hBS細胞に由来する新規な肝細胞様細胞及び肝芽細胞様細胞
本発明は、hBS細胞に由来する新しい肝細胞様細胞集団、及び、薬剤スクリーニング及び毒性テストのような医療における前記肝細胞様細胞の潜在的応用に関連する。さらに、本発明は、肝細胞様細胞と同じ応用として使われることができて、さらに、例えば初期肝形成または肝再生障害などの試験管内の肝形成研究に使用されることも可能な適切な特性を有する肝芽細胞様細胞に関連する。本発明に記載の肝細胞様細胞及び肝芽細胞様細胞は、遺伝子またはタンパク質発現レベルにおいて、薬物輸送体特性および/または薬物代謝特性のどちらかを表す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、hBS細胞に由来する新しい肝細胞様細胞集団、及び、薬剤スクリーニング及び毒性テストのような医療における前記肝細胞様細胞の潜在的応用に関係する。さらに、本発明は、肝細胞様細胞と同じ応用として使われることができて、さらに、例えば初期肝形成または肝再生障害などの試験管内の肝形成研究に使用されることも可能な適切な特性を有する肝芽細胞様細胞にも関連する。本発明に記載の肝細胞様細胞及び肝芽細胞様細胞は、遺伝子またはタンパク質発現レベルにおいて、薬物輸送体特性および/または薬物代謝特性のどちらかを表す。
【背景技術】
【0002】
多能性ヒト幹細胞には、様々なヒト細胞型への接近可能性に革命をもたらすことが期待される。多能性ヒト胚盤胞由来幹(hBS)細胞を培養し、その後の所望の目標細胞型へそれらを分化させる可能性は、生体内応用及び試験管応用範囲に、細胞の安定的で実質的に無制限の供給を提供する。
【0003】
肝不全及び末期肝疾患は、世界中で大量死亡の原因となるとともに医療制度上の主な負担でもある。肝臓移植は、最も成功した治療である。しかし、この手順の有効性は、制限されて、多くの合併症、例えば感染症または拒絶反応につながっていた。肝臓移植は、さらに利用可能なドナー臓器の不足が欠点であり、治療された患者は、頻繁に生涯にわたる免疫抑制に付託される。移植器官のニーズを低下させる細胞に基づく治療は、社会及びこれらの疾患を患っている個人の両方にも非常に重要である。
【0004】
さらに、肝臓は代謝のセンター及び人体の解毒器官であり、したがって、インビトロ・テスト用の機能的細胞型の高信頼性の供給源を確保するために大きな努力が行われた。残念ながら、肝臓の複雑さ及び機能は、今日において利用可能ないかなる細胞型によっても反映されていない。主たるヒト肝細胞の入手可能性は制限され、インビトロ使用に使われる場合に、細胞がさらに急速にその通常の表現型及び機能的な特性を失うことは公知である(すなわち24時間以内)。初代細胞のよく使用される変形例は、肝臓細胞株であり、それは順番に代謝酵素の非常に低いレベルを含み、生体内の天然の肝細胞とかなり異なる他の重要なタンパク質の配列を有する。肝臓代謝が種特異であり、他の種の肝臓毒性を予測するのに問題点をもたらすことが公知にも関わらず、更なる多くの試験が動物性物質を使用して実行された。
【0005】
製薬開発において、逆肝臓反応は、最も顕著な毒性易罹病性である。したがって、ヒト肝臓毒性易罹病性の早期予測は、臨床試験用に合成物を選ぶ時に、最重要である。この分野の能力を向上させる努力は、モデルの有効性問題及び開発について言及しなければならず、ヒトの逆肝損傷を誘発するために一致する複合の生物学的過程により大きな範囲を提供する。両方の分野において、hBS細胞に由来する分化した細胞の使用は、有望な機会を提供する。
【0006】
したがって、新薬または化学製品の開発には、ヒト肝細胞に擬態し、候補分子の効果を予測することが可能であるモデル・システムのための緊急のニーズが存在する。有効性及び生理的関連に関して、ヒト多能性幹細胞は、機能的なヒト肝細胞の理想的な再生可能な供給源として役立つことがあり得る。hBS細胞が適当な環境に配置されるときに、特定の肝臓特性が分化の2〜4週後に観察された。
【0007】
2003年のRambhatla等による前の研究による国際公開WO01/81549及び国際公開WO2005/097980は、いくつかの肝細胞様特性を有する細胞を確認した。これらの特性はすなわち、分化されたhBS細胞培養のCYP及びGST活性である。しかし、それまで、生成の細胞は、薬物輸送体発現及び特定のCYP及びGST発現パターンに関して、従来の循環系を潜在的に交換するために必要である代謝特性を示さなかった。本発明において、創薬及び再生医療ために、薬物輸送体と重要な代謝酵素の少なくとも72時間の安定発現を有する、hBS細胞由来の肝細胞様細胞集団が提示された。
【0008】
Cellartisの特許出願国際公開WO2006034873は、発生生物学の経路をたどるために定義済み方法における異なる要因の用途を可能にする方法に基づく。本発明において、それは主に、分化に影響を及ぼす細胞の分泌内因子である。加えて、培養基の変更の頻度は、異なる。現在の方法は、培養基の少ない頻繁な変更を可能にし、したがって、大きな労働力を要しない。さらに、本発明の細胞はより成熟し、創薬及び毒性テストに役立つ分析システムでの長期間の培養を可能にする。
【0009】
国際公開WO2005097980と米国特許出願公開US20030003573のどちらも、薬物輸送体または機能的な輸送体の存在について教示していない。国際公開WO2005097980は、CYP3A4、CYP2C9及びCYP1A2が薬剤スクリーニングのための望ましい酵素であることを述べるだけである(表3を参照)。しかし、出願はこれらの最も重要なCYPs活性について、何も教示しない。特に、CYP3A4は創薬及び毒性テストに用いられる唯一重要な酵素である。大多数の全ての薬は、CYP3A4によって新陳代謝する。肝細胞が、ヒト成人肝細胞を反映する個人間の構成で、機能的なCYP3A4、CYP2C9及びCYP1A2酵素を示すhBS細胞に由来することは望ましい。
【0010】
hBS細胞に由来される肝細胞が以下の結合を有する場合、創薬及び毒性テストにそれはさらに望ましい:(i)機能的なCYP3A4、CYP2C9及びCYP1A2酵素、(ii)機能的なGST酵素及び(ii)機能的な薬物輸送体。最も重要なCYPs及び薬物輸送体に関して、国際公開WO200509780に記載されている細胞の詳細がなく、さらに、限られたGSTs特性解析データしか示されていない。対照的に、本発明は第2相酵素の完全な説明を有する。
【発明の概要】
【0011】
本発明は肝細胞様細胞及び肝芽細胞様細胞及び各自の調製方法に関する。本発明の肝細胞様細胞は、薬物輸送体および/または代謝酵素を表すので、特に創薬及び毒性テストに、かなり適している。
【0012】
ヒト胚盤胞由来幹細胞(hBS細胞)は、多能性であり、内胚葉、外胚葉及び中胚葉の全ての3つの胎児胚葉細胞及び、全身及び細菌細胞を引き起こすことができる。それで、将来において、肝臓細胞の機能的な特性を有するhBS細胞に由来される分化した細胞は、肝不全患者の体外肝庇護のための移植又は生物反応器内で使われる可能性を有するだけではなく、さらに、薬目標、生体異物の肝臓代謝、及び肝毒性を検討する試験システムになり得る。hBS細胞に由来された肝細胞は、同じ遺伝子の提供者から必要に応じて、機能的なヒト肝細胞の無制限の供給源を潜在的に提供することができ、それで、毒性試験のような試験管内テストの予測可能性を改良し、動物実験の必要性を低下させる。しかし、生体異物の毒性は、その毒性及び反応性の代謝物質への生体内変化によく依存し、したがって、生体内変化システムの存在及び配列が必要である。現在、主たるヒト肝細胞は、試験管内の薬物代謝及び毒性テストのモデルを構成する。それにもかかわらず、初代肝細胞が培養される場合に、薬物代謝酵素の活性及び多くのトランスポータ機能は、急速に消失および/または変化する。さらに、試験管内研究に使われる肝細胞癌細胞株(例えばHepG2)の多くは、幾つの重要な薬物代謝酵素の発現を欠く。
【0013】
シトクロムP450s(CYPs)は、混合機能モノオキシゲナーゼ及び主な第一位相異物代謝酵素である。この酸性代謝は、生体異物の自然体に依存し、不活化及び除去促進、プロドラッグまたは代謝活性化をもたらす。CYP発現の主な部位は肝臓であり、CYP3A4はヒト成人肝臓で最も多量であるCYPイソ酵素である。薬物代謝のための最も重要な酵素は、系統1−3に帰属し、臨床的に使用された薬の代謝に依存している全ての位相Iの70−80%を示す。CYP発現及び活性は、多形性のために大きい個人間の変化を提示する。さらに、CYPsが数倍、誘発されたり、または、特定の薬によって阻害され、追加的な、一時的な、代謝活性の変動性をもたらす。特に、肝細胞の3つの主要CYP−系統(1−3)ベースCYP−活性の組成物は、薬物代謝のために非常に重要である。本願明の実施例には、hBS細胞由来肝細胞様細胞が記載され、CYP1A2及びCYP3A4/7を含む大部分のCYP酵素からのmRNAが検出された。主要CYP−系統ベースCYP−活性、より正確はCYP1A2、CYP2C9及びCYP3A4が検出され、さらに、前記3つのCYPs活性間の配合は、ヒトの初代肝細胞に類似する。したがって、本発明は、機能的な薬物代謝酵素を表示する肝細胞様細胞の生成方法を提供する。
【0014】
肝細胞の機能的な薬物輸送体(例えばBSEP、MRP2及びOATPs)は、肝臓の薬物代謝及び毒性を分析する時に重要である。したがって、本発明は、機能的なトランスポータを表示する肝細胞様細胞の生成方法を提供する。
【0015】
上に述べたように、本願発明はhBS細胞に由来される細胞集団に関連し、細胞集団細胞の少なくとも20%は、アルファ−1−抗トリプシン、サイトケラチン18、HNF−3ベータ、アルブミンまたはL型脂肪酸結合蛋白の特性のうちの少なくとも1つを示し、細胞集団は、以下の6つの特性のうちの少なくとも3つを有する。
A.薬物輸送体
i)細胞の少なくとも1%が、BSEPのタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
ii)細胞の少なくとも1%が、MRP2のタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
iii)細胞の少なくとも1%が、OATP2および/またはOATP−8のタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
B.薬物代謝酵素
iv)細胞の少なくとも20%が、GST A1−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
v)細胞の少なくとも20%が、CYP450s−1A2、−2A6、−2B6、−2C8、−2C9、−2C19、−2D6、−2E1、−3A4及び−3A7のうちの少なくとも2つのタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
vi)細胞の少なくとも20%が、GST P1−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示していない。
【0016】
さらに、本願発明はhBS細胞に由来される細胞集団に関連し、その中の少なくとも細胞集団の細胞の約10%が、HNF3ベータ及びAFPの少なくとも一つを表示し、増殖能を有し、細胞集団は、以下の4つの特性のうちの少なくとも2つを有する。
A.受容体
i)細胞の少なくとも1%が、アルファ−6−インテグリンのタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
ii)細胞の少なくとも1%が、c−Metのタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
B.細胞間接着分子
iii)細胞の少なくとも1%が、ICAM−1のタンパク質および/または発現を示し、
C.転写因子
iv)細胞の少なくとも10%が、HNF−4アルファのタンパク質および/または発現を示し、
D.サイトケラチン
v)細胞の少なくとも1%が、CK19のタンパク質および/または発現を示し、
vi)細胞の少なくとも1%が、CK7のタンパク質および/または発現を示し、
E.上皮細胞接着分子
vii)細胞の少なくとも1%が、EpCAMのタンパク質および/または発現を示す。
【0017】
尿素は、タンパク質及びアミノ酸代謝の最終的な分解産物である。肝臓の肝細胞は、尿素へアンモニアを変える体内唯一の細胞型である。したがって、本発明は尿素を合成する肝細胞様細胞の調製方法を提供する。
【0018】
本発明の一実施例において、hBSCから由来した肝細胞様細胞は、初代肝細胞と同様のレベルに培養基へ尿素を生産及び分泌する。肝細胞様細胞は、初代肝細胞と比較して少なくとも10%、20%、50%、70%、80%、90%または少なくとも100%の尿素を合成する能力を有する。肝細胞様細胞は、10日から20日間尿素のために分析され、尿素合成の高水準を維持する。詳細は、本願明細書の実施例10を参照。
【0019】
異なるフィーダフリ表面への肝細胞様細胞の隔離及び再接種は、異なる類型の精製された肝細胞様細胞集団を可能にし、それは、肝細胞に基づく薬毒性及び代謝テスト、及び他の試験分析の範囲で異なる応用によって要求される柔軟性のために必要である。したがって、本発明は、96−ウェルプレートのようなあらゆる種類の精製及び濃縮される肝細胞様細胞のフィーダフリ培養、好ましくは、コラーゲンI培養を生成する方法を提供する。
【0020】
本発明の一実施例において、肝細胞様細胞は、ウェルの異なる表層、例えば96−ウェルプレート上にうまく再接種される。異なる表層は、コラーゲンI、マトリゲルまたはmEF細胞層であってもよい。初代肝細胞を再接種することは、非常にむずかしい。それで、肝細胞様細胞が再接種される能力を有することは、初代肝細胞と比較して本質的利点を有する。詳しくは、実施例15を参照。
【0021】
増殖可能な状況で培養される時に拡大する能力及び、分化適切な状況に保たれるときに、機能的な肝細胞へ分化する能力を備える肝芽を原種状態に保つ能力は、機能的な肝細胞の非無制限の供給源をキープするのに価値がある。したがって、本発明は、mEF−細胞層に肝芽細胞様細胞を再接種することによって肝芽細胞様細胞を原種状態にキープするための方法を提供する。加えて、肝芽細胞様細胞は、マトリゲルまたはコラーゲンがコーティングされた表面に再接種されるときに肝細胞様細胞に分化している。
【発明の説明】
【0022】
定義及び省略形
ここで使用しているフィーダ細胞は、単独でまたは組合せで使用する支持細胞型を意味することを目的とする。細胞型は、ヒト又は他の種に起源のものでも良い。フィーダ細胞が由来する組織は、胚、胎児、新生児、少年又は成人組織を含み、それは、更に包皮、臍の緒、筋肉、肺、上皮、胎盤、卵管、腺、ストロマまたは胸部の皮膚に由来される組織を含む。フィーダ細胞は、ヒト線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、ケラチン生成細胞、内皮細胞及び上皮細胞からなる群に関連する細胞型に由来してもよい。フィーダ細胞を誘導するのに使われてもよい特定の細胞型の実施例は、胚線維芽細胞、胚体外内胚葉細胞、胚体外中胚葉細胞、胎児線維芽細胞および/または線維細胞、胎児の筋細胞、胎児の皮膚細胞、胎児の肺細胞、胎児の内皮細胞、胎児の上皮の細胞、臍の緒間充織細胞、胎盤の線維芽細胞および/または線維細胞、胎盤の内皮細胞、出産後の包皮線維芽細胞および/または線維細胞、出産後の筋細胞、出産後の皮膚細胞、出産後の内皮細胞、成人皮膚線維芽細胞および/または線維細胞、成人筋細胞、成人卵管内皮細胞、成人腺子宮内膜細胞、成人間質子宮内膜細胞、成人乳ガン実質細胞、成人内皮細胞、成人上皮の細胞または成人ケラチン生成細胞を含む。フィーダ細胞がhBS細胞に由来されるときに、細胞は線維芽細胞であってもよい。
【0023】
ここで使用しているように、用語「3D」は、三次元を意味することを目的とする。
【0024】
ここで使用しているように、用語「胚盤胞由来幹細胞」は、BS細胞を意味し、ヒトの型は「hBS細胞」と呼ばれる。
【0025】
ここで使用しているように、用語「AAT」は、肝臓マーカーのアルファ−アンチ−トリプシンを意味することを目的とする。
【0026】
ここで使用しているように、用語「AFP」は、肝臓マーカーのアルファ−フェト−タンパク質を意味することを目的とする。
【0027】
ここで使用しているように、用語「BSEP」は、胆汁酸塩輸出ポンプを意味することを目的とする。
【0028】
ここで使用しているように、用語「CK」は、異なる亜類型(例えばサイトケラチン18、サイトケラチン19及びサイトケラチン7)を有する肝臓マーカー・サイトケラチン(交互に用いられる)を意味することを目的とする。
【0029】
ここで使用しているように、用語「c−Met」は、肝細胞成長因子および/または散乱因子受容体を意味することを目的とする。
【0030】
ここで使用しているように、用語「ICAM−1」は、細胞内粘着力分子1を意味することを目的とする。
【0031】
ここで使用しているように、用語「LFABP」は、肝臓脂肪酸結合蛋白(交互に用いられる)を意味する。
【0032】
ここで使用しているように、用語「EpCAM」は、上皮細胞接着分子(交互に用いられる)を意味する。
【0033】
ここで使用しているように、用語「FGF」は、線維芽細胞成長因子を意味し、好ましくはヒトおよび/または組み換え型オリジンであり、それに対して帰属している亜類型は、例えばbFGF(時々FGF2と称する)及びFGF4である。
【0034】
ここで使用しているように、用語「DMSO」は、ジメチルスルホキシドを意味する。
【0035】
ここで使用しているように、「CYP」はシトクロムP、より詳しくはシトクロムP 450、多数の異なるサブユニット肝臓構成(例えば1A1、1A2、3A4その他)の主要位相1の代謝酵素を意味する。
【0036】
ここで使用しているように、用語「GST」は、グルタチオン転移酵素を意味することを目的とし、それの亜類型の実施例は、GST A1−1、GST M1−1及びGST P1−1である。
【0037】
ここで使用しているように、交互に用いられる「HNF3ベータ」および/または「HNF3b」は、肝細胞核要因3、例えば肝臓、膵島及び脂肪細胞のような組織に由来の転写因子調整遺伝子発現を意味することを目的とする。HNF3ベータは、時々さらにFoxa2と称してもよく、フォークヘッドボックス転写因子系統のメンバーである転写因子から由来している名前である。
【0038】
ここで使用しているように、用語「OATP」は、有機アニオン・トランスポーター遺伝子を意味することを目的とし、それは、肝臓内のスルホブロモフタレイン(BSP)及び抱合型胆汁酸(タウロコール酸)及び非抱合型胆汁酸(コール酸塩)のような有機アニオンのナトリウム(Na+)−独立トランスポートの媒介となる。
【0039】
ここで使用しているように、用語「UGT」は、ウリジン二リン酸グルクロノシル転移酵素を意味することを目的とし、それは、グルクロン酸化活性を触媒している一群の肝臓酵素である。
【0040】
ここで使用しているように、用語「異種動物由来成分不含」は、人間以外の動物成分への直接又は間接的な暴露の完全な回避を意図する。
【0041】
上記において言及されたように、本願発明は改良型のhBS細胞由来肝芽細胞様細胞および肝細胞様細胞を提供する。改良型の肝細胞様細胞は、同じ薬物輸送体及び代謝酵素を使用して生体内肝細胞と類似した薬取り込み、分泌及び代謝を確実にする薬物輸送体および/または代謝酵素を表示する。それで、それらの薬物および化学薬品への反応が生体内の肝細胞に似ていることが期待されることにつれ、これらの全ての特徴の発現は創薬及び毒性テストに使用される細胞のための望ましい特徴である。
【0042】
したがって、本願発明の開示する肝芽細胞様細胞または肝細胞様細胞は、創薬プロセス、薬物輸送体を研究するためのインビトロ・モデル、薬物代謝酵素を研究するためのインビトロ・モデル、肝形成を研究するためのインビトロ・モデル、初期の肝形成、ヒト肝再生障害を調査するためのインビトロ・モデル、インビトロ・肝毒性テストのような多数の研究目的に有利に使われる。
【0043】
さらに、本発明の肝芽細胞様細胞及び肝細胞様細胞は有利に、いくつかの肝臓疾患及び障害の治療および/または予防のために使われることができる。したがって、本発明の肝芽細胞様細胞及び肝細胞様細胞が、薬剤に使われることができる。
【0044】
肝芽細胞様細胞は、肝細胞様細胞の原種細胞であり、したがって、それらは、例えば、代謝的に有能な肝細胞様細胞を得るために、または、肝細胞様細胞への成熟を研究するために最適に使われる。
【0045】
肝細胞様細胞
現在のコンテキストにおいて、用語「肝細胞様細胞」は、アルファ−1−アンチトリプシン、サイトケラチン18、HNF−3ベータ、アルブミンまたは肝臓脂肪酸結合蛋白質の特性のうちの少なくとも1つを示している細胞を意味することを目的とする。本発明の肝細胞様細胞は、さらに、薬品トランスポート及び薬物代謝に関する重要及び安定した特性を有する。
【0046】
したがって、一実施例において、本発明はhBS細胞に由来される細胞集団に関連し、その細胞集団の細胞の少なくとも20%が、アルファ−1−抗トリプシン(AAT)、サイトケラチン18(CK18)、HNF−3ベータ、アルブミンまたは肝臓脂肪酸結合蛋白(LFABP)の特性のうちの少なくとも1つを示し、さらに細胞集団は、以下の6つの特性のうちの少なくとも3つを有する。
A.薬物輸送体
i) 細胞の少なくとも1%が、BSEPのタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
ii) 細胞の少なくとも1%が、MRP2のタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
iii) 細胞の少なくとも1%が、タンパク質および/または遺伝子発現OATP2および/またはOATP−8を示し、
B. 薬物代謝酵素
iv) 細胞の少なくとも20%が、GST A1−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
v) 細胞の少なくとも20%が、CYP450s−1A2、−2A6、−2B6、−2C8、−2C9、−2C19 −2D6、−2E1、−3A4及び−3A7のうちの少なくとも2つのタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
vi) 細胞の少なくとも20%が、GST P1−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示していない。
【0047】
付加物または必要条件の代替品として、vi)細胞の少なくとも約5%が、GST M1−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
【0048】
本発明の一実施例において、肝細胞様細胞は、フェーズIシトクロムp450酵素によって薬品を新陳代謝させることができる。特に、cyp1A2、cyp2C9及びcyp3A4は、誘発因子がない場合も新陳代謝することができる。実施例において、肝細胞様細胞によって新陳代謝する物質は、フェナセチン、ジクロフェナク及びミダゾラムであり、代謝物質はLC−MSによって分析された。肝細胞様細胞が誘発因子の影響なしで薬品を新陳代謝させることができる点は、重要である(例えば、国際公開WO2005097980に記載される通り)。
【0049】
他の実施例で、肝細胞様細胞は、ヒト初代肝細胞培養のcyp活性配合と同様のcyp−活性の配合を有する。具体的には、肝細胞様細胞のCyp1A2、Cyp3A4及びCyp2C9の配合はヒト初代肝細胞培養物の配合に匹敵する。Cyp1A2、Cyp3A4及びCyp2C9間のCyp−活性配合は、ヒト初代肝細胞培養組織の配合と比較して、30%、50%、75%及び100%と異なることができる。
【0050】
本発明の一実施例において、肝細胞様細胞は、機能的な薬物輸送体を表示する。特に、OATP−2は、ICG染料の着色により能動的に測定され、それは、細胞の範囲内の機能的な薬物輸送体の存在の指示である(図48)。
【0051】
本発明の更なる実施例において、細胞集団はhBS細胞に由来し、細胞集団の細胞の少なくとも20%は、アルファ 1−アンチトリプシン、サイトケラチン18、HNF−3ベータ、アルブミンまたは肝臓脂肪酸結合蛋白の特性のうちの少なくとも1つを示し、細胞集団は、以下の2つの特性を有する。
A.薬物輸送体
iii)細胞の少なくとも1%が、機能的に活性を有するOATP−2および/またはOATP−8を示し、
B.薬物代謝酵素
iv)細胞の少なくとも20%が、GSTA1−1の機能的な活性を示し、
v)細胞の少なくとも20%が、薬物代謝物質を分析することで測定される機能的に活性を有するCyp1A2、Cyp3A4および/またはCyp2C9を示す。
【0052】
本発明の更なる実施例において、細胞集団はhBS細胞に由来し、細胞集団の細胞の少なくとも75%は、アルファ 1−アンチトリプシン、サイトケラチン18、HNF−3ベータ、アルブミンまたは肝臓脂肪酸結合蛋白の特性を示し、細胞集団は、少なくとも2つの以下の特性を有する。
A.薬物輸送体
iii)細胞の少なくとも10%が、機能的に活性を有するOATP−2および/またはOATP−8を示し、
B.薬物代謝酵素
iv)細胞の少なくとも30%が、GSTA1−1の機能的な活性を示し、
v)細胞の少なくとも50%が、薬品代謝物質を分析することで測定される機能的に活性を有するCyp1A2、Cyp3A4および/またはCyp2C9を示す。
【0053】
グリコーゲン記憶は、肝細胞様細胞の顕著なもう一つの特徴である。
【0054】
さらに、肝細胞様及び肝芽細胞様細胞の割合は、Notch−2陽性である。Notchシグナル伝達経路は、成人の胚発育及びホメオスタシスの保全に広く使われている。それは、幹細胞信号ネットワークを構成するさらにキー経路の1本である。哺乳類において、4つのNotch受容体(Notch1−Notch4)及び5つの構造的類似のNotchリガンド(Delta−like1 [さらに、Delta1と呼ばれる]、Delta−like3、Delta−like4、Jagged1及びJagged2)がこれまで確認された。Notchリガンドは、1回膜貫通タンパクである。隣接の細胞に表示されるリガンドと結合することによって、Notch受容体は起動し、それは、タンパク質分解解放及び、順番に分化を調整するNotchの細胞内領域の核移動を導く。胚発育の間、Notch−2は広く表示され、Notch−2は、多器官に重要な役割を有する。肝臓において、Notch−2は、肝内胆管の形成及び分化に関与している(アーダー等、2005、コダマ等、2006)。肝臓様細胞が幹細胞によって生成されるので、それらの細胞型のノッチ・シグナリングの役割を理解することは、重要である。
【0055】
肝細胞様細胞は、肝細胞のために典型的な形態学を表示し、すなわち、それらは多角形の細胞形状を有し、大きい細胞直径(およそ25−50μM)、よく二重核を有し、脂質微粒を蓄積する傾向を示す。
【0056】
AAT、CK18、HNF−3ベータ、アルブミン及びLFABPは全て肝臓の特定のマーカーであり、それらの発現は、肝細胞様細胞を表す。しかし、これらの肝臓特定マーカーの全てが、本発明の細胞集団の全ての細胞に、必ずしも表示されるというわけではない。これらのマーカーのうちの一つ、二つ、三つ、四つだけを表示する均等な細胞は肝細胞と同様に機能することができ、それによって、それらが使われるべきであることによって決まる上述の目的に役立つ。細胞のlysationによって代謝を研究するために、少なくとも、CYPs及びGSTsが、要求される。摂取を研究するために、OATPsは重要であり、さらに、分泌物のために、例えばBSEPまたはMRP−2の研究が要求される。実施する研究がインビボの研究に近付くにつれて、前記の特徴のうちより多くのものが必要となる。もっとよいものは、細胞−細胞相互作用によって肝臓環境を提供するマクロファージ及びクッパー細胞のような他の肝臓細胞型の肝細胞様細胞を潜在的に有する。この種の培養系は、サンドイッチの形状であり、これに一つ以上細胞型が組み込まれ、この3D構造及びさらなる体内模倣状況は肝細胞様細胞が潜在的にさらに正反対を示させることができる。すなわち、血液の方へ1つの親水側、胆汁の方へ1つの疎水側が示される。毒性研究のために、それらの相互作用により、フェーズI及びIIの代謝酵素が両方とも好ましい。加えて、細胞集団が周知の薬品誘発因子に反応できることが望ましく、それによって、例えばフェーズIおよび/またはフェーズIIの代謝酵素が誘導できる。
【0057】
本発明の実施例において、上述の特性i)−vi)のうちの少なくとも3つを有する細胞集団の少なくとも約30%の細胞、例えば、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%または少なくとも約95%が、アルファ 1−アンチトリプシン、CK18、HNF−3ベータ、アルブミンまたはLFABPの特性の中の少なくとも2つ、例えば少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つまたは全てを示す。特定の実施形態において、特性の少なくとも一つは薬物輸送体のグループ(すなわち特性i−iii)に関連するものであり、特性のうちの少なくとも1は薬物代謝酵素(すなわち特性iv)−vi))のグループに関連するものである。したがって、一つ以上の肝臓特定マーカーに加えて、細胞集団は、更に少なくとも一つの前記薬物輸送体特性及び少なくとも一つの前記薬物代謝特性を有してもよい。より具体的には、本発明の細胞集団は、特性i)−vi)のうちの少なくとも4つ、例えば少なくとも5つまたは全6つの特性を有する。
【0058】
特性i)は、肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の割合に関係し、本発明による細胞集団の薬物輸送体BSEPのタンパク質および/または遺伝子発現を示す。BSEPは、胆汁酸塩輸出ポンプ(bile salt export pump)を表し、ATP加水分解のエネルギーを使用して、細胞外及び細胞内膜にわたる分子のトランスポートを触媒するATP−結合カセット(ABC)トランスポータであり、したがって、胆汁に薬品を外へ輸出することができる(通常は生体内に位置され、肝細胞のアピカル側と称する)。本発明の実施例において、肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の少なくとも5%、例えば、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%または少なくとも50%が、BSEPのタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
【0059】
特性ii)は、本発明による細胞集団の薬物輸送体MRP2のタンパク質および/または遺伝子発現を示す肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の割合に関する。MRP2は、複数薬品抵抗タンパク質2を表し、さらにABCトランスポータ系統のメンバーであり、胆汁に薬品代謝物質を輸出する。本発明の実施例において、肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の少なくとも5%、例えば少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%または少なくとも80%が、MRP2のタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
【0060】
特性iii)は、本発明による細胞集団の薬物輸送体OATP2および/またはOATP8のタンパク質および/または遺伝子発現を示す肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の割合に関する。OATP−2及びOATP−8は、有機アニオン・トランスポータ2及び8を表し、両方ともOATP系統のメンバーであり、血液から有毒な内在性代謝物質及び生体異物物質を巻き取ることが公知である。OATPsは、体内の血液の方の肝細胞の基底外側に位置している。本発明の一実施例において、肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の少なくとも5%、例えば少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%または少なくとも80%が、OATP2および/またはOATP−8のタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
【0061】
特性iv)は、本発明による細胞集団における薬品代謝酵素GST A1−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示す肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の割合に関連する。グルタチオン転移酵素(GSTs)は、グルタチオンを有する生体異物の活用を触媒し、第2相解毒システムの不可欠な部分である。さらに、指定された7つのクラスへ割れられる17種の異なるヒト細胞質GSTサブユニットがあり、例えばA、M、P及びSである。GST A1−1は、生体内成人ヒト肝臓における最も多量のサブユニットである。GST P1−1が胎児の肝臓でより高い程度で表示される一方、GST M1−1は同様に成人ヒト肝臓において表示される。本発明の一実施例において、肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の少なくとも30%、例えば少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%または少なくとも80%は、GST A1−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
【0062】
特性v)は、発明の細胞集団のCYP450s−1A2、−2A6、−2B6、−2C8、−2C9、−2C19、−2D6、−2E1、−3A4及び−3A7からなるグループから選択される薬品代謝酵素のうちの少なくとも2つのタンパク質および/または遺伝子発現を示す肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の割合に関連する。CYPは、シトクロムP450を表し、肝臓の小胞体細網構造に位置する一群の酵素である。それらの役割は、内在性合成物及び生体異物の代謝及び解毒である。これらの酵素の高い濃度は肝臓及び小腸で見つかるが、多数のCYPsは同様に他の組織でも見つかる。CYPsは、抑制及び誘導を含む多くの機構によって変えられることができて、人から人へ変化することができる。CYPシステムは、薬物代謝、薬品相互作用及び薬剤誘発性肝毒性を理解するのに重要である。
【0063】
本発明の一実施例において、肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の少なくとも30%、例えば、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%または少なくとも80%が、CYP450s−1A2、−2A6、−2B6、−2C8、−2C9、−2C19、 2D6、−2E1、−3A4及び−3A7のうちの少なくとも2つのタンパク質および/または遺伝子発現を示す。さらに、一般的CYP450酵素活性が、そのような細胞集団に示されることができ、細胞集団は、これらのCYP450タンパク質のうちの少なくとも1つ、例えば、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つまたは全10の酵素活性を更に示してもよい。
【0064】
特性vi)は、本発明による細胞集団の第2相酵素GST P1−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示す肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の割合に関連する。本発明の一実施例において、肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の少なくとも10%、例えば、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%または少なくとも80%は、GST P1−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示していない。
【0065】
さらに、細胞集団はGST酵素活性を示すことを示してもよく、それは、細胞集団の溶解物のタンパク質の少なくとも0.01μmol/min/mg、例えば少なくとも0.03μmol/min/mg、少なくとも0.05μmol/min/mg、少なくとも1.0μmol/min/mg、少なくとも0.07μmol/min/mg、少なくとも0.09μmol/min/mg、少なくとも0.11μmol/min/mg、少なくとも0.13μmol/min/mgまたは少なくとも0.15μmol/min/mgであってもよい。
【0066】
本発明の特定の実施例において、細胞組成は、CK 18共発現細胞を含み、例えばCYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2D6、CYP2E1;CYP2C8、CYP2C9及びCYP2C19の組合せ、またはCYP3A4及びCYP3A7の組合せのような一つ以上のCYP薬物代謝酵素を含む。
【0067】
上述の特性に加えて、本発明の細胞集団の細胞の少なくとも約5%は、以下の追加的な特性のうちの少なくとも1つを有する。
A.受容体
vii)細胞の少なくとも約5%が、c−Metのタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
B. 細胞間接着分子
viii)細胞の少なくとも約5%が、ICAM−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
C.薬物代謝酵素
ix)細胞の少なくとも1%が、UGTのタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
D.転写因子
x)細胞の少なくとも90%が、非Oct−4のタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
【0068】
好ましくは、細胞集団は特性vii)、viii)、ix)またはx)のうちの少なくとも2つ、例えば少なくとも3つまたは全4つを有する。
【0069】
特性vii)は、発明の細胞集団における受容体c−Metのタンパク質レベルおよび/または遺伝子発現に関する。c−Metは、肝細胞成長因子および/または散乱因子受容体であり、それによって、肝細胞様細胞が、生体内ヒト肝細胞と同じ細胞内調節及びメカニズム(メチル化)を反応及び有するのを期待される。本発明の一実施例において、肝細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも10%、例えば少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%が、c−Metのタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
【0070】
特性viii)は、本発明による細胞集団の細胞間接着分子ICAM−1のタンパク質のレベルおよび/または遺伝子発現に関する。ICAM−1は、肝臓内の細胞−細胞相互作用に重要な細胞内部−粘着力分子である。本発明の一実施例において、肝細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも10%、例えば、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%は、ICAM−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
【0071】
特性ix)は、本発明による細胞集団の薬品代謝酵素UGTのタンパク質のレベルおよび/または遺伝子発現に関する。ウリジン・ジホスホグルクロノシルトランスフェラーゼは、GSTs第2相代謝酵素と同様にfat−soluble化学製品、両方の内因性培養基、薬品及び他の生体異物に砂糖の酵素添加の役割を果たす。哺乳類において、グルクロン酸は体の潜在的中毒レベルの環境または薬品から、代謝及び脂溶性化学製品の廃棄物蓄積を予防するために用いるメイン砂糖である。特にUGT2B7は、成人ヒト肝臓の重要な第2相酵素であり、例えば、薬品ジクロフェナクを新陳代謝するために、Cyp2C9及びCyp3A4と協力する。本発明の一実施例において、肝細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも5%、例えば、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%は、UGTのタンパク質および/または遺伝子発現を示す。さらに、細胞集団はUGT酵素活性を示してもよい。
【0072】
特性x)は本発明による肝細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の割合に関連し、それは転写因子Oct−4の非タンパク質および/または遺伝子発現を示す。Oct−4は転写因子であり、その発現は未分化のhBS細胞に特徴的であり、肝細胞様細胞を含んでいる細胞集団におけるその存在は、望ましくない。したがって、Oct−4の無しまたは低い発現は、それらが未分化のhBS細胞ではないことを示し、未分化の細胞集団が潜在的に奇形腫様組織を引き起こすことがあるので、たとえば、再生医療においてそれは利点である。本発明の一実施例において、肝細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも10%、例えば少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%は、Oct−4のタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
【0073】
上述の特性i)−x)の一部は、誘発因子の追加で誘導でき、それは、デキサメタゾン、オメプラゾールからなるグループから単独でまたは組合せで選択される。誘発因子は、同様にリファンピシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジドを含んでもよい。このような方法で、CYP450タンパク質のうちの少なくとも1つの発現が、誘発因子の追加で誘導できる。さらに、GST A1−1および/またはGST M1−1タンパク質の発現は、誘発因子の追加で誘導できる。UGTタンパク質の発現は、同様に誘発因子の追加で誘導できる。
【0074】
本発明の肝細胞様細胞は、それらが培養される間にこれらが示す特性i)−x)を維持することができる。この文脈において、用語「維持された特性」は、定義済みの培養組織及び分析期間にわたる安定的タンパク質発現を意味することを目的とし、それは、例えば免疫組織化学及び発現輝度の測定及び比較で更に示されることができる。したがって、本願発明による肝細胞様細胞を含んでいる細胞集団が、少なくとも一ヶ月間、例えば、維持された特性を有しながら少なくとも一週間または少なくとも72時間、インビトロで培養されることが可能である。
【0075】
本発明の一実施例で、肝細胞様細胞を含んでいる細胞集団またはその部分母集団は、更にAFPを表示する。
【0076】
さらに特定の臓器模倣応用のために、おそらく、他の肝臓細胞型、例えばクッパー細胞および/またはマクロファージが、必要である。
【0077】
本発明の肝細胞様または肝芽細胞様細胞は、本願明細書に記載されているそれらのそれぞれの特性を確かめるために使用の前に選ばれ、より高い収穫を得る。細胞は、細胞表面に表示される肝臓マーカー及び次のFACソーティングのために抗原検出を用いて精製されてもよい。抗原ベースのソートのための他の代わりは培養皿を特定の抗体でコーティングし、培養基から皿に細胞を加え、右側の抗原と細胞を結びつけ、及び残りの細胞は廃棄され、まとめられた細胞は更なる用途のために収穫する。この方法は、時々免疫と称され、さらに陰性選択として実行されることができる。すなわち、不要な細胞型をコーティングされる抗原へ結合させ、懸濁液の肝細胞様細胞を有する培養基を確保する。このアプローチは、磁気ビーズ上で実行された方がよく、いわゆるMACソートまたはカラムクロマトグラフィを使用する。例えば特定の特性を有する肝細胞様細胞のような細胞を精製するさらなる方法は、細胞分離のための、遠心分離中での浮遊密度またはサイズに基づく密度勾配培養基の使用を含む。
【0078】
肝細胞様または肝芽細胞様細胞の精製集団を得るためのさらなる代替方法は、hBS細胞由来細胞の混合集団における陽性選択または陰性選択を実行することである。両方の選択方法は、細胞単片の切断又は、コラゲナーゼIVまたはトリプシン、または、例えばEDTAまたは適切な酵素及びキレート化剤の混成物のような酵素への追加及び暴露によって手動で実行されることができる。本発明の1つの特定の実施例において、培養皿は、カルシウム/マグネシウムフリーPBSで二回洗われ、その後、カルシウム/マグネシウムフリーPBSに希釈される0.5mMのEDTAにおいて培養され、非肝細胞様又は非肝芽細胞様細胞を取り除き、マウス胚のフィーダ上で完全に成長する肝臓様細胞型を残す、陰性選択をもたらす。キレート化剤および/または酵素への更なる暴露の後、肝臓様細胞は、フィーダ細胞及び、実験に更にプールされ、使われる皿から分離される。
【0079】
肝芽細胞様細胞
