ａｂｌ遺伝子変異の検出用プローブおよびその用途
【課題】一塩基のみが異なる、変異を含む検出対象配列と変異を含まない非検出対象配列とが共存する場合でも、前記変異を含む検出対象配列を検出可能な検出用プローブを提供する。
【解決手段】特定の配列からなる群から選択された少なくとも一つのオリゴヌクレオチドをプローブとして使用する。これらのプローブを、例えば、Ｔｍ解析に使用することによって、変異が発生しているａｂｌ遺伝子と変異が発生していないａｂｌ遺伝子とが含まれる試料であっても、前者の変異を検出することができる。
【解決手段】特定の配列からなる群から選択された少なくとも一つのオリゴヌクレオチドをプローブとして使用する。これらのプローブを、例えば、Ｔｍ解析に使用することによって、変異が発生しているａｂｌ遺伝子と変異が発生していないａｂｌ遺伝子とが含まれる試料であっても、前者の変異を検出することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、白血病に関連するａｂｌ遺伝子の変異を検出するためのプローブおよびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
あらゆる疾患の原因や、個体間の疾患易罹患性（疾患のかかり易さ）、個体間における薬効の違い等を遺伝子レベルで解析する方法として、点突然変異、いわゆる一塩基多型（ＳＮＰ）の検出が広く行われている。
【０００３】
点突然変異の一般的な検出方法としては、（１）試料の標的ＤＮＡについて、検出対象配列に相当する領域を増幅させ、その全遺伝子配列を解析するＤｉｒｅｃｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法や（２）Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、（３）検出対象配列に相当する領域を増幅させ、温度勾配カラム中でＨＰＬＣを行い、溶出される時間によって変異の有無を検出するＤｅｎａｔｕｒｉｎｇ ＨＰＬＣ法、（４）目的の変異を含む領域に蛍光プローブが結合すると蛍光を発することを利用し、前記蛍光の検出により変異を検出するＩｎｖａｄａｒ法、（５）３’末端領域に目的の変異が位置するプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅の有無によって変異を判断するＡＳＰ−ＰＣＲ法等があげられる。
【０００４】
しかしながら、前記（１）、（２）および（４）の方法は、感度が低く（それぞれ約２０％、約５％、約５％程度）、操作に多大な手間と時間がかかり、また、前記（３）の方法は、感度が約１０％と低く、また、変異の有無が確認できるのみで、どの部位にどのような変異が生じているのかを解析できず、特異性にかけるという問題がある。また、前記（５）の方法は、感度は高いものの特異性が低く、偽陽性が生じ易いという問題がある。なお、感度は数値（％）が小さい程高感度である。
【０００５】
このような問題から、近年、点突然変異の検出方法として、Ｔｍ解析を利用した検出が行われている。これは、検出目的の点突然変異を含む検出対象配列に相補的なプローブを用いて、検出試料の標的一本鎖ＤＮＡと前記プローブとのハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成させ、このハイブリッド形成体に加熱処理を施して温度上昇に伴うハイブリッドの解離（融解）を吸光度等のシグナル測定により検出し、この検出結果に基づいてＴｍ値を決定することによって点突然変異の有無を判断する方法である。Ｔｍ値は、ハイブリッド形成体の相同性が高い程高く、相同性が低い程低くなる。このため、点突然変異を含む検出対象配列とそれに相補的なプローブとのハイブリッド形成体について予めＴｍ値（評価基準値）を求めておき、検出試料の標的一本鎖ＤＮＡと前記プローブとのＴｍ値（測定値）を測定し、測定値が評価基準値と同じであれば、マッチ、すなわち標的ＤＮＡに点突然変異が存在すると判断でき、測定値が評価基準値より低ければ、ミスマッチ、すなわち標的ＤＮＡに点突然変異が存在しないと判断できる。
【０００６】
しかしながら、このようなＴｍ解析を用いた検出方法は、感度が低いという問題がある。これは、特に、白血病患者の血液細胞由来ＤＮＡについて点突然変異を検出する際に問題となっている（特許文献１）。白血病は、骨髄中の造血幹細胞がガン化することによって起こる疾患である。中でも慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＣＭＬ）は、９番目の染色体と２２番目の染色体との転座により形成されるｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子が発症原因として知られており、その治療には、ＡＢＬキナーゼ阻害剤であるイマチニブ等が広く使用されている。しかしながら、このａｂｌ遺伝子（前記融合遺伝子におけるａｂｌ遺伝子を含む）に点突然変異が存在すると、イマチニブに対して耐性を発現するという問題があり、その場合、治療において、イマチニブ投与量の増加、他の治療薬への変更、骨髄移植等への切り替え等が必要になる。したがって、白血病、特にＣＭＬの治療においては、ａｂｌ遺伝子における点突然変異の有無を検出することが非常に重要となっている。しかしながら、一人のＣＭＬ患者の血液であっても、その血液細胞にはａｂｌ遺伝子に点突然変異が発生しているもの（変異遺伝子）と発生していないもの（正常遺伝子）とが含まれており、両者の違いは、点突然変異すなわち一塩基の配列にすぎない。そうすると、点突然変異を検出するためのプローブは、点突然変異を含む変異配列（検出対象配列）にハイブリダイズ（マッチ）するが、さらに、点突然変異を含まない正常配列（非検出対象配列）にもハイブリダイズ（ミスマッチ）するという現象が起こってしまう。このような場合に、Ｔｍ解析によってシグナルの強度と温度との関係を示す融解曲線を作成すると、マッチしている変異配列に対する高温側のピークが、ミスマッチである正常配列に対する低温側のピークの存在によって検出し難くなるという問題がある。つまり、従来のプローブでは、変異を含む変異配列が存在する場合であっても、変異を含まない正常配列の存在によって、その検出が困難となり、検出感度の低下が生じてしまう。
【特許文献１】特公表２００４−５３７９９２号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、一塩基のみが異なる、変異を含む検出対象配列と変異を含まない非検出対象配列とが共存する場合でも、前記変異を含む検出対象配列を検出可能な検出用プローブおよびその用途の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明のプローブは、ａｂｌ遺伝子の変異を検出するためのプローブであって、下記（Ａ１）〜（Ｉ１）からなる群から選択された少なくとも一つのオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする。
（Ａ１）配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ａ２）配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｂ１）配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｂ２）配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｃ１）配列番号６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｃ２）配列番号７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｄ１）配列番号８の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｄ２）配列番号９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｅ１）配列番号１０の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｆ１）配列番号１１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｇ１）配列番号１２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｇ２）配列番号１３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｈ１）配列番号１４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｈ２）配列番号１５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｉ１）配列番号１６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【０００９】
本発明の変異の検出方法は、ａｂｌ遺伝子における変異の検出方法であって、下記工程（１）〜（５）を含むことを特徴とする。
（１）ＤＮＡを含有する試料に、本発明のプローブを添加する工程
（２）前記ＤＮＡに前記プローブをハイブリダイズさせる工程
（３）前記ＤＮＡと前記プローブとのハイブリッド形成体について、温度変化に伴うシグナルの変動を測定する工程
（４）前記シグナルの変動を解析してＴｍ値を決定する工程
（５）前記Ｔｍ値から変異の有無を決定する工程
【発明の効果】
【００１０】
本発明のプローブによれば、検出目的の変異が発生しているａｂｌ遺伝子（ｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子におけるａｂｌ遺伝子を含む。以下同様。）（変異遺伝子）と変異が発生していないａｂｌ遺伝子（正常遺伝子）とが共存している場合でも、前記目的の変異が発生した検出対象配列を検出できる。例えば、前記Ｔｍ解析においては、従来のプローブであると、前記プローブが、一塩基のみ異なる変異遺伝子と正常遺伝子の双方にハイブリダイズするため、前記融解曲線において、両者のシグナルが重なり、変異遺伝子の存在を検出することが非常に困難であった。これに対して、本発明のプローブによれば、変異遺伝子と正常遺伝子の双方にハイブリダイズするものの、融解曲線において、両者のシグナルを十分に分離できる。このため、本発明によれば、従来よりも優れた感度で、変異遺伝子を検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明において、以下、検出目的の変異が発生しているａｂｌ遺伝子を「変異遺伝子または検出対象遺伝子」、検出目的の変異が発生している配列であって、プローブによる検出対象の配列を「変異配列または検出対象配列」、検出目的の変異が発生していないａｂｌ遺伝子を「正常遺伝子または非検出対象遺伝子」、検出目的の変異が発生していない配列を「正常配列または非検出対象配列」、変異の有無を検出する試料中のＤＮＡを「標的ＤＮＡ」ともいう。本発明において検出する変異としては、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）等があげられる。
【００１２】
＜プローブ＞
本発明のプローブは、前述のように、ａｂｌ遺伝子の変異を検出するためのプローブであって、前記（Ａ１）〜（Ｉ１）からなる群から選択された少なくとも一つのオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする。ａｂｌ遺伝子のｃＤＮＡ配列（ｍＲＮＡ配列）を、配列番号１に示す。なお、この配列は、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００５１５７に登録されている。以下に、これらのプローブについて説明する。
【００１３】
下記（Ａ１）および（Ａ２）のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、それぞれ、配列番号１の塩基配列における７３０番目の塩基Ａの変異（Ａ→Ｇ）を検出するためのプローブである。下記配列番号２または配列番号３のオリゴヌクレオチドによれば、順鎖における変異を確認でき、これらの相補的オリゴヌクレオチドによれば、逆鎖における変異を確認できる。
（Ａ１）配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
（Ａ２）配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
５’−ｔｇｔｇｃｔｔｃａＣｇｇｔｇａｔｇｔｃｃ−３’
（配列番号２）
５’−ｇｔｇｃｔｔｃａＣｇｇｔｇａｔｇｔｃｃｇｔｇｃｇｔｔｃｃ−３’
（配列番号３）
【００１４】
下記（Ｂ１）および（Ｂ２）のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、それぞれ、配列番号１の塩基配列における７４９番目の塩基Ｇの変異（Ｇ→Ａ）を検出するためのプローブである。下記配列番号４または配列番号５のオリゴヌクレオチドによれば、順鎖における変異を確認でき、これらの相補的オリゴヌクレオチドによれば、逆鎖における変異を確認できる。
（Ｂ１）配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
（Ｂ２）配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
５’−ｃａａｇｃｔｇｇｇｃｇＡｇｇｇｃｃ−３’ （配列番号４）
５’−ｃａｃａａｇｃｔｇｇｇｃｇＡｇｇｇ−３’ （配列番号５）
【００１５】
下記（Ｃ１）および（Ｃ２）のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、それぞれ、配列番号１の塩基配列における９４３番目の塩基Ａの変異（Ａ→Ｇ）を検出するためのプローブである。下記配列番号６または配列番号７のオリゴヌクレオチドによれば、順鎖における変異を確認でき、これらの相補的オリゴヌクレオチドによれば、逆鎖における変異を確認できる。
（Ｃ１）配列番号６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
（Ｃ２）配列番号７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
５’−ｃｔｃａｇＣｇａｔｇａｔａｔａｇａａｃｇｇ−３’ （配列番号６）
５’−ｃａｇＣｇａｔｇａｔａｔａｇａａｃｇｇｇ−３’ （配列番号７）
【００１６】
下記（Ｄ１）および（Ｄ２）のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、それぞれ、配列番号１の塩基配列における９４４番目の塩基Ｃの変異（Ｃ→Ｔ）を検出するためのプローブである。下記配列番号８または配列番号９のオリゴヌクレオチドによれば、順鎖における変異を確認でき、これらの相補的オリゴヌクレオチドによれば、逆鎖における変異を確認できる。
（Ｄ１）配列番号８の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
（Ｄ２）配列番号９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
５’−ｃｔｃａＡｔｇａｔｇａｔａｔａｇａａｃｇ−３’ （配列番号８）
５’−ａｃｔｃａＡｔｇａｔｇａｔａｔａｇａａｃ−３’ （配列番号９）
【００１７】
下記（Ｅ１）のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、それぞれ、配列番号１の塩基配列における９５１番目の塩基Ｃの変異（Ｃ→Ｇ）を検出するためのプローブである。下記配列番号１０のオリゴヌクレオチドによれば、逆鎖における変異を確認でき、これらの相補的オリゴヌクレオチドによれば、順鎖における変異を確認できる。
（Ｅ１）配列番号１０の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
５’−ｔｔｃｃｃｇｔａｇｇｔｃａｔＣａａｃ−３’ （配列番号１０）
【００１８】
下記（Ｆ１）のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、それぞれ、配列番号１の塩基配列における１０５２番目の塩基Ｔの変異（Ｔ→Ｃ）を検出するためのプローブである。下記配列番号１１のオリゴヌクレオチドによれば、順鎖における変異を確認でき、これらの相補的オリゴヌクレオチドによれば、逆鎖における変異を確認できる。
（Ｆ１）配列番号１１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
５’−ｇｔｃａｇｃｃａＣｇｇａｇｔａｃｃ−３’ （配列番号１１）
【００１９】
下記（Ｇ１）および（Ｇ２）のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、それぞれ、配列番号１の塩基配列における１０６４番目の塩基Ａの変異（Ａ→Ｇ）を検出するためのプローブである。下記配列番号１２または配列番号１３のオリゴヌクレオチドによれば、順鎖における変異を確認でき、これらの相補的オリゴヌクレオチドによれば、逆鎖における変異を確認できる。
（Ｇ１）配列番号１２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
（Ｇ２）配列番号１３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
５’−ｇｔｔｔｔｔｃｔｔｃＣｃｃａｇｇｔａｃｔｃ−３’ （配列番号１２）
５’−ｇｔｔｔｔｔｃｔｔｃＣｃｃａｇｇｔａｃｔｃｃ−３’ （配列番号１３）
【００２０】
下記（Ｈ１）および（Ｈ２）のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、それぞれ、配列番号１の塩基配列における１０７５番目の塩基Ｔの変異（Ｔ→Ｇ）を検出するためのプローブである。下記配列番号１４または配列番号１５のオリゴヌクレオチドによれば、順鎖における変異を確認でき、これらの相補的オリゴヌクレオチドによれば、逆鎖における変異を確認できる。
（Ｈ１）配列番号１４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
（Ｈ２）配列番号１５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
５’−ｇａｔｇａＣｇｔｔｔｔｔｃｔｔｃｔｃｃ−３’ （配列番号１４）
５’−ｔｇｔｇｇａｔｇａＣｇｔｔｔｔｔｃｔｔｃ−３’ （配列番号１５）
【００２１】
下記（Ｉ１）のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、配列番号１の塩基配列における１１８７番目の塩基Ａの変異（Ａ→Ｇ）を検出するためのプローブである。下記配列番号１６のオリゴヌクレオチドによれば、順鎖における変異を確認でき、これらの相補的オリゴヌクレオチドによれば、逆鎖における変異を確認できる。
（Ｉ１）配列番号１６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
５’−ｃｃａｇｃａＣｇｇｇｃｔｇｔｇｔａｇｇｔｇｔｃｃ−３’
（配列番号１６）
【００２２】
