ＺＮＦ２８１を発現する臍帯血由来の万能幹細胞の分離方法
本発明は、臍帯血から分離された単核細胞をフィブロネクチンが含まれた培養容器内で培養した後、培養物から幹細胞を回収することを特徴とする臍帯血由来の万能幹細胞の分離方法、本発明によって分離された臍帯血由来の万能幹細胞、前記の臍帯血由来の万能幹細胞またはこれから分化した細胞を含む細胞治療剤に関するものである。また、本発明は、新規な幹細胞培養用培地、この培地で幹細胞を培養して増殖させることを特徴とする幹細胞の培養方法、及び幹細胞を球培養(sphere culture)または三次元培養することを特徴とする幹細胞の幹性(stemness)増加方法に関するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臍帯血から分離された単核細胞をフィブロネクチンが含まれた培養容器内で培養した後、培養物から幹細胞を回収することを特徴とする臍帯血由来の万能幹細胞の分離方法、本発明によって分離された臍帯血由来の万能幹細胞、前記の臍帯血由来の万能幹細胞またはこれから分化した細胞を含む細胞治療剤に関するものである。また、本発明は、新規な幹細胞培養用培地、この培地で幹細胞を培養して増殖させることを特徴とする幹細胞の培養方法、及び幹細胞を球培養(sphere culture)または三次元培養することを特徴とする幹細胞の幹性(stemness)増加方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞などは、自己再生(self-renewing)、分化、永久性(immortal)などの特徴を有しており、このような独特の性質を用いて再生医学の観点から多様な退行性疾病の治療のための解決方法として提示されるだけでなく、細胞などのバイオロジーに対する深い通察ができる。多様な組職から得ることができる成体幹細胞は、一般的に胚芽幹細胞に比べて無制限的なソースと研究者らが直面できる倫理的な問題を避けることができるため、遥かに魅力的である。さらに、臍帯血から分離された幹細胞は、骨髓や脂肪組職と異なって寄贈者が追加的な害を被る恐れがないので、他の成体幹細胞などよりもさらに大きい長所を有している。
【０００３】
試験管内(in vitro)で臍帯血由来の間葉系幹細胞は、成功的に神経細胞、肝細胞、骨細胞のような多様な種類の細胞に成功的に導入された(Sun, W. et al., Stem cells, 23:931, 2005; Hong SH. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 30:1153, 2005; Hutson EL. et al., Tissue Engineering, 11:1407, 2005)。また、生体内(in vivo)で、臍帯血間葉系幹細胞を用いた傷、糖尿病、心臓梗塞(heart infraction)などに成功的な移植が多くの論文などを介して報告されて来た(Nonome, K. et al., Am, J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 289:1091, 2005; Yoshida, S. et al., Stem cells, 23:1409, 2005; Kim Bo. et al., Circulation, 112:96, 2005)。伝染病の伝達危険が少なく、移植片対宿主病(graft-versus-host disease)にかかる危険が低いため、臍帯血間葉系幹細胞移植は、小児、大人患者の皆に急速に施術されている(Claudio G. B. et al., Annual Review of Medicine, 57:403, 2006)。臍帯血移植がいくつかの疾病、特に、造血母欠陷(hematopoietic defection)に係った疾病などに施術することができる方法として受け入れられたと言っても(Grewal, SS. et al., Blood, 103:1147, 2004; Knutsen, AP. et al., Journal pediatrics, 142:519, 2003; Ooi, J. et al., Blood, 103:489, 2004; Sanz GF. et al., Blood, 103:489, 2004)、臍帯血由来の間葉系幹細胞の臨床的な適用に関する研究は、依然として制限されている。例えば、脊髓損傷された女性及びバージャー病(buerger's disease)患者において、完全な回復ではないが、部分的に成功した報告などがある(Kim, SW. et al., Stem Cells, 2006; Kang, KS. et al., Cytotherapy, 7:368, 2005)。しかし、このような細胞などの発達メカニズムだけでなく、この細胞などをどんなによく培養して増殖するかに対しては、依然としてよく知られていない。
【０００４】
臍帯血から間葉系幹細胞を分離する方法は、骨髓由来の間葉系幹細胞の分離方法を適用した時に、細胞の分離率が２０％内外であり、５時間以内の新鮮な血液を使用した時は、５０％であるが、その以後になると、２０％以下に落ち、分離後にも細胞の増殖がよくできない限界を示した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明者らは、ヒト臍帯血由来の血液から分離した単核細胞をフィブロネクチンが含まれた培養容器で培養し、紡錘形(spindle-shape)の細胞が大量に増殖され、集落を成すことを見付け、これを持続的に培養した時、細胞の特性が一定ほど維持されることを確認した。それで既存の方法において問題視されている臍帯血由来の非造血係万能幹細胞及び間葉系幹細胞の效率的分離及び大量増殖が可能な培養方法として本発明を完成した。
【０００６】
本発明の一つの目的は、臍帯血から分離された単核細胞をフィブロネクチンが含まれた培養容器内で培養した後、培養物から幹細胞を回収することを特徴とする臍帯血由来の万能幹細胞の分離方法を提供することにある。
【０００７】
本発明の他の目的は、前記分離方法によって分離された臍帯血由来の万能幹細胞を提供することにある。
【０００８】
本発明のまた他の目的は、前記臍帯血由来の万能幹細胞またはこれから分化した細胞を含有する細胞治療剤を提供することにある。
【０００９】
本発明のまた他の目的は、本発明による新規な幹細胞培養用培地を提供することにある。
【００１０】
本発明のまた他の目的は、幹細胞を前記培地で培養して増殖させることを特徴とする幹細胞の培養方法を提供することにある。
【００１１】
本発明のまた他の目的は、幹細胞を球培養または三次元培養することを特徴とする幹細胞の幹性増加方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の一つの観点は、臍帯血から分離された単核細胞をフィブロネクチンが含まれた培養容器内で培養した後、培養物から幹細胞を回収することを特徴とする臍帯血由来の万能幹細胞の分離方法に関するものである。
【００１３】
前記培養物から幹細胞を回収することにおいて、幹細胞の免疫学的特性を用いて分離することを更に含むことができる。
【００１４】
先ず、臍帯血から単核細胞の分離は、当業界に知られている通常の方法を用いて行うことができる。本発明の一つの態様においては、臍帯血とHetasepを混合して赤血球を除去した後、フィコール−プラーク(Ficoll-plaque)を用いて単核細胞を分離することによって得ることができる。ここで、臍帯血とHetasepの混合比は、臍帯血５ｍｌ当たり０．５〜２ｍｌにするのが好ましい。
【００１５】
本発明では、臍帯血から単核細胞の分離収率を高めるために、分娩直後に回収した臍帯血、分娩直後に回収して室温で１２〜４８時間保管した臍帯血または３〜５℃で６〜７２時間保管した臍帯血を使用するのが好ましい。
【００１６】
本発明は、臍帯血から分離された単核細胞から幹細胞を分離する方法において、フィブロネクチンを用いることを特徴とする。本発明における用語‘フィブロネクチンを含む培養容器'とは、単核細胞とフィブロネクチンとが接触できる状態を意味する。例えば、フィブロネクチンは、培養容器にコーティングされるとか、粒子形態または三次元構造物の形態として培地に含まれることができる。一つの態様として、フィブロネクチンが培養容器にコーティングされた場合、フィブロネクチンは、０．１〜１ｍｇ／ｍｌの濃度で含まれることができる。
【００１７】
本発明において、フィブロネクチンは、特別な制限なく、動物から由来したものを使用することができるが、ヒトから由来したものが好ましい。前記フィブロネクチンは、人工合成(例えば、化学的合成法、タンパク質合成装置を用いた合成など)または生合成(例えば、組換えＤＮＡ技術、繊維芽細胞培養など)を通じて製造するとか、ヒトを含む動物の血漿または細胞外基質から分離することによって入手することもできる。前記フィブロネクチンは、フィブロネクチンの断片(fragment)またはペプチドであるとか、これを含むことができる。
【００１８】
単核細胞をフィブロネクチンが含まれた培養容器内で培養する時、利用可能な培地は、特に制限されないが、基本培地としては、ＳＮＵ−１またはＥＧＭ−２を用いるのが好ましい。
【００１９】
‘ＳＮＵ−１培地’の組成は、下記の通りである(表１)。
【００２０】
【表１】
【００２１】
本発明では、前記基本培地にＦＧＦ−Ｂ(Fibroblast Growth Factor)、アスコルビン酸(Ascorbic acid)、ＥＧＦ(Epodermal Growth Factor)、ヒドロコルチゾン(hydrocortisone)、ＩＧＦ−１(Insulin-like Growth Factor-1)またはＶＥＧＦ(Vascular Endothelial Growth Factor)、ヘパリン(heparin)を添加し、必要に応じてＧＡ−１０００(Gentamycin Sulfate、 Amphotericin-B)を更に添加するのが好ましい。
【００２２】
より好ましくは、 前記基本培地に、ウシ胎児血清(ＦＢＳ)２０％、ｂＦＧＦ(Fibroblast Growth Factor)１〜４０ｎｇ／ｍｌ、アスコルビン酸０．１〜５．０μｇ／ｍｌ、ＥＧＦ(Epidermal Growth Factor)１〜４０ｎｇ／ｍｌ、ヒドロコルチゾン０．１〜１μｇ／ｍｌ、ＩＧＦ−Ｉ(Insulin-like Growth Factor-1)１〜４０ｎｇ／ｍｌまたはＶＥＧＦ(Vascular Endothelial Growth Factor)１〜５ｎｇ／ｍｌ及びヘパリン２０〜２５μｇ／ｍｌを添加し、必要に応じてＧＡ−１０００(Gentamycin Sulfate、 Amphotericin-B)を更に添加することである。
【００２３】
一方、単核細胞を培養して３日後、付着しなかった単核細胞は除去し、付着した単核細胞のみを続けて培養する。これにより、付着した単核細胞のうち、幹細胞だけ選択的に増殖するようになり、分離した後、１２〜２０日の間に速く増殖する幹細胞を観察することができる。ここで、培地は２〜３日ごとに交替するのが好ましい。
【００２４】
培養物から臍帯血由来の万能幹細胞を取得する方法としては、ソーティング機能を有したフローサイトメーターを使用したＦＡＣＳ法(Int．Immunol.，10(3):275，1998)、磁気ビーズを使用する方法、間葉系幹細胞を特異的に認識する抗体を使用したパニング法(J．Immunol.，141(8):2797，1998)などがある。また、大量の培養物などから多分化能幹細胞を取得する方法としては、細胞の表面に発現されて分子（以下、表面抗原と称する）を特異的に認識する抗体を単独または組み合わせてこれをカラムとして使用する方法がある。
【００２５】
フローサイトメーターのソーティングの方式としては、水滴荷電方式、セルキャプチャー方式などを例示することができる。どちらの方法も、細胞の表面抗原を特異的に認識する抗体を蛍光に標識し、標識された抗体と抗原との結合体に対する蛍光を測定して蛍光強度を電気信号に変換することにより細胞の抗原発現量を定量することができる。また、使用する蛍光物質の種類を組み合わせることにより複数の表面抗原を発現している細胞を分離することも可能である。ここに使用可能な蛍光物質としては、ＦＩＴＣ(fluorescein isothiocyanate)、ＰＥ(phycoerythrin)、ＡＰＣ(allo-phycocyanin)、ＴＲ(TexasRed：テキサスレッド)、Ｃｙ３、ＣｙＣｈｒｏｍｅ、レッド(Red)６１３、レッド６７０、ＴＲＩ−カラー、クァンタムレッド(QuantumRed)などがある。
【００２６】
フローサイトメーターを使用したＦＡＣＳ法としては、前記にで取得した幹細胞溶液を集め、遠心分離などの方法で細胞を分離した後、直接抗体で染色する方法と、一度適当な培地中で培養、増殖を行った後に抗体を染色する方法を利用することができる。細胞の染色はまず、表面抗原を認識する一次抗体と目的の細胞サンプルを混合し、氷上で３０分〜１時間、インキュベーションする。一次抗体が蛍光で標識されている場合には、洗浄後フローサイトメーターで分離を行う。一次抗体が蛍光標識されていない場合には、洗浄後一次抗体に対して結合活性を有する蛍光標識された二次抗体と一次抗体が反応した細胞とを混合し、再び氷で３０分〜１時間、インキュベーションする。洗浄後、一次抗体と二次抗体で染色された細胞をフローサイトメーターで分離を行う。
【００２７】
本発明によって分離された、臍帯血由来の万能幹細胞は、下記の特性のうち、少なくとも一つの特性を有している：
（ａ）転写調節因子であるｃ−ｍｙｃ、ＺＮＦ２８１に対して陽性の免疫学的な特性を示す。
（ｂ）細胞外基質がコーティングされた底に付着され、付着の後５〜３０日の間に紡錘形または球形態の細胞集落を成しながら増殖する。
（ｃ）３０〜４５のＣＰＤＬ(cumulative population doubling level)を示す。
（ｄ）ＣＤ１４、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５及びＨＬＡ−ＤＲに対して陰性の免疫学的特性を示す。
（ｅ）中胚葉、内胚葉及び外胚葉の細胞に分化可能である。
（ｆ）ＴＩＭＰ−２、ＴＧＦ−β、ＲＡＮＴＥＳ ＣＩＮＣ−３、ＥＯＴＡＸＩＮ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ１２ｐ４０、ＩＬ１３、ＩＬ−１６、ＩＰ−１０、Ｌｅｐｔｉｎ、ＭＣＰ−２、ＭＩＧ、ＭＩＰ−３ａ、ｂ−ＮＧＦｍ、ｓＴＮＦＲＩ、ＰＦＧＦ−ｂｂからなる群から選択された少なくとも一つのサイトカインまたはケモカインを分泌する。
【００２８】
本発明の臍帯血由来の万能幹細胞がＯｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｒｅｘ−１、ｃ−ｍｙｃ、ＺＮＦ２８１を発現するということは、未分化状態が維持されていることを意味する。
【００２９】
また、本発明の臍帯血由来の万能幹細胞は、３０〜４５のＣＰＤＬ(cumulative population doubling level)を示し、増殖力が優れることを分かる。核型分析によって、本発明の細胞は速く増殖するが、正常染色体の構造を有していることが確証された。
【００３０】