このコンテキストにおいて、用語「肝芽細胞様細胞」は、HNF3ベータ及びAFPの少なくとも一つのを表示し、増殖能を有する細胞を意味することを目的とする。したがって、本願発明の一実施例は、hBS細胞に由来される細胞集団に関連し、細胞集団の細胞の少なくとも約10%が、少なくとも一つのHNF3ベータ及びAFPを表示し、増殖能を有し、細胞集団は以下の4つの特性のうちの少なくとも2つを有する。
A.受容体
i)細胞の少なくとも1%が、アルファ−6−インテグリンのタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
ii)細胞の少なくとも1%が、c−Metのタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
B.細胞間接着分子
iii)細胞の少なくとも1%が、ICAM−1のタンパク質および/または発現を示し、
C.転写因子
iv)細胞の少なくとも10%が、HNF−4アルファのタンパク質および/または発現を示し、
D.サイトケラチン
v)細胞の少なくとも1%が、CK19のタンパク質および/または発現を示し、
vi)細胞の少なくとも1%が、CK7のタンパク質および/または発現を示し、
E.上皮細胞接着分子
vii)細胞の少なくとも1%が、EpCAMのタンパク質および/または発現を示す。
【0080】
細胞質比に高い核を有し、立方形の形状であることは、肝芽細胞様細胞の顕著な特徴である。さらに、それらは細胞質に小さい核小体及び微粒を有してもよい。好ましくは、細胞の直径は10−30μmの間であってもよい。
【0081】
肝芽細胞様細胞は、更に肝細胞様細胞に分化する能力を有する内皮オリジンの細胞である。HNF3ベータは内皮性マーカーであり、内胚葉は肝細胞の方へ発育経路に沿っている。HNF3ベータは、同様に膵臓で表示されることは公知である。この文脈において、用語「増殖能」は、細胞集団の細胞が分裂することを意味することを目的とする。
【0082】
HNF3ベータ以外の肝芽細胞様及び肝細胞様細胞へ分化するhBS細胞によって表示される追加的な内皮性マーカーの実施例は、Gata4、Cdx2(尾部関連ホメオボックス転写因子)、Sox17(Sry−box含有遺伝子17の遺伝子製品)、Pdx1(膵臓の十二指腸ホメオボックス因子−1)及びAFPであり、後者は通常、胎児の肝臓マーカーとみなされる。
【0083】
肝芽細胞様細胞は、さらに、増殖されてもよく、それは、前駆状態の1つの表示であり、すなわち、それらは未成熟で完全に肝細胞様細胞に分化されなかった。細胞の繁殖的状態は、多数の手段によって示されることができ、それらは例えばBrdU取り込み及び染色または例えばKI67のような繁殖的細胞に特有なタンパク質マーカーを使するもう一つの染色であり、固定の時点に集団における繁殖細胞を染色する。
【0084】
肝芽細胞様細胞の特性i)−vii)は、肝発育にとって重要な体内関連マーカーである。
【0085】
特性i)は、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の割合に関連し、アルファ−6−インテグリン受容体のタンパク質および/または遺伝子発現を示す。アルファ−6−インテグリンは、ラミニン受容体である。ラミニン受容体は、例えば発育中の肝臓の細胞外基質の一部であり、多数の細胞型(例えば体内肝芽及び肝細胞)に表示される。本発明の一実施例において、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも5%、例えば、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%が、アルファ−6−インテグリン受容体のタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
【0086】
特性ii)は、c−Met受容体のタンパク質および/または遺伝子発現を示す、肝芽細胞様細胞を含む細胞集団の細胞の割合に関する。本発明の一実施例において、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも5%、例えば、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%は、c−Met受容体のタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
【0087】
特性iii)は、細胞集団において、細胞間の粘着力分子ICAM−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示す肝芽細胞様細胞を含む細胞の割合に関する。本発明の一実施例において、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団における細胞の少なくとも5%、例えば、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%が、細胞間の粘着力分子ICAM−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
【0088】
特性iv)は、転写因子HNF−4アルファのタンパク質および/または遺伝子発現を示す肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団における細胞の割合に関する。この転写因子は、特に内皮性細胞型において表示され、したがって、肝芽細胞様細胞を表す。本発明の一実施例において、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも5%、例えば、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%が、HNF−4アルファのタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
【0089】
特性v)は、サイトケラチン19のタンパク質および/または遺伝子発現を示す、肝芽細胞様細胞を含む細胞集団の細胞の割合に関する。このサイトケラチンは、肝細胞以外の特に肝臓幹細胞及び肝芽において表示され、したがって、肝芽細胞様細胞を表す。本発明の一実施例において、肝芽細胞様細胞を含む細胞集団の細胞の少なくとも5%、例えば、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%が、サイトケラチン19のタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
【0090】
特性vi)は、サイトケラチン7のタンパク質および/または遺伝子発現を示す、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団における細胞の割合に関する。このサイトケラチンは、肝細胞ではなく特に肝臓幹細胞及び肝芽において表示され、したがって、肝芽細胞様細胞を表す。本発明の一実施例において、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも5%、例えば、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%が、サイトケラチン7のタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
【0091】
特性vii)は、上皮細胞接着分子のタンパク質および/または遺伝子発現を示す、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の割合に関する。この上皮細胞接着分子は、肝細胞でなく特に肝臓前駆において表示され、したがって、肝芽細胞様細胞を表す。本発明の一実施例において、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも5%、例えば、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%が、上皮細胞接着分子のタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
【0092】
本発明の一実施例において、上述の特性i)−vii)のうちの少なくとも2つを有する細胞集団の細胞の少なくとも約15%、例えば、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%または少なくとも約95%が、HNF3ベータ及びAFPのうちの少なくとも一つに表示され、増殖能を有する。さらに、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団は、特性i)−vii)のうちの少なくとも3つまたは全4つを有する。
【0093】
本発明の他の実施例において、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団は、更に以下の特性のうちの少なくとも1つを有する。
F.薬物輸送体:
viii)細胞の少なくとも1%が、BSEPのタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
ix)細胞の少なくとも1%が、MRP2のタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
【0094】
BSEP及びMRP2は、肝細胞様細胞へ発育の間に、すでに薬品トランスポート・プロセスを実行することにとって重要であるが、それは、この発育的なフェーズで代謝、解毒及び分泌物が同様に必要とするからである。
【0095】
更なる使用態様
薬品トランスポート及び薬物代謝酵素の発現のために、本発明の肝細胞様細胞及び肝芽細胞様細胞は、医薬品用途に非常に適している。したがって、本発明に記載されている細胞集団が、予防および/または病状治療、および/または例えば、肝臓組織退化、原発性胆汁性肝硬変を含む自己免疫障害からなる群から選択される肝臓障害、脂質異常症を含む代謝障害、例えばアルコール濫用によって生じる肝臓障害、ウイルスによって生じる疾患(例えばB型肝炎、C型肝炎及びA型肝炎)、例えば調合薬に対する急性毒性反応によって生じる肝臓壊死及び肝細胞性癌及び代謝病状および/または、疾患で苦しんでいる患者の腫瘍除去のような組織退化によって生じる疾患のための医薬品の製造に使われることができる。
【0096】
さらに、本発明の肝細胞様細胞及び肝芽細胞様細胞は、スクリーニングの目的のために最適に使われる。例えば、細胞は本発明の細胞集団から合成物へ細胞を暴露することを含む、肝細胞毒性の合成物をスクリーニングする方法に使うことが可能であり、合成物が細胞に対して有毒かどうか決定する。細胞は、さらに肝細胞性機能を調整する能力のために合成物をスクリーニングする方法に使われてもよい。上記の方法は、本発明の細胞集団からの細胞を合成物へ暴露し、合成物との接触から起こる細胞のいかなる表現型または代謝変化を測定し、肝細胞性機能を調整する能力に変化を関連づける方法である。
【0097】
再生医療の応用において、hBS細胞は、異種動物由来成分不含hBS細胞に由来されるべきであり(実施例1を参照)、さらに分化の間に、分離及び可能性二次培養は直接的にも間接的にも非人間動物由来構成要素に暴露されない。これは、ヒト由来構成要素(例えば組み換え型培養基及び添加物)だけを用いて達成されることができる。
【0098】
製剤方法
本発明の細胞集団は、分化誘導薬を用いずに得られるが、それは、一般的に他に使われる。分化誘導薬は、細胞に有毒な欠点を有し、そのような方法によって得られる分化細胞の収穫は低く、さらに、これらの得られた細胞の品質にも影響を及ぼす可能性がある。本発明の発明者は、培養状況を確認することにより、分化誘導薬を使用しないで肝細胞様細胞および/または肝芽細胞様細胞へhBS細胞の分化を可能にする。本発明による肝細胞様細胞及び肝芽細胞様細胞の製剤方法は、細胞の改良された品質及び改良された収穫を提供する。さらに、得られた細胞は、ここに記載されている特性を有し、この特性が細胞をここに記載の用途以外にも適応させる。
【0099】
本発明の一実施例において、96−ウェルプレートの肝細胞様細胞へのhBS細胞の分化は、うまく実行される。96−ウェルの少なくとも50%、60%、70%、80%、90%または100%が、肝細胞様細胞へhBS細胞を分化させることに成功した。hBS細胞は、本発明の実施要項に従う期間で肝細胞様細胞へ分化するが、例えば20日目、25日目、30日目または35日目である。
【0100】
本発明の方法は、さらに、周知の方法より労力が掛からない。bFGF以外の、高価な因子は、培養基への添加物として必要でなく、bFGFは、低い量だけ必要で、以前報告されるほうより少ない量である。
【0101】
方法は、細胞から排出する内因子に依存し、中毒特性のいかなる潜在的添加物にも依存しない。すなわち、より穏やかな、より生理的に適切な環境を実現する。それゆえに、方法はまれな培養基置換及び部分的な培養基置換に依存する。有毒な物質は、特定の誘導酵素の誘導性のみを確認するために使われる。
【0102】
加えて、方法は肝細胞様細胞へ分化するために重要なmEF細胞に依存する。hBS細胞が分化するmEF細胞の濃度は、20.000細胞/cm2から200.000細胞/cm2の範囲内で変動してもよく、例えば約30.000から100.000細胞/cm2、例えば40.000から70.000細胞/cm2、例えば52.000細胞/cm2である。
【0103】
肝細胞様細胞への分化方法にとって重要な他の1つの要因は、bFGFの存在であり、それは、分化の前に培養基に加えられる。
【0104】
本発明のための出発原料は、未分化hBS細胞株のような最適に多能性の未分化hBS細胞である。そのような材料は、Cellartis AB社から得られることができ、さらにNIH幹細胞レジストリで入手できる(http://stemcells.nih.gov/research/registry/)。Cellartis AB社は、2つのhBS細胞株(SA001及びSA002)を有し、SA002(SA002.5)の1つのサブクローンは、NIHを通して入手できる。それらのhBS細胞株は、本発明において多用された。
【0105】
出発物質として推薦されるhBS細胞の特性は、以下の通りである:陽性のアルカリホスファターゼ、SSEA−3−SSEA−4、TRA 1−60、TRA 1−81、Oct−4、陰性のSSEA−1、テロメラーゼ活性、及びインビトロ及びインビボの多分化能(後者は、免疫不全マウスの奇形腫形成によって示される)(図1)。
【0106】
使用の前に、出発物質として使用されるhBS細胞株は、特徴プログラムに従うLOT製造に由来されてもよい。hBS細胞株のLOT製剤は、標準化方法に従う培養及び1つの単一継代における100ストロー以上の冷凍でのhBS細胞の拡張を構成する(出願中の特許国際公開WO2004098285)。hBS細胞株の形態は、冷凍の前後、更に、LOTからの細胞の解凍の後の次なる培養における連続的継代でモニタされる。LOT冷凍の品質は、10解凍の各ストローの100パーセントの解凍速度を示す解凍回復率の検査によって確認される。細胞の汚染がないことを確認するために、微生物学的安全に関する安全試験が、それから細胞及び冷凍経過における培養基に実行される。実行される特性解析プログラムは、hBS細胞株の分化状態を確認する方法の幅広い範囲を含む。未分化細胞(SSEA−1、SSEA−3、SSEA−4、TRA−1−60、TRA−1−81、Oct−4及びALP)のための一般に認められたマーカーの最初のマーカー発現分析において、実行される。継代の細胞の遺伝子の安定性及び冷凍−解凍サイクルが、染色体分析及びFISHで点検される。テロメラーゼ活性が、Telo TAGGG Telomerase PCR ELISAPLUSキットを使用して測定される。hBS細胞の多分化能が、胎様体ステップで試験管内の分化及び、免疫不全SCIDマウスの腎臓カプセルでのhBS細胞の移植による体内分化によって調べられる。
【0107】
ここで用いられる出発物質は、さらに完全に異種動物由来成分不含に由来されてもよく、それによって、完全な異種動物由来成分不含肝細胞様細胞が、再生医療の潜在的使用のために得られてもよい。hBS細胞の異種動物由来成分不含由来物のために、全ての培養基及びマトリックス構成要素、フィーダ細胞及び使用する他の材料は、いかなる人間以外の動物材料に由来又は接触しなくてもよい。hBS細胞の異種動物由来成分不含由来物のための適切な構成要素及び、異種動物由来成分不含肝細胞様細胞、異種動物由来成分不含由来のヒト線維芽細胞であり、たとえば、ヒト包皮線維芽細胞、組み換え型成長因子を有する無血清またはヒト血清ベースの培養基、分化因子および/または潜在的な他の添加物、及び、ヒト組み換え酵素または細胞の分離及び培養のための殺菌したメカニカルツールの何れかである。
【0108】
他の出発物質は内皮性細胞であり、すなわちすでに内胚葉血統へ取組まれたhBS細胞由来の細胞である。そのような細胞は、以下の内胚葉マーカーのうちの1つ以上を表示してもよい:HNF3ベータ(肝細胞核因子3)、Gata4、Cdx2(尾部関連ホメオボックス転写因子)、Sox 17(Sry−box含有遺伝子17の遺伝子製品)、及びPdx1(膵臓の十二指腸ホメオボックス因子−1)。
【0109】
本願発明の一実施例は本発明による肝芽細胞様細胞および/または肝細胞様細胞を含む集団の製剤のための方法に関し、次のステップを含んでいる:
i)無血清培地の支持マトリックスでhBS細胞またはhBS細胞由来前駆を少なくとも5日間、試験管内分化を行う。
ii)培養基を約5日から25日ごとに変える。
iii)機械的隔離によって細胞を分離する。
iv)酵素処理によってステップiii)において得られる細胞を任意に解離する。
v)表面抗原発現に基づいて細胞を任意にソートする。
【0110】
hBS細胞に由来される前駆は、HNF3ベータ及びAFPを表示してもよく、増殖能を有する。
【0111】
ステップi)のインビトロの分化は、少なくとも10日間(例えば少なくとも20日間、少なくとも30日間または少なくとも40日間)実行される。このステップの分化のために与えられる時間は、得られた細胞が肝細胞様細胞または肝芽細胞様細胞の特性を有するかを決定している。したがって、肝細胞様細胞を得るために、hBS細胞の試験管内分化または無血清培地での支持マトリックス上のhBS細胞由来前駆は、約18日から約30日まで実行され、好ましくは20−27日間、より好ましくは約25日間実行され、反対に、約5日から約10日間、好ましくは15日間肝芽細胞様細胞を得るために必要である。
【0112】
血清培地は、VitroHES(商標)、bFGFで補充されるVitroHES(商標)及びあらかじめ自己調整されたVitroHES(商標)(すでに肝細胞様細胞に改良される)からなる群から選択されてもよい。無血清培地は、bFGFを更に含み、その濃度は好ましくは約4ng/mlから約200ng/mlまでの濃度、例えば、約4ng/mlから約150ng/mlまで、約4ng/mlから約100ng/mlまで、約4ng/mlから約50ng/mlまで、または約4ng/mlから約10ng/mlまでである。
【0113】
本発明の一実施例において、無血清培地はbFGFを含んでいるVitroHES(商標)である。bFGFの濃度は、約4ng/mlから約200ng/mlまであってもよく、例えば、約4ng/mlから約150ng/mlまで、約4ng/mlから約100ng/mlまで、約4ng/mlから約50ng/mlまで、または約4ng/mlから約10ng/mlまでである。bFGFの濃度は、4ng/mlであってもよい。
【0114】
ステップii)において、無血清培養基は、約10日ごとから約20日ごと、例えば、約12−18日ごと、例えば14−15日ごとに変わってもよい。
【0115】
支持マトリックスは、例えば、ヒトまたはマウス・フィーダ細胞のようなフィーダ細胞を含んでもよく、または、定義済みまたは未定義の配合の細胞外基質を含んでもよい。あるいは、支持マトリックスは以下を含んでもよい:細胞培養に使用されるプラスチック細胞培養容器の内側にコーティングする、単独または組合せの、一つ以上のタンパク質を含むコーティング、または、三次元環境(例えば多孔性フィルタ)を含んでもよい。支持マトリックスとして多孔性フィルタを使用する場合、この多孔性フィルタは、直径が約4μmの孔サイズを有してもよく、単独でまたは組合せで、一つ以上のタンパク質でコーティングされてもよい。
【0116】
上記にて説明した容器またはフィルタコーティングするために使用する一つ以上タンパク質は、コラーゲン、ラミニン及びそれらの組合せからなる群から選択されてもよい。
【0117】
ステップiii)において実行される細胞のメカニカル分析は、細胞形態の視覚の点検で判断されることで肝芽細胞様細胞および/または肝細胞様細胞を取り出すことによって実行されてもよい。肝細胞様細胞は、肝細胞の典型的な形態学を表示する。すなわち、それらは多角形の細胞形状を有し、大きい細胞直径(凡そ25−50μM)は、しばしば核を二つもち、脂肪顆粒を蓄積する傾向がある。経験及び完全な実験によって、形態学は、肝臓マーカー(例えばアルファ−1−抗トリプシン、CK18、HNF−3ベータ、アルブミンまたはLFABP)の発現に関連づけられた。実行された選択は、免疫組織化学による識別によって肝芽細胞様細胞または肝細胞様細胞として更に検査されてもよい。メカニカル解剖の代わりに、それらが成長している表層及び、例えば酵素またはキレート化剤またはそれらの組合せから細胞を分離し、その後、例えばFACソート、磁気ビーズまたは免疫することによって細胞をソートする。細胞は、それから適切な培養および/または例えばインビトロの分析のために更に使われる数に相当するマルチウェルプレート分析容器に最後に接種されてもよい。
【0118】
本願明細書において記載されている方法によれば、本発明の細胞集団は、ヒトまたはマウス・フィーダ細胞のようなフィーダ細胞の存在下で得ることができ、さらにそれらはフィーダ細胞がない場合に得ることができる。フィーダ細胞がない場合、本発明の細胞集団は、定義済みまたは未定義の配合の細胞外基質、または単独または組合せで、一つ以上のタンパク質で内側がコーティングされたプラスチック細胞培養容器を使用して得ることができる。この目的の適切なタンパク質は、コラーゲン、ラミニン及びそれらの組合せからなる群から選択されてもよい。あるいは、本願発明の細胞集団は、三次元環境(例えば多孔性フィルタ)を使用することによって獲得してもよい。
【0119】
肝細胞様細胞を得る追加的な方法は、例えば異なる培養基配合によって刺激される3D培養における最終的に類似する内胚葉によって、肝細胞様細胞へhBS細胞を統制的に分化させることである。異なる因子または構成要素は、それからタイプ及び濃度(たとえば血清、培養基における成長因子及び他の刺激的な因子)に加えられるかまたは変化する。簡単に概説すると、未分化のhBS細胞部分は取り除かれて、たとえば24−ウェルプレートのフィルタ挿入紙へ移動されてもよい。全ての培養は、それから異なる培養基配合において育てられて、肝細胞様細胞または肝芽細胞様細胞の収穫を最大にするための一番よい時間枠を見つけるために、例えば異なる時間位置上の免疫組織化学分析のような分析を受ける。
【0120】
肝細胞様細胞または肝芽細胞様細胞を得るためのさらなる追加的方法は、例えばヒト成人肝臓または器官断片または他の種(例えばマウス胚の肝臓を実施例2で述べたように肝細胞様細胞の方へ分化するように刺激させる)の細胞型の肝臓断片を有するhBS細胞に由来されるhBS細胞または内胚葉前駆細胞を相互培養することである。そのようなシステムの相互培養は、3D構造(例えば肝細胞及びダクトの一群)の形成のために有益である。
【0121】
さらに、肝細胞様及び肝芽細胞様細胞の繁殖的な状態への誘導は、培養基の培養によって誘導されることが可能であり、それは、例えば成長因子を含んでいる肝細胞のために調整される。
【0122】
本発明の具体例において、得られた細胞集団は、異種動物由来成分不含であってもよい。
【0123】
本願発明の一実施例は、本発明の肝細胞様細胞を含む集団を生産するための改良された方法に関連し、その方法は、以下のステップを含む。
i)hBS細胞を育てることに適している培養基、例えばVitroHES(商標)培養基の中で最大10日から30日間、好ましくは例えば、15日目または23日目までの13日間から27日間、hBS細胞をインビトロで分化させ、例えば、培養基の100%が、新規な肝細胞培養基に取り替えられることができ、50%に変わる。
ii)10−40日目、好ましくは13−35日目、例えば15日目または23日目にHCM培養基のような肝細胞の培養のために最適化される新規な培養基に代わる。培養基は、以下の構成要素の一つ以上を含んでもよい:ウシ血清アルブミン、アスコルビン酸、上皮細胞増殖因子、トランスフェリン、インスリン、ヒドロコルチゾン及び抗生物質。
【0124】
交換する培養基の量は、30%から最高100%まで変動することができる。培養基は、一週間に三回、または一週間に一回交換され、好ましくは週に一度交換される。
【0125】
さらに、方法は次の工程を含んでもよい。
iii)高い濃度のデキサメタゾンを最大10日、好ましくは8日間、任意に加える。
iv)ナトリウム酪酸塩(NaB)及びHGFを最大10日、好ましくは5日間、任意に加える。
v)細胞を分離する。
vi)酵素処理によってステップii)において得られる細胞を任意に解離する。
vii)表面抗原発現に基づいて細胞を任意にソートする。
【0126】
全ての詳細及び以下の一般的方法で言及される詳細は、上述の特定の実施例に準用する。
【0127】
キット
本発明の別の態様は、以下を含んでいるキットに関する:i)肝細胞様細胞および/または肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団、ii)一つ以上の成熟因子および/または成熟培養基、及びiii)任意的に使用指示書。成熟培養基は、VitroHES(商標)、bFGFで補充されるVitroHES(商標)、及びあらかじめ調整されたVitroHES(商標)(肝細胞様細胞上ですでに調整された)からなる群から選択されてもよい。
【0128】
一つ以上の成熟因子は、bFGF、上皮増殖因子、肝細胞増殖因子及びオンコスタチンMからなる群から選択される。
【0129】
さらに、キットは成熟をモニタするためのツールを含んでもよい。
【0130】
一実施例において、成熟をモニタするための道具は以下を含む:
i)HNF3ベータ、AFP、アルブミン、BSEP、MRP2、OATP−2、OATP−8、GST A1−1、CYP450−1A2、CYP450−2A6、CYP450−2B6、CYP450−2C8、CYP450−2C9、CYP450−2C19 CYP450−2D6、CYP450−2E1、CYP450−3A4、CYP450−3A7、GST M1−1及びUGTからなる群から選択される発現マーカーを符号化する遺伝子の少なくとも3つ、例えば少なくとも4つまたは少なくとも5つに対するPCRプライマー、及び
ii)ユーザーズ・マニュアル。
【0131】
他の一実施例において、成熟をモニタするためのツールは以下を含む:
i)HNF3ベータ、AFP、アルブミン、BSEP、MRP2、OATP−2、OATP−8、GST A1−1、CYP450−1A2、CYP450−2A6、CYP450−2B6、CYP450−2C8、CYP450−2C9、CYP450−2C19 CYP450−2D6、CYP450−2E1、CYP450−3A4、CYP450−3A7、GST M1−1及びUGTからなるグループから選択される発現マーカー抗原の少なくとも3つ、例えば少なくとも4つまたは少なくとも5つに対抗する抗体、および
ii)ユーザーズ・マニュアル。
【0132】
細胞をモニタするための追加的な道具は、PROD分析構成要素及び、培養基の尿素および/またはアルブミン検出のための構成要素である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0133】
【非特許文献1】シュヴァルツ、ロバート、E等、ヒト胚性幹細胞から機能的な肝臓細胞を発育するための限定条件、幹細胞及び発育 14:643−655(2005)。
【非特許文献2】Rambhatla、ヒト胚性幹細胞からの大量の肝細胞様細胞、Cell Transplant. 2003; 12(1):1−11
【非特許文献3】ハインズ等、ヒト胚性幹細胞の分化、由来物、特徴; StemCells; 2004; 22(3): 367−76.
【特許文献】
【0134】
【特許文献1】国際公開WO03055992、多能性胚盤胞由来幹細胞株の樹立方法
【特許文献2】国際公開WO2005/097980
【特許文献3】国際公開WO01/81549
【図面の簡単な説明】
【0135】
【図1】出発物質の特性、hBS細胞、即ち、(A)形態学、(B)SSEA−1(陰性)、(C)SSEA−3、(D)SSEA−4、(E)TRA−1−60、(F)TRA−1−81、(G)Oct−4、(H)ALP(すべてがhBS細胞株SA002、LOT AL002に由来)及び、右上に外胚葉性組織、右下の内胚葉組織、及び左の中胚葉性組織(hBS細胞株SA121に由来)印をつけられた外胚葉性組織を有する免疫不全マウスからのエオシン染色された奇形腫断片、ヘマトキシリンによって図解される(I)体内多分化能。
【図2】以下の肝臓マーカーに陽性染色した肝細胞様細胞を示す:(A)アルブミン、及び、(B)CK−18、(C)DAPI(核)、及び(D)フェーズ対照、すべてがSA002に、継代56、mEFsでの23分化日の後
【図3】以下の肝臓マーカーに陽性染色した肝細胞様細胞を示す:(A)AAT、(B)HNF3ベータ及び(C)DAPI、全てがSA034で、継代137、mEFでの分化の32日以後。
【図4】以下の肝臓マーカーに陽性染色した肝細胞様細胞を示す:(A)SA034でのLFABP、継代135、mEFでの25分化日後、及び初期の肝臓マーカー(B)AFPの弱陽性、SA002で、継代56、mEFでの23分化日の後。
【図5】SA002で(A)CK18と(B)Cyp1A2の共発現を示す。継代63、mEFでの23分化日の後。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図6】SA002での(A)CK18と(B)Cyp2A6の共発現を示す。継代63、mEFでの23分化日の後。Cypタンパク質発現は、さらにリファンピシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジド(データは示されない)のCYP誘発因子混合を使用して、更に誘導されることができる。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図7】継代63、mEFでの23分化日後の、SA002での(A)CK18と(B)Cyp2B6の共発現を示す。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図8】継代63、mEFでの23分化日後の、SA002での(A)CK18と(B)Cyp2C8/9/19の共発現を示す。Cypタンパク質発現は、さらにリファンピシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジド(データは示されない)のCYP誘発因子混合を使用して、更に誘導されることができた。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図9】継代63、mEFでの23分化日後の、SA002での(A)CK18と(B)Cyp2D6の共発現を示す。Cypタンパク質発現は、さらにリファンピシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジド(データは示されていない)のCYP誘発因子混合を使用して、更に誘導されることができた。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図10】mEFでの23分化日後の、継代63での、SA002での(A)CK18と(B)Cyp2E1の共発現を示す。Cypタンパク質発現は、さらにリファンピシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジド(データは示されない)のCYP誘発因子混合を使用して、更に誘導されることができた。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図11】mEFでの23分化日後の、継代63での、SA002での(A)CK18と(B)Cyp3A4/7の共発現を示す。Cypタンパク質発現は、さらにリファンピシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジド(データは示されない)のCYP誘発因子混合を使用して、更に誘導されることができた。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図12】誘導混合物処理後にウエスタンブロット法によって視覚化される肝細胞様細胞のCyp3A4/7及びCyp1A2の誘導性を示す。mEFで23−25日の分化後の継代51、53、54及び55のSA002(LOT AL002)及び、23−25日の分化後の継代51、53、54及び55のSA002.5(LOT BE002.5)での誘導されたhBS細胞(リファンピシンのCyp誘発因子混合、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及び96時間イソニアジド)非処理のhBS細胞:SA002(LOT AL002)、継代47、52及び56、19−23日の分化後、及びSA002.5(LOT BE002.5)継代48、53及びmEFで55、19−26日の分化後。HepG2(Cat No HB−8065, ATCC):陰性対照としての継代23。陰性対照としての継代2での主たるケラチン生成細胞(Cat No C−12003、Promocell))。陽性対照として使われ、解凍及び最近準備したヒト初代肝細胞(男性の及び女性の)。ベータ−アクチンが、内部ローディング対照として使われた。
【図13】PROD分析を使用する一般のCyp活性を示す。画像明るさによって視覚化される、Cyp誘発因子(上記の通り)処理において活性は増加する。位相コントラスト(A)及びPROD蛍光(B)の非処理の細胞、位相コントラスト(C)及びPROD蛍光(D)の誘導された細胞。位相コントラスト(E)及びPROD蛍光(F)における技術的対照(細胞にPRODを追加することなく)。全ては、mEFで26日分化後に、継代56のSA002の画像である。灰色のスケールのよりよく明るさを視覚化するためにAdobe Photoshopを使用している、赤から黄に変わる画像。
【図14】リファンピシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジドの混合を加えることによって、(A)前で誘導(B)後のGST A1−1、(C)前で誘導(D)後のGST M1−1、及び(E)前で誘導(F)後のGST P1−1の発現を示す。GST M1−1及びGST P1−1のはっきりした誘導は、観察されることができないが、GST A1−1のわずかな誘導は発見された。よりよく灰色のスケールの明るさを視覚化するために、Adobe Photoshopを使用して、赤から黄色に変わる画像。
【図15】誘導混合物処理の後のウエスタンブロット法による、肝細胞様細胞におけるGST A1−1の誘導を示す。96時間リファンピシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジドのCYP誘発因子混合による処理及び非処理での、mEFの分化の20−26日後の、SA002.5(LOT BE002.5)継代35、36、43及び46、及びSA167(LOT CE167)継代17、18,25及び28。GSTタンパク質製剤及びヒト男性及び女性の最近備えた(解凍した)、初代肝細胞が、対照として使われた。
【図16】3つの異なるhESC株及びヒト肝細胞及びHepG2細胞に由来する肝細胞様細胞のCDNBへのGST酵素活性、全タンパク質(平均±SD(n=3))のμmol培養基共役/分/mgとして示される。
【図17】フェーズII代謝酵素UGT1A1及びUGT1A6の肝細胞様細胞の免疫反応性を示す。CK18(B)と共発現されるUGT1A1(A)、及びCK18(D)と二重着色されるUGT1A6(C)、全てが、mEFでの24日分化後の、SA002で継代59にある。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図18】薬物輸送体OATP−2/8のための肝細胞様細胞の免疫反応性を示す。継代56、SA002の(A)DAPI、(B)OATP−2/8、(C)位相コントラスト、mEFでの23日分化後。よりよく灰色のスケールの明るさを視覚化するためにAdobe Photoshopを使用して赤から黄に変わる画像。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図19】薬物輸送体BSEPのための肝細胞様細胞の免疫反応性を示す。mEFで23日分化後、SA002の継代32の(A)DAPI、(B)BSEP、(C)位相コントラスト。よりよく灰色のスケールの明るさを視覚化するためにAdobe Photoshopを使用して赤から黄に変わる画像。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図20】薬物輸送体MRP−2のための肝細胞様細胞の免疫反応性を示す。mEFで22日分化後、SA002の継代33の(A)DAPI、(B)MRP−2、(C)位相コントラスト。よりよく灰色のスケールの明るさを視覚化するためにAdobe Photoshopを使用して赤から黄に変わる画像。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図21】細胞株SA002、LOT AL002からの肝細胞様細胞のグリコーゲンの保管を示す、21日分化後の継代15。グリコーゲンは、PAS染色−システムによってピンクの染色として検出される。培養は、(BとD)のどちらで処理されるかまたは、グリコーゲン検出の前にヒト唾液(A及びC)で処理されていない。
【図22】マトリゲルに分化する肝細胞様細胞のCYP及びGST免疫染色を示す。SA002及びp57での(B)Cyp2B6と共発現される(A)Cyp1A2および(D)GST A1−1と共発現される(C)CK18、マトリゲルでの24日間の分化後。よりよく灰色のスケールの明るさを視覚化するためにAdobe Photoshopを使用して赤から黄に変わる画像。
【図23】cDNAの同じ総量からの未分化のhBS細胞の対照サンプル(BE002.5継代24、5日(対照サンプル1)及びBE002、継代62、4日(対照サンプル2))に関連する21分化日の継代2の、細胞株SA002.5、LOT BE002.5から肝細胞様細胞におけるQPCRを使用して高いMRP−2発現を示す。発現レベルは、3つの細胞サンプルのために得られるCT値(閾値サイクル)から算出され、さらに対照サンプル2の発現に比較される。肝細胞様細胞のMRP2発現は、未分化細胞のものより11から32倍高い。
【図24】肝細胞様細胞におけるCyp1A2発現の誘導を示す。非処理の肝細胞様細胞(A)及び、対応する位相コントラスト(B)及び、誘導された(C)及び、対応する位相コントラスト(D)。よりよく灰色のスケールの明るさを視覚化するためにAdobe Photoshopを使用して赤から黄に変わる画像。
【図25】肝細胞様細胞でのCyp2B6発現の誘導を示す。非処理の肝細胞様細胞(A)及び、対応する位相コントラスト(B)及び、誘導された(C)及び、対応する位相コントラスト(D)。よりよく灰色のスケールの明るさを視覚化するためにAdobe Photoshopを使用して赤から黄に変わる画像。
【図26】胚マウス肝臓と共培養されるhBS細胞によって形成されるAFP陽性の肝芽細胞様細胞を示す。赤(特徴的に核を染色してある)のヒト特定の核抗原、hBS細胞は緑の内胚葉由来されたAFP陽性の大きいクラスタを引き起こしていることを示す(実施例2を参照)。
【図27】細胞株SA167(A及びB)、SA002(CおよびD)及びSA002.5(E及びF)に由来した非処理及び誘導された肝細胞様細胞のCyp1A2、3A4/7及び1A1タンパク質発現のウエスタンブロット法分析を示す。A、C、E:非処理の細胞、B、D、F:誘発因子カクテルで処理される細胞、G:ヒト肝細胞Lot GIU 22(CYP1A1 Lot MYO)、H:未分化のhESC株SA002.5、I:MEF、J:HepG2細胞及びK:組み換え型CYP1A1。
【図28】(A)は、肝臓/内胚葉マーカーHNF4アルファの反応を示す。(B)は、集団における繁殖細胞の割合を示すために使用されるマーカーであるKi67の反応である。(C)は、多くの肝芽細胞様細胞に共存されるHNF4アルファ及びKi67を示す。(D)はDAPI(染色核)示す。(E)は形態学を示す。
【図29】培養基への反応として増殖能に関連する結果及びその誘導を示す。(実施例4を参照)。VitroHES(商標)の培養された(A)−(C)は SA002細胞の肝細胞様細胞を示す。(A)は、形態学を示している。(B)KI67マーカー反応なしをを示す(即ち、増殖なし)。(C)肝臓マーカー・アルファ−1−抗トリプシン反応を示している。(D)−(F)は、Willimas E培養基で培養された肝細胞様SA002細胞を示す。(D)は、形態学を示している。(E)KI67マーカー(増殖)反応を示している。(F)は、肝臓マーカー・アルファ−1−抗トリプシン反応を示している。
【図30】肝細胞様細胞及び初代肝細胞のEROD反応を示す。左の欄は、(上部から)未処理、オメプラゾール+リファンピン誘導、及び6−構成要素カクテル誘導の肝細胞様細胞でのEROD活性を示し、右側の欄は、初代肝細胞の対応結果を示す。肝細胞様細胞は、したがって、特定のCyp1A2反応性を有し、それは、非常に弱いながら、Cyp誘発因子処理の前に検出された。(実施例13を参照。)
【図31】HepG2と比較して肝細胞様細胞由来のhBS細胞におけるCyp活性を示す。(A)及び(D)は、非処理の肝細胞様細胞を示し、(B)及び(E)は、誘導肝細胞様細胞を示し、(C)及び(F)は、HepG2を示す。
【図32】肝細胞様細胞及び初代肝細胞のPROD反応を示す。左の欄は、(上部から)非処理、プリミドン誘導、及び6−構成要素カクテル誘導の肝細胞様細胞でのPROD活性を示し、右側の欄は、初代肝細胞の対応する結果を示す。肝細胞様細胞は、したがって、Cyp誘発因子処理の前に一般のCyp活性を有する。(実施例4を参照。)
【図33】肝細胞小管区分(左)を有するラット肝細胞(lan Cotgreave教授からの画像)及び小管類似構造(右)を有する肝細胞様細胞を示す。
【図34】hBS細胞から肝芽細胞様細胞を経過して肝細胞様細胞の由来物のためのフローチャートを示す。
【図35】17日間後の培養下の膜表現型Notch2(膜組織で、緑の)及び細胞株SA461(継代26)の核染色(青の)の発現を示す。矢印は、双核肝細胞様細胞を示す。拡大倍率250x。
【図36】Cyp3A4、3A7、1A1、1A2及びCyp2A6の相対的な遺伝子発現レベルが肝細胞様細胞、HepG2及びヒト肝エキスの誘導及び非誘導培養のリアルタイムPCR技術によって測定及び比較されたことを示す。ヒト肝エキスの測定は、1にセットされ、他のサンプルは、各々のシトクロムp450のヒト肝臓基準に関連する。全ての遺伝子のための発現は、GAPDH(CYP1A1/1A2、CYP2A6またはTBP(CYP3A4/3A7)に対して標準化される。
【図37】肝細胞様細胞を培養するための培養基の改良の研究デザインを示す。研究デザインA;培養基の100%は、15日後にVitroHES(商標)からHCMに交換され、23日に50%のHCMは、新規なHCM−培養基と取り替えられた。実験は、細胞株SA002で行われた。研究デザインB;培養基の100%は、23日後にVitroHES(商標)からHCMに交換された。実験は、細胞株SA348で行われた。
【図38】研究デザインA及びB、図37及び実施例1、2及び表5に基づいて、それぞれVitroHES(商標)(A)及びHCM(B)で培養された肝細胞様細胞の形態を示す。
【図39】研究デザインA及びB、図37及び実施例1、2及び表5に基づくHCMと比べて、VitroHES(商標)でのHNF4−アルファ、アルブミン、CYP3A4及びUGT2B7の相対的なmRNA発現レベルを示す。参照プロトコル(VitroHES(商標))からのデータは、1に設定され、HCM−培養基による異なる遺伝子の発現レベルの倍増加は、グラフに示される。
【図40】肝細胞様細胞を培養する培養基での増強剤及び誘導因子のための研究計画を示す。研究デザインC;50μmデキサメタゾンが、22−24日以後に加えられた。実験は、細胞株SA002、SA167及びSA348で行われた。研究デザインD;VitroHES(商標)培養基が、別の5日間、HGF及びナトリウム酪酸塩(NaB)で補充されるHCM−培養基に、21日後に交換された。
【図41】研究デザインC、図40及び実施例1、2、3及び表6に基づいて、VitroHES(商標)(A)及び50μmデキサメタゾンで補充されるVitroHES(商標)(B)で培養された肝細胞様細胞の形態を示す。同じく、研究デザイン D、図40及び実施例1、2及び表7に基づいて、C)VitroHES(商標)、HGF及び酪酸ナトリウムで補充されるD)HCMで培養された肝細胞様細胞。
【図42】A)研究デザインC、図40及び実施例1、2、3及び表6に基づいて、50のμmデキサメタゾン処理の後の肝細胞様細胞でのHNF4−アルファ、アルブミン、CYP3A4及びUGT2B7の相対的なmRNA発現レベルを示す。B)研究デザインD、図40及び実施例1、2及び表7に基づく、酪酸ナトリウム及びHGF処理後の相対的mRNA遺伝子発現レベルを示す。参照プロトコル(VitroHES(商標))からのデータは、1に設定され、異なる処理による異なる遺伝子の発現レベルの倍増加は、グラフに示される。
