死滅させるためにｉｎ ｖｉｖｏで有利に使用される。従って、本発明は腫瘍細胞又は血管壁の平滑筋細胞（再発性狭窄症）を死滅させるのに利用できる。
【００５８】
本発明の他の利点は、非限定的な例示とみなすべきである以下の実施例及び図面に明示される。
【００５９】
一般分子生物学技術
プラスミドＤＮＡの分取抽出、プラスミドＤＮＡの塩化セシウム勾配遠心分離、アガロース又はアクリルアミドゲル電気泳動、ＤＮＡフラグメントの電気溶離精製、タンパク質のフェノール又はフェノール−クロロホルム抽出、塩類溶媒中のＤＮＡのエタノール又はイソプロパノール沈降、大腸菌での形質転換等の分子生物学で慣用的に使用されている方法は当業者に周知であり、文献に詳細に記載されている［Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８２； Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ら（編），“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７］。
【００６０】
連結については、ＤＮＡフラグメントをアガロース又はアクリルアミドゲル電気泳動によりその寸法に応じて分離し、フェノール又はフェノール／クロロホルム混合物で抽出し、エタノール沈降させた後、製造業者の指示に従ってファージＴ４（Ｂｉｏｌａｂｓ）のＤＮＡリガーゼの存在下でインキュベートする。
【００６１】
付着５’末端の充填は製造業者の指示に従って大腸菌（Ｂｉｏｌａｂｓ）のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメントにより実施できる。付着３’末端の破壊は、ファージＴ４（Ｂｉｏｌａｂｓ）のポリメラーゼＤＮＡを製造業者の指示に従って使用することにより実施される。付着５’末端の破壊はヌクレアーゼＳ１処理により実施される。
【００６２】
合成オリゴヌクレオチドによるｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発は、Ａｍｅｒｓｈａｍから市販されているキットを使用することにより、Ｔａｙｌｏｒら［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３（１９８５）８７４９−８７６４］により開発された方法に従って実施することができる。
【００６３】
所謂ＰＣＲ法［Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０（１９８５）１３５０−１３５４； Ｍｕｌｌｉｓ Ｋ．Ｂ．とＦａｌｏｏｎａ Ｆ．Ａ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５５（１９８７）３３５−３５０］によるＤＮＡフラグメントの酵素増幅は、「ＤＮＡサーマルサイクラー」（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を製造業者の指示に従って使用することにより実施することができる。ゲノムＤＮＡの増幅はより詳細には、適当なプローブを使用して１００℃で５分間、９５℃で１分間を３０サイクル、５８℃で２分間、次いで７２℃で３分間の条件下で実施される。増幅産物はゲル電気泳動により分析する。
【００６４】
ヌクレオチド配列の確認は、Ａｍｅｒｓｈａｍにより市販されているキットを使用することにより、Ｓａｎｇｅｒら［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４（１９７７）５４６３−５４６７］により開発された方法により実施することができる。
【００６５】
材料と方法：
１．使用した構築物：
−プラスミドｐＢＫＣＭＶはＳｔｒａｔａｇｅｎｅの市販品であり、ネオマイシン耐性遺伝子を含む。
−夫々野生型ｐ５３及びｐ５３ Ｒ２７３ＨをコードするプラスミドｐＣ５３Ｃ１Ｎ３及びｐ５３−４．２．Ｎ３はＡ．Ｌｅｖｉｎｅ（Ｈｉｎｄｓら，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆ．（１９９０），１，５７１）に由来する。