本発明のプローブは、標識化物質で標識化されたプローブであることが好ましい。前記標識化物質は、制限されないが、前記標識化プローブの具体例として、例えば、蛍光色素（蛍光団）で標識された、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような蛍光消光現象（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）を利用したプローブとしては、中でも、オリゴヌクレオチドを３’末端もしくは５’末端がＣとなるように設計し、その末端のＣがＧに近づくと発光が弱くなる蛍光色素で標識化したプローブが特に好ましい。このプローブは、一般的に、グアニン消光プローブと呼ばれており、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。
【００２３】
前記蛍光色素は、制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光色素としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（商標名、モレキュラー・プローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＲＭＡ(モレキュラープローブ社製)等があげられる。プローブの検出条件は、特に制限されず、使用する蛍光色素により適宜決定できるが、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅは、検出波長４５０〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５〜７００ｎｍ）、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬは、検出波長５１５〜５５５ｎｍで検出できる。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。
【００２４】
また、本発明のプローブは、例えば、３’末端にリン酸基が付加されてもよい。後述するように、変異の有無を検出するＤＮＡ（標的ＤＮＡ）は、ＰＣＲ等の遺伝子増幅法によって調製することができ、この際、本発明のプローブを遺伝子増幅反応の反応液中に共存させることができる。このような場合に、プローブの３’末端にリン酸基を付加させておけば、プローブ自体が遺伝子増幅反応によって伸長することを十分に防止できる。また、３’末端に前述のような標識化物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。
【００２５】
本発明のプローブは、ａｂｌ遺伝子の変異の検出に使用することができる。検出方法は、何ら制限されず、検出対象配列とプローブとのハイブリダイズを利用する方法であればよい。本発明のプローブを適用する方法の一例として、Ｔｍ解析を利用した変異の検出方法について、以下に説明する。
【００２６】
＜変異検出方法＞
本発明の変異検出方法は、前述のように、ａｂｌ遺伝子における変異の検出方法であって、下記工程（１）〜（５）を含むことを特徴とする。なお、本発明の変異検出方法は、本発明のプローブを使用することが特徴であって、その他の構成や条件等は、以下の記載に制限されない。
（１）ＤＮＡを含有する試料に、本発明のプローブを添加する工程
（２）前記ＤＮＡに前記プローブをハイブリダイズさせる工程
（３）前記ＤＮＡと前記プローブとのハイブリッド形成体について、温度変化に伴うシグナルの変動を測定する工程
（４）前記シグナルの変動を解析してＴｍ値を決定する工程
（５）前記Ｔｍ値から変異の有無を決定する工程
【００２７】
本発明において、試料中のＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡでもよいし二本鎖ＤＮＡであってもよい。前記ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡの場合は、例えば、前記ハイブリダイズ工程に先立って、加熱により前記試料中の二本鎖ＤＮＡを解離させる工程を含むことが好ましい。二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離することによって、次のハイブリダイズ工程において、検出用プローブや阻害用ポリヌクレオチドとのハイブリダイズが可能となる。
【００２８】
本発明において、試料に含まれるＤＮＡは、例えば、生体試料に元来含まれるＤＮＡでもよいが、検出精度を向上できることから、生体試料に元来含まれているＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ等により増幅させた増幅産物であることが好ましい。増幅産物の長さは、特に制限されないが、例えば、５０〜１０００ｍｅｒであり、好ましくは８０〜２００ｍｅｒである。また、試料中のＤＮＡは、例えば、生体試料由来のＲＮＡ（トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等）からＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ）により合成したｃＤＮＡであってもよい。
【００２９】
本発明の変異検出方法を適用する試料は、制限されず、ａｂｌ遺伝子が存在する試料があげられる。具体例としては、白血球細胞等の血球試料、全血試料等があげられる。なお、本発明において、試料の採取方法、ＤＮＡの調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。
【００３０】
本発明において、前記試料中のＤＮＡに対する、本発明のプローブの添加割合（モル比）は、制限されないが、検出シグナルを十分に確保できることから、１倍以下が好ましく、より好ましくは、０．１倍以下である。この際、試料中のＤＮＡとは、例えば、検出目的の変異が発生している検出対象ＤＮＡと前記変異が発生していない非検出対象ＤＮＡとの合計でもよいし、検出目的の変異が発生している検出対象配列を含む増幅産物と前記変異が発生していない非検出対象配列を含む増幅産物との合計でもよい。なお、試料中のＤＮＡにおける前記検出対象ＤＮＡの割合は、通常、不明であるが、結果的に、前記プローブの添加割合（モル比）は、検出対象ＤＮＡ（検出対象配列を含む増幅産物）に対して１０倍以下となることが好ましく、より好ましくは５倍以下、さらに、好ましくは３倍以下である。また、その下限は特に制限されないが、例えば、０．００１倍以上であり、好ましくは０．０１倍以上であり、より好ましくは０．１倍以上である。
【００３１】
前記ＤＮＡに対する本発明のプローブの添加割合は、例えば、二本鎖ＤＮＡに対するモル比でもよいし、一本鎖ＤＮＡに対するモル比でもよい。
【００３２】
Ｔｍ値について説明する。二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。この現象に基づき、融解温度Ｔｍとは、一般に、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。
【００３３】
本発明において、Ｔｍ値を決定するための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、本発明のプローブに付加した標識のシグナルを測定することが好ましい。このため、本発明のプローブとして、前述の標識化プローブを使用することが好ましい。前記標識化プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブがあげられる。前者のようなプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識によるシグナルをシグナル特有の条件（吸光度等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行ならびにＴｍ値の決定を行うことができる。標識化プローブにおける標識化物質は、例えば、前述のとおりである。
【００３４】
次に、本発明の変異検出方法について、本発明のプローブとして、蛍光色素で標識化された標識化プローブを使用する例をあげて説明する。なお、本発明の変異検出方法は、本発明のプローブを使用すること自体が特徴であり、その他の工程や条件については何ら制限されない。
【００３５】
まず、全血からゲノムＤＮＡを単離する。全血からのゲノムＤＮＡの単離は、従来公知の方法によって行うことができ、例えば、市販のゲノムＤＮＡ単離キット（商品名ＧＦＸ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）等が使用できる。
【００３６】
次に、単離したゲノムＤＮＡを含む試料に標識化プローブを添加する。前記標識化プローブとしては、例えば、ＱＰｒｏｂｅが好ましい。このＱＰｒｏｂｅとは、一般に、プローブ末端のシトシン塩基を蛍光色素で標識化したプローブであり、これが検出対象配列にハイブリッドすることで前記蛍光色素と検出対象配列のグアニン塩基とが相互作用し、その結果、蛍光が減少（または消光）するものである。標識化プローブの配列は、前述の通りであって、検出目的の変異に応じて、適宜選択すればよい。
【００３７】
前記検出用プローブの添加のタイミングは、特に制限されず、例えば、後述するＰＣＲ処理の後、ＰＣＲ増幅産物に対して添加してもよいし、ＰＣＲ等による増幅処理前に添加してもよい。このようにＰＣＲ等による増幅処理前に前記検出用プローブを添加する場合は、例えば、前述のように、その３’末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加することが好ましい。
【００３８】
前記検出用プローブは、単離したゲノムＤＮＡを含む液体試料に添加してもよいし、溶媒中でゲノムＤＮＡと混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものがあげられる。
【００３９】
続いて、単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ等の遺伝子増幅法によって検出目的の点突然変異を生じる部位を含む配列（検出対象配列および非検出対象配列）を増幅させる。前記遺伝子増幅法は、制限されず、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等があげられるが、ＰＣＲ法が好ましい。なお、以下、ＰＣＲ法を例にあげて、本発明を説明するが、これには制限されない。なお、ＰＣＲの条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【００４０】
ＰＣＲのプライマーの配列は、目的の検出対象配列を増幅できるものであれば特に制限されず、目的の配列に応じて、従来公知の方法により適宜設計できる。プライマーの長さは、特に制限されず、一般的な長さ（例えば、１０〜３０ｍｅｒ）に設定できる。以下に、前記（Ａ１）〜（Ｈ２）のプローブを使用する際の、検出対象配列の増幅に使用できるプライマーセットの一例を示す。なお、これらは例示であって、本発明を制限するものではない。
【００４１】
Ａ１プローブおよびＡ２プローブ用のプライマーセット
センスプライマー 配列番号１７
５’−ｇａｃａａｇｔｇｇｇａｇａｔｇｇａａｃｇｃ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号１８
５’−ｃａｃｇｇｃｃａｃｃｇｔｃａｇｇ−３’
Ｂ１プローブおよびＢ２プローブ用のプライマーセット
センスプライマー 配列番号１９
５’−ｇａｃａａｇｔｇｇｇａｇａｔｇｇａａｃｇｃ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号２０
５’−ｃａｃｇｇｃｃａｃｃｇｔｃａｇｇ−３’
Ｃ１プローブおよびＣ２プローブ用のプライマーセット
センスプライマー 配列番号２１
５’−ｇｇａｃｇｇａｃｇｇａｃｃｇｔｃｃｔｃｇｔｔｇｔｃｔｔｇｔｔｇｇｃ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号２２
５’−ｇｇａｃｇｇａｃｇｇａｃｃｇｃａｃｔｃｃｃｔｃａｇｇｔａｇｔｃｃａｇ−３’
Ｄ１プローブおよびＤ２プローブ用のプライマーセット
センスプライマー 配列番号２３
５’−ｇｇａｃｇｇａｃｇｇａｃｃｇｔｃｃｔｃｇｔｔｇｔｃｔｔｇｔｔｇｇｃ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号２４
５’−ｇｇａｃｇｇａｃｇｇａｃｃｇｃａｃｔｃｃｃｔｃａｇｇｔａｇｔｃｃａｇ−３’
Ｅ１プローブ用のプライマーセット
センスプライマー 配列番号２５
５’−ｇｇａｃｇｇａｃｇｇａｃｃｇｔｃｃｔｃｇｔｔｇｔｃｔｔｇｔｔｇｇｃ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号２６
５’−ｇｇａｃｇｇａｃｇｇａｃｃｇｃａｃｔｃｃｃｔｃａｇｇｔａｇｔｃｃａｇ−３’
Ｆ１プローブ用のプライマーセット
センスプライマー 配列番号２７
５’−ｇｇｃｃｇｇｃｃｃｃｇｔｇｇｔｇｃｔｇｃｔｇｔａｃａｔｇ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号２８
５’−ｃａｃｇｃｃｃｔｇｔｇａｃｔｃｃａｔｇ−３’
Ｇ１プローブおよびＧ２プローブ用のプライマーセット
センスプライマー 配列番号２９
５’−ｇｇｃｃｇｇｃｃｃｃｇｔｇｇｔｇｃｔｇｃｔｇｔａｃａｔｇ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号３０
５’−ｃａｃｇｃｃｃｔｇｔｇａｃｔｃｃａｔｇ−３’
Ｈ１プローブおよびＨ２プローブ用のプライマーセット
センスプライマー 配列番号３１
５’−ｇｇｃｃｇｇｃｃｃｃｇｔｇｇｔｇｃｔｇｃｔｇｔａｃａｔｇ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号３２
５’−ｃａｃｇｃｃｃｔｇｔｇａｃｔｃｃａｔｇ−３’
Ｉ１プローブ用のプライマーセット
センスプライマー 配列番号３３
５’−ａｃｃｔａｃｃｔａｃｃｔａｇａｔｃｔｔｇｃｔｇｃｃｃｇａａａｃｔｇ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号３４
５’−ａｃｃｔａｃｃｔａｃｃｔｃｔｔｇｔｔｇｔａｇｇｃｃａｇｇｃｔｃｔｃ−３’
【００４２】
次に、得られたＰＣＲ増幅産物の解離、および、解離により得られた一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズを行う。
【００４３】
前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５〜９５℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。
【００４４】
また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、４０〜５０℃である。
【００４５】
ハイブリダイズ工程の反応液における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応液におけるＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１〜１μＭであり、好ましくは０．１〜０．５μＭ、前記標識化プローブの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲が好ましく、例えば、０．００１〜１０μＭであり、好ましくは０．００１〜１μＭである。
【００４６】
そして、得られた前記一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリッド形成体を加熱し、温度上昇に伴うシグナルの変動を測定する。例えば、ＱＰｒｏｂｅを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとのハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００４７】
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃であり、好ましくは２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．１〜２０℃／秒であり、好ましくは０．３〜５℃／秒である。
【００４８】
次に、前記シグナルの変動を解析してＴｍ値として決定する。具体的には、得られた蛍光強度から各温度における値（−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ）を算出し、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定できる。また、単位時間当たりの蛍光強度増加量（蛍光強度増加量／ｔ）が最も高い点をＴｍ値として決定することもできる。なお、標識化プローブとして、消光プローブではなく、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示すプローブを使用した場合には、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。
【００４９】
前記Ｔｍ値は、例えば、従来公知のＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｌｔｃａｌｃ．ｃｏｍ／）等により算出でき、また、隣接法（Ｎｅａｒｅｓｔ Ｎｅｉｇｈｂｏｒ Ｍｅｔｈｏｄ）によって決定することもできる。
【００５０】
また、本発明においては、前述のように、ハイブリッド形成体を加熱して、温度上昇に伴うシグナル変動を測定する方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。すなわち、前記プローブを添加した試料の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定してもよい。
【００５１】
具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、ＱＰｒｏｂｅ）を使用した場合、前記プローブを試料に添加した際には、前記プローブは解離しているため蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、前記プローブを試料に添加した際には、前記プローブは解離しているため蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００５２】
＜プローブキット＞
本発明のプローブキットは、ａｂｌ遺伝子の変異の検出に使用するプローブキットであり、本発明のプローブを含むことを特徴とする。本発明のプローブキットにおいて、本発明のプローブは、一種類でもよいし二種類以上であってもよい。後者の場合、二種類以上のプローブは、混合された状態で含まれてもよいし、別個の試薬として含まれていてもよい。また、二種類以上の本発明のプローブが混合された状態で本発明のプローブキットに含まれる場合や、別個の試薬として含まれているが、例えば、使用時に同じ反応系で、各プローブと各検出対象配列とのＴｍ解析を行う場合、各プローブは、別個の標識化物質で標識化されていることが好ましい。このように標識化物質の種類を変えることで、同じ反応系であっても、それぞれのプローブについての検出が可能になる。前記標識化物質としては、例えば、検出波長が異なる物質であることが好ましい。
【００５３】