本発明の臍帯血由来の万能幹細胞は、造血母幹細胞マーカーまたは免疫拒否反応関連マーカーとして知られたＣＤ１４、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５及びＨＬＡ−ＤＲに対して陰性の免疫学的な特性を示す。このように本発明の臍帯血由来の万能幹細胞は、造血及び免疫拒否反応関連マーカーが欠けて移植の時に血管形成と拒否反応を最小化することができ、同種間移植(allogenic transplantation)に有用な細胞として使用することができる。
【００３１】
本発明の臍帯血由来の万能幹細胞は、中胚葉の骨形成細胞、軟骨細胞、脂肪細胞への分化だけではなく、内胚葉の肝細胞及び外胚葉の神経細胞と網膜関連細胞へも分化することができる。よって、本発明の臍帯血由来の万能幹細胞は、多様な疾病を治療するのに利用され得る。
【００３２】
本発明の臍帯血由来の万能幹細胞は、ＴＩＭＰ−２、ＴＧＦ−β、ＲＡＮＴＥＳ ＣＩＮＣ−３、ＥＯＴＡＸＩＮ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ１２ｐ４０、ＩＬ１３、ＩＬ−１６、ＩＰ−１０、Ｌｅｐｔｉｎ、ＭＣＰ−２、ＭＩＧ、ＭＩＰ−３ａ、ｂ−ＮＧＦｍ、ｓＴＮＦＲＩ、ＰＦＧＦ−ｂｂなどの多様なサイトカインまたはケモカインを分泌する。このようなサイトカインまたはケモカインを分泌することにより本発明の臍帯血由来の万能幹細胞は、多様な疾病を治療するのに利用され得る。
【００３３】
このような特徴を有する幹細胞は、新規なものであって、本発明は、前記のような特徴を有する臍帯血由来の万能幹細胞を提供する。
【００３４】
本発明の臍帯血由来の万能幹細胞は、骨形成細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肝細胞、神経細胞を含めて多様な類型の細胞に分化することができ、それに対応されるように多様な疾病治療に利用することができる。よって、本発明は、本発明の臍帯血由来の万能幹細胞またはこれから分化した細胞を含有する細胞治療剤を提供する。本発明の細胞治療剤は、例えば、神経疾患(例えば、退行性神経疾患)、骨関節炎(例えば、退行性関節炎、リウマチ関節炎)、骨欠損(例えば、骨粗鬆症)、肝疾患(例えば、肝硬変)、心血管系疾患を含む多様な疾病を治療するのに利用され得る。
【００３５】
本発明の細胞治療剤は、細胞を保護及び維持する一つ以上の希釈剤を含むのが好ましい。前記希釈剤は、生理食塩水、ＰＢＳ(Phosphate Buffered Saline)、ＨＢＳＳ(Hank's balanced salt solution)などの緩衝溶液、血漿または血液成分などがあり得る。
【００３６】
一方、本発明は、新規な幹細胞培養用培地に関するものである。前記培地は、ウシ胎児血清(ＦＢＳ)２０％、ｂＦＧＦ(Fibroblast Growth Factor)１〜４０ｎｇ／ｍｌ、アスコルビン酸０．１〜５．０μｇ／ｍｌ、ＥＧＦ(Epidermal Growth Factor)１〜４０ｎｇ／ｍｌ、ヒドロコルチゾン０．１〜１μｇ／ｍｌ、ＩＧＦ−Ｉ(Insulin-like Growth Factor-1)１〜４０ｎｇ／ｍｌまたはＶＥＧＦ(Vascular Endothelial Growth Factor)１〜５ｎｇ／ｍｌ及びヘパリン２０〜２５μｇ／ｍｌが添加され、必要に応じてＧＡ−１０００(Gentamycin Sulfate、Amphotericin-B)が更に添加されたＥＧＭ−２またはＳＮＵ−１培地を含む。
【００３７】
前記幹細胞培養用培地は、新規なものであって、上述されたように、本発明による臍帯血由来の万能幹細胞の分離方法においても用いられた。本発明の培地は、臍帯血由来の幹細胞を含めてすべての成体幹細胞の増殖に有用であるので、成体幹細胞を培養するのに利用することができる。
【００３８】
また、本発明は、幹細胞を本発明の培地で培養して増殖させることを特徴とする幹細胞の培養方法に関するものである。前記幹細胞は、好ましくは成体幹細胞であり得る。
【００３９】
一つの態様として、本発明の幹細胞培養用培地は、本発明の臍帯血由来の万能幹細胞培養に利用され得る。本発明の臍帯血由来の万能幹細胞を本発明の培地で培養しながら紡錘形(spindle-shape)細胞の集落が確認されてから３〜５日後に継代培養するのが好ましい。培養は、５％ＣＯ２条件下で行うのが適合し、培養は、５〜３０日間長続くことができるが、これに制限されるのではない。
【００４０】
一方、本発明は、幹細胞を球培養(sphere culture)または三次元培養することを特徴とする幹細胞の幹性(stemness)を増加させる方法に関するものである。前記三次元培養の時にＭＥＦ(Mouse embryonic fibroblast cell)を用いることを特徴とするのが好ましい。また、前記幹細胞は、成体幹細胞であるものを更に含むことができる。
【００４１】
前記において、幹性増加とは、胚芽幹細胞様集落(Embryonic Stem Cell-like colony)を形成するとか、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２などのような転写調節因子をさらに強く発現することを意味する。
【発明の効果】
【００４２】
以上、詳細に記述したように、本発明による万能幹細胞は、ヒト臍帯血由来ので、フィブロネクチンを含む培養容器内で培養すれば、既存の成体幹細胞に比べて未分化段階で長い間に盛んな細胞成長をし、不治病治療に有用に使用されることができ、軟骨細胞、骨形成細胞及び脂肪細胞など多くの種類の細胞に分化する能力を有しているため、神経系疾患、心血管系、骨格系疾患などの治療に効果的である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、ヒト臍帯血由来の細胞を分離した後、それぞれ１４日目、１５日目、１６日目、１７日目、１８日目の細胞成長形態を示した写真（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ）及び新しい容器に移した後、Ｐａｓｓａｇｅ３で細胞成長を示した写真である（Ｆ）。
【図２】図２は、臍帯血由来の万能幹細胞の時間に応じる細胞増殖を累積で示したグラフである。
【図３】図３は、本発明による臍帯血由来の万能幹細胞を長期間培養した後、核型分析を行った結果である。
【図４】図４は、本発明による臍帯血由来の万能幹細胞に様々なマーカーを付着させて流細胞分析を行った結果である。
【図５】図５は、本発明による臍帯血由来の万能幹細胞が未分化状態幹細胞マーカーの発現を流細胞分析器と細胞免疫染色を介して分析した結果である（Ａ：Ｏｃｔ４流細胞分析結果グラフ、Ｂ：免疫染色でＯｃｔ４発現写真、Ｃ：Ｏｃｔ４発現写真の核染色写真、Ｄ：Ｏｃｔ４発現写真と核染色写真との合成）。
【図６】図６は、ｔｅｒｒａ−１、ｈＵＣＢ−ＭＳＣ、ＡＤ−ＭＳＣ及びＡＭにおいてＺＮＦ２８１の発現を確認した結果（上）と、３〜９回継代培養されたｈＵＣＢ−ＭＳＣにおいてＺＮＦ２８１の発現をＦＡＣＳ分析で確認した結果（下）である。
【図７】図７は、本発明によるヒト臍帯血由来の万能幹細胞がＺＮＦ２８１、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ｍｙｃ及びＲｅｘ−１のような未分化状態を維持するのにおいて重要な遺伝子を発現していることをＲＴ−ＰＣＲを介して確認した結果である。
【図８】図８は、ヒト臍帯血由来の万能幹細胞がそれぞれ骨形成細胞、脂肪細胞、軟骨細胞及び神経細胞に分化したことを示す写真である（Ａ：骨形成細胞に分化を誘導しなかった対照群をＡｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ Ｓで染色した写真、Ｂ：骨形成細胞に分化を誘導した細胞のＡｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ Ｓ染色写真、Ｃ：脂肪細胞に分化を誘導しなかった対照群のオイルレッドＯ(Oil red O)染色写真、Ｄ：脂肪細胞に分化を誘導した細胞のオイルレッドＯ(Oil red O)染色写真、Ｅ：軟骨細胞に分化を誘導した細胞のＴｏｌｕｉｄｉｎｅ Ｂｌｕｅ染色写真、Ｆ：軟骨細胞に分化を誘導した後に撮影した細胞ｐｅｌｌｅｔの写真、Ｇ：神経細胞に分化を誘導した後に神経細胞のマーカーであるＴｕｊ−１及びＭＡＰ２で免疫蛍光染色した写真）。
【図９】図９は、ヒト臍帯血由来の万能幹細胞を骨形成細胞及び脂肪細胞に分化を誘導した後、ＲＮＡを抽出した後にＲＴ−ＰＣＲを介して確認した結果である（ＰＰＡＲ−γとＦＡＢＰ−４は、脂肪細胞分化のマーカーであり、Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｔｙｐｅ １は、骨形成細胞分化のマーカーである。ＰＰＡＲ−γ：Peroxisome Proliferator-Activated Receptor gamma、ＦＡＢＰ−４：Fatty Acid Binding Protein-4、ＧＡＰＤＨ：Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）。
【図１０】図１０は、本発明による臍帯血由来の万能幹細胞の網膜関連タンパク質の発現様相を示したものである。
【図１１】図１１は、ヒト臍帯血由来の万能幹細胞を培養した培養液を集めて細胞が分泌した様々なサイトカインを抗体配列(antibody array)を用いて分析した写真である(Ａ：ｈＵＣＢ−ＭＳＣ１、Ｂ：ｈＵＣＢ−ＭＳＣ２、Ｃ：ｈＵＣＢ−ＭＳＣ３、Ｄ：配列された抗体の順に、ＰＯＳ：Positive control、ＮＥＧ：Negative control、ＧＣＳＦ：Granulocyte-Colony Stimulating Factor、ＧＭ−ＣＳＦ：Granulocyte Monocyte-Colony Stimulating Factor、ＩＣＡＭ−１：Intra-Cellular Adhesion Molecule、ＩＦＮ−γ：Interferon-γ、ＩＬ：Interleukin、ＭＣＰ：Monocyte Chemoattractant Protein、Ｍ−ＣＳＦ：Monocyte-Golony Stimulating Factor、ＭＩＧ：Monokine induced by Interferon Gamma、ＭＩＰ：Macrophage Inflammatory Protein、ＲＡＮＴＥＳ：Regulated upon Activation、Normal T-cell Expressed and Secreted、ＴＧＦ−β：Transforming Growth Factor-β、ＴＮＦ：Tumour Necrosis Factor、ｓＴＮＦＲ：soluble Tumour Necrosis Factor Receptor、ＰＤＧＦ−ＢＢ：Platelet-Derived Growth Factor-BB、ＴＩＭＰ２：Tissue Inhibitor of Metalloproteinases-2)。
【図１２】図１２、図１３は、本発明によって分離した臍帯血由来の万能幹細胞を球培養(sphere culture)及びマウス線維芽細胞(mouse fibroblast cell)であるＳＴＯ細胞を用いて三次原的に培養した写真及び転写調節因子であるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２遺伝子の発現様相をＲＴ−ＰＣＲを介して確認した結果である（図１２：球培養を介した臍帯血由来の万能幹細胞の三次元培養、図１３：ＳＴＯ細胞を用いた臍帯血由来の万能幹細胞の三次元培養）。
【図１３】図１２、図１３は、本発明によって分離した臍帯血由来の万能幹細胞を球培養(sphere culture)及びマウス線維芽細胞(mouse fibroblast cell)であるＳＴＯ細胞を用いて三次原的に培養した写真及び転写調節因子であるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２遺伝子の発現様相をＲＴ−ＰＣＲを介して確認した結果である（図１２：球培養を介した臍帯血由来の万能幹細胞の三次元培養、図１３：ＳＴＯ細胞を用いた臍帯血由来の万能幹細胞の三次元培養）。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
以下、実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということは、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者において自明なことである。
【００４５】
実施例１：本発明による臍帯血由来の万能幹細胞の培養、増殖能の調査及び核型分析
Ｆｕｌｌ ｔｅｒｍ ＵＣＢサンプル（ｎ＝２０）は、産婦の同意下で集めた。まず、Ｆｕｌｌ ｔｅｒｍ ＵＣＢをＨｅｔａＳｅｐ(Stem cells TechnologiesINC，Vancouver，BC)を用いて赤血球を優先的に分離した。その後は、既存の方法と同様にフィコール相(ficoll gradient)から分離を行った。分離した単核細胞を２０％ＦＢＳを含有したＥＧＭ−２ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓを添加したＳＮＵ−１培地またはＥＧＭ−２（Ｌｏｎｚａ）を用いてフィブロネクチンを０．１ｍｇ／ｍｌ−１ｍｇ／ｍｌの濃度でコーティングした６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１×１０５〜８細胞で培養した。ＥＧＭ−２ ＳｉｎｇＱｏｕｔｓの構成は、ヘパリン(heparin)、アスコルビン酸(Ascorbic acid)、ｒｈＥＧＦ、ヒドロコルチゾン(hydrocortisone)、ＶＥＧＦ、ｒｈＦＧＦ−Ｂ、Ｒ３−ＩＧＦ−１、ＧＡ−１０００から構成されている。細胞を培養してから３日後に付着されなかった単核細胞を除去し、培地は２〜３日ごとに交替させた。
【００４６】
前記分離した後、ＣＯ２５％の条件で培養してから５〜３０日目に、一定の紡錘形の細胞などが集落を成すことを確認した（図１Ａ）。生成された集落は、速い速度で増殖し、集落が観察されてから３日〜７日後、０．１２５％のＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡで浮遊させた後、新しい容器に移して細胞を続けて維持した（図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅ及び図１Ｆ）。図１は、このような過程を示す写真であって、時間が経過するに応じて細胞集落の大きさが増加することを見られ、また、継代培養の後にも細胞の形状が一定に維持されることを観察することができる。（図１：本実施例によって分離した臍帯血由来の万能幹細胞の形成と増殖過程を示す写真。Ａ：単核細胞培養１４日後の初期集落の形態、Ｂ：１５日、Ｃ：１６日、Ｄ：１７日、Ｅ：１８日、Ｆ：継代培養後のｐａｓｓａｇｅ３で観察した細胞の写真）。
【００４７】
