ＳｅａｋｅｍＧｏｌｄアガロースを含む分泌細胞含有マクロビーズ、及びその利用方法
本発明は、アガロースによって被覆された分泌細胞含有ビーズ構造物の製造方法と利用方法とについて記載する。好ましくはその直径が４ｍｍ〜１２ｍｍであり、好ましくは膵島を含有する前記ビーズは、特定のアガロース、すなわち、Seakem Goldアガロースから形成される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、ここにそれらの全体を参考文献として合体させる２００４年１１月１７日出願の仮出願第６０／６２９，２７７号と、２００５年９月２６日出願の仮出願第６０／７２０，９１７号との優先権を主張するものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は、アガロースによって被覆された分泌細胞含有アガロースマクロビーズの質と量を改善するための方法に関する。これは下記のSeakem Goldアガロースの使用によって達成される。
【背景技術】
【０００３】
今日、膵島補充療法が種々の障害を有する患者の治療のために有効なアプローチであることが確立している。これらには、上腹部摘出を受けるガン患者（ツァキス（Tzakis）ほか，Lancet 336: 402-405(1990)）；膵炎（クレイトン（Clayton）ほか，Transplantation 76: 92-98 (2003)；ファーニー（Farney）ほか，Surgery 110: 427-437 (1991)；フォンテス（Fontes）ほか，Transplant Proc 24: 2809 (1992)；オーベンホルツァー（Obenholzer）ほか，Transplantation 69: 1115-1123 (2000)；ロバートソン（Robertson）ほか，Diabetes 50: 47-50 (2001)），および、膵島移植が治療オプションであるインスリン依存患者（ゴス（Goss）ほか，Transplantation 74: 1761-1766 (2002)；リコルディ（Ricordi）ほか，Transplantation 75: 1524-1527 (2003)；リャン（Ryan）ほか，Diabetes 50: 710-719 (2001)；シャピロ（Shapiro）ほか，N. Engl. J. Med 343; 230-238 (2000)、が含まれる。
【０００４】
上述したように、治療における膵島の有用性により、勿論、それらを単離する方法の開発が注目されている。自動化方法を使用する単離について多くの報告があるが（ブランドホースト（Brandhorst）ほか，Exp. Clin, Endocrinol Diabetes 103 Suppl. 2: 3〜14 (1995)，クイ（Cui）ほか，Cell Transplant 6: 48-54 (2001)；マルケッティ（Marchetti）ほか，Transplantation 52: 209-213 (1991)；ミヤモト（Miyamoto）ほか，Cell Transplant 7: 397-402 (1998)；ニールセン（Nielsen）ほか，Comp. Med. 52: 127-135 (2002)；スワンソン（Swanson）ほか，Hum. Immunnol62: 739-749 (2001)；トゥーミー（Toomey）ほか，Brit. J. Surg. 80: 240-243 (1993)；トソ（Toso）ほか，Cell Transplant 9: 297-305 (2000)；ウェンバーグ（Wennberg）ほか，Transplant, Proc. 33: 2537 (2001))，膵島の単離が困難であることはいまだに悪名高い。例えば、ボスタ（Bosta）ほか，J. Investig Med 43: 555-566 (1995)；クリックハーン（Krickhahn）ほか，Cell Transplant 11: 827-838 (2002)；クリックハーン（Krickhahn）ほか，Ann Transplant 6: 48-54 (2001)，オニール（O’Neil）ほか，Cell Transplant 10: 235-246 (2001)およびホワイト（White）ほか，Horm. Metab, Res31: 579-524 (1991)これらはすべてこれに関する問題について記載している。
【０００５】
分泌細胞および／又は細胞小器官、例えば、ガン細胞、膵島、など、を含むマクロビーズの製造は周知である。例えば、米国特許第６，８１８，２３０；６，８０８，７０５；ＲＥ ３８，０２７；６，３０３，１５１；６，２２４，９１２；５，８８８，４９７および５，６４３，５６９号、更に、米国特許出願公開第２００５／００９６５６１号、を参照。ここに、これらの全てを参考文献として合体させる。
【０００６】
アガロースは、これら特許文献において生物材料をカプセル化するために使用され、その後、それによって得られた構造物を第２のアガロース層で更にカプセル化している。
【０００７】
アガロースに関する当業者には、この利用可能な材料に様々なタイプ及び多様性があることが認識されるであろう。そのようなアガロースの一つのタイプであるSeakem Goldアガロースは、ここにその開示内容を参考文献として合体させる米国特許第４，９８３，２６８号に記載されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述した特許および出願に最初に記載された材料の改良版を得ることが必要とされ続けている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
今般、Seakem Goldアガロースによって、従来技術の製品よりも予想外に優れた製品が得られることが見出された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の詳細について以下の開示に説明する。
【００１１】
図面の簡単な説明
図１はテストおよび対照動物の平均の１日の血糖値に関する情報を示している。
【００１２】
ここでの使用において、「マクロビーズ」という用語は、直径が約４ｍｍから約１０〜１２ｍｍ、最も好ましくは直径が約６ｍｍから約８ｍｍである実質的に球形である構造物をいう。前記第２アガロース層の厚みは、好ましくは、約０．０５ｍｍ〜約５ｍｍ、より好ましくは約０．５ｍｍ〜約５ｍｍ、更に好ましくは約１．０ｍｍ〜３ｍｍ、そして最も好ましくは約１．０ｍｍ〜２．０ｍｍである。第２アガロース層は、Seakem Goldアガロースとすることができるが、必ずしもSeakem Goldアガロースにする必要はない。
【００１３】
「マクロビーズ」は、好適な構造物として使用されるが、分泌細胞をカプセル化し、そして、好ましくは、第２のアガロース層によって被覆された任意の固体のアガロース構造物が本発明の特徴である。
【００１４】
前記分泌細胞は様々なものとすることができる。所望の分泌産物を産生する任意の細胞又は細胞小器官をカプセル化することができる。そのように使用可能な材料の例として、膵島、ガン細胞、幹細胞がある。各ビーズは、様々な数の細胞小器官を含むことができ、例えば、膵島の場合、約５０〜約５０００個の膵島、好ましくは、約１００〜約２５００個の膵島、更に好ましくは、約２５０〜約１０００個、そして最も好ましくは約４７５〜約５５０個の膵島を含むことができる。約５００個の膵島が特に好適である。
【実施例】
【００１５】
例１
ここにその全部を参考文献として合体させる、２００６年６月８日に第１１／２７３，７３７号として公開された、ガズダ（Gazda）ほかの特許出願公開第２００６／０１２１４４５号に記載の方法に従って、膵島を単離した。ただし、本発明はこの特定の単離方法に依存するものではないので、膵島の単離のためにその他の方法も可能であり、それらを使用してもよいことが銘記される。
【００１６】
単離と評価の後、適当な膵臓を更に処理した。前記腺から脂肪と結合組織とを除去し、その後、主膵管に、１６ｇのステンレス鋼、鈍端ニードルをカニューレ挿入した。コラゲナーゼＰを１．５〜２．０ｇ／ｌの濃度で含有するＨＢＳＳの溶液を、５０ｍｌ／ｍｍの速度で、３０℃で潅流して、膵臓重量ｇあたり２ｍｌの溶液を作製した。
【００１７】
その後、前記膵臓を、３０℃で、２００ｍｌのコラゲナーゼ溶液と共に、５００ｍｌのＨＢＳＳと２％のＰＳで被覆した。３９℃の水をゆっくりと外部循環させることによって前記器官を３７℃まで暖め、３６〜３７℃の消化温度（digestatetemperature）に維持した。前記器官が解離されたように見え、手による圧力に対してほとんど抵抗を示さないようになった時（約１０〜２０分間の総時間後で３７℃に達してから５〜１０分間）、消化を停止した。
【００１８】
次に、収集された消化物を遠心分離にかけて、上清を吸引し、それによって得られたペレットを１０％ＰＳと器官保存溶液中に懸濁させた。その後、膵島を、５０ｍｌの試験管中にて２％ＰＳを添加したＨＢＳＳで、１．１０５，１，０９５，１．０８５および１．０５ｇ／ｃｍ３の濃度勾配で、不連続フィコールによって精製した。前記試験管を４℃にて６５０ｇで遠心分離にかけ、膵島含有層を収集し、１０％ＰＳ添加ＨＢＢＳ中で三回洗浄し、その後、それらを、解剖顕微鏡を使用して、非膵島組織について手作業で精製した。膵島を再懸濁し、膵島収率の算出のために二つの０．５ｍｌのサンプルを使用した。
【００１９】
テストした１０の膵臓の平均収率は、１３０，０００ＥＩＮであり、消化組織１グラム当たり１，１０１ＥＩＮの平均値であった。純度は全てのケースにおいて９０％以上であった。前記器官の９個について、膵島生存率は８９％以上であった。
【００２０】
例２
上記で暗示したように、膵島の単離後、純度、生存率を含む様々なパラメーターを測定した。
【００２１】
純度は、約５００のＥＩＮをＤＴＺで１０分間染色することによって評価し、その後、解剖顕微鏡とデジタルカメラとを用いて、標準的な画像分析を行った。