前述のように、ａｂｌ遺伝子には、白血病に関連する複数の変異が知られており、本発明のプローブによれば、前述した各種変異（９種類）を検出することが可能である。他方、白血病に関与するａｂｌ遺伝子は、例えば、いずれか一箇所の変異のみが検出される場合もあるが、複数個所の変異が検出される場合もある。本発明において検出目的としている複数の変異は、白血病やその薬剤（例えば、イマチニブ）と関係を示す変異であるが、変異ごとに特有の特徴を示すと考えられる。このため、例えば、複数の変異を検出し、それらの結果を総合的に判断することで、より良い診断や治療が可能になる。したがって、本発明のプローブキットにおいて、本発明のプローブを２種類以上含有させることによって、診断や治療等のための変異の検出をより簡便に行うことができる。
【００５４】
つぎに、本発明の実施例について、比較例と併せて説明する。ただし、本発明は下記の実施例および比較例により制限されない。
【実施例１】
【００５５】
ａｂｌ遺伝子の７３０番目塩基の点突然変異（Ａ→Ｇ）
本発明のプローブを使用して、ａｂｌ遺伝子における７３０番目塩基の点突然変異（Ａ→Ｇ）についてのＴｍ解析を行った。
【００５６】
配列番号１に示す７３０番目の塩基Ａに変異を有さない正常ａｂｌ遺伝子配列を挿入したプラスミド（以下、「ｗｔＤＮＡ」という）と、前記７３０番目の塩基ＡがＧに変異した変異ａｂｌ遺伝子（ａｂｌチロシンキナーゼＡ７３０Ｇ（アミノ酸情報Ｍ２４４Ｖ））を挿入したプラスミド（以下、「ｍｔＤＮＡ」という）とを調製した。そして、両者を所定の割合（ｍｔＤＮＡ：ｗｔＤＮＡ＝３：９７）に調製し、１０４ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ（１μＬ）を下記ＰＣＲ反応液４９μＬに添加してＰＣＲ反応を行った。前記ＰＣＲ反応液における検出用プローブの終濃度は５０ｎＭとした。前記ＰＣＲ反応は、サーマルサイクラーにより、９５℃で６０秒処理した後、９５℃１秒および５８℃３０秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返し、さらに９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した。そして、続けて温度の上昇速度を１℃／３秒として、前記ＰＣＲ反応液を４０℃から９５℃に加熱していき、経時的な蛍光強度の変化を測定した（波長５８５〜７００ｎｍ）。
【００５７】
【表１】
【００５８】
センスプライマー 配列番号１７
５’−ｇａｃａａｇｔｇｇｇａｇａｔｇｇａａｃｇｃ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号１８
５’−ｃａｃｇｇｃｃａｃｃｇｔｃａｇｇ−３’
（実施例１−１）
検出用プローブＡ１ 配列番号２
５’−ｔｇｔｇｃｔｔｃａＣｇｇｔｇａｔｇｔｃｃ−（TAMRA）−３’
（実施例１−２）
検出用プローブＡ２ 配列番号３
５’−ｇｔｇｃｔｔｃａＣｇｇｔｇａｔｇｔｃｃｇｔｇｃｇｔｔｃｃ
−（TAMRA）−３’
（比較例１）
検出用プローブ 配列番号３５
５’−（TAMRA）−ｃａｃｃＧｔｇａａｇｃａｃａａｇ−Ｐ−３’
【００５９】
これらの結果を図１に示す。図１は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図１において、（Ａ）は、実施例１−１、（Ｂ）は、実施例１−２、（Ｃ）は、比較例１の結果である。なお、同じ条件で、各プローブとｗｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成、および、各プローブとｍｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成を行った場合、それぞれのピークは以下の通りであり、これを評価基準とした。
【００６０】
ピーク温度（℃）
プローブ ｗｔＤＮＡ（１００％） ｍｔＤＮＡ（１００％）
実施例１−１ ５６．０ ６５．０
実施例１−２ ６９．０ ７４．０
比較例１ ５０．０ ５７．０
【００６１】
同図（Ａ）および(Ｂ)に示すように、実施例１−１および実施例１−２のプローブを使用した結果、前記評価基準と同等のｗｔＤＮＡのピーク（℃）およびｍｔＤＮＡのピーク（℃）が検出された。これに対して、同図（Ｃ）に示すように、比較例１のプローブを使用した場合、ｍｔＤＮＡのピークは確認できなかった。この結果から、本発明のプローブによれば、ｍｔＤＮＡとｗｔＤＮＡとが共存する場合でも、ｍｔＤＮＡの検出感度を向上できることがわかった。
【実施例２】
【００６２】
ａｂｌ遺伝子の７４９番目塩基の点突然変異（Ｇ→Ａ）
本発明のプローブを使用して、ａｂｌ遺伝子における７４９番目塩基の点突然変異（Ｇ→Ａ）についてのＴｍ解析を行った。
【００６３】
配列番号１に示す７４９番目の塩基Ｇに変異を有さない正常ａｂｌ遺伝子配列を挿入したプラスミド（以下、「ｗｔＤＮＡ」という）と、前記７４９番目の塩基ＧがＡに変異した変異ａｂｌ遺伝子（ａｂｌチロシンキナーゼＧ７４９Ａ（アミノ酸情報Ｇ２５０Ｅ））を挿入したプラスミド（以下、「ｍｔＤＮＡ」という）とを調製した。そして、両者を所定の割合（ｍｔＤＮＡ：ｗｔＤＮＡ＝３：９７）に調製し、１０４ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ（１μＬ）を下記ＰＣＲ反応液４９μＬに添加してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応ならびに蛍光強度の検出は、前記実施例１と同様にして行った。
【００６４】
【表２】
【００６５】
センスプライマー 配列番号１９
５’−ｇａｃａａｇｔｇｇｇａｇａｔｇｇａａｃｇｃ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号２０
５’−ｃａｃｇｇｃｃａｃｃｇｔｃａｇｇ−３’
（実施例２−１）
検出用プローブＢ１ 配列番号４
５’−（TAMRA）−ｃａａｇｃｔｇｇｇｃｇＡｇｇｇｃｃ−Ｐ−３’
（実施例２−２）
検出用プローブＢ２ 配列番号５
５’−（TAMRA）−ｃａｃａａｇｃｔｇｇｇｃｇＡｇｇｇ−Ｐ−３’
（比較例２）
検出用プローブ 配列番号３６
５’−（TAMRA）−ｃｃｃＴｃｇｃｃｃａｇｃｔｔ−Ｐ−３’
【００６６】
これらの結果を図２に示す。図２は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図２において、（Ａ）は、実施例２−１、（Ｂ）は、実施例２−２、（Ｃ）は、比較例２の結果である。なお、同じ条件で、各プローブとｗｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成、および、各プローブとｍｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成を行った場合、それぞれのピークは以下の通りであり、これを評価基準とした。
【００６７】
ピーク温度（℃）
プローブ ｗｔＤＮＡ（１００％） ｍｔＤＮＡ（１００％）
実施例２−１ ５９．０ ６６．０
実施例２−２ ５８．０ ６４．０
【００６８】
同図（Ａ）および(Ｂ)に示すように、実施例２−１および実施例２−２のプローブを使用した結果、前記評価基準と同等のｗｔＤＮＡのピーク（℃）およびｍｔＤＮＡのピーク（℃）が検出された。これに対して、同図（Ｃ）に示すように、比較例２のプローブを使用した場合、ｍｔＤＮＡのピークは確認できなかった。この結果から、本発明のプローブによれば、ｍｔＤＮＡとｗｔＤＮＡとが共存する場合でも、ｍｔＤＮＡの検出感度を向上できることがわかった。
【実施例３】
【００６９】
ａｂｌ遺伝子の９４３番目塩基の点突然変異（Ａ→Ｇ）
本発明のプローブを使用して、ａｂｌ遺伝子における９４３番目塩基の点突然変異（Ａ→Ｇ）についてのＴｍ解析を行った。
【００７０】
配列番号１に示す９４３番目の塩基Ａに変異を有さない正常ａｂｌ遺伝子配列を挿入したプラスミド（以下、「ｗｔＤＮＡ」という）と、前記９４３番目の塩基ＡがＧに変異した変異ａｂｌ遺伝子（ａｂｌチロシンキナーゼＡ９４３Ｇ（アミノ酸情報Ｔ３１５Ａ））を挿入したプラスミド（以下、「ｍｔＤＮＡ」という）とを調製した。そして、両者を所定の割合（ｍｔＤＮＡ：ｗｔＤＮＡ＝３：９７）に調製し、１０４ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ（１μＬ）を下記ＰＣＲ反応液４９μＬに添加してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応ならびに蛍光強度の検出は、前記実施例１と同様にして行った。
【００７１】
【表３】
【００７２】
センスプライマー 配列番号２１
５’−ｇｇａｃｇｇａｃｇｇａｃｃｇｔｃｃｔｃｇｔｔｇｔｃｔｔｇｔｔｇｇｃ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号２２
５’−ｇｇａｃｇｇａｃｇｇａｃｃｇｃａｃｔｃｃｃｔｃａｇｇｔａｇｔｃｃａｇ−３’
（実施例３−１）
検出用プローブＣ１ 配列番号６
５’−（Pacific Blue）−ｃｔｃａｇＣｇａｔｇａｔａｔａｇａａｃｇｇ−Ｐ−３’
（実施例３−２）
検出用プローブＣ２ 配列番号７
５’−（TAMRA）−ｃａｇＣｇａｔｇａｔａｔａｇａａｃｇｇｇ−Ｐ−３’
（比較例３−１）
検出用プローブ 配列番号３７
５’−（TAMRA）−ｃａｔｇａａｃｔｃａＧｃｇａｔｇａｔａｔａｇ−Ｐ−３’
（比較例３−２）
検出用プローブ 配列番号３８
５’−（TAMRA）−ｃｃｃｇｔｔｃｔａｔａｔｃａｔｃｇＣｔｇ−Ｐ−３’
【００７３】
これらの結果を図３に示す。図３は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図３において、（Ａ）は、実施例３−１、（Ｂ）は、実施例３−２、（Ｃ）は、比較例３−１、（Ｄ）は、比較例３−２の結果である。なお、同じ条件で、各プローブとｗｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成、および、各プローブとｍｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成を行った場合、それぞれのピークは以下の通りであり、これを評価基準とした。
【００７４】
ピーク温度（℃）
プローブ ｗｔＤＮＡ（１００％） ｍｔＤＮＡ（１００％）
実施例３−１ ５２．０ ６１．０
実施例３−２ ５０．０ ６０．０
比較例３−１ ５２．０ Ｎ．Ｄ
比較例３−２ ５５．０ Ｎ．Ｄ
【００７５】
同図（Ａ）および(Ｂ)に示すように、実施例３−１および実施例３−２のプローブを使用した結果、前記評価基準と同等のｗｔＤＮＡのピーク（℃）およびｍｔＤＮＡのピーク（℃）が検出された。これに対して、同図（Ｃ）および(Ｄ)に示すように、比較例３−１および比較例３−２のプローブを使用した場合、ｍｔＤＮＡのピークは確認できなかった。この結果から、本発明のプローブによれば、ｍｔＤＮＡとｗｔＤＮＡとが共存する場合でも、ｍｔＤＮＡの検出感度を向上できることがわかった。
【実施例４】
【００７６】
ａｂｌ遺伝子の９４４番目塩基の点突然変異（Ｃ→Ｔ）
本発明のプローブを使用して、ａｂｌ遺伝子における９４４番目塩基の点突然変異（Ｃ→Ｔ）についてのＴｍ解析を行った。
【００７７】
配列番号１に示す９４４番目の塩基Ｃに変異を有さない正常ａｂｌ遺伝子配列を挿入したプラスミド（以下、「ｗｔＤＮＡ」という）と、前記９４４番目の塩基ＣがＴに変異した変異ａｂｌ遺伝子（ａｂｌチロシンキナーゼＣ９４４Ｔ（アミノ酸情報Ｔ３１５Ｉ））を挿入したプラスミド（以下、「ｍｔＤＮＡ」という）とを調製した。そして、両者を所定の割合（ｍｔＤＮＡ：ｗｔＤＮＡ＝３：９７）に調製し、１０４ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ（１μＬ）を前記表３に示すＰＣＲ反応液４９μＬに添加してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応ならびに蛍光強度の検出は、前記実施例１と同様にして行った。
【００７８】
センスプライマー 配列番号２３
５’−ｇｇａｃｇｇａｃｇｇａｃｃｇｔｃｃｔｃｇｔｔｇｔｃｔｔｇｔｔｇｇｃ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号２４
５’−ｇｇａｃｇｇａｃｇｇａｃｃｇｃａｃｔｃｃｃｔｃａｇｇｔａｇｔｃｃａｇ−３’
（実施例４−１）
検出用プローブＤ１ 配列番号８
５’−（BODIPY FL）−ｃｔｃａＡｔｇａｔｇａｔａｔａｇａａｃｇ−Ｐ−３’
（実施例４−２）
検出用プローブＤ２ 配列番号９
５’−ａｃｔｃａＡｔｇａｔｇａｔａｔａｇａａｃ−（TAMRA）−３’
（比較例４−１）
検出用プローブ 配列番号３９
５’−（TAMRA）−ｃｃｃｇｔｔｃｔａｔａｔｃａｔｃａＴｔｇａｇ−Ｐ−３’
（比較例４−２）
検出用プローブ 配列番号４０
５’−（TAMRA）−ｃｃｇｔｔｃｔａｔａｔｃａｔｃａＴｔｇ−Ｐ−３’
【００７９】
これらの結果を図４に示す。図４は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図４において、（Ａ）は、実施例４−１、（Ｂ）は、実施例４−２、（Ｃ）は、比較例４−１、（Ｄ）は、比較例４−２の結果である。なお、同じ条件で、各プローブとｗｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成、および、各プローブとｍｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成を行った場合、それぞれのピークは以下の通りであり、これを評価基準とした。
【００８０】
ピーク温度（℃）
プローブ ｗｔＤＮＡ（１００％） ｍｔＤＮＡ（１００％）
実施例４−１ ４６．０ ５５．０
実施例４−２ ４６．０ ５５．０
比較例４−１ ５４．０ ５９．０
比較例４−２ ４９．０ ５４．０
【００８１】
同図（Ａ）および(Ｂ)に示すように、実施例４−１および実施例４−２のプローブを使用した結果、前記評価基準と同等のｗｔＤＮＡのピーク（℃）およびｍｔＤＮＡのピーク（℃）が検出された。これに対して、同図（Ｃ）および(Ｄ)に示すように、比較例４−１および比較例４−２のプローブを使用した場合、ｍｔＤＮＡのピークは確認できなかった。この結果から、本発明のプローブによれば、ｍｔＤＮＡとｗｔＤＮＡとが共存する場合でも、ｍｔＤＮＡの検出感度を向上できることがわかった。
【実施例５】
【００８２】
ａｂｌ遺伝子の９５１番目塩基の点突然変異（Ｃ→Ｇ）
本発明のプローブを使用して、ａｂｌ遺伝子における９５１番目塩基の点突然変異（Ｃ→Ｇ）についてのＴｍ解析を行った。
【００８３】
配列番号１に示す９５１番目の塩基Ｃに変異を有さない正常ａｂｌ遺伝子配列を挿入したプラスミド（以下、「ｗｔＤＮＡ」という）と、前記９５１番目の塩基ＣがＧに変異した変異ａｂｌ遺伝子（ａｂｌチロシンキナーゼＣ９５１Ｇ（アミノ酸情報Ｆ３１７Ｌ））を挿入したプラスミド（以下、「ｍｔＤＮＡ」という）とを調製した。そして、両者を所定の割合（ｍｔＤＮＡ：ｗｔＤＮＡ＝３：９７）に調製し、１０４ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ（１μＬ）を前記表３に示すＰＣＲ反応液４９μＬに添加してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応ならびに蛍光強度の検出は、前記実施例１と同様にして行った。
【００８４】
センスプライマー 配列番号２５
５’−ｇｇａｃｇｇａｃｇｇａｃｃｇｔｃｃｔｃｇｔｔｇｔｃｔｔｇｔｔｇｇｃ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号２６
５’−ｇｇａｃｇｇａｃｇｇａｃｃｇｃａｃｔｃｃｃｔｃａｇｇｔａｇｔｃｃａｇ−３’
（実施例５）
検出用プローブＥ１ 配列番号１０
５’−ｔｔｃｃｃｇｔａｇｇｔｃａｔＣａａｃ−（TAMRA）−３’
（比較例５−１）
検出用プローブ 配列番号４１
５’−ｔｔＧａｔｇａｃｃｔａｃｇｇｇａａｃｃ−（TAMRA）−３’
（比較例５−２）
検出用プローブ 配列番号４２
５’−ｔｔＧａｔｇａｃｃｔａｃｇｇｇａａｃ−（TAMRA）−３’
（比較例５−３）
検出用プローブ 配列番号４３
５’−（TAMRA）−ｃｃｃｇｔａｇｇｔｃａｔＣａａｃｔｃ−Ｐ−３’
【００８５】
これらの結果を図５に示す。図５は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図５において、（Ａ）は、実施例５、（Ｂ）は、比較例５−１、（Ｃ）は、比較例５−２、（Ｄ）は、比較例５−３の結果である。なお、同じ条件で、各プローブとｗｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成、および、各プローブとｍｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成を行った場合、それぞれのピークは以下の通りであり、これを評価基準とした。
【００８６】
ピーク温度（℃）
プローブ ｗｔＤＮＡ（１００％） ｍｔＤＮＡ（１００％）
実施例５ ４７．０ ６０．０
比較例５−１ ５８．０ ６２．０
比較例５−２ ５６．０ ６０．０
比較例５−３ Ｎ．Ｄ． Ｎ．Ｄ．
【００８７】
同図（Ａ）に示すように、実施例５のプローブを使用した結果、前記評価基準と同等のｗｔＤＮＡのピーク（℃）およびｍｔＤＮＡのピーク（℃）が検出された。これに対して、同図（Ｂ）および（Ｃ）に示すように、比較例５−１および比較例５−２のプローブを使用した場合、ｍｔＤＮＡのピークは確認できなかった。また、図（Ｄ）に示すように、比較例５−３のプローブを使用した場合、多数のピークが存在し、判別ができなかった。この結果から、本発明のプローブによれば、ｍｔＤＮＡとｗｔＤＮＡとが共存する場合でも、ｍｔＤＮＡの検出感度を向上できることがわかった。
【実施例６】
【００８８】
ａｂｌ遺伝子の１０５２番目塩基の点突然変異（Ｔ→Ｃ）
本発明のプローブを使用して、ａｂｌ遺伝子における１０５２番目塩基の点突然変異（Ｔ→Ｃ）についてのＴｍ解析を行った。
【００８９】
配列番号１に示す１０５２番目の塩基Ｔに変異を有さない正常ａｂｌ遺伝子配列を挿入したプラスミド（以下、「ｗｔＤＮＡ」という）と、前記１０５２番目の塩基ＴがＣに変異した変異ａｂｌ遺伝子（ａｂｌチロシンキナーゼＴ１０５２Ｃ（アミノ酸情報Ｍ３５１Ｔ））を挿入したプラスミド（以下、「ｍｔＤＮＡ」という）とを調製した。そして、両者を所定の割合（ｍｔＤＮＡ：ｗｔＤＮＡ＝３：９７）に調製し、１０４ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ（１μＬ）を前記表１に示すＰＣＲ反応液４９μＬに添加してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応ならびに蛍光強度の検出は、前記実施例１と同様にして行った。
【００９０】
センスプライマー 配列番号２７
５’−ｇｇｃｃｇｇｃｃｃｃｇｔｇｇｔｇｃｔｇｃｔｇｔａｃａｔｇ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号２８
５’−ｃａｃｇｃｃｃｔｇｔｇａｃｔｃｃａｔｇ−３’
（実施例６）
検出用プローブＦ１ 配列番号１１
５’−ｇｔｃａｇｃｃａＣｇｇａｇｔａｃｃ−（BODIPY FL）−３’
（比較例６−１）
検出用プローブ 配列番号４４
