Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓｄｅｇｒａｄａｎｓによる全植物材料の分解の間におけるカルボヒドラーゼの発現
本発明は、細胞壁分解系、特に、セルロース、ヘミセルロースおよび他の炭水化物に結合する、および／またはそれらを解重合する酵素を含有する系に関する。こうした系は多くの用途を有する。一実施形態では、本発明は、植物材料を分解する酵素混合物を作製する方法を提供する。好ましくは、この分解は植物材料の化学的前処理をせずに起こる。この方法は、所与の植物材料の存在下でＳａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓを増殖させ、次いでＳａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ中に発現する酵素の発現を測定することを含む。所与の植物材料の存在下で増加した発現を受ける酵素は、組み合わせることにより、所与の植物材料を分解する酵素混合物を形成する。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓの２−４０株（本明細書では「Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０」と呼称する）は、複合多糖類（ＣＰ）を分解する海洋細菌の新たに出現してきた一群を代表する。Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓは、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されており、受入番号ＡＴＣＣ４３９６１を保有している。Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０は、チェサピーク湾（Ｃｈｅｓａｐｅａｋｅ Ｂａｙ）流域中の枯死段階の塩性湿地コードグラス（ｃｏｒｄ ｇｒａｓｓ）Ｓｐａｒｔｉｎａ ａｌｔｅｒｎｉｆｌｏｒａから単離された海洋性γ−プロテオバクテリアである。枯死段階の植物からの単離と合致して、Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株は、高等植物の細胞壁の共通成分であるセルロース、ペクチン、キシランおよびキチンを含め、多くの複合多糖類を分解することができる。Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株は、寒天、アガロース、ラミナリンなどの藻類の細胞壁成分、ならびにタンパク質、澱粉、プルランおよびアルギン酸を解重合することもできる。この多数の高分子を分解する以外に、Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株は、該多糖類の各々を唯一の炭素源として利用することができる。したがって、Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株は、不溶性複合多糖類（ＩＣＰ）の微生物分解の優れたモデルであるばかりでなく、こうしたＩＣＰの完全代謝の典型として使用することもできる。ＩＣＰは、動植物における形態および構造のために使用される糖類重合体である。それらは、水に不溶であり、したがって分解し難い。
【０００２】
Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株は、増殖のために少なくとも１％の海水塩を必要としており、１０％もの高い塩濃度に耐えよう。それは、好気性で、一般に桿状であり、単極鞭毛によって運動性である、高度に多形性のグラム陰性細菌である。以前の研究によれば、２−４０は、寒天、キチン、アルギン酸、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、β−グルカン、ラミナリン、ペクチン、プルラン、澱粉およびキシランを含め、少なくとも１０種の異なる炭化水素高分子（ＣＰ）を分解できると判定された。それに加え、この細菌は真正チロシナーゼを合成することが示された。１６Ｓ ｒＤＮＡの分析によれば、２−４０は、プロテオバクテリア門のγサブクラスの一員であり、Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、およびフナクイムシの共生生物であるセルロース分解性窒素固定細菌Ｔｅｒｉｄｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．と関係のあることが示されている。
【０００３】
アガラーゼ、キチナーゼおよびアルギナーゼ各系の特性が、全般的に決定された。ザイモグラム活性ゲルによって、以上の３系は多数のデポリメラーゼからなることが示され、多面的な証拠から、これらのデポリメラーゼの少なくとも幾つかは細胞表面に付着していることが示唆される。活性アッセイによれば、Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ酵素活性の大半は、ＣＰでの対数増殖中に細胞分画と共にあるが、その後の増殖期では、活性の大部分が上清中に見出され、細胞付随活性は激減することが明らかになっている（Ｓｔｏｔｚ １９９４年）。ＣＰでの増殖は、細胞形態の劇的変化も伴う。Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓのグルコース増殖培養物は、細胞のサイズおよび形状が相対的に均一であり、細胞表面が概ね滑らかで特徴がない。しかし、アガロース、アルギン酸またはキチンで増殖させると、Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ細胞は、表面の新規な構造および特徴を示す。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
基質としてセルロースを使用する酵素系を特定し、適切なベクターを用いて該タンパク質をコードする遺伝子を発現させ、アミノ酸産物（酵素および非酵素産物）を同定して単離し、これらの産物を、ならびにこれらの遺伝子を含有する微生物を、エタノール製造などの目的のために使用する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、植物材料を分解する酵素混合物を創製する方法を提供する。好ましくは、この分解は植物材料の化学的前処理をせずに起こる。この方法は、所与の植物材料の存在下でＳａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓを増殖させ、次いでＳａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ中に発現する酵素の発現を測定することを含む。所与の植物材料の存在下で増加した発現を受ける酵素は、組み合わせることにより、所与の植物材料を分解する酵素混合物を形成する。
【０００６】
本発明は、所与の植物材料の存在下でＳａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ中で上方調節される酵素を、増加した発現速度で構成的に発現する、改変された細菌も提供する。この改変細菌は、非改変細菌より遥かに速い速度で所与の植物材料を分解することができる。
【０００７】
本発明は、該細菌を用いて１種または複数の植物材料を分解し、その分解過程から生じたより単純な糖類を用いて、１種または複数の植物材料を含む水性混合物中にエタノールを産生することにより、エタノールを産生する方法も提供する。エタノールは、当技術分野で公知の任意の方法により産生される。一実施形態では、エタノールは、この細菌の分解産物から酵母細胞によって産生される。該細菌は、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株でもよいし、または所与の植物材料の存在に応答して、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ中で上方調節される酵素を発現する改変細菌でもよい。本発明の特定の実施形態では、細菌および１種または複数の植物材料の水性混合物は、少なくとも１％の塩および／または多くとも１０％の塩を含む。本発明のこうした実施形態は、糖類をエタノールに変換するステップを省略することにより、糖を作るためにも使用される。
【０００８】
本発明は、酵素混合物を用いて所与の植物材料を分解し、その分解過程から生じたより単純な糖類を用いて、エタノールを産生することにより、エタノールを産生する方法も提供する。エタノールは、当技術分野で公知の任意の方法により産生される。一実施形態では、エタノールは、この細菌の分解産物から酵母細胞によって産生される。該酵素混合物は、所与の植物材料の存在に応答して、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株中で上方調節される酵素の２種以上である。該酵素類は、当技術分野で公知の任意の方法により、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株から回収される。本発明の特定の実施形態では、タンパク質および１種または複数の植物材料の水性混合物は、少なくとも１％の塩および／または多くとも１０％の塩を含む。他の特定の実施形態では、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株は、植物材料の第１の部分で約０．３〜約０．５のＯＤ６００になるまで増殖させる。他の特定の実施形態では、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株は、約５〜約１０のＯＤ６００になるまで増殖させる。他の特定の実施形態では、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株は、１０を超えるＯＤ６００になるまで増殖させる。本発明のこうした実施形態は、酵母を添加しないことにより、糖を作るためにも使用される。
【０００９】
所与の植物材料の分解に使用される酵素混合物に関するより特定の実施形態では、本発明は、Ｃｅｌ５ＨおよびＣｅｌ５Ｉを含んだ組成物を包含する。別の特定の実施形態では、本発明は、Ｃｅｌ５ＨおよびＣｅｌ５Ｆを含んだ組成物を包含する。
【００１０】
所与の植物材料の分解に使用される酵素混合物に関する代替的な実施形態では、本発明は、Ｃｅｌ５Ｆ、Ｃｅｌ５Ｈ、Ｃｅｌ５Ｉ、Ｃｅｐ９４ＡおよびＣｅｐ９４Ｂを含んだ組成物を包含する。より特定の実施形態では、本発明は、Ｃｅｌ６Ａ、Ｂｇｌ３ＣおよびＣｅｌ９Ｂを更に含んだ組成物を包含する。より特定の実施形態では、本発明は、Ｃｅｌ５Ａ、Ｃｅｌ５Ｂ、Ｃｅｌ５Ｃ、Ｃｅｌ５Ｄ、Ｃｅｌ５Ｅ、Ｃｅｌ５Ｇ、Ｃｅｌ５Ｊ、Ｃｅｌ９Ａ、Ｂｇｌ１Ａ、Ｂｇｌ１Ｂ、Ｃｅｄ３ＡおよびＣｅｄ３Ｂを更に含んだ組成物を包含する。追加の実施形態では、本発明の組成物は酵母を更に含む。
【００１１】
所与の植物材料の分解に使用される酵素混合物に関する代替的な実施形態では、本発明は、Ｃｅｌ５Ｅ、Ｃｅｌ５Ｉ、Ｃｅｌ９Ａ、Ｂｇｌ１ＡおよびＣｅｄ３Ｂを含んだ組成物を包含する。より特定の実施形態では、本発明は、Ｃｅｌ５Ｂ、Ｃｅｐ９４ＡおよびＣｅｐ９４Ｂを更に含んだ組成物を包含する。追加の実施形態では、本発明の組成物は酵母を更に含む。
【００１２】
所与の植物材料の分解に使用される酵素混合物に関する代替的な実施形態では、本発明は、Ｃｅｌ５Ｆ、Ｃｅｌ９Ａ、Ｂｇｌ１ＡおよびＣｅｄ３Ｂを含んだ組成物を包含する。より特定の実施形態では、本発明は、Ｃｅｌ５Ｂ、Ｃｅｌ５Ｅ、Ｃｅｌ５Ｉ、Ｂｇｌ１Ｂ、Ｂｇｌ３Ｃ、Ｃｅｐ９４ＡおよびＣｅｐ９４Ｂを更に含んだ組成物を包含する。追加の実施形態では、本発明の組成物は酵母を更に含む。
【００１３】
所与の植物材料の分解に使用される酵素混合物に関する代替的な実施形態では、本発明は、Ｃｅｌ５Ｉ、Ｂｇｌ１Ａ、Ｂｇｌ１Ｂ、Ｃｅｄ３ＢおよびＣｅｐ９４Ｂを含んだ組成物を包含する。より特定の実施形態では、本発明は、Ｃｅｌ５Ａ、Ｃｅｌ５Ｇ、Ｃｅｌ９Ａ、Ｂｇｌ３ＣおよびＣｅｐ９４Ａを更に含んだ組成物を包含する。追加の実施形態では、本発明の組成物は酵母を更に含む。
【００１４】
所与の植物材料の分解に使用される酵素混合物に関する代替的な実施形態では、本発明は、Ｃｅｌ５Ｅ、Ｃｅｌ５Ｆ、Ｃｅｌ５Ｈ、Ｃｅｌ６ＡおよびＣｅｌ９Ｂを含んだ組成物を包含する。より特定の実施形態では、本発明は、Ｃｅｌ５Ｉ、Ｂｇｌ３ＣおよびＣｅｐ９４Ａを更に含んだ組成物を包含する。他の特定の実施形態では、本発明は、Ｃｅｌ５Ｃ、Ｃｅｌ５ＤおよびＣｅｄ３Ａを更に含んだ組成物を包含する。追加の実施形態では、本発明の組成物は酵母を更に含む。
【００１５】
