Ｎ結合型グリカン化合物
Ａ−ＧｌｃＮＡｃ［ＧｌｃＮＡｃ］−ＧａｌＮＡｃ−ＧａｌＮＡｃ−ＱｕｉＮＡｃ４ＮＡｃ（ＡはＧｌｃＮＡｃまたはＧｌｃである）を含む単離または精製化合物が提供される。カンピロバクター生物により引き起こされる感染症を治療または予防するための特定の用途を有する、前記化合物に基づくワクチンがさらに提供される。カンピロバクター生物により引き起こされる感染症の存在を診断するための特定の用途を有する、前記化合物に対する抗体または抗血清も提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、任意選択によりアミノ酸、ペプチド、タンパク質もしくは脂質に融合または結合していてもよい式１のＮ結合型グリカン化合物に関する。本発明はさらに、前記化合物に対する抗体および抗血清、ならびにカンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）病原体により引き起こされる感染症を診断するためのその使用に関する。本発明はさらに、カンピロバクター病原体による感染症を治療または予防するためのワクチンとしての該化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）およびカンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）は、ヒト感染症を引き起こすカンピロバクターの最も一般的に単離された２種である。これらの生物は、世界中で高い割合の胃腸炎を引き起こし、ケース数ではしばしばサルモネラ、赤痢菌および腸内毒素原性大腸菌を合わせた数を超えている（Ｂｕｔｚｌｅｒ ＪＰ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２００４）。さらに、カンピロバクター・ジェジュニ感染症は、ポリオ根絶以来病原体により引き起こされる麻痺の最も一般的な原因であるギラン−バレー症候群の発症と関連づけられてきた（概要については、Ｋａｉｄａ Ｋ、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００９；Ｂｅｒｅｓｗｉｌｌ Ｓ＆Ｋｉｓｔ Ｍ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、２００３参照）。他のカンピロバクター種は、ヒト胃腸炎の新興病原体と認識されており（カンピロバクター・ウプサリエンシス（Ｃ．ｕｐｓａｌｉｅｎｓｉｓ）、カンピロバクター・ハイオインテスティナリス（Ｃ．ｈｙｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ））、子供の炎症性腸疾患、歯肉炎、歯周炎およびヒトの流産（カンピロバクター・レクタス（Ｃ．ｒｅｃｔｕｓ）、カンピロバクター・コンサイサス（Ｃ．ｃｏｎｃｉｓｕｓ））（Ｚｈａｎｇ ＬＳ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００９）、ならびに家畜の性病および不妊症（特にウシ；カンピロバクター・フィタス・ベネレアリス（Ｃ．ｆｅｔｕｓ ｖｅｎｅｒｅａｌｉｓ））、およびヒツジの流産（カンピロバクター・フィタス・フィタス（Ｃ．ｆｅｔｕｓ ｆｅｔｕｓ））（Ｂｕｔｚｌｅｒ ＪＰ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、２００４およびその中の参考文献）と関連づけられた。
【０００３】
２０００年のカンピロバクター・ジェジュニのゲノム配列の公開（Ｐａｒｋｈｉｌｌ等、Ｎａｔｕｒｅ、２０００）以来、いくつかの他のカンピロバクターのゲノム配列が報告されてきた。今までに記載されてきた細菌の大部分とは異なり、全てのカンピロバクターは、Ｎ結合型タンパク質グリコシル化に必要とされる保存されたｐｇｌ遺伝子を含む（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ ＣＭ＆Ｗｒｅｎ ＢＷ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００５；Ｎｏｔｈａｆｔ Ｈ＆Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ ＣＭ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０１０）。
【０００４】
真核生物では、グリコシル化タンパク質は、細胞外基質および細胞表面の遍在性成分である。そのオリゴ糖部分は、免疫認識からがん進行に及ぶ生物学的過程において重要な広範囲の細胞−細胞および細胞−基質認識事象に関係している。グリコシル化は、以前は真核生物に限定したものであると考えられていたが、分析方法およびゲノム配列決定の進歩により、細菌においてＯ結合型およびＮ結合型タンパク質グリコシル化経路の両方についての報告が増加してきた（Ｎｏｔｈａｆｔ Ｈ＆Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ ＣＭ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１０）。細菌における最初の一般的なタンパク質グリコシル化経路の発見（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ ＣＭ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９９）、カンピロバクター・ジェジュニのグリカンは、全部Ｎ結合を通して結合しており（Ｋｅｌｌｙ ＪＨ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ２００６、Ｗａｃｋｅｒ Ｍ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２、Ｙｏｕｎｇ ＮＭ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００２）、経路を大腸菌に機能的に伝達することができるだけでなく（Ｗａｃｋｅｒ Ｍ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２）、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ酵素（ＰｇｌＢ）は外来性の糖をタンパク質に付加することができる（Ｆｅｌｄｍａｎ Ｍ等、ＰＮＡＳ ２００５）という証明以来、高まる研究活動が、この系のさらなる特徴づけおよび利用をもたらしてきた。
【０００５】
カンピロバクター・ジェジュニのＮ結合型七糖の詳細な構造が記載されている（Ｙｏｕｎｇ ＮＭ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００２）。高分解能マジック角スピニング（ＨＲ−ＭＡＳ）ＮＭＲなどの方法を使用して（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ ＣＭ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００３）、カンピロバクター・ジェジュニとカンピロバクター・コリの両方でこの七糖は構造が保存されていることが示された。
【０００６】
カンピロバクター・ジェジュニのＮ結合型グリコシル化経路の中間体、すなわち、遊離（オリゴ−）七糖（ｆＯＳ）−カンピロバクター・ジェジュニの細胞膜周辺腔の可溶性成分が記載されている（Ｌｉｕ Ｘ等、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６）。このｆＯＳは、タンパク質上に付加しているＮ結合型オリゴ糖と同一の構造を有する（Ｎｏｔｈａｆｔ Ｈ等、ＰＮＡＳ ２００９）。実験室での増殖条件下で、ｆＯＳ対タンパク質にＮ結合している七糖の比率は、約９：１である。カンピロバクター・ジェジュニのｆＯＳは、細菌の周辺質グルカンと同様に浸透圧調節で役割を果たしており、この経路は、環境の浸透圧調節物質濃度を変えることにより、操作することができる（Ｎｏｔｈａｆｔ Ｈ等、ＰＮＡＳ ２００９）。
【０００７】
図１は、カンピロバクター・ジェジュニ中のＮ結合型タンパク質グリコシル化および遊離オリゴ糖を示している。ウンデカプレニルピロリン酸結合型七糖は、ヌクレオチド活性化糖の付加により、サイトゾル内に集合する（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ ＣＭ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００３；Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ ＣＭ等、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００３）。完全な七糖は、ＡＢＣ輸送体ＰｇｌＫにより内膜を横切って周辺質に移される（Ａｌａｉｍｏ Ｃ等、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、２００６）。オリゴ糖は、ＰｇｌＢにより、タンパク質コンセンサス配列、Ｄ／Ｅ−Ｘ１−Ｎ−Ｘ２−Ｓ／Ｔ（Ｘ１、Ｘ２は、プロリンを除く任意のアミノ酸であり得る）中のアスパラギンのアミノ基に移される（Ｋｏｗａｒｉｋ Ｍ等、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ２００６；Ｙｏｕｎｇ ＮＭ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００２）。さらに、大量の遊離七糖（ｆＯＳ）を、カンピロバクター・ジェジュニ中に見出すことができる（Ｌｉｕ Ｘ等、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６）；ｆＯＳとＮ−グリカンの比率は、９：１であると決定された。ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ−アセチルガラクトサミン；バシロサミン（Ｂａｃ）、２,４−ジアセトアミド−２,４,６−トリデオキシグルコース；ＧａｌＮＡｃ、Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｇｌｃ、グルコース（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ ＣＭ等、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００３より）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、その全てがＮ結合型グリカンおよびｆＯＳを有するいくつかのカンピロバクター種からＮ−グリカンおよびｆＯＳ構造を決定した。さらに、発明者等は、カンピロバクターのＮ−グリカンおよびｆＯＳを、２つの構造グループに分けることができることを証明した。第１グループは、カンピロバクター・ジェジュニおよびカンピロバクター・コリについて公開されたものと類似の構造を産生する（Ｙｏｕｎｇ ＮＭ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００２；Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ ＣＭ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００３）。第２グループは、カンピロバクター・ジェジュニおよびカンピロバクター・コリについて決定されたものとは異なり、今まで記載されたことがない独特のグリカン構造を産生する。このグループに入るカンピロバクター種には、カンピロバクター・フィタス・ベネレアリス（家畜の性病および不妊症の原因）、カンピロバクター・フィタス・フィタス（ヒツジの流産の原因）、カンピロバクター・コンサイサス（歯肉炎および歯周炎に関連し、胃腸炎の患者の糞便から単離された）、カンピロバクター・ハイオインテスティナリス（カンピロバクター・ジェジュニおよびカンピロバクター・コリのように、下痢に関連する）ならびにカンピロバクター・ハイオインテスティナリス亜種が含まれる。
【０００９】
カンピロバクター・スプトルム（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｕｔｏｒｕｍ）およびカンピロバクター・スプトルム亜種、カンピロバクター・ラニエナエ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｎｉｅｎａｅ）、カンピロバクター・ウレオリチカス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）（胃腸炎に関与していることが示唆されている新興腸病原体、Ｂｕｌｌｍａｎ Ｓ等、ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ＆Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０１０）、カンピロバクター・ホミニス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｈｏｍｉｎｉｓ）、カンピロバクター・グラシリス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｇｒａｃｉｌｉｓ）、カンピロバクター・レクタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｒｅｃｔｕｓ）（歯周疾患およびヒトの流産）、カンピロバクター・ショウアエ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｏｗａｅ）、カンピロバクター・ムコサリス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｃｏｓａｌｉｓ）ならびにカンピロバクター・カーブス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｕｒｖｕｓ）は、第２グループの中に入ると考えられる。