【図43】培養基置換頻度、希薄及び頻繁な培養基置換のための研究計画を示す。HCM及びVitroHES(商標)が使われた。
【図44】研究デザインE、図43及び実施例1、表8に基づく、希薄な(A)対頻繁な(B)培養基置換後の肝細胞様細胞の形態を示す。
【図45】研究デザインE、図43及び実施例1、表8に基づく、頻繁な培養基置換と比較したまれな培養基置換後のHNF4−アルファ、アルブミン、CYP3A4及びUGT2B7の相対的なmRNA遺伝子発現レベルを示す。頻繁な培養基置換からのデータは、1に設定され、まれな培養基置換後の異なる遺伝子の発現レベルの倍増加は、グラフに示される。
【図46】96−ウェルにコーティングされるコラーゲンIに38日旧肝細胞様細胞を再接種後の3日(A)から6日(B−C)まで。肝細胞様細胞の外植体は、再接種する前に、Ca及びMg−フリーPBS(A)またはコラゲナーゼ(B−D)に処理された。培養物は、肝細胞マーカーCK18(B,D)及びHNF3ベータ(C)のために、二倍染色される。図尺度:100μm(A)及び50μm(B−C)。実験的な詳細のために、実施例15を参照。
【図47】(A−C及びG−I)及びmEF−細胞層(D−F及びJ−L)96−ウェルにコーティングされるコラーゲンIに再接種の5日後、肝芽細胞様細胞の免疫細胞学及び形態を示す。培養物は、肝芽マーカーHNF4アルファ(A、B、D、E)及びCK19(G、H、J、K)のために染色された。核染色のためのDapiを有するマーカーのオーバレイ図は、B、E、H及びKに示される。各々の染色のための対応の形態図は、C、F、I及びLでそれぞれ見られる。図Cの矢印は、重核細胞を示す。図尺度:25μm;40x対物レンズが使われた。実験的な詳細のために、実施例18を参照。
【図48】30日の旧培養における肝細胞様細胞のICG摂取を示す。
【図49】15日の旧培養での肝芽を示す。細胞は、CK19(A)、CK7(B)及びEpCam(C)に陽性である。
【発明を実施するための形態】
【実施例1】
【0136】
出発物質
本発明のための出発物質は、例えば未分化のhBS細胞株のような最適に多能性未分化のhBS細胞である。前記材料は、Cellartis社から得られることができ、さらにNIH幹細胞レジストリを通して入手できる。http://stemcells.nih.gov/research/registry/。Cellartis ABは、2種のhBS細胞株(SA001及びSA002)を有し、SA002(SA002.5)の1つのサブクローンがNIHを通して入手できる。加えて、20のCellartis細胞株は英幹細胞バンクにリストされる。それらのhBS細胞株及び加えて、Cellartis社からのSA167及びSA348が、本願発明において多用された。出発物質として推薦されるhBS細胞の特性は、以下である:アルカリホスファターゼ、SSEA−3、SSEA−4、TRA 1−60、TRA 1−81、Oct−4の陽性反応、SSEA−1の陰性反応、テロメラーゼ活性、及びインビトロ及び体内の多分化能(後者は免疫不全マウスの奇形腫形成によって示される)(図1を参照)(方法及びプロトコルはすでに開示された。ハインズその他、国際公開WO03055992)。
【0137】
LOT調製及び特性解析プログラム
hBS細胞株のLOT調製は、標準化された方法に基づくhBS細胞の培養拡張及び、次の1つの単一通過での100本以上のストローの冷凍を構成する(出願中の特許国際公開WO2004098285)。hBS細胞株の形態は、冷凍の前後、更に、LOTからの細胞の解凍後の次の培養における連続的な継代でモニタされる。LOT冷凍の品質は、解凍回復率の検査によって確認され、それは、10解凍の各ストローのための100%の解凍速度を示す。すなわち、細胞材料は、解凍時に各々のガラス化ストローから二次培養されることができる。微生物学的に安全に関する安全試験は、細胞に汚染がないかを確認するために、それから細胞及び冷凍継代での培養基に実行される。実行される特性解析プログラムは、hBS細胞株の分化状態を確認するために方法の幅広い範囲を含む。最初に、未分化の細胞(SSEA−1、SSEA−3、SSEA−4、TRA−1−60、TRA−1−81、Oct−4及びALP)のための一般に認められたマーカーのマーカー発現分析が、実行される。継代全体における細胞の遺伝子安定性及び冷凍−解凍サイクルは、染色体分析及びFISHで点検される。テロメラーゼ活性は、Telo TAGGG テロメラーゼ PCR ELISAPLUSキットを使用して測定される。hBS細胞の多分化能は、胚様体ステップによる試験管内分化及び、免疫不全SCIDマウスの腎臓被膜でのhBS細胞の移植による体内分化によって調べられる。
【0138】
ここで用いられる出発物質は、さらに、完全に異種動物由来成分不含であってもよく、それによって、異種動物由来成分不含肝細胞様細胞は、再生医療の潜在的使用のために得られて、したがって、組織不適合性及び人間外の病原体の潜在的転送の危険度をかなり減少させる。hBS細胞の異種動物由来成分不含由来のために、全ての培養基及びマトリックス構成要素、フィーダ細胞及び使用する他の材料は、いかなる人間以外の動物材料に由来、または接触してはならない。hBS細胞の異種動物由来成分不含由来のための適切な構成要素及び、異種動物由来成分不含肝細胞様細胞は、異種動物由来成分不含のヒト線維芽細胞であり、それは、例えばヒト包皮線維芽細胞、ヒト組み換え型成長因子を有する培養基ベース無血清またはヒト血清、分化因子および/または潜在的他の添加物、及び細胞の培養及び分離のための殺菌メカニカル道具またはヒト組み換え酵素である。
【実施例2】
【0139】
肝細胞様細胞を得るためのプロトコル
内因子プロトコル(分化は、培養基に分泌される内因子への暴露によって誘導される)
a)IVF培養皿(ファルカン)でのmEF細胞層で育てられるhBS細胞は、肝細胞様細胞を得るために、37度、5%のCO2及び95%の湿度の下で最高40日間分化させられる。使用する培養基(4ng/mlの加えられるヒト組み換え型bFGF [インビトロゲン]を有するVitroHES(商標)[ Vitrolife AB ])は、おおよそ1から2mlの旧培養基を放棄し、1から2mlの新しい培養基に加えることによって、7日及び21日ごと、通常14日ごとに変えられる。18日から30日後に、肝細胞様細胞は、カット及び転送ツールとして鋭いミクロ毛細管またはStem Cell Tool(商標)(Vitrolife AB)を使用して培養から分離され、細胞はそれから長期保存(冷凍された)または即時利用のためにプールされるか、または培養皿に直接染色されるかまたは固定されるかまたは、例えばCyp活性分析の生体細胞として使用される。hBS細胞の分化がmEFS(例えばマトリゲル上のhBS細胞培養)の非存在下で徹底的に変更されるので、mEFSは肝細胞様細胞の発育を支える基本的信号を提供するようであり、少ない肝細胞様細胞が、その培養(データは示されてない)から得られることができる。これは、そのような培養物のためのmEF−馴化培地を用いて、培養基へのmEFsによる因子の分泌物を指定して部分的に救われることができる。従って、我々は、培養期間で培養基を二度以上に変えることは、肝細胞様細胞を得るための不利な点であることを観察した。肝細胞様細胞を得るための重要なもう一つの要素は、bFGFで培養基を補充することである。
【0140】
b)4ng/mlのbFGFで補充されるmEF馴化培地Matrigel(商標)(ベクトン−ディッキンソン)で育てられるhBS細胞は、肝細胞様細胞を得るために、37度、5%のCO2及び95%の湿度下で最大40日間、分化される。使用する培養基は、7日及び21日ごとの間で変えられる。18日から30日あとに、肝細胞様細胞は、カット及び転送ツールにとして鋭いミクロの毛細管またはStem Cell Tool(商標)を使用して培養物から分離され、細胞は、それから長期保存(冷凍された)または即時利用のためにプールされるかまたは、固定及び例えば免疫組織化学の特性解析のために使用される。
【0141】
肝細胞様細胞及び分化細胞集団を有する培養皿内の肝芽細胞様細胞の選択が手動で実行され、大部分は形態学に依存する。形態学は、主に免疫組織化学を使用する以前の経験及び完全な実験によって肝臓マーカー発現に関連づけられ、それは例えば実施例3から7までにリストされる。その経験で、熟練した人は、形態学によって能動的に肝細胞様細胞を選ぶことができる。
【0142】
肝芽細胞様細胞を得るために、同じプロトコルが使われるが、潜伏期間は、10日から20日間、好適には15日間短くなる。
【0143】
フィルタ培養
IVF皿内のmEFで5日から10日間培養された未分化hBS細胞(BE002.5継代42)は、小さい断片に切られ、ガラス毛細管を用いて、400μl培養基を含んでいる24−ウェルプレートのフィルタ挿入紙(孔サイズ:4μmの直径、外植体培養のために特殊化される、ミリポア)に移動される。フィルタは、培養基に細胞がおぼれることを妨げながら、細胞の栄養摂取を可能にし、水分環境をつくる培養基面と接触し、それによって、体内状況は、模倣される。培養基は、50%のVitroHES(商標)及び4ng/mlのbFGFで補充されるmEF内の未分化のhBS細胞からの50%の馴化培地を構成する。半分の培養基は、一日おき又は3日ごとに変えられる。細胞は、分析の前にそれぞれ7、14、21及び31日間分化する。3D−hBS細胞培養は、免疫組織化学によって分析される。培養物は、30%のサッカロースの低温保存の後に4%のPFAに取り付けられ、Sakura O.C.T. tissue−tekに組み込まれる。10μmのアールのクリオ切片は、異なる内胚葉の免疫反応性のマーカー及び肝細胞様マーカーために形態学的に分析される。
【0144】
共同培養プロトコル
マウス胚肝臓の器官形成は、三次元フィルタシステムの肝細胞様細胞へのhBS細胞分化を促進することができる。異なる発育的な段階におけるEGFP(強化された緑の蛍光タンパク質)トランスジェニック・マウス胚の肝臓外植体は分離され、フィルタシステムで培養されるhBS細胞に移植される。対照培養物として、hBS細胞のみ、または肝臓以外のマウス胚外植体(心臓及び卵黄嚢)は、hBS細胞に移植され、フィルタ上で培養された。共同培養物は、4ng/mlのbFGFで補充されるVitroHES(商標)で培養され、培養基の50%は、第2日又は第3日ごとに交換された。7日目及び14日目に、共培養が免疫組織化学分析のために用意された。HNF3ベータ、AFP、HNF4アルファ、CK18、CYP3A4/7及びCYP1A2/1のような内皮性及び肝臓マーカーが分析された。
【0145】
内胚葉由来構造の量または数は、4つのカテゴリ、即ち小さいクラスタ、大きいクラスタ、ダクト及びライニング、皮覆組織(下の定義を見る)に分けられた。皮覆組織を除いて、構造は内胚葉及び初期の肝臓マーカーAFP、HNF3ベータ及びアルファ−1−抗トリプシンeに陽性だった。異なる構造の数は、各々の断面及び培養物のために計数された。各々の構造の総数が、各々の共培養のために計数された断面の数に割られた。これは、構造が断面につきどれくらいよく起こっているかを測定する数値をもたらし、三次元hBS細胞共培養での内胚葉構造の数量の表示を与える。平均値及び各グループ(n=3)の平均(SEM)の標準エラーが算出された。研究は、二回繰り返された。
【0146】
小さいクラスタが、AFPに陽性である5つの細胞より少ないかまたは同じ数の集合として定義された。大きいクラスタは、AFPに陽性である6つの細胞より多いかまたは同じ数の集合として定義された。ダクト及びライニングは、単一またはマルチ層中空構造として定義される一般的なカテゴリを形成した。皮覆組織は、細胞のAFP陽性ライニングまたはクラスタと関連する堅い列の細長い核を有する有機物化される構造として定義された。皮覆組織は、AFPに決して陽性でない。14日目において、ダクト及びライニングが単にマウス胚外植体移植片を含むグループに存在する場合、全てのグループは、小さいクラスタの類似した量を現し、それで、自発的に分化するhBS細胞は、ダクト及びライニングを形成する傾向ではなかった。しかし、大きいクラスタは、卵黄嚢及び心臓共培養と比較してよりよく肝臓共培養で発生し、自発的に、hBS細胞を分化させた。組織、例えば大きいクラスタ及びダクトは、例えばHNF3ベータ、AFP、アルファ−1−抗トリプシン、Hnf4アルファ、CYP3A4/7及びCYP1A2/1のような内胚葉及び肝臓マーカーに陽性であった。しかし、クラスタは未成熟肝細胞様細胞を潜在的に示しているCK18に陰性であった。
【0147】
全体的に、データは、hBS細胞が単独より肝臓との直接の接触時に、E10.5マウス胚から肝芽細胞様細胞または肝細胞様細胞により有効に分化させることができることを示す。
【0148】
表1は、E10.5胚マウス肝臓のhBS細胞の共培養の14日後に、免疫組織化学によって分析される肝臓マーカーの一覧を示している。
【0149】
【表1】
【実施例3】
【0150】
肝臓マーカーによる特性解析(図2、3及び4を参照)
肝細胞様細胞は、肝細胞の典型的な形態学を表示する。すなわち、それらは多角形の細胞形状、大きい細胞直径(凡そ25−50μM)を有し、よく核を二つもち、脂肪顆粒を蓄積する傾向がある。さらに、それらは肝臓細胞型のために記載されるいくつかのマーカー、例えばアルブミン、アルファ1−抗トリプシン、LFABP、CK18及びHNF3ベータを表示する。それらは未分化の細胞のために使われる幹細胞マーカーであるOct−4をもはや表示しない。おそらくいくつかの未成熟肝細胞様細胞は依然として胎児の肝臓マーカーAFPを表示する。これらの細胞は、優先して分化hBS細胞のコロニーで見つかる。細胞核を視覚化する対照としてのDAPI(4’,6’−diamidino−2−phenylindole dihydrochloride hydrate. Sigma Aldrich)。(マトリゲル(商標)で分化された肝細胞様細胞のCK18発現のために図22を参照。)
【0151】
繁殖的な肝芽細胞様前駆細胞の識別のために、AFP、HNF4アルファ、CK19、CK7及びEpCamが、使われた。(図49)
【0152】
使用された一次抗体:
アルブミン(ウサギ)1:500、DAKOCytomation、A0001
AAT(ウサギ)1:200、DAKOCytomation、A0012
CK18(マウス)1:200、DAKOCytomation、M7010
LFABP(ヤギ)1:500、サンタクルーズ、sc−16064
HNF3b(ヤギ)1:250、サンタクルーズ、sc−6554
Oct−4(マウス)1:500、サンタクルーズ、sc−5279
c−Met(HGF受容体(マウス))1:100、upstate、05−237
アルファ6−インテグリン(CD49f(ラット))1:250、BD バイオサイエンス、555736
ICAM−1(CD54(マウス))1:500、BD Pharmingen、559047
AFP(マウス)1:200、SIGMA、A8452
HNF4アルファ(ウサギ)1:400、サンタクルーズ、sc−8987
CK19(マウス)1:200、Novocastra、NCL−CK19
CK7(マウス)1:200、Novocastra、NCL−L−CK7−560
EpCAM−FITC(1:200)GeneTex社 GTX28666
【0153】
使用された第2の抗体:
−donkey anti−goat−Alexa 488、1:500、Molecular Probes、# A−11055
−donkey anti mouse−Cy3(1:1000)Jackson Immuno Research #715−165−151
−donkey anti−mouse−Cy2(1:100)Jackson Immuno Research #715−225−151
−donkey anti−rabbit−Alexa488(1:1000)Molecular Probes #A−21206
−donkey anti−rabbit−Alexa594(1:1000)Molecular Probes #A−21207
−donkey anti−rat−Cy3(1:500)Jackson Immuno Research #712−165−153
−donkey anti−rat−Cy2(1:100)Jackson Immuno Research #712−225−153
【0154】
免疫染色プロトコル:
アルブミン、AAT、CK18、HNF3b、Oct−4、CK19、CK7、AFP:
4%PFAに15分凝固し、2回PBS洗浄し、0,1% PBTの5%FBSに30分入れ、一次抗体を0.1%PBTの1%FBS中で4℃で一晩培養させ、二次抗体を0.1%PBTの1%FBS中で常温で3時間培養させ、全ては0.1%PBT、0.05mg/mlのDAPIの中で常温で5分間洗浄され、DAKOCytomation封入剤のなかで組み込まれる。
【0155】
LFABP、c−Met、アルファ6−インテグリン、ICAM−1、CXCR4:
4%PFAに15分凝固し、2回PBS洗浄し、PBS内の5%FBSに30分入れ、一次抗体をPBTの1%FBS中で4℃で一晩培養させ、二次抗体をPBTの1%FBS中で常温で3時間培養させ、全ては0.05mg/mlのPBS、DAPIの中で常温で5分間洗浄され、DAKOCytomation封入剤の中で組み込まれる。
【0156】
EpCam:
4%PFAに15分凝固し、2回PBS洗浄し、0,1%PBTの5%FBSに30分入れ、0.1%PBTの1%FBS中で4℃で一晩培養される一次抗体を直接活用するFITC、0.05mg/mlのPBS、DAPIの中で常温で5分間洗浄され、DAKOCytomation封入剤の中で組み込まれる。
【実施例4】
【0157】
特徴描写
フェーズI代謝酵素:
肝細胞様細胞は、以下のCypsの免疫反応性を表示する:1A2、2A6、2B6、2C8/9/19(3つの亜類型間の潜在的抗体交差反応)、2D6、2E1、3A4/7(2つの亜類型間の潜在的抗体交差反応)。(mEFに分化される肝細胞様細胞は図5−11を参照、マトリゲル(商標)で分化された肝細胞様細胞でのCyp1A2及びCyp2B6発現は、図22を参照)。Cyp発現誘導性は、25μMリファムピン、20μMデソキシフェノバルビタール(プリミドン)、100μMデキサメタゾン、88mMのエタノール、25μMオメプラゾール及び100μMイソニアジドを含むCyp誘導混合物に96時間の暴露の後に見られた。(mEFでの肝細胞様細胞のCyp 1A2及び2B6の誘導について、図24及び25を参照)CypsはさらにHepG2内で免疫組織化学的に分析された。それは、いかなる反応も引き起こさなかった(図31を参照)。
【0158】
使用された一次抗体:
Cyp1A2(ウサギ)1:100、biomol、CR3130;
Cyp2A6(ウサギ)1:100、biomol、CR3260;
Cyp2B6(ヒツジ)1:100、biomol、CR3295;
Cyp2C8/9/19(ウサギ)1:100、biomol、CR3280;
Cyp2D6(ヒツジ)1:100、biomol、CR3245;
Cyp2E1(ウサギ)1:100、Chemicon、AB1252;
Cyp3A4/7(ヒツジ)1:100、biomol、CR3345;
Cyp2E1(ウサギ)1:1000、Oxford Biomedical Research、PA26;
Cyp3A4/7(ウサギ)1:1000、Oxford Biomedical Research、PA32。
【0159】
使用された第2の抗体:
−donkey anti−goat−Alexa 488, 1:500, Molecular Probes, # A−11055
−donkey anti mouse−Cy3, 1:1000, Jackson Immuno Research, #715−165−151
−donkey anti−mouse−Cy2, 1:100, Jackson Immuno Research, #715−225−151
−donkey anti−rabbit−Alexa488, 1:1000, Molecular Probes, #A−21206
−donkey anti−rabbit−Alexa594, 1:1000, Molecular Probes, #A−21207
−donkey anti−rat−Cy3, 1:500, Jackson Immuno Research, #712−165−153
−donkey anti−rat−Cy2, 1:100, Jackson Immuno Research, #712−225−153
−donkey anti−sheep−Alexa488, 1:1000, #A−11015
−donkey anti−sheep−Alexa594, 1:1000, #A−11016
【0160】
免疫染色プロトコル:
4%PFAに15分凝固し、2回PBS洗浄し、0,1%PBT内の5%FBSに30分入れ、
一次抗体を0.1% PBTの1%FBS中で4℃で一晩培養させ、二次抗体を0.1%PBTの1%FBS中で常温で3時間培養させ、全ては0.1% PBT、0.05mg/mlのDAPIの中で常温で5分間洗浄され、DAKOCytomation封入剤の中で組み込まれる。
【0161】
ウエスタンブロット法:
Cyp1A2及び3A4/7発現は、ウエスタンブロット法(図12を参照)において確認された。Cyp誘導剤処理で、1A2及び3A4及びまたは3A7のタンパク質量(潜在的交差反応)は、非処理及び誘導の細胞からのタンパク質バンドに比べて肝細胞様細胞の誘導性の視覚化を明らかに強化した。タンパク質は、M−PERタンパク質摘出試薬(ピアス)を使用して細胞から抽出され、1:100プロテアーゼ抑制剤カクテル(シグマ−アルドリッチ)で補充される。タンパク質は、電気泳動法によって12%のSDSポリアクリルアミドゲルで分離され、ニトロセルロース膜組織に変えられる(Biorad、ヘラクレス、CA)。免疫ブロット法のために、(Cyp1A2(ウサギ)及びCyp3A4/7(ウサギ)、両方ともBiomolから)に対する一次抗体は、1%のBSAブロッキングバッファーに希釈された。二次抗体は、対応HRP−共役抗体であった(それぞれヤギ抗ウサギ、ヤギ抗マウス及びウサギ抗ヤギ(1:2000; DAKO、Glostrup、デンマーク))。強化化学ルミネセンス(ECL)が、製造業者の指示(Amersham、Piscataway、NJ)によって使われた。HepG2細胞が、陰性対照として使われた。一次ヒト肝細胞(インビトロ テクノロジーズ、ライプツィヒ、ドイツにおいて)が、陽性対照として使われた。
【0162】
追加的な実行において、Biomol(ウサギpAb、CR130))からのCyp1A2特定抗体が、使われた。誘導及び非処理のSA002、LOT AL002及びSA167、LOT AL002、に進行された結果は、両方のhBS細胞由来肝細胞様細胞集団に特定のCyp1A2反応を示す(弱いにもかかわらず)(図27を参照)。
【0163】
Cyp活性分析(図13、30及び32を参照):
PROD分析は、96時間のCyp誘導混合物との処理においてPROD活性の強い誘導、および非処理の肝細胞様細胞で構造性PROD活性を示した。さらに、EROD分析は、特定の構造性及び誘導可能性Cyp 1A2活性を示して実行された(図30を参照)。両方の分析は、初代肝細胞と同程度の誘導活性を示し、さらに、hBS細胞由来肝細胞様細胞におけるいかなる誘導の前に、基礎発現が、弱いけれども、実際にはあった。
【0164】
カクテルは、25μMリファンピシン、20μMデソキシフェノバルビタール(プリミドン)、100μMデキサメタゾン、88mMエタノール、25μMオメプラゾール及び100μMイソニアジドを含んでいる。PROD(ペントキシレゾルフィン)は一般のCyp活性分析であり、EROD(エトキシレゾルフィン)はCyp1 A2に特有である。PRODまたはEROD貯蔵液(Sigma Aldrich,Cat. No.77105及び46121それぞれからの製品)は、2mMの濃度でDMSOにおいて準備される。細胞は、各種の誘発因子で96時間誘導されるかまたは対照として処理しないまま放置する。分析を実行する前に、細胞はPBSによって慎重に二回洗われ、誘発因子の残余量を洗い落とすために、新しいPBSで15−30分間培養される。細胞は、37℃の暗い環境で60分間、PBS内の25μMのPRODまたはPBS内の50μMのERODによって培養された。それから、細胞はPBSによって再び二回洗われ、顕微鏡の下で分析された。
【0165】
Cyp3A4、3A7、1A1、1A2及びCyp2A6の相対的な遺伝子発現レベルが測定され、肝細胞様細胞、HepG2及びヒト肝エキスの誘導及び非誘導培養物でのリアルタイムPCR技術によって比較される。ヒト肝エキスの測定は、1にセットされ、他の全てのサンプルは、各シトクロムp450のためのヒト肝臓参照に関連した。全ての遺伝子の発現は、GAPDH(CYP1A1/1A2、CYP2A6)又はTBP(CYP3A4/3A7)に対して正常化される。図36を参照。
【実施例5】
【0166】
特徴描写:
フェーズII代謝酵素:
肝細胞様細胞は、GST A1−1の強い免疫反応性及びGST M1−1の弱い免疫反応性を表示する。胎児のGST P1−1の免疫反応性は、ほとんど示されなかった(mEFで分化される肝細胞様細胞について図14を参照)。さらに、肝細胞様細胞は、UGT 1A1及びUGT 1A6のための免疫反応性を示す(図17を参照)。誘導剤処理で、わずかな誘導が、GST A1−1のために観察されたが、GST M1−1またはGST P1−1のためのはっきりした誘導はなかった。(マトリゲル(商標)に育てられた肝細胞様細胞でのGST A1−1発現は、図22を参照。)
【0167】
使用された一次抗体:
GSTA1−1(ウサギ)1:500、オックスフォード生医学研究、GS62;
GST M1−1(ウサギ)1:500、オックスフォード生医学研究、GS67;
GST P1−1(ウサギ)1:500、オックスフォード生医学研究、GS72;
UGT 1A1(ウサギ)1:500、BD バイオサイエンス、458411;
UGT1A6(ウサギ)1:500、BD バイオサイエンス、458416。
【0168】
使用された第2の抗体:
−donkey 抗ウサギ−Alexa488、1:1000, Molecular Probes(#A−21206)
−donkey 抗ウサギ−Alexa594(1:1000),Molecular Probes, #A−21207
【0169】
免疫染色プロトコル:
4%PFAに15分凝固し、2回PBS洗浄し、0.1%PBS内の5%FBSに30分入れ、一次抗体をPBTの1%FBT中で4℃で一晩培養させ、二次抗体を0.1%PBTの1%FBS中で常温で3時間培養させ、全てが0.05mg/mlのDAPI 、0.1%PBTの中で常温で5分間洗浄され、DAKOCytomation封入剤の中に組み込まれる。
【0170】
ウエスタンブロット法:
ウエスタンブロット法分析が、BS細胞株SA002.5(LOT BE002.5)、SA167(LOT CE167)(図15を参照)及びSA002(LOT AL002)(データが示されてない)からの肝細胞様細胞でGST A1−1(25kDa)発現を確認する。より胎児性GST亜類型GST P1−1(25kDa)のための発現は、ウエスタンブロット法によって検出されなかった。ヒトGSTsを共起表現するV79細胞からの細胞溶解物が、陽性対照として使われた。B−アクチン(42kDa)が、内部積載対照として使われた。GST A1−1またはGST P1−1の発現が、株SA002またはSA002.5からの未分化hBS細胞において検出されることができなかった。
【0171】
タンパク質は、1:100のプロテアーゼ抑制剤カクテル(シグマ−オールドリッチ)で補充され、M−PERタンパク質摘出試薬(ピアス)を使用して細胞から抽出された。タンパク質は、電気泳動法によって12%のSDSポリアクリルアミドゲルに分離され、その後、ニトロセルロース膜(Biorad、ヘラクレス、CA)へ変えられた。免疫ブロット法のために、GST A1−1及びGST P1−1(1:1000)に対する一次抗体が、1%のBSAブロッキングバッファーにおいて希釈された。二次抗体は、対応HRP−共役抗体であった(ヤギ抗ウサギ、ヤギ抗マウス及びウサギ抗ヤギそれぞれ、1:2000(DAKO、Glostrup、デンマーク))。強化された化学ルミネセンス(ECL)が、製造業者の指示(Amersham、Piscataway、NJ)によって使われた。一次ヒト肝細胞(インビトロ テクノロジーズ、ライプツィヒ、ドイツ)及びGSTタンパク質調製が、陽性対照として使われた。
【0172】
GST活性分析(図16を参照):
1−クロロ−2,4−ジニトロベンゼン(CDNB)へのGST触媒活性が、Habigとその他、1974の分光測光法の分析を使用して決定された。CDNB(1−クロロ−2,4−ジニトロベンゼン)は、一般のGST参照培養基(Mannervik 1988)である。反応混合は、85μlの0.1Mのリン酸カリウム(pH 6.5)、2.5μlの0.2MのGSH、2.5μlの20mMのCDNB及びM−PER渙散バッファ内の10μlのタンパク質溶解物から構成されていた。タンパク質なしで、10μlのM−PER渙散バッファとの完全な分析混合が、対照として使われた。340nm及び30℃の吸光度が、フィリップスPU8720 UV/VIS走査型分光光度計を使用して1分間モニタされた。CDNBへのGST触媒活性が、hBS細胞株SA002(LOT AL002)SA002.5(LOT BE002.5)及びSA167(LOT CE167)及びヒト初代肝細胞培養物に由来した肝細胞様細胞、およびHepG2培養物において検定された。hBS由来肝細胞様細胞が、ヒト初代肝細胞に類似したGST−活性及びHepG2培養より本質的に高いGST活性レベルを示した。図16を参照。
【実施例6】
【0173】
特徴描写:
薬物輸送体
免疫組織化学:
肝細胞様細胞は、トランスポータMRP2、BSEP、及びOATP−2および/またはOATP−8のための免疫反応性(潜在的抗体交差反応)を示す(図18、19、20を参照)。BSEPが肝芽細胞様細胞及び肝細胞様細胞より小さい集団だけにおいて表示される時、OATP−2/8及びMRP2が、大多数の肝細胞様細胞において表示されるようである。
【0174】
使用された一次抗体:
MRP2(ウサギ)1:50、サンタクルーズ、sc−20766;
BSEP(ヤギ)1:50、サンタクルーズ、sc−17292;
予め希釈されたOATP−2(マウス)、Progen Biotechnik社、クローンmMDQ
【0175】
使用された第2の抗体:
−donkey anti−goat−Alexa 488、1:500、分子の調査、# A−11055
−donkey anti mouse−Cy3,、1:1000、Jackson Immuno Research #715−165−151
−donkey anti−mouse−Cy2, 1:100, Jackson Immuno Research, #715−225−151
−donkey anti−rabbit−Alexa488, 1:1000, Molecular Probes, #A−21206
−donkey anti−rabbit−Alexa594, 1:1000, Molecular Probes, #A−21207
−donkey anti−rat−Cy3, 1:500, Jackson Immuno Research, #712−165−153
−donkey anti−rat−Cy2, 1:100, Jackson Immuno Research, #712−225−153
−donkey anti−sheep−Alexa488, 1:1000, #A−11015
−donkey anti−sheep−Alexa594, 1:1000, #A−11016
【0176】
免疫染色プロトコル:
MRP2,OATP−2:
4%PFAに15分凝固し、2回PBS洗浄し、0.1%PBT内の5%FBSに30分入れ、一次抗体を0.1%PBTの1%FBS中で4℃で一晩培養させ、二次抗体を0.1%PBTの1%FBS中で常温で3時間培養させ、全ては0.05mg/mlのDAPI 、0.1%PBTの中で常温で5分間洗浄され、DAKOCytomation封入剤の中で組み込まれる。
【0177】
BSEP:
4%PFAに15分凝固し、2回PBS洗浄し、0.1%PBS内の5%FBSに30分入れ、一次抗体をPBSの1%FBS中で4℃で一晩培養させ、二次抗体をPBSの1%FBS中で常温で3時間培養させ、全ては0.05mg/mlのDAPI 、PBSの中で常温で5分間洗浄され、DAKOCytomation封入剤の中で組み込まれる。
【0178】
MRP2遺伝子発現の分析(図23を参照)
肝細胞様細胞でMRP2発現は未分化細胞での発現と比較してそれぞれ11から32倍高い。
【0179】
完全RNAは、GibcoからのTrizol Reagentを使用して、肝細胞様細胞(SA002.5、LOT BE002.5継代2、mEFでの21日分化後)及び、未分化hBS細胞(SA002.5、LOT BE002.5継代24、5日目(対照サンプル1)及びSA002、LOT BE002、継代62、4日目(対照サンプル2))から抽出された。5μgの完全RNAが、Supercript IIキット(インビトロゲン社)を使用して、デオキシリボヌクレアーゼ(インビトロゲン社、ペイズリー、英国)による処理の後に相補型DNA(cDNA)に逆転写された。トランスポータのための遺伝子特有プライマー及び調査が、プライマー3ソフトウェア・プログラム及びNetprimerを使用して考案された。200ngのcDNAが、SensiMix Sybr Green Mix, ( 1.5mMの最終的なMgCl2);(Celtic Diagnostics)、0.7ユニットAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ)、300nMの遺伝子特有の前方及び後方のプライマーに適切な遺伝子のためのプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって詳しく説明される。使用するプライマー・シーケンスは、前方:tgcagcctccataaccatga及び、後部:ggacttcagatgcctgccaである。PCRは、50度で2分間、95度で10分間、最初工程のCorbett Rotorgeneで実行され、そのあと95度で15秒及び62度で60秒を40回実行される。各々のサンプルのPCR拡大は、ピペット操作エラーを最小にするために重複に実行された。ノー・テンプレート対照が、陰性対照として各々の実行のために含まれた。各々のサンプルのためのCt値は、記録され、各々のサンプルのための相対的な遺伝子発現が、2△(40−Ct)を使用して、標準のABIプロトコルを使用して算出された。90%効率の推測下の相対的な発現が最も低いサンプルをゼロにセットすることによって推定された。
【実施例7】
【0180】
PAS陽性による細胞のグリコーゲン貯蔵発見(過ヨウ素酸染色シッフシステム、SIGMA−ALDRICH、Cat−no.395B)
肝細胞様細胞が、PAS陽性方法によって検出されるグリコーゲンを保存する(図21を参照)。技術的な陰性対照として、唾液処理された培養物は、培養物の95−99%でグリコーゲン発見の減少を証明した。ブドウ糖余剰がある限りグリコーゲン合成及び貯蔵は人体の多数の細胞型の一般的な機能ある。しかし、肝細胞及び骨格の筋肉は、グリコーゲンを保存する際に特に特殊化される。肝細胞様細胞を選ぶかまたは取り除く前の分化hBS細胞培養において、グリコーゲンを保存する他の細胞集団が、観察され、同じく、グリコーゲンを保存することができない、いくつかの集団も観察される。重要なことに、グリコーゲンを保存しいない培養物の非肝細胞様細胞がある。細胞は、メタノールに希釈される4%のパラホルムアルデヒドに室温で、15分間、取り付けられ、その後、3回をPBSで洗われた。技術的陰性対照として、培養物は室温で、20分間、ヒト唾液で処理され、その後、PBSで洗われた。ヒト唾液は、グリコーゲンを消化するα−アミラーゼを含む。アルデヒドにグリコールを酸化する過沃素酸が処理及び非処理の培養物に5分間室温で、加えられ、PBSにおける繰り返し洗浄が続いた。その後、培養物は室温で、15分間、シッフ試薬で培養され、パラローズアニリン及び異性重亜硫酸ナトリウム間の反応を可能にし、グリコール含有する細胞コンパートメントを明るいピンクに染色するパラローズアニリン製品を作り出す。PBSで洗った後に、細胞は、室温で、90秒間、ヘマトキシリンで対比染色され、マウンティング培養基に取り付ける前にH2Oにおいてすすがれた。ヘマトキシリンは、細胞(青っぽい)の核を染色する。
【実施例8】
【0181】
遺伝子の分析
重要な特定の遺伝子を分析するさらなる別の方法、例えば、下記の物質は量的PCR(QPCR)を用いている。そのような措置は以下の通りである:第1の適切な遺伝子が選ばれ、それらの遺伝子と相補的にマッチするプライマーが考案され、定量化がPCR分析によって行われ、重要な遺伝子の発現レベルがハウスキーピング遺伝子、分化の間に下方対照する遺伝子と比較される(分化の間に安定して表示されることが公知の場合)。いくつかのhBS細胞株の分化の間に、下方対照される適切な遺伝子の実施例は、Cripto、Nanog及びOct−4である。
【0182】
hBS細胞由来肝細胞様細胞は、例えばマイクロアレイ、microfluidityカードまたは遺伝子の適切な選択を有する遺伝子チップのような、従来の技術によって遺伝子レベル(mRNA発現レベル)で、更に特徴描写されてもよい。例えば下記の表(表1)にリストされる。サンプルの完全RNAに由来されるcDNAは、例えばmicrofluidityカードと交雑され、実験は、PCRセットアップに入り、更に、適切なソフトウェアを使用して分析される。
【0183】
【表2】
【0184】
誘発因子混合物で処理されるかまたは非処理である細胞株SA167、LOT CA167及びSA002、LOT AL002の未分化hBS細胞及び、2つの細胞株に由来する肝細胞様細胞は、インストラクタのマニュアル(Applied Biosystems 7900HT Micro Fluidic Card Getting Started Guide)及び以下の短縮プロトコルに従って、LDAチップ上で並行に繰り返し行われる。
【0185】
cDNAが、完全RNAから調製され、適切な濃度を達成するためにRNase/DNaseフリー水に希釈される(下記参照)。以下の構成要素が混合された:
cDNA(1−100 ng)、5μl
RNase/DNaseフリー水
TaqManの汎用PCR、45のμl
マスター混合物(2X)(50μl)
合計:100μl
【0186】
サンプルは、その後、LDAカードに載せられ(各々のサンプル混合物は、1サンプルにつき100ul及び170ng cDNAである)、遠心分離機で分離され、その後に、LDAカードは密閉された。最後に、マニュアルの説明に基づいて、カードはABI 7900HTリアルタイムPCRシステムで実行され、結果はSDS 2.2.1ソフトウェア及び相対的な定量化方法を用いて分析される。
【0187】
hBS細胞−由来肝細胞様細胞から検出の肝臓タンパク質の概要(LDA分析またはQPCRによって)は、下の表3及び4に示される。
【0188】
【表3】
【0189】
【表4】
【実施例9】
【0190】
肝細胞様細胞の生物反応器培養物
hBS細胞及びそれの由来的細胞型、例えば肝芽細胞様細胞または肝細胞様細胞は、例えば人工中空ファイバー毛細血管膜によって区分される三次元スペースにおいて育てられてもよい。このシステムは、毛細管間のより大きい細胞集団へ細胞を成長させることを可能にし、培養基の潅流及び酸素類のガスによって最適化、天然環境を提供する。密閉生物反応器システムは、細胞(最高10^11細胞)を大量に生産し、細胞の機能的特性の保全を支えるために開発される。酵素潅流による細胞隔離が、密閉したGMPシステムで拡大された。細胞浄化が、例えば膜組織抗原発現に基づくFACソートまたは密度勾配培養基及び遠心分離を使用して、それから実行される。
【実施例10】
【0191】
尿素合成
尿素合成は、肝臓特定の特性であり、したがって、異なる細胞株から肝細胞様細胞へ分化する培養基の尿素濃度が、24時間潜伏の後、異なる時刻で測定された。培養基サンプルは、集められ、分析のために送られた。尿素分泌が、尿素/尿素窒素(ロシュ/日立)の運動UV検査法のためのキットを使用して分析された(Klinisk Kemi、C−研究室、Sahlgrenska大学病院、イェーテボリで)。
【0192】
血清/プラスマの期待値は、10−50mg/dL(1.7−8.3mmol/L)である。
【0193】
方法に従う尿素発見のための低いレベルは、0.8のmmol/Lであった。
【0194】
【表5】
【0195】
hBSC−由来肝細胞様細胞は、初代肝細胞と同様の濃度の培養基へ尿素を生産及び分泌する。十分に面白いことに、肝細胞様細胞が培養物内で現れてからおよそ20日後に、重要な尿素濃度のみが、測定されることができる。
【0196】
例えばアルブミン分泌に関する更なる機能的テストが、シュヴァルツとその他の2002及び2005にて説明したように、実行されることができる。肝細胞様細胞及び肝芽細胞様細胞の更なる機能的な特徴描写が、LDL摂取及び糖新生を実行する能力のために分析されることができた。
【実施例11】
【0197】
細胞極性及び機能性
サンドイッチ培養系が、更に細胞極性及び肝細胞様細胞の長期の機能性を改善することができる。そのような培養系において、肝細胞様細胞の埋め込みは、低いレベル酸性応力と別の肝臓体内を模倣する三次元環境提供する。それによって、肝細胞様細胞は有極性を示する。すなわち、アピカル側を有する上皮様組織(生体内胆汁側の方へ、疎水性)及び基底外側(生体内血液側の方へ、親水性)を形成する。サンドイッチ培養での肝細胞様細胞のもう一つの潜在的改良は、Cyp発現のより強い誘導性である。
【実施例12】
【0198】
免疫組織化学的ノッチ特徴描写:
IVF皿で育てられる培養hBS細胞は、室温で、15分間、4%のパラホルムアルデヒドに取り付けられた。細胞は、それから一次抗体によって一晩4℃で培養された(Notch2、1:200 サンタクル\ス、sc5545、USA)。その翌日、細胞は10分間二回1X PBSによって洗われ、1時間、室温の1X PBS内で第2抗体(抗ウサギ−FITC、1:500)によってその後に培養され、それぞれ5分間二度洗われ、5分間1μg/mlのDAPI溶液に暴露される。水でそれぞれ5分間二回細胞を洗った後に、それらは、アクアマウントに取り付けられ、蛍光性顕微鏡検査によって分析される。最近、未分化のhBS細胞がNotch2(Noggleとその他(2006))を表示することが示された。Cellartis hBS細胞株SA002において、大多数の細胞は、分化の第1日にNotch2に弱陽性である。2週後に、Notch2は、肝細胞様および/または肝芽細胞様細胞のほんの少数のサブセットだけで見つかる。すなわち、肝臓形態学に似ている二核小体の細胞である(図35を参照)。
【実施例13】
【0199】
肝芽細胞様及び肝細胞様細胞の繁殖的状態が、実施例2の内因子プロトコルに基づいて、hBS細胞をそれぞれ14及び21日間培養することによって、試験された。分析の日、培養物は室温で15−20分間4%のPFAに取り付けられ、数回PBSで洗われ、PBSに希釈される0.1−0.5%のTritonX100において透過処理された。肝芽細胞様細胞のため、内胚葉/初期肝臓マーカーHNF4アルファ(ウサギpAb、サンタクルーズ、SC−8987、1:400希薄)が使われ、肝細胞様細胞のために、内胚葉/肝臓マーカーHNF3ベータ (Foxa−2)(IgG、サンタクルーズ、SC−6554、1.200希薄)が使用された。2つの肝臓様細胞集団の増殖を研究するために、抗体、Ki67(BD Pharmingen、#556003、1:500希薄)が、一晩冷蔵庫での培養に加えられる。いくつかの洗浄の後、第2の抗体が利用され、室温で2時間培養された。培養物が洗われ、DAPIは核を検出するために最後の洗濯に含まれた。HNF4アルファに陽性の肝芽細胞様細胞は、Ki67との共局所によって繁殖表示である(図28を参照)。肝細胞様細胞はKi67に陽性でなく、非繁殖細胞を示した。
【0200】
増殖能が肝細胞様細胞において誘導されることができたかどうか確認するために、培養基状況を変えるとともに、初代肝細胞の増殖を刺激する公知の成長因子を加えることによって、hBS細胞由来肝細胞様細胞の増殖誘導が、追加的に試験された。hBS細胞(細胞株SA002)は、先に述べた状況の下で17日間分化させられ、肝芽細胞及び肝細胞様細胞になる。培養基は、10%のFBS(または血清代替物)で補充されるウィリアムズ培養基E(シグマ、W−4128)、1%のPEST、1%のグルタマックス、1x ITS、0.25ng/mlデキサメタゾン、2%のDMSO、20ng/ml HGF、10ng/ml EGF、10ng/mlオンコスタチンM、10mMのニコチンアミド及び4ng/ml bFGFに変えられた。hBS細胞は、おおよそ5日ごとに変えられる培養基で、さらに5−15日間育てられた。細胞の増殖能は、その後で、上記通りの追加的な11日以後に分析された。上記通りに補充されるウィリアムズE培養基で培養される時に、hBS細胞由来肝細胞様細胞は繁殖するが、4ng/mlのbFGFで補充されるVitroHES(商標)で育てられる肝細胞様細胞において増殖は検出されなかった(図29を参照)。したがって、もし適切な培養基で培養された場合、肝細胞様細胞は、増加する増殖能へ刺激されることができる。
【実施例14】
【0201】
96−ウェルプレートの肝細胞様細胞へのhBS細胞分化
