ＰＶＭＶに対する抵抗性を有する植物の選別又は取得方法
本発明は、トウガラシ葉脈斑紋病（ＰＶＭＶ）に対する抵抗性を有する植物のｅＩＦ４Ｅ遺伝子及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅにおける突然変異の組合せを検出又は誘発することによる前記植物の選別又は取得に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子における突然変異の組合せを介してポティウイルス（Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ）属のウイルスに対する抵抗性を有する植物を選別又は取得する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポティウイルスは最も大きな植物ウイルス群を形成する。これらのウイルスは植物ウイルスの約３分の１を占め、３０科を超える植物を感染させることができる（ＳＨＵＫＬＡ ｅｔ ａｌ．， １９９４，Ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｏｔｙｖｉｒｉｄａｅ，ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ編，Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ， ＵＫ）。ポティウイルスの伝播は、非永続的にアブラムシ（例えばＭｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ）によって行なわれる。この感染は、葉の着色異常（モザイク、葉脈の黄変）、葉の変形、植物全体の壊死、ひいては罹患した植物のサイズの大幅な低減及び生産能力の喪失を導き得る葉脈の壊死を誘発する。花、種子及び果実自体も同様に数多くのポティウイルスに罹患し、その結果、繁殖力の低下、種子によるポティウイルスの伝搬並びに果実の変形、変色及び壊死がもたらされる。
【０００３】
ポティウイルスは、エンベロープのない長さ６８０〜９００ｎｍ、幅１１〜１５ｎｍの糸状構造を有する（ＬＡＮＧＥＮＢＥＲＧ及びＺＨＡＮＧ， Ｊ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． １１８（３）： ２４３−２４７， １９９７）（ＤＯＵＧＨＥＲＴＹ及びＣＡＲＲＩＮＧＴＯＮ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ． ２６： １２３−１４３， １９８８； ＲＩＥＣＨＭＡＮＮ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７３： １−１６， １９９２）。ウイルスゲノムはおよそ１０ｋｂの長さのセンス１本鎖ＲＮＡで構成されている。１本鎖ＲＮＡはその３’末端にポリＡ尾部を有し、５’で、Ｖｉｒａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｏｍｅ−ｌｉｎｋｅｄを略してＶＰｇと呼ばれるウイルスタンパク質に結合する（ＭＵＲＰＨＹ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌ． １７８： ２８５−２８８， １９９０； ＴＡＫＡＨＡＳＨＩ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｅｓ １４（３）： ２３５−２４３， １９９７）。ウイルスＲＮＡは、感染サイクルのさまざまな段階、すなわちポリプロテインの切断、ウイルスゲノムの複製、細胞間移動、長距離移動、アブラムシによる伝播及び「ＲＮＡサイレンシング」の阻害などに関与する１０種の機能タンパク質に成熟するポリプロテインをコードする。
【０００４】
ナス科、ウリ科、マメ科、アブラナ科及びキク科が特にポティウイルスに対し感受性をもつ。例えば、ナス科そしてより詳細にはトマト及びトウガラシ（又はピーマン）は、全く異なる複数のポティウイルスによる感染を受ける。そのうちジャガイモＹウイルス（Ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｙ − ＰＶＹ）は、栽培地域全体にわたり存在するが、一方その他のものは一大陸に限定されている（Ｔｏｂａｃｃｏ ｅｔｃｈ ｖｉｒｕｓ（ＴＥＶ）、Ｐｅｐｐｅｒ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓはアメリカ大陸、Ｐｅｐｐｅｒ ｖｅｉｎａｌ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ（ＰＶＭＶ）及びＰｏｔｙｖｉｒｕｓ Ｅはアフリカ、そしてＣｈｉｌｉ ｖｅｉｎａｌ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓはアジア）。しかしながら、いくつかのポティウイルスがその原産地域以外で同定されていることから、この区分はもはや絶対的なものではない。ＰＶＭＶはまず最初に１９７１年にガーナでトウガラシ類及びペチュニア上で単離された。以降、ＰＶＭＶは複数のアフリカ諸国で、主としてサハラ以南の地域であるが同様にチュニジア及びエチオピアでも同定された（ＢＲＵＮＴ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｌ． ６９： ２３５−２４３， １９７１； ＢＲＵＮＴ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｌ． ８８： １１５−１１９， １９７８； ＧＯＲＳＡＮＥ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｔｒ． １７： １４９−１５８， １９９９）。その天然の宿主は主として、トウガラシのみならずトマト、タバコ及びナスを含むナス科である。
【０００５】
現在のところ、真菌又は細菌による感染とは異なり、ウイルスに対する直接的な対抗手段は存在しない。用いられている戦略は、アブラムシといったようなウイルスの媒介動物を除去し、かつ／又は栽培地域内に最も多く存在するウイルスに対して抵抗性のある植物を選別し栽培することから成る。
【０００６】
種子市場の国際化により、育種家にとっては多抵抗性の亜種を作り出すことが増々不可欠になっている。より一般的には、ポティウイルスによる感染の経済的重大性そしてこのタイプの感染に対する直接的な対抗手段がないことを考慮すると、多抵抗性の植物亜種の探究が、植物改良の主軸の一つを構成する。
【０００７】
ＣＡＲＡＮＴＡ ｅｔ ａｌ．（Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ． ８６（７）： ７３９−７４３， １９９６）はトウガラシにおいて、或る特定の遺伝子座の組合せが抵抗性のスペクトルを拡大し、新しいポティウイルスに対する抵抗性を付与することができるということを示した。かくして、ＰＶＭＶに対する抵抗性を有する植物が、共にＰＶＭＶに対し感受性を有するＣａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ及びＦｌｏｒｉｄａ ＶＲ２の亜種間の交配に由来する倍化半数体の子孫において同定された。遺伝子解析により、（Ｆｌｏｒｉｄａ ＶＲ２に由来し、かつ病原型０及び１のＰＶＹ並びにＴＥＶに対する抵抗性を制御する）劣性遺伝子ｐｖｒ２と、Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ由来のｐｖｒ６と名付けられたもう一つの劣性因子との協働からＰＶＭＶに対する抵抗性が得られることが示された。
【０００８】
病原因子（ウイルス、細菌、菌類又は線虫）による攻撃に対して、植物は、感染から自己防御する又は感染に耐えるためのいくつかの戦略を有している。非宿主抵抗性（一つの種の全ての個体が一つの特定の病原体に対する抵抗性を有する場合）と宿主耐性（その種の少なくとも一つの個体が病原因子の一つの株に対し感受性を有する場合）が区別される。関与する遺伝子が優性であるか劣性であるかに応じて宿主抵抗性の二つの導入方法を区別することが可能である。
【０００９】
ＦＬＯＲ（Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ． ９： ２７５−２９６， １９７１）によって記載された「遺伝子対遺伝子モデル」では、植物の優性主働遺伝子が関与する。抵抗性は、病原因子におけるこの遺伝子及び対応する特異的非病原性遺伝子の存在に左右される。これら二つの遺伝子が同時に存在する場合、宿主植物の抵抗性が誘発され、往々にして、感染部位に局在した過敏反応（壊死）に関与する。
【００１０】
抵抗性は同様に劣性の植物遺伝子によっても制御可能である。特に、ポティウイルスに対する抵抗性の半分近くが劣性であると推定されており、一方その他の病原因子についてのこの割合は平均２０％にすぎない。ＦＲＡＳＥＲ（Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ ６３： １７５−１８５， １９９２）は、劣性の抵抗性が、植物内でのウイルスのサイクルの完成に必要な宿主の遺伝子産物の特異的な欠損又は改変の結果もたらされるという、「Ｆｒａｓｅｒの負のモデル」という名前で知られている仮説を提起した。
【００１１】
ポティウイルスのＶＰｇタンパク質は、ポティウイルス／宿主植物の相互作用、特に或る特定の宿主植物に対する或る特定のポティウイルス株の病原性において重要な役割を果たす。ＶＰｇタンパク質内に突然変異を有するポティウイルスは、ウイルス増殖の阻害、細胞間のポティウイルスの移動の阻害又は長距離でのそれらの移動の阻害といったさまざまな機序に関与する、抵抗性の劣性遺伝子を回避することができるということが示されている。このことは、ＴＶＭＶ／Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ（ｖａ遺伝子）、ＰＶＹ／トマト（ｐｏｔ−１遺伝子）、ＰＶＹ／トウガラシ類（ｐｖｒ２遺伝子）、ＬＭＶ／レタス（ｍｏ１遺伝子）及びＰＳｂＭＶ／エンドウ（ｓｂｍ１遺伝子）という対において示された（ＫＥＬＬＥＲ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ． １１： １２４−１３０ ２０， １９９８； ＭＯＵＲＹ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ． １７（３）： ３２２−３２９， ２００４； ＲＥＤＯＮＤＯ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ． １４： ８０４−８１０， ２００１； ＮＩＣＯＬＡＳ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌ． ２３７： ４５２−４５９ ３５， １９９７； ＭＡＳＵＴＡ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ． ８９： １１８−１２３， １９９９）。
【００１２】
ポティウイルスのＶＰｇタンパク質と相互作用することができる宿主植物の因子の中には、特に、ＲＮＡの真核生物翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）が存在し、そして特にｅＩＦ４Ｅ及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅと呼ばれるアイソフォームが存在する（ＷＩＴＴＭＡＮ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌ． ２３４： ８４−９２， １９９７； ＳＣＨＡＡＤ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌ． ２７３： ３００−３０６， ２０００； ＬＥＬＬＩＳ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． １２： １０４６−１０５１， ２００２； ＤＵＰＲＡＴ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ． ３２： ９２７−９３４， ２００２）。植物においては、ｅＩＦ４Ｅは、ＲＮＡのキャップ（ｍ７ＧｐｐｐＮ）と翻訳開始構造を結合させることを可能にするｅＩＦ４Ｆ複合体（ｅＩＦ４ＥとｅＩＦ４Ｇの化合物）を構成する（ＢＲＯＷＮＩＮＧ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３２（１−２）： １０７−１４３， １９９６）。植物細胞から二つのｅＩＦ４Ｆ複合体（ｅＩＦ４Ｆ及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｆと命名されたもの）が精製され、そのそれぞれのサブユニットは、ＲＮＡのキャップに結合するサブユニットについてはｅＩＦ４Ｅ（サブユニットｐ２６）及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ（サブユニットｐ２８）、もう一つのサブユニットについてはｅＩＦ４Ｇ及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｇと命名された。さまざまなタイプのＲＮＡの翻訳に関与すると思われるｅＩＦ４Ｅ及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅは植物における小さい多重遺伝子族に属しており、該多重遺伝子族はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａにおいては４つの遺伝子から成り、そのうちの三つがｅＩＦ４Ｅをコードし、一つがアイソフォームｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅをコードする（ＲＯＤＲＩＧＵＥＺ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ． １３（４）： ４６５−４７３， １９９８）。
【００１３】
タンパク質ｅＩＦ４Ｅ及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅは両方共、ＩＦ４Ｅと呼ばれる保存されたドメインを有する。このドメインは、ＰＦＡＭデータベース（ＢＡＴＥＭＡＮ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３０： ２７６−２８０， ２００２）上にＰＦＡＭ０１６５２という番号で載っている。しかしながら、同じサブファミリー（すなわち４Ｅ又は（ｉｓｏ）４Ｅ）に属し異なる種に由来するｅＩＦ４Ｅタンパク質は、同じ種に由来するｅＩＦ４Ｅタンパク質とｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質の間で見られるもの（４２〜５１％の同一性）を上回る同一率を示す（ｅＩＦ４Ｅタンパク質間では６１〜８６％の同一性、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質間では５９〜８２％の同一性）（ＲＵＦＦＥＬ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ｉｎ ｐｒｅｓｓ， ２００４）。
【特許文献１】国際公開第０３／０６６９００号パンフレット
【非特許文献１】ＣＡＲＡＮＴＡ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ． ８６（７）： ７３９−７４３， １９９６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
以下の記載では、それぞれサブファミリーｅＩＦ４Ｅ及びサブファミリーｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅを代表するタンパク質として、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍのｅＩＦ４Ｅタンパク質及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質について述べる。
【００１５】
Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍのｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＹ１２２０５２）は、添付の配列表において配列番号１で示されており、推定されたポリペプチド配列は配列番号２で示されている。
【００１６】
Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、添付の配列表において配列番号３で示されており、推定されたポリペプチド配列は配列番号４で示されている。
【００１７】
ここでは、ＩＦ４Ｅドメインを含み、かつそのペプチド配列が少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、きわめて好ましくは少なくとも７０％の全体的な同一性をＣａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍのｅＩＦ４Ｅタンパク質（配列番号２）との間で有しているあらゆるタンパク質を、ｅＩＦ４Ｅタンパク質と定義する。
【００１８】
ＩＦ４Ｅドメインを含み、かつそのポリペプチド配列が少なくとも５９％、好ましくは少なくとも６５％、きわめて好ましくは少なくとも７０％の同一性をＣａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質（配列番号４）との間で有しているあらゆるタンパク質を、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質と定義する。
【００１９】
ここで述べた同一率とは、配列番号２又は配列番号４の参照配列の全てを含む配列のアラインメントにＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）のＰＩＬＥＵＰプログラムを利用することにより決定された全体的な同一率である。
【００２０】
ｅＩＦ４Ｅ又はｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅを改変する突然変異は、或る特定のポティウイルス種に対する劣性の抵抗性を誘発するということが報告されてきている。例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａにおけるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅアイソフォームをコードする遺伝子の分断は、Ｔｕｒｎｉｐ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ（ＴｕＭＶ）、ＴＥＶ及びＬｅｔｔｕｃｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ（ＬＭＶ）に対する抵抗性を誘発するものの、Ｔｏｍａｔｏ ｂｌａｃｋ ｒｉｎｇ ｖｉｒｕｓ（ＴＢＲＶ、Ｎｅｐｏｖｉｒｕｓ属）又はＣｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ、Ｃｕｃｕｍｏｖｉｒｕｓ属）に対する抵抗性には効果が無いということが示された（ＤＵＰＲＡＴ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ． ３２： ９２７−９３４， ２００２； ＬＥＬＬＩＳ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． １２： １０４６−１０５１， ２００２）。ＮＩＣＡＩＳＥ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １３２： １２７２−１２８２， ２００３）は、レタスモザイクウイルス（ＬＭＶ）に対する抵抗性をもつ植物はｅＩＦ４Ｅ遺伝子内に点突然変異を有し、その反面、抵抗性レタス植物におけるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の配列は感受性のある植物のものと異なっていないということを示した。