５’−ｃｃａｃｔｃａｇａｔｃｔｃｇｔｃａｇｃｃａＣｇｇａｇｔａｃｃ
−（TAMRA）−３’
（比較例６−２）
検出用プローブ 配列番号４５
５’−（TAMRA）−ｃｃａＴｇｇａｇｔａｃｃｔａｇＣｇａａｇ−Ｐ−３’
【００９１】
これらの結果を図６に示す。図６は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図６において、（Ａ）は、実施例６、（Ｂ）は、比較例６−１、（Ｃ）は、比較例６−２の結果である。なお、同じ条件で、各プローブとｗｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成、および、各プローブとｍｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成を行った場合、それぞれのピークは以下の通りであり、これを評価基準とした。
【００９２】
ピーク温度（℃）
プローブ ｗｔＤＮＡ（１００％） ｍｔＤＮＡ（１００％）
実施例６ ５３．０ ６４．０
比較例６−１ ６８．０ ７３．０
比較例６−２ Ｎ．Ｄ． Ｎ．Ｄ．
【００９３】
同図（Ａ）に示すように、実施例６のプローブを使用した結果、前記評価基準と同等のｗｔＤＮＡのピーク（℃）およびｍｔＤＮＡのピーク（℃）が検出された。これに対して、同図（Ｂ）および(Ｃ)に示すように、比較例６−１および比較例６−２のプローブを使用した場合、ｍｔＤＮＡのピークは確認できなかった。この結果から、本発明のプローブによれば、ｍｔＤＮＡとｗｔＤＮＡとが共存する場合でも、ｍｔＤＮＡの検出感度を向上できることがわかった。
【実施例７】
【００９４】
ａｂｌ遺伝子の１０６４番目塩基の点突然変異（Ａ→Ｇ）
本発明のプローブを使用して、ａｂｌ遺伝子における１０６４番目塩基の点突然変異（Ａ→Ｇ）についてのＴｍ解析を行った。
【００９５】
配列番号１に示す１０６４番目の塩基Ａに変異を有さない正常ａｂｌ遺伝子配列を挿入したプラスミド（以下、「ｗｔＤＮＡ」という）と、前記９４３番目の塩基ＡがＧに変異した変異ａｂｌ遺伝子（ａｂｌチロシンキナーゼＡ１０６４Ｇ（アミノ酸情報Ｅ３５５Ｇ））を挿入したプラスミド（以下、「ｍｔＤＮＡ」という）とを調製した。そして、両者を所定の割合（ｍｔＤＮＡ：ｗｔＤＮＡ＝３：９７）に調製し、１０４ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ（１μＬ）を下記ＰＣＲ反応液４９μＬに添加してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応ならびに蛍光強度の検出は、前記実施例１と同様にして行った。
【００９６】
【表４】
【００９７】
センスプライマー 配列番号２９
５’−ｇｇｃｃｇｇｃｃｃｃｇｔｇｇｔｇｃｔｇｃｔｇｔａｃａｔｇ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号３０
５’−ｃａｃｇｃｃｃｔｇｔｇａｃｔｃｃａｔｇ−３’
（実施例７−１）
検出用プローブＧ１ 配列番号１２
５’−ｇｔｔｔｔｔｃｔｔｃＣｃｃａｇｇｔａｃｔｃ−（TAMRA）−３’
（実施例７−２）
検出用プローブＧ２ 配列番号１３
５’−ｇｔｔｔｔｔｃｔｔｃＣｃｃａｇｇｔａｃｔｃｃ−（TAMRA）−３’
（比較例７）
検出用プローブ 配列番号４６
５’−（TAMRA）−ｃｔｔｃＣｃｃａｇｇｔａｃｔｃｃ−Ｐ−３’
【００９８】
これらの結果を図７に示す。図７は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図７において、（Ａ）は、実施例７−１、（Ｂ）は、実施例７−２、（Ｃ）は、比較例７の結果である。なお、同じ条件で、各プローブとｗｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成、および、各プローブとｍｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成を行った場合、それぞれのピークは以下の通りであり、これを評価基準とした。
【００９９】
ピーク温度（℃）
プローブ ｗｔＤＮＡ（１００％） ｍｔＤＮＡ（１００％）
実施例７−１ ５３．０ ６２．０
実施例７−２ ５５．０ ６３．０
【０１００】
同図（Ａ）および(Ｂ)に示すように、実施例７−１および実施例７−２のプローブを使用した結果、前記評価基準と同等のｗｔＤＮＡのピーク（℃）およびｍｔＤＮＡのピーク（℃）が検出された。これに対して、同図（Ｃ）に示すように、比較例７のプローブを使用した場合、ｍｔＤＮＡのピークは確認できなかった。この結果から、本発明のプローブによれば、ｍｔＤＮＡとｗｔＤＮＡとが共存する場合でも、ｍｔＤＮＡの検出感度を向上できることがわかった。
【実施例８】
【０１０１】
ａｂｌ遺伝子の１０７５番目塩基の点突然変異（Ｔ→Ｇ）
本発明のプローブを使用して、ａｂｌ遺伝子における１０７５番目塩基の点突然変異（Ｔ→Ｇ）についてのＴｍ解析を行った。
【０１０２】
配列番号１に示す１０７５番目の塩基Ｔに変異を有さない正常ａｂｌ遺伝子配列を挿入したプラスミド（以下、「ｗｔＤＮＡ」という）と、前記１０７５番目の塩基ＴがＧに変異した変異ａｂｌ遺伝子（ａｂｌチロシンキナーゼＴ１０７５Ｇ（アミノ酸情報Ｆ３５９Ｖ））を挿入したプラスミド（以下、「ｍｔＤＮＡ」という）とを調製した。そして、両者を所定の割合（ｍｔＤＮＡ：ｗｔＤＮＡ＝３：９７）に調製し、１０４ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ（１μＬ）を前記表４のＰＣＲ反応液４９μＬに添加してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応ならびに蛍光強度の検出は、前記実施例１と同様にして行った。
【０１０３】
センスプライマー 配列番号３１
５’−ｇｇｃｃｇｇｃｃｃｃｇｔｇｇｔｇｃｔｇｃｔｇｔａｃａｔｇ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号３２
５’−ｃａｃｇｃｃｃｔｇｔｇａｃｔｃｃａｔｇ−３’
（実施例８−１）
検出用プローブＨ１ 配列番号１４
５’−ｇａｔｇａＣｇｔｔｔｔｔｃｔｔｃｔｃｃ−（TAMRA）−３’
（実施例８−２）
検出用プローブＨ２ 配列番号１５
５’−ｔｇｔｇｇａｔｇａＣｇｔｔｔｔｔｃｔｔｃ−（TAMRA）−３’
（比較例８−１）
検出用プローブ 配列番号４７
５’−（TAMRA）−ｃｔｇｔｇｇａｔｇａＣｇｔｔｔｔｔｃ−Ｐ−３’
（比較例８−２）
検出用プローブ 配列番号４８
５’−（TAMRA）−ｃｃｔｇｔｇｇａｔｇａＣｇｔｔｔｔｔｃ−Ｐ−３’
【０１０４】
これらの結果を図８に示す。図８は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図８において、（Ａ）は、実施例８−１、（Ｂ）は、実施例８−２、（Ｃ）は、比較例８−１、（Ｄ）は、比較例８−２の結果である。なお、同じ条件で、各プローブとｗｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成、および、各プローブとｍｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成を行った場合、それぞれのピークは以下の通りであり、これを評価基準とした。
【０１０５】
ピーク温度（℃）
プローブ ｗｔＤＮＡ（１００％） ｍｔＤＮＡ（１００％）
実施例８−１ ４８．０ ５８．０
実施例８−２ ５０．０ ６０．０
比較例８−１ ４８．０ ５８．０
比較例８−２ ５０．０ ５９．０
【０１０６】
同図（Ａ）および(Ｂ)に示すように、実施例８−１および実施例８−２のプローブを使用した結果、前記評価基準と同等のｗｔＤＮＡのピーク（℃）およびｍｔＤＮＡのピーク（℃）が検出された。これに対して、同図（Ｃ）および(Ｄ)に示すように、比較例８−１および比較例８−２のプローブを使用した場合、多数のピークが現れ、ｍｔＤＮＡのピークを判別できなかった。この結果から、本発明のプローブによれば、ｍｔＤＮＡとｗｔＤＮＡとが共存する場合でも、ｍｔＤＮＡの検出感度を向上できることがわかった。
【実施例９】
【０１０７】
ａｂｌ遺伝子の１１８７番目塩基の点突然変異（Ａ→Ｇ）
本発明のプローブを使用して、ａｂｌ遺伝子における１１８７番目塩基の点突然変異（Ａ→Ｇ）についてのＴｍ解析を行った。
【０１０８】
配列番号１に示す１１８７番目の塩基Ａに変異を有さない正常ａｂｌ遺伝子配列を挿入したプラスミド（以下、「ｗｔＤＮＡ」という）と、前記１８７番目の塩基ＡがＧに変異した変異ａｂｌ遺伝子（ａｂｌチロシンキナーゼＡ１１８７Ｇ（アミノ酸情報Ｈ３９６Ｒ））を挿入したプラスミド（以下、「ｍｔＤＮＡ」という）とを調製した。そして、両者を所定の割合（ｍｔＤＮＡ：ｗｔＤＮＡ＝３：９７）に調製し、１０４ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ（１μＬ）を下記ＰＣＲ反応液４９μＬに添加してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応ならびに蛍光強度の検出は、前記実施例１と同様にして行った。
【０１０９】
【表５】
【０１１０】
センスプライマー 配列番号３３
５’−ａｃｃｔａｃｃｔａｃｃｔａｇａｔｃｔｔｇｃｔｇｃｃｃｇａａａｃｔｇ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号３４
５’−ａｃｃｔａｃｃｔａｃｃｔｃｔｔｇｔｔｇｔａｇｇｃｃａｇｇｃｔｃｔｃ−３’
（実施例９）
検出用プローブＩ１ 配列番号１６
５’−ｃｃａｇｃａＣｇｇｇｃｔｇｔｇｔａｇｇｔｇｔｃｃ−（TAMRA）−３’
（比較例９−１）
検出用プローブ 配列番号４９
５’−ｇｃｔｃｃａｇｃａＣｇｇｇｃｔｇｔｇｔａｇｇｔｇｔｃｃ−（TAMRA）−３’
（比較例９−２）
検出用プローブ 配列番号５０
５’−（TAMRA）−ｃｃａｇｃａＣｇｇｇｃｔｇｔｇｔａｇ−Ｐ−３’
【０１１１】
これらの結果を図９に示す。図９は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図９において、（Ａ）は、実施例９、（Ｂ）は、比較例９−１、（Ｃ）は、比較例９−２の結果である。なお、同じ条件で、各プローブとｗｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成、および、各プローブとｍｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成を行った場合、それぞれのピークは以下の通りであり、これを評価基準とした。
【０１１２】
ピーク温度（℃）
プローブ ｗｔＤＮＡ（１００％） ｍｔＤＮＡ（１００％）
実施例９ ６６．０ ７３．０
比較例９−１ ６９．０ ７５．０
比較例９−２ ５５．０ ６５．０
【０１１３】
同図（Ａ）に示すように、実施例９−１のプローブを使用した結果、前記評価基準と同等のｗｔＤＮＡのピーク（℃）およびｍｔＤＮＡのピーク（℃）が検出された。これに対して、同図（Ｂ）および（Ｃ）に示すように、比較例９−１および比較例９−２のプローブを使用した場合、多数のピークが現れ、ｍｔＤＮＡのピークを判別できなかった。この結果から、本発明のプローブによれば、ｍｔＤＮＡとｗｔＤＮＡとが共存する場合でも、ｍｔＤＮＡの検出感度を向上できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
以上のように、本発明のプローブによれば、検出目的の変異が発生しているａｂｌ遺伝子（変異遺伝子）と変異が発生していないａｂｌ遺伝子（正常遺伝子）とが共存している場合でも、前記検出対象である変異遺伝子を検出できる。例えば、前記Ｔｍ解析においては、従来のプローブであると、前述のようにプローブが一塩基のみ異なる変異遺伝子と正常遺伝子の双方にハイブリダイズするため、前記融解曲線において、両者のシグナルが重なり、変異遺伝子の存在を検出することが非常に困難であった。これに対して、本発明のプローブによれば、変異遺伝子と正常遺伝子の双方にハイブリダイズするものの、融解曲線において、両者のシグナルを分離できる。このため、本発明によれば、例えば、Ｔｍ解析によっても、変異遺伝子の検出が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】図１は、本発明の実施例におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の他の実施例におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明のさらにその他の実施例におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明のさらにその他の実施例におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明のさらにその他の実施例におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明のさらにその他の実施例におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明のさらにその他の実施例におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図８】図８は、本発明のさらにその他の実施例におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図９】図９は、本発明のさらにその他の実施例におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、白血病に関連するａｂｌ遺伝子の変異を検出するためのプローブおよびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
あらゆる疾患の原因や、個体間の疾患易罹患性（疾患のかかり易さ）、個体間における薬効の違い等を遺伝子レベルで解析する方法として、点突然変異、いわゆる一塩基多型（ＳＮＰ）の検出が広く行われている。
【０００３】
点突然変異の一般的な検出方法としては、（１）試料の標的ＤＮＡについて、検出対象配列に相当する領域を増幅させ、その全遺伝子配列を解析するＤｉｒｅｃｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法や（２）Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、（３）検出対象配列に相当する領域を増幅させ、温度勾配カラム中でＨＰＬＣを行い、溶出される時間によって変異の有無を検出するＤｅｎａｔｕｒｉｎｇ ＨＰＬＣ法、（４）目的の変異を含む領域に蛍光プローブが結合すると蛍光を発することを利用し、前記蛍光の検出により変異を検出するＩｎｖａｄａｒ法、（５）３’末端領域に目的の変異が位置するプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅の有無によって変異を判断するＡＳＰ−ＰＣＲ法等があげられる。
【０００４】
しかしながら、前記（１）、（２）および（４）の方法は、感度が低く（それぞれ約２０％、約５％、約５％程度）、操作に多大な手間と時間がかかり、また、前記（３）の方法は、感度が約１０％と低く、また、変異の有無が確認できるのみで、どの部位にどのような変異が生じているのかを解析できず、特異性にかけるという問題がある。また、前記（５）の方法は、感度は高いものの特異性が低く、偽陽性が生じ易いという問題がある。なお、感度は数値（％）が小さい程高感度である。
【０００５】
このような問題から、近年、点突然変異の検出方法として、Ｔｍ解析を利用した検出が行われている。これは、検出目的の点突然変異を含む検出対象配列に相補的なプローブを用いて、検出試料の標的一本鎖ＤＮＡと前記プローブとのハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成させ、このハイブリッド形成体に加熱処理を施して温度上昇に伴うハイブリッドの解離（融解）を吸光度等のシグナル測定により検出し、この検出結果に基づいてＴｍ値を決定することによって点突然変異の有無を判断する方法である。Ｔｍ値は、ハイブリッド形成体の相同性が高い程高く、相同性が低い程低くなる。このため、点突然変異を含む検出対象配列とそれに相補的なプローブとのハイブリッド形成体について予めＴｍ値（評価基準値）を求めておき、検出試料の標的一本鎖ＤＮＡと前記プローブとのＴｍ値（測定値）を測定し、測定値が評価基準値と同じであれば、マッチ、すなわち標的ＤＮＡに点突然変異が存在すると判断でき、測定値が評価基準値より低ければ、ミスマッチ、すなわち標的ＤＮＡに点突然変異が存在しないと判断できる。
【０００６】
しかしながら、このようなＴｍ解析を用いた検出方法は、感度が低いという問題がある。これは、特に、白血病患者の血液細胞由来ＤＮＡについて点突然変異を検出する際に問題となっている（特許文献１）。白血病は、骨髄中の造血幹細胞がガン化することによって起こる疾患である。中でも慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＣＭＬ）は、９番目の染色体と２２番目の染色体との転座により形成されるｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子が発症原因として知られており、その治療には、ＡＢＬキナーゼ阻害剤であるイマチニブ等が広く使用されている。しかしながら、このａｂｌ遺伝子（前記融合遺伝子におけるａｂｌ遺伝子を含む）に点突然変異が存在すると、イマチニブに対して耐性を発現するという問題があり、その場合、治療において、イマチニブ投与量の増加、他の治療薬への変更、骨髄移植等への切り替え等が必要になる。したがって、白血病、特にＣＭＬの治療においては、ａｂｌ遺伝子における点突然変異の有無を検出することが非常に重要となっている。しかしながら、一人のＣＭＬ患者の血液であっても、その血液細胞にはａｂｌ遺伝子に点突然変異が発生しているもの（変異遺伝子）と発生していないもの（正常遺伝子）とが含まれており、両者の違いは、点突然変異すなわち一塩基の配列にすぎない。そうすると、点突然変異を検出するためのプローブは、点突然変異を含む変異配列（検出対象配列）にハイブリダイズ（マッチ）するが、さらに、点突然変異を含まない正常配列（非検出対象配列）にもハイブリダイズ（ミスマッチ）するという現象が起こってしまう。このような場合に、Ｔｍ解析によってシグナルの強度と温度との関係を示す融解曲線を作成すると、マッチしている変異配列に対する高温側のピークが、ミスマッチである正常配列に対する低温側のピークの存在によって検出し難くなるという問題がある。つまり、従来のプローブでは、変異を含む変異配列が存在する場合であっても、変異を含まない正常配列の存在によって、その検出が困難となり、検出感度の低下が生じてしまう。
【特許文献１】特公表２００４−５３７９９２号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、一塩基のみが異なる、変異を含む検出対象配列と変異を含まない非検出対象配列とが共存する場合でも、前記変異を含む検出対象配列を検出可能な検出用プローブおよびその用途の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明のプローブは、ａｂｌ遺伝子の変異を検出するためのプローブであって、下記（Ａ１）〜（Ｉ１）からなる群から選択された少なくとも一つのオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする。