所与の植物材料の分解に使用される酵素混合物に関する代替的な実施形態では、本発明は、Ｘｙｎ１０ａ、Ｘｙｎ１０ｂおよびＸｙｎ１１ａを含んだ組成物を包含する。より特定の実施形態では、本発明は、Ｘｙｎ１０ＤおよびＸｙｎ１１Ｂを更に含んだ組成物を包含する。追加の実施形態では、本発明の組成物は酵母を更に含む。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】異なる基質でのＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓの増殖速度を示す棒グラフである。
【図２】０．１％の大麦β−グルカン、ＨＥセルロースのいずれかで増殖させた、Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓからのタンパク質のコンゴーレッド染色ＳＤＳゲルを示す図である。
【図３】グルコース、コーン、アビセル（Ａｖｉｃｅｌ）および新聞用紙の存在下で培養した、Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓにおけるセルロース分解酵素の相対的な発現を示す棒グラフである。グラフの目盛から外れた棒は、その上の数字で示されている。
【図４】セルロースで増殖させたときのＳａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株における、ｃｅｌ５Ａ、ｃｅｌ５Ｈおよびｃｅｌ５Ｉの経時的な誘導倍率を示す線グラフである。
【図５】セロデキストリン、セロビオース、セロトラオースおよびアビセルの存在下で増殖させたときのＳａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株における、ｃｅｌ５Ｈの相対発現レベルを示す線グラフである。
【図６】キシラン存在下で培養したＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓにおける、ヘミセルロース分解酵素の誘導倍率を示す棒グラフである。
【図７】キシラン存在下で様々な時間培養したＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓにおける、ヘミセルロース分解酵素の誘導倍率を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０は、分泌酵素および表面結合酵素を用いて、高等植物細胞壁中に見出される高分子の全てを分解できる海洋細菌である。この細菌は、化学的な前処理をせずに全植物材料を糖化する異常な能力を有する。例えば、この細菌は、唯一の炭素源として（同一濃度での発生時間、ｈ）、グルコース（２．６）、アビセル（２．２５）、オートスペルト（ｏａｔ ｓｐｅｌｔ）キシラン（１．６）、新聞用紙（＞６）、コーン粉末全葉（＞６）、およびＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｇａｔｕｍ粉末葉（＞６）を利用できるため、相乗作用性のヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、および恐らくはリグニナーゼの産生が示されている。ゲノム配列の分析から、この細菌は、少なくとも１２種のエンドグルカナーゼ、１種のセロビオヒドロラーゼ、２種のセロデキストリナーゼ、３種のセロビアーゼ、７種のキシラナーゼ、１０種の「アラビナーゼ」、５種のマンナーゼおよび１４種のペクチナーゼを産生することが予測される。ザイモグラムの分析および培養物のプロテオーム分析から、こうした酵素のサブセットが、前述の各基質での増殖中に誘導されることが明らかになった。特異酵素の誘導は、ｑＲＴ−ＰＣＲで評価した。特異酵素の命名法は、２００５年５月４日に出願され、その全体が本明細書に組み込まれる米国公開第２００６／０１０５９１４号として公開された、米国出願第１１／１２１１５４号に更に詳細に説明されている。
【００１８】
Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓは、植物材料と、したがって植物材料で作られている生成物とを効果的に分解する。したがって、特定の植物材料に曝した際にＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ中に発現する酵素混合物の誘導によって、個々の酵素および酵素混合物は、Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓを曝した植物材料の分解に効果的であることが示される。このことは、所与の植物材料への曝露に応答してＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ中での高い発現を増加させる、または維持する２種以上の任意の酵素を使用して、その植物材料を分解する酵素混合物を形成し得ることを意味する。Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓが単純な糖類に効果的に分解する２種類の植物材料は、セルロースおよびヘミセルロースが豊富な植物材料である。こうした２種類の炭水化物を分解する酵素系について、より詳細に以下に説明する。
【００１９】
セルロース
Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０は、セルロースを単純な糖類に分解する多くの酵素を発現する。例えば、コーン葉の存在下で下記の表１に示すセルロース分解酵素が増加した。
【００２０】
【表１】
【００２１】
コーン葉の存在下でＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓにより発現が増加する酵素は、コーン葉を糖に消化するために恐らく必要である。したがって、２０倍を超えて増加した酵素、即ちｃｅｌ５Ｆ、ｃｅｌ５Ｈは、コーン葉の分解に有効である。更に、表１に示すセルロース分解酵素の全種または任意の少数種の混合物であって、表１に示す発現の増加または図３に示す相対的な発現に比例または反比例して組み合わせた混合物は、酵素混合物をコーン葉の分解に有効にするために使用される。対応する混合物が、表１に示す情報を用いてグルコース、新聞用紙またはアビセルについても作製される。更に、他の植物材料用の混合物も、その植物材料にＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓを曝露し、分解酵素のＲＮＡ、タンパク質または活性度の検出により、分解酵素の発現を検出することによって作製される。
【００２２】
その上、化学的に純粋な形態の微結晶セルロースのアビセルに１０時間曝した際のＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓにおいて、下記の表２に示すように以下の酵素が誘導された。
【００２３】
【表２】
【００２４】
ｃｅｌ５Ａ、ｃｅｌ５Ｇ、ｃｅｌ９Ａ、ｃｅｌ５Ｂ、ｃｅｄ３Ｂ、ｂｇｌ１Ａおよびｃｅｐ９４Ｂは、Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０中に構成的に発現するようである。アビセルでの２時間の増殖後、ｃｅｌ９Ａの発現が増加する。これに続いて、４時間でｃｅｌ５Ｆの発現が増加し、１０時間でｃｅｌ５Ｈおよびｃｅｌ５Ｉの発現が増加する。ｃｅｌ５Ｉは、アビセルでの２４時間の培養でさえも過剰発現し続ける。
【００２５】
ｃｅｌ５Ｉおよびｃｅｌ５Ｈは、セルロースの分解に特に重要であることも示された。Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０をセルロースに曝したとき、ｃｅｌ５Ｉは５００倍を超えて誘導され、ｃｅｌ５Ｈは１００倍を超えて誘導される（図４）。その上、Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０をセロビオース、セロトラオース、セロデキストリンなどのセロデキストリン類に曝したとき、ｃｅｌ５Ｈは５００倍を超えて発現する（図５）。したがって、これらのタンパク質はいずれも、セルロースを単純な糖類に効率的に分解するために使用することができよう。
【００２６】
更に、特定の植物材料に曝したときのＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ中で発現が増加する分解酵素は、操作・作製した細菌中で構成的および／または過剰に発現し、その特定の植物材料の分解に有効な細菌を作製し得る。例えば、コーン葉の存在下でＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ中に誘導されることが、表１に示されているタンパク質の混合物は、構成的に発現するように、ある細菌中に導入することができよう。こうしたタンパク質は、高速で発現するように導入することもできよう。次いで、操作・作製したこうした細菌は、植物材料、例えばコーン葉の分解に使用される。一実施形態では、操作・作製しようとする細菌はＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓである。別の実施形態では、操作・作製しようとする細菌はＥ．ｃｏｌｉである。
【００２７】
ヘミセルロース
Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０は、ヘミセルロースを単純な糖類に分解する多くの酵素を発現する。ヘミセルロースは、糖単量体の短い分岐鎖として存在する。ヘミセルロースを構成する糖類には、キシロース、マンノース、ガラクトースおよび／またはアラビノースが含まれる。ヘミセルロースは、セルロースおよびペクチンと一連の架橋を形成することにより、剛直な細胞壁を形成する。セルロースと異なり、ヘミセルロースは、大体において非晶質であり、相対的に弱く、加水分解を受け易い。
【００２８】
Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓは、ヘミセルロースをより単純な糖類に分解するために使用される、多くのヘミセルラーゼを産生する。図６に示すように、ｘｙｎ１０Ａ、ｘｙｎ１０Ｂ、ｘｙｎ１０Ｄ、ｘｙｎ１１Ａおよびｘｙｎ１１Ｂの発現が、ヘミセルロースを含有するキシランで増殖させたＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０中に誘発される。その上、図７に示すように、ｘｙｎ１０Ａ、ｘｙｎ１０Ｂ、ｘｙｎ１０Ｄ、ｘｙｎ１１Ａおよびｘｙｎ１１Ｂの発現は、キシランでのＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０の１０時間の培養後に示された。しかし、２時間では、最大の発現増加がｘｙｎ１１Ａおよびｘｙｎ１１Ｂに対して見られた一方、キシランでのＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０の４時間の培養における発現の最大増加は、ｘｙｎ１０Ａであった。
【００２９】
したがって、Ｘｙｎ１０ａ、Ｘｙｎ１０ｂ、Ｘｙｎ１０ｄ、Ｘｙｎ１１ａおよびＸｙｎ１１ｂは全て、ヘミセルロースのより単純な糖類への分解に重要である。しかし、Ｘｙｎ１０ａ、Ｘｙｎ１０ｂ、Ｘｙｎ１１ａおよびＸｙｎ１１ｂの重要性を特に強調すべきである。
【００３０】
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓタンパク質のクローニングおよび発現
クローニングおよび発現の基本系では、ベクターとしてｐＥＴ ２８Ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、クローニング株としてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびタンパク質発現株にはＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ−２１（ＤＥ３）ＲＯＳＥＴＴＡ（商標）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用する。この系は、ベクターが、クローニング株のＤＨ５αに欠けているＴ７ｌａｃプロモーターで発現を制御するため、プラスミドのスクリーニングおよび増殖の間に低レベルの発現さえも排除するので、有毒なまたはそれ以外の困難な遺伝子のクローニングを可能にする。青白選別（ｂｌｕｅ／ｗｈｉｔｅ ｓｃｒｅｅｎ）の後、プラスミドをＤＨ５αから精製し、発現宿主中に入れて形質転換させる。ＲＯＳＥＴＴＡ（商標）株は、ベクターにコードされたタンパク質のＩＰＴＧ誘発発現を可能にするＴ７ｌａｃプロモーターを有し、ＬｏｎおよびＯｍｐプロテアーゼを欠いている。
【００３１】