【００２１】
ＲＵＦＦＥＬ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｊ． ３２： １０６７−１０７５， ２００２）ならびに国際公開第０３／０６６９００号パンフレットは、劣性遺伝子ｐｖｒ２により付与されたＴＥＶ及びＰＶＹに対する劣性の抵抗性が、ｅＩＦ４Ｅ内、特にこのタンパク質の、さまざまな植物種に由来するｅＩＦ４Ｅタンパク質間できわめて高度に保存された領域内での配列の変異と関係するということを示している。
【００２２】
本発明者は今や、トウガラシにおけるｐｖｒ６遺伝子座とｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子との同時分離を実証した。本発明者は、ＰＶＭＶに対する抵抗性を示す植物が、国際公開第０３／０６６９００号パンフレットに記載されたような翻訳因子ｅＩＦ４Ｅをコードする突然変異した対立遺伝子（抵抗性対立遺伝子ｐｖｒ２）に加えて、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅをコードする配列内の突然変異を有するということを確認した。
【００２３】
この突然変異は、野生型タンパク質の２０２個のアミノ酸の５１番目のアミノ酸に終止コドンが組み込まれ、コード配列において８２ｂｐが欠失することから成る。野生型ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質と突然変異タンパク質の間では最初の２９のアミノ酸のみが保存され、そのことは、突然変異タンパク質がもはや機能的でないことを表わしている。
【００２４】
従って、単独ではＰＶＭＶ抵抗性を付与しないものの劣性因子ｐｖｒ２と協働した場合にはこの抵抗性を付与することができるものとして先に記載した劣性因子ｐｖｒ６（ＣＡＲＡＮＴＡ ｅｔ ａｌ．， １９９６，前掲書）は、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に対応する。これまでに同定されたｅＩＦ４Ｅ又はｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの突然変異体の場合、これら二つの遺伝子の一方のみの突然変異で一つ又は複数の特定のポティウイルスに対する劣性の抵抗性を充分に付与できることから、ｐｖｒ６とｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの間のこの対応は予想外のことである。
【００２５】
従って、ＰＶＭＶを第一の例とする一部のポティウイルスは、それらの感染サイクルを完成させるためのｅＩＦ４Ｅ及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの利用に関して、これまでに見られたものとは異なる形の挙動を示すと思われる。これまで研究されたポティウイルスが、宿主植物内でｅＩＦ４Ｅ或いはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの一方を利用していたのに対し、ＰＶＭＶはｅＩＦ４Ｅ及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの両方を利用することができると思われる。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明は、ＰＶＭＶに対する抵抗性を有する植物の選別方法において、試験対象の植物において、前記植物内に存在するｅＩＦ４Ｅ及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質の形態を調査する段階、並びに
ａ） ＤＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＫＳＸ5ＱＸ6ＡＷＧＳＳＸ7ＲＸ8Ｘ9ＹＴＦＳＸ10ＶＥＸ11ＦＷＸ12Ｘ13ＹＮＮＩＨＸ14ＰＳＫＬＸ15Ｘ16ＧＡＤ（式中、
− Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ15及びＸ16は各々中性アミノ酸を表わし、
− Ｘ5及びＸ14は塩基性アミノ酸を表わし、
− Ｘ11は酸性アミノ酸を表わし、
− Ｄ、Ｋ、Ｓ、Ｑ、Ａ、Ｗ、Ｇ、Ｒ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｖ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｐ及びＬは一文字コードでのその通常の意味を有する）
という一般配列（Ｉ）により定義される領域を含むｅＩＦ４Ｅタンパク質（以下「野生型ｅＩＦ４Ｅタンパク質」と呼ぶ）を全く発現せず、
かつ、前記配列（Ｉ）の少なくとも一つの中性アミノ酸を荷電アミノ酸好ましくは塩基性アミノ酸により置換し、かつ／又は前記配列（Ｉ）の少なくとも一つの荷電アミノ酸を中性アミノ酸又は逆の電荷をもつアミノ酸により置換することにより上述の配列（Ｉ）が定義する領域から誘導された領域を含む、突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質を発現し、かつ
ｂ） 機能性ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を全く発現しない、
植物を選別する段階、
を含んで成ることを特徴とする方法に関する。
【００２７】
ここで、「中性アミノ酸」として定義されるのは、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、グルタミン、アスパラギンの中から選択されるあらゆるアミノ酸である。「荷電アミノ酸」として定義されるのは、ヒスチジン、リジン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸の中から選択されるあらゆるアミノ酸である。これらの荷電アミノ酸の中で、ヒスチジン、リジン又はアルギニンは塩基性アミノ酸であり、グルタミン酸及びアスパラギン酸は酸性アミノ酸である。
【００２８】
ここで「機能性ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質」として定義されるのは、ｅＩＦ（ｉｓｏ４Ｇ）と複合体を形成しＲＮＡのキャップに結合することができるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質である。機能性ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を全く発現しない植物は、いかなるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質も発現できないか、或いは非機能性ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質のみを発現できるかである。
【００２９】
ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質の発現の欠如は、例えば、このタンパク質をコードする配列の欠失、又はｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の転写及び／もしくは翻訳の欠如によって生じ得る。ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質の非機能性は例えば、このタンパク質をコードする配列中の突然変異などによって生じる。
【００３０】
この非機能性ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質に関しては、野生型ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質における、真核生物のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質間に保存されているＩＦ４Ｅドメインの８つのトリプトファン残基のうちの一つ又は複数を含む部分を、前記非機能性ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質内に有していない植物が、優先的に選別される。これらのトリプトファン残基は、配列番号４の配列の３４位、３７位、５０位、６７位、９６位、１０７位、１２１位及び１５６位にあるものに対応している。これらは、配列のアラインメントに基づき、その他のあらゆるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質内で当業者により容易に位置特定され得る。
【００３１】
有利には、欠失部分は、配列番号４の配列の３１〜３６位、４７〜５２位、６４〜６９位、９３〜９８位、１１８〜１２３位及び１５３〜１５８位に対応するＩＦ４Ｅドメインの領域のうちの一つ又は複数を含む。
【００３２】
特に有利には、欠失部分は、配列番号４の参照配列の３０〜２０２位に対応するＩＦ４Ｅドメインの残基を含んでいる。
【００３３】
ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質におけるこの欠失は、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のコード部分における欠失により生じ得る。これは同様にｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ内の点突然変異、又は早まった終止コドン及び／もしくはリーディングフレームのずれを導く外因性配列の挿入によっても生じ得る。関係する突然変異のタイプ及びこの突然変異の位置に応じて、その生じた非機能性ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質は、欠失部分の代りに非関連配列を含み得る。
【００３４】
ｅＩＦ４Ｅタンパク質に関しては、
− 荷電アミノ酸による、前記配列（Ｉ）のアミノ酸Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3又はＸ4のうちの少なくとも一つの置換、及び
− 荷電アミノ酸による、前記配列（Ｉ）のその他の中性アミノ酸のうちの少なくとも一つの置換、及び／又は
− 中性アミノ酸もしくは逆の電荷をもつアミノ酸による、前記配列（Ｉ）の荷電アミノ酸のうちの少なくとも一つの置換
により上述の配列（Ｉ）が定義する領域から誘導された領域を含む突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質を有する植物が優先的に選別される。
【００３５】
特に好ましくは、
− 塩基性アミノ酸による、配列（Ｉ）の中性アミノ酸Ｘ3の置換、
− 塩基性アミノ酸による、配列（Ｉ）の中性アミノ酸Ｘ7の置換、
− 中性アミノ酸による、配列（Ｉ）のＣ末端の位置にあるアスパラギン酸残基の置換
により上述の配列（Ｉ）が定義する領域から誘導された領域を含む突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質を含有する植物が選別される。
【００３６】
試験対象の植物に存在するｅＩＦ４Ｅタンパク質及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質の形態の検出は、例えばｅＩＦ４Ｅタンパク質又はｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質の野生型の形態又は突然変異型の形態に対して特異的な抗体などを用いて実施可能である。
【００３７】
しかしながら、一般に、試験対象の植物に存在するｅＩＦ４Ｅ及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の対立遺伝子の形態を調べることによりこの検出を行うのがより便利である。
【００３８】
本発明は、ＰＶＭＶに対する抵抗性を有する植物の選別方法において、試験対象の植物において、前記植物内に存在するか又はそこで発現したｅＩＦ４Ｅ及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の対立遺伝子の形態を調べる段階、及び、上述した野生型ｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードするｅＩＦ４Ｅ遺伝子のいかなる対立遺伝子ももたず又は発現もせず、しかも上述した突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードするｅＩＦ４Ｅ遺伝子の対立遺伝子を発現し、その上、上述した機能性ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードするｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のいかなる対立遺伝子ももたず又は発現もせず、かつ場合によっては上述した非機能性ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードするｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の対立遺伝子を発現する植物を選別する段階を含んで成ることを特徴とする方法に関する。
【００３９】
試験対象の植物において存在するｅＩＦ４Ｅ及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の対立遺伝子の形態の検出は、それ自体当業者にとって既知である従来の方法により実施することができる。例えば、ｅＩＦ４ＥもしくはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの野生型対立遺伝子もしくは突然変異対立遺伝子と選択的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドプローブ、又はｅＩＦ４ＥもしくはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅもしくはこれらの遺伝子の目的の突然変異を有する部分の増幅を可能にする増幅プライマーを利用することができる。その後、増幅産物においてこの突然変異の有無を、例えば該増幅産物の配列決定によって、又は、目的の突然変異の性質に応じて、増幅産物のサイズの決定、もしくは野生型対立遺伝子内あるいは突然変異対立遺伝子内にのみ存在する標的配列を認識する制限酵素での消化によって、検出することができる。
【００４０】
本発明は同様に、ＰＶＭＶに対する抵抗性を有する植物を取得する方法をも目的としている。
【００４１】
本発明に従った方法の第一の変形形態に従うと、これには、
− 前記植物に存在するｅＩＦ４Ｅ遺伝子の対立遺伝子を、上述した突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする対立遺伝子に置き換える段階、及び
− 前記植物に存在するｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の対立遺伝子を、上述した非機能性突然変異ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする対立遺伝子に置き換える段階、又は前記ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子を直接もしくはエピジェネティックに不活性化させる段階
が含まれる。
【００４２】
本発明に従った方法の第二の変形形態に従うと、該方法は、そのｅＩＦ４Ｅ遺伝子の全ての対立遺伝子が上述した突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする植物から実施され、前記植物に存在するｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の対立遺伝子を、上述した非機能性突然変異ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする対立遺伝子に置き換える段階、又は前記ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子を直接もしくはエピジェネティックに不活性化させる段階を含んで成る。
【００４３】
本発明に従った方法の第三の変形形態に従うと、該方法は、そのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の全ての対立遺伝子が上述した突然変異ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする植物から、又は前記ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子が不活性化されている植物から実施され、前記植物に存在するｅＩＦ４Ｅ遺伝子の対立遺伝子を上述した突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする対立遺伝子に置き換える段階を含んで成る。
【００４４】
ｅＩＦ４Ｅ遺伝子又はｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の「対立遺伝子の置き換え」というのは、ここでは、その修飾を実施するために用いる方法の如何に関わらず、所望の突然変異配列による、関連する遺伝子の最初のコード配列の置換を生じさせる、あらゆる遺伝子修飾を意味する。
【００４５】
ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の「不活性化」というのは、ここでは、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質の発現の欠如をもたらすあらゆる遺伝子修飾を意味する。この不活性化は、それがｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の修飾（例えばコード配列のレベル又は前記遺伝子のプロモーター配列のレベルのもの）により生じる場合に「直接的不活性化」と定義され、それがｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の修飾によらない場合「エピジェネティック不活性化」と定義される。「サイレンシング」とも呼ばれるエピジェネティック不活性化は、特に転写の遮断（転写サイレンシングもしくは「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ」を略してＴＧＳ）又はｍＲＮＡの特異的分解（転写後サイレンシングもしくは「Ｐｏｓｔ−Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ」を略してＰＴＧＳ）により生じ得る。
【００４６】
所望の突然変異対立遺伝子によるｅＩＦ４Ｅ又はｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の対立遺伝子の置き換えは、相同組換えといった遺伝子組換えを利用した、又はＴＩＬＬＩＮＧ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ ＩＮ Ｇｅｎｏｍｅｓ； ＭａＣＡＬＬＵＭ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １２３： ４３９−４４２， ２０００）もしくはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の場合の挿入による突然変異誘発といった突然変異誘発を利用した、それ自体既知の技術により実施することができる。