持続的に細胞を培養しながら、分離した臍帯血由来の万能幹細胞の増殖力がどのくらいなのか調査するためにＣＰＤＬ(cumulative population doubling level)を測定した(Cristofalo et al.，Proc．Natl．Acad．Sci.，USA 95，1998)。細胞は、二分法を用いて増殖する。したがって、細胞の成長速度は、１つの細胞が２つの細胞になる時間がどのくらいなのかに応じて決定される。これをＤｏｕｂｌｉｎｇ ｔｉｍｅといい、細胞の増殖力を評価できる尺度として使用され得る。もし、ＣＤＰＬ値が１０であれば、１つの細胞が１０回の分裂をすることを意味し、これを数値上で計算すれば、１つの細胞が約１０００個の細胞まで増殖することを意味する。既存の臍帯血由来の幹細胞の最大の問題点は、脂肪組職や骨髓由来の間葉系幹細胞に比べて著しく落ちる増殖力であり、細胞の大量増殖である臨床適用の側面からも増殖力が重要であると見られる。測定方法は、次のように行った。まず、異なる臍帯血サンプルから分離した３種類の臍帯血由来の万能幹細胞を１００ディッシュに２×１０５個ずつ培養し、３日または４日ごとに継代を行い、細胞計算機を用いて細胞数を測定した。細胞の増殖が止めるまで継続的に細胞を培養して細胞数を測定した。このように求めた細胞数を次のような数学式１を用いてＣＰＤＬ値を求める。
【００４８】
【数１】
【００４９】
ここで、ＮＩは、最初培養をはじめる時の細胞数、ＮＨは、継代を行う当時の飽和状態での細胞数を意味する。
【００５０】
このような方法で持続的に細胞を維持しながら値を求めた。対照群としては、やはり臍帯血から由来した内皮前駆細胞(hUCB-EPC; human Umbilical cord blood derived endothelial progenitor cells)を用いた。その結果は、図２のグラフのように、臍帯血由来の内皮前駆細胞が２ヶ月程度の培養時間に約２０ＣＰＤＬを示した一方、臍帯血由来の万能幹細胞の場合は、３種類の異なるサンプルのすべてが４０〜４５ＣＰＤＬを示した。このような数値は、理論上に１つの細胞集落から１０１２まで増殖できることを意味する。
【００５１】
一般的に、このような盛んな増殖力を示す細胞は、癌細胞化されて速く爆発的に増加する場合があり得る。癌細胞化された細胞は、人体内で多くの調節信号などを無視して大きく増殖する傾向があるため、細胞治療剤として利用することができず、研究の目的もないと見られる。したがって、本発明によって分離した臍帯血由来の万能幹細胞が正常な染色体を有した細胞なのか確認を必ずしなければならず、その方法として、核型分析を解して細胞の染色体異常を確認して見た。図３からわかるように、ｐａｓｓａｇｅ１０の細胞においても正常染色体の構造を有していることが確認された。
【００５２】
実施例２：本発明による臍帯血由来の万能幹細胞の表面抗原分析
培地内に懸濁した細胞などを特性を分析するフローサイトメトリー(flow cytometry)実験を行った。細胞表面抗原のフェノタイピング(phenotyping)のために、３−４継代細胞などを取得してＦＩＴＣ(fluorescein isothiocyanate)またはＰＥ(phycoerythrin)が結合された抗体で染色し、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ(Becton Dickinson，NY)にて分析を行った。
【００５３】
本発明によって分離した臍帯血由来の万能幹細胞(partially pluripotent stem cell)の特性を分析するために、標識抗原としては、ＣＤ１０(Ｔ細胞マーカー)、ＣＤ１４(単核細胞マーカー)、ＣＤ２４(上皮細胞マーカー)、ＣＤ２９(単核細胞マーカー)、ＣＤ３１(内皮細胞マーカー)、ＣＤ３４(造血母幹細胞マーカー)、ＣＤ４４(間葉系幹細胞マーカー)、ＣＤ４５(非造血母幹細胞マーカー)、ＣＤ５１／６１(破骨細胞マーカー)、ＣＤ７３(間葉系幹細胞マーカー)、ＣＤ９０(間葉系幹細胞マーカー)、ＣＤ１０５(間葉系幹細胞マーカー)、ＣＤ１３３(造血母幹細胞マーカー)、ＨＬＡ−ＤＲ(免疫拒否反応関連マーカー)を使用し、これをフローサイトメトリーを用いて分析を行った。実施結果は、表２の通りである。図４は、下記の結果をグラフで表示したものである。
【００５４】
【表２】
【００５５】
実施例３：本発明による臍帯血由来の万能幹細胞のＺＮＦ２８１発現及び核心転写因子(Core transcription factor)発現様相分析
ＺＮＦ２８１(Zinc finger protein 281)は、ＥＳＣで核心転写因子中の一つである(Wang J et al．(2006) Nature 444，364-368)。初期にＺＢＰ−９９と命名された、ＺＮＦ２８１は、ＺＢＰ−８９と９１％アミノ酸配列類似性及び７９％配列同一性を共有する４つのＫｒｐｐｅｌ型ジンクフィンガーを保有している。また、２つの遺伝子のカルボキシ末端切片には、よく保存されたアミノ酸配列が存在する。ＺＮＦ２８１ ｃＤＮＡの予想されるオープンリーディングフレームは、９９ｋＤａタンパク質を暗号化する。ＥＭＳＡ(Electrophoretic mobility shift as say)の結果では、ガストリン(GASTRIN)及びオルニチン脱炭酸酵素(ORNITHINE DECARBOXYLASE)遺伝子のＧＣ−リッチ(rich)プロモーター部位に特異的に結合することを示す(Law DJ et al．(1999) Biochem Biophys Res Commun 262，113-120; Lisowsky T et a l．(1999) FEBS Lett 453，369-374)。ＺＮＦ２８１は、質量スペクトル多次元タンパク質同定技術(mass spectral multidimensional protein identification technology)と組合されたタンデム親和度精製(tandem affinity purification)によってｃ−ＭＹＣ連関タンパク質のうちの一つとして同定された(Koch HB et al．(2007) Cell Cycle 6，205-217)。
【００５６】
ＰＯＵファミリー転写因子(family transcription factors)のようなＯｃｔ３／４遺伝子などは、分化した組職では存在せず、高い増殖能を含有する未分化した幹細胞などから特別に発現されるものとして知られている(Tai M-H．et al.，Carcinogenesis 26:4 95，2005; Tondreau T．et al.，Stem cells，23:1105，2005)。一般的に胚芽幹細胞のマーカーとして使用されるが、前記のような特性で未分化状態を意味するマーカーとして使用されることもある。それで幹性(stemness)のマーカーとしてＯｃｔ４を使用して細胞コロニーを染色した結果、多い細胞などが核部位にＯｃｔ４が染色されることを確認することができ、フローサイトメトリーを介した分析においても多くの細胞で発現することを確認することができた。
【００５７】
細胞内タンパク質(intracellular proteins)の染色のために、細胞などは、４℃で４％ホルムアルデヒドで一晩固定し、０．１％トリトン(Triton)Ｘ−１００(Sigma-Aldrich)で１０分間透過処理(permeabilize)した。スライドとディッシュは、ヒトＯｃｔ４(１：２００)に対するマウス１次抗体で１時間インキュベーションした後、ＰＢＳ(phosphate buffered saline; Gibco)で洗浄し、赤色蛍光染料であるＡｌｅｘａ５９４が結合されたｇｏａｔ抗マウスＩｇＧ２次抗体(Invitrogen)で１時間インキュベーションして免疫染色を行い、対照染色としてＤＡＰＩを用いて核を染色した。
【００５８】
図５、図６に示されたように、Ｏｃｔ４染色結果、多い臍帯血由来の万能幹細胞でＯｃｔ４を発現することとして示された（図５Ａ：Ｏｃｔ４流細胞分析結果グラフ、Ｂ：免疫染色でＯｃｔ４発現写真、Ｃ：Ｏｃｔ４発現写真の核染色写真、Ｄ：Ｏｃｔ４発現写真と核染色写真との合成写真）。
【００５９】
これらのＯｃｔ４のような遺伝子は、幹細胞の幹性(stemness)と極めて密接に関連されており、実際に、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２などのような遺伝子を過発現させて成体幹細胞で胚芽幹細胞と類似した構造の全能性を有した細胞を誘導する技術も最近研究された(Takahashi et al，Cell，131(5)，861-872，2007)。したがって、幹細胞においてこのような遺伝子の発現は、幹細胞の幹性(stemness)を失わないのに未分化状態を維持するのにおいて非常に重要であるといえる。したがって、本発明によって分離した臍帯血由来の万能幹細胞において、既存の論文によって知られたＺＮＦ２ ８１、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２のような遺伝子の発現がどのように示されるのか逆転写重合酵素連鎖反応(ＲＴ−ＰＣＲ)を介して確認してみることにした。
【００６０】
本実施例のために作製されたプライマーは、下記の表３の通りである。
【００６１】
【表３】
【００６２】
図７から実験結果を見ると、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、ｃ−ｍｙｃ、ＺＮＦ２８１、ＲＥＸ−１などの遺伝子が発現することを確認することができる。これは、本発明による臍帯血由来の幹細胞の万能幹細胞としての能力を示すものであるといえるでしょう。
【００６３】
実施例４：本発明による臍帯血由来の万能幹細胞の骨形成細胞への分化
骨形成細胞へ分化を誘導するために細胞を付着させ、細胞が付着してから約７０−８０％のコンフルアンシ(confluency)になるまで培養した。７０−８０％のコンフルアンシに到逹した場合に骨分化誘導培地に交換した。骨分化誘導培地は、ＤＭＥＭ(low glucose)に１０％のＦＢＳを添加し、１０ｍＭのβ−グリセロリン酸(beta-glycerophosphate)(Sigma-Aldrich)、０．１μＭのデキサメタゾン(Dexamethasone)(Sigma-Aldrich)、５０μＭのアスコルビン酸塩(ascorbate)(Sigma-Aldrich)を添加して製造した。培地は、３日ごとに交換させ、分化誘導は、約２週間行った。
【００６４】
２週後、骨分化によったカルシウム鉱物化(calcium mineralization)を確認するためにアリザリンレッドＳ染色(Alizarin red s staining)を行った。染色方法は、次の通りである。培地を除去した後に蒸溜水を用いて２回洗浄した後、冷たい７０％のＥｔＯＨを使用して４℃で１時間固定した。再び蒸溜水で２回洗浄した後、４０ｍＭのアリザリンレッドＳ(Alizarin red s)を使用して常温で１０分間染色した。その後に蒸溜水を用いて５回洗浄した。
【００６５】
染色を行った結果、図８Ａ、図８Ｂに示されたように、分化を誘導しない図８Ａは、アリザリンレッドＳ(Alizarin red s)に染色されたカルシウムがほとんど見えないが、分化を誘導した図８Ｂでは、赤色で染色されることを観察できる。これは、臍帯血由来の万能幹細胞が骨形成細胞へ分化してカルシウムを分泌することを意味すると見られる。
【００６６】
実施例５：本発明による臍帯血由来の万能幹細胞の脂肪細胞への分化
脂肪細胞分化を誘導するために、細胞が付着してから約７０−８０％のコンフルアンシになるまで培養した。７０−８０％のコンフルアンシに到逹した場合に脂肪分化誘導培地に交換した。脂肪分化誘導培地は、ＤＭＥＭ(low glucose)に１０％のＦＢＳを添加した。１μＭのデキサメタゾン(Dexamethasone)、１０μｇ／ｍｌのインシュリン(insulin)(Sigma-Aldrich)、０．５ｍＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチン(3-isobutyl-1-methylxanthine)(Sigma-Aldrich)、０．２ｍＭのインドメタシン(indomethacin)(Sigma-Aldrich)を添加して分化培地を製造した。分化誘導培地は、３日ごとに交換させ、分化誘導は、約２−３週間行った。
【００６７】
２−３週の後にオイルレッドＯ(Oil red O)染色を行って脂肪分化が誘導されたことを確認する。培地を除去してＰＢＳを用いて洗浄した後、１０％のホルマリンを入れて常温で５分間置いた。ホルマリンを除去し、再び新しいホルマリンを同量入れて常温で最小１時間以上固定した。ホルマリンを除去した後、６０％のイソプロパノール(isopropanol)を用いて洗浄した。完全に乾くまで待った後、オイルレッドＯ(Oil red O)染色薬を入れて常温で１０分間染色した。染色薬を除去した後、直ちに蒸溜水を入れて洗浄した。
【００６８】
脂肪幹細胞への分化を経る細胞などは、オイルレッドＯ(Oil red O)によって染色された時に赤い色を示すが、オイルレッドＯ(Oil red O)は、脂肪細胞の脂肪滴(lipid droplet)を赤い色で染色するからである。図８Ｃ及び図８Ｄからわかるように、分化を誘導しない図８Ｃは、脂肪滴(lipid droplet)が多く見えないだけでなく染色もほとんどできなかったが、分化を誘導した図８Ｄは、脂肪滴(lipid droplet)が多く見えて赤い色に染色されたことを観察できる。
【００６９】
実施例６：本発明による臍帯血由来の万能幹細胞の軟骨細胞への分化
軟骨細胞へ分化を誘導するために、ロンザ(Lonza)から出たｒＴＧＦ−ｂｅｔａ ３を含有した軟骨細胞形成培地(PT-3003)に３週間処理した。培地は、一週間に２回ずつ交換させ、軟骨細胞形成(osteogenesis)は、１週間ごとに測定した。
【００７０】
軟骨細胞に分化したのか調べるために、トルイジンブルー染色(toluidine blue staining)を行った。細胞などを１０時間４％のホルムアルデヒドで固定し、その後に再び１０時間ピクリン酸(picric acid)で固定した。その後、クリオセクション(cryosection)して３分間トルイジンブルー染色(toluidine blue staining)を行い、ヘマトキシリン(hematoxilin)で３秒間対比染色(counterstaining)を行った。
【００７１】
軟骨細胞への分化を経る細胞などは、ペレット(pellet)が崩れず、一定の形態を維持してトルイジンブルー(toluidine blue)によって染色された時に青色を示すが、図８Ｅ及び図８Ｆに示されたように、青色に染色されていることを確認することができ、形態もよく維持していることを確認することができる。
【００７２】
実施例７：本発明による臍帯血由来の万能幹細胞の骨形成細胞及び脂肪細胞へ分化誘導後の遺伝子発現レベルの変化
幹細胞は、分化過程を経ながら遺伝子発現の様相が著しく変化することを観察することができる。一般的に、幹細胞が脂肪細胞へ分化をするようになると、ＰＰＡＲ−γ(Peroxisome Proloferator-activated Receptor-γ)やＦＡＢＰ４(Fatty Acid Binding Protein 4)のような遺伝子の発現が増加し、骨形成細胞へ分化するようになると、コラーゲン型１(Collagen Type 1)などの遺伝子発現が増加する(Mat hews et al.，J Am Acad Dermatol，56(3)，472-492，2007; Cho et al.，J．Cell．Biochem.，96，533-542，2005)。したがって、分化を誘導した後、特定細胞で発現する遺伝子の発現レベルを見ることによって、間接的に分化を確認することができる。実験方法は、下記の通りである。