遺伝子モデルのヌクレオチド配列をＤＯＥ ＪＧＩのＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓゲノムウェブサーバーから入手し、ＰＲＩＭＥＲＱＵＥＳＴ（商標）設計ツール中に入力した。設計パラメーターは、最適Ｔｍが６０℃、最適プライマーサイズが２０ｎｔ、最適ＧＣ％＝５０であり、産物のサイズ範囲は、当該遺伝子の適度にできるだけ多くの部分をクローニングするために、各プライマーが各ＯＲＦの最初および最後の１００ヌクレオチド以内で選択されるように、選定した。クローニングおよび発現ベクターのｐＥＴ ２８Ｂは、Ｃ末端の６×ヒスチジン融合部、ならびにタンパク質発現用の開始および終止コドンを与える。したがって、ＰＣＲプライマーに５’制限酵素認識部位を付加する際には、ベクターのフレームおよび挿入配列に慎重な注意が必要である。生成した「テイルドプライマー（ｔａｉｌｅｄ ｐｒｉｍｅｒｓ）」の長さは２６〜３０ｎｔであり、それらの配列は、ＰＤＲＡＷソフトウェアパッケージを用いた「仮想クローニング」分析によって検証した。このプログラムは、ＤＮＡのベクター配列および挿入配列を標準的な制限酵素で切断し、一緒に連結することを可能にする。プライマー設計のエラーで導入される任意のフレームシフトを検出するために、生成する配列のアミノ酸への翻訳を調べた。これを検証した後、当該プライマーをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，Ｍｄ．）から購入した。
【００３２】
ＰＣＲ反応物は、順方向および逆方向プライマーを１０ｐＭｏｌ、１０ｍＭのＤＮＴＰを１μｌ、１００ｍＭのＭｇＣｌ２を１．５μｌおよびＰＲＯＯＦ ＰＲＯ（登録商標）Ｐｆｕポリメラーゼ１μｌを、鋳型としての２−４０ゲノムＤＮＡ０．５μｌと共に、反応液５０μｌ中に含有していた。ＰＣＲ条件には、テール付きプライマーおよびＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼに対する標準的パラメーターを用いた。ＰＣＲ産物は、ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎｕｐキットで浄化し、０．８％アガロースゲル中で観察した。浄化およびサイズ確認の後、ＰＣＲ産物およびｐＥＴ ２８Ｂを適当な制限酵素、普通はＡｓｃＩおよびＣｌａＩで３７℃で１〜４時間消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋキットを用いて浄化し、アガロースゲル中で可視化する。清浄な消化物は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて暗中、室温で少なくとも２時間連結する。次いで、連結反応物をエレクトロポレーションによりＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに入れて形質転換させる。形質転換体は、非選択培地中で３７℃で１時間インキュベートした後、アンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含有するＬＢ寒天上に播種する。ｐＥＴ ２８ＢはＡｍｐ遺伝子を保持し、挿入部はｌａｃＺ ＯＲＦ中にクローニングされるので、白色コロニーは挿入配列を含有する。白色コロニーを爪楊枝で採取し、新たなＬＢ／Ａｍｐ／Ｘ−ｇａｌプレート上に点在させるが、点在コロニーのうち３個は、３ｍｌの終夜ブロースに接種するために更に使用する。プラスミドは、終夜の生長後に白色のままであった点在コロニーに対応するブロースから調製する。次いで、これらのプラスミド調製物を適当な制限酵素で１回消化し、アガロース電気泳動により可視化して、サイズを確認する。
【００３３】
次いで、該プラスミドをＲＯＳＥＴＴＡ（商標）株中に熱ショックで導入して形質転換する。形質転換体は、非選択的レスキュー用培地中で３７℃で１時間インキュベートし、ＡｍｐおよびＣｍを含むＬＢ寒天（ＲＯＳＥＴＴＡ（商標）培地）上に播種し、３７℃で終夜インキュベートする。こうして選択したいずれのコロニーも、ベクターおよび挿入部を含有するはずである。これは、３個のコロニーをＲＯＳＥＴＴＡ（商標）培地プレート上に点在させ、対応する３ｍｌの終夜ブロースに接種することにより、確認される。翌朝、そのブロースを用いて２５ｍｌブロースに接種し、０．６程度のＯＤ６００になるまで増殖させる（２〜３時間）。この時点で、１ｍｌ分量を培養物から取り出し、ペレット化し、１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理バッファー１／１０容中に再浮遊させる。この予備誘導試料は、後にウェスタンブロットで使用するために、−２０℃で凍結する。次いで、残りのブロースを改変のために１ｍＭ ＩＰＴＧに添加し、３７℃で４時間インキュベートする。誘導ペレット試料を１時間の間隔で収集する。これの試料および予備誘導対照を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で移動させ、ＰＶＤＦ膜またはニトロセルロース上へエレクトロブロットする。次いで、その膜は、モノクローナルマウスα−ＨＩＳＴＡＧ（登録商標）一次抗体の１／５０００希釈液、その後ＨＲＰコンジュゲートヤギα−マウスＩｇＧ二次抗体を用いるウェスタンブロットとして処理する。バンドは、ＢｉｏＲａｄのＯｐｔｉ−４ＣＮ基質キットを用いた比色法で可視化する。誘導試料にはＨｉｓタグ付きバンドが存在するが、非誘導対照には存在しないことにより、発現の成功が確認され、毎時間時点のバンド間比較を用いることにより、後の規模拡大精製における誘導パラメーターが最適化される。
【００３４】
組換えタンパク質の産生および精製
ＲＯＳＥＴＴＡ（商標）培地の５００ｍｌまたは１リットルブロース中で、発現株を０．６〜０．８のＯＤ６００まで増殖させる。この時点で非誘導試料を収集し、残りの培養物を、１００ｍＭ ＩＰＴＧの最終濃度１ｍＭまで添加することにより誘導する。誘導は、３７℃で４時間、または２５℃で１６時間実施される。培養物ペレットを回収し、保存および細胞溶解促進のために、−２０℃で終夜凍結する。次いで、ペレットを氷上で１０分間融解し、秤量済みファルコン（ｆａｌｃｏｎ）チューブへ移し、秤量する。次いで、その細胞を、湿潤ペレット重量１ｇ当たり４ｍｌの溶解バッファー（８Ｍ尿素、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）中で、２５℃で１時間振とうする。溶解物を１５０００ｇで３０分間遠心し、細胞屑をペレット化する。清澄溶解物（上清）を清浄なファルコンチューブ中にピペット導入し、清澄溶解物各４ｍｌに対してＱＩＡＧＥＮ ５０％ Ｎｉｃｋｅｌ−ＮＴＡ樹脂１ｍｌを添加する。この混合物を室温で１時間静かに撹拌することにより、樹脂上のＮｉ＋２イオンと組換えタンパク質のＨｉｓタグとの結合を促進する。結合した後、スラリーを使い捨てミニカラム中に装填し、流出液（希薄化溶解物）を収集し、後の評価用に保存する。樹脂は、予めｐＨ７．０に調節した溶解バッファーで２回洗浄する。こうした洗浄液各々の容量は、清澄溶解物の元の容量に等しい。２回のこの洗浄流出液も、ウェスタンブロットでの後の分析により、精製効率を評価するために保存する。
【００３５】
この時点で、カラムは、Ｃ末端でＨｉｓタグにより固定化されている、相対的に精製された組換えタンパク質を含有する。これはリフォールディングにとって理想的状況であり、そこでカラムを４℃の部屋へ移動させ、尿素濃度が減少する一連の再生バッファーをカラム中に通過させる。再生バッファーは、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、５００ｍＭ ＮａＣｌおよび２０％グリセロール中に変化量の尿素を含有する。このバッファーは、６Ｍ、４Ｍ、２Ｍおよび１Ｍの尿素を含有する原液として調製される。こうした原液の一定分量を容易に混合して、５Ｍおよび３Ｍの尿素濃度を得ることができ、こうして１Ｍ刻みで減少する一連の尿素濃度を得ることができる。６Ｍバッファー１容（元の溶解物容量）をカラム中に通過させ、次に５Ｍバッファー１容が続き、１Ｍバッファーまで継続するが、１Ｍバッファーは、尿素１Ｍでのカラムの平衡化を確実にするために、１回繰り返す。この時点で、リフォールディング済みタンパク質は、２５０ｍＭイミダゾールを含有する１Ｍ尿素、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロールを用いて、元容量の１／１０の８分画中に溶出される。イミダゾールは、ニッケルイオン−Ｈｉｓタグ相互作用を破壊し、それによりタンパク質がカラムから放出される。
【００３６】
希薄化溶解物、２回分の洗浄液、および溶出分画におけるＨｉｓタグ付きタンパク質の量を評価するために、ウェスタンブロットを使用する。希薄化溶解物および／または洗浄液中に多量の組換えタンパク質があるならば、このプロセスを繰り返し、より多くのタンパク質を「スカベンジ」することが可能である。対象タンパク質を含有する溶出分画は、プールした後、濃縮し、セントリコン（ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）遠心限外ろ過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて保存バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール）中に交換する。次いで、酵素調製物を一定分量ずつ小分けし、−８０℃で凍結して活性アッセイでの使用に備える。
【実施例】
【００３７】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を更に支持するが、それらを専ら表現するものではない。
【００３８】
ザイモグラム手順
全ての活性ゲルは、適当なＣＰ基質を分離用ゲル中に直接組み入れた、標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルとして調製した。ザイモグラムは、８％ポリアクリルアミド濃度と、最終濃度が０．１％（ＨＥセルロース）、０．１５％（大麦β−グルカン）またはＯ．２％（キシラン）となるように、ｄＨ２Ｏおよび／またはゲルバッファー溶液中に溶解した基質と共にキャスティングした。ゲルは、Ｌａｅｍｍｌｉの手順に従った不連続条件下で操作するが、例外として、２％ＳＤＳの最終濃度および１００ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有する試料バッファー中で、９５℃で８分間処理する。電気泳動後、ゲルは、２．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２ｍＭ ＤＴＴおよび２．５ｍＭ ＣａＣｌ２を含有する、２０ｍＭ ＰＩＰＥＳバッファーｐＨ６．８の再生バッファー８０ｍｌ中で、室温で１時間インキュベートする。カルシウムは、Ｌａｍ１６Ａのｔｓｐ３ｓなどの潜在的カルシウム結合ドメインのリフォールディングを補助するために、含めた。
【００３９】
１時間の平衡化後、ゲルを再生バッファーの新たな８０ｍｌ分量中に入れ、静かに振とうしながら４℃で終夜維持した。翌朝、ゲルを２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．８の８０ｍｌ中で、室温で１時間平衡化し、清浄な容器へ移し、最小量のＰＩＰＥＳバッファーで覆い、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーションの後、ゲルを、ｄＨ２Ｏ中０．２５％コンゴーレッド（ＨＥセルロース、β−グルカンおよびキシラン）または７％酢酸中０．０１％トルイジンブルーのいずれかの溶液で３０分間染色した。明確なバンドが染色バックグランドに対して見えるまで、ゲルを、コンゴーレッドに対しては１Ｍ ＮａＣｌで、およびトルイジンブルーに対してはｄＨ２Ｏで除染色した。
【００４０】
（実施例１）遺伝子型決定法
Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓの増殖速度を様々な基質で培養した（図１）。基本培地は、（２．３％即席海洋水（Ｉｎｓｔａｎｔ Ｏｃｅａｎ）、０．０５％酵母エキス、０．０５％ＮＨ４Ｃｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８）で構成されていた。各炭素源の最終濃度は、グルコース、キシロース、セロビオース、アラビノース、キシラン、アビセルが０．２％、新聞用紙、アメリカクサキビおよびコーン葉が１．０％であった。Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓは、増殖する全ての植物材料で増殖した。
【００４１】