【００１０】
図２は、ゲノム配列決定されたカンピロバクター種および他の関連生物を含む、この経路の主要成分、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＰｇｌＢ）のタンパク質配列の系統発生解析を説明しており、カンピロバクターが２つのグループに分かれることを証明している。カンピロバクター分枝中、構造１を産生する種は上の囲みの中にあり、式１Ａおよび式１Ｂを産生する株は下の囲みの中にある（Ｎｏｔｈａｆｔ Ｈ＆Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ ＣＭ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０１０より）。
【００１１】
図３は、（Ａ）カンピロバクター・ジェジュニのＮ−グリカン特異的抗血清、（Ｂ）ＳＢＡ−レクチン（構造１の末端ＧａｌＮＡｃ残基を認識する）に対するＮ−グリカン反応性、（Ｃ）ＷＧＡ−レクチン反応性（ＧａｌＮＡｃ構造との交差反応性により、式１Ａおよび１Ｂの末端ＧｌｃＮＡｃ残基を認識する）および（Ｄ）質量分析に基づくｆＯＳ解析が、ｐｇｌ経路由来のグリカンがカンピロバクター種間で異なることを示したことを説明している。
【００１２】
一態様によると、本発明は、式１：Ａ−ＧｌｃＮＡｃ［ＧｌｃＮＡｃ］−ＧａｌＮＡｃ−ＧａｌＮＡｃ−ＱｕｉＮＡｃ４ＮＡｃ（ＡはＧｌｃＮＡｃまたはＧｌｃである）の新規なＮ結合型グリカン（Ｎ−グリカンと呼ぶ）化合物に関する。天然型のこの化合物は、いくつかのカンピロバクター種に共通である。その天然型では、化合物は、周辺質に可溶性であると同時に、病原体を含む多くのカンピロバクター種の内膜および周辺タンパク質および最も特に表面外膜タンパク質に結合している。本発明では、式１の化合物は、単離および／または精製型で提供される。化合物は、ＧｌｃまたはＧｌｃＮＡｃのいずれかを含む、末端糖が互いに異なる２種の七糖を含む。前記化合物の第１は、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ［ＧｌｃＮＡｃ］−ＧａｌＮＡｃ−ＧａｌＮＡｃ−ＱｕｉＮＡｃ４ＮＡｃ（本明細書中式１Ａ）である。前記化合物の第２は、Ｇｌｃ−ＧｌｃＮＡｃ［ＧｌｃＮＡｃ］−ＧａｌＮＡｃ−ＧａｌＮＡｃ−ＱｕｉＮＡｃ４ＮＡｃ（本明細書中式１Ｂ）である。
【００１３】
上記式１中、ＱｕｉＮＡｃ４ＮＡｃは、バシロサミンの略語を構成する糖類Ｂａｃの代替能記を表す。
【００１４】
一態様では、本発明は、単一のアミノ酸、オリゴペプチド、ペプチド、タンパク質もしくは脂質に接続または結合した式１の化合物を含む、単離または精製化合物に関する。一態様では、オリゴペプチドまたはペプチドは、２〜４個のアミノ酸、または２〜３０個のアミノ酸、または２〜２０個のアミノ酸、または２〜１０個のアミノ酸を含む。
【００１５】
本発明はさらに、式１の化合物を提供するステップと、前記化合物を動物またはヒトに接種して前記化合物に対する免疫応答を刺激するステップと、前記動物から血清を回収するステップと、任意選択により前記血清を精製して抗体または抗血清を得るステップとを含む、抗体または抗血清を産生する方法に関する。得られる抗体または抗血清は、カンピロバクター・フィタス・ベネレアリス、カンピロバクター・フィタス・フィタス、カンピロバクター・コンサイサス、カンピロバクター・ハイオインテスティナリスおよびカンピロバクター・ハイオインテスティナリス亜種、カンピロバクター・スプトルムおよびカンピロバクター・スプトルム亜種、カンピロバクター・ラニエナエ、カンピロバクター・ウレオリチカス、カンピロバクター・ホミニス、カンピロバクター・グラシリス、カンピロバクター・レクタス、カンピロバクター・ショウアエ、カンピロバクター・ムコサリスならびにカンピロバクター・カーブスを含む、本明細書に記載されているグリカンが生まれつき備わっているカンピロバクター種に結合する。
【００１６】
抗体または抗血清は、動物中またはヒト中の前記生物の存在を検出する診断目的のために使用することができる。
【００１７】
本発明の化合物は、家畜の生殖障害の主要な原因であり、現在のワクチンの使用が限られているカンピロバクター・フィタス・ベネレアリスに対する、または式１のグリカンが生まれつき備わっている、上に列挙した種を含む他のカンピロバクター種に対する、アジュバントを含むまたは含まないワクチン製剤に使用することができる。本発明の化合物は、タンパク質糖タンパク質工学、治療および診断用途への使用が可能である。したがって、本発明は、任意選択により単一のアミノ酸、オリゴペプチド、ペプチド、タンパク質もしくは脂質に接続または結合している式１の化合物を含むワクチンに関する。単一のアミノ酸は、アスパラギンを含むことができる。
【００１８】
本発明はさらに、カンピロバクター生物により引き起こされる感染症を治療もしくは予防するための、式１の化合物が前記生物中の天然グリカンを含む前記ワクチンの使用、およびヒトもしくは動物中での前記使用を含む治療方法に関する。
【００１９】
別の態様によると、本発明は、上記ワクチンを動物の群に投与することにより動物の群の生殖力および健康を改善する方法に関する。
【００２０】
本明細書に記載するワクチン、抗体および抗血清はまた、ヒトにおける予防、治療および診断のために使用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】カンピロバクター・ジェジュニ中のＮ結合型タンパク質グリコシル化および遊離オリゴ糖を示す図である。
【図２】種々のカンピロバクター種におけるｆＯＳおよびＮ−グリカン構造を要約する図である。
【図３】選択したカンピロバクター種におけるＮ−グリカンおよびｆＯＳ解析を示す図である。
【図３Ｄ（１）】選択したカンピロバクター種におけるＮ−グリカンおよびｆＯＳ解析を示す図である。
【図３Ｄ（２）】選択したカンピロバクター種におけるＮ−グリカンおよびｆＯＳ解析を示す図である。
【図３Ｄ（３）】選択したカンピロバクター種におけるＮ−グリカンおよびｆＯＳ解析を示す図である。
【図３Ｄ（４）】選択したカンピロバクター種におけるＮ−グリカンおよびｆＯＳ解析を示す図である。
【図３Ｄ（５）】選択したカンピロバクター種におけるＮ−グリカンおよびｆＯＳ解析を示す図である。
【図４Ａ】カンピロバクター・フィタス・フィタスから精製したｆＯＳの１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図４Ｂ】カンピロバクター・フィタス・フィタスおよびカンピロバクター・フィタス・ベネレアリスについての２Ｄ ＨＳＱＣ ＮＭＲスペクトルの重ね合わせを示す図である。
【図５】カンピロバクター・ジェジュニ、カンピロバクター・コリおよびカンピロバクター・ウプサリエンシスのｆＯＳおよびＮ−グリカン（構造１）ならびに本明細書に記載する他のカンピロバクター種からの式１Ａおよび式１Ｂの構造を示す図である。
【図６】本明細書に記載する条件下での式１Ａおよび式１Ｂの溶出プロファイルならびに精製した式１Ａおよび式１Ｂの確認を示す図である。
【図６Ｄ】本明細書に記載する条件下での式１Ａおよび式１Ｂの溶出プロファイルならびに精製した式１Ａおよび式１Ｂの確認を示す図である。
【図６Ｅ】本明細書に記載する条件下での式１Ａおよび式１Ｂの溶出プロファイルならびに精製した式１Ａおよび式１Ｂの確認を示す図である。
【図７】精製した式１Ａおよび式１Ｂ化合物とＢＳＡの結合を示す図である。
【図８】ＢＳＡ−糖複合体の各々に対して産生した抗血清による免疫ブロットを示す図である。
【図９Ａ】グリカン部分として式１の化合物を含む糖ペプチドのＭＳスペクトルを示す図である。
【図９Ｂ】グリカン部分として式１の化合物を含む糖ペプチドのＭＳスペクトルを示す図である。
【図９Ｃ】グリカン部分として式１の化合物を含む糖ペプチドのＭＳスペクトルを示す図である。
【図９Ｄ】グリカン部分として式１の化合物を含む糖ペプチドのＭＳスペクトルを示す図である。
【図９Ｅ】グリカン部分として式１の化合物を含む糖ペプチドのＭＳスペクトルを示す図である。
【図９Ｆ】グリカン部分として式１の化合物を含む糖ペプチドのＭＳスペクトルを示す図である。
【図１０】式１Ａおよび式１Ｂ特異的抗血清により標識したカンピロバクター細胞を示す図である。
【図１１】式１Ａ、式１Ｂおよび構造１に対して産生した抗血清による免疫ブロットを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、グリカン化合物Ａ−ＧｌｃＮＡｃ［ＧｌｃＮＡｃ］−ＧａｌＮＡｃ−ＧａｌＮＡｃ−ＱｕｉＮＡｃ４ＮＡｃ（ＡはＧｌｃＮＡｃまたはＧｌｃである）に関する。上記化合物は、２種のグリカン化合物ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ［ＧｌｃＮＡｃ］−ＧａｌＮＡｃ−ＧａｌＮＡｃ−ＱｕｉＮＡｃ４ＮＡｃ（本明細書中式１Ａ）およびＧｌｃ−ＧｌｃＮＡｃ［ＧｌｃＮＡｃ］−ＧａｌＮＡｃ−ＧａｌＮＡｃ−ＱｕｉＮＡｃ４ＮＡｃ（本明細書中式１Ｂ）を包含する。
【００２３】
上記式中、ＱｕｉＮＡｃ４ＮＡｃは、バシロサミンの略語を構成する糖類Ｂａｃの代替能記を表す（ｄｉＮＡｃＢａｃとしても知られている）。式１の化合物は、任意選択により単一のアミノ酸、オリゴペプチド、ペプチド、タンパク質もしくは脂質に接続または結合している。
【００２４】
前記脂質は、細菌の、古細菌のもしくは真核生物の供給源から単離および精製することができる、あるいは化学合成することができる。グリカン化合物と脂質の前記結合は、リン酸、ピロリン酸リンカーにより、またはグリコシド結合により媒介され得る。Ｎ−グリカンに結合している脂質（種々の鎖長、飽和度および立体配置を有する）の例が記載された（Ｆａｒｉｄｍｏａｙｅｒ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００９；Ｃｈｅｎ ＭＭ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００７）。本来の宿主中でまたは異種発現系中で産生される脂質結合Ｎ−グリカン化合物には、カンピロバクター・ジェジュニのＮ−グリカンについて示され（Ｒｅｌｄ ＣＷ等、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００８、Ｒｅｉｄ ＣＷ等、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００９）、カンピロバクター・ラリ（Ｃ．ｌａｒｉ）のＮ−グリカン（Ｓｃｈｗａｒｚ Ｆ等、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１１）およびＮ−グリカン−脂質Ａ複合体（カンピロバクター・ジェジュニのＮ−グリカンについて示された（ｖａｎ Ｓｏｒｇｅ ＮＭ等、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００９））について提案されたようなウンデカプレニル−リン酸結合Ｎ−グリカン化合物が含まれる。
【００２５】
上記化合物は、複数種のカンピロバクター中で実質的に保存されていることが決定された。
【００２６】
図３Ａ〜図３Ｄは、選択したカンピロバクター種におけるＮ−グリカンおよびｆＯＳを示している。（Ａ）（Ｂ）末端ＧａｌＮＡｃ残基を認識するダイズ凝集素とも反応するが、（Ｃ）式１Ａおよび式１Ｂ中に存在する末端ＧｌｃＮＡｃ残基を認識するコムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）とほとんど反応性を示さない他のカンピロバクター種（開いた囲み）と交差反応するカンピロバクター・ジェジュニのＮ結合型七糖を認識する抗血清を使用したウェスタンブロット。カンピロバクター・ジェジュニ特異的抗血清と反応しなかったが、ＷＧＡと反応した種を強調表示した。（Ｄ）（１）カンピロバクター・ジェジュニ、（２）カンピロバクター・フィタス・ベネレアリス、（３）カンピロバクター・コンサイサス、（４）カンピロバクター・フィタス・フィタスおよび（５）カンピロバクター・ハイオインテスティナリスのｆＯＳまたはＡｓｎ−結合に富む分画の質量分析の例；質量分析により解析した全ての種の結果を表１に要約している。
【００２７】
【表１】
【００２８】
表１．選択したカンピロバクター菌株中の質量分析により決定したｆＯＳおよびＮ−グリカン構造質量。数字は、遊離オリゴ糖（ｆＯＳ）もしくはＡｓｎ結合型のいずれかとしての式１Ａおよび式１Ｂの質量を示している。質量は、示した菌株の全細胞可溶化液から陽イオンモードで得た。式１Ａおよび式１Ｂの構造を、図４、表３および図５に示すようにＮＭＲにより決定した。Ｎ／Ｄは未決定である。