【００７３】
骨形成細胞と脂肪細胞とをそれぞれ誘導２−３週後にＴｒｉｚｏｌ(Invitrogen)を用いてＲＮＡを抽出した。ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ(Bioneer)を使用してｃＤＮＡを合成し、Ｍａｘｉｍｅ ＰＣＲ ＰｒｅＭｉｘ Ｋｉｔ(Intronbio)を用いてＰＣＲを行った。
【００７４】
本実施例に使用するために作製したプライマーは、下記の表４の通りである。
【００７５】
【表４】
【００７６】
実験を行った結果、図９からわかるように、脂肪細胞分化マーカーであるＰＰＡＲ−γとＦＡＢＰ４とは、分化を誘導した細胞で発現が大きく増加することが見られ、骨形成細胞の分化マーカーであるコラーゲン型１(Collagen Type 1)の場合も同様に分化を誘導した細胞で大きく増加することが見られた。一方、ローディングコントロール(loading control)であるＧＡＰＤＨの場合、分化を誘導した細胞としない細胞とのいずれも同一に出たし、したがって、実験結果の正当性を裏付けた。
【００７７】
実施例８：本発明による臍帯血由来の万能幹細胞の神経細胞への分化
神経細胞へ分化を誘導するために、一応５％のＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ(basic Fibroblast Growth Factor)を含有したＤＭＥＭから構成された培地で２４時間前処理(preincubation)した。本格的な神経分化を誘導するために、１％のＤＭＳＯ、１００ｕＭのＢＨＡ、０．５ｍＭのＶＰＡ、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ、Ｂ２７を含有したＤＭＥＭから構成された神経細胞形成培地に２４時間処理した。神経細胞へ分化したのか調べるために、細胞を４％パラホルムアルデヒド(paraformaldehyde)に固定した後、Ｔｕｊ−１、ＭＡＰ−２、ＧＦＡＰ、ニューロフィラメント−１６０(Neurofilament-160)の神経細胞マーカーで免疫染色を行った場合、４種類のマーカーを発現することを確認することができた(図８Ｇ)。
【００７８】
実施例９：本発明による臍帯血由来の間葉系幹細胞の網膜(retina)関連特性タンパク質発現分析
本実施例は、臍帯血由来の万能幹細胞で網膜(retina)関連特性を調べるために、免疫蛍光染色法を用いて発現程度及びパターンに関して確認した。網膜(retina)だけで特異的に発現するタンパク質の発現様相を確認した。
【００７９】
図１０は、網膜で特異的に発現するタンパク質を免疫蛍光染色を介して発現様相を確認した写真である。Ａ）では、ＰＡＸ６及びＨｕ ｐｒｏｔｅｉｎの発現様相を観察した。ＰＡＸ６は、網膜前駆体マーカー(retina progenitor marker)として知られており、Ｈｕ ｐｒｏｔｅｉｎは、網膜を構成する細胞のうちの１つである神経節細胞(ganglion cell)及びアマクリン細胞(amacrine cell)で特異的に発現するタンパク質である。一般的な細胞培養状態では発現しないことを確認した。Ｂ）では、オプシン(Opsin)とロドプシン(Rhodopsin)との発現様相を確認した。オプシンの場合は、錘体細胞(Cone cell)に特異的に発現するタンパク質であり、ロドプシンの場合は、杆体細胞(rod cell)に特異的に発現するタンパク質である。一般的な細胞培養状態でオプシンは発現しなかったが、ロドプシンは発現することを確認した。Ｃ）では、ＣＲＸ及びリカバリン(Recoverin)との発現様相を確認した。ＣＲＸは、ｐａｎ−ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍａｒｋｅｒとして知られており、リカバリンは、ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍａｒｋｅｒとして知られている。一般的な細胞培養状態では発現しないことを確認した(倍率４００倍、ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝５０ｕｍ)。
【００８０】
実施例１０：本発明による臍帯血由来の万能幹細胞で分泌したサイトカイン分析
幹細胞を用いた治療の可能性は、大きく２つに分けられ得る。第１は、損傷された細胞への直接的な分化を介した治療効果であり、第２は、生体内で既存の細胞などに治療効果を示すことができる肯定的な変化を起こす多くのサイトカインや成長因子を分泌する能力である。一般的に、幹細胞は多くのサイトカインまたは成長因子を分泌するものとして知られている(Kim et al．Cytokine．2005)。このような効果をパラクリン効果(paracrine effect)と呼ぶ。本発明によって分離・増殖した臍帯血由来の万能幹細胞のサイトカイン分泌様相がどうか調べるために、ヒトサイトカイン抗体アレイ(human Cytokine antibody array)(RaybioTech．Norc ross，USA)を用いて調査して見た。
【００８１】
まず、ＦＢＳとサプリメント(Supplement)を除去した培養液を用いて細胞を２４時間安定化させた後、２時間ごとに培地を１ｍｌずつ集めた。集めた培地を１００μｌずつ合わせてタンパク質定量法を用いて定量した後、配列を行った。
【００８２】
図１１からわかるように、３つの異なるサンプルから分離した臍帯血由来の万能幹細胞で共通的にＩＬ−８、ＴＩＭＰ−２などが分泌することを確認でき、その他に、ＴＧＦ−β、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＩＮＣ−３、エオタキシン(EOTAXIN)、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ１２ｐ４０、ＩＬ１３、ＩＬ−１６、ＩＰ−１０、レプチン(Leptin)、ＭＣＰ−２、ＭＩＧ、ＭＩＰ−３ａ、ｂ−ＮＧＦｍ、ｓＴＮＦＲＩ、ＰＦＧＦ−ｂｂのようなサイトカインなども分泌することを確認することができた(図１１Ａ：ｈＵＣＢ−ＭＳＣ１の配列分析写真、図１１Ｂ：ｈＵＣＢ−ＭＳＣ２、図１１Ｃ：ｈＵＣＢ−ＭＳＣ３、図１１Ｄ：抗体配列手順)。
【００８３】
実施例１１：本発明による臍帯血由来の万能幹細胞の三次元培養
成体幹細胞は、一般的に培養ディッシュ(culture dish)で単層(monolayer)へ増殖する。しかし、２Ｄではない３Ｄ状態の球(sphere)で増殖させると、さらに幹性(stemness)の高い細胞を選別して増殖させ得ることを実験を介して確認した。球(sphere)の形成のために培養ディッシュ(culture dish)を０．７％のアガロース(agarose)でコーティングさせるが、細胞がディッシュの底に侵透できないようにコーティングは５ｍｍ以上になるようにする。細胞を接種(seeding)する時に、単細胞(single cell)間の付着を最小化するために、ｃｍ２当り２０００個未満の細胞を振り撤いた。このように得られた球(sphere)は、４０μｍのストレーナ(strainer)を用いて球(sphere)を形成できなかった単細胞(single cell)と区分した。その結果、図１２からわかるように、球培養(sphere culture)時に細胞死せず、球(sphere)を形成して幹細胞の特徴を維持することを観察できる。また、図１２Ａ−Ｄのように、球培養(sphere culture)を介して培養した細胞は、単層(monolayer)で培養した幹細胞に比べて相対的にＯＣＴ４、ＳＯＸ２などの胚芽マーカー(embryonic marker)の発現が高く示されることを観察できた。
【００８４】
胚芽幹細胞(Embryonic stem cell)の培養は、マウス胚芽線維芽細胞(Mouse embryonic fibroblast cell)上でなされる。マウス胚芽線維芽細胞(Mouse embryonic fibroblast cell)が出すＬＩＦなどの様々なケモカイン(chemokine)がＥＳ細胞の形態を維持して分化しないように抑える役割を果たすからである。臍帯血由来の万能幹細胞をマウス胚芽線維芽細胞(mouse embryonic fibroblast cell line)上で培養した結果、一般的な成体幹細胞の形態のように偏平ではなく三次原的な形態でコロニー(colony)を成すことを観察した。ＳＴＯ細胞は、マイトマイシンＣ(mitomycin C)を０．１ｍｇ／ｍｌで処理して増殖を抑制した後、０．１％のゼラチン(gelatin)がコーティングされたディッシュに２×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌで接種(seeding)した後２４時間培養した後に臍帯血由来の万能幹細胞を接種(seeding)した。その結果、図１３からわかるように、時間が過ぎることに応じて細胞がＳＴＯ細胞上で胚芽幹細胞(Embryonic stem cell)と類似するように増殖することを観察できる。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明による万能幹細胞は、ヒト臍帯血由来で、フィブロネクチンを含む培養容器内で培養すると、既存の成体幹細胞に比べて未分化段階で長期間盛んな細胞成長をし、不治病治療に有用に使用されることができ、軟骨細胞、骨形成細胞及び脂肪細胞など多くの種類の細胞へ分化する能力を有しているため、神経系疾患、心血管系、骨格係疾患などの治療に使用され得る。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臍帯血から分離された単核細胞をフィブロネクチンが含まれた培養容器内で培養した後、培養物から幹細胞を回収することを特徴とする臍帯血由来の万能幹細胞の分離方法、本発明によって分離された臍帯血由来の万能幹細胞、前記の臍帯血由来の万能幹細胞またはこれから分化した細胞を含む細胞治療剤に関するものである。また、本発明は、新規な幹細胞培養用培地、この培地で幹細胞を培養して増殖させることを特徴とする幹細胞の培養方法、及び幹細胞を球培養(sphere culture)または三次元培養することを特徴とする幹細胞の幹性(stemness)増加方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞などは、自己再生(self-renewing)、分化、永久性(immortal)などの特徴を有しており、このような独特の性質を用いて再生医学の観点から多様な退行性疾病の治療のための解決方法として提示されるだけでなく、細胞などのバイオロジーに対する深い通察ができる。多様な組職から得ることができる成体幹細胞は、一般的に胚芽幹細胞に比べて無制限的なソースと研究者らが直面できる倫理的な問題を避けることができるため、遥かに魅力的である。さらに、臍帯血から分離された幹細胞は、骨髓や脂肪組職と異なって寄贈者が追加的な害を被る恐れがないので、他の成体幹細胞などよりもさらに大きい長所を有している。
【０００３】
試験管内(in vitro)で臍帯血由来の間葉系幹細胞は、成功的に神経細胞、肝細胞、骨細胞のような多様な種類の細胞に成功的に導入された(Sun, W. et al., Stem cells, 23:931, 2005; Hong SH. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 30:1153, 2005; Hutson EL. et al., Tissue Engineering, 11:1407, 2005)。また、生体内(in vivo)で、臍帯血間葉系幹細胞を用いた傷、糖尿病、心臓梗塞(heart infraction)などに成功的な移植が多くの論文などを介して報告されて来た(Nonome, K. et al., Am, J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 289:1091, 2005; Yoshida, S. et al., Stem cells, 23:1409, 2005; Kim Bo. et al., Circulation, 112:96, 2005)。伝染病の伝達危険が少なく、移植片対宿主病(graft-versus-host disease)にかかる危険が低いため、臍帯血間葉系幹細胞移植は、小児、大人患者の皆に急速に施術されている(Claudio G. B. et al., Annual Review of Medicine, 57:403, 2006)。臍帯血移植がいくつかの疾病、特に、造血母欠陷(hematopoietic defection)に係った疾病などに施術することができる方法として受け入れられたと言っても(Grewal, SS. et al., Blood, 103:1147, 2004; Knutsen, AP. et al., Journal pediatrics, 142:519, 2003; Ooi, J. et al., Blood, 103:489, 2004; Sanz GF. et al., Blood, 103:489, 2004)、臍帯血由来の間葉系幹細胞の臨床的な適用に関する研究は、依然として制限されている。例えば、脊髓損傷された女性及びバージャー病(buerger's disease)患者において、完全な回復ではないが、部分的に成功した報告などがある(Kim, SW. et al., Stem Cells, 2006; Kang, KS. et al., Cytotherapy, 7:368, 2005)。しかし、このような細胞などの発達メカニズムだけでなく、この細胞などをどんなによく培養して増殖するかに対しては、依然としてよく知られていない。
【０００４】
臍帯血から間葉系幹細胞を分離する方法は、骨髓由来の間葉系幹細胞の分離方法を適用した時に、細胞の分離率が２０％内外であり、５時間以内の新鮮な血液を使用した時は、５０％であるが、その以後になると、２０％以下に落ち、分離後にも細胞の増殖がよくできない限界を示した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明者らは、ヒト臍帯血由来の血液から分離した単核細胞をフィブロネクチンが含まれた培養容器で培養し、紡錘形(spindle-shape)の細胞が大量に増殖され、集落を成すことを見付け、これを持続的に培養した時、細胞の特性が一定ほど維持されることを確認した。それで既存の方法において問題視されている臍帯血由来の非造血係万能幹細胞及び間葉系幹細胞の效率的分離及び大量増殖が可能な培養方法として本発明を完成した。
【０００６】
本発明の一つの目的は、臍帯血から分離された単核細胞をフィブロネクチンが含まれた培養容器内で培養した後、培養物から幹細胞を回収することを特徴とする臍帯血由来の万能幹細胞の分離方法を提供することにある。
【０００７】
本発明の他の目的は、前記分離方法によって分離された臍帯血由来の万能幹細胞を提供することにある。
【０００８】
本発明のまた他の目的は、前記臍帯血由来の万能幹細胞またはこれから分化した細胞を含有する細胞治療剤を提供することにある。
【０００９】
本発明のまた他の目的は、本発明による新規な幹細胞培養用培地を提供することにある。
【００１０】