【００４７】
ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の直接的不活性化も同様に、同じ技術により実施することができる。
【００４８】
ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のサイレンシングは、センス方向又はアンチセンス方向の抑制によって、又はＲＮＡｉ（ＮＩＳＨＩＫＵＲＡ， Ｃｅｌｌ １０７： ４１５−４１８， ２００１； ＴＥＮＬＬＡＤＯ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ． １０２： ８５−９６， ２００４； ＺＡＭＯＲＥ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２５２： ５３３−５４３， ２００４）の利用によって実施可能である。
【００４９】
本発明は同様に、本発明に従った方法により得られる可能性のあるＰＶＭＶ抵抗性の植物をも目的としている。
【００５０】
これには特に次のものが含まれる。
− ＣＡＲＡＮＴＡ ｅｔ ａｌ．（１９９６、前掲書）の刊行物の中で記載されている二重変異体ｐｖｒ２ ｐｖｒ６以外の、存在するｅＩＦ４Ｅ遺伝子の対立遺伝子が上述した突然変異対立遺伝子であり、存在するｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の対立遺伝子が上述した非機能性の突然変異対立遺伝子である植物、
− 存在するｅＩＦ４Ｅ遺伝子の対立遺伝子が上述した突然変異対立遺伝子であり、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の対立遺伝子が直接不活性化されている植物、
− 存在するｅＩＦ４Ｅ遺伝子の対立遺伝子が上述した突然変異対立遺伝子であり、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現をなくすことができる一つの配列（センス鎖、アンチセンス鎖、又はＲＮＡｉで転写可能なもの）により形質転換されている植物。
【００５１】
本発明に従ったＰＶＭＶ抵抗性植物の選別又は取得方法は、ＰＶＭＶから防御することが望まれているあらゆる植物、より詳細には、トウガラシ、トマト又はナスといったようなナス科、メロンといったウリ科、アブラナ科、エンドウといったマメ科及びキク科の植物に適用可能である。
【００５２】
さらにこれらの方法は同様に、ＰＶＭＶと同様にその感染サイクルを完成するために区別なくｅＩＦ４Ｅ又はｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅを利用することのできるその他のポティウイルス、例として挙げるとポティウイルスＢＣＭＶ（Ｂｅａｎ ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）又はポティウイルスＡｚＭＶ（Ａｚｕｋｉｎｉ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）（ＦＩＳＨＥＲ及びＫＹＬＥ， Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． ９２： ２０４−２１２， １９９６）に対する植物の防御のためにも適用することができる。
【００５３】
本発明は、ＰＶＭＶに対する抵抗性におけるｅＩＦ４Ｅ及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの関与並びにＰＶＭＶ抵抗性植物の選別及び取得のための本発明に従った方法の実施を例示する実施例について述べた、以下の補足的な記載を読むことにより、さらによく理解されるものである。
【実施例１】
【００５４】
トウガラシにおけるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ（ｐｖｒ６+）のｃＤＮＡの取得
【００５５】
ポティウイルスに対する感受性を有するトウガラシのＹｏｌｏ Ｗｏｎｄｅｒ遺伝子型由来の全ＲＮＡを、ＴＲＩ−Ｒｅａｇｅｎｔ試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ）を用いて、１００〜２００ｍｇの葉から単離した。
【００５６】
トウガラシのｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのｃＤＮＡの３’末端を、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＥＭＢＬ登録番号：Ｙ１０５４７）、Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ５３０１６３）及びＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（ＴＩＧＲ：ＴＣ１２６３１６）のｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのｃＤＮＡ配列のアラインメントに基づいて設計されたプライマー５’−ＡＡＧＴＧＧＡＣＴＧＴＴＡＣＧＡＧＣＡＧＣＡＧ−３’（配列番号５）を用いて、３’ＲＡＣＥ ＰＣＲ技術（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ３’ＲＡＣＥシステムキット、バージョン２．０）により得た。
【００５７】
３’ＲＡＣＥ産物の配列（５’−ＡＴＴＧＣＴＧＧＡＡＣＴＴＧＧＧＧＡＧＧＧ−３’、配列番号６）から設計されたプライマー、及びトマトのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ配列の５’ＵＴＲ末端（ＴＩＧＲ登録番号ＴＣ１２６３１６）（５’−ＡＡＡＡＣＡＡＴＧＧＣＣＡＣＣＧＡＡＧＣＡ−３’、配列番号７）から設計されたプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲにより、トウガラシのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の全長ｃＤＮＡを増幅した。以下の条件下でＲＴ−ＰＣＲを実施する：９４℃で５分間、次に（９４℃で３０秒、５３℃で３０秒、７２℃で１分の）サイクルを３０回、そして７２℃で５分間。
【００５８】
ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター系（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＵＳＡ）を、増幅後にｃＤＮＡをクローニングするために利用した。
【００５９】
Ｇｅｎｏｍｅ ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｒｅｎｏｂｌｅ， ＦＲＡＮＣＥ）により、二つの末端から、少なくとも３つの独立した陽性クローンを配列決定した。ヌクレオチド配列又はペプチド配列の分析のために、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＵＳＡ）のＰｉｌｅＵｐプログラムを利用した。
【００６０】
このようにして得られたトウガラシのｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのｃＤＮＡ配列は、６６０個のヌクレオチド長（配列番号３）を有しており、また２０２個のアミノ酸（配列番号４）をコードする６０９個のヌクレオチドの唯一のリーディングフレームを有している。
【００６１】
トウガラシのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの全ｃＤＮＡを含む比較ウインドウでＢＬＡＳＴソフトウェアを利用することにより決定される最大の配列同一率を、レタス（ＡＦ５３０１６３， Ｅ＝１・１０-59）、エンドウ（ＡＹ４２３３７７， Ｅ＝２・１０-24）、トウモロコシ（ＡＦ０７６９５５， Ｅ＝４・１０-10）、Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ（Ｙ１０５４７， Ｅ＝６・１０-9）及び小麦（Ｍ９５８１８， Ｅ＝９・１０-8）のｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのｃＤＮＡについて得た。
【００６２】
トウガラシのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの前述の全ペプチド配列を含む比較ウインドウでＢＬＡＳＴソフトウェアを利用することにより決定される最大の配列同一率を、レタス（ＡＡＰ８６６０３， Ｅ＝８・１０-77）及び小麦（ＡＡＡ３４２９６， Ｅ＝９１・１０-873）のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質について得、得られたＹｏｌｏ ＷｏｎｄｅｒのｃＤＮＡがｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのｃＤＮＡに非常に良く対応することを確認した。
【００６３】
トウガラシのｅＩＦ４Ｅ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＹ１２２０５２， ＲＵＦＦＥＬ ｅｔ ａｌ．， ２００２）及びトウガラシのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅのコード領域は、５７．２％の配列同一性を示す（又、対応するペプチド配列のレベルでは４８．３％の配列同一性）。
【実施例２】
【００６４】
トウガラシにおける遺伝子型ｐｖｒ６+及びｐｖｒ６の配列の比較：ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅにおける突然変異の実証
【００６５】
配列の変異を対立遺伝子ｐｖｒ６+又はｐｖｒ６と関連付けることができるか否かを決定するために、異なる５つのトウガラシ系統のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの全長ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列をアラインした。
− Ｙｏｌｏ Ｗｏｎｄｅｒ亜種（ＹＷ）はポティウイルスに対して感受性を有する。
− Ｙｏｌｏ Ｙ亜種（ＹＹ）は、抵抗性対立遺伝子ｐｖｒ２1（ＰＶＹ病原型０に対する抵抗性）を有し、ＰＶＭＶに対する感受性を示す。
− Ｆｌｏｒｉｄａ ＶＲ２亜種（Ｆ）は、抵抗性対立遺伝子ｐｖｒ２2（ＰＶＹ（０）及び（１）並びにＴＥＶに対する抵抗性）を有し、ＰＶＭＶに対する感受性を示す。
− Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ亜種（Ｐ）は、ＰＶＹ及びポティウイルスＥに対する部分的な抵抗性を有する対立遺伝子ｐｖｒ２3、及び対立遺伝子ｐｖｒ６を有し、ＰＶＭＶに対する感受性を示す。
− Ｆ１［Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ×Ｆｌｏｒｉｄａ ＶＲ２］由来の倍化半数体系統ＤＨ８０１は、対立遺伝子ｐｖｒ２2及びｐｖｒ６を有し、ＰＶＭＶに対する抵抗性を示す。
【００６６】
上述の５つのトウガラシ系統のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅのリーディングフレーム及び対応するアミノ酸配列のアラインメントの結果を、図１に示した。
【００６７】
図１の説明：
（Ａ）は、遺伝子型ｐｖｒ６+及びｐｖｒ６のヌクレオチド配列のアラインメント（コード部分）であり、
（Ｂ）は、遺伝子型ｐｖｒ６+及びｐｖｒ６の対応するアミノ酸配列のアラインメントである。
【００６８】
ヌクレオチドのアラインメントは、遺伝子型ＹＷ、ＹＹ及びＦの対立遺伝子ｐｖｒ６+のコード部分が互いに１００％同一であることを示している。ヌクレオチドのアラインメントは、遺伝子型Ｐ及びＤＨ８０１の対立遺伝子ｐｖｒ６のコード部分が同様に互いに１００％同一であるが、ヌクレオチド８９〜１７０の欠失と、２６８位におけるＡによるＧの置換、４８３位におけるＡによるＣの置換、そして５３７位におけるＴによるＣの置換とによって第一の群と異なっているということを示している（図１Ａ）。８２個のヌクレオチドの欠失は、リーディングフレームを変化させ、５１番アミノ酸の後に終止コドンを導入する。遺伝子型ｐｖｒ６+及びｐｖｒ６のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質の配列のアラインメントは、最初の２９のアミノ酸（該タンパク質がもつ２０２個のうち）のみが保存されているということを示している（図１Ｂ）。
【実施例３】
【００６９】
ホモ接合の状態で、ｐｖｒ２遺伝子座で突然変異した対立遺伝子（対立遺伝子ｐｖｒ２1又はｐｖｒ２2に対応するｅＩＦ４Ｅ配列）及び突然変異した対立遺伝子ｐｖｒ６（突然変異したｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ配列）を同時に有する植物の選別
【００７０】
ホモ接合の状態で対立遺伝子ｐｖｒ２1（国際公開第０３／０６６９００号パンフレットの配列番号８）又はｐｖｒ２2（国際公開第０３／０６６９００号パンフレットの配列番号２２）を有するトウガラシの植物から（これらの突然変異体の選別方法は国際公開第０３／０６６９００号パンフレット内に記載されている）、突然変異したｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅに対応する対立遺伝子ｐｖｒ６をさらに有し、かくしてＰＶＭＶ抵抗性を有する植物を、以下のとおりに選別する。
【００７１】
ＲＴ ＰＣＲによる選別
【００７２】
植物からのＲＮＡの抽出は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＵＳＡ）により市販されている製品ＴＲＩ−Ｒｅａｇｅｎｔを用いて、同社により提供されている手順に基づく標準的な抽出手順に従う。
【００７３】
ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写（ＲＴ）は以下のように実施する。７．５μｌのＨ2Ｏ、１μｌのオリゴＤＴプライマー（１００ｎｇ／μｌ）、２．５μｌのｄＮＴＰ（各４ｍＭ）及び２μｌのＲＮＡの混合物を、６５℃で５分間インキュベートし、その後２分間氷冷する。４μｌのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＲＴ緩衝液（５×）及び２μｌのＤＴＴ（０．１Ｍ）を添加し、次に混合物を４２℃で２分間インキュベートする。１μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，２００Ｕ／μｌ）を添加し、次に混合物を４２℃で５０分間インキュベートする。７０℃で１５分間、反応を不活性化させ、その後、生成したｃＤＮＡを４℃で保存する。
【００７４】
１７μｌのＨ2Ｏ、２．５μｌのＨｉｆｉ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ緩衝液（１０×）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１μｌのＭｇＳＯ4（５０ｍＭ）、１μｌのｄＮＴＰ（各４ｍＭ）、０．５μｌのセンスプライマー５’−ＡＴＧＧＣＣＡＣＣＧＡＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＧＧ−３’（配列番号８）（１０μｍ）、０．５μｌのアンチセンスプライマー５’−ＴＣＡＣＡＣＧＧＴＧＴＡＴＣＧＧＣＴＣＴＴＡＧＣＴ−３’（配列番号９）（１０μＭ）（これらのプライマーの位置は図１Ａに示した）、０．５μｌのＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｐｌａｔｉｎｉｕｍ Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び２μｌのＲＴ産物を混合して、ＰＣＲを実施する。以下の条件下でＰＣＲを実施する：９４℃で５分間、次に（９４℃で３０秒、６４℃で３０秒、７２℃で１分の）サイクルを３０回、そして７２℃で５分間。
【００７５】
ＰＣＲ産物の泳動を１×ＴＡＥ緩衝液を用い１％のアガロースゲル上で実施し、増幅した断片を臭化エチジウム（ＢＥＴ）での染色により明らかにする。
【００７６】
結果を図２に示した。
【００７７】
図２の説明：
レーン１は、栽培品種ＰｅｒｅｎｎｉａｌのＲＮＡで実施したＲＴ−ＰＣＲに対応し（対立遺伝子ｐｖｒ６）、２及び３は栽培品種Ｆｌｏｒｉｄａ ＶＲ２及びＹｏｌｏ Ｗｏｎｄｅｒ（対立遺伝子ｐｖｒ６+）に対応する。レーン５、６、７、８、１１、１２、１３、１４、１５、１９、２０、２２、２３及び２５は、ＰＶＭＶ抵抗性の子孫において実施したＲＴ−ＰＣＲに対応し、レーン４、９、１０、１６、１７、１８、２１及び２４はＰＶＭＶに対する感受性を有する子孫において実施したＲＴ−ＰＣＲに対応する。
【００７８】
結果は、突然変異したｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの対立遺伝子（ｐｖｒ６）を有する植物が５２７ｂｐの増幅産物（８２ｂｐの欠失に相当）を示し、一方野生型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの対立遺伝子（ｐｖｒ６+）を有する植物は６０９ｂｐの増幅産物を示すということを示している。
【００７９】
ＲＦＬＰによる選別
【００８０】
１） ＥｃｏＲＶによる消化及び制限断片の分離
【００８１】
ＦＵＬＴＯＮ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｔｒ． １３（３）： ２０７−２０９， １９９５）により記載されたマイクロ抽出の手順に従って、植物からＤＮＡを抽出する。
【００８２】
その後、これを一晩３７℃でＤＮＡ１μｇあたり２．５ＵのＥｃｏＲＶ酵素で消化する。消化産物を、ＢＥＴ１０μｌを含有するＮＥＢの１％アガロースゲル（１×）上に載せ、制限断片を分離する。ＮＥＢの１×緩衝液の中で２４時間２５Ｖで泳動を実施し、泳動の後、断片をナイロン膜上に移す。膜を１０〜１５分間２×ＳＳＣですすぎ、その後外気で乾燥させ、８０℃で２時間加熱する。
【００８３】
２） プローブの調製
【００８４】
実施例１で記載したように得たＹｏｌｏ Ｗｏｎｄｅｒ遺伝子型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ（ｐｖｒ６+）のｃＤＮＡをプローブとして利用する。
【００８５】
32Ｐで標識したプローブの調製を、以下の条件下でＰＣＲにより実施する。
【００８６】
【表１】
【００８７】
１００ｍＭの母液から１０ｍＭへの、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰの希釈：
− １００ｍＭのｄＮＴＰ ５μｌ、
− Ｈ2Ｏ ４５μｌ。
【００８８】
１００ｍＭの母液から１ｍＭへのｄＣＴＰの希釈：
− １００ｍＭのｄＣＴＰ ０．５μｌ、
− Ｈ2Ｏ ４９．５μｌ。
ＡＴＧ＋ｄＣＴＰのミックス：
− １０ｍＭのｄＡＴＰ ２．５μｌ 最終濃度：５０μＭ、
− １０ｍＭのｄＴＴＰ ２．５μｌ 最終濃度：５０μＭ、
− １０ｍＭのｄＧＴＰ ２．５μｌ 最終濃度：５０μＭ、
− １ｍＭのｄＣＴＰ ２．５μｌ 最終濃度：５μＭ、
− Ｈ2Ｏ ４９０μｌ。
【００８９】
プローブの標識は、９４℃で３０秒、５２℃で４５秒、７２℃で１分半というＰＣＲサイクルを３０回繰り返して行う。
【００９０】