【００２９】
実施例１ 式１Ａおよび１Ｂの化合物の精製
カンピロバクター・ジェジュニ１１１６８、カンピロバクター・コンサイサス、カンピロバクター・ハイオインテスティナリス、カンピロバクター・フィタス・フィタスおよびカンピロバクター・フィタス・ベネレアリスを、微好気性条件下で培養した。遠心分離後に得られた全細胞をｐＨ８（アンモニアの添加により調整した）、３７℃で４８時間、大過剰のプロテイナーゼＫにより分解した。分解産物または遊離オリゴ糖を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５カラム（１．５×６０ｃｍ）で分離し、各分画を溶出した後、塩ピークを乾燥して、1Ｈ ＮＭＲにより解析した。所望の産物を含む分画を、Ｈｉｔｒａｐ Ｑカラム（５ｍＬサイズ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）で陰イオン交換クロマトグラフィーにより分離し、グリカンを直線勾配のＮａＣｌ（０〜１Ｍ、１時間）で溶出したところ、両グリカン化合物（式１Ａおよび式１Ｂ）の混合物が単離された。ＮＭＲによる解析の前に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１５で脱塩を行った。
【００３０】
実施例２：ＮＭＲ分光法解析
標準パルスシーケンスＤＱＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ（混合時間１２０ｍｓ）、ＲＯＥＳＹ（混合時間５００ｍｓ）、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣ（１００ｍｓ広範囲転送遅延）を使用して、アセトン内部標準（1Ｈについては２．２２５ｐｐｍおよび13Ｃについては３１．４５ｐｐｍ）を用いて、２５℃、３ｍｍ勾配プローブにより、Ｖａｒｉａｎ ＩＮＯＶＡ５００ＭＨｚ（1Ｈ）分光計で、実施例１で得たグリカンに対するＮＭＲ実験を行った。ＡＱ時間を、Ｈ−Ｈ相関については０．８〜１秒およびＨＳＱＣについては０．２５秒に維持し、t１について２５６インクリメントを得た。結果を、図４、図５（ＮＭＲスペクトルおよび構造）ならびに化学シフトに相当する表２に示す。
【００３１】
図４Ａは、カンピロバクター・フィタス・フィタスから精製したｆＯＳの１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。図４Ｂは、カンピロバクター・フィタス・フィタスおよびカンピロバクター・フィタス・ベネレアリスについての２Ｄ ＨＳＱＣスペクトルの重ね合わせであり、両種のｆＯＳ構造が同一であることを示している。ＮＭＲスペクトルは、カンピロバクター・コンサイサスについて得られたものと重ね合わせることもできる（図示せず）。カンピロバクター・フィタス・フィタスから精製した遊離オリゴ糖についての対応する化学シフトδ（ｐｐｍ）（図４Ａに示すような）を、表２に要約する。炭素およびプロトン化学シフトは、内部アセトン標準（δＨ２．２２５ｐｐｍ、δＣ３１．０７ｐｐｍ）を基準とした。
【００３２】
タンパク質に付加しているまたは遊離型（ｆＯＳ）で現れるカンピロバクターグリカンは、２つの構造グループに分けることができる。カンピロバクター種の第１グループは、カンピロバクター・ジェジュニおよびカンピロバクター・コリについて以前に決定され、カンピロバクター・ウプサリエンシスについて本明細書で決定された独特のグリカン構造を産生する。第２グループに入るカンピロバクターは、カンピロバクター・フィタス・ベネレアリス（家畜の性病および不妊症の原因）、カンピロバクター・フィタス・フィタス（ヒツジの流産の原因）、カンピロバクター・コンサイサス、カンピロバクター・ハイオインテスティナリス、カンピロバクター・ハイオインテスティナリス亜種、カンピロバクター・スプトルムおよびカンピロバクター・スプトルム亜種、カンピロバクター・ラニエナエ、カンピロバクター・ウレオリチカス、カンピロバクター・ホミニス、カンピロバクター・グラシリス、カンピロバクター・レクタス、カンピロバクター・ショウアエ、カンピロバクター・ムコサリスならびにカンピロバクター・カーブスからなる。
【００３３】
カンピロバクター・フィタス・フィタス、カンピロバクター・フィタス・ベネレアリスおよびカンピロバクター・コンサイサスから大規模精製した遊離オリゴ糖（ｆＯＳ）を使用したＮＭＲによる構造決定は、カンピロバクターのこの第２グループが、カンピロバクター・ジェジュニおよびカンピロバクター・コリについて当初記載されたものとは異なる構造を産生することを証明した（図４および図５）。
【００３４】
【表２】
【００３５】
表２：カンピロバクター・フィタス・フィタスから精製した遊離オリゴ糖（式１Ａおよび式１Ｂ）についての化学シフトδ（ｐｐｍ）（スペクトルについては図４Ａに示す）。炭素およびプロトン化学シフトは、内部アセトン標準（δＨ２．２２５ｐｐｍ、δＣ３１．０７ｐｐｍ）を基準とした。大文字は、図４Ａおよび図５に概要を述べた単糖残基を指す。
【００３６】
実施例３：単一のアミノ酸に結合した式１の化合物のグリカンの調製
完全細胞の溶解後に得られた全細胞抽出物をプロナーゼＥで分解した後、Ｌｉｕ Ｘ．等、ＡｎａｌＣｈｅｍ、２００５およびＮｏｔｈａｆｔ Ｈ．等、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２０１０により記載されているような質量分析により、カンピロバクター・ジェジュニの単一のアスパラギンに結合した七糖（構造１）およびカンピロバクター・フィタス・フィタスの単一のアスパラギンに結合した式１Ａ（表１）が同定された。
【００３７】
実施例４：式１化合物の発現
式１Ａおよび式１Ｂ化合物の産生および移行に必要な全ての遺伝子をコードするタンパク質グリコシル化オペロンをクローニングし、大腸菌プラスミドから発現させることができる。あるいは、カンピロバクター・ジェジュニのタンパク質グリコシル化（ｐｇｌ）オペロンを含む、Ｗａｃｋｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２により記載されたプラスミドpスフェラーゼに交換することができる。Ｎ結合型タンパク質グリコシル化のためのアフィニティータグ受容体ペプチド（カンピロバクター・ジェジュニおよびカンピロバクター・ラリのＮ−グリカンについて既に示されている。Ｗａｃｋｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２、Ｓｃｈｗａｒｚ等、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１１）の存在下で、またはこのようなタンパク質とファージタンパク質との融合体として（Ｄｕｅｒｒ等、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０１０）、異種系で、式１Ａおよび式１Ｂ化合物の発現を行うことができる。タンパク質／ペプチド／ファージを含むグリカンを、必要に応じてレクチンもしくはグリカン認識剤アフィニティークロマトグラフィーと組み合わせて、アフィニティータグ精製により精製して、グリコシル化ペプチドと非グリコシル化ペプチドを分離することができる。
【００３８】
実施例５：式１Ａおよび式１Ｂの精製
パルスアンペロメトリック検出（ＨＰＡＥＣ／ＰＡＤ）を使用して高速陰イオン交換クロマトグラフィーにより、精製した式１Ａおよび式１Ｂ ｆＯＳを分離した。図６は、以下の条件下でのＣａｒｂｏＰａｃ（登録商標）ＰＡ２００ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｏｌｕｍｎ（ガードカラム：３×５０ｍｍを備えた３×２５０ｍｍ ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１００）の溶出プロファイルを示す：流速：０．５ｍＬ／分；溶離系、１００ｍＭ水酸化ナトリウム中５０ｍＭ酢酸ナトリウム；検出モード、パルス電流測定、四倍波形、Ａｕ電極；周囲カラム温度を約３０℃に設定した（図６Ａ）。上で概要を述べたのと同じ条件下で、セミ分取ＰＡ１００カラム（９×２５０ｍｍ）およびフラクションコレクター（ＤＩＯＮＥＸ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００）を使用して、約０．５ｎｍｏｌの式１Ａと式１Ｂの混合物（図６Ａ）あるいは分離後の式１Ｂ（図６Ｂ）および式１Ａ（図６Ｃ）のいずれかをＨＰＡＥＣ／ＰＡＤにより解析した。式１Ａまたは式１Ｂのいずれかを含む分画を、等モル両の０．２Ｍ ＨＣｌで中和し、−２０℃で保管した。表１に概要を述べた式１Ａおよび式１Ｂの観測質量に対応する、精製後の精製した式１Ａ（図６Ｄ）および式１Ｂ（図６Ｅ）のエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）により得られたスペクトル。
【００３９】
実施例６：式１Ａおよび式１ＢとＢＳＡとの結合
還元的アミノ化により、実施例５で調製した精製および中和した、式１Ａおよび１Ｂ化合物をＢＳＡに結合させた（Ｇｉｌｄｅｒｓｌｅｅｖｅ ＪＣ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．２００８参照）。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；２μＬの１５０ｍｇ／ｍＬ溶液；分画Ｖ）、ホウ酸ナトリウム（５．５μＬの４００ｍＭ溶液、ｐＨ８．５）、硫酸ナトリウム（３．７μＬの３Ｍ溶液、５０℃）、オリゴ糖（式１Ａもしくは式１Ｂ）（７．０μＬの１５当量の２０ｍＭ溶液）、Ｈ2Ｏ（１．４μＬ）およびシアノ水素化ホウ素ナトリウム（２．２μＬの３Ｍ溶液）の混合物を、加熱した蓋をして、５６℃で９６時間、ＰＣＲサーマルサイクラー中、２００μＬのＰＣＲチューブ中でインキュベートした。反応物をＨ2Ｏで１００μＬの最終容積に希釈し、５００μｌの透析チューブ（ＭＷＣＯ１００００）に移し、Ｈ2Ｏ（２．５Ｌ）に対して３回透析した。
【００４０】
図７は、式１Ａおよび式１ＢとＢＳＡの結合を示す。糖複合体を１２．５％ＰＡＧＥにより分離し（Ａ）、アルカリホスファターゼと結合した市販のＷＧＡ−レクチンを使用してウエスタンブロッティングにより監視した（Ｂ）。１レーン、４００ｎｇ ＢＳＡ分画Ｖ；２レーン、４００ｎｇのＢＳＡ分画Ｖに連結した式１Ｂ；３レーン、４００ｎｇのＢＳＡ分画Ｖに連結した式１Ｂ。分子量マーカー（ＫＤａのＭＷ）を左に示す。
【００４１】
実施例７：式１Ａまたは式１Ｂ−ＢＳＡ複合体によるウサギ免疫化
６週間免疫化プロトコル（承認された動物実験委員会プロトコル第７１７号）を使用して、２ｍｇの実施例６で調製した糖複合体化合物の各々でニュージーランドホワイトウサギを免疫化した。フロイント完全アジュバント（抗原と１：１の比率）を使用した２．０ｍｇの抗原の初回皮下注射（３部位、各部位に０．５ｍｌを注射した）後、フロイント不完全アジュバント（抗原と１：１の比率）と混合した２．０ｍｇの式１Ａ−ＢＳＡ複合体および式１Ｂ−ＢＳＡ複合体の各々のブースター投与を、４週間後に皮下に行った（３部位、各部位に０．５ｍｌを注射した）。６週間後、血液試料を氷上で６０分間冷却した後、１０．０００×ｇで２０分間遠心分離することにより、各動物の５ｍｌ血液試料から血清を調製した。カンピロバクター全細胞可溶化液を使用したウエスタンブロッティングにより、式１Ａおよび式１Ｂ特異的抗体の産生について、個々の血清を解析した（図８）。
【００４２】
図８は、単一ＢＳＡ−糖複合体に対して産生した抗血清による免疫ブロットを示す：カンピロバクター・ジェジュニ１１１６８野生型（１レーン）、カンピロバクター・ジェジュニ１１１６８ｐｇｌＢ変異株（２レーン）またはカンピロバクター・フィタス・フィタス（３レーン）のいずれかからの１２０μｇの全細胞可溶化液を、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにアプライした。ＰＶＤＦ膜への転写後、固定化タンパク質を、（Ａ）ＢＳＡ−式１Ｂ化合物で免疫化したウサギから得た１：２０００希釈の血清試料（ＳＺＲ−１）および（Ｂ）ＢＳＡ−式１Ａ化合物で免疫化したウサギの血清（ＳＺＲ−３）でプローブした。分子量マーカー（ＫＤａのＭＷ）を左に示す。
【００４３】
実施例８：式１Ａおよび式１Ｂ化合物はＮ結合している。
細胞を、ＭＨブロス中、微好気性条件下で培養し、遠心分離により収集し、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．２中で２回洗浄した。ペレットを凍結乾燥し、１．５ｍｌのＬｏｂｉｎｄチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に入れた。ペレット（１０ｍｇ）を、１５０ユニットのＢｅｎｏｚａｎａｓｅの存在下で１ｍｌ氷冷トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に再懸濁し、ボルテックスして再懸濁し、氷上に保った。超音波処理（間に氷上で１分間を入れて、３０秒で６回）後、４℃、２００００×ｇで３０分間の遠心分離により、細胞片を除去した。上清をＬｏＢｉｎｄ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チューブに回収し、凍結乾燥した。記載のように試料処理、糖ペプチド富化および質量分析を適用した（Ｓｃｏｔｔ ＮＥ等 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２０１０）。カンピロバクター・フィタス・フィタス、カンピロバクター・フィタス・ベネレアリスおよびカンピロバクター・コンサイサスについて、タンパク質分解細胞可溶化液から得られるポリペプチド中に位置するアスパラギンにＮ結合した式１Ａおよび式１Ｂを同定した（表３）。