本発明のまた他の目的は、幹細胞を前記培地で培養して増殖させることを特徴とする幹細胞の培養方法を提供することにある。
【００１１】
本発明のまた他の目的は、幹細胞を球培養または三次元培養することを特徴とする幹細胞の幹性増加方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の一つの観点は、臍帯血から分離された単核細胞をフィブロネクチンが含まれた培養容器内で培養した後、培養物から幹細胞を回収することを特徴とする臍帯血由来の万能幹細胞の分離方法に関するものである。
【００１３】
前記培養物から幹細胞を回収することにおいて、幹細胞の免疫学的特性を用いて分離することを更に含むことができる。
【００１４】
先ず、臍帯血から単核細胞の分離は、当業界に知られている通常の方法を用いて行うことができる。本発明の一つの態様においては、臍帯血とHetasepを混合して赤血球を除去した後、フィコール−プラーク(Ficoll-plaque)を用いて単核細胞を分離することによって得ることができる。ここで、臍帯血とHetasepの混合比は、臍帯血５ｍｌ当たり０．５〜２ｍｌにするのが好ましい。
【００１５】
本発明では、臍帯血から単核細胞の分離収率を高めるために、分娩直後に回収した臍帯血、分娩直後に回収して室温で１２〜４８時間保管した臍帯血または３〜５℃で６〜７２時間保管した臍帯血を使用するのが好ましい。
【００１６】
本発明は、臍帯血から分離された単核細胞から幹細胞を分離する方法において、フィブロネクチンを用いることを特徴とする。本発明における用語‘フィブロネクチンを含む培養容器'とは、単核細胞とフィブロネクチンとが接触できる状態を意味する。例えば、フィブロネクチンは、培養容器にコーティングされるとか、粒子形態または三次元構造物の形態として培地に含まれることができる。一つの態様として、フィブロネクチンが培養容器にコーティングされた場合、フィブロネクチンは、０．１〜１ｍｇ／ｍｌの濃度で含まれることができる。
【００１７】
本発明において、フィブロネクチンは、特別な制限なく、動物から由来したものを使用することができるが、ヒトから由来したものが好ましい。前記フィブロネクチンは、人工合成(例えば、化学的合成法、タンパク質合成装置を用いた合成など)または生合成(例えば、組換えＤＮＡ技術、繊維芽細胞培養など)を通じて製造するとか、ヒトを含む動物の血漿または細胞外基質から分離することによって入手することもできる。前記フィブロネクチンは、フィブロネクチンの断片(fragment)またはペプチドであるとか、これを含むことができる。
【００１８】
単核細胞をフィブロネクチンが含まれた培養容器内で培養する時、利用可能な培地は、特に制限されないが、基本培地としては、ＳＮＵ−１またはＥＧＭ−２を用いるのが好ましい。
【００１９】
‘ＳＮＵ−１培地’の組成は、下記の通りである(表１)。
【００２０】
【表１】
【００２１】
本発明では、前記基本培地にＦＧＦ−Ｂ(Fibroblast Growth Factor)、アスコルビン酸(Ascorbic acid)、ＥＧＦ(Epodermal Growth Factor)、ヒドロコルチゾン(hydrocortisone)、ＩＧＦ−１(Insulin-like Growth Factor-1)またはＶＥＧＦ(Vascular Endothelial Growth Factor)、ヘパリン(heparin)を添加し、必要に応じてＧＡ−１０００(Gentamycin Sulfate、 Amphotericin-B)を更に添加するのが好ましい。
【００２２】
より好ましくは、 前記基本培地に、ウシ胎児血清(ＦＢＳ)２０％、ｂＦＧＦ(Fibroblast Growth Factor)１〜４０ｎｇ／ｍｌ、アスコルビン酸０．１〜５．０μｇ／ｍｌ、ＥＧＦ(Epidermal Growth Factor)１〜４０ｎｇ／ｍｌ、ヒドロコルチゾン０．１〜１μｇ／ｍｌ、ＩＧＦ−Ｉ(Insulin-like Growth Factor-1)１〜４０ｎｇ／ｍｌまたはＶＥＧＦ(Vascular Endothelial Growth Factor)１〜５ｎｇ／ｍｌ及びヘパリン２０〜２５μｇ／ｍｌを添加し、必要に応じてＧＡ−１０００(Gentamycin Sulfate、 Amphotericin-B)を更に添加することである。
【００２３】
一方、単核細胞を培養して３日後、付着しなかった単核細胞は除去し、付着した単核細胞のみを続けて培養する。これにより、付着した単核細胞のうち、幹細胞だけ選択的に増殖するようになり、分離した後、１２〜２０日の間に速く増殖する幹細胞を観察することができる。ここで、培地は２〜３日ごとに交替するのが好ましい。
【００２４】
培養物から臍帯血由来の万能幹細胞を取得する方法としては、ソーティング機能を有したフローサイトメーターを使用したＦＡＣＳ法(Int．Immunol.，10(3):275，1998)、磁気ビーズを使用する方法、間葉系幹細胞を特異的に認識する抗体を使用したパニング法(J．Immunol.，141(8):2797，1998)などがある。また、大量の培養物などから多分化能幹細胞を取得する方法としては、細胞の表面に発現されて分子（以下、表面抗原と称する）を特異的に認識する抗体を単独または組み合わせてこれをカラムとして使用する方法がある。
【００２５】
フローサイトメーターのソーティングの方式としては、水滴荷電方式、セルキャプチャー方式などを例示することができる。どちらの方法も、細胞の表面抗原を特異的に認識する抗体を蛍光に標識し、標識された抗体と抗原との結合体に対する蛍光を測定して蛍光強度を電気信号に変換することにより細胞の抗原発現量を定量することができる。また、使用する蛍光物質の種類を組み合わせることにより複数の表面抗原を発現している細胞を分離することも可能である。ここに使用可能な蛍光物質としては、ＦＩＴＣ(fluorescein isothiocyanate)、ＰＥ(phycoerythrin)、ＡＰＣ(allo-phycocyanin)、ＴＲ(TexasRed：テキサスレッド)、Ｃｙ３、ＣｙＣｈｒｏｍｅ、レッド(Red)６１３、レッド６７０、ＴＲＩ−カラー、クァンタムレッド(QuantumRed)などがある。
【００２６】
フローサイトメーターを使用したＦＡＣＳ法としては、前記にで取得した幹細胞溶液を集め、遠心分離などの方法で細胞を分離した後、直接抗体で染色する方法と、一度適当な培地中で培養、増殖を行った後に抗体を染色する方法を利用することができる。細胞の染色はまず、表面抗原を認識する一次抗体と目的の細胞サンプルを混合し、氷上で３０分〜１時間、インキュベーションする。一次抗体が蛍光で標識されている場合には、洗浄後フローサイトメーターで分離を行う。一次抗体が蛍光標識されていない場合には、洗浄後一次抗体に対して結合活性を有する蛍光標識された二次抗体と一次抗体が反応した細胞とを混合し、再び氷で３０分〜１時間、インキュベーションする。洗浄後、一次抗体と二次抗体で染色された細胞をフローサイトメーターで分離を行う。
【００２７】
本発明によって分離された、臍帯血由来の万能幹細胞は、下記の特性のうち、少なくとも一つの特性を有している：
（ａ）転写調節因子であるｃ−ｍｙｃ、ＺＮＦ２８１に対して陽性の免疫学的な特性を示す。
（ｂ）細胞外基質がコーティングされた底に付着され、付着の後５〜３０日の間に紡錘形または球形態の細胞集落を成しながら増殖する。
（ｃ）３０〜４５のＣＰＤＬ(cumulative population doubling level)を示す。
（ｄ）ＣＤ１４、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５及びＨＬＡ−ＤＲに対して陰性の免疫学的特性を示す。
（ｅ）中胚葉、内胚葉及び外胚葉の細胞に分化可能である。
（ｆ）ＴＩＭＰ−２、ＴＧＦ−β、ＲＡＮＴＥＳ ＣＩＮＣ−３、ＥＯＴＡＸＩＮ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ１２ｐ４０、ＩＬ１３、ＩＬ−１６、ＩＰ−１０、Ｌｅｐｔｉｎ、ＭＣＰ−２、ＭＩＧ、ＭＩＰ−３ａ、ｂ−ＮＧＦｍ、ｓＴＮＦＲＩ、ＰＦＧＦ−ｂｂからなる群から選択された少なくとも一つのサイトカインまたはケモカインを分泌する。
【００２８】
本発明の臍帯血由来の万能幹細胞がＯｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｒｅｘ−１、ｃ−ｍｙｃ、ＺＮＦ２８１を発現するということは、未分化状態が維持されていることを意味する。
【００２９】
また、本発明の臍帯血由来の万能幹細胞は、３０〜４５のＣＰＤＬ(cumulative population doubling level)を示し、増殖力が優れることを分かる。核型分析によって、本発明の細胞は速く増殖するが、正常染色体の構造を有していることが確証された。
【００３０】
本発明の臍帯血由来の万能幹細胞は、造血母幹細胞マーカーまたは免疫拒否反応関連マーカーとして知られたＣＤ１４、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５及びＨＬＡ−ＤＲに対して陰性の免疫学的な特性を示す。このように本発明の臍帯血由来の万能幹細胞は、造血及び免疫拒否反応関連マーカーが欠けて移植の時に血管形成と拒否反応を最小化することができ、同種間移植(allogenic transplantation)に有用な細胞として使用することができる。
【００３１】
本発明の臍帯血由来の万能幹細胞は、中胚葉の骨形成細胞、軟骨細胞、脂肪細胞への分化だけではなく、内胚葉の肝細胞及び外胚葉の神経細胞と網膜関連細胞へも分化することができる。よって、本発明の臍帯血由来の万能幹細胞は、多様な疾病を治療するのに利用され得る。
【００３２】
本発明の臍帯血由来の万能幹細胞は、ＴＩＭＰ−２、ＴＧＦ−β、ＲＡＮＴＥＳ ＣＩＮＣ−３、ＥＯＴＡＸＩＮ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ１２ｐ４０、ＩＬ１３、ＩＬ−１６、ＩＰ−１０、Ｌｅｐｔｉｎ、ＭＣＰ−２、ＭＩＧ、ＭＩＰ−３ａ、ｂ−ＮＧＦｍ、ｓＴＮＦＲＩ、ＰＦＧＦ−ｂｂなどの多様なサイトカインまたはケモカインを分泌する。このようなサイトカインまたはケモカインを分泌することにより本発明の臍帯血由来の万能幹細胞は、多様な疾病を治療するのに利用され得る。
【００３３】
このような特徴を有する幹細胞は、新規なものであって、本発明は、前記のような特徴を有する臍帯血由来の万能幹細胞を提供する。
【００３４】
本発明の臍帯血由来の万能幹細胞は、骨形成細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肝細胞、神経細胞を含めて多様な類型の細胞に分化することができ、それに対応されるように多様な疾病治療に利用することができる。よって、本発明は、本発明の臍帯血由来の万能幹細胞またはこれから分化した細胞を含有する細胞治療剤を提供する。本発明の細胞治療剤は、例えば、神経疾患(例えば、退行性神経疾患)、骨関節炎(例えば、退行性関節炎、リウマチ関節炎)、骨欠損(例えば、骨粗鬆症)、肝疾患(例えば、肝硬変)、心血管系疾患を含む多様な疾病を治療するのに利用され得る。
【００３５】
本発明の細胞治療剤は、細胞を保護及び維持する一つ以上の希釈剤を含むのが好ましい。前記希釈剤は、生理食塩水、ＰＢＳ(Phosphate Buffered Saline)、ＨＢＳＳ(Hank's balanced salt solution)などの緩衝溶液、血漿または血液成分などがあり得る。
【００３６】
一方、本発明は、新規な幹細胞培養用培地に関するものである。前記培地は、ウシ胎児血清(ＦＢＳ)２０％、ｂＦＧＦ(Fibroblast Growth Factor)１〜４０ｎｇ／ｍｌ、アスコルビン酸０．１〜５．０μｇ／ｍｌ、ＥＧＦ(Epidermal Growth Factor)１〜４０ｎｇ／ｍｌ、ヒドロコルチゾン０．１〜１μｇ／ｍｌ、ＩＧＦ−Ｉ(Insulin-like Growth Factor-1)１〜４０ｎｇ／ｍｌまたはＶＥＧＦ(Vascular Endothelial Growth Factor)１〜５ｎｇ／ｍｌ及びヘパリン２０〜２５μｇ／ｍｌが添加され、必要に応じてＧＡ−１０００(Gentamycin Sulfate、Amphotericin-B)が更に添加されたＥＧＭ−２またはＳＮＵ−１培地を含む。
【００３７】
前記幹細胞培養用培地は、新規なものであって、上述されたように、本発明による臍帯血由来の万能幹細胞の分離方法においても用いられた。本発明の培地は、臍帯血由来の幹細胞を含めてすべての成体幹細胞の増殖に有用であるので、成体幹細胞を培養するのに利用することができる。
【００３８】
また、本発明は、幹細胞を本発明の培地で培養して増殖させることを特徴とする幹細胞の培養方法に関するものである。前記幹細胞は、好ましくは成体幹細胞であり得る。
【００３９】
一つの態様として、本発明の幹細胞培養用培地は、本発明の臍帯血由来の万能幹細胞培養に利用され得る。本発明の臍帯血由来の万能幹細胞を本発明の培地で培養しながら紡錘形(spindle-shape)細胞の集落が確認されてから３〜５日後に継代培養するのが好ましい。培養は、５％ＣＯ２条件下で行うのが適合し、培養は、５〜３０日間長続くことができるが、これに制限されるのではない。
【００４０】
一方、本発明は、幹細胞を球培養(sphere culture)または三次元培養することを特徴とする幹細胞の幹性(stemness)を増加させる方法に関するものである。前記三次元培養の時にＭＥＦ(Mouse embryonic fibroblast cell)を用いることを特徴とするのが好ましい。また、前記幹細胞は、成体幹細胞であるものを更に含むことができる。
【００４１】
前記において、幹性増加とは、胚芽幹細胞様集落(Embryonic Stem Cell-like colony)を形成するとか、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２などのような転写調節因子をさらに強く発現することを意味する。
【発明の効果】
【００４２】
以上、詳細に記述したように、本発明による万能幹細胞は、ヒト臍帯血由来ので、フィブロネクチンを含む培養容器内で培養すれば、既存の成体幹細胞に比べて未分化段階で長い間に盛んな細胞成長をし、不治病治療に有用に使用されることができ、軟骨細胞、骨形成細胞及び脂肪細胞など多くの種類の細胞に分化する能力を有しているため、神経系疾患、心血管系、骨格系疾患などの治療に効果的である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、ヒト臍帯血由来の細胞を分離した後、それぞれ１４日目、１５日目、１６日目、１７日目、１８日目の細胞成長形態を示した写真（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ）及び新しい容器に移した後、Ｐａｓｓａｇｅ３で細胞成長を示した写真である（Ｆ）。
【図２】図２は、臍帯血由来の万能幹細胞の時間に応じる細胞増殖を累積で示したグラフである。
【図３】図３は、本発明による臍帯血由来の万能幹細胞を長期間培養した後、核型分析を行った結果である。
【図４】図４は、本発明による臍帯血由来の万能幹細胞に様々なマーカーを付着させて流細胞分析を行った結果である。