標識したらプローブを変性させ、その後、１）で記載したように得た膜とハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションは、以下の緩衝液中で少なくとも１６時間６５℃で実施する：５００ｍＬに対して、ＮａＣｌを２１．９１ｇ、クエン酸ナトリウムを１８．３８ｇ、Ｈ2Ｏを３８０ｍＬ、２０％ＳＤＳを１５ｍＬ、ｐＨ７．５の１ＭのＮａＰＯ4を２５ｍＬ、１００×Ｄｅｎｈａｒｄｔを２５ｍＬ、０．２５ＭのＥＤＴＡを５ｍＬ、５０％の硫酸デキストラン５０ｍＬ）。
【００９１】
その後、６５℃で予熱した、４０ｍＭのＮａＰｉの１％ＳＤＳ緩衝液（Ｓｅｒｖａ）中で膜を洗浄する。
【００９２】
洗浄条件は以下のとおりである：
− 攪拌下で６５℃、２０分間の洗浄を１回、
− ６５℃で加熱した新しい緩衝液中で２〜３分間のすすぎを１回。
【００９３】
ＲＦＬＰの結果を図３に示した。
【００９４】
図３の説明：
この図は、対立遺伝子ｐｖｒ６を有するＰｅｒｅｎｎｉａｌ（ラインＰ）、対立遺伝子ｐｖｒ６+を有するＦｌｏｒｉｄａ ＶＲ２（ラインＦ）、Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ×Ｆｌｏｒｉｄａ ＶＲ２のハイブリッドＦ１（ラインＦ１）、及びＰＶＭＶ抵抗性（ラインＲ）の子孫又はＰＶＭＶ感受性の子孫（ラインＳ）の各遺伝子型間のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅマーカーについて観察されたＲＦＬＰの特徴の違いを示す。
【００９５】
結果は、対立遺伝子ｐｖｒ６+を有する感受性植物が制限断片Ｈを有するのに対し、（対立遺伝子ｐｖｒ２2に加えて）対立遺伝子ｐｖｒ６を有する抵抗性植物が制限断片Ｂを有するということを示している。
【実施例４】
【００９６】
ＰＶＭＶ抵抗性試験及びＰＶＭＶに対する抵抗性をもつトウガラシの一つの遺伝子型におけるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ（ｐｖｒ６+）又はｅＩＦ４Ｅ（ｐｖｒ２+）の一過性発現
【００９７】
ＰＶＭＶに対するトウガラシの抵抗性試験
【００９８】
この試験は、抵抗性対立遺伝子ｐｖｒ２1（又はｐｖｒ２2）及びｐｖｒ６を有する植物がＰＶＭＶに対する充分な抵抗性を有することを確認するために行う。
【００９９】
接種試験で利用するウイルス材料は、コートジボワール共和国で単離されＪ．Ｃ． ＴＨＯＵＶＥＮＥＬ（ＩＲＤ， Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ， Ｆｒａｎｃｅ）により提供されたＰＶＭＶ−ＩＣ分離株、及びＣＡＲＡＮＴＡ ｅｔ ａｌ．の刊行物（１９９６、前掲書）の中で記載された分離株に対応する。該分離株をＢＯＳの方法（ＢＯＳ， Ｍｅｄｅｄ． Ｆａｃ． Ｌａｎｄｂｏｕｗｗｅｔ Ｇｅｎｔ． ３４： ８７５−８８７， １９６９）に従って維持し、子葉又は双葉の段階にあるトウガラシ植物に機械的接種する前にＣａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ ｃｖ． Ｙｏｌｏ Ｗｏｎｄｅｒの植物上で増殖させる。
【０１００】
ウイルス接種材料はＣＡＲＡＮＴＡ ｅｔ ａｌ．（１９９６、前掲書）の中で記載されているように調製する。接種試験は、「防虫」した空調チャンバ内で、制御された条件で実施する。接種から４週間後に、全ての植物を、ＣＡＲＡＮＴＡ ｅｔ ａｌ．（１９９６、前掲書）により記載されているように、ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ試験により、抗原であるＰＶＭＶのキャプシドタンパク質の有無について個別に評価する。トウガラシ植物における機械的接種及びＰＶＭＶの検出については、当業者にとっては完全に既知のものであるその他の手順を利用することもできる。
【０１０１】
この抵抗性試験により、ＰＶＭＶ抵抗性と、ｅＩＦ４Ｅの突然変異型に対応する対立遺伝子ｐｖｒ２1（又はｐｖｒ２2）の存在及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの突然変異型に対応する対立遺伝子ｐｖｒ６の存在との間の、完全な同時分離を確認することが可能になる。
【０１０２】
ＰＶＭＶの感受性におけるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質とｅＩＦ４Ｅタンパク質の独立した役割の検証のための、ＰＶＭＶ抵抗性を有するトウガラシの遺伝子型（ｐｖｒ２2＋ｐｖｒ６の組合せ）における、Ｙｏｌｏ ＷｏｎｄｅｒのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ又はｅＩＦ４ＥのｃＤＮＡの一過性発現
【０１０３】
ＰＶＭＶがその感染サイクルを完成させるために対立遺伝子ｐｖｒ２+（野生型ｅＩＦ４Ｅ対立遺伝子に対応）又は対立遺伝子ｐｖｒ６+（野生型ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ対立遺伝子に対応）を独立した形で利用することができるという仮説を検証する目的で、対立遺伝子ｐｖｒ２2及びｐｖｒ６を有する抵抗性遺伝子型ＤＨ８０１について、ＰＶＸ（ジャガイモウイルスＸ）ウイルスベクターを介した、Ｙｏｌｏ ＷｏｎｄｅｒのｅＩＦ４Ｅ又はｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのｃＤＮＡの一過性発現の実験（ＣＨＡＰＭＡＮ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２（４）： ５４９−５５７， １９９２； ＢＡＵＬＣＯＭＢＥ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ． ７： １０４５−１０５３， １９９５）を実施した。
【０１０４】
遺伝子型Ｙｏｌｏ Ｗｏｎｄｅｒ（ｐｖｒ２+）及びＦｌｏｒｉｄａ ＶＲ２（ｐｖｒ２2）のｅＩＦ４ＥのＯＲＦを、それぞれベクターｐＰＶＸｅＹＷ及びｐＰＶＸｅＦを得るために、クローニング部位ＣｌａＩ及びＳａｌＩで、発現ベクターｐＰＶＸ２０１内で（ＢＡＵＬＣＯＭＢＥ ｅｔ ａｌ．， １９９５、前掲書）クローニングした。同様にして、それぞれ発現ベクターｐＰＶＸ（ｉｓｏ）ｅＹＷ及びｐＰＶＸ（ｉｓｏ）ｅＰを得るために、ｐＰＶＸ２０１内で遺伝子型Ｙｏｌｏ Ｗｏｎｄｅｒ（ｐｖｒ６+）及びＰｅｒｅｎｎｉａｌ（ｐｖｒ６）のｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのＯＲＦをクローニングした。これらのプラスミドをＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａに機械的に接種する。接種から１０日後に、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの接種された葉を、トウガラシの遺伝子型Ｙｏｌｏ Ｗｏｎｄｅｒ及びＤＨ８０１における一過性発現の試験のための接種材料として利用する。発現ベクターＰＶＸをトウガラシに接種してから１０日後に、同じ葉に上述のようにＰＶＭＶ−ＩＣを接種する。
【０１０５】
ベクターＰＶＸとＰＶＭＶの蓄積を、ＰＶＭＶの接種から１０日後に、接種済みの葉について、ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ及びＲＴ−ＰＣＲによって評価する。ＰＶＸの蓄積の検出を可能にするＲＴ−ＰＣＲ（当業者にとって既知の従来の条件）を、以下のプライマーを用いて実施する：センス５’−ＣＣＧＡＴＣＴＣＡＡＧＣＣＡＣＴＣＴＣＣＧ−３’（配列番号１０）及びアンチセンス５’−ＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＴＴＧ−３’（配列番号１１）。ＰＶＭＶの蓄積の検出を可能にするＲＴ−ＰＣＲ（当業者にとって既知の従来の条件）を、次の変性プライマーを用いて実施する：センス（Ｎｉｂ遺伝子内で確定されているもの）５’−ＧＧＮＡＡＲＧＣＮＣＣＮＴＡＹＡＴ−３’（配列番号１２）及びアンチセンス（ＣＰ遺伝子内で確定されているもの）５’−ＣＧＣＧＣＴＡＡＴＧＡＣＡＴＡＴＣＧＧＴ−３’（配列番号１３）。
【０１０６】
ＰＶＭＶに対する抵抗性を有する遺伝子型ＤＨ８０１に、組換えプラスミド（ｅＩＦ４Ｅ又はｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅを有する）及び分離株ＰＶＭＶ−ＩＣを同時接種する。突然変異型がＰＶＭＶに対する感受性を回復しないことを確認するために、ＤＨ８０１において（遺伝子型Ｆｌｏｒｉｄａ ＶＲ２の）対立遺伝子ｐｖｒ２2又は（遺伝子型Ｐｅｒｅｎｎｉａｌの）対立遺伝子ｐｖｒ６を発現させることにより、対照実験を並行して行う。
【０１０７】
結果を、一過性発現実験における、ＰＶＭＶを接種した葉の数に対するＰＶＭＶによる感染を受けた葉の数の比を示す下表にまとめた。
【０１０８】
【表２】
【０１０９】
これらの実験は、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の発現及びそれとは独立してｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現（遺伝子は感受性遺伝子型Ｙｏｌｏ Ｗｏｎｄｅｒに由来）が両方共、抵抗性遺伝子型ＤＨ８０１内でのＰＶＭＶの増殖を可能にするということを示している。これらの実験から、我々は、ＰＶＭＶがその感染サイクルを実現するために野生型ｅＩＦ４Ｅタンパク質又は野生型ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を利用することができ、かつ二つのタンパク質における突然変異が、植物に抵抗性を付与するのに必要であるという結論を下すことができる。
【実施例５】
【０１１０】
ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの不活性化によるＰＶＭＶ抵抗性植物の取得
【０１１１】
抵抗性対立遺伝子ｐｖｒ２1（又はｐｖｒ２2）を有する植物において、ＰＶＭＶ抵抗性を付与するｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の対立遺伝子（ｐｖｒ６）を、部位特異的突然変異誘発タイプの方法（ＨＯＨＮ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９６： ８３２１−８３２３， １９９９）、又は相同組換えの方法（ＫＥＭＰＬＩＮ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３８９： ８０２−８０３， １９９７； ＪＯＮＥＳ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｇｅｎ． Ｒｅｓ． １： ２８５−２９７， １９９２； ＢＥＶＡＮ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ． １２： ８７１１−８７２１， １９８４）により、ｉｎ ｐｌａｎｔａ形質転換することができる。
【０１１２】
ＰＶＭＶ抵抗性の抵抗性対立遺伝子ｐｖｒ２1（又はｐｖｒ２2）を有する植物は同様に、「遺伝子サイレンシング」（転写後遺伝子サイレンシングすなわちＰＴＧＳ）タイプの方法によって内因性ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のノックアウトにより得ることもできる。ＰＴＧＳによる特異的ノックアウトは、内因性ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の５’又は３’ＵＴＲに対してそれを行うことによって実施することができる。５’又は３’ＵＴＲに対するＰＴＧＳによるノックアウトのこの特異性は、ＰＴＧＳの機序の理解に由来する新規なデータに基づくものである（ＮＩＳＨＩＫＵＲＡ， Ｃｅｌｌ １０７： ４１５−４１８， ２００１）。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】５つのトウガラシ系統のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅのリーディングフレーム及び対応するアミノ酸配列のアラインメントの結果を示した図。
【図２】各品種のＲＴ−ＰＣＲの結果を示した図。
【図３】各品種のＲＦＬＰの分析結果を示した図。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子における突然変異の組合せを介してポティウイルス（Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ）属のウイルスに対する抵抗性を有する植物を選別又は取得する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポティウイルスは最も大きな植物ウイルス群を形成する。これらのウイルスは植物ウイルスの約３分の１を占め、３０科を超える植物を感染させることができる（ＳＨＵＫＬＡ ｅｔ ａｌ．， １９９４，Ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｏｔｙｖｉｒｉｄａｅ，ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ編，Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ， ＵＫ）。ポティウイルスの伝播は、非永続的にアブラムシ（例えばＭｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ）によって行なわれる。この感染は、葉の着色異常（モザイク、葉脈の黄変）、葉の変形、植物全体の壊死、ひいては罹患した植物のサイズの大幅な低減及び生産能力の喪失を導き得る葉脈の壊死を誘発する。花、種子及び果実自体も同様に数多くのポティウイルスに罹患し、その結果、繁殖力の低下、種子によるポティウイルスの伝搬並びに果実の変形、変色及び壊死がもたらされる。
【０００３】
ポティウイルスは、エンベロープのない長さ６８０〜９００ｎｍ、幅１１〜１５ｎｍの糸状構造を有する（ＬＡＮＧＥＮＢＥＲＧ及びＺＨＡＮＧ， Ｊ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． １１８（３）： ２４３−２４７， １９９７）（ＤＯＵＧＨＥＲＴＹ及びＣＡＲＲＩＮＧＴＯＮ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ． ２６： １２３−１４３， １９８８； ＲＩＥＣＨＭＡＮＮ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７３： １−１６， １９９２）。ウイルスゲノムはおよそ１０ｋｂの長さのセンス１本鎖ＲＮＡで構成されている。１本鎖ＲＮＡはその３’末端にポリＡ尾部を有し、５’で、Ｖｉｒａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｏｍｅ−ｌｉｎｋｅｄを略してＶＰｇと呼ばれるウイルスタンパク質に結合する（ＭＵＲＰＨＹ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌ． １７８： ２８５−２８８， １９９０； ＴＡＫＡＨＡＳＨＩ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｅｓ １４（３）： ２３５−２４３， １９９７）。ウイルスＲＮＡは、感染サイクルのさまざまな段階、すなわちポリプロテインの切断、ウイルスゲノムの複製、細胞間移動、長距離移動、アブラムシによる伝播及び「ＲＮＡサイレンシング」の阻害などに関与する１０種の機能タンパク質に成熟するポリプロテインをコードする。
【０００４】
ナス科、ウリ科、マメ科、アブラナ科及びキク科が特にポティウイルスに対し感受性をもつ。例えば、ナス科そしてより詳細にはトマト及びトウガラシ（又はピーマン）は、全く異なる複数のポティウイルスによる感染を受ける。そのうちジャガイモＹウイルス（Ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｙ − ＰＶＹ）は、栽培地域全体にわたり存在するが、一方その他のものは一大陸に限定されている（Ｔｏｂａｃｃｏ ｅｔｃｈ ｖｉｒｕｓ（ＴＥＶ）、Ｐｅｐｐｅｒ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓはアメリカ大陸、Ｐｅｐｐｅｒ ｖｅｉｎａｌ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ（ＰＶＭＶ）及びＰｏｔｙｖｉｒｕｓ Ｅはアフリカ、そしてＣｈｉｌｉ ｖｅｉｎａｌ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓはアジア）。しかしながら、いくつかのポティウイルスがその原産地域以外で同定されていることから、この区分はもはや絶対的なものではない。ＰＶＭＶはまず最初に１９７１年にガーナでトウガラシ類及びペチュニア上で単離された。以降、ＰＶＭＶは複数のアフリカ諸国で、主としてサハラ以南の地域であるが同様にチュニジア及びエチオピアでも同定された（ＢＲＵＮＴ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｌ． ６９： ２３５−２４３， １９７１； ＢＲＵＮＴ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｌ． ８８： １１５−１１９， １９７８； ＧＯＲＳＡＮＥ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｔｒ． １７： １４９−１５８， １９９９）。その天然の宿主は主として、トウガラシのみならずトマト、タバコ及びナスを含むナス科である。
【０００５】
現在のところ、真菌又は細菌による感染とは異なり、ウイルスに対する直接的な対抗手段は存在しない。用いられている戦略は、アブラムシといったようなウイルスの媒介動物を除去し、かつ／又は栽培地域内に最も多く存在するウイルスに対して抵抗性のある植物を選別し栽培することから成る。
【０００６】
種子市場の国際化により、育種家にとっては多抵抗性の亜種を作り出すことが増々不可欠になっている。より一般的には、ポティウイルスによる感染の経済的重大性そしてこのタイプの感染に対する直接的な対抗手段がないことを考慮すると、多抵抗性の植物亜種の探究が、植物改良の主軸の一つを構成する。
【０００７】
ＣＡＲＡＮＴＡ ｅｔ ａｌ．（Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ． ８６（７）： ７３９−７４３， １９９６）はトウガラシにおいて、或る特定の遺伝子座の組合せが抵抗性のスペクトルを拡大し、新しいポティウイルスに対する抵抗性を付与することができるということを示した。かくして、ＰＶＭＶに対する抵抗性を有する植物が、共にＰＶＭＶに対し感受性を有するＣａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ及びＦｌｏｒｉｄａ ＶＲ２の亜種間の交配に由来する倍化半数体の子孫において同定された。遺伝子解析により、（Ｆｌｏｒｉｄａ ＶＲ２に由来し、かつ病原型０及び１のＰＶＹ並びにＴＥＶに対する抵抗性を制御する）劣性遺伝子ｐｖｒ２と、Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ由来のｐｖｒ６と名付けられたもう一つの劣性因子との協働からＰＶＭＶに対する抵抗性が得られることが示された。
【０００８】
病原因子（ウイルス、細菌、菌類又は線虫）による攻撃に対して、植物は、感染から自己防御する又は感染に耐えるためのいくつかの戦略を有している。非宿主抵抗性（一つの種の全ての個体が一つの特定の病原体に対する抵抗性を有する場合）と宿主耐性（その種の少なくとも一つの個体が病原因子の一つの株に対し感受性を有する場合）が区別される。関与する遺伝子が優性であるか劣性であるかに応じて宿主抵抗性の二つの導入方法を区別することが可能である。