【００４４】
カンピロバクター・フィタス・フィタス、カンピロバクター・フィタス・ベネレアリスおよびカンピロバクター・コンサイサスから糖ペプチドを単離および同定し、結果を表３に示す。その全てのグリカン部分は、式１Ａまたは１Ｂの化合物を含んでいた。
【００４５】
【表３】
【００４６】
式１Ａおよび式１ＢとＮ結合していると同定されたタンパク質のリスト。多重反応モニタリング（ＭＲＭ）質量分析により、式１Ａおよび式１Ｂについての単一ピーク面積を測定した。
【００４７】
図９Ａ〜図９Ｆは、以下のように、式１Ａおよび式１Ｂ化合物が（同じペプチドと）Ｎ結合していることを示すＭＳスペクトルを示している。
９Ａ）トリプシン分解したＨＩＬＩＣ−ＬＣ富化ペプチドのＭＳスペクトル（前駆体イオンスキャン）；（Ｂ）対応するイオンの相対ピーク面積の定量化；（Ｃ）炭水化物部分のＭＳ／ＭＳ、（Ｄ）ｍ／ｚイオン９６８．４４５４５のペプチド部分のＭＳ／ＭＳ；９Ｅ）炭水化物部分のＭＳ／ＭＳおよび９Ｆ）ｍ／ｚイオン９８２．１２０６９のペプチド部分のＭＳ／ＭＳ。
【００４８】
実施例９ 式１Ａおよび１Ｂは、カンピロバクター細胞表面上に提示される。
カンピロバクター・フィタス・フィタス、カンピロバクター・フィタス・ベネレアリス、カンピロバクター・コンサイサス、カンピロバクター・ハイオインテスティナリスおよびカンピロバクター・ジェジュニの細胞を、微好気性条件下で１８〜２４時間ＭＨプレートで培養した。細胞を２ｍｌのＭＨブロスとともにプレートから収集し、氷上で１０分間冷却し、６０００×ｇで５分間遠心分離した。さらなる標識化および予冷却した（４℃）溶液を使用した洗浄ステップのために細胞を氷上に保った。細胞を、２ｍｌ洗浄緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ）で２回洗浄した。非特異的結合を防ぐために、細胞を３０分間洗浄緩衝液中１％脱脂乳でブロックした。一次抗体（０．５％脱脂乳を含む洗浄緩衝液に１：１０００希釈）を３０分間アプライした。細胞を、２ｍｌ洗浄緩衝液で３回洗浄した。蛍光標識二次抗体（抗ウサギ−ＩｇＧ−Ａｌｅｘａ−Ｆｌｏｕｒ５４６、０．５％脱脂乳を含む洗浄緩衝液に１：１００希釈）を３０分間アプライし、細胞を洗浄緩衝液中で４回洗浄した。Ｏｐｔｒｏｎｉｃｓ ＭａｃｒｏＦｉｒｅ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｃａｍｅｒａ（ＬＭ−ＭＦＣＣＤ）を備えたＬｅｉｃａ ＤＭＲＸＡ Ｕｐｒｉｇｈｔ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを使用して細胞表面標識を監視した。同一のソフトウェア設定で各写真を撮影した。構造１を産生するカンピロバクター・ジェジュニが陰性対照となった。
【００４９】
図１０は、一次抗血清および蛍光タグ二次抗体として１０Ａ、ＳＺＲ−１（抗式１Ｂ）または１０Ｂ、ＳＺＲ−３（抗式１Ａ）でプローブしたカンピロバクター・フィタス・フィタス、カンピロバクター・フィタス・ベネレアリス、カンピロバクター・コンサイサス、カンピロバクター・ハイオインテスティナリスおよびカンピロバクター・ジェジュニ（陰性対照）の全細胞の蛍光顕微鏡法画像を示している。
【００５０】
図１１は、式１Ａもしくは式１Ｂのいずれかに対して産生した抗血清による、またはカンピロバクター・ジェジュニのＮ−グリカンを標的にする抗血清（構造１、ｈＲ６は、Ｓｃｈｗａｒｚ等、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１０に記載された）による免疫ブロットを示している。９０μｇのカンピロバクター・フィタス・フィタス（１レーン）、カンピロバクター・フィタス・ベネレアリス（２レーン）、カンピロバクター・コンサイサス（３レーン）、カンピロバクター・ハイオインテスティナリス（４レーン）およびカンピロバクター・ジェジュニ１１１６８（５レーン）を、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにアプライした。ＰＶＤＦ膜への転写後、固定化タンパク質を、（Ａ）ＢＳＡ−式１Ｂ化合物で免疫化したウサギから得た１：５００希釈の血清試料（ＳＺＲ−１）、（Ｂ）ＢＳＡ−式１Ａ化合物で免疫化したウサギの１：５００希釈血清（ＳＺＲ−３）、または（Ｃ）カンピロバクター・ジェジュニのＮ−グリカンに対して特異的な１：５０００の抗血清（ｈＲ６）でプローブした。分子量マーカー（ＫＤａのＭＷ）を左に示す。
【００５１】
グリカン化合物（式１Ａおよび式１Ｂ）を、種々のグリカン担体（ペプチド、脂質）に結合させることができる。得られた化合物を使用して、式１Ａおよび式１Ｂを提示する細菌種による感染に対して保護的なそれぞれの構造に対する免疫応答を刺激することができる。
【００５２】
産生した抗血清／抗体を、例えば、感染した家畜（特に、カンピロバクター・フィタス・ベネレアリスウシ）中のカンピロバクター・フィタス・ベネレアリスもしくはカンピロバクター・フィタス・フィタスを検出する、またはヒト病原性カンピロバクター株（例えば、カンピロバクター・コンサイサス、カンピロバクター・ハイオインテスティナリス、カンピロバクター・ウレオリチカスを検出するための診断として使用することができる（すなわち、表面上に固定して）。前記抗血清／抗体を、任意の体液または分泌物中の化合物を検出するために使用することができる。例えば、動物中に存在し得るカンピロバクター・フィタス・ベネレアリス感染症を検出するために、式１のグリカンを認識する抗体を使用して雄ウシ精液を試験することができるだろう。
【００５３】
本発明の化合物は、カンピロバクター・フィタス・ベネレアリス、カンピロバクター・フィタス・フィタスおよび本明細書に記載するグリカンが生まれつき備わっている他のカンピロバクター種に対して、動物、特に家畜を免疫化するために使用することができる。免疫化は、群の生殖力および健康の改善のために、個々の動物における、または群全体基準での、疾患の治療または予防の形をとることができる。
【００５４】
式１のグリカンが生まれつき備わっているカンピロバクター種の範囲において、本明細書に記載する化合物を、ヒト中の前記生物による感染症を治療または予防するためのワクチンを調製するために上記と同様に使用することができる。同様に、前記化合物に対して産生した抗血清または抗体を使用して、同様の診断機能をヒトで得ることができる。同様に、バクテリオファージまたはその受容体結合タンパク質などの他の治療により、この化合物を標的化することができる。
【００５５】
本発明は、その種々の実施形態を通して記載されてきた。本発明はこのような実施形態に範囲を限定されないことが当業者により理解されるだろう。逆に、本発明の全範囲は、その特許請求の範囲を含み、特許明細書に基づいて当業者に理解されるであろう修正、変形および代替実施形態を含む、この特許明細書全体を包含し、これを参照することにより認識されるだろう。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、任意選択によりアミノ酸、ペプチド、タンパク質もしくは脂質に融合または結合していてもよい式１のＮ結合型グリカン化合物に関する。本発明はさらに、前記化合物に対する抗体および抗血清、ならびにカンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）病原体により引き起こされる感染症を診断するためのその使用に関する。本発明はさらに、カンピロバクター病原体による感染症を治療または予防するためのワクチンとしての該化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）およびカンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）は、ヒト感染症を引き起こすカンピロバクターの最も一般的に単離された２種である。これらの生物は、世界中で高い割合の胃腸炎を引き起こし、ケース数ではしばしばサルモネラ、赤痢菌および腸内毒素原性大腸菌を合わせた数を超えている（Ｂｕｔｚｌｅｒ ＪＰ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２００４）。さらに、カンピロバクター・ジェジュニ感染症は、ポリオ根絶以来病原体により引き起こされる麻痺の最も一般的な原因であるギラン−バレー症候群の発症と関連づけられてきた（概要については、Ｋａｉｄａ Ｋ、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００９；Ｂｅｒｅｓｗｉｌｌ Ｓ＆Ｋｉｓｔ Ｍ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、２００３参照）。他のカンピロバクター種は、ヒト胃腸炎の新興病原体と認識されており（カンピロバクター・ウプサリエンシス（Ｃ．ｕｐｓａｌｉｅｎｓｉｓ）、カンピロバクター・ハイオインテスティナリス（Ｃ．ｈｙｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ））、子供の炎症性腸疾患、歯肉炎、歯周炎およびヒトの流産（カンピロバクター・レクタス（Ｃ．ｒｅｃｔｕｓ）、カンピロバクター・コンサイサス（Ｃ．ｃｏｎｃｉｓｕｓ））（Ｚｈａｎｇ ＬＳ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００９）、ならびに家畜の性病および不妊症（特にウシ；カンピロバクター・フィタス・ベネレアリス（Ｃ．ｆｅｔｕｓ ｖｅｎｅｒｅａｌｉｓ））、およびヒツジの流産（カンピロバクター・フィタス・フィタス（Ｃ．ｆｅｔｕｓ ｆｅｔｕｓ））（Ｂｕｔｚｌｅｒ ＪＰ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、２００４およびその中の参考文献）と関連づけられた。
【０００３】
２０００年のカンピロバクター・ジェジュニのゲノム配列の公開（Ｐａｒｋｈｉｌｌ等、Ｎａｔｕｒｅ、２０００）以来、いくつかの他のカンピロバクターのゲノム配列が報告されてきた。今までに記載されてきた細菌の大部分とは異なり、全てのカンピロバクターは、Ｎ結合型タンパク質グリコシル化に必要とされる保存されたｐｇｌ遺伝子を含む（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ ＣＭ＆Ｗｒｅｎ ＢＷ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００５；Ｎｏｔｈａｆｔ Ｈ＆Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ ＣＭ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０１０）。
【０００４】
真核生物では、グリコシル化タンパク質は、細胞外基質および細胞表面の遍在性成分である。そのオリゴ糖部分は、免疫認識からがん進行に及ぶ生物学的過程において重要な広範囲の細胞−細胞および細胞−基質認識事象に関係している。グリコシル化は、以前は真核生物に限定したものであると考えられていたが、分析方法およびゲノム配列決定の進歩により、細菌においてＯ結合型およびＮ結合型タンパク質グリコシル化経路の両方についての報告が増加してきた（Ｎｏｔｈａｆｔ Ｈ＆Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ ＣＭ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１０）。細菌における最初の一般的なタンパク質グリコシル化経路の発見（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ ＣＭ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９９）、カンピロバクター・ジェジュニのグリカンは、全部Ｎ結合を通して結合しており（Ｋｅｌｌｙ ＪＨ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ２００６、Ｗａｃｋｅｒ Ｍ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２、Ｙｏｕｎｇ ＮＭ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００２）、経路を大腸菌に機能的に伝達することができるだけでなく（Ｗａｃｋｅｒ Ｍ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２）、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ酵素（ＰｇｌＢ）は外来性の糖をタンパク質に付加することができる（Ｆｅｌｄｍａｎ Ｍ等、ＰＮＡＳ ２００５）という証明以来、高まる研究活動が、この系のさらなる特徴づけおよび利用をもたらしてきた。