様々な細胞壁高分子での増殖中にどのグルカナーゼが誘導されるかを見出すために、ザイモグラムを行なった（図２）。唯一の炭素源としてグルコースを含有する培地中で、０．３〜０．５のＯＤ６００まで細胞を増殖させ、回収し、表示した誘導剤を含有する同容量の培地へ移した。試料を表示した時間に取り出し、ＯＤ６００に規格化した試料中のタンパク質を、分割用ゲル中に０．１％の大麦β−グルカンまたはＨＥセルロースのいずれかを含めた標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、分別した。ゲルをリフォールディングバッファー（２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ［ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）］バッファー［ｐＨ６．８］、２．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２ｍＭジチオスレイトール、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２）中で室温で１時間インキュベートした後、新たなリフォールディングバッファー中で４℃で終夜維持した。ゲルをＰＩＰＥＳバッファーに移し、３７℃でインキュベートし、０．２５％コンゴーレッド中で染色した。算出質量は、ｋＤａ単位で左側に示してある。異なるグルカナーゼが、使用した異なる植物材料または炭水化物源の存在下で発現した。
【００４２】
グルコースおよび細胞壁高分子での増殖中におけるセルロース分解酵素の発現が、決定された（図３）。Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓをグルコースで、０．３〜０．４のＯＤ６００まで培養し、回収し、表示した基質を含有する同容量の培地へ移した。１０時間後に、ＲＮＡ ＰＲＯＴＥＣＴ（商標）細菌試薬（Ｑｉａｇｅｎ）およびＲＮＥＡＳＹ（商標）ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＲＮＡを単離した。ＱＩＡＮＴＩＴＥＣＴ（商標）逆転写キットを用いて、ｃＤＮＡを合成した。各表示遺伝子、またはグアニル酸キナーゼおよびジヒドロ葉酸レダクターゼの対照遺伝子２種の１２０〜２００ｂｐ断片を、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（商標）マスターミックスキット（Ｒｏｃｈｅ）およびＬＩＧＨＴ ＣＹＣＬＥＲ（商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ）を用いて増幅した。その上に数字で示した棒は、縮尺１／１０で提示してある。異なるセルロース分解酵素が、異なる植物材料または炭水化物源によって誘導された。
【００４３】
（実施例２）キシランでのＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓの増殖に応答した、Ｘｙｎ１０Ａ、Ｘｙｎ１０Ｂ、Ｘｙｎ１１ＡおよびＸｙｎ１１Ｂの発現増加の測定
６種の標的遺伝子：ｘｙｎ１０Ａ〜Ｄおよびｘｙｎ１１Ａ〜Ｂに対して、２種のハウスキーピング遺伝子：ジヒドロ葉酸レダクターゼおよびグアニル酸キナーゼと共に、プライマーを設計した。Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓをグルコース培地中で、ＯＤ６００が０．３７０〜０．４００になるまで培養した。０時間時点を取り、培養物を１０時間の経時実験のためにキシラン培地へ移した。第２の培養物は、対照としてグルコースへ再び移した。試料は、キシラン、グルコース双方の培養物から０、２、４および１０時間に採取した。
【００４４】
各試料のＲＮＡは、ＲＮＡｐｒｏｔｅｃｔ（商標）細菌試薬（Ｑｉａｇｅｎ）およびＲｎｅａｓｙ ＭｉｎｉＫｉｔを用いて精製した。単離したｍＲＮＡは、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｈ（商標）逆転写酵素を用いて変換し、発現パターンは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｐｒｏ（商標）ｐＲＴ−ＰＣＲを用いて分析した。
【００４５】
図６に示すように、ｘｙｎ１０Ａ、ｘｙｎ１０Ｂ、ｘｙｎ１０Ｄ、ｘｙｎ１１Ａおよびｘｙｎ１１Ｂは全て、キシランに曝してから２、４および１０時間後に、より大きいｍＲＮＡ発現を示した。この増加は、ｘｙｎ１０Ａ、ｘｙｎ１０Ｂ、ｘｙｎ１１Ａおよびｘｙｎ１１Ｂの場合に最大であった。図７に示すように、キシランでのＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓの培養２時間におけるｍＲＮＡ発現の最高倍率誘導は、ｘｙｎ１１Ａおよびｘｙｎ１１Ｂの場合であった。ｘｙｎ１０Ａは、４時間で最高の誘導を受けた。１０時間では、ｘｙｎ１０Ａ、ｘｙｎ１０Ｂ、ｘｙｎ１１Ａおよびｘｙｎ１１Ｂは全て、より高い倍率誘導を受けた。
【００４６】
Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓが、キシランに曝した際にこれらのタンパク質の発現を増加させるため、また、既知のヘミセルラーゼ遺伝子に対して、これらのタンパク質が示す配列相同性のために、Ｘｙｎ１０Ａ、Ｘｙｎ１０Ｂ、Ｘｙｎ１０Ｄ、Ｘｙｎ１１ＡおよびＸｙｎ１１Ｂは、ヘミセルロースの分解に使用できる機能性ヘミセルラーゼである。
等価物および参照による組込み
当業者であれば、本明細書に記載の特定のポリペプチド、核酸、方法、アッセイおよび試薬に関する夥しい等価物を認識され、または単なる常套的実験を用いて該等価物を確かめることができよう。このような等価物は、本発明の範囲内にあると見なされ、以下の特許請求の範囲に包含される。
【００４７】
本出願は、学術的な教科書、公表論文および特許出願、ならびに交付された米国および外国特許に対する夥しい引用を含む。こうした引用文献全ての完全な内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００１】
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓの２−４０株（本明細書では「Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０」と呼称する）は、複合多糖類（ＣＰ）を分解する海洋細菌の新たに出現してきた一群を代表する。Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓは、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託されており、受入番号ＡＴＣＣ４３９６１を保有している。Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０は、チェサピーク湾（Ｃｈｅｓａｐｅａｋｅ Ｂａｙ）流域中の枯死段階の塩性湿地コードグラス（ｃｏｒｄ ｇｒａｓｓ）Ｓｐａｒｔｉｎａ ａｌｔｅｒｎｉｆｌｏｒａから単離された海洋性γ−プロテオバクテリアである。枯死段階の植物からの単離と合致して、Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株は、高等植物の細胞壁の共通成分であるセルロース、ペクチン、キシランおよびキチンを含め、多くの複合多糖類を分解することができる。Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株は、寒天、アガロース、ラミナリンなどの藻類の細胞壁成分、ならびにタンパク質、澱粉、プルランおよびアルギン酸を解重合することもできる。この多数の高分子を分解する以外に、Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株は、該多糖類の各々を唯一の炭素源として利用することができる。したがって、Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株は、不溶性複合多糖類（ＩＣＰ）の微生物分解の優れたモデルであるばかりでなく、こうしたＩＣＰの完全代謝の典型として使用することもできる。ＩＣＰは、動植物における形態および構造のために使用される糖類重合体である。それらは、水に不溶であり、したがって分解し難い。
【０００２】
Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株は、増殖のために少なくとも１％の海水塩を必要としており、１０％もの高い塩濃度に耐えよう。それは、好気性で、一般に桿状であり、単極鞭毛によって運動性である、高度に多形性のグラム陰性細菌である。以前の研究によれば、２−４０は、寒天、キチン、アルギン酸、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、β−グルカン、ラミナリン、ペクチン、プルラン、澱粉およびキシランを含め、少なくとも１０種の異なる炭化水素高分子（ＣＰ）を分解できると判定された。それに加え、この細菌は真正チロシナーゼを合成することが示された。１６Ｓ ｒＤＮＡの分析によれば、２−４０は、プロテオバクテリア門のγサブクラスの一員であり、Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、およびフナクイムシの共生生物であるセルロース分解性窒素固定細菌Ｔｅｒｉｄｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．と関係のあることが示されている。
【０００３】
アガラーゼ、キチナーゼおよびアルギナーゼ各系の特性が、全般的に決定された。ザイモグラム活性ゲルによって、以上の３系は多数のデポリメラーゼからなることが示され、多面的な証拠から、これらのデポリメラーゼの少なくとも幾つかは細胞表面に付着していることが示唆される。活性アッセイによれば、Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ酵素活性の大半は、ＣＰでの対数増殖中に細胞分画と共にあるが、その後の増殖期では、活性の大部分が上清中に見出され、細胞付随活性は激減することが明らかになっている（Ｓｔｏｔｚ １９９４年）。ＣＰでの増殖は、細胞形態の劇的変化も伴う。Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓのグルコース増殖培養物は、細胞のサイズおよび形状が相対的に均一であり、細胞表面が概ね滑らかで特徴がない。しかし、アガロース、アルギン酸またはキチンで増殖させると、Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ細胞は、表面の新規な構造および特徴を示す。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
基質としてセルロースを使用する酵素系を特定し、適切なベクターを用いて該タンパク質をコードする遺伝子を発現させ、アミノ酸産物（酵素および非酵素産物）を同定して単離し、これらの産物を、ならびにこれらの遺伝子を含有する微生物を、エタノール製造などの目的のために使用する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、植物材料を分解する酵素混合物を創製する方法を提供する。好ましくは、この分解は植物材料の化学的前処理をせずに起こる。この方法は、所与の植物材料の存在下でＳａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓを増殖させ、次いでＳａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ中に発現する酵素の発現を測定することを含む。所与の植物材料の存在下で増加した発現を受ける酵素は、組み合わせることにより、所与の植物材料を分解する酵素混合物を形成する。
【０００６】
本発明は、所与の植物材料の存在下でＳａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ中で上方調節される酵素を、増加した発現速度で構成的に発現する、改変された細菌も提供する。この改変細菌は、非改変細菌より遥かに速い速度で所与の植物材料を分解することができる。
【０００７】
本発明は、該細菌を用いて１種または複数の植物材料を分解し、その分解過程から生じたより単純な糖類を用いて、１種または複数の植物材料を含む水性混合物中にエタノールを産生することにより、エタノールを産生する方法も提供する。エタノールは、当技術分野で公知の任意の方法により産生される。一実施形態では、エタノールは、この細菌の分解産物から酵母細胞によって産生される。該細菌は、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株でもよいし、または所与の植物材料の存在に応答して、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ中で上方調節される酵素を発現する改変細菌でもよい。本発明の特定の実施形態では、細菌および１種または複数の植物材料の水性混合物は、少なくとも１％の塩および／または多くとも１０％の塩を含む。本発明のこうした実施形態は、糖類をエタノールに変換するステップを省略することにより、糖を作るためにも使用される。