−プラスミドｐＢＫｐ５３（Ｒ２７３Ｈ）はヒトミニ遺伝子ｐ５３を含む。このプラスミドはｐＣ５３−４．２．Ｎ３から得た。
−プラスミドｐＢＫＭｄｍ２はβグロビンをコードする配列の末端の非翻訳領域とそれに続くＭｄｍ２をコードする配列から構成されるコーディングカセットをｐＢＫＣＭＶにクローニングすることにより得た。
−プラスミドｐＧＫｈｙｇｒｏはハイグロマイシン耐性遺伝子の発現を可能にする（Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８，６４９−６５１）。
−プラスミドｐＣＭＶＮｅｏＢａｍはネオマイシン耐性遺伝子を発現させる（Ｈｉｎｄｓら（１９９０）Ｃｅｌｌ．Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆ．，１，５７１−５８０）。
−プラスミドｐＣＭＶｐ１０７及びｐＣＭＶＣＤ２０はｐ１０７タンパク質とＣＤ２０表面マーカーの発現を可能にする（Ｚｈｕら（１９９３）Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，７，１１１１−１１２５）。
−プラスミドｐＣＭＶＥ２Ｆ−４及びｐＣＭＶＥ２Ｆ−５はＥ２Ｆ−４及びＥ２Ｆ−５タンパク質の発現を可能にする（Ｓａｒｄｅｔら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ．，９２，２４０３−２４０７）。
−プラスミドｐＬｅｘＡ、ｐＬｅｘＡ（６−４１）、ｐＬｅＸＡ（１６−２５）は遊離又はｐ５３（６−４１）もしくはｐ５３（１６−２５）とフェーズを合せて融合したＬｅｘＡのＤＮＡ（アミノ酸１〜８７）への付着のためのドメインの発現を可能にする。ｐＬｅｘＡ（６−４１）及びｐＬｅＸＡ（１６−２５）はＬＧＭＥ（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ）で構築されたプラスミドｐＬｅｘＡｐｏｌｙＩＩから得た。
−ｐ１０７の真核生物発現プラスミド：ｐ１０７（３８５−１０６８）、ｐ１０７（１−７８１）及びｐ１０７（７８１−１０６８）（Ｚｈｕら，ＥＭＢＯ Ｊ．１４（１９９５）１９０４）。
−プラスミドｐＳＧＫ１ＨＡｐ１０７はｐ１０７のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ発現を可能にする。ｐ１０７はＫｏｚａｋ配列のコンテキストに含まれ、エピトープＨＡはｐ１０７のＣ末端に融合発現される。
−プラスミドｐＢＣ−ＭＤＭ２及びｐＢＣ−ＭＤＭ２（１−１３４）はＭＤＭ２及びＭＤＭ２（１−１３４）をｐＢＣにクローニングすることにより得た（Ｃｈａｔｔｏｎら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １８（１９９５）１４２）。
−プラスミドｐＧｅｘ−ＭＤＭ２及びｐＧｅｘ−ＭＤＭ２（１−１７７）はＭＤＭ２及びＭＤＭ２（１−１７７）をｐＧｅｘにクローニングすることにより得た。
【００６６】
２．方法：
ｐ５３の発現はモノクローナル抗体Ｄ０１を使用して全細胞抽出物でウェスタンブロッティングにより測定する。
【００６７】
Ｍｄｍ２タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現は半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより評価する。
【００６８】
ＤＮＡが汚染されていないことはＰＣＲにより確認する。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】Ｍｄｍ２タンパク質Ａ〜Ｆの模式図。
【図２】種々のＭｄｍ２タンパク質を発現するプラスミドによるＳａｏｓ−２細胞のトランスフェクションのグラフ。
【図３ａ】種々のｐ５３によるＭｄｍ２の形質転換性の阻害を示す模式図。