【０００９】
ＦＬＯＲ（Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ． ９： ２７５−２９６， １９７１）によって記載された「遺伝子対遺伝子モデル」では、植物の優性主働遺伝子が関与する。抵抗性は、病原因子におけるこの遺伝子及び対応する特異的非病原性遺伝子の存在に左右される。これら二つの遺伝子が同時に存在する場合、宿主植物の抵抗性が誘発され、往々にして、感染部位に局在した過敏反応（壊死）に関与する。
【００１０】
抵抗性は同様に劣性の植物遺伝子によっても制御可能である。特に、ポティウイルスに対する抵抗性の半分近くが劣性であると推定されており、一方その他の病原因子についてのこの割合は平均２０％にすぎない。ＦＲＡＳＥＲ（Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ ６３： １７５−１８５， １９９２）は、劣性の抵抗性が、植物内でのウイルスのサイクルの完成に必要な宿主の遺伝子産物の特異的な欠損又は改変の結果もたらされるという、「Ｆｒａｓｅｒの負のモデル」という名前で知られている仮説を提起した。
【００１１】
ポティウイルスのＶＰｇタンパク質は、ポティウイルス／宿主植物の相互作用、特に或る特定の宿主植物に対する或る特定のポティウイルス株の病原性において重要な役割を果たす。ＶＰｇタンパク質内に突然変異を有するポティウイルスは、ウイルス増殖の阻害、細胞間のポティウイルスの移動の阻害又は長距離でのそれらの移動の阻害といったさまざまな機序に関与する、抵抗性の劣性遺伝子を回避することができるということが示されている。このことは、ＴＶＭＶ／Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ（ｖａ遺伝子）、ＰＶＹ／トマト（ｐｏｔ−１遺伝子）、ＰＶＹ／トウガラシ類（ｐｖｒ２遺伝子）、ＬＭＶ／レタス（ｍｏ１遺伝子）及びＰＳｂＭＶ／エンドウ（ｓｂｍ１遺伝子）という対において示された（ＫＥＬＬＥＲ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ． １１： １２４−１３０ ２０， １９９８； ＭＯＵＲＹ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ． １７（３）： ３２２−３２９， ２００４； ＲＥＤＯＮＤＯ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ． １４： ８０４−８１０， ２００１； ＮＩＣＯＬＡＳ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌ． ２３７： ４５２−４５９ ３５， １９９７； ＭＡＳＵＴＡ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ． ８９： １１８−１２３， １９９９）。
【００１２】
ポティウイルスのＶＰｇタンパク質と相互作用することができる宿主植物の因子の中には、特に、ＲＮＡの真核生物翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）が存在し、そして特にｅＩＦ４Ｅ及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅと呼ばれるアイソフォームが存在する（ＷＩＴＴＭＡＮ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌ． ２３４： ８４−９２， １９９７； ＳＣＨＡＡＤ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌ． ２７３： ３００−３０６， ２０００； ＬＥＬＬＩＳ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． １２： １０４６−１０５１， ２００２； ＤＵＰＲＡＴ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ． ３２： ９２７−９３４， ２００２）。植物においては、ｅＩＦ４Ｅは、ＲＮＡのキャップ（ｍ７ＧｐｐｐＮ）と翻訳開始構造を結合させることを可能にするｅＩＦ４Ｆ複合体（ｅＩＦ４ＥとｅＩＦ４Ｇの化合物）を構成する（ＢＲＯＷＮＩＮＧ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３２（１−２）： １０７−１４３， １９９６）。植物細胞から二つのｅＩＦ４Ｆ複合体（ｅＩＦ４Ｆ及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｆと命名されたもの）が精製され、そのそれぞれのサブユニットは、ＲＮＡのキャップに結合するサブユニットについてはｅＩＦ４Ｅ（サブユニットｐ２６）及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ（サブユニットｐ２８）、もう一つのサブユニットについてはｅＩＦ４Ｇ及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｇと命名された。さまざまなタイプのＲＮＡの翻訳に関与すると思われるｅＩＦ４Ｅ及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅは植物における小さい多重遺伝子族に属しており、該多重遺伝子族はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａにおいては４つの遺伝子から成り、そのうちの三つがｅＩＦ４Ｅをコードし、一つがアイソフォームｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅをコードする（ＲＯＤＲＩＧＵＥＺ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ． １３（４）： ４６５−４７３， １９９８）。
【００１３】
タンパク質ｅＩＦ４Ｅ及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅは両方共、ＩＦ４Ｅと呼ばれる保存されたドメインを有する。このドメインは、ＰＦＡＭデータベース（ＢＡＴＥＭＡＮ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３０： ２７６−２８０， ２００２）上にＰＦＡＭ０１６５２という番号で載っている。しかしながら、同じサブファミリー（すなわち４Ｅ又は（ｉｓｏ）４Ｅ）に属し異なる種に由来するｅＩＦ４Ｅタンパク質は、同じ種に由来するｅＩＦ４Ｅタンパク質とｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質の間で見られるもの（４２〜５１％の同一性）を上回る同一率を示す（ｅＩＦ４Ｅタンパク質間では６１〜８６％の同一性、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質間では５９〜８２％の同一性）（ＲＵＦＦＥＬ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ｉｎ ｐｒｅｓｓ， ２００４）。
【特許文献１】国際公開第０３／０６６９００号パンフレット
【非特許文献１】ＣＡＲＡＮＴＡ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ． ８６（７）： ７３９−７４３， １９９６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
以下の記載では、それぞれサブファミリーｅＩＦ４Ｅ及びサブファミリーｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅを代表するタンパク質として、Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍのｅＩＦ４Ｅタンパク質及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質について述べる。
【００１５】
Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍのｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＹ１２２０５２）は、添付の配列表において配列番号１で示されており、推定されたポリペプチド配列は配列番号２で示されている。
【００１６】
Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、添付の配列表において配列番号３で示されており、推定されたポリペプチド配列は配列番号４で示されている。
【００１７】
ここでは、ＩＦ４Ｅドメインを含み、かつそのペプチド配列が少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、きわめて好ましくは少なくとも７０％の全体的な同一性をＣａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍのｅＩＦ４Ｅタンパク質（配列番号２）との間で有しているあらゆるタンパク質を、ｅＩＦ４Ｅタンパク質と定義する。
【００１８】
ＩＦ４Ｅドメインを含み、かつそのポリペプチド配列が少なくとも５９％、好ましくは少なくとも６５％、きわめて好ましくは少なくとも７０％の同一性をＣａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質（配列番号４）との間で有しているあらゆるタンパク質を、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質と定義する。
【００１９】
ここで述べた同一率とは、配列番号２又は配列番号４の参照配列の全てを含む配列のアラインメントにＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）のＰＩＬＥＵＰプログラムを利用することにより決定された全体的な同一率である。
【００２０】
ｅＩＦ４Ｅ又はｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅを改変する突然変異は、或る特定のポティウイルス種に対する劣性の抵抗性を誘発するということが報告されてきている。例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａにおけるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅアイソフォームをコードする遺伝子の分断は、Ｔｕｒｎｉｐ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ（ＴｕＭＶ）、ＴＥＶ及びＬｅｔｔｕｃｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ（ＬＭＶ）に対する抵抗性を誘発するものの、Ｔｏｍａｔｏ ｂｌａｃｋ ｒｉｎｇ ｖｉｒｕｓ（ＴＢＲＶ、Ｎｅｐｏｖｉｒｕｓ属）又はＣｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ、Ｃｕｃｕｍｏｖｉｒｕｓ属）に対する抵抗性には効果が無いということが示された（ＤＵＰＲＡＴ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ． ３２： ９２７−９３４， ２００２； ＬＥＬＬＩＳ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． １２： １０４６−１０５１， ２００２）。ＮＩＣＡＩＳＥ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １３２： １２７２−１２８２， ２００３）は、レタスモザイクウイルス（ＬＭＶ）に対する抵抗性をもつ植物はｅＩＦ４Ｅ遺伝子内に点突然変異を有し、その反面、抵抗性レタス植物におけるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の配列は感受性のある植物のものと異なっていないということを示した。
【００２１】
ＲＵＦＦＥＬ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｊ． ３２： １０６７−１０７５， ２００２）ならびに国際公開第０３／０６６９００号パンフレットは、劣性遺伝子ｐｖｒ２により付与されたＴＥＶ及びＰＶＹに対する劣性の抵抗性が、ｅＩＦ４Ｅ内、特にこのタンパク質の、さまざまな植物種に由来するｅＩＦ４Ｅタンパク質間できわめて高度に保存された領域内での配列の変異と関係するということを示している。
【００２２】
本発明者は今や、トウガラシにおけるｐｖｒ６遺伝子座とｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子との同時分離を実証した。本発明者は、ＰＶＭＶに対する抵抗性を示す植物が、国際公開第０３／０６６９００号パンフレットに記載されたような翻訳因子ｅＩＦ４Ｅをコードする突然変異した対立遺伝子（抵抗性対立遺伝子ｐｖｒ２）に加えて、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅをコードする配列内の突然変異を有するということを確認した。
【００２３】
この突然変異は、野生型タンパク質の２０２個のアミノ酸の５１番目のアミノ酸に終止コドンが組み込まれ、コード配列において８２ｂｐが欠失することから成る。野生型ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質と突然変異タンパク質の間では最初の２９のアミノ酸のみが保存され、そのことは、突然変異タンパク質がもはや機能的でないことを表わしている。
【００２４】
従って、単独ではＰＶＭＶ抵抗性を付与しないものの劣性因子ｐｖｒ２と協働した場合にはこの抵抗性を付与することができるものとして先に記載した劣性因子ｐｖｒ６（ＣＡＲＡＮＴＡ ｅｔ ａｌ．， １９９６，前掲書）は、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子に対応する。これまでに同定されたｅＩＦ４Ｅ又はｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの突然変異体の場合、これら二つの遺伝子の一方のみの突然変異で一つ又は複数の特定のポティウイルスに対する劣性の抵抗性を充分に付与できることから、ｐｖｒ６とｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの間のこの対応は予想外のことである。
【００２５】
従って、ＰＶＭＶを第一の例とする一部のポティウイルスは、それらの感染サイクルを完成させるためのｅＩＦ４Ｅ及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの利用に関して、これまでに見られたものとは異なる形の挙動を示すと思われる。これまで研究されたポティウイルスが、宿主植物内でｅＩＦ４Ｅ或いはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの一方を利用していたのに対し、ＰＶＭＶはｅＩＦ４Ｅ及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの両方を利用することができると思われる。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明は、ＰＶＭＶに対する抵抗性を有する植物の選別方法において、試験対象の植物において、前記植物内に存在するｅＩＦ４Ｅ及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質の形態を調査する段階、並びに
ａ） ＤＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＫＳＸ5ＱＸ6ＡＷＧＳＳＸ7ＲＸ8Ｘ9ＹＴＦＳＸ10ＶＥＸ11ＦＷＸ12Ｘ13ＹＮＮＩＨＸ14ＰＳＫＬＸ15Ｘ16ＧＡＤ（式中、
− Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ15及びＸ16は各々中性アミノ酸を表わし、
− Ｘ5及びＸ14は塩基性アミノ酸を表わし、
− Ｘ11は酸性アミノ酸を表わし、
− Ｄ、Ｋ、Ｓ、Ｑ、Ａ、Ｗ、Ｇ、Ｒ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｖ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｐ及びＬは一文字コードでのその通常の意味を有する）
という一般配列（Ｉ）により定義される領域を含むｅＩＦ４Ｅタンパク質（以下「野生型ｅＩＦ４Ｅタンパク質」と呼ぶ）を全く発現せず、
かつ、前記配列（Ｉ）の少なくとも一つの中性アミノ酸を荷電アミノ酸好ましくは塩基性アミノ酸により置換し、かつ／又は前記配列（Ｉ）の少なくとも一つの荷電アミノ酸を中性アミノ酸又は逆の電荷をもつアミノ酸により置換することにより上述の配列（Ｉ）が定義する領域から誘導された領域を含む、突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質を発現し、かつ
ｂ） 機能性ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を全く発現しない、
植物を選別する段階、
を含んで成ることを特徴とする方法に関する。
【００２７】
ここで、「中性アミノ酸」として定義されるのは、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、グルタミン、アスパラギンの中から選択されるあらゆるアミノ酸である。「荷電アミノ酸」として定義されるのは、ヒスチジン、リジン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸の中から選択されるあらゆるアミノ酸である。これらの荷電アミノ酸の中で、ヒスチジン、リジン又はアルギニンは塩基性アミノ酸であり、グルタミン酸及びアスパラギン酸は酸性アミノ酸である。
【００２８】
ここで「機能性ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質」として定義されるのは、ｅＩＦ（ｉｓｏ４Ｇ）と複合体を形成しＲＮＡのキャップに結合することができるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質である。機能性ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を全く発現しない植物は、いかなるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質も発現できないか、或いは非機能性ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質のみを発現できるかである。
【００２９】
ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質の発現の欠如は、例えば、このタンパク質をコードする配列の欠失、又はｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の転写及び／もしくは翻訳の欠如によって生じ得る。ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質の非機能性は例えば、このタンパク質をコードする配列中の突然変異などによって生じる。
【００３０】