【図５】図５は、本発明による臍帯血由来の万能幹細胞が未分化状態幹細胞マーカーの発現を流細胞分析器と細胞免疫染色を介して分析した結果である（Ａ：Ｏｃｔ４流細胞分析結果グラフ、Ｂ：免疫染色でＯｃｔ４発現写真、Ｃ：Ｏｃｔ４発現写真の核染色写真、Ｄ：Ｏｃｔ４発現写真と核染色写真との合成）。
【図６】図６は、ｔｅｒｒａ−１、ｈＵＣＢ−ＭＳＣ、ＡＤ−ＭＳＣ及びＡＭにおいてＺＮＦ２８１の発現を確認した結果（上）と、３〜９回継代培養されたｈＵＣＢ−ＭＳＣにおいてＺＮＦ２８１の発現をＦＡＣＳ分析で確認した結果（下）である。
【図７】図７は、本発明によるヒト臍帯血由来の万能幹細胞がＺＮＦ２８１、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ｍｙｃ及びＲｅｘ−１のような未分化状態を維持するのにおいて重要な遺伝子を発現していることをＲＴ−ＰＣＲを介して確認した結果である。
【図８】図８は、ヒト臍帯血由来の万能幹細胞がそれぞれ骨形成細胞、脂肪細胞、軟骨細胞及び神経細胞に分化したことを示す写真である（Ａ：骨形成細胞に分化を誘導しなかった対照群をＡｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ Ｓで染色した写真、Ｂ：骨形成細胞に分化を誘導した細胞のＡｌｉｚａｒｉｎ Ｒｅｄ Ｓ染色写真、Ｃ：脂肪細胞に分化を誘導しなかった対照群のオイルレッドＯ(Oil red O)染色写真、Ｄ：脂肪細胞に分化を誘導した細胞のオイルレッドＯ(Oil red O)染色写真、Ｅ：軟骨細胞に分化を誘導した細胞のＴｏｌｕｉｄｉｎｅ Ｂｌｕｅ染色写真、Ｆ：軟骨細胞に分化を誘導した後に撮影した細胞ｐｅｌｌｅｔの写真、Ｇ：神経細胞に分化を誘導した後に神経細胞のマーカーであるＴｕｊ−１及びＭＡＰ２で免疫蛍光染色した写真）。
【図９】図９は、ヒト臍帯血由来の万能幹細胞を骨形成細胞及び脂肪細胞に分化を誘導した後、ＲＮＡを抽出した後にＲＴ−ＰＣＲを介して確認した結果である（ＰＰＡＲ−γとＦＡＢＰ−４は、脂肪細胞分化のマーカーであり、Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｔｙｐｅ １は、骨形成細胞分化のマーカーである。ＰＰＡＲ−γ：Peroxisome Proliferator-Activated Receptor gamma、ＦＡＢＰ−４：Fatty Acid Binding Protein-4、ＧＡＰＤＨ：Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）。
【図１０】図１０は、本発明による臍帯血由来の万能幹細胞の網膜関連タンパク質の発現様相を示したものである。
【図１１】図１１は、ヒト臍帯血由来の万能幹細胞を培養した培養液を集めて細胞が分泌した様々なサイトカインを抗体配列(antibody array)を用いて分析した写真である(Ａ：ｈＵＣＢ−ＭＳＣ１、Ｂ：ｈＵＣＢ−ＭＳＣ２、Ｃ：ｈＵＣＢ−ＭＳＣ３、Ｄ：配列された抗体の順に、ＰＯＳ：Positive control、ＮＥＧ：Negative control、ＧＣＳＦ：Granulocyte-Colony Stimulating Factor、ＧＭ−ＣＳＦ：Granulocyte Monocyte-Colony Stimulating Factor、ＩＣＡＭ−１：Intra-Cellular Adhesion Molecule、ＩＦＮ−γ：Interferon-γ、ＩＬ：Interleukin、ＭＣＰ：Monocyte Chemoattractant Protein、Ｍ−ＣＳＦ：Monocyte-Golony Stimulating Factor、ＭＩＧ：Monokine induced by Interferon Gamma、ＭＩＰ：Macrophage Inflammatory Protein、ＲＡＮＴＥＳ：Regulated upon Activation、Normal T-cell Expressed and Secreted、ＴＧＦ−β：Transforming Growth Factor-β、ＴＮＦ：Tumour Necrosis Factor、ｓＴＮＦＲ：soluble Tumour Necrosis Factor Receptor、ＰＤＧＦ−ＢＢ：Platelet-Derived Growth Factor-BB、ＴＩＭＰ２：Tissue Inhibitor of Metalloproteinases-2)。
【図１２】図１２、図１３は、本発明によって分離した臍帯血由来の万能幹細胞を球培養(sphere culture)及びマウス線維芽細胞(mouse fibroblast cell)であるＳＴＯ細胞を用いて三次原的に培養した写真及び転写調節因子であるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２遺伝子の発現様相をＲＴ−ＰＣＲを介して確認した結果である（図１２：球培養を介した臍帯血由来の万能幹細胞の三次元培養、図１３：ＳＴＯ細胞を用いた臍帯血由来の万能幹細胞の三次元培養）。
【図１３】図１２、図１３は、本発明によって分離した臍帯血由来の万能幹細胞を球培養(sphere culture)及びマウス線維芽細胞(mouse fibroblast cell)であるＳＴＯ細胞を用いて三次原的に培養した写真及び転写調節因子であるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２遺伝子の発現様相をＲＴ−ＰＣＲを介して確認した結果である（図１２：球培養を介した臍帯血由来の万能幹細胞の三次元培養、図１３：ＳＴＯ細胞を用いた臍帯血由来の万能幹細胞の三次元培養）。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
以下、実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということは、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者において自明なことである。
【００４５】
実施例１：本発明による臍帯血由来の万能幹細胞の培養、増殖能の調査及び核型分析
Ｆｕｌｌ ｔｅｒｍ ＵＣＢサンプル（ｎ＝２０）は、産婦の同意下で集めた。まず、Ｆｕｌｌ ｔｅｒｍ ＵＣＢをＨｅｔａＳｅｐ(Stem cells TechnologiesINC，Vancouver，BC)を用いて赤血球を優先的に分離した。その後は、既存の方法と同様にフィコール相(ficoll gradient)から分離を行った。分離した単核細胞を２０％ＦＢＳを含有したＥＧＭ−２ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓを添加したＳＮＵ−１培地またはＥＧＭ−２（Ｌｏｎｚａ）を用いてフィブロネクチンを０．１ｍｇ／ｍｌ−１ｍｇ／ｍｌの濃度でコーティングした６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１×１０５〜８細胞で培養した。ＥＧＭ−２ ＳｉｎｇＱｏｕｔｓの構成は、ヘパリン(heparin)、アスコルビン酸(Ascorbic acid)、ｒｈＥＧＦ、ヒドロコルチゾン(hydrocortisone)、ＶＥＧＦ、ｒｈＦＧＦ−Ｂ、Ｒ３−ＩＧＦ−１、ＧＡ−１０００から構成されている。細胞を培養してから３日後に付着されなかった単核細胞を除去し、培地は２〜３日ごとに交替させた。
【００４６】
前記分離した後、ＣＯ２５％の条件で培養してから５〜３０日目に、一定の紡錘形の細胞などが集落を成すことを確認した（図１Ａ）。生成された集落は、速い速度で増殖し、集落が観察されてから３日〜７日後、０．１２５％のＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡで浮遊させた後、新しい容器に移して細胞を続けて維持した（図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅ及び図１Ｆ）。図１は、このような過程を示す写真であって、時間が経過するに応じて細胞集落の大きさが増加することを見られ、また、継代培養の後にも細胞の形状が一定に維持されることを観察することができる。（図１：本実施例によって分離した臍帯血由来の万能幹細胞の形成と増殖過程を示す写真。Ａ：単核細胞培養１４日後の初期集落の形態、Ｂ：１５日、Ｃ：１６日、Ｄ：１７日、Ｅ：１８日、Ｆ：継代培養後のｐａｓｓａｇｅ３で観察した細胞の写真）。
【００４７】
持続的に細胞を培養しながら、分離した臍帯血由来の万能幹細胞の増殖力がどのくらいなのか調査するためにＣＰＤＬ(cumulative population doubling level)を測定した(Cristofalo et al.，Proc．Natl．Acad．Sci.，USA 95，1998)。細胞は、二分法を用いて増殖する。したがって、細胞の成長速度は、１つの細胞が２つの細胞になる時間がどのくらいなのかに応じて決定される。これをＤｏｕｂｌｉｎｇ ｔｉｍｅといい、細胞の増殖力を評価できる尺度として使用され得る。もし、ＣＤＰＬ値が１０であれば、１つの細胞が１０回の分裂をすることを意味し、これを数値上で計算すれば、１つの細胞が約１０００個の細胞まで増殖することを意味する。既存の臍帯血由来の幹細胞の最大の問題点は、脂肪組職や骨髓由来の間葉系幹細胞に比べて著しく落ちる増殖力であり、細胞の大量増殖である臨床適用の側面からも増殖力が重要であると見られる。測定方法は、次のように行った。まず、異なる臍帯血サンプルから分離した３種類の臍帯血由来の万能幹細胞を１００ディッシュに２×１０５個ずつ培養し、３日または４日ごとに継代を行い、細胞計算機を用いて細胞数を測定した。細胞の増殖が止めるまで継続的に細胞を培養して細胞数を測定した。このように求めた細胞数を次のような数学式１を用いてＣＰＤＬ値を求める。
【００４８】
【数１】
【００４９】
ここで、ＮＩは、最初培養をはじめる時の細胞数、ＮＨは、継代を行う当時の飽和状態での細胞数を意味する。
【００５０】
このような方法で持続的に細胞を維持しながら値を求めた。対照群としては、やはり臍帯血から由来した内皮前駆細胞(hUCB-EPC; human Umbilical cord blood derived endothelial progenitor cells)を用いた。その結果は、図２のグラフのように、臍帯血由来の内皮前駆細胞が２ヶ月程度の培養時間に約２０ＣＰＤＬを示した一方、臍帯血由来の万能幹細胞の場合は、３種類の異なるサンプルのすべてが４０〜４５ＣＰＤＬを示した。このような数値は、理論上に１つの細胞集落から１０１２まで増殖できることを意味する。
【００５１】
一般的に、このような盛んな増殖力を示す細胞は、癌細胞化されて速く爆発的に増加する場合があり得る。癌細胞化された細胞は、人体内で多くの調節信号などを無視して大きく増殖する傾向があるため、細胞治療剤として利用することができず、研究の目的もないと見られる。したがって、本発明によって分離した臍帯血由来の万能幹細胞が正常な染色体を有した細胞なのか確認を必ずしなければならず、その方法として、核型分析を解して細胞の染色体異常を確認して見た。図３からわかるように、ｐａｓｓａｇｅ１０の細胞においても正常染色体の構造を有していることが確認された。
【００５２】
実施例２：本発明による臍帯血由来の万能幹細胞の表面抗原分析
培地内に懸濁した細胞などを特性を分析するフローサイトメトリー(flow cytometry)実験を行った。細胞表面抗原のフェノタイピング(phenotyping)のために、３−４継代細胞などを取得してＦＩＴＣ(fluorescein isothiocyanate)またはＰＥ(phycoerythrin)が結合された抗体で染色し、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ(Becton Dickinson，NY)にて分析を行った。
【００５３】
本発明によって分離した臍帯血由来の万能幹細胞(partially pluripotent stem cell)の特性を分析するために、標識抗原としては、ＣＤ１０(Ｔ細胞マーカー)、ＣＤ１４(単核細胞マーカー)、ＣＤ２４(上皮細胞マーカー)、ＣＤ２９(単核細胞マーカー)、ＣＤ３１(内皮細胞マーカー)、ＣＤ３４(造血母幹細胞マーカー)、ＣＤ４４(間葉系幹細胞マーカー)、ＣＤ４５(非造血母幹細胞マーカー)、ＣＤ５１／６１(破骨細胞マーカー)、ＣＤ７３(間葉系幹細胞マーカー)、ＣＤ９０(間葉系幹細胞マーカー)、ＣＤ１０５(間葉系幹細胞マーカー)、ＣＤ１３３(造血母幹細胞マーカー)、ＨＬＡ−ＤＲ(免疫拒否反応関連マーカー)を使用し、これをフローサイトメトリーを用いて分析を行った。実施結果は、表２の通りである。図４は、下記の結果をグラフで表示したものである。
【００５４】
【表２】
【００５５】
実施例３：本発明による臍帯血由来の万能幹細胞のＺＮＦ２８１発現及び核心転写因子(Core transcription factor)発現様相分析
ＺＮＦ２８１(Zinc finger protein 281)は、ＥＳＣで核心転写因子中の一つである(Wang J et al．(2006) Nature 444，364-368)。初期にＺＢＰ−９９と命名された、ＺＮＦ２８１は、ＺＢＰ−８９と９１％アミノ酸配列類似性及び７９％配列同一性を共有する４つのＫｒｐｐｅｌ型ジンクフィンガーを保有している。また、２つの遺伝子のカルボキシ末端切片には、よく保存されたアミノ酸配列が存在する。ＺＮＦ２８１ ｃＤＮＡの予想されるオープンリーディングフレームは、９９ｋＤａタンパク質を暗号化する。ＥＭＳＡ(Electrophoretic mobility shift as say)の結果では、ガストリン(GASTRIN)及びオルニチン脱炭酸酵素(ORNITHINE DECARBOXYLASE)遺伝子のＧＣ−リッチ(rich)プロモーター部位に特異的に結合することを示す(Law DJ et al．(1999) Biochem Biophys Res Commun 262，113-120; Lisowsky T et a l．(1999) FEBS Lett 453，369-374)。ＺＮＦ２８１は、質量スペクトル多次元タンパク質同定技術(mass spectral multidimensional protein identification technology)と組合されたタンデム親和度精製(tandem affinity purification)によってｃ−ＭＹＣ連関タンパク質のうちの一つとして同定された(Koch HB et al．(2007) Cell Cycle 6，205-217)。
【００５６】
ＰＯＵファミリー転写因子(family transcription factors)のようなＯｃｔ３／４遺伝子などは、分化した組職では存在せず、高い増殖能を含有する未分化した幹細胞などから特別に発現されるものとして知られている(Tai M-H．et al.，Carcinogenesis 26:4 95，2005; Tondreau T．et al.，Stem cells，23:1105，2005)。一般的に胚芽幹細胞のマーカーとして使用されるが、前記のような特性で未分化状態を意味するマーカーとして使用されることもある。それで幹性(stemness)のマーカーとしてＯｃｔ４を使用して細胞コロニーを染色した結果、多い細胞などが核部位にＯｃｔ４が染色されることを確認することができ、フローサイトメトリーを介した分析においても多くの細胞で発現することを確認することができた。