【図３ｂ】種々のｐ５３によるＭｄｍ２の形質転換性の阻害を示す模式図。
【図４】細胞周期に及ぼすＭｄｍ２過剰発現の効果。
【図５】細胞周期に及ぼすＭｄｍ２過剰発現の効果。
【００７０】
実施例１：Ｍｄｍ２の形質転換性の立証
Ｓａｏｓ−２細胞にプラスミドｐＢＫＭＤＭ２、対照プラスミドｐＢＫｐ５３（Ｒ２７３Ｈ）又はｐ５３−対照プラスミドｐＢＫＣＭＶをトランスフェクトした後、ゲネチシン４１８（Ｇ４１８）耐性を選択する。
【００７１】
第１の試験では、クローンを個々に選択して増殖させ、他の２つの試験ではクローンを単離せずに軟質寒天培地で培養する。
【００７２】
このために、０．３７５％軟質寒天に細胞１０４個を２回接種する。２４時間後に５０個を上回る細胞を含むコロニーの合計数と、コロニー当たりの細胞数（コロニー寸法）を測定する。各値は夫々２回ずつ実施した４回の実験の平均に対応する。得られた結果を表Ｉに示す。Ｍｄｍ２に対応する試験１のクローンをＭ１〜Ｍ６、ｐ５３（Ｒ２７３Ｈ）のクローンをｐ５３−１〜ｐ５３−６、対照クローンをＣｏ１〜Ｃｏ５として示す。
【００７３】
予想通り、Ｃｏ１とＣｏ４はトランスフェクトしたＭｄｍ２を発現せず、Ｃｏ１〜３はｐ５３タンパク質を発現しない。
【００７４】
【表１】
【００７５】
実施例２：配列番号１のＭｄｍ２のＮ末端領域（１〜１３４）はＳａｏｓ−２細胞の軟質寒天増殖を刺激するのに必要且つ十分である。
【００７６】
ｎｅｏ耐性と図１に示すＭｄｍ２タンパク質Ａ〜Ｆを同時に発現するプラスミドｐＢＫＣＭＶ又はブランク対照プラスミドｐＢＫＣＭＶをＳａｏｓ−２細胞にトランスフェクトした後、Ｇ４１８耐性を選択する。生存細胞を集めて増幅後、軟質寒天コロニー形成を試験する。図２の結果は軟質寒天で形成されたクローン数を完全Ｍｄｍ２（Ａ）のクローン数の相対値として表す。これらの結果は、構築物に応じて３〜７個の異なる細胞プールを試験した独立トランスフェクションを表す２回の実験の結果である。これらの結果から明らかなように、Ｍｄｍ２のＮ末端ドメインは腫瘍原性をもつ。最も有効な構築物は全タンパク質に対応する。
【００７７】
実施例３：野生型ｐ５３、ｐ５３突然変異体及びｐ５３フラグメントによるＭｄｍ２の腫瘍原性の復帰
Ｍｄｍ２で形質転換した１群のＳａｏｓ−２細胞にプラスミ
ドｐＧＨｈｙｇｒｏと、ｐＣ５３Ｃ１Ｎ３（ｐ５３）、ｐＣ５３−４．２．Ｎ３、ｐ５３（Ｒ２７３Ｈ）、ｐ５３（１−５２）、ｐＬｅｘＡ（６−４１）、ｐＬｅｘＡ（１６−２５）、ｐＬｅｘＡ、ｐ５３（Ｌ１４Ｑ，Ｆ１９Ｓ）、ｐ５３（Ｌ２２Ｑ，Ｗ２３Ｓ）とｐＣＭＶＮｅｏＢａｍとのどちらかとを共トランスフェクトした後、Ｇ４１８の存在下でハイグロマイシン耐性を選択する。耐性細胞の独立プール３〜５個からの細胞１０００００個を軟質寒天（０．３７５％）に２回接種する。２５日間培養後に、少なくとも５０個の細胞を含むコロニーを数える。図３は代表的実験の結果と、Ｍｄｍ２の形質転換性の阻害を試験した種々のｐ５３の模式図を示す。この実験から明らかなように、Ｍｄｍ２タンパク質に結合することが可能なタンパク質の発現を可能にする構築物しかＭｄｍ２の腫瘍原性を阻害せず、この場合にはｐ５３、ｐ５３Ｒ２７３Ｈ、ｐ５３（１−５２）、ＬｅｘＡ（６−４１）、ＬｅｘＡ（１６−２５）である。他方、Ｍｄｍ２と結合する能力を失ったことが判明した二重突然変異体（Ｌｉｎら，Ｇｅｎｅ Ｄｅｖ．，１９９４，８，１２３５−１２４６）は阻害効果をもたない。野生型ｐ５３のトランス作用性を維持した突然変異体ｐ５３（１４−１９）がＭｄｍ２による形質転換を阻害しないという事実は、Ｍｄｍ２の腫瘍原性がＭｄｍ２によるｐ５３のトランス作用性の阻害から独立していることを裏付けるものである。
【００７８】
実施例４：Ｍｄｍ２はＳａｏｓ−２細胞でｐ１０７により誘導されるＧ１細胞周期の遮断を阻害する。
【００７９】