（Ａ１）配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ａ２）配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｂ１）配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｂ２）配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｃ１）配列番号６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｃ２）配列番号７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｄ１）配列番号８の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｄ２）配列番号９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｅ１）配列番号１０の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｆ１）配列番号１１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｇ１）配列番号１２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｇ２）配列番号１３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｈ１）配列番号１４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｈ２）配列番号１５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｉ１）配列番号１６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【０００９】
本発明の変異の検出方法は、ａｂｌ遺伝子における変異の検出方法であって、下記工程（１）〜（５）を含むことを特徴とする。
（１）ＤＮＡを含有する試料に、本発明のプローブを添加する工程
（２）前記ＤＮＡに前記プローブをハイブリダイズさせる工程
（３）前記ＤＮＡと前記プローブとのハイブリッド形成体について、温度変化に伴うシグナルの変動を測定する工程
（４）前記シグナルの変動を解析してＴｍ値を決定する工程
（５）前記Ｔｍ値から変異の有無を決定する工程
【発明の効果】
【００１０】
本発明のプローブによれば、検出目的の変異が発生しているａｂｌ遺伝子（ｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子におけるａｂｌ遺伝子を含む。以下同様。）（変異遺伝子）と変異が発生していないａｂｌ遺伝子（正常遺伝子）とが共存している場合でも、前記目的の変異が発生した検出対象配列を検出できる。例えば、前記Ｔｍ解析においては、従来のプローブであると、前記プローブが、一塩基のみ異なる変異遺伝子と正常遺伝子の双方にハイブリダイズするため、前記融解曲線において、両者のシグナルが重なり、変異遺伝子の存在を検出することが非常に困難であった。これに対して、本発明のプローブによれば、変異遺伝子と正常遺伝子の双方にハイブリダイズするものの、融解曲線において、両者のシグナルを十分に分離できる。このため、本発明によれば、従来よりも優れた感度で、変異遺伝子を検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明において、以下、検出目的の変異が発生しているａｂｌ遺伝子を「変異遺伝子または検出対象遺伝子」、検出目的の変異が発生している配列であって、プローブによる検出対象の配列を「変異配列または検出対象配列」、検出目的の変異が発生していないａｂｌ遺伝子を「正常遺伝子または非検出対象遺伝子」、検出目的の変異が発生していない配列を「正常配列または非検出対象配列」、変異の有無を検出する試料中のＤＮＡを「標的ＤＮＡ」ともいう。本発明において検出する変異としては、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）等があげられる。
【００１２】
＜プローブ＞
本発明のプローブは、前述のように、ａｂｌ遺伝子の変異を検出するためのプローブであって、前記（Ａ１）〜（Ｉ１）からなる群から選択された少なくとも一つのオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする。ａｂｌ遺伝子のｃＤＮＡ配列（ｍＲＮＡ配列）を、配列番号１に示す。なお、この配列は、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００５１５７に登録されている。以下に、これらのプローブについて説明する。
【００１３】
下記（Ａ１）および（Ａ２）のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、それぞれ、配列番号１の塩基配列における７３０番目の塩基Ａの変異（Ａ→Ｇ）を検出するためのプローブである。下記配列番号２または配列番号３のオリゴヌクレオチドによれば、順鎖における変異を確認でき、これらの相補的オリゴヌクレオチドによれば、逆鎖における変異を確認できる。
（Ａ１）配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
（Ａ２）配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
５’−ｔｇｔｇｃｔｔｃａＣｇｇｔｇａｔｇｔｃｃ−３’
（配列番号２）
５’−ｇｔｇｃｔｔｃａＣｇｇｔｇａｔｇｔｃｃｇｔｇｃｇｔｔｃｃ−３’
（配列番号３）
【００１４】
下記（Ｂ１）および（Ｂ２）のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、それぞれ、配列番号１の塩基配列における７４９番目の塩基Ｇの変異（Ｇ→Ａ）を検出するためのプローブである。下記配列番号４または配列番号５のオリゴヌクレオチドによれば、順鎖における変異を確認でき、これらの相補的オリゴヌクレオチドによれば、逆鎖における変異を確認できる。
（Ｂ１）配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
（Ｂ２）配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
５’−ｃａａｇｃｔｇｇｇｃｇＡｇｇｇｃｃ−３’ （配列番号４）
５’−ｃａｃａａｇｃｔｇｇｇｃｇＡｇｇｇ−３’ （配列番号５）
【００１５】
下記（Ｃ１）および（Ｃ２）のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、それぞれ、配列番号１の塩基配列における９４３番目の塩基Ａの変異（Ａ→Ｇ）を検出するためのプローブである。下記配列番号６または配列番号７のオリゴヌクレオチドによれば、順鎖における変異を確認でき、これらの相補的オリゴヌクレオチドによれば、逆鎖における変異を確認できる。
（Ｃ１）配列番号６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
（Ｃ２）配列番号７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
５’−ｃｔｃａｇＣｇａｔｇａｔａｔａｇａａｃｇｇ−３’ （配列番号６）
５’−ｃａｇＣｇａｔｇａｔａｔａｇａａｃｇｇｇ−３’ （配列番号７）
【００１６】
下記（Ｄ１）および（Ｄ２）のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、それぞれ、配列番号１の塩基配列における９４４番目の塩基Ｃの変異（Ｃ→Ｔ）を検出するためのプローブである。下記配列番号８または配列番号９のオリゴヌクレオチドによれば、順鎖における変異を確認でき、これらの相補的オリゴヌクレオチドによれば、逆鎖における変異を確認できる。
（Ｄ１）配列番号８の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
（Ｄ２）配列番号９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
５’−ｃｔｃａＡｔｇａｔｇａｔａｔａｇａａｃｇ−３’ （配列番号８）
５’−ａｃｔｃａＡｔｇａｔｇａｔａｔａｇａａｃ−３’ （配列番号９）
【００１７】
下記（Ｅ１）のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、それぞれ、配列番号１の塩基配列における９５１番目の塩基Ｃの変異（Ｃ→Ｇ）を検出するためのプローブである。下記配列番号１０のオリゴヌクレオチドによれば、逆鎖における変異を確認でき、これらの相補的オリゴヌクレオチドによれば、順鎖における変異を確認できる。
（Ｅ１）配列番号１０の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
５’−ｔｔｃｃｃｇｔａｇｇｔｃａｔＣａａｃ−３’ （配列番号１０）
【００１８】
下記（Ｆ１）のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、それぞれ、配列番号１の塩基配列における１０５２番目の塩基Ｔの変異（Ｔ→Ｃ）を検出するためのプローブである。下記配列番号１１のオリゴヌクレオチドによれば、順鎖における変異を確認でき、これらの相補的オリゴヌクレオチドによれば、逆鎖における変異を確認できる。
（Ｆ１）配列番号１１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
５’−ｇｔｃａｇｃｃａＣｇｇａｇｔａｃｃ−３’ （配列番号１１）
【００１９】
下記（Ｇ１）および（Ｇ２）のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、それぞれ、配列番号１の塩基配列における１０６４番目の塩基Ａの変異（Ａ→Ｇ）を検出するためのプローブである。下記配列番号１２または配列番号１３のオリゴヌクレオチドによれば、順鎖における変異を確認でき、これらの相補的オリゴヌクレオチドによれば、逆鎖における変異を確認できる。
（Ｇ１）配列番号１２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
（Ｇ２）配列番号１３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
５’−ｇｔｔｔｔｔｃｔｔｃＣｃｃａｇｇｔａｃｔｃ−３’ （配列番号１２）
５’−ｇｔｔｔｔｔｃｔｔｃＣｃｃａｇｇｔａｃｔｃｃ−３’ （配列番号１３）
【００２０】
下記（Ｈ１）および（Ｈ２）のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、それぞれ、配列番号１の塩基配列における１０７５番目の塩基Ｔの変異（Ｔ→Ｇ）を検出するためのプローブである。下記配列番号１４または配列番号１５のオリゴヌクレオチドによれば、順鎖における変異を確認でき、これらの相補的オリゴヌクレオチドによれば、逆鎖における変異を確認できる。
（Ｈ１）配列番号１４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
（Ｈ２）配列番号１５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
５’−ｇａｔｇａＣｇｔｔｔｔｔｃｔｔｃｔｃｃ−３’ （配列番号１４）
５’−ｔｇｔｇｇａｔｇａＣｇｔｔｔｔｔｃｔｔｃ−３’ （配列番号１５）
【００２１】
下記（Ｉ１）のオリゴヌクレオチドからなるプローブは、配列番号１の塩基配列における１１８７番目の塩基Ａの変異（Ａ→Ｇ）を検出するためのプローブである。下記配列番号１６のオリゴヌクレオチドによれば、順鎖における変異を確認でき、これらの相補的オリゴヌクレオチドによれば、逆鎖における変異を確認できる。
（Ｉ１）配列番号１６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補的オリゴヌクレオチド
５’−ｃｃａｇｃａＣｇｇｇｃｔｇｔｇｔａｇｇｔｇｔｃｃ−３’
（配列番号１６）
【００２２】
本発明のプローブは、標識化物質で標識化されたプローブであることが好ましい。前記標識化物質は、制限されないが、前記標識化プローブの具体例として、例えば、蛍光色素（蛍光団）で標識された、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような蛍光消光現象（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）を利用したプローブとしては、中でも、オリゴヌクレオチドを３’末端もしくは５’末端がＣとなるように設計し、その末端のＣがＧに近づくと発光が弱くなる蛍光色素で標識化したプローブが特に好ましい。このプローブは、一般的に、グアニン消光プローブと呼ばれており、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。
【００２３】
前記蛍光色素は、制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光色素としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（商標名、モレキュラー・プローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＲＭＡ(モレキュラープローブ社製)等があげられる。プローブの検出条件は、特に制限されず、使用する蛍光色素により適宜決定できるが、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅは、検出波長４５０〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５〜７００ｎｍ）、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬは、検出波長５１５〜５５５ｎｍで検出できる。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。
【００２４】
また、本発明のプローブは、例えば、３’末端にリン酸基が付加されてもよい。後述するように、変異の有無を検出するＤＮＡ（標的ＤＮＡ）は、ＰＣＲ等の遺伝子増幅法によって調製することができ、この際、本発明のプローブを遺伝子増幅反応の反応液中に共存させることができる。このような場合に、プローブの３’末端にリン酸基を付加させておけば、プローブ自体が遺伝子増幅反応によって伸長することを十分に防止できる。また、３’末端に前述のような標識化物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。
【００２５】
本発明のプローブは、ａｂｌ遺伝子の変異の検出に使用することができる。検出方法は、何ら制限されず、検出対象配列とプローブとのハイブリダイズを利用する方法であればよい。本発明のプローブを適用する方法の一例として、Ｔｍ解析を利用した変異の検出方法について、以下に説明する。
【００２６】
＜変異検出方法＞
本発明の変異検出方法は、前述のように、ａｂｌ遺伝子における変異の検出方法であって、下記工程（１）〜（５）を含むことを特徴とする。なお、本発明の変異検出方法は、本発明のプローブを使用することが特徴であって、その他の構成や条件等は、以下の記載に制限されない。
（１）ＤＮＡを含有する試料に、本発明のプローブを添加する工程
（２）前記ＤＮＡに前記プローブをハイブリダイズさせる工程
（３）前記ＤＮＡと前記プローブとのハイブリッド形成体について、温度変化に伴うシグナルの変動を測定する工程
（４）前記シグナルの変動を解析してＴｍ値を決定する工程
（５）前記Ｔｍ値から変異の有無を決定する工程
【００２７】
本発明において、試料中のＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡでもよいし二本鎖ＤＮＡであってもよい。前記ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡの場合は、例えば、前記ハイブリダイズ工程に先立って、加熱により前記試料中の二本鎖ＤＮＡを解離させる工程を含むことが好ましい。二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離することによって、次のハイブリダイズ工程において、検出用プローブや阻害用ポリヌクレオチドとのハイブリダイズが可能となる。
【００２８】
本発明において、試料に含まれるＤＮＡは、例えば、生体試料に元来含まれるＤＮＡでもよいが、検出精度を向上できることから、生体試料に元来含まれているＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ等により増幅させた増幅産物であることが好ましい。増幅産物の長さは、特に制限されないが、例えば、５０〜１０００ｍｅｒであり、好ましくは８０〜２００ｍｅｒである。また、試料中のＤＮＡは、例えば、生体試料由来のＲＮＡ（トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等）からＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ）により合成したｃＤＮＡであってもよい。
【００２９】
本発明の変異検出方法を適用する試料は、制限されず、ａｂｌ遺伝子が存在する試料があげられる。具体例としては、白血球細胞等の血球試料、全血試料等があげられる。なお、本発明において、試料の採取方法、ＤＮＡの調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。
【００３０】
本発明において、前記試料中のＤＮＡに対する、本発明のプローブの添加割合（モル比）は、制限されないが、検出シグナルを十分に確保できることから、１倍以下が好ましく、より好ましくは、０．１倍以下である。この際、試料中のＤＮＡとは、例えば、検出目的の変異が発生している検出対象ＤＮＡと前記変異が発生していない非検出対象ＤＮＡとの合計でもよいし、検出目的の変異が発生している検出対象配列を含む増幅産物と前記変異が発生していない非検出対象配列を含む増幅産物との合計でもよい。なお、試料中のＤＮＡにおける前記検出対象ＤＮＡの割合は、通常、不明であるが、結果的に、前記プローブの添加割合（モル比）は、検出対象ＤＮＡ（検出対象配列を含む増幅産物）に対して１０倍以下となることが好ましく、より好ましくは５倍以下、さらに、好ましくは３倍以下である。また、その下限は特に制限されないが、例えば、０．００１倍以上であり、好ましくは０．０１倍以上であり、より好ましくは０．１倍以上である。
【００３１】
前記ＤＮＡに対する本発明のプローブの添加割合は、例えば、二本鎖ＤＮＡに対するモル比でもよいし、一本鎖ＤＮＡに対するモル比でもよい。
【００３２】
Ｔｍ値について説明する。二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。この現象に基づき、融解温度Ｔｍとは、一般に、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。