4日間から5日間、前のhBS細胞は、小さい断片に手動で解剖され、マイトマイシンC−に処理され、96−ウェルコーティングされたmEFへ移動される。hBS細胞の2つから3つの断片が各々のウェルに加えられた。培養物は、4ng/ml bFGFで補充されるVitroHES(商標)において、37℃、5%のCO2及び95%の湿度で20−30日間培養された。10日目に、培養基の50%が、4ng/mlのbFGFで補充される新しいVitroHES(商標)と取り替えられ、20日目に、培養基の100%が取り替えられた。hBS細胞は、MEF−コーティング、IVF−皿で培養されたhBS細胞コロニーに類似するコロニーに分化され、例えば肝芽細胞様細胞は、HNF4アルファに免疫陽性反応であり、14日目あたりにコロニーの周辺に現れ、20日目の肝細胞様細胞に現れた。96−ウェルの80%が、このプロトコルを用いて20日目に肝細胞様細胞へhBS細胞を分化させることに成功した。
【実施例15】
【0202】
異なる表層への肝細胞様細胞の再接種
肝細胞様細胞の再接種の前に、96ウェルプレートのウェルが、異なるコーティングによって予めコーティングされる:ラットの尾からのコラーゲンI (BD Biosciences、#354236)、10%から100%の異なる濃度のマトリゲル(商標)(基底膜マトリックス、BD Biosciences、#356237)、または、mitocycin C処理のmEF細胞層。コーティングは、次のように実行された:コラーゲンIが96ウェルに加えられ、5%のCO2、30min−1hの95%湿度で37℃で培養される。コラーゲンIの余剰が廃棄され、ウェルは、その後いかなる酸性の酸性トレースも取り除くために二回PBSによって洗われた。ウェルは、20%のFCSで補充され、予め暖められた50−100μlのHCM−培養基で満たされた(HBM(商標)、Cambrexからのcc−4316BB、cc−4362BB、cc−4335BB、cc−4313BB、cc−4321BB、cc−4317BB、cc−4381BBのHCM(商標) SingleQoutsで補充されるcc−3199)。マトリゲル(商標)コーティングのために、マトリゲル(商標)の冷凍分割量が、冷蔵庫において一晩解凍された。マトリゲル(商標)は、10%から100%のマトリゲル(商標)を達成するためにHCM−培養基で希釈された。マトリゲル(商標)の異なる濃度は、96−ウェルに加えられ、30分間37℃で培養された。マトリゲル(商標)の余剰は、20%のFCSで補充されるHCM−培養基を加える前に廃棄された。25から38日までの古い培養範囲の肝細胞様細胞が、BDからのマイクロ外科用メスを用いてマイクロ解剖され、VitroHES(商標)培養基を含んでいる収集ディッシュへ幹細胞ナイフで移動される。領域を含んでいるミクロ解剖した肝細胞様細胞は、小さいクラスタを形成し、いくつかのプレートから集められた。クラスタは、37℃で10分間カルシウム及びマグネシウムなしのPBS、加熱プレートでのTrypLe Select(Gibco、#12563)で42℃で3−5分間、または37℃で5−15分間Collagenase IVによって、20%のFCSで補充されるHCM−培養基を含んでいる96−ウェルプレートの異なるコーティング上に再接種する前に処理される。一日以後、肝細胞様細胞を有するクラスタは、表層に付属し、表層上にクラスタから移り始めた。これは、肝細胞様細胞の全ての異なる種類のコーティング及び分離処理にとって真実だった。20%FCSで補充されるHCM−培養基は、無血清HCM−培養基に交換された。培養に、一日おきに、新しいHCM−培養基が提供された。数日後に、肝細胞様細胞は、ウェルを再接種した。肝細胞様細胞は、保持された肝臓典型的形態学を培養物で45日間キープした。大きい多角形及び複数核細胞(図46を参照)は、肝細胞マーカーHNF3ベータ及びCK18(図46)に陽性であった。
【実施例16】
【0203】
新陳代謝の肝細胞様細胞
異なる分化プロトコルによって得られるhBS細胞由来肝細胞様細胞は、誘発因子の非存在下でフェーズIシトクロムp450酵素、cyp1A2、cyp2C9及びcyp3A4にそれぞれによって、フェナセチン(アルドリッチ)、ジクロフェナック(SIGMA)及びミダゾラム(SIGMA)を新陳代謝させるその能力のために検査された。培養基へ放出されたそれぞれ物質の代謝物質が、LC−MSで測定された。細胞株SA002、SA002.5及びSA348からの肝細胞様細胞を含んでいる混合培養物が、26日から35日までに試験された。物質は、フェノールレッドなしの培養基、26μMフェナセチン、9μMジクロフェナク及び3μMミダゾラムの中でカクテルとして、6時間、12時間及び24時間、37℃で5%のCO2の条件下で培養された。各々の培養及び時刻からのサンプルはいかなる細胞残屑も取り除くために、集められ、高速で20分間遠心分離機で分離された。100μlの取り除かれた培養基サンプルは、96−ウェルプレートへ移動され、15μlのアセトニトリルは、各々のウェルに加えられた。LC−MSによって代謝物質測定が実行され、分析されるまで、サンプルは冷凍だった。
【0204】
液体クロマトグラフィ・システムは、HP1100シリーズLCポンプ及びHTS PAL注射器(CTC Analytics、Zwingen、スイス)と組み合わせであるカラムオーブン(Agilent Technologies、ドイツ、Waldbronn、ドイツ)から構成されていた。4−ヒドロキシジクロフェナック及び1−ヒドロキシミダゾラムのために、LC分離が、逆相HyPurity C18(2.1x50mm、5μm、ThermoQuest、ランコーン、英国)にHyPurity C18 precolumnとともに40℃で実行された。移動式フェーズは、以下から構成されていた:(A)0.1%の(v/v)ギ酸及び(B)アセトニトリルにおける0.1%の(v/v)ギ酸。有機条件剤含有量は、3分間に5から80%のBに、線形に増やされ、そして、0.2分間5%のBに戻る。
【0205】
パラセタモールのために、クロマトグラフィが、HyPurity C18 precolumnを有するZorbax Eclipse XDB−C8(4.6x150mm、5μm)上で、同じシステム及び移動式フェーズを使用して実行された。有機条件剤含有量は、5分間に2から30%のBに、線形に増やされ、そして2分間に30から80%まで増加し、その後0.1分間2%のBに戻る。4−ヒドロキシジクロフェナック、1−ヒドロキシミダゾラム及びパラセタモールのための保持時間は、それぞれ、2.9、2.4及び6.4分であった。発見は、電気スプレイ・インタフェース(Biosystems/MDS Sciex、コンコード、カナダ)を備えている3倍の四重極質量分析計API4000で実行された。450℃の4−ヒドロキシジクロフェナック及び550℃での1−ヒドロキシミダゾラム及びパラセタモール、ネビュライザー・ガスのための、ターボ・ヒーター温度で操作されるMSは、それぞれ、50、30、70及び、50であった(GS1)。ターボ・ガスはそれぞれ、50、60、70及び、70であり(GS2)、カーテン・ガスは、それぞれ20、20、10及び20であった。4−ヒドロキシジクロフェナックのための電気スプレイ電圧は、陰性モードの−3kVであり、1−ヒドロキシミダゾラム及びパラセタモールのための電気スプレイ電圧はそれぞれ陽性モードの5、3.5kVであった。
【0206】
衝突エネルギーは、それぞれ、−15、39及び21Vにセットされ、衝突活性化解離ガスは、それぞれ、5、7及び、5である。選択されるMRM移行は、4−ヒドロキシジクロフェナックは309.9>265.9であり、1−ヒドロキシミダゾラムは342.0>202.7で、パラセタモールは152.3>110.0である。200msの滞留時間が使われた。計測器対照、データ収集及びデータ評価が、Applied Biosystem/MDS Sciex Analyst 1.4ソフトウェアを使用して実行された。
【0207】
誘発因子の非存在下及び異なる世代の異なるhBS細胞由来肝細胞様細胞のCyp−活性
【0208】
【表6】
【実施例17】
【0209】
cyp活性の配合
体内の薬物代謝を予測するために、薬物代謝を分析するときに、肝細胞の範囲内のcyp−活性配合は欠かせない。hBSC−由来肝細胞様細胞のcyp−活性配合がどれくらいよくヒト肝細胞を反映させるかについて分析するために、薬品フェナセチン(26μM)ジクロフェナック(9μM)及びミダゾラム(3μM)、(それぞれcyp1A2、cyp2C9及びcyp3A4によって新陳代謝される)の混合が、細胞株SA348及びヒト初代肝細胞に由来した肝細胞様細胞に加えられた。薬品カクテルの12時間培養の後に、サンプルは、代謝物質のLC−MS発見のために集められた。サンプルは、前の実施例16に記載されている通りにLC−MSによって調製され、分析された。試験した3つの酵素システム間のcyp活性配合が、分析された。
【0210】
【表7】
【0211】
肝細胞様細胞のcyp活性配合は、ヒト初代肝細胞培養でのcyp活性配合と類似していた。
【実施例18】
【0212】
肝細胞様細胞の改良
hBSC−由来肝細胞様細胞を改善するために、リアルタイムPCR技術に基づく選別法が使われた。4つの遺伝子の相対的な発現レベル;HNF4アルファ、Cyp3a4、アルブミン及びUGT2B7が、肝細胞様細胞の改良を示した。Cyp3a4は、成人肝臓内で重要なシトクロムp450酵素である。それは、成人肝臓でのフェーズI酵素活性の60%を構成する。アルブミンは、成熟及び成人肝細胞に高く表示される。UTG2B7は、成人肝臓の重要なフェーズII酵素(グルクロノシルトランスフェラーゼ)である。Cyp3a4、アルブミン及びUTG2B7の上昇レベルが、改良され、成熟し、潜在的により機能的な肝細胞様細胞示す。HNF4アルファは、肝芽細胞様細胞の初期のマーカーである。HNF4アルファ遺伝子発現の上昇レベルは、肝芽細胞様細胞の増加数を示す。アルブミン、Cyp3A4及びUTG2B7の高水準及び、加えて、HNF4アルファの減少されたレベルは、HCLCの成熟した及びより機能的な集団を示す。
【0213】
異なるプロトコルからの細胞サンプルの完全RNA(詳細な説明のために下記を参照)が、Invitrogens Trizol方法を使用して抽出された。cDNAが、オリゴdT(oligo dT)を使用して完全RNAサンプルから作られた。その後、使用準備済のTaqmanプライマー、Applied Biosystemsからの標準プログラム及び装置を使用して、cDNAがリアルタイムPCR反応において拡大された。
【0214】
分析のために、PCR製品を検出するために必要なサイクル(CT−値)の数が、同じサンプルでのハウスキーピング遺伝子、GAPDHのCT−値に正常化された。正常化されたCT−値は、その後で、相対的な定量化(△△Ct方法)のために比較的Ct方法を用いて、各々の実験における対照サンプルの正常化されたCT−値と比較された。結果は、それからサンプルと同じ実験の対照サンプルとのフォールド変化として提示された。
【0215】
異なるパラメータ及び培養プロトコルが、肝細胞様細胞を改善するために合成された。異なる培養基が試験され、肝細胞様細胞は、培養でより長い時間キープされ、培養基置換の頻度は分析され、異なる成熟及び誘導因子が試験されたなどである。
【0216】
肝細胞様細胞へhBS細胞を分化させる参照プロトコル(実施例2に記載されている内容と類似する):
1日目
hBS細胞は、手動で断片に切断され、4ng/mlのbFGFで補充されるVitroHES(商標)−培養基を含み、mEF−コーティングされたIVF皿へ移動された。
10日目
培養基の50%は、4ng/ml bFGFで補充されるVitroHES(商標)と取り替えられた。
14−15日目
HNF4−アルファ染色によって示される肝芽細胞様細胞は、コロニーの周辺に存在する。
20日目
培養基の100%が、4ng/ml bFGFで補充されるVitroHES(商標)と取り替えられた。肝細胞様細胞は、コロニーの周辺に現れている。
【0217】
プロトコルの重要な要素のうちの1つは、培養基を非常にまれに置換することである。内因子は、分化過程に重要である。
【0218】
改良されたプロトコル
I 異なる培養基
CambrexからのHCM−培養基 表5の実験1、2; 図37−39
【0219】
II 成熟及び誘導因子を有するサプリメント
a. デキサメタゾン 表6の実験1、2、3; 図40−42
b. HCM−培養基、HGF、ナトリウム酪酸塩 表7の実験1、2; 図40−42
【0220】
III 培養基置換頻度
HCM−培養基及びVitroHES(商標) 表8の実験1; 図43−45
【0221】
【表8】
【0222】
【表9】
【0223】
【表10】
【0224】
【表11】
【0225】
I. CambrexからのHCM培養基が、ウシ血清アルブミンの一等分で補充される無血清基礎培養基(BSA−FAF; 10ml/500mlのHBM、cc−4362BB、Cambrex)、アスコルビン酸(0.5ml/500mlのHBM、cc−4316BB、Cambrex)、上皮細胞増殖因子(rh−EGF; 0,5ml/500mlのHBM、cc−4317BB、Cambrex)、トランスフェリン(0.5ml/500mlのHBM; cc−4313BB、Cambrex)、インスリン(0.5ml/500mlのHBM; cc−4321BB、Cambrex)、ヒドロコルチゾン(0.5ml/500mlのHBM; cc−4335BB、Cambrex)及び抗生物質(GA−1000; 0.5ml/500mlのHBM; cc−4381BB、Cambrex)である。培養基は、初代肝細胞培養のために最適化される。
【0226】
VitroHES(商標)が、HCM−培養基により15日目または23日目の後に交換された。プロトコルは、改良された肝細胞様細胞をもたらした。細胞株SA002及びSA348に由来の改良肝細胞様細胞は、アルブミン、CYP3A4及びUGT2B7(図39)の上昇する遺伝子発現レベルを示した。形態学によって判断されれば、肝細胞を有するコロニーの末梢は、改良された培養物においてより広く、細胞は脂肪質でない(図38)。プロトコル詳細の研究設計のために、図37、表5、実験1及び2を参照。
【0227】
IIa. 細胞株SA167、SA348、SA002に由来されるHCLCは、参照プロトコルに基づき分化されたが、プロトコルの終わりでの8日間の高い濃度のデキサメタゾンによるサプルメントはHCLCの外観を改良した(図41A+B)。加えて、HNF4アルファ、アルブミン、cyp3A4及びUGT2B7の上昇する遺伝子発現レベルが、明白である傾向が示された(図42A)。研究設計のために、図40を参照、研究デザインC及びプロトコルの詳細は、表6、実験1、2、3を参照。
【0228】
IIb. 細胞株SA167及びSA002に由来される肝細胞様細胞が、21日目まで参照プロトコルに基づき分化された。その時刻で、培養基はHGF及びナトリウム酪酸塩(NaB)で補充されるHCM−培養基に交換された。
【0229】
III. 分化のためのまれな培養基置換及びhBS細胞に由来される肝細胞様細胞の成熟処理の重要性が、VitroHES(商標)及びHCM(商標)−培養基の中の異なるいくつかの培養基のために試験され、分析された。参照プロトコルは、15日目まで続かれた。15日目の後、培養基は週3回または週1回交換された。研究デザインのために、図43を参照、プロトコルの詳細について、表8の実験1を参照。はっきりした傾向が、試験される全ての培養基のために観察された。培養基のまれにされた置換が、形態学に基づいく肝細胞様細胞(図44A+B)及び、Cyp3A4、アルブミン、UTG2B7及びHNF4アルファのために上昇した遺伝子発現レベル(図45)を改良した。データは、内因子が、hBSC−由来肝細胞様細胞の分化処理のために重要であることを示す。
【実施例19】
【0230】
hBS細胞由来肝芽前駆細胞
肝芽前駆細胞株を確立するために、15日間古いhBS−細胞由来肝芽細胞が、分離され、異なるコーティングに再接種された。肝芽細胞様細胞の再接種の前に、96−ウェルプレートのウェルが、以下の異なるコーティングによって予めコーティングされた;17−20x103細胞/cm2の密度を有するマイトマイシンC−処理のmEF細胞、ラットの尾からのコラーゲンI(BD Biosciences、#354236)または、HCM−培養基に1:3で希釈したマトリゲル(商標)(基底膜マトリックス、BD Biosciences、#356237)。コラーゲンI及びマトリゲル(商標)のためのコーティング手順は前の実施例15で記載されている。ウェルは、20%のFCSで補充される予め暖められた50−100μlのHCM培養基で満たされた(HBM(商標)、Cambrexからのcc−4316BB、cc−4362BB、cc−4335BB、cc−4313BB、cc−4321BB、cc−4317BB、cc−4381BBのHCM(商標) SingleQoutsに補充されるcc−3199)。15日間古い培養からの肝芽細胞様細胞の範囲がBDからのマイクロ外科用メスを用いてマイクロ解剖され、VitroHES(商標)培養基を含んでいる収集ディッシュに、幹細胞ナイフで移動される。範囲を含むマイクロ解剖された肝芽細胞様細胞は、小さいクラスタを形成し、いくつかのプレートから集められた。ところが、mEF−細胞層に再接種される肝芽細胞様細胞は、肝細胞の典型的特性を示しておらず、小さい核を有する肝芽細胞様細はmEF−細胞層上で育てられた(図47D−F及びK、L)。加えて、mEFに育てられる大多数の肝芽細胞様細胞クラスタは、肝芽マーカーCK19(図47J、K)に強く陽性だったが、コラーゲンI及びマトリゲル(商標)上の肝芽細胞様細胞の一部だけが、CK19に陽性であった(図47G、H)。mEF細胞層上の肝芽細胞様細胞及びコラーゲンI及びマトリゲル(商標)コーティング上の肝芽細胞様細胞は、HNF4アルファ陽性核を示したが、mEFに育てられる肝芽細胞様細胞(図47A、B、D、E)と比較して、後者は、より大きくて、強く染色されなかった核を有した。データは、肝細胞様細胞への肝芽細胞様細胞の分化がコラーゲンI及びマトリゲル(商標)コーティング上で可能にされる場合に、mEF細胞層が、前駆状態に肝芽細胞様細胞をキープする能力を有することを示す。
【実施例20】
【0231】
機能的な薬物輸送体
hBSC由来肝細胞様細胞におけるトランスポータに関する機能的なテストが、培養にインドシアニングリーン色素(ICG)を利用することによって分析された。ICGは、5mg/mlの濃度へ蒸留、殺菌された水に溶かされ、その後で、1mg/mlの最終濃度へ培養基で薄められた。ICG溶液は、細胞培養皿に加えられ、おおよそ60分間37℃で培養された。培養の後に、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に洗い落され、ICGの細胞摂取は、ステレオ顕微鏡で検査された。肝細胞様細胞は、ICG色素を表し、細胞の範囲に機能的な薬物輸送体の存在を示唆する(図48)。
【技術分野】
【0001】
本発明は、hBS細胞に由来する新しい肝細胞様細胞集団、及び、薬剤スクリーニング及び毒性テストのような医療における前記肝細胞様細胞の潜在的応用に関係する。さらに、本発明は、肝細胞様細胞と同じ応用として使われることができて、さらに、例えば初期肝形成または肝再生障害などの試験管内の肝形成研究に使用されることも可能な適切な特性を有する肝芽細胞様細胞にも関連する。本発明に記載の肝細胞様細胞及び肝芽細胞様細胞は、遺伝子またはタンパク質発現レベルにおいて、薬物輸送体特性および/または薬物代謝特性のどちらかを表す。
【背景技術】
【0002】
多能性ヒト幹細胞には、様々なヒト細胞型への接近可能性に革命をもたらすことが期待される。多能性ヒト胚盤胞由来幹(hBS)細胞を培養し、その後の所望の目標細胞型へそれらを分化させる可能性は、生体内応用及び試験管応用範囲に、細胞の安定的で実質的に無制限の供給を提供する。
【0003】
肝不全及び末期肝疾患は、世界中で大量死亡の原因となるとともに医療制度上の主な負担でもある。肝臓移植は、最も成功した治療である。しかし、この手順の有効性は、制限されて、多くの合併症、例えば感染症または拒絶反応につながっていた。肝臓移植は、さらに利用可能なドナー臓器の不足が欠点であり、治療された患者は、頻繁に生涯にわたる免疫抑制に付託される。移植器官のニーズを低下させる細胞に基づく治療は、社会及びこれらの疾患を患っている個人の両方にも非常に重要である。
【0004】
さらに、肝臓は代謝のセンター及び人体の解毒器官であり、したがって、インビトロ・テスト用の機能的細胞型の高信頼性の供給源を確保するために大きな努力が行われた。残念ながら、肝臓の複雑さ及び機能は、今日において利用可能ないかなる細胞型によっても反映されていない。主たるヒト肝細胞の入手可能性は制限され、インビトロ使用に使われる場合に、細胞がさらに急速にその通常の表現型及び機能的な特性を失うことは公知である(すなわち24時間以内)。初代細胞のよく使用される変形例は、肝臓細胞株であり、それは順番に代謝酵素の非常に低いレベルを含み、生体内の天然の肝細胞とかなり異なる他の重要なタンパク質の配列を有する。肝臓代謝が種特異であり、他の種の肝臓毒性を予測するのに問題点をもたらすことが公知にも関わらず、更なる多くの試験が動物性物質を使用して実行された。
【0005】
製薬開発において、逆肝臓反応は、最も顕著な毒性易罹病性である。したがって、ヒト肝臓毒性易罹病性の早期予測は、臨床試験用に合成物を選ぶ時に、最重要である。この分野の能力を向上させる努力は、モデルの有効性問題及び開発について言及しなければならず、ヒトの逆肝損傷を誘発するために一致する複合の生物学的過程により大きな範囲を提供する。両方の分野において、hBS細胞に由来する分化した細胞の使用は、有望な機会を提供する。
【0006】
したがって、新薬または化学製品の開発には、ヒト肝細胞に擬態し、候補分子の効果を予測することが可能であるモデル・システムのための緊急のニーズが存在する。有効性及び生理的関連に関して、ヒト多能性幹細胞は、機能的なヒト肝細胞の理想的な再生可能な供給源として役立つことがあり得る。hBS細胞が適当な環境に配置されるときに、特定の肝臓特性が分化の2〜4週後に観察された。
【0007】
2003年のRambhatla等による前の研究による国際公開WO01/81549及び国際公開WO2005/097980は、いくつかの肝細胞様特性を有する細胞を確認した。これらの特性はすなわち、分化されたhBS細胞培養のCYP及びGST活性である。しかし、それまで、生成の細胞は、薬物輸送体発現及び特定のCYP及びGST発現パターンに関して、従来の循環系を潜在的に交換するために必要である代謝特性を示さなかった。本発明において、創薬及び再生医療ために、薬物輸送体と重要な代謝酵素の少なくとも72時間の安定発現を有する、hBS細胞由来の肝細胞様細胞集団が提示された。
【0008】
Cellartisの特許出願国際公開WO2006034873は、発生生物学の経路をたどるために定義済み方法における異なる要因の用途を可能にする方法に基づく。本発明において、それは主に、分化に影響を及ぼす細胞の分泌内因子である。加えて、培養基の変更の頻度は、異なる。現在の方法は、培養基の少ない頻繁な変更を可能にし、したがって、大きな労働力を要しない。さらに、本発明の細胞はより成熟し、創薬及び毒性テストに役立つ分析システムでの長期間の培養を可能にする。
【0009】
国際公開WO2005097980と米国特許出願公開US20030003573のどちらも、薬物輸送体または機能的な輸送体の存在について教示していない。国際公開WO2005097980は、CYP3A4、CYP2C9及びCYP1A2が薬剤スクリーニングのための望ましい酵素であることを述べるだけである(表3を参照)。しかし、出願はこれらの最も重要なCYPs活性について、何も教示しない。特に、CYP3A4は創薬及び毒性テストに用いられる唯一重要な酵素である。大多数の全ての薬は、CYP3A4によって新陳代謝する。肝細胞が、ヒト成人肝細胞を反映する個人間の構成で、機能的なCYP3A4、CYP2C9及びCYP1A2酵素を示すhBS細胞に由来することは望ましい。
【0010】
hBS細胞に由来される肝細胞が以下の結合を有する場合、創薬及び毒性テストにそれはさらに望ましい:(i)機能的なCYP3A4、CYP2C9及びCYP1A2酵素、(ii)機能的なGST酵素及び(ii)機能的な薬物輸送体。最も重要なCYPs及び薬物輸送体に関して、国際公開WO200509780に記載されている細胞の詳細がなく、さらに、限られたGSTs特性解析データしか示されていない。対照的に、本発明は第2相酵素の完全な説明を有する。
【発明の概要】
【0011】
本発明は肝細胞様細胞及び肝芽細胞様細胞及び各自の調製方法に関する。本発明の肝細胞様細胞は、薬物輸送体および/または代謝酵素を表すので、特に創薬及び毒性テストに、かなり適している。
【0012】
ヒト胚盤胞由来幹細胞(hBS細胞)は、多能性であり、内胚葉、外胚葉及び中胚葉の全ての3つの胎児胚葉細胞及び、全身及び細菌細胞を引き起こすことができる。それで、将来において、肝臓細胞の機能的な特性を有するhBS細胞に由来される分化した細胞は、肝不全患者の体外肝庇護のための移植又は生物反応器内で使われる可能性を有するだけではなく、さらに、薬目標、生体異物の肝臓代謝、及び肝毒性を検討する試験システムになり得る。hBS細胞に由来された肝細胞は、同じ遺伝子の提供者から必要に応じて、機能的なヒト肝細胞の無制限の供給源を潜在的に提供することができ、それで、毒性試験のような試験管内テストの予測可能性を改良し、動物実験の必要性を低下させる。しかし、生体異物の毒性は、その毒性及び反応性の代謝物質への生体内変化によく依存し、したがって、生体内変化システムの存在及び配列が必要である。現在、主たるヒト肝細胞は、試験管内の薬物代謝及び毒性テストのモデルを構成する。それにもかかわらず、初代肝細胞が培養される場合に、薬物代謝酵素の活性及び多くのトランスポータ機能は、急速に消失および/または変化する。さらに、試験管内研究に使われる肝細胞癌細胞株(例えばHepG2)の多くは、幾つの重要な薬物代謝酵素の発現を欠く。
【0013】
シトクロムP450s(CYPs)は、混合機能モノオキシゲナーゼ及び主な第一位相異物代謝酵素である。この酸性代謝は、生体異物の自然体に依存し、不活化及び除去促進、プロドラッグまたは代謝活性化をもたらす。CYP発現の主な部位は肝臓であり、CYP3A4はヒト成人肝臓で最も多量であるCYPイソ酵素である。薬物代謝のための最も重要な酵素は、系統1−3に帰属し、臨床的に使用された薬の代謝に依存している全ての位相Iの70−80%を示す。CYP発現及び活性は、多形性のために大きい個人間の変化を提示する。さらに、CYPsが数倍、誘発されたり、または、特定の薬によって阻害され、追加的な、一時的な、代謝活性の変動性をもたらす。特に、肝細胞の3つの主要CYP−系統(1−3)ベースCYP−活性の組成物は、薬物代謝のために非常に重要である。本願明の実施例には、hBS細胞由来肝細胞様細胞が記載され、CYP1A2及びCYP3A4/7を含む大部分のCYP酵素からのmRNAが検出された。主要CYP−系統ベースCYP−活性、より正確はCYP1A2、CYP2C9及びCYP3A4が検出され、さらに、前記3つのCYPs活性間の配合は、ヒトの初代肝細胞に類似する。したがって、本発明は、機能的な薬物代謝酵素を表示する肝細胞様細胞の生成方法を提供する。
【0014】
肝細胞の機能的な薬物輸送体(例えばBSEP、MRP2及びOATPs)は、肝臓の薬物代謝及び毒性を分析する時に重要である。したがって、本発明は、機能的なトランスポータを表示する肝細胞様細胞の生成方法を提供する。
【0015】
上に述べたように、本願発明はhBS細胞に由来される細胞集団に関連し、細胞集団細胞の少なくとも20%は、アルファ−1−抗トリプシン、サイトケラチン18、HNF−3ベータ、アルブミンまたはL型脂肪酸結合蛋白の特性のうちの少なくとも1つを示し、細胞集団は、以下の6つの特性のうちの少なくとも3つを有する。
A.薬物輸送体
i)細胞の少なくとも1%が、BSEPのタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
ii)細胞の少なくとも1%が、MRP2のタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
iii)細胞の少なくとも1%が、OATP2および/またはOATP−8のタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
B.薬物代謝酵素
iv)細胞の少なくとも20%が、GST A1−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
v)細胞の少なくとも20%が、CYP450s−1A2、−2A6、−2B6、−2C8、−2C9、−2C19、−2D6、−2E1、−3A4及び−3A7のうちの少なくとも2つのタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
vi)細胞の少なくとも20%が、GST P1−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示していない。
【0016】
さらに、本願発明はhBS細胞に由来される細胞集団に関連し、その中の少なくとも細胞集団の細胞の約10%が、HNF3ベータ及びAFPの少なくとも一つを表示し、増殖能を有し、細胞集団は、以下の4つの特性のうちの少なくとも2つを有する。
A.受容体
i)細胞の少なくとも1%が、アルファ−6−インテグリンのタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
ii)細胞の少なくとも1%が、c−Metのタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
B.細胞間接着分子
iii)細胞の少なくとも1%が、ICAM−1のタンパク質および/または発現を示し、
C.転写因子
iv)細胞の少なくとも10%が、HNF−4アルファのタンパク質および/または発現を示し、
D.サイトケラチン
v)細胞の少なくとも1%が、CK19のタンパク質および/または発現を示し、
vi)細胞の少なくとも1%が、CK7のタンパク質および/または発現を示し、
E.上皮細胞接着分子
vii)細胞の少なくとも1%が、EpCAMのタンパク質および/または発現を示す。
【0017】
尿素は、タンパク質及びアミノ酸代謝の最終的な分解産物である。肝臓の肝細胞は、尿素へアンモニアを変える体内唯一の細胞型である。したがって、本発明は尿素を合成する肝細胞様細胞の調製方法を提供する。
【0018】
本発明の一実施例において、hBSCから由来した肝細胞様細胞は、初代肝細胞と同様のレベルに培養基へ尿素を生産及び分泌する。肝細胞様細胞は、初代肝細胞と比較して少なくとも10%、20%、50%、70%、80%、90%または少なくとも100%の尿素を合成する能力を有する。肝細胞様細胞は、10日から20日間尿素のために分析され、尿素合成の高水準を維持する。詳細は、本願明細書の実施例10を参照。
【0019】
異なるフィーダフリ表面への肝細胞様細胞の隔離及び再接種は、異なる類型の精製された肝細胞様細胞集団を可能にし、それは、肝細胞に基づく薬毒性及び代謝テスト、及び他の試験分析の範囲で異なる応用によって要求される柔軟性のために必要である。したがって、本発明は、96−ウェルプレートのようなあらゆる種類の精製及び濃縮される肝細胞様細胞のフィーダフリ培養、好ましくは、コラーゲンI培養を生成する方法を提供する。
【0020】
本発明の一実施例において、肝細胞様細胞は、ウェルの異なる表層、例えば96−ウェルプレート上にうまく再接種される。異なる表層は、コラーゲンI、マトリゲルまたはmEF細胞層であってもよい。初代肝細胞を再接種することは、非常にむずかしい。それで、肝細胞様細胞が再接種される能力を有することは、初代肝細胞と比較して本質的利点を有する。詳しくは、実施例15を参照。
【0021】
増殖可能な状況で培養される時に拡大する能力及び、分化適切な状況に保たれるときに、機能的な肝細胞へ分化する能力を備える肝芽を原種状態に保つ能力は、機能的な肝細胞の非無制限の供給源をキープするのに価値がある。したがって、本発明は、mEF−細胞層に肝芽細胞様細胞を再接種することによって肝芽細胞様細胞を原種状態にキープするための方法を提供する。加えて、肝芽細胞様細胞は、マトリゲルまたはコラーゲンがコーティングされた表面に再接種されるときに肝細胞様細胞に分化している。
【発明の説明】
【0022】
定義及び省略形
ここで使用しているフィーダ細胞は、単独でまたは組合せで使用する支持細胞型を意味することを目的とする。細胞型は、ヒト又は他の種に起源のものでも良い。フィーダ細胞が由来する組織は、胚、胎児、新生児、少年又は成人組織を含み、それは、更に包皮、臍の緒、筋肉、肺、上皮、胎盤、卵管、腺、ストロマまたは胸部の皮膚に由来される組織を含む。フィーダ細胞は、ヒト線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、ケラチン生成細胞、内皮細胞及び上皮細胞からなる群に関連する細胞型に由来してもよい。フィーダ細胞を誘導するのに使われてもよい特定の細胞型の実施例は、胚線維芽細胞、胚体外内胚葉細胞、胚体外中胚葉細胞、胎児線維芽細胞および/または線維細胞、胎児の筋細胞、胎児の皮膚細胞、胎児の肺細胞、胎児の内皮細胞、胎児の上皮の細胞、臍の緒間充織細胞、胎盤の線維芽細胞および/または線維細胞、胎盤の内皮細胞、出産後の包皮線維芽細胞および/または線維細胞、出産後の筋細胞、出産後の皮膚細胞、出産後の内皮細胞、成人皮膚線維芽細胞および/または線維細胞、成人筋細胞、成人卵管内皮細胞、成人腺子宮内膜細胞、成人間質子宮内膜細胞、成人乳ガン実質細胞、成人内皮細胞、成人上皮の細胞または成人ケラチン生成細胞を含む。フィーダ細胞がhBS細胞に由来されるときに、細胞は線維芽細胞であってもよい。
【0023】
ここで使用しているように、用語「3D」は、三次元を意味することを目的とする。
【0024】
ここで使用しているように、用語「胚盤胞由来幹細胞」は、BS細胞を意味し、ヒトの型は「hBS細胞」と呼ばれる。
【0025】
ここで使用しているように、用語「AAT」は、肝臓マーカーのアルファ−アンチ−トリプシンを意味することを目的とする。
【0026】
ここで使用しているように、用語「AFP」は、肝臓マーカーのアルファ−フェト−タンパク質を意味することを目的とする。
【0027】
ここで使用しているように、用語「BSEP」は、胆汁酸塩輸出ポンプを意味することを目的とする。
【0028】
ここで使用しているように、用語「CK」は、異なる亜類型(例えばサイトケラチン18、サイトケラチン19及びサイトケラチン7)を有する肝臓マーカー・サイトケラチン(交互に用いられる)を意味することを目的とする。
【0029】
ここで使用しているように、用語「c−Met」は、肝細胞成長因子および/または散乱因子受容体を意味することを目的とする。
【0030】
ここで使用しているように、用語「ICAM−1」は、細胞内粘着力分子1を意味することを目的とする。
【0031】
ここで使用しているように、用語「LFABP」は、肝臓脂肪酸結合蛋白(交互に用いられる)を意味する。
【0032】
ここで使用しているように、用語「EpCAM」は、上皮細胞接着分子(交互に用いられる)を意味する。
【0033】
ここで使用しているように、用語「FGF」は、線維芽細胞成長因子を意味し、好ましくはヒトおよび/または組み換え型オリジンであり、それに対して帰属している亜類型は、例えばbFGF(時々FGF2と称する)及びFGF4である。
【0034】
ここで使用しているように、用語「DMSO」は、ジメチルスルホキシドを意味する。
【0035】
ここで使用しているように、「CYP」はシトクロムP、より詳しくはシトクロムP 450、多数の異なるサブユニット肝臓構成(例えば1A1、1A2、3A4その他)の主要位相1の代謝酵素を意味する。
【0036】
ここで使用しているように、用語「GST」は、グルタチオン転移酵素を意味することを目的とし、それの亜類型の実施例は、GST A1−1、GST M1−1及びGST P1−1である。
【0037】
ここで使用しているように、交互に用いられる「HNF3ベータ」および/または「HNF3b」は、肝細胞核要因3、例えば肝臓、膵島及び脂肪細胞のような組織に由来の転写因子調整遺伝子発現を意味することを目的とする。HNF3ベータは、時々さらにFoxa2と称してもよく、フォークヘッドボックス転写因子系統のメンバーである転写因子から由来している名前である。
【0038】
ここで使用しているように、用語「OATP」は、有機アニオン・トランスポーター遺伝子を意味することを目的とし、それは、肝臓内のスルホブロモフタレイン(BSP)及び抱合型胆汁酸(タウロコール酸)及び非抱合型胆汁酸(コール酸塩)のような有機アニオンのナトリウム(Na+)−独立トランスポートの媒介となる。
【0039】
ここで使用しているように、用語「UGT」は、ウリジン二リン酸グルクロノシル転移酵素を意味することを目的とし、それは、グルクロン酸化活性を触媒している一群の肝臓酵素である。
【0040】
ここで使用しているように、用語「異種動物由来成分不含」は、人間以外の動物成分への直接又は間接的な暴露の完全な回避を意図する。
【0041】
上記において言及されたように、本願発明は改良型のhBS細胞由来肝芽細胞様細胞および肝細胞様細胞を提供する。改良型の肝細胞様細胞は、同じ薬物輸送体及び代謝酵素を使用して生体内肝細胞と類似した薬取り込み、分泌及び代謝を確実にする薬物輸送体および/または代謝酵素を表示する。それで、それらの薬物および化学薬品への反応が生体内の肝細胞に似ていることが期待されることにつれ、これらの全ての特徴の発現は創薬及び毒性テストに使用される細胞のための望ましい特徴である。
【0042】
したがって、本願発明の開示する肝芽細胞様細胞または肝細胞様細胞は、創薬プロセス、薬物輸送体を研究するためのインビトロ・モデル、薬物代謝酵素を研究するためのインビトロ・モデル、肝形成を研究するためのインビトロ・モデル、初期の肝形成、ヒト肝再生障害を調査するためのインビトロ・モデル、インビトロ・肝毒性テストのような多数の研究目的に有利に使われる。
【0043】
さらに、本発明の肝芽細胞様細胞及び肝細胞様細胞は有利に、いくつかの肝臓疾患及び障害の治療および/または予防のために使われることができる。したがって、本発明の肝芽細胞様細胞及び肝細胞様細胞が、薬剤に使われることができる。
【0044】
肝芽細胞様細胞は、肝細胞様細胞の原種細胞であり、したがって、それらは、例えば、代謝的に有能な肝細胞様細胞を得るために、または、肝細胞様細胞への成熟を研究するために最適に使われる。
【0045】
肝細胞様細胞
現在のコンテキストにおいて、用語「肝細胞様細胞」は、アルファ−1−アンチトリプシン、サイトケラチン18、HNF−3ベータ、アルブミンまたは肝臓脂肪酸結合蛋白質の特性のうちの少なくとも1つを示している細胞を意味することを目的とする。本発明の肝細胞様細胞は、さらに、薬品トランスポート及び薬物代謝に関する重要及び安定した特性を有する。
【0046】
したがって、一実施例において、本発明はhBS細胞に由来される細胞集団に関連し、その細胞集団の細胞の少なくとも20%が、アルファ−1−抗トリプシン(AAT)、サイトケラチン18(CK18)、HNF−3ベータ、アルブミンまたは肝臓脂肪酸結合蛋白(LFABP)の特性のうちの少なくとも1つを示し、さらに細胞集団は、以下の6つの特性のうちの少なくとも3つを有する。
A.薬物輸送体
i) 細胞の少なくとも1%が、BSEPのタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
ii) 細胞の少なくとも1%が、MRP2のタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
iii) 細胞の少なくとも1%が、タンパク質および/または遺伝子発現OATP2および/またはOATP−8を示し、
B. 薬物代謝酵素
iv) 細胞の少なくとも20%が、GST A1−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
v) 細胞の少なくとも20%が、CYP450s−1A2、−2A6、−2B6、−2C8、−2C9、−2C19 −2D6、−2E1、−3A4及び−3A7のうちの少なくとも2つのタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
vi) 細胞の少なくとも20%が、GST P1−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示していない。
【0047】
付加物または必要条件の代替品として、vi)細胞の少なくとも約5%が、GST M1−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
【0048】
本発明の一実施例において、肝細胞様細胞は、フェーズIシトクロムp450酵素によって薬品を新陳代謝させることができる。特に、cyp1A2、cyp2C9及びcyp3A4は、誘発因子がない場合も新陳代謝することができる。実施例において、肝細胞様細胞によって新陳代謝する物質は、フェナセチン、ジクロフェナク及びミダゾラムであり、代謝物質はLC−MSによって分析された。肝細胞様細胞が誘発因子の影響なしで薬品を新陳代謝させることができる点は、重要である(例えば、国際公開WO2005097980に記載される通り)。
【0049】
他の実施例で、肝細胞様細胞は、ヒト初代肝細胞培養のcyp活性配合と同様のcyp−活性の配合を有する。具体的には、肝細胞様細胞のCyp1A2、Cyp3A4及びCyp2C9の配合はヒト初代肝細胞培養物の配合に匹敵する。Cyp1A2、Cyp3A4及びCyp2C9間のCyp−活性配合は、ヒト初代肝細胞培養組織の配合と比較して、30%、50%、75%及び100%と異なることができる。
【0050】
本発明の一実施例において、肝細胞様細胞は、機能的な薬物輸送体を表示する。特に、OATP−2は、ICG染料の着色により能動的に測定され、それは、細胞の範囲内の機能的な薬物輸送体の存在の指示である(図48)。
【0051】
本発明の更なる実施例において、細胞集団はhBS細胞に由来し、細胞集団の細胞の少なくとも20%は、アルファ 1−アンチトリプシン、サイトケラチン18、HNF−3ベータ、アルブミンまたは肝臓脂肪酸結合蛋白の特性のうちの少なくとも1つを示し、細胞集団は、以下の2つの特性を有する。
A.薬物輸送体
iii)細胞の少なくとも1%が、機能的に活性を有するOATP−2および/またはOATP−8を示し、
B.薬物代謝酵素
iv)細胞の少なくとも20%が、GSTA1−1の機能的な活性を示し、
v)細胞の少なくとも20%が、薬物代謝物質を分析することで測定される機能的に活性を有するCyp1A2、Cyp3A4および/またはCyp2C9を示す。
【0052】
本発明の更なる実施例において、細胞集団はhBS細胞に由来し、細胞集団の細胞の少なくとも75%は、アルファ 1−アンチトリプシン、サイトケラチン18、HNF−3ベータ、アルブミンまたは肝臓脂肪酸結合蛋白の特性を示し、細胞集団は、少なくとも2つの以下の特性を有する。
A.薬物輸送体
iii)細胞の少なくとも10%が、機能的に活性を有するOATP−2および/またはOATP−8を示し、
B.薬物代謝酵素
iv)細胞の少なくとも30%が、GSTA1−1の機能的な活性を示し、
v)細胞の少なくとも50%が、薬品代謝物質を分析することで測定される機能的に活性を有するCyp1A2、Cyp3A4および/またはCyp2C9を示す。
【0053】
グリコーゲン記憶は、肝細胞様細胞の顕著なもう一つの特徴である。
【0054】
さらに、肝細胞様及び肝芽細胞様細胞の割合は、Notch−2陽性である。Notchシグナル伝達経路は、成人の胚発育及びホメオスタシスの保全に広く使われている。それは、幹細胞信号ネットワークを構成するさらにキー経路の1本である。哺乳類において、4つのNotch受容体(Notch1−Notch4)及び5つの構造的類似のNotchリガンド(Delta−like1 [さらに、Delta1と呼ばれる]、Delta−like3、Delta−like4、Jagged1及びJagged2)がこれまで確認された。Notchリガンドは、1回膜貫通タンパクである。隣接の細胞に表示されるリガンドと結合することによって、Notch受容体は起動し、それは、タンパク質分解解放及び、順番に分化を調整するNotchの細胞内領域の核移動を導く。胚発育の間、Notch−2は広く表示され、Notch−2は、多器官に重要な役割を有する。肝臓において、Notch−2は、肝内胆管の形成及び分化に関与している(アーダー等、2005、コダマ等、2006)。肝臓様細胞が幹細胞によって生成されるので、それらの細胞型のノッチ・シグナリングの役割を理解することは、重要である。
【0055】
肝細胞様細胞は、肝細胞のために典型的な形態学を表示し、すなわち、それらは多角形の細胞形状を有し、大きい細胞直径(およそ25−50μM)、よく二重核を有し、脂質微粒を蓄積する傾向を示す。
【0056】
AAT、CK18、HNF−3ベータ、アルブミン及びLFABPは全て肝臓の特定のマーカーであり、それらの発現は、肝細胞様細胞を表す。しかし、これらの肝臓特定マーカーの全てが、本発明の細胞集団の全ての細胞に、必ずしも表示されるというわけではない。これらのマーカーのうちの一つ、二つ、三つ、四つだけを表示する均等な細胞は肝細胞と同様に機能することができ、それによって、それらが使われるべきであることによって決まる上述の目的に役立つ。細胞のlysationによって代謝を研究するために、少なくとも、CYPs及びGSTsが、要求される。摂取を研究するために、OATPsは重要であり、さらに、分泌物のために、例えばBSEPまたはMRP−2の研究が要求される。実施する研究がインビボの研究に近付くにつれて、前記の特徴のうちより多くのものが必要となる。もっとよいものは、細胞−細胞相互作用によって肝臓環境を提供するマクロファージ及びクッパー細胞のような他の肝臓細胞型の肝細胞様細胞を潜在的に有する。この種の培養系は、サンドイッチの形状であり、これに一つ以上細胞型が組み込まれ、この3D構造及びさらなる体内模倣状況は肝細胞様細胞が潜在的にさらに正反対を示させることができる。すなわち、血液の方へ1つの親水側、胆汁の方へ1つの疎水側が示される。毒性研究のために、それらの相互作用により、フェーズI及びIIの代謝酵素が両方とも好ましい。加えて、細胞集団が周知の薬品誘発因子に反応できることが望ましく、それによって、例えばフェーズIおよび/またはフェーズIIの代謝酵素が誘導できる。