（ｉ）ＣＤ−２０の発現用プラスミド（ＣＤ−２０細胞表面マーカーをコードするｐＣＭＶＣＤ２０ ２μｇ）、（ｉｉ）コーディング配列をもたないか、又はＭｄｍ２（ＰＢＫＣＭＶＭｄｍ２）、Ｍｄｍ２の１〜１３４ドメイン（ＰＢＫＣＭＶＭｄｍ２（１−１３４））、Ｅ２Ｆ−４（ｐＣＭＶＥ２Ｆ−４）もしくはＥ２Ｆ−５（ｐＣＭＶＥ２Ｆ−５）をコードするＣＭＶ（サイトメガロウイルスのプロモーター）型の発現プラスミド（９μｇ）、及び（ｉｉｉ）ｐ１０７の発現ベクター（ｐＣＭＶｐ１０７、９μｇ）の３種のプラスミドをＳａｏｓ−２細胞に共トランスフェクトする。その後、Ｚｈｕら，Ｇｅｎｅ Ｄｅｖ．，１９９３，７，１１１１−１１２５に記載されているようにＦＡＣＳｃａｎにより分析するために細胞を処理する。代表的実験の結果を図４に示す。同図から明らかなように、ｐ１０７の過剰発現の不在下ではＭｄｍ２又はその１〜１３４ドメインの発現は細胞周期に無効である。他方、Ｍｄｍ２と効力をもつその１〜１３４ドメインの発現はｐ１０７により誘導されるＧ１細胞周期の停止を解除することができる。本実施例から明らかなように、Ｍｄｍ２はｐ５３のトランス作用活性の阻害剤であるばかりでなく、細胞周期の制御に関与する因子を阻害することが可能な細胞周期の正のレギュレーターでもある。
【００８０】
同様の実験で、ｐ１０７（３８５−１０６８）１μｇ、ｐＣＭＶＮｅｏＢａｍ ８μｇ、ｐＸＪＭＤＭ２ １μｇ、ｐＸＪ４１ ８μｇ及びｐＣＭＶＣＤ２０ ２μｇをＳａｏｓ−２細胞にコトランスフェクトする。代表的実験の結果を図５に示す。これらの結果から明らかなように、ＭＤＭ２の発現はｐ１０７及びＭＤＭ２と相互作用することが可能な欠失突然変異体ｐ１０７（３８５−１０６８）により誘導されるＧ１遮断を解除することができる。
【００８１】
実施例５：Ｍｄｍ２はｐ１０７とｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ相互作用する。
【００８２】
本実施例はＭｄｍ２とｐ１０７がｉｎ ｖｉｖｏと同様にｉｎ ｖｉｔｒｏでも物理的相互作用することを立証する。これらの結果を細胞周期のレベルのＭｄｍ２活性（実施例４）と相関させる。
【００８３】
５．１．ｉｎ ｖｉｔｒｏ
Ｓ３５でｉｎ ｖｉｔｒｏ標識したｐ１０７をセファロースグルタチオンビーズに固定化したタンパク質ＧＳＴ−ＭＤＭ２（ベクターｐＧｅｘ−ＭＤＭ２）又はＧＳＴ−ＭＤＭ２（１−１７７）（ベクターｐＧｅｘ−ＭＤＭ２（１−１７７））と接触させる。ＭＤＭ２に結合したｐ１０７をポリアクリルアミドゲル後にオートラジオグラフィーにより検出する。得られた結果を下表ＩＩに示す。
【００８４】
５．２．ｉｎ ｖｉｖｏ
融合タンパク質ＧＳＴ−ＭＤＭ２又はＧＳＴ−ＭＤＭ２（１−１３４）を発現するプラスミドｐＢＣ−ＭＤＭ２又はｐＢＣ−ＭＤＭ２（１−１３４）と、ｐ１０７又はｐ１０７の突然変異体の発現プラスミドをＣｏｓ細胞に共トランスフェクトする。全細胞抽出物からのタンパク質複合体ＧＳＴ−ＭＤＭ２−ｐ１０７をセファロースグルタチオンビーズ上で単離し、抗ｐ１０７ポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｐ１０７−Ｃ１８）を用いてウェスタンブロットによりｐ１０７タンパク質を検出する。得られた結果を下表ＩＩに示す。
【００８５】
【表２】
【００８６】
上記結果から明らかなように、Ｍｄｍ２とｐ１０７のタンパク質−タンパク質相互作用はｉｎ ｖｉｔｒｏだけでなく細胞内でも存在する。細胞形質転換に必要なＭｄｍ２の領域（１〜１３４）はｐ１０７と相互作用する領域である。この領域はより厳密には「ポケットドメイン」、「Ａ」領域及び「スペーサー」の一部に位置するとして位置決定された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
無ｐ５３コンテキストの癌の治療用医薬組成物の製造のための、Ｍｄｍ２タンパク質の腫瘍原活性を少なくとも部分的に阻害することが可能な化合物の使用。
【請求項２】
配列番号１に示すＭｄｍ２タンパク質の配列の１〜１３４ドメインのレベルに結合することが可能な化合物の請求項１に記載の使用。
【請求項３】