【０００５】
カンピロバクター・ジェジュニのＮ結合型七糖の詳細な構造が記載されている（Ｙｏｕｎｇ ＮＭ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００２）。高分解能マジック角スピニング（ＨＲ−ＭＡＳ）ＮＭＲなどの方法を使用して（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ ＣＭ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００３）、カンピロバクター・ジェジュニとカンピロバクター・コリの両方でこの七糖は構造が保存されていることが示された。
【０００６】
カンピロバクター・ジェジュニのＮ結合型グリコシル化経路の中間体、すなわち、遊離（オリゴ−）七糖（ｆＯＳ）−カンピロバクター・ジェジュニの細胞膜周辺腔の可溶性成分が記載されている（Ｌｉｕ Ｘ等、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６）。このｆＯＳは、タンパク質上に付加しているＮ結合型オリゴ糖と同一の構造を有する（Ｎｏｔｈａｆｔ Ｈ等、ＰＮＡＳ ２００９）。実験室での増殖条件下で、ｆＯＳ対タンパク質にＮ結合している七糖の比率は、約９：１である。カンピロバクター・ジェジュニのｆＯＳは、細菌の周辺質グルカンと同様に浸透圧調節で役割を果たしており、この経路は、環境の浸透圧調節物質濃度を変えることにより、操作することができる（Ｎｏｔｈａｆｔ Ｈ等、ＰＮＡＳ ２００９）。
【０００７】
図１は、カンピロバクター・ジェジュニ中のＮ結合型タンパク質グリコシル化および遊離オリゴ糖を示している。ウンデカプレニルピロリン酸結合型七糖は、ヌクレオチド活性化糖の付加により、サイトゾル内に集合する（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ ＣＭ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００３；Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ ＣＭ等、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００３）。完全な七糖は、ＡＢＣ輸送体ＰｇｌＫにより内膜を横切って周辺質に移される（Ａｌａｉｍｏ Ｃ等、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、２００６）。オリゴ糖は、ＰｇｌＢにより、タンパク質コンセンサス配列、Ｄ／Ｅ−Ｘ１−Ｎ−Ｘ２−Ｓ／Ｔ（Ｘ１、Ｘ２は、プロリンを除く任意のアミノ酸であり得る）中のアスパラギンのアミノ基に移される（Ｋｏｗａｒｉｋ Ｍ等、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ２００６；Ｙｏｕｎｇ ＮＭ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００２）。さらに、大量の遊離七糖（ｆＯＳ）を、カンピロバクター・ジェジュニ中に見出すことができる（Ｌｉｕ Ｘ等、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６）；ｆＯＳとＮ−グリカンの比率は、９：１であると決定された。ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ−アセチルガラクトサミン；バシロサミン（Ｂａｃ）、２,４−ジアセトアミド−２,４,６−トリデオキシグルコース；ＧａｌＮＡｃ、Ｎ−アセチルガラクトサミン；Ｇｌｃ、グルコース（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ ＣＭ等、Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００３より）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、その全てがＮ結合型グリカンおよびｆＯＳを有するいくつかのカンピロバクター種からＮ−グリカンおよびｆＯＳ構造を決定した。さらに、発明者等は、カンピロバクターのＮ−グリカンおよびｆＯＳを、２つの構造グループに分けることができることを証明した。第１グループは、カンピロバクター・ジェジュニおよびカンピロバクター・コリについて公開されたものと類似の構造を産生する（Ｙｏｕｎｇ ＮＭ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００２；Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ ＣＭ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００３）。第２グループは、カンピロバクター・ジェジュニおよびカンピロバクター・コリについて決定されたものとは異なり、今まで記載されたことがない独特のグリカン構造を産生する。このグループに入るカンピロバクター種には、カンピロバクター・フィタス・ベネレアリス（家畜の性病および不妊症の原因）、カンピロバクター・フィタス・フィタス（ヒツジの流産の原因）、カンピロバクター・コンサイサス（歯肉炎および歯周炎に関連し、胃腸炎の患者の糞便から単離された）、カンピロバクター・ハイオインテスティナリス（カンピロバクター・ジェジュニおよびカンピロバクター・コリのように、下痢に関連する）ならびにカンピロバクター・ハイオインテスティナリス亜種が含まれる。
【０００９】
カンピロバクター・スプトルム（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｕｔｏｒｕｍ）およびカンピロバクター・スプトルム亜種、カンピロバクター・ラニエナエ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｎｉｅｎａｅ）、カンピロバクター・ウレオリチカス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）（胃腸炎に関与していることが示唆されている新興腸病原体、Ｂｕｌｌｍａｎ Ｓ等、ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ＆Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０１０）、カンピロバクター・ホミニス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｈｏｍｉｎｉｓ）、カンピロバクター・グラシリス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｇｒａｃｉｌｉｓ）、カンピロバクター・レクタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｒｅｃｔｕｓ）（歯周疾患およびヒトの流産）、カンピロバクター・ショウアエ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｏｗａｅ）、カンピロバクター・ムコサリス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｃｏｓａｌｉｓ）ならびにカンピロバクター・カーブス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｕｒｖｕｓ）は、第２グループの中に入ると考えられる。
【００１０】
図２は、ゲノム配列決定されたカンピロバクター種および他の関連生物を含む、この経路の主要成分、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＰｇｌＢ）のタンパク質配列の系統発生解析を説明しており、カンピロバクターが２つのグループに分かれることを証明している。カンピロバクター分枝中、構造１を産生する種は上の囲みの中にあり、式１Ａおよび式１Ｂを産生する株は下の囲みの中にある（Ｎｏｔｈａｆｔ Ｈ＆Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ ＣＭ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０１０より）。
【００１１】
図３は、（Ａ）カンピロバクター・ジェジュニのＮ−グリカン特異的抗血清、（Ｂ）ＳＢＡ−レクチン（構造１の末端ＧａｌＮＡｃ残基を認識する）に対するＮ−グリカン反応性、（Ｃ）ＷＧＡ−レクチン反応性（ＧａｌＮＡｃ構造との交差反応性により、式１Ａおよび１Ｂの末端ＧｌｃＮＡｃ残基を認識する）および（Ｄ）質量分析に基づくｆＯＳ解析が、ｐｇｌ経路由来のグリカンがカンピロバクター種間で異なることを示したことを説明している。
【００１２】
一態様によると、本発明は、式１：Ａ−ＧｌｃＮＡｃ［ＧｌｃＮＡｃ］−ＧａｌＮＡｃ−ＧａｌＮＡｃ−ＱｕｉＮＡｃ４ＮＡｃ（ＡはＧｌｃＮＡｃまたはＧｌｃである）の新規なＮ結合型グリカン（Ｎ−グリカンと呼ぶ）化合物に関する。天然型のこの化合物は、いくつかのカンピロバクター種に共通である。その天然型では、化合物は、周辺質に可溶性であると同時に、病原体を含む多くのカンピロバクター種の内膜および周辺タンパク質および最も特に表面外膜タンパク質に結合している。本発明では、式１の化合物は、単離および／または精製型で提供される。化合物は、ＧｌｃまたはＧｌｃＮＡｃのいずれかを含む、末端糖が互いに異なる２種の七糖を含む。前記化合物の第１は、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ［ＧｌｃＮＡｃ］−ＧａｌＮＡｃ−ＧａｌＮＡｃ−ＱｕｉＮＡｃ４ＮＡｃ（本明細書中式１Ａ）である。前記化合物の第２は、Ｇｌｃ−ＧｌｃＮＡｃ［ＧｌｃＮＡｃ］−ＧａｌＮＡｃ−ＧａｌＮＡｃ−ＱｕｉＮＡｃ４ＮＡｃ（本明細書中式１Ｂ）である。
【００１３】
上記式１中、ＱｕｉＮＡｃ４ＮＡｃは、バシロサミンの略語を構成する糖類Ｂａｃの代替能記を表す。
【００１４】
一態様では、本発明は、単一のアミノ酸、オリゴペプチド、ペプチド、タンパク質もしくは脂質に接続または結合した式１の化合物を含む、単離または精製化合物に関する。一態様では、オリゴペプチドまたはペプチドは、２〜４個のアミノ酸、または２〜３０個のアミノ酸、または２〜２０個のアミノ酸、または２〜１０個のアミノ酸を含む。
【００１５】
本発明はさらに、式１の化合物を提供するステップと、前記化合物を動物またはヒトに接種して前記化合物に対する免疫応答を刺激するステップと、前記動物から血清を回収するステップと、任意選択により前記血清を精製して抗体または抗血清を得るステップとを含む、抗体または抗血清を産生する方法に関する。得られる抗体または抗血清は、カンピロバクター・フィタス・ベネレアリス、カンピロバクター・フィタス・フィタス、カンピロバクター・コンサイサス、カンピロバクター・ハイオインテスティナリスおよびカンピロバクター・ハイオインテスティナリス亜種、カンピロバクター・スプトルムおよびカンピロバクター・スプトルム亜種、カンピロバクター・ラニエナエ、カンピロバクター・ウレオリチカス、カンピロバクター・ホミニス、カンピロバクター・グラシリス、カンピロバクター・レクタス、カンピロバクター・ショウアエ、カンピロバクター・ムコサリスならびにカンピロバクター・カーブスを含む、本明細書に記載されているグリカンが生まれつき備わっているカンピロバクター種に結合する。
【００１６】
抗体または抗血清は、動物中またはヒト中の前記生物の存在を検出する診断目的のために使用することができる。
【００１７】
本発明の化合物は、家畜の生殖障害の主要な原因であり、現在のワクチンの使用が限られているカンピロバクター・フィタス・ベネレアリスに対する、または式１のグリカンが生まれつき備わっている、上に列挙した種を含む他のカンピロバクター種に対する、アジュバントを含むまたは含まないワクチン製剤に使用することができる。本発明の化合物は、タンパク質糖タンパク質工学、治療および診断用途への使用が可能である。したがって、本発明は、任意選択により単一のアミノ酸、オリゴペプチド、ペプチド、タンパク質もしくは脂質に接続または結合している式１の化合物を含むワクチンに関する。単一のアミノ酸は、アスパラギンを含むことができる。
【００１８】
本発明はさらに、カンピロバクター生物により引き起こされる感染症を治療もしくは予防するための、式１の化合物が前記生物中の天然グリカンを含む前記ワクチンの使用、およびヒトもしくは動物中での前記使用を含む治療方法に関する。
【００１９】
別の態様によると、本発明は、上記ワクチンを動物の群に投与することにより動物の群の生殖力および健康を改善する方法に関する。
【００２０】
本明細書に記載するワクチン、抗体および抗血清はまた、ヒトにおける予防、治療および診断のために使用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】カンピロバクター・ジェジュニ中のＮ結合型タンパク質グリコシル化および遊離オリゴ糖を示す図である。
【図２】種々のカンピロバクター種におけるｆＯＳおよびＮ−グリカン構造を要約する図である。
【図３】選択したカンピロバクター種におけるＮ−グリカンおよびｆＯＳ解析を示す図である。
【図３Ｄ（１）】選択したカンピロバクター種におけるＮ−グリカンおよびｆＯＳ解析を示す図である。