【0057】
本発明の実施例において、上述の特性i)−vi)のうちの少なくとも3つを有する細胞集団の少なくとも約30%の細胞、例えば、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%または少なくとも約95%が、アルファ 1−アンチトリプシン、CK18、HNF−3ベータ、アルブミンまたはLFABPの特性の中の少なくとも2つ、例えば少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つまたは全てを示す。特定の実施形態において、特性の少なくとも一つは薬物輸送体のグループ(すなわち特性i−iii)に関連するものであり、特性のうちの少なくとも1は薬物代謝酵素(すなわち特性iv)−vi))のグループに関連するものである。したがって、一つ以上の肝臓特定マーカーに加えて、細胞集団は、更に少なくとも一つの前記薬物輸送体特性及び少なくとも一つの前記薬物代謝特性を有してもよい。より具体的には、本発明の細胞集団は、特性i)−vi)のうちの少なくとも4つ、例えば少なくとも5つまたは全6つの特性を有する。
【0058】
特性i)は、肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の割合に関係し、本発明による細胞集団の薬物輸送体BSEPのタンパク質および/または遺伝子発現を示す。BSEPは、胆汁酸塩輸出ポンプ(bile salt export pump)を表し、ATP加水分解のエネルギーを使用して、細胞外及び細胞内膜にわたる分子のトランスポートを触媒するATP−結合カセット(ABC)トランスポータであり、したがって、胆汁に薬品を外へ輸出することができる(通常は生体内に位置され、肝細胞のアピカル側と称する)。本発明の実施例において、肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の少なくとも5%、例えば、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%または少なくとも50%が、BSEPのタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
【0059】
特性ii)は、本発明による細胞集団の薬物輸送体MRP2のタンパク質および/または遺伝子発現を示す肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の割合に関する。MRP2は、複数薬品抵抗タンパク質2を表し、さらにABCトランスポータ系統のメンバーであり、胆汁に薬品代謝物質を輸出する。本発明の実施例において、肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の少なくとも5%、例えば少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%または少なくとも80%が、MRP2のタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
【0060】
特性iii)は、本発明による細胞集団の薬物輸送体OATP2および/またはOATP8のタンパク質および/または遺伝子発現を示す肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の割合に関する。OATP−2及びOATP−8は、有機アニオン・トランスポータ2及び8を表し、両方ともOATP系統のメンバーであり、血液から有毒な内在性代謝物質及び生体異物物質を巻き取ることが公知である。OATPsは、体内の血液の方の肝細胞の基底外側に位置している。本発明の一実施例において、肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の少なくとも5%、例えば少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%または少なくとも80%が、OATP2および/またはOATP−8のタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
【0061】
特性iv)は、本発明による細胞集団における薬品代謝酵素GST A1−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示す肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の割合に関連する。グルタチオン転移酵素(GSTs)は、グルタチオンを有する生体異物の活用を触媒し、第2相解毒システムの不可欠な部分である。さらに、指定された7つのクラスへ割れられる17種の異なるヒト細胞質GSTサブユニットがあり、例えばA、M、P及びSである。GST A1−1は、生体内成人ヒト肝臓における最も多量のサブユニットである。GST P1−1が胎児の肝臓でより高い程度で表示される一方、GST M1−1は同様に成人ヒト肝臓において表示される。本発明の一実施例において、肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の少なくとも30%、例えば少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%または少なくとも80%は、GST A1−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
【0062】
特性v)は、発明の細胞集団のCYP450s−1A2、−2A6、−2B6、−2C8、−2C9、−2C19、−2D6、−2E1、−3A4及び−3A7からなるグループから選択される薬品代謝酵素のうちの少なくとも2つのタンパク質および/または遺伝子発現を示す肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の割合に関連する。CYPは、シトクロムP450を表し、肝臓の小胞体細網構造に位置する一群の酵素である。それらの役割は、内在性合成物及び生体異物の代謝及び解毒である。これらの酵素の高い濃度は肝臓及び小腸で見つかるが、多数のCYPsは同様に他の組織でも見つかる。CYPsは、抑制及び誘導を含む多くの機構によって変えられることができて、人から人へ変化することができる。CYPシステムは、薬物代謝、薬品相互作用及び薬剤誘発性肝毒性を理解するのに重要である。
【0063】
本発明の一実施例において、肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の少なくとも30%、例えば、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%または少なくとも80%が、CYP450s−1A2、−2A6、−2B6、−2C8、−2C9、−2C19、 2D6、−2E1、−3A4及び−3A7のうちの少なくとも2つのタンパク質および/または遺伝子発現を示す。さらに、一般的CYP450酵素活性が、そのような細胞集団に示されることができ、細胞集団は、これらのCYP450タンパク質のうちの少なくとも1つ、例えば、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つまたは全10の酵素活性を更に示してもよい。
【0064】
特性vi)は、本発明による細胞集団の第2相酵素GST P1−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示す肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の割合に関連する。本発明の一実施例において、肝細胞様細胞から成る細胞集団の細胞の少なくとも10%、例えば、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%または少なくとも80%は、GST P1−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示していない。
【0065】
さらに、細胞集団はGST酵素活性を示すことを示してもよく、それは、細胞集団の溶解物のタンパク質の少なくとも0.01μmol/min/mg、例えば少なくとも0.03μmol/min/mg、少なくとも0.05μmol/min/mg、少なくとも1.0μmol/min/mg、少なくとも0.07μmol/min/mg、少なくとも0.09μmol/min/mg、少なくとも0.11μmol/min/mg、少なくとも0.13μmol/min/mgまたは少なくとも0.15μmol/min/mgであってもよい。
【0066】
本発明の特定の実施例において、細胞組成は、CK 18共発現細胞を含み、例えばCYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2D6、CYP2E1;CYP2C8、CYP2C9及びCYP2C19の組合せ、またはCYP3A4及びCYP3A7の組合せのような一つ以上のCYP薬物代謝酵素を含む。
【0067】
上述の特性に加えて、本発明の細胞集団の細胞の少なくとも約5%は、以下の追加的な特性のうちの少なくとも1つを有する。
A.受容体
vii)細胞の少なくとも約5%が、c−Metのタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
B. 細胞間接着分子
viii)細胞の少なくとも約5%が、ICAM−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
C.薬物代謝酵素
ix)細胞の少なくとも1%が、UGTのタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
D.転写因子
x)細胞の少なくとも90%が、非Oct−4のタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
【0068】
好ましくは、細胞集団は特性vii)、viii)、ix)またはx)のうちの少なくとも2つ、例えば少なくとも3つまたは全4つを有する。
【0069】
特性vii)は、発明の細胞集団における受容体c−Metのタンパク質レベルおよび/または遺伝子発現に関する。c−Metは、肝細胞成長因子および/または散乱因子受容体であり、それによって、肝細胞様細胞が、生体内ヒト肝細胞と同じ細胞内調節及びメカニズム(メチル化)を反応及び有するのを期待される。本発明の一実施例において、肝細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも10%、例えば少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%が、c−Metのタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
【0070】
特性viii)は、本発明による細胞集団の細胞間接着分子ICAM−1のタンパク質のレベルおよび/または遺伝子発現に関する。ICAM−1は、肝臓内の細胞−細胞相互作用に重要な細胞内部−粘着力分子である。本発明の一実施例において、肝細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも10%、例えば、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%は、ICAM−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
【0071】
特性ix)は、本発明による細胞集団の薬品代謝酵素UGTのタンパク質のレベルおよび/または遺伝子発現に関する。ウリジン・ジホスホグルクロノシルトランスフェラーゼは、GSTs第2相代謝酵素と同様にfat−soluble化学製品、両方の内因性培養基、薬品及び他の生体異物に砂糖の酵素添加の役割を果たす。哺乳類において、グルクロン酸は体の潜在的中毒レベルの環境または薬品から、代謝及び脂溶性化学製品の廃棄物蓄積を予防するために用いるメイン砂糖である。特にUGT2B7は、成人ヒト肝臓の重要な第2相酵素であり、例えば、薬品ジクロフェナクを新陳代謝するために、Cyp2C9及びCyp3A4と協力する。本発明の一実施例において、肝細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも5%、例えば、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%は、UGTのタンパク質および/または遺伝子発現を示す。さらに、細胞集団はUGT酵素活性を示してもよい。
【0072】
特性x)は本発明による肝細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の割合に関連し、それは転写因子Oct−4の非タンパク質および/または遺伝子発現を示す。Oct−4は転写因子であり、その発現は未分化のhBS細胞に特徴的であり、肝細胞様細胞を含んでいる細胞集団におけるその存在は、望ましくない。したがって、Oct−4の無しまたは低い発現は、それらが未分化のhBS細胞ではないことを示し、未分化の細胞集団が潜在的に奇形腫様組織を引き起こすことがあるので、たとえば、再生医療においてそれは利点である。本発明の一実施例において、肝細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも10%、例えば少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%は、Oct−4のタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
【0073】
上述の特性i)−x)の一部は、誘発因子の追加で誘導でき、それは、デキサメタゾン、オメプラゾールからなるグループから単独でまたは組合せで選択される。誘発因子は、同様にリファンピシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジドを含んでもよい。このような方法で、CYP450タンパク質のうちの少なくとも1つの発現が、誘発因子の追加で誘導できる。さらに、GST A1−1および/またはGST M1−1タンパク質の発現は、誘発因子の追加で誘導できる。UGTタンパク質の発現は、同様に誘発因子の追加で誘導できる。
【0074】
本発明の肝細胞様細胞は、それらが培養される間にこれらが示す特性i)−x)を維持することができる。この文脈において、用語「維持された特性」は、定義済みの培養組織及び分析期間にわたる安定的タンパク質発現を意味することを目的とし、それは、例えば免疫組織化学及び発現輝度の測定及び比較で更に示されることができる。したがって、本願発明による肝細胞様細胞を含んでいる細胞集団が、少なくとも一ヶ月間、例えば、維持された特性を有しながら少なくとも一週間または少なくとも72時間、インビトロで培養されることが可能である。
【0075】
本発明の一実施例で、肝細胞様細胞を含んでいる細胞集団またはその部分母集団は、更にAFPを表示する。
【0076】
さらに特定の臓器模倣応用のために、おそらく、他の肝臓細胞型、例えばクッパー細胞および/またはマクロファージが、必要である。
【0077】
本発明の肝細胞様または肝芽細胞様細胞は、本願明細書に記載されているそれらのそれぞれの特性を確かめるために使用の前に選ばれ、より高い収穫を得る。細胞は、細胞表面に表示される肝臓マーカー及び次のFACソーティングのために抗原検出を用いて精製されてもよい。抗原ベースのソートのための他の代わりは培養皿を特定の抗体でコーティングし、培養基から皿に細胞を加え、右側の抗原と細胞を結びつけ、及び残りの細胞は廃棄され、まとめられた細胞は更なる用途のために収穫する。この方法は、時々免疫と称され、さらに陰性選択として実行されることができる。すなわち、不要な細胞型をコーティングされる抗原へ結合させ、懸濁液の肝細胞様細胞を有する培養基を確保する。このアプローチは、磁気ビーズ上で実行された方がよく、いわゆるMACソートまたはカラムクロマトグラフィを使用する。例えば特定の特性を有する肝細胞様細胞のような細胞を精製するさらなる方法は、細胞分離のための、遠心分離中での浮遊密度またはサイズに基づく密度勾配培養基の使用を含む。
【0078】
肝細胞様または肝芽細胞様細胞の精製集団を得るためのさらなる代替方法は、hBS細胞由来細胞の混合集団における陽性選択または陰性選択を実行することである。両方の選択方法は、細胞単片の切断又は、コラゲナーゼIVまたはトリプシン、または、例えばEDTAまたは適切な酵素及びキレート化剤の混成物のような酵素への追加及び暴露によって手動で実行されることができる。本発明の1つの特定の実施例において、培養皿は、カルシウム/マグネシウムフリーPBSで二回洗われ、その後、カルシウム/マグネシウムフリーPBSに希釈される0.5mMのEDTAにおいて培養され、非肝細胞様又は非肝芽細胞様細胞を取り除き、マウス胚のフィーダ上で完全に成長する肝臓様細胞型を残す、陰性選択をもたらす。キレート化剤および/または酵素への更なる暴露の後、肝臓様細胞は、フィーダ細胞及び、実験に更にプールされ、使われる皿から分離される。
【0079】
肝芽細胞様細胞
このコンテキストにおいて、用語「肝芽細胞様細胞」は、HNF3ベータ及びAFPの少なくとも一つのを表示し、増殖能を有する細胞を意味することを目的とする。したがって、本願発明の一実施例は、hBS細胞に由来される細胞集団に関連し、細胞集団の細胞の少なくとも約10%が、少なくとも一つのHNF3ベータ及びAFPを表示し、増殖能を有し、細胞集団は以下の4つの特性のうちの少なくとも2つを有する。
A.受容体
i)細胞の少なくとも1%が、アルファ−6−インテグリンのタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
ii)細胞の少なくとも1%が、c−Metのタンパク質および/または遺伝子発現を示し、
B.細胞間接着分子
iii)細胞の少なくとも1%が、ICAM−1のタンパク質および/または発現を示し、
C.転写因子
iv)細胞の少なくとも10%が、HNF−4アルファのタンパク質および/または発現を示し、
D.サイトケラチン
v)細胞の少なくとも1%が、CK19のタンパク質および/または発現を示し、
vi)細胞の少なくとも1%が、CK7のタンパク質および/または発現を示し、
E.上皮細胞接着分子
vii)細胞の少なくとも1%が、EpCAMのタンパク質および/または発現を示す。
【0080】
細胞質比に高い核を有し、立方形の形状であることは、肝芽細胞様細胞の顕著な特徴である。さらに、それらは細胞質に小さい核小体及び微粒を有してもよい。好ましくは、細胞の直径は10−30μmの間であってもよい。
【0081】
肝芽細胞様細胞は、更に肝細胞様細胞に分化する能力を有する内皮オリジンの細胞である。HNF3ベータは内皮性マーカーであり、内胚葉は肝細胞の方へ発育経路に沿っている。HNF3ベータは、同様に膵臓で表示されることは公知である。この文脈において、用語「増殖能」は、細胞集団の細胞が分裂することを意味することを目的とする。
【0082】
HNF3ベータ以外の肝芽細胞様及び肝細胞様細胞へ分化するhBS細胞によって表示される追加的な内皮性マーカーの実施例は、Gata4、Cdx2(尾部関連ホメオボックス転写因子)、Sox17(Sry−box含有遺伝子17の遺伝子製品)、Pdx1(膵臓の十二指腸ホメオボックス因子−1)及びAFPであり、後者は通常、胎児の肝臓マーカーとみなされる。
【0083】
肝芽細胞様細胞は、さらに、増殖されてもよく、それは、前駆状態の1つの表示であり、すなわち、それらは未成熟で完全に肝細胞様細胞に分化されなかった。細胞の繁殖的状態は、多数の手段によって示されることができ、それらは例えばBrdU取り込み及び染色または例えばKI67のような繁殖的細胞に特有なタンパク質マーカーを使するもう一つの染色であり、固定の時点に集団における繁殖細胞を染色する。
【0084】
肝芽細胞様細胞の特性i)−vii)は、肝発育にとって重要な体内関連マーカーである。
【0085】
特性i)は、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の割合に関連し、アルファ−6−インテグリン受容体のタンパク質および/または遺伝子発現を示す。アルファ−6−インテグリンは、ラミニン受容体である。ラミニン受容体は、例えば発育中の肝臓の細胞外基質の一部であり、多数の細胞型(例えば体内肝芽及び肝細胞)に表示される。本発明の一実施例において、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも5%、例えば、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%が、アルファ−6−インテグリン受容体のタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
【0086】
特性ii)は、c−Met受容体のタンパク質および/または遺伝子発現を示す、肝芽細胞様細胞を含む細胞集団の細胞の割合に関する。本発明の一実施例において、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも5%、例えば、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%は、c−Met受容体のタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
【0087】
特性iii)は、細胞集団において、細胞間の粘着力分子ICAM−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示す肝芽細胞様細胞を含む細胞の割合に関する。本発明の一実施例において、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団における細胞の少なくとも5%、例えば、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%が、細胞間の粘着力分子ICAM−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
【0088】
特性iv)は、転写因子HNF−4アルファのタンパク質および/または遺伝子発現を示す肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団における細胞の割合に関する。この転写因子は、特に内皮性細胞型において表示され、したがって、肝芽細胞様細胞を表す。本発明の一実施例において、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも5%、例えば、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%が、HNF−4アルファのタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
【0089】
特性v)は、サイトケラチン19のタンパク質および/または遺伝子発現を示す、肝芽細胞様細胞を含む細胞集団の細胞の割合に関する。このサイトケラチンは、肝細胞以外の特に肝臓幹細胞及び肝芽において表示され、したがって、肝芽細胞様細胞を表す。本発明の一実施例において、肝芽細胞様細胞を含む細胞集団の細胞の少なくとも5%、例えば、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%が、サイトケラチン19のタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
【0090】
特性vi)は、サイトケラチン7のタンパク質および/または遺伝子発現を示す、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団における細胞の割合に関する。このサイトケラチンは、肝細胞ではなく特に肝臓幹細胞及び肝芽において表示され、したがって、肝芽細胞様細胞を表す。本発明の一実施例において、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも5%、例えば、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%が、サイトケラチン7のタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
【0091】
特性vii)は、上皮細胞接着分子のタンパク質および/または遺伝子発現を示す、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の割合に関する。この上皮細胞接着分子は、肝細胞でなく特に肝臓前駆において表示され、したがって、肝芽細胞様細胞を表す。本発明の一実施例において、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団の細胞の少なくとも5%、例えば、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%が、上皮細胞接着分子のタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
【0092】
本発明の一実施例において、上述の特性i)−vii)のうちの少なくとも2つを有する細胞集団の細胞の少なくとも約15%、例えば、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%または少なくとも約95%が、HNF3ベータ及びAFPのうちの少なくとも一つに表示され、増殖能を有する。さらに、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団は、特性i)−vii)のうちの少なくとも3つまたは全4つを有する。
【0093】
本発明の他の実施例において、肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団は、更に以下の特性のうちの少なくとも1つを有する。
F.薬物輸送体:
viii)細胞の少なくとも1%が、BSEPのタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
ix)細胞の少なくとも1%が、MRP2のタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
【0094】
BSEP及びMRP2は、肝細胞様細胞へ発育の間に、すでに薬品トランスポート・プロセスを実行することにとって重要であるが、それは、この発育的なフェーズで代謝、解毒及び分泌物が同様に必要とするからである。
【0095】
更なる使用態様
薬品トランスポート及び薬物代謝酵素の発現のために、本発明の肝細胞様細胞及び肝芽細胞様細胞は、医薬品用途に非常に適している。したがって、本発明に記載されている細胞集団が、予防および/または病状治療、および/または例えば、肝臓組織退化、原発性胆汁性肝硬変を含む自己免疫障害からなる群から選択される肝臓障害、脂質異常症を含む代謝障害、例えばアルコール濫用によって生じる肝臓障害、ウイルスによって生じる疾患(例えばB型肝炎、C型肝炎及びA型肝炎)、例えば調合薬に対する急性毒性反応によって生じる肝臓壊死及び肝細胞性癌及び代謝病状および/または、疾患で苦しんでいる患者の腫瘍除去のような組織退化によって生じる疾患のための医薬品の製造に使われることができる。
【0096】
さらに、本発明の肝細胞様細胞及び肝芽細胞様細胞は、スクリーニングの目的のために最適に使われる。例えば、細胞は本発明の細胞集団から合成物へ細胞を暴露することを含む、肝細胞毒性の合成物をスクリーニングする方法に使うことが可能であり、合成物が細胞に対して有毒かどうか決定する。細胞は、さらに肝細胞性機能を調整する能力のために合成物をスクリーニングする方法に使われてもよい。上記の方法は、本発明の細胞集団からの細胞を合成物へ暴露し、合成物との接触から起こる細胞のいかなる表現型または代謝変化を測定し、肝細胞性機能を調整する能力に変化を関連づける方法である。
【0097】
再生医療の応用において、hBS細胞は、異種動物由来成分不含hBS細胞に由来されるべきであり(実施例1を参照)、さらに分化の間に、分離及び可能性二次培養は直接的にも間接的にも非人間動物由来構成要素に暴露されない。これは、ヒト由来構成要素(例えば組み換え型培養基及び添加物)だけを用いて達成されることができる。
【0098】
製剤方法
本発明の細胞集団は、分化誘導薬を用いずに得られるが、それは、一般的に他に使われる。分化誘導薬は、細胞に有毒な欠点を有し、そのような方法によって得られる分化細胞の収穫は低く、さらに、これらの得られた細胞の品質にも影響を及ぼす可能性がある。本発明の発明者は、培養状況を確認することにより、分化誘導薬を使用しないで肝細胞様細胞および/または肝芽細胞様細胞へhBS細胞の分化を可能にする。本発明による肝細胞様細胞及び肝芽細胞様細胞の製剤方法は、細胞の改良された品質及び改良された収穫を提供する。さらに、得られた細胞は、ここに記載されている特性を有し、この特性が細胞をここに記載の用途以外にも適応させる。
【0099】
本発明の一実施例において、96−ウェルプレートの肝細胞様細胞へのhBS細胞の分化は、うまく実行される。96−ウェルの少なくとも50%、60%、70%、80%、90%または100%が、肝細胞様細胞へhBS細胞を分化させることに成功した。hBS細胞は、本発明の実施要項に従う期間で肝細胞様細胞へ分化するが、例えば20日目、25日目、30日目または35日目である。
【0100】
本発明の方法は、さらに、周知の方法より労力が掛からない。bFGF以外の、高価な因子は、培養基への添加物として必要でなく、bFGFは、低い量だけ必要で、以前報告されるほうより少ない量である。
【0101】
方法は、細胞から排出する内因子に依存し、中毒特性のいかなる潜在的添加物にも依存しない。すなわち、より穏やかな、より生理的に適切な環境を実現する。それゆえに、方法はまれな培養基置換及び部分的な培養基置換に依存する。有毒な物質は、特定の誘導酵素の誘導性のみを確認するために使われる。
【0102】
加えて、方法は肝細胞様細胞へ分化するために重要なmEF細胞に依存する。hBS細胞が分化するmEF細胞の濃度は、20.000細胞/cm2から200.000細胞/cm2の範囲内で変動してもよく、例えば約30.000から100.000細胞/cm2、例えば40.000から70.000細胞/cm2、例えば52.000細胞/cm2である。
【0103】
肝細胞様細胞への分化方法にとって重要な他の1つの要因は、bFGFの存在であり、それは、分化の前に培養基に加えられる。
【0104】
本発明のための出発原料は、未分化hBS細胞株のような最適に多能性の未分化hBS細胞である。そのような材料は、Cellartis AB社から得られることができ、さらにNIH幹細胞レジストリで入手できる(http://stemcells.nih.gov/research/registry/)。Cellartis AB社は、2つのhBS細胞株(SA001及びSA002)を有し、SA002(SA002.5)の1つのサブクローンは、NIHを通して入手できる。それらのhBS細胞株は、本発明において多用された。
【0105】
出発物質として推薦されるhBS細胞の特性は、以下の通りである:陽性のアルカリホスファターゼ、SSEA−3−SSEA−4、TRA 1−60、TRA 1−81、Oct−4、陰性のSSEA−1、テロメラーゼ活性、及びインビトロ及びインビボの多分化能(後者は、免疫不全マウスの奇形腫形成によって示される)(図1)。
【0106】
使用の前に、出発物質として使用されるhBS細胞株は、特徴プログラムに従うLOT製造に由来されてもよい。hBS細胞株のLOT製剤は、標準化方法に従う培養及び1つの単一継代における100ストロー以上の冷凍でのhBS細胞の拡張を構成する(出願中の特許国際公開WO2004098285)。hBS細胞株の形態は、冷凍の前後、更に、LOTからの細胞の解凍の後の次なる培養における連続的継代でモニタされる。LOT冷凍の品質は、10解凍の各ストローの100パーセントの解凍速度を示す解凍回復率の検査によって確認される。細胞の汚染がないことを確認するために、微生物学的安全に関する安全試験が、それから細胞及び冷凍経過における培養基に実行される。実行される特性解析プログラムは、hBS細胞株の分化状態を確認する方法の幅広い範囲を含む。未分化細胞(SSEA−1、SSEA−3、SSEA−4、TRA−1−60、TRA−1−81、Oct−4及びALP)のための一般に認められたマーカーの最初のマーカー発現分析において、実行される。継代の細胞の遺伝子の安定性及び冷凍−解凍サイクルが、染色体分析及びFISHで点検される。テロメラーゼ活性が、Telo TAGGG Telomerase PCR ELISAPLUSキットを使用して測定される。hBS細胞の多分化能が、胎様体ステップで試験管内の分化及び、免疫不全SCIDマウスの腎臓カプセルでのhBS細胞の移植による体内分化によって調べられる。
【0107】
ここで用いられる出発物質は、さらに完全に異種動物由来成分不含に由来されてもよく、それによって、完全な異種動物由来成分不含肝細胞様細胞が、再生医療の潜在的使用のために得られてもよい。hBS細胞の異種動物由来成分不含由来物のために、全ての培養基及びマトリックス構成要素、フィーダ細胞及び使用する他の材料は、いかなる人間以外の動物材料に由来又は接触しなくてもよい。hBS細胞の異種動物由来成分不含由来物のための適切な構成要素及び、異種動物由来成分不含肝細胞様細胞、異種動物由来成分不含由来のヒト線維芽細胞であり、たとえば、ヒト包皮線維芽細胞、組み換え型成長因子を有する無血清またはヒト血清ベースの培養基、分化因子および/または潜在的な他の添加物、及び、ヒト組み換え酵素または細胞の分離及び培養のための殺菌したメカニカルツールの何れかである。
【0108】
他の出発物質は内皮性細胞であり、すなわちすでに内胚葉血統へ取組まれたhBS細胞由来の細胞である。そのような細胞は、以下の内胚葉マーカーのうちの1つ以上を表示してもよい:HNF3ベータ(肝細胞核因子3)、Gata4、Cdx2(尾部関連ホメオボックス転写因子)、Sox 17(Sry−box含有遺伝子17の遺伝子製品)、及びPdx1(膵臓の十二指腸ホメオボックス因子−1)。
【0109】
本願発明の一実施例は本発明による肝芽細胞様細胞および/または肝細胞様細胞を含む集団の製剤のための方法に関し、次のステップを含んでいる:
i)無血清培地の支持マトリックスでhBS細胞またはhBS細胞由来前駆を少なくとも5日間、試験管内分化を行う。
ii)培養基を約5日から25日ごとに変える。
iii)機械的隔離によって細胞を分離する。
iv)酵素処理によってステップiii)において得られる細胞を任意に解離する。
v)表面抗原発現に基づいて細胞を任意にソートする。
【0110】
hBS細胞に由来される前駆は、HNF3ベータ及びAFPを表示してもよく、増殖能を有する。
【0111】
ステップi)のインビトロの分化は、少なくとも10日間(例えば少なくとも20日間、少なくとも30日間または少なくとも40日間)実行される。このステップの分化のために与えられる時間は、得られた細胞が肝細胞様細胞または肝芽細胞様細胞の特性を有するかを決定している。したがって、肝細胞様細胞を得るために、hBS細胞の試験管内分化または無血清培地での支持マトリックス上のhBS細胞由来前駆は、約18日から約30日まで実行され、好ましくは20−27日間、より好ましくは約25日間実行され、反対に、約5日から約10日間、好ましくは15日間肝芽細胞様細胞を得るために必要である。
【0112】
血清培地は、VitroHES(商標)、bFGFで補充されるVitroHES(商標)及びあらかじめ自己調整されたVitroHES(商標)(すでに肝細胞様細胞に改良される)からなる群から選択されてもよい。無血清培地は、bFGFを更に含み、その濃度は好ましくは約4ng/mlから約200ng/mlまでの濃度、例えば、約4ng/mlから約150ng/mlまで、約4ng/mlから約100ng/mlまで、約4ng/mlから約50ng/mlまで、または約4ng/mlから約10ng/mlまでである。
【0113】
本発明の一実施例において、無血清培地はbFGFを含んでいるVitroHES(商標)である。bFGFの濃度は、約4ng/mlから約200ng/mlまであってもよく、例えば、約4ng/mlから約150ng/mlまで、約4ng/mlから約100ng/mlまで、約4ng/mlから約50ng/mlまで、または約4ng/mlから約10ng/mlまでである。bFGFの濃度は、4ng/mlであってもよい。
【0114】
ステップii)において、無血清培養基は、約10日ごとから約20日ごと、例えば、約12−18日ごと、例えば14−15日ごとに変わってもよい。
【0115】
支持マトリックスは、例えば、ヒトまたはマウス・フィーダ細胞のようなフィーダ細胞を含んでもよく、または、定義済みまたは未定義の配合の細胞外基質を含んでもよい。あるいは、支持マトリックスは以下を含んでもよい:細胞培養に使用されるプラスチック細胞培養容器の内側にコーティングする、単独または組合せの、一つ以上のタンパク質を含むコーティング、または、三次元環境(例えば多孔性フィルタ)を含んでもよい。支持マトリックスとして多孔性フィルタを使用する場合、この多孔性フィルタは、直径が約4μmの孔サイズを有してもよく、単独でまたは組合せで、一つ以上のタンパク質でコーティングされてもよい。
【0116】
上記にて説明した容器またはフィルタコーティングするために使用する一つ以上タンパク質は、コラーゲン、ラミニン及びそれらの組合せからなる群から選択されてもよい。
【0117】
ステップiii)において実行される細胞のメカニカル分析は、細胞形態の視覚の点検で判断されることで肝芽細胞様細胞および/または肝細胞様細胞を取り出すことによって実行されてもよい。肝細胞様細胞は、肝細胞の典型的な形態学を表示する。すなわち、それらは多角形の細胞形状を有し、大きい細胞直径(凡そ25−50μM)は、しばしば核を二つもち、脂肪顆粒を蓄積する傾向がある。経験及び完全な実験によって、形態学は、肝臓マーカー(例えばアルファ−1−抗トリプシン、CK18、HNF−3ベータ、アルブミンまたはLFABP)の発現に関連づけられた。実行された選択は、免疫組織化学による識別によって肝芽細胞様細胞または肝細胞様細胞として更に検査されてもよい。メカニカル解剖の代わりに、それらが成長している表層及び、例えば酵素またはキレート化剤またはそれらの組合せから細胞を分離し、その後、例えばFACソート、磁気ビーズまたは免疫することによって細胞をソートする。細胞は、それから適切な培養および/または例えばインビトロの分析のために更に使われる数に相当するマルチウェルプレート分析容器に最後に接種されてもよい。
【0118】
本願明細書において記載されている方法によれば、本発明の細胞集団は、ヒトまたはマウス・フィーダ細胞のようなフィーダ細胞の存在下で得ることができ、さらにそれらはフィーダ細胞がない場合に得ることができる。フィーダ細胞がない場合、本発明の細胞集団は、定義済みまたは未定義の配合の細胞外基質、または単独または組合せで、一つ以上のタンパク質で内側がコーティングされたプラスチック細胞培養容器を使用して得ることができる。この目的の適切なタンパク質は、コラーゲン、ラミニン及びそれらの組合せからなる群から選択されてもよい。あるいは、本願発明の細胞集団は、三次元環境(例えば多孔性フィルタ)を使用することによって獲得してもよい。
【0119】
肝細胞様細胞を得る追加的な方法は、例えば異なる培養基配合によって刺激される3D培養における最終的に類似する内胚葉によって、肝細胞様細胞へhBS細胞を統制的に分化させることである。異なる因子または構成要素は、それからタイプ及び濃度(たとえば血清、培養基における成長因子及び他の刺激的な因子)に加えられるかまたは変化する。簡単に概説すると、未分化のhBS細胞部分は取り除かれて、たとえば24−ウェルプレートのフィルタ挿入紙へ移動されてもよい。全ての培養は、それから異なる培養基配合において育てられて、肝細胞様細胞または肝芽細胞様細胞の収穫を最大にするための一番よい時間枠を見つけるために、例えば異なる時間位置上の免疫組織化学分析のような分析を受ける。
【0120】
肝細胞様細胞または肝芽細胞様細胞を得るためのさらなる追加的方法は、例えばヒト成人肝臓または器官断片または他の種(例えばマウス胚の肝臓を実施例2で述べたように肝細胞様細胞の方へ分化するように刺激させる)の細胞型の肝臓断片を有するhBS細胞に由来されるhBS細胞または内胚葉前駆細胞を相互培養することである。そのようなシステムの相互培養は、3D構造(例えば肝細胞及びダクトの一群)の形成のために有益である。
【0121】
さらに、肝細胞様及び肝芽細胞様細胞の繁殖的な状態への誘導は、培養基の培養によって誘導されることが可能であり、それは、例えば成長因子を含んでいる肝細胞のために調整される。
【0122】
本発明の具体例において、得られた細胞集団は、異種動物由来成分不含であってもよい。
【0123】
本願発明の一実施例は、本発明の肝細胞様細胞を含む集団を生産するための改良された方法に関連し、その方法は、以下のステップを含む。
i)hBS細胞を育てることに適している培養基、例えばVitroHES(商標)培養基の中で最大10日から30日間、好ましくは例えば、15日目または23日目までの13日間から27日間、hBS細胞をインビトロで分化させ、例えば、培養基の100%が、新規な肝細胞培養基に取り替えられることができ、50%に変わる。
ii)10−40日目、好ましくは13−35日目、例えば15日目または23日目にHCM培養基のような肝細胞の培養のために最適化される新規な培養基に代わる。培養基は、以下の構成要素の一つ以上を含んでもよい:ウシ血清アルブミン、アスコルビン酸、上皮細胞増殖因子、トランスフェリン、インスリン、ヒドロコルチゾン及び抗生物質。
【0124】
交換する培養基の量は、30%から最高100%まで変動することができる。培養基は、一週間に三回、または一週間に一回交換され、好ましくは週に一度交換される。
【0125】
さらに、方法は次の工程を含んでもよい。
iii)高い濃度のデキサメタゾンを最大10日、好ましくは8日間、任意に加える。
iv)ナトリウム酪酸塩(NaB)及びHGFを最大10日、好ましくは5日間、任意に加える。
v)細胞を分離する。
vi)酵素処理によってステップii)において得られる細胞を任意に解離する。
vii)表面抗原発現に基づいて細胞を任意にソートする。
【0126】
全ての詳細及び以下の一般的方法で言及される詳細は、上述の特定の実施例に準用する。
【0127】
キット
本発明の別の態様は、以下を含んでいるキットに関する:i)肝細胞様細胞および/または肝芽細胞様細胞を含んでいる細胞集団、ii)一つ以上の成熟因子および/または成熟培養基、及びiii)任意的に使用指示書。成熟培養基は、VitroHES(商標)、bFGFで補充されるVitroHES(商標)、及びあらかじめ調整されたVitroHES(商標)(肝細胞様細胞上ですでに調整された)からなる群から選択されてもよい。
【0128】
一つ以上の成熟因子は、bFGF、上皮増殖因子、肝細胞増殖因子及びオンコスタチンMからなる群から選択される。
【0129】
さらに、キットは成熟をモニタするためのツールを含んでもよい。
【0130】
一実施例において、成熟をモニタするための道具は以下を含む:
i)HNF3ベータ、AFP、アルブミン、BSEP、MRP2、OATP−2、OATP−8、GST A1−1、CYP450−1A2、CYP450−2A6、CYP450−2B6、CYP450−2C8、CYP450−2C9、CYP450−2C19 CYP450−2D6、CYP450−2E1、CYP450−3A4、CYP450−3A7、GST M1−1及びUGTからなる群から選択される発現マーカーを符号化する遺伝子の少なくとも3つ、例えば少なくとも4つまたは少なくとも5つに対するPCRプライマー、及び
ii)ユーザーズ・マニュアル。
【0131】
他の一実施例において、成熟をモニタするためのツールは以下を含む:
i)HNF3ベータ、AFP、アルブミン、BSEP、MRP2、OATP−2、OATP−8、GST A1−1、CYP450−1A2、CYP450−2A6、CYP450−2B6、CYP450−2C8、CYP450−2C9、CYP450−2C19 CYP450−2D6、CYP450−2E1、CYP450−3A4、CYP450−3A7、GST M1−1及びUGTからなるグループから選択される発現マーカー抗原の少なくとも3つ、例えば少なくとも4つまたは少なくとも5つに対抗する抗体、および
ii)ユーザーズ・マニュアル。
【0132】
細胞をモニタするための追加的な道具は、PROD分析構成要素及び、培養基の尿素および/またはアルブミン検出のための構成要素である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0133】
【非特許文献1】シュヴァルツ、ロバート、E等、ヒト胚性幹細胞から機能的な肝臓細胞を発育するための限定条件、幹細胞及び発育 14:643−655(2005)。
【非特許文献2】Rambhatla、ヒト胚性幹細胞からの大量の肝細胞様細胞、Cell Transplant. 2003; 12(1):1−11
【非特許文献3】ハインズ等、ヒト胚性幹細胞の分化、由来物、特徴; StemCells; 2004; 22(3): 367−76.