化合物が前記Ｍｄｍ２タンパク質の１〜１３４ドメインに対するｓｃＦＶであることを特徴とする請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
化合物が配列番号２に示す配列のペプチド１〜５２、１〜４１、６〜４１、１６〜２５、１８〜２３又はその誘導体の１種により完全又は部分的に表されることを特徴とする請求項１又は２に記載の使用。
【請求項５】
配列番号１に示すＭｄｍ２タンパク質の配列の１〜１３４ドメインの近傍のドメインに結合することが可能であり、この結合により前記タンパク質の腫瘍原活性を改変する化合物の請求項１に記載の使用。
【請求項６】
化合物がＭｄｍ２タンパク質のＣ末端ドメインと相互作用することを特徴とする請求項１又は５に記載の使用。
【請求項７】
化合物がＴＦＩＩ、ＴＢＰ及びＴＡＦ２５０から選択される転写因子であることを特徴とする請求項１、５又は６に記載の使用。
【請求項８】
化合物がＭｄｍ２タンパク質の１３５〜４９１ドメインと相互作用することを特徴とする請求項１又は５に記載の使用。
【請求項９】
化合物がタンパク質Ｒｂ、Ｌ５及び転写因子Ｅ２Ｆから選択されるタンパク質の全部又は一部であることを特徴とする請求項１、５又は８に記載の使用。
【請求項１０】
癌治療用医薬組成物の製造のための、Ｍｄｍ２タンパク質の１〜１３４ドメインに対するｓｃＦＶの使用。
【請求項１１】
無ｐ５３コンテキストの癌の治療用医薬組成物の製造のための、Ｍｄｍ２タンパク質の腫瘍原活性を阻害することが可能な化合物をコードする核酸の使用。
【請求項１２】
核酸がアンチセンス核酸、Ｍｄｍ２タンパク質のドメインの１つに直接固定しその腫瘍原活性を阻害することが可能なリガンドオリゴリボヌクレオチド、Ｍｄｍ２のドメインの１つとオリゴマーを形成しその腫瘍原活性を阻害することが可能なペプチドもしくはタンパク質の全部もしくは一部をコードする核酸、又は配列番号１に示すＭｄｍ２タンパク質の配列の１〜１３４ドメインに対する細胞内抗体をコードする核酸であることを特徴とする請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
アンチセンス核酸が、Ｍｄｍ２タンパク質をコードする核酸に相補的であり、その転写及び／又はその翻訳を阻害することが可能なＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ）又はリボザイムをコードするＤＮＡであることを特徴とする請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
核酸がＤＥＡＥ−デキストランとの複合体、核タンパク質との複合体、カチオン脂質もしくはポリマーとの複合体、リポソーム形態又はそのままで使用されることを特徴とする請求項１１から１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
核酸がベクターの一部を構成することを特徴とする請求項１１から１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
核酸がアデノウイルス、レトロウイルス及びアデノ随伴ウイルスから選択されるウイルスベクターの一部を構成することを特徴とする請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
Ｍｄｍ２タンパク質の腫瘍原活性を少なくとも部分的に阻害することが可能な化合物をコードする核酸配列を含むウイルスベクター。
【請求項１８】
核酸配列がｓｃＦＶ又はＭｄｍ２タンパク質の１〜１３４ドメイン（配列番号１）のレベルに相互作用することが可能なペプチドをコードすることを特徴とする請求項１７に記載のウイルスベクター。
【請求項１９】
アデノウイルス、レトロウイルス及びアデノ随伴ウイルスから選択されることを特徴とする請求項１７又は１８に記載のウイルスベクター。
【請求項２０】
アデノウイルス又はレトロウイルスであることを特徴とする請求項１７から１９のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