【００２２】
生存率は、フルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）とエチジウムブロマイド（ＥＢ）とでサンプルを染色することによって測定した。詳述すると、約５００のＥＩＮを１ｍｌのＲＰＭＩ、１０％ＰＳと１％の抗生剤／抗菌剤（antimyotic）（Ａ／Ａ）に添加した。次に、１０ｍｇのＦＤＡと１ｍのアセトンとで予め作製しておいた２０μｌのＦＤＡ染色液と、３０μｌのＥＢと１ｍｌのＰＢＳとで予め作製しておいた２００μｌのＥＢとを添加した。膵島を暗所で７分間染色し、次に、１０〜５０の膵島のランダムサンプルを、蛍光顕微鏡で観察し、写真撮影して、標準画像分析を使用して生存率を測定した。
【００２３】
前記膵島のインスリン含有量も、約５００のＥＩＮを酸アルコール抽出溶液（７．２ｍｌのＩＮ ＨＣｌ，４００ｍｌの１００％変性エタノール）中に置くことによって測定した。サンプルを−２０℃で保存し、インスリンＲＩＡを行った。
【００２４】
【表１】
【００２５】
例３
この例と、これ以降の例とは、上述したようにして有用であるとして同定され単離された膵島がマクロビーズに使用可能であるか否かという問題を扱うものである。
【００２６】
精製した膵島を、ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＰＳ＋１％ Ａ／Ａ中で、２０００ＥＩＮ／ｍｌの量にまで再懸濁した。各試験管が２０００ＥＩＮで１ｍｌの懸濁物を含むように、膵島は試験管に均質に分けられた。
【００２７】
重力による沈殿後、上清を除去し、２．５％ ＨＥＰＥＳ緩衝液を添加した最小必須培地中で５０℃にて調製した１．５％ Seakem Goldアガロース０．５ｍｌを各サンプルに添加し均一に混合した。次に、前記懸濁物を無菌ミネラルオイルの下方に排出し、スムースな表面と等しい膵島分布を有する４つのビーズを作った。
【００２８】
マクロビーズを取り出し、二回洗浄（ＲＰＭＩ＋５％ＰＳ＋１％ Ａ／Ａ）した。これらのマクロビーズを同じ溶液中で、加湿５％ＣＯ２雰囲気中で、５〜７日間培養し、その後、それらをＲＰＭＩ＋１％ Ａ／Ａ中で三回洗浄し、その後、第２のアガロースコーティングの塗布を行った。このために、６０℃で、ＨＥＰＥＳ緩衝液を添加した最小必須培地中５％のアガロース０．５ｍｌを、ピペットを介して、無菌プラスチックスプーンに移し、各マクロビーズを３〜５回ローリングして均質な第２アガロースコーティングを作製した。無菌ミネラルオイルに移してスムースな表面を作製した後、マクロビーズを取り出し、ＲＰＭＩ＋２．５％ＰＳ＋１％ Ａ／Ａ中で二回洗浄し、加湿した５％ＣＯ２と空気中で３７℃にてインキュベートした。勿論、ビーズ製造のためのその他の方法を使用することも可能である。
【００２９】
カプセル化膵島を含むマクロビーズを測定したところ６ヶ月間以上に渡って生存し続け、その期間中、ラジオイムノアッセイはそれらが良好なレベルのインスリンを産生し続けたことを示した。
【００３０】
例４
この例は、ブタ膵島がイン・ヴィヴォで作用する能力を証明する実験について記載するものである。
【００３１】
オスの非肥満糖尿病ＣＢ１７−ＰｒＫｄｃ＜ｓｃｉｄ＞Ｊマウス、７〜９週齢を使用した。１週間の順化後、前記動物に２７５ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシンを与えた。これは糖尿病を誘発するものである。９日間後、それらの血糖値が平均で４８０ｍｇ／ｄｌを超えたときに、それらのインスリン療法を開始した。
【００３２】
ストレプトゾトシン投与後の３４〜３５日目、前記動物に約１０００ＥＩＮのブタ膵島を与え、これらは、ここに参考文献として合体させるボーウェン（Bowen）ほか，Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci, 58:441-447（1980）に従って、血液に移植された。簡単に説明すると、膵島を懸濁液からペレット化し、培地を吸引した。次に、約５〜１０μｌの血液を前記動物から採取し、前記膵島に添加し、凝固させた。前記移植動物を等量のケタミン（１６７ｍｇ／ｄｌ）、キシラジン（３３ｍｇ／ｍｌ）と生理食塩水で麻酔した。前記混合物を０．５ｍｌ／１００ｇの投与量で皮下投与した。左脇腹に小さな切開を形成し腎臓を露出させ、解剖顕微鏡を使用して、腎臓の嚢（capsule）に小さな切開を形成した。次に、前記嚢を腎臓から分離し、前記膵島／血栓をカプセルの下に置き、前記切開を閉じ、動物を回復させた。
【００３３】
前記移植後の３８〜３９日目に、前記動物に対して腎摘出を行った。簡単に説明すると、麻酔後、移植片を有する腎臓を露出させ腎血管を結刹し、各動物の腎臓を取り出した。５日後、動物を屠殺し、完全な膵島ベータ細胞破壊の組織学的確認のために膵臓を収集した。
【００３４】
組織サンプルを１０％中性緩衝製剤中に２４時間載置し、次に、７０％エチルアルコールに移した。
【００３５】
この後、前記組織をパラフィンに包埋して５μｍの切片をヘマトキシリンとエオシンで染色した。膵臓および移植腎臓切片を、標準方法を使用して、インスリンおよびグルカゴン含有細胞を染色し、その後、それらを調べた。
【００３６】
前記マウスの全てが、膵島移植後に正常血糖になった。腎摘出後、全てのマウスが、４日間以内に高血糖になった。
【００３７】
例５
この例は、異なるアガロースから製造されたアガロース−アガロース被覆ビーズが、移植動物においてどの程度、組織反応、すなわち、炎症、を引き起こすか、を測定するように構成された実験を記載するものである。
【００３８】
二系統のラット、すなわち、Wistar系およびSprague Dawley系ラット、を使用した。全部で２９匹のラットをテストした（Wistar系１４匹、Sprangue Dawley系１５匹）。各系統の３匹のラットを使用して、本発明のSeakem Goldアガロース−アガロース被覆ビーズをテストした。各系統の３匹のラットを使用してアガロースタイプFMC HGT(P)及びAmrescoをテストした。２匹のWistar系ラットを使用してSigma HVアガロースをテストし、４匹のSprangue Dawley系ラットも同様に使用した。最後に、３匹のWistar系ラットを使用してSigma LVアガロースビーズをテストし、２匹のSprangeuDawley系ラットも同様に使用した。
【００３９】
２匹の例外を除いて、各タイプの全部で６０個の空ビーズを前記ラットの腹腔に移植した。２匹のSprague Dawley系ラットには、５４又は５９のSigma HVアガロースビーズを与えた。前記ラットを３ヶ月間観察し、その後、屠殺した。様々な器官を取り出して炎症（脾臓、肝臓、腎臓、骨格筋、膵臓および腸間膜）を調べた。
【００４０】
組織を、American College of Veterinary Pathologyによって認可されている基準を使用した炎症によって評価した。評価には、実質的には以下のように、炎症を評価するために６ポイントスケールを使用した。
【００４１】
０＝正常
１＝最小（１０％以下の炎症）
２＝軽度（１０〜２５％の炎症）
３＝中度（２５〜５０％の炎症）
４＝強度（５０〜７５％の炎症）
５＝重度（７５％以上の炎症）
【００４２】
各動物の前記組織を評価し、その後、平均化した。その結果を下に示す。
【００４３】
【表２】
【００４４】
【表３】
【００４５】
【表４】
【００４６】
本発明のアガロース−アガロース被覆ビーズが最も炎症性が低いことは明白であった。
【００４７】
本発明のビーズをFMC HGT(P)アガロース（FMC HGTPアガロース)から成り、それによって被覆されたビーズと比較する、犬に対する追加の炎症研究を行った。ここでも、本発明のアガロース−アガロース被覆ビーズが最も炎症性が低かった。
【００４８】
更なる研究において、犬に、ブタ膵島を含有する本発明のアガロース−アガロース被覆ビーズを与えた。これらの動物を２．５年間後に屠殺したが、最小限の炎症しか観察されなかった。非移植対照動物との比較において、腹膜と腸間膜は顕著に正常な外観であった。
【００４９】
例６
これらの実験において、イン・ヴィトロで培養された膵島含有Seakem Goldアガロースマクロビーズが、対照(空)のマクロビーズと比較された。
【００５０】
Seakem Goldアガロースにカプセル化された膵島を、例３において前述したように調製した。
【００５１】
自然発生的に糖尿性である１２匹のオスＢＢラットを被験動物として使用した。全ての動物は１０〜１５週齢であり、３〜１６日間にわたって臨床的に糖尿性であることが示されていたものである。
【００５２】
２０〜２１日間の生存後、前記ＢＢラットを、ケタミン／キシラジン／ＮａＣｌを２．２〜２．３ｍｌ／ｋｇ体重の投与量で皮下投与することによって麻酔した。麻酔後、前記動物に、１日あたりのインスリン必要量の１．０倍に等しい投与量の膵島含有マクロビーズのインプラント、又は、同量の空マクロビーズ、のいずれかを与えた。
【００５３】
移植後、前記動物を観察し、一般的状態（良好、良、又は不良）、体重、血糖、尿糖、尿ケトン、を含む臨床知見を毎日記録した。研究を通して血清サンプルを収集して、インスリン、グルカゴン、ブタＣペプチド、の測定に使用した。ラジオイムノアッセイを使用してこれらのパラメーターを測定した。腹腔内耐糖性テストも行った。
【００５４】
移植の９７日間後、前記動物に対して完全検視（complete necroscopies）を行った。動物を麻酔し、放血し腹腔を露出させた。
【００５５】
研究の９７日の期間全体を通して、膵島含有Seakem Goldアガロースビーズを投与されていた６匹の動物はインスリンの投与を必要としなかった。これは空のマクロビーズを投与された動物と対照的である。これら動物には、血糖値が３００〜５００ｍｇ／ｄｌにまで上昇したので、研究開始後２日間から始めて外因性インスリンを投与された。これらの対照動物のうちの２匹は、おそらくインスリン欠損のために、研究の３日目に死んでいた。