【特許文献】
【0134】
【特許文献1】国際公開WO03055992、多能性胚盤胞由来幹細胞株の樹立方法
【特許文献2】国際公開WO2005/097980
【特許文献3】国際公開WO01/81549
【図面の簡単な説明】
【0135】
【図1】出発物質の特性、hBS細胞、即ち、(A)形態学、(B)SSEA−1(陰性)、(C)SSEA−3、(D)SSEA−4、(E)TRA−1−60、(F)TRA−1−81、(G)Oct−4、(H)ALP(すべてがhBS細胞株SA002、LOT AL002に由来)及び、右上に外胚葉性組織、右下の内胚葉組織、及び左の中胚葉性組織(hBS細胞株SA121に由来)印をつけられた外胚葉性組織を有する免疫不全マウスからのエオシン染色された奇形腫断片、ヘマトキシリンによって図解される(I)体内多分化能。
【図2】以下の肝臓マーカーに陽性染色した肝細胞様細胞を示す:(A)アルブミン、及び、(B)CK−18、(C)DAPI(核)、及び(D)フェーズ対照、すべてがSA002に、継代56、mEFsでの23分化日の後
【図3】以下の肝臓マーカーに陽性染色した肝細胞様細胞を示す:(A)AAT、(B)HNF3ベータ及び(C)DAPI、全てがSA034で、継代137、mEFでの分化の32日以後。
【図4】以下の肝臓マーカーに陽性染色した肝細胞様細胞を示す:(A)SA034でのLFABP、継代135、mEFでの25分化日後、及び初期の肝臓マーカー(B)AFPの弱陽性、SA002で、継代56、mEFでの23分化日の後。
【図5】SA002で(A)CK18と(B)Cyp1A2の共発現を示す。継代63、mEFでの23分化日の後。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図6】SA002での(A)CK18と(B)Cyp2A6の共発現を示す。継代63、mEFでの23分化日の後。Cypタンパク質発現は、さらにリファンピシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジド(データは示されない)のCYP誘発因子混合を使用して、更に誘導されることができる。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図7】継代63、mEFでの23分化日後の、SA002での(A)CK18と(B)Cyp2B6の共発現を示す。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図8】継代63、mEFでの23分化日後の、SA002での(A)CK18と(B)Cyp2C8/9/19の共発現を示す。Cypタンパク質発現は、さらにリファンピシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジド(データは示されない)のCYP誘発因子混合を使用して、更に誘導されることができた。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図9】継代63、mEFでの23分化日後の、SA002での(A)CK18と(B)Cyp2D6の共発現を示す。Cypタンパク質発現は、さらにリファンピシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジド(データは示されていない)のCYP誘発因子混合を使用して、更に誘導されることができた。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図10】mEFでの23分化日後の、継代63での、SA002での(A)CK18と(B)Cyp2E1の共発現を示す。Cypタンパク質発現は、さらにリファンピシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジド(データは示されない)のCYP誘発因子混合を使用して、更に誘導されることができた。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図11】mEFでの23分化日後の、継代63での、SA002での(A)CK18と(B)Cyp3A4/7の共発現を示す。Cypタンパク質発現は、さらにリファンピシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジド(データは示されない)のCYP誘発因子混合を使用して、更に誘導されることができた。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図12】誘導混合物処理後にウエスタンブロット法によって視覚化される肝細胞様細胞のCyp3A4/7及びCyp1A2の誘導性を示す。mEFで23−25日の分化後の継代51、53、54及び55のSA002(LOT AL002)及び、23−25日の分化後の継代51、53、54及び55のSA002.5(LOT BE002.5)での誘導されたhBS細胞(リファンピシンのCyp誘発因子混合、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及び96時間イソニアジド)非処理のhBS細胞:SA002(LOT AL002)、継代47、52及び56、19−23日の分化後、及びSA002.5(LOT BE002.5)継代48、53及びmEFで55、19−26日の分化後。HepG2(Cat No HB−8065, ATCC):陰性対照としての継代23。陰性対照としての継代2での主たるケラチン生成細胞(Cat No C−12003、Promocell))。陽性対照として使われ、解凍及び最近準備したヒト初代肝細胞(男性の及び女性の)。ベータ−アクチンが、内部ローディング対照として使われた。
【図13】PROD分析を使用する一般のCyp活性を示す。画像明るさによって視覚化される、Cyp誘発因子(上記の通り)処理において活性は増加する。位相コントラスト(A)及びPROD蛍光(B)の非処理の細胞、位相コントラスト(C)及びPROD蛍光(D)の誘導された細胞。位相コントラスト(E)及びPROD蛍光(F)における技術的対照(細胞にPRODを追加することなく)。全ては、mEFで26日分化後に、継代56のSA002の画像である。灰色のスケールのよりよく明るさを視覚化するためにAdobe Photoshopを使用している、赤から黄に変わる画像。
【図14】リファンピシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジドの混合を加えることによって、(A)前で誘導(B)後のGST A1−1、(C)前で誘導(D)後のGST M1−1、及び(E)前で誘導(F)後のGST P1−1の発現を示す。GST M1−1及びGST P1−1のはっきりした誘導は、観察されることができないが、GST A1−1のわずかな誘導は発見された。よりよく灰色のスケールの明るさを視覚化するために、Adobe Photoshopを使用して、赤から黄色に変わる画像。
【図15】誘導混合物処理の後のウエスタンブロット法による、肝細胞様細胞におけるGST A1−1の誘導を示す。96時間リファンピシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジドのCYP誘発因子混合による処理及び非処理での、mEFの分化の20−26日後の、SA002.5(LOT BE002.5)継代35、36、43及び46、及びSA167(LOT CE167)継代17、18,25及び28。GSTタンパク質製剤及びヒト男性及び女性の最近備えた(解凍した)、初代肝細胞が、対照として使われた。
【図16】3つの異なるhESC株及びヒト肝細胞及びHepG2細胞に由来する肝細胞様細胞のCDNBへのGST酵素活性、全タンパク質(平均±SD(n=3))のμmol培養基共役/分/mgとして示される。
【図17】フェーズII代謝酵素UGT1A1及びUGT1A6の肝細胞様細胞の免疫反応性を示す。CK18(B)と共発現されるUGT1A1(A)、及びCK18(D)と二重着色されるUGT1A6(C)、全てが、mEFでの24日分化後の、SA002で継代59にある。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図18】薬物輸送体OATP−2/8のための肝細胞様細胞の免疫反応性を示す。継代56、SA002の(A)DAPI、(B)OATP−2/8、(C)位相コントラスト、mEFでの23日分化後。よりよく灰色のスケールの明るさを視覚化するためにAdobe Photoshopを使用して赤から黄に変わる画像。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図19】薬物輸送体BSEPのための肝細胞様細胞の免疫反応性を示す。mEFで23日分化後、SA002の継代32の(A)DAPI、(B)BSEP、(C)位相コントラスト。よりよく灰色のスケールの明るさを視覚化するためにAdobe Photoshopを使用して赤から黄に変わる画像。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図20】薬物輸送体MRP−2のための肝細胞様細胞の免疫反応性を示す。mEFで22日分化後、SA002の継代33の(A)DAPI、(B)MRP−2、(C)位相コントラスト。よりよく灰色のスケールの明るさを視覚化するためにAdobe Photoshopを使用して赤から黄に変わる画像。反応性は、顕微鏡及び色において明らかに視覚化されることができる。
【図21】細胞株SA002、LOT AL002からの肝細胞様細胞のグリコーゲンの保管を示す、21日分化後の継代15。グリコーゲンは、PAS染色−システムによってピンクの染色として検出される。培養は、(BとD)のどちらで処理されるかまたは、グリコーゲン検出の前にヒト唾液(A及びC)で処理されていない。
【図22】マトリゲルに分化する肝細胞様細胞のCYP及びGST免疫染色を示す。SA002及びp57での(B)Cyp2B6と共発現される(A)Cyp1A2および(D)GST A1−1と共発現される(C)CK18、マトリゲルでの24日間の分化後。よりよく灰色のスケールの明るさを視覚化するためにAdobe Photoshopを使用して赤から黄に変わる画像。
【図23】cDNAの同じ総量からの未分化のhBS細胞の対照サンプル(BE002.5継代24、5日(対照サンプル1)及びBE002、継代62、4日(対照サンプル2))に関連する21分化日の継代2の、細胞株SA002.5、LOT BE002.5から肝細胞様細胞におけるQPCRを使用して高いMRP−2発現を示す。発現レベルは、3つの細胞サンプルのために得られるCT値(閾値サイクル)から算出され、さらに対照サンプル2の発現に比較される。肝細胞様細胞のMRP2発現は、未分化細胞のものより11から32倍高い。
【図24】肝細胞様細胞におけるCyp1A2発現の誘導を示す。非処理の肝細胞様細胞(A)及び、対応する位相コントラスト(B)及び、誘導された(C)及び、対応する位相コントラスト(D)。よりよく灰色のスケールの明るさを視覚化するためにAdobe Photoshopを使用して赤から黄に変わる画像。
【図25】肝細胞様細胞でのCyp2B6発現の誘導を示す。非処理の肝細胞様細胞(A)及び、対応する位相コントラスト(B)及び、誘導された(C)及び、対応する位相コントラスト(D)。よりよく灰色のスケールの明るさを視覚化するためにAdobe Photoshopを使用して赤から黄に変わる画像。
【図26】胚マウス肝臓と共培養されるhBS細胞によって形成されるAFP陽性の肝芽細胞様細胞を示す。赤(特徴的に核を染色してある)のヒト特定の核抗原、hBS細胞は緑の内胚葉由来されたAFP陽性の大きいクラスタを引き起こしていることを示す(実施例2を参照)。
【図27】細胞株SA167(A及びB)、SA002(CおよびD)及びSA002.5(E及びF)に由来した非処理及び誘導された肝細胞様細胞のCyp1A2、3A4/7及び1A1タンパク質発現のウエスタンブロット法分析を示す。A、C、E:非処理の細胞、B、D、F:誘発因子カクテルで処理される細胞、G:ヒト肝細胞Lot GIU 22(CYP1A1 Lot MYO)、H:未分化のhESC株SA002.5、I:MEF、J:HepG2細胞及びK:組み換え型CYP1A1。
【図28】(A)は、肝臓/内胚葉マーカーHNF4アルファの反応を示す。(B)は、集団における繁殖細胞の割合を示すために使用されるマーカーであるKi67の反応である。(C)は、多くの肝芽細胞様細胞に共存されるHNF4アルファ及びKi67を示す。(D)はDAPI(染色核)示す。(E)は形態学を示す。
【図29】培養基への反応として増殖能に関連する結果及びその誘導を示す。(実施例4を参照)。VitroHES(商標)の培養された(A)−(C)は SA002細胞の肝細胞様細胞を示す。(A)は、形態学を示している。(B)KI67マーカー反応なしをを示す(即ち、増殖なし)。(C)肝臓マーカー・アルファ−1−抗トリプシン反応を示している。(D)−(F)は、Willimas E培養基で培養された肝細胞様SA002細胞を示す。(D)は、形態学を示している。(E)KI67マーカー(増殖)反応を示している。(F)は、肝臓マーカー・アルファ−1−抗トリプシン反応を示している。
【図30】肝細胞様細胞及び初代肝細胞のEROD反応を示す。左の欄は、(上部から)未処理、オメプラゾール+リファンピン誘導、及び6−構成要素カクテル誘導の肝細胞様細胞でのEROD活性を示し、右側の欄は、初代肝細胞の対応結果を示す。肝細胞様細胞は、したがって、特定のCyp1A2反応性を有し、それは、非常に弱いながら、Cyp誘発因子処理の前に検出された。(実施例13を参照。)
【図31】HepG2と比較して肝細胞様細胞由来のhBS細胞におけるCyp活性を示す。(A)及び(D)は、非処理の肝細胞様細胞を示し、(B)及び(E)は、誘導肝細胞様細胞を示し、(C)及び(F)は、HepG2を示す。
【図32】肝細胞様細胞及び初代肝細胞のPROD反応を示す。左の欄は、(上部から)非処理、プリミドン誘導、及び6−構成要素カクテル誘導の肝細胞様細胞でのPROD活性を示し、右側の欄は、初代肝細胞の対応する結果を示す。肝細胞様細胞は、したがって、Cyp誘発因子処理の前に一般のCyp活性を有する。(実施例4を参照。)
【図33】肝細胞小管区分(左)を有するラット肝細胞(lan Cotgreave教授からの画像)及び小管類似構造(右)を有する肝細胞様細胞を示す。
【図34】hBS細胞から肝芽細胞様細胞を経過して肝細胞様細胞の由来物のためのフローチャートを示す。
【図35】17日間後の培養下の膜表現型Notch2(膜組織で、緑の)及び細胞株SA461(継代26)の核染色(青の)の発現を示す。矢印は、双核肝細胞様細胞を示す。拡大倍率250x。
【図36】Cyp3A4、3A7、1A1、1A2及びCyp2A6の相対的な遺伝子発現レベルが肝細胞様細胞、HepG2及びヒト肝エキスの誘導及び非誘導培養のリアルタイムPCR技術によって測定及び比較されたことを示す。ヒト肝エキスの測定は、1にセットされ、他のサンプルは、各々のシトクロムp450のヒト肝臓基準に関連する。全ての遺伝子のための発現は、GAPDH(CYP1A1/1A2、CYP2A6またはTBP(CYP3A4/3A7)に対して標準化される。
【図37】肝細胞様細胞を培養するための培養基の改良の研究デザインを示す。研究デザインA;培養基の100%は、15日後にVitroHES(商標)からHCMに交換され、23日に50%のHCMは、新規なHCM−培養基と取り替えられた。実験は、細胞株SA002で行われた。研究デザインB;培養基の100%は、23日後にVitroHES(商標)からHCMに交換された。実験は、細胞株SA348で行われた。
【図38】研究デザインA及びB、図37及び実施例1、2及び表5に基づいて、それぞれVitroHES(商標)(A)及びHCM(B)で培養された肝細胞様細胞の形態を示す。
【図39】研究デザインA及びB、図37及び実施例1、2及び表5に基づくHCMと比べて、VitroHES(商標)でのHNF4−アルファ、アルブミン、CYP3A4及びUGT2B7の相対的なmRNA発現レベルを示す。参照プロトコル(VitroHES(商標))からのデータは、1に設定され、HCM−培養基による異なる遺伝子の発現レベルの倍増加は、グラフに示される。
【図40】肝細胞様細胞を培養する培養基での増強剤及び誘導因子のための研究計画を示す。研究デザインC;50μmデキサメタゾンが、22−24日以後に加えられた。実験は、細胞株SA002、SA167及びSA348で行われた。研究デザインD;VitroHES(商標)培養基が、別の5日間、HGF及びナトリウム酪酸塩(NaB)で補充されるHCM−培養基に、21日後に交換された。
【図41】研究デザインC、図40及び実施例1、2、3及び表6に基づいて、VitroHES(商標)(A)及び50μmデキサメタゾンで補充されるVitroHES(商標)(B)で培養された肝細胞様細胞の形態を示す。同じく、研究デザイン D、図40及び実施例1、2及び表7に基づいて、C)VitroHES(商標)、HGF及び酪酸ナトリウムで補充されるD)HCMで培養された肝細胞様細胞。
【図42】A)研究デザインC、図40及び実施例1、2、3及び表6に基づいて、50のμmデキサメタゾン処理の後の肝細胞様細胞でのHNF4−アルファ、アルブミン、CYP3A4及びUGT2B7の相対的なmRNA発現レベルを示す。B)研究デザインD、図40及び実施例1、2及び表7に基づく、酪酸ナトリウム及びHGF処理後の相対的mRNA遺伝子発現レベルを示す。参照プロトコル(VitroHES(商標))からのデータは、1に設定され、異なる処理による異なる遺伝子の発現レベルの倍増加は、グラフに示される。
【図43】培養基置換頻度、希薄及び頻繁な培養基置換のための研究計画を示す。HCM及びVitroHES(商標)が使われた。
【図44】研究デザインE、図43及び実施例1、表8に基づく、希薄な(A)対頻繁な(B)培養基置換後の肝細胞様細胞の形態を示す。
【図45】研究デザインE、図43及び実施例1、表8に基づく、頻繁な培養基置換と比較したまれな培養基置換後のHNF4−アルファ、アルブミン、CYP3A4及びUGT2B7の相対的なmRNA遺伝子発現レベルを示す。頻繁な培養基置換からのデータは、1に設定され、まれな培養基置換後の異なる遺伝子の発現レベルの倍増加は、グラフに示される。
【図46】96−ウェルにコーティングされるコラーゲンIに38日旧肝細胞様細胞を再接種後の3日(A)から6日(B−C)まで。肝細胞様細胞の外植体は、再接種する前に、Ca及びMg−フリーPBS(A)またはコラゲナーゼ(B−D)に処理された。培養物は、肝細胞マーカーCK18(B,D)及びHNF3ベータ(C)のために、二倍染色される。図尺度:100μm(A)及び50μm(B−C)。実験的な詳細のために、実施例15を参照。
【図47】(A−C及びG−I)及びmEF−細胞層(D−F及びJ−L)96−ウェルにコーティングされるコラーゲンIに再接種の5日後、肝芽細胞様細胞の免疫細胞学及び形態を示す。培養物は、肝芽マーカーHNF4アルファ(A、B、D、E)及びCK19(G、H、J、K)のために染色された。核染色のためのDapiを有するマーカーのオーバレイ図は、B、E、H及びKに示される。各々の染色のための対応の形態図は、C、F、I及びLでそれぞれ見られる。図Cの矢印は、重核細胞を示す。図尺度:25μm;40x対物レンズが使われた。実験的な詳細のために、実施例18を参照。
【図48】30日の旧培養における肝細胞様細胞のICG摂取を示す。
【図49】15日の旧培養での肝芽を示す。細胞は、CK19(A)、CK7(B)及びEpCam(C)に陽性である。
【発明を実施するための形態】
【実施例1】
【0136】
出発物質
本発明のための出発物質は、例えば未分化のhBS細胞株のような最適に多能性未分化のhBS細胞である。前記材料は、Cellartis社から得られることができ、さらにNIH幹細胞レジストリを通して入手できる。http://stemcells.nih.gov/research/registry/。Cellartis ABは、2種のhBS細胞株(SA001及びSA002)を有し、SA002(SA002.5)の1つのサブクローンがNIHを通して入手できる。加えて、20のCellartis細胞株は英幹細胞バンクにリストされる。それらのhBS細胞株及び加えて、Cellartis社からのSA167及びSA348が、本願発明において多用された。出発物質として推薦されるhBS細胞の特性は、以下である:アルカリホスファターゼ、SSEA−3、SSEA−4、TRA 1−60、TRA 1−81、Oct−4の陽性反応、SSEA−1の陰性反応、テロメラーゼ活性、及びインビトロ及び体内の多分化能(後者は免疫不全マウスの奇形腫形成によって示される)(図1を参照)(方法及びプロトコルはすでに開示された。ハインズその他、国際公開WO03055992)。
【0137】
LOT調製及び特性解析プログラム
hBS細胞株のLOT調製は、標準化された方法に基づくhBS細胞の培養拡張及び、次の1つの単一通過での100本以上のストローの冷凍を構成する(出願中の特許国際公開WO2004098285)。hBS細胞株の形態は、冷凍の前後、更に、LOTからの細胞の解凍後の次の培養における連続的な継代でモニタされる。LOT冷凍の品質は、解凍回復率の検査によって確認され、それは、10解凍の各ストローのための100%の解凍速度を示す。すなわち、細胞材料は、解凍時に各々のガラス化ストローから二次培養されることができる。微生物学的に安全に関する安全試験は、細胞に汚染がないかを確認するために、それから細胞及び冷凍継代での培養基に実行される。実行される特性解析プログラムは、hBS細胞株の分化状態を確認するために方法の幅広い範囲を含む。最初に、未分化の細胞(SSEA−1、SSEA−3、SSEA−4、TRA−1−60、TRA−1−81、Oct−4及びALP)のための一般に認められたマーカーのマーカー発現分析が、実行される。継代全体における細胞の遺伝子安定性及び冷凍−解凍サイクルは、染色体分析及びFISHで点検される。テロメラーゼ活性は、Telo TAGGG テロメラーゼ PCR ELISAPLUSキットを使用して測定される。hBS細胞の多分化能は、胚様体ステップによる試験管内分化及び、免疫不全SCIDマウスの腎臓被膜でのhBS細胞の移植による体内分化によって調べられる。
【0138】
ここで用いられる出発物質は、さらに、完全に異種動物由来成分不含であってもよく、それによって、異種動物由来成分不含肝細胞様細胞は、再生医療の潜在的使用のために得られて、したがって、組織不適合性及び人間外の病原体の潜在的転送の危険度をかなり減少させる。hBS細胞の異種動物由来成分不含由来のために、全ての培養基及びマトリックス構成要素、フィーダ細胞及び使用する他の材料は、いかなる人間以外の動物材料に由来、または接触してはならない。hBS細胞の異種動物由来成分不含由来のための適切な構成要素及び、異種動物由来成分不含肝細胞様細胞は、異種動物由来成分不含のヒト線維芽細胞であり、それは、例えばヒト包皮線維芽細胞、ヒト組み換え型成長因子を有する培養基ベース無血清またはヒト血清、分化因子および/または潜在的他の添加物、及び細胞の培養及び分離のための殺菌メカニカル道具またはヒト組み換え酵素である。
【実施例2】
【0139】
肝細胞様細胞を得るためのプロトコル
内因子プロトコル(分化は、培養基に分泌される内因子への暴露によって誘導される)
a)IVF培養皿(ファルカン)でのmEF細胞層で育てられるhBS細胞は、肝細胞様細胞を得るために、37度、5%のCO2及び95%の湿度の下で最高40日間分化させられる。使用する培養基(4ng/mlの加えられるヒト組み換え型bFGF [インビトロゲン]を有するVitroHES(商標)[ Vitrolife AB ])は、おおよそ1から2mlの旧培養基を放棄し、1から2mlの新しい培養基に加えることによって、7日及び21日ごと、通常14日ごとに変えられる。18日から30日後に、肝細胞様細胞は、カット及び転送ツールとして鋭いミクロ毛細管またはStem Cell Tool(商標)(Vitrolife AB)を使用して培養から分離され、細胞はそれから長期保存(冷凍された)または即時利用のためにプールされるか、または培養皿に直接染色されるかまたは固定されるかまたは、例えばCyp活性分析の生体細胞として使用される。hBS細胞の分化がmEFS(例えばマトリゲル上のhBS細胞培養)の非存在下で徹底的に変更されるので、mEFSは肝細胞様細胞の発育を支える基本的信号を提供するようであり、少ない肝細胞様細胞が、その培養(データは示されてない)から得られることができる。これは、そのような培養物のためのmEF−馴化培地を用いて、培養基へのmEFsによる因子の分泌物を指定して部分的に救われることができる。従って、我々は、培養期間で培養基を二度以上に変えることは、肝細胞様細胞を得るための不利な点であることを観察した。肝細胞様細胞を得るための重要なもう一つの要素は、bFGFで培養基を補充することである。
【0140】
b)4ng/mlのbFGFで補充されるmEF馴化培地Matrigel(商標)(ベクトン−ディッキンソン)で育てられるhBS細胞は、肝細胞様細胞を得るために、37度、5%のCO2及び95%の湿度下で最大40日間、分化される。使用する培養基は、7日及び21日ごとの間で変えられる。18日から30日あとに、肝細胞様細胞は、カット及び転送ツールにとして鋭いミクロの毛細管またはStem Cell Tool(商標)を使用して培養物から分離され、細胞は、それから長期保存(冷凍された)または即時利用のためにプールされるかまたは、固定及び例えば免疫組織化学の特性解析のために使用される。
【0141】
肝細胞様細胞及び分化細胞集団を有する培養皿内の肝芽細胞様細胞の選択が手動で実行され、大部分は形態学に依存する。形態学は、主に免疫組織化学を使用する以前の経験及び完全な実験によって肝臓マーカー発現に関連づけられ、それは例えば実施例3から7までにリストされる。その経験で、熟練した人は、形態学によって能動的に肝細胞様細胞を選ぶことができる。
【0142】
肝芽細胞様細胞を得るために、同じプロトコルが使われるが、潜伏期間は、10日から20日間、好適には15日間短くなる。
【0143】
フィルタ培養
IVF皿内のmEFで5日から10日間培養された未分化hBS細胞(BE002.5継代42)は、小さい断片に切られ、ガラス毛細管を用いて、400μl培養基を含んでいる24−ウェルプレートのフィルタ挿入紙(孔サイズ:4μmの直径、外植体培養のために特殊化される、ミリポア)に移動される。フィルタは、培養基に細胞がおぼれることを妨げながら、細胞の栄養摂取を可能にし、水分環境をつくる培養基面と接触し、それによって、体内状況は、模倣される。培養基は、50%のVitroHES(商標)及び4ng/mlのbFGFで補充されるmEF内の未分化のhBS細胞からの50%の馴化培地を構成する。半分の培養基は、一日おき又は3日ごとに変えられる。細胞は、分析の前にそれぞれ7、14、21及び31日間分化する。3D−hBS細胞培養は、免疫組織化学によって分析される。培養物は、30%のサッカロースの低温保存の後に4%のPFAに取り付けられ、Sakura O.C.T. tissue−tekに組み込まれる。10μmのアールのクリオ切片は、異なる内胚葉の免疫反応性のマーカー及び肝細胞様マーカーために形態学的に分析される。
【0144】
共同培養プロトコル
マウス胚肝臓の器官形成は、三次元フィルタシステムの肝細胞様細胞へのhBS細胞分化を促進することができる。異なる発育的な段階におけるEGFP(強化された緑の蛍光タンパク質)トランスジェニック・マウス胚の肝臓外植体は分離され、フィルタシステムで培養されるhBS細胞に移植される。対照培養物として、hBS細胞のみ、または肝臓以外のマウス胚外植体(心臓及び卵黄嚢)は、hBS細胞に移植され、フィルタ上で培養された。共同培養物は、4ng/mlのbFGFで補充されるVitroHES(商標)で培養され、培養基の50%は、第2日又は第3日ごとに交換された。7日目及び14日目に、共培養が免疫組織化学分析のために用意された。HNF3ベータ、AFP、HNF4アルファ、CK18、CYP3A4/7及びCYP1A2/1のような内皮性及び肝臓マーカーが分析された。
【0145】
内胚葉由来構造の量または数は、4つのカテゴリ、即ち小さいクラスタ、大きいクラスタ、ダクト及びライニング、皮覆組織(下の定義を見る)に分けられた。皮覆組織を除いて、構造は内胚葉及び初期の肝臓マーカーAFP、HNF3ベータ及びアルファ−1−抗トリプシンeに陽性だった。異なる構造の数は、各々の断面及び培養物のために計数された。各々の構造の総数が、各々の共培養のために計数された断面の数に割られた。これは、構造が断面につきどれくらいよく起こっているかを測定する数値をもたらし、三次元hBS細胞共培養での内胚葉構造の数量の表示を与える。平均値及び各グループ(n=3)の平均(SEM)の標準エラーが算出された。研究は、二回繰り返された。
【0146】
小さいクラスタが、AFPに陽性である5つの細胞より少ないかまたは同じ数の集合として定義された。大きいクラスタは、AFPに陽性である6つの細胞より多いかまたは同じ数の集合として定義された。ダクト及びライニングは、単一またはマルチ層中空構造として定義される一般的なカテゴリを形成した。皮覆組織は、細胞のAFP陽性ライニングまたはクラスタと関連する堅い列の細長い核を有する有機物化される構造として定義された。皮覆組織は、AFPに決して陽性でない。14日目において、ダクト及びライニングが単にマウス胚外植体移植片を含むグループに存在する場合、全てのグループは、小さいクラスタの類似した量を現し、それで、自発的に分化するhBS細胞は、ダクト及びライニングを形成する傾向ではなかった。しかし、大きいクラスタは、卵黄嚢及び心臓共培養と比較してよりよく肝臓共培養で発生し、自発的に、hBS細胞を分化させた。組織、例えば大きいクラスタ及びダクトは、例えばHNF3ベータ、AFP、アルファ−1−抗トリプシン、Hnf4アルファ、CYP3A4/7及びCYP1A2/1のような内胚葉及び肝臓マーカーに陽性であった。しかし、クラスタは未成熟肝細胞様細胞を潜在的に示しているCK18に陰性であった。
【0147】
全体的に、データは、hBS細胞が単独より肝臓との直接の接触時に、E10.5マウス胚から肝芽細胞様細胞または肝細胞様細胞により有効に分化させることができることを示す。
【0148】
表1は、E10.5胚マウス肝臓のhBS細胞の共培養の14日後に、免疫組織化学によって分析される肝臓マーカーの一覧を示している。
【0149】
【表1】
【実施例3】
【0150】
肝臓マーカーによる特性解析(図2、3及び4を参照)
肝細胞様細胞は、肝細胞の典型的な形態学を表示する。すなわち、それらは多角形の細胞形状、大きい細胞直径(凡そ25−50μM)を有し、よく核を二つもち、脂肪顆粒を蓄積する傾向がある。さらに、それらは肝臓細胞型のために記載されるいくつかのマーカー、例えばアルブミン、アルファ1−抗トリプシン、LFABP、CK18及びHNF3ベータを表示する。それらは未分化の細胞のために使われる幹細胞マーカーであるOct−4をもはや表示しない。おそらくいくつかの未成熟肝細胞様細胞は依然として胎児の肝臓マーカーAFPを表示する。これらの細胞は、優先して分化hBS細胞のコロニーで見つかる。細胞核を視覚化する対照としてのDAPI(4’,6’−diamidino−2−phenylindole dihydrochloride hydrate. Sigma Aldrich)。(マトリゲル(商標)で分化された肝細胞様細胞のCK18発現のために図22を参照。)
【0151】
繁殖的な肝芽細胞様前駆細胞の識別のために、AFP、HNF4アルファ、CK19、CK7及びEpCamが、使われた。(図49)
【0152】
使用された一次抗体:
アルブミン(ウサギ)1:500、DAKOCytomation、A0001
AAT(ウサギ)1:200、DAKOCytomation、A0012
CK18(マウス)1:200、DAKOCytomation、M7010
LFABP(ヤギ)1:500、サンタクルーズ、sc−16064
HNF3b(ヤギ)1:250、サンタクルーズ、sc−6554
Oct−4(マウス)1:500、サンタクルーズ、sc−5279
c−Met(HGF受容体(マウス))1:100、upstate、05−237
アルファ6−インテグリン(CD49f(ラット))1:250、BD バイオサイエンス、555736
ICAM−1(CD54(マウス))1:500、BD Pharmingen、559047
AFP(マウス)1:200、SIGMA、A8452
HNF4アルファ(ウサギ)1:400、サンタクルーズ、sc−8987
CK19(マウス)1:200、Novocastra、NCL−CK19
CK7(マウス)1:200、Novocastra、NCL−L−CK7−560
EpCAM−FITC(1:200)GeneTex社 GTX28666
【0153】
使用された第2の抗体:
−donkey anti−goat−Alexa 488、1:500、Molecular Probes、# A−11055
−donkey anti mouse−Cy3(1:1000)Jackson Immuno Research #715−165−151
−donkey anti−mouse−Cy2(1:100)Jackson Immuno Research #715−225−151
−donkey anti−rabbit−Alexa488(1:1000)Molecular Probes #A−21206
−donkey anti−rabbit−Alexa594(1:1000)Molecular Probes #A−21207
−donkey anti−rat−Cy3(1:500)Jackson Immuno Research #712−165−153
−donkey anti−rat−Cy2(1:100)Jackson Immuno Research #712−225−153
【0154】
免疫染色プロトコル:
アルブミン、AAT、CK18、HNF3b、Oct−4、CK19、CK7、AFP:
4%PFAに15分凝固し、2回PBS洗浄し、0,1% PBTの5%FBSに30分入れ、一次抗体を0.1%PBTの1%FBS中で4℃で一晩培養させ、二次抗体を0.1%PBTの1%FBS中で常温で3時間培養させ、全ては0.1%PBT、0.05mg/mlのDAPIの中で常温で5分間洗浄され、DAKOCytomation封入剤のなかで組み込まれる。
【0155】
LFABP、c−Met、アルファ6−インテグリン、ICAM−1、CXCR4:
4%PFAに15分凝固し、2回PBS洗浄し、PBS内の5%FBSに30分入れ、一次抗体をPBTの1%FBS中で4℃で一晩培養させ、二次抗体をPBTの1%FBS中で常温で3時間培養させ、全ては0.05mg/mlのPBS、DAPIの中で常温で5分間洗浄され、DAKOCytomation封入剤の中で組み込まれる。
【0156】
EpCam:
4%PFAに15分凝固し、2回PBS洗浄し、0,1%PBTの5%FBSに30分入れ、0.1%PBTの1%FBS中で4℃で一晩培養される一次抗体を直接活用するFITC、0.05mg/mlのPBS、DAPIの中で常温で5分間洗浄され、DAKOCytomation封入剤の中で組み込まれる。
【実施例4】
【0157】
特徴描写
フェーズI代謝酵素:
肝細胞様細胞は、以下のCypsの免疫反応性を表示する:1A2、2A6、2B6、2C8/9/19(3つの亜類型間の潜在的抗体交差反応)、2D6、2E1、3A4/7(2つの亜類型間の潜在的抗体交差反応)。(mEFに分化される肝細胞様細胞は図5−11を参照、マトリゲル(商標)で分化された肝細胞様細胞でのCyp1A2及びCyp2B6発現は、図22を参照)。Cyp発現誘導性は、25μMリファムピン、20μMデソキシフェノバルビタール(プリミドン)、100μMデキサメタゾン、88mMのエタノール、25μMオメプラゾール及び100μMイソニアジドを含むCyp誘導混合物に96時間の暴露の後に見られた。(mEFでの肝細胞様細胞のCyp 1A2及び2B6の誘導について、図24及び25を参照)CypsはさらにHepG2内で免疫組織化学的に分析された。それは、いかなる反応も引き起こさなかった(図31を参照)。
【0158】
使用された一次抗体:
Cyp1A2(ウサギ)1:100、biomol、CR3130;
Cyp2A6(ウサギ)1:100、biomol、CR3260;
Cyp2B6(ヒツジ)1:100、biomol、CR3295;
Cyp2C8/9/19(ウサギ)1:100、biomol、CR3280;
Cyp2D6(ヒツジ)1:100、biomol、CR3245;
Cyp2E1(ウサギ)1:100、Chemicon、AB1252;
Cyp3A4/7(ヒツジ)1:100、biomol、CR3345;
Cyp2E1(ウサギ)1:1000、Oxford Biomedical Research、PA26;
Cyp3A4/7(ウサギ)1:1000、Oxford Biomedical Research、PA32。
【0159】
使用された第2の抗体:
−donkey anti−goat−Alexa 488, 1:500, Molecular Probes, # A−11055
−donkey anti mouse−Cy3, 1:1000, Jackson Immuno Research, #715−165−151
−donkey anti−mouse−Cy2, 1:100, Jackson Immuno Research, #715−225−151
−donkey anti−rabbit−Alexa488, 1:1000, Molecular Probes, #A−21206
−donkey anti−rabbit−Alexa594, 1:1000, Molecular Probes, #A−21207
−donkey anti−rat−Cy3, 1:500, Jackson Immuno Research, #712−165−153
−donkey anti−rat−Cy2, 1:100, Jackson Immuno Research, #712−225−153
−donkey anti−sheep−Alexa488, 1:1000, #A−11015
−donkey anti−sheep−Alexa594, 1:1000, #A−11016
【0160】
免疫染色プロトコル:
4%PFAに15分凝固し、2回PBS洗浄し、0,1%PBT内の5%FBSに30分入れ、
一次抗体を0.1% PBTの1%FBS中で4℃で一晩培養させ、二次抗体を0.1%PBTの1%FBS中で常温で3時間培養させ、全ては0.1% PBT、0.05mg/mlのDAPIの中で常温で5分間洗浄され、DAKOCytomation封入剤の中で組み込まれる。
【0161】
ウエスタンブロット法:
Cyp1A2及び3A4/7発現は、ウエスタンブロット法(図12を参照)において確認された。Cyp誘導剤処理で、1A2及び3A4及びまたは3A7のタンパク質量(潜在的交差反応)は、非処理及び誘導の細胞からのタンパク質バンドに比べて肝細胞様細胞の誘導性の視覚化を明らかに強化した。タンパク質は、M−PERタンパク質摘出試薬(ピアス)を使用して細胞から抽出され、1:100プロテアーゼ抑制剤カクテル(シグマ−アルドリッチ)で補充される。タンパク質は、電気泳動法によって12%のSDSポリアクリルアミドゲルで分離され、ニトロセルロース膜組織に変えられる(Biorad、ヘラクレス、CA)。免疫ブロット法のために、(Cyp1A2(ウサギ)及びCyp3A4/7(ウサギ)、両方ともBiomolから)に対する一次抗体は、1%のBSAブロッキングバッファーに希釈された。二次抗体は、対応HRP−共役抗体であった(それぞれヤギ抗ウサギ、ヤギ抗マウス及びウサギ抗ヤギ(1:2000; DAKO、Glostrup、デンマーク))。強化化学ルミネセンス(ECL)が、製造業者の指示(Amersham、Piscataway、NJ)によって使われた。HepG2細胞が、陰性対照として使われた。一次ヒト肝細胞(インビトロ テクノロジーズ、ライプツィヒ、ドイツにおいて)が、陽性対照として使われた。
【0162】
追加的な実行において、Biomol(ウサギpAb、CR130))からのCyp1A2特定抗体が、使われた。誘導及び非処理のSA002、LOT AL002及びSA167、LOT AL002、に進行された結果は、両方のhBS細胞由来肝細胞様細胞集団に特定のCyp1A2反応を示す(弱いにもかかわらず)(図27を参照)。
【0163】
Cyp活性分析(図13、30及び32を参照):
PROD分析は、96時間のCyp誘導混合物との処理においてPROD活性の強い誘導、および非処理の肝細胞様細胞で構造性PROD活性を示した。さらに、EROD分析は、特定の構造性及び誘導可能性Cyp 1A2活性を示して実行された(図30を参照)。両方の分析は、初代肝細胞と同程度の誘導活性を示し、さらに、hBS細胞由来肝細胞様細胞におけるいかなる誘導の前に、基礎発現が、弱いけれども、実際にはあった。
【0164】
カクテルは、25μMリファンピシン、20μMデソキシフェノバルビタール(プリミドン)、100μMデキサメタゾン、88mMエタノール、25μMオメプラゾール及び100μMイソニアジドを含んでいる。PROD(ペントキシレゾルフィン)は一般のCyp活性分析であり、EROD(エトキシレゾルフィン)はCyp1 A2に特有である。PRODまたはEROD貯蔵液(Sigma Aldrich,Cat. No.77105及び46121それぞれからの製品)は、2mMの濃度でDMSOにおいて準備される。細胞は、各種の誘発因子で96時間誘導されるかまたは対照として処理しないまま放置する。分析を実行する前に、細胞はPBSによって慎重に二回洗われ、誘発因子の残余量を洗い落とすために、新しいPBSで15−30分間培養される。細胞は、37℃の暗い環境で60分間、PBS内の25μMのPRODまたはPBS内の50μMのERODによって培養された。それから、細胞はPBSによって再び二回洗われ、顕微鏡の下で分析された。
【0165】
Cyp3A4、3A7、1A1、1A2及びCyp2A6の相対的な遺伝子発現レベルが測定され、肝細胞様細胞、HepG2及びヒト肝エキスの誘導及び非誘導培養物でのリアルタイムPCR技術によって比較される。ヒト肝エキスの測定は、1にセットされ、他の全てのサンプルは、各シトクロムp450のためのヒト肝臓参照に関連した。全ての遺伝子の発現は、GAPDH(CYP1A1/1A2、CYP2A6)又はTBP(CYP3A4/3A7)に対して正常化される。図36を参照。
【実施例5】
【0166】
特徴描写:
フェーズII代謝酵素:
肝細胞様細胞は、GST A1−1の強い免疫反応性及びGST M1−1の弱い免疫反応性を表示する。胎児のGST P1−1の免疫反応性は、ほとんど示されなかった(mEFで分化される肝細胞様細胞について図14を参照)。さらに、肝細胞様細胞は、UGT 1A1及びUGT 1A6のための免疫反応性を示す(図17を参照)。誘導剤処理で、わずかな誘導が、GST A1−1のために観察されたが、GST M1−1またはGST P1−1のためのはっきりした誘導はなかった。(マトリゲル(商標)に育てられた肝細胞様細胞でのGST A1−1発現は、図22を参照。)
【0167】
使用された一次抗体:
GSTA1−1(ウサギ)1:500、オックスフォード生医学研究、GS62;
GST M1−1(ウサギ)1:500、オックスフォード生医学研究、GS67;
GST P1−1(ウサギ)1:500、オックスフォード生医学研究、GS72;
UGT 1A1(ウサギ)1:500、BD バイオサイエンス、458411;
UGT1A6(ウサギ)1:500、BD バイオサイエンス、458416。
【0168】
使用された第2の抗体:
−donkey 抗ウサギ−Alexa488、1:1000, Molecular Probes(#A−21206)
−donkey 抗ウサギ−Alexa594(1:1000),Molecular Probes, #A−21207
【0169】
免疫染色プロトコル:
4%PFAに15分凝固し、2回PBS洗浄し、0.1%PBS内の5%FBSに30分入れ、一次抗体をPBTの1%FBT中で4℃で一晩培養させ、二次抗体を0.1%PBTの1%FBS中で常温で3時間培養させ、全てが0.05mg/mlのDAPI 、0.1%PBTの中で常温で5分間洗浄され、DAKOCytomation封入剤の中に組み込まれる。
【0170】
ウエスタンブロット法:
ウエスタンブロット法分析が、BS細胞株SA002.5(LOT BE002.5)、SA167(LOT CE167)(図15を参照)及びSA002(LOT AL002)(データが示されてない)からの肝細胞様細胞でGST A1−1(25kDa)発現を確認する。より胎児性GST亜類型GST P1−1(25kDa)のための発現は、ウエスタンブロット法によって検出されなかった。ヒトGSTsを共起表現するV79細胞からの細胞溶解物が、陽性対照として使われた。B−アクチン(42kDa)が、内部積載対照として使われた。GST A1−1またはGST P1−1の発現が、株SA002またはSA002.5からの未分化hBS細胞において検出されることができなかった。
【0171】
タンパク質は、1:100のプロテアーゼ抑制剤カクテル(シグマ−オールドリッチ)で補充され、M−PERタンパク質摘出試薬(ピアス)を使用して細胞から抽出された。タンパク質は、電気泳動法によって12%のSDSポリアクリルアミドゲルに分離され、その後、ニトロセルロース膜(Biorad、ヘラクレス、CA)へ変えられた。免疫ブロット法のために、GST A1−1及びGST P1−1(1:1000)に対する一次抗体が、1%のBSAブロッキングバッファーにおいて希釈された。二次抗体は、対応HRP−共役抗体であった(ヤギ抗ウサギ、ヤギ抗マウス及びウサギ抗ヤギそれぞれ、1:2000(DAKO、Glostrup、デンマーク))。強化された化学ルミネセンス(ECL)が、製造業者の指示(Amersham、Piscataway、NJ)によって使われた。一次ヒト肝細胞(インビトロ テクノロジーズ、ライプツィヒ、ドイツ)及びGSTタンパク質調製が、陽性対照として使われた。
【0172】
GST活性分析(図16を参照):