【００３３】
本発明において、Ｔｍ値を決定するための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、本発明のプローブに付加した標識のシグナルを測定することが好ましい。このため、本発明のプローブとして、前述の標識化プローブを使用することが好ましい。前記標識化プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブがあげられる。前者のようなプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識によるシグナルをシグナル特有の条件（吸光度等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行ならびにＴｍ値の決定を行うことができる。標識化プローブにおける標識化物質は、例えば、前述のとおりである。
【００３４】
次に、本発明の変異検出方法について、本発明のプローブとして、蛍光色素で標識化された標識化プローブを使用する例をあげて説明する。なお、本発明の変異検出方法は、本発明のプローブを使用すること自体が特徴であり、その他の工程や条件については何ら制限されない。
【００３５】
まず、全血からゲノムＤＮＡを単離する。全血からのゲノムＤＮＡの単離は、従来公知の方法によって行うことができ、例えば、市販のゲノムＤＮＡ単離キット（商品名ＧＦＸ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）等が使用できる。
【００３６】
次に、単離したゲノムＤＮＡを含む試料に標識化プローブを添加する。前記標識化プローブとしては、例えば、ＱＰｒｏｂｅが好ましい。このＱＰｒｏｂｅとは、一般に、プローブ末端のシトシン塩基を蛍光色素で標識化したプローブであり、これが検出対象配列にハイブリッドすることで前記蛍光色素と検出対象配列のグアニン塩基とが相互作用し、その結果、蛍光が減少（または消光）するものである。標識化プローブの配列は、前述の通りであって、検出目的の変異に応じて、適宜選択すればよい。
【００３７】
前記検出用プローブの添加のタイミングは、特に制限されず、例えば、後述するＰＣＲ処理の後、ＰＣＲ増幅産物に対して添加してもよいし、ＰＣＲ等による増幅処理前に添加してもよい。このようにＰＣＲ等による増幅処理前に前記検出用プローブを添加する場合は、例えば、前述のように、その３’末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加することが好ましい。
【００３８】
前記検出用プローブは、単離したゲノムＤＮＡを含む液体試料に添加してもよいし、溶媒中でゲノムＤＮＡと混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものがあげられる。
【００３９】
続いて、単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ等の遺伝子増幅法によって検出目的の点突然変異を生じる部位を含む配列（検出対象配列および非検出対象配列）を増幅させる。前記遺伝子増幅法は、制限されず、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等があげられるが、ＰＣＲ法が好ましい。なお、以下、ＰＣＲ法を例にあげて、本発明を説明するが、これには制限されない。なお、ＰＣＲの条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【００４０】
ＰＣＲのプライマーの配列は、目的の検出対象配列を増幅できるものであれば特に制限されず、目的の配列に応じて、従来公知の方法により適宜設計できる。プライマーの長さは、特に制限されず、一般的な長さ（例えば、１０〜３０ｍｅｒ）に設定できる。以下に、前記（Ａ１）〜（Ｈ２）のプローブを使用する際の、検出対象配列の増幅に使用できるプライマーセットの一例を示す。なお、これらは例示であって、本発明を制限するものではない。
【００４１】
Ａ１プローブおよびＡ２プローブ用のプライマーセット
センスプライマー 配列番号１７
５’−ｇａｃａａｇｔｇｇｇａｇａｔｇｇａａｃｇｃ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号１８
５’−ｃａｃｇｇｃｃａｃｃｇｔｃａｇｇ−３’
Ｂ１プローブおよびＢ２プローブ用のプライマーセット
センスプライマー 配列番号１９
５’−ｇａｃａａｇｔｇｇｇａｇａｔｇｇａａｃｇｃ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号２０
５’−ｃａｃｇｇｃｃａｃｃｇｔｃａｇｇ−３’
Ｃ１プローブおよびＣ２プローブ用のプライマーセット
センスプライマー 配列番号２１
５’−ｇｇａｃｇｇａｃｇｇａｃｃｇｔｃｃｔｃｇｔｔｇｔｃｔｔｇｔｔｇｇｃ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号２２
５’−ｇｇａｃｇｇａｃｇｇａｃｃｇｃａｃｔｃｃｃｔｃａｇｇｔａｇｔｃｃａｇ−３’
Ｄ１プローブおよびＤ２プローブ用のプライマーセット
センスプライマー 配列番号２３
５’−ｇｇａｃｇｇａｃｇｇａｃｃｇｔｃｃｔｃｇｔｔｇｔｃｔｔｇｔｔｇｇｃ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号２４
５’−ｇｇａｃｇｇａｃｇｇａｃｃｇｃａｃｔｃｃｃｔｃａｇｇｔａｇｔｃｃａｇ−３’
Ｅ１プローブ用のプライマーセット
センスプライマー 配列番号２５
５’−ｇｇａｃｇｇａｃｇｇａｃｃｇｔｃｃｔｃｇｔｔｇｔｃｔｔｇｔｔｇｇｃ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号２６
５’−ｇｇａｃｇｇａｃｇｇａｃｃｇｃａｃｔｃｃｃｔｃａｇｇｔａｇｔｃｃａｇ−３’
Ｆ１プローブ用のプライマーセット
センスプライマー 配列番号２７
５’−ｇｇｃｃｇｇｃｃｃｃｇｔｇｇｔｇｃｔｇｃｔｇｔａｃａｔｇ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号２８
５’−ｃａｃｇｃｃｃｔｇｔｇａｃｔｃｃａｔｇ−３’
Ｇ１プローブおよびＧ２プローブ用のプライマーセット
センスプライマー 配列番号２９
５’−ｇｇｃｃｇｇｃｃｃｃｇｔｇｇｔｇｃｔｇｃｔｇｔａｃａｔｇ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号３０
５’−ｃａｃｇｃｃｃｔｇｔｇａｃｔｃｃａｔｇ−３’
Ｈ１プローブおよびＨ２プローブ用のプライマーセット
センスプライマー 配列番号３１
５’−ｇｇｃｃｇｇｃｃｃｃｇｔｇｇｔｇｃｔｇｃｔｇｔａｃａｔｇ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号３２
５’−ｃａｃｇｃｃｃｔｇｔｇａｃｔｃｃａｔｇ−３’
Ｉ１プローブ用のプライマーセット
センスプライマー 配列番号３３
５’−ａｃｃｔａｃｃｔａｃｃｔａｇａｔｃｔｔｇｃｔｇｃｃｃｇａａａｃｔｇ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号３４
５’−ａｃｃｔａｃｃｔａｃｃｔｃｔｔｇｔｔｇｔａｇｇｃｃａｇｇｃｔｃｔｃ−３’
【００４２】
次に、得られたＰＣＲ増幅産物の解離、および、解離により得られた一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズを行う。
【００４３】
前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５〜９５℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。
【００４４】
また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、４０〜５０℃である。
【００４５】
ハイブリダイズ工程の反応液における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応液におけるＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１〜１μＭであり、好ましくは０．１〜０．５μＭ、前記標識化プローブの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲が好ましく、例えば、０．００１〜１０μＭであり、好ましくは０．００１〜１μＭである。
【００４６】
そして、得られた前記一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリッド形成体を加熱し、温度上昇に伴うシグナルの変動を測定する。例えば、ＱＰｒｏｂｅを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとのハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００４７】
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃であり、好ましくは２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．１〜２０℃／秒であり、好ましくは０．３〜５℃／秒である。
【００４８】
次に、前記シグナルの変動を解析してＴｍ値として決定する。具体的には、得られた蛍光強度から各温度における値（−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ）を算出し、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定できる。また、単位時間当たりの蛍光強度増加量（蛍光強度増加量／ｔ）が最も高い点をＴｍ値として決定することもできる。なお、標識化プローブとして、消光プローブではなく、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示すプローブを使用した場合には、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。
【００４９】
前記Ｔｍ値は、例えば、従来公知のＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｌｔｃａｌｃ．ｃｏｍ／）等により算出でき、また、隣接法（Ｎｅａｒｅｓｔ Ｎｅｉｇｈｂｏｒ Ｍｅｔｈｏｄ）によって決定することもできる。
【００５０】
また、本発明においては、前述のように、ハイブリッド形成体を加熱して、温度上昇に伴うシグナル変動を測定する方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよい。すなわち、前記プローブを添加した試料の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定してもよい。
【００５１】
具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、ＱＰｒｏｂｅ）を使用した場合、前記プローブを試料に添加した際には、前記プローブは解離しているため蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、前記プローブを試料に添加した際には、前記プローブは解離しているため蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記試料の温度を徐々に降下して、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００５２】
＜プローブキット＞
本発明のプローブキットは、ａｂｌ遺伝子の変異の検出に使用するプローブキットであり、本発明のプローブを含むことを特徴とする。本発明のプローブキットにおいて、本発明のプローブは、一種類でもよいし二種類以上であってもよい。後者の場合、二種類以上のプローブは、混合された状態で含まれてもよいし、別個の試薬として含まれていてもよい。また、二種類以上の本発明のプローブが混合された状態で本発明のプローブキットに含まれる場合や、別個の試薬として含まれているが、例えば、使用時に同じ反応系で、各プローブと各検出対象配列とのＴｍ解析を行う場合、各プローブは、別個の標識化物質で標識化されていることが好ましい。このように標識化物質の種類を変えることで、同じ反応系であっても、それぞれのプローブについての検出が可能になる。前記標識化物質としては、例えば、検出波長が異なる物質であることが好ましい。
【００５３】
前述のように、ａｂｌ遺伝子には、白血病に関連する複数の変異が知られており、本発明のプローブによれば、前述した各種変異（９種類）を検出することが可能である。他方、白血病に関与するａｂｌ遺伝子は、例えば、いずれか一箇所の変異のみが検出される場合もあるが、複数個所の変異が検出される場合もある。本発明において検出目的としている複数の変異は、白血病やその薬剤（例えば、イマチニブ）と関係を示す変異であるが、変異ごとに特有の特徴を示すと考えられる。このため、例えば、複数の変異を検出し、それらの結果を総合的に判断することで、より良い診断や治療が可能になる。したがって、本発明のプローブキットにおいて、本発明のプローブを２種類以上含有させることによって、診断や治療等のための変異の検出をより簡便に行うことができる。
【００５４】
つぎに、本発明の実施例について、比較例と併せて説明する。ただし、本発明は下記の実施例および比較例により制限されない。
【実施例１】
【００５５】
ａｂｌ遺伝子の７３０番目塩基の点突然変異（Ａ→Ｇ）
本発明のプローブを使用して、ａｂｌ遺伝子における７３０番目塩基の点突然変異（Ａ→Ｇ）についてのＴｍ解析を行った。
【００５６】
配列番号１に示す７３０番目の塩基Ａに変異を有さない正常ａｂｌ遺伝子配列を挿入したプラスミド（以下、「ｗｔＤＮＡ」という）と、前記７３０番目の塩基ＡがＧに変異した変異ａｂｌ遺伝子（ａｂｌチロシンキナーゼＡ７３０Ｇ（アミノ酸情報Ｍ２４４Ｖ））を挿入したプラスミド（以下、「ｍｔＤＮＡ」という）とを調製した。そして、両者を所定の割合（ｍｔＤＮＡ：ｗｔＤＮＡ＝３：９７）に調製し、１０４ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ（１μＬ）を下記ＰＣＲ反応液４９μＬに添加してＰＣＲ反応を行った。前記ＰＣＲ反応液における検出用プローブの終濃度は５０ｎＭとした。前記ＰＣＲ反応は、サーマルサイクラーにより、９５℃で６０秒処理した後、９５℃１秒および５８℃３０秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返し、さらに９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した。そして、続けて温度の上昇速度を１℃／３秒として、前記ＰＣＲ反応液を４０℃から９５℃に加熱していき、経時的な蛍光強度の変化を測定した（波長５８５〜７００ｎｍ）。
【００５７】
【表１】
【００５８】
センスプライマー 配列番号１７
５’−ｇａｃａａｇｔｇｇｇａｇａｔｇｇａａｃｇｃ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号１８
５’−ｃａｃｇｇｃｃａｃｃｇｔｃａｇｇ−３’
（実施例１−１）
検出用プローブＡ１ 配列番号２
５’−ｔｇｔｇｃｔｔｃａＣｇｇｔｇａｔｇｔｃｃ−（TAMRA）−３’
（実施例１−２）
検出用プローブＡ２ 配列番号３
５’−ｇｔｇｃｔｔｃａＣｇｇｔｇａｔｇｔｃｃｇｔｇｃｇｔｔｃｃ
−（TAMRA）−３’
（比較例１）
検出用プローブ 配列番号３５
５’−（TAMRA）−ｃａｃｃＧｔｇａａｇｃａｃａａｇ−Ｐ−３’
【００５９】
これらの結果を図１に示す。図１は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図１において、（Ａ）は、実施例１−１、（Ｂ）は、実施例１−２、（Ｃ）は、比較例１の結果である。なお、同じ条件で、各プローブとｗｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成、および、各プローブとｍｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成を行った場合、それぞれのピークは以下の通りであり、これを評価基準とした。
【００６０】
ピーク温度（℃）
プローブ ｗｔＤＮＡ（１００％） ｍｔＤＮＡ（１００％）
実施例１−１ ５６．０ ６５．０
実施例１−２ ６９．０ ７４．０
比較例１ ５０．０ ５７．０
【００６１】
同図（Ａ）および(Ｂ)に示すように、実施例１−１および実施例１−２のプローブを使用した結果、前記評価基準と同等のｗｔＤＮＡのピーク（℃）およびｍｔＤＮＡのピーク（℃）が検出された。これに対して、同図（Ｃ）に示すように、比較例１のプローブを使用した場合、ｍｔＤＮＡのピークは確認できなかった。この結果から、本発明のプローブによれば、ｍｔＤＮＡとｗｔＤＮＡとが共存する場合でも、ｍｔＤＮＡの検出感度を向上できることがわかった。
【実施例２】
【００６２】
ａｂｌ遺伝子の７４９番目塩基の点突然変異（Ｇ→Ａ）
本発明のプローブを使用して、ａｂｌ遺伝子における７４９番目塩基の点突然変異（Ｇ→Ａ）についてのＴｍ解析を行った。
【００６３】
配列番号１に示す７４９番目の塩基Ｇに変異を有さない正常ａｂｌ遺伝子配列を挿入したプラスミド（以下、「ｗｔＤＮＡ」という）と、前記７４９番目の塩基ＧがＡに変異した変異ａｂｌ遺伝子（ａｂｌチロシンキナーゼＧ７４９Ａ（アミノ酸情報Ｇ２５０Ｅ））を挿入したプラスミド（以下、「ｍｔＤＮＡ」という）とを調製した。そして、両者を所定の割合（ｍｔＤＮＡ：ｗｔＤＮＡ＝３：９７）に調製し、１０４ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ（１μＬ）を下記ＰＣＲ反応液４９μＬに添加してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応ならびに蛍光強度の検出は、前記実施例１と同様にして行った。
【００６４】
【表２】
【００６５】
センスプライマー 配列番号１９
５’−ｇａｃａａｇｔｇｇｇａｇａｔｇｇａａｃｇｃ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号２０
５’−ｃａｃｇｇｃｃａｃｃｇｔｃａｇｇ−３’
（実施例２−１）
検出用プローブＢ１ 配列番号４
５’−（TAMRA）−ｃａａｇｃｔｇｇｇｃｇＡｇｇｇｃｃ−Ｐ−３’
（実施例２−２）
検出用プローブＢ２ 配列番号５
５’−（TAMRA）−ｃａｃａａｇｃｔｇｇｇｃｇＡｇｇｇ−Ｐ−３’
（比較例２）
検出用プローブ 配列番号３６
５’−（TAMRA）−ｃｃｃＴｃｇｃｃｃａｇｃｔｔ−Ｐ−３’
【００６６】
これらの結果を図２に示す。図２は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図２において、（Ａ）は、実施例２−１、（Ｂ）は、実施例２−２、（Ｃ）は、比較例２の結果である。なお、同じ条件で、各プローブとｗｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成、および、各プローブとｍｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成を行った場合、それぞれのピークは以下の通りであり、これを評価基準とした。