【００５６】
対照と比較して、膵島含有Seakem Goldアガロースビーズを投与された動物において平均日間血糖値は遥かに低かった。又、前記６匹のテスト動物は、インスリン療法無しでも、非常に狭い範囲の日間血糖変化しか示さなかった。
【００５７】
１ヶ月後、前記膵島を投与されたこれらの動物は中度の高血糖になったが、限られた血糖変動（約１００ｍｇ／ｄｌ）しか示さなかった。これは、２〜３Ｕ／日の外因性インスリンを投与したにもかかわらず約４００〜５００ｍｇ／ｄｌの極端な変化を示した対照と対照的である。
【００５８】
Ｉ型糖尿病の臨床診断を確認するために、全ての動物に対して最初、腹腔内耐糖性テストを行った。このテストは、移植の８および９０日後にも行われた。移植の５日間前、グルコースチャレンジ（challenge）に対する反応は明白ではなかったが、移植後８日目に、膵島含有マクロビーズのレシピエントはグルコースチャレンジに対する顕著な反応、すなわち、血糖の初期上昇と、その後の、正常血糖値への復帰、を示した。上述したように同時にインスリン療法を行ったにもかかわらず、前記空マクロビーズを投与された動物においても高血糖は抑制されなかった。
【００５９】
移植の９０日間後、もう一つの腹腔内耐糖性テストを行った。前記膵島マクロビーズを投与されたラットについて再びベースライン血糖値を再度確立したが、出発血糖値ははるかに高いものであった、すなわち、それは約４００ｍ／ｄｌであった。空マクロビーズを投与されたラットはベースライン血糖値を再度確立することができなかった。
【００６０】
ブタＣ−ペプチドについてのアッセイでは、移植前の動物における研究においても、又、空マクロビーズレシピエントからもペプチドは検出されなかった。これに対して、膵島マクロビーズを移植されたラットの血清中では、移植の２１日間後での０．８８０ ０．２４９ｎｇ／ｍｌから研究の終了時での０．６６２ ０．１６０ｎｇ／ｄｌまでの平均レベルでペプチドがルーチン的に検出された。
【００６１】
研究動物は、更に、糖尿、ケトン尿症、および炭酸水素塩投与の必要性、に関してもテストされた。移植前には有意な差は無かったが、この後、膵島マクロビーズレシピエントでは糖尿（８１中の６７に対して５６のサンプル中の３７）とケトン尿症（５４中の３２に対して６４のサンプル中２０）との発症が遥かに少なかった。炭酸水素塩療法の必要性も大幅に低下した（２６に対して２の処置）。
【００６２】
例７
以下の実験は、膵島をカプセル化するSeakem Goldアガロースが、長期間にわたってイン・ヴィトロで培養することが可能であり、それでも機能を維持することを示すものである。
【００６３】
これらの実験において、上述した例６のラットと同じ基準を満たす１２匹の糖尿病ＢＢラットの組を使用し、２３匹のWistar-Furth系ラット、７週齢も使用した。この第２群のラットは正常対照として作用した。
【００６４】
これらのWistar-Furth系ラットのうちの５匹に、その尾静脈を介して、６５ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシンを投与して糖尿病を誘発させた。二つの連続血糖読み取り値＞５００ｍ／ｄｌが観察された時、ラットは、後述するようにしてインスリン療法を受け始めた。
【００６５】
０．１ｍｌ／１００ｇのケタミン／（６０ｍｇ／ｍｌ），キシラジン（６ｍｇ／ｍｌ），／ブタルフェノール（３ｍｇ／ｍｌ）投与量の筋肉内投与を使用して、到着後２０〜２１日で動物を麻酔した。
【００６６】
麻酔後、全てのＢＢラットに、上述したようにして、膵島を含有するSeakem Goldアガロースビーズを与えた。これらラットを４匹の３つの組に分け、９週間、４０週間又は６７週間、イン・ヴィトロで培養したマクロビーズを与えた。投与したマクロビーズの量は、動物の１日のインスリン必要量の１．０倍に等しいものとした。
【００６７】
前記Wistar-Furth系ラットのうちの５匹には、イン・ヴィトロで７．８〜１１．５週間培養したマクロビーズを、前記ＢＢラットと同じ投与量、投与した。これはWistar-Furth系ラット１匹あたり約４５〜４９のマクロビーズ、ＢＢラット１匹あたり５６〜６０のマクロビーズである。
【００６８】
前記実験中、ラットは、平均で７５ｇ体重増加した。その結果、最初の移植の９７日目に、ＢＢラットに追加の移植を行った。ラットの平均の移植前インスリン必要量は０．００８３Ｕインスリン／ｇ体重であった。この値から、２４時間当たり３９．１９ｍＵのインスリンを作り出すために追加の１７個の膵島含有マクロビーズが必要であることが計算された。後述するように、第２の移植前に、各ラットから４個のビーズが取り除かれたので、１９週間培養された２１個のマクロビーズが投与された。Wistar-Furth系ラットには第２の移植を行わなかった。
【００６９】
ここでも、例７で行った種々のアッセイを、同じ方法を使用して行った。
【００７０】
移植の２０１〜２０２日目に、上述したようにして、完全検視を行った。
【００７１】
平均の１日あたりの糖値が図1に示されている。移植後、約１ヶ月で全てのＢＢラットにおいて正常血糖値（１００〜２００ｍｇ／ｄｌ）が回復した。この後、ＢＢラットにおいて中程度の高血糖値（２００〜４００ｍｇ／ｄｌ）が生じ、これは研究の残り期間を通して持続した。中程度の高血糖値と最大体重増加とは同時に起こった。体重が一定に留まったのに対して、糖値は研究の残り期間を通して３００〜４００ｍｇ／ｄｌの間で変動した。ビーズのイン・ヴィトロ培養時間の長さにかかわらず、膵島含有Seakem Goldアガロースマクロビーズを投与された前記３群のラット間では平均の１日の血糖値に差は無かった。
【００７２】
糖尿病が誘発された前記Wistar-Furth系ラットも、約１ヶ月、正常血糖値を示し、その後、中程度の高血糖値が観察された。
【００７３】
上述したように、研究に入って９７日間でＢＢラットに第２の移植が行われた。この第２の移植は１日の血糖値に影響を与えなかった。
【００７４】
ブタＣペプチドも分析され、３群のＢＢラット全てに検出された。実験の最初の８８日間の間、平均ブタＣペプチドレベルは０．６〜０．９ｎｇ／ｍから０．２〜０．４ｎｇ／ｍｌへと低下した。１１６日間後、前記第２移植の後、ペプチドレベルは、平均で０．３〜０．７ｎ／ｍｌへと増加し、検視において腹膜液で４０倍の増加が観察された。
【００７５】
膵島マクロビーズ移植を受けた全てのラットに対して、研究期間全体を通してグルコースチャレンジ処理が行われた。培養時間の異なるマクロビーズ間において、移植後のグルコースチャレンジに対して応答するマクロビーズの能力において差は観察されなかった。詳述すると、全てのＢＢラットの血糖値は、１００〜２００ｍｇ／ｄｌの初期値からおよそ二倍になった。ベースライン血糖への復帰は、１２匹の動物中１０匹において１２０分間以内に起こった。この応答は、正常なWistar−Furth系動物において観察されたものに類似したものであった。
【００７６】
全ての研究動物は確かに最終的には高血糖になったが、移植後１０５日目でのグルコースチャレンジは、血糖における初期上昇を示し、その後、ベースライン血糖値に戻った。移植後の２００日間において、グルコース投与後にベースライング血糖値においてわずかな増加があっただけで、その後、ベースライング血糖値に戻った。
【００７７】
これらの研究における結果は、前述のTransplantationにおけるジャイン（Jain）ほかの研究との比較において、そのアガロースがSeakem Goldである場合、膵島を含有するアガロースビーズが、ジャイン（Jain）ほかによって報告されたものよりも予想外に良好である、ということを示している。例えば、ジャイン（Jain）ほかの報告では２００日までに対象動物の４０％が死亡したのに対して、本発明のマクロビーズでの死亡率はゼロであった。更に、ここに達成された結果は、ジャイン（Jain）ほかによって報告されたものの半分の数のマクロビーズを使用して達成されたものである。更には、ここでは詳述を避ける結果において、検視後、回収されたマクロビーズのインスリンの産生レベルを測定したところ、それはジャイン（Jain）ほかによって報告されている検視後に回収されたマクロビーズのレベルよりも遥かに高いものであった。
【００７８】
例８
本発明のビーズの強度を、ＦＭＣ ＨＧＴ（Ｐ）アガロースから形成され、それによって被覆されたビーズと比較するための実験を行った。
【００７９】
これらのテストにおいて、ビーズを、個々に、上下のプレートを備える圧縮装置に入れた。上方プレートを毎分１２インチの速度で降下させ、ビーズをそれらが破裂するまで圧縮した。ｌｂｆ単位での圧縮力（最大圧縮力）を測定した。
【００８０】
ＨＧＴ（Ｐ）の場合、最大圧縮力は０．７１４ｌｂｆから３．１８３ｌｂｆの範囲であり、平均は１．９５８、標準偏差は０．５４４４であった。本発明の製品の場合、その範囲は２．３２２ｌｂｆから６．４１８ｌｂｆ、平均は４．２８２、標準偏差は１．０９６であった。
【００８１】
明らかに、本発明のビーズの方が、他のアガロース−アガロース被覆ビーズよりも強度が高かった。
【００８２】
以上の例は、使用されるアガロースがSeakem Goldアガロースであるアガロースによって被覆された、分泌細胞含有アガロースマクロビーズに関する、本発明の様々な特徴構成を記載するものである。
【００８３】
ここでの使用において、「マクロビーズ」という用語は、直径が約４ｍｍから約１０〜１２ｍｍ、最も好ましくは直径が約６ｍｍから約８ｍｍである実質的に球形である構造物をいう。前記第２アガロース層の厚みは、好ましくは、約０．０５ｍｍ〜約５ｍｍ、より好ましくは約０．５ｍｍ〜約５ｍｍ、更に好ましくは約１．０ｍｍ〜３ｍｍ、そして最も好ましくは約１．０ｍｍ〜２．０ｍｍである。第２アガロース層は、Seakem Goldアガロースとすることができるが、必ずしもSeakem Goldアガロースにする必要はない。