1−クロロ−2,4−ジニトロベンゼン(CDNB)へのGST触媒活性が、Habigとその他、1974の分光測光法の分析を使用して決定された。CDNB(1−クロロ−2,4−ジニトロベンゼン)は、一般のGST参照培養基(Mannervik 1988)である。反応混合は、85μlの0.1Mのリン酸カリウム(pH 6.5)、2.5μlの0.2MのGSH、2.5μlの20mMのCDNB及びM−PER渙散バッファ内の10μlのタンパク質溶解物から構成されていた。タンパク質なしで、10μlのM−PER渙散バッファとの完全な分析混合が、対照として使われた。340nm及び30℃の吸光度が、フィリップスPU8720 UV/VIS走査型分光光度計を使用して1分間モニタされた。CDNBへのGST触媒活性が、hBS細胞株SA002(LOT AL002)SA002.5(LOT BE002.5)及びSA167(LOT CE167)及びヒト初代肝細胞培養物に由来した肝細胞様細胞、およびHepG2培養物において検定された。hBS由来肝細胞様細胞が、ヒト初代肝細胞に類似したGST−活性及びHepG2培養より本質的に高いGST活性レベルを示した。図16を参照。
【実施例6】
【0173】
特徴描写:
薬物輸送体
免疫組織化学:
肝細胞様細胞は、トランスポータMRP2、BSEP、及びOATP−2および/またはOATP−8のための免疫反応性(潜在的抗体交差反応)を示す(図18、19、20を参照)。BSEPが肝芽細胞様細胞及び肝細胞様細胞より小さい集団だけにおいて表示される時、OATP−2/8及びMRP2が、大多数の肝細胞様細胞において表示されるようである。
【0174】
使用された一次抗体:
MRP2(ウサギ)1:50、サンタクルーズ、sc−20766;
BSEP(ヤギ)1:50、サンタクルーズ、sc−17292;
予め希釈されたOATP−2(マウス)、Progen Biotechnik社、クローンmMDQ
【0175】
使用された第2の抗体:
−donkey anti−goat−Alexa 488、1:500、分子の調査、# A−11055
−donkey anti mouse−Cy3,、1:1000、Jackson Immuno Research #715−165−151
−donkey anti−mouse−Cy2, 1:100, Jackson Immuno Research, #715−225−151
−donkey anti−rabbit−Alexa488, 1:1000, Molecular Probes, #A−21206
−donkey anti−rabbit−Alexa594, 1:1000, Molecular Probes, #A−21207
−donkey anti−rat−Cy3, 1:500, Jackson Immuno Research, #712−165−153
−donkey anti−rat−Cy2, 1:100, Jackson Immuno Research, #712−225−153
−donkey anti−sheep−Alexa488, 1:1000, #A−11015
−donkey anti−sheep−Alexa594, 1:1000, #A−11016
【0176】
免疫染色プロトコル:
MRP2,OATP−2:
4%PFAに15分凝固し、2回PBS洗浄し、0.1%PBT内の5%FBSに30分入れ、一次抗体を0.1%PBTの1%FBS中で4℃で一晩培養させ、二次抗体を0.1%PBTの1%FBS中で常温で3時間培養させ、全ては0.05mg/mlのDAPI 、0.1%PBTの中で常温で5分間洗浄され、DAKOCytomation封入剤の中で組み込まれる。
【0177】
BSEP:
4%PFAに15分凝固し、2回PBS洗浄し、0.1%PBS内の5%FBSに30分入れ、一次抗体をPBSの1%FBS中で4℃で一晩培養させ、二次抗体をPBSの1%FBS中で常温で3時間培養させ、全ては0.05mg/mlのDAPI 、PBSの中で常温で5分間洗浄され、DAKOCytomation封入剤の中で組み込まれる。
【0178】
MRP2遺伝子発現の分析(図23を参照)
肝細胞様細胞でMRP2発現は未分化細胞での発現と比較してそれぞれ11から32倍高い。
【0179】
完全RNAは、GibcoからのTrizol Reagentを使用して、肝細胞様細胞(SA002.5、LOT BE002.5継代2、mEFでの21日分化後)及び、未分化hBS細胞(SA002.5、LOT BE002.5継代24、5日目(対照サンプル1)及びSA002、LOT BE002、継代62、4日目(対照サンプル2))から抽出された。5μgの完全RNAが、Supercript IIキット(インビトロゲン社)を使用して、デオキシリボヌクレアーゼ(インビトロゲン社、ペイズリー、英国)による処理の後に相補型DNA(cDNA)に逆転写された。トランスポータのための遺伝子特有プライマー及び調査が、プライマー3ソフトウェア・プログラム及びNetprimerを使用して考案された。200ngのcDNAが、SensiMix Sybr Green Mix, ( 1.5mMの最終的なMgCl2);(Celtic Diagnostics)、0.7ユニットAmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ)、300nMの遺伝子特有の前方及び後方のプライマーに適切な遺伝子のためのプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって詳しく説明される。使用するプライマー・シーケンスは、前方:tgcagcctccataaccatga及び、後部:ggacttcagatgcctgccaである。PCRは、50度で2分間、95度で10分間、最初工程のCorbett Rotorgeneで実行され、そのあと95度で15秒及び62度で60秒を40回実行される。各々のサンプルのPCR拡大は、ピペット操作エラーを最小にするために重複に実行された。ノー・テンプレート対照が、陰性対照として各々の実行のために含まれた。各々のサンプルのためのCt値は、記録され、各々のサンプルのための相対的な遺伝子発現が、2△(40−Ct)を使用して、標準のABIプロトコルを使用して算出された。90%効率の推測下の相対的な発現が最も低いサンプルをゼロにセットすることによって推定された。
【実施例7】
【0180】
PAS陽性による細胞のグリコーゲン貯蔵発見(過ヨウ素酸染色シッフシステム、SIGMA−ALDRICH、Cat−no.395B)
肝細胞様細胞が、PAS陽性方法によって検出されるグリコーゲンを保存する(図21を参照)。技術的な陰性対照として、唾液処理された培養物は、培養物の95−99%でグリコーゲン発見の減少を証明した。ブドウ糖余剰がある限りグリコーゲン合成及び貯蔵は人体の多数の細胞型の一般的な機能ある。しかし、肝細胞及び骨格の筋肉は、グリコーゲンを保存する際に特に特殊化される。肝細胞様細胞を選ぶかまたは取り除く前の分化hBS細胞培養において、グリコーゲンを保存する他の細胞集団が、観察され、同じく、グリコーゲンを保存することができない、いくつかの集団も観察される。重要なことに、グリコーゲンを保存しいない培養物の非肝細胞様細胞がある。細胞は、メタノールに希釈される4%のパラホルムアルデヒドに室温で、15分間、取り付けられ、その後、3回をPBSで洗われた。技術的陰性対照として、培養物は室温で、20分間、ヒト唾液で処理され、その後、PBSで洗われた。ヒト唾液は、グリコーゲンを消化するα−アミラーゼを含む。アルデヒドにグリコールを酸化する過沃素酸が処理及び非処理の培養物に5分間室温で、加えられ、PBSにおける繰り返し洗浄が続いた。その後、培養物は室温で、15分間、シッフ試薬で培養され、パラローズアニリン及び異性重亜硫酸ナトリウム間の反応を可能にし、グリコール含有する細胞コンパートメントを明るいピンクに染色するパラローズアニリン製品を作り出す。PBSで洗った後に、細胞は、室温で、90秒間、ヘマトキシリンで対比染色され、マウンティング培養基に取り付ける前にH2Oにおいてすすがれた。ヘマトキシリンは、細胞(青っぽい)の核を染色する。
【実施例8】
【0181】
遺伝子の分析
重要な特定の遺伝子を分析するさらなる別の方法、例えば、下記の物質は量的PCR(QPCR)を用いている。そのような措置は以下の通りである:第1の適切な遺伝子が選ばれ、それらの遺伝子と相補的にマッチするプライマーが考案され、定量化がPCR分析によって行われ、重要な遺伝子の発現レベルがハウスキーピング遺伝子、分化の間に下方対照する遺伝子と比較される(分化の間に安定して表示されることが公知の場合)。いくつかのhBS細胞株の分化の間に、下方対照される適切な遺伝子の実施例は、Cripto、Nanog及びOct−4である。
【0182】
hBS細胞由来肝細胞様細胞は、例えばマイクロアレイ、microfluidityカードまたは遺伝子の適切な選択を有する遺伝子チップのような、従来の技術によって遺伝子レベル(mRNA発現レベル)で、更に特徴描写されてもよい。例えば下記の表(表1)にリストされる。サンプルの完全RNAに由来されるcDNAは、例えばmicrofluidityカードと交雑され、実験は、PCRセットアップに入り、更に、適切なソフトウェアを使用して分析される。
【0183】
【表2】
【0184】
誘発因子混合物で処理されるかまたは非処理である細胞株SA167、LOT CA167及びSA002、LOT AL002の未分化hBS細胞及び、2つの細胞株に由来する肝細胞様細胞は、インストラクタのマニュアル(Applied Biosystems 7900HT Micro Fluidic Card Getting Started Guide)及び以下の短縮プロトコルに従って、LDAチップ上で並行に繰り返し行われる。
【0185】
cDNAが、完全RNAから調製され、適切な濃度を達成するためにRNase/DNaseフリー水に希釈される(下記参照)。以下の構成要素が混合された:
cDNA(1−100 ng)、5μl
RNase/DNaseフリー水
TaqManの汎用PCR、45のμl
マスター混合物(2X)(50μl)
合計:100μl
【0186】
サンプルは、その後、LDAカードに載せられ(各々のサンプル混合物は、1サンプルにつき100ul及び170ng cDNAである)、遠心分離機で分離され、その後に、LDAカードは密閉された。最後に、マニュアルの説明に基づいて、カードはABI 7900HTリアルタイムPCRシステムで実行され、結果はSDS 2.2.1ソフトウェア及び相対的な定量化方法を用いて分析される。
【0187】
hBS細胞−由来肝細胞様細胞から検出の肝臓タンパク質の概要(LDA分析またはQPCRによって)は、下の表3及び4に示される。
【0188】
【表3】
【0189】
【表4】
【実施例9】
【0190】
肝細胞様細胞の生物反応器培養物
hBS細胞及びそれの由来的細胞型、例えば肝芽細胞様細胞または肝細胞様細胞は、例えば人工中空ファイバー毛細血管膜によって区分される三次元スペースにおいて育てられてもよい。このシステムは、毛細管間のより大きい細胞集団へ細胞を成長させることを可能にし、培養基の潅流及び酸素類のガスによって最適化、天然環境を提供する。密閉生物反応器システムは、細胞(最高10^11細胞)を大量に生産し、細胞の機能的特性の保全を支えるために開発される。酵素潅流による細胞隔離が、密閉したGMPシステムで拡大された。細胞浄化が、例えば膜組織抗原発現に基づくFACソートまたは密度勾配培養基及び遠心分離を使用して、それから実行される。
【実施例10】
【0191】
尿素合成
尿素合成は、肝臓特定の特性であり、したがって、異なる細胞株から肝細胞様細胞へ分化する培養基の尿素濃度が、24時間潜伏の後、異なる時刻で測定された。培養基サンプルは、集められ、分析のために送られた。尿素分泌が、尿素/尿素窒素(ロシュ/日立)の運動UV検査法のためのキットを使用して分析された(Klinisk Kemi、C−研究室、Sahlgrenska大学病院、イェーテボリで)。
【0192】
血清/プラスマの期待値は、10−50mg/dL(1.7−8.3mmol/L)である。
【0193】
方法に従う尿素発見のための低いレベルは、0.8のmmol/Lであった。
【0194】
【表5】
【0195】
hBSC−由来肝細胞様細胞は、初代肝細胞と同様の濃度の培養基へ尿素を生産及び分泌する。十分に面白いことに、肝細胞様細胞が培養物内で現れてからおよそ20日後に、重要な尿素濃度のみが、測定されることができる。
【0196】
例えばアルブミン分泌に関する更なる機能的テストが、シュヴァルツとその他の2002及び2005にて説明したように、実行されることができる。肝細胞様細胞及び肝芽細胞様細胞の更なる機能的な特徴描写が、LDL摂取及び糖新生を実行する能力のために分析されることができた。
【実施例11】
【0197】
細胞極性及び機能性
サンドイッチ培養系が、更に細胞極性及び肝細胞様細胞の長期の機能性を改善することができる。そのような培養系において、肝細胞様細胞の埋め込みは、低いレベル酸性応力と別の肝臓体内を模倣する三次元環境提供する。それによって、肝細胞様細胞は有極性を示する。すなわち、アピカル側を有する上皮様組織(生体内胆汁側の方へ、疎水性)及び基底外側(生体内血液側の方へ、親水性)を形成する。サンドイッチ培養での肝細胞様細胞のもう一つの潜在的改良は、Cyp発現のより強い誘導性である。
【実施例12】
【0198】
免疫組織化学的ノッチ特徴描写:
IVF皿で育てられる培養hBS細胞は、室温で、15分間、4%のパラホルムアルデヒドに取り付けられた。細胞は、それから一次抗体によって一晩4℃で培養された(Notch2、1:200 サンタクル\ス、sc5545、USA)。その翌日、細胞は10分間二回1X PBSによって洗われ、1時間、室温の1X PBS内で第2抗体(抗ウサギ−FITC、1:500)によってその後に培養され、それぞれ5分間二度洗われ、5分間1μg/mlのDAPI溶液に暴露される。水でそれぞれ5分間二回細胞を洗った後に、それらは、アクアマウントに取り付けられ、蛍光性顕微鏡検査によって分析される。最近、未分化のhBS細胞がNotch2(Noggleとその他(2006))を表示することが示された。Cellartis hBS細胞株SA002において、大多数の細胞は、分化の第1日にNotch2に弱陽性である。2週後に、Notch2は、肝細胞様および/または肝芽細胞様細胞のほんの少数のサブセットだけで見つかる。すなわち、肝臓形態学に似ている二核小体の細胞である(図35を参照)。
【実施例13】
【0199】
肝芽細胞様及び肝細胞様細胞の繁殖的状態が、実施例2の内因子プロトコルに基づいて、hBS細胞をそれぞれ14及び21日間培養することによって、試験された。分析の日、培養物は室温で15−20分間4%のPFAに取り付けられ、数回PBSで洗われ、PBSに希釈される0.1−0.5%のTritonX100において透過処理された。肝芽細胞様細胞のため、内胚葉/初期肝臓マーカーHNF4アルファ(ウサギpAb、サンタクルーズ、SC−8987、1:400希薄)が使われ、肝細胞様細胞のために、内胚葉/肝臓マーカーHNF3ベータ (Foxa−2)(IgG、サンタクルーズ、SC−6554、1.200希薄)が使用された。2つの肝臓様細胞集団の増殖を研究するために、抗体、Ki67(BD Pharmingen、#556003、1:500希薄)が、一晩冷蔵庫での培養に加えられる。いくつかの洗浄の後、第2の抗体が利用され、室温で2時間培養された。培養物が洗われ、DAPIは核を検出するために最後の洗濯に含まれた。HNF4アルファに陽性の肝芽細胞様細胞は、Ki67との共局所によって繁殖表示である(図28を参照)。肝細胞様細胞はKi67に陽性でなく、非繁殖細胞を示した。
【0200】
増殖能が肝細胞様細胞において誘導されることができたかどうか確認するために、培養基状況を変えるとともに、初代肝細胞の増殖を刺激する公知の成長因子を加えることによって、hBS細胞由来肝細胞様細胞の増殖誘導が、追加的に試験された。hBS細胞(細胞株SA002)は、先に述べた状況の下で17日間分化させられ、肝芽細胞及び肝細胞様細胞になる。培養基は、10%のFBS(または血清代替物)で補充されるウィリアムズ培養基E(シグマ、W−4128)、1%のPEST、1%のグルタマックス、1x ITS、0.25ng/mlデキサメタゾン、2%のDMSO、20ng/ml HGF、10ng/ml EGF、10ng/mlオンコスタチンM、10mMのニコチンアミド及び4ng/ml bFGFに変えられた。hBS細胞は、おおよそ5日ごとに変えられる培養基で、さらに5−15日間育てられた。細胞の増殖能は、その後で、上記通りの追加的な11日以後に分析された。上記通りに補充されるウィリアムズE培養基で培養される時に、hBS細胞由来肝細胞様細胞は繁殖するが、4ng/mlのbFGFで補充されるVitroHES(商標)で育てられる肝細胞様細胞において増殖は検出されなかった(図29を参照)。したがって、もし適切な培養基で培養された場合、肝細胞様細胞は、増加する増殖能へ刺激されることができる。
【実施例14】
【0201】
96−ウェルプレートの肝細胞様細胞へのhBS細胞分化
4日間から5日間、前のhBS細胞は、小さい断片に手動で解剖され、マイトマイシンC−に処理され、96−ウェルコーティングされたmEFへ移動される。hBS細胞の2つから3つの断片が各々のウェルに加えられた。培養物は、4ng/ml bFGFで補充されるVitroHES(商標)において、37℃、5%のCO2及び95%の湿度で20−30日間培養された。10日目に、培養基の50%が、4ng/mlのbFGFで補充される新しいVitroHES(商標)と取り替えられ、20日目に、培養基の100%が取り替えられた。hBS細胞は、MEF−コーティング、IVF−皿で培養されたhBS細胞コロニーに類似するコロニーに分化され、例えば肝芽細胞様細胞は、HNF4アルファに免疫陽性反応であり、14日目あたりにコロニーの周辺に現れ、20日目の肝細胞様細胞に現れた。96−ウェルの80%が、このプロトコルを用いて20日目に肝細胞様細胞へhBS細胞を分化させることに成功した。
【実施例15】
【0202】
異なる表層への肝細胞様細胞の再接種
肝細胞様細胞の再接種の前に、96ウェルプレートのウェルが、異なるコーティングによって予めコーティングされる:ラットの尾からのコラーゲンI (BD Biosciences、#354236)、10%から100%の異なる濃度のマトリゲル(商標)(基底膜マトリックス、BD Biosciences、#356237)、または、mitocycin C処理のmEF細胞層。コーティングは、次のように実行された:コラーゲンIが96ウェルに加えられ、5%のCO2、30min−1hの95%湿度で37℃で培養される。コラーゲンIの余剰が廃棄され、ウェルは、その後いかなる酸性の酸性トレースも取り除くために二回PBSによって洗われた。ウェルは、20%のFCSで補充され、予め暖められた50−100μlのHCM−培養基で満たされた(HBM(商標)、Cambrexからのcc−4316BB、cc−4362BB、cc−4335BB、cc−4313BB、cc−4321BB、cc−4317BB、cc−4381BBのHCM(商標) SingleQoutsで補充されるcc−3199)。マトリゲル(商標)コーティングのために、マトリゲル(商標)の冷凍分割量が、冷蔵庫において一晩解凍された。マトリゲル(商標)は、10%から100%のマトリゲル(商標)を達成するためにHCM−培養基で希釈された。マトリゲル(商標)の異なる濃度は、96−ウェルに加えられ、30分間37℃で培養された。マトリゲル(商標)の余剰は、20%のFCSで補充されるHCM−培養基を加える前に廃棄された。25から38日までの古い培養範囲の肝細胞様細胞が、BDからのマイクロ外科用メスを用いてマイクロ解剖され、VitroHES(商標)培養基を含んでいる収集ディッシュへ幹細胞ナイフで移動される。領域を含んでいるミクロ解剖した肝細胞様細胞は、小さいクラスタを形成し、いくつかのプレートから集められた。クラスタは、37℃で10分間カルシウム及びマグネシウムなしのPBS、加熱プレートでのTrypLe Select(Gibco、#12563)で42℃で3−5分間、または37℃で5−15分間Collagenase IVによって、20%のFCSで補充されるHCM−培養基を含んでいる96−ウェルプレートの異なるコーティング上に再接種する前に処理される。一日以後、肝細胞様細胞を有するクラスタは、表層に付属し、表層上にクラスタから移り始めた。これは、肝細胞様細胞の全ての異なる種類のコーティング及び分離処理にとって真実だった。20%FCSで補充されるHCM−培養基は、無血清HCM−培養基に交換された。培養に、一日おきに、新しいHCM−培養基が提供された。数日後に、肝細胞様細胞は、ウェルを再接種した。肝細胞様細胞は、保持された肝臓典型的形態学を培養物で45日間キープした。大きい多角形及び複数核細胞(図46を参照)は、肝細胞マーカーHNF3ベータ及びCK18(図46)に陽性であった。
【実施例16】
【0203】
新陳代謝の肝細胞様細胞
異なる分化プロトコルによって得られるhBS細胞由来肝細胞様細胞は、誘発因子の非存在下でフェーズIシトクロムp450酵素、cyp1A2、cyp2C9及びcyp3A4にそれぞれによって、フェナセチン(アルドリッチ)、ジクロフェナック(SIGMA)及びミダゾラム(SIGMA)を新陳代謝させるその能力のために検査された。培養基へ放出されたそれぞれ物質の代謝物質が、LC−MSで測定された。細胞株SA002、SA002.5及びSA348からの肝細胞様細胞を含んでいる混合培養物が、26日から35日までに試験された。物質は、フェノールレッドなしの培養基、26μMフェナセチン、9μMジクロフェナク及び3μMミダゾラムの中でカクテルとして、6時間、12時間及び24時間、37℃で5%のCO2の条件下で培養された。各々の培養及び時刻からのサンプルはいかなる細胞残屑も取り除くために、集められ、高速で20分間遠心分離機で分離された。100μlの取り除かれた培養基サンプルは、96−ウェルプレートへ移動され、15μlのアセトニトリルは、各々のウェルに加えられた。LC−MSによって代謝物質測定が実行され、分析されるまで、サンプルは冷凍だった。
【0204】
液体クロマトグラフィ・システムは、HP1100シリーズLCポンプ及びHTS PAL注射器(CTC Analytics、Zwingen、スイス)と組み合わせであるカラムオーブン(Agilent Technologies、ドイツ、Waldbronn、ドイツ)から構成されていた。4−ヒドロキシジクロフェナック及び1−ヒドロキシミダゾラムのために、LC分離が、逆相HyPurity C18(2.1x50mm、5μm、ThermoQuest、ランコーン、英国)にHyPurity C18 precolumnとともに40℃で実行された。移動式フェーズは、以下から構成されていた:(A)0.1%の(v/v)ギ酸及び(B)アセトニトリルにおける0.1%の(v/v)ギ酸。有機条件剤含有量は、3分間に5から80%のBに、線形に増やされ、そして、0.2分間5%のBに戻る。
【0205】
パラセタモールのために、クロマトグラフィが、HyPurity C18 precolumnを有するZorbax Eclipse XDB−C8(4.6x150mm、5μm)上で、同じシステム及び移動式フェーズを使用して実行された。有機条件剤含有量は、5分間に2から30%のBに、線形に増やされ、そして2分間に30から80%まで増加し、その後0.1分間2%のBに戻る。4−ヒドロキシジクロフェナック、1−ヒドロキシミダゾラム及びパラセタモールのための保持時間は、それぞれ、2.9、2.4及び6.4分であった。発見は、電気スプレイ・インタフェース(Biosystems/MDS Sciex、コンコード、カナダ)を備えている3倍の四重極質量分析計API4000で実行された。450℃の4−ヒドロキシジクロフェナック及び550℃での1−ヒドロキシミダゾラム及びパラセタモール、ネビュライザー・ガスのための、ターボ・ヒーター温度で操作されるMSは、それぞれ、50、30、70及び、50であった(GS1)。ターボ・ガスはそれぞれ、50、60、70及び、70であり(GS2)、カーテン・ガスは、それぞれ20、20、10及び20であった。4−ヒドロキシジクロフェナックのための電気スプレイ電圧は、陰性モードの−3kVであり、1−ヒドロキシミダゾラム及びパラセタモールのための電気スプレイ電圧はそれぞれ陽性モードの5、3.5kVであった。
【0206】
衝突エネルギーは、それぞれ、−15、39及び21Vにセットされ、衝突活性化解離ガスは、それぞれ、5、7及び、5である。選択されるMRM移行は、4−ヒドロキシジクロフェナックは309.9>265.9であり、1−ヒドロキシミダゾラムは342.0>202.7で、パラセタモールは152.3>110.0である。200msの滞留時間が使われた。計測器対照、データ収集及びデータ評価が、Applied Biosystem/MDS Sciex Analyst 1.4ソフトウェアを使用して実行された。
【0207】
誘発因子の非存在下及び異なる世代の異なるhBS細胞由来肝細胞様細胞のCyp−活性
【0208】
【表6】
【実施例17】
【0209】
cyp活性の配合
体内の薬物代謝を予測するために、薬物代謝を分析するときに、肝細胞の範囲内のcyp−活性配合は欠かせない。hBSC−由来肝細胞様細胞のcyp−活性配合がどれくらいよくヒト肝細胞を反映させるかについて分析するために、薬品フェナセチン(26μM)ジクロフェナック(9μM)及びミダゾラム(3μM)、(それぞれcyp1A2、cyp2C9及びcyp3A4によって新陳代謝される)の混合が、細胞株SA348及びヒト初代肝細胞に由来した肝細胞様細胞に加えられた。薬品カクテルの12時間培養の後に、サンプルは、代謝物質のLC−MS発見のために集められた。サンプルは、前の実施例16に記載されている通りにLC−MSによって調製され、分析された。試験した3つの酵素システム間のcyp活性配合が、分析された。
【0210】
【表7】
【0211】
肝細胞様細胞のcyp活性配合は、ヒト初代肝細胞培養でのcyp活性配合と類似していた。
【実施例18】
【0212】
肝細胞様細胞の改良
hBSC−由来肝細胞様細胞を改善するために、リアルタイムPCR技術に基づく選別法が使われた。4つの遺伝子の相対的な発現レベル;HNF4アルファ、Cyp3a4、アルブミン及びUGT2B7が、肝細胞様細胞の改良を示した。Cyp3a4は、成人肝臓内で重要なシトクロムp450酵素である。それは、成人肝臓でのフェーズI酵素活性の60%を構成する。アルブミンは、成熟及び成人肝細胞に高く表示される。UTG2B7は、成人肝臓の重要なフェーズII酵素(グルクロノシルトランスフェラーゼ)である。Cyp3a4、アルブミン及びUTG2B7の上昇レベルが、改良され、成熟し、潜在的により機能的な肝細胞様細胞示す。HNF4アルファは、肝芽細胞様細胞の初期のマーカーである。HNF4アルファ遺伝子発現の上昇レベルは、肝芽細胞様細胞の増加数を示す。アルブミン、Cyp3A4及びUTG2B7の高水準及び、加えて、HNF4アルファの減少されたレベルは、HCLCの成熟した及びより機能的な集団を示す。
【0213】
異なるプロトコルからの細胞サンプルの完全RNA(詳細な説明のために下記を参照)が、Invitrogens Trizol方法を使用して抽出された。cDNAが、オリゴdT(oligo dT)を使用して完全RNAサンプルから作られた。その後、使用準備済のTaqmanプライマー、Applied Biosystemsからの標準プログラム及び装置を使用して、cDNAがリアルタイムPCR反応において拡大された。
【0214】
分析のために、PCR製品を検出するために必要なサイクル(CT−値)の数が、同じサンプルでのハウスキーピング遺伝子、GAPDHのCT−値に正常化された。正常化されたCT−値は、その後で、相対的な定量化(△△Ct方法)のために比較的Ct方法を用いて、各々の実験における対照サンプルの正常化されたCT−値と比較された。結果は、それからサンプルと同じ実験の対照サンプルとのフォールド変化として提示された。
【0215】
異なるパラメータ及び培養プロトコルが、肝細胞様細胞を改善するために合成された。異なる培養基が試験され、肝細胞様細胞は、培養でより長い時間キープされ、培養基置換の頻度は分析され、異なる成熟及び誘導因子が試験されたなどである。
【0216】
肝細胞様細胞へhBS細胞を分化させる参照プロトコル(実施例2に記載されている内容と類似する):
1日目
hBS細胞は、手動で断片に切断され、4ng/mlのbFGFで補充されるVitroHES(商標)−培養基を含み、mEF−コーティングされたIVF皿へ移動された。
10日目
培養基の50%は、4ng/ml bFGFで補充されるVitroHES(商標)と取り替えられた。
14−15日目
HNF4−アルファ染色によって示される肝芽細胞様細胞は、コロニーの周辺に存在する。
20日目
培養基の100%が、4ng/ml bFGFで補充されるVitroHES(商標)と取り替えられた。肝細胞様細胞は、コロニーの周辺に現れている。
【0217】
プロトコルの重要な要素のうちの1つは、培養基を非常にまれに置換することである。内因子は、分化過程に重要である。
【0218】
改良されたプロトコル
I 異なる培養基
CambrexからのHCM−培養基 表5の実験1、2; 図37−39
【0219】
II 成熟及び誘導因子を有するサプリメント
a. デキサメタゾン 表6の実験1、2、3; 図40−42
b. HCM−培養基、HGF、ナトリウム酪酸塩 表7の実験1、2; 図40−42
【0220】
III 培養基置換頻度
HCM−培養基及びVitroHES(商標) 表8の実験1; 図43−45
【0221】
【表8】
【0222】
【表9】
【0223】
【表10】
【0224】
【表11】
【0225】
I. CambrexからのHCM培養基が、ウシ血清アルブミンの一等分で補充される無血清基礎培養基(BSA−FAF; 10ml/500mlのHBM、cc−4362BB、Cambrex)、アスコルビン酸(0.5ml/500mlのHBM、cc−4316BB、Cambrex)、上皮細胞増殖因子(rh−EGF; 0,5ml/500mlのHBM、cc−4317BB、Cambrex)、トランスフェリン(0.5ml/500mlのHBM; cc−4313BB、Cambrex)、インスリン(0.5ml/500mlのHBM; cc−4321BB、Cambrex)、ヒドロコルチゾン(0.5ml/500mlのHBM; cc−4335BB、Cambrex)及び抗生物質(GA−1000; 0.5ml/500mlのHBM; cc−4381BB、Cambrex)である。培養基は、初代肝細胞培養のために最適化される。
【0226】
VitroHES(商標)が、HCM−培養基により15日目または23日目の後に交換された。プロトコルは、改良された肝細胞様細胞をもたらした。細胞株SA002及びSA348に由来の改良肝細胞様細胞は、アルブミン、CYP3A4及びUGT2B7(図39)の上昇する遺伝子発現レベルを示した。形態学によって判断されれば、肝細胞を有するコロニーの末梢は、改良された培養物においてより広く、細胞は脂肪質でない(図38)。プロトコル詳細の研究設計のために、図37、表5、実験1及び2を参照。
【0227】
IIa. 細胞株SA167、SA348、SA002に由来されるHCLCは、参照プロトコルに基づき分化されたが、プロトコルの終わりでの8日間の高い濃度のデキサメタゾンによるサプルメントはHCLCの外観を改良した(図41A+B)。加えて、HNF4アルファ、アルブミン、cyp3A4及びUGT2B7の上昇する遺伝子発現レベルが、明白である傾向が示された(図42A)。研究設計のために、図40を参照、研究デザインC及びプロトコルの詳細は、表6、実験1、2、3を参照。
【0228】
IIb. 細胞株SA167及びSA002に由来される肝細胞様細胞が、21日目まで参照プロトコルに基づき分化された。その時刻で、培養基はHGF及びナトリウム酪酸塩(NaB)で補充されるHCM−培養基に交換された。
【0229】
III. 分化のためのまれな培養基置換及びhBS細胞に由来される肝細胞様細胞の成熟処理の重要性が、VitroHES(商標)及びHCM(商標)−培養基の中の異なるいくつかの培養基のために試験され、分析された。参照プロトコルは、15日目まで続かれた。15日目の後、培養基は週3回または週1回交換された。研究デザインのために、図43を参照、プロトコルの詳細について、表8の実験1を参照。はっきりした傾向が、試験される全ての培養基のために観察された。培養基のまれにされた置換が、形態学に基づいく肝細胞様細胞(図44A+B)及び、Cyp3A4、アルブミン、UTG2B7及びHNF4アルファのために上昇した遺伝子発現レベル(図45)を改良した。データは、内因子が、hBSC−由来肝細胞様細胞の分化処理のために重要であることを示す。
【実施例19】
【0230】
hBS細胞由来肝芽前駆細胞
肝芽前駆細胞株を確立するために、15日間古いhBS−細胞由来肝芽細胞が、分離され、異なるコーティングに再接種された。肝芽細胞様細胞の再接種の前に、96−ウェルプレートのウェルが、以下の異なるコーティングによって予めコーティングされた;17−20x103細胞/cm2の密度を有するマイトマイシンC−処理のmEF細胞、ラットの尾からのコラーゲンI(BD Biosciences、#354236)または、HCM−培養基に1:3で希釈したマトリゲル(商標)(基底膜マトリックス、BD Biosciences、#356237)。コラーゲンI及びマトリゲル(商標)のためのコーティング手順は前の実施例15で記載されている。ウェルは、20%のFCSで補充される予め暖められた50−100μlのHCM培養基で満たされた(HBM(商標)、Cambrexからのcc−4316BB、cc−4362BB、cc−4335BB、cc−4313BB、cc−4321BB、cc−4317BB、cc−4381BBのHCM(商標) SingleQoutsに補充されるcc−3199)。15日間古い培養からの肝芽細胞様細胞の範囲がBDからのマイクロ外科用メスを用いてマイクロ解剖され、VitroHES(商標)培養基を含んでいる収集ディッシュに、幹細胞ナイフで移動される。範囲を含むマイクロ解剖された肝芽細胞様細胞は、小さいクラスタを形成し、いくつかのプレートから集められた。ところが、mEF−細胞層に再接種される肝芽細胞様細胞は、肝細胞の典型的特性を示しておらず、小さい核を有する肝芽細胞様細はmEF−細胞層上で育てられた(図47D−F及びK、L)。加えて、mEFに育てられる大多数の肝芽細胞様細胞クラスタは、肝芽マーカーCK19(図47J、K)に強く陽性だったが、コラーゲンI及びマトリゲル(商標)上の肝芽細胞様細胞の一部だけが、CK19に陽性であった(図47G、H)。mEF細胞層上の肝芽細胞様細胞及びコラーゲンI及びマトリゲル(商標)コーティング上の肝芽細胞様細胞は、HNF4アルファ陽性核を示したが、mEFに育てられる肝芽細胞様細胞(図47A、B、D、E)と比較して、後者は、より大きくて、強く染色されなかった核を有した。データは、肝細胞様細胞への肝芽細胞様細胞の分化がコラーゲンI及びマトリゲル(商標)コーティング上で可能にされる場合に、mEF細胞層が、前駆状態に肝芽細胞様細胞をキープする能力を有することを示す。
【実施例20】
【0231】
機能的な薬物輸送体
hBSC由来肝細胞様細胞におけるトランスポータに関する機能的なテストが、培養にインドシアニングリーン色素(ICG)を利用することによって分析された。ICGは、5mg/mlの濃度へ蒸留、殺菌された水に溶かされ、その後で、1mg/mlの最終濃度へ培養基で薄められた。ICG溶液は、細胞培養皿に加えられ、おおよそ60分間37℃で培養された。培養の後に、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に洗い落され、ICGの細胞摂取は、ステレオ顕微鏡で検査された。肝細胞様細胞は、ICG色素を表し、細胞の範囲に機能的な薬物輸送体の存在を示唆する(図48)。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
hBS細胞に由来する細胞集団であって、
細胞集団の細胞の少なくとも20%が、
アルファ 1−アンチトリプシン、サイトケラチン18、HNF−3ベータ、アルブミンまたは尿中L型脂肪酸結合蛋白のうちの少なくとも1つ特性を示すとともに、
細胞集団が、下記六つの特性のうちの少なくとも三つの特性を有する前記細胞集団:
A.薬物輸送体
i)細胞の少なくとも1%が、BSEPのタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性、
ii)細胞の少なくとも1%が、MRP2のタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性、
iii)細胞の少なくとも1%が、タンパク質および/または遺伝子発現OATP−2および/またはOATP−8を示す特性、
B.薬物代謝酵素
iv)細胞の少なくとも20%が、GST A1−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性、
v)細胞の少なくとも20%が、CYP450s−1A2、−2A6、−2B6、−2C8、−2C9、−2C19、−2D6、−2E1、−3A4及び−3A7の少なくとも2つのタンパク質および/またはGST A1−1の遺伝子発現を示す特性、
vi)細胞の少なくとも20%がGST P1−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示さない特性。
【請求項2】
細胞集団は、少なくとも一つの前記薬物輸送体特徴及び少なくとも一つの前記薬物代謝特徴を有する請求項1に記載の細胞集団。
【請求項3】
細胞集団が、前記特性のうちの少なくとも四つ、例えば五つの特性を有する請求項1または2に記載の細胞集団。
【請求項4】
細胞集団が前記特徴のうちの全ての6つの特性を有する請求項1〜3のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項5】
請求項1又は2に記載の細胞集団であって、
細胞集団の細胞の少なくとも20%が、アルファ 1−アンチトリプシン、サイトケラチン18、HNF−3ベータ、アルブミンまたは尿中L型脂肪酸結合蛋白特性の少なくとも一つの示し、以下の特性を有する:
A.薬物輸送体
iii)細胞の少なくとも1%が、機能的に活性を有するOATP−2および/またはOATP−8を示す特性、
B.薬物代謝酵素
細胞の少なくとも20%が、GSTA1−1の機能的な活性を示す特性、
細胞の少なくとも20%が、薬物代謝物質を分析することによって測定され、機能的に活性を有するCyp1A2、Cyp3A4および/またはCyp2C9を示す特性。
【請求項6】
請求項1又は2に記載の細胞集団であって、
細胞集団の細胞の少なくとも75%が、アルファ 1−アンチトリプシン、サイトケラチン18、HNF−3ベータ、アルブミンまたは尿中L型脂肪酸結合蛋白特性を示し、細胞集団が少なくとも以下の特性を有する。
A.薬物輸送体
iii)細胞の少なくとも10%が、機能的に活性を有するOATP−2および/またはOATP−8を示す特性、
B.薬物代謝酵素
iv)細胞の少なくとも30%が、GSTA1−1の機能的な活性を示す特性、
v)細胞の少なくとも50%が、薬代謝物質を分析することによって測定され、機能的に活性を有するCyp1A2、Cyp3A4および/またはCyp2C9を示す特性。
【請求項7】
特性i)が、細胞の少なくとも5%、例えば、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%または少なくとも50%である請求項1〜6のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項8】
特性ii)が、細胞の少なくとも5%、例えば、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%にあてはまる請求項1〜7のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項9】
特性iii)は、細胞の少なくとも5%、例えば、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%または少なくとも80%にあてはまる請求項1〜8のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項10】
特性iv)が、細胞の少なくとも30%、例えば、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%または少なくとも80%にあてはまる請求項1〜9のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項11】
特性v)が、細胞の少なくとも30%、例えば、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%または少なくとも80%にあてはまる請求項1〜10のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項12】
特性vi)が、細胞の少なくとも10%、例えば、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%または少なくとも80%にあてはまる請求項1〜11のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項13】
細胞集団の細胞の少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%または少なくとも約95%のような少なくとも約30%が、アルファ 1−アンチトリプシン、サイトケラチン18、HNF−3ベータ、アルブミンまたは尿中L型脂肪酸結合蛋白のうちの少なくとも1つを示している請求項1〜12のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項14】
細胞の少なくとも約5%がサイトケラチン18及びCYP1A2を共発現する請求項1〜13のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項15】
細胞の少なくとも約5%がサイトケラチン18及びCYP2A6を共発現する請求項1〜14のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項16】
細胞の少なくとも約5%がサイトケラチン18及びCYP2B6を共発現する請求項1〜15のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項17】
少なくとも、細胞の約5%が、サイトケラチン18及びCYP2C8、CYP2C9および/またはCYP2C19を共発現する請求項1〜16のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項18】
、細胞の少なくとも約5%が、サイトケラチン18及びCYP2D6を共発現する請求項1〜17のいずれかに記載の細胞集。
【請求項19】
細胞の少なくとも約5%がサイトケラチン18及びCYP2E1を共発現する請求項1〜18のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項20】
細胞の少なくとも約5%が、サイトケラチン18及びCYP3A4および/またはCYP3A7を共発現する請求項1〜19のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項21】
細胞の少なくとも約5%が、以下の追加的な特性のうちの少なくとも1つを有する請求項1〜20のいずれかに記載の細胞集団。
A.受容体
vii)細胞の少なくとも約5%が、c−Metのタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性、
B.細胞間接着分子
viii)細胞の少なくとも約5%がICAM−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性、
C.薬物代謝酵素
ix)細胞の少なくとも1%がUGTのタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性、
D.転写因子
x)細胞の少なくとも90%が、1Oct−4のタンパク質および/または遺伝子発現を示さない特性。
【請求項22】
細胞集団は、特性vii)、viii)、ix)またはx)の中で、少なくとも二つ、例えば少なくとも三つを有する請求項21に記載の細胞集団。
【請求項23】
細胞集団が、特性vii)、viii)、ix)またはx)のうちの4つすべてを有する請求項21または22に記載の細胞集団。
【請求項24】
特性vii)が、細胞の少なくとも10%、例えば、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%にあてはまる請求項21〜23のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項25】
特性viii)が、例えば、細胞の少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%のような少なくとも10%にあてはまる請求項21〜24のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項26】
特性ix)が、例えば、細胞の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%のような少なくとも5%にあてはまる請求項21〜25のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項27】
特性x)が、例えば、細胞の少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも95%のような少なくとも10%にあてはまる請求項21〜26のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項28】
CYP450タンパク質のうちの少なくとも1つの発現が、誘発因子の付加物に誘導できる請求項1〜27のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項29】
GST A1−1および/またはGST M1−1タンパク質の発現が、誘発因子の付加物に誘導できる請求項1〜28のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項30】
UGTタンパク質の発現は、誘発因子の付加物に誘導できる請求項21〜29のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項31】