【図３Ｄ（２）】選択したカンピロバクター種におけるＮ−グリカンおよびｆＯＳ解析を示す図である。
【図３Ｄ（３）】選択したカンピロバクター種におけるＮ−グリカンおよびｆＯＳ解析を示す図である。
【図３Ｄ（４）】選択したカンピロバクター種におけるＮ−グリカンおよびｆＯＳ解析を示す図である。
【図３Ｄ（５）】選択したカンピロバクター種におけるＮ−グリカンおよびｆＯＳ解析を示す図である。
【図４Ａ】カンピロバクター・フィタス・フィタスから精製したｆＯＳの１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図４Ｂ】カンピロバクター・フィタス・フィタスおよびカンピロバクター・フィタス・ベネレアリスについての２Ｄ ＨＳＱＣ ＮＭＲスペクトルの重ね合わせを示す図である。
【図５】カンピロバクター・ジェジュニ、カンピロバクター・コリおよびカンピロバクター・ウプサリエンシスのｆＯＳおよびＮ−グリカン（構造１）ならびに本明細書に記載する他のカンピロバクター種からの式１Ａおよび式１Ｂの構造を示す図である。
【図６】本明細書に記載する条件下での式１Ａおよび式１Ｂの溶出プロファイルならびに精製した式１Ａおよび式１Ｂの確認を示す図である。
【図６Ｄ】本明細書に記載する条件下での式１Ａおよび式１Ｂの溶出プロファイルならびに精製した式１Ａおよび式１Ｂの確認を示す図である。
【図６Ｅ】本明細書に記載する条件下での式１Ａおよび式１Ｂの溶出プロファイルならびに精製した式１Ａおよび式１Ｂの確認を示す図である。
【図７】精製した式１Ａおよび式１Ｂ化合物とＢＳＡの結合を示す図である。
【図８】ＢＳＡ−糖複合体の各々に対して産生した抗血清による免疫ブロットを示す図である。
【図９Ａ】グリカン部分として式１の化合物を含む糖ペプチドのＭＳスペクトルを示す図である。
【図９Ｂ】グリカン部分として式１の化合物を含む糖ペプチドのＭＳスペクトルを示す図である。
【図９Ｃ】グリカン部分として式１の化合物を含む糖ペプチドのＭＳスペクトルを示す図である。
【図９Ｄ】グリカン部分として式１の化合物を含む糖ペプチドのＭＳスペクトルを示す図である。
【図９Ｅ】グリカン部分として式１の化合物を含む糖ペプチドのＭＳスペクトルを示す図である。
【図９Ｆ】グリカン部分として式１の化合物を含む糖ペプチドのＭＳスペクトルを示す図である。
【図１０】式１Ａおよび式１Ｂ特異的抗血清により標識したカンピロバクター細胞を示す図である。
【図１１】式１Ａ、式１Ｂおよび構造１に対して産生した抗血清による免疫ブロットを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、グリカン化合物Ａ−ＧｌｃＮＡｃ［ＧｌｃＮＡｃ］−ＧａｌＮＡｃ−ＧａｌＮＡｃ−ＱｕｉＮＡｃ４ＮＡｃ（ＡはＧｌｃＮＡｃまたはＧｌｃである）に関する。上記化合物は、２種のグリカン化合物ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ［ＧｌｃＮＡｃ］−ＧａｌＮＡｃ−ＧａｌＮＡｃ−ＱｕｉＮＡｃ４ＮＡｃ（本明細書中式１Ａ）およびＧｌｃ−ＧｌｃＮＡｃ［ＧｌｃＮＡｃ］−ＧａｌＮＡｃ−ＧａｌＮＡｃ−ＱｕｉＮＡｃ４ＮＡｃ（本明細書中式１Ｂ）を包含する。
【００２３】
上記式中、ＱｕｉＮＡｃ４ＮＡｃは、バシロサミンの略語を構成する糖類Ｂａｃの代替能記を表す（ｄｉＮＡｃＢａｃとしても知られている）。式１の化合物は、任意選択により単一のアミノ酸、オリゴペプチド、ペプチド、タンパク質もしくは脂質に接続または結合している。
【００２４】
前記脂質は、細菌の、古細菌のもしくは真核生物の供給源から単離および精製することができる、あるいは化学合成することができる。グリカン化合物と脂質の前記結合は、リン酸、ピロリン酸リンカーにより、またはグリコシド結合により媒介され得る。Ｎ−グリカンに結合している脂質（種々の鎖長、飽和度および立体配置を有する）の例が記載された（Ｆａｒｉｄｍｏａｙｅｒ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００９；Ｃｈｅｎ ＭＭ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００７）。本来の宿主中でまたは異種発現系中で産生される脂質結合Ｎ−グリカン化合物には、カンピロバクター・ジェジュニのＮ−グリカンについて示され（Ｒｅｌｄ ＣＷ等、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００８、Ｒｅｉｄ ＣＷ等、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００９）、カンピロバクター・ラリ（Ｃ．ｌａｒｉ）のＮ−グリカン（Ｓｃｈｗａｒｚ Ｆ等、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１１）およびＮ−グリカン−脂質Ａ複合体（カンピロバクター・ジェジュニのＮ−グリカンについて示された（ｖａｎ Ｓｏｒｇｅ ＮＭ等、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００９））について提案されたようなウンデカプレニル−リン酸結合Ｎ−グリカン化合物が含まれる。
【００２５】
上記化合物は、複数種のカンピロバクター中で実質的に保存されていることが決定された。
【００２６】
図３Ａ〜図３Ｄは、選択したカンピロバクター種におけるＮ−グリカンおよびｆＯＳを示している。（Ａ）（Ｂ）末端ＧａｌＮＡｃ残基を認識するダイズ凝集素とも反応するが、（Ｃ）式１Ａおよび式１Ｂ中に存在する末端ＧｌｃＮＡｃ残基を認識するコムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）とほとんど反応性を示さない他のカンピロバクター種（開いた囲み）と交差反応するカンピロバクター・ジェジュニのＮ結合型七糖を認識する抗血清を使用したウェスタンブロット。カンピロバクター・ジェジュニ特異的抗血清と反応しなかったが、ＷＧＡと反応した種を強調表示した。（Ｄ）（１）カンピロバクター・ジェジュニ、（２）カンピロバクター・フィタス・ベネレアリス、（３）カンピロバクター・コンサイサス、（４）カンピロバクター・フィタス・フィタスおよび（５）カンピロバクター・ハイオインテスティナリスのｆＯＳまたはＡｓｎ−結合に富む分画の質量分析の例；質量分析により解析した全ての種の結果を表１に要約している。
【００２７】
【表１】
【００２８】
表１．選択したカンピロバクター菌株中の質量分析により決定したｆＯＳおよびＮ−グリカン構造質量。数字は、遊離オリゴ糖（ｆＯＳ）もしくはＡｓｎ結合型のいずれかとしての式１Ａおよび式１Ｂの質量を示している。質量は、示した菌株の全細胞可溶化液から陽イオンモードで得た。式１Ａおよび式１Ｂの構造を、図４、表３および図５に示すようにＮＭＲにより決定した。Ｎ／Ｄは未決定である。
【００２９】
実施例１ 式１Ａおよび１Ｂの化合物の精製
カンピロバクター・ジェジュニ１１１６８、カンピロバクター・コンサイサス、カンピロバクター・ハイオインテスティナリス、カンピロバクター・フィタス・フィタスおよびカンピロバクター・フィタス・ベネレアリスを、微好気性条件下で培養した。遠心分離後に得られた全細胞をｐＨ８（アンモニアの添加により調整した）、３７℃で４８時間、大過剰のプロテイナーゼＫにより分解した。分解産物または遊離オリゴ糖を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５カラム（１．５×６０ｃｍ）で分離し、各分画を溶出した後、塩ピークを乾燥して、1Ｈ ＮＭＲにより解析した。所望の産物を含む分画を、Ｈｉｔｒａｐ Ｑカラム（５ｍＬサイズ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）で陰イオン交換クロマトグラフィーにより分離し、グリカンを直線勾配のＮａＣｌ（０〜１Ｍ、１時間）で溶出したところ、両グリカン化合物（式１Ａおよび式１Ｂ）の混合物が単離された。ＮＭＲによる解析の前に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１５で脱塩を行った。
【００３０】
実施例２：ＮＭＲ分光法解析
標準パルスシーケンスＤＱＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ（混合時間１２０ｍｓ）、ＲＯＥＳＹ（混合時間５００ｍｓ）、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣ（１００ｍｓ広範囲転送遅延）を使用して、アセトン内部標準（1Ｈについては２．２２５ｐｐｍおよび13Ｃについては３１．４５ｐｐｍ）を用いて、２５℃、３ｍｍ勾配プローブにより、Ｖａｒｉａｎ ＩＮＯＶＡ５００ＭＨｚ（1Ｈ）分光計で、実施例１で得たグリカンに対するＮＭＲ実験を行った。ＡＱ時間を、Ｈ−Ｈ相関については０．８〜１秒およびＨＳＱＣについては０．２５秒に維持し、t１について２５６インクリメントを得た。結果を、図４、図５（ＮＭＲスペクトルおよび構造）ならびに化学シフトに相当する表２に示す。
【００３１】
図４Ａは、カンピロバクター・フィタス・フィタスから精製したｆＯＳの１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。図４Ｂは、カンピロバクター・フィタス・フィタスおよびカンピロバクター・フィタス・ベネレアリスについての２Ｄ ＨＳＱＣスペクトルの重ね合わせであり、両種のｆＯＳ構造が同一であることを示している。ＮＭＲスペクトルは、カンピロバクター・コンサイサスについて得られたものと重ね合わせることもできる（図示せず）。カンピロバクター・フィタス・フィタスから精製した遊離オリゴ糖についての対応する化学シフトδ（ｐｐｍ）（図４Ａに示すような）を、表２に要約する。炭素およびプロトン化学シフトは、内部アセトン標準（δＨ２．２２５ｐｐｍ、δＣ３１．０７ｐｐｍ）を基準とした。
【００３２】
タンパク質に付加しているまたは遊離型（ｆＯＳ）で現れるカンピロバクターグリカンは、２つの構造グループに分けることができる。カンピロバクター種の第１グループは、カンピロバクター・ジェジュニおよびカンピロバクター・コリについて以前に決定され、カンピロバクター・ウプサリエンシスについて本明細書で決定された独特のグリカン構造を産生する。第２グループに入るカンピロバクターは、カンピロバクター・フィタス・ベネレアリス（家畜の性病および不妊症の原因）、カンピロバクター・フィタス・フィタス（ヒツジの流産の原因）、カンピロバクター・コンサイサス、カンピロバクター・ハイオインテスティナリス、カンピロバクター・ハイオインテスティナリス亜種、カンピロバクター・スプトルムおよびカンピロバクター・スプトルム亜種、カンピロバクター・ラニエナエ、カンピロバクター・ウレオリチカス、カンピロバクター・ホミニス、カンピロバクター・グラシリス、カンピロバクター・レクタス、カンピロバクター・ショウアエ、カンピロバクター・ムコサリスならびにカンピロバクター・カーブスからなる。
【００３３】
カンピロバクター・フィタス・フィタス、カンピロバクター・フィタス・ベネレアリスおよびカンピロバクター・コンサイサスから大規模精製した遊離オリゴ糖（ｆＯＳ）を使用したＮＭＲによる構造決定は、カンピロバクターのこの第２グループが、カンピロバクター・ジェジュニおよびカンピロバクター・コリについて当初記載されたものとは異なる構造を産生することを証明した（図４および図５）。
【００３４】
【表２】
【００３５】
表２：カンピロバクター・フィタス・フィタスから精製した遊離オリゴ糖（式１Ａおよび式１Ｂ）についての化学シフトδ（ｐｐｍ）（スペクトルについては図４Ａに示す）。炭素およびプロトン化学シフトは、内部アセトン標準（δＨ２．２２５ｐｐｍ、δＣ３１．０７ｐｐｍ）を基準とした。大文字は、図４Ａおよび図５に概要を述べた単糖残基を指す。
【００３６】
実施例３：単一のアミノ酸に結合した式１の化合物のグリカンの調製
完全細胞の溶解後に得られた全細胞抽出物をプロナーゼＥで分解した後、Ｌｉｕ Ｘ．等、ＡｎａｌＣｈｅｍ、２００５およびＮｏｔｈａｆｔ Ｈ．等、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２０１０により記載されているような質量分析により、カンピロバクター・ジェジュニの単一のアスパラギンに結合した七糖（構造１）およびカンピロバクター・フィタス・フィタスの単一のアスパラギンに結合した式１Ａ（表１）が同定された。
【００３７】
実施例４：式１化合物の発現
式１Ａおよび式１Ｂ化合物の産生および移行に必要な全ての遺伝子をコードするタンパク質グリコシル化オペロンをクローニングし、大腸菌プラスミドから発現させることができる。あるいは、カンピロバクター・ジェジュニのタンパク質グリコシル化（ｐｇｌ）オペロンを含む、Ｗａｃｋｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２により記載されたプラスミドpスフェラーゼに交換することができる。Ｎ結合型タンパク質グリコシル化のためのアフィニティータグ受容体ペプチド（カンピロバクター・ジェジュニおよびカンピロバクター・ラリのＮ−グリカンについて既に示されている。Ｗａｃｋｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２、Ｓｃｈｗａｒｚ等、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１１）の存在下で、またはこのようなタンパク質とファージタンパク質との融合体として（Ｄｕｅｒｒ等、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０１０）、異種系で、式１Ａおよび式１Ｂ化合物の発現を行うことができる。タンパク質／ペプチド／ファージを含むグリカンを、必要に応じてレクチンもしくはグリカン認識剤アフィニティークロマトグラフィーと組み合わせて、アフィニティータグ精製により精製して、グリコシル化ペプチドと非グリコシル化ペプチドを分離することができる。