【００６７】
ピーク温度（℃）
プローブ ｗｔＤＮＡ（１００％） ｍｔＤＮＡ（１００％）
実施例２−１ ５９．０ ６６．０
実施例２−２ ５８．０ ６４．０
【００６８】
同図（Ａ）および(Ｂ)に示すように、実施例２−１および実施例２−２のプローブを使用した結果、前記評価基準と同等のｗｔＤＮＡのピーク（℃）およびｍｔＤＮＡのピーク（℃）が検出された。これに対して、同図（Ｃ）に示すように、比較例２のプローブを使用した場合、ｍｔＤＮＡのピークは確認できなかった。この結果から、本発明のプローブによれば、ｍｔＤＮＡとｗｔＤＮＡとが共存する場合でも、ｍｔＤＮＡの検出感度を向上できることがわかった。
【実施例３】
【００６９】
ａｂｌ遺伝子の９４３番目塩基の点突然変異（Ａ→Ｇ）
本発明のプローブを使用して、ａｂｌ遺伝子における９４３番目塩基の点突然変異（Ａ→Ｇ）についてのＴｍ解析を行った。
【００７０】
配列番号１に示す９４３番目の塩基Ａに変異を有さない正常ａｂｌ遺伝子配列を挿入したプラスミド（以下、「ｗｔＤＮＡ」という）と、前記９４３番目の塩基ＡがＧに変異した変異ａｂｌ遺伝子（ａｂｌチロシンキナーゼＡ９４３Ｇ（アミノ酸情報Ｔ３１５Ａ））を挿入したプラスミド（以下、「ｍｔＤＮＡ」という）とを調製した。そして、両者を所定の割合（ｍｔＤＮＡ：ｗｔＤＮＡ＝３：９７）に調製し、１０４ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ（１μＬ）を下記ＰＣＲ反応液４９μＬに添加してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応ならびに蛍光強度の検出は、前記実施例１と同様にして行った。
【００７１】
【表３】
【００７２】
センスプライマー 配列番号２１
５’−ｇｇａｃｇｇａｃｇｇａｃｃｇｔｃｃｔｃｇｔｔｇｔｃｔｔｇｔｔｇｇｃ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号２２
５’−ｇｇａｃｇｇａｃｇｇａｃｃｇｃａｃｔｃｃｃｔｃａｇｇｔａｇｔｃｃａｇ−３’
（実施例３−１）
検出用プローブＣ１ 配列番号６
５’−（Pacific Blue）−ｃｔｃａｇＣｇａｔｇａｔａｔａｇａａｃｇｇ−Ｐ−３’
（実施例３−２）
検出用プローブＣ２ 配列番号７
５’−（TAMRA）−ｃａｇＣｇａｔｇａｔａｔａｇａａｃｇｇｇ−Ｐ−３’
（比較例３−１）
検出用プローブ 配列番号３７
５’−（TAMRA）−ｃａｔｇａａｃｔｃａＧｃｇａｔｇａｔａｔａｇ−Ｐ−３’
（比較例３−２）
検出用プローブ 配列番号３８
５’−（TAMRA）−ｃｃｃｇｔｔｃｔａｔａｔｃａｔｃｇＣｔｇ−Ｐ−３’
【００７３】
これらの結果を図３に示す。図３は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図３において、（Ａ）は、実施例３−１、（Ｂ）は、実施例３−２、（Ｃ）は、比較例３−１、（Ｄ）は、比較例３−２の結果である。なお、同じ条件で、各プローブとｗｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成、および、各プローブとｍｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成を行った場合、それぞれのピークは以下の通りであり、これを評価基準とした。
【００７４】
ピーク温度（℃）
プローブ ｗｔＤＮＡ（１００％） ｍｔＤＮＡ（１００％）
実施例３−１ ５２．０ ６１．０
実施例３−２ ５０．０ ６０．０
比較例３−１ ５２．０ Ｎ．Ｄ
比較例３−２ ５５．０ Ｎ．Ｄ
【００７５】
同図（Ａ）および(Ｂ)に示すように、実施例３−１および実施例３−２のプローブを使用した結果、前記評価基準と同等のｗｔＤＮＡのピーク（℃）およびｍｔＤＮＡのピーク（℃）が検出された。これに対して、同図（Ｃ）および(Ｄ)に示すように、比較例３−１および比較例３−２のプローブを使用した場合、ｍｔＤＮＡのピークは確認できなかった。この結果から、本発明のプローブによれば、ｍｔＤＮＡとｗｔＤＮＡとが共存する場合でも、ｍｔＤＮＡの検出感度を向上できることがわかった。
【実施例４】
【００７６】
ａｂｌ遺伝子の９４４番目塩基の点突然変異（Ｃ→Ｔ）
本発明のプローブを使用して、ａｂｌ遺伝子における９４４番目塩基の点突然変異（Ｃ→Ｔ）についてのＴｍ解析を行った。
【００７７】
配列番号１に示す９４４番目の塩基Ｃに変異を有さない正常ａｂｌ遺伝子配列を挿入したプラスミド（以下、「ｗｔＤＮＡ」という）と、前記９４４番目の塩基ＣがＴに変異した変異ａｂｌ遺伝子（ａｂｌチロシンキナーゼＣ９４４Ｔ（アミノ酸情報Ｔ３１５Ｉ））を挿入したプラスミド（以下、「ｍｔＤＮＡ」という）とを調製した。そして、両者を所定の割合（ｍｔＤＮＡ：ｗｔＤＮＡ＝３：９７）に調製し、１０４ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ（１μＬ）を前記表３に示すＰＣＲ反応液４９μＬに添加してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応ならびに蛍光強度の検出は、前記実施例１と同様にして行った。
【００７８】
センスプライマー 配列番号２３
５’−ｇｇａｃｇｇａｃｇｇａｃｃｇｔｃｃｔｃｇｔｔｇｔｃｔｔｇｔｔｇｇｃ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号２４
５’−ｇｇａｃｇｇａｃｇｇａｃｃｇｃａｃｔｃｃｃｔｃａｇｇｔａｇｔｃｃａｇ−３’
（実施例４−１）
検出用プローブＤ１ 配列番号８
５’−（BODIPY FL）−ｃｔｃａＡｔｇａｔｇａｔａｔａｇａａｃｇ−Ｐ−３’
（実施例４−２）
検出用プローブＤ２ 配列番号９
５’−ａｃｔｃａＡｔｇａｔｇａｔａｔａｇａａｃ−（TAMRA）−３’
（比較例４−１）
検出用プローブ 配列番号３９
５’−（TAMRA）−ｃｃｃｇｔｔｃｔａｔａｔｃａｔｃａＴｔｇａｇ−Ｐ−３’
（比較例４−２）
検出用プローブ 配列番号４０
５’−（TAMRA）−ｃｃｇｔｔｃｔａｔａｔｃａｔｃａＴｔｇ−Ｐ−３’
【００７９】
これらの結果を図４に示す。図４は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図４において、（Ａ）は、実施例４−１、（Ｂ）は、実施例４−２、（Ｃ）は、比較例４−１、（Ｄ）は、比較例４−２の結果である。なお、同じ条件で、各プローブとｗｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成、および、各プローブとｍｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成を行った場合、それぞれのピークは以下の通りであり、これを評価基準とした。
【００８０】
ピーク温度（℃）
プローブ ｗｔＤＮＡ（１００％） ｍｔＤＮＡ（１００％）
実施例４−１ ４６．０ ５５．０
実施例４−２ ４６．０ ５５．０
比較例４−１ ５４．０ ５９．０
比較例４−２ ４９．０ ５４．０
【００８１】
同図（Ａ）および(Ｂ)に示すように、実施例４−１および実施例４−２のプローブを使用した結果、前記評価基準と同等のｗｔＤＮＡのピーク（℃）およびｍｔＤＮＡのピーク（℃）が検出された。これに対して、同図（Ｃ）および(Ｄ)に示すように、比較例４−１および比較例４−２のプローブを使用した場合、ｍｔＤＮＡのピークは確認できなかった。この結果から、本発明のプローブによれば、ｍｔＤＮＡとｗｔＤＮＡとが共存する場合でも、ｍｔＤＮＡの検出感度を向上できることがわかった。
【実施例５】
【００８２】
ａｂｌ遺伝子の９５１番目塩基の点突然変異（Ｃ→Ｇ）
本発明のプローブを使用して、ａｂｌ遺伝子における９５１番目塩基の点突然変異（Ｃ→Ｇ）についてのＴｍ解析を行った。
【００８３】
配列番号１に示す９５１番目の塩基Ｃに変異を有さない正常ａｂｌ遺伝子配列を挿入したプラスミド（以下、「ｗｔＤＮＡ」という）と、前記９５１番目の塩基ＣがＧに変異した変異ａｂｌ遺伝子（ａｂｌチロシンキナーゼＣ９５１Ｇ（アミノ酸情報Ｆ３１７Ｌ））を挿入したプラスミド（以下、「ｍｔＤＮＡ」という）とを調製した。そして、両者を所定の割合（ｍｔＤＮＡ：ｗｔＤＮＡ＝３：９７）に調製し、１０４ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ（１μＬ）を前記表３に示すＰＣＲ反応液４９μＬに添加してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応ならびに蛍光強度の検出は、前記実施例１と同様にして行った。
【００８４】
センスプライマー 配列番号２５
５’−ｇｇａｃｇｇａｃｇｇａｃｃｇｔｃｃｔｃｇｔｔｇｔｃｔｔｇｔｔｇｇｃ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号２６
５’−ｇｇａｃｇｇａｃｇｇａｃｃｇｃａｃｔｃｃｃｔｃａｇｇｔａｇｔｃｃａｇ−３’
（実施例５）
検出用プローブＥ１ 配列番号１０
５’−ｔｔｃｃｃｇｔａｇｇｔｃａｔＣａａｃ−（TAMRA）−３’
（比較例５−１）
検出用プローブ 配列番号４１
５’−ｔｔＧａｔｇａｃｃｔａｃｇｇｇａａｃｃ−（TAMRA）−３’
（比較例５−２）
検出用プローブ 配列番号４２
５’−ｔｔＧａｔｇａｃｃｔａｃｇｇｇａａｃ−（TAMRA）−３’
（比較例５−３）
検出用プローブ 配列番号４３
５’−（TAMRA）−ｃｃｃｇｔａｇｇｔｃａｔＣａａｃｔｃ−Ｐ−３’
【００８５】
これらの結果を図５に示す。図５は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図５において、（Ａ）は、実施例５、（Ｂ）は、比較例５−１、（Ｃ）は、比較例５−２、（Ｄ）は、比較例５−３の結果である。なお、同じ条件で、各プローブとｗｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成、および、各プローブとｍｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成を行った場合、それぞれのピークは以下の通りであり、これを評価基準とした。
【００８６】
ピーク温度（℃）
プローブ ｗｔＤＮＡ（１００％） ｍｔＤＮＡ（１００％）
実施例５ ４７．０ ６０．０
比較例５−１ ５８．０ ６２．０
比較例５−２ ５６．０ ６０．０
比較例５−３ Ｎ．Ｄ． Ｎ．Ｄ．
【００８７】
同図（Ａ）に示すように、実施例５のプローブを使用した結果、前記評価基準と同等のｗｔＤＮＡのピーク（℃）およびｍｔＤＮＡのピーク（℃）が検出された。これに対して、同図（Ｂ）および（Ｃ）に示すように、比較例５−１および比較例５−２のプローブを使用した場合、ｍｔＤＮＡのピークは確認できなかった。また、図（Ｄ）に示すように、比較例５−３のプローブを使用した場合、多数のピークが存在し、判別ができなかった。この結果から、本発明のプローブによれば、ｍｔＤＮＡとｗｔＤＮＡとが共存する場合でも、ｍｔＤＮＡの検出感度を向上できることがわかった。
【実施例６】
【００８８】
ａｂｌ遺伝子の１０５２番目塩基の点突然変異（Ｔ→Ｃ）
本発明のプローブを使用して、ａｂｌ遺伝子における１０５２番目塩基の点突然変異（Ｔ→Ｃ）についてのＴｍ解析を行った。
【００８９】
配列番号１に示す１０５２番目の塩基Ｔに変異を有さない正常ａｂｌ遺伝子配列を挿入したプラスミド（以下、「ｗｔＤＮＡ」という）と、前記１０５２番目の塩基ＴがＣに変異した変異ａｂｌ遺伝子（ａｂｌチロシンキナーゼＴ１０５２Ｃ（アミノ酸情報Ｍ３５１Ｔ））を挿入したプラスミド（以下、「ｍｔＤＮＡ」という）とを調製した。そして、両者を所定の割合（ｍｔＤＮＡ：ｗｔＤＮＡ＝３：９７）に調製し、１０４ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ（１μＬ）を前記表１に示すＰＣＲ反応液４９μＬに添加してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応ならびに蛍光強度の検出は、前記実施例１と同様にして行った。
【００９０】
センスプライマー 配列番号２７
５’−ｇｇｃｃｇｇｃｃｃｃｇｔｇｇｔｇｃｔｇｃｔｇｔａｃａｔｇ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号２８
５’−ｃａｃｇｃｃｃｔｇｔｇａｃｔｃｃａｔｇ−３’
（実施例６）
検出用プローブＦ１ 配列番号１１
５’−ｇｔｃａｇｃｃａＣｇｇａｇｔａｃｃ−（BODIPY FL）−３’
（比較例６−１）
検出用プローブ 配列番号４４
５’−ｃｃａｃｔｃａｇａｔｃｔｃｇｔｃａｇｃｃａＣｇｇａｇｔａｃｃ
−（TAMRA）−３’
（比較例６−２）
検出用プローブ 配列番号４５
５’−（TAMRA）−ｃｃａＴｇｇａｇｔａｃｃｔａｇＣｇａａｇ−Ｐ−３’
【００９１】
これらの結果を図６に示す。図６は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図６において、（Ａ）は、実施例６、（Ｂ）は、比較例６−１、（Ｃ）は、比較例６−２の結果である。なお、同じ条件で、各プローブとｗｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成、および、各プローブとｍｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成を行った場合、それぞれのピークは以下の通りであり、これを評価基準とした。
【００９２】
ピーク温度（℃）
プローブ ｗｔＤＮＡ（１００％） ｍｔＤＮＡ（１００％）
実施例６ ５３．０ ６４．０
比較例６−１ ６８．０ ７３．０
比較例６−２ Ｎ．Ｄ． Ｎ．Ｄ．
【００９３】
同図（Ａ）に示すように、実施例６のプローブを使用した結果、前記評価基準と同等のｗｔＤＮＡのピーク（℃）およびｍｔＤＮＡのピーク（℃）が検出された。これに対して、同図（Ｂ）および(Ｃ)に示すように、比較例６−１および比較例６−２のプローブを使用した場合、ｍｔＤＮＡのピークは確認できなかった。この結果から、本発明のプローブによれば、ｍｔＤＮＡとｗｔＤＮＡとが共存する場合でも、ｍｔＤＮＡの検出感度を向上できることがわかった。
【実施例７】
【００９４】
ａｂｌ遺伝子の１０６４番目塩基の点突然変異（Ａ→Ｇ）
本発明のプローブを使用して、ａｂｌ遺伝子における１０６４番目塩基の点突然変異（Ａ→Ｇ）についてのＴｍ解析を行った。
【００９５】
配列番号１に示す１０６４番目の塩基Ａに変異を有さない正常ａｂｌ遺伝子配列を挿入したプラスミド（以下、「ｗｔＤＮＡ」という）と、前記９４３番目の塩基ＡがＧに変異した変異ａｂｌ遺伝子（ａｂｌチロシンキナーゼＡ１０６４Ｇ（アミノ酸情報Ｅ３５５Ｇ））を挿入したプラスミド（以下、「ｍｔＤＮＡ」という）とを調製した。そして、両者を所定の割合（ｍｔＤＮＡ：ｗｔＤＮＡ＝３：９７）に調製し、１０４ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ（１μＬ）を下記ＰＣＲ反応液４９μＬに添加してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応ならびに蛍光強度の検出は、前記実施例１と同様にして行った。
【００９６】
【表４】
【００９７】
センスプライマー 配列番号２９
５’−ｇｇｃｃｇｇｃｃｃｃｇｔｇｇｔｇｃｔｇｃｔｇｔａｃａｔｇ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号３０
５’−ｃａｃｇｃｃｃｔｇｔｇａｃｔｃｃａｔｇ−３’
（実施例７−１）
検出用プローブＧ１ 配列番号１２
５’−ｇｔｔｔｔｔｃｔｔｃＣｃｃａｇｇｔａｃｔｃ−（TAMRA）−３’
（実施例７−２）
検出用プローブＧ２ 配列番号１３
５’−ｇｔｔｔｔｔｃｔｔｃＣｃｃａｇｇｔａｃｔｃｃ−（TAMRA）−３’
（比較例７）
検出用プローブ 配列番号４６
５’−（TAMRA）−ｃｔｔｃＣｃｃａｇｇｔａｃｔｃｃ−Ｐ−３’
【００９８】
これらの結果を図７に示す。図７は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図７において、（Ａ）は、実施例７−１、（Ｂ）は、実施例７−２、（Ｃ）は、比較例７の結果である。なお、同じ条件で、各プローブとｗｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成、および、各プローブとｍｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成を行った場合、それぞれのピークは以下の通りであり、これを評価基準とした。
【００９９】
ピーク温度（℃）
プローブ ｗｔＤＮＡ（１００％） ｍｔＤＮＡ（１００％）
実施例７−１ ５３．０ ６２．０
実施例７−２ ５５．０ ６３．０
【０１００】
同図（Ａ）および(Ｂ)に示すように、実施例７−１および実施例７−２のプローブを使用した結果、前記評価基準と同等のｗｔＤＮＡのピーク（℃）およびｍｔＤＮＡのピーク（℃）が検出された。これに対して、同図（Ｃ）に示すように、比較例７のプローブを使用した場合、ｍｔＤＮＡのピークは確認できなかった。この結果から、本発明のプローブによれば、ｍｔＤＮＡとｗｔＤＮＡとが共存する場合でも、ｍｔＤＮＡの検出感度を向上できることがわかった。
【実施例８】
【０１０１】
ａｂｌ遺伝子の１０７５番目塩基の点突然変異（Ｔ→Ｇ）
本発明のプローブを使用して、ａｂｌ遺伝子における１０７５番目塩基の点突然変異（Ｔ→Ｇ）についてのＴｍ解析を行った。
【０１０２】
配列番号１に示す１０７５番目の塩基Ｔに変異を有さない正常ａｂｌ遺伝子配列を挿入したプラスミド（以下、「ｗｔＤＮＡ」という）と、前記１０７５番目の塩基ＴがＧに変異した変異ａｂｌ遺伝子（ａｂｌチロシンキナーゼＴ１０７５Ｇ（アミノ酸情報Ｆ３５９Ｖ））を挿入したプラスミド（以下、「ｍｔＤＮＡ」という）とを調製した。そして、両者を所定の割合（ｍｔＤＮＡ：ｗｔＤＮＡ＝３：９７）に調製し、１０４ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ（１μＬ）を前記表４のＰＣＲ反応液４９μＬに添加してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応ならびに蛍光強度の検出は、前記実施例１と同様にして行った。
【０１０３】
センスプライマー 配列番号３１
５’−ｇｇｃｃｇｇｃｃｃｃｇｔｇｇｔｇｃｔｇｃｔｇｔａｃａｔｇ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号３２
５’−ｃａｃｇｃｃｃｔｇｔｇａｃｔｃｃａｔｇ−３’
（実施例８−１）
検出用プローブＨ１ 配列番号１４
５’−ｇａｔｇａＣｇｔｔｔｔｔｃｔｔｃｔｃｃ−（TAMRA）−３’
（実施例８−２）
検出用プローブＨ２ 配列番号１５
５’−ｔｇｔｇｇａｔｇａＣｇｔｔｔｔｔｃｔｔｃ−（TAMRA）−３’
（比較例８−１）
検出用プローブ 配列番号４７
５’−（TAMRA）−ｃｔｇｔｇｇａｔｇａＣｇｔｔｔｔｔｃ−Ｐ−３’
（比較例８−２）
検出用プローブ 配列番号４８
５’−（TAMRA）−ｃｃｔｇｔｇｇａｔｇａＣｇｔｔｔｔｔｃ−Ｐ−３’
【０１０４】