【請求項２１】
請求項１から１１のいずれか一項に記載のＭｄｍ２タンパク質の腫瘍原活性を阻害することが可能な化合物を含む医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１２又は１３に記載のＭｄｍ２タンパク質の腫瘍原活性を阻害することが可能な化合物をコードする核酸配列を含む医薬組成物。
【請求項２３】
請求項１４から２０のいずれか一項に記載の少なくとも１種のウイルスベクターを含むことを特徴とする請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
腫瘍内投与用に調剤された請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
癌治療用医薬組成物の製造のための、Ｍｄｍ２タンパク質の１〜１３４ドメイン（配列番号１）に対する細胞内抗体をコードする核酸配列の使用。
【請求項１】
無ｐ５３コンテキストの癌の治療用医薬組成物の製造のための、Ｍｄｍ２タンパク質の腫瘍原活性を少なくとも部分的に阻害することが可能な化合物の使用。
【請求項２】
配列番号１に示すＭｄｍ２タンパク質の配列の１〜１３４ドメインのレベルに結合することが可能な化合物の請求項１に記載の使用。
【請求項３】
化合物が前記Ｍｄｍ２タンパク質の１〜１３４ドメインに対するｓｃＦＶであることを特徴とする請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
化合物が配列番号２に示す配列のペプチド１〜５２、１〜４１、６〜４１、１６〜２５、１８〜２３又はその誘導体の１種により完全又は部分的に表されることを特徴とする請求項１又は２に記載の使用。
【請求項５】
配列番号１に示すＭｄｍ２タンパク質の配列の１〜１３４ドメインの近傍のドメインに結合することが可能であり、この結合により前記タンパク質の腫瘍原活性を改変する化合物の請求項１に記載の使用。
【請求項６】
化合物がＭｄｍ２タンパク質のＣ末端ドメインと相互作用することを特徴とする請求項１又は５に記載の使用。
【請求項７】
化合物がＴＦＩＩ、ＴＢＰ及びＴＡＦ２５０から選択される転写因子であることを特徴とする請求項１、５又は６に記載の使用。
【請求項８】
化合物がＭｄｍ２タンパク質の１３５〜４９１ドメインと相互作用することを特徴とする請求項１又は５に記載の使用。
【請求項９】
化合物がタンパク質Ｒｂ、Ｌ５及び転写因子Ｅ２Ｆから選択されるタンパク質の全部又は一部であることを特徴とする請求項１、５又は８に記載の使用。
【請求項１０】
癌治療用医薬組成物の製造のための、Ｍｄｍ２タンパク質の１〜１３４ドメインに対するｓｃＦＶの使用。
【請求項１１】
無ｐ５３コンテキストの癌の治療用医薬組成物の製造のための、Ｍｄｍ２タンパク質の腫瘍原活性を阻害することが可能な化合物をコードする核酸の使用。
【請求項１２】
核酸がアンチセンス核酸、Ｍｄｍ２タンパク質のドメインの１つに直接固定しその腫瘍原活性を阻害することが可能なリガンドオリゴリボヌクレオチド、Ｍｄｍ２のドメインの１つとオリゴマーを形成しその腫瘍原活性を阻害することが可能なペプチドもしくはタンパク質の全部もしくは一部をコードする核酸、又は配列番号１に示すＭｄｍ２タンパク質の配列の１〜１３４ドメインに対する細胞内抗体をコードする核酸であることを特徴とする請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
アンチセンス核酸が、Ｍｄｍ２タンパク質をコードする核酸に相補的であり、その転写及び／又はその翻訳を阻害することが可能なＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡ）又はリボザイムをコードするＤＮＡであることを特徴とする請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