【００３８】
実施例５：式１Ａおよび式１Ｂの精製
パルスアンペロメトリック検出（ＨＰＡＥＣ／ＰＡＤ）を使用して高速陰イオン交換クロマトグラフィーにより、精製した式１Ａおよび式１Ｂ ｆＯＳを分離した。図６は、以下の条件下でのＣａｒｂｏＰａｃ（登録商標）ＰＡ２００ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｏｌｕｍｎ（ガードカラム：３×５０ｍｍを備えた３×２５０ｍｍ ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１００）の溶出プロファイルを示す：流速：０．５ｍＬ／分；溶離系、１００ｍＭ水酸化ナトリウム中５０ｍＭ酢酸ナトリウム；検出モード、パルス電流測定、四倍波形、Ａｕ電極；周囲カラム温度を約３０℃に設定した（図６Ａ）。上で概要を述べたのと同じ条件下で、セミ分取ＰＡ１００カラム（９×２５０ｍｍ）およびフラクションコレクター（ＤＩＯＮＥＸ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００）を使用して、約０．５ｎｍｏｌの式１Ａと式１Ｂの混合物（図６Ａ）あるいは分離後の式１Ｂ（図６Ｂ）および式１Ａ（図６Ｃ）のいずれかをＨＰＡＥＣ／ＰＡＤにより解析した。式１Ａまたは式１Ｂのいずれかを含む分画を、等モル両の０．２Ｍ ＨＣｌで中和し、−２０℃で保管した。表１に概要を述べた式１Ａおよび式１Ｂの観測質量に対応する、精製後の精製した式１Ａ（図６Ｄ）および式１Ｂ（図６Ｅ）のエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）により得られたスペクトル。
【００３９】
実施例６：式１Ａおよび式１ＢとＢＳＡとの結合
還元的アミノ化により、実施例５で調製した精製および中和した、式１Ａおよび１Ｂ化合物をＢＳＡに結合させた（Ｇｉｌｄｅｒｓｌｅｅｖｅ ＪＣ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．２００８参照）。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；２μＬの１５０ｍｇ／ｍＬ溶液；分画Ｖ）、ホウ酸ナトリウム（５．５μＬの４００ｍＭ溶液、ｐＨ８．５）、硫酸ナトリウム（３．７μＬの３Ｍ溶液、５０℃）、オリゴ糖（式１Ａもしくは式１Ｂ）（７．０μＬの１５当量の２０ｍＭ溶液）、Ｈ2Ｏ（１．４μＬ）およびシアノ水素化ホウ素ナトリウム（２．２μＬの３Ｍ溶液）の混合物を、加熱した蓋をして、５６℃で９６時間、ＰＣＲサーマルサイクラー中、２００μＬのＰＣＲチューブ中でインキュベートした。反応物をＨ2Ｏで１００μＬの最終容積に希釈し、５００μｌの透析チューブ（ＭＷＣＯ１００００）に移し、Ｈ2Ｏ（２．５Ｌ）に対して３回透析した。
【００４０】
図７は、式１Ａおよび式１ＢとＢＳＡの結合を示す。糖複合体を１２．５％ＰＡＧＥにより分離し（Ａ）、アルカリホスファターゼと結合した市販のＷＧＡ−レクチンを使用してウエスタンブロッティングにより監視した（Ｂ）。１レーン、４００ｎｇ ＢＳＡ分画Ｖ；２レーン、４００ｎｇのＢＳＡ分画Ｖに連結した式１Ｂ；３レーン、４００ｎｇのＢＳＡ分画Ｖに連結した式１Ｂ。分子量マーカー（ＫＤａのＭＷ）を左に示す。
【００４１】
実施例７：式１Ａまたは式１Ｂ−ＢＳＡ複合体によるウサギ免疫化
６週間免疫化プロトコル（承認された動物実験委員会プロトコル第７１７号）を使用して、２ｍｇの実施例６で調製した糖複合体化合物の各々でニュージーランドホワイトウサギを免疫化した。フロイント完全アジュバント（抗原と１：１の比率）を使用した２．０ｍｇの抗原の初回皮下注射（３部位、各部位に０．５ｍｌを注射した）後、フロイント不完全アジュバント（抗原と１：１の比率）と混合した２．０ｍｇの式１Ａ−ＢＳＡ複合体および式１Ｂ−ＢＳＡ複合体の各々のブースター投与を、４週間後に皮下に行った（３部位、各部位に０．５ｍｌを注射した）。６週間後、血液試料を氷上で６０分間冷却した後、１０．０００×ｇで２０分間遠心分離することにより、各動物の５ｍｌ血液試料から血清を調製した。カンピロバクター全細胞可溶化液を使用したウエスタンブロッティングにより、式１Ａおよび式１Ｂ特異的抗体の産生について、個々の血清を解析した（図８）。
【００４２】
図８は、単一ＢＳＡ−糖複合体に対して産生した抗血清による免疫ブロットを示す：カンピロバクター・ジェジュニ１１１６８野生型（１レーン）、カンピロバクター・ジェジュニ１１１６８ｐｇｌＢ変異株（２レーン）またはカンピロバクター・フィタス・フィタス（３レーン）のいずれかからの１２０μｇの全細胞可溶化液を、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにアプライした。ＰＶＤＦ膜への転写後、固定化タンパク質を、（Ａ）ＢＳＡ−式１Ｂ化合物で免疫化したウサギから得た１：２０００希釈の血清試料（ＳＺＲ−１）および（Ｂ）ＢＳＡ−式１Ａ化合物で免疫化したウサギの血清（ＳＺＲ−３）でプローブした。分子量マーカー（ＫＤａのＭＷ）を左に示す。
【００４３】
実施例８：式１Ａおよび式１Ｂ化合物はＮ結合している。
細胞を、ＭＨブロス中、微好気性条件下で培養し、遠心分離により収集し、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．２中で２回洗浄した。ペレットを凍結乾燥し、１．５ｍｌのＬｏｂｉｎｄチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に入れた。ペレット（１０ｍｇ）を、１５０ユニットのＢｅｎｏｚａｎａｓｅの存在下で１ｍｌ氷冷トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に再懸濁し、ボルテックスして再懸濁し、氷上に保った。超音波処理（間に氷上で１分間を入れて、３０秒で６回）後、４℃、２００００×ｇで３０分間の遠心分離により、細胞片を除去した。上清をＬｏＢｉｎｄ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チューブに回収し、凍結乾燥した。記載のように試料処理、糖ペプチド富化および質量分析を適用した（Ｓｃｏｔｔ ＮＥ等 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２０１０）。カンピロバクター・フィタス・フィタス、カンピロバクター・フィタス・ベネレアリスおよびカンピロバクター・コンサイサスについて、タンパク質分解細胞可溶化液から得られるポリペプチド中に位置するアスパラギンにＮ結合した式１Ａおよび式１Ｂを同定した（表３）。
【００４４】
カンピロバクター・フィタス・フィタス、カンピロバクター・フィタス・ベネレアリスおよびカンピロバクター・コンサイサスから糖ペプチドを単離および同定し、結果を表３に示す。その全てのグリカン部分は、式１Ａまたは１Ｂの化合物を含んでいた。
【００４５】
【表３】
【００４６】
式１Ａおよび式１ＢとＮ結合していると同定されたタンパク質のリスト。多重反応モニタリング（ＭＲＭ）質量分析により、式１Ａおよび式１Ｂについての単一ピーク面積を測定した。
【００４７】
図９Ａ〜図９Ｆは、以下のように、式１Ａおよび式１Ｂ化合物が（同じペプチドと）Ｎ結合していることを示すＭＳスペクトルを示している。
９Ａ）トリプシン分解したＨＩＬＩＣ−ＬＣ富化ペプチドのＭＳスペクトル（前駆体イオンスキャン）；（Ｂ）対応するイオンの相対ピーク面積の定量化；（Ｃ）炭水化物部分のＭＳ／ＭＳ、（Ｄ）ｍ／ｚイオン９６８．４４５４５のペプチド部分のＭＳ／ＭＳ；９Ｅ）炭水化物部分のＭＳ／ＭＳおよび９Ｆ）ｍ／ｚイオン９８２．１２０６９のペプチド部分のＭＳ／ＭＳ。
【００４８】
実施例９ 式１Ａおよび１Ｂは、カンピロバクター細胞表面上に提示される。
カンピロバクター・フィタス・フィタス、カンピロバクター・フィタス・ベネレアリス、カンピロバクター・コンサイサス、カンピロバクター・ハイオインテスティナリスおよびカンピロバクター・ジェジュニの細胞を、微好気性条件下で１８〜２４時間ＭＨプレートで培養した。細胞を２ｍｌのＭＨブロスとともにプレートから収集し、氷上で１０分間冷却し、６０００×ｇで５分間遠心分離した。さらなる標識化および予冷却した（４℃）溶液を使用した洗浄ステップのために細胞を氷上に保った。細胞を、２ｍｌ洗浄緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ）で２回洗浄した。非特異的結合を防ぐために、細胞を３０分間洗浄緩衝液中１％脱脂乳でブロックした。一次抗体（０．５％脱脂乳を含む洗浄緩衝液に１：１０００希釈）を３０分間アプライした。細胞を、２ｍｌ洗浄緩衝液で３回洗浄した。蛍光標識二次抗体（抗ウサギ−ＩｇＧ−Ａｌｅｘａ−Ｆｌｏｕｒ５４６、０．５％脱脂乳を含む洗浄緩衝液に１：１００希釈）を３０分間アプライし、細胞を洗浄緩衝液中で４回洗浄した。Ｏｐｔｒｏｎｉｃｓ ＭａｃｒｏＦｉｒｅ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｃａｍｅｒａ（ＬＭ−ＭＦＣＣＤ）を備えたＬｅｉｃａ ＤＭＲＸＡ Ｕｐｒｉｇｈｔ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを使用して細胞表面標識を監視した。同一のソフトウェア設定で各写真を撮影した。構造１を産生するカンピロバクター・ジェジュニが陰性対照となった。
【００４９】
図１０は、一次抗血清および蛍光タグ二次抗体として１０Ａ、ＳＺＲ−１（抗式１Ｂ）または１０Ｂ、ＳＺＲ−３（抗式１Ａ）でプローブしたカンピロバクター・フィタス・フィタス、カンピロバクター・フィタス・ベネレアリス、カンピロバクター・コンサイサス、カンピロバクター・ハイオインテスティナリスおよびカンピロバクター・ジェジュニ（陰性対照）の全細胞の蛍光顕微鏡法画像を示している。
【００５０】
図１１は、式１Ａもしくは式１Ｂのいずれかに対して産生した抗血清による、またはカンピロバクター・ジェジュニのＮ−グリカンを標的にする抗血清（構造１、ｈＲ６は、Ｓｃｈｗａｒｚ等、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１０に記載された）による免疫ブロットを示している。９０μｇのカンピロバクター・フィタス・フィタス（１レーン）、カンピロバクター・フィタス・ベネレアリス（２レーン）、カンピロバクター・コンサイサス（３レーン）、カンピロバクター・ハイオインテスティナリス（４レーン）およびカンピロバクター・ジェジュニ１１１６８（５レーン）を、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにアプライした。ＰＶＤＦ膜への転写後、固定化タンパク質を、（Ａ）ＢＳＡ−式１Ｂ化合物で免疫化したウサギから得た１：５００希釈の血清試料（ＳＺＲ−１）、（Ｂ）ＢＳＡ−式１Ａ化合物で免疫化したウサギの１：５００希釈血清（ＳＺＲ−３）、または（Ｃ）カンピロバクター・ジェジュニのＮ−グリカンに対して特異的な１：５０００の抗血清（ｈＲ６）でプローブした。分子量マーカー（ＫＤａのＭＷ）を左に示す。
【００５１】
グリカン化合物（式１Ａおよび式１Ｂ）を、種々のグリカン担体（ペプチド、脂質）に結合させることができる。得られた化合物を使用して、式１Ａおよび式１Ｂを提示する細菌種による感染に対して保護的なそれぞれの構造に対する免疫応答を刺激することができる。
【００５２】
産生した抗血清／抗体を、例えば、感染した家畜（特に、カンピロバクター・フィタス・ベネレアリスウシ）中のカンピロバクター・フィタス・ベネレアリスもしくはカンピロバクター・フィタス・フィタスを検出する、またはヒト病原性カンピロバクター株（例えば、カンピロバクター・コンサイサス、カンピロバクター・ハイオインテスティナリス、カンピロバクター・ウレオリチカスを検出するための診断として使用することができる（すなわち、表面上に固定して）。前記抗血清／抗体を、任意の体液または分泌物中の化合物を検出するために使用することができる。例えば、動物中に存在し得るカンピロバクター・フィタス・ベネレアリス感染症を検出するために、式１のグリカンを認識する抗体を使用して雄ウシ精液を試験することができるだろう。
【００５３】
本発明の化合物は、カンピロバクター・フィタス・ベネレアリス、カンピロバクター・フィタス・フィタスおよび本明細書に記載するグリカンが生まれつき備わっている他のカンピロバクター種に対して、動物、特に家畜を免疫化するために使用することができる。免疫化は、群の生殖力および健康の改善のために、個々の動物における、または群全体基準での、疾患の治療または予防の形をとることができる。
【００５４】