【００８４】
「マクロビーズ」は、好適な構造物として使用されるが、分泌細胞をカプセル化し、そして、好ましくは、第２のアガロース層によってコーティングされた任意の固体のアガロース構造物が本発明の特徴である。
【００８５】
前記分泌細胞は様々なものとすることができる。所望の分泌産物を産生する任意の細胞又は細胞小器官をカプセル化することができる。そのように使用可能な材料の例として、膵島、ガン細胞、幹細胞がある。各ビーズは、様々な数の細胞小器官を含むことができ、例えば、膵島の場合、約５０〜約５０００個の膵島、好ましくは、約１００〜約２５００個の膵島、更に好ましくは、約２５０〜約１０００個、そして最も好ましくは約４７５〜約５５０個の膵島を含むことができる。約５００個の膵島が特に好適である。
【００８６】
本発明のその他の態様は当業者にとって明らかであろうから、ここでは更に説明しない。
【００８７】
ここに使用した用語と表現は説明の用語であって限定の用語ではなく、これらの用語および表現を使用するにあたって図示され記載された特徴構成の任意の均等物又はそれらの一部を除外する意図はなく、本発明の範囲内において種々の改変が可能であると認識される。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】テストおよび対照動物の平均の１日の血糖値に関する情報を示している。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、ここにそれらの全体を参考文献として合体させる２００４年１１月１７日出願の仮出願第６０／６２９，２７７号と、２００５年９月２６日出願の仮出願第６０／７２０，９１７号との優先権を主張するものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は、アガロースによって被覆された分泌細胞含有アガロースマクロビーズの質と量を改善するための方法に関する。これは下記のSeakem Goldアガロースの使用によって達成される。
【背景技術】
【０００３】
今日、膵島補充療法が種々の障害を有する患者の治療のために有効なアプローチであることが確立している。これらには、上腹部摘出を受けるガン患者（ツァキス（Tzakis）ほか，Lancet 336: 402-405(1990)）；膵炎（クレイトン（Clayton）ほか，Transplantation 76: 92-98 (2003)；ファーニー（Farney）ほか，Surgery 110: 427-437 (1991)；フォンテス（Fontes）ほか，Transplant Proc 24: 2809 (1992)；オーベンホルツァー（Obenholzer）ほか，Transplantation 69: 1115-1123 (2000)；ロバートソン（Robertson）ほか，Diabetes 50: 47-50 (2001)），および、膵島移植が治療オプションであるインスリン依存患者（ゴス（Goss）ほか，Transplantation 74: 1761-1766 (2002)；リコルディ（Ricordi）ほか，Transplantation 75: 1524-1527 (2003)；リャン（Ryan）ほか，Diabetes 50: 710-719 (2001)；シャピロ（Shapiro）ほか，N. Engl. J. Med 343; 230-238 (2000)、が含まれる。
【０００４】
上述したように、治療における膵島の有用性により、勿論、それらを単離する方法の開発が注目されている。自動化方法を使用する単離について多くの報告があるが（ブランドホースト（Brandhorst）ほか，Exp. Clin, Endocrinol Diabetes 103 Suppl. 2: 3〜14 (1995)，クイ（Cui）ほか，Cell Transplant 6: 48-54 (2001)；マルケッティ（Marchetti）ほか，Transplantation 52: 209-213 (1991)；ミヤモト（Miyamoto）ほか，Cell Transplant 7: 397-402 (1998)；ニールセン（Nielsen）ほか，Comp. Med. 52: 127-135 (2002)；スワンソン（Swanson）ほか，Hum. Immunnol62: 739-749 (2001)；トゥーミー（Toomey）ほか，Brit. J. Surg. 80: 240-243 (1993)；トソ（Toso）ほか，Cell Transplant 9: 297-305 (2000)；ウェンバーグ（Wennberg）ほか，Transplant, Proc. 33: 2537 (2001))，膵島の単離が困難であることはいまだに悪名高い。例えば、ボスタ（Bosta）ほか，J. Investig Med 43: 555-566 (1995)；クリックハーン（Krickhahn）ほか，Cell Transplant 11: 827-838 (2002)；クリックハーン（Krickhahn）ほか，Ann Transplant 6: 48-54 (2001)，オニール（O’Neil）ほか，Cell Transplant 10: 235-246 (2001)およびホワイト（White）ほか，Horm. Metab, Res31: 579-524 (1991)これらはすべてこれに関する問題について記載している。
【０００５】
分泌細胞および／又は細胞小器官、例えば、ガン細胞、膵島、など、を含むマクロビーズの製造は周知である。例えば、米国特許第６，８１８，２３０；６，８０８，７０５；ＲＥ ３８，０２７；６，３０３，１５１；６，２２４，９１２；５，８８８，４９７および５，６４３，５６９号、更に、米国特許出願公開第２００５／００９６５６１号、を参照。ここに、これらの全てを参考文献として合体させる。
【０００６】
アガロースは、これら特許文献において生物材料をカプセル化するために使用され、その後、それによって得られた構造物を第２のアガロース層で更にカプセル化している。
【０００７】
アガロースに関する当業者には、この利用可能な材料に様々なタイプ及び多様性があることが認識されるであろう。そのようなアガロースの一つのタイプであるSeakem Goldアガロースは、ここにその開示内容を参考文献として合体させる米国特許第４，９８３，２６８号に記載されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述した特許および出願に最初に記載された材料の改良版を得ることが必要とされ続けている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
今般、Seakem Goldアガロースによって、従来技術の製品よりも予想外に優れた製品が得られることが見出された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の詳細について以下の開示に説明する。
【００１１】
図面の簡単な説明
図１はテストおよび対照動物の平均の１日の血糖値に関する情報を示している。
【００１２】
ここでの使用において、「マクロビーズ」という用語は、直径が約４ｍｍから約１０〜１２ｍｍ、最も好ましくは直径が約６ｍｍから約８ｍｍである実質的に球形である構造物をいう。前記第２アガロース層の厚みは、好ましくは、約０．０５ｍｍ〜約５ｍｍ、より好ましくは約０．５ｍｍ〜約５ｍｍ、更に好ましくは約１．０ｍｍ〜３ｍｍ、そして最も好ましくは約１．０ｍｍ〜２．０ｍｍである。第２アガロース層は、Seakem Goldアガロースとすることができるが、必ずしもSeakem Goldアガロースにする必要はない。
【００１３】
「マクロビーズ」は、好適な構造物として使用されるが、分泌細胞をカプセル化し、そして、好ましくは、第２のアガロース層によって被覆された任意の固体のアガロース構造物が本発明の特徴である。
【００１４】
前記分泌細胞は様々なものとすることができる。所望の分泌産物を産生する任意の細胞又は細胞小器官をカプセル化することができる。そのように使用可能な材料の例として、膵島、ガン細胞、幹細胞がある。各ビーズは、様々な数の細胞小器官を含むことができ、例えば、膵島の場合、約５０〜約５０００個の膵島、好ましくは、約１００〜約２５００個の膵島、更に好ましくは、約２５０〜約１０００個、そして最も好ましくは約４７５〜約５５０個の膵島を含むことができる。約５００個の膵島が特に好適である。
【実施例】
【００１５】
例１
ここにその全部を参考文献として合体させる、２００６年６月８日に第１１／２７３，７３７号として公開された、ガズダ（Gazda）ほかの特許出願公開第２００６／０１２１４４５号に記載の方法に従って、膵島を単離した。ただし、本発明はこの特定の単離方法に依存するものではないので、膵島の単離のためにその他の方法も可能であり、それらを使用してもよいことが銘記される。
【００１６】
単離と評価の後、適当な膵臓を更に処理した。前記腺から脂肪と結合組織とを除去し、その後、主膵管に、１６ｇのステンレス鋼、鈍端ニードルをカニューレ挿入した。コラゲナーゼＰを１．５〜２．０ｇ／ｌの濃度で含有するＨＢＳＳの溶液を、５０ｍｌ／ｍｍの速度で、３０℃で潅流して、膵臓重量ｇあたり２ｍｌの溶液を作製した。
【００１７】
その後、前記膵臓を、３０℃で、２００ｍｌのコラゲナーゼ溶液と共に、５００ｍｌのＨＢＳＳと２％のＰＳで被覆した。３９℃の水をゆっくりと外部循環させることによって前記器官を３７℃まで暖め、３６〜３７℃の消化温度（digestatetemperature）に維持した。前記器官が解離されたように見え、手による圧力に対してほとんど抵抗を示さないようになった時（約１０〜２０分間の総時間後で３７℃に達してから５〜１０分間）、消化を停止した。
【００１８】