この非機能性ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質に関しては、野生型ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質における、真核生物のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質間に保存されているＩＦ４Ｅドメインの８つのトリプトファン残基のうちの一つ又は複数を含む部分を、前記非機能性ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質内に有していない植物が、優先的に選別される。これらのトリプトファン残基は、配列番号４の配列の３４位、３７位、５０位、６７位、９６位、１０７位、１２１位及び１５６位にあるものに対応している。これらは、配列のアラインメントに基づき、その他のあらゆるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質内で当業者により容易に位置特定され得る。
【００３１】
有利には、欠失部分は、配列番号４の配列の３１〜３６位、４７〜５２位、６４〜６９位、９３〜９８位、１１８〜１２３位及び１５３〜１５８位に対応するＩＦ４Ｅドメインの領域のうちの一つ又は複数を含む。
【００３２】
特に有利には、欠失部分は、配列番号４の参照配列の３０〜２０２位に対応するＩＦ４Ｅドメインの残基を含んでいる。
【００３３】
ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質におけるこの欠失は、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のコード部分における欠失により生じ得る。これは同様にｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ内の点突然変異、又は早まった終止コドン及び／もしくはリーディングフレームのずれを導く外因性配列の挿入によっても生じ得る。関係する突然変異のタイプ及びこの突然変異の位置に応じて、その生じた非機能性ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質は、欠失部分の代りに非関連配列を含み得る。
【００３４】
ｅＩＦ４Ｅタンパク質に関しては、
− 荷電アミノ酸による、前記配列（Ｉ）のアミノ酸Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3又はＸ4のうちの少なくとも一つの置換、及び
− 荷電アミノ酸による、前記配列（Ｉ）のその他の中性アミノ酸のうちの少なくとも一つの置換、及び／又は
− 中性アミノ酸もしくは逆の電荷をもつアミノ酸による、前記配列（Ｉ）の荷電アミノ酸のうちの少なくとも一つの置換
により上述の配列（Ｉ）が定義する領域から誘導された領域を含む突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質を有する植物が優先的に選別される。
【００３５】
特に好ましくは、
− 塩基性アミノ酸による、配列（Ｉ）の中性アミノ酸Ｘ3の置換、
− 塩基性アミノ酸による、配列（Ｉ）の中性アミノ酸Ｘ7の置換、
− 中性アミノ酸による、配列（Ｉ）のＣ末端の位置にあるアスパラギン酸残基の置換
により上述の配列（Ｉ）が定義する領域から誘導された領域を含む突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質を含有する植物が選別される。
【００３６】
試験対象の植物に存在するｅＩＦ４Ｅタンパク質及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質の形態の検出は、例えばｅＩＦ４Ｅタンパク質又はｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質の野生型の形態又は突然変異型の形態に対して特異的な抗体などを用いて実施可能である。
【００３７】
しかしながら、一般に、試験対象の植物に存在するｅＩＦ４Ｅ及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の対立遺伝子の形態を調べることによりこの検出を行うのがより便利である。
【００３８】
本発明は、ＰＶＭＶに対する抵抗性を有する植物の選別方法において、試験対象の植物において、前記植物内に存在するか又はそこで発現したｅＩＦ４Ｅ及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の対立遺伝子の形態を調べる段階、及び、上述した野生型ｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードするｅＩＦ４Ｅ遺伝子のいかなる対立遺伝子ももたず又は発現もせず、しかも上述した突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードするｅＩＦ４Ｅ遺伝子の対立遺伝子を発現し、その上、上述した機能性ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードするｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のいかなる対立遺伝子ももたず又は発現もせず、かつ場合によっては上述した非機能性ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードするｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の対立遺伝子を発現する植物を選別する段階を含んで成ることを特徴とする方法に関する。
【００３９】
試験対象の植物において存在するｅＩＦ４Ｅ及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の対立遺伝子の形態の検出は、それ自体当業者にとって既知である従来の方法により実施することができる。例えば、ｅＩＦ４ＥもしくはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの野生型対立遺伝子もしくは突然変異対立遺伝子と選択的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドプローブ、又はｅＩＦ４ＥもしくはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅもしくはこれらの遺伝子の目的の突然変異を有する部分の増幅を可能にする増幅プライマーを利用することができる。その後、増幅産物においてこの突然変異の有無を、例えば該増幅産物の配列決定によって、又は、目的の突然変異の性質に応じて、増幅産物のサイズの決定、もしくは野生型対立遺伝子内あるいは突然変異対立遺伝子内にのみ存在する標的配列を認識する制限酵素での消化によって、検出することができる。
【００４０】
本発明は同様に、ＰＶＭＶに対する抵抗性を有する植物を取得する方法をも目的としている。
【００４１】
本発明に従った方法の第一の変形形態に従うと、これには、
− 前記植物に存在するｅＩＦ４Ｅ遺伝子の対立遺伝子を、上述した突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする対立遺伝子に置き換える段階、及び
− 前記植物に存在するｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の対立遺伝子を、上述した非機能性突然変異ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする対立遺伝子に置き換える段階、又は前記ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子を直接もしくはエピジェネティックに不活性化させる段階
が含まれる。
【００４２】
本発明に従った方法の第二の変形形態に従うと、該方法は、そのｅＩＦ４Ｅ遺伝子の全ての対立遺伝子が上述した突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする植物から実施され、前記植物に存在するｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の対立遺伝子を、上述した非機能性突然変異ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする対立遺伝子に置き換える段階、又は前記ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子を直接もしくはエピジェネティックに不活性化させる段階を含んで成る。
【００４３】
本発明に従った方法の第三の変形形態に従うと、該方法は、そのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の全ての対立遺伝子が上述した突然変異ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする植物から、又は前記ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子が不活性化されている植物から実施され、前記植物に存在するｅＩＦ４Ｅ遺伝子の対立遺伝子を上述した突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする対立遺伝子に置き換える段階を含んで成る。
【００４４】
ｅＩＦ４Ｅ遺伝子又はｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の「対立遺伝子の置き換え」というのは、ここでは、その修飾を実施するために用いる方法の如何に関わらず、所望の突然変異配列による、関連する遺伝子の最初のコード配列の置換を生じさせる、あらゆる遺伝子修飾を意味する。
【００４５】
ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の「不活性化」というのは、ここでは、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質の発現の欠如をもたらすあらゆる遺伝子修飾を意味する。この不活性化は、それがｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の修飾（例えばコード配列のレベル又は前記遺伝子のプロモーター配列のレベルのもの）により生じる場合に「直接的不活性化」と定義され、それがｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の修飾によらない場合「エピジェネティック不活性化」と定義される。「サイレンシング」とも呼ばれるエピジェネティック不活性化は、特に転写の遮断（転写サイレンシングもしくは「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ」を略してＴＧＳ）又はｍＲＮＡの特異的分解（転写後サイレンシングもしくは「Ｐｏｓｔ−Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ」を略してＰＴＧＳ）により生じ得る。
【００４６】
所望の突然変異対立遺伝子によるｅＩＦ４Ｅ又はｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の対立遺伝子の置き換えは、相同組換えといった遺伝子組換えを利用した、又はＴＩＬＬＩＮＧ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ ＩＮ Ｇｅｎｏｍｅｓ； ＭａＣＡＬＬＵＭ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １２３： ４３９−４４２， ２０００）もしくはｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の場合の挿入による突然変異誘発といった突然変異誘発を利用した、それ自体既知の技術により実施することができる。
【００４７】
ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の直接的不活性化も同様に、同じ技術により実施することができる。
【００４８】
ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のサイレンシングは、センス方向又はアンチセンス方向の抑制によって、又はＲＮＡｉ（ＮＩＳＨＩＫＵＲＡ， Ｃｅｌｌ １０７： ４１５−４１８， ２００１； ＴＥＮＬＬＡＤＯ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ． １０２： ８５−９６， ２００４； ＺＡＭＯＲＥ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２５２： ５３３−５４３， ２００４）の利用によって実施可能である。
【００４９】
本発明は同様に、本発明に従った方法により得られる可能性のあるＰＶＭＶ抵抗性の植物をも目的としている。
【００５０】
これには特に次のものが含まれる。
− ＣＡＲＡＮＴＡ ｅｔ ａｌ．（１９９６、前掲書）の刊行物の中で記載されている二重変異体ｐｖｒ２ ｐｖｒ６以外の、存在するｅＩＦ４Ｅ遺伝子の対立遺伝子が上述した突然変異対立遺伝子であり、存在するｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の対立遺伝子が上述した非機能性の突然変異対立遺伝子である植物、
− 存在するｅＩＦ４Ｅ遺伝子の対立遺伝子が上述した突然変異対立遺伝子であり、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の対立遺伝子が直接不活性化されている植物、
− 存在するｅＩＦ４Ｅ遺伝子の対立遺伝子が上述した突然変異対立遺伝子であり、ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現をなくすことができる一つの配列（センス鎖、アンチセンス鎖、又はＲＮＡｉで転写可能なもの）により形質転換されている植物。
【００５１】
本発明に従ったＰＶＭＶ抵抗性植物の選別又は取得方法は、ＰＶＭＶから防御することが望まれているあらゆる植物、より詳細には、トウガラシ、トマト又はナスといったようなナス科、メロンといったウリ科、アブラナ科、エンドウといったマメ科及びキク科の植物に適用可能である。
【００５２】
さらにこれらの方法は同様に、ＰＶＭＶと同様にその感染サイクルを完成するために区別なくｅＩＦ４Ｅ又はｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅを利用することのできるその他のポティウイルス、例として挙げるとポティウイルスＢＣＭＶ（Ｂｅａｎ ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）又はポティウイルスＡｚＭＶ（Ａｚｕｋｉｎｉ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）（ＦＩＳＨＥＲ及びＫＹＬＥ， Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． ９２： ２０４−２１２， １９９６）に対する植物の防御のためにも適用することができる。
【００５３】
本発明は、ＰＶＭＶに対する抵抗性におけるｅＩＦ４Ｅ及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの関与並びにＰＶＭＶ抵抗性植物の選別及び取得のための本発明に従った方法の実施を例示する実施例について述べた、以下の補足的な記載を読むことにより、さらによく理解されるものである。
【実施例１】
【００５４】
トウガラシにおけるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ（ｐｖｒ６+）のｃＤＮＡの取得
【００５５】
ポティウイルスに対する感受性を有するトウガラシのＹｏｌｏ Ｗｏｎｄｅｒ遺伝子型由来の全ＲＮＡを、ＴＲＩ−Ｒｅａｇｅｎｔ試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ）を用いて、１００〜２００ｍｇの葉から単離した。
【００５６】
トウガラシのｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのｃＤＮＡの３’末端を、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＥＭＢＬ登録番号：Ｙ１０５４７）、Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＦ５３０１６３）及びＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（ＴＩＧＲ：ＴＣ１２６３１６）のｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのｃＤＮＡ配列のアラインメントに基づいて設計されたプライマー５’−ＡＡＧＴＧＧＡＣＴＧＴＴＡＣＧＡＧＣＡＧＣＡＧ−３’（配列番号５）を用いて、３’ＲＡＣＥ ＰＣＲ技術（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ３’ＲＡＣＥシステムキット、バージョン２．０）により得た。
【００５７】
３’ＲＡＣＥ産物の配列（５’−ＡＴＴＧＣＴＧＧＡＡＣＴＴＧＧＧＧＡＧＧＧ−３’、配列番号６）から設計されたプライマー、及びトマトのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ配列の５’ＵＴＲ末端（ＴＩＧＲ登録番号ＴＣ１２６３１６）（５’−ＡＡＡＡＣＡＡＴＧＧＣＣＡＣＣＧＡＡＧＣＡ−３’、配列番号７）から設計されたプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲにより、トウガラシのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の全長ｃＤＮＡを増幅した。以下の条件下でＲＴ−ＰＣＲを実施する：９４℃で５分間、次に（９４℃で３０秒、５３℃で３０秒、７２℃で１分の）サイクルを３０回、そして７２℃で５分間。
【００５８】
ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙベクター系（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＵＳＡ）を、増幅後にｃＤＮＡをクローニングするために利用した。
【００５９】
Ｇｅｎｏｍｅ ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｒｅｎｏｂｌｅ， ＦＲＡＮＣＥ）により、二つの末端から、少なくとも３つの独立した陽性クローンを配列決定した。ヌクレオチド配列又はペプチド配列の分析のために、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＵＳＡ）のＰｉｌｅＵｐプログラムを利用した。
【００６０】
このようにして得られたトウガラシのｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのｃＤＮＡ配列は、６６０個のヌクレオチド長（配列番号３）を有しており、また２０２個のアミノ酸（配列番号４）をコードする６０９個のヌクレオチドの唯一のリーディングフレームを有している。
【００６１】
トウガラシのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの全ｃＤＮＡを含む比較ウインドウでＢＬＡＳＴソフトウェアを利用することにより決定される最大の配列同一率を、レタス（ＡＦ５３０１６３， Ｅ＝１・１０-59）、エンドウ（ＡＹ４２３３７７， Ｅ＝２・１０-24）、トウモロコシ（ＡＦ０７６９５５， Ｅ＝４・１０-10）、Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ（Ｙ１０５４７， Ｅ＝６・１０-9）及び小麦（Ｍ９５８１８， Ｅ＝９・１０-8）のｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのｃＤＮＡについて得た。