【００５７】
細胞内タンパク質(intracellular proteins)の染色のために、細胞などは、４℃で４％ホルムアルデヒドで一晩固定し、０．１％トリトン(Triton)Ｘ−１００(Sigma-Aldrich)で１０分間透過処理(permeabilize)した。スライドとディッシュは、ヒトＯｃｔ４(１：２００)に対するマウス１次抗体で１時間インキュベーションした後、ＰＢＳ(phosphate buffered saline; Gibco)で洗浄し、赤色蛍光染料であるＡｌｅｘａ５９４が結合されたｇｏａｔ抗マウスＩｇＧ２次抗体(Invitrogen)で１時間インキュベーションして免疫染色を行い、対照染色としてＤＡＰＩを用いて核を染色した。
【００５８】
図５、図６に示されたように、Ｏｃｔ４染色結果、多い臍帯血由来の万能幹細胞でＯｃｔ４を発現することとして示された（図５Ａ：Ｏｃｔ４流細胞分析結果グラフ、Ｂ：免疫染色でＯｃｔ４発現写真、Ｃ：Ｏｃｔ４発現写真の核染色写真、Ｄ：Ｏｃｔ４発現写真と核染色写真との合成写真）。
【００５９】
これらのＯｃｔ４のような遺伝子は、幹細胞の幹性(stemness)と極めて密接に関連されており、実際に、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２などのような遺伝子を過発現させて成体幹細胞で胚芽幹細胞と類似した構造の全能性を有した細胞を誘導する技術も最近研究された(Takahashi et al，Cell，131(5)，861-872，2007)。したがって、幹細胞においてこのような遺伝子の発現は、幹細胞の幹性(stemness)を失わないのに未分化状態を維持するのにおいて非常に重要であるといえる。したがって、本発明によって分離した臍帯血由来の万能幹細胞において、既存の論文によって知られたＺＮＦ２ ８１、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２のような遺伝子の発現がどのように示されるのか逆転写重合酵素連鎖反応(ＲＴ−ＰＣＲ)を介して確認してみることにした。
【００６０】
本実施例のために作製されたプライマーは、下記の表３の通りである。
【００６１】
【表３】
【００６２】
図７から実験結果を見ると、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２、ｃ−ｍｙｃ、ＺＮＦ２８１、ＲＥＸ−１などの遺伝子が発現することを確認することができる。これは、本発明による臍帯血由来の幹細胞の万能幹細胞としての能力を示すものであるといえるでしょう。
【００６３】
実施例４：本発明による臍帯血由来の万能幹細胞の骨形成細胞への分化
骨形成細胞へ分化を誘導するために細胞を付着させ、細胞が付着してから約７０−８０％のコンフルアンシ(confluency)になるまで培養した。７０−８０％のコンフルアンシに到逹した場合に骨分化誘導培地に交換した。骨分化誘導培地は、ＤＭＥＭ(low glucose)に１０％のＦＢＳを添加し、１０ｍＭのβ−グリセロリン酸(beta-glycerophosphate)(Sigma-Aldrich)、０．１μＭのデキサメタゾン(Dexamethasone)(Sigma-Aldrich)、５０μＭのアスコルビン酸塩(ascorbate)(Sigma-Aldrich)を添加して製造した。培地は、３日ごとに交換させ、分化誘導は、約２週間行った。
【００６４】
２週後、骨分化によったカルシウム鉱物化(calcium mineralization)を確認するためにアリザリンレッドＳ染色(Alizarin red s staining)を行った。染色方法は、次の通りである。培地を除去した後に蒸溜水を用いて２回洗浄した後、冷たい７０％のＥｔＯＨを使用して４℃で１時間固定した。再び蒸溜水で２回洗浄した後、４０ｍＭのアリザリンレッドＳ(Alizarin red s)を使用して常温で１０分間染色した。その後に蒸溜水を用いて５回洗浄した。
【００６５】
染色を行った結果、図８Ａ、図８Ｂに示されたように、分化を誘導しない図８Ａは、アリザリンレッドＳ(Alizarin red s)に染色されたカルシウムがほとんど見えないが、分化を誘導した図８Ｂでは、赤色で染色されることを観察できる。これは、臍帯血由来の万能幹細胞が骨形成細胞へ分化してカルシウムを分泌することを意味すると見られる。
【００６６】
実施例５：本発明による臍帯血由来の万能幹細胞の脂肪細胞への分化
脂肪細胞分化を誘導するために、細胞が付着してから約７０−８０％のコンフルアンシになるまで培養した。７０−８０％のコンフルアンシに到逹した場合に脂肪分化誘導培地に交換した。脂肪分化誘導培地は、ＤＭＥＭ(low glucose)に１０％のＦＢＳを添加した。１μＭのデキサメタゾン(Dexamethasone)、１０μｇ／ｍｌのインシュリン(insulin)(Sigma-Aldrich)、０．５ｍＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチン(3-isobutyl-1-methylxanthine)(Sigma-Aldrich)、０．２ｍＭのインドメタシン(indomethacin)(Sigma-Aldrich)を添加して分化培地を製造した。分化誘導培地は、３日ごとに交換させ、分化誘導は、約２−３週間行った。
【００６７】
２−３週の後にオイルレッドＯ(Oil red O)染色を行って脂肪分化が誘導されたことを確認する。培地を除去してＰＢＳを用いて洗浄した後、１０％のホルマリンを入れて常温で５分間置いた。ホルマリンを除去し、再び新しいホルマリンを同量入れて常温で最小１時間以上固定した。ホルマリンを除去した後、６０％のイソプロパノール(isopropanol)を用いて洗浄した。完全に乾くまで待った後、オイルレッドＯ(Oil red O)染色薬を入れて常温で１０分間染色した。染色薬を除去した後、直ちに蒸溜水を入れて洗浄した。
【００６８】
脂肪幹細胞への分化を経る細胞などは、オイルレッドＯ(Oil red O)によって染色された時に赤い色を示すが、オイルレッドＯ(Oil red O)は、脂肪細胞の脂肪滴(lipid droplet)を赤い色で染色するからである。図８Ｃ及び図８Ｄからわかるように、分化を誘導しない図８Ｃは、脂肪滴(lipid droplet)が多く見えないだけでなく染色もほとんどできなかったが、分化を誘導した図８Ｄは、脂肪滴(lipid droplet)が多く見えて赤い色に染色されたことを観察できる。
【００６９】
実施例６：本発明による臍帯血由来の万能幹細胞の軟骨細胞への分化
軟骨細胞へ分化を誘導するために、ロンザ(Lonza)から出たｒＴＧＦ−ｂｅｔａ ３を含有した軟骨細胞形成培地(PT-3003)に３週間処理した。培地は、一週間に２回ずつ交換させ、軟骨細胞形成(osteogenesis)は、１週間ごとに測定した。
【００７０】
軟骨細胞に分化したのか調べるために、トルイジンブルー染色(toluidine blue staining)を行った。細胞などを１０時間４％のホルムアルデヒドで固定し、その後に再び１０時間ピクリン酸(picric acid)で固定した。その後、クリオセクション(cryosection)して３分間トルイジンブルー染色(toluidine blue staining)を行い、ヘマトキシリン(hematoxilin)で３秒間対比染色(counterstaining)を行った。
【００７１】
軟骨細胞への分化を経る細胞などは、ペレット(pellet)が崩れず、一定の形態を維持してトルイジンブルー(toluidine blue)によって染色された時に青色を示すが、図８Ｅ及び図８Ｆに示されたように、青色に染色されていることを確認することができ、形態もよく維持していることを確認することができる。
【００７２】
実施例７：本発明による臍帯血由来の万能幹細胞の骨形成細胞及び脂肪細胞へ分化誘導後の遺伝子発現レベルの変化
幹細胞は、分化過程を経ながら遺伝子発現の様相が著しく変化することを観察することができる。一般的に、幹細胞が脂肪細胞へ分化をするようになると、ＰＰＡＲ−γ(Peroxisome Proloferator-activated Receptor-γ)やＦＡＢＰ４(Fatty Acid Binding Protein 4)のような遺伝子の発現が増加し、骨形成細胞へ分化するようになると、コラーゲン型１(Collagen Type 1)などの遺伝子発現が増加する(Mat hews et al.，J Am Acad Dermatol，56(3)，472-492，2007; Cho et al.，J．Cell．Biochem.，96，533-542，2005)。したがって、分化を誘導した後、特定細胞で発現する遺伝子の発現レベルを見ることによって、間接的に分化を確認することができる。実験方法は、下記の通りである。
【００７３】
骨形成細胞と脂肪細胞とをそれぞれ誘導２−３週後にＴｒｉｚｏｌ(Invitrogen)を用いてＲＮＡを抽出した。ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ(Bioneer)を使用してｃＤＮＡを合成し、Ｍａｘｉｍｅ ＰＣＲ ＰｒｅＭｉｘ Ｋｉｔ(Intronbio)を用いてＰＣＲを行った。
【００７４】
本実施例に使用するために作製したプライマーは、下記の表４の通りである。
【００７５】
【表４】
【００７６】
実験を行った結果、図９からわかるように、脂肪細胞分化マーカーであるＰＰＡＲ−γとＦＡＢＰ４とは、分化を誘導した細胞で発現が大きく増加することが見られ、骨形成細胞の分化マーカーであるコラーゲン型１(Collagen Type 1)の場合も同様に分化を誘導した細胞で大きく増加することが見られた。一方、ローディングコントロール(loading control)であるＧＡＰＤＨの場合、分化を誘導した細胞としない細胞とのいずれも同一に出たし、したがって、実験結果の正当性を裏付けた。
【００７７】
実施例８：本発明による臍帯血由来の万能幹細胞の神経細胞への分化
神経細胞へ分化を誘導するために、一応５％のＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ(basic Fibroblast Growth Factor)を含有したＤＭＥＭから構成された培地で２４時間前処理(preincubation)した。本格的な神経分化を誘導するために、１％のＤＭＳＯ、１００ｕＭのＢＨＡ、０．５ｍＭのＶＰＡ、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ、Ｂ２７を含有したＤＭＥＭから構成された神経細胞形成培地に２４時間処理した。神経細胞へ分化したのか調べるために、細胞を４％パラホルムアルデヒド(paraformaldehyde)に固定した後、Ｔｕｊ−１、ＭＡＰ−２、ＧＦＡＰ、ニューロフィラメント−１６０(Neurofilament-160)の神経細胞マーカーで免疫染色を行った場合、４種類のマーカーを発現することを確認することができた(図８Ｇ)。
【００７８】
実施例９：本発明による臍帯血由来の間葉系幹細胞の網膜(retina)関連特性タンパク質発現分析
本実施例は、臍帯血由来の万能幹細胞で網膜(retina)関連特性を調べるために、免疫蛍光染色法を用いて発現程度及びパターンに関して確認した。網膜(retina)だけで特異的に発現するタンパク質の発現様相を確認した。
【００７９】
図１０は、網膜で特異的に発現するタンパク質を免疫蛍光染色を介して発現様相を確認した写真である。Ａ）では、ＰＡＸ６及びＨｕ ｐｒｏｔｅｉｎの発現様相を観察した。ＰＡＸ６は、網膜前駆体マーカー(retina progenitor marker)として知られており、Ｈｕ ｐｒｏｔｅｉｎは、網膜を構成する細胞のうちの１つである神経節細胞(ganglion cell)及びアマクリン細胞(amacrine cell)で特異的に発現するタンパク質である。一般的な細胞培養状態では発現しないことを確認した。Ｂ）では、オプシン(Opsin)とロドプシン(Rhodopsin)との発現様相を確認した。オプシンの場合は、錘体細胞(Cone cell)に特異的に発現するタンパク質であり、ロドプシンの場合は、杆体細胞(rod cell)に特異的に発現するタンパク質である。一般的な細胞培養状態でオプシンは発現しなかったが、ロドプシンは発現することを確認した。Ｃ）では、ＣＲＸ及びリカバリン(Recoverin)との発現様相を確認した。ＣＲＸは、ｐａｎ−ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍａｒｋｅｒとして知られており、リカバリンは、ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍａｒｋｅｒとして知られている。一般的な細胞培養状態では発現しないことを確認した(倍率４００倍、ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝５０ｕｍ)。
【００８０】
実施例１０：本発明による臍帯血由来の万能幹細胞で分泌したサイトカイン分析
幹細胞を用いた治療の可能性は、大きく２つに分けられ得る。第１は、損傷された細胞への直接的な分化を介した治療効果であり、第２は、生体内で既存の細胞などに治療効果を示すことができる肯定的な変化を起こす多くのサイトカインや成長因子を分泌する能力である。一般的に、幹細胞は多くのサイトカインまたは成長因子を分泌するものとして知られている(Kim et al．Cytokine．2005)。このような効果をパラクリン効果(paracrine effect)と呼ぶ。本発明によって分離・増殖した臍帯血由来の万能幹細胞のサイトカイン分泌様相がどうか調べるために、ヒトサイトカイン抗体アレイ(human Cytokine antibody array)(RaybioTech．Norc ross，USA)を用いて調査して見た。
【００８１】
まず、ＦＢＳとサプリメント(Supplement)を除去した培養液を用いて細胞を２４時間安定化させた後、２時間ごとに培地を１ｍｌずつ集めた。集めた培地を１００μｌずつ合わせてタンパク質定量法を用いて定量した後、配列を行った。
【００８２】
図１１からわかるように、３つの異なるサンプルから分離した臍帯血由来の万能幹細胞で共通的にＩＬ−８、ＴＩＭＰ−２などが分泌することを確認でき、その他に、ＴＧＦ−β、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＩＮＣ−３、エオタキシン(EOTAXIN)、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ１２ｐ４０、ＩＬ１３、ＩＬ−１６、ＩＰ−１０、レプチン(Leptin)、ＭＣＰ−２、ＭＩＧ、ＭＩＰ−３ａ、ｂ−ＮＧＦｍ、ｓＴＮＦＲＩ、ＰＦＧＦ−ｂｂのようなサイトカインなども分泌することを確認することができた(図１１Ａ：ｈＵＣＢ−ＭＳＣ１の配列分析写真、図１１Ｂ：ｈＵＣＢ−ＭＳＣ２、図１１Ｃ：ｈＵＣＢ−ＭＳＣ３、図１１Ｄ：抗体配列手順)。
【００８３】
実施例１１：本発明による臍帯血由来の万能幹細胞の三次元培養