次に、収集された消化物を遠心分離にかけて、上清を吸引し、それによって得られたペレットを１０％ＰＳと器官保存溶液中に懸濁させた。その後、膵島を、５０ｍｌの試験管中にて２％ＰＳを添加したＨＢＳＳで、１．１０５，１，０９５，１．０８５および１．０５ｇ／ｃｍ３の濃度勾配で、不連続フィコールによって精製した。前記試験管を４℃にて６５０ｇで遠心分離にかけ、膵島含有層を収集し、１０％ＰＳ添加ＨＢＢＳ中で三回洗浄し、その後、それらを、解剖顕微鏡を使用して、非膵島組織について手作業で精製した。膵島を再懸濁し、膵島収率の算出のために二つの０．５ｍｌのサンプルを使用した。
【００１９】
テストした１０の膵臓の平均収率は、１３０，０００ＥＩＮであり、消化組織１グラム当たり１，１０１ＥＩＮの平均値であった。純度は全てのケースにおいて９０％以上であった。前記器官の９個について、膵島生存率は８９％以上であった。
【００２０】
例２
上記で暗示したように、膵島の単離後、純度、生存率を含む様々なパラメーターを測定した。
【００２１】
純度は、約５００のＥＩＮをＤＴＺで１０分間染色することによって評価し、その後、解剖顕微鏡とデジタルカメラとを用いて、標準的な画像分析を行った。
【００２２】
生存率は、フルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）とエチジウムブロマイド（ＥＢ）とでサンプルを染色することによって測定した。詳述すると、約５００のＥＩＮを１ｍｌのＲＰＭＩ、１０％ＰＳと１％の抗生剤／抗菌剤（antimyotic）（Ａ／Ａ）に添加した。次に、１０ｍｇのＦＤＡと１ｍのアセトンとで予め作製しておいた２０μｌのＦＤＡ染色液と、３０μｌのＥＢと１ｍｌのＰＢＳとで予め作製しておいた２００μｌのＥＢとを添加した。膵島を暗所で７分間染色し、次に、１０〜５０の膵島のランダムサンプルを、蛍光顕微鏡で観察し、写真撮影して、標準画像分析を使用して生存率を測定した。
【００２３】
前記膵島のインスリン含有量も、約５００のＥＩＮを酸アルコール抽出溶液（７．２ｍｌのＩＮ ＨＣｌ，４００ｍｌの１００％変性エタノール）中に置くことによって測定した。サンプルを−２０℃で保存し、インスリンＲＩＡを行った。
【００２４】
【表１】
【００２５】
例３
この例と、これ以降の例とは、上述したようにして有用であるとして同定され単離された膵島がマクロビーズに使用可能であるか否かという問題を扱うものである。
【００２６】
精製した膵島を、ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＰＳ＋１％ Ａ／Ａ中で、２０００ＥＩＮ／ｍｌの量にまで再懸濁した。各試験管が２０００ＥＩＮで１ｍｌの懸濁物を含むように、膵島は試験管に均質に分けられた。
【００２７】
重力による沈殿後、上清を除去し、２．５％ ＨＥＰＥＳ緩衝液を添加した最小必須培地中で５０℃にて調製した１．５％ Seakem Goldアガロース０．５ｍｌを各サンプルに添加し均一に混合した。次に、前記懸濁物を無菌ミネラルオイルの下方に排出し、スムースな表面と等しい膵島分布を有する４つのビーズを作った。
【００２８】
マクロビーズを取り出し、二回洗浄（ＲＰＭＩ＋５％ＰＳ＋１％ Ａ／Ａ）した。これらのマクロビーズを同じ溶液中で、加湿５％ＣＯ２雰囲気中で、５〜７日間培養し、その後、それらをＲＰＭＩ＋１％ Ａ／Ａ中で三回洗浄し、その後、第２のアガロースコーティングの塗布を行った。このために、６０℃で、ＨＥＰＥＳ緩衝液を添加した最小必須培地中５％のアガロース０．５ｍｌを、ピペットを介して、無菌プラスチックスプーンに移し、各マクロビーズを３〜５回ローリングして均質な第２アガロースコーティングを作製した。無菌ミネラルオイルに移してスムースな表面を作製した後、マクロビーズを取り出し、ＲＰＭＩ＋２．５％ＰＳ＋１％ Ａ／Ａ中で二回洗浄し、加湿した５％ＣＯ２と空気中で３７℃にてインキュベートした。勿論、ビーズ製造のためのその他の方法を使用することも可能である。
【００２９】
カプセル化膵島を含むマクロビーズを測定したところ６ヶ月間以上に渡って生存し続け、その期間中、ラジオイムノアッセイはそれらが良好なレベルのインスリンを産生し続けたことを示した。
【００３０】
例４
この例は、ブタ膵島がイン・ヴィヴォで作用する能力を証明する実験について記載するものである。
【００３１】
オスの非肥満糖尿病ＣＢ１７−ＰｒＫｄｃ＜ｓｃｉｄ＞Ｊマウス、７〜９週齢を使用した。１週間の順化後、前記動物に２７５ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシンを与えた。これは糖尿病を誘発するものである。９日間後、それらの血糖値が平均で４８０ｍｇ／ｄｌを超えたときに、それらのインスリン療法を開始した。
【００３２】
ストレプトゾトシン投与後の３４〜３５日目、前記動物に約１０００ＥＩＮのブタ膵島を与え、これらは、ここに参考文献として合体させるボーウェン（Bowen）ほか，Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci, 58:441-447（1980）に従って、血液に移植された。簡単に説明すると、膵島を懸濁液からペレット化し、培地を吸引した。次に、約５〜１０μｌの血液を前記動物から採取し、前記膵島に添加し、凝固させた。前記移植動物を等量のケタミン（１６７ｍｇ／ｄｌ）、キシラジン（３３ｍｇ／ｍｌ）と生理食塩水で麻酔した。前記混合物を０．５ｍｌ／１００ｇの投与量で皮下投与した。左脇腹に小さな切開を形成し腎臓を露出させ、解剖顕微鏡を使用して、腎臓の嚢（capsule）に小さな切開を形成した。次に、前記嚢を腎臓から分離し、前記膵島／血栓をカプセルの下に置き、前記切開を閉じ、動物を回復させた。
【００３３】
前記移植後の３８〜３９日目に、前記動物に対して腎摘出を行った。簡単に説明すると、麻酔後、移植片を有する腎臓を露出させ腎血管を結刹し、各動物の腎臓を取り出した。５日後、動物を屠殺し、完全な膵島ベータ細胞破壊の組織学的確認のために膵臓を収集した。
【００３４】
組織サンプルを１０％中性緩衝製剤中に２４時間載置し、次に、７０％エチルアルコールに移した。
【００３５】
この後、前記組織をパラフィンに包埋して５μｍの切片をヘマトキシリンとエオシンで染色した。膵臓および移植腎臓切片を、標準方法を使用して、インスリンおよびグルカゴン含有細胞を染色し、その後、それらを調べた。
【００３６】
前記マウスの全てが、膵島移植後に正常血糖になった。腎摘出後、全てのマウスが、４日間以内に高血糖になった。
【００３７】
例５
この例は、異なるアガロースから製造されたアガロース−アガロース被覆ビーズが、移植動物においてどの程度、組織反応、すなわち、炎症、を引き起こすか、を測定するように構成された実験を記載するものである。
【００３８】
二系統のラット、すなわち、Wistar系およびSprague Dawley系ラット、を使用した。全部で２９匹のラットをテストした（Wistar系１４匹、Sprangue Dawley系１５匹）。各系統の３匹のラットを使用して、本発明のSeakem Goldアガロース−アガロース被覆ビーズをテストした。各系統の３匹のラットを使用してアガロースタイプFMC HGT(P)及びAmrescoをテストした。２匹のWistar系ラットを使用してSigma HVアガロースをテストし、４匹のSprangue Dawley系ラットも同様に使用した。最後に、３匹のWistar系ラットを使用してSigma LVアガロースビーズをテストし、２匹のSprangeuDawley系ラットも同様に使用した。
【００３９】
２匹の例外を除いて、各タイプの全部で６０個の空ビーズを前記ラットの腹腔に移植した。２匹のSprague Dawley系ラットには、５４又は５９のSigma HVアガロースビーズを与えた。前記ラットを３ヶ月間観察し、その後、屠殺した。様々な器官を取り出して炎症（脾臓、肝臓、腎臓、骨格筋、膵臓および腸間膜）を調べた。
【００４０】
組織を、American College of Veterinary Pathologyによって認可されている基準を使用した炎症によって評価した。評価には、実質的には以下のように、炎症を評価するために６ポイントスケールを使用した。
【００４１】
０＝正常
１＝最小（１０％以下の炎症）
２＝軽度（１０〜２５％の炎症）
３＝中度（２５〜５０％の炎症）
４＝強度（５０〜７５％の炎症）
５＝重度（７５％以上の炎症）
【００４２】
各動物の前記組織を評価し、その後、平均化した。その結果を下に示す。
【００４３】
【表２】
【００４４】
【表３】
【００４５】
【表４】
【００４６】
本発明のアガロース−アガロース被覆ビーズが最も炎症性が低いことは明白であった。
【００４７】
本発明のビーズをFMC HGT(P)アガロース（FMC HGTPアガロース)から成り、それによって被覆されたビーズと比較する、犬に対する追加の炎症研究を行った。ここでも、本発明のアガロース−アガロース被覆ビーズが最も炎症性が低かった。
【００４８】
更なる研究において、犬に、ブタ膵島を含有する本発明のアガロース−アガロース被覆ビーズを与えた。これらの動物を２．５年間後に屠殺したが、最小限の炎症しか観察されなかった。非移植対照動物との比較において、腹膜と腸間膜は顕著に正常な外観であった。
【００４９】
例６
これらの実験において、イン・ヴィトロで培養された膵島含有Seakem Goldアガロースマクロビーズが、対照(空)のマクロビーズと比較された。
【００５０】
Seakem Goldアガロースにカプセル化された膵島を、例３において前述したように調製した。
【００５１】
自然発生的に糖尿性である１２匹のオスＢＢラットを被験動物として使用した。全ての動物は１０〜１５週齢であり、３〜１６日間にわたって臨床的に糖尿性であることが示されていたものである。
【００５２】