【００６２】
トウガラシのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの前述の全ペプチド配列を含む比較ウインドウでＢＬＡＳＴソフトウェアを利用することにより決定される最大の配列同一率を、レタス（ＡＡＰ８６６０３， Ｅ＝８・１０-77）及び小麦（ＡＡＡ３４２９６， Ｅ＝９１・１０-873）のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質について得、得られたＹｏｌｏ ＷｏｎｄｅｒのｃＤＮＡがｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのｃＤＮＡに非常に良く対応することを確認した。
【００６３】
トウガラシのｅＩＦ４Ｅ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＹ１２２０５２， ＲＵＦＦＥＬ ｅｔ ａｌ．， ２００２）及びトウガラシのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅのコード領域は、５７．２％の配列同一性を示す（又、対応するペプチド配列のレベルでは４８．３％の配列同一性）。
【実施例２】
【００６４】
トウガラシにおける遺伝子型ｐｖｒ６+及びｐｖｒ６の配列の比較：ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅにおける突然変異の実証
【００６５】
配列の変異を対立遺伝子ｐｖｒ６+又はｐｖｒ６と関連付けることができるか否かを決定するために、異なる５つのトウガラシ系統のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの全長ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列をアラインした。
− Ｙｏｌｏ Ｗｏｎｄｅｒ亜種（ＹＷ）はポティウイルスに対して感受性を有する。
− Ｙｏｌｏ Ｙ亜種（ＹＹ）は、抵抗性対立遺伝子ｐｖｒ２1（ＰＶＹ病原型０に対する抵抗性）を有し、ＰＶＭＶに対する感受性を示す。
− Ｆｌｏｒｉｄａ ＶＲ２亜種（Ｆ）は、抵抗性対立遺伝子ｐｖｒ２2（ＰＶＹ（０）及び（１）並びにＴＥＶに対する抵抗性）を有し、ＰＶＭＶに対する感受性を示す。
− Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ亜種（Ｐ）は、ＰＶＹ及びポティウイルスＥに対する部分的な抵抗性を有する対立遺伝子ｐｖｒ２3、及び対立遺伝子ｐｖｒ６を有し、ＰＶＭＶに対する感受性を示す。
− Ｆ１［Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ×Ｆｌｏｒｉｄａ ＶＲ２］由来の倍化半数体系統ＤＨ８０１は、対立遺伝子ｐｖｒ２2及びｐｖｒ６を有し、ＰＶＭＶに対する抵抗性を示す。
【００６６】
上述の５つのトウガラシ系統のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅのリーディングフレーム及び対応するアミノ酸配列のアラインメントの結果を、図１に示した。
【００６７】
図１の説明：
（Ａ）は、遺伝子型ｐｖｒ６+及びｐｖｒ６のヌクレオチド配列のアラインメント（コード部分）であり、
（Ｂ）は、遺伝子型ｐｖｒ６+及びｐｖｒ６の対応するアミノ酸配列のアラインメントである。
【００６８】
ヌクレオチドのアラインメントは、遺伝子型ＹＷ、ＹＹ及びＦの対立遺伝子ｐｖｒ６+のコード部分が互いに１００％同一であることを示している。ヌクレオチドのアラインメントは、遺伝子型Ｐ及びＤＨ８０１の対立遺伝子ｐｖｒ６のコード部分が同様に互いに１００％同一であるが、ヌクレオチド８９〜１７０の欠失と、２６８位におけるＡによるＧの置換、４８３位におけるＡによるＣの置換、そして５３７位におけるＴによるＣの置換とによって第一の群と異なっているということを示している（図１Ａ）。８２個のヌクレオチドの欠失は、リーディングフレームを変化させ、５１番アミノ酸の後に終止コドンを導入する。遺伝子型ｐｖｒ６+及びｐｖｒ６のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質の配列のアラインメントは、最初の２９のアミノ酸（該タンパク質がもつ２０２個のうち）のみが保存されているということを示している（図１Ｂ）。
【実施例３】
【００６９】
ホモ接合の状態で、ｐｖｒ２遺伝子座で突然変異した対立遺伝子（対立遺伝子ｐｖｒ２1又はｐｖｒ２2に対応するｅＩＦ４Ｅ配列）及び突然変異した対立遺伝子ｐｖｒ６（突然変異したｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ配列）を同時に有する植物の選別
【００７０】
ホモ接合の状態で対立遺伝子ｐｖｒ２1（国際公開第０３／０６６９００号パンフレットの配列番号８）又はｐｖｒ２2（国際公開第０３／０６６９００号パンフレットの配列番号２２）を有するトウガラシの植物から（これらの突然変異体の選別方法は国際公開第０３／０６６９００号パンフレット内に記載されている）、突然変異したｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅに対応する対立遺伝子ｐｖｒ６をさらに有し、かくしてＰＶＭＶ抵抗性を有する植物を、以下のとおりに選別する。
【００７１】
ＲＴ ＰＣＲによる選別
【００７２】
植物からのＲＮＡの抽出は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＵＳＡ）により市販されている製品ＴＲＩ−Ｒｅａｇｅｎｔを用いて、同社により提供されている手順に基づく標準的な抽出手順に従う。
【００７３】
ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写（ＲＴ）は以下のように実施する。７．５μｌのＨ2Ｏ、１μｌのオリゴＤＴプライマー（１００ｎｇ／μｌ）、２．５μｌのｄＮＴＰ（各４ｍＭ）及び２μｌのＲＮＡの混合物を、６５℃で５分間インキュベートし、その後２分間氷冷する。４μｌのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＲＴ緩衝液（５×）及び２μｌのＤＴＴ（０．１Ｍ）を添加し、次に混合物を４２℃で２分間インキュベートする。１μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，２００Ｕ／μｌ）を添加し、次に混合物を４２℃で５０分間インキュベートする。７０℃で１５分間、反応を不活性化させ、その後、生成したｃＤＮＡを４℃で保存する。
【００７４】
１７μｌのＨ2Ｏ、２．５μｌのＨｉｆｉ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ緩衝液（１０×）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１μｌのＭｇＳＯ4（５０ｍＭ）、１μｌのｄＮＴＰ（各４ｍＭ）、０．５μｌのセンスプライマー５’−ＡＴＧＧＣＣＡＣＣＧＡＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＧＧ−３’（配列番号８）（１０μｍ）、０．５μｌのアンチセンスプライマー５’−ＴＣＡＣＡＣＧＧＴＧＴＡＴＣＧＧＣＴＣＴＴＡＧＣＴ−３’（配列番号９）（１０μＭ）（これらのプライマーの位置は図１Ａに示した）、０．５μｌのＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｐｌａｔｉｎｉｕｍ Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び２μｌのＲＴ産物を混合して、ＰＣＲを実施する。以下の条件下でＰＣＲを実施する：９４℃で５分間、次に（９４℃で３０秒、６４℃で３０秒、７２℃で１分の）サイクルを３０回、そして７２℃で５分間。
【００７５】
ＰＣＲ産物の泳動を１×ＴＡＥ緩衝液を用い１％のアガロースゲル上で実施し、増幅した断片を臭化エチジウム（ＢＥＴ）での染色により明らかにする。
【００７６】
結果を図２に示した。
【００７７】
図２の説明：
レーン１は、栽培品種ＰｅｒｅｎｎｉａｌのＲＮＡで実施したＲＴ−ＰＣＲに対応し（対立遺伝子ｐｖｒ６）、２及び３は栽培品種Ｆｌｏｒｉｄａ ＶＲ２及びＹｏｌｏ Ｗｏｎｄｅｒ（対立遺伝子ｐｖｒ６+）に対応する。レーン５、６、７、８、１１、１２、１３、１４、１５、１９、２０、２２、２３及び２５は、ＰＶＭＶ抵抗性の子孫において実施したＲＴ−ＰＣＲに対応し、レーン４、９、１０、１６、１７、１８、２１及び２４はＰＶＭＶに対する感受性を有する子孫において実施したＲＴ−ＰＣＲに対応する。
【００７８】
結果は、突然変異したｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの対立遺伝子（ｐｖｒ６）を有する植物が５２７ｂｐの増幅産物（８２ｂｐの欠失に相当）を示し、一方野生型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの対立遺伝子（ｐｖｒ６+）を有する植物は６０９ｂｐの増幅産物を示すということを示している。
【００７９】
ＲＦＬＰによる選別
【００８０】
１） ＥｃｏＲＶによる消化及び制限断片の分離
【００８１】
ＦＵＬＴＯＮ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｔｒ． １３（３）： ２０７−２０９， １９９５）により記載されたマイクロ抽出の手順に従って、植物からＤＮＡを抽出する。
【００８２】
その後、これを一晩３７℃でＤＮＡ１μｇあたり２．５ＵのＥｃｏＲＶ酵素で消化する。消化産物を、ＢＥＴ１０μｌを含有するＮＥＢの１％アガロースゲル（１×）上に載せ、制限断片を分離する。ＮＥＢの１×緩衝液の中で２４時間２５Ｖで泳動を実施し、泳動の後、断片をナイロン膜上に移す。膜を１０〜１５分間２×ＳＳＣですすぎ、その後外気で乾燥させ、８０℃で２時間加熱する。
【００８３】
２） プローブの調製
【００８４】
実施例１で記載したように得たＹｏｌｏ Ｗｏｎｄｅｒ遺伝子型のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ（ｐｖｒ６+）のｃＤＮＡをプローブとして利用する。
【００８５】
32Ｐで標識したプローブの調製を、以下の条件下でＰＣＲにより実施する。
【００８６】
【表１】
【００８７】
１００ｍＭの母液から１０ｍＭへの、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰの希釈：
− １００ｍＭのｄＮＴＰ ５μｌ、
− Ｈ2Ｏ ４５μｌ。
【００８８】
１００ｍＭの母液から１ｍＭへのｄＣＴＰの希釈：
− １００ｍＭのｄＣＴＰ ０．５μｌ、
− Ｈ2Ｏ ４９．５μｌ。
ＡＴＧ＋ｄＣＴＰのミックス：
− １０ｍＭのｄＡＴＰ ２．５μｌ 最終濃度：５０μＭ、
− １０ｍＭのｄＴＴＰ ２．５μｌ 最終濃度：５０μＭ、
− １０ｍＭのｄＧＴＰ ２．５μｌ 最終濃度：５０μＭ、
− １ｍＭのｄＣＴＰ ２．５μｌ 最終濃度：５μＭ、
− Ｈ2Ｏ ４９０μｌ。
【００８９】
プローブの標識は、９４℃で３０秒、５２℃で４５秒、７２℃で１分半というＰＣＲサイクルを３０回繰り返して行う。
【００９０】
標識したらプローブを変性させ、その後、１）で記載したように得た膜とハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションは、以下の緩衝液中で少なくとも１６時間６５℃で実施する：５００ｍＬに対して、ＮａＣｌを２１．９１ｇ、クエン酸ナトリウムを１８．３８ｇ、Ｈ2Ｏを３８０ｍＬ、２０％ＳＤＳを１５ｍＬ、ｐＨ７．５の１ＭのＮａＰＯ4を２５ｍＬ、１００×Ｄｅｎｈａｒｄｔを２５ｍＬ、０．２５ＭのＥＤＴＡを５ｍＬ、５０％の硫酸デキストラン５０ｍＬ）。
【００９１】
その後、６５℃で予熱した、４０ｍＭのＮａＰｉの１％ＳＤＳ緩衝液（Ｓｅｒｖａ）中で膜を洗浄する。
【００９２】
洗浄条件は以下のとおりである：
− 攪拌下で６５℃、２０分間の洗浄を１回、
− ６５℃で加熱した新しい緩衝液中で２〜３分間のすすぎを１回。
【００９３】
ＲＦＬＰの結果を図３に示した。
【００９４】
図３の説明：
この図は、対立遺伝子ｐｖｒ６を有するＰｅｒｅｎｎｉａｌ（ラインＰ）、対立遺伝子ｐｖｒ６+を有するＦｌｏｒｉｄａ ＶＲ２（ラインＦ）、Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ×Ｆｌｏｒｉｄａ ＶＲ２のハイブリッドＦ１（ラインＦ１）、及びＰＶＭＶ抵抗性（ラインＲ）の子孫又はＰＶＭＶ感受性の子孫（ラインＳ）の各遺伝子型間のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅマーカーについて観察されたＲＦＬＰの特徴の違いを示す。
【００９５】
結果は、対立遺伝子ｐｖｒ６+を有する感受性植物が制限断片Ｈを有するのに対し、（対立遺伝子ｐｖｒ２2に加えて）対立遺伝子ｐｖｒ６を有する抵抗性植物が制限断片Ｂを有するということを示している。
【実施例４】
【００９６】
ＰＶＭＶ抵抗性試験及びＰＶＭＶに対する抵抗性をもつトウガラシの一つの遺伝子型におけるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ（ｐｖｒ６+）又はｅＩＦ４Ｅ（ｐｖｒ２+）の一過性発現
【００９７】
ＰＶＭＶに対するトウガラシの抵抗性試験
【００９８】
この試験は、抵抗性対立遺伝子ｐｖｒ２1（又はｐｖｒ２2）及びｐｖｒ６を有する植物がＰＶＭＶに対する充分な抵抗性を有することを確認するために行う。
【００９９】
接種試験で利用するウイルス材料は、コートジボワール共和国で単離されＪ．Ｃ． ＴＨＯＵＶＥＮＥＬ（ＩＲＤ， Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ， Ｆｒａｎｃｅ）により提供されたＰＶＭＶ−ＩＣ分離株、及びＣＡＲＡＮＴＡ ｅｔ ａｌ．の刊行物（１９９６、前掲書）の中で記載された分離株に対応する。該分離株をＢＯＳの方法（ＢＯＳ， Ｍｅｄｅｄ． Ｆａｃ． Ｌａｎｄｂｏｕｗｗｅｔ Ｇｅｎｔ． ３４： ８７５−８８７， １９６９）に従って維持し、子葉又は双葉の段階にあるトウガラシ植物に機械的接種する前にＣａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ ｃｖ． Ｙｏｌｏ Ｗｏｎｄｅｒの植物上で増殖させる。
【０１００】
ウイルス接種材料はＣＡＲＡＮＴＡ ｅｔ ａｌ．（１９９６、前掲書）の中で記載されているように調製する。接種試験は、「防虫」した空調チャンバ内で、制御された条件で実施する。接種から４週間後に、全ての植物を、ＣＡＲＡＮＴＡ ｅｔ ａｌ．（１９９６、前掲書）により記載されているように、ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ試験により、抗原であるＰＶＭＶのキャプシドタンパク質の有無について個別に評価する。トウガラシ植物における機械的接種及びＰＶＭＶの検出については、当業者にとっては完全に既知のものであるその他の手順を利用することもできる。
【０１０１】
この抵抗性試験により、ＰＶＭＶ抵抗性と、ｅＩＦ４Ｅの突然変異型に対応する対立遺伝子ｐｖｒ２1（又はｐｖｒ２2）の存在及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの突然変異型に対応する対立遺伝子ｐｖｒ６の存在との間の、完全な同時分離を確認することが可能になる。
【０１０２】
ＰＶＭＶの感受性におけるｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質とｅＩＦ４Ｅタンパク質の独立した役割の検証のための、ＰＶＭＶ抵抗性を有するトウガラシの遺伝子型（ｐｖｒ２2＋ｐｖｒ６の組合せ）における、Ｙｏｌｏ ＷｏｎｄｅｒのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ又はｅＩＦ４ＥのｃＤＮＡの一過性発現
【０１０３】
ＰＶＭＶがその感染サイクルを完成させるために対立遺伝子ｐｖｒ２+（野生型ｅＩＦ４Ｅ対立遺伝子に対応）又は対立遺伝子ｐｖｒ６+（野生型ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ対立遺伝子に対応）を独立した形で利用することができるという仮説を検証する目的で、対立遺伝子ｐｖｒ２2及びｐｖｒ６を有する抵抗性遺伝子型ＤＨ８０１について、ＰＶＸ（ジャガイモウイルスＸ）ウイルスベクターを介した、Ｙｏｌｏ ＷｏｎｄｅｒのｅＩＦ４Ｅ又はｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのｃＤＮＡの一過性発現の実験（ＣＨＡＰＭＡＮ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２（４）： ５４９−５５７， １９９２； ＢＡＵＬＣＯＭＢＥ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ． ７： １０４５−１０５３， １９９５）を実施した。
【０１０４】
遺伝子型Ｙｏｌｏ Ｗｏｎｄｅｒ（ｐｖｒ２+）及びＦｌｏｒｉｄａ ＶＲ２（ｐｖｒ２2）のｅＩＦ４ＥのＯＲＦを、それぞれベクターｐＰＶＸｅＹＷ及びｐＰＶＸｅＦを得るために、クローニング部位ＣｌａＩ及びＳａｌＩで、発現ベクターｐＰＶＸ２０１内で（ＢＡＵＬＣＯＭＢＥ ｅｔ ａｌ．， １９９５、前掲書）クローニングした。同様にして、それぞれ発現ベクターｐＰＶＸ（ｉｓｏ）ｅＹＷ及びｐＰＶＸ（ｉｓｏ）ｅＰを得るために、ｐＰＶＸ２０１内で遺伝子型Ｙｏｌｏ Ｗｏｎｄｅｒ（ｐｖｒ６+）及びＰｅｒｅｎｎｉａｌ（ｐｖｒ６）のｅＩＦ（ｉｓｏ）４ＥのＯＲＦをクローニングした。これらのプラスミドをＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａに機械的に接種する。接種から１０日後に、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの接種された葉を、トウガラシの遺伝子型Ｙｏｌｏ Ｗｏｎｄｅｒ及びＤＨ８０１における一過性発現の試験のための接種材料として利用する。発現ベクターＰＶＸをトウガラシに接種してから１０日後に、同じ葉に上述のようにＰＶＭＶ−ＩＣを接種する。
【０１０５】
ベクターＰＶＸとＰＶＭＶの蓄積を、ＰＶＭＶの接種から１０日後に、接種済みの葉について、ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ及びＲＴ−ＰＣＲによって評価する。ＰＶＸの蓄積の検出を可能にするＲＴ−ＰＣＲ（当業者にとって既知の従来の条件）を、以下のプライマーを用いて実施する：センス５’−ＣＣＧＡＴＣＴＣＡＡＧＣＣＡＣＴＣＴＣＣＧ−３’（配列番号１０）及びアンチセンス５’−ＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＴＧＧＣＡＧＧＡＧＴＴＧ−３’（配列番号１１）。ＰＶＭＶの蓄積の検出を可能にするＲＴ−ＰＣＲ（当業者にとって既知の従来の条件）を、次の変性プライマーを用いて実施する：センス（Ｎｉｂ遺伝子内で確定されているもの）５’−ＧＧＮＡＡＲＧＣＮＣＣＮＴＡＹＡＴ−３’（配列番号１２）及びアンチセンス（ＣＰ遺伝子内で確定されているもの）５’−ＣＧＣＧＣＴＡＡＴＧＡＣＡＴＡＴＣＧＧＴ−３’（配列番号１３）。
【０１０６】