【０００８】
本発明は、酵素混合物を用いて所与の植物材料を分解し、その分解過程から生じたより単純な糖類を用いて、エタノールを産生することにより、エタノールを産生する方法も提供する。エタノールは、当技術分野で公知の任意の方法により産生される。一実施形態では、エタノールは、この細菌の分解産物から酵母細胞によって産生される。該酵素混合物は、所与の植物材料の存在に応答して、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株中で上方調節される酵素の２種以上である。該酵素類は、当技術分野で公知の任意の方法により、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株から回収される。本発明の特定の実施形態では、タンパク質および１種または複数の植物材料の水性混合物は、少なくとも１％の塩および／または多くとも１０％の塩を含む。他の特定の実施形態では、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株は、植物材料の第１の部分で約０．３〜約０．５のＯＤ６００になるまで増殖させる。他の特定の実施形態では、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株は、約５〜約１０のＯＤ６００になるまで増殖させる。他の特定の実施形態では、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株は、１０を超えるＯＤ６００になるまで増殖させる。本発明のこうした実施形態は、酵母を添加しないことにより、糖を作るためにも使用される。
【０００９】
所与の植物材料の分解に使用される酵素混合物に関するより特定の実施形態では、本発明は、Ｃｅｌ５ＨおよびＣｅｌ５Ｉを含んだ組成物を包含する。別の特定の実施形態では、本発明は、Ｃｅｌ５ＨおよびＣｅｌ５Ｆを含んだ組成物を包含する。
【００１０】
所与の植物材料の分解に使用される酵素混合物に関する代替的な実施形態では、本発明は、Ｃｅｌ５Ｆ、Ｃｅｌ５Ｈ、Ｃｅｌ５Ｉ、Ｃｅｐ９４ＡおよびＣｅｐ９４Ｂを含んだ組成物を包含する。より特定の実施形態では、本発明は、Ｃｅｌ６Ａ、Ｂｇｌ３ＣおよびＣｅｌ９Ｂを更に含んだ組成物を包含する。より特定の実施形態では、本発明は、Ｃｅｌ５Ａ、Ｃｅｌ５Ｂ、Ｃｅｌ５Ｃ、Ｃｅｌ５Ｄ、Ｃｅｌ５Ｅ、Ｃｅｌ５Ｇ、Ｃｅｌ５Ｊ、Ｃｅｌ９Ａ、Ｂｇｌ１Ａ、Ｂｇｌ１Ｂ、Ｃｅｄ３ＡおよびＣｅｄ３Ｂを更に含んだ組成物を包含する。追加の実施形態では、本発明の組成物は酵母を更に含む。
【００１１】
所与の植物材料の分解に使用される酵素混合物に関する代替的な実施形態では、本発明は、Ｃｅｌ５Ｅ、Ｃｅｌ５Ｉ、Ｃｅｌ９Ａ、Ｂｇｌ１ＡおよびＣｅｄ３Ｂを含んだ組成物を包含する。より特定の実施形態では、本発明は、Ｃｅｌ５Ｂ、Ｃｅｐ９４ＡおよびＣｅｐ９４Ｂを更に含んだ組成物を包含する。追加の実施形態では、本発明の組成物は酵母を更に含む。
【００１２】
所与の植物材料の分解に使用される酵素混合物に関する代替的な実施形態では、本発明は、Ｃｅｌ５Ｆ、Ｃｅｌ９Ａ、Ｂｇｌ１ＡおよびＣｅｄ３Ｂを含んだ組成物を包含する。より特定の実施形態では、本発明は、Ｃｅｌ５Ｂ、Ｃｅｌ５Ｅ、Ｃｅｌ５Ｉ、Ｂｇｌ１Ｂ、Ｂｇｌ３Ｃ、Ｃｅｐ９４ＡおよびＣｅｐ９４Ｂを更に含んだ組成物を包含する。追加の実施形態では、本発明の組成物は酵母を更に含む。
【００１３】
所与の植物材料の分解に使用される酵素混合物に関する代替的な実施形態では、本発明は、Ｃｅｌ５Ｉ、Ｂｇｌ１Ａ、Ｂｇｌ１Ｂ、Ｃｅｄ３ＢおよびＣｅｐ９４Ｂを含んだ組成物を包含する。より特定の実施形態では、本発明は、Ｃｅｌ５Ａ、Ｃｅｌ５Ｇ、Ｃｅｌ９Ａ、Ｂｇｌ３ＣおよびＣｅｐ９４Ａを更に含んだ組成物を包含する。追加の実施形態では、本発明の組成物は酵母を更に含む。
【００１４】
所与の植物材料の分解に使用される酵素混合物に関する代替的な実施形態では、本発明は、Ｃｅｌ５Ｅ、Ｃｅｌ５Ｆ、Ｃｅｌ５Ｈ、Ｃｅｌ６ＡおよびＣｅｌ９Ｂを含んだ組成物を包含する。より特定の実施形態では、本発明は、Ｃｅｌ５Ｉ、Ｂｇｌ３ＣおよびＣｅｐ９４Ａを更に含んだ組成物を包含する。他の特定の実施形態では、本発明は、Ｃｅｌ５Ｃ、Ｃｅｌ５ＤおよびＣｅｄ３Ａを更に含んだ組成物を包含する。追加の実施形態では、本発明の組成物は酵母を更に含む。
【００１５】
所与の植物材料の分解に使用される酵素混合物に関する代替的な実施形態では、本発明は、Ｘｙｎ１０ａ、Ｘｙｎ１０ｂおよびＸｙｎ１１ａを含んだ組成物を包含する。より特定の実施形態では、本発明は、Ｘｙｎ１０ＤおよびＸｙｎ１１Ｂを更に含んだ組成物を包含する。追加の実施形態では、本発明の組成物は酵母を更に含む。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】異なる基質でのＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓの増殖速度を示す棒グラフである。
【図２】０．１％の大麦β−グルカン、ＨＥセルロースのいずれかで増殖させた、Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓからのタンパク質のコンゴーレッド染色ＳＤＳゲルを示す図である。
【図３】グルコース、コーン、アビセル（Ａｖｉｃｅｌ）および新聞用紙の存在下で培養した、Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓにおけるセルロース分解酵素の相対的な発現を示す棒グラフである。グラフの目盛から外れた棒は、その上の数字で示されている。
【図４】セルロースで増殖させたときのＳａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株における、ｃｅｌ５Ａ、ｃｅｌ５Ｈおよびｃｅｌ５Ｉの経時的な誘導倍率を示す線グラフである。
【図５】セロデキストリン、セロビオース、セロトラオースおよびアビセルの存在下で増殖させたときのＳａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株における、ｃｅｌ５Ｈの相対発現レベルを示す線グラフである。
【図６】キシラン存在下で培養したＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓにおける、ヘミセルロース分解酵素の誘導倍率を示す棒グラフである。
【図７】キシラン存在下で様々な時間培養したＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓにおける、ヘミセルロース分解酵素の誘導倍率を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０は、分泌酵素および表面結合酵素を用いて、高等植物細胞壁中に見出される高分子の全てを分解できる海洋細菌である。この細菌は、化学的な前処理をせずに全植物材料を糖化する異常な能力を有する。例えば、この細菌は、唯一の炭素源として（同一濃度での発生時間、ｈ）、グルコース（２．６）、アビセル（２．２５）、オートスペルト（ｏａｔ ｓｐｅｌｔ）キシラン（１．６）、新聞用紙（＞６）、コーン粉末全葉（＞６）、およびＰａｎｉｃｕｍ ｖｉｇａｔｕｍ粉末葉（＞６）を利用できるため、相乗作用性のヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、および恐らくはリグニナーゼの産生が示されている。ゲノム配列の分析から、この細菌は、少なくとも１２種のエンドグルカナーゼ、１種のセロビオヒドロラーゼ、２種のセロデキストリナーゼ、３種のセロビアーゼ、７種のキシラナーゼ、１０種の「アラビナーゼ」、５種のマンナーゼおよび１４種のペクチナーゼを産生することが予測される。ザイモグラムの分析および培養物のプロテオーム分析から、こうした酵素のサブセットが、前述の各基質での増殖中に誘導されることが明らかになった。特異酵素の誘導は、ｑＲＴ−ＰＣＲで評価した。特異酵素の命名法は、２００５年５月４日に出願され、その全体が本明細書に組み込まれる米国公開第２００６／０１０５９１４号として公開された、米国出願第１１／１２１１５４号に更に詳細に説明されている。
【００１８】
Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓは、植物材料と、したがって植物材料で作られている生成物とを効果的に分解する。したがって、特定の植物材料に曝した際にＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ中に発現する酵素混合物の誘導によって、個々の酵素および酵素混合物は、Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓを曝した植物材料の分解に効果的であることが示される。このことは、所与の植物材料への曝露に応答してＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ中での高い発現を増加させる、または維持する２種以上の任意の酵素を使用して、その植物材料を分解する酵素混合物を形成し得ることを意味する。Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓが単純な糖類に効果的に分解する２種類の植物材料は、セルロースおよびヘミセルロースが豊富な植物材料である。こうした２種類の炭水化物を分解する酵素系について、より詳細に以下に説明する。
【００１９】
セルロース
Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０は、セルロースを単純な糖類に分解する多くの酵素を発現する。例えば、コーン葉の存在下で下記の表１に示すセルロース分解酵素が増加した。
【００２０】
【表１】
【００２１】
コーン葉の存在下でＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓにより発現が増加する酵素は、コーン葉を糖に消化するために恐らく必要である。したがって、２０倍を超えて増加した酵素、即ちｃｅｌ５Ｆ、ｃｅｌ５Ｈは、コーン葉の分解に有効である。更に、表１に示すセルロース分解酵素の全種または任意の少数種の混合物であって、表１に示す発現の増加または図３に示す相対的な発現に比例または反比例して組み合わせた混合物は、酵素混合物をコーン葉の分解に有効にするために使用される。対応する混合物が、表１に示す情報を用いてグルコース、新聞用紙またはアビセルについても作製される。更に、他の植物材料用の混合物も、その植物材料にＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓを曝露し、分解酵素のＲＮＡ、タンパク質または活性度の検出により、分解酵素の発現を検出することによって作製される。
【００２２】
その上、化学的に純粋な形態の微結晶セルロースのアビセルに１０時間曝した際のＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓにおいて、下記の表２に示すように以下の酵素が誘導された。
【００２３】
【表２】
【００２４】
ｃｅｌ５Ａ、ｃｅｌ５Ｇ、ｃｅｌ９Ａ、ｃｅｌ５Ｂ、ｃｅｄ３Ｂ、ｂｇｌ１Ａおよびｃｅｐ９４Ｂは、Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０中に構成的に発現するようである。アビセルでの２時間の増殖後、ｃｅｌ９Ａの発現が増加する。これに続いて、４時間でｃｅｌ５Ｆの発現が増加し、１０時間でｃｅｌ５Ｈおよびｃｅｌ５Ｉの発現が増加する。ｃｅｌ５Ｉは、アビセルでの２４時間の培養でさえも過剰発現し続ける。
【００２５】
ｃｅｌ５Ｉおよびｃｅｌ５Ｈは、セルロースの分解に特に重要であることも示された。Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０をセルロースに曝したとき、ｃｅｌ５Ｉは５００倍を超えて誘導され、ｃｅｌ５Ｈは１００倍を超えて誘導される（図４）。その上、Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０をセロビオース、セロトラオース、セロデキストリンなどのセロデキストリン類に曝したとき、ｃｅｌ５Ｈは５００倍を超えて発現する（図５）。したがって、これらのタンパク質はいずれも、セルロースを単純な糖類に効率的に分解するために使用することができよう。
【００２６】