２０〜２１日間の生存後、前記ＢＢラットを、ケタミン／キシラジン／ＮａＣｌを２．２〜２．３ｍｌ／ｋｇ体重の投与量で皮下投与することによって麻酔した。麻酔後、前記動物に、１日あたりのインスリン必要量の１．０倍に等しい投与量の膵島含有マクロビーズのインプラント、又は、同量の空マクロビーズ、のいずれかを与えた。
【００５３】
移植後、前記動物を観察し、一般的状態（良好、良、又は不良）、体重、血糖、尿糖、尿ケトン、を含む臨床知見を毎日記録した。研究を通して血清サンプルを収集して、インスリン、グルカゴン、ブタＣペプチド、の測定に使用した。ラジオイムノアッセイを使用してこれらのパラメーターを測定した。腹腔内耐糖性テストも行った。
【００５４】
移植の９７日間後、前記動物に対して完全検視（complete necroscopies）を行った。動物を麻酔し、放血し腹腔を露出させた。
【００５５】
研究の９７日の期間全体を通して、膵島含有Seakem Goldアガロースビーズを投与されていた６匹の動物はインスリンの投与を必要としなかった。これは空のマクロビーズを投与された動物と対照的である。これら動物には、血糖値が３００〜５００ｍｇ／ｄｌにまで上昇したので、研究開始後２日間から始めて外因性インスリンを投与された。これらの対照動物のうちの２匹は、おそらくインスリン欠損のために、研究の３日目に死んでいた。
【００５６】
対照と比較して、膵島含有Seakem Goldアガロースビーズを投与された動物において平均日間血糖値は遥かに低かった。又、前記６匹のテスト動物は、インスリン療法無しでも、非常に狭い範囲の日間血糖変化しか示さなかった。
【００５７】
１ヶ月後、前記膵島を投与されたこれらの動物は中度の高血糖になったが、限られた血糖変動（約１００ｍｇ／ｄｌ）しか示さなかった。これは、２〜３Ｕ／日の外因性インスリンを投与したにもかかわらず約４００〜５００ｍｇ／ｄｌの極端な変化を示した対照と対照的である。
【００５８】
Ｉ型糖尿病の臨床診断を確認するために、全ての動物に対して最初、腹腔内耐糖性テストを行った。このテストは、移植の８および９０日後にも行われた。移植の５日間前、グルコースチャレンジ（challenge）に対する反応は明白ではなかったが、移植後８日目に、膵島含有マクロビーズのレシピエントはグルコースチャレンジに対する顕著な反応、すなわち、血糖の初期上昇と、その後の、正常血糖値への復帰、を示した。上述したように同時にインスリン療法を行ったにもかかわらず、前記空マクロビーズを投与された動物においても高血糖は抑制されなかった。
【００５９】
移植の９０日間後、もう一つの腹腔内耐糖性テストを行った。前記膵島マクロビーズを投与されたラットについて再びベースライン血糖値を再度確立したが、出発血糖値ははるかに高いものであった、すなわち、それは約４００ｍ／ｄｌであった。空マクロビーズを投与されたラットはベースライン血糖値を再度確立することができなかった。
【００６０】
ブタＣ−ペプチドについてのアッセイでは、移植前の動物における研究においても、又、空マクロビーズレシピエントからもペプチドは検出されなかった。これに対して、膵島マクロビーズを移植されたラットの血清中では、移植の２１日間後での０．８８０ ０．２４９ｎｇ／ｍｌから研究の終了時での０．６６２ ０．１６０ｎｇ／ｄｌまでの平均レベルでペプチドがルーチン的に検出された。
【００６１】
研究動物は、更に、糖尿、ケトン尿症、および炭酸水素塩投与の必要性、に関してもテストされた。移植前には有意な差は無かったが、この後、膵島マクロビーズレシピエントでは糖尿（８１中の６７に対して５６のサンプル中の３７）とケトン尿症（５４中の３２に対して６４のサンプル中２０）との発症が遥かに少なかった。炭酸水素塩療法の必要性も大幅に低下した（２６に対して２の処置）。
【００６２】
例７
以下の実験は、膵島をカプセル化するSeakem Goldアガロースが、長期間にわたってイン・ヴィトロで培養することが可能であり、それでも機能を維持することを示すものである。
【００６３】
これらの実験において、上述した例６のラットと同じ基準を満たす１２匹の糖尿病ＢＢラットの組を使用し、２３匹のWistar-Furth系ラット、７週齢も使用した。この第２群のラットは正常対照として作用した。
【００６４】
これらのWistar-Furth系ラットのうちの５匹に、その尾静脈を介して、６５ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシンを投与して糖尿病を誘発させた。二つの連続血糖読み取り値＞５００ｍ／ｄｌが観察された時、ラットは、後述するようにしてインスリン療法を受け始めた。
【００６５】
０．１ｍｌ／１００ｇのケタミン／（６０ｍｇ／ｍｌ），キシラジン（６ｍｇ／ｍｌ），／ブタルフェノール（３ｍｇ／ｍｌ）投与量の筋肉内投与を使用して、到着後２０〜２１日で動物を麻酔した。
【００６６】
麻酔後、全てのＢＢラットに、上述したようにして、膵島を含有するSeakem Goldアガロースビーズを与えた。これらラットを４匹の３つの組に分け、９週間、４０週間又は６７週間、イン・ヴィトロで培養したマクロビーズを与えた。投与したマクロビーズの量は、動物の１日のインスリン必要量の１．０倍に等しいものとした。
【００６７】
前記Wistar-Furth系ラットのうちの５匹には、イン・ヴィトロで７．８〜１１．５週間培養したマクロビーズを、前記ＢＢラットと同じ投与量、投与した。これはWistar-Furth系ラット１匹あたり約４５〜４９のマクロビーズ、ＢＢラット１匹あたり５６〜６０のマクロビーズである。
【００６８】
前記実験中、ラットは、平均で７５ｇ体重増加した。その結果、最初の移植の９７日目に、ＢＢラットに追加の移植を行った。ラットの平均の移植前インスリン必要量は０．００８３Ｕインスリン／ｇ体重であった。この値から、２４時間当たり３９．１９ｍＵのインスリンを作り出すために追加の１７個の膵島含有マクロビーズが必要であることが計算された。後述するように、第２の移植前に、各ラットから４個のビーズが取り除かれたので、１９週間培養された２１個のマクロビーズが投与された。Wistar-Furth系ラットには第２の移植を行わなかった。
【００６９】
ここでも、例７で行った種々のアッセイを、同じ方法を使用して行った。
【００７０】
移植の２０１〜２０２日目に、上述したようにして、完全検視を行った。
【００７１】
平均の１日あたりの糖値が図1に示されている。移植後、約１ヶ月で全てのＢＢラットにおいて正常血糖値（１００〜２００ｍｇ／ｄｌ）が回復した。この後、ＢＢラットにおいて中程度の高血糖値（２００〜４００ｍｇ／ｄｌ）が生じ、これは研究の残り期間を通して持続した。中程度の高血糖値と最大体重増加とは同時に起こった。体重が一定に留まったのに対して、糖値は研究の残り期間を通して３００〜４００ｍｇ／ｄｌの間で変動した。ビーズのイン・ヴィトロ培養時間の長さにかかわらず、膵島含有Seakem Goldアガロースマクロビーズを投与された前記３群のラット間では平均の１日の血糖値に差は無かった。
【００７２】
糖尿病が誘発された前記Wistar-Furth系ラットも、約１ヶ月、正常血糖値を示し、その後、中程度の高血糖値が観察された。
【００７３】
上述したように、研究に入って９７日間でＢＢラットに第２の移植が行われた。この第２の移植は１日の血糖値に影響を与えなかった。
【００７４】
ブタＣペプチドも分析され、３群のＢＢラット全てに検出された。実験の最初の８８日間の間、平均ブタＣペプチドレベルは０．６〜０．９ｎｇ／ｍから０．２〜０．４ｎｇ／ｍｌへと低下した。１１６日間後、前記第２移植の後、ペプチドレベルは、平均で０．３〜０．７ｎ／ｍｌへと増加し、検視において腹膜液で４０倍の増加が観察された。
【００７５】
膵島マクロビーズ移植を受けた全てのラットに対して、研究期間全体を通してグルコースチャレンジ処理が行われた。培養時間の異なるマクロビーズ間において、移植後のグルコースチャレンジに対して応答するマクロビーズの能力において差は観察されなかった。詳述すると、全てのＢＢラットの血糖値は、１００〜２００ｍｇ／ｄｌの初期値からおよそ二倍になった。ベースライン血糖への復帰は、１２匹の動物中１０匹において１２０分間以内に起こった。この応答は、正常なWistar−Furth系動物において観察されたものに類似したものであった。
【００７６】
全ての研究動物は確かに最終的には高血糖になったが、移植後１０５日目でのグルコースチャレンジは、血糖における初期上昇を示し、その後、ベースライン血糖値に戻った。移植後の２００日間において、グルコース投与後にベースライング血糖値においてわずかな増加があっただけで、その後、ベースライング血糖値に戻った。
【００７７】
これらの研究における結果は、前述のTransplantationにおけるジャイン（Jain）ほかの研究との比較において、そのアガロースがSeakem Goldである場合、膵島を含有するアガロースビーズが、ジャイン（Jain）ほかによって報告されたものよりも予想外に良好である、ということを示している。例えば、ジャイン（Jain）ほかの報告では２００日までに対象動物の４０％が死亡したのに対して、本発明のマクロビーズでの死亡率はゼロであった。更に、ここに達成された結果は、ジャイン（Jain）ほかによって報告されたものの半分の数のマクロビーズを使用して達成されたものである。更には、ここでは詳述を避ける結果において、検視後、回収されたマクロビーズのインスリンの産生レベルを測定したところ、それはジャイン（Jain）ほかによって報告されている検視後に回収されたマクロビーズのレベルよりも遥かに高いものであった。
【００７８】
例８
本発明のビーズの強度を、ＦＭＣ ＨＧＴ（Ｐ）アガロースから形成され、それによって被覆されたビーズと比較するための実験を行った。
【００７９】
これらのテストにおいて、ビーズを、個々に、上下のプレートを備える圧縮装置に入れた。上方プレートを毎分１２インチの速度で降下させ、ビーズをそれらが破裂するまで圧縮した。ｌｂｆ単位での圧縮力（最大圧縮力）を測定した。