式１のグリカンが生まれつき備わっているカンピロバクター種の範囲において、本明細書に記載する化合物を、ヒト中の前記生物による感染症を治療または予防するためのワクチンを調製するために上記と同様に使用することができる。同様に、前記化合物に対して産生した抗血清または抗体を使用して、同様の診断機能をヒトで得ることができる。同様に、バクテリオファージまたはその受容体結合タンパク質などの他の治療により、この化合物を標的化することができる。
【００５５】
本発明は、その種々の実施形態を通して記載されてきた。本発明はこのような実施形態に範囲を限定されないことが当業者により理解されるだろう。逆に、本発明の全範囲は、その特許請求の範囲を含み、特許明細書に基づいて当業者に理解されるであろう修正、変形および代替実施形態を含む、この特許明細書全体を包含し、これを参照することにより認識されるだろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ−ＧｌｃＮＡｃ［ＧｌｃＮＡｃ］−ＧａｌＮＡｃ−ＧａｌＮＡｃ−ＱｕｉＮＡｃ４ＮＡｃ（ＡはＧｌｃＮＡｃまたはＧｌｃである）を含む単離または精製化合物。
【請求項２】
単一のアミノ酸、オリゴペプチド、ペプチド、タンパク質もしくは脂質に接続または結合した、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記単一のアミノ酸がアスパラギンである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物を含むワクチン。
【請求項５】
アジュバントをさらに含む、請求項４に記載のワクチン。
【請求項６】
カンピロバクター生物により引き起こされる感染症を治療もしくは予防するための請求項４または５に記載のワクチンの使用であって、請求項１または請求項２に記載の化合物が前記生物中の天然グリカンを含む使用。
【請求項７】
前記生物が、カンピロバクター・フィタス・ベネレアリス、カンピロバクター・フィタス・フィタス、カンピロバクター・コンサイサス、カンピロバクター・ハイオインテスティナリス、カンピロバクター・ハイオインテスティナリス亜種、カンピロバクター・スプトルムおよびカンピロバクター・スプトルム亜種、カンピロバクター・ラニエナエ、カンピロバクター・ウレオリチカス、カンピロバクター・ホミニス、カンピロバクター・グラシリス、カンピロバクター・レクタス、カンピロバクター・ショウアエ、カンピロバクター・ムコサリスならびにカンピロバクター・カーブスである、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
カンピロバクター生物により引き起こされる感染症を治療または予防する方法であって、治療もしくは予防を必要としている動物またはヒトに、請求項４または５に記載のワクチンを投与することにより、請求項１に記載の化合物が前記生物を生まれつき備えている、方法。
【請求項９】
前記生物が、カンピロバクター・フィタス・ベネレアリス、カンピロバクター・フィタス・フィタス、カンピロバクター・コンサイサス、カンピロバクター・ハイオインテスティナリス、カンピロバクター・ハイオインテスティナリス亜種、カンピロバクター・スプトルムおよびカンピロバクター・スプトルム亜種、カンピロバクター・ラニエナエ、カンピロバクター・ウレオリチカス、カンピロバクター・ホミニス、カンピロバクター・グラシリス、カンピロバクター・レクタス、カンピロバクター・ショウアエ、カンピロバクター・ムコサリスならびにカンピロバクター・カーブスである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項４または５に記載のワクチンを、動物の群れまたはヒトに投与することにより、動物の群れの生殖力および健康あるいはヒトの健康を改善する方法。
【請求項１１】
請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物を動物またはヒトに接種して、前記動物または前記ヒトにおける前記化合物に対する免疫応答を刺激するステップと、前記動物から血清を回収するステップと、任意選択により前記血清を精製して抗体または精製抗血清を得るステップとを含む、抗体または抗血清を産生する方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法により調製した抗体または抗血清を含む、請求項１に記載の化合物が生まれつき備わっているカンピロバクター生物に対して有効な抗体または抗血清。
【請求項１３】
前記生物が、カンピロバクター・フィタス・ベネレアリス、カンピロバクター・フィタス・フィタス、カンピロバクター・コンサイサス、カンピロバクター・ハイオインテスティナリス、カンピロバクター・ハイオインテスティナリス亜種、カンピロバクター・スプトルムおよびカンピロバクター・スプトルム亜種、カンピロバクター・ラニエナエ、カンピロバクター・ウレオリチカス、カンピロバクター・ホミニス、カンピロバクター・グラシリス、カンピロバクター・レクタス、カンピロバクター・ショウアエ、カンピロバクター・ムコサリスならびにカンピロバクター・カーブスである、請求項１２に記載の抗体または抗血清。
【請求項１４】
カンピロバクター生物により引き起こされる動物またはヒトの感染症の存在を診断する方法であって、動物またはヒトから試料を得て、前記試料を請求項１２または１３に記載の抗体または抗血清に接触させることにより、請求項１に記載の化合物が前記生物を生まれつき備えている、方法。
【請求項１５】
前記生物が、カンピロバクター・フィタス・ベネレアリス、カンピロバクター・フィタス・フィタス、カンピロバクター・コンサイサス、またはカンピロバクター・ハイオインテスティナリス、またはカンピロバクター・ウレオリチカスである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１】
Ａ−ＧｌｃＮＡｃ［ＧｌｃＮＡｃ］−ＧａｌＮＡｃ−ＧａｌＮＡｃ−ＱｕｉＮＡｃ４ＮＡｃ（ＡはＧｌｃＮＡｃまたはＧｌｃである）を含む単離または精製化合物。
【請求項２】
単一のアミノ酸、オリゴペプチド、ペプチド、タンパク質もしくは脂質に接続または結合した、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記単一のアミノ酸がアスパラギンである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物を含むワクチン。
【請求項５】
アジュバントをさらに含む、請求項４に記載のワクチン。
【請求項６】
カンピロバクター生物により引き起こされる感染症を治療もしくは予防するための請求項４または５に記載のワクチンの使用であって、請求項１または請求項２に記載の化合物が前記生物中の天然グリカンを含む使用。
【請求項７】
前記生物が、カンピロバクター・フィタス・ベネレアリス、カンピロバクター・フィタス・フィタス、カンピロバクター・コンサイサス、カンピロバクター・ハイオインテスティナリス、カンピロバクター・ハイオインテスティナリス亜種、カンピロバクター・スプトルムおよびカンピロバクター・スプトルム亜種、カンピロバクター・ラニエナエ、カンピロバクター・ウレオリチカス、カンピロバクター・ホミニス、カンピロバクター・グラシリス、カンピロバクター・レクタス、カンピロバクター・ショウアエ、カンピロバクター・ムコサリスならびにカンピロバクター・カーブスである、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
カンピロバクター生物により引き起こされる感染症を治療または予防する方法であって、治療もしくは予防を必要としている動物またはヒトに、請求項４または５に記載のワクチンを投与することにより、請求項１に記載の化合物が前記生物を生まれつき備えている、方法。
【請求項９】
前記生物が、カンピロバクター・フィタス・ベネレアリス、カンピロバクター・フィタス・フィタス、カンピロバクター・コンサイサス、カンピロバクター・ハイオインテスティナリス、カンピロバクター・ハイオインテスティナリス亜種、カンピロバクター・スプトルムおよびカンピロバクター・スプトルム亜種、カンピロバクター・ラニエナエ、カンピロバクター・ウレオリチカス、カンピロバクター・ホミニス、カンピロバクター・グラシリス、カンピロバクター・レクタス、カンピロバクター・ショウアエ、カンピロバクター・ムコサリスならびにカンピロバクター・カーブスである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項４または５に記載のワクチンを、動物の群れまたはヒトに投与することにより、動物の群れの生殖力および健康あるいはヒトの健康を改善する方法。
【請求項１１】
請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物を動物またはヒトに接種して、前記動物または前記ヒトにおける前記化合物に対する免疫応答を刺激するステップと、前記動物から血清を回収するステップと、任意選択により前記血清を精製して抗体または精製抗血清を得るステップとを含む、抗体または抗血清を産生する方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法により調製した抗体または抗血清を含む、請求項１に記載の化合物が生まれつき備わっているカンピロバクター生物に対して有効な抗体または抗血清。
【請求項１３】
前記生物が、カンピロバクター・フィタス・ベネレアリス、カンピロバクター・フィタス・フィタス、カンピロバクター・コンサイサス、カンピロバクター・ハイオインテスティナリス、カンピロバクター・ハイオインテスティナリス亜種、カンピロバクター・スプトルムおよびカンピロバクター・スプトルム亜種、カンピロバクター・ラニエナエ、カンピロバクター・ウレオリチカス、カンピロバクター・ホミニス、カンピロバクター・グラシリス、カンピロバクター・レクタス、カンピロバクター・ショウアエ、カンピロバクター・ムコサリスならびにカンピロバクター・カーブスである、請求項１２に記載の抗体または抗血清。
【請求項１４】
カンピロバクター生物により引き起こされる動物またはヒトの感染症の存在を診断する方法であって、動物またはヒトから試料を得て、前記試料を請求項１２または１３に記載の抗体または抗血清に接触させることにより、請求項１に記載の化合物が前記生物を生まれつき備えている、方法。
【請求項１５】
前記生物が、カンピロバクター・フィタス・ベネレアリス、カンピロバクター・フィタス・フィタス、カンピロバクター・コンサイサス、またはカンピロバクター・ハイオインテスティナリス、またはカンピロバクター・ウレオリチカスである、請求項１４に記載の方法。
【図２】
【図３Ｄ（１）】
【図３Ｄ（２）】
【図３Ｄ（３）】
【図３Ｄ（４）】
【図３Ｄ（５）】
【図４Ｂ】
【図５−１】
【図５−２】
【図７】
【図８】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１】
【図３】
【図４Ａ】
【図６】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図９Ｅ】
【図９Ｆ】
【図１０】
【図３Ｄ（１）】
【図３Ｄ（２）】
【図３Ｄ（３）】
【図３Ｄ（４）】
【図３Ｄ（５）】
【図４Ｂ】
【図５−１】
【図５−２】
【図７】
【図８】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１】
【図３】
【図４Ａ】
【図６】
【図６Ｄ】
【図６Ｅ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図９Ｅ】
【図９Ｆ】
【図１０】
【公表番号】特表２０１３−５１９７３７（Ｐ２０１３−５１９７３７Ａ）
【公表日】平成２５年５月３０日（２０１３．５．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５２２１７（Ｐ２０１２−５５２２１７）
【出願日】平成２３年２月１１日（２０１１．２．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２０１１／０５００８４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０９７７３３
【国際公開日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【出願人】（５０７３８８９６０）ザ・ガバナーズ・オブ・ザ・ユニバーシティー・オブ・アルバータ (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月３０日（２０１３．５．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月１１日（２０１１．２．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２０１１／０５００８４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０９７７３３
【国際公開日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【出願人】（５０７３８８９６０）ザ・ガバナーズ・オブ・ザ・ユニバーシティー・オブ・アルバータ (9)
【Ｆターム（参考）】
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