更に、特定の植物材料に曝したときのＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ中で発現が増加する分解酵素は、操作・作製した細菌中で構成的および／または過剰に発現し、その特定の植物材料の分解に有効な細菌を作製し得る。例えば、コーン葉の存在下でＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ中に誘導されることが、表１に示されているタンパク質の混合物は、構成的に発現するように、ある細菌中に導入することができよう。こうしたタンパク質は、高速で発現するように導入することもできよう。次いで、操作・作製したこうした細菌は、植物材料、例えばコーン葉の分解に使用される。一実施形態では、操作・作製しようとする細菌はＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓである。別の実施形態では、操作・作製しようとする細菌はＥ．ｃｏｌｉである。
【００２７】
ヘミセルロース
Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０は、ヘミセルロースを単純な糖類に分解する多くの酵素を発現する。ヘミセルロースは、糖単量体の短い分岐鎖として存在する。ヘミセルロースを構成する糖類には、キシロース、マンノース、ガラクトースおよび／またはアラビノースが含まれる。ヘミセルロースは、セルロースおよびペクチンと一連の架橋を形成することにより、剛直な細胞壁を形成する。セルロースと異なり、ヘミセルロースは、大体において非晶質であり、相対的に弱く、加水分解を受け易い。
【００２８】
Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓは、ヘミセルロースをより単純な糖類に分解するために使用される、多くのヘミセルラーゼを産生する。図６に示すように、ｘｙｎ１０Ａ、ｘｙｎ１０Ｂ、ｘｙｎ１０Ｄ、ｘｙｎ１１Ａおよびｘｙｎ１１Ｂの発現が、ヘミセルロースを含有するキシランで増殖させたＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０中に誘発される。その上、図７に示すように、ｘｙｎ１０Ａ、ｘｙｎ１０Ｂ、ｘｙｎ１０Ｄ、ｘｙｎ１１Ａおよびｘｙｎ１１Ｂの発現は、キシランでのＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０の１０時間の培養後に示された。しかし、２時間では、最大の発現増加がｘｙｎ１１Ａおよびｘｙｎ１１Ｂに対して見られた一方、キシランでのＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０の４時間の培養における発現の最大増加は、ｘｙｎ１０Ａであった。
【００２９】
したがって、Ｘｙｎ１０ａ、Ｘｙｎ１０ｂ、Ｘｙｎ１０ｄ、Ｘｙｎ１１ａおよびＸｙｎ１１ｂは全て、ヘミセルロースのより単純な糖類への分解に重要である。しかし、Ｘｙｎ１０ａ、Ｘｙｎ１０ｂ、Ｘｙｎ１１ａおよびＸｙｎ１１ｂの重要性を特に強調すべきである。
【００３０】
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓタンパク質のクローニングおよび発現
クローニングおよび発現の基本系では、ベクターとしてｐＥＴ ２８Ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、クローニング株としてＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびタンパク質発現株にはＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ−２１（ＤＥ３）ＲＯＳＥＴＴＡ（商標）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用する。この系は、ベクターが、クローニング株のＤＨ５αに欠けているＴ７ｌａｃプロモーターで発現を制御するため、プラスミドのスクリーニングおよび増殖の間に低レベルの発現さえも排除するので、有毒なまたはそれ以外の困難な遺伝子のクローニングを可能にする。青白選別（ｂｌｕｅ／ｗｈｉｔｅ ｓｃｒｅｅｎ）の後、プラスミドをＤＨ５αから精製し、発現宿主中に入れて形質転換させる。ＲＯＳＥＴＴＡ（商標）株は、ベクターにコードされたタンパク質のＩＰＴＧ誘発発現を可能にするＴ７ｌａｃプロモーターを有し、ＬｏｎおよびＯｍｐプロテアーゼを欠いている。
【００３１】
遺伝子モデルのヌクレオチド配列をＤＯＥ ＪＧＩのＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓゲノムウェブサーバーから入手し、ＰＲＩＭＥＲＱＵＥＳＴ（商標）設計ツール中に入力した。設計パラメーターは、最適Ｔｍが６０℃、最適プライマーサイズが２０ｎｔ、最適ＧＣ％＝５０であり、産物のサイズ範囲は、当該遺伝子の適度にできるだけ多くの部分をクローニングするために、各プライマーが各ＯＲＦの最初および最後の１００ヌクレオチド以内で選択されるように、選定した。クローニングおよび発現ベクターのｐＥＴ ２８Ｂは、Ｃ末端の６×ヒスチジン融合部、ならびにタンパク質発現用の開始および終止コドンを与える。したがって、ＰＣＲプライマーに５’制限酵素認識部位を付加する際には、ベクターのフレームおよび挿入配列に慎重な注意が必要である。生成した「テイルドプライマー（ｔａｉｌｅｄ ｐｒｉｍｅｒｓ）」の長さは２６〜３０ｎｔであり、それらの配列は、ＰＤＲＡＷソフトウェアパッケージを用いた「仮想クローニング」分析によって検証した。このプログラムは、ＤＮＡのベクター配列および挿入配列を標準的な制限酵素で切断し、一緒に連結することを可能にする。プライマー設計のエラーで導入される任意のフレームシフトを検出するために、生成する配列のアミノ酸への翻訳を調べた。これを検証した後、当該プライマーをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，Ｍｄ．）から購入した。
【００３２】
ＰＣＲ反応物は、順方向および逆方向プライマーを１０ｐＭｏｌ、１０ｍＭのＤＮＴＰを１μｌ、１００ｍＭのＭｇＣｌ２を１．５μｌおよびＰＲＯＯＦ ＰＲＯ（登録商標）Ｐｆｕポリメラーゼ１μｌを、鋳型としての２−４０ゲノムＤＮＡ０．５μｌと共に、反応液５０μｌ中に含有していた。ＰＣＲ条件には、テール付きプライマーおよびＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼに対する標準的パラメーターを用いた。ＰＣＲ産物は、ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎｕｐキットで浄化し、０．８％アガロースゲル中で観察した。浄化およびサイズ確認の後、ＰＣＲ産物およびｐＥＴ ２８Ｂを適当な制限酵素、普通はＡｓｃＩおよびＣｌａＩで３７℃で１〜４時間消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋキットを用いて浄化し、アガロースゲル中で可視化する。清浄な消化物は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて暗中、室温で少なくとも２時間連結する。次いで、連結反応物をエレクトロポレーションによりＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに入れて形質転換させる。形質転換体は、非選択培地中で３７℃で１時間インキュベートした後、アンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含有するＬＢ寒天上に播種する。ｐＥＴ ２８ＢはＡｍｐ遺伝子を保持し、挿入部はｌａｃＺ ＯＲＦ中にクローニングされるので、白色コロニーは挿入配列を含有する。白色コロニーを爪楊枝で採取し、新たなＬＢ／Ａｍｐ／Ｘ−ｇａｌプレート上に点在させるが、点在コロニーのうち３個は、３ｍｌの終夜ブロースに接種するために更に使用する。プラスミドは、終夜の生長後に白色のままであった点在コロニーに対応するブロースから調製する。次いで、これらのプラスミド調製物を適当な制限酵素で１回消化し、アガロース電気泳動により可視化して、サイズを確認する。
【００３３】
次いで、該プラスミドをＲＯＳＥＴＴＡ（商標）株中に熱ショックで導入して形質転換する。形質転換体は、非選択的レスキュー用培地中で３７℃で１時間インキュベートし、ＡｍｐおよびＣｍを含むＬＢ寒天（ＲＯＳＥＴＴＡ（商標）培地）上に播種し、３７℃で終夜インキュベートする。こうして選択したいずれのコロニーも、ベクターおよび挿入部を含有するはずである。これは、３個のコロニーをＲＯＳＥＴＴＡ（商標）培地プレート上に点在させ、対応する３ｍｌの終夜ブロースに接種することにより、確認される。翌朝、そのブロースを用いて２５ｍｌブロースに接種し、０．６程度のＯＤ６００になるまで増殖させる（２〜３時間）。この時点で、１ｍｌ分量を培養物から取り出し、ペレット化し、１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理バッファー１／１０容中に再浮遊させる。この予備誘導試料は、後にウェスタンブロットで使用するために、−２０℃で凍結する。次いで、残りのブロースを改変のために１ｍＭ ＩＰＴＧに添加し、３７℃で４時間インキュベートする。誘導ペレット試料を１時間の間隔で収集する。これの試料および予備誘導対照を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で移動させ、ＰＶＤＦ膜またはニトロセルロース上へエレクトロブロットする。次いで、その膜は、モノクローナルマウスα−ＨＩＳＴＡＧ（登録商標）一次抗体の１／５０００希釈液、その後ＨＲＰコンジュゲートヤギα−マウスＩｇＧ二次抗体を用いるウェスタンブロットとして処理する。バンドは、ＢｉｏＲａｄのＯｐｔｉ−４ＣＮ基質キットを用いた比色法で可視化する。誘導試料にはＨｉｓタグ付きバンドが存在するが、非誘導対照には存在しないことにより、発現の成功が確認され、毎時間時点のバンド間比較を用いることにより、後の規模拡大精製における誘導パラメーターが最適化される。
【００３４】
組換えタンパク質の産生および精製
ＲＯＳＥＴＴＡ（商標）培地の５００ｍｌまたは１リットルブロース中で、発現株を０．６〜０．８のＯＤ６００まで増殖させる。この時点で非誘導試料を収集し、残りの培養物を、１００ｍＭ ＩＰＴＧの最終濃度１ｍＭまで添加することにより誘導する。誘導は、３７℃で４時間、または２５℃で１６時間実施される。培養物ペレットを回収し、保存および細胞溶解促進のために、−２０℃で終夜凍結する。次いで、ペレットを氷上で１０分間融解し、秤量済みファルコン（ｆａｌｃｏｎ）チューブへ移し、秤量する。次いで、その細胞を、湿潤ペレット重量１ｇ当たり４ｍｌの溶解バッファー（８Ｍ尿素、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）中で、２５℃で１時間振とうする。溶解物を１５０００ｇで３０分間遠心し、細胞屑をペレット化する。清澄溶解物（上清）を清浄なファルコンチューブ中にピペット導入し、清澄溶解物各４ｍｌに対してＱＩＡＧＥＮ ５０％ Ｎｉｃｋｅｌ−ＮＴＡ樹脂１ｍｌを添加する。この混合物を室温で１時間静かに撹拌することにより、樹脂上のＮｉ＋２イオンと組換えタンパク質のＨｉｓタグとの結合を促進する。結合した後、スラリーを使い捨てミニカラム中に装填し、流出液（希薄化溶解物）を収集し、後の評価用に保存する。樹脂は、予めｐＨ７．０に調節した溶解バッファーで２回洗浄する。こうした洗浄液各々の容量は、清澄溶解物の元の容量に等しい。２回のこの洗浄流出液も、ウェスタンブロットでの後の分析により、精製効率を評価するために保存する。
【００３５】
この時点で、カラムは、Ｃ末端でＨｉｓタグにより固定化されている、相対的に精製された組換えタンパク質を含有する。これはリフォールディングにとって理想的状況であり、そこでカラムを４℃の部屋へ移動させ、尿素濃度が減少する一連の再生バッファーをカラム中に通過させる。再生バッファーは、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、５００ｍＭ ＮａＣｌおよび２０％グリセロール中に変化量の尿素を含有する。このバッファーは、６Ｍ、４Ｍ、２Ｍおよび１Ｍの尿素を含有する原液として調製される。こうした原液の一定分量を容易に混合して、５Ｍおよび３Ｍの尿素濃度を得ることができ、こうして１Ｍ刻みで減少する一連の尿素濃度を得ることができる。６Ｍバッファー１容（元の溶解物容量）をカラム中に通過させ、次に５Ｍバッファー１容が続き、１Ｍバッファーまで継続するが、１Ｍバッファーは、尿素１Ｍでのカラムの平衡化を確実にするために、１回繰り返す。この時点で、リフォールディング済みタンパク質は、２５０ｍＭイミダゾールを含有する１Ｍ尿素、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロールを用いて、元容量の１／１０の８分画中に溶出される。イミダゾールは、ニッケルイオン−Ｈｉｓタグ相互作用を破壊し、それによりタンパク質がカラムから放出される。