成体幹細胞は、一般的に培養ディッシュ(culture dish)で単層(monolayer)へ増殖する。しかし、２Ｄではない３Ｄ状態の球(sphere)で増殖させると、さらに幹性(stemness)の高い細胞を選別して増殖させ得ることを実験を介して確認した。球(sphere)の形成のために培養ディッシュ(culture dish)を０．７％のアガロース(agarose)でコーティングさせるが、細胞がディッシュの底に侵透できないようにコーティングは５ｍｍ以上になるようにする。細胞を接種(seeding)する時に、単細胞(single cell)間の付着を最小化するために、ｃｍ２当り２０００個未満の細胞を振り撤いた。このように得られた球(sphere)は、４０μｍのストレーナ(strainer)を用いて球(sphere)を形成できなかった単細胞(single cell)と区分した。その結果、図１２からわかるように、球培養(sphere culture)時に細胞死せず、球(sphere)を形成して幹細胞の特徴を維持することを観察できる。また、図１２Ａ−Ｄのように、球培養(sphere culture)を介して培養した細胞は、単層(monolayer)で培養した幹細胞に比べて相対的にＯＣＴ４、ＳＯＸ２などの胚芽マーカー(embryonic marker)の発現が高く示されることを観察できた。
【００８４】
胚芽幹細胞(Embryonic stem cell)の培養は、マウス胚芽線維芽細胞(Mouse embryonic fibroblast cell)上でなされる。マウス胚芽線維芽細胞(Mouse embryonic fibroblast cell)が出すＬＩＦなどの様々なケモカイン(chemokine)がＥＳ細胞の形態を維持して分化しないように抑える役割を果たすからである。臍帯血由来の万能幹細胞をマウス胚芽線維芽細胞(mouse embryonic fibroblast cell line)上で培養した結果、一般的な成体幹細胞の形態のように偏平ではなく三次原的な形態でコロニー(colony)を成すことを観察した。ＳＴＯ細胞は、マイトマイシンＣ(mitomycin C)を０．１ｍｇ／ｍｌで処理して増殖を抑制した後、０．１％のゼラチン(gelatin)がコーティングされたディッシュに２×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌで接種(seeding)した後２４時間培養した後に臍帯血由来の万能幹細胞を接種(seeding)した。その結果、図１３からわかるように、時間が過ぎることに応じて細胞がＳＴＯ細胞上で胚芽幹細胞(Embryonic stem cell)と類似するように増殖することを観察できる。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明による万能幹細胞は、ヒト臍帯血由来で、フィブロネクチンを含む培養容器内で培養すると、既存の成体幹細胞に比べて未分化段階で長期間盛んな細胞成長をし、不治病治療に有用に使用されることができ、軟骨細胞、骨形成細胞及び脂肪細胞など多くの種類の細胞へ分化する能力を有しているため、神経系疾患、心血管系、骨格係疾患などの治療に使用され得る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
臍帯血から分離された単核細胞をフィブロネクチンが含まれた培養容器内で培養した後、培養物から幹細胞を回収することを特徴とする万能幹細胞の分離方法。
【請求項２】
前記単核細胞は、臍帯血をＨｅｔａｓｅｐと混合して赤血球を除去した後、フィコール−プラーク(Ficoll-plaque)を用いて単核細胞を分離する段階を経って取得することを特徴とする請求項１に記載の万能幹細胞の分離方法。
【請求項３】
臍帯血とＨｅｔａｓｅｐとの混合割合は、臍帯血５ｍｌ当たり０．５〜２ｍｌにすることを特徴とする請求項２に記載の万能幹細胞の分離方法。
【請求項４】
前記臍帯血は、分娩直後回収した臍帯血、分娩直後回収して室温で１２〜４８時間保管した臍帯血または３〜５℃で６〜７２時間保管した臍帯血であることを特徴とする請求項１に記載の万能幹細胞の分離方法。
【請求項５】
前記フィブロネクチンが含まれた培養容器は、フィブロネクチンは培養容器にコーティングされるとか、粒子形態または３次元構造物形態で培地に含まれたことを特徴とする請求項１に記載の万能幹細胞の分離方法。
【請求項６】
フィブロネクチンが培養容器にコーティングされた場合、フィブロネクチンは０．１〜１ｍｇ／ｍｌで含まれることを特徴とする請求項５に記載の万能幹細胞の分離方法。
【請求項７】
前記フィブロネクチンは、動物から由来したことを特徴とする請求項１に記載の万能幹細胞の分離方法。
【請求項８】
前記動物は、ヒトであることを特徴とする請求項７に記載の万能幹細胞の分離方法。
【請求項９】
前記フィブロネクチンは、人工的に合成されるとか、生合成されたことを特徴とする請求項１に記載の万能幹細胞の分離方法。
【請求項１０】
前記フィブロネクチンは、フィブロネクチンの断片またはペプチドを含むことを特徴とする請求項１に記載の万能幹細胞の分離方法。
【請求項１１】
培養の時には、ウシ胎児血清(ＦＢＳ)２０％、ｂＦＧＦ１〜４０ｎｇ／ｍｌ、アスコルビン酸０．１〜５．０μｇ／ｍｌ、ＥＧＦ１〜４０ｎｇ／ｍｌ、ヒドロコルチゾン０．１〜１μｇ／ｍｌ、ＩＧＦ−Ｉ１〜４０ｎｇ／ｍｌまたはＶＥＧＦ１〜５ｎｇ／ｍｌ及びヘパリン２０〜２５μｇ／ｍｌを含むＥＧＭ−２または ＳＮＵ−１培地を用いることを特徴とする請求項１に記載の万能幹細胞の分離方法。
【請求項１２】
培養物から幹細胞を回収することにおいて、幹細胞の免疫学的特性を用いて分離することを特徴とする請求項１に記載の万能幹細胞の分離方法。
【請求項１３】
請求項１によって分離した、下記の特徴の中で少なくとも一特性を有する万能幹細胞：（ａ）転写調節因子であるｃ−ｍｙｃ、ＺＮＦ２８１に対して陽性の免疫学的特性を示す；（ｂ）細胞の外基質がコーティングされた底に付着して付着後５〜３０日間に紡錘形または球形態の細胞集落を成しながら増殖する；（ｃ）３０〜４５のＣＰＤＬ(cumulative population doubling level)を示す；（ｄ）ＣＤ１４、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５及びＨＬＡ−ＤＲに対して陰性の免疫学的特性を示す；（ｅ）中胚葉、内胚葉及び外胚葉の細胞に分化可能である；（ｆ）ＴＩＭＰ−２、ＴＧＦ−β、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＩＮＣ−３、エオタキシン(EOTAXIN)、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ１２ｐ４０、ＩＬ１３、ＩＬ−１６、ＩＰ−１０、レプチン(Leptin)、ＭＣＰ−２、ＭＩＧ、ＭＩＰ−３ａ、ｂ−ＮＧＦｍ、ｓＴＮＦＲＩ、ＰＦＧＦ−ｂｂからなる群から選択された少なくとも一つのサイトカインまたはケモカインを分泌する。
【請求項１４】
請求項１３による臍帯血由来の万能幹細胞またはこれから分化した細胞を含む細胞治療剤。
【請求項１５】
ウシ胎児血清(FBS)２０％、ｂＦＧＦ１〜４０ｎｇ／ｍｌ、アスコルビン酸０．１〜５．０μｇ／ｍｌ、ＥＧＦ１〜４０ｎｇ／ｍｌ、ヒドロコルチゾン０．１〜１μｇ／ｍｌ、ＩＧＦ−Ｉ１〜４０ｎｇ／ｍｌまたはＶＥＧＦ１〜５ｎｇ／ｍｌ及びヘパリン２０〜２５μｇ／ｍｌが追加されたＥＧＭ−２またはＳＮＵ−１培地を含む幹細胞培養用培地。
【請求項１６】
前記幹細胞は、成体幹細胞であることを特徴とする請求項１５に記載の幹細胞培養用培地。
【請求項１７】
幹細胞を請求項１５または１６による培地で培養して増殖させることを特徴とする幹細胞の培養方法。
【請求項１８】
前記幹細胞は、成体幹細胞であることを特徴とする請求項１７に記載の幹細胞の培養方法。
【請求項１９】
幹細胞を球培養(sphere culture)または三次元培養することを特徴とする幹細胞の幹性(stemness)を増加させる方法。
【請求項２０】
三次元培養の時にＭＥＦ(Mouse embryonic fibroblast cell)を用いることを特徴とする請求項１９に記載の幹細胞の幹性(stemness)を増加させる方法。
【請求項２１】
前記幹細胞は、成体幹細胞であることを特徴とする請求項２０に記載の幹細胞の幹性(stemness)を増加させる方法。
【請求項１】
臍帯血から分離された単核細胞をフィブロネクチンが含まれた培養容器内で培養した後、培養物から幹細胞を回収することを特徴とする万能幹細胞の分離方法。
【請求項２】
前記単核細胞は、臍帯血をＨｅｔａｓｅｐと混合して赤血球を除去した後、フィコール−プラーク(Ficoll-plaque)を用いて単核細胞を分離する段階を経って取得することを特徴とする請求項１に記載の万能幹細胞の分離方法。
【請求項３】
臍帯血とＨｅｔａｓｅｐとの混合割合は、臍帯血５ｍｌ当たり０．５〜２ｍｌにすることを特徴とする請求項２に記載の万能幹細胞の分離方法。
【請求項４】
前記臍帯血は、分娩直後回収した臍帯血、分娩直後回収して室温で１２〜４８時間保管した臍帯血または３〜５℃で６〜７２時間保管した臍帯血であることを特徴とする請求項１に記載の万能幹細胞の分離方法。
【請求項５】
前記フィブロネクチンが含まれた培養容器は、フィブロネクチンは培養容器にコーティングされるとか、粒子形態または３次元構造物形態で培地に含まれたことを特徴とする請求項１に記載の万能幹細胞の分離方法。
【請求項６】
フィブロネクチンが培養容器にコーティングされた場合、フィブロネクチンは０．１〜１ｍｇ／ｍｌで含まれることを特徴とする請求項５に記載の万能幹細胞の分離方法。
【請求項７】
前記フィブロネクチンは、動物から由来したことを特徴とする請求項１に記載の万能幹細胞の分離方法。
【請求項８】
前記動物は、ヒトであることを特徴とする請求項７に記載の万能幹細胞の分離方法。
【請求項９】
前記フィブロネクチンは、人工的に合成されるとか、生合成されたことを特徴とする請求項１に記載の万能幹細胞の分離方法。
【請求項１０】
前記フィブロネクチンは、フィブロネクチンの断片またはペプチドを含むことを特徴とする請求項１に記載の万能幹細胞の分離方法。
【請求項１１】
培養の時には、ウシ胎児血清(ＦＢＳ)２０％、ｂＦＧＦ１〜４０ｎｇ／ｍｌ、アスコルビン酸０．１〜５．０μｇ／ｍｌ、ＥＧＦ１〜４０ｎｇ／ｍｌ、ヒドロコルチゾン０．１〜１μｇ／ｍｌ、ＩＧＦ−Ｉ１〜４０ｎｇ／ｍｌまたはＶＥＧＦ１〜５ｎｇ／ｍｌ及びヘパリン２０〜２５μｇ／ｍｌを含むＥＧＭ−２または ＳＮＵ−１培地を用いることを特徴とする請求項１に記載の万能幹細胞の分離方法。
【請求項１２】
培養物から幹細胞を回収することにおいて、幹細胞の免疫学的特性を用いて分離することを特徴とする請求項１に記載の万能幹細胞の分離方法。
【請求項１３】
請求項１によって分離した、下記の特徴の中で少なくとも一特性を有する万能幹細胞：（ａ）転写調節因子であるｃ−ｍｙｃ、ＺＮＦ２８１に対して陽性の免疫学的特性を示す；（ｂ）細胞の外基質がコーティングされた底に付着して付着後５〜３０日間に紡錘形または球形態の細胞集落を成しながら増殖する；（ｃ）３０〜４５のＣＰＤＬ(cumulative population doubling level)を示す；（ｄ）ＣＤ１４、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５及びＨＬＡ−ＤＲに対して陰性の免疫学的特性を示す；（ｅ）中胚葉、内胚葉及び外胚葉の細胞に分化可能である；（ｆ）ＴＩＭＰ−２、ＴＧＦ−β、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＩＮＣ−３、エオタキシン(EOTAXIN)、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ１２ｐ４０、ＩＬ１３、ＩＬ−１６、ＩＰ−１０、レプチン(Leptin)、ＭＣＰ−２、ＭＩＧ、ＭＩＰ−３ａ、ｂ−ＮＧＦｍ、ｓＴＮＦＲＩ、ＰＦＧＦ−ｂｂからなる群から選択された少なくとも一つのサイトカインまたはケモカインを分泌する。
【請求項１４】
請求項１３による臍帯血由来の万能幹細胞またはこれから分化した細胞を含む細胞治療剤。
【請求項１５】
ウシ胎児血清(FBS)２０％、ｂＦＧＦ１〜４０ｎｇ／ｍｌ、アスコルビン酸０．１〜５．０μｇ／ｍｌ、ＥＧＦ１〜４０ｎｇ／ｍｌ、ヒドロコルチゾン０．１〜１μｇ／ｍｌ、ＩＧＦ−Ｉ１〜４０ｎｇ／ｍｌまたはＶＥＧＦ１〜５ｎｇ／ｍｌ及びヘパリン２０〜２５μｇ／ｍｌが追加されたＥＧＭ−２またはＳＮＵ−１培地を含む幹細胞培養用培地。
【請求項１６】
前記幹細胞は、成体幹細胞であることを特徴とする請求項１５に記載の幹細胞培養用培地。
【請求項１７】
幹細胞を請求項１５または１６による培地で培養して増殖させることを特徴とする幹細胞の培養方法。
【請求項１８】
前記幹細胞は、成体幹細胞であることを特徴とする請求項１７に記載の幹細胞の培養方法。
【請求項１９】
幹細胞を球培養(sphere culture)または三次元培養することを特徴とする幹細胞の幹性(stemness)を増加させる方法。
【請求項２０】
三次元培養の時にＭＥＦ(Mouse embryonic fibroblast cell)を用いることを特徴とする請求項１９に記載の幹細胞の幹性(stemness)を増加させる方法。
【請求項２１】
前記幹細胞は、成体幹細胞であることを特徴とする請求項２０に記載の幹細胞の幹性(stemness)を増加させる方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１２】
【図１３】
【図８】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１２】
【図１３】
【図８】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１２−５２０６７１（Ｐ２０１２−５２０６７１Ａ）
【公表日】平成２４年９月１０日（２０１２．９．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５００７０８（Ｐ２０１２−５００７０８）
【出願日】平成２２年３月３日（２０１０．３．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００１３３８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１０７１９２
【国際公開日】平成２２年９月２３日（２０１０．９．２３）
【出願人】（５０９０８４１４９）エスエヌユー アールアンドディービー ファウンデーション (19)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年９月１０日（２０１２．９．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月３日（２０１０．３．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００１３３８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１０７１９２
【国際公開日】平成２２年９月２３日（２０１０．９．２３）
【出願人】（５０９０８４１４９）エスエヌユー アールアンドディービー ファウンデーション (19)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]