【００８０】
ＨＧＴ（Ｐ）の場合、最大圧縮力は０．７１４ｌｂｆから３．１８３ｌｂｆの範囲であり、平均は１．９５８、標準偏差は０．５４４４であった。本発明の製品の場合、その範囲は２．３２２ｌｂｆから６．４１８ｌｂｆ、平均は４．２８２、標準偏差は１．０９６であった。
【００８１】
明らかに、本発明のビーズの方が、他のアガロース−アガロース被覆ビーズよりも強度が高かった。
【００８２】
以上の例は、使用されるアガロースがSeakem Goldアガロースであるアガロースによって被覆された、分泌細胞含有アガロースマクロビーズに関する、本発明の様々な特徴構成を記載するものである。
【００８３】
ここでの使用において、「マクロビーズ」という用語は、直径が約４ｍｍから約１０〜１２ｍｍ、最も好ましくは直径が約６ｍｍから約８ｍｍである実質的に球形である構造物をいう。前記第２アガロース層の厚みは、好ましくは、約０．０５ｍｍ〜約５ｍｍ、より好ましくは約０．５ｍｍ〜約５ｍｍ、更に好ましくは約１．０ｍｍ〜３ｍｍ、そして最も好ましくは約１．０ｍｍ〜２．０ｍｍである。第２アガロース層は、Seakem Goldアガロースとすることができるが、必ずしもSeakem Goldアガロースにする必要はない。
【００８４】
「マクロビーズ」は、好適な構造物として使用されるが、分泌細胞をカプセル化し、そして、好ましくは、第２のアガロース層によってコーティングされた任意の固体のアガロース構造物が本発明の特徴である。
【００８５】
前記分泌細胞は様々なものとすることができる。所望の分泌産物を産生する任意の細胞又は細胞小器官をカプセル化することができる。そのように使用可能な材料の例として、膵島、ガン細胞、幹細胞がある。各ビーズは、様々な数の細胞小器官を含むことができ、例えば、膵島の場合、約５０〜約５０００個の膵島、好ましくは、約１００〜約２５００個の膵島、更に好ましくは、約２５０〜約１０００個、そして最も好ましくは約４７５〜約５５０個の膵島を含むことができる。約５００個の膵島が特に好適である。
【００８６】
本発明のその他の態様は当業者にとって明らかであろうから、ここでは更に説明しない。
【００８７】
ここに使用した用語と表現は説明の用語であって限定の用語ではなく、これらの用語および表現を使用するにあたって図示され記載された特徴構成の任意の均等物又はそれらの一部を除外する意図はなく、本発明の範囲内において種々の改変が可能であると認識される。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】テストおよび対照動物の平均の１日の血糖値に関する情報を示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズを製造する方法であって、
（ａ）分泌細胞をSeakem Goldアガロース中に懸濁させる工程、
（ｂ）前記工程（ａ）の懸濁分泌細胞からビーズを形成する工程、
（ｃ）前記工程（ｂ）のビーズを加湿空気中でインキュベートする工程、
（ｄ）前記工程（ｃ）のビーズをアガロースで被覆して、アガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズを形成する工程、を含む方法。
【請求項２】
前記工程（ｃ）のビーズを、５％アガロース中でローリングして、前記ローリングされたビーズをミネラルオイルと接触させ、そして前記ローリングされたビーズを洗浄して前記アガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズを形成する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分泌細胞が、膵島である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記膵島が、ヒト膵島である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記膵島が、ウシ膵島である請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記膵島が、ブタ膵島である請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ビーズが、約５０〜約５０００の膵島を含む請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記ビーズが、約１００〜約２５００の膵島を含む請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記ビーズが、約４７５〜約５５０の膵島を含む請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記ビーズが、約４ｍｍ〜約１２ｍｍの直径を有するマクロビーズである請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記マクロビーズが、約４ｍｍ〜約１０ｍｍの直径を有する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記マクロビーズが、約４ｍｍ〜約８ｍｍの直径を有する請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記マクロビーズが、約６ｍｍ〜約８ｍｍの直径を有する請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ビーズを、約０．０５ｍｍ〜約５．０ｍｍのアガロース層で被覆する工程を有する請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ビーズを約１．０ｍｍ〜約３．０ｍｍのアガロース層で被覆する工程を有する請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ビーズを約１．００ｍｍ〜約２．０ｍｍのアガロース層で被覆する工程を有する請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
アガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズ。
【請求項１８】
膵島を含む請求項１７に記載のアガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズ。
【請求項１９】
前記膵島が、ヒト膵島である請求項１８に記載のアガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズ。
【請求項２０】
前記膵島が、ウシ膵島である請求項１８に記載のアガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズ。
【請求項２１】
前記膵島が、ブタ膵島である請求項１８に記載のアガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズ。
【請求項２２】
約５０〜約５０００の膵島を含む請求項１８に記載のアガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズ。
【請求項２３】
約１００〜約２５００の膵島を含む請求項１８に記載のアガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズ。
【請求項２４】
約４７５〜約５５０の膵島を含む請求項１８に記載のアガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズ。
【請求項２５】
約４ｍｍ〜約１２ｍｍの直径を有する請求項１８に記載のアガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズ。
【請求項２６】
約４ｍｍ〜約１０ｍｍの直径を有する請求項１８に記載のアガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズ。
【請求項２７】
約４ｍｍ〜約８ｍｍの直径を有する請求項１８に記載のアガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズ。
【請求項２８】
約６ｍｍ〜約８ｍｍの直径を有する請求項１８に記載のアガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズ。
【請求項２９】
約０．０５ｍｍ〜約５．０ｍｍのアガロース層で被覆されている請求項１７に記載のアガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズ。
【請求項３０】
約１．０ ｍｍ〜約３．０ ｍｍのアガロース層で被覆されている請求項１７に記載のアガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズ。
【請求項３１】
約１．０ｍｍ〜約２．０ｍｍのアガロース層で被覆されている請求項１７に記載のアガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズ。
【請求項３２】
分泌細胞の機能不全によって引き起こされた状態を有する対象体を治療する方法であって、請求項１７に記載のアガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズを、前記状態を軽減するのに十分な量で投与する工程を有する方法。
【請求項３３】