核酸がＤＥＡＥ−デキストランとの複合体、核タンパク質との複合体、カチオン脂質もしくはポリマーとの複合体、リポソーム形態又はそのままで使用されることを特徴とする請求項１１から１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
核酸がベクターの一部を構成することを特徴とする請求項１１から１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
核酸がアデノウイルス、レトロウイルス及びアデノ随伴ウイルスから選択されるウイルスベクターの一部を構成することを特徴とする請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
Ｍｄｍ２タンパク質の腫瘍原活性を少なくとも部分的に阻害することが可能な化合物をコードする核酸配列を含むウイルスベクター。
【請求項１８】
核酸配列がｓｃＦＶ又はＭｄｍ２タンパク質の１〜１３４ドメイン（配列番号１）のレベルに相互作用することが可能なペプチドをコードすることを特徴とする請求項１７に記載のウイルスベクター。
【請求項１９】
アデノウイルス、レトロウイルス及びアデノ随伴ウイルスから選択されることを特徴とする請求項１７又は１８に記載のウイルスベクター。
【請求項２０】
アデノウイルス又はレトロウイルスであることを特徴とする請求項１７から１９のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
【請求項２１】
請求項１から１１のいずれか一項に記載のＭｄｍ２タンパク質の腫瘍原活性を阻害することが可能な化合物を含む医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１２又は１３に記載のＭｄｍ２タンパク質の腫瘍原活性を阻害することが可能な化合物をコードする核酸配列を含む医薬組成物。
【請求項２３】
請求項１４から２０のいずれか一項に記載の少なくとも１種のウイルスベクターを含むことを特徴とする請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
腫瘍内投与用に調剤された請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
癌治療用医薬組成物の製造のための、Ｍｄｍ２タンパク質の１〜１３４ドメイン（配列番号１）に対する細胞内抗体をコードする核酸配列の使用。
【図１】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１１−２２５５７１（Ｐ２０１１−２２５５７１Ａ）
【公開日】平成２３年１１月１０日（２０１１．１１．１０）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−１０２８２６（Ｐ２０１１−１０２８２６）
【出願日】平成２３年５月２日（２０１１．５．２）
【分割の表示】特願平９−５１０９００の分割
【原出願日】平成８年９月２日（１９９６．９．２）
【出願人】（５０５３６０４７６）
【出願人】（５９４１５８５８５）アンステイテユ・ナシオナル・ドウ・ラ・サンテ・エ・ドウ・ラ・ルシエルシユ・メデイカル (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月１０日（２０１１．１１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１０２８２６（Ｐ２０１１−１０２８２６）
【出願日】平成２３年５月２日（２０１１．５．２）
【分割の表示】特願平９−５１０９００の分割
【原出願日】平成８年９月２日（１９９６．９．２）
【出願人】（５０５３６０４７６）
【出願人】（５９４１５８５８５）アンステイテユ・ナシオナル・ドウ・ラ・サンテ・エ・ドウ・ラ・ルシエルシユ・メデイカル (3)
【Ｆターム（参考）】
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