ＰＶＭＶに対する抵抗性を有する遺伝子型ＤＨ８０１に、組換えプラスミド（ｅＩＦ４Ｅ又はｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅを有する）及び分離株ＰＶＭＶ−ＩＣを同時接種する。突然変異型がＰＶＭＶに対する感受性を回復しないことを確認するために、ＤＨ８０１において（遺伝子型Ｆｌｏｒｉｄａ ＶＲ２の）対立遺伝子ｐｖｒ２2又は（遺伝子型Ｐｅｒｅｎｎｉａｌの）対立遺伝子ｐｖｒ６を発現させることにより、対照実験を並行して行う。
【０１０７】
結果を、一過性発現実験における、ＰＶＭＶを接種した葉の数に対するＰＶＭＶによる感染を受けた葉の数の比を示す下表にまとめた。
【０１０８】
【表２】
【０１０９】
これらの実験は、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子の発現及びそれとは独立してｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の発現（遺伝子は感受性遺伝子型Ｙｏｌｏ Ｗｏｎｄｅｒに由来）が両方共、抵抗性遺伝子型ＤＨ８０１内でのＰＶＭＶの増殖を可能にするということを示している。これらの実験から、我々は、ＰＶＭＶがその感染サイクルを実現するために野生型ｅＩＦ４Ｅタンパク質又は野生型ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を利用することができ、かつ二つのタンパク質における突然変異が、植物に抵抗性を付与するのに必要であるという結論を下すことができる。
【実施例５】
【０１１０】
ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅの不活性化によるＰＶＭＶ抵抗性植物の取得
【０１１１】
抵抗性対立遺伝子ｐｖｒ２1（又はｐｖｒ２2）を有する植物において、ＰＶＭＶ抵抗性を付与するｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の対立遺伝子（ｐｖｒ６）を、部位特異的突然変異誘発タイプの方法（ＨＯＨＮ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９６： ８３２１−８３２３， １９９９）、又は相同組換えの方法（ＫＥＭＰＬＩＮ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３８９： ８０２−８０３， １９９７； ＪＯＮＥＳ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｇｅｎ． Ｒｅｓ． １： ２８５−２９７， １９９２； ＢＥＶＡＮ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ． １２： ８７１１−８７２１， １９８４）により、ｉｎ ｐｌａｎｔａ形質転換することができる。
【０１１２】
ＰＶＭＶ抵抗性の抵抗性対立遺伝子ｐｖｒ２1（又はｐｖｒ２2）を有する植物は同様に、「遺伝子サイレンシング」（転写後遺伝子サイレンシングすなわちＰＴＧＳ）タイプの方法によって内因性ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子のノックアウトにより得ることもできる。ＰＴＧＳによる特異的ノックアウトは、内因性ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の５’又は３’ＵＴＲに対してそれを行うことによって実施することができる。５’又は３’ＵＴＲに対するＰＴＧＳによるノックアウトのこの特異性は、ＰＴＧＳの機序の理解に由来する新規なデータに基づくものである（ＮＩＳＨＩＫＵＲＡ， Ｃｅｌｌ １０７： ４１５−４１８， ２００１）。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】５つのトウガラシ系統のｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅのリーディングフレーム及び対応するアミノ酸配列のアラインメントの結果を示した図。
【図２】各品種のＲＴ−ＰＣＲの結果を示した図。
【図３】各品種のＲＦＬＰの分析結果を示した図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＶＭＶに対する抵抗性を有する植物の選別方法において、試験対象の植物において、前記植物内に存在するｅＩＦ４Ｅ及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質の形態を調査する段階、並びに
ａ） ＤＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＫＳＸ5ＱＸ6ＡＷＧＳＳＸ7ＲＸ8Ｘ9ＹＴＦＳＸ10ＶＥＸ11ＦＷＸ12Ｘ13ＹＮＮＩＨＸ14ＰＳＫＬＸ15Ｘ16ＧＡＤ（式中、
− Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ15及びＸ16は各々中性アミノ酸を表わし、
− Ｘ5及びＸ14は塩基性アミノ酸を表わし、
− Ｘ11は酸性アミノ酸を表わし、
− Ｄ、Ｋ、Ｓ、Ｑ、Ａ、Ｗ、Ｇ、Ｒ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｖ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｐ及びＬは一文字コードでのその通常の意味を有する）
という一般配列（Ｉ）により定義される領域を含むｅＩＦ４Ｅタンパク質（以下「野生型ｅＩＦ４Ｅタンパク質」と呼ぶ）を全く発現せず、
かつ、前記配列（Ｉ）の少なくとも一つの中性アミノ酸を荷電アミノ酸好ましくは塩基性アミノ酸により置換し、かつ／又は前記配列（Ｉ）の少なくとも一つの荷電アミノ酸を中性アミノ酸又は逆の電荷をもつアミノ酸により置換することにより上述の配列（Ｉ）が定義する領域から誘導された領域を含む、突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質を発現し、かつ
ｂ） 機能性ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を全く発現しない、
植物を選別する段階、
を含んで成ることを特徴とする方法。
【請求項２】
野生型ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質の配列の少なくとも一部分が欠失した非機能性ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を発現する植物を選別する段階を含んで成り、前記欠失が、配列番号４の配列の３４位、３７位、５０位、６７位、９６位、１０７位、１２１位及び１５６位に対応する、前記タンパク質のＩＦ４Ｅドメインのトリプトファン残基のうちの一つ又は複数を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
− 荷電アミノ酸による、前記配列（Ｉ）のアミノ酸Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3又はＸ4のうちの少なくとも一つの置換、及び
− 荷電アミノ酸による、前記配列（Ｉ）のその他の中性アミノ酸のうちの少なくとも一つの置換、及び／又は
− 中性アミノ酸もしくは逆の電荷をもつアミノ酸による、前記配列（Ｉ）の荷電アミノ酸のうちの少なくとも一つの置換、
により上述の配列（Ｉ）が定義する領域から誘導された領域を含む突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質を発現する植物を選別する段階を含んで成ることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
− 塩基性アミノ酸による、配列（Ｉ）の中性アミノ酸Ｘ3の置換、
− 塩基性アミノ酸による、配列（Ｉ）の中性アミノ酸Ｘ7の置換、
− 中性アミノ酸による、配列（Ｉ）のＣ末端の位置にあるアスパラギン酸残基の置換
により上述の配列（Ｉ）が定義する領域から誘導された領域を含む突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質を発現する植物を選別する段階を含んで成ることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＰＶＭＶに対する抵抗性を有する植物を取得する方法において、
− 前記植物に存在するｅＩＦ４Ｅ遺伝子の対立遺伝子を、請求項１、３又は４のいずれか一つに記載の突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする対立遺伝子に置き換える段階、及び
− 前記植物に存在するｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の対立遺伝子を、請求項１又は２に記載の突然変異ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする対立遺伝子に置き換える段階、又は前記ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子を直接もしくはエピジェネティックに不活性化させる段階
を含んで成ることを特徴とする方法。
【請求項６】
ＰＶＭＶに対する抵抗性を有する植物を取得する方法において、そのｅＩＦ４Ｅ遺伝子の全ての対立遺伝子が請求項１、３又は４のいずれか一つに記載の突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする植物から実施されること、及び前記植物に存在するｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の対立遺伝子を、請求項１又は２に記載の突然変異ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする対立遺伝子に置き換える段階、又は前記ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子を直接もしくはエピジェネティックに不活性化させる段階を含んで成ることを特徴とする方法。
【請求項７】
ＰＶＭＶに対する抵抗性を有する植物を取得する方法において、そのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の全ての対立遺伝子が請求項１又は２に記載の突然変異ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする植物から、又は前記ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子が不活性化されている植物から実施されること、及び前記植物に存在するｅＩＦ４Ｅ遺伝子の対立遺伝子を、請求項１、３又は４のいずれか一つに記載の突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする対立遺伝子に置き換える段階を含んで成ることを特徴とする方法。
【請求項８】
ナス科、ウリ科、アブラナ科、マメ科及びキク科の中から選択された植物に対し実施されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１】
ＰＶＭＶに対する抵抗性を有する植物の選別方法において、試験対象の植物において、前記植物内に存在するｅＩＦ４Ｅ及びｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質の形態を調査する段階、並びに
ａ） ＤＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＫＳＸ5ＱＸ6ＡＷＧＳＳＸ7ＲＸ8Ｘ9ＹＴＦＳＸ10ＶＥＸ11ＦＷＸ12Ｘ13ＹＮＮＩＨＸ14ＰＳＫＬＸ15Ｘ16ＧＡＤ（式中、
− Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ15及びＸ16は各々中性アミノ酸を表わし、
− Ｘ5及びＸ14は塩基性アミノ酸を表わし、
− Ｘ11は酸性アミノ酸を表わし、
− Ｄ、Ｋ、Ｓ、Ｑ、Ａ、Ｗ、Ｇ、Ｒ、Ｙ、Ｔ、Ｆ、Ｖ、Ｅ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｐ及びＬは一文字コードでのその通常の意味を有する）
という一般配列（Ｉ）により定義される領域を含むｅＩＦ４Ｅタンパク質（以下「野生型ｅＩＦ４Ｅタンパク質」と呼ぶ）を全く発現せず、
かつ、前記配列（Ｉ）の少なくとも一つの中性アミノ酸を荷電アミノ酸好ましくは塩基性アミノ酸により置換し、かつ／又は前記配列（Ｉ）の少なくとも一つの荷電アミノ酸を中性アミノ酸又は逆の電荷をもつアミノ酸により置換することにより上述の配列（Ｉ）が定義する領域から誘導された領域を含む、突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質を発現し、かつ
ｂ） 機能性ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を全く発現しない、
植物を選別する段階、
を含んで成ることを特徴とする方法。
【請求項２】
野生型ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質の配列の少なくとも一部分が欠失した非機能性ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質を発現する植物を選別する段階を含んで成り、前記欠失が、配列番号４の配列の３４位、３７位、５０位、６７位、９６位、１０７位、１２１位及び１５６位に対応する、前記タンパク質のＩＦ４Ｅドメインのトリプトファン残基のうちの一つ又は複数を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
− 荷電アミノ酸による、前記配列（Ｉ）のアミノ酸Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3又はＸ4のうちの少なくとも一つの置換、及び
− 荷電アミノ酸による、前記配列（Ｉ）のその他の中性アミノ酸のうちの少なくとも一つの置換、及び／又は
− 中性アミノ酸もしくは逆の電荷をもつアミノ酸による、前記配列（Ｉ）の荷電アミノ酸のうちの少なくとも一つの置換、
により上述の配列（Ｉ）が定義する領域から誘導された領域を含む突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質を発現する植物を選別する段階を含んで成ることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
− 塩基性アミノ酸による、配列（Ｉ）の中性アミノ酸Ｘ3の置換、
− 塩基性アミノ酸による、配列（Ｉ）の中性アミノ酸Ｘ7の置換、
− 中性アミノ酸による、配列（Ｉ）のＣ末端の位置にあるアスパラギン酸残基の置換
により上述の配列（Ｉ）が定義する領域から誘導された領域を含む突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質を発現する植物を選別する段階を含んで成ることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＰＶＭＶに対する抵抗性を有する植物を取得する方法において、
− 前記植物に存在するｅＩＦ４Ｅ遺伝子の対立遺伝子を、請求項１、３又は４のいずれか一つに記載の突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする対立遺伝子に置き換える段階、及び
− 前記植物に存在するｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の対立遺伝子を、請求項１又は２に記載の突然変異ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする対立遺伝子に置き換える段階、又は前記ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子を直接もしくはエピジェネティックに不活性化させる段階
を含んで成ることを特徴とする方法。
【請求項６】
ＰＶＭＶに対する抵抗性を有する植物を取得する方法において、そのｅＩＦ４Ｅ遺伝子の全ての対立遺伝子が請求項１、３又は４のいずれか一つに記載の突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする植物から実施されること、及び前記植物に存在するｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の対立遺伝子を、請求項１又は２に記載の突然変異ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする対立遺伝子に置き換える段階、又は前記ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子を直接もしくはエピジェネティックに不活性化させる段階を含んで成ることを特徴とする方法。
【請求項７】
ＰＶＭＶに対する抵抗性を有する植物を取得する方法において、そのｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子の全ての対立遺伝子が請求項１又は２に記載の突然変異ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅタンパク質をコードする植物から、又は前記ｅＩＦ（ｉｓｏ）４Ｅ遺伝子が不活性化されている植物から実施されること、及び前記植物に存在するｅＩＦ４Ｅ遺伝子の対立遺伝子を、請求項１、３又は４のいずれか一つに記載の突然変異ｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする対立遺伝子に置き換える段階を含んで成ることを特徴とする方法。
【請求項８】
ナス科、ウリ科、アブラナ科、マメ科及びキク科の中から選択された植物に対し実施されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一つに記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００８−５０００３６（Ｐ２００８−５０００３６Ａ）
【公表日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１４０１４（Ｐ２００７−５１４０１４）
【出願日】平成１７年５月２５日（２００５．５．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００５／００１２９６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１８８５０
【国際公開日】平成１７年１２月１５日（２００５．１２．１５）
【出願人】（５０４３０１２５８）
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＯＰＬＡＮＴＥ−ＶＡＬＯＲ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月２５日（２００５．５．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００５／００１２９６
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１８８５０
【国際公開日】平成１７年１２月１５日（２００５．１２．１５）
【出願人】（５０４３０１２５８）
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＯＰＬＡＮＴＥ−ＶＡＬＯＲ
【Ｆターム（参考）】
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