前記状態が、インスリン依存糖尿病である請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ビーズが、膵島を含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記膵島が、ヒト膵島である請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記膵島が、ブタ膵島である請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記膵島が、ウシ膵島である請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記ビーズが、前記対象体の腹腔に置かれる請求項３２に記載の方法。
【請求項１】
アガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズを製造する方法であって、
（ａ）分泌細胞をSeakem Goldアガロース中に懸濁させる工程、
（ｂ）前記工程（ａ）の懸濁分泌細胞からビーズを形成する工程、
（ｃ）前記工程（ｂ）のビーズを加湿空気中でインキュベートする工程、
（ｄ）前記工程（ｃ）のビーズをアガロースで被覆して、アガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズを形成する工程、を含む方法。
【請求項２】
前記工程（ｃ）のビーズを、５％アガロース中でローリングして、前記ローリングされたビーズをミネラルオイルと接触させ、そして前記ローリングされたビーズを洗浄して前記アガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズを形成する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分泌細胞が、膵島である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記膵島が、ヒト膵島である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記膵島が、ウシ膵島である請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記膵島が、ブタ膵島である請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ビーズが、約５０〜約５０００の膵島を含む請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記ビーズが、約１００〜約２５００の膵島を含む請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記ビーズが、約４７５〜約５５０の膵島を含む請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記ビーズが、約４ｍｍ〜約１２ｍｍの直径を有するマクロビーズである請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記マクロビーズが、約４ｍｍ〜約１０ｍｍの直径を有する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記マクロビーズが、約４ｍｍ〜約８ｍｍの直径を有する請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記マクロビーズが、約６ｍｍ〜約８ｍｍの直径を有する請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ビーズを、約０．０５ｍｍ〜約５．０ｍｍのアガロース層で被覆する工程を有する請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ビーズを約１．０ｍｍ〜約３．０ｍｍのアガロース層で被覆する工程を有する請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ビーズを約１．００ｍｍ〜約２．０ｍｍのアガロース層で被覆する工程を有する請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
アガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズ。
【請求項１８】
膵島を含む請求項１７に記載のアガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズ。
【請求項１９】
前記膵島が、ヒト膵島である請求項１８に記載のアガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズ。
【請求項２０】
前記膵島が、ウシ膵島である請求項１８に記載のアガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズ。
【請求項２１】
前記膵島が、ブタ膵島である請求項１８に記載のアガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズ。
【請求項２２】
約５０〜約５０００の膵島を含む請求項１８に記載のアガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズ。
【請求項２３】
約１００〜約２５００の膵島を含む請求項１８に記載のアガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズ。
【請求項２４】
約４７５〜約５５０の膵島を含む請求項１８に記載のアガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズ。
【請求項２５】
約４ｍｍ〜約１２ｍｍの直径を有する請求項１８に記載のアガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズ。
【請求項２６】
約４ｍｍ〜約１０ｍｍの直径を有する請求項１８に記載のアガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズ。
【請求項２７】
約４ｍｍ〜約８ｍｍの直径を有する請求項１８に記載のアガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズ。
【請求項２８】
約６ｍｍ〜約８ｍｍの直径を有する請求項１８に記載のアガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズ。
【請求項２９】
約０．０５ｍｍ〜約５．０ｍｍのアガロース層で被覆されている請求項１７に記載のアガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズ。
【請求項３０】
約１．０ ｍｍ〜約３．０ ｍｍのアガロース層で被覆されている請求項１７に記載のアガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズ。
【請求項３１】
約１．０ｍｍ〜約２．０ｍｍのアガロース層で被覆されている請求項１７に記載のアガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズ。
【請求項３２】
分泌細胞の機能不全によって引き起こされた状態を有する対象体を治療する方法であって、請求項１７に記載のアガロース被覆Seakem Goldアガロース分泌細胞ビーズを、前記状態を軽減するのに十分な量で投与する工程を有する方法。
【請求項３３】
前記状態が、インスリン依存糖尿病である請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ビーズが、膵島を含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記膵島が、ヒト膵島である請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記膵島が、ブタ膵島である請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記膵島が、ウシ膵島である請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記ビーズが、前記対象体の腹腔に置かれる請求項３２に記載の方法。
【図１】
【公表番号】特表２００９−５０９５０７（Ｐ２００９−５０９５０７Ａ）
【公表日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３２２９５（Ｐ２００８−５３２２９５）
【出願日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３６１２５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３８０２９
【国際公開日】平成１９年４月５日（２００７．４．５）
【出願人】（５０８０８９７５０）ザ・ロゴシン・インスティテュート・インコーポレイテッド (1)
【住所又は居所原語表記】５０５ ＥＡＳＴ ７０ＴＨ ＳＴＲＥＥＴ， ＮＥＷ ＹＯＲＫ， ＮＥＷ ＹＯＲＫ １００２１， ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３６１２５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３８０２９
【国際公開日】平成１９年４月５日（２００７．４．５）
【出願人】（５０８０８９７５０）ザ・ロゴシン・インスティテュート・インコーポレイテッド (1)
【住所又は居所原語表記】５０５ ＥＡＳＴ ７０ＴＨ ＳＴＲＥＥＴ， ＮＥＷ ＹＯＲＫ， ＮＥＷ ＹＯＲＫ １００２１， ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ
【Ｆターム（参考）】
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