誘発因子が、デキサメタゾン、オメプラゾールから成るグループから単独でまたは共に選択される請求項28〜30のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項32】
誘発因子が、リファムプシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジドを含む請求項28−31のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項33】
細胞集団が、特性v)のCYP450タンパク質のうちの少なくとも1つの酵素活性を示す請求項1〜32のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項34】
細胞集団がGST酵素活性を示す請求項1〜33のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項35】
GST酵素活性が、細胞集団の溶解物内のタンパク質の例えば、少なくとも0.03μmol/min/mg、少なくとも0.05μmol/min/mg、少なくとも1.0μmol/min/mg、少なくとも0.07μmol/min/mg、少なくとも0.09μmol/min/mg、少なくとも0.11μmol/min/mg、少なくとも0.13μmol/min/mgまたは少なくとも0.15μmol/min/mgのような少なくとも0.4μmol/min/mgである請求項33に記載の細胞集団。
【請求項36】
細胞集団が、UGT酵素活性を示す請求項21〜35のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項37】
前記細胞集団が、特性を維持しながら試験管内で少なくとも一ヶ月間培養される請求項1〜36のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項38】
前記細胞集団が、特性を維持しながら試験管内で少なくとも一週月間培養される請求項1〜37のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項39】
前記細胞集団が、特性を維持しながら試験管内で少なくとも72時間培養される請求項1〜38のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項40】
前記細胞集団が、更にアルファフェトタンパク質を示す請求項1〜39のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項41】
前記細胞集団が、ヒトまたはマウス・フィーダ細胞のようなフィーダ細胞の存在下で得られる請求項1〜40のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項42】
前記細胞集団が、フィーダ細胞がない場合に得られる請求項1〜41のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項43】
前記細胞集団が、細胞外マトリックスを使用して得られ、前記マトリックスは、定義済み又は未定義の組成物である請求項42に記載の細胞集団。
【請求項44】
前記細胞集団が、内側に一つ以上のタンパク質により単独でまたは共にコーティングされるプラスチック細胞培養容器を使用して得られる請求項42または43に記載の細胞集団。
【請求項45】
一つ以上のタンパク質がコラーゲン、ラミニン及びそれらの組合せから構成されるグループから選択される請求項44に記載の細胞集団。
【請求項46】
前記細胞集団が、例えば多孔性フィルタのような三次元環境を使用して得られる請求項44または45に記載の細胞集団。
【請求項47】
前記細胞集団が、異種動物由来成分を含まない請求項41〜46のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項48】
細胞集団における細胞の少なくとも約10%が、HNF3ベータ及びAFPの少なくとも一つのを示し、増殖能を有し、細胞集団は以下の5つの特性のうちの少なくとも2つを有するhBS細胞に由来する細胞集団:
A.受容体
i)細胞の少なくとも1%が、アルファ−6−インテグリンのタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性、
ii)細胞の少なくとも1%が、c−Metのタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性、
B.細胞間接着分子
iii)細胞の少なくとも1%が、ICAM−1のタンパク質および/または発現を示す特性、
C.転写因子
iv)細胞の少なくとも10%が、HNF−4アルファのタンパク質および/または発現を示す特性。
【請求項49】
細胞集団が、以下の特性のうちの少なくとも2つを有する請求項48に記載の細胞集団:
A.受容体
i)細胞の少なくとも1%が、アルファ−6−インテグリンのタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性、
ii)細胞の少なくとも1%が、c−Metのタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性、
B.細胞間接着分子
iii)細胞の少なくとも1%が、ICAM−1のタンパク質および/または発現を示す特性、
C.転写因子
iv)細胞の少なくとも10%が、HNF−4アルファのタンパク質および/または発現を示す特性、
D.サイトケラチン
v)細胞の少なくとも1%が、CK19のタンパク質および/または発現を示す特性、
vi)細胞の少なくとも1%が、CK7のタンパク質および/または発現を示す特性、
E.上皮細胞接着分子
vii)細胞の少なくとも1%が、EpCAMのタンパク質および/または発現を示す特性。
【請求項50】
細胞集団が、前記特性のうちの少なくとも3つを有する請求項48または49に記載の細胞集団。
【請求項51】
細胞集団が、前記特性のうちの例えば少なくとも5、少なくとも6または全7つのような少なくとも4つを有する請求項48〜50のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項52】
特性i)が、細胞の例えば、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%のように少なくとも5%にあてはまる請求項48〜51のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項53】
特性ii)が、細胞の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%のような少なくとも5%にあてはまる請求項48〜52のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項54】
特性iii)が、細胞の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%のような少なくとも5%にあてはまる請求項48〜53のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項55】
特性iv)が、細胞の少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%のような少なくとも15%にあてはまる請求項48〜54のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項56】
個体群の細胞の少なくとも約15%、たとえば、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%又は少なくとも約95%が、HNF3ベータ及びAFPの少なくとも一つを示し、増殖能を有する請求項48〜55のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項57】
前記細胞集団が、以下の特性のうちの少なくとも1つを有する請求項48〜56のいずれかに記載の細胞集団:
F.薬物輸送体
viii)細胞の少なくとも1%が、BSEPのタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性、
ix)細胞の少なくとも1%が、MRP2のタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性。
【請求項58】
創薬プロセスのための、請求項1〜57のいずれかに定義した細胞集団の使用。
【請求項59】
試験管内モデルの薬物輸送体を研究するための、請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項60】
試験管内モデルの薬物代謝酵素を研究するための請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項61】
試験管内のモデルで早期肝形成のような肝形成を研究するための請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項62】
試験管内のモデルで ヒト肝再生障害を研究するための請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項63】
試験管内の肝毒性テストのための、請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項64】
薬剤としての請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項65】
肝臓組織の退化のような組織退化によって生じる疾患および/または病状の治療および/または予防するのための医薬製品を製造するための請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項66】
肝臓疾患治療用の医薬品を製造するための請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項67】
原発性胆汁性肝硬変を含む自動免疫性障害、脂質異常症を含んでいる代謝障害、2型糖尿病、肥満、アルコール等の濫用によって生じる肝臓疾患、B型肝炎、C型肝炎及びA型肝炎などのウイルスによって生じる疾患、調合薬に対する鋭い中毒反応によって生じる肝臓壊死及び肝細胞性癌を患っている患者の腫瘍除去からなる群から選択される肝臓疾患を治療および/または予防する医薬品の製造のための請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項68】
代謝病状および/または疾患を治療および/または予防する医薬品を製造するための請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項69】
代謝的に改善された肝細胞様細胞を得るための請求項48〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団からの一つ以上の細胞の使用。
【請求項70】
肝細胞様細胞の成熟を研究するための請求項48〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団からの一つ以上の細胞の使用。
【請求項71】
請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団から合成物への細胞をさらすことから成る工程、及び、合成物が細胞に有毒かをどうか測定する工程を含む肝細胞性毒性の合成物をスクリーニング方法。
【請求項72】
請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団から合成物へ細胞をさらす工程、合成物との接触による細胞のいかなる表現型又は代謝変化を決定する工程、変化を肝細胞性機能を調整する能力に関連づける工程を含む肝細胞性機能を調整する能力のために合成物をスクリーニング方法。
【請求項73】
請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団を得るために、
i)少なくとも5日間、無血清培地内の支持マトリックス上のhBS細胞から由来するhBS細胞または原種を試験管での分化する工程、
ii)約5日乃至約25日ごとに媒介物を変える工程、
iii)機械的隔離によって細胞を分離する工程、
iv)酵素処理によりステップiii)で得られる細胞を任意に解離する工程、
v)表面抗原発現に基づいて細胞を任意にソートする工程を含む方法。
【請求項74】
hBS細胞に由来する原種が、少なくとも一つのHNF3ベータ及びAFPを示し、増殖能を有する請求項73に記載の方法。
【請求項75】
無血清培地が、bFGFから成るVitroHES(商標)である請求項73または74に記載の方法。
【請求項76】
bFGFの濃度が、約4ng/mlから約200ng/mlまでであり、例えば、約4ng/mlから約150ng/mlまで、約4ng/mlから約100のng/ml、約4ng/mlから約50のng/mlまで、または約4ng/mlから約10のng/mlまでである請求項73〜75のいずれかに記載の方法。
【請求項77】
bFGFの濃度が、少なくとも4ng/mlである請求項75に記載の方法。
【請求項78】
ステップi)の試験管内分化が、少なくとも10日間、例えば、少なくとも20日間、少なくとも30日間または少なくとも40日間実行される請求項73〜77のいずれかに記載の方法。
【請求項79】
支持マトリックスがヒトまたはマウス・フィーダ細胞のようなフィーダ細胞を含む請求項73〜78のいずれかに記載の方法。
【請求項80】
支持マトリックスが、定義済みまたは未定義組成物の細胞外基質を含む請求項73〜78のいずれかに記載の方法。
【請求項81】
支持マトリックスが、細胞培養のために使用されるプラスチック細胞培養容器の中の内側にコーティングされ、一つ以上のタンパク質の単独または組合せからなるコーティングを含む請求項80に記載の方法。
【請求項82】
支持マトリックスが、三次元環境、例えば多孔性フィルタを含む請求項73〜81のいずれかに記載の方法。
【請求項83】
多孔性フィルタが、直径が約4μmの孔サイズを有する請求項82に記載の方法。
【請求項84】
多孔性フィルタが、単独または組合せによる一つ以上のタンパク質にコーティングされる請求項82〜83のいずれかに記載の方法。
【請求項85】
一つ以上タンパク質が、コラーゲン、ラミニン及びこれらの組合せからなる群から選択される請求項81〜84のいずれかに記載の方法。
【請求項86】
ステップii)が、約10日間乃至約20日間ごとに実行される請求項73〜85のいずれかに記載の方法。
【請求項87】
ステップii)が、14日から15日間ごとに実行される請求項73〜86のいずれかによる方法。
【請求項88】
i)請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団、
ii)一つ以上の成熟因子および/または成熟培養基、及び
iii)任意に、使用説明書、
を含むキット。
【請求項89】
成熟培養基が、VitroHES(商標)、bFGFで補充されるVitroHES(商標)、あらかじめ自己調整されたVitroHES(商標)、及び肝細胞特異的な培養基からなる群から選択される請求項88に記載のキット。
【請求項90】
一つ以上の成熟因子が、bFGF、上皮増殖因子、肝細胞増殖因子及びオンコスタチンMからなる群から選択される請求項88または89に記載のキット。
【請求項91】
成熟をモニタする道具をさらに含む請求項89に記載のキット。
【請求項92】
成熟をモニタするための道具が、
i)HNF3ベータ、AFP、アルブミン、BSEP、MRP2、OATP−2、OATP−8、GST A1−1、CYP450−1A2、CYP450−2A6、CYP450−2B6、CYP450−2C8、CYP450−2C9、CYP450−2C19 CYP450−2D6、CYP450−2E1、CYP450−3A4、CYP450−3A7、GST M1−1及びUGTからなる群から選択されるマーカー発現を記録する、少なくとも3つ、少なくとも4つまたは少なくとも5つの遺伝子に対抗するPCRプライマー、及び
ii)ユーザーズ・マニュアル、
からなる請求項91に記載のキット。
【請求項93】
成熟をモニタする道具が、
i)HNF3ベータ、AFP、アルブミン、BSEP、MRP2、OATP−2、OATP−8、GST A1−1、CYP450−1A2、CYP450−2A6、CYP450−2B6、CYP450−2C8、CYP450−2C9、CYP450−2C19 CYP450−2D6、CYP450−2E1、CYP450−3A4、CYP450−3A7、GST M1−1及びUGTからなる群から選択される、少なくとも3つ、たとえば少なくとも4つまたは少なくとも5つのマーカー発現抗原に対する抗体、及び
ii)ユーザーズ・マニュアル、
からなる請求項90または91に記載のキット。
【請求項1】
hBS細胞に由来する細胞集団であって、
細胞集団の細胞の少なくとも20%が、
アルファ 1−アンチトリプシン、サイトケラチン18、HNF−3ベータ、アルブミンまたは尿中L型脂肪酸結合蛋白のうちの少なくとも1つ特性を示すとともに、
細胞集団が、下記六つの特性のうちの少なくとも三つの特性を有する前記細胞集団:
A.薬物輸送体
i)細胞の少なくとも1%が、BSEPのタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性、
ii)細胞の少なくとも1%が、MRP2のタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性、
iii)細胞の少なくとも1%が、タンパク質および/または遺伝子発現OATP−2および/またはOATP−8を示す特性、
B.薬物代謝酵素
iv)細胞の少なくとも20%が、GST A1−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性、
v)細胞の少なくとも20%が、CYP450s−1A2、−2A6、−2B6、−2C8、−2C9、−2C19、−2D6、−2E1、−3A4及び−3A7の少なくとも2つのタンパク質および/またはGST A1−1の遺伝子発現を示す特性、
vi)細胞の少なくとも20%がGST P1−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示さない特性。
【請求項2】
細胞集団は、少なくとも一つの前記薬物輸送体特徴及び少なくとも一つの前記薬物代謝特徴を有する請求項1に記載の細胞集団。
【請求項3】
細胞集団が、前記特性のうちの少なくとも四つ、例えば五つの特性を有する請求項1または2に記載の細胞集団。
【請求項4】
細胞集団が前記特徴のうちの全ての6つの特性を有する請求項1〜3のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項5】
請求項1又は2に記載の細胞集団であって、
細胞集団の細胞の少なくとも20%が、アルファ 1−アンチトリプシン、サイトケラチン18、HNF−3ベータ、アルブミンまたは尿中L型脂肪酸結合蛋白特性の少なくとも一つの示し、以下の特性を有する:
A.薬物輸送体
iii)細胞の少なくとも1%が、機能的に活性を有するOATP−2および/またはOATP−8を示す特性、
B.薬物代謝酵素
細胞の少なくとも20%が、GSTA1−1の機能的な活性を示す特性、
細胞の少なくとも20%が、薬物代謝物質を分析することによって測定され、機能的に活性を有するCyp1A2、Cyp3A4および/またはCyp2C9を示す特性。
【請求項6】
請求項1又は2に記載の細胞集団であって、
細胞集団の細胞の少なくとも75%が、アルファ 1−アンチトリプシン、サイトケラチン18、HNF−3ベータ、アルブミンまたは尿中L型脂肪酸結合蛋白特性を示し、細胞集団が少なくとも以下の特性を有する。
A.薬物輸送体
iii)細胞の少なくとも10%が、機能的に活性を有するOATP−2および/またはOATP−8を示す特性、
B.薬物代謝酵素
iv)細胞の少なくとも30%が、GSTA1−1の機能的な活性を示す特性、
v)細胞の少なくとも50%が、薬代謝物質を分析することによって測定され、機能的に活性を有するCyp1A2、Cyp3A4および/またはCyp2C9を示す特性。
【請求項7】
特性i)が、細胞の少なくとも5%、例えば、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%または少なくとも50%である請求項1〜6のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項8】
特性ii)が、細胞の少なくとも5%、例えば、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%にあてはまる請求項1〜7のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項9】
特性iii)は、細胞の少なくとも5%、例えば、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%または少なくとも80%にあてはまる請求項1〜8のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項10】
特性iv)が、細胞の少なくとも30%、例えば、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%または少なくとも80%にあてはまる請求項1〜9のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項11】
特性v)が、細胞の少なくとも30%、例えば、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%または少なくとも80%にあてはまる請求項1〜10のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項12】
特性vi)が、細胞の少なくとも10%、例えば、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%または少なくとも80%にあてはまる請求項1〜11のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項13】
細胞集団の細胞の少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%または少なくとも約95%のような少なくとも約30%が、アルファ 1−アンチトリプシン、サイトケラチン18、HNF−3ベータ、アルブミンまたは尿中L型脂肪酸結合蛋白のうちの少なくとも1つを示している請求項1〜12のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項14】
細胞の少なくとも約5%がサイトケラチン18及びCYP1A2を共発現する請求項1〜13のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項15】
細胞の少なくとも約5%がサイトケラチン18及びCYP2A6を共発現する請求項1〜14のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項16】
細胞の少なくとも約5%がサイトケラチン18及びCYP2B6を共発現する請求項1〜15のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項17】
少なくとも、細胞の約5%が、サイトケラチン18及びCYP2C8、CYP2C9および/またはCYP2C19を共発現する請求項1〜16のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項18】
、細胞の少なくとも約5%が、サイトケラチン18及びCYP2D6を共発現する請求項1〜17のいずれかに記載の細胞集。
【請求項19】
細胞の少なくとも約5%がサイトケラチン18及びCYP2E1を共発現する請求項1〜18のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項20】
細胞の少なくとも約5%が、サイトケラチン18及びCYP3A4および/またはCYP3A7を共発現する請求項1〜19のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項21】
細胞の少なくとも約5%が、以下の追加的な特性のうちの少なくとも1つを有する請求項1〜20のいずれかに記載の細胞集団。
A.受容体
vii)細胞の少なくとも約5%が、c−Metのタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性、
B.細胞間接着分子
viii)細胞の少なくとも約5%がICAM−1のタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性、
C.薬物代謝酵素
ix)細胞の少なくとも1%がUGTのタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性、
D.転写因子
x)細胞の少なくとも90%が、1Oct−4のタンパク質および/または遺伝子発現を示さない特性。
【請求項22】
細胞集団は、特性vii)、viii)、ix)またはx)の中で、少なくとも二つ、例えば少なくとも三つを有する請求項21に記載の細胞集団。
【請求項23】
細胞集団が、特性vii)、viii)、ix)またはx)のうちの4つすべてを有する請求項21または22に記載の細胞集団。
【請求項24】
特性vii)が、細胞の少なくとも10%、例えば、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%にあてはまる請求項21〜23のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項25】
特性viii)が、例えば、細胞の少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%のような少なくとも10%にあてはまる請求項21〜24のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項26】
特性ix)が、例えば、細胞の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%のような少なくとも5%にあてはまる請求項21〜25のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項27】
特性x)が、例えば、細胞の少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも95%のような少なくとも10%にあてはまる請求項21〜26のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項28】
CYP450タンパク質のうちの少なくとも1つの発現が、誘発因子の付加物に誘導できる請求項1〜27のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項29】
GST A1−1および/またはGST M1−1タンパク質の発現が、誘発因子の付加物に誘導できる請求項1〜28のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項30】
UGTタンパク質の発現は、誘発因子の付加物に誘導できる請求項21〜29のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項31】
誘発因子が、デキサメタゾン、オメプラゾールから成るグループから単独でまたは共に選択される請求項28〜30のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項32】
誘発因子が、リファムプシン、デキサメタゾン、デソキシフェノバルビタール、エタノール、オメプラゾール及びイソニアジドを含む請求項28−31のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項33】
細胞集団が、特性v)のCYP450タンパク質のうちの少なくとも1つの酵素活性を示す請求項1〜32のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項34】
細胞集団がGST酵素活性を示す請求項1〜33のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項35】
GST酵素活性が、細胞集団の溶解物内のタンパク質の例えば、少なくとも0.03μmol/min/mg、少なくとも0.05μmol/min/mg、少なくとも1.0μmol/min/mg、少なくとも0.07μmol/min/mg、少なくとも0.09μmol/min/mg、少なくとも0.11μmol/min/mg、少なくとも0.13μmol/min/mgまたは少なくとも0.15μmol/min/mgのような少なくとも0.4μmol/min/mgである請求項33に記載の細胞集団。
【請求項36】
細胞集団が、UGT酵素活性を示す請求項21〜35のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項37】
前記細胞集団が、特性を維持しながら試験管内で少なくとも一ヶ月間培養される請求項1〜36のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項38】
前記細胞集団が、特性を維持しながら試験管内で少なくとも一週月間培養される請求項1〜37のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項39】
前記細胞集団が、特性を維持しながら試験管内で少なくとも72時間培養される請求項1〜38のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項40】
前記細胞集団が、更にアルファフェトタンパク質を示す請求項1〜39のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項41】
前記細胞集団が、ヒトまたはマウス・フィーダ細胞のようなフィーダ細胞の存在下で得られる請求項1〜40のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項42】
前記細胞集団が、フィーダ細胞がない場合に得られる請求項1〜41のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項43】
前記細胞集団が、細胞外マトリックスを使用して得られ、前記マトリックスは、定義済み又は未定義の組成物である請求項42に記載の細胞集団。
【請求項44】
前記細胞集団が、内側に一つ以上のタンパク質により単独でまたは共にコーティングされるプラスチック細胞培養容器を使用して得られる請求項42または43に記載の細胞集団。
【請求項45】
一つ以上のタンパク質がコラーゲン、ラミニン及びそれらの組合せから構成されるグループから選択される請求項44に記載の細胞集団。
【請求項46】
前記細胞集団が、例えば多孔性フィルタのような三次元環境を使用して得られる請求項44または45に記載の細胞集団。
【請求項47】
前記細胞集団が、異種動物由来成分を含まない請求項41〜46のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項48】
細胞集団における細胞の少なくとも約10%が、HNF3ベータ及びAFPの少なくとも一つのを示し、増殖能を有し、細胞集団は以下の5つの特性のうちの少なくとも2つを有するhBS細胞に由来する細胞集団:
A.受容体
i)細胞の少なくとも1%が、アルファ−6−インテグリンのタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性、
ii)細胞の少なくとも1%が、c−Metのタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性、
B.細胞間接着分子
iii)細胞の少なくとも1%が、ICAM−1のタンパク質および/または発現を示す特性、
C.転写因子
iv)細胞の少なくとも10%が、HNF−4アルファのタンパク質および/または発現を示す特性。
【請求項49】
細胞集団が、以下の特性のうちの少なくとも2つを有する請求項48に記載の細胞集団:
A.受容体
i)細胞の少なくとも1%が、アルファ−6−インテグリンのタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性、
ii)細胞の少なくとも1%が、c−Metのタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性、
B.細胞間接着分子
iii)細胞の少なくとも1%が、ICAM−1のタンパク質および/または発現を示す特性、
C.転写因子
iv)細胞の少なくとも10%が、HNF−4アルファのタンパク質および/または発現を示す特性、
D.サイトケラチン
v)細胞の少なくとも1%が、CK19のタンパク質および/または発現を示す特性、
vi)細胞の少なくとも1%が、CK7のタンパク質および/または発現を示す特性、
E.上皮細胞接着分子
vii)細胞の少なくとも1%が、EpCAMのタンパク質および/または発現を示す特性。
【請求項50】
細胞集団が、前記特性のうちの少なくとも3つを有する請求項48または49に記載の細胞集団。
【請求項51】
細胞集団が、前記特性のうちの例えば少なくとも5、少なくとも6または全7つのような少なくとも4つを有する請求項48〜50のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項52】
特性i)が、細胞の例えば、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%のように少なくとも5%にあてはまる請求項48〜51のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項53】
特性ii)が、細胞の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%のような少なくとも5%にあてはまる請求項48〜52のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項54】
特性iii)が、細胞の少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%のような少なくとも5%にあてはまる請求項48〜53のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項55】
特性iv)が、細胞の少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%のような少なくとも15%にあてはまる請求項48〜54のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項56】
個体群の細胞の少なくとも約15%、たとえば、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%又は少なくとも約95%が、HNF3ベータ及びAFPの少なくとも一つを示し、増殖能を有する請求項48〜55のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項57】
前記細胞集団が、以下の特性のうちの少なくとも1つを有する請求項48〜56のいずれかに記載の細胞集団:
F.薬物輸送体
viii)細胞の少なくとも1%が、BSEPのタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性、
ix)細胞の少なくとも1%が、MRP2のタンパク質および/または遺伝子発現を示す特性。
【請求項58】
創薬プロセスのための、請求項1〜57のいずれかに定義した細胞集団の使用。
【請求項59】
試験管内モデルの薬物輸送体を研究するための、請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項60】
試験管内モデルの薬物代謝酵素を研究するための請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項61】
試験管内のモデルで早期肝形成のような肝形成を研究するための請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項62】
試験管内のモデルで ヒト肝再生障害を研究するための請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項63】
試験管内の肝毒性テストのための、請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項64】
薬剤としての請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項65】
肝臓組織の退化のような組織退化によって生じる疾患および/または病状の治療および/または予防するのための医薬製品を製造するための請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項66】
肝臓疾患治療用の医薬品を製造するための請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項67】
原発性胆汁性肝硬変を含む自動免疫性障害、脂質異常症を含んでいる代謝障害、2型糖尿病、肥満、アルコール等の濫用によって生じる肝臓疾患、B型肝炎、C型肝炎及びA型肝炎などのウイルスによって生じる疾患、調合薬に対する鋭い中毒反応によって生じる肝臓壊死及び肝細胞性癌を患っている患者の腫瘍除去からなる群から選択される肝臓疾患を治療および/または予防する医薬品の製造のための請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項68】
代謝病状および/または疾患を治療および/または予防する医薬品を製造するための請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団の使用。
【請求項69】
代謝的に改善された肝細胞様細胞を得るための請求項48〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団からの一つ以上の細胞の使用。
【請求項70】
肝細胞様細胞の成熟を研究するための請求項48〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団からの一つ以上の細胞の使用。
【請求項71】
請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団から合成物への細胞をさらすことから成る工程、及び、合成物が細胞に有毒かをどうか測定する工程を含む肝細胞性毒性の合成物をスクリーニング方法。
【請求項72】
請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団から合成物へ細胞をさらす工程、合成物との接触による細胞のいかなる表現型又は代謝変化を決定する工程、変化を肝細胞性機能を調整する能力に関連づける工程を含む肝細胞性機能を調整する能力のために合成物をスクリーニング方法。
【請求項73】
請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団を得るために、
i)少なくとも5日間、無血清培地内の支持マトリックス上のhBS細胞から由来するhBS細胞または原種を試験管での分化する工程、
ii)約5日乃至約25日ごとに媒介物を変える工程、
iii)機械的隔離によって細胞を分離する工程、
iv)酵素処理によりステップiii)で得られる細胞を任意に解離する工程、
v)表面抗原発現に基づいて細胞を任意にソートする工程を含む方法。
【請求項74】
hBS細胞に由来する原種が、少なくとも一つのHNF3ベータ及びAFPを示し、増殖能を有する請求項73に記載の方法。
【請求項75】
無血清培地が、bFGFから成るVitroHES(商標)である請求項73または74に記載の方法。
【請求項76】
bFGFの濃度が、約4ng/mlから約200ng/mlまでであり、例えば、約4ng/mlから約150ng/mlまで、約4ng/mlから約100のng/ml、約4ng/mlから約50のng/mlまで、または約4ng/mlから約10のng/mlまでである請求項73〜75のいずれかに記載の方法。
【請求項77】
bFGFの濃度が、少なくとも4ng/mlである請求項75に記載の方法。
【請求項78】
ステップi)の試験管内分化が、少なくとも10日間、例えば、少なくとも20日間、少なくとも30日間または少なくとも40日間実行される請求項73〜77のいずれかに記載の方法。
【請求項79】
支持マトリックスがヒトまたはマウス・フィーダ細胞のようなフィーダ細胞を含む請求項73〜78のいずれかに記載の方法。
【請求項80】
支持マトリックスが、定義済みまたは未定義組成物の細胞外基質を含む請求項73〜78のいずれかに記載の方法。
【請求項81】
支持マトリックスが、細胞培養のために使用されるプラスチック細胞培養容器の中の内側にコーティングされ、一つ以上のタンパク質の単独または組合せからなるコーティングを含む請求項80に記載の方法。
【請求項82】
支持マトリックスが、三次元環境、例えば多孔性フィルタを含む請求項73〜81のいずれかに記載の方法。
【請求項83】
多孔性フィルタが、直径が約4μmの孔サイズを有する請求項82に記載の方法。
【請求項84】
多孔性フィルタが、単独または組合せによる一つ以上のタンパク質にコーティングされる請求項82〜83のいずれかに記載の方法。
【請求項85】
一つ以上タンパク質が、コラーゲン、ラミニン及びこれらの組合せからなる群から選択される請求項81〜84のいずれかに記載の方法。
【請求項86】
ステップii)が、約10日間乃至約20日間ごとに実行される請求項73〜85のいずれかに記載の方法。
【請求項87】
ステップii)が、14日から15日間ごとに実行される請求項73〜86のいずれかによる方法。
【請求項88】
i)請求項1〜57のいずれかにおいて定義した細胞集団、
ii)一つ以上の成熟因子および/または成熟培養基、及び
iii)任意に、使用説明書、
を含むキット。
【請求項89】
成熟培養基が、VitroHES(商標)、bFGFで補充されるVitroHES(商標)、あらかじめ自己調整されたVitroHES(商標)、及び肝細胞特異的な培養基からなる群から選択される請求項88に記載のキット。
【請求項90】
一つ以上の成熟因子が、bFGF、上皮増殖因子、肝細胞増殖因子及びオンコスタチンMからなる群から選択される請求項88または89に記載のキット。
【請求項91】
成熟をモニタする道具をさらに含む請求項89に記載のキット。
【請求項92】
成熟をモニタするための道具が、
i)HNF3ベータ、AFP、アルブミン、BSEP、MRP2、OATP−2、OATP−8、GST A1−1、CYP450−1A2、CYP450−2A6、CYP450−2B6、CYP450−2C8、CYP450−2C9、CYP450−2C19 CYP450−2D6、CYP450−2E1、CYP450−3A4、CYP450−3A7、GST M1−1及びUGTからなる群から選択されるマーカー発現を記録する、少なくとも3つ、少なくとも4つまたは少なくとも5つの遺伝子に対抗するPCRプライマー、及び
ii)ユーザーズ・マニュアル、
からなる請求項91に記載のキット。
【請求項93】
成熟をモニタする道具が、
i)HNF3ベータ、AFP、アルブミン、BSEP、MRP2、OATP−2、OATP−8、GST A1−1、CYP450−1A2、CYP450−2A6、CYP450−2B6、CYP450−2C8、CYP450−2C9、CYP450−2C19 CYP450−2D6、CYP450−2E1、CYP450−3A4、CYP450−3A7、GST M1−1及びUGTからなる群から選択される、少なくとも3つ、たとえば少なくとも4つまたは少なくとも5つのマーカー発現抗原に対する抗体、及び
ii)ユーザーズ・マニュアル、
からなる請求項90または91に記載のキット。
【図16】
【図23】
【図36】
【図37】
【図40】
【図43】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図38】
【図39】
【図41】
【図42】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49】
【図23】
【図36】
【図37】
【図40】
【図43】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図38】
【図39】
【図41】
【図42】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49】
【公表番号】特表2009−539358(P2009−539358A)
【公表日】平成21年11月19日(2009.11.19)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2009−513588(P2009−513588)
【出願日】平成19年6月4日(2007.6.4)
【国際出願番号】PCT/EP2007/004940
【国際公開番号】WO2007/140968
【国際公開日】平成19年12月13日(2007.12.13)
【出願人】(503071598)セルアーティス アーベー (10)
【Fターム(参考)】
【公表日】平成21年11月19日(2009.11.19)
【国際特許分類】
【出願日】平成19年6月4日(2007.6.4)
【国際出願番号】PCT/EP2007/004940
【国際公開番号】WO2007/140968
【国際公開日】平成19年12月13日(2007.12.13)
【出願人】(503071598)セルアーティス アーベー (10)
【Fターム(参考)】
[ Back to top ]