【００３６】
希薄化溶解物、２回分の洗浄液、および溶出分画におけるＨｉｓタグ付きタンパク質の量を評価するために、ウェスタンブロットを使用する。希薄化溶解物および／または洗浄液中に多量の組換えタンパク質があるならば、このプロセスを繰り返し、より多くのタンパク質を「スカベンジ」することが可能である。対象タンパク質を含有する溶出分画は、プールした後、濃縮し、セントリコン（ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）遠心限外ろ過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて保存バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール）中に交換する。次いで、酵素調製物を一定分量ずつ小分けし、−８０℃で凍結して活性アッセイでの使用に備える。
【実施例】
【００３７】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を更に支持するが、それらを専ら表現するものではない。
【００３８】
ザイモグラム手順
全ての活性ゲルは、適当なＣＰ基質を分離用ゲル中に直接組み入れた、標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルとして調製した。ザイモグラムは、８％ポリアクリルアミド濃度と、最終濃度が０．１％（ＨＥセルロース）、０．１５％（大麦β−グルカン）またはＯ．２％（キシラン）となるように、ｄＨ２Ｏおよび／またはゲルバッファー溶液中に溶解した基質と共にキャスティングした。ゲルは、Ｌａｅｍｍｌｉの手順に従った不連続条件下で操作するが、例外として、２％ＳＤＳの最終濃度および１００ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有する試料バッファー中で、９５℃で８分間処理する。電気泳動後、ゲルは、２．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２ｍＭ ＤＴＴおよび２．５ｍＭ ＣａＣｌ２を含有する、２０ｍＭ ＰＩＰＥＳバッファーｐＨ６．８の再生バッファー８０ｍｌ中で、室温で１時間インキュベートする。カルシウムは、Ｌａｍ１６Ａのｔｓｐ３ｓなどの潜在的カルシウム結合ドメインのリフォールディングを補助するために、含めた。
【００３９】
１時間の平衡化後、ゲルを再生バッファーの新たな８０ｍｌ分量中に入れ、静かに振とうしながら４℃で終夜維持した。翌朝、ゲルを２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．８の８０ｍｌ中で、室温で１時間平衡化し、清浄な容器へ移し、最小量のＰＩＰＥＳバッファーで覆い、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーションの後、ゲルを、ｄＨ２Ｏ中０．２５％コンゴーレッド（ＨＥセルロース、β−グルカンおよびキシラン）または７％酢酸中０．０１％トルイジンブルーのいずれかの溶液で３０分間染色した。明確なバンドが染色バックグランドに対して見えるまで、ゲルを、コンゴーレッドに対しては１Ｍ ＮａＣｌで、およびトルイジンブルーに対してはｄＨ２Ｏで除染色した。
【００４０】
（実施例１）遺伝子型決定法
Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓの増殖速度を様々な基質で培養した（図１）。基本培地は、（２．３％即席海洋水（Ｉｎｓｔａｎｔ Ｏｃｅａｎ）、０．０５％酵母エキス、０．０５％ＮＨ４Ｃｌ、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８）で構成されていた。各炭素源の最終濃度は、グルコース、キシロース、セロビオース、アラビノース、キシラン、アビセルが０．２％、新聞用紙、アメリカクサキビおよびコーン葉が１．０％であった。Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓは、増殖する全ての植物材料で増殖した。
【００４１】
様々な細胞壁高分子での増殖中にどのグルカナーゼが誘導されるかを見出すために、ザイモグラムを行なった（図２）。唯一の炭素源としてグルコースを含有する培地中で、０．３〜０．５のＯＤ６００まで細胞を増殖させ、回収し、表示した誘導剤を含有する同容量の培地へ移した。試料を表示した時間に取り出し、ＯＤ６００に規格化した試料中のタンパク質を、分割用ゲル中に０．１％の大麦β−グルカンまたはＨＥセルロースのいずれかを含めた標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、分別した。ゲルをリフォールディングバッファー（２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ［ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）］バッファー［ｐＨ６．８］、２．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２ｍＭジチオスレイトール、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２）中で室温で１時間インキュベートした後、新たなリフォールディングバッファー中で４℃で終夜維持した。ゲルをＰＩＰＥＳバッファーに移し、３７℃でインキュベートし、０．２５％コンゴーレッド中で染色した。算出質量は、ｋＤａ単位で左側に示してある。異なるグルカナーゼが、使用した異なる植物材料または炭水化物源の存在下で発現した。
【００４２】
グルコースおよび細胞壁高分子での増殖中におけるセルロース分解酵素の発現が、決定された（図３）。Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓをグルコースで、０．３〜０．４のＯＤ６００まで培養し、回収し、表示した基質を含有する同容量の培地へ移した。１０時間後に、ＲＮＡ ＰＲＯＴＥＣＴ（商標）細菌試薬（Ｑｉａｇｅｎ）およびＲＮＥＡＳＹ（商標）ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＲＮＡを単離した。ＱＩＡＮＴＩＴＥＣＴ（商標）逆転写キットを用いて、ｃＤＮＡを合成した。各表示遺伝子、またはグアニル酸キナーゼおよびジヒドロ葉酸レダクターゼの対照遺伝子２種の１２０〜２００ｂｐ断片を、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（商標）マスターミックスキット（Ｒｏｃｈｅ）およびＬＩＧＨＴ ＣＹＣＬＥＲ（商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ）を用いて増幅した。その上に数字で示した棒は、縮尺１／１０で提示してある。異なるセルロース分解酵素が、異なる植物材料または炭水化物源によって誘導された。
【００４３】
（実施例２）キシランでのＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓの増殖に応答した、Ｘｙｎ１０Ａ、Ｘｙｎ１０Ｂ、Ｘｙｎ１１ＡおよびＸｙｎ１１Ｂの発現増加の測定
６種の標的遺伝子：ｘｙｎ１０Ａ〜Ｄおよびｘｙｎ１１Ａ〜Ｂに対して、２種のハウスキーピング遺伝子：ジヒドロ葉酸レダクターゼおよびグアニル酸キナーゼと共に、プライマーを設計した。Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓをグルコース培地中で、ＯＤ６００が０．３７０〜０．４００になるまで培養した。０時間時点を取り、培養物を１０時間の経時実験のためにキシラン培地へ移した。第２の培養物は、対照としてグルコースへ再び移した。試料は、キシラン、グルコース双方の培養物から０、２、４および１０時間に採取した。
【００４４】
各試料のＲＮＡは、ＲＮＡｐｒｏｔｅｃｔ（商標）細菌試薬（Ｑｉａｇｅｎ）およびＲｎｅａｓｙ ＭｉｎｉＫｉｔを用いて精製した。単離したｍＲＮＡは、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｈ（商標）逆転写酵素を用いて変換し、発現パターンは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｐｒｏ（商標）ｐＲＴ−ＰＣＲを用いて分析した。
【００４５】
図６に示すように、ｘｙｎ１０Ａ、ｘｙｎ１０Ｂ、ｘｙｎ１０Ｄ、ｘｙｎ１１Ａおよびｘｙｎ１１Ｂは全て、キシランに曝してから２、４および１０時間後に、より大きいｍＲＮＡ発現を示した。この増加は、ｘｙｎ１０Ａ、ｘｙｎ１０Ｂ、ｘｙｎ１１Ａおよびｘｙｎ１１Ｂの場合に最大であった。図７に示すように、キシランでのＳ．ｄｅｇｒａｄａｎｓの培養２時間におけるｍＲＮＡ発現の最高倍率誘導は、ｘｙｎ１１Ａおよびｘｙｎ１１Ｂの場合であった。ｘｙｎ１０Ａは、４時間で最高の誘導を受けた。１０時間では、ｘｙｎ１０Ａ、ｘｙｎ１０Ｂ、ｘｙｎ１１Ａおよびｘｙｎ１１Ｂは全て、より高い倍率誘導を受けた。
【００４６】
Ｓ．ｄｅｇｒａｄａｎｓが、キシランに曝した際にこれらのタンパク質の発現を増加させるため、また、既知のヘミセルラーゼ遺伝子に対して、これらのタンパク質が示す配列相同性のために、Ｘｙｎ１０Ａ、Ｘｙｎ１０Ｂ、Ｘｙｎ１０Ｄ、Ｘｙｎ１１ＡおよびＸｙｎ１１Ｂは、ヘミセルロースの分解に使用できる機能性ヘミセルラーゼである。
等価物および参照による組込み
当業者であれば、本明細書に記載の特定のポリペプチド、核酸、方法、アッセイおよび試薬に関する夥しい等価物を認識され、または単なる常套的実験を用いて該等価物を確かめることができよう。このような等価物は、本発明の範囲内にあると見なされ、以下の特許請求の範囲に包含される。
【００４７】
本出願は、学術的な教科書、公表論文および特許出願、ならびに交付された米国および外国特許に対する夥しい引用を含む。こうした引用文献全ての完全な内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃｅｌ５ＨおよびＣｅｌ５Ｉを含む組成物。
【請求項２】
Ｃｅｌ５ＨおよびＣｅｌ５Ｆを含む組成物。
【請求項３】
Ｃｅｌ５Ｆ、Ｃｅｌ５Ｈ、Ｃｅｌ５Ｉ、Ｃｅｐ９４ＡおよびＣｅｐ９４Ｂを含む組成物。
【請求項４】
Ｃｅｌ６Ａ、Ｂｇｌ３ＣおよびＣｅｌ９Ｂを更に含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
Ｃｅｌ５Ａ、Ｃｅｌ５Ｂ、Ｃｅｌ５Ｃ、Ｃｅｌ５Ｄ、Ｃｅｌ５Ｅ、Ｃｅｌ５Ｇ、Ｃｅｌ５Ｊ、Ｃｅｌ９Ａ、Ｂｇｌ１Ａ、Ｂｇｌ１Ｂ、Ｃｅｄ３ＡおよびＣｅｄ３Ｂを更に含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
酵母を更に含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
Ｃｅｌ５Ｅ、Ｃｅｌ５Ｉ、Ｃｅｌ９Ａ、Ｂｇｌ１ＡおよびＣｅｄ３Ｂを含む組成物。
【請求項８】
Ｃｅｌ５Ｂ、Ｃｅｐ９４ＡおよびＣｅｐ９４Ｂを更に含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
酵母を更に含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
Ｃｅｌ５Ｆ、Ｃｅｌ９Ａ、Ｂｇｌ１ＡおよびＣｅｄ３Ｂを含む組成物。
【請求項１１】
Ｃｅｌ５Ｂ、Ｃｅｌ５Ｅ、Ｃｅｌ５Ｉ、Ｂｇｌ１Ｂ、Ｂｇｌ３Ｃ、Ｃｅｐ９４ＡおよびＣｅｐｐ９４Ｂを更に含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
酵母を更に含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
Ｃｅｌ５Ｉ、Ｂｇｌ１Ａ、Ｂｇｌ１Ｂ、Ｃｅｄ３ＢおよびＣｅｐ９４Ｂを含む組成物。
【請求項１４】
Ｃｅｌ５Ａ、Ｃｅｌ５Ｇ、Ｃｅｌ９Ａ、Ｂｇｌ３ＣおよびＣｅｐ９４Ａを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
酵母を更に含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
Ｃｅｌ５Ｅ、Ｃｅｌ５Ｆ、Ｃｅｌ５Ｈ、Ｃｅｌ６ＡおよびＣｅｌ９Ｂを含む組成物。
【請求項１７】
Ｃｅｌ５Ｉ、Ｂｇｌ３ＣおよびＣｅｐ９４Ａを更に含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
Ｃｅｌ５Ｃ、Ｃｅｌ５ＤおよびＣｅｄ３Ａを更に含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