これらの結果を図８に示す。図８は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図８において、（Ａ）は、実施例８−１、（Ｂ）は、実施例８−２、（Ｃ）は、比較例８−１、（Ｄ）は、比較例８−２の結果である。なお、同じ条件で、各プローブとｗｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成、および、各プローブとｍｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成を行った場合、それぞれのピークは以下の通りであり、これを評価基準とした。
【０１０５】
ピーク温度（℃）
プローブ ｗｔＤＮＡ（１００％） ｍｔＤＮＡ（１００％）
実施例８−１ ４８．０ ５８．０
実施例８−２ ５０．０ ６０．０
比較例８−１ ４８．０ ５８．０
比較例８−２ ５０．０ ５９．０
【０１０６】
同図（Ａ）および(Ｂ)に示すように、実施例８−１および実施例８−２のプローブを使用した結果、前記評価基準と同等のｗｔＤＮＡのピーク（℃）およびｍｔＤＮＡのピーク（℃）が検出された。これに対して、同図（Ｃ）および(Ｄ)に示すように、比較例８−１および比較例８−２のプローブを使用した場合、多数のピークが現れ、ｍｔＤＮＡのピークを判別できなかった。この結果から、本発明のプローブによれば、ｍｔＤＮＡとｗｔＤＮＡとが共存する場合でも、ｍｔＤＮＡの検出感度を向上できることがわかった。
【実施例９】
【０１０７】
ａｂｌ遺伝子の１１８７番目塩基の点突然変異（Ａ→Ｇ）
本発明のプローブを使用して、ａｂｌ遺伝子における１１８７番目塩基の点突然変異（Ａ→Ｇ）についてのＴｍ解析を行った。
【０１０８】
配列番号１に示す１１８７番目の塩基Ａに変異を有さない正常ａｂｌ遺伝子配列を挿入したプラスミド（以下、「ｗｔＤＮＡ」という）と、前記１８７番目の塩基ＡがＧに変異した変異ａｂｌ遺伝子（ａｂｌチロシンキナーゼＡ１１８７Ｇ（アミノ酸情報Ｈ３９６Ｒ））を挿入したプラスミド（以下、「ｍｔＤＮＡ」という）とを調製した。そして、両者を所定の割合（ｍｔＤＮＡ：ｗｔＤＮＡ＝３：９７）に調製し、１０４ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ（１μＬ）を下記ＰＣＲ反応液４９μＬに添加してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応ならびに蛍光強度の検出は、前記実施例１と同様にして行った。
【０１０９】
【表５】
【０１１０】
センスプライマー 配列番号３３
５’−ａｃｃｔａｃｃｔａｃｃｔａｇａｔｃｔｔｇｃｔｇｃｃｃｇａａａｃｔｇ−３’
アンチセンスプライマー 配列番号３４
５’−ａｃｃｔａｃｃｔａｃｃｔｃｔｔｇｔｔｇｔａｇｇｃｃａｇｇｃｔｃｔｃ−３’
（実施例９）
検出用プローブＩ１ 配列番号１６
５’−ｃｃａｇｃａＣｇｇｇｃｔｇｔｇｔａｇｇｔｇｔｃｃ−（TAMRA）−３’
（比較例９−１）
検出用プローブ 配列番号４９
５’−ｇｃｔｃｃａｇｃａＣｇｇｇｃｔｇｔｇｔａｇｇｔｇｔｃｃ−（TAMRA）−３’
（比較例９−２）
検出用プローブ 配列番号５０
５’−（TAMRA）−ｃｃａｇｃａＣｇｇｇｃｔｇｔｇｔａｇ−Ｐ−３’
【０１１１】
これらの結果を図９に示す。図９は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図９において、（Ａ）は、実施例９、（Ｂ）は、比較例９−１、（Ｃ）は、比較例９−２の結果である。なお、同じ条件で、各プローブとｗｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成、および、各プローブとｍｔＤＮＡ（１００％）とのハイブリッド形成を行った場合、それぞれのピークは以下の通りであり、これを評価基準とした。
【０１１２】
ピーク温度（℃）
プローブ ｗｔＤＮＡ（１００％） ｍｔＤＮＡ（１００％）
実施例９ ６６．０ ７３．０
比較例９−１ ６９．０ ７５．０
比較例９−２ ５５．０ ６５．０
【０１１３】
同図（Ａ）に示すように、実施例９−１のプローブを使用した結果、前記評価基準と同等のｗｔＤＮＡのピーク（℃）およびｍｔＤＮＡのピーク（℃）が検出された。これに対して、同図（Ｂ）および（Ｃ）に示すように、比較例９−１および比較例９−２のプローブを使用した場合、多数のピークが現れ、ｍｔＤＮＡのピークを判別できなかった。この結果から、本発明のプローブによれば、ｍｔＤＮＡとｗｔＤＮＡとが共存する場合でも、ｍｔＤＮＡの検出感度を向上できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
以上のように、本発明のプローブによれば、検出目的の変異が発生しているａｂｌ遺伝子（変異遺伝子）と変異が発生していないａｂｌ遺伝子（正常遺伝子）とが共存している場合でも、前記検出対象である変異遺伝子を検出できる。例えば、前記Ｔｍ解析においては、従来のプローブであると、前述のようにプローブが一塩基のみ異なる変異遺伝子と正常遺伝子の双方にハイブリダイズするため、前記融解曲線において、両者のシグナルが重なり、変異遺伝子の存在を検出することが非常に困難であった。これに対して、本発明のプローブによれば、変異遺伝子と正常遺伝子の双方にハイブリダイズするものの、融解曲線において、両者のシグナルを分離できる。このため、本発明によれば、例えば、Ｔｍ解析によっても、変異遺伝子の検出が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】図１は、本発明の実施例におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の他の実施例におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明のさらにその他の実施例におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明のさらにその他の実施例におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明のさらにその他の実施例におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明のさらにその他の実施例におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明のさらにその他の実施例におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図８】図８は、本発明のさらにその他の実施例におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【図９】図９は、本発明のさらにその他の実施例におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａｂｌ遺伝子の変異を検出するためのプローブであって、下記（Ａ１）〜（Ｉ１）からなる群から選択された少なくとも一つのオリゴヌクレオチドからなるプローブ。
（Ａ１）配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ａ２）配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｂ１）配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｂ２）配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｃ１）配列番号６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｃ２）配列番号７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｄ１）配列番号８の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｄ２）配列番号９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｅ１）配列番号１０の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｆ１）配列番号１１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｇ１）配列番号１２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｇ２）配列番号１３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｈ１）配列番号１４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｈ２）配列番号１５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｉ１）配列番号１６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【請求項２】
前記（Ａ１）および（Ａ２）のオリゴヌクレオチドからなるプローブが、配列番号１の塩基配列における７３０番目の塩基Ａの変異（Ａ→Ｇ）を検出するためのプローブである、請求項１記載のプローブ。
【請求項３】
前記（Ｂ１）および（Ｂ２）のオリゴヌクレオチドからなるプローブが、配列番号１の塩基配列における７４９番目の塩基Ｇの変異（Ｇ→Ａ）を検出するためのプローブである、請求項１記載のプローブ。
【請求項４】
前記（Ｃ１）および（Ｃ２）のオリゴヌクレオチドからなるプローブが、配列番号１の塩基配列における９４３番目の塩基Ａの変異（Ａ→Ｇ）を検出するためのプローブである、請求項１記載のプローブ。
【請求項５】
前記（Ｄ１）および（Ｄ２）のオリゴヌクレオチドからなるプローブが、配列番号１の塩基配列における９４４番目の塩基Ｃの変異（Ｃ→Ｔ）を検出するためのプローブである、請求項１記載のプローブ。
【請求項６】
前記（Ｅ１）のオリゴヌクレオチドからなるプローブが、配列番号１の塩基配列における９５１番目の塩基Ｃの変異（Ｃ→Ｇ）を検出するためのプローブである、請求項１記載のプローブ。
【請求項７】
前記（Ｆ１）のオリゴヌクレオチドからなるプローブが、配列番号１の塩基配列における１０５２番目の塩基Ｔの変異（Ｔ→Ｃ）を検出するためのプローブである、請求項１記載のプローブ。
【請求項８】
前記（Ｇ１）および（Ｇ２）のオリゴヌクレオチドからなるプローブが、配列番号１の塩基配列における１０６４番目の塩基Ａの変異（Ａ→Ｇ）を検出するためのプローブである、請求項１記載のプローブ。
【請求項９】
前記（Ｈ１）および（Ｈ２）のオリゴヌクレオチドからなるプローブが、配列番号１の塩基配列における１０７５番目の塩基Ｔの変異（Ｔ→Ｇ）を検出するためのプローブである、請求項１記載のプローブ。
【請求項１０】
前記（Ｉ１）オリゴヌクレオチドからなるプローブが、配列番号１の塩基における１１８７番目の塩基Ａの変異（Ａ→Ｇ）を検出するためのプローブである、請求項１記載のプローブ。
【請求項１１】
前記プローブが標識化プローブである、請求項１から１０のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項１２】
前記標識化プローブが、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブである、請求項１１記載のプローブ。
【請求項１３】
前記標識化プローブが、蛍光色素で標識されたプローブであり、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少するプローブである、請求項１１記載のプローブ。
【請求項１４】
前記プローブにおいて、５’末端または３’末端の塩基がＣであり、前記末端塩基Ｃが標識化されている、請求項１３記載のプローブ。
【請求項１５】
前記プローブが、Ｔｍ解析用のプローブである、請求項１から１４のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項１６】
ａｂｌ遺伝子における変異の検出方法であって、下記工程（１）〜（５）を含むことを特徴とする変異の検出方法。
（１）ＤＮＡを含有する試料に、請求項１から１５のいずれか一項に記載のプローブを添加する工程
（２）前記ＤＮＡに前記プローブをハイブリダイズさせる工程
（３）前記ＤＮＡと前記プローブとのハイブリッド形成体について、温度変化に伴うシグナルの変動を測定する工程
（４）前記シグナルの変動を解析してＴｍ値を決定する工程
（５）前記Ｔｍ値から変異の有無を決定する工程
【請求項１７】
前記試料が、血液試料である、請求項１６記載の変異の検出方法。
【請求項１】
ａｂｌ遺伝子の変異を検出するためのプローブであって、下記（Ａ１）〜（Ｉ１）からなる群から選択された少なくとも一つのオリゴヌクレオチドからなるプローブ。
（Ａ１）配列番号２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ａ２）配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｂ１）配列番号４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｂ２）配列番号５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｃ１）配列番号６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｃ２）配列番号７の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｄ１）配列番号８の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｄ２）配列番号９の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｅ１）配列番号１０の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｆ１）配列番号１１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｇ１）配列番号１２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｇ２）配列番号１３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｈ１）配列番号１４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｈ２）配列番号１５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
（Ｉ１）配列番号１６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
【請求項２】
前記（Ａ１）および（Ａ２）のオリゴヌクレオチドからなるプローブが、配列番号１の塩基配列における７３０番目の塩基Ａの変異（Ａ→Ｇ）を検出するためのプローブである、請求項１記載のプローブ。
【請求項３】
前記（Ｂ１）および（Ｂ２）のオリゴヌクレオチドからなるプローブが、配列番号１の塩基配列における７４９番目の塩基Ｇの変異（Ｇ→Ａ）を検出するためのプローブである、請求項１記載のプローブ。
【請求項４】
前記（Ｃ１）および（Ｃ２）のオリゴヌクレオチドからなるプローブが、配列番号１の塩基配列における９４３番目の塩基Ａの変異（Ａ→Ｇ）を検出するためのプローブである、請求項１記載のプローブ。
【請求項５】
前記（Ｄ１）および（Ｄ２）のオリゴヌクレオチドからなるプローブが、配列番号１の塩基配列における９４４番目の塩基Ｃの変異（Ｃ→Ｔ）を検出するためのプローブである、請求項１記載のプローブ。
【請求項６】
前記（Ｅ１）のオリゴヌクレオチドからなるプローブが、配列番号１の塩基配列における９５１番目の塩基Ｃの変異（Ｃ→Ｇ）を検出するためのプローブである、請求項１記載のプローブ。
【請求項７】
前記（Ｆ１）のオリゴヌクレオチドからなるプローブが、配列番号１の塩基配列における１０５２番目の塩基Ｔの変異（Ｔ→Ｃ）を検出するためのプローブである、請求項１記載のプローブ。
【請求項８】
前記（Ｇ１）および（Ｇ２）のオリゴヌクレオチドからなるプローブが、配列番号１の塩基配列における１０６４番目の塩基Ａの変異（Ａ→Ｇ）を検出するためのプローブである、請求項１記載のプローブ。
【請求項９】
前記（Ｈ１）および（Ｈ２）のオリゴヌクレオチドからなるプローブが、配列番号１の塩基配列における１０７５番目の塩基Ｔの変異（Ｔ→Ｇ）を検出するためのプローブである、請求項１記載のプローブ。
【請求項１０】
前記（Ｉ１）オリゴヌクレオチドからなるプローブが、配列番号１の塩基における１１８７番目の塩基Ａの変異（Ａ→Ｇ）を検出するためのプローブである、請求項１記載のプローブ。
【請求項１１】
前記プローブが標識化プローブである、請求項１から１０のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項１２】
前記標識化プローブが、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブである、請求項１１記載のプローブ。
【請求項１３】
前記標識化プローブが、蛍光色素で標識されたプローブであり、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少するプローブである、請求項１１記載のプローブ。
【請求項１４】
前記プローブにおいて、５’末端または３’末端の塩基がＣであり、前記末端塩基Ｃが標識化されている、請求項１３記載のプローブ。
【請求項１５】
前記プローブが、Ｔｍ解析用のプローブである、請求項１から１４のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項１６】
ａｂｌ遺伝子における変異の検出方法であって、下記工程（１）〜（５）を含むことを特徴とする変異の検出方法。
（１）ＤＮＡを含有する試料に、請求項１から１５のいずれか一項に記載のプローブを添加する工程
（２）前記ＤＮＡに前記プローブをハイブリダイズさせる工程
（３）前記ＤＮＡと前記プローブとのハイブリッド形成体について、温度変化に伴うシグナルの変動を測定する工程
（４）前記シグナルの変動を解析してＴｍ値を決定する工程
（５）前記Ｔｍ値から変異の有無を決定する工程
【請求項１７】
前記試料が、血液試料である、請求項１６記載の変異の検出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００８−１９９９６５（Ｐ２００８−１９９９６５Ａ）
【公開日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−４００７７（Ｐ２００７−４００７７）
【出願日】平成１９年２月２０日（２００７．２．２０）
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月２０日（２００７．２．２０）
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
【Ｆターム（参考）】
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