酵母を更に含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
Ｘｙｎ１０ａ、Ｘｙｎ１０ｂおよびＸｙｎ１１ａを含む組成物。
【請求項２１】
Ｘｙｎ１０ＤおよびＸｙｎ１１Ｂを更に含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株、１種または複数の植物材料、および酵母を水性混合物中に提供し、それによりエタノールを生成することを含む、エタノールを製造する方法。
【請求項２３】
前記水性混合物が少なくとも１％の塩を更に含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記水性混合物が多くとも１０％の塩を更に含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株、および１種または複数の植物材料を水性混合物中に提供し、それにより糖を生成することを含む、糖を製造するための方法。
【請求項２６】
前記水性混合物が少なくとも１％の塩を更に含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記水性混合物が多くとも１０％の塩を更に含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
植物材料からエタノールを製造する方法であって、該方法は：
ａ．Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株を提供するステップ、
ｂ．該植物材料の第１の部分において該Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株を増殖させるステップ、
ｃ．Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株からタンパク質を回収するステップ、ならびに
ｄ．該タンパク質を該植物材料の第２の部分および酵母と水性混合物中で混合するステップ
を含み、それによりエタノールを生成する、方法。
【請求項２９】
前記水性混合物が少なくとも１％の塩を更に含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記水性混合物が多くとも１０％の塩を更に含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株を、前記植物材料の第１の部分において約０．３〜約０．５のＯＤ６００に達するまで増殖させる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株を、前記植物材料の第１の部分において約５〜約１０のＯＤ６００に達するまで増殖させる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
植物材料から糖を製造する方法であって、該方法は：
ａ．Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株を提供するステップ、
ｂ．該植物材料の第１の部分において該Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株を増殖させるステップ、
ｃ．Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株からタンパク質を回収するステップ、および
ｄ．該タンパク質を該植物の第２の部分と水性混合物中で混合するステップ
を含み、それにより糖を生成する、方法。
【請求項３４】
前記水性混合物が少なくとも１％の塩を更に含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記水性混合物が多くとも１０％の塩を更に含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株を、約０．３〜約０．５のＯＤ６００に達するまで増殖させる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株を、前記植物材料の第１の部分において約５〜約１０のＯＤ６００に達するまで増殖させる、請求項３３に記載の方法。
【請求項１】
Ｃｅｌ５ＨおよびＣｅｌ５Ｉを含む組成物。
【請求項２】
Ｃｅｌ５ＨおよびＣｅｌ５Ｆを含む組成物。
【請求項３】
Ｃｅｌ５Ｆ、Ｃｅｌ５Ｈ、Ｃｅｌ５Ｉ、Ｃｅｐ９４ＡおよびＣｅｐ９４Ｂを含む組成物。
【請求項４】
Ｃｅｌ６Ａ、Ｂｇｌ３ＣおよびＣｅｌ９Ｂを更に含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
Ｃｅｌ５Ａ、Ｃｅｌ５Ｂ、Ｃｅｌ５Ｃ、Ｃｅｌ５Ｄ、Ｃｅｌ５Ｅ、Ｃｅｌ５Ｇ、Ｃｅｌ５Ｊ、Ｃｅｌ９Ａ、Ｂｇｌ１Ａ、Ｂｇｌ１Ｂ、Ｃｅｄ３ＡおよびＣｅｄ３Ｂを更に含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
酵母を更に含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
Ｃｅｌ５Ｅ、Ｃｅｌ５Ｉ、Ｃｅｌ９Ａ、Ｂｇｌ１ＡおよびＣｅｄ３Ｂを含む組成物。
【請求項８】
Ｃｅｌ５Ｂ、Ｃｅｐ９４ＡおよびＣｅｐ９４Ｂを更に含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
酵母を更に含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
Ｃｅｌ５Ｆ、Ｃｅｌ９Ａ、Ｂｇｌ１ＡおよびＣｅｄ３Ｂを含む組成物。
【請求項１１】
Ｃｅｌ５Ｂ、Ｃｅｌ５Ｅ、Ｃｅｌ５Ｉ、Ｂｇｌ１Ｂ、Ｂｇｌ３Ｃ、Ｃｅｐ９４ＡおよびＣｅｐｐ９４Ｂを更に含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
酵母を更に含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
Ｃｅｌ５Ｉ、Ｂｇｌ１Ａ、Ｂｇｌ１Ｂ、Ｃｅｄ３ＢおよびＣｅｐ９４Ｂを含む組成物。
【請求項１４】
Ｃｅｌ５Ａ、Ｃｅｌ５Ｇ、Ｃｅｌ９Ａ、Ｂｇｌ３ＣおよびＣｅｐ９４Ａを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
酵母を更に含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
Ｃｅｌ５Ｅ、Ｃｅｌ５Ｆ、Ｃｅｌ５Ｈ、Ｃｅｌ６ＡおよびＣｅｌ９Ｂを含む組成物。
【請求項１７】
Ｃｅｌ５Ｉ、Ｂｇｌ３ＣおよびＣｅｐ９４Ａを更に含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
Ｃｅｌ５Ｃ、Ｃｅｌ５ＤおよびＣｅｄ３Ａを更に含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
酵母を更に含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
Ｘｙｎ１０ａ、Ｘｙｎ１０ｂおよびＸｙｎ１１ａを含む組成物。
【請求項２１】
Ｘｙｎ１０ＤおよびＸｙｎ１１Ｂを更に含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株、１種または複数の植物材料、および酵母を水性混合物中に提供し、それによりエタノールを生成することを含む、エタノールを製造する方法。
【請求項２３】
前記水性混合物が少なくとも１％の塩を更に含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記水性混合物が多くとも１０％の塩を更に含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株、および１種または複数の植物材料を水性混合物中に提供し、それにより糖を生成することを含む、糖を製造するための方法。
【請求項２６】
前記水性混合物が少なくとも１％の塩を更に含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記水性混合物が多くとも１０％の塩を更に含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
植物材料からエタノールを製造する方法であって、該方法は：
ａ．Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株を提供するステップ、
ｂ．該植物材料の第１の部分において該Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株を増殖させるステップ、
ｃ．Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株からタンパク質を回収するステップ、ならびに
ｄ．該タンパク質を該植物材料の第２の部分および酵母と水性混合物中で混合するステップ
を含み、それによりエタノールを生成する、方法。
【請求項２９】
前記水性混合物が少なくとも１％の塩を更に含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記水性混合物が多くとも１０％の塩を更に含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株を、前記植物材料の第１の部分において約０．３〜約０．５のＯＤ６００に達するまで増殖させる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株を、前記植物材料の第１の部分において約５〜約１０のＯＤ６００に達するまで増殖させる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
植物材料から糖を製造する方法であって、該方法は：
ａ．Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株を提供するステップ、
ｂ．該植物材料の第１の部分において該Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株を増殖させるステップ、
ｃ．Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株からタンパク質を回収するステップ、および
ｄ．該タンパク質を該植物の第２の部分と水性混合物中で混合するステップ
を含み、それにより糖を生成する、方法。
【請求項３４】
前記水性混合物が少なくとも１％の塩を更に含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記水性混合物が多くとも１０％の塩を更に含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株を、約０．３〜約０．５のＯＤ６００に達するまで増殖させる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ２−４０株を、前記植物材料の第１の部分において約５〜約１０のＯＤ６００に達するまで増殖させる、請求項３３に記載の方法。
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図６】
【図７】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１０−５２５８１５（Ｐ２０１０−５２５８１５Ａ）
【公表日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０６３０８（Ｐ２０１０−５０６３０８）
【出願日】平成２０年４月３０日（２００８．４．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００５５５９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３６９９７
【国際公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【出願人】（５０９３０３３４９）ユニバーシティー オブ メリーランド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月３０日（２００８．４．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００５５５９
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３６９９７
【国際公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【出願人】（５０９３０３３４９）ユニバーシティー オブ メリーランド (2)
【Ｆターム（参考）】
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